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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Parasitologia
“ALTERAÇÕES IMUNOLÓGICAS NO SANGUE
PERIFÉRICO DE CÃES SUBMETIDOS À
IMUNOPROFILAXIA PARA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA”
MÁRCIO SOBREIRA SILVA ARAÚJO
Belo Horizonte - MG
Novembro - 2006
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MÁRCIO SOBREIRA SILVA ARAÚJO
“ALTERAÇÕES IMUNOLÓGICAS NO SANGUE
PERIFÉRICO DE CÃES SUBMETIDOS À
IMUNOPROFILAXIA PARA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA”
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Parasitologia do Departamento
de Parasitologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial para a obtenção
do título de Doutor em Ciências - Área de
Concentração em Imunoparasitologia.
Orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho - Laboratório de Doença de Chagas do
Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo
Co-orientadora: Dra. Maria Norma Melo - Laboratório de Biologia de Leishmania
Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas/UFMG
Belo Horizonte - MG
Novembro – 2006
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Local de Desenvolvimento da Tese
Laboratório de Doença de Chagas - CPqRR – Fiocruz / MG
Canil da Polícia Militar de Minas Gerais - PMMG
Colaboradores
Dr. Wilson Mayrink
I
Doutoranda Renata Aline Andrade
II
Dra Mariléia Andrade
II
Capitão Leonardo Rocha Vianna
III
Dra Andréa Teixeira Carvalho
IV
Dr Luiz Cosme Cotta Malaquias
V
I - Laboratório de Leishmanioses, Departamento de Parasitologia - ICB / UFMG
II - Laboratório de Doença de Chagas - CPqRR – Fiocruz / MG
III - Canil da Polícia Militar de Minas Gerais – 4º Cia PMMG
IV - Laboratório de Imunologia celular e Molecular - CPqRR – Fiocruz / MG
V - Universidade do Vale do Rio Doce - UNIVALE
Suporte Financeiro
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
CPqRR - Centro de Pesquisa René Rachou
CNPq - Conselho Nacional de Pesquisa
FAPEMIG – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais
Tributo a um cão
“... O mais altruísta dos amigos que um homem pode ter neste mundo
egoísta, aquele que nunca o abandona e nunca mostra ingratidão ou deslealdade, é
o cão”.
“Senhores jurados, o cão permanece com seu dono na prosperidade e na
pobreza, na saúde e na doença. Ele dormirá no chão frio, onde os ventos invernais
sopram e a neve se lança impetuosamente. Quando só ele estiver ao lado de seu,
ele beijará a mão que não tem alimento a oferecer, ele lamberá suas feridas e as
dores que aparecem nos encontros com a violência do mundo. Ele guarda o sono de
seu pobre dono como se fosse um príncipe. Quando todos os amigos abandonarem,
o cão permanecerá. Quando a riqueza desaparece e a reputação se despedaça, ele
é constante em seu amor como o sol na sua jornada através do firmamento. Se a
fortuna arrasta o dono para o exílio, o desamparo e o desabrigo, o cão fiel pede o
privilégio maior de acompanhá-lo, para protegê-lo contra o perigo, para lutar contra
seus inimigos. E quando a ultima cena se apresenta, a morte o leva em seus braços
e seu corpo é deixado sobre a laje fria, não importa que todos os amigos sigam seu
caminho, lá ao lado de sua sepultura se encontrará seu nobre cão, a cabeça entre
as patas, os olhos tristes mas em atenta observação, fé e confiança mesmos a
morte.”
Retirado da caderneta de vacinação da
Clínica veterinária São Francisco de Assis
.
Dedico este trabalho aos meus pais, José
Arnaldo e Maria das Dores, por terem dado tudo
de si pela minha formação intelectual e moral; e
por acreditarem em minhas lutas e
compreenderem minha ausência em momentos
importantes. Aos meus queridos Irmãos, que
sempre me deram apoio e carinho;
A minha amada Caroline, por seu amor,
paciência, confiança e compreensão; e também
por estar sempre ao meu lado e acreditar em
mim...
Agradecimentos
Ao Dr. Olindo, pela orientação e também pelos ensinamentos em imunologia e
citometria; com você aprendi dentre outras coisas o que é imprescindível para um
bom pesquisador, explorar todas as possibilidades de interpretação que os dados
possam proporcionar. Obrigado pela confiança e amizade.
A Dra Norma Maria Melo, pela co-orientação, confiança e amizade, obrigado pelo
privilégio de poder compartilhar sua sabedoria e humildade.
Ao Dr. Wilson Mayrink, pela colaboração e apoio na realização deste projeto.
Ao Capitão Leonardo Rocha Vianna, veterinário responsável pelo canil da PMMG e
aos auxiliares veterinários, sargentos: Kátia, Fonseca, Welles, Mangabeira e ao
Fabrício, pelos inúmeros auxílios no manuseio com os animais e pelo tempo que
tivemos oportunidade de trabalharmos juntos.
À amiga Renata Aline Andrade, muitíssimo obrigado por sua ajuda, seu
companheirismo e sua amizade que foram fundamentais no desenvolvimento deste
trabalho.
À Dra Andréa Teixeira e a Dra Mariléia Andrade, pela amizade e disponibilidade em
ajudar, pela colaboração nas correções, sugestões e valiosas contribuições no
desenvolvimento intelectual deste trabalho.
A Dr. Alexandre Reis pelos conhecimentos e esclarecimentos a mim transmitidos
durante nossos “Bate papos”; obrigado por todas as sugestões e conselhos.
Aos diretores do centro de pesquisa René Rachou, Dr. Roberto Sena Rocha e Dr.
Álvaro José Romanha, pelo apoio e por terem me possibilitado desenvolver este
trabalho.
Ao Programa de Pós-graduação em Parasitologia da UFMG, e aos professores em
especial à professora Marilene Michalick, pelo apoio.
À querida e estimada secretária da Pós-graduação, Sumara pela sua notável
dedicação e pela carinhosa atenção devotada a todos que em algum instante
necessitam de seus préstimos.
À Dra Célia Gontijo, pela amizade e apoio em vários momentos.
Ao Sidney, técnico do laboratório de leishmaniose, pelo auxílio na realização das
Reações de imunofluorescência.
À Anna Carolina Lustosa Lima, pela ajuda na estatística.
A todos os amigos do laboratório de Doença Chagas: Ana Paula Marciano, Ana
Paula Wedling, Paula, Julia, Bia, Lidiane, Jordana, Izabelle, Kátia, Vanessa, Dra
Silvana, Renato e Dani; pelo convívio sempre agradável, pela amizade e
companheirismo, pelo apoio e atenção; Agradeço em especial a Roberta Félix,
Eliandra e Renata, por ouvir minhas lamurias e por serem sempre muito
prestativas.... saibam que este trabalho tem um pouquinho de cada um de todos
vocês!!! Muitíssimo obrigado por tudo que fizeram por mim !!!
A todos os amigos do laboratório de Entomologia Médica: Érika, Sabrina, Tati, Tina,
Jairo, Carol, Rafael, Nágila, Lili, Gustavo Martins, Gustavo Bahia, Ana Cristina,
Monique, Cíntia, Taciana, Ilkeline e Marlene, pelo carinho e apoio; em especial a
Danielle Costa (Dani) que me ajudou no desenvolvimento do projeto.
Ao Dr. Paulo Pimenta, chefe do laboratório de Entomologia Médica, pela orientação
e colaboração na primeira parte do meu doutorado onde desenvolvia outro projeto
que infelizmente não pudemos dar continuidade devido ao surgimento de problemas
inerentes à padronização das técnicas; espero continuar contando com a sua
colaboração e amizade.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia; em especial a Tiza, pelas inúmeras
ajudas durante as leituras no “Facs” e a Clari pelos incentivos e sempre me
proporcionar um “alto astral”.
Aos Amigos do setor de Informática do CPqRR, Edmar, Daniel e Matheus, pelos
auxílios.
Aos Motoristas Toninho e Cláudio pela amizade e pelas inúmeras vezes que me
acompanhou nas idas ao canil da PMMG.
Ao Bibliotecário e amigo, Segemar, pelos inúmeros auxílios.
Aos funcionários do Centro de Pesquisa René Rachou, em especial aos amigos do
Biotério: Kelly, Wanderley, Kátia, Marcílio, Jaci, D. Vera.
À Simone, pelas “dicas” e pelos primeiros ensinamentos sobre imunofenotipagem.
Ao Dr. Cosme, por ter me recebido em seu Laboratório e me auxiliar na dosagem de
Óxido nítrico.
À Érika Marciana, por me socorrer com seus préstimos, me ajudando a formatar este
trabalho.
À Caroline e seus Familiares, Luiz Inácio, Graça, Miriam, Patrícia, Rodrigo e também
Francisca, pelo imenso carinho e atenção a mim devotada.
Aos meus amigos e colegas do doutorado, Raul, Rodolfo, Gustavo, Lívio, Marcelo,
Arthur, pelo companheirismo, pela amizade e pela agradável convivência.
À Conceição Pimenta, que me mostrou como enfrentar as dificuldades inerentes da
vida.
As agências financiadoras: CNPq, FAPEMIG e ao Centro de Pesquisas René
Rachou-FIOCRUZ.
Sou eternamente grato a todas as pessoas que mesmo em sua mais breve
passagem ou curta convivência me ofereceram sua contribuição, de qualquer
natureza, para a realização deste trabalho.
Enfim, Agradeço a Deus, por estar sempre presente ao meu lado.... ter me dado
forças para superar os obstáculos durante o desenvolver deste trabalho.... e ter me
concedido a dádiva de conviver com pessoas tão especiais.
I
Sumário
Lista de Figuras........................................................................................................ V
Lista de Tabelas ..................................................................................................... XII
Lista de Diagramas ............................................................................................... XIII
Lista de Abreviaturas............................................................................................XIV
Resumo .................................................................................................................XVII
Abstract................................................................................................................XVIII
INTRODUÇÃO..........................................................................................................19
JUSTIFICATIVA........................................................................................................36
OBJETIVOS..............................................................................................................39
1 - Objetivo Geral ...................................................................................................40
2 - Objetivos específicos ........................................................................................40
MATERIAL E MÉTODOS .........................................................................................40
1 - Animais .............................................................................................................42
2 - Vacinas .............................................................................................................42
2.1 - LEISHVACIN.......................................................................................................................... 43
2.2 - LEISHMUNE
®
........................................................................................................................ 43
2.3 - Protocolos de Vacinação ....................................................................................................... 43
2.3.1 - Controles......................................................................................................................... 43
2.3.2 - Delineamento .................................................................................................................. 43
3 - Avaliação da Resposta Imune Celular ..............................................................44
3.1 - Resposta imune celular no contexto ex vivo ......................................................................... 44
3.1.1 - Obtenção do sangue periférico para imunofenotipagem................................................ 44
3.1.2 - Ensaio de imunofenotipagem celular no contexto ex vivo.............................................. 45
4 - Obtenção e análise de dados por citometria de fluxo .......................................48
4.1 - A técnica de imunofenotipagem empregando a citometria de fluxo...................................... 48
4.2 - Obtenção e análise dos dados no citômetro ......................................................................... 49
4.3 - Estratégias para análise imunofenotípica celular por citometria de fluxo no contexto ex vivo
.......................................................................................................................................................
50
4.4 - Avaliação em Neutrófilos ....................................................................................................... 50
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD18 ..................................... 50
Determinação da freqüência de neutrófilos MHCI
+
e CD32
+
..................................................... 51
Determinação da freqüência de neutrófilos MHCII
+
................................................................... 52
4.5 - Avaliação em Eosinófilos....................................................................................................... 53
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD18 ..................................... 53
Determinação da freqüência de eosinófilos MHCI
+
e CD32
+
..................................................... 54
Determinação da freqüência de eosinófilos MHCII
+
.................................................................. 56
4.6 - Avaliação em Monócitos........................................................................................................ 57
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD18 ..................................... 57
Determinação da freqüência de monócitos MHCI
+
, MHCII
+
e CD32
+
........................................ 57
4.7 - Avaliação em Linfócitos ......................................................................................................... 59
Determinação da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD5
+
) ......................................................... 59
Determinação da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD5
+Low
)..................................................... 60
Determinação da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD4
+
) e (CD3
+
CD8
+
)................................. 61
Determinação da freqüência de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
expressando CD18......................... 62
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de MHCII em linfócitos T CD4
+
e
CD8
+
........................................................................................................................................... 64
Determinação da freqüência de linfócitos B............................................................................... 65
II
Determinação da freqüência de linfócitos B CD32
+
................................................................... 65
5 - Resposta imune celular no contexto in vitro......................................................66
5.1 - Preparação do Antígeno Solúvel de Leishmania (ASL) utilizado na estimulação das culturas
de CMSP........................................................................................................................................
67
5.1.1 - Obtenção da massa de promastigotas ........................................................................... 67
5.1.2 - Preparo do Antígeno Solúvel de Leishmania (ASL) ....................................................... 68
5.2 - Obtenção de leucócitos do sangue periférico para fenotipagem no contexto in vitro........... 68
5.3 - Ensaio de imunofenotipagem celular e marcação de citocinas intracitoplasmáticas no
contexto in vitro..............................................................................................................................
70
5.4 - Estratégia de análise de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo em culturas de
CMSP.............................................................................................................................................
73
Determinação da freqüência de linfócitos T CD4
+
e linfócitos T CD8
+
expressando citocinas
intracitoplasmáticas (INF-
, IL-4)................................................................................................ 73
6 - Avaliação da produção de óxido nítrico por células mononuclerares do sangue
periférico.................................................................................................................
74
7 - Antigenicidade avaliada através da citometria de fluxo e da Reação de
Imunofluorescência indireta (RIFI) .........................................................................75
7.1 - Pesquisa de anticorpos da classe IgG e subclasses IgG1 e IgG2 pela citometria de fluxo . 75
7.1.1 - Obtenção de formas promastigotas de Leishmania chagasi para utilização como
antígeno......................................................................................................................................
75
7.2 - Preparação das amostras de plasma para avaliação pela citometria de fluxo ..................... 76
7.3 - Metodologia empregada para a avaliação da reatividade de IgG e subclasses IgG1 e IgG2
de cães vacinados a formas promastigotas de L. chagasi............................................................
76
7.4 - Aquisição e análise dos dados da pesquisa de reatividade de IgG e subclasses IgG1 e IgG2
de cães vacinados a formas promastigotas de L. chagasi............................................................
77
8 - Pesquisa de anticorpos da classe IgG pela Reação de Imunofluorescência
Indireta (RIFI) .........................................................................................................79
9 - Análise estatística dos dados............................................................................79
RESULTADOS..........................................................................................................80
I . Cinética do perfil hematológico do sangue periférico canino no contexto ex-
vivo, desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
....81
I.1. Cinética do perfil hematológico desencadeada pela imunização com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
: ênfase em subpopulações leucocitárias. ...82
II . Cinética do perfil imunofenotípico de leucócitos do sangue periférico
canino no contexto ex-vivo, desencadeada pela imunização com a
LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
...............................................................................85
II.1. Cinética do perfil fenotípico de leucócitos do sangue periférico canino,
desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
:
ênfase na resposta imune inata (NEUTRÓFILOS, EOSINÓFILOS, MONÓCITOS)
...............................................................................................................................86
II.1.1 - Cinética de alterações imunofenotípicas em NEUTRÓFILOS circulantes de cães
submetidos à vacinação.................................................................................................................
86
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em NEUTRÓFILOS.................................................. 86
Percentual de NEUTRÓFILOS MHCI
+
....................................................................................... 87
Percentual de NEUTRÓFILOS MHCII
+
...................................................................................... 87
Percentual de NEUTRÓFILOS CD32
+
....................................................................................... 87
II.1.2- Cinética de alterações fenotípicas em EOSINÓFILOS circulantes de cães submetidos à
vacinação. ......................................................................................................................................
90
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em EOSINÓFILOS................................................... 90
Percentual de EOSINÓFILOS MHCI
+
........................................................................................ 90
Percentual de EOSINÓFILOS MHCII
+
....................................................................................... 90
Percentual de EOSINÓFILOS CD32
+
........................................................................................ 91
III
II.1.3 - Cinética de alterações fenotípicas em MONÓCITOS circulantes de cães submetidos à
vacinação. ......................................................................................................................................
93
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em MONÓCITOS..................................................... 93
Percentual de MONÓCITOS MHCI
++
......................................................................................... 93
Percentual de MONÓCITOS MHCII
+
......................................................................................... 93
Percentual de MONÓCITOS CD32
+
......................................................................................... 94
III . Caracterização de aspectos fenotípicos de células envolvidas na
IMUNIDADE ADAPTATIVA de cães imunizados com a LEISHVACIN e
LEISHMUNE®: ênfase em LINFÓCITOS T e LINFÓCITOS B................................96
III.1- Cinética de alterações imunofenotípicas em LINFÓCITOS T circulantes de
cães submetidos à vacinação. ...............................................................................97
III.1.1 - Percentual de LINFÓCITOS T(CD3
+
CD5
+
) ....................................................................... 97
III.1.2 - Percentual de subpopulação LINFÓCITOS T (CD3
+
CD5
+Low
) .......................................... 97
III.1.3– Percentual de subpopulações de LINFÓCITOS T CD4
+
................................................... 99
III.1.4 – Percentual de subpopulações de LINFÓCITOS T CD8
+
.................................................. 99
III.2- Percentual de LINFÓCITOS B .....................................................................100
III.2.1- Percentual de LINFÓCITOS B CD32
+
.............................................................................. 100
III.3- Razão entre a Freqüência de LINFÓCITOS T e B (Razão LT/LB)...............101
III.4- Razão entre a Freqüência de LINFÓCITOS T CD4
+
e CD8
+
(Razão
CD4
+
/CD8
+
)..........................................................................................................101
III.5- Cinética de alterações imunofenotípicas em moléculas de adesão e de
ativação em LINFÓCITOS circulantes. ................................................................103
III.5.1- Percentual de LINFÓCITOS T CD4
+
CD18
+
..................................................................... 103
III.5.2- Percentual de LINFÓCITOS T CD8
+
CD18
+
...................................................................... 103
III.5.3.- Densidade de Expressão de MHCII (IMF) em LINFÓCITOS T CD4
+
............................. 103
III.5.4.- Densidade de Expressão de MHC II (IMF) em LINFÓCITOS T CD8
+
............................ 104
IV. Impacto da imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE® no perfil
de síntese de citocinas em linfócitos do sangue periférico, após estimulação
antígeno-específica in vitro..................................................................................106
IV.1- Avaliação do impacto da imunização no perfil de síntese de citocinas
intracitoplasmáticas do Tipo 1 (IFN ) e do Tipo 2 (IL-4) por linfócitos T CD4
+
e
CD8
+
do sangue periférico, após estimulação de CMSP com antígeno-específico in
vitro; .....................................................................................................................
107
IV.1.1- Perfil de expressão de IFN- e IL-4 intracitoplasmático por Linfócitos ............................ 108
IV.1.2- Análise da razão de expressão de IFN- e IL-4 intracitoplasmática por Linfócitos T ...... 110
IV.1.3- Perfil de expressão de IFN- intracitoplasmático por Linfócitos T CD4
+
e CD8
+
............. 111
IV.1.4- Perfil de expressão de IL-4 intracitoplasmático por Linfócitos T CD4
+
e CD8
+
............... 113
V. Impacto da imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE® na
produção de Óxido Nítrico por células mononucleares do sangue periférico,
após estimulação antígeno-específica in vitro...................................................115
V.1- Avaliação do impacto da imunização na produção de Óxido Nítrico no
sobrenadante de cultura de CMSP do sangue periférico de cães submetidos à
vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
, após estimulação de com antígeno-
específico in vitro..................................................................................................116
V.1.1- Dosagem dos níveis de Nítrito (NO
-2
) ............................................................................... 116
VI. Impacto da imunização no perfil de reatividade de imunoglobulinas séricas
anti-Leishmania, através da pesquisa de IgG e subclasses IgG1 e IgG2 anti-
formas promastigotas fixadas de L. chagasi......................................................118
IV
VI.1- Avaliação da capacidade antigênica das vacinas LEISHMUNE
®
e
LEISHVACIN em induzir a reatividade de imunoglobulinas (IgG e subclasses IgG1
e IgG2) anti-L. chagasi fixada...............................................................................119
VII. Síntese dos Resultados..................................................................................127
VII.1- Alterações imunofenotípicas em células da imunidade inata......................128
VII.2- Alterações imunofenotípicas em células da imunidade adaptativa.............129
VII.3- Perfil de síntese de citocinas intracitoplasmática em linfócitos “in vitro”.....131
VII.4- Produção de Óxido Nítrico por células mononucleares do sangue periférico,
após estimulação antígeno-específica “in vitro”. ..................................................133
VII.5- Reatividade de IgG e subclasses IgG1 e IgG2 anti-formas promastigotas
fixadas de L. chagasi............................................................................................133
DISCUSSÃO...........................................................................................................136
EVIDÊNCIAS e CONCLUSÃO................................................................................159
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................162
ANEXO ...................................................................................................................179
Anexo A - Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG
(CEUA/UFMG) .....................................................................................................180
V
Lista de Figuras
Figura 1 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade
média de fluorescência (IMF) de CD18
em neutrófilos do sangue periférico de
cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. ..........................51
Figura 2 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
neutrófilos MHCII
+
e CD32
+
no sangue periférico de cães Imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
..................................................................52
Figura 3 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
neutrófilos MHCII
+
no sangue periférico de cães Imunizados com a LEISHVACIN
e com a LEISHMUNE
®
........................................................................................53
Figura 4 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade
média de fluorescência (IMF) de eosinófilos CD18 no sangue periférico de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
....................................54
Figura 5 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
eosinófilos MHCII
+
e CD32
+
no sangue periférico de cães Imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
..................................................................55
Figura 6 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
eosinófilos MHCII
+
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN
e com a LEISHMUNE
®
........................................................................................56
Figura 7 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade
média de fluorescência (IMF) de CD18
em monócitos do sangue periférico de
cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. ..........................57
Figura 8 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
monócitos MHCI
+
, MHCII
+
e CD32
+
no sangue periférico de cães imunizados
com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. ......................................................58
Figura 9 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
linfócitos T CD3
+
CD5
+
, no sangue periférico de cães imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
..................................................................60
Figura 10 - Seqüência de procedimentos utilizados para caracterizar a população de
linfócitosCD3
+
CD5
+Low
no sangue periférico de cães imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
..................................................................61
VI
Figura 11 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
linfócitos T CD3
+
CD4
+
e infócitos T CD3
+
CD8
+
, no sangue periférico de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
....................................62
Figura 12 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
linfócitos TCD4
+
CD18
+
e T CD8
+
CD18
+
no sangue periférico de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
....................................63
Figura 13 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade
média de fluorescência (IMF) de MHCII
em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
do sangue
periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.......64
Figura 14 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
linfócitos B no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com
a LEISHMUNE
®
...................................................................................................65
Figura 15 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
linfócitos B CD32
+
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN
e com a LEISHMUNE
®
........................................................................................66
Figura 16 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
linfócitos T CD4
+
IFN-
+
e TCD4
+
IL-4
+
na cultura de CMSP de cães imunizados
com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. ......................................................74
Figura 17 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
parasitos fluorescentes........................................................................................78
Figura 18 - Gráficos de densidade representativos da imuofenotipagem de linfócitos
do sangue periférico canino. ...............................................................................98
Figura 19 - Análise de correlação de Pearson entre os valores referentes à
freqüência percentual de linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
e linfócitos T CD8
+
no sangue
periférico de cães vacinados com a LEISHMUNE
®
no tempo intermediário pós-
vacinal (2ª Dose). Os valores de “r” e “p” estão inseridos na figura. .................100
Figura 20 - Freqüência de linfócitos T IFN-
em células mononucleares do sangue
periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a
LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in
vitro....................................................................................................................
108
Figura 21 - Freqüência de linfócitos T IL-4
+
em células mononucleares do sangue
periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a
VII
LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in
vitro....................................................................................................................109
Figura 22 - Razão entre linfócitos T IFN-
+
/IL-4
+
em células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais
imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo
de cinco dias, in vitro.........................................................................................110
Figura 23 - Freqüência de linfócitos T CD4
+
INF-
+
em células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais
imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo
de cinco dias, in vitro.........................................................................................111
Figura 24 - Freqüência de linfócitos T CD8
+
INF-
em células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais
imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo
de cinco dias, in vitro.........................................................................................112
Figura 25 - Freqüência de linfócitos T CD4
+
IL-4
+
em células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais
imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo
de cinco dias, in vitro.........................................................................................113
Figura 26 - Freqüência de linfócitos T CD8
+
IL-4
+
em células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais
imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo
de cinco dias, in vitro.........................................................................................
114
Figura 27 - Concentração nitrito M no sobrenadante de culturas de células
mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e
animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6),
após cultivo de cinco dias, in vitro. ....................................................................116
Figura 28 - Concentração nitrito M/monócitos em culturas de células
mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e
animais imunizados com a LEISHVACIN (n=3) e com a LEISHMUNE
®
(n=3),
após cultivo de cinco dias, in vitro. ....................................................................
117
Figura 29 - Reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi,
avaliada através da reação de imunofluorescência convencional (RIFI) em soros
de cães imunizados com a LEISHVACIN ( ) e com a LEISHMUNE
®
( ). ..120
VIII
Figura 30 - Reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi,
avaliada por citometria de fluxo.........................................................................121
Figura 31 - Reatividade de IgG1 anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi,
avaliada por citometria de fluxo.........................................................................122
Figura 32 - Reatividade de IgG2 anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi,
avaliada por citometria de fluxo.........................................................................123
Figura 33 - Correlações entre reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas
de L. chagasi, avaliada por citometria de fluxo para LEISHVACIN ( ) e
LEISHMUNE
®
( ) e parâmetros da imunidade celular. .....................................125
XII
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Painel de Anticorpos monoclonais utilizados nos ensaios de
imunofenotipagem celular no contexto ex vivo....................................................47
Tabela 2 - Painel de Anticorpos monoclonais utilizados nos ensaios de
imunofenotipagem celular e marcação de citocinas intracitoplasmáticas no
contexto in vitro - Cultura de CMSP ....................................................................72
Tabela 3 - Leucometria do sangue periférico de cães submetidos à vacinação com
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
............................................................................84
Tabela 4 - Cinética de alterações fenotípicas em NEUTRÓFILOS circulantes de cães
submetidos à vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
. ............................89
Tabela 5 - Cinética de alterações fenotípicas em EOSINÓFILOS circulantes de cães
submetidos à vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
. ............................92
Tabela 6 - Cinética de alterações fenotípicas em MONÓCITOS circulantes de cães
submetidos à vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
. ............................95
Tabela 7 - Cinética de alterações fenotípicas em LINFÓCITOS circulantes de cães
submetidos à vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
. ..........................102
Tabela 8 - Cinética de alterações fenotípicas em moléculas de adesão e ativação de
LINFÓCITOS circulantes de cães submetidos à vacinação com LEISHVACIN e
LEISHMUNE
®
....................................................................................................105
XIII
Lista de Diagramas
Diagrama 1 - Desenho experimental no contexto ex vivo .........................................45
Diagrama 2 - Desenho experimental no contexto in vitro – Cultura de CMSP..........67
Diagrama 3 - Alterações imunofenotípicas em células da imunidade inata induzidas
pelo processo vacinal........................................................................................129
Diagrama 4 - Alterações imunofenotípicas em células da imunidade adaptativa
induzidas pelo processo vacinal........................................................................
130
Diagrama 5 - Alterações no perfil e no balanço de citocinas induzidas pelo processo
vacinal. ..............................................................................................................132
Diagrama 6 - Alterações na produção de Óxido Nítrico (NO) induzidas pelo processo
vacinal. ..............................................................................................................133
Diagrama 7 - Reatividade de IgG e suas subclasses IgG1 e IgG2 anti-formas
promastigotas fixadas de L. chagasi avaliada por citometria de fluxo, induzidas
pelo processo vacinal com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
..................135
XIV
Lista de Abreviaturas
Ac Anticorpo
Ag Antígeno
APC Célula apresentadora de antígeno
ASL Antígeno Solúvel de Leishmania
BCG Bacilo de Clamétte-Guérin
ºC Graus Celsius
CMSP Células mononucleares do sangue periférico
CD Grupamento de diferenciação
CD14 Marcador de superfície celular da população de monócitos
CD18 Marcador de molécula de adesão
CD3 Marcador de superfície celular da população de linfócitos T
CD32 Marcador de receptor de imunoglobulina
CD4 Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
auxiliares / indutores
CD5 Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
CD8 Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
citotóxicos / supressores
CMBlast Meio de cultura celular
CMF Canal Médio de Fluorescência
CPqRR Centro de Pesquisas René Rachou
DCs Células dendríticas
EDTA Ácido etileno diamino tetraacético
FACS Fluorecence Acitivated Cell Sorter
Fc Fração cristalizável de imunoglobulinas
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
FITC Isotiocianato de fluoresceína
FL Fluorescência
FL1 Fluorescência do tipo 1
FL2 Fluorescência do tipo 2
FL3 Fluorescência do tipo 3
FML Fucose Manose Ligante
XV
FSC Forward Angle Light Scatter (Tamanho celular)
FUNASA Fundação Nacional de Saúde
gp63 Glicoproteína 63 KD
HLA-DR Antígeno Leucocitário Humano
ICB Institutuo de Ciências Biológicas (UFMG)
IDR Intradermorreação de Montenegro
IFN- Interferon gamma
Ig Imunoglobulinas
IgE Imunoglobulina E
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL Interleucina
IMF Intensidade Média de Fluorescência
LB Linfócitos B
LIT Meio de cultura de Infusão de fígado e Triptose
LPG Lipofosfoglicano
LPS Lipopolisacarídeo
LT Linfócitos T
LV Leishmaniose visceral
LVC Leishmaniose visceral canina
MFF Solução fixadora
MHC I Complexo principal de histocompatibilidade do tipo I
MHC II Complexo principal de histocompatibilidade do tipo II
mL mililitro
NNN/LIT Meio de cultivo bifásico Nicole, Novy e Neal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
PBS Salina tamponada com fosfato
PE Ficoeritrina
pH Potencial Hidrogênionico
PMA Acetato mirístico de forbol
PMN Polimorfonuclear
RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta
XVI
RIO Reativos intermediários do oxigênio
SFB Soro Fetal Bovino
SSC Side Angle Light Scatter (Granulosidade celular)
Th Células T helper
Th1 Celulas T CD4
+
secretoras do padrão 1 de citocinas
Th2 Celulas T CD4
+
secretoras do padrão 2 de citocinas
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
WHO Organização Mundial da Saúde
L microlitro
XVII
Resumo
A leishmaniose visceral causada por Leishmania chagasi representa, no âmbito da interação parasito-
hospedeiro, uma cadeia composta pela tríade homem-vetor-cão, na qual, os canídeos representam
papel relevante, como reservatórios no elo da transmissão para o homem. Nesse contexto, a
imunoprofilaxia vacinal aplicada em cães por meio de duas vacinas: LEISHVACIN (antígeno bruto de
promastigotas L. amazonensis associado ao BCG) e LEISHMUNE
®
(antígeno fucose-manose-ligante-
FML associado a saponina) apresentam-se como importante medida de controle da infecção através do
estabelecimento de mecanismos imunoprotetores. Embora eventos imunológicos distintos pareçam estar
envolvidos no processo de imunização com a LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
, os resultados apresentados
até o momento foram gerados através de protocolos experimentais não pareados, o que não permite
uma comparação cientificamente fundamentada. Assim, este estudo se propôs caracterizar por meio de
um protocolo unificado, os aspectos imunológicos associados à imunoprofilaxia com esses dois
imunbiológicos. Para tal, dois grupos de doze cães da raça Pastor Alemão foram imunizados com três
doses da LEISHVACIN ou da LEISHMUNE
®
, em intervalos consecutivos de 21 dias. Aspectos celulares
e moleculares do sangue periférico dos cães vacinados foram avaliados antes e sete dias após cada
dose vacinal, incluindo o perfil fenotípico de leucócitos associados à imunidade inata e adaptativa, a
síntese antígeno-específica in vitro de IFN- e IL-4 intracitoplasmáticos e óxido nítrico por células
mononucleares, e o perfil da reatividade sérica de IgG anti-Leishmania chagasi. Nossos resultados
demonstraram perfil fenotípico distintos para as células da imunidade inata dependendo da vacina
utilizada. Enquanto a LEISHVACIN promoveu recrutamento precoce de Neutrófilos e Eosinófilos, com
envolvimento tardio de Monócitos a LEISHMUNE
®
induziu um recrutamento precoce de Neutrófilos e
monócitos, sem envolvimento de Eosinófilos. No âmbito da imunidade adaptativa observamos também
um envolvimento seletivo de populações celulares. A LEISHVACIN promoveu uma resposta de perfil
misto, associada à ativação de linfócitos T e linfócitos B, com ativação precoce de linfócitos T CD4
+
e
tardia de linfócitos T CD8
+
, avaliadas pela alteração na expressão de MHC II. Por outro lado, a
LEISHMUNE
®
promoveu uma resposta de perfil mais seletivo, associada à ativação preferencial de
linfócitos T, com ativação tardia de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
. Análise de aspectos funcionais de
leucócitos circulantes confirmou o perfil misto induzido pela LEISHVACIN, com o aumento paralelo de
IFN e de IL-4. Por outro lado o perfil mais direcionado da LEISHMUNE
®
foi confirmado pela expressão
seletiva de IFN. Esse perfil, mais favorável à imunidade celular, desencadeado pela LEISHMUNE
®
foi
adicionalmente caracterizado pela maior síntese in vitro de NO antígeno-específico (M/monócitos).
Embora todos os cães imunizados apresentaram soroconversão pelos métodos convencionais (RIFI), a
avaliação da reatividade de IgG por citometria de fluxo (PPFP), segundo proposto por Carvalho-Neta et
al. (2006), demonstrou um perfil distinto de reatividade imuológica pós-vacinal, com sorocorvesão de
66,6% para a LEISHVACIN e 33,3% para a LEISHMUNE
®
. Em análise subseqüente, observamos uma
correlação positiva entre os valores de PPFP e o %CD8
+
IL-4
+
para a LEISHVACIN enquanto uma
correlação negativa entre PPFP e CD4
+
IL-4
+
foi observada para a LEISHMUNE
®
. Atribuímos o perfil
distinto de ativação do sistema imune relacionado as vacinas LEISHVACIN (misto – celular/humoral)
versus LEISHMUNE
®
(seletivo – celular), possa ser uma conseqüência direta da natureza antigênica
(complexa versus purificada) bem como do adjuvante empregado na composição vacinal.
Palavras-chave:
leishmaniose visceral canina, LEISHVACIN; LEISHMUNE
®
; imunofenotipagem, citocinas, oxido nítrico, imunoglobulina G.
