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Raquel Lopes Martins Souza
Caracterização fenotípica e funcional de
hemócitos circulantes de Biomphalaria
glabrata e Biomphalaria tenagophila,
linhagens resistentes e susceptíveis, durante a
infecção por Schistosoma mansoni
UNIVERSIDADE FERERAL DE MINAS GERAIS
BELO HORIZONTE, 2006
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ÍNDICE
Lista de
figuras..........................................................................................................................4
Listas de
tabelas........................................................................................................................8
Lista de
Abreviaturas...............................................................................................................9
Resumo...........................................................................................................................
..........10
Abstract..........................................................................................................................
..........12
1.
Introdução...............................................................................................................................14
2. Revisão da
literatura...........................................................................................................17
2.1. Aspectos
gerais..................................................................................................................17
2.2. Morfologia dos moluscos do gênero
Biomphalaria...........................................................17
2.3. Moluscos e a transmissão da
esquistossomose..................................................................18
2.4. Relação parasito –
hospedeiro............................................................................................23
2.4.1. Hospedeiro
definitivo......................................................................................................23
2.4.2. Hospedeiro
Intermediário...............................................................................................24
2.5. Sistema de defesa interna do
molusco...............................................................................28
2.6. Mecanismos funcionais na interação parasito –
molusco..................................................38
3.
Objetivos..............................................................................................................................44
3.1. Objetivos
Gerais.................................................................................................................44
3.2. Objetivos
específicos.........................................................................................................44
Capítulo 1
4. Caracterização morfológica da população de hemócitos circulantes de
caramujos B. glabrata e B. tenagophila durante a infecção experimental pelo S. mansoni
e tratamento com sílica.
...............................................................................................................................46
2
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4.1. Material e
métodos...........................................................................................................49
4.1.1.
Caramujos.......................................................................................................................49
4.1.2. O
Parasito........................................................................................................................49
4.1.3. Infecção de
caramujos.....................................................................................................50
4.1.4. Tratamento com
sílica.....................................................................................................50
4.1.5. Coleta da hemolinfa e isolamento de
hemócitos.............................................................51
4.1.6. Contagem diferencial de hemócitos e
viabilidade..........................................................52
4.1.7. Caracterização fenotípica de hemócitos circulantes de B. tenagophila
.........................53
4.1.8. Análise
estatística............................................................................................................54
4.2. Resultados
........................................................................................................................55
4.2.1. Caracterização do perfil fenotípico de hemócitos de caramujos B. glabrata e
B. tenagophila através da citometria de
fluxo..........................................................................55
4.2.2. Efeito da inoculação de sílica no perfil de hemócitos circulantes de caramujos
do gênero
Biomphalaria...........................................................................................................64
4.3.
Discussão...........................................................................................................................81
Capítulo 2
5. Papel de lectina e ação de carboidratos na interação de hemócitos circulantes
de B. glabrata e B. tenagophila com S. mansoni
............................................................................86
5.1. Material e
métodos...........................................................................................................89
5.1.1.
Caramujos.......................................................................................................................89
5.1.2. O
Parasito........................................................................................................................89
5.1.3. Infecção de
caramujos.....................................................................................................89
5.1.4. Marcação de moléculas expressas na superfície de hemócitos
circulantes.....................89
3
5.1.5. Ação das lectinas e de carboidratos na interação de hemócitos com
esporocistos transformados in
vitro...............................................................................................................91
5.1.6. Índice de adesão celular
(CAI)........................................................................................93
5.1.7. Viabilidade dos
esporocistos...........................................................................................93
5.1.8. Análise
estatística............................................................................................................94
5.2.
Resultados.........................................................................................................................96
5.2.1. Marcação dos hemócitos circulantes de caramujos do gênero Biomphalaria.
com lectinas
fluorescentes................................................................................................................96
5.2.2. Ação de carboidratos na interação de hemócitos com esporocistos
transformados in
vitro.........................................................................................................................................108
5.3.
Discussão.........................................................................................................................125
Capítulo 3
6. Análise da interação dos hemócitos com antígenos e esporocistos de S.
mansoni.......131
6.1. Material e
métodos.........................................................................................................133
6.1.1.
Caramujos.....................................................................................................................133
6.1.2. O
Parasito......................................................................................................................133
6.1.3. Infecção de
caramujos...................................................................................................133
6.1.4. Contagem diferencial de hemócitos e viabilidade....................................
...................133
6.1.5. Análise da interação dos hemócitos com antígenos e esporocistos de S.
mansoni. .....134
6.1.6. Análise
estatística..........................................................................................................135
6.2.
Resultados.......................................................................................................................136
6.2.1. Produção de
NO............................................................................................................136
4
6.3.
Discussão.........................................................................................................................140
7.
Conclusões..........................................................................................................................142
8. Referências
bibliográficas................................................................................................145
9. Anexos
...............................................................................................................................158
5
Lista de figuras
página
Figura 1 Análise do perfil da população dos hemócitos circulantes de caramujos
Biomphalaria pela citometria de fluxo (FACSCalibur), separados a partir da granulosidade
(SSC-Height) versus tamanho (FSC-Height)
A: Leitura da hemolinfa total
B: Leitura após eliminação de células mortas e
debris.............................................................57
Figura 2: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B. glabrata
da linhagem BH (BG-BH), B. tenagophila linhagem Cabo Frio (BT-CF) e B. tenagophila
linhagem Taim (BT-T) livres de infecção por S. mansoni, obtida na citometria de fluxo. *
representa diferença significativa (p < 0,05) em relação a população 1 de B. glabrata (sem
infecção)....................................................................................................................................58
Figura 3: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B. glabrata
nas primeiras 24 horas (A) e durante 30 dias (B) de infecção com S. mansoni, obtida através
da citometria de fluxo. * Diferenças significativas (p < 0,05) em relação ao ponto 0 (sem
infecção)....................................................................................................................................60
Figura 4: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B.
tenagophila da linhagem Cabo Frio nas primeiras 24 horas (A) e durante 30 dias (B) de
infecção com S. mansoni, obtida através da citometria de fluxo. * Representa diferenças
significativas (p < 0,05) em relação ao ponto 0 (sem
infecção).............................................................................62
Figura 5: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B.
tenagophila da linhagem Taim nas primeiras 24 horas (A) e durante 30 dias (B) de infecção
com S. mansoni, obtida através da citometria de fluxo. * Representa diferenças significativas
(p < 0,05) em relação ao ponto 0 (sem
infecção).............................................................................................63
Figura 6: Efeito da inoculação de sílica na porcentagem das populações de hemócitos
circulantes na hemolinfa de B. glabrata, nas primeiras 120 horas de infecção por miracídios
de S. mansoni. A: Caramujos inoculados com CBSS e B: Caramujos inoculados com sílica. *
Diferenças significativas em relação ao ponto 0 e # diferenças entre os grupos (p < 0,05)
Cada ponto representa média + desvio padrão de triplicatas da hemolinfa total de 3 caramujos.
O ponto 0 representa caramujos com 24 horas de inoculação de sílica e livres de
infecção.....................................................................................................................................68
Figura 7: Efeito da inoculação de sílica na porcentagem das populações de hemócitos
circulantes na hemolinfa de B tenagophila da linhagem Cabo Frio, nas primeiras 120 horas de
infecção por miracídios de S. mansoni. A: Caramujos inoculados com CBSS e B: Caramujos
inoculados com sílica. * Diferenças significativas antes e após infecção e # representa as
diferenças significativas entre sílica e CBSS (p < 0,05) Cada ponto representa média + desvio
6
padrão de triplicatas da hemolinfa total de 3 caramujos. O ponto 0 representa caramujos com
24 horas de inoculação de sílica e livres de infecção................................................................70
Figura 8: Efeito da inoculação de sílica na porcentagem das populações de hemócitos
circulantes na hemolinfa de B tenagophila da linhagem do Taim, nas primeiras 120 horas de
infecção por miracídios de S. mansoni. A: Caramujos inoculados com CBSS e B: Caramujos
inoculados com sílica. * Diferenças significativas antes e após infecção e # representa as
diferenças significativas entre sílica e CBSS (p < 0,05). Cada ponto representa média + desvio
padrão de triplicatas da hemolinfa total de 3 caramujos. O ponto 0 representa caramujos com
24 horas de inoculação de sílica e livres de infecção................................................................72
Figura 9: Granulosidade dos hemócitos circulantes de B. glabrata. A: caramujos
livres de infecção e após 24 horas da inoculação da sílica e B: caramujos com 5 horas de
infecção e 30 horas de inoculação de sílica. Hemócitos analisados pela Citometria de
Fluxo.......................78
Figura 10: Granulosidade dos hemócitos circulantes de B. tenagophila Cabo Frio. A:
caramujos livres de infecção e após 24 horas da inoculação da sílica e B: caramujos com 5
horas de infecção e 30 horas de inoculação de sílica. Hemócitos analisados pela Citometria de
Fluxo.........................................................................................................................................79
Figura 11: Granulosidade dos hemócitos circulantes de B. tenagophila Taim. A:
caramujos livres de infecção e após 24 horas da inoculação da sílica e B: caramujos com 5
horas de infecção e 30 horas de inoculação de sílica. Hemócitos analisados pela Citometria de
Fluxo.........................................................................................................................................80
Figura 12: Hemócitos aderidos a superfície dos esporocistos de S. mansoni - Índice
de adesão celular –
IAC.............................................................................................................................95
Figura 13: Porcentagem de hemócitos presentes na hemolinfa total de caramujos
Biomphalaria marcados com lectinas conjugadas com FITC (ConA, PNA, SBA e WGA). BG
- B. glabrata, BT-CF – B. tenagophila da linhagem Cabo Frio e BT-T – B. tenagophila da
linhagem Taim. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação a B. glabrata e
dois * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação a B. glabrata e alinhagem
Cabo Frio..................................................................................................................................97
Figura 14 Marcação da superfície de hemócitos circulantes de caramujos B. glabrata,
com lectinas conjugadas a FITC. a e b: marcação com WGA; c e d: marcação com ConA; e e
f: marcação com PNA. a, c e e: Nomarski; b, d e f: microscopia de fluorescência. Aumento
600x...........................................................................................................................................99
Figura 15: Marcação da superfície de hemócitos circulantes de caramujos B.
tenagophila Cabo Frio, com lectinas conjugadas a FITC. a e b: marcação com WGA; c e d:
marcação com PNA; e e f: marcação com ConA-FITC. a, c e e: Nomarski; b, d e f:
7
microscopia de fluorescência. Aumento
600x...................................................................................................92
Figura 16: Marcação da superfície de hemócitos circulantes de caramujos B.
