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II
FXYD2: UM ESTUDO DE SUAS INTERAÇÕES E EFEITOS
SOBRE AS ATPases TIPO P
Vanessa Faria Cortes
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Química Biológica do Instituto de
Bioquímica Medica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro como parte dos requisitos para obtenção do
titulo de Doutor em Ciências.
Orientadores: Prof. Carlos Frederico Leite Fontes (Orientador)
Dr. Marcelo Alves Ferreira (Co- Orientador)
Rio de Janeiro
Agosto de 2007
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Bioquímica Médica
III
FXYD2: UM ESTUDO DE SUAS INTERAÇÕES E EFEITOS
SOBRE AS ATPases TIPO P
Vanessa Faria Cortes
Prof. Carlos Frederico Leite Fontes (Orientador)
Dr. Marcelo Alves Ferreira (Co- Orientador)
Tese de Doutorado apresentada ao programa de pós-graduação em Química Biológica do
Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências (Química Biológica).
Aprovada por:
___________________________________________
Prof
a
. Maria Lucia Bianconi
___________________________________________
Prof
o
. Antonio Ferreira Pereira
___________________________________________
Prof
o
. Mauro Sola-Penna
___________________________________________
Prof
o
. Mário Alberto Cardoso da Silva Neto (Revisor / Suplente interno)
___________________________________________
Prof
o
. Celso Caruso Neves (Suplente externo)
___________________________________________
Dr. Marcelo Alves Ferreira (Co-orientador)
___________________________________________
Prof
o
. Carlos Frederico Leite Fontes (Orientador)
Rio de Janeiro
IV
Agosto de 2007
FICHA CATALOGRÁFICA
CORTES, Vanessa Faria
FXYD2: Um estudo de suas interações e efeitos sobre as ATPases Tipo P. Rio de
Janeiro, UFRJ, IBqM, 2007, xiii, 131 fls.
Tese: Doutor em Química Biológica
1. Na
+
,K
+
-ATPase 2. FXYD2
2. SERCA 4. Proteína cinase
5. PMCA 6. Família FXYD
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro
II. Título
V
A presente tese foi realizada no laboratório de estrutura e regulação de P-
ATPases e no laboratório de membranas transportadoras do Instituto de Bioquímica
Medica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob orientação do Professor
Carlos Frederico Leite Fontes e co-orientador Marcelo Alves Ferreira, e contou
com o apoio das seguintes entidades: Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientifico e Tecnológico (CNPq).
VI
AGRADECIMENTOS
Esta é resultado de um trabalho que teve inicio a 10 anos, quando o Dr. Marcelo Alves, na época
aluno de Doutorado me aceitou como sua aluna de iniciação cientifica. Após a conclusão de seu
Doutorado, Marcelo foi para a Fiocruz e iniciei este trabalho com o Professor Carlos Frederico, uma
pessoa muito agradável e que me propôs um trabalho super interessante, pelo qual me apaixonei. Então,
juntos, começamos a investigar os possíveis mecanismo regulatórios do FXYD2 em diferentes ATPases
do tipo P. Então Marcelo e Fred, agradeço a vocês por terem me dado a oportunidade de mostrar o meu
potencial, e se esta tese existe, foi devido a grande contribuição de vocês.
Com o passar dos anos, muitas amizades foram feitas como: Adriana, Manu, Vanessa I, Cristiano,
Otacílio, Leandro, Mônica, Bernardo Dany, Lia, Jorge. E também os mais recentes no laboratório: Isabela
(minha aluna de IC), Ana Paula, Dudu, Mateus, Cris, Milene, Tiago, Juliana, Pablo (apesar de ser recente
no lab, já conheço a uns 20 anos – fala sério hein !).
Ah, você também Denise, pensou que eu fosse esquecer de ti. Obrigada por entrar na vida do meu
orientador e transformá-lo. Sejam Felizes... Sempre.
Agradeço também aos professores Hector, Helena e Júlio pelas conversas e sugestões que fizerem
para tornar este trabalho mais bonito. Deus, pois sem ele esta tese não seria possível.
A técnica Rosangela, por sempre me fazer companhia na hora do almoço, sabe que eu odeio
almoçar sozinha.
Aos meus Pais, não tenho nem palavras para agradecer - Amo vocês!!!
Minha irmã, minhas amigas (Vanessa, Carla, Kary), pois cada palavra, cada conversa a toa, me
estimularam a chegar até aqui. Amo muito vocês.
Agradeço também as minhas cunhadas (Rosangela e Lourdes), as minhas sobrinhas (Gra, Andréa,
Andressa), Tia Vitória, Nana e Bira, pessoas que me ajudaram bastante tomando conta do Vitinho para
que pudesse vir ao laboratório.
Agradeço também as meninas do salão pela motivação e ajuda com o Vitinho.
E, obviamente, neste ínterim apareceram vocês dois razões da minha vida. Obrigada, Carlos, meu
marido e Victor meu filho lindo. Amo vocês demais. Obrigada por fazerem parte da minha vida...
Deus, razão do meu viver, obrigada por esta tese e pelas amizades que fiz através dela.
VII
ABREVIAÇÕES
ATP Adenosina trifosfatada marcada com fósforo radiotivo
[
-
32
P] Fósforo marcado radiativamente
∆G
0
Variação de Energia de Ativação
AKAP Proteína Cinase A Ancorada
ATP Trifosfato de Adenosina
ATPase enzima que hidrolisa ATP
CaM Calmodulina
CHIF Proteína indutora da formação de canais
DAG Diacilglicerol
DMSO Dimetil sulfóxido
EDTA Ácido etileno-diamino tetracético
EGTA Ácido [etilenobis (oxietilenonitrila)]tetracético
FXYD2-np FXYD2 não fosforilado
FXYD2-PKA FXYD2 previamnete fosforilado por PKA
FXYD2-PKA/PKC FXYD2 previamente fosforilado por PKA e PKC
FXYD2-PKC FXYD2 previamnete fosforilado por PKC
IOVs vesículas inside-out
Kd Constante de dissociação
K
m
Constante de Michales-Menten- concentração de substrato para qual
é atingida a metade da velocidade máxima enzimática.
MAT-8 Antígeno 8 de tumor mamário
OBPF Fator Promotor da Ligação de Ouabaína
VIII
OLF Fator Homólogo a Ouabaína
Pi Fósforo
PKA Proteína Kinase AMPc dependente
PKC Proteína Kinase dependente Ca
2+
PKCam Proteína Kinase Cálcio-Calmodulina depedente
PKD Proteína kinase D
PLB Fosfolambam
PLM Fosfolemmam
PLMS Fosfolemmam – like
PMCA Ca
2+
-ATPase de Membrana Plasmática
PS Fosfatidilserina
RIC Proteína indutora de canal iônico
RIC Proteína relacionada ao canal iônico
RNM Ressonância Nuclear Magnética
ROS Espécies reativas de oxigênio
SDS Dodecil sulfato de sódio
SERCA Ca
2+
-ATPase de Retículo Endoplasmático
SLN Sarcolipina
V
max
Velocidade máxima de uma reação enzimática
IX
ÍNDICE
1- INTRODUÇÃO
1
1.1- A Na
+
,K
+
-ATPase 2
1.1.1- A Na
+
,K
+
-ATPase e suas subunidades 3
1.1.2- Ciclo catalítico da Na
+
, K
+
-ATPase 10
1.1.3- A síntese de ATP e a fosforilação por Pi: mecanismos de reversão da bomba 13
1.1.4- A ouabaína 14
1.2- A famlia P-ATPase 17
1.3- A Ca
2+-
ATPase de membrana plasmática (PMCA) 19
1..4- Ca
2+
-ATPase de Reticulo sarcoendoplasmático (SERCA) 24
1.5- A família FXYD 27
1.5.1- FXYD1 31
1.5.2- FXYD3 33
1.5.3- FXYD4 33
1.5.4- FXYD5 34
1.5.5- FXYD6 35
1.5.6- FXYD7 36
1.5.7- FXYD10 36
1.6- Fosfolamban e Sarcolipina 37
1.7 O FXYD2 40
1.8- Regulação da Na
+
,K
+
-ATPase e da PMCA por fosforilação- Papel das proteínas cinases 45
2- OBJETIVOS
53
3- MATERIAL E MÉTODOS
55
3.1- Purificação da Na
+
,K
+
-ATPase 56
3.2- Preparação do ghost 56
3.3- Extração do FXYD2 57
3.4- Síntese do [
32
P] ATP
57
3.5- Analise por gel de poiliacrilamida SDS-PAGE das proteínas fosforiladas por cinases 57
3.6- Método para isolar o FXYD2 fosforilado por cinase 58
3.7- Análise do FXYD2 fosforilado através de western-blot 59
3.8- Determinação de atividade ATPásica 59
3.9- Preparação das Vesículas Inside-Out (IOVs) 60
3.10- Captação de cálcio 60
3.11- Análise da ligação do FXYD2 através de microcalorimetria por titulação isotérmica 61
3.12- Reagentes utilizados 61
4- RESULTADOS
62
4.1- Influência do FXYD2 na afinidade por ATP e na V
max
da Na
+
,K
+
-ATPase 63
4.2- Fosforilação do FXYD2 por subunidade catalítica de PKC na presença e na ausência de
sódio
66
4.3- Análise através de western-blot do FXYD2 fosforilado 68
4.4- Efeito do FXYD2 Sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal de porco 70
4.5- Efeito do FXYD2 na atividade da Na
+
,K
+
-ATPase de eritrócito de porco 72
4.6- Efeito do FXYD2 sobre a PMCA de eritrócito de porco 74
4.7- Captação de Ca
2+
pela PMCA na presença do FXYD2 76
4.8- Efeito do FXYD2 sobre a SERCA 78
4.9- Análise da ligação do FXYD2 a enzima nativa através de ITC 81
5- DISCUSSÃO
83
6- CONCLUSÕES
96
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
99
8- ANEXOS
117
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1- Modelo tridimensional suposto da estrutura topológica da Na
+
,K
+
-ATPase
4
Figura 2- Esquema da regulação da Na
+
,K
+
-ATPase por diversos fatores
9
Figura 3- Ciclo de Reações da Na
+
,K
+
-ATPase
11
Figura 4- - Estrutura química da Ouabaína e sitio de interação proposto com a Na
+
,K
+
-
ATPase
15
Figura 5- Ciclo Geral de reações das ATPases do tipo P
18
Figura 6: Estrutura secundária da Ca
2+-
ATPase de membrana plasmática
21
Figura 7- Cristal da estrutura da SERCA 1a
26
Figura 8- Representação da estrutura da calmodulina com os 4 sítios de ligação para cálcio
22
Figura 9- Alinhamento da seqüência das proteínas que compõem a Família FXYD
29
Figura 10- Principais características estruturais e funcionais das proteínas FXYD
30
Figura 11- Suposto papel fisiológico do FXYD1 (PLM) no músculo cardíaco e esquelético
32
Figura 12- Semelhanças estruturais entre o fosfolamban e a sarcolipina
37
Figura 13- Sítio de ligação da SERCA para o Fosfolamban
39
Figura 14- Distribuição tecido específica do FXYD2
41
Figura 15- Western-Blot anti-FXYD2
43
Figura 16: Cascata de sinalização das Proteínas Cinases
46
Figura 17- Influência do FXYD2 na afinidade por substrato e na V
max
da Na
+
,K
+
-ATPase
64
Figura 18- Fosforilação do FXYD2 por PKC comercial na presença e na ausência de sódio
67
Figura 19- Análise através de Western Blot com anticorpo anti-fosfoserina e anti-
fosfotreonina
69
Figura 20- Efeito do FXYD2 fosforilado por cinases endógenas na Atividade Na
+
,K
+
-
ATPásica de medula renal de porco
71
Figura 21- Efeito do FXYD2 fosforilado por cinases endógenas na Na
+
,K
+
-ATPase de
eritrócito
73
Figura 22- Efeito do FXYD2 fosforilado por cinases endógenas na Atividade Ca
2+
-ATPásica
de eritrócito de porco
75
Figura 23- Efeito do FXYD2 na captação de Ca2
+
pela PMCA de eritrócitos de porco
77
Figura 24- Efeito do FXYD2 na Serca de músculo esquelético
79
Figura 25- Efeito do FXYD2 na Atividade da SERCA de cérebro
80
Figura 26- Ligação do FXYD2 na Na
+
,K
+
-ATPase - Medida através de ensaio calorimétrico
pelo ITC
82
Figura 27- Alinhamento do FXYD2 de diferentes espécies
87
XI
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1- Os componentes da família FXYD 27
Tabela 2- Órgãos e tecidos que expressam o RNAm e as proteínas da Família FXYD 28
Tabela 3- Resumo das diferentes isoformas de PKC, distribuição tecidual e seus respectivos
ativadores.
47
Tabela 4- Efeito da adição de FXYD2 nos parâmetros cinéticos para hidrólise de ATP pela
Na
+
, K
+
-ATPase
65
XII
RESUMO
FXYD2: UM ESTUDO DE SUAS INTERAÇÕES E EFEITOS SOBRE AS ATPases TIPO
P
Vanessa Faria Cortes
Prof. Carlos Frederico Leite Fontes (Orientador)
Dr. Marcelo Alves Ferreira (Co- Orientador)
Resumo da tese de Doutorado submetida ao programa de pós-graduação em
Química Biológica do Instituo de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários a obtenção do titulo de doutor em
Ciências (Química Biológica)
A Na
+
,K
+
-ATPase é uma ATPase do tipo P que pode apresentar 3 subunidades (alfa, beta
e gama). A subunidade gama (FXYD2) é um membro da família FXYD, e pode ser isolado da
Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal de porco através de um tratamento com metanol-cloroformio
(1:1).
Nós demonstramos previamente que o FXYD2 pode ser fosforilado por PKA, e nesta tese
fosforilamos este peptídeo por PKC, mostrando a interferência desta fosforilação para a atividade
da Na
+
,K
+
-ATPase e da Ca
2+
-ATPase.
Para obter um FXYD2 fosforilado, primeiramente fosforilamos a enzima nativa por PKA
ou PKC, e então submetemos à enzima a extração com (Metanol:clorofórmio). FXYD2-np (não-
fosforilado) foi capaz de aumentar a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase purificada em 2 vezes, no
entanto quando este é fosforilado por PKA e/ou PKC (FXYD2-PKA/PKC) o incremento é de 4
vezes. Em eritrócitos, a adição de FXYD2 fosforilado por PKA (FXYD2-PKA) ocasionou um
aumento de 80% da atividade Na
+
,K
+
-ATPase, enquanto o FXYD2-np, ou FXYD2-PKA/PKC ou
apenas FXYD2 fosforilado por PKC (FXYD2-PKC), apresentou um aumento em torno de 60%.
Em relação a Ca
2+-
ATPase, a adição de FXYD2-np não tem efeito na atividade basal, no entanto
quando adicionamos FXYD2-PKA/PKC ocorre um aumento de 2 vezes na atividade ATPásica. A
atividade da PMCA na presença de calmodulina e incubada com FXYD2-np apresenta um
aumento de 3 vezes. No entanto quando adicionamos o FXYD2-PKA ocorre uma inibição de
50% da atividade enzimática. A captação de cálcio corrobora os resultados da medida de
atividade.
Em ensaios calorimétricos (análise através de ITC) mostramos que o FXYD2 tem sua
interação com a Na
+
,K
+
-ATPase facilitada na presença de sódio (120 mM), o que não ocorre na
presença de potássio (30 mM). Este resultado sugere que o FXYD2 tem uma maior afinidade pela
conformação E1 da enzima.
Nossos resultados com o FXYD2-PKA/PKC sugerem que este peptídeo poderia ser um
regulador especifico da Na
+
,K
+
-ATPase durante seu ciclo catalítico. Em adição, o fato do FXYD2
interagir com outras P-ATPases sugere que o sítio de interação dos proteolipídios da família
FXYD seria conservado entre as P-ATPases, regulando-as de maneira individual. Os resultados
da captação de cálcio da PMCA podem explicar o aumento e a inibição da atividade observada na
presença do FXYD2-np e FXYD2-PKA, respectivamente.
XIII
ABSTRACT
Na
+
,K
+
-ATPase is a P-ATPase composed by two main subunits (alpha, beta) and an
accessory third subunit (gamma). The gamma subunit is a FXYD protein (FXYD2) and can be
isolated from Na
+
,K
+
-ATPase of pig kidney medulla by a chloroform-methanol (1:1) extraction.
We have demonstrated previously that gamma subunit can be phosphorylated by PKA and
now we show that gamma can also be phosphorylated by PKC, increasing Na
+
,K
+
-ATPase and
Ca
2+
-ATPase activities.
To obtain a purified phosphorylated FXYD2, purified Na
+
,K
+
-ATPase was first
phosphorylated by PKA and/or PKC and then submitted to CM extraction. Non-phosphorylated
FXYD2 (np-FXYD2) increases purified Na
+
,K
+
-ATPase by 2-fold, and when the FXYD2 is
phosphorylated by PKA and PKC (PKA/PKC-FXYD2) or phosphorylated by PKA (PKA-
FXYD2) or phosphorylated by PKC (PKC-FXYD2) the increases goes up to 4-fold. In pig
erythrocytes, the addition of PKA-FXYD2, PKC-FXYD2 and np-FXYD2 increased Na
+
,K
+
-
ATPase activity by 80, 60, 55%, respectively. The addition of np-FXYD2 had no effect on the
PMCA basal activity, but PKA-FXYD2 and PKC-FXYD2 increased this activity in up to 200%.
PMCA activity was increased by calmodulin in the presence of np-FXYD2 (3-fold) Moreover,
PKA-FXYD2 in the presence of calmodulin decreased to 50% the ATPase activity.
The Ca
2+
uptake of PMCA is doubled by a pretreatment of this enzyme with np-FXYD2,
and pretreatment with the PKA-FXYD2 caused a reduction of 50% of the Ca
2+
uptake.
We also show, with calorimetric assays (ITC) that in the presence of sodium (120 mM)
the binding of FXYD2 on Na
+
,K
+
-ATPase is increased. In a medium with high potassium (30
mM) and no sodium this binding is slower.
Our results with PKA and PKC phosphorylation of gamma subunit suggest that
Phosphorylation might be a specific regulatory event of the catalytic cycle of Na
+
,K
+
-ATPase. In
addition, FXYD2 interacts with other P-ATPases, suggesting that the anchoring for FXYD2
could be conserved within the P-ATPase family and possible interactions between FXYD
proteins and this conserved site can cross regulate different P-ATPases. The effect of the FXYD2
on calcium uptake could explain the activation of PMCA, suggesting this proteolipid does not
uncouple this enzyme.
2
1.1- A Na
+
,K
+
-ATPase
A Na
+
,K
+
-ATPase desde a sua descoberta por J.C. Skou em 1957, tem sido amplamente
estudada. Atualmente é conhecido que esta enzima desempenha participação fundamental em
inúmeros processos fisiológicos celulares vitais, principalmente em relação à manutenção da
homeostase.
Também conhecida por "Bomba de Na
+
e K
+
", esta enzima regula as concentrações
citoplasmáticas de Na
+
e K
+
, utilizando a energia proveniente do metabolismo para subsidiar o
antiporte destes íons contra gradientes de concentração desfavoráveis. O transporte ativo destes
cátions é possível a partir da hidrólise de uma molécula de ATP com estequiometria de 3:2:1
(Na
+
:K
+
:ATP) (Glynn, 1993). A Na
+
,K
+
-ATPase é uma proteína integral de membrana
plasmática, largamente difundida e encontrada em plantas superiores, artrópodes, moluscos, e
vertebrados sem grandes diferenças estruturais em sua seqüência primária (Bonting, 1970).
Atribui-se a esta enzima um grande número de funções cuja importância fisiológica é
indiscutível; muitos autores enfatizam esta característica, cunhando esta enzima como uma
“governanta” celular. Entre estas funções podemos listar: manutenção do potencial de repouso
em membranas biológicas; fornecimento da energia necessária ao potencial de ação de células
excitáveis; transporte secundário de sais em tecidos onde este transporte é intenso, como na alça
de Henle, brânquias de peixes ou glândulas de sal nas aves marinhas; transporte de água nos
túbulos renais proximais, peles de anfíbios, bexigas de peixes; manutenção de um meio
intracelular rico em K
+
, indispensável para a atividade plena de diversas enzimas intracelulares;
geração do gradiente eletroquímico que é utilizado pelas células para acoplar o transporte de
substâncias vitais como: hexoses, aminoácidos, íons Cl
-
e Ca
2+
ou íons H
+
e, por fim, geração de
calor, já que a bomba responde por 20% de toda a taxa metabólica basal nos mamíferos (Albers,
3
1975; Robinson & Flashner, 1979; Glynn, 1985). No rim, esta enzima desempenha um papel
primário na reabsorção de Na
+
e água. Então, esta enzima é essencial para a manutenção do
fluido corporal e homeostase eletrolítica (Jorgensen, 1990).