XVIII
Abstract
Visceral leishmaniasis is caused by Leishmania chagasi. The host-parasite interaction (human- vector-
dog), the last one represent a relevant play as reservoirs in the transmission to humans. In this context,
two immmunobiologics were used as dog`s vaccine immunoprofylaxis: LEISHVACIN (promastigote
antigen of L. amazonensis associated to BCG) and LEISHMUNE
®
( fucose-mannose- binding FML
associated with saponin) are known as an important control strategies of infection, creating a mechanism
of immune protection. Although distinct immune events seam to be related to the immune response
process caused by LEISHMUNE
®
, the recent data were generated by not paired experimental protocols,
so a fundamental scientific comparison is not allowed. In this study, it considered the characterization by
unified protocols, the immune aspects associated to these immunobiologics. For such, two groups of
twelve dogs each were immunized with tree doses of LEISHVACIN or LEISHMUNE
®
, in 21 days
consecutives intervals. The peripherical blood of immunized dogs was evaluated by 1) cellular and
molecular aspects seven days before and after each dose, including the phenotypic traits of leucocytes
associated to the innate and adaptative immunity, 2) the antigen specific synthesis in vitro of INF- and IL-
4 intracytoplasmatics and nitric oxide by mononuclear cells and 4) the trait of serical reactivity of igG anti-
Leishmania chagasi. Our results demonstrate a distinct phenotypic trait of cells associated to the innate
immunity related to the immunobiologics used. While LEISHVACIN promoted an early conscription of
neutrophils and eosinophils with a late involvement of monocytes, LEISHMUNE
®
induced an early
conscription of neutrophils and monocytes with no eosinophils involvement. Under the adaptive immunity
scope a selective cell populations were observed. The LEISHVACIN promoted a mixed trait of immune
response associated to an early lymphocyte TCD4 and a late T CD8 activation, evaluated by the
alteration in the MHC II expression. On the other hand, the LEISHMUNE
®
promoted a more selective
trait, associated mainly to lymphocytes activation and a delayed one of lymphocytes T CD4 e TCD8.
Analyses of the functional aspects of circulating leucocytes, confirmed the mixed trait induced by
LEISHVACIN with a parallel increase of IFN- and IL-4. The directed trait of LEISHMUNE
®
was confirmed
by the selective expression of INF-. This trait more favorable to cellular immunity unchained by
LEISHMUNE
®
was additionally characterized by the increase in vitro of NO antigen- specific
(M/monocytes).Although all dogs immunized presented seroconversion in the conventional methods
(RIFI), the reactivity activation of IgG by flow cytometry (PPFP), as proposed by Carvalho-Neta et al
(2006), demonstrated a distinct trait of immunologic reativity pos-vaccine, with seroconversion of 66,6 %
for LEISHVACIN and 33,3% for LEISHMUNE
®
. In subsequent analyses, we observed a positive
correlation between the values of PPFP and the %CD8
+
IL-4 for LEIHSVACIN while a negative correlation
between PPFP and CD4
+
IL-4
+
was observed for LEISHMUNE
®
. We attribute this distinct activation of the
immune system to the immunobiologic LEISHVACIN (mixed-cellular/humoral) versus LEISHMUNE
®
(Selective-cellular) can be a direct consequence of the antigenic nature (complex versus purified) as well
as the adjuvante used in the vaccine compound.
Keywords: visceral leishmaniasis canine, LEISHVACIN,
LEISHMUNE
®
, immunophenotyping citokines, nitric oxide, immunoglobulin G
INTRODUÇÃO
Introdução
20
As leishmanioses são um complexo de doenças parasitárias causadas por
protozoários pertencentes ao gênero Leishmania (Ross, 1903), família
Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida. O gênero Leishmania compreende
parasitos heteroxênicos de hospedeiros mamíferos, dentre eles homens, cães e
roedores. Os insetos vetores são flebotomíneos da família Psychodidae, subfamília
Phlebotominae, pertencentes aos gêneros Phlebotomus e Lutzomyia (LAINSON &
SHAW 1987).
Atualmente as leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de pessoas em 88
países, estimando-se que 350 milhões de pessoas estão expostas ao risco de
infecção por diferentes espécies de Leishmania. A incidência anual de novos casos
no mundo encontra-se em torno dois milhões (1,5 milhões de leishmaniose
tegumentar e 500.000 de leishmaniose visceral). Como em outras doenças tropicais
as leishmanioses estão relacionadas ao desenvolvimento econômico e a mudanças
ambientais humanas que promovem a exposição de hospedeiros susceptíveis aos
insetos vetores infectados (WHO, 2005). Embora as leishmanioses sejam
consideradas doenças rurais, o recente aparecimento destas enfermidades em
grandes centros urbanos e a re-emergência em várias cidades do mundo representa
um problema de saúde pública emergente (ASHFORD, 2000).
No ciclo biológico os parasitos sob a forma de amastigotas, presentes no
hospedeiro vertebrado, são ingeridos pelas fêmeas de flebotomíneos durante o
repasto sangüíneo. No vetor estas formas transformam-se em promastigotas que se
multiplicam e passam por uma série de mudanças morfológicas e fisiológicas que
levam a adesões ao tubo digestivo do inseto. No final deste processo ocorre a
metacilogênese com aparecimento de formas promastigotas metacíclicas que
migram para o tubo digestivo anterior. Ao realizar um novo repasto sanguíneo, as
formas infectantes são inoculadas na pele do hospedeiro vertebrado. Neste
momento, os parasitos são internalizados por células fagocitárias,
predominantemente macrófagos, onde, após transformarem em formas amastigotas,
resistentes à ação das enzimas lisossomais, residem e se multiplicam no interior de
fagolisossomos (CHANG, 1983). A intensa proliferação das amastigotas dentro do
macrófago favorece o rompimento da membrana celular e a liberação de parasitos,
Introdução
21
os quais infectam rapidamente outros macrófagos, protegendo-se da ação do
complemento e de anticorpos, podendo iniciar nova fase de multiplicação.
As leishmanioses podem apresentar um amplo espectro de formas clínicas,
desde uma lesão cutânea localizada, com cura espontânea a uma doença sistêmica
generalizada. As diferentes manifestações clínicas das leishmanioses dependem de
vários fatores tais como: espécie de Leishmania envolvida e sua virulência e
aspectos relacionados ao condição nutricional e imunológico do hospedeiro. As
leishmanioses são classificadas em quatro principais formas clínicas denominadas:
leishmaniose cutânea localizada, leishmaniose cutâneo-mucosa, leishmaniose
cutânea difusa e leishmaniose visceral (LV), sendo que no Novo Mundo as três
primeiras formas são agrupadas em uma única denominação conhecida por
leishmaniose tegumentar americana (LTA). A LTA pode ser causada por várias
espécies de Leishmania incluindo L. (Leishmania) mexicana, L. (L.) amazonenesis,
L. (L.) venezuelensis, L. (Viania) braziliensis, L. (V.) panamensis, L. (V.) guyanensis,
L. (V.) peruviania, L. (V.) lainsoni e L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi e L. (V.) lindenberge
(HERWALDT, 1999). A forma clínica visceral é causada pelas espécies Leishmania
(Leishmania) donovani e L. (L.) infatum no velho mundo, atingindo partes do
continente asiático, africano e europeu. No novo mundo, a Leishmania (L.) chagasi é
o agente etiológico da LV. Este parasito possui um tropismo tecidual, estabelecendo-
se primariamente, em órgãos viscerais como o fígado e baço, bem como na medula
óssea. A lesão primária na pele é raramente observada e uma porcentagem
substancial de infecções parecem ser assintomáticas ou auto-resolutivas (JAFFE &
GREENBLAT, 1991). Já a doença ativa, conhecida como leishmaniose visceral
clássica, quando não tratada, pode levar ao óbito. Em geral, pacientes portadores da
leishmaniose visceral clássica apresentam febre, hepatoesplenomegalia, perda de
peso, linfoadenopatia, anemia e leucopenia (DEANE & GRIMALDI JR, 1985;
BADARO et al., 1986).
Em relação aos reservatórios da leishmaniose visceral humana no velho
mundo, vale a pena enfatizar a ocorrência de ciclo antropofílico na Índia, onde o
homem é o único hospedeiro mamífero encontrado infectado por L. donovani, não
tendo sido identificado até o momento animais com o papel de reservatório. Sendo
assim, a infecção parece ocorrer num ciclo entre os seres humanos sem a presença
relevante de um animal reservatório para L. donovani (PALATNIK DE SOUZA et al.,
Introdução
22
2001). No caso da L. infantum, o cão, é o principal hospedeiro domestico,
reservatório para infecção humana em áreas rurais próximas ao centros urbanos
(MOLANO et al., 2003). No ciclo silvestre da L. chagasi, as raposas Dusicyon
ventulus, no nordeste do Brasil (DEANE & DEANE, 1962), e Cerdocyon thous, na
região norte do Brasil (LAINSON et al., 1969) são, até o momento, supostos
hospedeiros silvestres. No ciclo rural e urbano da L. chagasi, os hospedeiros
vertebrados reconhecidos como reservatórios, a semelhança da L. infantum, estão
limitados a mamíferos pertencentes à família Canidae (DEANE & DEANE, 1954;
SILVA et al., 2001). Nesse contexto, o cão vem sendo apontado como o mais
importante reservatório, considerando, principalmente o intenso parasitismo cutâneo
que ocorre nestes animais e também o grande número de casos de leishmaniose
visceral canina (LVC) (DEANE & DEANE, 1955; KEENAN et al., 1984;
ABRANCHES, 1991; COSTA et al., 1999; REIS et al., 2006). Sendo assim, o cão
representa uma abundante fonte de infecção para os hospedeiros invertebrados,
demonstrando a sua importância como elo na manutenção da transmissão da
infecção para o homem. Estes animais têm sido encontrados em todos os focos da
doença humana, sendo considerados o principal elo na cadeia de transmissão da
leishmaniose visceral.
Os trabalhos sobre a infecção canina por parasitos do gênero Leishmania
abordam em sua maioria basicamente dois aspectos: o cão como modelo
experimental para o estudo da leishmaniose visceral humana e investigações
inerentes ao cão como hospedeiro/reservatório visando o desenvolvimento de
programas de controle da LV humana (DEPLAZES et al., 1995; HOMMEL et al.,
1995; SANTOS-GOMES et al., 2000). Os programas que buscam o desenvolvimento
de medidas profiláticas e de controle para as doenças parasitárias humanas
baseiam-se, geralmente, nas condições epidemiológicas em que as mesmas se
desenvolvem. No contexto da LV, uma das principais ações até então empregadas é
a detecção e eliminação dos cães sorologicamente positivos (ALENCAR, 1961).
Entretanto, o sacrifício dos animais soro positivos provoca um profundo impacto e
indignação aos proprietários, em face ao papel que o cão representa na sociedade
atual, não só no valor afetivo como na prática de segurança da população. Uma
alternativa para evitar o sacrifício dos animais acometidos pela LVC seria a busca de
medidas terapêuticas ou imunoprofiláticas.
Introdução
23
O emprego de medidas terapêuticas teria como finalidade a recuperação dos
cães infectados e isto acarretaria o controle profilático da infecção humana
(ALENCAR, 1959). Entretanto, as tentativas de tratamentos com de drogas
comercialmente utilizadas com eficácia em humanos, não têm obtido êxito na
terapêutica em cães; segundo MARZOCHI et al. (1985), o insucesso da
antimonioterapia em cães poderia ser explicado em parte por uma alta excreção
renal do antimônio, por um diferente metabolismo desta droga no fígado ou também
por uma resposta imune não usual nos animais infectados. Sendo assim, o
tratamento da LVC ainda constitui um desafio para a ciência, estimulando diversos
grupos de pesquisa nesta área de estudo.
Considerando que a prática quimioterápica na LVC é ainda ineficaz e que na
profilaxia da LV as medidas antivetoriais são pouco eficientes, a aplicação de
medidas imunoprofiláticas apresenta-se como um importante fator a ser considerado
para controlar a infecção canina. Para MARZOCHI et al. (1985), a possibilidade de
aplicação de uma vacina para o controle da LVC seria, uma importante medida
sanitária, economicamente viável, uma vez que tal vacina poderia ser aplicada
juntamente com a vacina anti-rábica, cujo programa no Brasil tem sido bem
sucedido. Segundo DUNAN et al. (1989), no caso da LVC, a imunoprofilaxia
apresenta como uma das únicas alternativas para o controle da infecção. Alguns
estudos já foram realizados com o intuito de desenvolver uma vacina anti-LVC;
porém, estes apresentaram resultados controversos ou pouco conclusivos, o que
tem incentivado a busca de novos imunógenos que possam proporcionar uma
intervenção vacinal eficaz para o controle da LVC.
Em relação aos imunobiológicos empregados em intervenções vacinais na
LVC podemos agrupá-los em três classes, que representam diferentes gerações de
antígenos vacinais no que se refere ao processo de produção. A primeira geração,
que se inicia com os primeiros estudos de vacinação contra a leishmaniose cutânea
humana por SALLES-GOMES (1939) e PESSOA et al. (1940) e se estende ate os
dias atuais, porém com menor intensidade, nos quais foram empregadas
preparações antigênicas tipicamente constituídas por antígenos brutos, obtidos
através de técnicas de atenuação ou fixação dos agentes etiológicos de interesse. A
partir dos anos 90, com o avanço das técnicas de biologia molecular começaram a
surgir os primeiros candidatos constituídos por subunidades definidas, denominados
Introdução
24
antígenos recombinantes que marcariam a segunda geração de vacinas. Segundo
SANTOS et al. (2002), as vacinas de segunda geração incluíram ainda, bactérias ou
vírus recombinantes que carreariam genes que codificariam antígenos de
Leishmania, além de utilização de vacinas vivas, com Leishmania geneticamente
modificada, e que causaria infecção abortiva no homem (CRUZ et al., 1991). Mais
recentemente, no final dos anos 90, com o avanço dos estudos do genoma de
diferentes agentes infecciosos começaram a surgir as vacinas de terceira geração
(vacinas de DNA), constituídas de genes que codificariam antígenos protetores,
clonados em vetores contendo promotores eucarióticos, as quais teriam uma
aplicação promissora no controle de diversas infecções (XU et al.,1994; ULMER et
al., 1996; HANDMAN et al., 2000). Além disso, elas poderiam oferecer diversas
vantagens quando comparadas às vacinas convencionais, como: estabilidade, baixo
custo, facilidade de manipulação e preparação de formas multigênicas; imunização
com DNA resultando na expressão de antígenos do parasito na sua forma nativa;
indução de uma resposta imune celular e humoral prolongada, devido a persistência
da expressão antigênica (GURUNATHAN et al., 2000).
Os estudos empregando candidatos à vacina para leishmaniose no âmbito
dos imunobiológicos de primeira geração têm mostrado alguns resultados
importantes. Na Europa, foi desenvolvida uma vacina, constituída de uma
preparação parcialmente purificada e liofilizada derivada de L. infantum, que quando
aplicada em modelo experimental murino foi capaz de proteger os camundongos
contra um desafio com L. mexicana e L. major (MONJOUR et al., 1985; FROMMEL
et al., 1988). Entretanto, quando avaliada experimentalmente em cães, foi observada
apenas uma elevada produção de anticorpos incapazes de controlar a infecção
(OGUNKOLADE et al., 1988). Em um outro estudo piloto, onde cães domésticos
residentes em área endêmica foram imunizados utilizando a mesma preparação
antigênica, foi observado que além de não conferir proteção nos animais vacinados,
promoveu um aumento da susceptibilidade dos cães à infecção (DUNAN et al.,
1989). Dentre inúmeros trabalhos que buscam o desenvolvimento de uma vacina de
primeira geração contra a LVC, no Brasil destaca-se os realizados pelo grupo de
leishmaniose do Departamento de Parasitologia da UFMG. Eles desenvolveram a
LEISHVACIN, uma vacina composta por antígeno de promastigotas sonicadas. Os
primeiros estudos desta vacina, que foram realizados em camundongos e humanos
Introdução
25
contra a leishmaniose tegumentar americana (LTA), ela era primariamente
constituída de cinco cepas de Leishmania (L. amazonesis, cepa BH8; L. major-Like,
cepa BH121; L. major-Like, cepa BH49; L. guyanensis, cepa M1176 e L.
amazonensis, cepa PH8). Contudo durante o encontro realizado em Belo Horizonte
pela organização mundial de saúde 1991 “Vaccine Advisory Group of Discussion”,
encontro que teve a participação de representante de organizações nacionais e
internacionais interessados no desenvolvimento de uma vacina contra LTA, foi
sugerido que os estudos desta vacina deveriam continuar, no entanto, usando
somente uma cepa de Leishmania, com a finalidade de padronizar a produção do
antígeno vacinal. Desta forma, a cepa PH8 de L. amazonensis foi escolhida devido
ao fato de seu antígeno bruto induzir altos índices de estimulação de linfócitos em de
pacientes voluntários “in vitro”, pelo fácil crescimento em cultura utilizando meio
acelular, além dessa cepa ser bem caracterizada taxonalmente (MAYRINK et al.,
1985; MAYRINK et al., 1986; MENDONÇA et al., 1995 GENARO et al., 1996;
MARZOCHI et al., 1998; MAYRINK et al., 2002).
Em 1996, MAYRINK e colaboradores realizaram um estudo no qual cães,
mantidos em canil, foram imunizados com antígeno bruto sonicado de L. braziliensis,
associado ao BCG (Bacillus Calmette-Guérin) como adjuvante. Os animais foram
posteriormente desafiados com L. chagasi. Ficou demonstrado neste estudo que os
cães que receberam vacina constituída de L. braziliensis tornaram-se protegidos
contra desafio com cepa heteróloga de L. chagasi (MAYRINK et al., 1996). Os cães
foram observados por 26 meses, com acompanhamento parasitológico e
imunológico a cada dois meses. Todos os cães controles, não vacinados,
desenvolveram infecção (9/9) enquanto apenas um dos cães vacinados desenvolveu
infecção patente (1/10). Os resultados mostraram proteção de 90% dos animais
vacinados, após 470 dias de acompanhamento. Nenhum animal que apresentava
habilidade em elaborar uma resposta de células T antígeno-específica, apresentou
sinais clínicos, enquanto todos os cães que apresentavam elevados níveis de
anticorpos anti-Leishmania tinham infecção patente. Estes resultados estimularam a
realização de dois ensaios vacinais em população de cães no município de Montes
Claros, MG, onde a LV é endêmica. Nesse estudo de campo foi observado, através
de ensaios de linfoproliferação in vitro, que o desenvolvimento da LVC estava
associado com uma inabilidade dos animais de montar resposta linfoproliferativa in
Introdução
26
vitro a antígenos de Leishmania. Entretanto, os resultados do teste de eficácia de
vacinação não demonstraram o estabelecimento de mecanismos protetores contra a
infecção por Leishmania na população vacinada em relação ao grupo controle. A
deficiência dos animais em estabelecer um padrão de resposta imune do tipo 1
poderia ter sido o responsável pelo insucesso da intervenção vacinal no estudo de
campo realizado em Montes Claros / MG (MAYRINK et al., 1996). Vale a pena
salientar, que os estudos feitos nestes trabalhos foram limitado pelas metodologias
disponíveis naquela data (anterior a 1996) para imunidade em cães, sendo assim
não foi possível à realização de uma avaliação mais detalhada da resposta imune
nos cães submetidos ao processo vacinal proposto por Mayrink et al., (1996) e
Genaro et al., (1996), desta forma estudos adicionais fazem-se necessários para
maior compreensão das falhas imunoterapêuticas observadas nesse estudo, bem
como para subsidiar a indicação da vacina acima citada para o controle da LVC.
Em relação a imunobiológicos da segunda geração, candidatos à vacina
contra a LVC, estudos desenvolvidos pelo nosso grupo em colaboração com a
HESKA Coorporation e o Infectious Disease Research Center (IDRI) – Seattle – USA
avaliou a eficácia de vacinas constituídas de combinação de antígenos definidos de
Leishmania, que favorecem o desenvolvimento de uma resposta linfocitária do tipo
1. As vacinas utilizados foram antígenos recombinantes LmSTI1 descrito por WEBB
et al. (1996) e LeIF descrito por SKEIKY et al. (1995). Neste trabalho FUJIWARA et
al. (2005) avaliaram aspectos da imunidade celular de cães submetidos a diferentes
esquemas de vacinação empregando estes imunógenos. Os autores observaram os
seguintes resultados: a avaliação do número absoluto de eosinófilos circulantes nos
animais imunizados foi menor que o grupo controle; em relação ao número de
linfócitos T absolutos circulantes não foi detectado uma grande variação nos
números de valores absolutos durante o período estudado que pudesse ser
associada a um perfil de imunoproteção ou susceptibilidade nos animais, sugerindo
que as vacinas utilizadas, embora induzam um estado de imunogenicidade
observada na sorologia e proliferação linfocitária, não alteraram ou então alteraram
discretamente o número absoluto de células T. Em relação as subpopulações de
linfócitos T os autores sugeriram que as vacinas utilizadas, alteraram o número de
células T CD4
+
e CD8
+
, sendo que redução do número de células CD4
+
foi
observada nos animais dos grupos imunizados com a combinação de três antígenos
Introdução
27
recombinantes (MAPS/TSA, LeIF e LmSTI1) e um aumento de células CD8
+
para os
grupos vacinados com associação de dois antígenos recombinantes (MAPS/TSA,e
LmSTI1) e com conseqüente alteração nos valores da razão CD4
+
/CD8
+
. No
entanto, essas alterações nas subpopulações de células T parecem não estar
associadas a um perfil de imunoproteção dos animais contra a infecção por
Leishmania. A análise dos resultados para linfócitos B CD21
+
demonstraram queda
nos valores absolutos dessas células para os grupos imunizados com vacinas, a
despeito de alta produção de anticorpos antígenos- específicos, refletindo no
aumento da razão entre linfócitos T e B. Quanto a população de monócitos
circulantes houve um aumento durante a etapa de vacinação, após a segunda dose,
para os grupos vacinais em relação ao controle. Os resultados obtidos por
FUJIWARA et al. (2005) mostraram que embora estes antígenos tenham sido
capazes de induzir um estado de imunogenicidade em cães vacinados, eles não
ofereceram proteção após o desafio experimental com 10
6
promastigotas de L.
chagasi por via endovenosa.
Mais recentemente, o laboratório Fort Dodge, adquiriu a patente de uma
vacina de segunda geração contra a LVC, conhecida por LEISHMUNE
®
; sendo esta
já licenciada pelo Ministério da Agricultura e disponível para comercialização, com
perspectiva de constituir uma ferramenta eficaz para o controle da LVC. A
LEISHMUNE foi desenvolvida pelo grupo de pesquisas da Dr
a
. Clarissa Palatnik de
Sousa, pesquisadora da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Esta vacina é
composta pelo antígeno complexo glicoprotéico ligante de fucose e manose (FML)
de Leishmania donovani e o adjuvante saponina. O antígeno de FML foi descrito em
1989 e isolado de promastigotas de L. donovani (PALATNIK et al., 1994; DA SILVA
et al., 2001). Essa fração glicoprotéica que contém fucose e manose foi denominada
FML e trata-se de um complexo que inibe fortemente a penetração de promastigotas
e amastigotas em macrófagos murinos in vitro de forma espécie específica
(PALATNIK et al., 1989; PALATNIK et al., 1993). O FML está presente na superfície
da Leishmania durante todo seu ciclo e é comum a todas as Leishmania do
complexo donovani, ou seja, é específico para as espécies que causam
leishmaniose visceral. A saponina por sua vez é um potente adjuvante com
capacidade de estimular a resposta imune ao antígeno promovendo aumento na
síntese de várias citocinas, como IFN-, IL2, IL-4 e IL-10 (COX & COUTER, 1997).
Introdução
28
Em 1996 começaram os ensaios para avaliar a eficácia da vacina FML na
área endêmica de São Gonçalo do Amaranto-RN (estudos de fase III). Os cães
vacinados foram avaliados por sorologia, pelo método ELISA-FML, e por teste de
intradermoreação ao lisado de Leishmania (IDR) nos seguintes períodos: dois, sete,
treze e vinte quatro meses após o programa vacinal completo. As diferenças entre
as proporções de positividade nos animais vacinados e controles foram altamente
significativas ao longo de todo período. Além disso, os valores de absorbâncias
determinados pelo ensaio de ELISA-FML nos soros e o tamanho das IDR foram
significativamente maiores no grupo vacinado com FML do que nos controles, em
todos os períodos avaliados. Após dois anos, 33% dos animais controles
desenvolveram sinais clínicos de leishmaniose visceral ou doença fatal, enquanto
apenas 8% dos cães vacinados mostraram sinais moderados da enfermidade, sem
nenhum registro de óbito neste grupo. Estes resultados mostraram 92% de proteção
contra a LVC no grupo vacinado, o que correspondeu a 76% de eficácia vacinal (DA
SILVA et al., 2001).
Em um segundo experimento de fase III, também em área endêmica, foi
observada uma diferença ainda maior entre os grupos de animais. Todos os animais
vacinados foram soropositivos no ensaio de ELISA-FML e mostraram IDR positiva
dois meses após a vacinação completa, mostrando valores de absorbância e
tamanho da IDR significativamente maiores do que os controles não vacinados,
durante os 3,5 anos de acompanhamento do estudo. Vinte e cinco por cento dos
animais controles e 5% dos vacinados desenvolveram doença clinica e fatal,
representando 95% de proteção alcançada em cães vacinados com FML. Embora
apresentassem maiores títulos de reatividade sorológica pela ELISA-FML e
mostrassem IDR mais intensa, 95% dos animais vacinados, apresentavam PCR
negativo na medula óssea e no sangue periférico (BORJA-CABRERA et al., 2002).
Para avaliação da resposta imune humoral e celular da vacina LEISHMUNE
®
os
pesquisadores utilizaram 600 cães que foram testados previamente ao inicio da
vacinação (D0), 30 dias após a terceira dose (D70) e sete meses após a primeira
dose. O teste de intradermoreação (IDR) foi realizado sete meses após a primeira
dose, com o intuito de mensurar a resposta imune celular. Trinta dias após o término
do programa vacinal (D70), 98% dos cães apresentavam soroconversão,
demonstrando que a vacina induziu resposta imune humoral. Sete meses após a
Introdução
29
primeira dose da vacina, 93% dos cães continuaram a apresentar sorologia positiva
e 59% apresentaram IDR positiva, indicando resposta imune celular protetora ativa.
Esses resultados foram similares aos obtidos nos estudos anteriores (DA SILVA et
al., 2001; BORJA-CABRERA et al., 2001). Sendo assim, os resultados obtidos e
publicados, até o momento, colocam a LEISHMUNE
®
como a primeira vacina
mundial que promove longo e significativo efeito protetor em cães, contra a LVC.
Essa vacina foi apresentada à comunidade medico veterinária e a sociedade em
geral, durante o XXIV Congresso Brasileiro da Anclivepa, em Belo Horizonte, em
agosto de 2003. É grande a esperança da comunidade de clínicos veterinários e
proprietários de cães quanto ao uso desta nova ferramenta para a prevenção e
controle da doença canina e humana. Além disso, evidências preliminares sugerem
que a vacina LEISHMUNE
®
seja bloqueadora da transmissão. Desta forma, ela não
somente protegeria os cães da incidência e morbidade da doença (BORJA-
CABRERA et al., 2004), mas também os manteria não-transmissores quando
infectados, bloqueando a transmissão para os flebotomíneos (MENDES et al., 2003).
Embora os trabalhos tenham demonstrado eficácia vacinal da LEISHVACIN, com
altos índices de proteção, como visto anteriormente, ainda são escassos os estudos
que abordam os eventos imunológicos pós-vacinais que seriam responsáveis pelo
estabelecimento de mecanismos imunoprotetores nos cães imunizados.
Outros inúmeros estudos sobre vacinas empregando diferentes antígenos
(parasitos atenuados ou fixados, proteínas recombinantes, vacinas de DNA) e
diferentes hospedeiros (humanos, macacos, camundongos e cães) já foram
realizados e estão citados nas revisões (HANDMAN, 2001; GRADONI, 2001, 2006;
VANLOUBBEECK & JONES, 2004; CAMPOS-NETO, 2005; COLER e REED, 2005).
Em relação à imunidade protetora e aos processos imunopatológicos, durante
a infecção por parasitos do gênero Leishmania, evidências experimentais indicam
que aspectos inerentes tanto ao parasito quanto ao hospedeiro podem influenciar de
maneira crucial nestes processos. A incapacidade do hospedeiro em controlar a
infecção está aparentemente relacionada a dois fatores principais: a habilidade de
algumas cepas de Leishmania resistirem aos efeitos microbicidas dos eventos de
imunidade inata e adaptativa do hospedeiro, bem como o estabelecimento de um
perfil de imunidade celular e humoral pelo hospedeiro vertebrado favoreça um
microambiente apropriado para a instalação do parasito no sistema mononuclear
Introdução
30
fagoacitário (GRIMALDI & TESH, 1993). Uma observação importante referente à
resposta imune na infecção por Leishmania é que, durante a infecção, o organismo
hospedeiro fica exposto a uma série de antígenos derivados do parasito,
respondendo a estes estímulos através de mecanismos múltiplos da imunidade
celular e humoral. Neste contexto, a leishmaniose é o protótipo de uma disfunção
imunológica específica resultante do parasitismo do sistema mononuclear fagocitário
por Leishmania, produzindo um amplo espectro de manifestações clínicas e
imunológicas, reversíveis com o tratamento específico ou espontaneamente nos
indivíduos imunologicamente competentes. Assim, a leishmaniose apresenta-se
como um bom modelo sistêmico para estudo da resposta imune humoral e da
imunidade mediada por células nos hospedeiros infectados. Por esta razão, a
leishmaniose tem sido amplamente investigada, permitindo o entendimento da
imunidade protetora bem como dos mecanismos imunopatológicos desencadeados
por este patógeno.
Em relação à infecção murina, a resistência do hospedeiro tem sido
associada com a ativação seletiva e diferenciação de um padrão de imunidade do
tipo 1, no qual, citocinas como o IFN- são de fundamental importância para o
estabelecimento de mecanismos de proteção. Por outro lado, a infecção progressiva
e fatal está relacionada a uma resposta predominantemente do tipo 2, com
participação de citocinas como a IL-4, IL-5 e IL-10 (HEINZEL et al., 1991; ERB et al.,
1996; SACKS &TRAUTH, 2002).
No caso da LVC, considerando o número limitado de investigações científicas
relacionadas a possíveis imunógenos candidatos para a prática imunoprofilática, por
muito tempo, o conhecimento do perfil imunológico em animais infectados,
portadores de diferentes formas clínicas, representou uma estratégia interessante
para se estabelecer os padrões de mecanismos envolvidos em episódios
imunoprotetores presentes em cães assintomáticos e os eventos imunopatológicos
observados em animais com maior grau de morbidade. Visando compreender
melhor os mecanismos imunológicos na LVC, alguns estudos avaliaram os aspectos
mais relevantes da resposta imune celular e humoral em cães portadores de
diferentes formas clínicas, incluindo aqueles realizados pelo nosso grupo de
investigação em parceria com os pesquisadores das leishmanioses do
Departamento de Parasitologia do ICB – UFMG. Estas informações podem ser
Introdução
31
empregadas com um suporte científico para a busca programada de um imunógeno,
hábil na indução de imunidade protetora para o controle da infecção dos cães (REIS
2001; REIS et al., 2006; Fujiwara, 2003).
Os estudos in vitro utilizando células de cães sintomáticos portadores de LVC
ativa demonstram a existência de uma supressão da resposta linfoproliferativa,
frente a diversos mitógenos e ao antígeno específico de L. chagasi, demonstrando
que cães sintomáticos apresentam falência na habilidade de responder a mitógenos
e mesmo a antígenos do parasito (REIS, 2001).
Segundo estudos de PINELLI et al. (1994), na LVC assintomática a imunidade
protetora contra L. infantum está associada a resposta do tipo 1. PINELLI et al.
(1997) demonstraram que linfócitos T CD8
+
desempenham um importante papel na
imunidade protetora na LVC causada por L. infantum, uma vez que essas células
são capazes de montar uma resposta do tipo 1, através da produção de IFN- além
de apresentarem habilidade de lisar macrófagos infectados por este parasito. Foi
observado ainda por PINELLI et al., 1994, 1995, que células de cães assintomáticos,
estimuladas in vitro, com o antígeno solúvel do parasito, são capazes de produzir
elevados níveis de IL-2 e IFN- quando comparado às células de cães sintomáticos.
Por outro lado, células de cães sintomáticos foram incapazes de produzir IFN-
quando cultivados na presença de antígenos do parasito, sugerindo que a
suscetibilidade de cães à infecção está associada a inabilidade de montar resposta
imune do tipo 1. Adicionalmente a esses achados, REIS (2001) em estudos
realizados em cães naturalmente infectados com L. chagasi, observaram uma
elevação no percentual de esplenócitos T CD8
+
em culturas in vitro estimuladas com
antígenos de L. chagasi, em relação a culturas controle, apenas no grupo de cães
assintomáticos. Esse dado reforça a hipótese de que a habilidade do hospedeiro
assintomático em recrutar células T CD8
+
na presença do estímulo antigênico
estaria intimamente ligado ao estabelecimento / manutenção de um estado de
equilíbrio com o parasito. A perda da habilidade de recrutar células T CD8
+
antígeno-
específicas estaria comprometendo o estabelecimento de mecanismos
imunoprotetores.
Adicionalmente, REIS 2001 acredita na hipótese de que a redução simultânea
de linfócitos B e monócitos circulantes poderia estar associada à inabilidade de
células do sangue periférico dos cães sintomáticos em responder aos estímulos
Introdução
32
mitogênicos e antígeno-específico in vitro, uma vez que essas células têm papel
central como apresentadoras de antígeno nos ensaios de linfoproliferação in vitro.
Ainda no estudo da celularidade de cães portadores de LVC, REIS (2001)
observou que animais assintomáticos apresentavam predomínio de linfócitos T CD8
+
circulantes, bem como residentes no baço, em relação aos animais sintomáticos. A
razão (CD4
+
/CD8
+
) na população de esplenócitos totais apresentou-se diminuída
apenas no grupo de cães assintomáticos, devido a um aumento seletivo da
subpopulação de esplenócitos T CD8
+
. Estes dados reforçam o papel protetor de
células T CD8
+
na LVC, sugerindo ainda que uma migração preferencial dessas
células para o baço possa ocorrer com o objetivo de promover a lise de macrófagos
infectados. Consistente com esta hipótese, REIS et al., 2006 mostraram a existência
de um menor parasitismo esplênico em cães assintomáticos.