tenagophila Taim, com lectinas conjugadas a FITC. a e b: marcação com WGA; c e d:
marcação com PNA. a e c: Nomarski; b e d: microscopia de fluorescência. Aumento
600x.........................100
Figura 17: Padrão de marcação de hemócitos circulantes de B. glabrata com lectinas
conjugadas com FITC, durante as primeiras 120 horas de infecção pelo S. mansoni. Em A:
marcação com ConA, B: marcação com PNA, C: marcação com SBA e D: marcação com
WGA.......................................................................................................................................101
Figura 18: Padrão de marcação de hemócitos circulantes de B. tenagophila da
linhagem Cabo Frio, com lectinas conjugadas com FITC, durante as primeiras 120 horas de
infecção pelo S. mansoni. Em A: marcação com ConA, B: marcação com PNA, C: marcação
com SBA e D: marcação com
WGA...............................................................................................................105
Figura 19: Padrão de marcação de hemócitos circulantes de B. tenagophila da
linhagem Taim, com lectinas conjugadas com FITC, durante as primeiras 120 horas de
infecção pelo S. mansoni. Em A: marcação com ConA, B: marcação com PNA, C: marcação
com SBA e D: marcação com
WGA...............................................................................................................107
Figura 20: Adesão de hemócitos circulantes de B. glabrata ao tegumento de
esporocistos de S. mansoni após 6 horas de incubação in vitro. Índice de adesão expresso
como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento IAC = 0,
esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50 hemócitos
aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A: Esporocistos
de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com células na presença
de hemolinfa de B. glabrata. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação
ao
controle....................................................................................................................................110
Figura 21: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Cabo
Frio ao tegumento de esporocistos de S. mansoni após 6 horas de incubação in vitro. Índice
de adesão expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento
IAC = 0, esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50
hemócitos aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A:
Esporocistos de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com
células na presença de hemolinfa de B. tenagophila Cabo Frio. * representa diferenças
significativas com p < 0,05 em relação ao
controle............................................................................................................112
8
Figura 22: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Cabo
Frio ao tegumento de esporocistos de S. mansoni após 6 horas de incubação in vitro. Índice
de adesão expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento
IAC = 0, esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50
hemócitos aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A:
Esporocistos de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com
células na presença de hemolinfa de B. tenagophila Cabo Frio. * representa diferenças
significativas com p < 0,05 em relação ao
controle............................................................................................................114
Figura 23: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Taim ao
tegumento de esporocistos de S. mansoni após 6 horas de incubação in vitro. Índice de adesão
expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento IAC = 0,
esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50 hemócitos
aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A: Esporocistos
de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com células na presença
de hemolinfa de B. tenagophila Taim. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em
relação ao controle..................................................................................................................116
Figura 24: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Taim ao
tegumento de esporocistos de S. mansoni após 6 horas de incubação in vitro. Índice de adesão
expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento IAC = 0,
esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50 hemócitos
aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A: Esporocistos
de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com células na presença
de hemolinfa de B. tenagophila Taim. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em
relação ao controle..................................................................................................................118
Figura 25: Porcentagem de esporocistos de S. mansoni mortos após 24 horas de
incubação com hemócitos na presença ou não do extrato solúvel da hemolinfa de caramujos
B. glabrata. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação ao
controle..........................120
Figura 26: Porcentagem de esporocistos de S. mansoni mortos após 24 horas de
incubação com hemócitos na presença ou não de extrato solúvel da hemolinfa de caramujos
B. tenagophila da linhagem Cabo Frio. Em A: esporocistos incubados na presença de
diferentes concentrações de N-acetilglicosamina e em B: esporocistos incubados na presença
de diferentes concentrações de Galactosamina. * representa diferenças significativas com p <
0,05 em relação ao controle e # representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação
aos tratamentos........................................................................................................................122
Figura 27: Porcentagem de esporocistos de S. mansoni mortos após 24 horas de
incubação com hemócitos na presença ou não de extrato solúvel da hemolinfa de caramujos
B. tenagophila da linhagem Taim. Em A: esporocistos incubados na presença de diferentes
9
concentrações de N-acetilglicosamina e em B: esporocistos incubados na presença de
diferentes concentrações de Galactosamina. * representa diferenças significativas com p <
0,05 em relação ao controle e # representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação
aos tratamentos........................................................................................................................124
Figura 28: Cinética de incubação dos hemócitos estimulados com SEA, para medida
de nitrito. BG: caramujos B. glabrata, BT-CF: caramujos B. tenagophila da linhagem Cabo
Frio e BT-Taim: caramujos B. tenagophila da linhagem
Taim......................................................137
Figura 29: Cinética da produção de Nitrato pelo hemócitos circulantes de caramujos
B. glabrata e B. tenagophila das linhagens Taim e Cabo Frio, durante a infecção pelo S.
mansoni sob reestímulo de
SEA............................................................................................................139
10
Lista de Tabelas
página
Tabela 1: Número de granulócitos (x 10
-5
/ ml) de hemolinfa retirada de caramujos B.
glabrata e B. tenagophila, tratados ou não com sílica, observados ao microscópio óptico. Os
valores representam média + desvio padrão de triplicadas com hemolinfa de três
caramujos.............66
Tabela 2: Número hemócitos circulantes (x10
-5
) na hemolinfa de caramujos
Biomphalaria glabrata infectados por S. mansoni tratados ou não pela sílica, analisada pela
técnica de citometria de fluxo. Os valores representam média + desvio padrão de triplicadas
com hemolinfa de três
caramujos.....................................................................................................74
Tabela 3: Número hemócitos circulantes (x10
-5
) na hemolinfa de caramujos
Biomphalaria tenagophila da linhagem Cabo Frio infectados por S. mansoni tratados ou não
pela sílica, analisada pela técnica de citometria de fluxo. Os valores representam média +
desvio padrão de triplicadas com hemolinfa de três
caramujos.......................................................................75
Tabela 4: Número hemócitos circulantes (x10
-5
) na hemolinfa de caramujos
Biomphalaria tenagophila da linhagem Taim infectados por S. mansoni tratados ou não pela
sílica, analisada pela técnica de citometria de fluxo. Os valores representam média + desvio
padrão de triplicadas com hemolinfa de três
caramujos............................................................................76
11
Lista de Abreviaturas
Abreviatu
ra
Significado
BH Linhagens de B. glabrata proveniente de Belo Horizonte -
MG
CBSS Solução salina balanceada de Chernin
CF Linhagens de B. tenagophila proveniente de Cabo Frio - RJ
ConA Lectina isolada de Conavalia ensiformis
dpi Dias após infecção pelo S. mansoni
ESPs Produtos excreto-secretados de esporocistos
FITC Isotiocianato de fluoresceina
FL1 Fluorescência 1
FL3 Fluorescência 3
FSC Tamanho
hpi Horas após infecção pelo S. mansoni
IAC Índice de adesão celular
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
NO Òxido nítrico
NOS Espécies reativas de nitrogênio
PNA Lectina isolada de Arachis hypogaea
ROS Espécies reativas de oxigênio
SBA Lectina isolada de Glicine Max
SEA Antígeno solúvel de ovos de S. mansoni
SID Sistema interno de defesa
SSC Granulosidade
WGA Lectina isolada de Triticum vulgaris
12
RESUMO
Moluscos do gênero Biomphalaria, hospedeiros do Schistosoma mansoni possuem
um sistema interno de defesa (SID) que compreende células circulantes denominadas
hemócitos e fatores solúveis presentes na hemolinfa. Os hemócitos circulantes estão
envolvidos na destruição das larvas de tremátodas, porém o mecanismo pelo qual eles
destroem o parasito ainda não está totalmente esclarecido. Como em outros gastropodas, os
hemócitos circulantes de Biomphalaria não são uma população homogênea e acredita-se que
cada tipo celular está envolvido de maneira diferente na destruição do parasito.
Um dos objetivos deste trabalho é o de caracterização morfológica do perfil da
população dos hemócitos circulantes, através da citometria de fluxo, de caramujos B.
tenagophila Taim (resistente ao S. mansoni), B. tenagophila Cabo Frio (parcialmente
suscetível ao S. mansoni) e B. glabrata BH (altamente suscetível ao S. mansoni) durante a
infecção pelo S. mansoni. Foi possível identificar duas subpopulações de hemócitos,
denominadas população de hemócitos pequenos e de hemócitos grandes. Em B. tenagophila
não infectado, da linhagem Taim ou Cabo Frio, os hemócitos pequenos representam cerca de
30 % do total de células circulantes, enquanto os hemócitos grandes cerca de 70 %.
Entretanto, em B. glabrata os hemócitos pequenos equivalem a 56 % do total, já os grandes
são 44 %. Após a infecção pelo S. mansoni, foram observadas variações no perfil da
população dos hemócitos circulantes, principalmente nas primeiras horas de infecção, que
correspondem a um aumento da porcentagem de hemócitos pequenos. Estas variações foram
ausentes em B. glabrata e significativamente marcantes nas linhagens Taim de B.
tenagophila. Durante a inoculação de silica nestes caramujos, a análise por citometria de
fluxo, demonstrou uma diminuição significativa na porcentagem de hemócitos pequenos e
aumento da população de hemócitos grandes. A diminuição da população de hemócitos
pequenos poderia ser justificada pelo fato de a sílica destruir pequenos granulócitos que
compõem parte da população de hemócitos pequenos. O tratamento com silica também
aumentou a granulocidade dos hemócitos, principalmente na linhagem do Taim de B.
tenagophila.