1.1.1- A Na
+
,K
+
-ATPase e suas subunidades
A Na
+
,K
+
-ATPase é um oligômero composto estequiometricamente por dois
polipeptídeos. Um peptídeo maior (
) com o peso molecular estimado em torno de 100 - 110
kDa , um glicopeptídeo (
) com peso molecular em torno de 50 kDa, e no caso do rim uma
terceira subunidade (γ) em torno de 10 KDa, como podemos observar na figura 1. Peters e cols
(1981) demonstraram uma estequiometria de 1:1 entre as subunidades
e
. No tecido renal, está
atualmente bem caracterizada a presença de uma terceira subunidade (
), de baixo peso molecular
aparente, resistente a proteólise e capaz de interagir com derivados fotoativados da ouabaína
(Forbush, 1978; Mercer, 1993).
Até o momento são descritas 4 isoformas de
(
1,
2,
3 e
4) e 3 isoformas de
(
1,
2
e
3) que exibem 85 e 45 % de identidade de suas seqüências, respectivamente, e que mostram
uma distribuição tecido específica, sendo a isoforma
1 amplamente distribuída.
4
Figura 1- Modelo tridimensional suposto da estrutura topológica da Na
+
,K
+
-ATPase. A figura representa os 10 segmentos
transmembrana da subunidade
(representado em verde) e subunidade com um segmento transmembrana (representada em
vermelho), e a subunidade
(FXYD2) com um único segmento transmembrana (representada em azul).
Resíduos que ligam ouabaína
Resíduos que ligam cátion
Sítio de fosforilação
5
Evidencias bioquímicas e estudos de transfecção sugerem que as isoformas
e
podem
se arranjar em diferentes combinações, em formas potencialmente funcionais. A isoforma
1,
por ser amplamente distribuída, pode assumir uma função de manutenção em todas as células.
Em ratos adultos a isoforma
2 é expressa predominantemente em cérebro, músculo esquelético
e coração, enquanto
3 é expressa somente no cérebro. Comparando as diferentes isoformas,
3
é a que possui uma menor afinidade por Na
+
, e pode se tornar ativa apenas após um aumento dos
níveis intracelulares deste íon. De modo similar a
1, a isoforma 1 é largamente expressa. Em
rato a isoforma
2 é expressa em músculo e cérebro, onde parece ter um papel complementar na
adesão de moléculas. A isoforma
3 tem sua expressão mais abundante em testículos e está
presente em níveis mais baixos em cérebro, rim, baço, pulmão, estomago, cólon e fígado, não
sendo detectada no coração (Malik, 1996). Alguns autores relatam que as isoformas de
podem
influenciar diferentemente as propriedades enzimáticas e de transporte das isoenzimas de Na
+
,K
+
-
ATPase, mas os efeitos são menos pronunciados comparando com os das isoformas de
.
(Blanco & Mercer, 1998; Schmalzing & cols, 1997;Mobasheri, 2000; Gloor & cols, 1990).
Através de dados obtidos a partir da análise de espalhamento de nêutrons e inativação por
bombardeio radioativo foi mostrado que o peso molecular obtido para o conjunto funcional da
Na
+
,K
+
-ATPase purificada de rim de porco atingia valores entre 381 - 420 kDa (Paschence e
cols., 1983). Este fato sugere que, na maioria dos tecidos, a enzima se organiza como um
heterodímero (
2
2
) funcional após a sua montagem na membrana plasmática.
Os eventos catalíticos e os sítios de ligação de substrato, de cátions, de ouabaína, são
atribuídos à subunidade
. Modelos recentes da topologia desta subunidade pressupõem a
existência de 10 segmentos transmembranares (H1-H10), que exibem cinco ligações na forma de
hélices extracelulares (“loops”) (Lingrel e Kuntzweiller, 1994). A afinidade por glicosídeos
6
cardíacos, por exemplo, a ouabaína, é determinada pela porção extracelular da subunidade
em
sua, mais precisamente nos segmentos H5-H6 (Shamraj e cols, 1993 e Palasis, 1996). Nesta
subunidade encontram-se ainda os sítios de ligação para ATP, ADP ou Mg-ATP, sendo os
resíduos Arg
544
, do segmento Arg
544
_ Asp
567
os mais relevantes para afinidade (Jacobsen,
2002). A Asp
369
também é parte do sítio de ligação e fosforilação catalítica pelo ATP e é o
resíduo que forma um aspartil-fosfato durante o ciclo catalítico da Na
+
,K
+
-ATPase (Lingrel e
Kuntzweiler, 1994).
O resíduo intracelular Glu
781
da subunidade
tem sido postulado como de suma
importância para ligação e/ou oclusão de cátions. Em experimentos de mutações sítio dirigidas na
Na
+
K
+
-ATPase, onde o Glu
781
foi substituído por aspartato, lisina, ou alanina, todos os mutantes
mostraram um aumento da afinidade aparente por ATP, comparado à enzima nativa. Os mutantes
Glu
781
– Asp e Glu
781
– Ala apresentaram uma redução na afinidade aparente por K
+
. Os mutantes
Glu
781
– Asp e Glu
781
– Ala mostraram uma redução na afinidade aparente por Na
+
, enquanto no
mutante Glu
781
- Lys observou-se um pequeno aumento na afinidade por este cátion (Koster e
cols., 1996). As isoformas de
são codificadas por genes separados e exibem uma expressão
tecido específica (Lingrel e cols, 1990).
Muitas indagações sobre o verdadeiro papel e funcionamento da subunidade
permanecem obscuras, e ainda não se sabe muita coisa sobre o seu real papel na atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase. Contudo, trabalhos sugerem que ela é de suma importância no ajuste
conformacional do complexo entre
e
em relação à sua posição na membrana após a expressão
(Guereing, 1991). Hamrick
e cols, (1993) mostraram que mutantes da subunidade- sem a porção
citoplasmática eram capazes de se associar plenamente com a subunidade catalítica.
7
Quimeras contendo porções transmembranares da subunidade
de outras ATPases (H
+
-
ATPase) de membrana, fusionadas com um segmento extracelular de 100 aminoácidos adjacente
ao domínio transmembrana original da subunidade-
, também eram capazes de associação e de
geração de dímeros da Na
+
,K
+
-ATPase funcionais. Estes dados sugerem que esta porção
extracelular é aparentemente decisiva para a associação com a subunidade-
. Soma-se a estes
dados que os domínios H7 e H8 da subunidade
estão envolvidos na interação com a subunidade
no espaço extracelular, e os resíduos compreendidos entre Asn
894
– Ala
919
do domínio
extracelular são suficientes para que esta interação ocorra (Lemas e cols., 1994). Sabe-se que a
subunidade-
é imprescindível para a atividade da enzima (Chow & Forte, 1995). Foi mostrado
que os 34 últimos aminoácidos da subunidade
, que se encontram no domínio citoplasmático,
quando truncados induzem um decréscimo significativo da afinidade aparente por K
+
extracelular, sendo proposto que a porção N-terminal não estaria diretamente envolvida com o
efeito observado, e sim o truncamento dos aminoácidos que perturbam o ectodomínio e/ou o
domínio transmembrana desta subunidade (Guerring e cols., 1996 e Hasler e cols., 1998). A
interação da subunidade
com a subunidade é relativamente forte, permanecendo estável após
tratamento com diversos detergentes não iônicos (Horisberger e cols., 1991). A subunidade
é
altamente glicosilada em sua porção extracelular e existem variações significantes no número de
sítios de glicosilação entre as diferentes isoformas de subunidade
. A isoforma
1 possui três
sítios de glicosilação e todos os três sítios consensuais são glicosilados. A isoforma
2 de galinha
possui quatro sítios potenciais de glicosilação, enquanto a de rato possui oito sítios potencias de
glicosilação (Tamkum e Frambrough., 1986; Miller e Farley., 1988; Treuheit e cols., 1993).
Todas essas variações de glicosilações sugerem que os carboidratos não são essenciais para o
transporte primário. Experimentos com Na
+
K
+
-ATPase sem as glicosilações ou incompletas
8
mantinham sua capacidade de hidrolisar ATP e ligar ouabaína, entretanto, eram mais sensíveis à
tripsinização, sugerindo que a glicosilação pode desempenhar um papel no processamento da
proteína (Zamofing e cols., 1986 e Schmalzing e cols., 1992).
Em suma, 4 isoformas de α e 3 isoformas de β são descritas até o momento. Entretanto,
outras isoformas podem existir. Muitas pesquisas têm mostrado a existência de outras isoformas
de β. Estudos moleculares com a Na
+
,K
+
-ATPase de peixe sugerem a existência de 7 ou mais
isoformas de subunidade β (Mobasheri e cols, 2000).
A expressão das múltiplas isoformas de Na
+
,K
+
-ATPase, que exibem diferentes afinidades
por Na
+
, pode ser fisiologicamente importante para o controle da concentração intracelular deste
íon. Vale Lembrar que o nível de Na
+
intracelular tem efeitos em diversas funções celulares,
como a regulação do Ca
2+
intracelular. Pequenos aumentos na concentração de Na
+
intracelular
favorecem o seqüestro de Ca
2+
dos estoques intracelulares, e o aumento da concentração de Ca
2+
é
um importante regulador da contração do músculo cardíaco e esquelético e também da
excitabilidade das células neuronais. (Blaustein, 1993)
Vale ressaltar que diversos mecanismos regulam a expressão e função da Na
+
,K
+
-ATPase.
A figura 2 representa alguns fatores que de alguma forma regulam esta enzima.
9
Figura 2- Esquema da regulação da Na
+
,K
+
-ATPase por diversos fatores. Alguns hormônios
e neurotransmissores estimulam PKA e PKC provocando uma fosforilação da subunidade a da
Na
+
,K
+
-ATPase, que afeta as propriedades de transporte e ou redistribuição através da membrana
ou estoques intracelulares. A figura também representa a subunidade B e proteínas FXYD, que
podem participar da regulação desta ATPase. Figura adaptada de Crambert G e Geering K
(2003)
Sci. STKE 166: 1-9.
10
1.1.2- Ciclo catalítico da Na
+
, K
+
-ATPase
Dentre os muitos esquemas de reação propostos para a Na
+
,K
+
-ATPase, um dos mais
aceitos é o mecanismo de Post-Albers (Post e cols., 1965), que preconiza a existência de pelo
menos duas conformações da enzima que acoplariam a fosforilação por ATP ao transporte de
íons. Post
e cols.., 1972 propuseram a existência de duas isoformas principais (E
1
e E
2
) que se
reciclariam em eventos químicos que envolvem a oclusão e o transporte de Na
+
e K
+
, a hidrólise
de ATP e a fosforilação da enzima em um resíduo
-aspartil de seu centro ativo. Sabe-se
atualmente que o domínio de fosforilação fica situado na porção citoplasmatica da enzima, no
aminoácido Asp-369 (Ellis-Davis e Kaplan, 1990) e que este resíduo é o sítio comum para a
fosforilação da Na
+
,K
+
-ATPase por Pi e por ATP (Schuurmans-Stekhoven e cols., 1980).
Jorgensen
e cols., 1988 faz uma adaptação do ciclo catalítico proposto por Post e Albers
(figura 3) e descreve que o passo inicial do ciclo de reação é a ligação de ATP com afinidade
aparente baixa em E2(K
+
), acelerando a velocidade de deoclusão deste íon e acelerando a
transição de E2 para E1 nesta enzima (passos 9, 10 e 11). O passo 14 (transição de E2 para E1 na
ausencia de ATP) normalmente é o passo limitante deste ciclo de reações. As medidas de
deoclusão de íons são realizadas pelo uso de Rb
86
que é um congênere do íon K
+
, uma vez que a
meia vida do K
+
radioativo é extremamente baixa (Glynn e Richards, 1982). Estes autores,
demonstraram que a velocidade de saída de
86
Rb da enzima com Rb
+
ocluído não era alterada
pela adição de Na
+
ou K
+
, mas era acelerada pela adição de ATP (passo 11). O ATP é ligado com
alta afinidade na conformação E
1
(Kd ~ 0.1 - 0.2 µM) e o aumento da energia de ligação do ATP
é associado com a transição E
2
(2K
+
) - E
1
.2K
+
é que constitui a força para direcionar o transporte
de K
+
através da membrana. O próximo passo de transdução de energia é a tranferência
dependente da ligação de Na
+
na forma E1 (passo 1), entre o -fosfato do ATP para
11
Figura 3- Ciclo de Reações da Na
+
,K
+
-ATPase proposto por Jorgensen e colaboradores
(1988).
A figura mostra as etapas do ciclo evidenciando a entrada e saída dos íons, bem como as
duas conformações principais da enzima (E1 e E2
sítios de ligação de cátions voltados para
o interior, alta afinidade por Na
+
.
11
2K
int
12
3Na
int
E
1
K
2
.ATP E
1
.ATP E
1
Na
3
.ATP
16
ATP
ATP
2
E
1
K
2
15
E
1
1
E
1
Na
3
3
10
2K
int
3Na
int
17
sïtios para E
2
(K
2
).ATP
14
E
1
P.ADP.(Na
3
)
cátions ocluídos
9
(
lento)
ADP
4
ATP
E
2
(K
2
) E
2
E
1
P(Na
3
)
(lento)
Pi
8
Pi
13
5
E
2
P.K
2
E
2
P E
2
P.Na
3
7
2K
ext
6
3Na
ext
sítios de ligação de cátions voltados para
o exterior, alta afinidade por K
+
12
o grupamento acil do Asp
369
da subunidade
e isomerização e a oclusão das fosfoformas (E
1
P (3
Na
+
) - E2P (2 Na
+
), de forma acoplada a reorientação dos sítios de cátions e liberação sequencial
dos íons Na
+
no meio extracelular (passos 2,3,4 e 5) (Jorgensen e cols., 1998; Lauger e cols.,
1991 e Lutsenko e cols., 1995). Neste contexto, foi mostrado que durante o transporte, os 3 íons
Na
+
são liberados em duas etapas: primeiro um íon Na
+
é liberado (formando subsequentemente
E
*
-P que apresenta dois íons Na
+
ligados), e somente após a bomba desliga os outros dois (Glynn
& Karlish, 1990). A fosforilação por ATP é dependente de Mg
2+
(Blostein e cols., 1979) sendo
que alguns outros cátions divalentes como Mn
2+
,
Ca
2+
, Fe
2+
entre outros, podem substituir o Mg
2+
para ativação da fosforilação, mas são incapazes de suportar a hidrólise de ATP e o ciclo normal
da bomba (Fukushima e Post, 1978; Siegel, 1979; Askari e Huang, 1981). Durante o movimento
transmembrana, a interconversão é acompanhada pela liberação da molécula de ADP e perda da
afinidade pelo Na
+
(passo 5), que precede a liberação de 3 íons Na
+
para fora da célula (passo 6).
O K
+
ao se ligar em alta afinidade a E
2
-P (passo 7), acelera a hidrólise desta fosfoenzima (passo
8), gerando novamente a forma de enzima que mantém os íons K
+
ocluídos (Hobbs e cols..,
1979). A forma E
2
da Na
+
,K
+
-ATPase é capaz de ocluir íons
86
Rb, em substituição aos íons K
+
(passo 8). Forbush, (1988) demonstrou que 2 íons K
+
seriam então ocluídos durante o ciclo de
reação da Na
+
,K
+
-ATPase, fato que concorda com uma estequiometria assimétrica na troca de 3
Na
+
por 2 K
+
a cada molécula de ATP hidrolisada, inicialmente proposta por Yamaguchi &
Tonomura (1979) e posteriormente determinada em medidas dos fluxos de Na
+
e K
+
mediados
pela bomba.
13
1.1.4- A síntese de ATP e a fosforilação por Pi, mecanismos de reversão da bomba
A síntese de ATP através da Na
+
,K
+
-ATPase só é possível porque alguns passos do ciclo
normal de hidrólise podem ser revertidos sob condições específicas, como altas concentrações de
ADP (mM) e Na
+
(acima de 200 mM). Estes passos, de acordo com a fig. 12, seriam os passos
13, 8, 7, 6, 5, 4, 3 e 2 do ciclo apresentado. Seguindo esta ordem, os eventos que conduzem à
síntese de ATP iniciam-se com a fosforilação da enzima por Pi em baixa afinidade. Esta
fosforilação apresenta um estágio de saturação relacionado a formação de um complexo enzima-
Pi (interação fraca) que é anterior a formação do intermediário fosforilado propriamente dito,
onde uma molécula de água é liberada.
E + Pi <------------> E
Pi <---------------> E-P + HOH
A fosfoenzima resultante é formada espontaneamente e não é capaz de sintetizar ATP
devido à considerável diferença que existe entre o
G de hidrólise do acil-fosfato e o
G de
hidrólise do resíduo pirofosfato do ATP nessas condições, caracterizando uma fosfoenzima
chamada de “baixa energia”. Quando o Na
+
e o ADP são adicionados, a ligação de Na
+
em baixa
afinidade a E
2
-P, provoca uma mudança de conformação para outra forma de fosfoenzima
chamada E
1
(Na)-P. Esta mudança é acompanhada de um aumento no
G de hidrólise do acil-
fosfato até um valor próximo do que é encontrado para o
-ATP. Isto permite a transferência do
grupo fosfato da fosfoenzima para o ADP, caracterizando um intermediário fosforilado definido
como de “alta energia” (De Moraes & de Meis, 1987; de Meis, 1989).
Como as reações do ciclo são reversíveis, conforme descrito acima, a forma E
2
pode ser
fosforilada por Pi em solução aquosa (desde que submetida a altas concentrações de Pi e Mg
2+
e
ausência de ATP, Na
+
ou K
+
). Esta fosforilação por Pi (reversão dos passos 7 e 8) é prontamente
inibida pela adição de Na
+
e foi muito estudada na presença de ouabaína porque o glicosídeo
14
aumenta o nível de fosforilação por Pi em meio aquoso (Albers e cols., 1968; Siegel e cols.,
1969). A fosforilação da enzima por Pi pode ocorrer na ausência de ouabaína, mas torna-se difícil
detectá-la porque a afinidade da enzima por Pi em água é baixa (na faixa mM), entretanto, essa
afinidade pode ser aumentada na presença de Mg
2+
na faixa mM (podendo chegar até um valor de
K
m
de 60-70 µM), (Taniguchi e Post, 1975; Kuriki e cols., 1976; Askari e cols., 1983). Durante a
fosforilação por Pi, o K
+
exerce um efeito inibidor, os níveis de E-P no equilíbrio ficam muito
reduzidos porque a fosfoenzima formada é quase toda sensível a K
+
e é quase totalmente
hidrolisada.
1.1.5- A ouabaína
A ouabaína é um glicosídeo cardíaco conhecido há mais de dois séculos por seus efeitos
cardiotônicos; este composto, quando em doses terapêuticas, provoca um aumento da força de
contração do coração. Este efeito foi relacionado a uma inibição parcial da Na
+
,K
+
-ATPase
acoplada a uma modificação da atividade do trocador Na
+
/Ca
2+
, o que induz a um aumento do
Ca
2+
intracelular que dispara a contração cardíaca (Hansen, 1984; Heller, 1990).
Yoda e Yoda (1982) demonstraram que a ouabaína liga preferencialmente à conformação
E
2
-P, exibindo uma única classe de sítios e produzindo um complexo estável e que se
decompunha muito lentamente. Na figura 4 podemos observar a estrutura química da ouabaína e
o sítio de interação com a Na
+
,K
+
-ATPase.
15
Figura 4- Estrutura química da Ouabaína e sitio de interação proposto com a Na
+
,K
+
-
ATPase
. A figura A representa a estrutura química da ouabaína e de outros glicosídeos
cardíacos. A figura B representa os resíduos que afetam a ligação de ouabaína na Na
+
,K
+
-
ATPase baseado na estrutura da SERCA. A região L1-L2 possui 8 sítios (Cys 104, Tyr 108, Gln
111, Glu 116, Pro 118, Asp 121, Asn 122 e Tyr 124. L3-4 possui apenas um sítio (Tyr 309). A
região M4b possui 3 sítios (Leu 331, Ala 332, e Thr 339). L5-6 Possui 3 sítios (Phe 783, Leu
790, Thr 794). M7 possui a Phe 863 e L7-8 possui Arg 880 e M10 Phe 882.