Quanto à resposta imune humoral na LV, proposições clássicas sugerem que
ela não desempenha um papel imunoprotetor, em função dos crescentes títulos de
anticorpos associados à evolução clínica em humanos. Durante muitos anos, a
maioria dos trabalhos, que abordavam os aspectos da resposta imune humoral na
LVC, esteve focalizada em avaliações soro-epidemiológicas e diagnósticas. A partir
dos estudos de PINELLI et al. (1994) e DEPLAZES et al. (1995) houve uma
retomada nos estudos que buscam associação entre resposta imune humoral os
eventos imunoprotetores e patológicos na LVC. Segundo PINELLI et al. (1994), cães
assintomáticos ou resistentes à infecção embora apresentem uma resposta celular
antígeno-específica e baixos níveis anticorpos específicos detectados no soro. Por
outro lado, os animais susceptíveis ou sintomáticos embora falhem na habilidade de
montar uma resposta celular, apresentam altos títulos de anticorpos no soro. Nos
trabalhos de DEPLAZES et al. (1995) a análise da resposta humoral em cães
infectados com L. infantum, através da pesquisa de subclasses de IgG (IgG1 e
IgG2), trouxeram um novo impacto para os estudos sorológicos na LVC. Segundo
DEPLAZES et al. (1995), cães infectados por L. infantum, portadores da forma
clínica assintomática apresentam maiores níveis de IgG2 em relação aos cães
sintomáticos que mostram maiores níveis de IgG1.
Em um estudo recente, realizado em nosso laboratório por REIS et al. 2006,
foi demonstrado que em cães naturalmente infectados por L. chagasi, os níveis
séricos de IgG1 parecem estar associados com mecanismos imunoprotetores da
Introdução
33
infecção canina, uma vez que estão freqüentemente mais elevados em cães
assintomáticos. Por outro lado, os níveis séricos de IgG2 parecem estar associados
a mecanismos imunopatológicos na LVC, com a observação mais freqüente de
títulos elevados nas formas mais graves da infecção. Os títulos de IgA e IgE, foram
significativamente mais baixos em animais assintomáticos em relação aos animais
sintomáticos. Os resultados de REIS 2001, sugerem que a pesquisa de IgE seja um
método importante no acompanhamento de novos critérios terapêuticos e
imunoprofiláticos como marcador de um padrão de imunidade não protetora.
Essas observações, embora a princípio controversas, em virtude da
metodologia empregada ou da preparação antigênica utilizada nos testes
sorológicos, indicam uma possível associação entre os mecanismos
imunoprotetores na LVC e o perfil de isotípos de imunoglobulinas e permitem uma
retomada nos estudos sorológicos na LVC, com um novo enfoque, onde a
predominância de sublasses de IgG podem ser um reflexo da existência de um
padrão de imunidade distinto, conseqüência de um perfil diferenciado de citocinas,
como já demonstrado em outras doenças infecto-parasitárias. Neste contexto,
alguns trabalhos têm chamado a atenção para o fato de que as citocinas do tipo 1 e
do tipo 2 têm um papel importante, determinando a mudança de classes de
imunoglobulinas de IgM para outras classes. Sabe-se, que em diferentes espécies, a
IL-4 favorece a mudança do padrão de IgM para IgG1 e IgE (SNAPPER & PAUL
1987), a IL-5 para IgA (BEAGLEY et al., 1988). Por outro lado, o IFN- secretado
pelas células do tipo 1 em camundongos, é capaz de induzir a produção de IgG2a
(SNAPPER & PAUL, 1987).
Outro fator importante a ser considerado durante o processo de infecção pela
Leishmania é a atividade anti-Leishmania (efeito citostático e citotóxico) promovida
pelos macrófagos através da produção de óxido nítrico (NO). O NO é gerado pela
oxidação do nitrogênio guanido terminal da L-arginina pela enzima NADPH-
dependente a NO sintase (STEUHR & NATHAN, 1989; MONCADA et al., 1993). A
produção de NO por macrófagos pode ser desencadeada por uma variedade de
patógenos, incluindo Leishmania major, Plasmodium falciparum, Schistosoma
mansoni, Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii (GREEN,et al.,1990; LIEW et
al.1990; JAMES & GLAVEN,1989; MUNIOZ-FERNANDEZ et al., 1992; ADAMS et
al., 1990). Para a ativação dos macrófagos e conseqüente produção de NO são
Introdução
34
necessários dois sinais consecutivos, sendo que comumente o primeiro sinal é o
IFN- (CRAWFORD, et al., 1994; DING et al., 1988; DRAPIER et al., 1988), e o LPS
atuaria como o segundo sinal “disparador” da ativação in vitro (HAMILTON &
ADAMS, 1987). Em condições fisiológicas, o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-)
é o principal segundo sinal para macrófagos primados com IFN- (DING et al., 1988;
DRAPIER et al., 1988) e evidências indicam que componentes dos parasitos podem
atuar como estímulos direto para a produção de TNF- (GREEN et al.,1990). Outras
citocinas, principalmente interleucina 2 (IL-2), (COX et al., 1990) podem atuar
sinergisticamente com INF- para ativação de macrofagos (NUSSLER e BILLAR,
1993; OSWALD et al., 1994). A produção de NO pode ser inibida ou regulada por
mecanismos que suprimem a ativação das células, desencadeados por
determinadas citocinas que inibem a produção de INF- pelos linfócitos do tipo Th1.
Estudos realizados em modelos murinos para leishmaniose têm mostrado que
a indução de oxido nítrico é um dos principais mecanismos efetores de macrófagos
na eliminação da infecção por Leishmania (LIEW et al., 1990; MAUEL et al., 1991).
Em estudo realizado com uma linhagem de macrófagos caninos (030-D), PINELLI et
al., 2000 observaram que a incubação destas células com sobrenadante provindo
culturas de células T com Leishmania contendo IFN-, TNF- e interleucina 2
resultou em aumento na produção de oxido nítrico. Observaram também aumento
no efeito atividade da anti-Leishmania nesta linhagem celular, quando infectada com
Leishmania depois de sua ativação.
Em suma, os estudos dos eventos imunológicos associados a imunoproteção
e patologia na LVC mostram, até o momento, que os padrões de imunidade
protetora contra a infecção por Leishmania em cães são semelhantes àqueles
observados em modelos de leishmaniose experimental murina e em humanos. Este
padrão de imunoproteção requer o estabelecimento de uma resposta imune celular,
antígeno-específica, com a produção de um padrão específico de citocinas e a
produção preferencial de Imunoglobulina antígeno específica. O conhecimento
destas informações representa uma base importante para a busca de antígenos que
sejam capazes de intervir no sistema imune do cão, favorecendo o desenvolvimento
de eventos imunológicos específicos relacionados a eliminação do parasito durante
os estágios iniciais de sua entrada no organismo hospedeiro, protegendo assim o
hospedeiro contra a infecção por Leishmania. Assim, acredita-se que uma
Introdução
35
intervenção vacinal que possibilite o desencadeamento de uma imunidade do tipo 1,
com predomínio de uma resposta celular antígeno-específica, seja fundamental para
o êxito do processo de vacinação contra a LVC. A deficiência dos animais em
estabelecer um padrão de resposta imune do tipo 1 seria o mecanismo associado ao
insucesso de uma intervenção vacinal. Neste contexto, ainda são escassos os
estudos que focalizam atenção nos eventos imunológicos pós-vacinais que seriam
responsáveis pelo estabelecimento de mecanismos imunoprotetores nos cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. Sendo assim, em nosso
estudo pretendemos ampliar o conhecimento sobre o potencial imunogênico destas
vacinas na ativação celular na resposta inata e adaptativa, sobre a imunidade
humoral, a interferência do processo vacinal na produção de citocinas e oxido
nítrico; fornecendo informações importantes inerentes aos eventos da resposta
imune desencadeada por estas vacinas.
JUSTIFICATIVA
Justificativa
37
A leishmaniose visceral canina é endêmica em muitas regiões do Brasil. Nos
últimos anos, várias cidades nas regiões sudeste, norte, nordeste e centro oeste,
incluindo, Montes Claros e Belo Horizonte-MG, São Paulo-SP, Bauru-SP, Campo
Grande-MT, Teresina-PI, Salvador-BA, São Luis-MA e Palmas-TO têm registrado
surtos desta zoonose, enfatizando o seu importante papel no contexto da saúde
pública em âmbito nacional. A necessidade da eliminação dos cães infectados, dada
a sua relevância como reservatórios domésticos da doença humana, tem trazido um
grande impacto social, considerando que, o sacrifício destes animais é sempre
traumático para os proprietários e de difícil execução pelas autoridades sanitárias.
Muitas vezes, os proprietários dos animais infectados se recusam a sacrificá-los,
transferindo-os para outros domicílios, interferindo em aspectos epidemiológicos
relevantes da leishmaniose, através da ampliação de áreas de risco. Maior
gravidade nete processo é a possibilidade de cães infectados, ainda assintomáticos,
funcionarem como potentes reservatórios da infecção, arriscando a saúde de outros
animais e de pessoas co-habitantes das regiões afetadas. Tais fatos chamam a
atenção para a importância da implementação de uma vacina anti-leishmaniose
visceral canina que possa ser empregada em campanhas efetivas de profilaxia e
controle da infecção canina.
Na busca estratégica de uma vacina, há vários anos, o grupo de pesquisa
Coordenado pelo Dr Wilson Mayrink da Universidade Federal de Minas Gerais e
mais recentemente, a Fort Dodge, em profícua cooperação com a Dra Clarissa
Palatnik de Souza, pesquisadora da Universidade Federal do Rio de Janeiro, vem
realizando estudos visando o desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose
visceral canina. Estes estudos proporcionaram a elaboração das vacinas
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
, respectivamente.
Embora existam estudos sobre a eficácia vacinal destes imunobiológicos para
o controle da LVC, e também estudos imunológicos que abordavam aspectos da
imunidade proporcionados por estas duas vacinas, os mesmos demonstravam que
processos distintos podiam ser responsáveis pelo estabelecimento de mecanismos
imunoprotetores nos cães imunizados. Como os resultados citados nestes estudos
foram gerados através de protocolos experimentais não pareados, isto não nos
permitia a comparação cientificamente fundamentada a respeito dos eventos
imunológicos desencadeados pelas vacinas. Neste contexto, nosso estudo focalizou
Justificativa
38
diferentes aspectos da imunidade humoral e celular através de protocolo unificado
de investigação, empregando novas metodologias de analises recentemente
desenvolvidas pelo nosso grupo. Isto nos que permitiu um estudo mais completo e
detalhado da resposta imune e também proporcionou confrontar e ampliar o
conhecimento acerca da dinâmica da resposta imune desencadeada por estas
vacinas.
OBJETIVOS
Objetivos
40
1 - Objetivo Geral
Caracterizar as alterações celulares e moleculares no sangue periférico de
cães submetidos a imunoprofilaxia para leishmaniose visceral canina utilizando a
LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
2 - Objetivos específicos
1. Investigar, no contexto ex vivo, a cinética do perfil fenotípico de leucócitos do
sangue periférico canino, desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e a
LEISHMUNE
®
: com ênfase na resposta imune inata (neutrófilos, eosinófilos,
monócitos)
2. Investigar, no contexto ex vivo, a cinética do perfil fenotípico de leucócitos do
sangue periférico canino, desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e a
LEISHMUNE
®
: com ênfase na resposta imune adaptativa (populações e sub-
populações de linfócitos)
3. Avaliar o impacto da imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
no
perfil de síntese de citocinas intracitoplasmáticas do tipo 1 (IFN-) e do tipo 2 (IL-4)
por linfócitos do sangue periférico, após estimulação de células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) com antígeno-específico in vitro;
4. Avaliar o impacto da imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
na
produção de Óxido Nítrico por células mononucleares do sangue periférico (CMSP),
após estimulação antígeno-específica in vitro;
5. Avaliar a capacidade antigênica das vacinas em induzir a reatividade de
imunoglobulinas séricas anti-Leishmania, através da pesquisa de IgG e subclasses
IgG1 e IgG2 anti-formas promastigotas L. chagasi fixadas.
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
42
1 - Animais
Neste trabalho foram utilizados 24 cães da raça Pastor Alemão, sendo 8
fêmeas e 16 machos, com idade entre 18 e 60 meses. Os animais pertencem ao
plantel da Polícia Militar de Minas Gerais – 4ª. Companhia de Policiamento com cães
de Belo Horizonte / MG.
Os cães foram mantidos em canis individuais com água potável e ração
balanceada (Purina) “ad libitum” e assepsia diária, sendo aplicada em todas as celas
borrifação de solução de hipoclorito de sódio a 1%. Quinzenalmente os animais
receberam banhos com sabonete e xampu.
Os cães foram periodicamente submetidos a exame coproparasitológico pelo
método HPJ para o diagnóstico de protozooses ou helmintoses intestinais e, ainda,
coleta de sangue para triagem sorológica através da reação de imunofluorescência
indireta (RIFI) para o diagnóstico de leishmaniose e babesiose. Os animais foram
rotineiramente submetidos ao tratamento anti-helmíntico de largo espectro com
composto de palmoato de pirantel e praziquantel (DUPRANTEL
MaxVet - SP.
Para obter uma ação anti-ectoparasitária, os animais foram tratados com aplicação
tópica de piretróide cipermetrina. Todos os cães foram também vacinados contra
parvovirose, cinomose, adenovirus, hepatite, adenovírus tipo 2, parainfluenza,
coronavirose e leptospirose canina (RECOMBITEK
- Merial, Inc - USA). Além disso,
os animais receberam vacina PNEUMODOG (Merial, Inc - USA) contra tosse canina
e vacina RABISIN-i (Merial, Inc - USA) anti-rábica. Os animais foram mantidos em
quarentena antes de serem submetidos ao protocolo de vacinação contra a
leishmaniose visceral canina.
2 - Vacinas
Neste trabalho foram utilizadas as vacinas LEISHVACIN, desenvolvida pelo
professor Wilson Mayrink e colaboradores do Departamento de Parasitologia
(UFMG), e a LEISHMUNE
®
, desenvolvida pela Dr
a
. Clarissa Palatnik e
colaboradores da UFRJ e atualmente comercializada pela FORT DODGE
®
(Campinas - SP / Brasil).
Material e Métodos
43
2.1 - LEISHVACIN
Vacina constituída pela cepa Leishmania (Leishmania) amazonensis
(IFLA/BR/1967/PH8), tendo como adjuvante o BCG (Bacilo Calmette-Guérin, cepa
Moreau Rio de Janeiro – Produzida pela Fundação Ataulfo de Paiva). Para
preparação desta vacina, formas promastigotas foram mantidas em meio bifásico
NNN/LIT (CAMARGO, 1964) e então sonicadas com auxílio de um aparelho de
ultrassom por três ciclos de 1 minuto a 40 watts, com intervalos de 1 minuto cada,
mantido em banho de gelo. O conteúdo protéico foi determinado e o extrato foi
diluído em salina na concentração de 600g de proteína/mL, sendo aplicado 0,6mL
(360g de proteína) associado ao BCG (Mayrink et al., 1996). O preparo do antígeno
foi realizado em condições estéreis no laboratório de leishmaniose do ICB-UFMG.
2.2 - LEISHMUNE
®
A vacina produzida pelo laboratório FORT DODGE
®
, é composta pelo
complexo glicoprotéico Ligante de Fucose e Manose (FML) de Leishmania donovani
e o adjuvante saponina.
2.3 - Protocolos de Vacinação
2.3.1 - Controles
Os controles foram os próprios cães que tiveram suas amostras de sangue
avaliadas anteriormente à vacinação.
2.3.2 - Delineamento
Anterior à vacinação foram realizados hemogramas e testes sorológicos
através da RIFI e reação imunoenzimática (ELISA) para leishmaniose, utilizando Kits
produzidos por BioManguinhos-Fiocruz, sendo soro-negativos para LVC, todos os
animais que participaram do estudo. Os cães foram separados em dois grupos com
12 animais cada, sendo estes homogêneos em relação ao sexo e idade.
Material e Métodos
44
Um dos grupos de animais foi vacinado com a vacina LEISHVACIN no
seguinte esquema: os cães receberam na 1º dose 0,6mL da vacina (360g de
proteína) mais 400g de BCG, na segunda dose, a mesma concentração da vacina
mais 300g BCG e na 3º dose, novamente a mesma dose da vacina mais 200g de
BCG. As doses foram aplicadas via subcutânea em intervalos de 21 dias.
O outro grupo de animais recebeu a vacina LEISHMUNE
®
. Esta vacina é
apresentada na forma de uma fração liofilizada e uma fração líquida que foram
misturadas no momento do uso. Após homogeneização das frações o produto foi
administrado em doses de 1mL via subcutânea, sendo aplicada em três doses com
intervalo de 21 dias entre cada dose, como recomendado pelo fabricante.
3 - Avaliação da Resposta Imune Celular
Para avaliação da resposta imune celular foram traçados dois delineamentos
experimentais, um no contexto ex vivo e o outro in vitro.
No primeiro, direcionado para o contexto ex vivo, foram realizadas
imunofenotipagens com marcadores de superfície celular do sangue periférico,
utilizando a técnica de citometria de fluxo e protocolos desenvolvidos por REIS 2001,
com algumas modificações. No segundo, voltado para o contexto in vitro, foram
realizadas imunofenotipagens utilizando marcadores de superfície celular para as
subpopulações de linfócitos T (CD4 e CD8) e marcadores de citocinas
intracitoplasmáticas (IFN- e IL-4) em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) submetidas à cultura, na ausência ou presença do antígeno solúvel de
Leishmania chagasi.
3.1 - Resposta imune celular no contexto ex vivo
3.1.1 - Obtenção do sangue periférico para imunofenotipagem
Para avaliação da resposta imune celular no contexto ex vivo, coletas de
sangue foram realizadas em 24 animais antes da primeira dose de vacinação (T0), e
no sétimo dia posterior a cada dose, nos 12 cães submetidos a cada uma das
vacinas.
Material e Métodos
45
O sangue foi coletado, em seringas descartáveis estéreis de 5mL, através de
venopunção na veia radial, e em seguida transferido para tubos estéreis contendo
EDTA, destinados à realização de hemograma, imunofenotipagem e separação do
plasma para avaliação sorológica pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
e pela citometria de fluxo.
Diagrama 1 - Desenho experimental no contexto ex vivo
24 Cães (PMMG- BH)
Sorologicamente negativos
para LVC (RIFI e ELISA)
12 cães
LEISHVACIN
12 cães
LEISHMUNE
Sangue em EDTA para
Fenotipagem (coletado 7 dias após cada
dose)
Protocolo de Imunização
1
a
Dose 2
a
Dose 3
a
Dose
21 dias
21 dias
Sangue em EDTA para
Fenotipagem
Antes
3.1.2 - Ensaio de imunofenotipagem celular no contexto ex vivo
Os anticorpos monoclonais utilizados nesta parte do trabalho estão descritos
na Tabela 1, e os mesmos foram diluídos em PBS-W (solução salina tamponada
com fosfato-PBS = 0,15M, 8g/l de NaCl, 2g/l de KCl, 2g/l de KH
2
PO
4
e 1,15g/l de
Na
2
HPO
4
, pH 7,2 com 0,5% de albumina bovina sérica (BSA) e 0,1% de azida
sódica) em diluições previamente estabelecidas na padronização do protocolo.
Em tubos cônicos de poliestireno de 5mL (FALCON
®
– BECTON DICKINSON)
contendo 30L dos anticorpos diluídos (ver Tabela 1), foram adicionados 30L de
sangue total coletado como descrito no item (3.1.1). As amostras de sangue
periférico foram homogeneizadas cuidadosamente e incubadas por 30 minutos a
temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Em seguida, as hemácias foram lisadas
adicionando-se 3mL de solução de lise (FACS LISYNG SOLUTION – BECTON
DICKINSON), sob agitação no vórtex. As suspensões celulares permaneceram em
Material e Métodos
46
repouso por 10 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz; após esse tempo
as mesmas foram centrifugadas a 400 x g por 7 minutos, a temperatura ambiente.
Após isso, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se os tubos e as células foram,
então, homogeneizadas no vórtex a baixa velocidade. Foram adicionados 3mL de
PBS-W e as suspensões celulares foram submetidas novamente a uma
centrifugação a 400 x g, por 7 minutos a temperatura ambiente, sendo novamente
desprezado o sobrenadante e, o sedimento ressuspendido e homogeneizado
cuidadosamente; essa última lavagem foi repetida mais uma vez. As células foram,
então, fixadas com 200L de solução fixadora para citometria – MaxFacsFix (MFF)
(10,0g/l de paraformaldeído, 10,2g/l de cacodilato de sódio e 6,65g/l de cloreto de
sódio, pH 7,2) e submetidas à leitura no citômetro de fluxo onde foram avaliados 20
mil eventos, procedimento realizado de imediato, ou então, até 24 horas sob
acondicionamento em geladeira .
Material e Métodos
47
Tabela 1 - Painel de Anticorpos monoclonais utilizados nos ensaios de imunofenotipagem celular no contexto ex vivo
Anticorpos*
Monoclonais
Hospedeiro
Clone
Fluorocromo
Diluição
final
Células alvo
Anti-CD3 canino
Camundongo CA17.2A12 R-PE 1:10 Linfócitos T maduros
Anti-CD4 canino
Rato YKIX302.9 PE 1:320 Linfócitos T auxiliar e neutrófilos
Anti-CD4 canino
Rato YKIX302.9 FITC 1:320 Linfócitos T auxiliar e neutrófilos
Anti-CD5 canino
Rato YKIX322.3 FITC 1:160 Linfócitos T
Anti-CD8 canino
Rato YCATE55.9 FITC 1:40 Céls. T supressoras e/ou citotóxicas
Anti-CD8 canino
Rato YCATE55.9 PE 1:80 Céls. T supressoras e/ou citotóxicas
Anti-CD14 humano
Camundongo TuK4 R-PE-Cy5 1:40 Monócitos e granulócitos
Anti-CD18 humano
Rato YFC118.3 R-PE 1:6 Leucócitos
Anti-CD32 humano
Camundongo AT10 FITC 1:6 Receptor de IgG (cél. B, monócitos,
granulócitos)
Anti-célula B canino
Camundongo CA2.1D6 R-PE 1:160 Linfócitos B
Anti-MHC II canino
Rato YKIX334.2 FITC 1:80 Células mononucleadas
Anti-MHCI camundongo
Camundongo 2G5 R-PE 1:20 Células nucleadas
* Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela SEROTEC Ltd (Oxford - England).
Material e Métodos
48
4 - Obtenção e análise de dados por citometria de fluxo
Após todo o procedimento de marcação da fenotipagem, as amostras foram
analisadas no citômetro FACScan (BECTON DICKINSON, San Jose, CA, EUA),
acoplado a um sistema de computador com programa específico (CELL QUEST
).
4.1 - A técnica de imunofenotipagem empregando a citometria de fluxo
A citometria de fluxo é uma técnica de análise celular automatizada, que
permite a avaliação simultânea de múltiplas propriedades físicas e bioquímicas
individuais de uma célula suspensa em meio líquido (JOROSZESKI & RADCLIFF,
1999). A caracterização fenotípica, por citometria de fluxo, inclui a análise básica de
três parâmetros celulares: tamanho (determinado pela difração do raio laser –
“Forward scatter” - FSC), granulosidade ou complexidade interna (determinada pela
refração e reflexão do raio laser – “Side Scatter” - SSC), e intensidade relativa de
fluorescência (exemplos: FL1, FL2 e FL3). Estas características são detectadas
utilizando-se um sistema ótico eletrônico acoplados, que avalia a emissão de
fluorescência e a dispersão do raio laser incidente sobre uma célula,
hidrodinamicamente focalizada. Esses sinais óticos e eletrônicos podem ser
medidos e armazenados, para posterior análise. Para a realização dos ensaios de
imunofenotipagem das células obtidas a partir do sangue periférico dos cães,
utilizamos anticorpos monoclonais que permitiram a marcação das populações
celulares; empregamos monoclonais anti CD14 para marcação dos monócitos, anti
Células B para linfócitos B, anti CD3 e CD5 para marcação de linfócitos T e anti CD4
e CD8 para as subpopulacoes de linfócitos T. Foram também utilizados anticorpos
anti-moléculas de MHC I e MHC II por serem conhecidas como marcadores de
ativação celular. No contexto da ativação celular, foi utilizado também o anticorpo
monoclonal anti-CD18 por se tratar de uma molécula de adesão importante durante
o processo de migração pós-ativação celular. No âmbito da imunorregulação,
empregamos o anticorpo anti-receptor de média afinidade para IgG (CD32) devido
seu reconhecido papel ativador da imunidade inata e modulador da atividade de
linfócitos B. Os anticorpos monoclonais anti-citocinas IFN- e anti IL-4 foram
selecionados por representarem dois pólos relevantes da resposta imune,
Material e Métodos
49
denomindados imunidade do tipo 1 e do tipo 2 respectivamente (Detalhes dos
anticorpos empregados estão descritos nas tabelas nas Tabelas 1 e 2).
Os anticorpos eram marcados com fluorocromos FITC (Isotiocianato de
fluoresceína - emitiam fluorescência tipo 1 -FL1), R-PE (Ficoeritrina - emitiam
fluorescência tipo 2 - FL2) ou com PE-Cy-5 (ficoeritrina conjugada com cianina -
emitiam fluorescência tipo 3 - FL3). Assim, foram utilizadas marcações duplas que
permitiram a análise simultânea de mais de um parâmetro por tubo.
4.2 - Obtenção e análise dos dados no citômetro
O primeiro passo para a obtenção dos dados por citometria de fluxo consistiu
na identificação da população celular de interesse (R1), após ajustes de ganho de
tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) e/ou fluorescências (FL1, FL2 e FL3). Após a
seleção da região de interesse (R1), foi feita a análise dos aspectos fenotípicos
considerando duas abordagens distintas: a primeira, através do percentual de
células positivas expresso em gráficos de dispersão pontual de fluorescência,
equivalente à população positiva para cada marcador avaliado; e a segunda,
avaliando a intensidade média de fluorescência (IMF) equivalente à densidade de
expressão de um determinado marcador fenotípico, em gráficos do tipo histograma
em escala logarítmica.
A primeira abordagem foi empregada para quantificar fenótipos celulares que
apresentam distribuição bimodal, ou seja, caracterizadas por apresentarem
populações positivas e negativas para o referido marcador fenotípico. Na segunda
abordagem foi utilizada uma análise semi-quantitativa da expressão de marcadores
fenotípicos que possuem distribuição unimodal, ou seja, toda a população celular de
interesse expressa constitutivamente o referido marcador fenotípico. Nessas
situações, alterações na densidade de expressão podem ocorrer, o que irá promover
o deslocamento da população celular ao longo do eixo da intensidade de
fluorescência.
Em todos os experimentos foram analisados para cada amostra os controles
das reações, que são importantes para avaliação da qualidade do perfil celular e
detecções de eventual ocorrência de fluorescências inespecíficas.
Material e Métodos
50
4.3 - Estratégias para análise imunofenotípica celular por citometria de fluxo no
contexto ex vivo
Os dados obtidos através da imunofenotipagem dos leucócitos do sangue
periférico dos cães submetidos à imunização contra leishmaniose visceral canina
com as vacinas LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
foram analisados utilizando-se
estratégias específicas dependendo do fenótipo celular investigado. Assim,
empregando-se os recursos de análise de dados disponíveis no programa
CellQuest
TM
(Becton Dickson), foram adotadas diferentes estratégias para análise
fenotípica de células envolvidas na imunidade inata e adaptativa.
Os aspectos fenotípicos analisados na imunidade inata (neutrófilos,
eosinófilos, monócitos) foram:
- Expressão de CD18 pela Intensidade Média de Fluorescência (IMF)
- Freqüência (%) de células MHC I
+
, MHC II
+
e CD32
+
4.4 - Avaliação em Neutrófilos
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD18
A análise de neutrófilos CD18
+
foi realizada a partir da seleção da região de
interesse (R1), baseada em aspectos imunofenotípicos e morfométricos em gráficos
de distribuição pontual de CD4/FL1 versus granulosidade (SSC), para a identificação
da população de neutrófilos como células CD4
+
SSC
Intermediário
, eliminando-se a
possibilidade de contaminação da região selecionada por monócitos e eosinófilos
(Figura 1A). Em seguida, foram construídos histogramas de CD18/FL2 versus
número de células para determinar a IMF para o marcador CD18 dentro da
população de neutrófilos previamente selecionada em R1 (Figura 1B).
Material e Métodos
51
CD4/FL1
SSC
CD18/FL2
Número de células
IMF=89,3
AB
R1
Figura 1 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade média de
fluorescência (IMF) de CD18
em neutrófilos do sangue periférico de cães imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL1 versus SSC utilizado para a seleção da população de
neutrófilos - R1 com fenótipo CD4
+
SSC
intermediário
. (B) Histograma de Intensidade Média de
Fluorescência (IMF) de CD18/FL2 versus número de células selecionadas na região R1, indicando
um exemplo representativo dos valores de IMF.
Determinação da freqüência de neutrófilos MHCI
+
e CD32
+
A análise de neutrófilos MHCI
+
e CD32
+
foi realizada a partir da seleção da
região de interesse (R1), baseada em aspectos imunofenotípicos e morfométricos
em gráficos de distribuição pontual de CD14/FL3 versus SSC, para a identificação
da população de neutrófilos como células CD14
-
SSC
Intermediário
, minimizando assim a
contaminação da região selecionada por monócitos e eosinófilos(Figura 2A). Em
seguida, foram construídos gráficos de SSC versus MHCI/FL1 (Figura 2B) ou
gráficos SSC versus CD32/FL1 (Figura 2C) para determinar o percentual de células
MHCI
+
ou CD32
+
, respectivamente, dentro da população de neutrófilos previamente
selecionada em R1.
Material e Métodos
52
CD14/FL3
SSC
A
R1
SSC
CD32/FL1
B
99,20
0,80
99,20
0,80
SSC
MHCI/FL1
C
97,20
2,80
97,20
2,80
Figura 2 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de neutrófilos MHCI
+
e
CD32
+
no sangue periférico de cães Imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD14/FL3 versus SSC utilizado para a seleção da população
celular de neutrófilos - R1, com o fenótipo CD14
-
SSC
Intermediário
. (B) Gráfico de distribuição pontual
SSC versus MHCI/FL1, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o
percentual de neutrófilos MHCI
+
. (C) Gráfico de distribuição pontual SSC versus CD32/FL1, contendo
as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o percentual de neutrófilos CD32
+
.
Nos quadrantes superiores à direita estão indicados um exemplo representativo das freqüências (%)
correspondentes a cada quadrante dos gráficos bidimensionais de fluorescência.
Determinação da freqüência de neutrófilos MHCII
+
A análise de neutrófilos MHCII
+
foi realizada a partir da seleção da região de
interesse (R1), baseada em aspectos imunofenotípicos e morfométricos em gráficos
de distribuição pontual de CD4/FL2 versus SSC, para a identificação da população
de neutrófilos como células CD4
+
SSC
intermediário
, minimizando assim a contaminação
da região selecionada por monócitos e eosinófilos (Figura 3A). Em seguida foram
Material e Métodos
53
construídos gráficos de CD4/FL2 versus MHCII
+
/FL1 para determinar o percentual
de células MHCII
+
dentro da população de neutrófilos previamente selecionada em
R1 (Figura 3B).
CD4/FL2
SSC
A
R1
MHCII/FL1
CD4/FL2
B
98,30
1,70
98,30
1,70
Figura 3 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de neutrófilos MHCII
+
no sangue periférico de cães Imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL2 versus SSC utilizado para a seleção da população celular
de interesse - R1, com o fenótipo CD4
+
SSC
intermediário
(B) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL2
versus MHCII/FL1, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o
percentual de neutrófilos MHCII
+
. No quadrante superior à direita esta indicado um exemplo
representativo da freqüência (%) correspondente a cada quadrante do gráfico bidimensionai de
fluorescência.
4.5 - Avaliação em Eosinófilos
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD18
A análise de eosinófilos CD18
+
foi realizada a partir da seleção da região de
interesse (R1), baseada na presença de auto-fluorescência característica destas
células em gráficos de distribuição pontual de CD4/FL1 versus FL3, para a
identificação da população de eosinófilos (Figura 4A). Depois foram construídos
gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC, para a confirmação de que a
população selecionada em R1 era eosinófilos (Figura 4B). Em seguida foram
construídos histogramas de CD18/FL2 versus número de células e para determinar
a intensidade média de fluorescência (IMF) para o marcador CD18 dentro da
população de eosinófilos previamente selecionada em R1 (Figura 4C).
Material e Métodos
54
CD4/FL1
FL3
A
R1
SSC
FSC
B
M1
C
IMF=72,2
CD18/FL2
Número de células
Figura 4 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade média de
fluorescência (IMF) de eosinófilos CD18 no sangue periférico de cães imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL1 versus FL3 utilizado para a seleção da população celular
de interesse - R1. (B) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC, contendo as células
selecionadas na região R1, empregado para certificar que a população selecionada era eosinófilos
(C) Histograma de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) CD18 versus número de células
selecionadas na região R1, indicando um exemplo representativo dos valores de IMF.
Determinação da freqüência de eosinófilos MHCI
+
e CD32
+
A análise de eosinófilos MHCI
+
e CD32
+
foi realizada a partir da seleção da
região de interesse (R1), baseada na presença de auto-fluorescência característica
destas células em gráficos de distribuição pontual de FL1 versus CD14/FL3, para a
identificação da população de eosinófilos (Figura 5A). Depois foram construídos
gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC, para a confirmação de que a
Material e Métodos
55
população selecionada em R1 era eosinófilos (Figura 5B). Em seguida, foram
construídos gráficos de fluorescência FL1 versus MHCI/FL2 (Figura 5C) e gráficos
de fluorescência CD14/FL3 versus CD32/FL1 (Figura 5D) para determinar o
percentual de células MHCI
+
ou CD32
+
, respectivamente,
dentro da população de
eosinófilos previamente selecionada em R1.
FL1
CD14/FL3
A
R1
SSC
FSC
B
CD32/FL1
CD14/FL3
099,3
00,7
099,3
00,7
098,4
01,6
098,4
01,6
FL1
C
MHCI/FL2
D
Figura 5 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de eosinófilos MHCII
+
e CD32
+
no sangue periférico de cães Imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus CD14/FL3 utilizado para a seleção da população
celular de interesse - R1 (B) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC, contendo as células
selecionadas na região R1, empregado para certificar que a população selecionada era eosinófilos
(C) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus MHCI/FL2, contendo as células selecionadas na região
R1, empregado para quantificar o percentual de eosinófilos MHCI
+
. (D) Gráfico de distribuição pontual
CD14/FL3 versus CD32/FL1, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para
quantificar o percentual de eosinófilos CD32
+
. Nos quadrantes superiores à direita estão indicados
exemplos representativos das freqüências (%) correspondentes a cada quadrante dos gráficos
bidimensionais de fluorescência.