Elementos solúveis da hemolinfa atuam sinergicamente com os hemócitos na
destruição do parasito, dentre eles a lectina tem sido identificadas. As lectinas são encontradas
na hemolinfa de moluscos como um fator que aglutina e opsonisa partícula e que pode mediar
o reconhecimento de partículas estranhas e/ou parasito. Em moluscos, as lectinas são
secretadas pelos hemócitos e podem estar solúveis na hemolinfa ou serem expressas na
superfície destas células. Assim, lectinas e/ou lectinas ligantes podem ser
importantesmarcadores de ativação de hemócitos em Biomphalaria. Além disso, a ligação
lectina-carboidrato pode mediar a adesão de hemócitos de Biomphalaria ao tegumento do
esporocisto de S. mansoni, sendo um importante fator na determinação de suscetibilidade à
infecção pelo S. mansoni em diferentes linhagens geográficas de B. tenagophila. Na tentativa
de verificar esta hipótese, os hemócitos de caramujos B. glabrata (linhagem BH de caramujos
altamente susceptível) e B. tenagophila Cabo Frio (linhagem de susceptibilidade moderada) e
Taim (linhagem completamente resistente) foram submetidos a marcação com diferentes
lectinas conjugados com FITC (ConA, PNA, SBA e WGA) e analisados em microscópio de
fluorescência. Os resultados demonstraram que todas as lectinas testadas foram capazes de se
ligar superfície dos hemócitos, entretanto, a marcação apresenta diferenças significativas em
células isoladas de diferentes espécies de caramujo. B. tenagophila apresentou um maior
proporção de hemócitos marcados em relação a B. glabrata. Além disso, a maioria dos
hemócitos circulantes de B. tenagophila foi marcada intensamente pelas lectinas PNA e
13
WGA, enquanto os hemócitos de B. glabrata, principalmente por ConA. Durante infecção por
S. mansoni, hemócitos marcados por lectinas quase desaparece da hemolinfa do Taim e
acumula em B. glabrata BH.
Para verificar a relevância funcional das lectinas, hemócitos e hemolinfa de
caramujos B. glabrata e B. tenagophila (Cabo Frio e Taim) foram incubados com
esporocistos de S. mansoni, axenicamente transformados, na presença ou não de carboidratos
N-acetilglicosamina e Galactosamina. Após 6 horas de incubação, foi analisado o índice de
adesão celular aos esporocistos e medida a viabilidade do parasito. As análises demonstraram
que hemócitos circulantes de B. glabrata não são capazes de produzir encapsulamento dos
esporocistos, in vitro, e, conseqüentemente, não ocorre mortalidade expressiva do parasito.
Desta forma, a adição de diferentes concentrações de carboidratos também não modificou o
padrão de adesão dos hemócitos ou a baixa mortalidade dos esporocitos observada em B.
glabrata. Em contraste, o índice de adesão celular de B. tenagophila, Taim e Cabo Frio ao
esporocistos, foi maior, resultando em maior mortalidade dos mesmos, especialmente no caso
de hemócitos isolados de B. tenagophila Taim. Tanto a adesão quanto a capacidade de
destruição dos esporocistos, foram potencializadas na presença da fração solúvel hemolinfa.
Hemócitos da linhagem Cabo Frio têm o índice de adesão aumentado pela presença de
carboidratos em baixa concentração, enquanto que a linhagem Taim, que apresenta os maiores
índices de adesão celular, esta foi amplamente inibida na presença das concentrações mais
altas de N-acetilglicosamina e Galactosamina. A inibição da adesão de hemócitos de B.
tenagophila Taim ao tegumento do parasito resultou em uma expressiva diminuição da
mortalidade dos mesmos. Tais dados sugerem que a resistência da linhagem Taim de B.
tenagophila possa estar relacionada quantidade e qualidade das lectinas presentes em sua
hemolinfa e/ou à expressão de ligantes (carboidratos) na superfície dos hemócitos
Durante a incubação de hemócitos circulantes de Biomphalaria, principalmente
quando infectados pelo S. mansoni, estes se revelaram capazes de produzir radicais reativos
de nitrogênio. A produção de NO se mostrou dependente do tempo de incubação e do
estímulo utilizado. Na presença de esporocistos de S. mansoni transformados in vitro, os
hemócitos produziram os maiores valores de NO em comparação aos incubados com antígeno
solúvel de ovos (SEA). Entretanto, não foram detectadas diferenças significativas na
produção de NO entre as espécies B. glabrata e B. tenagophila.
14
ABSTRACT
Mollusks of the genus Biomphalaria, intermediate hosts of the Schistosoma mansoni,
possess an internal system of defense (ISD) that is composed by circulating cells,
denominated hemocytes, and soluble factors present in the hemolymph. The circulating
hemocytes are normally found around trematode larvae in the resistant strains of snail,
although it is not completely know how the hemocytes destroy the parasite. As in other
gastropodes, the circulating hemocytes of Biomphalaria are not a homogeneous cell
population and it is believed that the different cell types would be involved in a different way
in the destruction of the parasite.
One of the objects of this work is the profile characterization, through the flow
cytometry analysis, of the circulating hemocyte population isolated from B. tenagophila Taim
(resistant to S. mansoni), B. tenagophila Cabo Frio (partially susceptible to S. mansoni) and
B. glabrata BH (highly susceptible to S. mansoni) during the infection for S .mansoni. Using
the flow cytometry, and analysing size and granulocyty, it was possible to identify two
distinct hemocytes populations, denominated population of small hemocytes and of big
hemocytes. In non-infected B. tenagophila snails of both strains, Taim and Cabo Frio, the
small hemocytes population represented about 30% of the total of circulating hemocytes,
while big hemocytes about 70%. Meantime, in B. glabrata, the population of small hemocytes
represents about 56%, while the large hemocytes 44%. After the infection with S. mansoni,
variations were observed in the profile of circulating hemocytes, mainly in the first hours of
infection that corresponds to the decrease of the percentage of small hemocytes. Those
variations were absent in B. glabrata and significantly outstanding in the B. tenagophila
Taim. As demeonstrated in previous work and confirmed in this study for all the species
and/or strains of Biomphalaria tested, silica inoculation in snails leads to reduction of
circulating granulocytes. In the analysis of circulating hemocytes by flow cytometric, it was
observed decrease in the percentage of small hemocytes. Moreover, the proportion increase in
the small hemocyte population induced by S. mansoni infection was not detected until 72 hpi
in B. tenagophila. The decrease in the population of small hemocytes would suggest that slica
acts on small granulocytes that are part of the population of small hemocytes. The sílica also
changes the granulocyty of the hemocytes, mainly in Taim B.tenagophila's strain.
Soluble elements of the snail hemolymph act sinergicallu with the hemocytes in the
parasite destruction, among the soluble elements lectins have been identified. The lectins were
clearly showed in the hemolymph of mollusks as being a factor that agglutinate and
opsonined particles and that can mediate the recognition of strange particles and/or parasites.
In the mollusks, the lectins are secreted by the hemocytes and they can be soluble in the
hemolymph or in the surface of the circulating hemocytes. Therefore, lectins and/or lectin-
ligants can be important markers of hemocytes activation in Biomphalaria. Moreover,
variation on lectin label on hemocytes would result in deficient parasite recogniton that
explain the variations in the susceptibility levels to the infection for S.mansoni observed in the
different geographical strain of B.tenagophila, as well as it would help in the understanding of
the destruction process of parasites. With this intent, circulating hemocytes isolated from B.
glabrata BH (highly susceptible snail strain), B. tenagophila Cabo Frio (strain of moderate
susceptibility) and B. tenagophila Taim completely resistant snail strain) were incubated with
different lectins conjugated with FITC (ConA, PNA, SBA and WGA) and analyzed in
fluorescence microscope. The results demonstrated that although lectin-labelled hemocytes
were detected in hemolymph of all snail species tested, circulating hemocytes from both
strains of B. tenagophila showed a larger number of lectin-labelled cells than B. glabrata.
15
Moreover, most of circulating hemocytes of B. tenagophila were intensively labelled by
lectins PNA-FITC and WGA-FITC, while in B. glabrata small hemocytes were labeled
mainly by ConA. Upon S. mansoni infection, lectin-labelled hemocytes almost disappeared
from the hemolymph of Taim and accumulated in B. glabrata BH.
To verify the functional relevance of lectins, hemocytes plus hemolymph from B.
glabrata and B. tenagophila (Cabo Frio and Taim) were incubated with axenically tranformed
sporocysts of S.mansoni, in the presence or not of competing carbohydrates, N-
acetilglicosamina or Galactosamina. After 6 hours of incubation, the index of cellular
adhesion to the sporocysts as well as parasite dead was analyzed under microscope. The
results showed that the hemocytes from B. glabrata, in the presence of hemolymph or not,
showed low cellular adhesion index (CAI) to sporocysts leading to low parasite mortality, that
was not modified by addition of N-acetilglicosamina. In contrast, large number of hemocytes
from B. tenagophila adhered to S. mansoni sporocyts and cellular adhesion index was higher
in the presence of hemolymph, leading to high parasite mortality, especially in the Taim
strain. The addition of low concentration of Galactosamina or N-acetilglicosamina to the
hemocytes and hemolymph of Cabo Frio snail strain resulted in increased adhesion index. The
experiments using hemocytes and hemolymph from Taim snail strain resulted in the greatest
cellular adhesion index, with a high proportion of the sporocysts showing encapsulation
(CAI=3), however the cellular adhesion was inhibited, in a dose dependent manner, by
addition of N-acetilglicosamina, and less intensively by Galactosamina. Moreover, the
inhibiton of cellular adhesion to sporocysts associated with lower mortality rate. Such data
suggest the resistance of Taim strain of B.tenagophila can be related to quality and quantity of
lectins present in the hemolymph, as well as to lectin ligants expressed on hemocytes.
Finally, our experiments demonstrated that circulating hemocytes from S. mansoni-
infected Biomphalaria were able to produce nitrogen reactive metabolite, such as nitric oxide,
in response to in vitro activation with sporocysts or S. mansoni soluble egg antigen (SEA).
However, there was no significant difference in NO production between the species
B.glabrata and B.tenagophila.
16
1. INTRODUÇÃO
O esclarecimento de mecanismos envolvidos na resistência de moluscos do gênero
Biomphalaria ao Schistosoma mansoni representa uma importante arma epidemiológica
principalmente na caracterização das possíveis áreas endêmicas da esquistossomose. No
estudo da interação parasito-hospedeiro intermediário tem-se utilizado o modelo experimental
S. mansoni / B. glabrata, sendo que a maioria dos trabalhos é realizada in vitro. A espécie B.
tenagophila, apesar de apresentar linhagens totalmente resistentes a infecção por diversas
cepas de S. mansoni testadas, e ser a segunda espécie transmissora em importância
epidemiológica no Brasil, ainda é muito pouco estudada.
O hemócito circulante é considerado o principal componente funcional do sistema de
defesa interna dos moluscos. A resistência de moluscos à infecção por S. mansoni tem sido
atribuída à capacidade destas células em envolver e destruir o esporocisto. Neste processo.
ocorre a produção de superóxidos e fagocitose de partes do tegumento do parasito (van der
Knaap & Loker, 1990).