A
B
16
Fontes e colaboradoras (1995) avaliaram a interação da Na
+
,K
+
-ATPase com a ouabaína
em solventes orgânicos (DMSO) e caracterizaram que, em 40% DMSO, a ouabaína se liga à
forma livre da enzima com alta afinidade (comparável à obtida para a forma fosforilada),
reduzindo drasticamente a velocidade de fosforilação por fosfato. Este fato tornou os ensaios em
que se media a inibição do acúmulo de E-P por Pi em DMSO, um excelente meio de avaliar
indiretamente a ligação de ouabaína à enzima neste sistema, já que o grau de inibição da enzima
fosforilada por Pi, observado em concentrações crescentes de ouabaína, correlaciona
perfeitamente com a ligação de
3
H-ouabaína medida nas mesmas condições.
Uma forma bem conhecida de diferenciar entre as isoformas de Na
+
,K
+
-ATPase é a
presença de diferentes afinidades por ouabaína entre estas isoformas. Neste contexto,
1 e
3
exibem maior afinidade pelo glicosídeo que
2 (todas na faixa nanomolar) enquanto que a
isoforma
1 de rim de rato exibiria especificamente a pior afinidade aparente (na faixa de
micromolar) (Mercer, 1993).
Xie e colaboradores (2001), em uma revisão recente, destacam diversos eventos
fisiológicos onde a ouabaína tem sido implicada, tais como: aumento de cálcio intracelular,
ativação de Ras e p42/44 MAPKs (proteína cinase ativadora de mitogenese) em miócitos
cardíacos, estímulo à produção intracelular de ROS (espécies reativas de oxigênio), entre outros.
Askari e cols. (1996, 1998) tem realizado estudos implicando a ouabaína em várias rotas de
sinalização celular onde a inibição parcial da Na
+
,K
+
-ATPase desencadearia respostas celulares
ligadas a ativação de vias Ca
2+
dependentes, ativação de SRC-cinases e MAP-kinases que
regulam a proliferação e diferenciação em miócitos.
Atualmente estudos têm mostrado a existência de um fator denominado “Ouabain like
Factor” (OLF), ou seja, um fator com ampla identidade a ouabaína e que é sintetizado pela
17
adrenal. E relevante ressaltar que o OLF é encontrado em concentrações elevadas no plasma de
pacientes hipertensos. Este fator é capaz de inibir a Na
+
,K
+
-ATPase, mimetizando os efeitos dos
glicosídeos cardíacos (Hamlyn e cols., 1991).
1.2- A família P-ATPase
As ATPases do tipo P são uma família de proteínas, com atividade enzimática, que estão
relacionadas com o transporte de íons através da membranas. Essas enzimas são fundamentais
para a manutenção da homeostasia celular, uma vez que são responsáveis pelo balanço osmótico
e composição de íons intracelular (Apell, 2003 ; Donnet e cols., 2001).
A atividade destas enzimas depende basicamente da hidrólise da molécula de ATP para a
formação de gradientes eletroquímicos que existem em todos os tipos celulares e através deste
mecanismo conseguem efetuar o transporte de diversos íons como: Na
+
, K
+
, H
+
, Ca
2+
, Cu
2+
, e
Cd
2+
(Fagan e Saier, 1994).
De acordo com o modelo proposto por Post e Albers (1969) estas ATPases adquirem
diferentes conformações para realizar o transporte de íons através de membrana, passando por
duas conformações principais, denominadas E1 e E2, conforme mostrado na figura 5. Inclui-se
ainda etapas de oclusão/deoclusão de íons, e fosforilação/defosforilação da ATPase.
18
Figura 5- Ciclo Geral de reações das ATPases do tipo P. A figura representa as duas
conformações principais (E1 e E2) que as ATPases adquirem durante seu ciclo catalítico, e a
hidrólise da molécula de ATP. Apell HJ (2004),
Bioelectrochemistry, 63: 149-156.
Em geral estas enzimas são inibidas por vanadato, um análogo de fosfato, e este composto
ajuda a distinguir uma P-ATPase de uma V-ATPase ou F-ATPase. Algumas proteínas que
compõem esta família são a Na
+
,K
+
-ATPase, a Ca
2+
-ATPase (PMCA e SERCA) (Carafoli, 1991),
a H
+
,K
+
-ATPase não gástrica, a H
+
-ATPase de membrana plasmática de plantas e fungos
(Serrano, 1989), a H
+
,K
+
-ATPase gástrica (Lorentzon e cols, 1988), e a Cl
-
-ATPase (Gereneser &
Puroshothan, 1996). Fagan & Saier (1994) ao analisar a seqüência de aminoácidos de 47 P-
ATPases, chegaram a conclusão de que todas elas vieram de um ancestral comum.
19
Dentre as proteínas da família P-ATPase as mais estudadas são: a Na
+
,K
+
-ATPase (que
mantém o gradiente eletroquímico de Na
+
e K
+
). A Ca
2+
-ATPase de retículo endoplasmático
(SERCA), que bombeia o Ca
2+
do lúmem para o retículo sarcoplasmático. E a H
+
,K
+
-ATPase,
que é expressa pelas células parietais da mucosa gástrica que direciona a secreção de ácido
clorídrico para o lúmem estomacal. (Apell, 2004).
A estrutura cristalográfica com alta resolução está disponível apenas para a SERCA, para
outros membros da família existem apenas estruturas cristalizadas com baixa resolução (8
Å)
(Herbert e cols, 2001; Kuhlbrandt, 1998; Scarbrough, 1999).
A porção enzimática destas P-ATPases é formada basicamente pelos loops
citoplasmáticos compreendidos entre L2-3, L4-5 e o N-terminal. Estas seqüências são
conservadas em diversas espécies estudadas. A maioria das ATPases do tipo P possuem 10
segmentos transmembrana com seqüência de aminoácidos muito preservadas. As mudanças
dizem respeito a mudança de carga e polaridade, o que determina as diferentes propriedades
funcionais destas enzimas.
1.3- Ca
2+
-ATPase de membrana Plasmática (PMCA)
O Ca
2+
livre citoplasmático é um importante segundo mensageiro, sendo um agente
sinalizador para um grande numero de funções celulares, incluindo a regulação de vias
metabólicas, agregação plaquetária, liberação de neurotransmissores, regulação hormonal,
apoptose, divisão celular, expressão gênica e contração muscular (Carafoli, 1987, 1991, 1992;
Meyer & Stryer, 1991, Berridge e cols., 2000). Para manter a funcionalidade da célula os níveis
de Ca
2+
intracelulares devem ser mantidos extremamente baixos, cerca de 1000 vezes menores do
que no meio extracelular. Caso as concentrações de Ca
2+
intracelular sejam mantidas em níveis
mais altos do que os seus limites normais de variação por tempo muito prolongado, pode haver
20
danos irreversíveis à célula, como apoptose ou morte por necrose (Yu e cols., 2001). Os níveis
intracelulares de Ca
2+
podem diminuir pelo armazenamento deste íon em estoques intracelulares
(que ocorre via Ca
2+
-ATPase de reticulo endoplasmático – SERCA) ou pelo efluxo de cálcio via
PMCA. A saída do cálcio é mediada principalmente pela PMCA e pelo trocador Na
+
/ Ca
2+
(Blaustein, 1988; Carafoli, 1987; Reeves, 1994).
A Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática de eritrócitos é uma proteina de 140kDa
(Schatzmann, 1996), que possui cerca de 1200 aminoácidos (Verma e cols., 1988). É sabido que
cerca de 10% das proteínas de membranas plasmáticas de eritrócitos correspondem à PMCA
(Knauf e cols, 1998).
É proposto que a estrutura da PMCA possuiria assim como a Na
+
,K
+
-ATPase e outras
ATPases tipo do P, 10 segmentos transmembranares, designados como M1 a M10, que conectam
3 regiões citoplasmáticas (Moller e col., 1995; Penniston e Enyedi, 1998; Carafoli e Brini, 2000).
A primeira região citoplasmática (domínio A) corresponde à porção transdutora, que
acopla a hidrólise de ATP com o transporte de cálcio e localiza-se entre as hélices M2-M3. O
domínio N situa-se entre as hélices M4-M5, que contém o sítio de ligação do nucleotídeo;
também se localiza nessas hélices o domínio P, onde se situa o ácido aspártico que é fosforilado
por ATP (Asp
465
). A partir de M10 encontra-se a última porção citoplasmática, onde se localiza
o domínio de ligação à calmodulina, seqüências consensos de fosforilação por proteína cinase C e
proteína cinase A, e sítios de regulação alostérica por cálcio. (Hofmann e cols., 1993; Wang,
1991). Estas regiões podem ser melhor observadas na figura 6.
21
Figura 6- Estrutura secundária da Ca
2+-
ATPase de membrana plasmática.Os retângulos
verdes representam a parte da enzima que possui a estrutura de a-hélice e as setas azuis,
estruturas em folha b-pregueada. O ácido aspártico que forma o intermediário fosforilado e a
lisina, que é marcada pelo FITC no domínio de ligação de ATP são representados pelas suas
letras símbolos em um círculo rosa, K para lisina e D para ácido aspártico. O domínio de ligação
da Calmodulina (CaM), e o domínio de ligação dos fosfolipídeos ácidos (PL) são mostrados em
vermelho e marron claro, respectivamente. O sítio de ligação do ATP está envolto por um círculo
cinza. As extremidades C-terminal e N-terminal estão marcados por C e N respectivamente. Este
modelo é baseado na sequência da PMCA4. (Reproduzido de Carafoli & Brini, 2000)
22
Todas as Ca
2+
-ATPases de membrana plasmática são ativadas por concentrações
nanomolares de calmodulina, na presença de concentrações micromolares de Ca
2+
. Entretanto,
concentrações altas de Ca
2+
inibem a Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática e de retículo
sarcoplasmático (Carafoli, 1994; de Meis, 1981). A calmodulina atua de duas formas na ativação
da PMCA, aumentando a afinidade por cálcio em torno de 20 vezes e a velocidade máxima de 4 -
10 vezes. (Wuytack & Raymaekers, 1992) A figura 7 mostra a estrutura da calmodulina e os
sítios de ligação do cálcio.
Figura 7: Representação da estrutura da calmodulina com os 4 sítios de ligação para cálcio.
Em vermelho representado a porção N-terminal e em verde representado a porção C-terminal.
Em amarelo esta representado o íon cálcio.
Biochemistry and Molecular Biology – Picture and
Movie Gallery.
Até o momento foram identificados 4 genes que codificam para Ca
2+
-ATPase de
membrana plasmática. Em humanos e ratos, a isoforma PMCA 1 é largamente distribuída,
enquanto a PMCA 2 e 3 são menos freqüentes. As isoformas 1 e 4 são expressas em muitos tipos
celulares e assumem um papel de manutenção da homeostase chamadas também de “governantas
23
celulares”. A PMCA 4 é expressa abundantemente em eritrócitos, útero, estomago e certas
regiões do cérebro. Eritrócitos humanos contém as isoformas PMCA 1 e PMCA 4 (Grover &
Khan, 1992; Keeton & Shull, 1995; Stauffer e cols., 1995).
Ainda não foram descritos na literatura inibidores específicos da PMCA, como são a
ouabaína para a Na
+
, K
+
-ATPase ou a thapsigargina para SERCA. Para inibir estas enzimas são
utilizados inibidores gerais de ATPases do tipo-P, como lantânio e ortovanadato ou antagonistas
de calmodulina como calmidazolium.
A grande variabilidade no carboxi-terminal entre as isoformas tem sugerido a existência
de diferentes sítios de fosforilação por PKC, e conseqüentemente diferentes efeitos em suas
atividades. Enyedi e colaboradores (1997) mostrou que as isoformas 2b e 3b não são fosforiladas
significativamente por PKC, ao contrário das isoformas 2a e 3a. Verma e cols (1999), relata que a
fosforilação da PMCA 4 a humana por PKC ocorre no domínio de ligação da calmodulina , mas
não afeta substancialmente a afinidade por calmodulina ou a atividade basal da enzima.
A importância da PMCA para a sinalização celular depende principalmente do tipo
celular. Em células neuronais e cardíacas, o principal caminho para o efluxo de Ca
2+
é via
trocador Na
+
/Ca
2+
(Reeves e cols., 1994), enquanto em eritrócitos o efluxo de Ca
2+
é mediado
pela PMCA (Wright e cols., 1993). Em outros tipos celulares funcionam efetivamente os dois
mecanismos de extrusão do Ca
2+
, onde o mecanismo predominante dependerá da concentração de
cálcio intracelular. A PMCA possui uma grande afinidade pelo cálcio, no entanto o trocador
Na
+
/Ca
2+
é mais eficaz no efluxo deste cálcio (Furukawa e cols., 1988).
A PMCA, assim como outras proteínas sinalizadoras, também podem se localizar dentro
de cavéolas, que são pequenas invaginações na membrana plasmática. As cavéolas fechadas no
interstício são incapazes de ejetar o cálcio, no entanto isto pode ser uma forma eficiente da célula
bloquear o efluxo de cálcio e controlar o transiente de Ca
2+
. É proposto que o Ca
2+
fique
24
sequestrado dentro da caveola, quase como uma vesícula na superfície celular, sendo liberado
quando requisitado. A composição lipídica da membrana parece regular a morfologia da caveola,
de acordo com a fluidez dos lipídeos envolvidos em sua composição, e interessantemente a
PMCA também é sensibilizada pelos lipídeos que a envolvem (Anderson, 1993; Rothenberg e
cols, 1992).
Em suma, a PMCA é uma importante controladora da homeostasia de Ca
2+
, sendo ativada
por uma série de reguladores, onde alguns ainda possuem mecanismos desconhecidos. O fato da
PMCA também estar localizada em caveolas tem sugerido um importante mecanismo de controle
dos transientes de Ca
2+
dentro da célula.
1.4- Ca
2+
-ATPase de Reticulo sarcoendoplasmático (SERCA)
A Ca
2+
-ATPase de retículo sarco/endoplasmático (SERCA) também é uma ATPase tipo
P , assim como a PMCA e Na
+
,K
+
-ATPase. Ela é uma proteína integral de membrana do reticulo,
formada por uma cadeia polipeptídica única com massa molecular relativa de 110.000 Da
(MacLennan, 1985; McFarland e Inesi, 1971).
Esta enzima desenvolve um papel importante no transporte de Ca
2+
para dentro do retículo
durante o ciclo de relaxamento e contração do músculo cardíaco. A quantidade e a velocidade do
transporte de Ca
2+
para o reticulo é que determina a duração do ciclo contração-relaxamento
(Frank e cols, 2003).
Três genes diferentes codificam as diferentes isoformas de SERCA em ratos (Wu e cols.,
1995). As SERCAs 1a e 1b são expressas em músculo esquelético de contração rápida. A
SERCA 2a é a isoforma cardíaca e de músculos de contração lenta, enquanto a SERCA 2b é
expressa no músculo da boca e em tecidos não musculares. A SERCA 3 é expressa em um grupo
25
limitado de tecidos não-musculares, incluindo células epiteliais, endoteliais e plaquetas, e sua
supressão não é letal (Kuo e cols., 1997).
A estrutura da SERCA, assim com da PMCA e da Na
+
,K
+
-ATPase é composta por 3
domínios citoplasmáticos globulares (domínios A, N e P) conectados por um segmento helicoidal
Stalk e dez hélices transmembranares, denominadas M1-M10. Propõe-se que o domínio A seria
responsável pelo acoplamento da quebra de ATP com o transporte de cálcio. No domínio N,
situa-se o sítio de ligação a nucleotídeos, e no domínio P está o resíduo aspartato
351
, que é
fosforilado por ATP durante o ciclo catalítico da enzima. Dois sítios de ligação de cálcio,
denominados sítios I e II, foram inicialmente localizados através de mutagênese sitio dirigida, nas
hélices transmembranares M4-M6 e M8 (Clarke e cols., 1989). É proposto que essas 4 hélices
formem uma estrutura semelhante a um canal através do qual o Ca
2+
seria transportado (Inesi e
cols., 1990). Toyoshima e cols. (2000), obtiveram um cristal da SERCA em alta resolução, o que
permitiu a confirmação das predições estruturais anteriormente propostas, como podemos
observar na figura 8.
26
Figura 8- Cristal da estrutura da SERCA 1 a. A figura mostra os domínios A, P e N e o N-
terminal e o Carboxi-terminal. Em rosa está mostrado o n-terminal que compreende o domínio
A, que forma 2 pequenas
-hélices, e o primeiro loop citoplasmático entre M1 e M2 (verde). Em
azul claro está demonstrado o dominio transmembrana que contem as 10
-hélices. O domínio P
está representado por Azul e o domínio N esta representado em vermelho. (Toyoshima e cols,
2000)
Está bem estabelecido que a SERCA é regulada pelo PLB, onde seu efeito inibitório é
revertido pela fosforilação por uma PKA ou por uma proteína cinase cálcio/calmodulina
dependente (PKCaMII) durante uma ativação adrenérgica (MacLennan e Kranias, 2003).
A tapsigargina é um inibidor específico, que permite a identificação da SERCA (Sagara e
Inesi, 1991). Ela se liga à SERCA com uma estequiometria 1:1 e uma afinidade sub-nanomolar
no terceiro segmento transmembrana M3 (Norregaard e cols., 1994). Nas células musculares, o
retículo sarcoplasmático é um reservatório de Ca
2+
que tem duas funções principais no controle
27
da concentração de Ca
2+
intracelular: acúmulo do Ca
2+
proveniente do meio intracelular para
causar o relaxamento muscular e liberação do Ca
2+
para promover a contração muscular (Mintz
& Guillain, 1997).
1.5- A família FXYD
Trabalhos de vários laboratórios permitiram identificar uma família de proteínas
denominadas FXYD. As proteínas FXYD são proteínas transmembranares com o N-terminal
extracelular, um único domínio transmembrana e um C-terminal intracelular.
Vários destes peptídeos são proteolipídios e se caracterizam por possuir a seqüência
padrão FXYD, atualmente agrupada em uma família de proteínas regulatórias que recebem o
mesmo nome deste motivo (FXYD). Na tabela abaixo mostramos estes peptídeos e seus
respectivos nomes comuns.
Nomes Abreviações
Fosfolemman FXYD 1
Subunidade
da Na
+
,K
+
-
ATPase
FXYD 2
Mat-8 FXYD 3
CHIF FXYD 4
RIC ou Disaderina FXYD 5
Fosfohipolina FXYD 6
Sem denominação FXYD 7
Fosfolemman - Like FXYD 10
Tabela 1- Os componentes da família FXYD : Resumo dos membros da família
FXYD e seus respectivos nomes e abreviações da acordo com a seqüência padrão
FXYD. Adaptado de Garty H e Karlish SDJ (2006).
Annu. Ver. Physiol. 68: 431-59.
28
Nessa família inclui-se o fosfolemman, fosfolamban, sarcolipina, CHIF, MAT-8, RIC,
além de duas novas proteínas descobertas recentemente e ainda sem denominação, que são
FXYD6 e FXYD7 (Arystarkhova e cols., 2002). A tabela 2 mostra os componentes da família
FXYD e os tecidos de onde foram isolados o RNAm e as respectivas proteínas.
Proteolipídeo RNAm Proteína
Fosfolemman (PLM) Coração, fígado,
músculo esquelético.
Coração (miócitos), Cérebro
(cerebelo e plexo coróide) e
rim.
Subunidade
Rim, coração e
estômago.
Rim.
Mat-8 (antígeno-8 de
tumor mamário)
Cólon, estômago e
útero.
Estômago.
Proteína indutora da
formação de canais
(CHIF)
Ducto coletor renal,
cólon distal.
Ducto coletor renal, cólon
distal.
RIC (proteína
relacionada a canal
iônico) ou Disaderina
Coração, cérebro, baço,
pulmão, fígado,
músculo esquelético,
rim e testículo.
Rim, intestino, coração, baço
e pulmão.
Fosfohipolina Cérebro e rim. SNC
FXYD 7 Cerebelo, hipocampo,
tronco cefálico.
Cerebelo, hipocampo e
tronco cefálico.
Fosfolemman-like
(PLMS)
Cérebro, coração, rim,
intestino e glândula
retal.