Material e Métodos
56
Determinação da freqüência de eosinófilos MHCII
+
A análise de eosinófilos MHCII
+
foi realizada a partir da seleção da região de
interesse (R1), baseada na presença de auto fluorescência característica destas
células em gráficos de distribuição pontual de CD4/FL2 versus FL3, para a
identificação da população de eosinófilos (Figura 6A). Em seguida, foram
construídos gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC, para a confirmação
de que a população selecionada em R1 era eosinófilos (Figura 6B). Posteriormente,
foram construídos gráficos de FL3 versus MHCII/FL1 para determinar o percentual
de células MHCII
+
dentro da população de neutrófilos previamente selecionada em
R1 (Figura 6C).
SSC
FSC
B
FL3
CD4/FL2
A
MHCII/FL1
FL3
C
098,8
00,2
098,8
00,2
R1
Figura 6 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de eosinófilos MHCII
+
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL2 versus FL3 utilizado para a seleção da população celular
de interesse - R1. (B) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC, contendo as células
selecionadas na região R1, empregado para certificar que a população selecionada era eosinófilos.
Material e Métodos
57
(C) Gráfico de distribuição pontual FL3 versus MHCII/FL1, contendo as células selecionadas na
região R1, empregado para quantificar o percentual de eosinófilos MHCII
+
. No quadrante superior à
direita está indicado um exemplo representativo das freqüências (%) correspondentes a cada
quadrante dos gráficos bidimensionais de fluorescência.
4.6 - Avaliação em Monócitos
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD18
A análise de monócitos CD18
+
foi realizada a partir da seleção da região de
interesse (R1), baseada em aspectos imunofenotípicos e morfométricos em gráficos
de distribuição pontual de CD14/FL3 versus SSC, para a identificação da população
de monócitos como células CD14
+High
SSC
intermediario
, minimizando assim a
contaminação da região selecionada por linfócitos e neutrófilos (Figura 7A). Em
seguida foram construídos histogramas de CD18/FL2 versus número de células para
determinar a intensidade média de fluorescência (IMF) para o marcador CD18
dentro da população de monócitos previamente selecionada em R1 (Figura 7B).
M1
CD14/FL3
SSC
CD18/FL2
Número de células
IMF=139,3
AB
R1
Figura 7 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade média de
fluorescência (IMF) de CD18
em monócitos do sangue periférico de cães imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD14/FL3 versus SSC utilizado para a seleção da população
celular de interesse - R1 com o fenótipo CD14
+High
SSC
intermediario
. (B) Histograma de Intensidade Média
de Fluorescência (IMF) CD18 versus número de células selecionadas na região R1, indicando um
exemplo representativo dos valores de IMF.
Determinação da freqüência de monócitos MHCI
+
, MHCII
+
e CD32
+
A análise de monócitos MHCI
+
, MHCII
+
e CD32
+
foi realizada a partir da
seleção da região de interesse (R1), baseada em aspectos imunofenotípicos e
morfométricos em gráficos de distribuição pontual de CD14/FL3 versus SSC, para a
Material e Métodos
58
identificação da população de monócitos como células CD14
+High
SSC
intermediario
,
minimizando assim a contaminação da região selecionada por linfócitos e neutrófilos
(Figura 8A). Em seguida foram construídos gráficos de distribuição pontual de SSC
versus MHCI/FL2, MHCII/FL1 e CD32/FL1 para determinar o percentual de células
MHCI
+
, MHCII
+
e CD32
+
dentro da população de monócitos previamente
selecionada em R1 (Figura 8B, 8C, 8D).
Figura 8 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos MHCI
+
,
MHCII
+
e CD32
+
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD14/FL3 versus SSC utilizado para a seleção da população
celular de interesse - R1 com o fenótipo CD14
+High
SSC
intermediario
(B) Gráfico de distribuição pontual de
SSC versus MHCI/FL2, contendo as células selecionadas na região R1 empregado para quantificar o
percentual de monócitos MHCII
+
(C) Gráfico de distribuição pontual SSC versus MHCII/FL1, contendo
as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o percentual de monócitos MHCII
+
.
(D) Gráfico de distribuição pontual SSC versus CD32/FL1, contendo as células selecionadas na
região R1, empregado para quantificar o percentual de monócitos CD32
+
. Nos quadrantes superiores
à direita estão indicados exemplos representativos das freqüências (%) correspondentes a cada
quadrante dos gráficos bidimensionais de fluorescência.
CD14/FL3
A
R1
MHCI/FL2
SSC
B
94,30
5,70
94,30
5,70
MHCII/FL1
SSC
C
27,30
72,30
27,30
72,30
SSC
CD32/FL1
SSC
D
99,40
0,60
99,40
0,60
Material e Métodos
59
4.7 - Avaliação em Linfócitos
Os aspectos fenotípicos analisados na imunidade adaptativa (populações e
subpopulações de linfócitos) foram:
Aspectos fenotípicos de linfócitos T:
- Freqüência (%) de linfócitos T CD3
+
e CD5
+
- Freqüência (%) de linfócitos T CD3
+
e CD5
+Low
- Freqüência (%) de subpopulações de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
- Freqüência (%) de células CD18
+
em subpopulações de linfócitos T
- Expressão de MHC II
+
nas subpopulações de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
pela Intensidade Média de Fluorescência (IMF)
Aspectos fenotípicos de linfócitos B:
- Freqüência (%) de linfócitos B
- Freqüência (%) de linfócitos B CD32
+
Determinação da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD5
+
)
A análise da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD5
+
) foi realizada utilizando-se
a estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise consistiu na seleção da
população celular de interesse, baseada em aspectos morfométricos, através de
gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC (Figura 9A). Após a seleção da
região de interesse (R1) contendo células de fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, o percentual
de linfócitos T, dentro da população selecionada, foi obtido em gráficos
bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência CD3/FL2 versus CD5/FL1,
como exemplificado na Figura 9B.
Material e Métodos
60
FSC
SSC
CD3/FL2
AB
R1
CD5/FL1
0,819,6
78,41,2
0,819,6
78,41,2
Figura 9 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos T
CD3
+
CD5
+
, no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse - R1, com fenótipo FSC
Low
SSC
Low
. (B) Gráficos de distribuição pontual CD3/FL2 versus
CD5/FL1, contendo as células selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual
das subpopulações de linfócitos T CD3
+
CD5
+
. No quadrante superior à direita está indicado um
exemplo representativo das freqüências (%) correspondentes a cada quadrante dos gráficos
bidimensionais de fluorescência.
Determinação da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD5
+Low
)
Uma análise mais detalhada da freqüência de linfócitos T CD3
+
CD5
+
nos
permitiu identificar a presença de duas subpopulações distintas, que diferiam quanto
à intensidade de expressão da molécula CD5, sendo então classificadas como
linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
e linfócitos T CD3
+
CD5
+High
.
Com o objetivo de se caracterizar melhor os aspectos fenotípicos da
população de linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
, realizamos um protocolo de
imunofenotipagem adicional, a fim de identificar a co-expressão dos marcadores
CD4 e CD8 por essa população de linfócitos T. Para tal, foi feito um ensaio de
imunofenotipagem em plataforma de duas cores incluindo as combinações de
anticorpos monoclonais anti-CD3FL1/anti-CD5FL2 (Figura 10B), anti-CD4FL1/anti-
CD5FL2, anti-CD8FL1/anti-CD5FL2.
Material e Métodos
61
FSC
SSC
CD3/FL1
AB
R1
CD5/FL2
=20,3%
Figura 10 - Seqüência de procedimentos utilizados para caracterizar a população de
linfócitosCD3
+
CD5
+Low
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse - R1, com fenótipo FSC
Low
SSC
Low
. (B) Gráficos de distribuição pontual CD3/FL1 versus
CD5/FL2, contendo as células selecionadas na região R1, empregados para destacar o fenótipo
CD3
+
CD5
+Low
- retângulo.
Determinação da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD4
+
) e (CD3
+
CD8
+
)
A análise da freqüência de linfócitos T CD3
+
CD4
+
e T CD3
+
CD8
+
foi realizada
utilizando-se a estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise consistiu na
seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos morfométricos,
através de gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC (Figura 11A). Após a
seleção da região de interesse (R1) contendo células de fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, o
percentual de subpopulações T CD3
+
CD4
+
e T CD3
+
CD8
+
, dentro da população
selecionada, foi obtido em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de
fluorescência, como exemplificado nas Figuras 11B e 11C.
Material e Métodos
62
FSC
SSC
A
R1
CD3/FL2
B
CD4/FL1
37,328,8
33,60,3
37,328,8
33,60,3
38,326,4
35,20,1
38,326,4
35,20,1
C
CD3/FL2
CD8/FL1
Figura 11 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos T
CD3
+
CD4
+
e infócitos T CD3
+
CD8
+
, no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e
com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse - R1, com fenótipo FSC
Low
SSC
Low
. (B) Gráficos de distribuição pontual CD3/FL2 versus
CD4/FL1 contendo as células selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual
das subpopulações de linfócitos T CD4
+
(C) Gráficos de distribuição pontual CD3/FL2 versus
CD8/FL2 contendo as células selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual
das subpopulações de linfócitos T CD8
+
. Nos quadrantes superiores à direita estão indicados
exemplos representativos das freqüências (%) correspondentes a cada quadrante dos gráficos
bidimensionais de fluorescência.
Determinação da freqüência de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
expressando CD18
A análise das freqüências de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
expressando CD18
foi realizada utilizando-se estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise
consistiu na seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos
morfométricos, através de gráficos de distribuição pontual de FSC versus SSC
(Figuras 12A). Após a seleção da região de interesse (R1) contendo células de
Material e Métodos
63
fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, o percentual de subpopulações celulares CD18
+
, dentro da
população selecionada, foi obtido em gráficos bidimensionais de distribuição pontual
de CD4/FL1 ou CD8/FL1 versus CD18/FL2, como exemplificado nas Figuras 12B e
12C.
FSC
SSC
A
R1
CD4/FL1
B
CD18/FL2
47,848,8
2,11,3
47,848,8
2,11,3
34,856,4
3,75,1
34,856,4
3,75,1
C
CD8/FL1
CD18/FL2
Figura 12 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos TCD4
+
CD18
+
e T CD8
+
CD18
+
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse - R1com o fenótipo FSC
Low
SSC
Low
(B) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL1 versus
CD18/FL2, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o percentual
de Linfócitos T CD4
+
CD18
+
.(C) Gráfico de distribuição pontual CD8/FL1 versus CD18/FL2, contendo
as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o percentual de Linfócitos T
CD8
+
CD18
+
. Nos quadrantes superiores à direita estão indicados exemplos representativos das
freqüências (%) correspondentes a cada quadrante dos gráficos bidimensionais de fluorescência.
Material e Métodos
64
Determinação da intensidade média de fluorescência (IMF) de MHCII em linfócitos T
CD4
+
e CD8
+
A análise da expressão da molécula MHCII na população de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
foi realizada a partir da seleção da região de interesse (R1), baseada em
aspectos imunofenotípicos e morfométricos em gráficos de distribuição pontual de
CD4/FL2 versus SSC (Figuras 13A) ou CD8/FL2 versus SSC (Figuras 13C), para a
identificação da população de linfócitos CD4
+
ou CD8
+
como células CD4
+High
SSC
Low ou
CD8
+High
SSC
Low
, minimizando assim a contaminação da região
selecionada por linfócitos B e NK. Em seguida foram construídos histogramas de
MHCII/FL1 versus número de células para determinar a intensidade média de
fluorescência (IMF) para o marcador MHCII dentro da população de Linfócitos CD4
+
ou CD8
+
previamente selecionada em R1 (Figura 13B, 13D).
CD4/FL2
SSC
MHCII/FL1
Número de células
IMF=50,6
AB
R1
CD8/FL2
SSC
MHCII/FL1
Número de células
IMF=48,7
C
D
R2
Figura 13 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar a intensidade média de
fluorescência (IMF) de MHCII
em linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
do sangue periférico de cães imunizados
com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL2 versus SSC utilizado para a seleção da população celular
de interesse - R1. (B) Histograma de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) MHCII versus número
de células selecionadas na região R1, indicando um exemplo representativo dos valores de IMF. (C)
Gráfico de distribuição pontual CD8/FL2 versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse – R2. (D) Histograma de Intensidade Média de Fluorescência (IMF) MHCII versus número
de células selecionadas na região R2, indicando um exemplo representativo dos valores de IMF.
Material e Métodos
65
Determinação da freqüência de linfócitos B
A análise da freqüência de linfócitos B foi realizada utilizando-se a estratégia
de análise convencional. Esse tipo de análise consistiu na seleção da população
celular de interesse, baseada em aspectos morfométricos, através de gráficos de
distribuição pontual de FSC versus SSC (Figura 14A). Após a seleção da região de
interesse (R1) contendo células de fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, o percentual de
subpopulações celulares fluorescentes, dentro da população selecionada, foi obtido
em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência, como
exemplificado na Figura 14B.
A
Cel B/FL2
B
CD5/FL1
9,416,2
0,174,3
9,416,2
0,174,3
FSC
SSC
R1
Figura 14 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos B no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse - R1, com fenótipo FSC
Low
SSC
Low
. (B) Gráficos de distribuição pontual CD5/FL1 versus Cel.l
B/FL2 contendo as células selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual das
subpopulações de linfócitos B. No quadrante superior à direita está indicado um exemplo
representativo das freqüências (%) correspondentes a cada quadrante dos gráficos bidimensionais de
fluorescência.
Determinação da freqüência de linfócitos B CD32
+
A análise de linfócitos B CD32
+
foi realizada a partir da seleção da região de
interesse (R1), baseada em aspectos imunofenotípicos e morfométricos em gráficos
de distribuição pontual de Cel B/FL2 versus SSC (Figura 15A), para a identificação
da população de linfócitos B como células Cél. B
+High
SSC
Low
, minimizando assim a
Material e Métodos
66
contaminação da região selecionada por linfócitos T e NK. Em seguida foram
construídos gráficos de distribuição pontual de fluorescência Cél. B/FL2 versus
CD32/FL1, para determinar o percentual de células CD32
+
dentro da população de
linfócitos B previamente selecionada em R1 (Figura 15B).
SSC
A
R1
Cel B/FL2
B
CD32/FL1
99,40
0,60
99,40
0,60
Cel B/FL2
Figura 15 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos B CD32
+
no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual Cel B/FL2 versus SSC utilizado para a seleção da população
celular de interesse - R1 com o fenótipo Cél. B
+High
SSC
Low
(B) Gráfico de distribuição pontual Cél.
B/FL2 versus CD32/FL1, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar
o percentual de Linfócitos B CD32
+
. No quadrante superior à direita está indicado um exemplo
representativo das freqüências (%) correspondentes a cada quadrante do gráfico bidimensional de
fluorescência.
5 - Resposta imune celular no contexto in vitro
Para avaliação da resposta imune celular no contexto in vitro, 8 animais, que
serviram como controle, tiveram seu sangue avaliado anteriormente à vacinação
(tempo 0) e 6 animais submetidos a cada esquema de vacinação tiveram seu
sangue avaliado quarenta dias após a ultima dose da vacina.
Material e Métodos
67
Diagrama 2 - Desenho experimental no contexto in vitro – Cultura de CMSP
5.1 - Preparação do Antígeno Solúvel de Leishmania (ASL) utilizado na
estimulação das culturas de CMSP
5.1.1 - Obtenção da massa de promastigotas
Culturas de L. chagasi (cepa BH 46) foram mantidas em erlenmeyers
contendo meio ágar-sangue, Novy-Mac-Neal-Nicolle (NNN) associado ao Liver
Infusion Tryptose (LIT), em estufa B.O.D. a 24 ± 1°C, durante quatro dias.
Posteriormente, 10mL desta cultura foram adicionados em erlenmayers de
capacidade para 2,5L que continham 500mL de meio LIT. Depois de adicionados os
parasitos, as culturas foram mantidas em estufa a 24 ± 1°C. Diariamente as culturas
foram homogeneizadas por movimentos circulares suaves. Decorridos 10 dias,
alíquotas foram retiradas para constatação da viabilidade e certificação da ausência
de agentes contaminantes. Estando a cultura aprovada nestes quesitos, a mesma foi
centrifugada a 800 x g, durante 10 minutos a 4ºC para obtenção das formas
promastigotas. Então, o sobrenadante foi descartado e a massa de parasitos foi
ressuspendida em PBS (0,15M, pH 7.2) e centrifugada nas mesmas condições
anteriores. Tal procedimento de lavagem foi repetido por mais duas vezes. Por fim, a
massa obtida foi armazenada à -70º C, até o momento do preparo do extrato
antigênico.
8 Cães (PMMG- BH)
Sorologicamentenegativos
para LVC (RIFI e ELISA)
6 cães
LEISHVACIN
6 cães
LEISHMUNE
Protocolo de Imunização
21 dias
Sangue em heparina
para cultura CMSP
Sangue em heparina
para cultura CMSP
1
a
Dose 2
a
Dose 3
a
Dose
21 dias
Antes 40º Dia
8 Cães (PMMG- BH)
Sorologicamentenegativos
para LVC (RIFI e ELISA)
6 cães
LEISHVACIN
6 cães
LEISHMUNE
Protocolo de Imunização
21 dias
Sangue em heparina
para cultura CMSP
Sangue em heparina
para cultura CMSP
1
a
Dose 2
a
Dose 3
a
Dose
21 dias
Antes 40º Dia
Material e Métodos
68
5.1.2 - Preparo do Antígeno Solúvel de Leishmania (ASL)
Para obtenção desse antígeno, massa de Leishmania obtida conforme
descrito no item anterior (5.1.1) foi submetida a três ciclos de congelamento em
nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria a 37ºC. Após essa etapa, a
massa de parasitos foi submetida a três ciclos de rompimento mecânico utilizando-
se um homogeneizador elétrico com pistão de teflon (Virtis) por 1 minuto a 30 000
rpm com intervalos de 30 segundos. Em seguida, o material antigênico foi
ressuspendido em 25mL de PBS (0,15M, pH 7,2) e centrifugado a 50 000 x g por 1
hora e 30 minutos a 4C. O sobrenadante contendo o antígeno solúvel de
Leishmania foi coletado e transferido para membrana de diálise, e então dialisado
contra PBS (0,15M, pH 7,2) a 4C, sob agitação constante, durante 24 horas. Por
fim, o antígeno foi filtrado em filtros estéreis descartáveis, de 0,22 m em condições
de fluxo laminar.
Uma alíquota foi retirada para dosagem da concentração de proteínas pelo
método de Lowry (LOWRY et al., 1951). Alíquotas do antígeno com a concentração
protéica de 1000g/mL foram feitas e mantidas congeladas a -70C, até o momento
do uso.
5.2 - Obtenção de leucócitos do sangue periférico para fenotipagem no
contexto in vitro
Foram coletados aproximadamente 10mL de sangue periférico, utilizando-se
seringas plásticas estéreis e heparinizadas, que foram diluídos com 10mL de RPMI
heparinizado (com 3L de heparina a 5000UI/mL) e aplicados lentamente sobre
15mL de Ficoll-hypaque (HISTOPAQUE
®
1.077 - SIGMA Co. USA) gelado em tubos
de polipropileno de 50mL (Falcon
®
, Becton Dickinson), os quais foram centrifugados
a 700 x g por 40 minutos em temperatura ambiente. Após a coleta do anel de CMSP,
as células foram lavadas por 2 vezes pela centrifugação a 500 x g por 10 minutos a
4º C, sendo a primeira lavagem com RPMI 1640 heparinizado e a segunda somente
com RPMI 1640. Ao final, as células foram ressuspendidas em RPMI 1640 e
submetidas à contagem em câmara hemacitométrica de Neubauer: para isto, foram
utilizados 10L da suspensão celular, que foram diluídos em 190L de Solução de
Material e Métodos
69
Turcks (diluição 1:20). O valor obtido foi multiplicado pelo volume ressuspendido e
pela diluição e aí então, o volume final foi ajustado para 1x10
7
células/mL. Para
controle de qualidade do perfil celular e também para termos uma estimativa do
percentual das populações celulares presentes na suspensão, retiramos 30L da
suspensão celular fixamos com 200 L de MFF e as submetemos à leitura no
citômetro.
Para a cultura celular foram utilizadas placas de 24 poços, nos quais
adicionamos em 8 poços para cada cão, 800L de meio de cultura CM-Blast (10%
Soro Fetal Bovino / 1% de Estreptavidina/Penicilina, 2mM L-glutamina e 0,1% de -
mercaptoetanol, em RPMI 1640) específico para cultivo de células caninas, segundo
proposto por REIS (2001). Em 4 poços desta placa foram adicionados 100L do
antígeno solúvel de L. chagasi na concentração de 250g/mL, de modo que a
concentração final deste antígeno no sistema ficou de 25g/mL, e nos poços
controles, foram adicionados também 100L de RPMI 1640. Por fim, adicionamos
em todos os poços da placa, 100L da suspensão de células numa concentração
final de 1x10
6
células/poço da placa. As culturas foram, então, mantidas por cinco
dias em incubadora a 37C, contendo atmosfera de 5% de CO
2
. Logo após esta
etapa, foram adicionados em cada poço da placa 10L de Brefeldina (BFA a
1mg/mL) de forma a obter uma concentração final de 10g/mL e as amostras foram
incubadas por mais 4 horas nas mesmas condições anteriores. Então, as células
foram recolhidas em um tubo de poliestireno de 5mL e foram centrifugadas a 400 x
g, por 7 minutos a temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram acondicionados a
-70ºC para posterior estudo de dosagem de Óxido Nítrico (Conforme o item 6). As
células contidas no sedimento foram ressuspendidas por rápida passagem em
vórtex a baixa velocidade e, sobre elas, foram adicionados 400L de PBS
suplementado com 10% de soro fetal bovino (0,15M, pH 7,2).
Material e Métodos
70
5.3 - Ensaio de imunofenotipagem celular e marcação de citocinas
intracitoplasmáticas no contexto in vitro
Os anticorpos monoclonais utilizados nesta parte do trabalho estão descritos
na Tabela 2, e os mesmos foram diluídos em solução de PBS adicionado de 10% de
Soro Fetal Bovino (SFB) (0,15M, pH 7,2), em diluições previamente estabelecidas na
padronização do protocolo.
Nos tubos utilizados para a marcação fenotípica foram colocados 60L de
anticorpo diluído (anti-CD4-FITC ou anti-CD8-FITC). Como controles, foram
utilizados tubos onde foi adicionado PBS 10% SFB ao invés de anticorpos, as
células desses tubos foram utilizadas somente para análise do perfil celular e
controle negativo da reação. Em cada tubo de marcação (contendo 60 L dos
anticorpos diluídos) foram adicionados 200L da suspensão celular, obtida conforme
descrito no intem anterior (5.2.) As suspensões celulares foram submetidas à
agitação lenta no vórtex, e deixadas sob incubação por 30 minutos, a temperatura
ambiente e ao abrigo da luz. Em seguida, foram adicionados às células, 3mL de
solução de lise/tubo sob agitação no vórtex e as mesmas foram deixadas em
repouso por 10 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Posteriormente,
as amostras foram centrifugadas a 400 x g, por 7 minutos a temperatura ambiente.
Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se o tubo de uma só
vez, sendo a boca do tubo secada em papel toalha absorvente. As suspensões
celulares foram ressuspendidas por meio de agitação suave no vórtex. Foram
adicionados a cada amostra 3mL de PBS 10% SFB (0,15M, pH 7,2) para lavagem,
sendo executado novamente uma centrifugação, conforme descrito anteriormente.
Então, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se o tubo, posteriormente, as
células foram ressuspendidas em 0,5mL de PBS 10% SFB (0,15M, pH 7,2) e em
seguida, foram adicionados 3mL de PBS-P (PBS contendo 0,5% BSA, 0,5%
saponina e 0,1% de azida sódica) com o intuito de permeabilizar as células.
Novamente os tubos foram centrifugados a 400 x g durante 7 minutos a temperatura
ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se o tubo,
as células foram ressupendidas sob agitação lenta no vórtex em 100L de PBS-P.
Desta suspensão celular, foram retirados 35L para marcação com anti-IL-4 que
foram colocados em um tubo contendo 35L do anticorpo diluído 1:100 em PBS-P;
Material e Métodos
71
outros 35 L foram usados para marcação anti-INF-que também foram colocados
em um tubo contendo 35L do anticorpo diluído 1:100 em PBS-P. Os 30 L
restantes não foram marcados e serviram como controle. Os tubos foram incubados
por 30 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a incubação, as
células foram lavadas duas vezes, sendo a primeira com 3mL de PBS-P e a
segunda, com 3mL de PBS 10% SFB (0,15M, pH 7,2), através da centrifugação das
amostras a 400 x g, por 7 minutos, a temperatura ambiente. Após a segunda
lavagem, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se o tubo, a boca do mesmo foi
secada em papel absorvente, o sedimento ressuspendido em vórtex adicionando-se,
posteriormente, 200L de solução fixadora MFF e, posteriormente submetido ao
citômetro de fluxo para leitura de 30 mil eventos, procedimento realizado de
imediato, ou então, até 24 horas sob acondicionamento em geladeira.
Material e Métodos
72
Tabela 2 - Painel de Anticorpos monoclonais utilizados nos ensaios de imunofenotipagem celular e marcação de citocinas
intracitoplasmáticas no contexto in vitro - Cultura CMSP
Anticorpos*
Monoclonais
Hospedeiro
Clone
Fluorocromo
Diluição final
Célula alvo/ Resposta imune
Anti-CD4 canino
Rato YKIX302.9 FITC 1:70 Linfócitos T auxiliar
Anti-CD8 canino
Rato YCATE55.9 FITC 1:35 Céls. T supressoras e/ou citotóxicas
Anti-INF- bovino
Camundongo CC302 R-PE 1:200 Tipo 1
Anti-IL 4 bovino
Camundongo CC303 R-PE 1:200 Tipo 2
* Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela SEROTEC Ltd (Oxford - England).
Material e Métodos
73
5.4 - Estratégia de análise de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de
fluxo em culturas de CMSP
Determinação da freqüência de linfócitos T CD4
+
e linfócitos T CD8
+
expressando
citocinas intracitoplasmáticas (INF-
, IL-4)
A análise das freqüências de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
expressando
citocinas intracitoplasmáticas (INF-, IL-4) foi realizada utilizando-se a estratégia de
análise convencional. Esse tipo de análise consistiu na seleção da população celular
de interesse, baseada em aspectos morfométricos, através de gráficos de
distribuição pontual de FSC versus SSC (Figura 16A). Após a seleção da região de
interesse (R1) contendo células de fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, foram construídos
gráficos de distribuição pontual de fluorescência CD4/FL1 ou CD8/FL1 versus
IFN-FL2 ou IL-4/FL2, para determinar o percentual de células IFN-
+
e IL-4
+
dentro
da população de linfócitos previamente selecionada em R1. Como exemplo, abaixo,
está demonstrada a seqüência utilizada para análise em linfócitos T CD4
+
INF-
+
e T
CD4
+
IL-4
+
em cultura estimulada com ASL (Figura 16A e 16B); para análise de
linfócitos T CD8
+
foi empregada a mesma estratégia.
Material e Métodos
74
FSC
SSC
A
R1
CD4/FL1
IL-4/FL2
50,548,1
0,80,6
50,548,1
0,80,6
CD4/FL1
IFN-/FL2
53,246,0
0,70,1
53,246,0
0,70,1
BC
Figura 16 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de linfócitos T
CD4
+
IFN-
+
e TCD4
+
IL-4
+
na cultura de CMSP de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
.
(A) Gráfico de distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de
interesse - R1 com o fenótipo FSC
Low
SSC
Low
(B) Gráfico de distribuição pontual CD4/FL1 versus IFN-
/FL2 contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o percentual de
Linfócitos T CD4
+
IFN- em cultura estimulada com ASL (B) Gráfico de distribuição pontual
fluorescência CD4/FL1 versus IL-4/FL2, contendo as células selecionadas na região R1, empregado
para quantificar o percentual de Linfócitos T CD4
+
IL-4
+
em cultura estimulada com ASL. Nos
quadrantes superiores à direita estão indicados exemplos representativos das freqüências (%)
correspondentes a cada quadrante dos gráficos bidimensionais de fluorescência.
6 - Avaliação da produção de óxido nítrico por células mononuclerares do
sangue periférico
O óxido nítrico (NO) é um gás altamente reativo que possui uma vida média
de aproximadamente 6 a 30 segundos, sendo rapidamente oxidado, gerando nitrito
(NO
-2
) e nitrato (NO
-
3
). Dessa forma, a quantificação da síntese de óxido nítrico por
Material e Métodos
75
células mononucleares do sangue periférico, após estimulação antígeno-específica
in vitro foi realizada, indiretamente, através da medida de Nitrito no sobrenadante
das culturas de CMSP.
Os sobrenadantes foram coletados conforme descrito no item (5.2) do material
e métodos. As amostras foram descongeladas e alíquotas de 100L foram
incubadas com 100L do reagente de Griess (GREEN et al., 1992) em placas de 96
poços (FALCON
®
- BECTON DICKSON), em duplicata e incubados a temperatura
ambiente por 10 minutos. A seguir, foi determinada a absorbância em leitor de
ELISA com filtro de 540nm. O reagente de Griess foi preparado no momento do uso,
misturando-se partes iguais da solução A (sulfanilamida 1% em H3PO4 2,5% -
MERCK) e da solução B (naftilenodiamina 0,1% em água bidestilada). Os resultados
foram determinados após a extrapolação de valores obtidos de uma curva padrão
realizada com nitrito de sódio (NaNO
2
- VETEC) nas concentrações de 0,78 a
100para cada placa.
Os resultados foram expressos considerando-se duas abordagens, uma, onde
foi expresso o valor da concentração de nitrito em M obtido em cada uma das
culturas e a outra, dada pela concentração de nitrito em M por monócitos. Para
esta segunda abordagem, o valor de nitrito em M obtido na cultura foi dividido pelo
número absoluto de monócitos presentes na suspensão de células mononucleares
submetidas à cultura in vitro.
7 - Antigenicidade avaliada através da citometria de fluxo e da Reação de
Imunofluorescência indireta (RIFI)
Para avaliação da resposta imune humoral, no tempo zero e 40 dias após o
processo vacinal, todos os cães foram submetidos a acompanhamento sorológico
pela técnica de citometria de fluxo e RIFI.
7.1 - Pesquisa de anticorpos da classe IgG e subclasses IgG1 e IgG2 pela
citometria de fluxo
7.1.1 - Obtenção de formas promastigotas de Leishmania chagasi para utilização
como antígeno
Material e Métodos
76
Formas promastigotas de L. chagasi (cepa BH 46) cultivadas conforme
descrito item 5.1.1. foram fixadas em MFF e avaliadas no citômetro de fluxo, a fim de
verificar parâmetros como número aproximado de parasitos e aspecto da população
(homogeneidade e ausência de contaminação). As culturas em que os parasitos
apresentaram perfeito perfil de tamanho e granulosidade, foram lavadas três vezes
com PBS 10% SFB (0,15M, pH 7,2), através de centrifugação a 900 x g, por 10
minutos a 4º C. Após as lavagens, os parasitos foram ressuspendidos em pequeno
volume de PBS 10% SFB. Foi realizada uma contagem em hemocitômetro de
Neubauer para ajuste da concentração celular para 5x10
6
/mL, com posterior
armazenamento das promastigotas a 4
o
C, até o momento de uso.
7.2 - Preparação das amostras de plasma para avaliação pela citometria de
fluxo
Os plasmas foram obtidos pela centrifugação a 800 x g por 15 minutos a 4ºC
das amostras de sangue periférico coletadas em EDTA conforme item (3.1.1). Após
a separação, os plasmas foram aliquotados em microtubos de 1,5mL e mantidos
congelados em freezer a -20ºC, até o momento do uso. Para realização dos
experimentos, as amostras de plasmas foram descongeladas e submetidas a uma
diluição inicial de 1:128 (previamente padronizada) em solução de PBS 3% de soro
fetal bovino (SIGMA CHEMICAL CORP., St. Louis, MO). As amostras de plasmas
diluídas foram centrifugadas a 15000 x g por 5 minutos a 4C, e os sobrenadantes
foram utilizados para preparar as diluições subseqüentes (1:128 a 1: 65.536) usadas
para os ensaios de citometria de fluxo.
7.3 - Metodologia empregada para a avaliação da reatividade de IgG e
subclasses IgG1 e IgG2 de cães vacinados a formas promastigotas de L.
chagasi
Para a realização dos ensaios foram usadas microplacas de 96 poços de
fundo em “U” (NUNC, Denmark), na qual foram adicionados 50L dos plasmas
diluídos em PBS 10% SBF (1:128 a 1:65536) e 50L da suspensão de parasitos
fixados obtidos conforme o item (7.1.1). A mistura foi incubada a 37ºC por 30
minutos, lavada duas vezes com 150L de PBS 10% SBF por centrifugação a 900 x
g, 10 minutos a 4ºC, sendo o sobrenadante desprezado. Os parasitos foram
Material e Métodos
77
reincubados com anticorpos anti-IgG ou anti-IgG1 ou anti-IgG2 conjugados com
FITC (BETHYL Laboratories, INC - Texas/EUA) a 37ºC por 30 minutos, a
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Os parasitos foram lavados duas vezes
com 150L de PBS 10% SBF por centrifugação a 900 x g, por 10 minutos a 4ºC, e o
sobrenadante foi desprezado. Em seguida, os parasitos foram fixados com 200L
MFF e mantidos a 4ºC por 30 min para posterior leitura de 10 mil eventos no
citômetro de fluxo.
7.4 - Aquisição e análise dos dados da pesquisa de reatividade de IgG e
subclasses IgG1 e IgG2 de cães vacinados a formas promastigotas de L.
chagasi
A análise da reatividade de anticorpos anti-L. chagasi foi feita inicialmente
pela seleção da população celular de interesse. Por se tratar de uma população de
pequeno tamanho e pequena complexidade interna, os ganhos de tamanho e
granulosidade (E00 e 300, respectivamente) foram empregados na escala logarítima
para permitir a identificação dos parasitos. Formas promastigotas apresentaram
uma distribuição característica e homogênea em gráficos bidimensionais de
tamanho versus granulosidade, o que permitiu o posicionamento de uma região
correspondente à população de interesse (R1) (Figura 17A). Utilizando-se
histogramas de intensidade de fluorescência em função do número de parasitos,
pôde-se analisar a intensidade de fluorescência relativa apresentada pela
população selecionada. Os resultados das análises de fluorescência apresentados
pelos parasitos, após incubação com plasmas dos cães e o respectivo sistema
reagente/fluorocromo, foram expressos sob a forma de percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP), observados para cada teste individual em relação
ao controle do conjugado.
O PPFP foi determinado para cada amostra, através do estabelecimento de
um limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o
controle da ligação inespecífica do conjugado (Figura 17B). Para cada experimento
foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 2% de PPFP para o controle
do conjugado. Em seguida, empregando-se o mesmo marcador (M1) foram obtidos
os valores de PPFP para amostras individuais (Figura 17C). Para cada conjunto de
Material e Métodos
78
ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando-se o controle do conjugado
daquele experimento.