Estudos preliminares, objetivando a caracterização de hemócitos circulantes de
moluscos, sugerem uma grande variação morfo-funcional desta população celular (Granath &
Yoshino, 1983; Barraco et al., 1993; Matricon-Gondran & Letorcart, 1999). A existência de
subpopulações de hemócitos, que possam ser diferencialmente ativados, pode estar associada
às diferenças na suscetibilidade à infecção observada entre estes caramujos.
Os mecanismos que regem a interação entre S. mansoni e os caramujos do gênero
Biomphalaria não estão totalmente esclarecidos. Ainda há discordâncias, principalmente em
relação aos aspectos celulares desta interação. Há uma carência muito grande de estudos que
abordem este aspecto da associação parasito-hospedeiro utilizando outras espécies de
Biomphalaria que transmitem esquistossomose no Brasil, como é o caso de B. tenagophila e
B. straminea.
17
B. tenagophila é, dentre as demais espécies transmissoras no país, a que possui as
maiores variações na taxa de resistência ao S. mansoni, apresentando linhagens suscetíveis e
linhagens totalmente resistentes à infecção pelo parasito. Em estudos anteriores (Martins-
Souza et al. 2003), foi demonstrado que a B. tenagophila da linhagem Taim apresenta total
resistência à infecção por S. mansoni, que mesmo após a destruição parcial da população dos
hemócitos circulantes, a resistência à infecção manteve-se inalterada. Este resultado
incentivou o estudo da determinação de possíveis fatores relacionados à resistência desta
linhagem.
O primeiro passo para o esclarecimento do mecanismo pelo qual o sistema de defesa
de algumas linhagens de B. tenagophila é capaz de destruir esporocistos de S. mansoni,
enquanto outras não, consiste na caracterização comparativa da população de hemócitos
circulantes e de suas alterações no decorrer da infecção. Este trabalho pretende caracterizar
fenotipicamente e morfologicamente a população de hemócitos, através da utilização de
Citometria de Fluxo. A técnica de Citometria de Fluxo apresenta-se como uma importante
ferramenta na caracterização de diferentes tipos celulares e sua utilização em invertebrados
tem sido recentemente relatada com resultados bastante esclarecedores (Amen et al., 1992;
Johnston & Yoshino, 2001).
Além disso, torna-se importante o estudo da associação dos hemócitos com os
fatores solúveis da hemolinfa, destacando-se neste caso em especial, as lectinas. A descrição
precisa da ação destas proteínas, bem como sua influência sobre subpopulações de hemócitos,
e que tipo de células são responsáveis por sua síntese, necessitam de estudos mais detalhados.
Acredita-se que lectinas possam ser importantes marcadores de ativação celular para
hemócitos de Biomphalaria. Estes marcadores poderão explicar as variações nos níveis de
18
suscetibilidade à infecção pelo S. mansoni observadas nas diferentes linhagens geográficas de
B. tenagophila, além de auxiliar no entendimento do processo de destruição do parasito.
Finalmente, apesar de vários autores relatarem a presença de produtos derivados de
oxigênio e nitrogênio produzidos pelos hemócitos, como tendo um papel importante na morte
do parasito, falta esclarecer por qual(is) a(s) via(s) estes produtos são originados, qual o
melhor estímulo e como eles são produzidos em diferentes linhagens e espécies de
Biomphalaria.
Estes conhecimentos, além de contribuírem para o esclarecimento dos mecanismos
de proteção desenvolvidos por hospedeiros invertebrados, também serão de grande valia na
definição de novas estratégias de controle da população de linhagens de Biomphalaria sp
altamente suscetíveis ao parasito.
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Aspectos gerais
O Schistosoma mansoni é um helminto da classe Trematódea, causador da
esquistossomose mansoni, doença debilitante que afeta milhões de pessoas especialmente em
algumas regiões da América Latina e África. É um parasito que apresenta um ciclo biológico
complexo, pois envolve um hospedeiro intermediário e um definitivo para completar seu
desenvolvimento. Na fase sexuada, o parasito pode ser encontrado em algumas espécies de
mamíferos, inclusive o homem, seu principal hospedeiro definitivo. Sua multiplicação
assexuada ocorre no hospedeiro intermediário, que necessariamente são moluscos do gênero
Biomphalaria.
2.2. Morfologia dos moluscos do gênero Biomphalaria
Os moluscos do gênero Biomphalaria apresentam concha discoidal, variando de 7 a
40 cm de diâmetro; apresentam hemolinfa pigmentada devido à presença de hemoglobina e
tubo renal em forma de J.
Entre as dez espécies de moluscos do gênero Biomphalaria descritas no Brasil,
apenas três foram encontradas naturalmente infectadas pelo S. mansoni: a B. glabrata, a B.
tenagophila e a B. straminea (Paraense, 1970). A distribuição da esquistossomose pelo
território brasileiro coincide com a distribuição geográfica destas três espécies, principalmente
com a da B. glabrata.
A espécie B. glabrata se caracteriza por apresentar concha com até 40 cm de
diâmetro e 11 mm de largura, seis a sete giros arredondados. Apesar da descrição
característica da concha da espécie, alguns exemplares podem apresentar morfologia que foge
à referida descrição, o que leva a concha não ser um parâmetro ideal para a identificação da
20
espécie. Por outro lado, a B. glabrata apresenta características internas típicas que são
utilizadas para a sua identificação. Dentre estas se destaca a presença de crista renal
pigmentada ao longo da superfície ventral do tubo renal em indivíduos adultos e a linha
pigmentada em indivíduos jovens. Tal característica não pode ser vista em nenhuma outra
espécie deste gênero. Além da crista renal pigmentada, a B. glabrata apresenta ovoteste com
mais de 350 divertículos; presença de bolsa vaginal; porção média da bainha do pênis
aproximadamente do mesmo diâmetro que a porção mais larga do canal deferente.
A B. tenagophila apresenta concha com até 35 cm de diâmetro e 11 mm de largura;
sete a oito giros, carena (angulação longitudinal na lateral da concha) em ambos os lados,
sendo mais acentuada à esquerda. A presença da carena normalmente só é vista nesta espécie,
porém podem ser encontrados indivíduos B. glabrata mais largos e com esta característica, ou
mesmo B. tenagophila em que esta está ausente. Sendo assim estas espécies podem ser
confundidas se forem levadas em conta apenas as características das conchas. Em relação à
anatomia interna da B. tenagophila, esta espécie difere de B. glabrata pela ausência de linha
ou crista renal pigmentada e presença de ovoteste com mais de 150 e menos de 350
divertículos.
A terceira espécie, B. straminea, apresenta concha com até 16,5 cm de diâmetro e 6
mm de largura; cinco giros arredondados. Internamente, B. straminea apresenta um
enrugamento na parede dorsal da vagina, o que lhe diferencia de B. glabrata e B. tenagophila.
Apesar das características morfológicas marcantes, a diferenciação das três espécies
tem sido realizada através da biologia molecular.
2.3. Moluscos e a transmissão da esquistossomose
21
Epidemiologicamente, a principal espécie transmissora da esquistossomose no Brasil
é a B. glabrata. Esta espécie encontra-se amplamente distribuída pelo território brasileiro,
principalmente na região Sudeste e na região Nordeste (Paraense 1986). Nestas regiões,
destaca-se a presença de B. glabrata nos estados de Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de
Janeiro, Goiás, São Paulo e Paraná (Souza e Lima, 1990). Recentemente, Carvalho et al.
(1998) relataram a presença de B. glabrata no Estado do Rio Grande do Sul. B. glabrata
apresenta as maiores taxas de suscetibilidade ao parasitismo pelo S. mansoni, o que faz com
que esta seja a espécie de escolha para trabalhos experimentais, visando esclarecer os
mecanismos que regem a interação entre o parasito e seu principal hospedeiro intermediário.
B. straminea apresenta uma densidade populacional alta no Nordeste brasileiro, mas
apresenta baixas taxas de infecções naturais. Assim, esta espécie é responsável pela
transmissão de S. mansoni em várias áreas do Nordeste brasileiro, sendo a única hospedeira
do S. mansoni no Estado do Ceará (Souza e Lima, 1990).
Atualmente, B. tenagophila é encontrada desde a Argentina (Patagônia) até o sul do
Estado da Bahia (Paraense, 2001). Esta espécie vem apresentando crescente importância
epidemiológica na transmissão da esquistossomose, devido à descoberta de novos focos
mantidos por ela no país, principalmente nas regiões Sul e Sudeste. No Brasil, B. tenagophila
pode transmitir a esquistossomose em algumas regiões nos estados do Rio de Janeiro e vem
sendo responsável por muitos casos autóctones de esquistossomose diagnosticados no estado
de São Paulo. Casos de transmissão da doença em regiões com B. tenagophila também têm
sido descritos em Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Paraense & Corrêa 1987, Espíndola et
al. 1992, Graeff-Teixeira et al., 1999), ampliando sua distribuição pelo território brasileiro e
sua importância na transmissão da esquistossomose. Em Minas Gerais, B. tenagophila pode
ser encontrada nas regiões do Norte de Minas, Vale do Jequitinhonha, Vale do Mucuri, Vale
22
do Rio Doce, na Zona da Mata e na região Central do Estado, como a área Metropolitana de
Belo Horizonte, sendo estas regiões consideradas como endêmicas para a esquistossomose
(Souza et al., 2001). Na região Metropolitana de Belo Horizonte, destaca-se a presença de B.
tenagophila nos municípios de Belo Horizonte (Milward, 1972), Jaboticatubas (Melo, 1982) e
em Itajubá (Souza e Lima, 1990).
As diversas linhagens geográficas de B. tenagophila possuem variado grau de
resistência à infecção pelo S. mansoni, sendo encontradas algumas suscetíveis e outras
totalmente resistentes ou refratárias (Coelho, 1995). Em comparação com a B. glabrata, B.
tenagophila apresenta-se mais resistente à infecção pelo S. mansoni (Silva et al., 1994; Souza
et al., 1995), entretanto, estudos com diferentes linhagens geográficas brasileiras de B.
tenagophila, na tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos nesta resistência, constituem
tema de investigação praticamente inexplorado.
Estudo comparativo analisou os níveis de suscetibilidade de B. glabrata originária de
Belo Horizonte, B. tenagophila do lago da Pampulha (Belo Horizonte) e B. straminea da
cidade de Paracatu (MG), à infecção experimental por uma cepa de S. mansoni originada do
Estado de Alagoas, obtendo os seguintes índices de infectividade: B. glabrata - 75,3%, B.
tenagophila – 32,6% e B. straminea – 11,3% (Souza et al. 1997).