Glândula retal de tubarão.
Tabela 2- Órgãos e tecidos que expressam o RNAm e as proteínas da Família
FXYD.
Resumos dos peptídeos pertencentes à família FXYD, os tecidos onde foram
primeiramente foram isolados o RNAm e onde são expressas as respectivas proteínas.
Adaptado de Garty H e Karlish SDJ (2006).
Annu. Ver. Physiol. 68: 431-59.
29
É importante ressaltar o alinhamento das seqüências entres os peptídeos da família
FXYD. Na figura 9 podemos observar as principais similaridades entre estes proteolipídeos.
Os peptídeos da família FXYD além de possuírem similaridades estruturais também
possuem similaridades funcionais, como a interação com a Na
+
,K
+
-ATPase. Muitos destes
peptídeos têm sido mostrados por modular a afinidade desta enzima por Na
+
e K
+
(Garty e
Karlish, 2006). A figura 10 mostra as principais características estruturais e funcionais destes
peptídeos.
Domínio Transmembrana
Figura 9
-
Alinhamento da seqüência das proteínas que compõem a Família FXYD
. Os
aminoácidos selecionados em preto representam a identidade entre alguns componentes da
família FXYD. Os aminoácidos marcados com asterisco indicam a identidade entre todos os
componentes da família FXYD. Adaptado de Garty H e Karlish SDJ (2006).
Annu. Ver. Physiol.
68: 431-59.
30
Figura 10- Principais características estruturais e funcionais das proteínas FXYD. No
modelo linear das proteínas FXYD, os resíduos conservados são marcados em vermelho. Em
azul está demonstrada a seqüência sinal no N-terminal. A região listrada no FXYD5 representa
uma região rica em prolina-serina e prolina-treonina. A estrutura octogonal no amino-terminal do
FXYD7 indica a presença de glicosilações. O sinal de
+ indica a presença de cargas positivas no
carboxi-terminal. O resíduo de serina indica o sítio de fosforilação por proteínas cinases. No
domínio trasmembrana está representada a glicina que é mutada em casos de hipomagnesemia
primária humana (FXYD2). Abaixo estão sumarizados alguns efeitos funcionais destes
proteolipídeos. A seta ( ) indica o efeito observado na afinidade por ouabaína reportado pelo
nosso grupo (Fontes e cols, 1999). Figura adaptada de Crambert G e Geering K (2003)
Sci. STKE
166: 1-9.
31
1.5.1- FXYD1-
O fosfolemman (PLM) tem um peso molecular aparente em torno de 15 kDa em SDS-
PAGE. É encontrado na membrana plasmática de células musculares cardíacas e esqueléticas e
também nos hepatócitos Após ter sido clonado de músculo cardíaco, revelou um peso molecular
de 8,4 kDa, possui 72 aminoácidos (Maeda,
e cols. 1998; Palmer e cols., 1991).
No músculo cardíaco, a fosforilação do PLM ocorre após estímulo dos receptores e
adrenérgicos, que estão relacionados ao aumento da freqüência de contratilidade cardíaca. O
PLM é um dos melhores substratos para PKA, onde a fosforilação na serina 68 por esta cinase
possivelmente depende da participação de AMPc em músculo liso de artéria, levando a um
relaxamento devido ao aumento da atividade da bomba de sódio. Este efeito sobre a Na
+
,K
+
-
ATPase pode ser explicado pelo fato do PLM e o FXYD2 dividirem uma significante
homologia. No músculo esquelético foi mostrado que o PLM pode ser fosforilado em resposta a
insulina ou epinefrina (Crambert e Geering, 2003). Na figura 11 podemos observar com maior
detalhe a influência do fosfolemman no músculo cardíaco e esquelético.
32
Figura 11- Suposto papel fisiológico do FXYD1 (PLM) no músculo cardíaco e esquelético.
Uma suposição é de que o fosfolemman quando fosforilado por PKA forma o canal de taurina ou
associa-se a Na
+
,K
+
-ATPase causando o aumento de Ca
2+
intracelular, bloqueando o canal
Na
+
,Ca
2+
, ocorrendo a contração muscular. Figura adaptada de Crambert G e Geering K (2003)
Sci. STKE 166: 1-9.
33
1.5.2- FXYD3-
Este proteolipídio foi inicialmente clonado de tumor mamário de murine induzido pelos
oncogenes
neu e ras, mas não pelos oncogenes c-myc ou int-2.Estudos recentes mostram que o
Mat-8 interagem com a Na
+
,K
+
-ATPase, assim como outros proteolipídios da família FXYD
(Morrison e Leder, 1994 ; Arimochi e cols, 2005).
Arimochi e cols. (2007) através de estudos de microscopia fluorescente determinaram a
distribuição celular do Mat-8 sua co-localização e associação física com a Na
+
,K
+
-ATPase em
cólon-26 (linhagem celular de câncer de cólon, onde a transcrição de Mat-8 é elevada). Neste
mesmo estudo é mostrado que a mutação da Gly
41
-Arg do domínio transmembrana do Mat e -8,
inibe a associação com a subunidade a da Na
+
,K
+
-ATPase. A mutação das Cys
44
-Ala e Cys
49
-Ala
não interfere na localização do Mat-8 na membrana plasmática ou no citoplasma.
1.5.3- FXYD4-
Um outro proteolipídeo importante é o CHIF (Proteína indutora da formação de canais),
conhecido como FXYD 4, e que recentemente tem sido mostrado como um importante
modulador da Na
+
,K
+
-ATPase. Este peptídeo foi clonado como um gene indutor da síntese de
aldosterona sendo expresso apenas no rim (ducto coletor) e no cólon. Na privação de Na
+
e com
alta concentração de K
+
esta regulação por corticosteróide induz o RNAm de CHIF e a proteína.
Assim como a subunidade
, CHIF é expresso somente na membrana basolateral (Shi e cols,
2001; Attali e cols, 1995; Wald e cols, 1996 e Wald e cols, 1997). Garty e cols (2002) em
experimentos de co-imunoprecipitação mostraram a existência de complexos
/
/
a,
/
/
b e
//CHIF, mas não complexos //a/b ou ///CHIF o que corrobora com a expressão tecido
específica destes peptídeos. Ainda neste trabalho foi sugerido que este FXYD poderia ser uma
34
outra subunidade auxiliar da bomba de Na
+
/K
+
, que interage com a subunidade
com efeitos
funcionais diferentes da subunidade
. Béguin & cols (2001) identificaram o CHIF como um
modulador positivo da afinidade por Na
+
, e como um modulador negativo da afinidade da
enzima por K
+
, sob um potencial de membrana negativo, independente do Na
+
externo, sendo
estes efeitos contrários quando a subunidade
é expressa. Aizman & cols (2002), geraram
camundongos “knockout” para CHIF e observaram que, em alto K
+
, eles obtiveram um volume
de urina duas vezes maior e um aumento considerável dos níveis de filtração glomerular. Efeitos
similares, porém menores, foram observados em camundongos que foram submetidos a uma
baixa ingestão de Na
+
. Ainda, o tratamento com alto K
+
por 10 dias e furosemida foram letais
para os camundongos “knockout”, mas não para os camundongos controles.
1.5.4- FXYD5-
Este é o FXYD atualmente caracterizado, é o que possui a menor porção citoplasmática,
em torno de 15 aminoácidos. Este peptídeo foi clonado, sendo tecido específico e regulador do
desenvolvimento do gene induzido pela oncoproteína E2a-Pbx1, denominada neste caso como
RIC (Fu e Kamps, 1997). Em humanos o FXYD5 tem sido identificado como uma proteína de
membrana associada ao câncer, que regula a E-caderina e promove a metástase, sendo
denominada como disaderina (Ino e cols., 2002). A disaderina tem sido reportada como presente
na membrana celular de diferentes carcinomas, mas não em células não tumorais (Aoki e cols.,
2003; Shimamura e cols., 2003; Sato e cols., 2003).
Lubarski e colaboradores (2005) demonstraram, através de imuno-localização, que o
FXYD5 é expresso em tecidos normais, preferencialmente em rim, fígado e intestinos. No rim o
FXYD5 localiza-se na membrana basolateral do túbulo conectivo, túbulo coletor. Entretanto,
35
também se observou sua presença na porção apical da alça de Henle. O FXYD5 também foi
capaz de imunoprecipitar com a subunidade alfa da Na
+
,K
+
-ATPase em Ovócitos de xenopus,
levando a um aumento de 2 vezes na atividade da bomba.
1.5.5- FXYD6-
Yamagushi e cols. (2001) recentemente clonou da biblioteca de cDNA uma proteína de
hipocampo de rato que parece ter grande similaridade com proteolipideos da família FXYD. Foi
denominada de fosfohipolina (FXYD6), e é muito semelhante ao FXYD10. Análises de
bioinformática demostraram uma semelhança de 87.6% e 95.8 % para genes humanos e genes de
camundongo, respectivamente.
Estudos mostram que a fosfohipolina é expressa no cérebro de ratos no período pós-natal
(3 semanas de vida), e se mantém em quantidade significativa no período adulto. Esses resultados
conduzem a suposição que este peptídeo desenvolvera um papel importante no sistema nervoso
central durante o desenvolvimento pós-natal, bem como no cérebro adulto, pois sua expressão é
mantida no período pós-natal em quantidades significativas.
Atualmente este peptídeo também foi descrito como o mais recente regulador da Na
+
,K
+
-
ATPase. Este e co-localizou e co-imunoprecipitou com a Na
+
,K
+
-ATPase da estria vascular do
ducto auditivo interno. O FXYD2 interagiu coma s isoformas
1 -
1 e
2-
2 de forma
diferentes. A associação do FXYD6 com a isoforma diminuiu suavemente a afinidade aparente
por K
+
e signifcativamente a afinidade por Na
+
. Por outro lado, a interação deste peptídeo coma
isoforma aumentou a afinidade por K e Na. Importante que o FXYD6 é o único expresso no
ouvido interno, sugerindo um importante papel na composição da endolinfa. (Delprat e cols,
2007)
36
1.5.6- FXYD7-
É uma proteina O-glicosilada que é expressa apenas no cérebro, neurônios, e células da
glia. Este se associa com a isoenzima
α1β1, mas não com a isoenzima α1β2, quando expressa em
ovócito de xenopus. Uma associação estável do FXYD7 com a Na
+
,K
+
-ATPase modifica a
afinidade aparente pelo K
+
externo, aumentando em 2 vezes o K
0,5
para K
+
. O FXYD7 também
modifica a afinidade aparente da Na
+
,K
+
-ATPase para o sódio extracelular, provavelmente pela
influencia na liberação de Na
+
para ou do meio extracelular (Béguin e cols., 2002)
Li e cols (2004), mostraram que o FXYD7, junto ao FXYD2 e o FXYD4, são localizados
muito próximos ao domínio transmembrana 9 (TM9) da subunidade alfa da Na
+
,K
+
-ATPase. Em
particular, a Leu
964
e a PHe
967
do TM9 contribuem para uma associação estável, onde a Phe
956
e
o Glu
960
estão envolvidos na transmissão do efeito funcional das proteínas FXYD para a Na
+
,K
+
-
ATPase . No entanto, análises com mutantes revelaram que o domínio transmembranar do
FXYD7 desempenha um papel estrutural e funcional para a interação deste peptídeo.
1.5.7- FXYD10-
Mahmmoud, e cols.(2000) identificaram uma proteína em glândula retal de tubarão,
denominada “fosfolemman-like protein” de tubarão (PLMS ou FXYD10). Esta proteína possui
alta similaridade com o fosfolemman, possuindo aproximadamente o mesmo peso molecular e
funcionando como alvo de fosforilação por PKA e PKC. O PLMS também é homólogo à
subunidade
da Na
+
,K
+
-ATPase, e associa-se especificamente a esta enzima. Resultados in vitro
indicam que o PLMS, quando fosforilado por PKC se dissocia da subunidade
, causando uma
ativação da enzima. Durante a fosforilação do PLMS no N-terminal o sítio de clivagem para
37
tripsina é exposto, sugerindo que este peptídeo interagiria funcionalmente com o N-Terminal da
Na
+
,K
+
-ATPase de tubarão para equilibrar as conformações E
1
-E
2
.
1.6- Fosfolamban e Sarcolipina
Apesar da semelhança entre estes proteolipídeos e os membros da família FXYD estes
não pertencem a esta família. Eles apresentam semelhança estrutural apenas no domínio
transmembrana, enquanto as outras regiões tecnicamente não possuem semelhança. Por outro
lado possuem semelhanças pelo fato de desempenharem funções parecidas, como a regulação de
ATPases do tipo P. A figura 12 mostra as semelhanças estruturais entre a sarcolipina e a SERCA.
Figura 12: Semelhanças estruturais entre o Phospholamban e a Sarcolipina. MacLennan DH
e Kranias EG. (2003);
Nature Reviews Molecular Cell Biology 4; 566-577
Resíduos não conservados
Resíduos conservados
Resíduos idênticos
Serina-P, Treonina-P
Fosfolamban
Sarcolipina
Lúmen
citossol
Resíduos não conservados
Resíduos conservados
Resíduos idênticos
Serina-P, Treonina-P
Fosfolamban
Sarcolipina
Lúmen
citossol
38
A sarcolipina foi primeiramente isolada como um proteolipideo de baixo peso molecular
de reticulo sarcoplasmático de músculo esquelético de contração rápida de coelho e de
preparações pufificadas de Ca
2+-
ATPase deste mesmo tecido (MacLennan e cols., 1972). Este
peptídeo possui um peso molecular aparente de 6 kDa e cerca de 31 aminoácidos. Odermatt e
cols
. (1998) mostraram que a SERCA 1a de músculo esquelético de contração rápida é inibida
pela sarcolipina, em uma associação com o mecanismo de ação do fosfolambam. Além disso, as
SERCA 1 e 2 são também inibidas pela sarcolipina
in vitro.
A sarcolipina é altamente co-expressa com SERCA 1a de músculo esquelético de
contração rápida. Apesar do fosfolamban (PLB) não ser expresso neste tecido, ambos (PLB e
SLN), são expressos em músculo cardíaco e músculo esquelético de contração lenta de humanos,
onde SERCA 2a é altamente expressa. Em ratos, a expressão de sarcolipina em músculo cardíaco
excede a expressão da mesma em músculo esquelético, já que a razão de expressão PLN/SLN no
coração é em torno de 8: 1 (Odermatt e cols
., 1997; Odermatt e cols., 1998; Gayan-Ramirez, e
cols., 2000). Asahi e cols. (2002) mostraram que a SLN tem um efeito inibitório na SERCA 2a, e
que quando combinada ao PLB a adição de SLN resulta em uma super-inibição.
Berrebi-Bertrand e colaboradores (2001) relatam que vários autores têm proposto que a
SLN se ligaria nas hélices transmembrana das isoformas de SERCA, uma vez que estas seriam
seqüências altamente conservadas. Neste contexto, haveria interação entre estas hélices e a hélice
transmembrana do SLN.
Uma outra proteína associada à SERCA 2a é o PLB que desempenha um papel central no
mecanismo de contração e relaxamento das células miocárdicas. Na figura 13 podemos observar
as regiões da SERCA que interagem com o PLB.
39
Figura 13- Sítio de ligação da SERCA para o Fosfolamban. Os 4 resíduos evidenciados na
figura afetam a ligação do fosfolamban na SERCA. Este resultado foi obtido através de mutações
específicas no domínio M6 da estrutura da SERCA. Os resíduos críticos na alça do domínio N
(envolto por um circulo preto) está deletado na Na
+
,K
+
-ATPase.
O PLB é uma proteína transmembrana que se associa em oligômeros e que auto-inibe
reversivelmente a SERCA 2a. Jones e cols. (1985) mostraram que ele se organiza como um
homopentâmero. Isto foi descoberto a partir da observação de géis em SDS-PAGE onde se
detectou duas bandas (com 6 e 30 kDa), porém com o aquecimento prévio das amostras havia
apenas a detecção de 6 kDa, desaparecendo a banda de 30 kDa. Neste contexto, a fosforilação do
PLB tem um importante papel modulatório do cálcio intracelular. Em seu estado defosforilado, o
PLB age como um inibidor da atividade da SERCA, sendo este efeito revertido quando ocorre a
fosforilação do PLB, na Thr 17, pela proteína cinase Ca
2+
-calmodulina dependente (PKcam). Esta
Alça específica da
SERCA
40
fosforilação só e possível se a Ser 16 estiver previamente fosforilada por PKA (Hagemann e
Xiao, 2002). É proposto que, com a fosforilação, o oligômero (pentâmero) sofre uma mudança
estrutural (abertura) que aumenta a afinidade da enzima por Ca
2+
aumentando a velocidade de
captação, o que seria decisivo na velocidade de relaxamento. Portanto, in vivo, este peptídeo
pode ser fosforilado por PKA e por PKC e PKcam em uma forma hierárquica (Simmerman e
cols., 1998; Luo e cols., 1994; Mac Lennan e cols., 1985; Colyer e cols., 1993).
O PLB tem sido associado à falência cardíaca em humanos. Estudos mostram que os
níveis de expressão de PLB estão reduzidos (cerca de 18%) em pacientes com cardiomiopatia
avançada (Meyer e cols., 1995). Outros estudos mostram que a captação de cálcio e a atividade
ATPásica estão diminuídos (33 a 41 %) nos pacientes com falência cardíaca, mas neste estudo o
acoplamento do transporte de Ca
2+
com o estado de fosforilação do fosfolamban não foi
analisado (Hicks e cols., 1979; Schwinger e cols.,1995).
1.7- O FXYD2
A subunidade
(FXYD2) é um pequeno peptídeo anfipático que contem o motivo
protéico FXYD, que está associado especificamente a Na
+
,K
+
-ATPase em alguns tipos celulares.
Apesar da Na
+
,K
+
-ATPase ser altamente distribuída no rim, a expressão do FXYD2 é específica,
este colocaliza com a Na
+
,K
+
-ATPase apenas na medula como podemos observar na figura 14
(Pu e cols., 2001).
41
Figura 14- Distribuição tecido específica do FXYD2. Western-blot utilizando anticorpo anti
subunidade
e anti-FXYD2. O Paineil (A) mostra a expressão da subunidade
e
em
diferentes tecidos. O painel (B) mostra a expressão da subunidade
e em diferentes regiões
do rim, em tecidos de diferentes. O FXYD2 é expresso apenas na medula renal (Therien e cols,
1997).
Forbush e cols. (1978) demonstraram pela primeira vez a existência de um pequeno
peptídeo hidrofóbico específico da Na
+
,K
+
-ATPase, que fotomarcava junto com a ouabaína
ligada a subunidade
. Apesar de este peptídeo ser considerado como uma terceira subunidade,
este foi considerado por muito tempo como não sendo parte integral do complexo enzimático.
Atualmente, é muito mais aceito que este proteolipídeo faria parte da maquinaria estrutural da
Na
+
,K
+
-ATPase, principalmente no rim, participando como um regulador da atividade. (Therien e
Blostein, 2000). Bobis e Farley (1994) mostraram que o FXYD2 não é essencial para a ligação de
ouabaína ou para a atividade ATPásica da Na
+
,K
+
-ATPase sugerindo que a participação do
FXYD2 como um ionoporo deve ser descartada, uma vez que nenhum efeito é observado na
captação de Rb
+
ou na ligação de Na
+
.
O FXYD2 parece estar presente em quantidades equimolares comparando-o com
e
(Collins e cols., 1982 e Hardwicke e cols., 1981). Os experimentos iniciais de biologia molecular
mostraram que o FXYD2 possui cerca de 58 aminoácidos e um peso molecular de 6500 Da
42
(Mercer, 1993). Após ter sido clonado e seqüenciado o FXYD2 teve sua seqüência comparada, o
que mostrou uma homologia forte (75%) entre espécies diferentes e de até 93% quando as
seqüências eram comparadas entre mamíferos. Análises estruturais mostraram que este
proteolipídeo possui um NH
2
- terminal voltado ao exterior e um COOH-terminal no interior da
célula, atravessando a membrana uma única vez em sua topologia (Béguin e cols, 1997).