FSC
SSC
A
B
R1
C
95,05%
Intensidade de fluorescência
Número de parasitos
0,71%
4,74%
Figura 17 - Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de parasitos
fluorescentes.
(A) Gráfico representa o perfil obtido pela distribuição pontual FSC versus SSC das formas
promastigotas de culturas fixadas de L. chagasi. R1 é a região da população de interesse
selecionada. (B) Representação do controle negativo das reações de imunofenotipagem através de
histogramas de fluorescência FL1 versus número de células.(C) Representação do controle positivo
das reações de imunofenotipagem através de histogramas de fluorescência FL1 versus número de
células. M1 marcador utilizado para analisar a intensidade de fluorescência das células presentes na
região selecionada.
Material e Métodos
79
8 - Pesquisa de anticorpos da classe IgG pela Reação de Imunofluorescência
Indireta (RIFI)
A resposta imune humoral foi avaliada no plasma de cães também pela RIFI,
empregando-se o KIT de Biomanguinhos, FIOCRUZ, RJ. Esse kit possui um
conjugado específico anti-IgG molécula total de cão. A diluição ótima do conjugado
foi determinada por titulação em bloco, empregando-se soros padrões positivos e
negativos, obtendo-se 1:40 para IgG-total. Desse modo, animais com títulos de IgG
superiores 1:40 foram considerados positivos. Os resultados foram expressos em
títulos de anticorpos, obtidos por diluição seriada do soro por fator 2, até o encontro
de resultado negativo ou ponto de titulação.
9 - Análise estatística dos dados
Inicialmente, a natureza paramétrica ou não paramétrica dos dados foi
avaliada considerando-se o seu grau de independência, normalidade e variância,
empregando-se o programa estatístico Minitab versão 11.0 (San Diego, USA). As
demais análises estatísticas foram realizadas, empregando-se o software GraphPad
Prism 3.03. Para dados apresentando uma distribuição paramétrica, foi empregada a
análise de variância (ANOVA), seguida pelo Teste de Tukey. Para dados com
distribuição não paramétrica foi empregado o teste Kruskal-wallis, seguido pelo
Teste de Dunns. Análises de correlação entre variáveis de distribuição paramétrica
ou não paramétrica foram realizadas pelos testes de Pearson ou Spearman,
respectivamente. As análises da reatividade de imunoglobulinas foram realizadas
através de uma analise estatística adicional pela avaliação da curva “receiver
operating characteristic curve” ROC, utilizando-se o programa estatístico MedCalc
versão 7.7.0.0 (Alexandria, USA). Análises de freqüência foram realizadas através
do Web Chi Square Calculator (http://www.georgetown.edu/faculty
/ballc/webtools/web_chi.html) Em todas as análises, as diferenças foram
consideradas significativas quando p≤0,05.
RESULTADOS
Resultados
81
I . Cinética do perfil hematológico do sangue periférico canino no contexto ex-
vivo, desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
Resultados
82
I.1. Cinética do perfil hematológico desencadeada pela imunização com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
: ênfase em subpopulações leucocitárias.
Considerando a complexidade e o grande número de informações geradas
em nosso estudo, será adotado um critério padrão de apresentação dos resultados,
no qual os valores numéricos de cada variável serão incluídos entre parênteses
após a descrição da análise estatística. Os valores numéricos aparecerão sempre
em ordem cronológica, ou seja, referentes ao período pré-vacinal (ANTES), tempo
precoce pós-vacinal (1ª Dose), tempo intermediário pós-vacinal (2ª Dose) e tempo
tardio pós-vacinal (3ª Dose). A cor preta será empregada para o período pré-vacinal
(ANTES), a cor vermelha para os tempos pós-vacinais da LEISHVACIN e a cor azul
para os tempos pós-vacinais da LEISHMUNE
®
. Setas serão empregadas para
orientar o sentido das alterações estatisticamente significativas (p< 0,05), sempre
em relação ao período pré-vacinal: aumento (↑) ou diminuição (↓).
Um aspecto relevante nos estudos que visam avaliar alterações no perfil
fenotípico de leucócitos circulantes consiste em considerar inicialmente a freqüência
dos parâmetros hematológicos do leucograma a fim de estabelecer a relevância da
apresentação dos resultados do perfil fenotípico sob a forma de valores relativos ou
absolutos. De um modo geral, situações clínicas que são acompanhadas de
alterações significativas nos valores absolutos de populações leucocitárias sugerem
a importância da avaliação subseqüente da freqüência de perfis fenotípicos distintos
expressos em valores absolutos. Por outro lado, situações acompanhadas por
valores inalterados do leucograma, sugerem a relevância da avaliação da freqüência
expressa em valores relativos, a fim de se estabelecer uma idéia de balanço entre
populações com perfis fenotípicos distintos.
A cinética dos parâmetros hematológicos desencadeada pela imunização com
a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
está apresentada na Tabela 3. A análise dos
dados não demonstrou alterações significativas no número absoluto de leucócitos
totais (LEISHVACIN = 12,51,9; 13,52,3; 13,92,6; 14,43,7 e LEISHMUNE
®
=
13,72,6; 15,03,1; 15,13,8; 15,63,2), bem como na freqüência de subpopulações
leucocitárias: granulócitos (LEISHVACIN = 4,61,9; 5,62,1; 5,21,8; 6,01,8 e
LEISHMUNE
®
= 5,01,8; 6,62,5; 6,62,7; 6,21,8) monócitos (LEISHVACIN = 3,40,8;
Resultados
83
3,60,7; 3,40,8; 3,7 e LEISHMUNE
®
= 3,80,7; 3,90,9; 3,61,0; 4,21,2) e linfócitos
(LEISHVACIN = 4,51,4; 4,41,1; 5,41,9; 4,81,4 e LEISHMUNE
®
= 4,81,0; 4,40,9;
5,01,3; 5,21,7) quando avaliados nos três tempos pós-vacinais, nos dois grupos de
animais avaliados.
Considerando a ausência de alterações na freqüência de leucócitos
circulantes expressa em valores absolutos, os resultados das análises fenotípicas
serão apresentados sob a forma de valores relativos.
Resultados
84
Tabela 3 - Leucometria do sangue periférico de cães submetidos à vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
Os resultados estão expressos como média do número de células/mm
3
de sangue periférico ± desvio padrão.
VACINA
LEISHVACIN LEISHMUNE
®
Parâmetro Hematológico
ANTES 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose ANTES 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose
Leucócitos Totais (x 10
3
/mm
3
) 12,51,9
13,5
2,3
13,92,6
14,43,7
13,72,6
15,03,1
15,13,8
15,63,2
Granulócitos (x 10
3
/mm
3
)
4,6
1,9
5,6
2,1 5,21,8 6,01,8 5,01,8 6,62,5 6,62,7 6,21,8
Monócitos (x 10
3
/mm
3
) 3,40,8 3,60,7 3,40,8 3,71,4 3,80,7 3,90,9 3,61,0 4,21,2
Linfócitos (x 10
3
/mm
3
) 4,51,4 4,41,1 5,41,9 4,81,4 4,81,0 4,40,9 5,01,3 5,21,7
Resultados
85
II . Cinética do perfil imunofenotípico de leucócitos do sangue periférico
canino no contexto ex-vivo, desencadeada pela imunização com a
LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
Resultados
86
Nesse trabalho os resultados referentes aos aspectos fenotípicos de
leucócitos circulantes foram expressos sob duas formas distintas: “valor percentual
(%)” de células expressando um determinado marcador fenotípico na população
celular de interesse e “intensidade média de fluorescência (IMF)” da densidade de
expressão de um determinado marcador fenotípico na população celular de
interesse. A primeira abordagem foi empregada para quantificar fenótipos celulares
que apresentam distribuição bimodal, ou seja, existem populações positivas e
populações negativas para o referido marcador fenotípico. Nesse caso, foi
considerada a freqüência percentual da subpopulação celular expressando o
marcador fenotípico de interesse. Na segunda abordagem foi utilizada uma análise
semi-quantitativa da expressão de marcadores fenotípicos que possuem distribuição
unimodal, ou seja, toda a população celular de interesse expressa constitutivamente
o referido marcador fenotípico. Nessas situações, alterações na densidade de
expressão podem ocorrer, caracterizando o deslocamento da população celular ao
longo do eixo da intensidade de fluorescência. Nesse caso, os resultados foram
expressos como intensidade média de fluorescência (IMF) obtida em escala
logarítmica.
II.1. Cinética do perfil fenotípico de leucócitos do sangue periférico canino,
desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
:
ênfase na resposta imune inata (NEUTRÓFILOS, EOSINÓFILOS, MONÓCITOS)
II.1.1 - Cinética de alterações imunofenotípicas em NEUTRÓFILOS circulantes
de cães submetidos à vacinação.
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em NEUTRÓFILOS
A Tabela 4 mostra os resultados da expressão de CD18 por neutrófilos do
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
,
avaliada através da intensidade média de florescência.
A análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN
e LEISHMUNE
®
apresentaram uma queda na expressão de CD18 no tempo precoce
pós-vacinal que se manteve no tempo intermediário e tardio. (LEISHVACIN =
Resultados
87
78,7±26,5; 53,8±20,4; 41,9±7,6; 35,3±9,3 e LEISHMUNE
®
= 76,7±30,0; 47,1±11,1;
42,3±11,2; 35,4±8,2).
Percentual de NEUTRÓFILOS MHCI
+
A Tabela 4 mostra os resultados da freqüência de neutrófilos MHCI
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN
apresentam queda no percentual de neutrófilos MHCI
+
no tempo precoce pós-
vacinal, não havendo alterações significativas nos tempos intermediário e tardio.
(LEISHVACIN = 4,2±4,7; 1,2±0,9; 1,7±0,6; 1,8±0,8). Os animais imunizados com a
LEISHMUNE
®
apresentaram uma queda no percentual de neutrófilos MHCI
+
no
tempo precoce pós-vacinal em relação ao período pré-vacinal, que se manteve nos
tempos intermediário e tardio. (LEISHMUNE
®
= 3,6±2,3; 0,6±0,2; 0,8±0,6;
0,9±0,4)
+
.
Percentual de NEUTRÓFILOS MHCII
+
A Tabela 4 mostra os resultados da freqüência de neutrófilos MHCII
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados mostrou que os animais imunizados tanto com a LEISHVACIN
quanto com a LEISHMUNE
®
apresentaram aumento significativo no percentual de
neutrófilos MHCII
+
no tempo precoce pós-vacinal, que se manteve nos tempos
intermediário e tardio. (LEISHVACIN = 0,5±0,2; 1,9± 0,7; 3,8±1,6; 2,1±0,4 e
LEISHMUNE
®
= 0,8± 0,4; 1,6±0,3; 3,4±0,7; 1,8±0,5).
Percentual de NEUTRÓFILOS CD32
+
A Tabela 4 mostra os resultados da freqüência de neutrófilos CD32
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN e
LEISHMUNE
®
apresentaram queda significativa no percentual de neutrófilos CD32
+
no tempo precoce pós-vacinal, que se manteve nos tempos intermediário e tardio.
Resultados
88
(LEISHVACIN = 1,7±1,7; 0,4±0,4; 0,4±0,2; 0,6±0,7 e LEISHMUNE
®
= 1,3±0,8;
0,5±0,4; 0,3±0,2; 0,3±0,3).
Resultados
89
Tabela 4 - Cinética de alterações fenotípicas em NEUTRÓFILOS circulantes de cães submetidos à vacinação com LEISHVACIN e
LEISHMUNE
®
.
*Resultados expressos sob a forma de intensidade média de Fluorescência. # Resultados expressos sob a forma de percentual de células fluorescentes dentro da população celular de interesse.
representam as diferenças significativas (p<0,05) em relação ao tempo “Antes”.
VACINA
LEISHVACIN LEISHMUNE
®
Fenótipo
ANTES 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose ANTES 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose
CD18 em Neutrófilo (IMF)
*
78,7±26,5
53,8
±20,4
41,9±7,6
35,3±9,3
76,7
±30,0
47,1
±11,1
42,3±11,2
35,4±8,2
Neutrófilo MHCI
+
(%)
#
4,2±4,7
1,2
±0,9
1,7
±0,6 1,8±0,8 3,6±2,3
0,6
±0,2
0,8±0,6
0,9±0,4
Neutrófilo MHCII
+
(%)
#
0,5±0,2
1,9
±0,7
3,8±1,6
2,1±0,4
0,8
±0,4
1,6
±0,3
3,4±0,7
1,8±0,5
Neutrófilo CD32
+
(%)
#
1,7±1,7
0,4
±0,4
0,4±0,2
0,6±0,7
1,3
±0,8
0,5
±0,4
0,3±0,2
0,3±0,3
Resultados
90
II.1.2- Cinética de alterações fenotípicas em EOSINÓFILOS circulantes de cães
submetidos à vacinação.
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em EOSINÓFILOS
A Tabela 5 mostra os resultados da expressão de CD18 em eosinófilos do
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
,
avaliada através da intensidade média de florescência.
A análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN
apresentaram um aumento na expressão de CD18 em eosinófilos no tempo precoce
pós-vacinal que se manteve no tempo intermediário do processo de vacinação
(LEISHVACIN = 64,6
±13,3; 103,8±30,3 e 89,5±28,6; 75,2±23,9). Nenhuma alteração
significativa foi observada em cães vacinados com a LEISHMUNE
®
(LEISHMUNE
®
=
65,7±26,8; 82,2±26,7; 88,3±23,5; 79,6±24,5).
Percentual de EOSINÓFILOS MHCI
+
A Tabela 5 mostra os resultados da freqüência de eosinófilos MHCI
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados mostrou que os animais imunizados tanto com a LEISHVACIN
quanto com a LEISHMUNE
®
não apresentaram diferenças significativas no
percentual de eosinófilos MHCI
+
em relação ao período pré-vacinal. (LEISHVACIN =
5,7±5,2; 2,6±3,8; 2,3±2,9; 2,9±3,5 e LEISHMUNE
®
= 3,8±5,0; 0,9±1,4; 1,2±1,0;1,3±1,0).
Percentual de EOSINÓFILOS MHCII
+
A Tabela 5 mostra os resultados da freqüência de eosinófilos MHCII
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados não demonstrou diferença significativa no percentual de
eosinófilos MHCII
+
nos animais imunizados tanto com a LEISHVACIN quanto com a
LEISHMUNE
®
. (LEISHVACIN = 0,6±0,8; 0,4±0,7; 0,3±0,3; 0,4±0,4 e LEISHMUNE
®
=
0,4±0,2; 0,3±0,4; 0,3±0,1; 0,4±0,3).
Resultados
91
Percentual de EOSINÓFILOS CD32
+
A Tabela 5 mostra os resultados da freqüência de eosinófilos CD32
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados não mostrou diferença significativa no percentual de eosinófilos
CD32
+
nos animais imunizados com a LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
(LEISHVACIN
= 2,0±2,6; 1,0±2,1; 0,6±0,5; 0,2±0,1 e LEISHMUNE
®
= 2,3±5,1; 0,5±0,8; 0,6±0,5; 0,4±0,6)
Resultados
92
Tabela 5 - Cinética de alterações fenotípicas em EOSINÓFILOS circulantes de cães submetidos à vacinação com LEISHVACIN e
LEISHMUNE
®
.
VACINA
LEISHVACIN LEISHMUNE
®
Fenótipo
Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose
CD18 em Eosinófilo (IMF)
*
64,6±13,3
103,8
±30,3
89,5±28,6
75,2
±23,9 65,7±26,8 82,2±26,7 88,3±23,5 79,6±24,5
Eosinófilo MHCI
+
(%)
#
5,7±5,2 2,6±3,8 2,3±2,9 2,9±3,5 3,8±5,0 0,9±1,4 1,2±1,0 1,3±1,0
Eosinófilo MHCII
+
(%)
#
0,6±0,8 0,4±0,7 0,3±0,3 0,4±0,4 0,4±0,2 0,3±0,4 0,3±0,1 0,4±0,3
Eosinófilo CD32
+
(%)
#
2,0±2,6 1,0±2,1 0,6±0,5 0,2±0,1 2,3±5,1 0,5±0,8 0,6±0,5 0,4±0,6
*Resultados expressos sob a forma de intensidade média de Fluorescência. # Resultados expressos sob a forma de percentual de células fluorescentes dentro da população celular de interesse.
representam as diferenças significativas (p<0,05) em relação ao tempo “Antes”.
Resultados
93
II.1.3 - Cinética de alterações fenotípicas em MONÓCITOS circulantes de cães
submetidos à vacinação.
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em MONÓCITOS
A Tabela 6 mostra os resultados da expressão de CD18 por monócitos do
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
,
avaliada através da intensidade média de florescência.
A análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN
apresentaram um aumento significativo na expressão de CD18 no tempo
intermediário do processo de vacinação (LEISHVACIN = 137,5
±64,3; 155,5±58,7;
169,0±44,0; 105,5±32,8). Já nos cães vacinados com a LEISHMUNE
®
não foram
observadas alterações significativas em nenhum tempo analisado (LEISHMUNE
®
=
139,4±57,3; 164,13±55,2; 148,2±26,3; 127,7±39,1).
Percentual de MONÓCITOS MHCI
++
A Tabela 6 mostra os resultados da freqüência de monócitos MHCI
++
(MHCI
+HIGH
) no sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
. A análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a
LEISHVACIN apresentaram uma redução na expressão de MHCI no tempo
intermediário e tardio pós-vacinal (LEISHVACIN = 10,6
±5,4; 7,9±4,6; 6,6±3,1;
7,3
±4,5). Por outro lado animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram uma
redução na expressão de MHCI no tempo precoce e intermediário pós-vacinal
(LEISHMUNE
®
= 19,5±18,5; 7,5±6,9; 6,7±6,4 e 12,8±15,9).
Percentual de MONÓCITOS MHCII
+
A Tabela 6 mostra os resultados da freqüência de monócitos MHCII
+
no
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN
apresentaram uma redução no percentual de monócitos MHCII
+
no tempo tardio pós-
vacinal (LEISHVACIN = 76,8±6,3; 77,5±8,6; 76,7±8,4 e 71,8±8,9). Por outro lado, os
cães vacinados com a LEISHMUNE
®
não apresentaram diferenças significativas no
Resultados
94
percentual de monócitos MHCII
+
nos tempos avaliados (LEISHMUNE
®
= 74,9±4,8;
76,7±5,8; 74,5±9,2; 72,7±5,7).
Percentual de MONÓCITOS CD32
+
A Tabela 6 mostra a freqüência de monócitos CD32
+
do sangue periférico de
cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A análise dos dados
mostrou que os animais imunizados com a LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
não
apresentam alterações significativas no percentual de monócitos CD32
+
em qualquer
tempo analisado. (LEISHVACIN = 1,7±1,1; 1,7±1,2; 0,8±0,6; 1,3±0,8 e LEISHMUNE
®
=
3,5±4,9; 1,6±0,8; 1,4±1,1; 1,0±0,6)
Resultados
95
Tabela 6 - Cinética de alterações fenotípicas em MONÓCITOS circulantes de cães submetidos à vacinação com LEISHVACIN e
LEISHMUNE
®
.
VACINA
LEISHVACIN LEISHMUNE
®
Fenótipo
Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose
CD18 em Monócitos (IMF)
*
137,5±64,3 155,5±58,7
169,0
±44,8
105,5
±32,8 139,4±57,3 164,13±55,2 148,2±26,3 127,7±39,1
Monócitos MHCI
+
(%)
#
10,6±5,4 7,9±4,6
6,6
±3,1
7,3±4,5
19,5
±18,5
7,5
±6,9
6,7±6,4
12,8
±15,9
Monócitos MHCII
++
(%)
#
76,8±6,3 77,5±8,6 76,7±8,4
71,8
±8,9
74,9
±4,8 76,7±5,8 74,5±9,2 72,7±5,7
Monócitos CD32
+
(%)
#
1,7±1,1 1,7±1,2 0,8±0,6 1,3±0,8 3,5±4,9 1,6±0,8 1,4±1,1 1,0±0,6
*Resultados expressos sob a forma de intensidade média de Fluorescência. # Resultados expressos sob a forma de percentual de células fluorescentes dentro da população celular de interesse.
representam as diferenças significativas (p<0,05) em relação ao tempo “Antes”.
Resultados
96
III . Caracterização de aspectos fenotípicos de células envolvidas na
IMUNIDADE ADAPTATIVA de cães imunizados com a LEISHVACIN e
LEISHMUNE®: ênfase em LINFÓCITOS T e LINFÓCITOS B.
Resultados
97
III.1- Cinética de alterações imunofenotípicas em LINFÓCITOS T circulantes de
cães submetidos à vacinação.
III.1.1 - Percentual de LINFÓCITOS T(CD3
+
CD5
+
)
A Tabela 7 mostra os resultados da freqüência de linfócitos T (CD3
+
CD5
+
) no
sangue periférico de cães imunizados com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
. A análise
dos resultados mostrou que cães imunizados com a LEISHVACIN não apresentaram
diferenças significativas no percentual de linfócitos T (CD3
+
CD5
+
) nos tempos
analisados (LEISHVACIN = 66,3±17,9; 76,8± 8,0; 78,7± 7,4; 75,4± 6,5). Por outro lado, os
animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento no percentual de
linfócitos T (CD3
+
CD5
+
) no tempo intermediário do processo vacinal (LEISHMUNE
®
=
71,5
± 9,7; 77,1± 6,8; 81,0±5,2; 77,6± 5,6).
III.1.2 - Percentual de subpopulação LINFÓCITOS T (CD3
+
CD5
+Low
)
Uma análise mais detalhada da freqüência de linfócitos T CD3
+
CD5
+
nos
permitiu identificar a presença de duas subpopulações distintas, que diferiam quanto à
intensidade de expressão da molécula CD5, sendo então classificadas como:
linfócitos T CD3
+
CD5
+High
e Linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
.
A analise dos dados demonstrou que animais imunizados com a LEISHVACIN
não apresentaram alterações significativas no percentual de linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
durante o processo vacinal (LEISHVACIN = 22,6±9,4; 27,5±10,7; 28,2±12,3; 24,8±12,5).
Por outro lado, os animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram um
aumento significativo no percentual de linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
no tempo
intermediário do processo vacinação (LEISHMUNE
®
= 21,8±6,2; 23,7±4,8; 27,1±7,4;
23,6±5,6).
Com o objetivo de caracterizar melhor os aspectos fenotípicos da população de
linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
, realizamos um protocolo de imunofenotipagem adicional, a
fim de identificar a co-expressão dos marcadores CD4 e CD8 por essa população de
linfócitos T. Para tal, alíquotas de sangue periférico coletado em EDTA foram
submetidas a um ensaio de imunofenotipagem em plataforma de duas cores inlcuindo
as combinações de anticorpos monoclonais anti-CD3 FITC/anti-CD5 PE (Figura 18B),
anti-CD4 FITC/anti-CD5 PE (Figura 18C), anti-CD8 FITC/anti-CD5 PE (Figura 18D).
Como demonstrado nas Figuras 18B, 18C e 18D, em sua quase totalidade, os
Resultados
98
linfócitos T CD5
+Low
co-expressam o marcador CD3 (Figura 18B) e CD8 (Figura 18D),
não co-expressando o marcardor CD4 (Figura 18C). Esse dado consiste numa
informação pioneira no âmbito da imunofenotipagem de células caninas.
Figura 18 - Gráficos de densidade representativos da imuofenotipagem de linfócitos do sangue
periférico canino.
(A) perfil de distribuição celular por FSC versus SSC destacando a população de linfócitos – elipse. (B)
Perfil imunofenotípico dos linfócitos selecionados em “A” avaliados em função da presença dos
marcadores CD3 e CD5, destacando o fenótipo CD3+CD5+Low - retângulo. (C) Perfil imunofenotípico
dos linfócitos selecionados em “A” avaliados em função da presença dos marcadores CD4 e CD5,
destacando o fenótipo CD4-CD5+Low - retângulo. (D) Perfil imunofenotípico dos linfócitos selecionados
em “A” avaliados em função da presença dos marcadores CD8 e CD5, destacando o fenótipo
CD8+CD5+Low - retângulo.
FSC
SSC
CD3/FL1
AB
R1
CD5/FL2
CD4/FL1
CD5/FL2
D
C
CD8/FL2
CD5/FL2
=20,3%
=20,5%
=19,9%
Resultados
99
III.1.3– Percentual de subpopulações de LINFÓCITOS T CD4
+
A Tabela 7 mostra os resultados das freqüências de linfócitos T CD4
+
no
sangue periférico dos cães vacinados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa na freqüência de
linfócitos T CD4
+
em animais imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
em todos os tempos analisados (LEISHVACIN = 34,7±6,6; 36,1±7,2; 36,8±6,0; 38,3±6,1 e
LEISHMUNE
®
= 38,9±7,9; 39,8±6,6; 41,1±7,8; 42,5±5,9)
III.1.4 – Percentual de subpopulações de LINFÓCITOS T CD8
+
A Tabela 7 mostra os resultados das freqüências de linfócitos T CD8
+
no
sangue periférico dos cães vacinados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados mostrou que animais imunizados com a LEISHVACIN o percentual
de linfócitos T CD8
+
permaneceu inalterado durante o processo vacinal (LEISHVACIN
= 31,2±8,2; 31,8±10,0; 35,1±11,2; 32,3±10,8). Por outro lado, nos animais imunizados
com a LEISHMUNE
®
foi observado um aumento no percentual de linfócitos T CD8
+
no
tempo intermediário do processo vacinação (LEISHMUNE
®
= 26,7±5,2; 28,2±3,8;
31,6±4,5; 28,5±3,9).
Análises complementares de correlação confirmaram a estreita associação
entre a elevada freqüência da população de linfócitos T CD8
+
e a freqüência de
linfócitos TCD3
+
CD5
+Low
no sangue periférico de cães vacinados com a LEISHMUNE
®
no período intermediário pós-vacinal. (Pearson r =0,8282, p=0,0016). Considerando
que quase todos os linfócitos CD5
+Low
co-expressam o marcador CD8 (Figura 19D),
nossos dados sugerem que a expansão de linfócitos T CD8
+
observados no período
intermediário pós-vacinação com LEISHMUNE
®
reflita uma expansão seletiva de
linfócitos T CD8
+
CD5
+Low
.
Resultados
100
15 40
20
45
Linfócito T CD3
+
CD5
Low+
Linfócito T CD8
+
Person r=0,8282
p=0,0016
32,5
27,5
Figura 19 - Análise de correlação de Pearson entre os valores referentes à freqüência percentual de
linfócitos T CD3
+
CD5
+Low
e linfócitos T CD8
+
no sangue periférico de cães vacinados com a
LEISHMUNE
®
no tempo intermediário pós-vacinal (2ª Dose). Os valores de “r” e “p” estão inseridos na
figura.
III.2- Percentual de LINFÓCITOS B
A Tabela 7 mostra os resultados da freqüência de linfócitos B no sangue
periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A análise
dos resultados mostrou que cães imunizados com a LEISHVACIN tiveram queda no
percentual de linfócitos B no tempo intermediário do processo de vacinação
(LEISHVACIN = 9,3±4,4; 8,8±2,8; 7,3±2,6; 8,3±3,6). Por outro lado os animais
imunizados com a LEISHMUNE
®
não apresentaram alterações significativas no
percentual de linfócitos B durante o processo vacinal (LEISHMUNE
®
= 9,8±3,5; 9,4±3,5;
8,1±2,2; 8,9±2,6).
III.2.1- Percentual de LINFÓCITOS B CD32
+
A Tabela 7 mostra os resultados da freqüência de linfócitos B CD32
+
no sangue
periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A análise
dos resultados mostrou que cães imunizados com a LEISHVACIN apresentaram uma
diminuição significativa no percentual de linfócitos B CD32
+
no tempo intermediário do
processo vacinal (LEISHVACIN = 8,6±9,9; 5,8±6,1; 1,9±2,9; 3,4±2,7). Por outro lado, os
animais imunizados com a LEISHMUNE
®
não apresentaram alterações significativas
Resultados
101
nos percentuais de linfócitos B CD32
+
durante o processo (LEISHMUNE
®
= 5,8±8,9;
3,4±2,8; 2,2±2,0; 2,6±2,0).
III.3- Razão entre a Freqüência de LINFÓCITOS T e B (Razão LT/LB)
Visando investigar o balanço do envolvimento da resposta imune adaptativa
celular e humoral durante o processo de imunização, calculamos a razão entre os
valores percentuais de linfócitos T e linfócitos B do sangue periférico dos cães
vacinados. Os resultados dessa razão estão representados na Tabela 7.
A análise dos resultados mostrou que cães imunizados com a LEISHVACIN
tiveram aumento significativo na razão LT/LB no tempo intermediário do processo
vacinal (LEISHVACIN = 7,0±2,8; 10,5±6,7; 0,7±2,7;10,3±5,2). Por outro lado, os
animais imunizados com a LEISHMUNE
®
não apresentaram alterações significativas
na razão LT/LB em qualquer tempo do processo de vacinação (LEISHMUNE
®
=
7,8±4,3; 11,6±11,8; 11,1±3,8; 10,3±3,1).
III.4- Razão entre a Freqüência de LINFÓCITOS T CD4
+
e CD8
+
(Razão
CD4
+
/CD8
+
)
Visando investigar o balanço do envolvimento da resposta imune adaptativa
auxiliar e citotóxica durante o processo de imunização, foi calculado a razão entre os
valores percentuais de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
do sangue periférico dos cães
vacinados. Os resultados dessa razão estão representados na Tabela 7.
A análise dos resultados não demonstrou nenhuma diferença significativa na
razão CD4
+
/CD8
+
em cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
em nenhum dos tempos avaliados. (LEISHVACIN = 1,2±0,6; 1,3±0,5; 1,1±0,4; 1,5±0,6 e
LEISHMUNE
®
= 1,5±0,5; 1,4±0,3; 1,3±0,4; 1,5±0,3).
Resultados
102
Tabela 7 - Cinética de alterações fenotípicas em LINFÓCITOS circulantes de cães submetidos à vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
.
Resultados expressos sob a forma de percentual de células fluorescentes dentro da população celular de interesse. representam as diferenças significativas (p<0,05) em relação ao tempo
“Antes”.
VACINA
LEISHVACIN LEISHMUNE
®
Fenótipo
Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose
Linfócitos T (%) 66,3±17,9 76,8± 8,0 78,7± 7,4 75,4± 6,5 71,5± 9,7 77,1± 6,8
81,0
±5,2
77,6
± 5,6
LT CD3
+
CD5
+Low
(%) 22,6±9,4 27,5±10,7 28,2±12,3 24,8±12,5 21,8±6,2 23,7±4,8
27,1
±7,4
23,6
±5,6
LT CD4
+
(%) 34,7±6,6 36,1±7,2 36,8±6,0 38,3±6,1 38,9±7,9 39,8±6,6 41,1±7,8 42,5±5,9
LT CD8
+
(%) 31,2±8,2 31,8±10,0 35,1±11,2 32,3±10,8 26,7±5,2 28,2±3,8
31,6
±4,5
28,5
±3,9
Linfócitos B (%) 9,3±4,4 8,8±2,8
7,3
±2,6
8,3
±3,6 9,8±3,5 9,4±3,5 8,1±2,2 8,9±2,6
LB CD32
+
(%) 8,6±9,9 5,8±6,1
1,9
±2,9
3,4
±2,7 5,8±8,9 3,4±2,8 2,2±2,0 2,6±2,0
Razão LT/LB 7,0±2,8 10,5±6,7
10,7
±2,7
10,3
±5,2 7,8±4,3 11,6±11,8 11,1±3,8 10,3±3,1
Razão CD4
+
/CD8
+
1,2±0,6 1,3±0,5 1,1±0,4 1,5±0,6 1,5±0,5 1,4±0,3 1,3±0,4 1,5±0,3
Resultados
103
III.5- Cinética de alterações imunofenotípicas em moléculas de adesão e de
ativação em LINFÓCITOS circulantes.
III.5.1- Percentual de LINFÓCITOS T CD4
+
CD18
+
A Tabela 8 mostra os resultados da freqüência de linfócitos T CD4
+
CD18
+
do
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa na
freqüência de linfócitos T CD4
+
CD18
+
em cães imunizados com a LEISHVACIN e com
a LEISHMUNE
®
em nenhum tempo analisado (LEISHVACIN = 1,5±2,3; 1,1±0,9; 0,6±0,4;
1,9±1,1 e LEISHMUNE
®
= 1,1±1,0; 0,6±0,3; 1,0±0,7; 1,1±0,9).
III.5.2- Percentual de LINFÓCITOS T CD8
+
CD18
+
A Tabela 8 mostra os resultados da freqüência de linfócitos T CD8
+
CD18
+
do
sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
A análise dos dados demonstrou que cães imunizados com a LEISHVACIN
apresentaram um aumento significativo no percentual de linfócitos T CD8
+
CD18
+
somente no tempo intermediário do processo vacinal (LEISHVACIN = 0,5±1,7; 1,0±0,7;
14,4±7,9; 3,9±1,9); Por outro lado os animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento no percentual de linfócitos T CD8
+
CD18
+
que se manteve
no tempo tardio (LEISHMUNE
®
= 0,3±0,4; 0,48±0,3; 10,4±7,7; 3,9±2,7).
III.5.3.- Densidade de Expressão de MHCII (IMF) em LINFÓCITOS T CD4
+
A Tabela 8 mostra os resultados da densidade de expressão de MHC II em
linfócitos T CD4
+
do sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
, avaliada através da intensidade média de fluorescência.
A análise dos dados demonstrou que linfócitos T CD4
+
de cães imunizados com
a LEISHVACIN apresentaram um aumento significativo na expressão de MHC II no
tempo precoce e uma redução no tempo tardio do processo vacinal (LEISHVACIN =
45,5±8,9; 64,9±27,8; 44,3±10,0; 35,5±9,8). Por outro lado, os animais vacinados com a
LEISHMUNE
®
apresentaram uma redução na expressão de MHC II no tempo tardio do
processo vacinal (LEISHMUNE
®
= 48,7±10,9; 57,8±21,8; 46,8±9,2; 36,5±10,0).
Resultados
104
III.5.4.- Densidade de Expressão de MHC II (IMF) em LINFÓCITOS T CD8
+
A Tabela 8 mostra os resultados da expressão de MHC II por linfócitos T CD8
+
do sangue periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
,
avaliada através da intensidade média de fluorescência.
A análise dos dados mostrou que linfócitos T CD8
+
de cães imunizados com a
LEISHVACIN apresentaram uma redução significativa na expressão de MHC II no
tempo tardio do processo de vacinação (LEISHVACIN = 54,3±20,8; 62,6±27,5; 44,5±12,1;
39,1±12,7). Por outro lado, os animais vacinados com a LEISHMUNE
®
apresentaram
uma redução na expressão de MHC II em linfócitos T CD8
+
no tempo intermediário do
processo vacinal que se manteve no tempo tardio (LEISHMUNE
®
= 47,9±12,8; 52,0±18,3;
43,5±11,1; 41,7±15,2).