O grau de compatibilidade entre o Schistosoma e os moluscos é determinado pela
constituição genética tanto do parasito como de seu hospedeiro intermediário (Basch, 1976).
Newton (1953) foi o primeiro a sugerir que a suscetibilidade dos moluscos B. glabrata ao S.
mansoni é condicionada por fatores genéticos. Posteriormente, estes resultados foram
confirmados por Richards (1973), que também demonstrou que o caráter de resistência,
adquirido pelo molusco na maturidade, é determinado por um único gene dominante, com
herança mendeliana. Por outro lado, Kagan & Geiger (1965) demonstraram a importância da
23
constituição genética do parasito, na determinação dos índices de infecção de linhagem albina
de B. glabrata.
Além dos fatores genéticos, o desenvolvimento do S. mansoni no molusco também é
influenciado por fatores ambientais, por aspectos comportamentais do miracídio e do
caramujo. A associação de S. mansoni com o hospedeiro intermediário tem se mostrado
altamente específica e restritiva ao desenvolvimento do parasito. Exemplificando, é possível
encontrar inúmeras espécies de mamíferos, pertencentes aos vários gêneros, que podem atuar
como hospedeiros definitivos (Adema e Loker, 1997), entretanto, somente poucas espécies de
moluscos do gênero Biomphalaria permitem o desenvolvimento do miracídio de S. mansoni
(Basch, 1976). Algumas linhagens do parasito podem ser restritas a uma única espécie de
Biomphalaria, ou até mesmo a uma determinada linhagem geográfica dessa espécie de
molusco, o que determina as variações na suscetibilidade dos caramujos em relação ao S.
mansoni
Este conjunto de fatores interfere no nível de susceptibilidade das espécies de
Biomphalaria que transmitem o parasito no Brasil. Desta forma, analisando populações de B.
glabrata de diferentes localidades Paraense & Corrêa (1963) relataram que as diferentes
linhagens desta espécie apresentavam suscetibilidade variável de 0 a 100% frente a uma única
cepa do S. mansoni de Belo Horizonte – Minas Gerais. De maneira semelhante, Paraense &
Corrêa (1978) testaram a suscetibilidade de B. tenagophila de 18 localidades do Brasil à
infecção por uma determinada linhagem de S. mansoni, e encontraram taxas de infectividade
que variaram de 0 a 91,5%. Corrêa et al. (1979), estudaram a suscetibilidade de duas
linhagens de B. tenagophila (uma isolada de Belo Horizonte, MG, e outra de Cabo Frio, RJ) e
uma de B. glabrata (isolada de Santa Luzia, MG) frente à infecção por duas cepas de S.
mansoni (LE – Belo Horizonte, MG e SJ – São José dos Campos, SP). Neste estudo, foi
24
demonstrado que a linhagem de B. glabrata se infecta com as duas cepas de S. mansoni
empregadas. Já B. tenagophila de Belo Horizonte e Cabo Frio não apresentaram nenhum
exemplar infectado com a cepa LE, porém se mostraram suscetíveis à infecção pela cepa SJ,
sendo que a B. tenagophila de Cabo Frio apresentou 100% suscetibilidade. Martins-Souza
(1999), demonstrou que caramujos B. tenagophila de Cabo Frio são mais susceptíveis à cepa
LE de S. mansoni, uma vez que estes apresentaram taxa de positividade que pode chegar a
40%. Uma população de B. tenagophila originária da Lagoa da Pampulha, Belo Horizonte, foi
testada por Souza et al. (1987), quanto a sua potencialidade em se tornar hospedeira de
diferentes cepas de S. mansoni. Para tanto os autores utilizaram as cepas "LE" e "HK" (de
fezes de pacientes residentes próximo a Pampulha) de Belo Horizonte, "AL" de Alagoas e
"SJ" de São Jose dos Campos, São Paulo e as taxas de infecção obtidas foram de 4% (cepa
"LE"), 6% (cepa "HK"), 30% (cepa "SJ") e 40% (cepa "AL"). A variação do grau de
resistência da B. tenagophila pela cepa LE de S. mansoni, foi confirmada por Silva et al.
(1994). Neste trabalho, os autores demonstraram que a terceira geração de B. tenagophila
proveniente de Ouro Branco (MG), apresentou apenas 2% de positividade para infecção com
a cepa LE de S. mansoni. Sendo assim, nos estudos epidemiológicos da esquistossomose
tornar-se importante verificar a taxa de suscetibilidade e/ou resistência de uma linhagem local
de Biomphalaria frente às diversas cepas de S. mansoni, e a partir daí determinar o potencial
da área tornar-se ou não endêmica para a esquistossomose, em função da origem dos
migrantes portadores da doença.
A variação na suscetibilidade de Biomphalaria frente ao S. mansoni tem sido
relacionada à sua origem geográfica (adaptabilidade), às diferenças de idades e as variações
genéticas dos moluscos (Richards, 1976a, b; 1977; Richards & Shade 1987). Em última
análise, estes diferentes fatores podem interferir no sistema de defesa interno do molusco,
25
influenciando a determinação da suscetibilidade ou resistência de Biomphalaria à infecção
pelo S. mansoni.
26
2.4. Relação parasito – hospedeiro
2.4.1. Hospedeiro definitivo
O ciclo vital do S. mansoni foi estudado, em seus aspectos gerais, por Lutz (1917,
1919). A evolução do S. mansoni dentro de seu hospedeiro definitivo, inicia-se pela
penetração ativa das cercárias, através da pele e mucosa do hospedeiro. Este processo de
penetração pode levar de 5 a 15 minutos (Coelho, 1957, 1970). Durante a penetração, as
cercárias perdem a cauda e sofrem transformações estruturais e fisiológicas dando origem aos
esquistossômulos (Standen,1951). Estes migram em direção aos vasos sangüíneos e, através
da circulação, atingem os pulmões. Dos pulmões, os esquistossômulos chegam ao fígado onde
completam seu desenvolvimento atingindo a maturidade sexual. Depois de migrarem para as
veias mesentéricas inferiores, os vermes acasalados iniciam a postura de ovos em torno de 35
dias após infecção. Segundo Moore & Sandground (1956), em hamsters infectados, as fêmeas
de S. mansoni produzem cerca de 300 ovos por dia, sendo que somente 22% destes ovos saem
nas fezes, 18 % ficam retidos na parede do intestino grosso, 32% no intestino delgado,
enquanto 25% são carregados para o fígado e 2% para outros órgãos. Os ovos retidos nos
tecidos estimulam reações granulomatosas, fundamentais na patogenia da esquistossomose
mansoni.
27
2.4.2. Hospedeiro Intermediário
Os ovos maduros de S. mansoni eliminados no ambiente através de fezes dos
hospedeiros, contêm embriões ciliados, denominados miracídios. Em contato com a água,
estes eclodem dos ovos e nadam ativamente a procura do hospedeiro intermediário - moluscos
do gênero Biomphalaria. Alguns autores sugerem a existência de um mecanismo de atração
de miracídios mediado por substâncias secretadas pelo hospedeiro intermediário (Lutz, 1919;
Faust e Hofmann, 1934; Brumpt, 1940; Kloetzel, 1958; Leiper & Atkinson,1975). Chernin
(1970, 1974) demonstrou que os moluscos produzem substâncias que estimulam a
concentração de miracídios e sua movimentação nas proximidades do caramujo, este processo
resulta no aumento da eficiência da penetração do trematódeo. Entretanto, essas substâncias
não promovem uma atração seletiva do miracídio em relação ao caramujo Biomphalaria, pois
estes miracídios excitados, podem penetrar em moluscos de outros gêneros, ou mesmo em
substrato gelatinoso (Chernin, 1974).
Outro fator que influencia fortemente a penetração dos miracídios no molusco é a
temperatura. Maldonado & Acosta-Matienzo (1974) mostraram que a redução de 1
o
C na
temperatura (de 26
o
C para 25
o
C) produz uma redução na taxa de infecção dos moluscos de
80% para 40%.
Após a localização do hospedeiro intermediário, o miracídio tem o primeiro contato
com o tecido do molusco e inicia-se o processo de penetração ativa. O miracídio de S.
mansoni pode penetrar por qualquer ponto das partes expostas do caramujo, porém, a base das
antenas e o pé são os locais mais utilizados (Coelho, 1957). O contato do miracídio com o
tegumento do molusco ocorre inicialmente através do terebratorium, órgão localizado na
extremidade anterior da larva, que, ao contato com o molusco, assume a forma de ventosa.
Simultaneamente, o conteúdo das glândulas de adesão, localizadas lateralmente ao
28
terebratorium é excretado. A ação combinada das enzimas digestivas das glândulas de
penetração e dos movimentos contráteis e rotatórios intensos podem resultar na penetração da
larva do parasito pelo epitélio e o seu estabelecimento no tecido subcutâneo do molusco
(Coelho, 1957). Durante a penetração no caramujo, os miracídios liberam o conteúdo das
glândulas de adesão e penetração e perdem suas placas ciliares. Durante este processo
também são observadas alterações estruturais na musculatura subepitelial e sistema nervoso.
Após a penetração inicia-se o desenvolvimento de células germinativas, e passadas 72 horas, a
larva dobra de tamanho e é denominada de esporocisto primário (Coelho, 1957). Na segunda
semana da infecção, observam-se alterações nas estruturas internas do esporocisto primário,
quando suas células germinativas encontram-se em franca multiplicação, e, em condições
ideais de temperatura (entre 25 e 28ºC), estas originam os esporocistos secundários (Faust &
Hoffmann, 1934; Maldonado & Acosta-Matienzo, 1947; Oliver & Mao, 1949; Pan, 1965;
Pereira et al., 1984). A formação do esporocisto secundário inicia-se com um aglomerado de
células germinativas nas paredes do esporocisto primário, verificando-se uma vacuolização
acentuada na parte central da larva. Esses aglomerados se reorganizam e dão origem a septos,
ficando o esporocisto primário dividido em 150 a 200 camadas, cada septos ou camada já
podendo ser considerado um esporocisto secundário.
As paredes desse esporocisto apresentam uma dupla camada muscular, logo abaixo
da camada cuticular, apresentando fibras musculares longitudinais e transversais. Esta
musculatura, associada à formação de espinho na parte mais externa da cutícula, terá papel
fundamental na motilidade e na capacidade de migração intratissular das larvas. A migração
processa-se ativamente através dos tecidos do molusco. A migração dos esporocistos
secundário do local de penetração do miracídio onde a maioria se desenvolve, até as glândulas
digestivas ou hepatopâncreas, leva de 2 a 3 dias.