Inicialmente acreditou-se que a subunidade
era um contaminante sem importância, ou
mesmo um produto de degradação da subunidade
(Ball e cols., 1983). No entanto, estudos de
Collins e Leszyk, (1987) e mais tarde de Mercer e cols. (1993) demonstraram através do
isolamento do cDNA do peptídeo e análise da seqüência de aminoácidos, que o FXYD2
representava uma entidade isolada e, em certos aspectos, similar a outros peptídeos hidrofóbicos
associados a outras ATPases tais como: o fosfolamban da Ca
2+
-ATPase de retículo
sarcoplasmático (MacLennan e cols., 1972) e proteolipídeos encontrados na H
+
-ATPase de
leveduras (Navarre e cols., 1992) e na ATP sintase (Blondin, 1979).
Horowitz e cols. (1991), utilizando técnicas de engenharia genética, expressou uma
Na
+
,K
+
-ATPase funcional em leveduras, utilizando plasmídeos contendo as informações do
cDNA da subunidade
de rim de ovelha e da subunidade
de rim de cão. Estes autores
conseguiram expressar as subunidades seletivamente, e descobriram que a combinação
e
(sem a presença do proteolipídio) era capaz de catalisar a hidrólise de ATP e a ligação de
ouabaína. Fontes e cols. (1999) extraíram da Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal um fator que era
capaz de aumentar a ligação de ouabaína à enzima, sendo então denominado OBPF (Fator
Promotor da Ligação de Ouabaína). Este fator era reconhecido pelo anticorpo anti-FXYD2, e
apresentava em grande quantidade no OBPF quando comparado à enzima nativa, e em
43
quantidade muito pequena quando analisado na enzima depletada deste fator, como podemos
observar na figura 15.
Figura 15-Western-Blot anti-FXYD2: Imunoidentificação do FXYD2 na enzima nativa (linha
1), no extrato de OBPF (linha 2) e Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal ( Fontes e cols. 1999).
Complementando este estudo, os resultados descritos no artigo em anexo (Cortes e cols,
2006) mostraram que a enzima depletada de FXYD2 mantinha sua funcionalidade, porém com
redução de 40% da sua atividade. Nos experimentos de Horowitz (1990) cepas de levedura que
expressaram isoladamente
ou
, não apresentaram atividade catalítica. Estes dados indicam que
a presença do FXYD2 seria dispensável para a atividade da enzima, mas não excluem a sua
existência como uma subunidade da Na
+
,K
+
-ATPase, com efeitos quantitativos no funcionamento
da mesma. Uma possibilidade comentada seria a de que a levedura poderia possuir proteolipídeos
endógenos que substituíssem o original. Navarrre e colaboradores (1992) mostraram que a
levedura, de fato, possui tais proteolipídios, mas não foi conclusivo sobre até que ponto poderia
realmente haver uma substituição deste tipo. Foi descrita uma nova variante para a subunidade
da Na
+
K
+
-ATPase de rim de rato. Em SDS-PAGE, o FXYD2 corre de forma difusa, entretanto,
aparece sob a forma de uma banda dupla. Estas bandas foram denominadas
a e
b. Existem
evidências de que estas duas formas seriam produto de uma única seqüência de mRNA. Beguin e
cols. (1997) mostraram em
Xenopus que as duas bandas de seriam produto de um uso
diferencial a alternado de dois diferentes códons de iniciação encontrados no genoma da
subunidade
, levando à tradução de um mRNA com oito bases a menos. A espectrometria de
44
massa da subunidade
da Na
+
K
+
-ATPase de rim de rato mostra que
a possui um peso de 7184
Da e
b um peso de 7337,9 Da (Küster e cols., 2000).
O FXYD2 pode interagir com as isoformas
1,
2 e
3, aumentando a afinidade para
sódio em
1e 3, mas não na isoforma 2. O domínio transmembrana 9 (TM9) parece ser crucial
para que ocorra o aumento na afinidade para sódio. Entretanto o loop entre TM 7 e 8 foi mostrado
como se fosse de extrema importância para a interação com FXYD2. Vale ressaltar que os
domínios transmembrana não são importantes apenas para determinar o efeito do FXYD2 sobre a
afinidade para sódio, mas também parecem ser importantes para outros efeitos deste peptídeo
(Zouzoulas & Blostein, 2006).
Atualmente vários estudos estão implicando o FXYD2 em diversos eventos que ocorrem
durante o mecanismo de catálise e transporte de íons pela Na
+
,K
+
-ATPase. Arystarkhova e
colaboradores (1999) mostraram que o FXYD2 modula a afinidade da Na
+
,K
+
-ATPase de rim de
rato, porco e cachorro, por sódio e potássio, diminuindo ligeiramente a afinidade da enzima por
ambos os íons. Nosso grupo demonstrou que o FXYD2 também é capaz de aumentar atividade
da Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal de porco.
O papel fisiológico do FXYD2 ainda permanece obscuro, mas é fato que ele se associa
especificamente com as isoformas de α e β. Também se torna questionável o fato do FXYD2
interagir com outras proteínas de membrana e talvez desempenhar efeitos importantes sem
requerer a presença das subunidades
α e β. Também é possível que existam outras isoformas de
FXYD2, assim como ocorre para as subunidades α e β. É importante mencionar que a perda do
FXYD efetivamente aboliu a ativação da Na,K-ATPase dependente da captação de glutamato, e a
atividade do transportador de glutamato GLAST/EAAT1 pode efetivamente regular o
45
recrutamento de FXYD2 para a superfície celular de astrócitos fetais humanos (Gegelashvili e
cols, 2007).
1.8- Regulação da Na
+
,K
+
-ATPase e da PMCA por fosforilação: Papel das proteínas cinases
As proteínas cinases e fosfatases desempenham um papel central na transdução de sinal
em eventos celulares, para isso podemos ver na figura 16 a cascata de sinalização das principais
proteínas cinases. Interações entre receptores da superfície celular e seus ligantes extracelulares
(hormônios, fatores de crescimento, citocinas e drogas) ativam a sinalização celular que resulta
em aumento ou diminuição da atividade celular. Atualmente existe pouca informação disponível
a respeito do envolvimento da Na
+
,K
+
-ATPase em cascatas intracelulares de sinalização. Porém,
a subunidade
é alvo de fosforilação por proteína cinase (Bertorello e Katz, 1995).
A PKC dispara uma série de respostas celulares através da fosforilação de várias proteínas
alvo em seus resíduos de Serina e/ou Treonina. Esta proteína é basicamente ativada por dois
segundos mensageiros intracelulares, o diacilglicerol (DAG) e o cálcio. Ela possui
aproximadamente 80 Kda, e é um polipeptídeo com quatro domínios conservados e cinco regiões
variáveis. As regiões conservadas incluem o domínio de ligação para ATP, o domínio de ligação
para o substrato, o domínio de ligação para o cálcio, e o domínio de ligação para o DAG. O
domínio de ligação para o DAG é conhecido como domínio de pseudosubstrato, uma vez que ele
possui uma seqüência de aminoácidos que lembra o substrato (Garrett & Grisham, p.1201-02,
1995). É importante ressaltar que existe várias isoformas de PKC e que possuem distribuição
tecido-específica, conforme mostrado na tabela 3.
47
Tabela 3- Resumo das diferentes isoformas de PKC, distribuição tecidual e seus
respectivos ativadores
. (Battaini F, 2001)
Isoformas de PKC Distribuição tecidual Ativada por:
PKC
Largamente distribuída Cálcio, fosfatidilserina (PS) e
Diacilglicerol (DAG)
PKC
I
Largamente distribuída (níveis
mais baixos)
Cálcio, PS e DAG
PKC
II
Largamente distribuída Cálcio, PS e DAG
PKC
Cérebro e coluna espinhal Cálcio, PS e DAG
PKC
Largamente distribuída PS e DAG
PKC
Cérebro e tecido hematopoiético PS e DAG
PKC
Coração, pulmão e pele PS e DAG
PKC
Tecido hematopoiético, cérebro e
músculo esquelético
PS e DAG
PKC
Largamente distribuída PS, fosfatidilinusitol (PI)- 3, 4, 5 e
trifosfato (P3)
PKC
Cérebro, rim e pulmão PS, fosfatidilinusitol (PI)- 3, 4, 5 e
trifosfato (P3)
PKC
Cérebro, rim e pulmão PS, fosfatidilinusitol (PI)- 3, 4, 5 e
trifosfato (P3)
PKC
(também
denominada PKD)
Pulmão e células epiteliais DAG; PI- 4, 5; Difosfato (P2)
PKC
Largamente distribuída DAG; PI- 4, 5; Difosfato (P2)
48
A holoenzima PKA é um heterotetrâmero, composto por uma subunidade dimérica
regulatória que mantém duas subunidades catalíticas. Quando o AMPc se liga no seu sítio ocorre
uma dissociação da holoenzima, e isto permite que o contato autoinibitório entre a subunidade
regulatória e a catalítica seja desfeito, com a saída da subunidade C ativa (catalítica). A cinase
então está livre para fosforilar substratos que contenham resíduos de serina ou treonina, que
devem estar presentes na seguinte região consenso: Arg-Arg-Xaa-Ser/thr ou Lys-Arg-Xaa-Xaa-
Ser/Thr. Dado a freqüente ocorrência desses padrões de seqüências em diversas proteínas, temos
então um acesso restrito à subunidade C, impedindo que proteínas sejam fosforiladas de forma
indiscriminada. Conseqüentemente, muitos mecanismos regulatórios são dependentes dos níveis
de AMPc. O nível total de AMPc é determinado pelo balanço celular entre adenilato ciclase e
atividades fosfodiesterases, que reduzem os níveis do segundo mensageiro. Apesar de o AMPc
ser requerido para ativação de PKA, fatores adicionais são responsáveis pelo retorno da cinase a
seu estado inativado. A subunidade regulatória é expressa em excesso comparando com a
subunidade catalítica, favorecendo um rápido retorno à holoenzima quando os níveis de AMPc
retornar ao estado basal.
Coghlan e cols. (1993) e Mocchly-Rosen (1995) demonstraram o papel da AKAP
(Proteína ancorada a cinase A), uma proteína específica que está ancorada à subunidade
regulatória da PKA (RII) e não a RI, nas membranas próximas a proteínas-alvo específicas,
regulando sua atividade por fosforilação.
A fosforilação da subunidade
da Na
+
,K
+
-ATPase por proteínas cinases tem sido
proposto como um mecanismo regulatório desta enzima. Os sítios de fosforilação para proteína
cinase A (PKA) e proteína cinase C (PKC) já foram identificados. A subunidade
da Na
+
,K
+
-
ATPase de rato é fosforilada
in vitro por PKC na Ser–18 e por PKA na Ser-938 (Fisone, 1994).
49
Interações entre PKC e PKA na regulação da Na
+
,K
+
-ATPase renal tem sido descrito (Bertorello,
1990). Foi reportado que a fosforilação em
1 por uma PKC era modulada pela presença de uma
PKA, possivelmente pelo estágio de fosforilação na Ser-938 (Borguini, 1994 ; Cheng, 1997).
Zaheer (1997) e Fisone (1998) mostraram que o “cross-talk” entre PKA, cálcio e
fosfolipídeos pode afetar o estágio final de fosforilação da enzima. O “cross-talk” pode ocorrer
em vários níveis: regulando a atividade das cinases, regulando a atividade das fosfatases, ou
afetando diretamente a conformação da enzima, o que implicaria uma exposição ou não dos sítios
de fosforilação. Foi observado que ligantes que estabilizam a Na
+
,K
+
-ATPase em uma
determinada conformação afetam a fosforilação por PKC ou PKA. Logvinenko e colaboradores
(1996) descreve que a fosforilação por PKA é máxima na presença de ligantes que levam a
enzima para a conformação E
1
, enquanto que a fosforilação por PKC é máxima na presença de
ligantes que a levem para a conformação E
2
. Vale acrescentar que a fosforilação por PKA in vitro
é descrita como ocorrer na presença de 0,05 % de triton X-100 (Feschenko e cols., 1994). Deve-
se ressaltar que o tratamento com certos detergentes pode ser lesivo à enzima. Robinson e
colaboradores (1980) sugerem que o triton X-100 inativa a enzima, trancando-a na conformação
E
1
.
Um fator importante de ser mencionado quando se trata de efeitos mediados por PKC é
que esta possui diferentes isoformas, que por sua vez podem desencadear efeitos diferenciados,
como sugerem os resultados obtidos em ovócitos de
Xenopus onde foram injetados diferentes
espécimes de PKC (Vasilets e cols., 1997).
Feschenko e cols. (2000) demonstraram que em células NRK e C6, que expressam
Na
+
,K
+
-ATPase, a fosforilação desta no resíduo de Ser-18 era ativada pelo éster de forbol e
dependente de cálcio. Somente três isoformas (
,
e
) respondem a esta descrição, e apenas a
50
isoforma
mostra uma translocação na membrana basolateral (onde a Na
+
,K
+
-ATPase está
localizada) na presença de PMA. Baseado na sensibilidade a inibidores de proteínas fosfatases,
conclui-se que a defosforilação da Ser-18 ocorre por uma PP1/PP2A. Pedemonte (1997) descreve
que o estímulo de PKC por éster de forbol permite uma ativação do transporte de
86
Rb
+
e reduz os
níveis intracelulares de sódio em células OK. O fato destes efeitos não serem observados nas
células que expressam deleção do N-terminal da subunidade
suporta a hipótese de que esta
região desempenha um papel importante na regulação da Na
+
,K
+
-ATPase mediada por PKC.
Middleton (1993) mostrou que Na
+
,K
+
-ATPase de células epiteliais renais intactas, quando
fosforilada por PKC, é rapidamente inibida, acrescentando que este efeito não é constante,
dependendo da heterogeneidade da isoforma de
1 da enzima.
Em medula renal, o tratamento com dibutiril-AMPc ou 8-bromo AMPc resulta em
maiores níveis de fosforilação da Na
+
,K
+
-ATPase por PKA do que quando temos
forskolina/IBMX, apesar deste sistema elevar os níveis de AMPc, sendo portanto o dibutiril-
AMPc o sistema mais eficiente para estimular a fosforilação por PKA .
Kurihara (2000) publicou os efeitos de uma PKA ancorada (AKAP) na Na
+
,K
+
-ATPase, e
concluiu que a AKAP, mais do que a PKA citossólica, pode desempenhar um papel importante
na regulação da Na
+
,K
+
-ATPase da membrana basolateral de glândulas parótidas através de
várias sinalizações moleculares empregando o AMPc como mensageiro intracelular. Seus
resultados mostraram que, com a adição de AMPc, a subunidade
era rápida e seletivamente
fosforilada pela AKAP endógena com alta eficiência, resultando em uma inibição de sua
atividade.
Féraille (1999) demonstrou que a fosforilação da subunidade
da Na
+
,K
+
-ATPase no
resíduo Tyr-10, localizado na porção NH2-Terminal citoplasmática, participa de um controle
51
fisiológico do Na
+
e da reabsorção de fluidos nos túbulos convolutos proximais renais. Para que
esta fosforilação ocorra é necessário um estímulo via insulina, que provoca em última análise
uma ativação da atividade ATPásica. Existem outros relatos na literatura de fosforilação da
Na
+
,K
+
-ATPase por outras proteínas cinases. Como exemplo, Netticadan (1997) caracterizou a
fosforilação da Na
+
,K
+
-ATPase cardíaca por uma proteína cinase dependente de
Ca
2+
/calmodulina (PKCaM) que provoca uma inibição da atividade catalítica da Na
+
,K
+
-ATPase.
Uma outra possibilidade interessante, no que diz respeito à regulação da atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase, é a fosforilação do FXYD2 por PKA. É importante ressaltar que a fosforilação
só é obtida quando o FXYD2 é fosforilado junto à subunidade
α (Cortes, 2003). Isto poderia ser
um elo entre o sinal hormonal e a resposta fisiológica da enzima nos tecidos que expressam
regularmente o FXYD2, como o rim. Neste contexto, são interessantes os achados de Dowd, e
cols. (1976), que identificaram dois peptídeos de baixo peso molecular como sendo ótimos
substratos para PKA em uma preparação de Na
+
,K
+
-ATPase de coração bovino. Importante que
naquela época não se sabia a natureza destes peptídeos.
Assim como a Na
+
,K
+
-ATPase , a Ca
2+
-ATPase também é alvo de regulação por proteínas
cinases, entretanto seus mecanismos de ação são idênticos. A PKA fosforila predominantemente
a bomba de cálcio em um resíduo de Serina específico que se localiza entre o carboxi-terminal e
o domínio de ligação da calmodulina (James, 1989) A subseqüente fosforilação da Ca
2+
-ATPase
por PKA tem sido reportada como aumentando a atividade desta enzima em sarcolema cardíaco
(Dixon, 1989), no entanto, isto só ocorre através da ligação de calmodulina em seu domínio
(James, 1989).
A seqüência consenso para fosforilação por PKA é restrita à isoforma PMCA1b (Carafoli,
1994). O estímulo da PMCA por PKA não é propriedade de todas as células. Outros fatores
parecem influenciar esta sensibilidade. Para ilustrar, a PMCA de células de músculo liso de aorta
52
mediam o efluxo de Ca
2+
, e são insensíveis ao AMPc, apesar de expressar a PMCA 1b em seu
tecido (Hammes, 1994).
Acredita-se que a ativação da PMCA por PKC, acontece em diversos tipos celulares,
incluindo eritrócitos (Wrigth, 1993), cultura de células de músculo liso de aorta (Furokawa,
1985) e neutrófilos (Lagast, 1984).
A PKC pode atuar fosforilando o resíduo de Treonina que se localiza no sítio de ligação
da calmodulina, e na Serina que se encontra no carboxi-terminal. Apesar da presença de 2 sítios,
a fosforilação ocorre estequiometricamente , sendo em torno de 1 mol de fosfato, para 1 mol de
PMCA. A fosforilação da PMCA é antagonizada pela calmodulina e baixas concentrações de
cálcio. A fosforilação prévia da bomba por PKC atenua a ativação desta enzima pela
calmodulina. Estes resultados sugerem que a fosforilação realmente ocorre no domínio de ligação
da calmodulina. (Wang, 1991).
A estrutura da SERCA foi determinada em uma resolução de 2,6 Ao, sendo então
proposto que o sítio de fosforilação para PKA se localizava no terceiro loop citoplasmático, entre
os segmentos transmembrana de H8 e H9
. (Toyoshima, 2000). Complementando o estudo,
Sweadner e Feschenko (2001) alinhou as sequencias da Ca
2+
-ATPase e da Na
+
,K
+
-ATPase e
examinou a possível disposição dos sítios de fosforilação para PKA na Na
+
,K
+
-ATPase,
concluindo que nesta enzima esta região se localiza dentro da membrana, em um local não muito
acessível nesta conformação. Esta diferença na disposição dos sítios de fosforilação entre PKA e
PKC reforça a informação de que o sítio de fosforilação para PKC está sempre acessível,
enquanto o sítio de fosforilação para PKA é exposto apenas em determinadas condições.
54
Para tentar esclarecer melhor os mecanismos de controle da Na
+
,K
+
-ATPase, PMCA e
SERCA pelo FXYD2 traçamos os seguintes objetivos:
Avaliar a influência do FXYD2 não fosforilado sobre a afinidade da Na
+
,K
+
-ATPase por
ATP, bem como na V
max
.
Verificar se o FXYD2 pode ser fosforilado por PKC
Verificar a influência do FXYD2 não fosforilado ou fosforilado por PKA, PKC ou por
PKA e PKC sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase.
Verificar a influência do FXYD2 não fosforilado ou fosforilado por PKA, PKC ou por
PKA e PKC sobre a atividade e a captação de cálcio da PMCA.
Verificar a influência do FXYD2 não fosforilado sobre a atividade da SERCA
Determinar para qual conformação da Na
+
,K
+
-ATPase o FXYD2 possui maior afinidade
56
3.1- Purificação da Na
+
,K
+
-ATPase :
A Na
+
, K
+
-ATPase foi purificada a partir da medula renal externa de rim de porco pelo
método de Jorgensen (1975), com as modificações descritas por Jensen e cols. (1984). A
preparação (estoque) foi armazenada a -30
C em um tampão de estocagem (12,6 mM imidazole,
0,625 mM EDTA, 250 mM sacarose, pH 7,4 acertado com HCl). A atividade ATPásica medida a
uma temperatura de 37
C ficou em torno de 8-11 µmoles.mg
-1
.min
-1
, valores compatíveis com
preparações funcionais de alta pureza. A concentração de proteína foi medida de acordo com o
método de Lowry e cols
. (1951), utilizando albumina de soro bovino como padrão. Cerca de
99,8% da atividade ATPásica desta preparação é inibida por ouabaína (1mM), atestando a pureza
desta preparação.