Resultados
105
Tabela 8 - Cinética de alterações fenotípicas em moléculas de adesão e ativação de LINFÓCITOS circulantes de cães submetidos à vacinação com
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
.
VACINA
LEISHVACIN LEISHMUNE
®
Fenótipo
Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose Antes 1ª Dose 2ª Dose 3ª Dose
LT CD4
+
CD18
+
(%)
*
1,5±2,3 1,1±0,9 0,6±0,4 1,9±1,1 1,1±1,0 0,6±0,3 1,00,7 1,1±0,9
LT CD8
+
CD18
+
(%)
*
0,5±1,7 1,0±0,7
14,4
±7,9
3,9
±1,9 0,3±0,4 0,48±0,3
10,4
±7,7
3,9±2,7
MHC II em LT CD4
+
(IMF)
#
45,5±8,9
64,9
±27,8
44,3
±10,0
35,5
±9,8
48,7
±10,9 57,8±21,8 46,8±9,2
36,5
±10,7
MHC II em LT CD8
+
(IMF)
#
54,3±20,8 62,6±27,5 44,5±12,1
39,1
±12,7
47,9
±12,8 52,0±18,3
43,5
±11,1
41,7±15,2
* Resultados expressos sob a forma de percentual de células fluorescentes dentro da população celular de interesse. # Resultados expressos sob a forma de intensidade
média de Fluorescência. representam as diferenças significativas (p<0,05) em relação ao tempo “Antes”.
Resultados
106
IV. Impacto da imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE® no perfil
de síntese de citocinas em linfócitos do sangue periférico, após estimulação
antígeno-específica in vitro.
Resultados
107
IV.1- Avaliação do impacto da imunização no perfil de síntese de citocinas
intracitoplasmáticas do Tipo 1 (IFN ) e do Tipo 2 (IL-4) por linfócitos T CD4
+
e
CD8
+
do sangue periférico, após estimulação de CMSP com antígeno-
específico in vitro;
Visando confirmar as hipóteses propostas de recrutamento seletivo de
células da imunidade adaptativa e inata no contexto da vacinação com a
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
, foi proposto avaliar aspectos funcionais dessas
células, como síntese de citocinas e produção de óxido nítrico, respectivamente.
Para tal, foram realizados protocolos de cultura in vitro de células mononucleares
do sangue periférico canino, coletadas antes e 40 dias após a 3ª Dose da vacina.
As culturas foram realizadas na ausência e na presença de antígenos solúvel de
Leishmania. A análise da síntese de citocinas foi realizada através do protocolo de
imunofenotipagem em plataforma de duas cores, permitindo a análise simultânea
do fenótipo de superfície celular (CD4 e CD8) e de citocinas intracitoplasmática
(IFN- e IL-4). A dosagem de oxido nítrico foi realizada através de ensaio
colorimétrico realizado no sobrenadante das culturas de CMSP. Os resultados
foram analisados empregando três abordagens distintas: 1) análise comparativa
entre grupos por meio das variáveis observadas nas culturas controle. 2) análise
comparativa entre grupos empregando os valores obtidos nas culturas estimuladas.
3) análise comparativa do impacto da estimulação antígeno específico nos
parâmetros avaliados na cultura controle e na cultura estimulada para cada grupo
de animal.
Resultados
108
IV.1.1- Perfil de expressão de IFN- e IL-4 intracitoplasmático por Linfócitos
A Figura 20 mostra os resultados do percentual de linfócitos T IFN-
em
cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 20A) ou na presença (Figura 20 B) de estimulação com antígeno específico
in vitro.
A análise dos dados demonstrou que os animais imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo no
percentual de linfócitos T IFN-
nas culturas controle quando comparados ao
grupo de animais não vacinados.
A análise dos dados demonstrou que os animais imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo no
percentual de linfócitos T IFN-
nas culturas estimuladas com antígeno quando
comparados ao grupo de animais não vacinados.
Nenhuma diferença significativa foi observada na análise do impacto da
estimulação antígeno específica nos grupos de animais avaliados.
A B
% Linfócitos T IFN-
+
0
1
2
% Linfócitos T IFN-
+
0
1
2
Figura 20 - Freqüência de linfócitos T IFN-
em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma de percentual médio ± erro padrão de células T IFN-
+
na população de linfócitos totais.
Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05.
Resultados
109
A Figura 21 mostra os resultados do percentual de linfócitos T IL-4
+
em
cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 21 A) ou na presença (Figura 21 B) de estimulação com antígeno
específico in vitro.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa no
percentual de linfócitos T IL-4
nas culturas controle quando comparamos grupo de
cães imunizados com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
com o grupo de animais
não vacinados. Apenas o grupo de animais imunizados com a LEISHVACIN
apresentaram um aumento significativo no percentual de linfócitos T IL-4
nas
culturas estimuladas com antígeno quando comparados ao grupo de animais não
vacinados. Nenhuma diferença significativa foi observada na análise do impacto da
estimulação antígeno específica nos grupos de animais avaliados.
A B
% Linfócitos T IL4
+
0.0
1.5
3.0
% Linfócitos T IL4
+
0.0
1.5
3.0
Figura 21 - Freqüência de linfócitos T IL-4
+
em células mononucleares do sangue periférico (CMSP)
de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma de percentual médio ± erro padrão de células T IL-4
+
na população de linfócitos totais.
Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05.
Resultados
110
IV.1.2- Análise da razão de expressão de IFN- e IL-4 intracitoplasmática por
Linfócitos T
A Figura 22 mostra os resultados da razão do percentual de linfócitos T IFN-
+
/IL-4
em cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 22A) ou na presença (Figura 22B) de estimulação com antígeno específico
in vitro.
A análise dos dados demonstrou que os animais imunizados tanto com a
LEISHVACIN quanto com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo
na razão do percentual de linfócitos T IFN-
/IL-4
+
nas culturas controle quando
comparados ao grupo de animais não vacinados. Apenas os animais vacinados
com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo na razão do
percentual de linfócitos T IFN-
/IL-4
+
nas culturas estimuladas com antígeno
quando comparados ao grupo de animais não vacinados. Também somente os
animais vacinados com a LEISHMUNE
®
apresentaram um impacto significativo da
estimulação antígeno- específica com aumento da razão do percentual de linfócitos
T IFN-
/IL-4
+
nas culturas estimuladas com antígeno quando comparadas com as
culturas controle.
A B
Razão % Linfócitos IFN-
+
/ IL4
+
0
1
2
Razão % Linfócitos IFN-
+
/ IL4
+
0
1
2
*
Figura 22 - Razão entre linfócitos T IFN-
+
/IL-4
+
em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos sob a forma
de percentual médio ± erro padrão da razão entre linfócitos T IFN-
+
/IL-4
+
na população de linfócitos totais.
Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05. (*) representa diferenças
significativas referentes ao impacto da estimulação antígeno-específica.
Resultados
111
IV.1.3- Perfil de expressão de IFN- intracitoplasmático por Linfócitos T CD4
+
e CD8
+
A Figura 23 mostra os resultados do percentual de linfócitos T CD4
+
INF-
em cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 23A) ou na presença (Figura 23B) de estimulação com antígeno específico
in vitro.
A análise dos dados demonstrou que os animais imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHVACIN
apresentaram aumento significativo no
percentual de linfócitos CD4
+
INF-
nas culturas controle quando comparados ao
grupo de animais não vacinados.
Apenas cães imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram aumento
significativo no percentual de linfócitos CD4
+
INF-
nas culturas estimuladas com
antígeno quando comparados ao grupo de animais não vacinados.
Nenhuma diferença significativa foi observada na análise do impacto da
estimulação antígeno específica nos grupos de animais avaliados.
A B
0.0
1.0
2.0
% Linfócitos T CD4
+
IFN-
+
% Linfócitos T CD4
+
IFN-
+
0.0
1.0
2.0
Figura 23 - Freqüência de linfócitos T CD4
+
INF-
+
em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma de percentual médio ± erro padrão de células CD4
+
INF-
+
na população de linfócitos
totais. Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05.
Resultados
112
A Figura 24 mostra os resultados do percentual de linfócitos T CD8
+
INF-
em cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 24A) ou na presença (Figura 24B) de estimulação com antígeno específico
in vitro.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa nas
duas abordagens estatísticas empregadas.
Nenhuma diferença significativa foi observada na análise do impacto da
estimulação antígeno específica nos grupos de animais avaliados.
A B
% Linfócitos T CD8
+
IFN-
+
0.0
0.5
1.0
% Linfócitos T CD8
+
IFN-
+
0.0
0.5
1.0
Figura 24 - Freqüência de linfócitos T CD8
+
INF-
em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma de percentual médio ± erro padrão de células CD8
+
INF-
+
na população de linfócitos
totais. Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05.
Resultados
113
IV.1.4- Perfil de expressão de IL-4 intracitoplasmático por Linfócitos T CD4
+
e
CD8
+
A Figura 25 mostra os resultados do percentual de linfócitos T CD4
+
IL-4
+
em
cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 25A) ou na presença (Figura 25B) de estimulação com antígeno específico
in vitro.
A análise dos dados demonstrou que apenas os animais imunizados com a
LEISHVACIN apresentaram um aumento significativo no percentual de linfócitos
CD4
+
IL-4
nas culturas controle quando comparados ao grupo de animais não
vacinados.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa no
percentual de linfócitos CD4
+
IL-4
nas culturas estimuladas com antígeno quando
foi comparado cães imunizados com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
com o
grupo de animais não vacinados.
Nenhuma diferença significativa foi observada na análise do impacto da
estimulação antígeno específica nos grupos de animais avaliados.
A B
% Linfócitos T CD4
+
IL-4
+
0.0
0.5
1.0
% Linfócitos T CD4
+
IL-4
+
0.0
0.5
1.0
Figura 25 - Freqüência de linfócitos T CD4
+
IL-4
+
em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma de percentual médio ± erro padrão de células CD4
+
IL-4
+
na população de linfócitos
totais. Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05.
Resultados
114
A Figura 26 mostra os resultados do percentual de linfócitos T CD8
+
IL-4
em
cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de cães
imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, realizadas na ausência
(Figura 26A) ou na presença (Figura 26B) de estimulação com antígeno específico
in vitro.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa no
percentual de linfócitos CD8
+
IL-4
nas culturas controle quando comparamos
animais vacinados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
quando
comparados ao grupo de animais não vacinados.
Apenas cães imunizados com a LEISHVACIN apresentaram um aumento
significativo no percentual de linfócitos CD8
+
IL-4
, nas culturas estimuladas com
antígeno, quando comparados aos grupos de animais não vacinados e aqueles
vacinados com a LEISHMUNE
®
.
A análise dos dados demonstrou que apenas os animais vacinados com a
LEISHVACIN apresentaram um impacto significativo da estimulação antígeno-
específica com aumento no percentual de linfócitos T CD8
IL-4
+
nas culturas
estimuladas com antígeno quando comparadas com as culturas controle.
A B
% Linfócitos T CD8
+
IL-4
+
0.0
1.5
0.75
0.0
1.5
% Linfócitos T CD8
+
IL-4
+
0.75
*
Figura 26 - Freqüência de linfócitos T CD8
+
IL-4
+
em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN (n=6) e com a
LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma de percentual médio ± erro padrão de células CD8
+
IL-4
+
na população de linfócitos
totais. Diferenças significativas estão destacadas por linhas conectoras quando p<0.05. (*)
representa diferenças significativas referentes ao impacto da estimulação antígeno-específica.
Resultados
115
V. Impacto da imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE® na
produção de Óxido Nítrico por células mononucleares do sangue periférico,
após estimulação antígeno-específica in vitro.
Resultados
116
V.1- Avaliação do impacto da imunização na produção de Óxido Nítrico no
sobrenadante de cultura de CMSP do sangue periférico de cães submetidos à
vacinação com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
, após estimulação de com
antígeno-específico in vitro
V.1.1- Dosagem dos níveis de Nítrito (NO
-2
)
O óxido nítrico (NO) é um gás altamente reativo possuindo uma vida média
de aproximadamente 6 a 30 segundos, sendo rapidamente oxidado gerando nitrito
(NO
-2
) e nitrato (NO
-3
). Dessa forma, a quantificação da síntese de óxido nítrico por
células mononucleares do sangue periférico, após estimulação antígeno-específica
in vitro foi realizada, indiretamente, através da medida de Nitrito (NO
-2
) no
sobrenadante das culturas de CMSP.
A Figura 27 mostra os resultados da concentração de nitrito expressa em M
no sobrenadante de culturas de cinco dias de células mononucleares do sangue
periférico de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
realizadas na ausência (Figura 27A) ou na presença (Figura 27B) de estimulação
com antígeno específico in vitro.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa nas
três abordagens estatísticas empregadas.
A B
[Nitrito] M
0.0
1.5
3.0
[Nitrito] M
0.0
1.5
3.0
Figura 27 - Concentração nitrito M no sobrenadante de culturas de células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a
LEISHVACIN (n=6) e com a LEISHMUNE
®
(n=6), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma dos valores médios ± erro padrão da concentração de nitrito presente no sobrenadante
das culturas de células mononucleares do sangue periférico submetidas após cinco dias de cultivo
in vitro.
Resultados
117
Numa abordagem adicional, a concentração de nitrito expressa em M foi
dividida pelo número de monócitos presentes na suspensão de células
mononucleares submetida à cultura in vitro, a fim de ser obtida a razão de
nitrito/monócitos.
A Figura 28 mostra os resultados da concentração de nitrito/monócitos em
culturas de células mononucleares do sangue periférico de cães imunizados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
realizadas na ausência (Figura 28A) ou na
presença (Figura 28B) de estimulação com antígeno específico in vitro. Os
resultados foram expressos sob a forma da razão da concentração nitrito
M/Monócitos presentes na suspensão de células mononucleares submetida à
cultura in vitro.
A análise dos dados demonstrou que apenas os animais imunizados com a
LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo na concentração de
nitrito/monócitos nas culturas controle quando comparados ao grupo de animais
não vacinados.
A análise dos dados demonstrou que apenas os animais vacinados com a
LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo na concentração de
nitrito/monócitos nas culturas estimuladas com antígeno quando comparados ao
grupo de animais não vacinados.
Nenhuma diferença significativa foi observada na análise do impacto da
estimulação antígeno específica nos grupos de animais avaliados.
A B
0.0×10
-00
1.5×10
-05
3.0×10
-05
[Nitrito] /Monócito
[Nitrito] /Monócito
0.0×10
-00
1.5×10
-05
3.0×10
-05
Figura 28 - Concentração nitrito M/monócitos em culturas de células mononucleares do sangue
periférico (CMSP) de cães NÃO VACINADOS (n=8) e animais imunizados com a LEISHVACIN
(n=3) e com a LEISHMUNE
®
(n=3), após cultivo de cinco dias, in vitro.
(A) na ausência ou (B) presença de antígeno solúvel de L. chagasi. Os resultados estão expressos
sob a forma dos valores médios ± erro padrão da concentração de nitrito no sobrenadante de
cultura de cinco dias, dividida pelo percentual de monócitos presentes na suspensão de células
mononucleares submetida à cultura in vitro. Diferenças significativas estão destacadas por linhas
conectoras quando p<0.05.
Resultados
118
VI. Impacto da imunização no perfil de reatividade de imunoglobulinas
séricas anti-Leishmania, através da pesquisa de IgG e subclasses IgG1 e
IgG2 anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi.
Resultados
119
VI.1- Avaliação da capacidade antigênica das vacinas LEISHMUNE
®
e
LEISHVACIN em induzir a reatividade de imunoglobulinas (IgG e subclasses
IgG1 e IgG2) anti-L. chagasi fixada
Um dos grandes questionamentos relacionados à intervenção vacinal na
LVC consiste no seu impacto na imunidade humoral dos animais submetidos à
imunização. De uma forma geral, uma vacina ideal deveria ser capaz de promover
o estabelecimento de uma imunidade celular pós-vacinal, sem promover alterações
significativas no perfil de imunidade humoral. Entretanto, esse desafio ainda
permanece como alvo de investigações científicas, visando à identificação de
preparações antigênicas com perfil seletivo para imunidade celular. Considerando
os resultados obtidos na análise do perfil imunofenotípico celular, no padrão de
síntese de citocinas e de produção de NO, nos propusemos investigar o impacto da
imunização com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
no âmbito da imunidade
humoral. Para tal, empregamos duas abordagens metodológicas de pesquisa de
imunoglobulinas G anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi: a reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e a pesquisa de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2 por
citometria de fluxo (PPFP-IgG). Diferenças na capacidade de detecção de
anticorpos dessas duas metodologias foram a base para a utilização simultânea de
ambas abordagens sorológicas, considerando que a PPFP-IgG possui capacidade
de detecção superior à RIFI, sendo capaz de identificar reatividade de IgG em
amostras de soros processadas em diluições mais altas (Carvalho-Neta et al.
2006).
A figura 29 mostra os resultados da reatividade de IgG, presente no soro de
cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, anti-formas
promastigotas fixadas de L. chagasi avaliadas pela RIFI. Os resultados das
análises foram expressos sob a forma de título da reatividade, através do inverso
da diluição dos soros testados.
A análise dos dados demonstrou que todos os animais dos grupos
imunizados, tanto com a LEISHVACIN quanto com a LEISHMUNE
®
, apresentaram
títulos de anticorpos superiores ao limiar de reatividade diagnóstica para LVC
(1:40), não sendo possível identificar diferenças na reatividade média dos títulos
entre os animais imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
Resultados
120
0
40
80
120
160
200
Inverso da diluição
0
40
80
120
160
200
Inverso da diluição
Figura 29 - Reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliada através da
reação de imunofluorescência convencional (RIFI) em soros de cães imunizados com a
LEISHVACIN (
) e com a LEISHMUNE
®
( ).
Os resultados estão expressos em “box plot”, destacando-se os valores mínimo, máximo e os
quartis da distribuição dos títulos da reatividade expressos sob a forma do inverso da diluição das
amostras testadas. Os valores destacados pelas barras correspondem ao segundo e terceiro
quartis, incluindo a mediana.
A Figura 30 mostra os resultados da reatividade de IgG, presente no soro de
cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, anti-formas
promastigotas fixadas de L. chagasi avaliadas pela citometria de fluxo. Os
resultados das análises foram expressos sob a forma de percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP) em seis diluições testadas (1:256 a 1:8.192).
A análise estatística dos dados não demonstrou diferenças significativas na
reatividade de IgG entre os grupos de animais imunizados com a LEISHVACIN e
com a LEISHMUNE
®
, embora o grupo de animais imunizados com a LEISHVACIN
tenha apresentado, nas diluições 1: 1.024, 1:2.048, 1:4.096 e 1:8.192 pico máximo
de reatividade superior ao observado para os animais imunizados com a
LEISHMUNE
®
(Figura 30 A). Uma análise estatística adicional foi realizada, através
da avaliação da “receiver operating characteristic curve” (curva ROC),
empregando-se o programa estatístico MedCalc que propõe, para cada uma das
diluições selecionadas, o estabelecimento de pontos de corte para a segregação
da reatividade de IgG entre os dois grupos. Os resultados dessa nova abordagem
estão representados na Figura 30 B. Nossos dados demonstraram que a
freqüência de animais com valores de PPFP acima do ponto de corte proposto
para cada diluição foi superior no grupo de animais vacinados com a LEISHVACIN
(41,6%, 41,6%, 50,0% e 75,0% para as diluições 1: 1.024, 1:2.048, 1:4.096 e
Resultados
121
1:8.192, respectivamente), quando comparados aos valores observados nos
animais vacinados com a LEISHMUNE
®
(16,6%, 25,0%, 25,0% e 50,0%). A análise
de Qui-quadrado não revelou diferença significativa entres as freqüências
observadas para cada grupo, em nenhuma das diluições testadas.
1.024 1.024
0
25
50
75
100
2.048
2.048
0
25
50
75
100
4.096 4.096
0
8.192 8.192
0
41,6% 16,6% 41,6% 25,0%
25
50
75
50,0% 25,0%
10
20
30
75% 50,0%
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
Diluições
AB
512 1.024 2.048 4.096 8.192
0
25
50
75
100
256
Diluições
1.024 1.024
0
25
50
75
100
2.048
2.048
0
25
50
75
100
4.096 4.096
0
8.192 8.192
0
41,6% 16,6% 41,6% 25,0%
25
50
75
50,0% 25,0%
10
20
30
75% 50,0%
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
Diluições
AB
512 1.024 2.048 4.096 8.192
0
25
50
75
100
256
Diluições
Figura 30 - Reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliada por
citometria de fluxo.
O resultado foi expresso sob a forma de percentuais de parasitos fluorescentes positivos (PPFP),
após incubação das formas promastigotas com soros de cães imunizados com a LEISHVACIN
(
, ) e com a LEISHMUNE
®
( , ). (A) Valores de PPFP foram avaliados nas diluições 1:256 a
1:8192, destacando-se em gráficos “box plot”, os valores mínimo, máximo e os quartis da
distribuição dos PPFP. Diferenças entre os valores máximos de PPFP foram destacadas por linhas
conectivas (
). (B) Valores de PPFP avaliados em diluições selecionadas, destacando-se em
gráficos de dispersão, a freqüência de valores de PPFP acima dos pontos de corte estabelecidos,
através da curva ROC para cada diluição.
A Figura 31 mostra os resultados da reatividade de IgG1, presentes no soro
de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, anti-formas
promastigotas fixadas de L. chagasi avaliadas pela citometria de fluxo. Os
resultados das análises foram expressos sob a forma de percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP) em seis diluições testadas (1:128 a 1:4.096).
A análise estatística dos dados não demonstrou diferenças significativas na
reatividade de IgG1 entre os grupos de animais imunizados com a LEISHVACIN e
com a LEISHMUNE
®
, embora o grupo de animais imunizados com a LEISHVACIN
tenha apresentado, nas diluições 1:512, 1:1.024, 1:2.048 e 1:4.096 um pico
Resultados
122
máximo de reatividade superior ao observado para os animais imunizados com a
LEISHMUNE
®
(Figura 31 A). Uma análise estatística adicional realizada, através da
avaliação da curva ROC, pelo estabelecimento de pontos de corte para a
segregação da reatividade de IgG1 entre os dois grupos, demonstrou que a
freqüência de animais com valores de PPFP acima do ponto de corte proposto
para cada diluição foi superior no grupo de animais vacinados com a LEISHVACIN
(33,3%, 75,0%, 91,6% e 33,3% para as diluições 1:512, 1:1.024, 1:2.048, e
1:4.096, respectivamente), quando comparados aos valores observados nos
animais vacinados com a LEISHMUNE
®
(8,3%, 50,0%, 58,3% e 0,0%) (Figura 31
B). A análise de Qui-quadrado não revelou diferença significativa entres as
freqüências observadas para cada grupo, em nenhuma das diluições testadas.
256 512 2.048 4.096128 1024
0
25
50
75
100
512 512
0
25
50
75
100
1.024 1.024
0
2.048 2.048
0
4.096 4.096
0
10
20
30
33,3% 8,3%
25
50
75
100
75,0% 50,0%
25
50
75
91,6%
58,3%
33,3% 0,0%
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
Diluições
AB
Diluições
256 512 2.048 4.096128 1024
0
25
50
75
100
512 512
0
25
50
75
100
1.024 1.024
0
2.048 2.048
0
4.096 4.096
0
10
20
30
33,3% 8,3%
25
50
75
100
75,0% 50,0%
25
50
75
91,6%
58,3%
33,3% 0,0%
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
Diluições
AB
Diluições
Figura 31 - Reatividade de IgG1 anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliada por
citometria de fluxo.
O resultado foi expresso sob a forma de percentuais de parasitos fluorescentes positivos (PPFP),
após incubação das formas promastigotas com soros de cães imunizados com a LEISHVACIN
(
, ) e com a LEISHMUNE
®
( , ). (A) Valores de PPFP foram avaliados nas diluições 1:128 a
1:4.096, destacando-se em gráficos “box plot”, os valores mínimo, máximo e os quartis da
distribuição dos PPFP. Diferenças entre os valores máximos de PPFP foram destacadas por linhas
conectivas (
). (B) Valores de PPFP avaliados em diluições selecionadas, destacando-se em
gráficos de dispersão, a freqüência de valores de PPFP acima dos pontos de corte estabelecidos,
através da curva ROC para cada diluição.
A Figura 32 mostra os resultados da reatividade de IgG2, presentes no soro
de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, anti-formas
promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliadas pela citometria de fluxo. Os
resultados das análises foram expressos sob a forma de percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP) em sete diluições testadas (1:256 a 1:16.384).
Resultados
123
A análise estatística dos dados não demonstrou diferenças significativas na
reatividade de IgG2 entre os grupos de animais imunizados com a LEISHVACIN e
com a LEISHMUNE
®
, embora o grupo de animais imunizados com a LEISHMUNE
®
tenha apresentado, nas diluições 1:2.048, 1:4.096, 1:8.192 e 1:16.384 um pico
máximo de reatividade superior ao observado para os animais imunizados com a
LEISHVACIN (Figura 32 A). Uma análise estatística adicional realizada, através da
avaliação da curva ROC, pelo estabelecimento de pontos de corte para a
segregação da reatividade de IgG2 entre os dois grupos, demonstrou que a
freqüência de animais com valores de PPFP acima do ponto de corte proposto
para cada diluição foi superior no grupo de animais vacinados com a LEISHMUNE
®
(66,6%, 50,0%, 33,3% e 50,0% para as diluições 1:2.048, 1:4.096, 1:8.192 e
1:16.384, respectivamente), quando comparados aos valores observados nos
animais vacinados com a LEISHVACIN (50,0%, 41,6%, 16,6% e 25,0%) (Figura 32
B). A análise de Qui-quadrado não revelou diferença significativa entres as
freqüências observadas para cada grupo, em nenhuma das diluições testadas.
0
25
50
75
100
512 1.024 2.048 4.096 8.192 256
16384
2.048 2.048
0
50
75
100
4.096 4.096
0
16.384 16.384
40
20
0
10
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
Diluições
AB
50,0% 66,6%
25
50
75
100
41,6% 50,0%
25,0% 50,0%
Diluições
25
12,5
8.192 8.192
25
50
75
16,6% 33,3%
0
30
0
25
50
75
100
512 1.024 2.048 4.096 8.192 256
16384
2.048 2.048
0
50
75
100
4.096 4.096
0
16.384 16.384
40
20
0
10
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
%Parasitos fluorescentes positivos (PPFP)
Diluições
AB
50,0% 66,6%
25
50
75
100
41,6% 50,0%
25,0% 50,0%
Diluições
25
12,5
8.192 8.192
25
50
75
16,6% 33,3%
0
30
Figura 32 - Reatividade de IgG2 anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliada por
citometria de fluxo.
O resultado foi expresso sob a forma de percentuais de parasitos fluorescentes positivos (PPFP),
após incubação das formas promastigotas com soros de cães imunizados com a LEISHVACIN
(
, ) e com a LEISHMUNE
®
( , ). (A) Valores de PPFP avaliados nas diluições 1:256 a
1:16.384, destacando-se em gráficos “box plot”, os valores mínimo, máximo e os quartis da
distribuição dos PPFP. Diferenças entre os valores máximos de PPFP foram destacadas por linhas
conectivas (
). (B) Valores de PPFP avaliados em diluições selecionadas, destacando-se em
gráficos de dispersão, a freqüência de valores de PPFP acima dos pontos de corte estabelecidos,
através da curva ROC para cada diluição.
Resultados
124
No âmbito da resposta imune, é bem documentada a estreita relação entre o
padrão de reatividade de imunoglobulinas e o perfil de síntese de citocinas. Nesse
contexto, visando fortalecer as avaliações desse estudo, realizamos algumas
análises de correlações entre o perfil de citocinas e a reatividade de IgG avaliadas
pela citometria de fluxo (PPFP-IgG). As Figuras 33A e 33B mostram os resultados
das correlações significativas encontradas na análise paralela dos dois parâmetros
acima mencionados.
Resultados
125
0 50 100
0
50
100
IgG 1:2048
IgG1 1:512
0 50 100
0
50
100
IgG 1:2048
IgG1 1:512
r= 0,709
p= 0,01 4
r=
r= r
-0,034
p= 0,914
0 50 100
0
50
100
IgG 1:2048
IgG2 1:2048
IgG 1:2048
IgG2 1:2048
0 50 100
0
50
100
0,8 81
p= 0,001
r=
0,8 67
p=0,00 1
r=
CD
EF
IgG 1:512
0 50 100
0
1
2
r= 0,949
p=0,01 6
0 50 100
0
2
4
6
r= - 0,880
p= 0,033
r=
0 50 100
0
2
4
6
IgG 1:512
% CD4
+
IL4
+
% CD8
+
IL4
+
B
A
0 50 100
0
50
100
IgG 1:2048
IgG1 1:512
0 50 100
0
50
100
IgG 1:2048
IgG1 1:512
r= 0,709
p= 0,01 4
r=
r= r
-0,034
p= 0,914
0 50 100
0
50
100
IgG 1:2048
IgG2 1:2048
IgG 1:2048
IgG2 1:2048
0 50 100
0
50
100
0,8 81
p= 0,001
r=
0,8 67
p=0,00 1
r=
CD
EF
IgG 1:512
0 50 100
0
1
2
r= 0,949
p=0,01 6
0 50 100
0
2
4
6
r= - 0,880
p= 0,033
r=
0 50 100
0
2
4
6
IgG 1:512
% CD4
+
IL4
+
% CD8
+
IL4
+
B
A
Figura 33 - Correlações entre reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi,
avaliada por citometria de fluxo para LEISHVACIN (
) e LEISHMUNE
®
( ) e parâmetros da
imunidade celular.
(A) % CD8
+
IL-4
+
, (B) % CD4
+
IL-4
+
e da imunidade humoral, (C) IgG1 1:512, (D) IgG1 1:512, (E)
IgG2 1:2048, (F) IgG2 1:2048. Os resultados foram expressos como valores individuais. As linhas
conectivas obtidas por regressão não-linear, ilustram as correlações positivas e negativas. Os
valores de correlação (r de Spearman) e significância (p≤0,05) estão mostrados nos gráficos.
A análise dos dados demonstrou que os animais vacinados com a
LEISHVACIN apresentaram uma correlação positiva forte entre o percentual de
células CD8
+
IL-4
+
observado nas culturas estimuladas com antígeno de
Leishmania e os valores da reatividade de IgG anti-Leishmania, através do PPFP,
Resultados
126
avaliados na diluição 1:512 (r= 0,943, p=0,0167) (Figura 33A). Por outro lado, a
análise dos dados demonstrou que os animais vacinados com a LEISHMUNE
®
apresentaram uma correlação negativa entre o percentual de células CD4
+
IL-4
+
observados nas culturas estimuladas com antígeno de Leishmania e os valores da
reatividade (PPFP) de IgG anti-Leishmania avaliados na diluição 1:512 (r=-0,8857,
p=0,0333) (Figura 33 B).
Levando-se em consideração a controvérsia existente entre
proteção/patologia e subclasses de IgG, em estudos empregando modelo canino,
foi avaliada a correlação entre IgG e as subclasses IgG1 e IgG2 nos grupos de
animais vacinados com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
. A análise dos dados
demonstrou que os animais vacinados com a LEISHVACIN apresentaram uma
correlação positiva entre a reatividade de IgG anti-Leishmania (diluição 1:2048) e
IgG1 (diluição 1:512) (r= 0,709, p=0,016) (Figura 33C). Já os animais vacinados
com a LEISHMUNE
®
não apresentaram correlação entre estas imunoglobulinas
(r=-0,034, p=0,914) (Figura 33D).
As Figuras 33E e 33F mostram os resultados das correlações encontradas
na análise paralela da reatividade de IgG (diluição 1:2048) e IgG2 (diluição 1:2048)
anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliada por citometria de fluxo,
em plasmas de cães imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
. A
análise dos dados demonstrou que os animais vacinados com a LEISHVACIN
apresentaram uma correlação positiva entre a reatividade de IgG anti-Leishmania
(diluição 1:2048) e IgG2 (diluição 1:2048) (r= 0,867, p=0,001) (Figura 33E).
Resultado semelhante foi verificado nos animais vacinados com a LEISHMUNE
®
(r= 0,881, p=0,001) (Figura 33F). Baseado nestas correlações, podemos concluir
que o aumento de reatividade de IgG anti formas promastigotas fixadas nos
animais vacinados com a LEISHVACIN é seguido do aumento da reatividade tanto
de IgG1 quanto de IgG2. Já o aumento de reatividade de IgG nos animais
vacinados com a LEISHMUNE
®
está associado preferencialmente com o aumento
da reatividade de IgG2. Esses dados reforçam a existência de reatividade
imunológica diferencial entre os animais vacinados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
.
Resultados
127
VII. Síntese dos Resultados
Resultados
128
VII.1- Alterações imunofenotípicas em células da imunidade inata
A análise dos dados relativos às alterações imunofenotípicas em células da
imunidade inata nos permitiu segregar o perfil de alterações em dois grupos: as
alterações comuns ao processo vacinal (representado por letras na cor cinza) e as
alterações específicas da vacina utilizada (representado por letras nas cores
vermelho e Azul) (Diagrama 3).
Interessantemente, como podemos observar no diagrama 3, uma análise
mais aprofundada destes resultados mostrou que a intervenção vacinal com
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
é acompanhada por um perfil distinto de alterações
imunofenotípicas. Neste contexto, a análise dos marcadores de superfície celular
expressos em células da imunidade inata do sangue periférico, relacionados com
ativação (MHC) e migração (CD18), nos permitiu inferir que a LEISHVACIN
promove um recrutamento precoce de Neutrófilos e Eosinófilos, com envolvimento
tardio de monócitos; e a LEISHMUNE
®
induz um recrutamento precoce e
persistente de Neutrófilos e monócitos, e não leva o envolvimento de eosinófilos.
Resultados
129
CD18
CD18
=
=
Eosinófilos
Eosinófilos
Neutrófilos
Neutrófilos
MHCI
MHCI
==
==
Monócitos
Monócitos
MHCI =
MHCI =
MHCII ==
MHCII ==
CD18 =
CD18 =
=
=
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUN
E
LEISHMUN
E
MHCI
MHCI
MHCI
MHCI
=
=
CD18
CD18
=
=
Eosinófilos
Eosinófilos
Neutrófilos
Neutrófilos
MHCI
MHCI
==
==
Monócitos
Monócitos
MHCI =
MHCI =
MHCII ==
MHCII ==
CD18 =
CD18 =
=
=
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUN
E
LEISHMUN
E
MHCI
MHCI
MHCI
MHCI
=
=
CD32
CD18
MHCII
Alterações induzidas pelo processo vacinal
CD32
CD18
MHCII
Diagrama 3 - Alterações imunofenotípicas em células da imunidade inata induzidas pelo processo
vacinal.