29
A localização final dos esporocistos será nos espaços intertubulares da glândula
digestiva, local com riqueza nutritiva onde começam, então, a sofrer profundas modificações
anatômicas no conteúdo de células germinativas (Melo e Coelho, 2005). Nas glândulas
digestivas, os esporocistos secundários sofrem transformações anatômicas e suas células
germinativas podem originar as cercárias. Segundo Jourdane et al. (1980) alguns esporocistos
secundários também podem originar outra geração esporocistos, que poderão gerar cercárias
ou novos esporocistos. De acordo com estes autores, a produção de novas gerações de
esporocistos forneceria a única explicação plausível para uma prolongada eliminação de
cercárias nos caramujos infectados, pois isso não ocorrendo, deveria haver uma exaustão no
processo de formação cercariana a partir de esporocistos secundários.
O desenvolvimento de S. mansoni em Biomphalaria, desde a penetração do
miracídio até a produção de cercárias e sua emergência para o meio aquático, pode ocorrer
dentro de um período de 27 a 30 dias, em condições ideais de temperatura (cerca de 28ºC).
Um único miracídio pode gerar cerca de 300 mil cercárias (Faust & Hoffman, 1934), sendo
que cada miracídio já leva definido o sexo das cercárias que serão produzidas.
O sucesso do desenvolvimento do S. mansoni em seus hospedeiros dependerá da
capacidade do parasito em: (1) encontrar e penetrar hospedeiros compatíveis; (2) adaptar-se à
condição de stress, como variação de fatores fisiológicos (osmolaridade, pH, concentração de
O
2
e CO
2
, e concentração de glicose) que ocorre na passagem do hospedeiro definitivo para o
meio aquático e daí para o hospedeiro intermediário; (3) escapar do sistema de defesa dos
hospedeiros e (4) obter nutrientes para o seu crescimento e reprodução.
A complexidade da resposta imune do hospedeiro vertebrado à infecção pelo S.
mansoni vem sendo estudada em vários aspectos. No molusco hospedeiro intermediário, Van
der Knaap & Loker (1990), descrevem um sistema interno de defesa compreendendo
30
elementos celulares e humorais que agem juntos na destruição de agentes patógenos. No caso
da infecção pelo S. mansoni, observa-se uma variação na intensidade dos mecanismos
funcionais de defesa, entre diferentes espécies e linhagens geográficas dos moluscos, que
pode estar relacionada com diferentes graus de suscetibilidade ou resistência à infecção
(Martins-Souza, 1999). A relação entre as diferenças na suscetibilidade de algumas linhagens
de Biomphalaria a infecção pelo S. mansoni e os diferentes mecanismos de defesa
desenvolvidos por estes hospedeiros durante a infecção, ainda apresenta-se como uma linha
de pesquisa pouco explorada.
31
2.5. Sistema de defesa interna do molusco
O sistema interno de defesa dos caramujos é composto de elementos celulares,
constituídos pelos hemócitos ou amebócitos, e por fatores solúveis presentes na hemolinfa.
2.5.1. Elementos celulares
Os hemócitos podem estar livres, circulantes na hemolinfa, ou estarem fixos nos
tecidos. A hemolinfa dos Planorbideos circula em um sistema semi-aberto, impulsionada pelo
coração, de onde parte a artéria aorta, que se ramifica para diversos tecidos, drenando nos
seios venosos e retornando ao coração pelas veias pulmonar e renal, após ser re-oxigenado na
parede pulmonar. O coração, envolto pela membrana do pericárdio, é dividido em duas
câmaras, a aurícula, que recebe hemolinfa da cavidade pulmonar, e o ventrículo, que impele a
hemolinfa através da aorta. A aorta se divide em duas artérias: a visceral, a qual irriga a parte
posterior do corpo do caramujo, incluindo os sistemas digestivo e genital, e a cefálica, que
atinge a toda região cefalopodal. As artérias se esvaziam nos espaços pseudovasculares dos
tecidos, acumulando hemolinfa em três seios venosos: cefalopodal, visceral e sub-renal,
retornando para o coração após circular pelo rim e pulmão (Baker, 1945; Paraense, 1970).
Os hemócitos podem ser produzidos por vários tecidos hematopoiéticos. Em B.
glabrata e Bulinus sp., foi identificada uma região bem definida, localizada entre o pericárdio
e o epitélio posterior da cavidade do manto, que provavelmente é o principal local de
formação de hemócitos, também designado de APO (“amebocyte producing organ”). Em
animais não estimulados, esta região se caracteriza como uma estrutura pequena, pouco
espessa e conspícua, sendo formada por células arredondadas e alongadas, que apresentam
citoplasma basófilo e núcleo oval ou alongado (Lie et al., 1976). Observações recentes
(Sullivan et al., 2004) mostraram um aumento de mitoses nas células desta região, ente 24 -
32
72 h após inoculação de antígenos de miracídios ou cercárias de S. mansoni. A observação de
células em processo de mitose foi muito maior em linhagem resistente de B. glabrata, que em
susceptíveis.
Outras regiões descritas como capazes de produzir hemócitos são a porção sacular
dos túbulos renais, margeando o pericárdio e, ocasionalmente, a região dorsal do reto.
Contudo, o número de mitoses e a população de células nestes sítios foram menores do que as
observadas no APO. A transferência do pericárdio de B. glabrata resistente (linhagem 13-16-
R1) à infecção por S. mansoni para a linhagem susceptível NIH resultou em redução de
esporocistos íntegros no tecido e na diminuição na produção de cercárias (Sullivan & Spence,
1994). A redução da susceptibilidade somente foi observada quando o pericárdio implantado
era de doador de linhagem resistente e havia sido previamente exposto a miracídios de S.
mansoni. A observação histológica destes implantes de doadores resistentes revelou a
presença de hemócitos em processo de mitose (Sullivan et al., 1995). Outras regiões retiradas
de B. glabrata resistente, como manto, coração, rim, glândulas digestivas, glândula do
albumen e genitais não produziram alterações na susceptibilidade de B. glabrata NIH à
infecção por S. mansoni (Sullivan & Spence, 1999). A transferência da região do pericárdio
de B. tenagophila da linhagem Taim (completamente resistente ao parasito) para B.
tenagophila susceptíveis resultou, na grande maioria dos casos, em uma proteção absoluta ao
desafio com miracídios de S. mansoni, sendo que a transferência de proteção ocorreu mesmo
sem exposição prévia do doador de APO ao parasito. Estes resultados demonstram a
importância dos hemócitos na resistência ao parasito observada nesta linhagem de caramujo
(Barbosa et al, manuscrito em preparação).
Vários autores acreditam que os hemócitos são os principais efetores do sistema de
defesa do molusco, atuando principalmente através fagocitose de partículas ou
33
microrganismos ou pelo encapsulamento de grandes invasores, como é o caso das larvas de
helmintos (Lutz, 1919; Loker et al., 1986; Adema & Loker, 1997). Os hemócitos também
produzem fatores solúveis que são lançados na hemolinfa ou estão expressos em sua
membrana, que estarão envolvidos no reconhecimento e na destruição de agentes patogênicos.
A participação de elementos celulares de B. glabrata na reação à infecção pelo S. mansoni e
outros trematódeos foi descrita inicialmente em estudos histológicos, nos quais foi
evidenciada intensa concentração celular ao redor do miracídio recém penetrado (Newton,
1952; Brooks,1953; Coelho & Barbosa, 1956; Coelho, 1957, 1962; Lie et al.,1987; Guaraldo
et al, 1981; Martins-Souza, 1999).
Os hemócitos de invertebrados, em geral, apresentam heterogeneidade morfológica,
bioquímica e funcional. Segundo Sminia (1981), apesar de vários estudos caracterizarem a
função e estrutura das células circulantes em Gastropoda, ainda não existe uma concordância
entre o número e os tipos celulares nestes animais. Este autor considera a população de
hemócitos circulantes de Gastropoda como sendo uma população composta de um único tipo
celular, sendo assim, as diferenças morfológicas observadas nos hemócitos circulantes
correspondem aos diferentes estágios de maturidade destas células. A diferença no estágio de
desenvolvimento dos hemócitos acarreta variação em sua capacidade funcional. As células
jovens, morfologicamente caracterizadas como células pequenas e arredondadas, apresentam
uma grande atividade mitótica e uma baixa atividade fagocitária, enquanto que as maduras,
maiores e com prolongamentos citoplasmáticos, têm pouca atividade mitótica, mas alta
atividade fagocitária (Sminia, 1981).
Entretanto, a existência de diferentes populações celulares na composição de
hemócitos circulantes tem sido aceita por muitos autores e baseia-se em diferenças
morfológicas e ultraestruturais, expressão de alguns determinantes antigênicos e no conteúdo
34
enzimático destas células. Ottaviani (1992) sugere que a população de hemócitos circulantes
de moluscos gastrópodes, é constituída basicamente por dois tipos de hemócitos circulantes:
os hemócitos estrelados, que emitem pseudópodes e os hemócitos arredondados. Porém, em
alguns gastrópodes, somente um tipo celular é descrito e este pode ser considerado como os
hemócitos que emitem pseudópodes. Segundo Ottaviani (1992), os hemócitos estrelados são
células que apresentam atividade fagocitária, aderem ao vidro, ligam à Concanavalina A e
contêm ácido murânico; enquanto que os hemócitos arredondados não possuem atividade
fagocitária, não aderem ao vidro, proliferam em presença de Fitohemoaglutinina e apresentam
marcadores típicos de linfócitos T de vertebrados. O autor, neste estudo, conclui que os
hemócitos arredondados apresentam características semelhantes às de linfócitos T de
vertebrados, enquanto os hemócitos estrelados assemelham-se aos macrófagos.
Outros autores (Harris, 1975; Yoshino, 1976; Lo Verde et al., 1982; Lie et al., 1987;
Barraco et al., 1993) também fazem distinção de duas subpopulações de hemócitos na
hemolinfa de B. glabrata, designando-os de granulócitos e hialinócitos. Os granulócitos são
células arredondadas com pequenos pseudópodes, medindo aproximadamente de 7 a 11 µm
de diâmetro. Os granulócitos de Gastropoda, em geral, são considerados células morfo-
funcionalmente semelhantes aos macrófagos de mamíferos (Bayne et al., 1980 a). Baseado
nesta hipótese, Bezerra et al. (1997) demonstraram a realização de pinocitose pelos
granulócitos de Biomphalaria através de sua capacidade de incorporar vermelho neutro,
desenvolvendo assim uma técnica que permitiu quantificar estas células. Posteriormente,
Martins-Souza et al. (2003) mostraram que os granulócitos são parcialmente destruídos após a
inoculação de sílica, de maneira semelhante ao efeito relatado em macrófagos de mamíferos.