3.2- Preparação do ghost:
A preparação de membrana plasmática de eritrócitos de porco (ghost) foi feita de acordo
com a metodologia descrita por Rega e colaboradores (1979). As hemácias foram separadas do
plasma e dos leucócitos por centrifugação a 5000 x g por 10 min., ressuspensas em tampão
contendo 20 mM de Tris-HCl pH 7.4, 130 mM de KCl e 0.6 mg/ml de PMSF, sendo em seguida
centrifugadas a 5000 x g por 10 min. O precipitado foi submetido a congelamento em N
2
líquido
e posterior descongelamento em temperatura ambiente, para a lise das células e em seguida
ressuspenso em tampão contendo: 5 mM de Hepes pH 7.4, 1mM de EDTA e 0.6 mg/mg de
PMSF, sendo centrifugado, posteriormente, a 7000 x g por 10 min. Este passo foi repetido 4
vezes, sendo a última lavagem feita na ausência de PMSF e de EDTA. O precipitado foi
novamente ressuspenso em tampão contendo 10 mM de Tris-HCl pH 7.4, 130 mM de HCl, 0.5
mM de MgCl
2
e 50M de CaCl
2
; e centrifugado a 7000 x g por 10 min. Essa etapa foi repetida 1
57
vez e o precipitado ressuspenso no mesmo tampão e estocado em N
2
. A concentração de
proteínas totais foi dosada pelo método de Lowry e cols. (1951).
3.3- Extração do FXYD2
A preparação é obtida conforme descrito em Fontes e cols. (1999). A Na
+
,K
+
-ATPase
(cerca de 900 µg) da medula renal de porco é adicionada sob agitação vigorosa, a uma mistura
(%, v/v) de 46% metanol, 46% clorofórmio e 8% de 750 mM NH
4
HCO
3
(pH 7,4) que depois é
centrifugado a 1000 rpm por 1 minuto. O sobrenadante (que contém o OBPF) é retirado e seco
em alguns minutos utilizando-se um banho de bloco a 37
0
C, sob vapor de N
2
.
3.4- Síntese do [
-
32
P] ATP:
O ATP radioativo foi sintetizado através de uma seqüência de reações enzimáticas,
envolvendo algumas enzimas da via glicolítica, descrita por Maia e cols. (1983) e purificado
através de cromatografia em microcoluna (0.5 cm x 1 cm) de resina DOWEX - AG-100,
(trocadora de ânions). Na coluna, o fosfato radioativo não incorporado, além de cátions
indesejáveis, são removidos por lavagens sucessivas com água e 20 mM de HCl. Logo após, é
realizada uma eluição específica do ATP marcado com 0,25 M de HCl, e as amostras são
neutralizadas, em banho de gelo, pela adição de aproximadamente 10% do volume total do eluído
com Mes-Tris 50mM (pH 6,0) , corrigindo-se o pH final com Tris-base até pH 7,0 para posterior
uso. Os índices de Pi contaminante observados após o procedimento de marcação do ATP
estiveram abaixo de um limite de 1-2 %.
3.5- Análise por gel de poliacrilamida SDS-PAGE das proteínas fosforiladas por
cinases
As eletroforeses foram realizadas em gel de poliacrilamida de acordo com a técnica de
Laemmli (1970), usando um sistema de acrilamida bis acrilamida de 15% para o gel de resolução
58
e 4% para o gel de concentração com um pH 8,8 e 6,8; respectivamente. Todas as corridas foram
realizadas a 20 mA de corrente constante. O corante azul de bromofenol foi usado como
marcador da frente de migração da amostra no gel. O gel foi corado com coomassie Blue R,
etanol e ácido acético e descorado com 30% de metanol e 8 % de ácido acético, e posteriormente
foi desidratado em uma solução contento 30% de metanol e 5% de glicerol. O gel foi exposto
durante 12 horas em um cassete. E depois scaneado pelo Phosphoimager STORM (Molecular
Dynamics).
Preparo das amostras aplicadas no gel:
As amostras contendo 20µg de proteína/ml de
Na
+
,K
+
-ATPase foram incubadas a 27
0
C na presença de KCl 100 mM, EGTA 1 mM, MgCl2 10
mM, DTT 1 mM, fosfatidilserina 80 µg/ml, Hepes pH 7,4 20 mM, PMA 100nM, H-89 200nM ,
para observar a fosforilação por cinases endógenas. A enzima foi preincubada 20 minutos com os
ativadores e inibidores de proteína cinase, FXYD2 e 5 minutos com ouabaína. O experimento foi
realizado na ausência ou na presença de sódio 120 mM.
3.6- Método para isolar o FXYD2 fosforilado por cinases
Para utilizar FXYD2 fosforilado isolado, a enzima purificada de medula renal de porco
(900µg) foi preincubada por 5 minutos com os ativadores e/ou inibidores de proteínas cinases A e
C, e o tempo de fosforilação foi de 60 minutos a 27
C. Posteriormente, esta enzima fosforilada
foi submetida ao tratamento com metanol e clorofórmio conforme descrito por Fontes e cols.
(1999). Os meio de reação para fosforilação pelas proteínas cinases foram: Fosforilação do
FXYD2 por PKA e PKC: KCl 100 mM, EGTA 1 mM, MgCl
2
10 mM, DTT 1 mM, Hepes 20
mM PH 7,4, fosfatidilserina 80 µg/ml, PMA 100 nM, dibutiril AMPc 0,5 mM, Triton X-100
0,05%, ATP 100 µM. Fosforilação do FXYD2 por PKA
: KCl 100 mM, EGTA 1 mM, MgCl2
10 mM, DTT 1 mM, Hepes 20 mM pH 7,4, dibutiril-AMPc 0,5 mM, triton X-100 0,05%,
59
Queletrina 3,6 µM, ATP 100µM. Fosforilação do FXYD2 por PKC: KCl 100 mM, EGTA 1 mM,
MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, Hepes 20 mM pH 7,4, fosfatidilserina 80 µg/ml, PMA 100 nM, H-
89 200 nM, ATP 100 µM.
3.7- Análise do FXYD2 fosforilado através de western-blot:
A enzima foi fosforilada por PKA e/ou PKC conforme descrito acima, sendo o FXYD2
então extraído conforme descrito por Fontes e cols. (1999). Primeiramente um gel de SDS-PAGE
foi realizado e as proteínas foram trasnferidas para uma membrana de PVDF (marca) utilizando
um semy-dry (Bio-Rad) a 200mA durante 4 minutos. Após, a membrana foi incubada overnight
em uma solução que continha: albumina bovina 3%, tween 20 0.1% e TBS (o que tem). No dia
seguinte a solução de bloqueio foi desprezada e adicionou-se o anticorpo policlonal
antifosfoserina (calbiochem) com uma diluição de 1:1000 durante 2 horas. Após a membrana foi
lavada com o mesmo tampãp de bloquio e incubada por 1 hora com o anticorpo secundário IGg,
anti-coelho (Amershan, pharmacia Biotech). Um kit ECL (Amershan, pharmacia Biotech) com
ação peroxidase foi utilizado para revelar a radiografia.
3.8- Determinações da Atividade ATPásica:
A atividade das diversas ATPases tipo P utilizadas nesta tese foi medida pela quantidade
de [
32
Pi] liberado por hidrólise do [
32
P]ATP. A atividade foi determinada de acordo com
Grubmeyer e Penefsky (1981). Com a Na
+
K
+
-ATPase, a reação foi iniciada com a adição de 3
mM de Na-ATP em meio contendo 130 mM de NaCl, 2 mM de MgCl
2
, 0,1 mM de EGTA, 20
mM de KCl, 10 mM de Hepes/Tris pH 7,4, a 37
o
C. Com a PMCA a reação foi iniciada com a
adição de 1 mM ou 20 µM de Na-ATP em um meio contendo 20 mM de BTP-HCl pH 7,0, 80
mM de KCl, 0,5 mM de MgCl
2
, 0,2 mM de EGTA, 1 mM de ouabaína e 20 µM de Ca
2+
livre, a
37
o
C. A atividade da Ca
2+
-ATPase foi medida na presença de 0.1 mg/ml de calmodulina e na
60
ausência da mesma, para observarmos o efeito tanto no estado basal como no estado ativado
desta enzima. Para medirmos a atividade da SERCA a reação foi iniciada com a adição de 10 µM
ou 2 mM de ATP em um meio contendo Tris-HCl pH 7,4 30 mM, MgCl
2
4 mM, KNO
3
100 mM,
Ouabaína 0,5 mM, EGTA 0,2 mM, azida 5 mM, cálcio 1µM (livre), e SERCA de músculo
(2.5µg/ml) ou SERCA de cérebro (5 µg/ml)
3.9- Preparação das vesiculas Inside out (IOVs) :
As vesículas foram preparadas a partir de 1,5 mg de ghost que foi centrifugado a 12500
rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspenso em um tampão
contendo 12,5µl de Hepes 0,2 M pH 7,5 e 10 µl EDTA-Tris 0,2 mM em um volume final de 1
ml. Depois a suspensão foi centrifugada a 12500 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi
descartado novamente, e o pellet foi incubado a 37
C por 60 minutos. Feito isto o pellet é passado
7 vezes em uma agulha de insulina e foi ressuspenso em um tampão contendo 300 µl de HEPES
2,5 mM pH 7,5.
3.10- Captação de cálcio:
As IOVs (85 µg/ml) foram adicionadas em um meio contendo: Tris-HCl 20 mM a pH 7,4,
MgCl
2
5 mM, NaATP 2mM, KCl 100mM, calmodulina 2µg/ml, 100 µM [
45
Ca] CaCl
2
(2.22 x 10
6
com/nmol). A suspensão foi filtrada em filtros Millipore (HAWP 0,45 µm) e lavado 3 vezes
com um tampão contendo LaCl
3
2 mM, MOPS 20mM, KCl 100 mM. Os filtros radiotaivos foram
contados por cintilação líquida. Um controle com triton X-100 0,01% foi realizado.
61
3.11- Análise da ligação do FXYD2 através de microcalorimetria por titulação
istoérmica.
Para este experimento foi utilizado o instrumento de titulação isotermal de calorimetria (VP-ITC,
MicroCal, Northampton, USA). As células contendo o meio de reação (2ml) foram preenchidas
com as soluções descritas abaixo e equilibradas a uma temperatura de 36
C. Depois de atingido o
equilíbrio, um período adicional foi necessário para gerar a linha de base utilizada nas análises
subseqüentes. Antes de iniciar os experimento o meio de reação foi deaerado (TermoVac,
MicroCal) por 5 minutos antes de adiciona-lo a célula. A agitação foi mantida em 307 rpm e o
fluxo de calor (µcal S-1) foi medido em função do tempo. A medida do calor de interação do
FXYD2 com a Na
+
,K
+
-ATPase foi iniciado com a injeção de 10µl de enzima (5µg) e medido
durante 30 minutos. Meio com sódio: NaCl
2
120 mM ou KCl
2
30mM e Tris-HCl 10 mM, MgCl
2
5 mM, 20% do volume final do meio de reação de FXYD2.
3.12- Reagentes utilizados:
Todos os sais e tampões utilizados nesta tese são de grau analítico e foram fornecidos em
sua maioria pela Sigma Chemical Co (MO, Estados Unidos). O Me
2
SO usado foi proveniente da
Riedel-de-Haëen e da Malinkrodft e atingem especificações para espectroscopia (Chromasolv
).
O
32
Pi foi fornecido pelo Instituto Brasileiro de Pesquisas Nucleares na forma de ácido
fosfórico livre de carreador e foi sempre utilizado após uma purificação prévia em coluna de
troca iônica de acordo com o método descrito por Kessler e cols. (1986). As enzimas utilizadas
na marcação de ATP foram fornecidas pela Boehringer-Mannheim (Alemanha). A ouabaína
tritiada foi fornecida pela New England Nuclear (NEN, DUPONT) (MA, Estados Unidos).
63
4.1- Influência do FXYD2 na afinidade por ATP e na V
max
da Na
+
,K
+
-ATPase.
Alguns trabalhos têm mostrado a influência do FXYD2 sobre a afinidade da Na
+
,K
+
-
ATPase por Na
+
e K
+
(Arystarkhova e cols., 1999). Quando o FXYD2 foi incubado em condições
saturantes de Na
+
e K
+
junto a Na
+
,K
+
-ATPase observamos apenas efeito na afinidade por ATP,
com uma pequena redução da afinidade aparente do 20
K
m
. Entretanto efeitos consideráveis
foram observados em ambas as V
max
(ou seja, tanto no sítio catalítico, quanto no regulatório).
Estas apresentam um aumento de 69, 2 % para Vmax1 e 30,7% para
V
max
2. (figura 17). Uma
tebela foi elaborada para uma melhor visualização dos parâmetros cinéticos (tabela 4).
64
Figura 17- Influência do FXYD2 na afinidade por substrato e na V
max
da Na
+
,K
+
-ATPase.
Os símbolos fechados representam o controle e os símbolos abertos representam a enzima na
presença de FXYD2. Uma quantidade fixa de FXYD (10% do volume final de reação) foi
adicionada a 50 µg/ml de enzima nativa e preincubada por 20 minutos. Antes de iniciar a reação.
As curvas foram ajustadas usando a equação de Michaelis-Menten modificada (n= (V
max1
[S ]/
K
m1
+ [S] ) + (V
max2
[S] / K
m2
+ [S] ), considerando 2 sítios de ligação para ATP, utilizando o
programa SigmaPlot para Windows, versão 8.0. Para uma melhor visualização as concentrações
iniciais foram expandidas no inset. Estas são médias de 4 experimentos, realizados em triplicata.
Cortes et al., 2005 - Figura 3
ATP (M)
0 200 400 600 800 1000 2000 3000
Na
+
, K
+
-ATPaseM.mg
-1
.min
-
1
)
0
2
4
6
8
10
12
14
ATP (M)
0 5 10 15 20 25
Na
+
,K
+
-ATPase (M.mg
-1
.min
-1
)
0
1
2
3
4
65
Tabela 4- Efeito da adição de FXYD2 nos parâmetros cinéticos para hidrólise de ATP pela
Na
+
, K
+
-ATPase. Os dados experimentais foram quantificados utilizando o programa SigmaPlot
para Windows 8.0. Os dados representam as médias de 4 experimentos, realizados em triplicata.
Estes dados foram obtidos a partir da análise da figura 19.
0,0009
13,73
0,1810,50
10,50
V
max
2
(µmoles/mg/min)
0,0047
364,02
7,75242,7
8,57
Km 2 (µM )
0,0081
3,03
0,051,79
0,09
V
max
1
(µmoles/mg/min)
0,3460
1,51
0,191,99
0,08
Km 1 (µM)
Valor de P
(Student
t-
Test
Adição de
FXYD2
ControleParâmetros
66
4.2- Fosforilação do FXYD2 por subunidade catalítica de PKC na presença e na ausência de
sódio
Demonstramos em trabalho de nosso grupo anexado (Cortes, 2006) que o FXYD2 pode
ser fosforilado por PKA. Esta tese mostra que a fosforilação do FXYD2 é capaz de aumentar a
atividade da Na
+
,K
+
-ATPase em 5 vezes. E que, além de ser fosforilado por PKA, também é
passível de fosforilação por PKC. A figura 18 mostra que o FXYD2 pode ser fosforilado por
PKC, porém somente quando interage com as subunidades
e da Na
+
,K
+
-ATPase. Na presença
ou na ausência de sódio não ocorre diferença significativa de fosforilação. Na presença de
ouabaína a fosforilação do FXYD2 diminui 35% na ausência de sódio, enquanto na presença
deste íon nenhuma diferença significativa é encontrada. Com surpresa observamos que ao
adicionar o FXYD2 a Na
+
,K
+
-ATPase nativa o grau de fosforilação deste peptídeo diminui em
67% e 70%, na presença ou na ausência de sódio respectivamente. Na presença de ouabaína a
inibição foi de 60% e 50% na presença ou ausência de sódio respectivamente. Um controle
somente na presença de PKC foi realizado e observamos que o grau de auto-fosforilaçao desta
cinase foi constante em todas as condições.
Interessante que tanto para o FXYD2, quanto para subunidade
a fosforilação parece ser
dependente da conformação enzimática, parecendo a conformação E1 ser a mais favorável para
este evento. Assim como ocorre na fosforilação deste peptídeo por PKA (Cortes e cols, 2006), a
fosforilação do FXYD2 por PKC só ocorre quando este peptídeo está associado a subunidade
,
sugerindo que o resíduo de fosforilação possam ser o mesmo ou estarem bem próximos.
67
Figura 18- Fosforilação do FXYD2 por PKC comercial na presença e na ausência de sódio.
O meio de fosforilação continha: Hepes pH 7,4 20 mM, KCl 100 mM, EGTA 1 mM, MgCl
2
10
mM, DTT 1mM, PS 80 µg/ml, CaCl 120 mM, H-89 200 nM, subunidade catalítica de PKC 20
mu, ATP 100 µM e 30 µg de Na
+
,K
+
-ATPase purificada de medula renal de porco. Gráfico (A)
na ausência de Na
+
e gráfico (B) na presença de 120mM de Na
+
. A enzima foi preincubada com
os reagentes por 5 minutos, e com o FXYD2 por 20 minutos. O tempo de fosforilação foi de 5
minutos a 27 °C. As barras são médias de três experimentos e foram obtidas a partir da
densitometria das bandas mostradas no inset.
inset:
Representa um dos 3 experimentos
realizados, as condições nas linha 1 a 7 estão de acordo com o que está mostrado nas barras. A
seta indica a condição controle onde foi adicionada apenas subunidade catalítica de PKC.
4.3- Análise através de western-blot do FXYD2 fosforilado.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0
10000
20000
30000
40000
Intensidade da banda de fosorilação
(unidades arbitrárias)
Enzyma + + - + + -
FXYD2 - + + - + +
Ouabaína - - - + + +
A
B
Auto fosforilação
de PKC
FXYD2
fosforilado
Auto fosforilação
de PKC
FXYD2
fosforilado
*
Enzima
FXYD2
Ouabaína
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7
68
É sabido que os peptídeos FXYD possuem regiões consenso de fosforilação por PKA e/ou
PKC, como no caso do fosfolemman (Therien e Blostein, 2000). Portanto para confirmar se o
FXYD2 realmente estaria sendo fosforilado por PKA e PKC, realizamos um western-blot com
anticorpo contra fosfoserina e fosfotreonina. O resultado mostrou que o método utilizado para
fosforilar e isolar o FXYD2 fosforilado são viáveis. Portanto, na figura 19a, utilizando-se o
anticorpo anti-fosfoserina detectamos quantidade significativa de serina fosforilada na condição
em que o FXYD2 era fosforilado por PKA e PKC ou somente por PKA, não sendo detectado no
peptídeo fosforilado por PKC. Por outro lado, ao utilizarmos o anticorpo anti-fosfotreonina,
grande quantidade de treonina fosforilada foi detectada no peptídeo fosforilado por PKA e PKC
ou somente por PKC (figura 19b).
Este resultado é importante pois mostra que a fosforilação do FXYD2 por PKA e PKC
ocorrem em resíduos diferentes. A fosforilação por PKA ocorre preferencialmente em um resíduo
de serina, enquanto a fosforilação por PKC ocorre preferencialmente em um resíduo de treonina.
Avaliando este experimento sugerimos um importante ponto regulatório, sendo
imprencindivel avaliar os efeitos deste peptídeo fosforilado pela diferentes cinases na atividade
de diversas ATPases.
69
Figura 19- Análise através de Western Blot com anticorpo anti-fosfoserina e anti-
fosfotreonina.
A Na
+
,K
+
-ATPase foi previamente fosforilada por proteínas cinases e depois o
FXYD2 foi extraído, conforme descrito em materias e métodos. (A) Um anticorpo policlonal
contra fosfoserina. Linha 1 - FXYD2-np, Linha 2 - FXYD2-PKA/PKC, Linha 3 - FXYD2-PKA,
Linha 4 – FXYD2-PKC. (B) Anticorpo contra fosfotreonina. Linha 1- FXYD-np, Linha 2-
FXYD- PKA, Linha 3- FXYD- PKC e linha 4- FXYD- PKA/PKC. Este dado é a representação
de um experimento de uma série de três.
4.4- Efeito do FXYD2 Sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal de porco.