Resultados expressos sob a forma de representam as diferenças significativas (p<0,05) em
relação ao tempo “Antes”; e = quando não apresentaram diferenças significativas. As alterações
comuns ao processo de vacinal (representado por letra em cinza) e as alterações específicas da
vacina utilizada (representado por letra em vermelho e Azul)
VII.2- Alterações imunofenotípicas em células da imunidade adaptativa
A análise dos dados relativos às alterações imunofenotípicas em células da
imunidade adaptativa, diferentemente do observado na imunidade inata, não
demonstrou alterações comuns ao processo vacinal. Nesta abordagem notamos
somente alterações que foram ocasionadas especificamente pela vacina utilizada,
que estão sintetizadas no Diagrama 4.
A síntese dos resultados nos permite inferir que a intervenção vacinal via
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
esta associada a uma indução seletiva de ativação
de populações celulares. Neste contexto, podemos observar que a LEISHVACIN
promove uma resposta imune adaptativa de perfil misto, associada à ativação de
linfócitos T e linfócitos B enquanto a LEISHMUNE
®
promove uma resposta imune
Resultados
130
adaptativa de perfil seletivo, associada à ativação tardia e preferencial de linfócitos
T.
Vimos também que a intervenção vacinal via LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
é acompanhada por uma cinética distinta de alterações imunofenotípicas em sub-
populações de linfócitos T. A LEISHVACIN promove uma alteração precoce em
linfócitos T CD4
+
, associada ao aumento na expressão de MHC II e alteração tardia
em linfócitos T CD8
+
, associada à queda na expressão de MHC II; já a
LEISHMUNE
®
promove uma alteração tardia em linfócitos T CD4
+
e CD8
+
,
associada à queda na expressão de MHC II.
Em síntese, estas análises nos sugerem então que a LEISHVACIN leva a
um perfil misto de resposta com envolvimento tanto de linfócitos T quanto B e a
LEISHMUNE
®
um perfil único somente com envolvimento de linfócitos T.
CD4
CD4
CD8
CD8
CD3+CD8+==
LB
LB
Linf B==
CD32 ==
T
T
T
T
CD3+CD5+==
CD5+Low = =
Alterações induzidas pelo processo vacinal
LEISHMUNELEISHVACIN
MHCII ==MHCII =
MHCII ==
MHCII =
CD18 = =
CD18 =
Diagrama 4 - Alterações imunofenotípicas em células da imunidade adaptativa induzidas pelo
processo vacinal.
Resultados expressos sob a forma de representam as diferenças significativas (p<0,05) em
relação ao tempo “Antes”; e = quando não apresentaram diferenças significativas.
Resultados
131
VII.3- Perfil de síntese de citocinas intracitoplasmática em linfócitos “in vitro”
A análise dos dados relativos às alterações no perfil de síntese de citocinas
IFN e IL-4 intracitoplasmáticas em linfócitos presentes na cultura de CMSP
também nos permitiu segregar as alterações em dois grupos: as alterações
comuns ao processo vacinal e as alterações específicas da vacina utilizada
(Diagrama 5).
A análise dos dados relativos à detecção de citocinas intracitoplasmáticas
em Linfócitos T após cultura de CMSP na ausência (CC-cultura controle) ou
presença de estimulo específico (CE-cultura estimulada), demonstrou que o
aumento do percentual de Linfócitos T IFN-
+
foi uma alteração comum do
processo de vacinação, observada tanto com a LEISHVACIN quanto com a
LEISHMUNE
®
, independente do estímulo com o antígeno específico. Cabe
ressaltar que a sub-população de Linfócitos T CD4
+
foi a principal responsável por
esse aumento no percentual de IFN- nos Linfócitos T totais.
Entretanto, observamos um padrão específico de alterações relacionadas ao
tipo de imunobiológico usado na vacinação (Diagrama 5). No grupo de animais
imunizados com a LEISHVACIN cuja cultura de CMSP foi estimulada com o
antígeno (CE), observamos um aumento no percentual de Linfócitos T totais
produzindo IL-4, acompanhado de um aumento tanto de IFN- quanto de IL-4 em
Linfócitos T CD4
+
, e aumento de IFN- em Linfócitos T CD8
+
. Essas alterações
caracterizam um perfil misto de resposta imune no grupo LEISHVACIN, o que não
pôde ser observado no grupo de animais imunizados com a LEISHMUNE
®
.
A análise dos dados relativos à razão do percentual de linfócitos T IFN-
+
/IL-
4
em cultura de CMSP na ausência (CC-cultura controle) ou na presença de
estimulo específico (CE-cultura estimulada) também está sintetizado no Diagrama
5. Esta analise demonstrou que os animais imunizados tanto com a LEISHVACIN
quanto com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo na razão do
percentual de linfócitos T IFN-
/IL-4
+
nas culturas controles, quando comparados
ao grupo de animais não vacinados. Por outro lado, apenas os animais vacinados
com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo na razão do
percentual de linfócitos T IFN-
/IL-4
+
nas culturas estimuladas com antígeno
quando comparados ao grupo de animais não vacinados.
Resultados
132
Em síntese, as análises do perfil de citocinas intracitoplasmáticas nos
sugerem então, que há um impacto diferencial na resposta imune do hospedeiro de
acordo com a vacina utilizada. Observamos que a imunização com LEISHVACIN
leva a um perfil misto de resposta com um aumento tanto da produção de IFN
quanto de IL-4, entretanto a imunização com LEISHMUNE
®
mostrou um perfil único
com aumento na produção de IFN por linfócitos e também aumento da razão
Linfócito T IFN-
+
/ IL-4
+
.
CD8
CD8
CD8
CD8
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUNE
LEISHMUNE
Alterações induzida pelo processo vacinal
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUNE
LEISHMUNE
IFN- -CC
IFN- - CC
IL-4 - CE
T
T
T
T
IFN- –CC
CD4
CD4
CD4
CD4
IL-4 - CE
IL-4 - CE
IFN- -CE
IFN- -CC
IFN- -CE
IFN- –CE
IFN-
IL-4 – CC
T
T
T
T
T
INF-
IL-4
T
T
T
IFN-
IL-4 – CC
IFN-
IL-4 –CE
Diagrama 5 - Alterações no perfil e no balanço de citocinas induzidas pelo processo vacinal.
Resultados expressos sob a forma de representam as diferenças significativas (p<0,05) em
relação ao tempo “Antes”; CC= Cultura controle, CE = Cultura estimulada. As alterações comuns ao
processo de vacinal (representado por letra em cinza) e as alterações específicas da vacina
utilizada (representado por letra em vermelho e Azul).
Resultados
133
VII.4- Produção de Óxido Nítrico por células mononucleares do sangue
periférico, após estimulação antígeno-específica “in vitro”.
A análise dos dados relativos à produção de óxido nítrico expresso através
da razão de nitrito/monócitos em culturas CMSP, demonstrou que apenas o grupo
de animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentou um aumento significativo
tanto na cultura controle (CC) quanto na cultura estimulada (CE) quando
comparados ao grupo de animais não vacinados (Diagrama 6)
Diagrama 6
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUNE
LEISHMUNE
Alterações induzida pelo processo vacinal
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUNE
LEISHMUNE
NO
NO
NO
NO/mØ – CC
NO/mØ – CE
Diagrama 6 - Alterações na produção de Óxido Nítrico (NO) induzidas pelo processo vacinal.
Resultados expressos sob a forma de ( ) representam as diferenças significativas (p<0,05) em
relação ao tempo “Antes”; CC= Cultura controle, CE = Cultura estimulada.
VII.5- Reatividade de IgG e subclasses IgG1 e IgG2 anti-formas promastigotas
fixadas de L. chagasi
Os resultados da RIFI demonstraram que todos os animais dos grupos
imunizados, tanto com a LEISHVACIN quanto com a LEISHMUNE
®
, apresentaram
títulos de anticorpos superiores ao limiar de reatividade diagnóstica para LVC
(1:40), não sendo possível identificar diferenças na reatividade média dos títulos
entre os animais imunizados com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
.
Embora os resultados da reatividade de IgG e suas subclasses IgG1 e IgG2
anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, avaliados através da citometria de
Resultados
134
fluxo, não tenham apresentado diferenças significativas, os animais imunizados
com a LEISHVACIN apresentaram pico de reatividade de IgG e IgG1 superiores
aos animais imunizados com LEISHMUNE
®
. Por outro lado, quando a reatividade
de IgG2 foi avaliada, os animais imunizados com a LEISHVACIN apresentaram
pico de reatividade inferior aos animais imunizados com a LEISHMUNE
®
.
No âmbito da correlação entre a reatividade de IgG e a síntese de IL-4 foi
observado uma correlação positiva no grupo de animais imunizados com a
LEISCHVACIN e uma correlação negativa com os animais imunizados com a
LEISHMUNE
®
.
Na análise de correlação entre a reatividade de IgG e IgG1 anti-Leishmania,
os animais vacinados com a LEISHVACIN apresentaram uma correlação positiva.
Já os animais vacinados com a LEISHMUNE
®
não apresentaram correlação entre
estas imunoglobulinas.
Por outro lado na análise de correlação entre a reatividade de IgG e IgG2
anti-Leishmania, tanto os animais imunizados com a LEISHVACIN quanto os
imunizados com a LEISHMUNE
®
, apresentaram uma correlação positiva entre a
reatividade destas imunoglobulinas. Em suma, o aumento de reatividade de IgG
nos animais vacinados com a LEISHVACIN é seguido do aumento da reatividade
tanto de IgG1 quanto de IgG2. Já o aumento de reatividade de IgG nos animais
vacinados com a LEISHMUNE
®
está associado preferencialmente com o aumento
da reatividade de IgG2. Esses dados reforçam a existência de reatividade
imunológica diferencial entre os animais vacinados com a LEISHVACIN e com a
LEISHMUNE
®
.
Resultados
135
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUNE
LEISHMUNE
Reatividade de IgG e suclasses IgG1 e IgG2 anti L. chagasi
induzida pelo processo vacinal
LEISHVACIN
LEISHVACIN
LEISHMUNE
LEISHMUNE
IgG
IgG1
IgG2
+ + +
+ +
+ +
+ + + + +
+
Diagrama 7 - Reatividade de IgG e suas subclasses IgG1 e IgG2 anti-formas promastigotas fixadas
de L. chagasi avaliada por citometria de fluxo, induzidas pelo processo vacinal com a LEISHVACIN
e com a LEISHMUNE
®
.
Resultados expressos sob a forma de (+) representam a intensidade da reatividade.
DISCUSSÃO
Discussão
137
A leishmaniose visceral é uma doença em elevada expansão em todo
Mundo, principalmente no Brasil, onde recentemente deixou de apresentar um
perfil epidemiológico tipicamente rural, urbanizando-se por diversos centros
metropolitanos, incluindo diversas cidades das regiões Norte, Nordeste, Sudeste e
Centro-Oeste. Nesse contexto, os hospedeiros vertebrados reconhecidos como
reservatórios estão limitados a mamíferos pertencentes à família Canidae, sendo o
cão o mais importante reservatório. O grande número de casos de leishmaniose
visceral canina (LVC) e o intenso parasitismo cutâneo que ocorre nestes animais
os tornam a principal fonte de infecção para o vetor flebotomíneo e
conseqüentemente para o homem, caracterizando assim o perfil antropozoonótico
da doença (ABRANCHES et al., 1991; MORENO & ALVAR, 2002). Estudos
recentes realizados em áreas endêmicas para leishmaniose visceral têm
demonstrado que, embora um elevado percentual de cães (60-80%) apresente
anticorpos específicos para L. chagasi ou mesmo uma resposta imune celular
específica detectada pela Intradermorreação de Montenegro, a maioria desses
animais não manifesta sinais clínicos da LVC (CABRAL et al., 1998). Embora seja
uma doença de evolução crônica com aparecimento de sinais viscero-cutâneos
graves em cerca de 50% dos animais infectados, a existência de uma elevada taxa
de cães assintomáticos, representa um fato epidemiologicamente relevante, uma
vez que, mesmo os animais sem sinais clínicos representam um papel ativo na
cadeia de transmissão (BERRAHAL et al., 1996; GRADONI, 2001). Assim, a
implantação de medidas de controle da LVC representa um instrumento efetivo
para a interrupção da transmissão em regiões endêmicas para a leishmaniose
visceral.
Os estudos que visam o desenvolvimento de medidas profiláticas para as
doenças parasitárias variam, geralmente, nas condições epidemiológicas em que
as mesmas se desenvolvem. No caso leishmaniose visceral, as principais ações
utilizadas pelos programas de controle estão fundamentadas no tratamento de
casos humanos, o controle do inseto vetor e a eliminação dos cães soropositivos
(PALATNIK DE SOUSA et al., 2001). Entretanto, a eutanásia dos animais positivos
acarreta um profundo impacto e indignação aos proprietários, em face ao papel
que o cão vem representando na sociedade atual, não só no campo valor afetivo,
como animais de estimação, mas também no âmbito social como guias de
Discussão
138
companhia ou na prática da segurança populacional. Dessa forma, uma alternativa
para evitar o sacrifício dos animais infectados seria a implementação de medidas
quimioterápicas ou imunoprofiláticas para a LVC. Embora a quimioterapia com os
antimoniais pentavalentes venha sendo empregada com sucesso no tratamento de
casos de leishmaniose visceral humana, estudos preliminares não têm logrado
êxito com o uso de antimoniais na terapêutica da LVC (MARZOCHI et al., 1985).
Assim, o tratamento da LVC ainda constitui um desafio para a ciência, estimulando
diversos grupos de pesquisa nesta área de estudo.
No campo da imunoprofilaxia, o uso de uma vacina capaz de controlar a
infecção dos cães por L. chagasi, representa uma alternativa impactante, sendo
assim a melhor solução para o controle da doença canina. Embora, até o
momento, não exista uma vacina de uso veterinário, recomendada pelo Ministério
da Saúde, como forma de controle da infecção humana, alguns estudos têm
relatado a aplicabilidade de imunobiológicos eficazes para o controle da LVC.
Neste contexto, vários grupos de pesquisas em todo mundo concentram
seus esforços na busca de uma vacina capaz de proteger o cão contra a LVC. A
imunização representa a melhor forma para a prevenção da LVC, considerando
seu custo-benefício. Tal medida diminuiria os elevados custos no emprego de
inseticidas, além de impedir a eutanásia de cães que, com certeza, é muito
traumático para os proprietários dos animais infectados. Alguns pesquisadores
impulsionados por este quadro epidemiológico e pelas dificuldades no
estabelecimento de medidas de profilaxia e controle da LV, buscam desenvolver
vacinas capazes de proteger cães contra LVC. Grupos de investigadores no Irã,
Itália e Espanha têm desenvolvido vacinas constituídas de antígenos brutos,
antígenos recombinantes, proteínas quiméricas (resultante da fusão de diferentes
determinantes antigênicos) e vacinas de DNA contendo genes de determinantes
antigênicos de Leishmania (HANDMAN, 2001; GRADONI, 2001, 2006;
VANLOUBBEECK & JONES, 2004; CAMPOS-NETO, 2005; COLER & REED,
2005). No Brasil destacam-se os trabalhos desenvolvidos pelo grupo de pesquisas
da UFMG, coordenado pelo professor Wilson Mayrink voltado para o
desenvolvimento de uma vacina de primeira geração que permitiram a criação do
protótipo da LEISHVACIN. Mais recentemente, um grupo de pesquisa da UFRJ,
coordenado pela professora Clarissa Palatnik desenvolveu uma vacina de segunda
geração, denominada LEISHMUNE
®
. Após sua aprovação pelo Ministério da
Discussão
139
Agricultura do Brasil, a LEISHMUNE
®
representa atualmente, uma ferramenta
imunoprofilática promissora que poderia ser aplicada em campanhas de controle
do calazar canino.
Embora estudos de proteção tenham revelado o potencial tanto da
LEISHVACIN quanto da LEISHMUNE
®
para o controle da LVC, várias restrições
para o uso destes imunobiológicos têm sido apresentadas, principalmente devido a
escassez de fundamentação científica acerca das bases celulares e moleculares
da imunidade protetora pós-vacinal. Com o intuito de contribuir nesse amplo
contexto de investigação, esse estudo, propôs avaliar, em estudo longitudinal, com
pareamento dos protocolos de imunização unificados, os aspectos imunológicos
desencadeados pela vacinação com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
.
Numa abordagem ampla, foram avaliados aspectos da imunidade celular, do
perfil de síntese de citocinas e produção de óxido nítrico, bem como aspectos da
imunidade humoral. Os resultados referentes a cada uma das investigações, serão
discutidos a seguir, contextualizados com base em aspectos inerentes ao protocolo
vacinal, com ênfase no papel da natureza molecular da preparação antigênica,
bem como dos adjuvantes empregados.
Considerando a complexidade da resposta imunológica que envolve a
leishmaniose, buscamos através de diferentes enfoques fazer a caracterização do
perfil de resposta imune celular envolvida no processo de imunização de cães
contra esta doença. Com este intuito, realizamos um protocolo de
imunofenotipagem de células do sangue periférico dos cães durante o processo
vacinal, conduzido dentro da disponibilidade comercial de anticorpos anti-
moléculas de superfície de leucócitos caninas. Moléculas na superfície de células
hematopoiéticas desempenham um importante papel no seu desenvolvimento e
função, servindo como objetos de crescentes avanços no conhecimento sobre o
sistema imune. Embora, anticorpos dirigidos para uma ampla variedade de
marcadores moleculares de leucócitos humanos e de camundongo sejam
disponíveis comercialmente, um repertório ainda restrito encontra-se disponível
para os estudos da resposta imune em cães. Em 1993 o First International Canine
Leucocyte Antigen Workshop – CLAW (COBBOLD & METCALFE, 1994) foi
conduzido com o objetivo de identificar antígenos de leucócitos caninos e
anticorpos monoclonais que reconhecessem antígenos homólogos, classificando-
os por analogia de acordo com a nomenclatura dos CD humanos e murinos. Desde
Discussão
140
então, reações cruzadas entre moléculas expressas por linfócitos humanos vêm
sendo relatadas em várias publicações (CHABANE et al.,1994; SCHUBERTH et
al., 1998, CULMSSE et al., 2001). Atualmente são produzidos anticorpos
monoclonais dirigidos a um pequeno conjunto de antígenos de células caninas,
capazes de identificar estágios de diferenciação, ativação, migração celular e
imunorregulação (WEISS, 2001). As perspectivas são grandes nesta área de
estudo, e acreditamos que, em breve, novos anticorpos anti-marcadores de
superfície de células caninas estarão disponíveis no mercado, permitindo a
ampliação das investigações apresentadas em nosso estudo. Mesmo com um
reduzido número de anticorpos monoclonais específicos para moléculas caninas,
sua utilização para imunofenotipagem através da citometria de fluxo, representa
uma poderosa ferramenta para estudos imunológicos. Em nosso estudo,
empregamos anticorpos monoclonais anti-CD14, anti-CD3, anti-CD5, anti-CD4 e
anti-CD8 para caracterização de subpopulações celulares, anti-MHC I, anti-MHC II
para avaliação de ativação celular e anti-CD18 e anti-CD32 para análise de
aspectos da migração e imunorregulação, respectivamente.
Até o momento são escassos os trabalhos encontrados na literatura que
descrevem o perfil fenotípico de células da imunidade inata em cães imunizados
para a LVC (BORJA-CABRERA et al., 2004; FUJIWARA et al., 2005). Neste
contexto, nossos resultados demonstraram numa análise aprofundada, que a
intervenção vacinal com LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
é acompanhada por um
perfil distinto de alterações imunofenotípicas. A análise de marcadores de
superfície celular expressos em células da imunidade inata do sangue periférico,
relacionados com ativação (MHC) e migração (CD18), nos permitiram inferir que a
LEISHVACIN promove um recrutamento precoce de neutrófilos e eosinófilos, com
envolvimento tardio de monócitos, enquanto a LEISHMUNE
®
induz um
recrutamento precoce e persistente de neutrófilos e monócitos, sem o envolvimento
de eosinófilos.
Os neutrófilos são conhecidos como células que estão presentes durante os
processos agudos da inflamação. Estas células, respondem a estímulos diversos,
contribuindo através de mecanismos efetores mediados pela atividade fagocítica
ou pela liberação de intermediários reativos de oxigênio, culminando em sua
reconhecida atividade microbicida. Atualmente é consenso, a participação de
neutrófilos em mecanismos efetores da resposta imune, sendo estas células
Discussão
141
potencialmente produtoras de citocinas durante a infecção por diversos patógenos
intracelulares, inclusive Leishmania (DENKERS & MARCHALL, 1998). Dados
recentes, em modelo experimental, sugerem que neutrófilos podem controlar a
infecção por L. donovani através da produção de reativos intermediários do
oxigênio, exercendo um importante papel na destruição inicial do parasito e no
recrutamento de fagócitos mononucleares (MURRAY & NATHAN, 1999). Assim, os
neutrófilos poderiam ter um papel fundamental no controle inicial da infecção por
Leishmania, sendo capazes de destruir formas promastigotas através da ativação
de mecanismos oxidativos, além de contribuir para o recrutamento adicional de
mononucleares. A habilidade de polimorfonucleares em eliminar o parasito em
cães saudáveis ou naturalmente infectados por L. infantum, foi avaliada por
BRANDIONISIO et al. (1996), confirmando o papel da produção de superóxidos
nos mecanismos microbicidas de polimorfonucleares.
Estudos realizados por PERSON et al. (1987) também demonstraram que os
eosinófilos apresentam capacidade microbicida frente a Leishmania. Acredita-se
que ativação dos eosinófilos, num microambiente contendo IFN- levaria à
estimulação da produção de vários mediadores inflamatórios. Além disso, a
expressão de receptores, tais como receptores Toll-4, 7 e 8 na superfície celular
dos eosinófilos ativados por IFN- poderia representar uma importante via de
interação eosinófilo-Leishmania que promoveria a eliminação do parasito por essas
células (NAGASE et al., 2003). Assim, o envolvimento precoce de eosinófilos
observado no contexto da LEISHVACIN poderia representar um mecanismo
leishmanicida adicional que compensaria a ausência do envolvimento precoce de
monócitos induzido por essa vacina.
A Leishmania é um parasito intracelular obrigatório que infecta, sobrevive e
multiplica preferencialmente em monócitos/macrófagos. Assim, a magnitude da
atividade leishmanicida da linhagem monocítica representa o principal evento no
estabelecimento da resistência à infecção por Leishmania. Os parasitos
fagocitados por macrófagos, bem como a interação de antígenos solúveis de
Leishmania com suas moléculas de superfície são importantes mecanismos
controladores da ativação da resposta inflamatória e controle do crescimento de
parasitos. A ativação dos macrófagos representa um dos primeiros eventos na
resistência inata à infecção intracelular.
Discussão
142
Em suma, a habilidade de ambos imunobiológicos em desencadear
alterações fenotípicas em células da imunidade inata, sugere sua possível
capacidade de induzir mecanismos imunoprotetores no âmbito da imunoprofilaxia
da LVC. O perfil diferenciado de alterações observadas após a vacinação com a
LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
, específicamente, acompanhadas por uma cinética
distinta, bem como num recrutamento diferencial, onde a LEISHVACIN mostra um
potencial mais amplo de envolvimento de diferentes populações avaliadas,
enquanto a LEISHMUNE
®
apresenta uma precocidade nos eventos de
recrutamento celular, poderia ser um reflexo direto a natureza antigênica do
imunógeno. Nesse contexto, a multiplicidade de interações induzida pela
LEISHVACIN é consistente com a natureza complexa do antígeno bruto de L.
amazonensis utilizado como base imunogênica dessa vacina. Por outro lado, a
natureza singular da preparação de antígeno purificado da LEISHMUNE
®
,
corrobora com o perfil mais seletivo, direcionado e precoce das alterações
fenotípicas observadas.
O reconhecimento de determinantes antigênicos e a iniciação da resposta
imune são controlados por múltiplos mecanismos. Várias estratégias de
reconhecimento têm sido descritas, dentre elas, o reconhecimento “padrão” é
baseado na detecção de um grupo limitado de padrões moleculares conservados
(PAMPs), que são singulares no mundo microbiano e invariante dentre classes de
patógenos (IWASAKI & MEDZHITOV, 2004). Os alvos de reconhecimento desses
PAMPs são detectados por receptores de reconhecimento padrão (PRR- TLR). O
padrão de reconhecimento universalmente usado no estabelecimento da resposta
imune possui, entretanto, um perfil diferenciado no recrutamento de diferentes
populações celulares, considerando que a distribuição de TLR difere em células da
imunidade inata. Tem sido descrito que enquanto neutrófilos expressam TLR-1 a
TLR-10, exceto TLR-3, eosinófilos expressam TLR-1, 4, 7, 9, 10 e monócitos
expressam TLR-1 a TLR-8, com exceção de TLR-3. Considerando a escassez de
informações referentes ao perfil de interação entre antígenos de Leishmania e
padrões específicos de TLR, numa análise especulativa, poderíamos sugerir que o
FML, antígeno purificado utilizado na LEISHMUNE
®
, apresentaria capacidade
seletiva de interação com TLR-2, presente em neutrófilos e monócitos, mas
ausente em eosinófilos. Por outro lado, é consistente inferir que a multiplicidade de
interações possíveis inerentes a LEISHVACIN seria a base do recrutamento mais
Discussão
143
amplo de células observadas nessa vacina, com envolvimento de neutrófilos,
monócitos e eosinófilos.
Embora seja consenso que a morte da Leishmania por fagócitos seja o
ponto crucial da resolução da infecção, estudos realizados em modelo
experimental têm demonstrado que a ativação efetiva e persistente de macrófagos
requer um padrão de citocinas derivadas de células da imunidade adaptativa, para
o controle efetivo da infecção. Além disso, cabe ressaltar a importância da
imunidade adaptativa no contexto da memória pós-vacinal e o seu papel
fundamental no direcionamento de uma imunidade inata pós-vacinal mais efetiva.
Visando caracterizar a contribuição da imunidade adaptativa no contexto da
vacinação anti-LVC, realizamos um estudo detalhado da cinética de alterações
fenotípicas em linfócitos circulantes, com ênfase em linfócitos T (CD3
+
e CD5
+
) e
suas sub-populações (CD4
+
e CD8
+
), linfócitos B, marcadores de ativação (MHC I
e MHC II), molécula de adesão (CD18) e o receptor de média afinidade para IgG
(CD32).
Nossos resultados demonstraram que enquanto a LEISHVACIN promoveu
uma resposta imune adaptativa de perfil misto, associado à ativação de linfócitos T
e linfócitos B, a LEISHMUNE
®
promoveu uma resposta imune adaptativa de perfil
seletivo, associada à ativação tardia e preferencial de linfócitos T. No âmbito do
recrutamento de subpopulações de linfócitos observamos ainda que a
LEISHVACIN promoveu um envolvimento precoce em linfócitos T CD4
+
, associada
ao aumento na expressão de MHC II, envolvimento de linfócitos B no período
intermediário do processo vacinal, com queda na expressão de CD32 e
participação nos tempos intermediário e tardio de linfócitos T CD8
+
, associada ao
aumento na expressão de CD18 e à queda na expressão de MHC II. Por outro
lado, a LEISHMUNE
®
promoveu uma alteração de linfócitos T no tempo
intermediário do processo vacinal, com envolvimento tardio de CD4
+
, intermediário
e tardio de CD8
+
, associada ao aumento na expressão e CD18 e à queda na
expressão de MHC II, sem alterações em linfócitos B.
Células T CD4
+
desempenham um papel decisivo no estabelecimento da
resposta imune específica na leishmaniose, pois podem mediar, através da
produção de diferentes citocinas, mecanismos efetores envolvidos no controle e
progressão da infecção (KEMP et al., 1999). Os linfócitos T auxiliares, que
expressam moléculas CD4 em sua superfície, reconhecem peptídeos antigênicos
Discussão
144
no contexto de células apresentadoras de antígenos (APC) (FORMAN, 1984), e,
uma vez ativados, promovem conexões imunológicas entre eventos da imunidade
humoral, via interação T/B bem como da imunidade celular inata (via fagócitos e
APCs) e adaptativa (via células T CD8
+
). Nossos dados demonstraram a existência
de um sincronismo do envolvimento precoce de linfócitos T CD4
+
e intermediário
de linfócitos B no contexto da vacinação com a LEISHVACIN, com envolvimento
tardio de linfócitos T CD8
+
, sugerindo um possível envolvimento misto da via de
cooperação T/B e da interação celular auxiliar/citotóxica. Por outro lado, o
recrutamento de carater intermediário/tardio de linfócitos TCD8
+
e CD4
+
, com
ausência de linfócitos B, observados na vacinação com a LEISHMUNE
®
, sugerem
um possível envolvimento mais seletivo da via de cooperação auxiliar/citotóxica.
Consistente com o envolvimento da interface celular/humoral na
LEISHVACIN, nossos dados demonstraram que além do sincronismo na cinética
de envolvimento de linfócitos T CD4
+
e células B, ocorre simultaneamente, o
estabelecimento de um padrão fenotípico de expressão de receptor de média
afinidade para IgG (CD32) em linfócitos B característico da ausência de
mecanismos moduladores da produção de imunoglobulina. Embora sejam
escassos os estudos referentes ao papel da molécula CD32 em linfócitos caninos,
a transferência de informações geradas em estudos derivados de humanos e
modelos experimentais murinos, mostra que embora o CD32 possua um papel
imunomodulador em neutrófilos e monócitos, sua expressão por linfócitos B está
diretamente associada a regulação da resposta humoral. Assim, os resultados
referentes à expressão de CD32 por linfócitos B, evidenciando a queda de sua
expressão no período intermediário do processo vacinal, paralela à queda na
freqüência de linfócitos B circulantes, reforçam a natureza mista da imunidade
desencadeada pela LEISHVACIN. Para alguns pesquisadores, é intrigante e
inesperada a queda de células B, em cães portadores de leishmaniose visceral
ativa, já que estes animais apresentam intensa atividade policlonal de células B,
evidenciada pela elevada produção de anticorpos (BOURDOISEAU et al.,1997),
sendo estes resultados, aparentemente contraditórios, com a noção constante de
hipergamaglobulinemia na LVC (KEENAN et al., 1984; SLAPPENDEL, 1988;
PINELLI, et al., 1994). Acreditamos que o evento de migração dos linfócitos B para
os sítios imunológicos secundários, como linfonodo e baço seria a chave dessa
questão. Importante característica encontrada em cães que apresentam elevados
Discussão
145
títulos de anticorpos é a hiperplasia folicular devido ao aumento na freqüência de
plasmócitos nos folículos dos linfonodos e do baço, áreas predominantemente de
atividade de células B (MARTINEZ-MORENO et al.,1993).
Os animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram um envolvimento
de linfócitos T (CD3
+
CD5
+
) no período intermediário do processo vacinal. Análises
fenotípicas adicionais demonstraram que as alterações no período intermediário
refletiam preferencialmente alterações em linfócitos T CD8
+
e de uma
subpopulação ainda desconhecida, apresentando um fenótipo CD3
+
CD5
Low+
. Ao
fazermos as análises da freqüência de linfócitos T CD3
+
CD5
+
verificamos a
presença de duas subpopulações distintas, que diferiam quanto à intensidade de
expressão da molécula CD5, sendo que uma população tinha alta expressão do
marcador CD5 (CD3
+
CD5
High+
) e a outra subpopulação apresentando baixa
densidade de expressão do marcador CD5 (CD3
+
CD5
Low+
). A análise dos dados
demonstrou que animais imunizados com a LEISHVACIN não apresentaram
alterações significativas no percentual de linfócitos T CD3
+
CD5
Low+
durante o
processo vacinal. De forma interessante, seletivamente os animais imunizados com
a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento significativo no percentual de linfócitos
T CD3
+
CD5
Low+
no tempo intermediário do processo vacinal. Ao fazermos uma
caracterização adicional dos aspectos fenotípicos desta subpopulação de linfócitos
T (CD3
+
CD5
Low+
) a fim de identificar a co-expressão dos marcadores CD4 e CD8,
verificamos que em sua quase totalidade, os linfócitos T CD3
+
CD5
Low+
co-
expressam o marcador CD8 e não o marcador CD4. Uma análise confirmatória da
correlação demonstrou adicionalmente a existência de forte associação entre a
freqüência de ambas as populações de linfócitos T (CD3
+
CD5
Low+
e CD8
+
). Esse
dado consiste numa informação pioneira no âmbito da imunofenotipagem de
células caninas. Embora, não tivemos a oportunidade de caracterizar
adicionalmente o perfil de fenotípico dessa subpopulação celular, acreditamos que
sua expansão num microambiente de caráter seletivo de envolvimento de
imunidade celular, possa sugerir a existência de estreita relação entre a presença
de células T CD3
+
CD5
Low+
CD8
+
e o estabelecimento de mecanismos efetores da
imunidade celular. Análises fenotípicas complementares estão ora em andamento
em nosso laboratório.
Em suma, a habilidade de ambos imunobiológicos em desencadear
alterações fenotípicas em células T CD8
+
, sugere sua possível capacidade de
Discussão
146
induzir mecanismos imunoprotetores no âmbito da imunoprofilaxia da LVC. O perfil
diferenciado da LEISHVACIN, com habilidade de induzir um perfil misto, com
envolvimento paralelo de linfócitos B corrobora o potencial imunogênico mais
amplo deste imunobiológico, enquanto a LEISHMUNE
®
apresenta uma maior
seletividade nos eventos de recrutamento celular. Novamente, acreditamos que
esse padrão diferencial de recrutamento celular poderia ser um reflexo direto a
natureza antigênica do imunógeno. A natureza antigênica complexa da
LEISHVACIN poderia refletir a maior capacidade de recrutamento de linfócitos B
enquanto, em contrapartida, o caráter singular da preparação de antígeno da
LEISHMUNE
®
, favoreceria o estabelecimento de eventos da imunidade celular.
Acreditamos que a ativação preferencial de linfócitos T CD8
+
pela
LEISHMUNE
®
seja em grande parte proporcionada pelo antígeno vacinal (FML),
pois sendo uma molécula purificada poderia ser processada e apresentada via
MHC I por células apresentadoras de antígeno através do mecanismo de “cross-
priming”. Alguns estudos têm fornecido evidências de que a ativação de células T
CD8
+
por antígenos exógenos possa ocorrer através do mecanismo de “cross-
priming” por meio da apresentação destes antígenos via MHC-I, uma vez que APC,
em especial as células dendríticas, podem fagocitar antígenos exógenos e
apresentá-los a linfócitos T CD8
+
via MHC-I (BROSSART & BEVAN, 1997). Para
patógenos intracelulares, tem sido descrito que o “cross-priming” possa ocorrer em
situações nas quais o microrganismo ao escapar da destruição no fagolisossomo,
tenha acesso ao compartimento citosólico, sendo assim apresentado às células T
CD8
+
via moléculas MHC-I (MORON et al., 2004). Mais recentemente foi
demonstrado que mesmo presente no interior de fagossomos, o patógeno pode ser
apresentado a linfócitos T CD8
+
em associação ao MHC-I. Parece que esta
organela possui funções próprias capazes de promover o “cross-priming” (HOUDE
et al., 2003).