A destruição destes hemócitos resultou em um aumento significativo da suscetibilidade de B.
tenagophila à infecção pelo S. mansoni. Os hemócitos circulantes designados de hialinócitos
35
são usualmente menores, medindo cerca de 4 a 8 µm de diâmetro, apresentam contorno
circular quando em contato com vidro, ausência de pseudópodes extensos e citoplasma
contendo raras organelas e pouco ou nenhum corpo semelhante a lisossomo. Barraco et al.
(1993) mostraram que os hialinócitos representam cerca de 10% das células presentes na
hemolinfa de B. glabrata e tanto granulócitos quanto hialinócitos apresentam semelhanças
quantitativas e morfológicas em B. glabrata e B. tenagophila.
Apesar de observar as diferenças morfológicas entre as subpopulações de hemócitos
circulantes, Amen et al. (1991) acreditam que os hialinócitos sejam células precursoras dos
granulócitos. Esta hipótese também foi sugerida por Martins-Souza et al. (2003) que
demonstraram que a inoculação de sílica em caramujos B. tenagophila acarretava uma
diminuição passageira no número de granulócitos circulantes. À medida que a população de
granulócitos se restabelece, foi observado um aumento considerável na população de
hialinócitos, que chega a representar cerca de 50 % da população de hemócitos totais,
sugerindo que os hialinócitos possam estar envolvidos na reposição do nível de granulócitos.
Joky et al. (1983) foram capazes de diferenciar 4 subtipos celulares, entre a
população de granulócitos, através da associação de diferenças morfológicas, com a expressão
de receptores de lectinas na superfície celular.
Em um estudo quantitativo, Granath & Yoshino (1983) analisaram a distribuição e
abundância de enzimas lisossomais como fosfatase ácida, esterase não específica e peroxidase
em hemócitos de B. glabrata. Neste estudo, foi mostrado que, de maneira geral, os hemócitos
aderentes ao vidro, isolados de linhagens resistente e suscetível ao S. mansoni, apresentam
reação para as três enzimas testadas isoladamente e para fosfatase ácida e esterase não
específica testadas simultaneamente.
36
Matricon-Gondran & Letorcart (1999) identificaram três subpopulações de
hemócitos presentes na hemolinfa de B. glabrata, considerando o tamanho das células e
características ultra-estruturais e designando-as: hemócitos grandes, hemócitos de tamanho
médio e os pequenos hemócitos. A proporção de cada tipo celular em relação à população
total não pode ser determinada pelos autores, apesar de se notar que os hemócitos grandes e os
médios são os mais abundantes do que os pequenos hemócitos.
Johnston & Yoshino (2001) utilizaram a citometria de fluxo e caracterizaram, em B.
glabrata, dois tipos celulares a partir da marcação destes com anticorpos anti-hemócitos e
proteínas excreto secretadas de esporocistos conjugadas com partículas fluorescentes.
2.5.2. Elementos solúveis
A associação entre o sistema de defesa interna dos moluscos e agentes patogênicos,
do ponto de vista celular e molecular, é complexa e envolve além dos hemócitos circulantes e
fixos, os componentes solúveis da hemolinfa. Estes componentes solúveis podem interagir
diretamente com agentes patogênicos, através da produção substâncias tóxicas ou peptídeos
líticos ou indiretamente, através moléculas mediadoras do reconhecimento do patógeno ou
ativadores de hemócitos. Peptídeos com função antimicrobiana, denominadas mytilinas, são
produzidos e armazenados em grânulos de hemócitos, bem como são secretados na hemolinfa
de Mytilus galloprovincialis (Mitta et al., 2000). Apesar da participação destes peptídeos na
destruição de infecções bacterianas, não existem evidências da participação dos mesmos na
interação do molusco com parasitos metazoários. Sapp e Loker (2000 a e b) demonstraram
que na maioria das relações digenéico-gastrópoda incompatíveis, fatores presentes na
hemolinfa de gastrópoda, não relacionados a osmolaridade, matam o esporocisto após cerca
de 6 horas de incubação, mas a natureza destes fatores ainda não foi estabelecida.
37
Os hemócitos atuam juntamente com fatores solúveis presentes na hemolinfa no
processo de encapsulamento e destruição de agentes patogênicos, incluindo larvas de
trematódeos. Vários estudos têm sido desenvolvidos com o objetivo de se estabelecer qual a
importância dos fatores solúveis da hemolinfa nos mecanismos de defesa desenvolvidos pelos
moluscos durante a presença de agentes patogênicos.
Bayne et al. (1980
a, b) foram os primeiros a desenvolver métodos in vitro para
avaliar o efeito da hemolinfa de B. glabrata sobre o esporocisto primário de S. mansoni
transformado axenicamente, que facilitaram o estudo dos mecanismos de resistência na
associação parasito – hospedeiro. Nestes estudos, os autores mostraram que a hemolinfa livre
de células, obtida de linhagens suscetíveis e resistentes de B. glabrata, é incapaz de alterar
visivelmente a morfologia do esporocisto in vitro, o mesmo acontece com hemolinfa
contendo hemócitos de linhagens suscetíveis. Entretanto, o esporocisto é destruído quando
incubado com fatores solúveis da hemolinfa e hemócitos de linhagens resistentes. Quando os
hemócitos de linhagens suscetíveis juntamente com fatores solúveis da hemolinfa de
linhagens resistentes são incubados com os esporocistos, estes hemócitos adquirem
capacidade de destruir os esporocistos. Granath & Yoshino (1984) confirmaram a importância
de fatores solúveis da hemolinfa no processo de destruição de esporocistos de S. mansoni em
estudos in vivo. Estes autores relataram que a transferência de plasma obtido de linhagens
resistentes de B. glabrata para linhagens suscetíveis resultou em uma redução da taxa de
infecção de linhagens de B. glabrata pelo S. mansoni.
Resultados similares foram obtidos em nosso laboratório quando foi feita a
transferência, in vivo, de fatores solúveis da hemolinfa de B. tenagophila da linhagem Taim
para a linhagem Cabo Frio (comunicação pessoal, Pereira 2004)
38
O estudo de Fryer & Bayne (1996) reforça a importância dos componentes solúveis
da hemolinfa na interiorização de partículas pelos hemócitos. Neste estudo, foi mostrado que
as partículas de poliestireno tratadas com fatores solúveis da hemolinfa de linhagens
parcialmente resistentes de B. glabrata são significativamente mais fagocitadas por hemócitos
de linhagens suscetíveis do que as partículas não tratadas.
Loker et al. (1984) e Renwrantz (1986) detectaram na hemolinfa de moluscos fatores
que aglutinam e opsonisam partículas, como lectinas, proteínas com alta afinidade para
radicais específicos de monossacarídeos, que possuem dois ou mais locais de ligação para as
unidades glicídicas. Bayne (1983) sugere que as lectinas presentes na hemolinfa de
gastrópodes poderiam mediar o reconhecimento de partículas estranhas e/ou parasitos. Nos
moluscos, as lectinas são secretadas pelos hemócitos e podem estar solúveis na hemolinfa ou
na superfície dos hemócitos circulantes (Richards e Renwrantz, 1991).
Mais recentemente, um grupo de proteínas com homologia ao fibrinogênio e com
atividade de lectina, foi identificado na hemolinfa de B. glabrata, sendo sua expressão
aumentada após a infecção do molusco com Echinostoma paraensei, outro trematódeo
digenêico. Esta proteína tem a capacidade de precipitar antígenos de excreção/secreção do
parasito e os autores sugerem que, além de participar do reconhecimento, estas proteínas
poderiam ser importantes inibidores do mecanismo de evasão do parasito (Adema et al., 1997
a e b).
Além das lectinas, outras proteínas com função homóloga a mediadores celulares já
caracterizadas em vertebrados, têm sido identificadas na hemolinfa de moluscos e podem
estar envolvidas na ativação dos hemócitos durante a infecção.
Como em vertebrados, a resposta inflamatória parece também desempenhar um
papel importante no sistema interno de defesa dos invertebrados (Ottaviani et al., 1993; e
39
1995; Rowley, 1996). Ottaviani et al. (1993) relatam a presença de uma variedade de
proteínas semelhantes a citocinas pró-inflamatórias de vertebrados, como Interleucina-1 alfa
(IL-1 α), Interleucina-1 beta (IL-1 β), Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-6 (IL-6) e Fator de
Necrose Tumoral alfa (TNF α), em hemócitos de duas espécies de moluscos (Planorbarius
corneus e Viviparus ater), estando presentes somente nos hemócitos com atividade
fagocitária. Em trabalhos posteriores, Ottaviani et al. (1995) relatam uma profunda inter-
relação entre citocina e a resposta imune inata de invertebrados, principalmente moluscos.
Segundo estes autores, diferentes citocinas (IL-1 α, IL-2 e TNF α) estimulam
significativamente a motilidade, aumentam a atividade fagocitária dos hemócitos e, além
disso, provocam a indução da óxido nítrico sintetase. Porém, até onde a motilidade da celular
é afetada, a resposta a diferentes citocinas varia entre as espécies de moluscos estudadas.
Estes resultados sugerem que citocinas sejam importantes moléculas ancestrais,
funcionalmente conservadas que também mantiveram a sua pleiotropicidade redundante no
modo de ação e a alta promiscuidade dos seus receptores durante evolução. Apesar destas
proteínas apresentarem semelhanças funcionais com citocinas de vertebrados, fazem-se
necessários estudos mais sofisticados para estabelecer o grau de homologia entre estas
proteínas.
Granath et al. (1994) identificaram uma proteína semelhante ao TNF - α na
hemolinfa de Gastropoda. Esta também foi encontrada na hemolinfa de B. glabrata por Boyer
(1994). Neste estudo, os autores demonstraram através de Western Blot a presença de uma
molécula de 53 kDa imunoreativa a anti-TNF-α, sendo que, sua quantificação através da
técnica de ELISA, demonstra que esta proteína diminui durante a infecção por S. mansoni.