Anti-Fosfoserina
1 2 3 4
Anti-fosfotreonina
1 2 3 4
A
B
70
Alguns estudos mostram que a fosforilação da subunidade
da Na
+
,K
+
-ATPase por PKA
levaria a uma diminuição da atividade desta enzima em 80% em se tratando de membranas cruas
de rim de coelho (Delamere e cols., 1990) ou em 19% em células intactas (Fisone, 1994). Então,
através dos resultados obtidos anteriormente, em que mostramos ser possível a isolar o FXYD2
fosforilado resolvemos avaliar seus efeitos sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase. Para isso
realizamos testes na presença do FXYD2-np, FXYD2-PKA/PKC, FXYD2-PKA e FXYD2-PKC.
Estes resultados mostraram um notável aumento da capacidade do FXYD2 de modular atividade
da Na
+
,K
+
-ATPase quando fosforilalado por PKA e/ou PKC, situações em que este ativou em
cerca de 5 vezes a atividade da enzima. Importante que o FXYD2-np também aumentou a
atividade desta enzima 2 vezes (figura 20).
Devo acrescentar que esta enzima já possui uma quantidade de FXYD2, e que neste
momento estamos oferecendo um excesso deste peptídeo. Através deste experimento mostramos
um considerável ponto regulatório deste peptídeo, principalmente ao tratarmos de um tecido que
normalmente expressa o FXYD2, e levando em consideração a função de controle dos níveis de
sódio, e de extrema uma importância um controle mais rigoroso da Na
+
.K
+
-ATPase.
-ATPase (µmoles/mg/min)
10
12
14
Enzima
Enz + FXYD2-np
Enz + FXYD2-PKA/PKC
Enz + FXYD2-PKA
Enz + FXYD2-PKC
71
Figura 20- Efeito do FXYD2 fosforilado por cinases endógenas na Atividade Na
+
,K
+
-
ATPásica de medula renal de porco
. O FXYD2 fosforilado foi obtido a partir da Na
+
,K
+
-
ATPase purificada de medula renal de porco que foi previamente fosforilado por proteínas
cinases conforme indicado na figura. Posteriormente, o FXYD2 foi extraído conforme materiais e
métodos. A atividade ATPásica foi medida em um meio contendo: NaCl 120 mM, KCl 20 mM,
Tris-HCl 10 mM pH 7,4, MgCl
2
1 mM, Na-ATP 3 mM, 3 µg/ml de Na
+
,K
+
-ATPase purificada .
O tempo de hidrólise foi de 2 minutos a 37
o
C. Estas são médias de 4 experimentos realizados em
triplicata. * indica valor de P£ 0,01.
4.5- Efeito do FXYD2 na atividade da Na
+
,K
+
-ATPase de eritrócito de porco.
*
*
*
*
72
Diversos trabalhos atualmente mostram a interação de outros membros da família FXYD
com a Na
+
,K
+
-ATPase. , sendo reportados os efeitos do PLM (Zhang e cols., 2006), Mat-8
(Crambert, e cols., 2005), CHIF (Jespersen, e cols., 2006), FXYD 7 (Crambert, e cols., 2003),
FXYD 10 (Cornelius e Mahmoud, 2007). Devido ao fato dessas proteínas serem expressas em
diferentes tecidos, surge a hipótese de que estas realmente agiriam como moduladores tecido-
específicos da Na
+
,K
+
-ATPase. Com base nesses resultados descritos na literatura avaliamos a
possibilidade do FXYD2 interagir com a Na
+
,K
+
-ATPase de eritrócito de porco, uma vez que,
esta enzima não expressa este peptídeo. O FXYD2-np aumentou a atividade ATPásica desta
enzima em 54%, e quando fosforilado previamente por PKA e PKC, ou somente por PKA e
somente por PKC, não ocorre efeito coletivo em relação ao FXYD2-np, pois obtivemos uma
ativação de 60, 80 e 56%, respectivamente. (figura 21).
Para esta enzima, o fato do FXYD2 ser fosforilado não interfere na regulação de sua
atividade ATPásica, sugerindo que a regulação deste peptídeo por fosforilação só é importante
para o tecido que normalmente o expressa, a Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal. Mais ainda
notamos que este peptídeo é capaz de interagir e sutilmente modular a atividade da Na
+
,K
+
-
ATpase de eritrócito.
73
Figura 21- Efeito do FXYD2 fosforilado por cinases endógenas na Na
+
,K
+
-ATPase de
eritrócito.
O FXYD2 fosforilado foi obtido conforme descrito em materias e métodos, sendo
então testado na atividade ATPásica da Na+, K+-ATPase de eritrócito de porco. Esta atividade
foi medida em um meio contendo: NaCl2 120 mM, KCl2 20 mM, Hepes-Tris pH 7,4 10 mM,
MgCl 2 2 mM, EGTA 0.1 Mm, Na-ATP 3mM, 100 µg/ml de enzima. O tempo de hidrólise foi de
60 minutos a 37 °C. * indica valor de P
0,01
Incremento da atividade
Na
+
,K
+
-ATPásica de eritrócito (%)
0
50
100
150
200
250
Enzima + FXYD2-np
Enz + FXYD2-PKA/PKC
Enz + FXYD2/PKA
Enz + FXYD2/PKC
Enzima
*
*
*
*
74
4.6- Efeito do FXYD2 sobre a PMCA de eritrócito de porco.
É sabido que os membros da família FXYD interagem com diversas isoformas da Na
+
,K
+
-
ATPase, a exemplo do que observamos no resultado anterior. Portanto seria de grande interesse
avaliar se o FXYD2 poderia interagir com outras ATPases do tipo P. Neste experimento
mostramos que o FXYD2-PKA/PKC FXYD2-PKA e o FXYD2-PKC aumentam a atividade
desta enzima em 3, 1,8, e 2 vezes, respectivamente, na ausência de calmodulina (figura 22 A). Na
presença de calmodulina (Figura 22 B) o FXYD2-np aumentou 3 vezes a atividade enzimática e
na presença do FXYD2-PKA/PKC aumentou 2,5 vezes. Quando adicionamos o FXYD2/PKC
ocorreu um incremento de 35% da atividade. Curiosamente, quando adicionamos o FXYD2-PKA
observamos uma inibição de 50 % da atividade enzimática em relação ao controle na ausência
deste peptídeo.
A regulação da PMCA pelo FXYD2 já é um resultado fascinante, imagine a regulação
desta enzima por este peptídeo fosforilado por diferentes cinases. É justamente isso que nos traz
este resultado. A PMCA tem sua atividade aumentada ou inibida dependendo da fosforilação do
FXYD2, mostra que dependendo da sinalização hormonal a PMCA ficará mais ou menos ativa,
sugerindo ser um evento importante principalmente para manifestação de alguma doença renal.
75
Figura 22- Efeito do FXYD2 fosforilado por cinases endógenas na Atividade Ca2+-
ATPásica de eritrócito de porco
. A concentração de proteína utilizada foi 0,1 mg/ml. Na figura
A, o meio continha 0,20 mM de CaCl2, 80 mM de KCl, 0,2 mM de EGTA, 20 mM de BTP-HCl
pH 7,0, 0,5 mM de MgCl2. A proteína foi preincubada com o FXYD2 por 20 minutos e o tempo
de hidrólise foi de 20 minutos. Na figura
B, o meio de reação foi o mesmo, com adição de CaM a
uma concentração de 0,1 mg/ml, e o tempo de hidrolise foi de 30 minutos. * indica valor de P
0,01
0
100
200
300
400
Enzima
Enz + FXYD2-np
Enz + FXYD2-PKA/PKC
Enz + FXYD2-PKA
Enz + FXYD2-PKC
Incremento da Atividade Ca
2+
-ATPásica (%)
0
100
200
300
400
*
*
*
*
*
*
A
B
76
4.7- Captação de Ca
2+
pela PMCA na presença do FXYD2
Para certificar de que o resultado acima é realmente um efeito direto do peptídeo sobre a
PMCA e que ele não está agindo como um desacoplador, avaliamos o efeito deste peptídeo
fosforilado ou não fosforilado na captação de cálcio pela PMCA. Então, corroborando o dado
anterior, mostramos na figura 23, que o FXYD2 atua também na captação de Ca
2+
pela PMCA.
Para isso foram utilizadas vesículas inside-out (IOV), que foram preparadas conforme descrito
nos materiais e métodos. O FXYD2-np aumentou 2 vezes a captação de Ca
2
. Quando o FXYD2-
PKA/PKC era incubado junto com as IOVs, o aumento na captação foi de 1,5 vezes. O FXYD2-
PKC não foi capaz de exercer efeitos, comparando-se a captação na ausência de FXYD2.
Entretanto o FXYD2-PKA inibiu em 50% a captação de Ca
2
pelas vesículas. Este resultado
quando comparado ao dado anterior, mostra que o FXYD2 não desacopla a PMCA e que pode ser
um importante regulador fisiológico desta ATPase.
Através deste resultado mostramos que o FXYD2 é um potente regulador da atividade da
PMCA, sendo a fosforilação deste peptídeo crucial para este evento. O resultado da captação
reforça grandemente o dado anterior e mostra que o FXYD2 não age como um desacoplador da
PMCA.
77
Figura 23- Efeito do FXYD2 na captação de Ca
2+
pela PMCA de eritrócitos de porco. As
IOVs (85 µg/ml) foram incubadas por 20 minutos com o FXYD2, e após adicionadas em um
meio contendo Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), MgCl
2
5 mM, NaATP 2 mM, KCl 100 mM,
calmodulina 2µg/ml, 100 µM [
45
Ca] CaCl
2
(2,22 x 10 6 com/nmol). A captação de Ca
2+
foi
medida nos tempos indicados. A suspensão foi filtrada em filtros millipore (HAWP 0,45 µm) e
lavadas 3 vezes com um tampão gelado contendo LaCl
3
2 mM, MOPS 20 mM, KCl 100 mM. A
radiação retida nos filtros foi medida por cintilação líquida. Um controle com 0,1% de triton foi
realizado.
Tempo (minutos)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Captação de cálcio (nmoles Ca
2+
/
mg PTN)
0
5
10
15
20
controle
FXYD-np
FXYD2-PKA/PKC
FXYD2-PKA
FXYD2-PKC
78
4.8- Efeito do FXYD2 sobre a SERCA
Já que mostramos nesta tese que o FXYD2 é capaz de interagir e modular a atividade da
PMCA tornou-se imprescindível avaliar os efeitos deste peptídeo na SERCA. Quando o FXYD2-
np foi incubado com a SERCA de músculo esquelético observou-se um aumento discreto da
atividade ATPásica desta enzima em altas concentrações de ATP (em torno de 33%). Em
condições não saturantes de ATP nenhum efeito significativo ocorreu para esta isoforma. Já em
preparações de SERCA de cérebros não foram observados efeitos significativos, em alta ou baixa
concentração de ATP (figuras 24 e 25).
Apesar da alta similaridade entre a SERCA e a PMCA o FXYD2 não foi capaz de
modular a atividade da SERCA. Apenas observamos uma ativação muito pequena em uma
condição especial com baixa concentração de ATP na isoforma de músculo esquelético.
Através deste resultado não podemos afirmar que não há interação, apenas que não há
modulação desta enzima por este peptídeo, sendo interessante avaliar futuramente através ed
experimentos de calorimetria se há interação entre a SERCA e o FXYD2.
79
Figura 24- Efeito do FXYD2 na Serca de músculo esquelético. O meio de reação
continha, Tris-HCl (pH 7,4) 30 mM, MgCl2 4 mM, KNO3 100 mM, Ouabaína 0,5 mM, EGTA
0,2 mM, Azida 5 mM, CaCl2 1 µM, enzima 2,5 µg/ml, Na-ATP 2 mM e CaM 0,1 mg/ml. Figura
A, em condições saturantes de ATP (2 mM) e figura em condições não saturantes de ATP (10
µM). A enzima foi preincubada com o FXYD2 por 20 minutos, e o tempo de hidrólise foi de 20
minutos a 37 °C. ** indicam valor de P
0,05.
10 µM ATP
0 20 40
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
2 mM ATP
0 20 40
Atividade (µmoles/ mg/ min)
0
10
20
30
40
FXYD2 (µl)
*
*
A
B
80
Figura 25- Efeito do FXYD2 na Atividade da SERCA de cérebro. O meio de reação
continha, Tris-HCl (pH 7,4) 30 mM, MgCl2 4 mM, KNO3 100 mM, Ouabaína 0,5 mM, EGTA
0,2 mM, Azida 5 mM, CaCl2 1 µM, enzima 5 µg/ml, Na-ATP 2 mM e CaM 0,1 mg/ml. Figura
A
em condições saturantes de ATP (2 mM) e figura B em condicões não saturantes de ATP (10
µM). A enzima foi preincubada com o FXYD2 por 20 minutos, e o tempo de hidrólise foi de 20
minutos a 37
C.
Plot 1
2 mM ATP
0 20 40
0
1
2
3
4
5
6
10 µM ATP
0 20 40
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Atividade(µmoles/ mg/ min)
FXYD2 (µl)
A
B
81
4.9- Análise da ligação do FXYD2 a enzima nativa através de ITC.
Até o momento avaliamos a influência do FXYD2 sobre a atividade enzimática. No
entanto, pouco se conhece sobre a interação deste peptídeo com a Na
+
,K
+
- ATPase. Portanto,
realizamos experimentos de calorimetria para tentar detectar em que conformação da enzima o
FXYD2 interage com maior afinidade. Em resultados preliminares mostramos que o FXYD2
interage com maior afinidade com a isoforma E
1
da enzima. Isto foi corroborado pelos resultados
obtidos com ITC, como podemos observar na figura 26. Na conformação E
2
, a interação
acontece, porém de uma forma muito mais lenta.
Este resultado em associação com a fosforilação do FXYD2 por PKC (figura 13)
reforçam o resultado de calorimetria, pois também observamos que a fosforilação do FXYD2 por
PKC era possivelmente facilitado pela enzima na conformação E1.
Pretendemos ainda, realizar experimentos no DSC para avaliar melhor a interação deste
peptídeo não só com a Na
+
,K
+
-ATPase, mas também com a PMCA e com SERCA, nos diferentes
estados de fosforilação do FXYD2.
82
Figura 26- Ligação do FXYD2 na Na
+
,K
+
-ATPase: Medida através de ensaio calorimétrico
pelo ITC.
O meio continha Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MgCl2 5 mM, NaCl2 120 mM ou KCl 20
mM. A quantidade de FXYD 2 foi 20% do volume final de reação. A variação de calor,
representada em µcalorias, foi medida durante 30 minutos.
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
Na+
K+
Tempo (min)
µcal/seg
84
Demonstramos nesta tese os efeitos da interação do FXYD2 com a Na
+
,K
+
-ATPase, e
com outras P-ATPases. O FXYD2 não altera a afinidade da Na
+
,K
+
-ATPase por ATP, mas
aumenta a
V
max1
de hidrólise de ATP em 70% para o primeiro sitio de ligação do nucleotídeo
(sítio catalítico). Este evento tem um efeito positivo no sítio regulatório, que sofre um aumento de
30% em sua
V
max2
(fig 17 e tab 4). Esta é a primeira vez em que é mostrada, de forma efetiva, o
efeito direto do FXYD2 na velocidade máxima de hidrólise do ATP. Isto sugere que os efeitos do
FXYD2 na hidrólise de ATP não são restritos ao aumento da afinidade por este nucleotídeo,
mesmo porque nossos resultados mostram que o FXYD2 aumenta apenas sutilmente a afinidade
pelo ATP para o primeiro sitio e por outro lado, reduz a afinidade aparente para o segundo sitio
de ligação do ATP. Somos o primeiro grupo que mediu efeitos diretos do FXYD2 na eficiência
de catálise da Na
+
,K
+
-ATPase.
Mahmmoud e cols (2000) identificaram um proteolipídeo associado a subunidade
, em
glândula retal de tubarão, sendo denominado fosfoleman-like (PLMS), por possuir uma
homologia muito grande com o fosfolemman, considerando o peso molecular e a fosforilação por
PKA e PKC. Neste mesmo trabalho foi mostrado que o PLMS quando fosforilado por PKC se
dissocia da subunidade
, culminando em uma ativação enzimática, e lembrando o mecanismo de
ação do fosfolamban na Ca
2+
-ATPase.
É sabido que o FXYD2 apresenta uma homologia muito grande com o PLM e o PLMS, e
já foi demonstrado que este peptídeo é fosforilado por PKA, como mostrado no artigo em anexo
(Cortes, 2006). Mahmoud e Cornelius (2002), descreveram a fosforilação do FXYD2 por PKC
apenas na presença de triton X100. Nesta tese mostramos que a fosforilação por PKC do FXYD2
de medula renal externa de porco também ocorre na ausência de triton X100. Corroborando estes
resultados mostramos na figura 18 que o FXYD2 é fosforilado por PKC, e que esta fosforilação é
85
dependente da associação deste peptídeo com a subunidade
, mesmo pré-requisito para a
fosforilação por PKA (Cortes e cols, 2006). Feschenko e Sweadner (1994) mostraram que a
adição de Na
+
, K
+
ou ouabaína estabilizavam a enzima em diferentes estados conformacionais
(E
1
, E
2
, E
2
P, respectivamente) que afetam a fosforilação por PKA e PKC, sugerindo que a
exposição dos sítios de fosforilação da subunidade
depende da conformação que a enzima
assume durante a exposição a diferentes condutores iônicos. Em se tratando do FXYD2 o
mecanismo é diferente do observado para a subunidade
, pois neste caso a fosforilação por esta
cinase não é depedente da presença ou ausência de sódio. No entanto, na presença de ouabaína a
fosforilação do FXYD2 é menor, podendo ser um indicativo de que a conformação da enzima é
importante para a fosforilação e que ela é facilitada quando a enzima está na conformação E
1
.
Quando submetemos a Na
+
,K
+
-ATPase, com FXYD2 adicionado, em um meio de fosforilaçao
para PKA observamos um aumento da marcação para este peptídeo fosforilado. Entretanto, ao
adicionarmos a enzima nesta mesma condição a um meio de fosforilaçao para PKC, ocorre uma
diminuição da marcação para o FXYD2 fosforilado, Diante deste resultado podemos sugerir que
quando adicionamos o FXYD2 em excesso, este formaria oligômeros que de alguma forma
estariam escondendo ou bloqueando o acesso ao sitio de fosforilação para PKC.
O fosfolemman, um peptídeo da família FXYD, contém sítios consenso de fosforilação
para PKA e PKC (Therien e Blostein, 2000). Entretanto, muitos dos membros desta família
contém a seqüência S
47
X(R/K)C(R/K)C (numerados a partir do FXYD2 de rato) que flanqueiam
o domínio transmembrana no lado citoplasmático. O resíduo de serina é muito conservado em
toda família e devido a sua presença próxima a cargas positivas, faz dela um possível alvo de
fosforilaçao por PKC. A seqüência do FXYD2 de porco, foi recentemente descrita (GenBank
accession number AY941203), e possui o motivo S
47
KRLRC na mesma configuração
86
mencionada acima. A presença de dois resíduos de arginina, próximo a serina torna esta serina
um alvo de fosforilaçao possível para PKA.
Nesta tese identificamos que a fosforilação do FXYD2 por PKA ou PKC provavelmente
ocorre em um resíduo de serina e treonina, respectivamente. Ao realizar o western-blot com
anticorpo anti-fosfoserina (figura 19), foi observado grande quantidade de serina fosforilada na
condição em que o FXYD2 havia sido fosforilado previamente por PKA e PKC ou somente por
PKA. Quando fosforilado por PKC não foi observado uma marcação significativa. Para certificar
de que a fosforilaçao deste peptídeo ocorre em um resíduo de treonina, um western-blot com
anticorpo anti-fosfotreoninina foi realizado. Neste caso uma marcação significativa foi observada
para o FXYD2-PKA/PKC e FXYD2-PKC, corroborando o dado anterior. Como podemos
observar na figura 27, o FXYD2 de porco também possui regiões consenso de fosforilação para
PKC, que seria a serina descrita anteriormente, e uma treonina que se encontra próxima ao
domínio transmembrana do lado extracitoplasmatico, com a seqüência T
25
VRNG. Relacionando
o resultado obtido com western blot e a análise da seqüência do FXYD podemos sugerir que a
fosforilaçao deste peptídeo por PKA ocorre no resíduo de serina, enquanto que a fosforilação por
PKC ocorre no resíduo de treonina.