É importante ressaltar a relevância que tem sido dada, ao papel das células
T CD8
+
nas leishmanioses. Diversos estudos têm demonstrado a importância do
recrutamento de células T CD8
+
em eventos de proteção na LVC (Pinelli et al.,
1995, 1997). Para PINELLI et al. (1997) os linfócitos T CD8
+
desempenham um
importante papel na imunidade protetora na LVC por L. infantum. Estes autores
observaram que essas células além de serem capazes de montar uma resposta do
tipo 1, através da produção de IFN-, são efetoras na lise de macrófagos infectados
Discussão
147
por L. infantum. Nos estudos de PINELLI et al. (1995), a partir de experimentos in
vitro, ficou ainda evidenciada a dependência da função efetiva de linfócitos T CD8
+
em relação a presença de linfócitos T CD4
+
. Em estudos de depleção de células T
CD4
+
, foi evidenciado que o envolvimento das células T CD8
+
na imunidade
protetora da LVC parece estar conectado a uma resposta eficaz de células T CD4
+
.
Como os parasitos intracelulares do gênero Leishmania residem em
compartimentos do endossoma dos macrófagos, ainda não está claro se antígenos
do parasito são apresentados no contexto de moléculas de MHC de classe I
através do mecanismo supracitado de “cross-priming”. Assim, parece que o
reconhecimento e destruição de macrófagos infectados por células T CD8
+
devem
requerer a cooperação de células T CD4
+
. Uma vez ausente, o animal apresentaria
uma perda na habilidade de controlar a infecção. Nesse contexto, tanto a
LEISHVACIN quanto a LEISHMUNE
®
apresentariam os requisitos necessários para
a atenção paralela e células T CD4
+
e CD8
+
.
No contexto da participação efetiva de linfócitos T CD4
+
no direcionamento
da resposta imune, vários estudos têm demonstrado que uma variedade de
citocinas desempenha um papel importante no sentido do favorecimento da
ativação de eventos da imunidade celular e humoral. Assim, o direcionamento da
resposta imune para um padrão de participação efetiva de linfócitos B, linfócitos T
CD8
+
, bem como células da imunidade inata, parece ser conseqüência direta do
perfil do microambiente de citocinas. Dependendo do tipo de citocina produzida
pelas células T CD4
+
, diferentes mecanismos promotores da imunidade inata e
adaptativa poderiam ser disparados. Num microambiente de predomínio de
citocinas do tipo 1 (como IL-12 e INF-) observa-se o favorecimento de
mecanismos da resposta imune celular. Por outro lado, num microambiente com
predomínio de citocinas do tipo 2 (como IL-4 e IL-10) parece existir um
favorecimento de eventos da síntese de anticorpos pelas células B (BALKWILL &
BURKE, 1989). Nossos dados demonstraram a sincronia da via de cooperação T/B
com aparecimento tardio da interação celular auxiliar/citotóxica, no contexto da
LEISHVACIN, o que sugere possivelmente o estabelecimento de um padrão misto
de citocinas com o envolvimento de citocinas do tipo 1 e do 2. Por outro lado, o
envolvimento de carater intermediário/tardio de linfócitos TCD8
+
e CD4
+
na via de
cooperação entre células T auxiliares/citotóxicas observado no processo vacinal
com a LEISHMUNE
®
, sugere o estabelecimento de um microambiente com
Discussão
148
predomínio de citocinas do tipo1. Essa hipótese de associação entre das
alterações fenotípicas em células da imunidade adaptativa no contexto do padrão
de citocinas serão abordados a seguir.
Considerando a disponibilidade comercial de anticorpos anti-citocinas
caninas, identificados por sua reatividade cruzada com moléculas bovinas, nesse
estudo, tivemos a possibilidade de avaliar paralelamente o perfil moléculas de
superfície de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
e o padrão de síntese de citocinas
intracitoplasmáticas em ensaios de estimulação antígeno-específica in vitro.
Nossos resultados mostraram que embora o aumento do percentual de
linfócitos T IFN-
+
tenha sido uma alteração comum ao processo de vacinação
tanto com a LEISHVACIN quanto com a LEISHMUNE
®
, cabe ressaltar que a sub-
população de linfócitos T CD4
+
foi a principal fonte de IFN-. No grupo de animais
imunizados com a LEISHVACIN observamos ainda aumento no percentual de
linfócitos T IL-4
+
, provenientes tanto de linfócitos T CD4
+
quanto T CD8
+
. A análise
do balanço IFN-
+
/IL-4
em linfócitos T demonstrou que tanto os animais imunizados
com a LEISHVACIN quanto com a LEISHMUNE
®
apresentaram um aumento
significativo de IFN-
em relação à IL-4
+
. Em síntese, as análises dos perfis de
citocinas intracitoplasmáticas corroboram mais uma vez o perfil misto de resposta
imune no grupo LEISHVACIN, e o padrão mais seletivo observado no grupo de
animais imunizados com a LEISHMUNE
®
. Acreditamos que o impacto diferencial
na resposta imune seja conseqüência direta tanto da natureza antigênica da vacina
(LEISHVACIN= Antígeno Bruto e LEISHMUNE
®
= Antígeno purificado - FML),
quanto em grande parte, pelo caráter imuno-auxiliar do adjuvante (LEISHVACIN=
BCG e LEISHMUNE
®
= Saponina).
No âmbito da natureza da preparação antigênica vacinal, sendo o antígeno
da LEISHVACIN um antígeno bruto de Leishmania amazonensis, acreditamos que
o mesmo seja composto por inúmeras moléculas antigênicas (carboidratos,
proteínas, lipídeos), caracterizando uma multiplicidade em termos de possibilidade
de interações com diferentes tipos celulares, via múltiplos receptores de superfície
celular, incluindo os TLR, já descritos anteriormente, receptores de linfócitos B
(mIgM), bem como apresentarem a possibilidade de conter determinantes
superantigênicos, o que levaria sua apresentação por células apresentadoras de
antígenos por diferentes vias, podendo ser apresentadas tanto via moléculas de
Discussão
149
MHC I quanto MHCII, quanto diretamente, no caso de possíveis componentes
superantigênicos. Isso desencadearia a ativação de uma resposta mais robusta
tanto celular quanto humoral levando a um perfil de resposta mista, ativando tanto
linfócitos T CD4
+
, linfócitos B bem como linfócitos T CD8
+
, num microambiente de
citocinas do tipo 1 e do tipo 2, como demonstrado pela presença simultânea de
IFN- e IL-4 nas culturas in vitro.
Por outro lado, sendo o antígeno da LEISHMUNE
®
um antígeno purificado
FML de Leishmania donovani, acreditamos que o mesmo apresente uma
antigenicidade mais seletiva, o que é característico de antígenos protéicos
purificados. Asssim, o FML seria processado e apresentado por células
apresentadoras de antígenos tanto via MHC II, característico de antígenos de
natureza exógena, quanto via MHC I, através da proposta de ativação via “cross-
priming”, levando a um perfil de resposta preferencialmente do tipo celular,
ativando preferencialmente linfócitos T CD8
+
, num microambiente caracterizado
pela presença seletiva de IFN- como foi observado em nossos resultados.
Nas duas ultimas décadas houve um considerável aumento do número de
pesquisas que buscam isolamento e caracterização de proteínas para uso como
imunobiológicos candidatos para a vacinação anti-LVC. Neste contexto o uso de
proteínas purificadas ou recombinantes tem se mostrado uma ferramenta mais
promissora na produção de vacinas. Vantagens significativas do uso de antígenos
purificados tais como alto grau de pureza, completa caracterização química,
ausência de contaminantes, completa reprodutibilidade e custo-benefício de
produção e estabilidade, uma vez que não há enzimas proteolíticas originárias do
material biológico bruto. De fato, proteínas purificadas ou recombinantes são mais
seguras que os microorganismos íntegros inativados, porém menos imunogênicos.
Assim, na era da utilização de vacinas de segunda geração, surge à necessidade
mais evidente da escolha de um adjuvante que possa propiciar maior poder de
imunogenicidade. Para AUCOUTURIER et al. (2001), os adjuvantes exercem uma
importante função na eficácia das vacinas à medida que os antígenos tornam-se
mais e mais purificados. Adjuvante vem do latim adjuvare, ajudar. Como definiu
EDELMAN (1998), adjuvante é uma substância usada em combinação com
antígenos específicos de modo que se produz mais imunidade do que usando
somente o antígeno. A função dos adjuvantes é aumentar a resposta imune
específica a antígenos vacinais, eles podem seletivamente aumentar diferentes
Discussão
150
componentes da resposta imune, tais como um particular isotipo de anticorpo ou
imunidade mediada por células. Seus mecanismos de ação não são ainda muito
claros, mas podem ser: através de geração de depósitos de antígenos, capacidade
de liberar um imunógeno para células efetoras geralmente via células
apresentadoras de antígenos (APCs), imunomodulação, efeitos na expressão de
MHC II em APCs, capacidade de apresentação preservando a integridade
conformacional do antígeno, entre outras. Até recentemente, os únicos adjuvantes
aprovados para uso eram, os sais de alumínio em humanos e os sais de alumínio e
óleos minerais em medicina veterinária (MEN et al.,1996). Infelizmente apesar de
serem bons estimuladores da produção de anticorpos, esses adjuvantes são,
geralmente, pobres estimuladores da resposta mediada por células. Uma boa
resposta imune celular é, contudo, essencial para o sucesso no controle de um
grande número de doenças, particularmente no caso da LVC. Outros adjuvantes
como a saponina QuilA, e O BCG (Bacillo Calmette-Guérin) dentre outros já
demonstraram capacidade ativar o sistema imune. Estes dois adjuvantes são a
bases da imunização empregada em nosso estudo. Embora pouco se saiba sobre
o efeito destes adjuvantes, combinados ou não com vacinas, no modelo canino é
sabido, através de estudos em modelos experimentais murinos que o BCG induz
um perfil de resposta misto (Tipo 1 e 2) e que a Saponina induz também um perfil
misto mas preferencialmente do tipo 1 ou seja induz resposta do Tipo 1 >Tipo 2
(SINGH & O`HAGAN, 2002; SCHIJNS, 2002; SINGH & O’HAGAN, 2003; LIMA et
al., 2004; ).
De forma mais detalhada, sabe-se que o BCG utilizado neste trabalho como
adjuvante da LEISHVACIN é derivado do Mycobacterium bovis, utilizado
mundialmente na prevenção da tuberculose (revisão de BARBOSA et al., 2003). O
BCG tem sido estudado amplamente nas ultimas décadas, tendo sido demonstrado
o seu importante papel na ativação de macrófagos, na indução de óxido nítrico
(NOZAKI et al.1997, KREUGER et al., 1998), na potencialização da resposta imune
celular e humoral de longa duração (WARREN & CHEDID, 1988), fundamentada
na indução da síntese mista de citocinas do tipo 1 e 2 (TAKAYAMA et al., 1991).
Diversos trabalhos descrerem o uso de BCG, combinado ou não com antígenos de
Leishmania, em ensaios imunoprotetores para leishmaniose cutânea e visceral
(MOMENI et al., 1999; BORJA-CABRERA et al., 2002; KHALIL et al., 2000; MISRA
et al., 2001). Em nosso trabalho acreditamos que o uso do BCG associado ao
Discussão
151
antígeno bruto de L. amazonensis tenha propiciado o estabelecimento de uma
resposta mista, levando a alterações em marcadores celulares de ativação, tanto
em células da imunidade inata (alteração em monócitos, neutrófilos e eosinófilos),
quanto da imunidade adaptativa (linfócitos T e B), bem como o fator mais relevante
para o estabelecimento de um padrão misto de citocinas, com indução de IFN- e
IL-4, no contexto da LEISHVACIN.
Já a saponina, o adjuvante empregado como adjuvante da LEISHMUNE
®
,
faz parte de um grupo heterogêneo de esteróis glicosídeos e triterpenóides
glicosídeos que estão presentes em uma ampla variedade de plantas, distribuída
pela casca, folhas, caule, raízes e flores (MILGARTE & ROBERTS, 1995). A
moderna tendência no desenvolvimento de vacinas em direção ao uso de proteínas
recombinante altamente purificadas, o qual são pobremente imunogênicas quando
administradas de forma isolada ou em combinação com sais de alumínio, tem
direcionado a pesquisa ao adjuvante saponina, o qual possui a habilidade de
estimular a resposta mediada por células, assim como a aumentar a produção de
anticorpos (BARR et al., 1998), e também a capacidade de estimular a resposta
imune ao antígeno promovendo aumento na síntese de várias citocinas, como IFN-
, IL2, IL-4 e IL-10 (COX & COUTER, 1997). As saponinas são estimuladoras de
linfócitos B “in vitro” (DALSGAARD et al., 1999) e “in vivo” há evidencias de efeito
imunoestimulador inespecífico. Quanto ao seu modelo de ação, BAR et al. (1998)
descrevem que a saponina poderia ter a capacidade de liberar o imunógeno para
células efetoras geralmente via APCs, favorecendo a indução de resposta T
citotóxica (SCOTT et al., 1985), além de permitir maior retenção do antígeno no
local da inoculação (geração de depósitos de antígenos). Nos estudos de escolha
do adjuvante para LEISHMUNE
®
, SANTOS et al. (2002) avaliaram cinco diferentes
adjuvantes (BCG, rIL-12, saponina - QS21, saponinas - QuilA e Reidel De Haen)
combinados com o antígeno FML em imunização de camundongos suíços contra
leishmaniose visceral. Neste estudo, os pesquisadores tinham como objetivo
melhorar a formulação da vacina FML que havia mostrado em trabalhos anteriores
ser protetora contra leishmaniose visceral (PALATNIK et al, 1994; SANTOS et al.,
1999). Eles verificaram um significante e expressivo aumento de resposta anti-FML
por IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgM detectado por todos adjuvantes sendo que no
grupo de camundongos vacinado com QuilA-FML foi observado aumento
acentuado na produção IgG2a e forte resposta intradermoreação. Desta forma, a
Discussão
152
saponina QuilA proporcionou maior eficácia de proteção quando combinada com o
antígeno FML que os demais adjuvantes. Em nosso trabalho constatamos que a
associação saponina FML propiciou uma maior tendência ao estabelecimento de
uma resposta seletiva via imunidade celular, levando à alterações em marcadores
celulares de ativação, tanto em células da imunidade inata (monócito e neutrófilos),
quanto da imunidade adaptativa (Linfócitos T CD8
+
, num contexto de cooperação
com linfócitos T CD4
+
), sendo que o processo vacinal induziu também uma
resposta celular mais direcionada a um padrão de imunidade mediada por IFN-.
Em suma, nossos resultados referentes ao padrão de síntese de citocinas
confirmaram o perfil seletivo da resposta imune desencadeada pela LEISHMUNE
®
,
com perfil seletivo de síntese de IFN- por linfócitos T CD4
+
e balanço favorável da
síntese de IFN- sobre IL-4 por linfócitos T totais. Por outro lado, a LEISHVACIN
apresentou um perfil misto da resposta imune com síntese de IFN- e IL-4 por
linfócitos T CD4
+
e IL-4 por células CD8
+
, embora apresente também um balanço
favorável de IFN- sobre IL-4 por linfócitos T. Esses dados demonstram a
habilidade de ambos imunobiológicos em desencadear alterações fenotípicas
capazes de induzir mecanismos imunoprotetores no âmbito da imunoprofilaxia da
LVC. Como mencionado anteriormente, a multiplicidade antigênica da
LEISHVACIN associada ao adjuvante de caráter misto BCG (tipo 1/Tipo2) e por
outro lado o carater purificado do antígeno da LEISHMUNE
®
paralelo ao adjuvante
saponina de perfil misto, porém predominantemente do tipo 1, poderiam ser a base
para o entendimento do perfil imunológico observado em nosso estudo.
Numa abordagem adicional acerca do potencial imunogênico da
LEISHVACIN e da LEISHMUNE
®
para o perfil da resposta imune celular, um fator
importante consiste em avaliar a capacidade do imunógeno de induzir a produção
de óxido nítrico (NO), um potente agente leishmanicida. O NO é um mediador
biológico sintetizado por diferentes tipos celulares, pela ação de uma família de
enzimas denominadas óxido nítrico sintase (NOS), que incluem as isoformas nNOS
(neuronal), eNOS (endotelial) - conhecidas como cNOS (constitutivas) - e a iNOS
(induzida). A ativação do sistema imune e o estabelecimento de um perfil de
caráter inflamatório está geralmente associado ao aumento na expressão de iNOS.
O mecanismo de ativação e o papel funcional de iNOS encontra-se bem
estabelecidos em macrófagos de camundongos e humanos. Entretanto, os eventos
Discussão
153
envolvidos na atividade de iNOS em monócitos/macrófagos caninos ainda
necessita ser esclarecido (MOSSALAYI et al.,1999; PANARO et al., 2001;
HOLZMULLER et al., 2005). Em humanos, uma forte expressão de iNOS tem sido
descrita em tecidos de indivíduos infectados por L. donovani, (FACCHETTI et
al.,1999). Os autores sugerem que a indução da expressão de iNOS seja regulada
primariamente em nível de transcrição e modulada por várias citocinas ou produtos
do parasito. Em geral, IFN-, IL-2 e TNF- são considerados potentes indutores da
expressão de iNOS. Por outro lado, IL-4, IL-10 e TGF-, são considerados
supressores da expressão de iNOS (DE VERA et al.,1996; TAUB & COX, 1995;
OSWALD et al.,1994). VOULDOUKIS et al. (1997), demonstraram que a IL-10 é
um potente inibidor da geração de NO por macrófagos humanos infectados com L.
major ou L. infantum. Além disso, os autores demonstraram que a função da IL-10
aumentava quando associada a IL-4. Considerando a importância do NO no
controle do parasitismo de macrófagos por Leishmania, alguns autores
correlacionam os eventos de proteção na leishmaniose à maior expressão de iNOS
e consequentemente uma produção mais elevada de NO (BRANDONISIO, et al.,
2001; GANTT et al., 2001).
Para avaliar a produção de NO por monócitos de animais vacinados com a
LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
, determinamos indiretamente os níveis de nitrito
em sobrenadante de cultura de células mononucleares do sangue periférico dos
animais antes e após a vacinação. Nossos resultados demonstraram que o grupo
de animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentou um aumento significativo
de produção de nitrito quando avaliamos a concentração de nitrito/monócitos
adicionada à cultura. Este resultado associa-se de forma interessante com o fato
deste grupo de animais apresentarem um aumento seletivo na produção de IFN-
por células mononucleares mantidas em cultura in vitro. A estreita relação entre a
produção óxido nítrico e a síntese de IFN- por culturas de células de cães
vacinados com a LEISHMUNE
®
, associado aos resultados anteriores que
demonstram seletividade do envolvimento de linfócitos T, preferencialmente CD8
+
nos dá suporte para sugerir que os animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentam os mecanismos imunológicos compatíveis com desenvolvimento de
proteção contra infecção por Leishmania . Por outro lado, os níveis de NO,
detectados via nitrito, no sobrenadante de culturas de células de cães vacinados
Discussão
154
com a LEISHVACIN não demonstraram nenhum aumento significativo. Esse dado
parece consistente com a maior presença de IL-4 observada nas culturas desses
animais, considerando o papel da IL-4 como um potente modulador da síntese de
NO como mencionado anteriormente.
O maior comprometimento da resposta imune com um microambiente de IL-
4 nos animais vacinados com a LEISHVACIN nos estimulou a investigar se esse
fato poderia estar associado com o favorecimento de uma resposta humoral mais
abundante. Inicialmente, visando complementar a caracterização do padrão
imunológico desencadeado pela vacinação com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
,
realizamos, numa etapa final de nosso estudo a caracterização do perfil de
imunoglobulinas IgG e subclasses de IgG (IgG1 e IgG2), que será discutida a
seguir.
Os estudos que abordam a resposta imune humoral na LVC apresentam um
consenso geral que os elevados níveis de anticorpos anti-Leishmania
desencadeados pela infecção não apresentam efeito protetor para o hospedeiro
infectado, uma vez que maiores títulos de anticorpos estão geralmente associados
com maior morbidade da infecção, ou seja, de um modo geral, níveis maiores de
anticorpos parecem ter um elevado valor preditivo e uma correlação significativa
com o número de sinais apresentados pelos cães avaliados. (ABRANCHES et al.,
1991; GENARO et al.,1992; PINELLI et al.,1994; FERRER et al., 1995;
SLAPPENDEL & FERRER, 1998; BORJA-CABRERA et al., 1999).
Nesse contexto, uma vacina que possua um caráter protetor deveria ser
capaz de induzir uma resposta imune eficaz, com um menor envolvimento possível
do compartimento humoral. Uma vacina com esse potencial seria ideal, pois além
de estimular os atributos de uma resposta imune característica dos animais
assintomáticos, considerados portadores de mecanismos imunoprotetores anti-
Leishmania, não levariam a soroconversão pós-vacinal, fato que facilitaria a ação
do Ministério da Saúde na triagem sorológica de cães infectados pelo parasito.
Empregando um dos métodos de diagnóstico para LVC preconizado pelo
Ministério da Agricultura e da Saúde, nossos resultados demonstram que 100%
dos animais vacinados, tanto com a LEISHVACIN quanto com a LEISHMUNE
®
,
apresentaram soroconversão pós-vacinal com reatividade superiores aos títulos de
1:40. Nessa primeira abordagem, nenhuma diferença significativa no perfil de
resposta humoral foi observada entre os dois grupos de animais vacinados.
Discussão
155
Considerando, entretanto, o nosso atual esforço na busca de metodologias
alternativas que possam ser empregadas para avaliar a reatividade sorológica
diferencial de animais portadores de diferentes formas clínicas da infecção, bem
como apresentar a capacidade de distinguir infecção ativa, da sorologia positiva
imunomediada pelos esquemas de imunização profilática, realizamos
adicionalmente a pesquisa detalhada do perfil de imunoglobulinas (IgG e
subclasses IgG1, IgG2) por citometria de fluxo.
Diferentemente dos estudos de IgG total, as análises de subclasses de IgG
na LVC apresentam ainda resultados controversos no que se refere ao papel
protetor de IgG1 e IgG2. Segundo DEPLAZES et al. (1995), cães assintomáticos
apresentam maiores níveis de IgG2 enquanto cães sintomáticos mostram maiores
níveis de IgG1. Entretanto, os autores admitem que os cães sintomáticos
apresentam tanto IgG1 como IgG2. Já para BOURDOISEAU et al. (1997) e REIS et
al. (2006) os níveis específicos de IgG1 são menores em cães sintomáticos. Para
REIS et al. (2006) existe uma possível associação dos níveis séricos de IgG1 com
mecanismos imunoprotetores da infecção canina, uma vez que observaram que
estão freqüentemente mais elevados em cães do grupo assintomático e que, com o
aparecimento dos sintomas, ocorre uma queda desses níveis. Por outro lado, os
níveis séricos de IgG2 parecem estar associados com a morbidade da LVC, com a
observação mais freqüente de títulos elevados nas formas mais graves da
infecção. De forma semelhante, NIETO et al. (1999), CAVALIERO et al. (1999)
sugerem que níveis elevados de IgG2 são observados em cães sintomáticos.
Acreditamos que as diferenças nas preparações antigênicas empregadas nos
testes sorológicos utilizados em cada um destes estudos seja um dos principais
fatores associados aos resultados controversos encontrados na literatura.
Independente de caracterizar o perfil das subclasses de IgG em cães vacinados, a
fim de conectá-lo a um possível papel protetor contra LVC, o objetivo de nosso
estudo foi utilizar do estudo do perfil de subclasses de IgG como um instrumento
de avaliar o estabelecimento de padrões de resposta imune humoral pós
vacinação.
Ao avaliarmos através citometria de fluxo a reatividade de IgG e das
subclasses IgG1 e IgG2 anti-formas promastigotas fixadas de L. chagasi, foi
observado que, ao logo da curva de titulação, soros de animais imunizados com a
LEISHVACIN apresentaram pico máximo de reatividade de IgG e IgG1 superiores
Discussão
156
que os animais imunizados com LEISHMUNE
®
, enquanto os animais imunizados
com a LEISHMUNE
®
apresentaram pico máximo de reatividade de IgG2 superior
aos animais imunizados com a LEISHVACIN. Análises complementares avaliando
a reatividade de amostras individuais confirmaram essa tendência, mostrando
maior freqüência de animais vacinados com LEISHVACIN
acima dos pontos de
corte estabelecidos para IgG total e IgG1. Por outro lado, maior freqüência de
animais vacinados com LEISHMUNE
®
foi observada acima dos pontos de corte
estabelecido para IgG2. Nossos resultados corroboram os dados relativos ao perfil
da imunidade humoral previamente descritos por FUJIWARA (2003) que observou
uma maior reatividade de IgG e IgG1 em animais vacinados com a com a
LEISHVACIN e os verificados por MENDES et al. (2003) que observaram uma
maior reatividade de IgG2 em animais vacinados com a com a LEISHMUNE
®
.
Numa análise complementar realizamos uma análise de correlação entre a
capacidade imunogênica da LEISHVACIN e da LEISHMUNE
®
, através da
avaliação paralela da resposta de IgG e do perfil de subclasses IgG1 e IgG2.
Nossos dados demonstraram que os animais vacinados com a LEISHVACIN
apresentavam uma correlação positiva entre a reatividade IgG tanto com a
reatividade de IgG1 quanto de IgG2. Por outro lado, os animais vacinados com a
LEISHMUNE
®
apresentavam a reatividade de IgG correlacionada
preferencialmente com a reatividade de IgG2. Esses dados em conjunto reforçam a
existência de reatividade imunológica diferencial entre os animais vacinados com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
, com um perfil misto e de caráter mais
complexo, em animais vacinados com a LEISHVACIN, reflexo da multiplicidade de
interações inerentes à composição antigênica da vacina. Mais uma vez, a
LEISHMUNE
®
apresentou um perfil mais seletivo, consistente com a natureza
purificada do antígeno vacinal. Como discutido anteriormente para a resposta
celular, pressupomos que o antígeno vacinal e o adjuvante apresentem papel
importante também na resposta humoral; acreditamos que o antígeno bruto da
LEISHVACIN tenha maior capacidade imunogênica sendo capaz de proporcionar
um estimulo policlonal em linfócitos B. Já o antígeno FML da LEISHMUNE
®
, por
ser um antígeno purificado, teria menor capacidade antigênica; também o
adjuvante BCG (da LEISHVACIN) induza uma resposta mais acentuada do Tipo 2,
o que poderia favorecer a reposta humoral, ao contrário a indução maior de
Discussão
157
resposta do Tipo 1 pela saponina na LEISHMUNE
®
favoreceria uma menor
resposta humoral.
Sabendo da estreita relação existente entre e o perfil de citocinas e de
imunoglobulinas, avaliamos ainda a possibilidade de correlação entre o perfil da
resposta humoral e o perfil de citocinas produzidas pelas células dos animais
vacinados. Como tais parâmetros foram avaliados quase simultaneamente após a
vacinação, acreditamos no potencial da análise de correlação em revelar
informações adicionais com o intuito de fortalecer as análises realizadas nesse
estudo. Nossos resultados demonstraram que enquanto os animais vacinados com
a LEISHVACIN apresentaram uma correlação positiva entre os valores da
reatividade de IgG anti-Leishmania e o percentual de células IL-4
+
presentes nas
culturas estimuladas com antígeno de Leishmania, os animais vacinados com a
LEISHMUNE
®
apresentaram uma correlação negativa entre os valores da
reatividade de IgG anti-Leishmania e o percentual de células IL-4
+
observados nas
culturas estimuladas com antígeno de Leishmania. Estes dados sugerem que à
semelhança dos estudos já publicados em modelo experimental murino, em cães a
síntese de IL-4 parece favorecer o estabelecimento da resposta humoral e o
aumento na síntese de IgG.
Ao final dessa discussão cabe ressaltar, que no caso da LEISHMUNE
®
, o
perfil mais seletivo na cinética de populações celulares do sangue periférico, bem
como do padrão de citocinas, apresentam-se como uma característica mais
favorável para uma vacina anti-Leishmania, considerando as expectativas
consenso do padrão de resposta imune que apresentariam um papel protetor na
LVC, incluindo a ativação da imunidade celular, preferencialmente de linfócitos T
CD8
+
, a indução na síntese de IFN- e óxido nítrico, como menor envolvimento de
linfócitos B e ausência de soroconversão nos animais vacinados. Neste contexto,
embora a LEISHVACIN também contemple diversos dos requisitos da expectativa
de uma vacina anti-Leishmania, o fato deste imunobiológico também contar com o
envolvimento de linfócitos B, levando à produção de IL-4 e maior soroconversão
pós-vacinal, sugerindo seu potencial imunoprofilático anti-LVC, porém, alerta para
a necessidade de pequenos ajustes no protocolo vacinal a fim de minimizar tais
alterações imunológicas não desejadas. Uma possibilidade seria a substituição do
adjuvante BCG por outro capaz de minimizar o componente humoral induzido pela
LEISHVACIN. Estudos dessa natureza, empregando o adjuvante saponina, bem
Discussão
158
como outras perspectivas de adjuvantes como o uso da saliva de flebotomíneos
como auxiliar no direcionamento da resposta imune induzida pela LEISHVACIN
estão ora em andamento por nosso grupo de pesquisa, coordenados pelo Dr
Alexandre Barbosa Reis.
Em suma, os resultados obtidos neste estudo permitiram compreender de
forma mais detalhada os mecanismos imunológicos desencadeados pelo processo
de imunização de cães visando o controle do calazar. Embora, nosso estudo tenha
fornecido informações relevantes acerca do potencial imunogênico da
LEISHVACIN e da LEISHMUNE
®
, acreditamos na importância da continuidade
deste e de outros estudos, no sentido de elucidar informações importantes que
constituem ainda grandes lacunas no entendimento da resposta imune no contexto
da imunoprofilaxia da LVC. Assim, temos como perspectivas futuras a realização
de estudos que visem avaliar a reatividade imunológica de outras células
envolvidas na resposta imune, incluindo elementos da imunidade inata como os
neutrófilos, a fim de caracterizar seu perfil de citocinas, bem como atividade
fagocítica em animais vacinados. Além disso, a ampliação do painel de citocinas
avaliadas permitirá a identificação de novas de vias importantes no contexto da
imunoproteção da LVC. Ainda, a análise de outras classes de imunoglobulinas
(IgA, IgE e IgM) e o uso de diferentes protocolos de imunização, especialmente no
caso da LEISHVACIN, como mencionado anteriormente, poderiam contribuir na
elucidação das dúvidas, favorecendo o embasamento científico acerca da resposta
imune de cães vacinados contra a LVC.
EVIDÊNCIAS
e CONCLUSÃO
Evidências e Conclusão
160
As principais evidências que embasam nossa conclusão geral estão listadas
abaixo:
1. A intervenção vacinal é acompanhada por um perfil distinto de alterações
imunofenotípicas em células da imunidade inata, caracterizado por um
recrutamento precoce de neutrófilos e eosinófilos, com envolvimento tardio de
monócitos na LEISHVACIN e um recrutamento precoce e persistente de neutrófilos
e monócitos na LEISHMUNE
®
;
2. A intervenção vacinal está associada a uma participação seletiva de
envolvimento de células da imunidade adaptativa: a LEISHVACIN promove uma
resposta imune de perfil misto, associada ao envolvimento de Linfócitos T e
Linfócitos B. Já a LEISHMUNE
®
promove uma resposta imune de perfil seletivo,
associada ao envolvimento preferencial de Linfócitos T;
3. A intervenção vacinal é acompanhada por uma cinética distinta de alterações
imunofenotípicas em subpopulações de Linfócitos T, com envolvimento precoce em
Linfócitos T CD4
+
e tardio em Linfócitos T CD8
+
, na LEISHVACIN, e envolvimento
tardio em Linfócitos T CD4
+
e CD8
+
, na LEISHMUNE
®
;
4. A detecção de citocinas intracitoplasmáticas em Linfócitos, na cultura de CMSP,
demonstrou que a imunização com LEISHVACIN leva a um perfil misto de resposta
com um aumento tanto da síntese de IFN- quanto de IL-4, enquanto a imunização
com LEISHMUNE
®
leva a um perfil específico com aumento somente na síntese de
IFN- e, conseqüente aumento da razão Linfócito T IFN-
+
/ IL-4
+
;
5. Somente os animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram aumento na
produção de óxido nítrico expressa em M/monócitos, fato observado na cultura
controle e estimulada;
6. A RIFI demonstrou que todos os animais vacinados, tanto com a LEISHVACIN
quanto com a LEISHMUNE
®
, apresentaram títulos de anticorpos superiores ao
limiar de reatividade diagnóstica para LVC (1:40);
Evidências e Conclusão
161
7. A reatividade de IgG, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, avaliados através da
citometria de fluxo, não apresentou diferenças entre os animais imunizados com a
LEISHVACIN e LEISHMUNE
®
. Apesar de não ter havido diferença, animais
imunizados com LEISHVACIN apresentaram pico de reatividade de IgG e IgG1
superiores e os animais imunizados com a LEISHMUNE
®
apresentaram o pico de
reatividade de IgG2 superior;
8. As análises de correlação da reatividade das imunoglobulinas anti-Leishmania,
mostraram que o aumento da reatividade de IgG nos animais vacinados com a
LEISHVACIN está associado com o aumento da reatividade tanto de IgG1 quanto
de IgG2. Já o aumento de reatividade de IgG nos animais vacinados com a
LEISHMUNE
®
está associado preferencialmente com o aumento da reatividade de
IgG2;
9. Os animais vacinados com a LEISHVACIN apresentaram uma correlação
positiva entre o percentual de células CD8
+
IL-4
+
e a reatividade IgG anti-
Leishmania e os animais vacinados com LEISHMUNE
®
apresentaram uma
correlação negativa entre o percentual de células CD4
+
IL-4
+
e a reatividade IgG
anti-Leishmania.
As evidências supra citadas nos levam a concluir que o processo vacinal promove
o desenvolvimento de um perfil distinto de ativação do sistema imune, aonde a
LEISHVACIN conduz a um perfil misto de resposta imune (celular/humoral) e a
LEISHMUNE
®
conduz a um perfil de resposta imune seletivo (celular). Neste
contexto, ambos imunobiológicos promovem o envolvimento de mecanismos
imunológicos mediados por macrófagos e linfócitos T CD8
+
, os quais representam
potenciais mecanismos efetores leishmanicidas que poderiam participar de eventos
protetores na prevenção da LVC.
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ANEXO
Anexos
180
Anexo A - Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da
UFMG (CEUA/UFMG)
Livros Grátis
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