87
Figura 27- Alinhamento do FXYD2 de diferentes espécies. Análise das seqüências do
FXYD2 de diferentes espécies utilizando o GenBank accesion number AY941203. A figura
evidencia os sítios possíveis de fosforilação por PKC e PKA, representado em caixa preto (PKC)
e caixa azul (PKA). Os resíduos em vermelhos são a treonina (T) e a serina (S) que são
fosforilado pelas respectivas cinases. Em rosa está representado a seqüência padrão FXYD. Os
resíduos em negrito representam aqueles que compõe o domínio transmembrana.
PORCO GAMA 1
MAGLSTDDGGSPKGDVDPFYYDYETVRNGGLIFAALAFIVGLIIILSKRLRCGGKKHRPINEDEL
HUMANO GAMA1
MTGLSMDGGGSPKGDVDPFYYDYETVRNGGLIFAGLAFIVGLLILLSRRFRCGGNKKRRQINEDEP
OVELHA GAMA1
ENEDPFYYDYETVRNGGLIFAALAFIVGLVIILSKRFRCGAKKKHRQIPEDGL
XENOPUS LAEVIS GAMA1
MADAQDDMSQMQDKFTYDYETIRKGGLIFAAIAFVVGMLIIFSGRFRCGRKKQLRALNDD
PORCO GAMA 1
MAGLSTDDGGSPKGDVDPFYYDYETVRNGGLIFAALAFIVGLIIILSKRLRCGGKKHRPINEDEL
HUMANO GAMA1
MTGLSMDGGGSPKGDVDPFYYDYETVRNGGLIFAGLAFIVGLLILLSRRFRCGGNKKRRQINEDEP
OVELHA GAMA1
ENEDPFYYDYETVRNGGLIFAALAFIVGLVIILSKRFRCGAKKKHRQIPEDGL
XENOPUS LAEVIS GAMA1
MADAQDDMSQMQDKFTYDYETIRKGGLIFAAIAFVVGMLIIFSGRFRCGRKKQLRALNDD
88
Delamere (1990) reporta que a adição de PKA a membranas cruas de rim de coelho
provocou 80% de inibição da atividade enzimática. Em adição, Fisone (1994), mostrou que o
estímulo da fosforilação por PKA em células intactas causa uma pequena inibição da atividade de
apenas 19%. Ambos os resultados foram obtidos na ausência de Triton X-100. Quando
adicionamos o FXYD2 fosforilado por proteínas cinases a uma preparação de Na
+
,K
+
-ATPase de
medula renal purificada, observamos uma ativação considerável (cerca de 4 vezes) da atividade
desta enzima, sugerindo que este peptídeo se comporta como um importante regulador da
Na
+
,K
+
-ATPase renal ( figura 20). O FXYD2 pode, assim como a subunidade
da enzima, ser
alvo de regulação hormonal positiva aumentando a reabsorção de sódio. Estes resultados abrem
uma extensa gama de possibilidades para mecanismos regulatórios do controle da Na
+
,K
+
-
ATPase de medula renal.
Atualmente está bem definido que as proteínas FXYD possuem um papel central na
interação e modulação das propriedades da Na
+
,K
+
-ATPase, sendo reportados os efeitos do PLM
(Zhang e cols., 2006), FXYD2 (Fontes e cols., 1999, Cortes e cols., 2006), Mat-8 (Crambert, e
cols., 2005), CHIF (Jespersen, e cols., 2006), FXYD 7 (Crambert, e cols., 2003), FXYD 10
(Cornelius e Mahmoud, 2007). Devido ao fato dessas proteínas serem expressas em diferentes
tecidos, surge a hipótese de que estas realmente agiriam como moduladores tecido-específicos da
Na
+
,K
+
-ATPase.
Inúmeros trabalhos têm sugerido que alguns peptídeos sofrem regulação hormonal, como
exemplo o fosfolamban, que é fosforilado por uma PKA ou CaMKII via sinalização adrenérgica
(Bhupathy e cols., 2007). Portanto, com o conhecimento prévio de que a Na
+
,K
+
-ATPase é uma
enzima de extrema importância para a manutenção da função renal e o controle da eliminação do
sódio, sugerimos que o FXYD2, por estar associado a esta enzima possuiria alguma participação
89
importante neste mecanismo, uma vez que ele só é expresso nos túbulos renais proximais.
Portanto, seria interessante avaliar os efeitos da dopamina e da angiotensina nesse peptídeo, já
que ele possui regiões-consenso de fosforilação para PKA e PKC.
Karlish & Garty (2005) questionam se seria possível que os membros da família FXYD
regulassem as propriedades de outra proteína que não seja a Na
+
,K
+
-ATPase. Respondendo a esta
questão, o PLM e MAT8 são capazes de ativar um canal de cloreto em
Xenopus sp. (Shimbo, e
cols., 1995), o CHIF aumenta a condutância específica de K
+
, sugerindo uma ativação de
KCNQ1 (Jespersen e cols., 2006). O RIC (disaderina) é reportado por diminuir a expressão de E-
caderina e promover a metástase (Ino e cols., 2002). Ainda, recentemente o PLM foi sugerido
como um regulador do trocador sódio cálcio (NCX) (Cheung e cols., 2007).
Nesta tese mostramos que o FXYD2 é capaz de modular a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase e
da PMCA de eritrócitos, que fisiologicamente não expressam o FXYD2, caracterizando
mecanismos de interação cruzada entre FXYDs e P-ATPases. Trabalhamos com o FXYD2 nativo
ou previamente fosforilado por proteínas cinases. Nossos resultados mostram que quando
adicionamos o FXYD2-np, FXYD2-PKA/PKC e FXYD2-PKC a ativação da Na
+
,K
+
-ATPase
chega a cerca de 60%, sendo o FXYD2-PKA capaz de aumentar em 80% a atividade da Na
+
,K
+
-
ATPase de eritrócito (figura 21). Este resultado mostra que para esta enzima a fosforilação do
FXYD2 não possui importância regulatória, como para a Na
+
,K
+
-ATPase que fisiologicamente
expressa este peptídeo. Demonstramos também que o FXYD2 é capaz de interagir e modular a
PMCA, com algumas peculiaridades, como visto na figura 22. O FXYD2 fosforilado por PKA,
na presença de calmodulina, inibe a atividade da PMCA em 50%, enquanto se fosforilado por
PKC não exerce efeito significativo. Na ausência de calmodulina, o FXYD2-PKA/PKC aumenta
a atividade da PMCA cerca de 3 vezes, parecendo haver um efeito aditivo da fosforilação por
PKA e PKC, o que mimetiza os efeitos da calmodulina nesta enzima. Estes resultados são
90
coerentes com vários experimentos de captação de cálcio radioativo, onde observamos uma
inibição de 50% da captação de Ca
2+
na presença do FXYD2-PKA (figura 23). Estes resultados
sugerem que o FXYD2 não desacopla a PMCA. Em adição, como foi mostrado na tese de
mestrado (Cortes, 2003), a Na
+
,K
+
-ATPase quando incubada com o fosfolemman recombinante
humano, aumenta suas propriedades de ligação com a ouabaína, sugerindo uma interação cruzada
deste FXYD, proveniente da Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática de músculo cardíaco, com a
Na
+
,K
+
-ATPase (Cortes, 2003).
Fisiologicamente, os resultados obtidos com a Na
+
,K
+
-ATPase e a PMCA de eritrócito
tem grande importância, uma vez que, o FXYD2 somente exerce seu efeito regulatório em seu
tecido de origem, ou seja, na Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal. Os resultados com a PMCA
mostram um ponto regulatório interessante, onde este peptídeo, dependendo do estímulo
hormonal poderá ativar (PKC) ou inibir (PKA) esta enzima.
A Na
+
,K
+
-ATPase é objeto de regulação por diversos hormônios, especialmente
corticosteroides, insulina e catecolaminas (Ferraile e cols.,1999; Pinto-Do-O e cols., 1997). A
aldosterona é o mais importante e conhecido agente atuador no transporte de Na
+
e K
+
através da
membrana epitelial de tecidos como o rim, adaptando o organismo a condições de baixa
concentração de Na
+
e alta concentração de K
+
. Foi demonstrado que o maior efeito da
aldosterona sobre a Na
+
,K
+
-ATP é em longo prazo, aumentando a expressão destas bombas. As
catecolaminas são hormônios presentes no túbulo proximal renal, que sinalizam uma inibição da
Na
+
,K
+
-ATPase. No néfron a inibição dos segmentos proximais são mediados por dois tipos de
receptores, DA1 e DA2, dependentes de PKC e PKA, respectivamente. A PKC parece estar
envolvida com respostas em longo prazo, enquanto a PKA em respostas a curto prazo (Chou e
cols., 1990). Neste contexto a fosforilação do FXYD2 por PKA e PKC representam um
importante mecanismo fisiológico, uma vez que, estes hormônios estão normalmente presentes
91
no leito renal. Este mecanismo seria importante não só para a Na
+
,K
+
-ATPase, mas também para
a PMCA, já que reportamos a interação desta enzima com o FXYD2 e regulação por este
peptídeo em seu estado fosforilado por PKA e/ou PKC. Este dado nos remete a sugerir mais um
mecanismo fisiológico no qual o FXYD2 participa.
Os recentes trabalhos que mostram o cristal da SERCA em várias conformações tem
ajudado muito a compreensão da estrutura e mecanismos de outras P-ATPases. A Na
+
,K
+
-
ATPase possui uma semelhança muito grande com a SERCA 1a, especialmente na porção C-
terminal do domínio A, bem como nos domínios M e P (Sweadner e Donnet, 2001), mas ainda
não existem cristais da Na
+
,K
+
-ATPase em resolução comparável a descrita para a SERCA.
Mahmoud e cols (2006) mostrou que o FXYD10 pode interagir com a Na
+
,K
+
-ATPase
através da interação entre a Cys
34
presente no C-terminal do FXYD10 e Cys
752
presente na
subunidade
da Na
+
,K
+
-ATPase. O mesmo mecanismo provavelmente ocorre para a SERCA e o
fosfolamban. Ainda segundo Mahmoud (2006) acredita-se que esta interação ocorra entre a Lys
55
e Lys
56
deste peptídeo e a Lys
347
e Lys
352
da subunidade
da Na
+
,K
+
-ATPase. Apesar de
acharmos esta sugestão um pouco controversa ela poderia explicar de alguma forma o resultado
observado na figura 24 e 25, onde o FXYD2 não é capaz de modular a atividade da SERCA de
cérebro e de músculo esquelético ( neste último caso em baixa concentração de ATP). Talvez este
dado pode ser explicado pelo fato do FXYD2 não possuir a cisteína na posição necessária para
que essa interação ocorra, como no caso do fosfolamban.
Até o momento só havíamos avaliado os efeitos do FXYD2 sobre a atividade enzimática.
Portanto, através de experimentos de calorimetria, tornou-se possível avaliar alguns parâmetros
relativos à interação do FXYD2 com a Na
+
,K
+
-ATPase. Como podemos observar na figura 26, a
interação do FXYD2 com a Na
+
,K
+
-ATPase parece ser facilitada pela presença do sódio, o que
92
não ocorre na presença de K
+
. Estes resultados sugerem que o FXYD2 possui uma maior
afinidade pela conformação E1 da enzima.
A Na
+
,K
+
-ATPase tem sido implicada em diversos eventos patológicos. Rose & Valdes
(1994), em uma revisão, mostram estas suposições em detalhe. A identificação de um fator que
inibe a Na
+
,K
+
-ATPase e a bomba de sódio de eritrócitos tem sido associado a diversas doenças
humanas, incluindo a hipertensão essencial e a insuficiência renal crônica. Além disso, o aumento
do fluido extracelular em humanos e em animais experimentais perfundidos com salina tem sido
reportado por aumentar os níveis deste fator, que inibe a Na
+
,K
+
-ATPase. (Kramer, 1985). Mais
tarde Hamlyn (1991), identificou um fator produzido pela adrenal e passando por uma coluna de
HPLC, descobriu que este era idêntico à ouabaína, o qual foi denominado OLF (Ouabain Like
Factor), o que reascendeu uma grande discussão sobre se os humanos sintetizam ou não
ouabaína. O fato é que, posteriormente diversos trabalhos têm identificado este fator na adrenal,
na urina e no plasma humano (Angelis e cols., 1998; Kelly e cols., 1986). Este é um dos
mecanismos pelos quais tenta-se explicar a hipertensão essencial, onde indivíduos portadores de
algum distúrbio estariam sintetizando grande quantidade de OLF, o que levaria a uma inibição da
bomba de Na
+
. Conseqüentemente, um acúmulo de Na
+
intracelular aconteceria culminando na
ativação de um trocador Na
+
/Ca
2+
resultando em saída de Na
+
e aumento de Ca
2+
intracelular que
levará ao efeito ionotrópico causado por digitálicos e uma vasoconstricção generalizada (Rose &
Valdes, 1994).
E o FXYD2 também tem sido apontado como origem etiológica de doenças, a exemplo da
hipomagnesemia renal humana, onde uma mutação Gly
41
-Arg, que se localiza no domínio
transmembrana e parece impedir a oligomerização deste peptideo seria um dos causadores desta
doença. Vale acrescentar que o resíduo Gly
41
é conservado entre todas os proteolipídeos da
93
família FXYD e já foi mostrado impedir a associação do Mat-8 com a Na
+
,K
+
-ATPase.
(Arimochi e cols., 2007).
Interessante que Hinojos e Doris (2004) descreveram em ratos jovens espontaneamente
hipertensos um aumento da atividade Na
+
,K
+
-ATPase em paralelo a um aumento da quantidade
de subunidades
e FXYD2 na membrana basolateral dos túbulos proximais. Estes autores
levantaram a hipótese de que a hipertensão poderia ser conseqüência do aumento da atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase nos túbulos proximais como resultado da combinação de fatores incluindo os
níveis de subunidades expressas, distribuição subcelular e fosforilação da serina.
Se pensarmos no rim, tanto a Na
+
,K
+
-ATPase, quanto a PMCA podem ser ativadas pela
angiotensina, e também pelo FXYD2. Essas duas enzimas, portanto, podem ser alvos importantes
de uma regulação específica pelo FXYD para manutenção do nível intracelular de sódio e cálcio,
sendo o cálcio um grande sinalizador intracelular. Estes mecanismos precisariam ser melhor
caracterizados para a real compreensão desta via de regulação, que possui enormes impactos na
fisiologia renal. Um ativador potente da Na
+
,K
+
-ATPase teria enorme repercussão na reabsorção
tubular de Na
+
e mimetizaria o efeito observado no aldosteronismo.
Torna-se importante avaliar os efeitos dos hormônios nestas situações, pois podem existir,
nesses mecanismos, estratégias importantes para a prevenção de doenças. No coração, a Na
+
,K
+
-
ATPase e o NCX podem juntos, promover o acúmulo de cálcio, promovendo um aumento da
força de contração (efeito farmacológico dos digitálicos). Por exemplo, com um estimulo
adrenérgico estaremos fosforilando o PLM, que inibe o NCX (trocador Na
+
/Ca
2+
) causando um
pulso de cálcio local, que combinado à fosforilação do PLB leva a uma ativação da SERCA 2a, o
que amplia o sinal de cálcio e aumenta a contratilidade do músculo cardíaco. Já a ativação da
94
Na
+
,K
+
-ATPase pelo PLM durante o estímulo
-adrenérgico pode ajudar a restaurar o gradiente
de Na
+
e Ca
2+
, levando a um relaxamento do músculo cardíaco (Garty & Karlish, 2005).
Em virtude desses resultados seria imprescindível avaliar os efeitos do FXYD2 na PMCA
da membrana basolateral do túbulo proximal renal, como avaliar os efeitos da angiotensina e
dopamina na presença deste peptídeo, caracterizando de forma mais ampla o papel do FXYD2
como um regulador intrínseco da fisiologia renal e dos mecanismos de reabsorção de sódio a
nível proximal.
O fato do FXYD2 associar-se a Na
+
,K
+
-ATPase de eritrócito ou com a Ca
2+
-ATPase
associado aos diversos trabalhos que mostram a presença destes diferentes peptídeos regulando a
Na
+
,K
+
-ATPase, como o fosfolemman-like, CHIF e FXYD7, nos remetem a propor uma possível
importância fisiológica para estes eventos. É possível que o sítio de ancoragem do FXYD2 na
subunidade
seja altamente preservado entre as diferentes isoformas de Na
+
,K
+
-ATPase e que os
proteolipídeos da família FXYD e as diferentes ATPases tipo P possuam os sítios de ancoragem
para estes proteolipídeos conservados, sendo possível a interação cruzada entre eles. Isto é
interessante, pois a expressão destes peptídeos é tecido específica, portanto no rim onde se tem
alta expressão de FXYD2, não há expressão de fosfolemman ou FXYD7, já no cérebro onde o
este peptídeo não é expresso temos a presença de um outro peptídeo regulatório que seria o
FXYD7, ou mesmo na glândula retal de tubarão que também não expressa o FXYD2, mas por
sua vez expressa o fosfolemman-like associado a subunidade
regulando a Na
+
,K
+
-ATPase.
Cabe-nos sugerir que a expressão tecido-específica destes peptídeos seja uma boa alternativa
fisiológica, pois deste modo as ATPases tipo P, dependendo do tecido onde são expressas, teriam
um controle fino de sua atividade pelo FXYD presente no determinado tecido.
95
Então, mostramos que o FXYD2 é um importante regulador não apenas da Na+,K+-
ATPase de medula renal, tecido em que é fisiologicamente expresso. Mas que, também é capaz
de exercer seus efeitos regulatorios sob a atividade e captação de cálcio da PMCA, enfatizando a
regulação diferencial que ocorre na presença deste peptídeo fosforilado por PKA ou por PKC.
Estes resultados abrem então um leque de mecanismos regulatorios que envolvem a
fisiologia renal, ou que podem contribuir para gênese de doenças renais importantes. Portanto a
continuidade deste estudo trará grande contribuição para o entendimento destes mecanismos e
desenvolvimento de medidas que visem a prevenção ou detecção de anormalidades renais que
comprometam o bem estar de um individuo.
97
O FXYD2 aumenta a Vmax da Na
+
,K
+
-ATPase em 70% para o primeiro sítio de ATP
(catalítico) e 30% para o segundo sítio (regulatorio). Entretanto, não foi observado
efeito sobre a afinidade por ATP. Esta é a primeira vez que um efeito do FXYD2
sobre a Vmax desta enzima é demonstrado, sugerindo que o efeito observado na
Vmax, não é restrito a efeitos na afinidade por ATP.
Este peptídeo, assim como outros FXYDs possui região consenso de fosforilação para
PKA e PKC, o que foi comprovado com os experimentos de auto-radiografia e
western-blot com anticorpo contra fosfoserina e fosfotreonina.
A Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal sofre aumento de sua atividade quando incubada
com o FXYD2. Este aumento chega a 80% quando este peptídeo é fosforilado por
PKA e/ou PKC, sugerindo um mecanismo regulatório importante para fisiologia renal.
Entretanto, quando este peptídeo e incubado com a Na
+
,K
+
-ATPase de eritrócito de
porco temos um aumento em torno de 60 a 80% da atividade, não fazendo diferença
se o FXYD2 está em seu estado fosforilado ou não fosforilado. Este resultado mostra
que a regulação por fosforilação só é importante para o tecido em que o FXYD2 é
originalmente expresso.
O FXYD2 também possui efeito na PMCA de eritrócito de porco. Para esta enzima a
fosforilação parece ser um importante mecanismo regulador. Pois, na presença do
FXYD2-PKA obtivemos uma inibição da bomba de 50% em relação ao controle sem
peptídeo. No entanto, quando fosforilado por PKA e PKC obtivemos um aumento de
2 vezes na atividade, acrescentando que na atividade basal, esta mesma condição
mimetiza o efeito da calmodulina, aumentando a atividade em 3 vezes.
Importante que estes resultados corroboram a captação de cálcio pela PMCA de
98
eritrócitos de porco, que exibem o mesmo perfil, sugerindo que este peptídeo não atua
desacoplando a enzima.
Também avaliamos os efeitos do FXYD2 sobre a SERCA de músculo esquelético.
Observamos apenas um aumento discreto da atividade em condições saturantes de
ATP (2mM).
Para a SERCA de cérebro nenhum efeito foi observado quando a incubamos com o
FXYD2, tanto em alta, quanto em baixa concentração de ATP.
Através de experimentos calorimétricos no ITC, analisamos a interação do FXYD2
com a Na
+
,K
+
-ATPase de medula renal. Através deste resultado podemos sugerir que
este peptídeo tem sua interação com esta enzima facilitada quando está na
conformação E1.
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