Apesar da imunoreatividade com anticorpos que reconhecem TNF-α de mamífero, o nível de
40
homologia entre estas proteínas não foi estabelecido bem como a sua importância funcional
na destruição do parasito durante a fase intramolusco.
Molécula semelhante a IL-1, ou com atividade imunológica, funcional e/ou biológica
semelhante a IL-1, tem sido detectada ou isolada de camarões de água doce (Beck and
Habicht, 1986), insetos (Scharrer et al., 1996), mexilhões (Hughes et al., 1990), caramujos
(Granath et al., 1994; Ottaviani et al., 1995) e tunicatas (Beck et al., 1989). Na hemolinfa de
B. glabrata proteína semelhantes a IL-1 está associada à ativação e proliferação celular
(Hughes et al., 1991; Raftos et al., 1991, 1992), ao aumento da fagocitose (Burke & Watkins,
1991; Beck et al., 1993) e com a produção de superóxidos (Granath et al., 1994). Segundo
Granath et al. (1994), as linhagens resistentes de B. glabrata apresentam níveis maiores de
proteínas semelhantes a IL-1 do que as linhagens suscetíveis, e estes caramujos mantêm
quantidades significativamente altas durante a exposição pelo S. mansoni em relação às
linhagens suscetíveis. Em adição, estudos in vitro, realizados por estes mesmos autores,
demonstraram que a incubação de hemócitos de caramujos resistentes com uma proteína
antagonista específica para o recombinante humano IL-1β (IRAP) leva a eliminação do efeito
de rhIL-1 sobre os hemócitos, o que inibe a produção de radicais reativos de oxigênio (ROI),
sugerindo que a IL-1 tenha um papel significativo na habilidade de B. glabrata resistir a
infecção pelo S. mansoni. A inoculação de rhIL-1β em caramujos B. glabrata susceptíveis
resulta em uma rápida ativação dos hemócitos e produção de superóxidos equivalentes aos
níveis encontrados em caramujos resistentes e, conseqüentemente, resultando em uma
redução altamente significativa do número de cercárias produzidas por estes caramujos
(Connors et al., 1995). Mais tarde, estes autores (Connors et al., 1998) demonstraram que a
diminuição na produção de cercárias, observada em B. glabrata susceptíveis inoculados com
rhIL-1β, é conseqüência da elevada mortalidade observada de esporocistos primários. Embora
41
a hemolinfa livre de células recolhida de caramujos tratados com rhIL-1 β tenha sido capaz de
matar esporocistos de S. mansoni, testes in vitro mostram que rhIL-1 β, “per si”, não
apresenta efeito tóxico, sugerindo que no processo de destruição do parasito esta proteína
possa estar atuando na estimulação da produção de fatores citotóxicos solúveis por B.
glabrata.
2.6. Mecanismos funcionais na interação parasito – molusco:
Dikkeboom et al. (1988a) demonstraram que o principal componente de defesa anti-
digeneico em moluscos é formado por hemócitos, células fagocíticas que circulam na
hemolinfa e migram através dos tecidos conectivos. Em algumas situações, os hemócitos são
capazes de ligar e matar larvas digeneicas em condições in vitro, mesmo sem plasma
(hemolinfa livre de células). Segundo Van der Knaap et al. (1981); Van der Knaap e Loker
(1990) os hemócitos por si só podem produzir lectinas e outros fatores requerentes neste
processo.
Vários estudos são realizados com o objetivo de se esclarecer os mecanismos que
regem a interação do parasito com seu molusco hospedeiro, principalmente no diz respeito à
relação dos hemócitos com o parasito. Em estudo de fagocitose in vitro, ZelcK e Becker
(1992) demonstraram que na presença de cálcio, hemócitos de caramujos B. glabrata
resistentes ou susceptíveis, infectados ou não pelo S. mansoni, são capazes de reconhecer e
fagocitar eritrócitos de carneiro sem a influência de qualquer outra substância. Noda e Loker
(1989) avaliaram a atividade fagocitária de hemócitos de B. glabrata infectados com
Echinostoma paraensei, frente à eritrócitos de carneiro e demonstraram que os hemócitos de
caramujos infectados possuem um índice de atividade fagocitária significativamente maior
que os hemócitos de caramujos não infectados. Adema et al. (1994) avaliaram a infecção por
42
Echinostoma paraensei em caramujos B. glabrata (espécie hospedeira) e Helix aspersa
(espécies não hospedeira), e mostraram que as alterações dos hemócitos de B. glabrata
decorrentes da infecção não foram observadas na espécie Helix aspersa, sugerindo que os
efeitos nos hemócitos induzidos pela infecção, apresentam um grau de especificidade entre
parasito - hospedeiro. Sapp & Loker (2000a) utilizando em seus experimentos a interação de
quatro espécies de trematódeos – E. paraensei. E. trivolvis, S. mansoni e Schistosomatium
douthitti - e cinco espécies de caramujos - B. glabrata, Heliosoma trivolvis, Lymnaea
satgnalis, Stagnicola elodes e Helix aspersa. Os autores observaram que diferentes espécies
de parasitos, ou mesmo estágios de desenvolvimento dos mesmos, induziram reações distintas
nos hemócitos do hospedeiro, sugerindo que os determinantes de especificidade variam com a
combinação parasito-hospedeiro e com o estágio do ciclo de vida do parasito.
Apesar do crescente número de modelos experimentais que tentam elucidar o
mecanismo de defesa interna dos moluscos, a maioria dos estudos utiliza caramujos do gênero
Biomphalaria e S.mansoni como o principal modelo experimental.
O processo de destruição dos esporocistos por hemócitos inicia-se com a atração dos
hemócitos para a proximidade do esporocisto primário, sugerindo uma resposta quimiotática.
Respostas quimiotáticas de células da hemolinfa de moluscos a larvas de trematódeos têm
sido demonstrados in vitro e in vivo, embora o mecanismo de estimulação destas células ainda
não está bem estabelecido.
Segundo Núñez et al. (1997), durante a transformação in vitro de miracídios de
Trichobilhazia ocellata em esporocisto-mãe, inicialmente ocorre a liberação de um
polipeptídios de 2 kDa entre os produtos excretados e secretados (E/S) pelo parasito, que
estimula a atividade dos hemócitos. Subsequentemente, o produto excretado e secretado pelo
parasito é constituído predominantemente por uma proteína de 40 kDa, a qual suprime a
43
atividade dos hemócitos. Núñez et al. (1997) demonstraram que o efeito supressivo da fração
de 40 kDa só pode ser encontrado em combinações de parasito e hospedeiro compatíveis.
Desta maneira, os autores demonstraram que esporocistos de S. mansoni causam uma
atividade inicial nos hemócitos de Lymnaea, assim como esporocistos de T. ocellata ativam
os hemócitos de Planorbarius corneus, porém, nos dois casos, os parasitos não foram capazes
de suprimir esta atividade no decorrer da infecção.
Lodes & Yoshino (1990) mostraram que produtos excretados e secretados por
esporocistos de S. mansoni estimulam a mobilidade de hemócitos de linhagens resistentes de
B. glabrata mas, inibem a mobilidade nas cepas suscetíveis. Resultados semelhantes também
foram obtidos por Bezerra et al. (1997) que mostraram que o número de hemócitos circulantes
e a porcentagem de células fagocitárias são semelhantes em B. glabrata e B. tenagophila
livres de infecção, tanto nas linhagens resistentes quanto nas suscetíveis ao S. mansoni.
Entretanto, 5 horas após a infecção por S. mansoni ocorre uma significativa redução do
número de células circulantes em todas as linhagens estudas, sendo a diminuição mais intensa
nas linhagens resistentes. Estes autores relacionaram o desaparecimento de hemócitos
circulantes em Biomphalaria com o recrutamento destas células para o local da infecção,
concluindo que a quimiotaxia e encapsulamento do esporocisto primário por hemócitos são
fenômenos que ocorrem num espaço de poucas horas, sendo os mesmos fundamentais para se
determinar o sucesso da eliminação do parasito no molusco hospedeiro.
O contato dos hemócitos com o tegumento do parasito pode resultar no
encapsulamento dos esporocistos e, em alguns casos, ocorre a destruição dos esporocistos. No
processo de encapsulamento e destruição dos esporocistos existe uma interação muito forte
entre hemócitos e os fatores solúveis presentes na hemolinfa. Bayne et al. (1984)
demonstraram em estudos in vitro que hemócitos de B. glabrata suscetíveis ou resistentes à
44
infecção são capazes de encapsular os esporocistos de S. mansoni, porém somente hemócitos
de linhagens geográficas resistentes são capazes de causar algum dano à membrana dos
esporocistos.
Os mecanismos pelos quais os hemócitos destroem o parasito ainda não foram
completamente elucidados. Dependendo do tamanho, os organismos (ou partículas) podem
ser fagocitados pelos hemócitos ou encapsulados (como no caso de larvas de Digenea) e,
subseqüentemente, lesados por metabólitos secretados pelos hemócitos ativados (Adema et
al., 1997a).
Quando analisados com um auxílio de microscópico eletrônico, a porção do
tegumento do esporocisto, que está rodeada por hemócitos, parece também sofrer fagocitose.
Assim sendo, pode ocorrer um mecanismo de destruição do esporocisto por agressão
mecânica. A emissão de pseudópodes por hemócitos de linhagens resistentes pode destruir
diretamente o tegumento sincicial do parasito, uma estrutura necessária para a aquisição de
nutrientes e manutenção do equilíbrio osmótico do esporocisto (van der Knaap & Locker,
1990).
Um dos principais mecanismos envolvidos na morte do parasito, mediada por
células, parece ser a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelo hemócitos.
Hemócitos de gastrópoda produzem ROS (Dikkeboom et al., 1988a) e este processo,
semelhante a citotoxidade oxidativa de macrófagos de mamíferos, é induzido em resposta a
infecção por trematódeos parasitos (Dikkeboom et al., 1988b). Segundo Adema et al. (1991) a
produção de radicais livres de oxigênio pode ser encontrada em muitas, mas não em todas
espécies de moluscos investigadas. Simultaneamente, Shozawa et al. (1989) relatam que os
hemócitos de B. glabrata produzem ROS. Posteriormente, Hahn et al. (2000) indicam que as
lectinas têm um papel muito importante no reconhecimento do parasito pelos hemócitos e na
45
ativação destas células. Hemócitos de B. glabrata, de linhagens susceptíveis e resistentes,
foram estimulados com albumina bovina conjugada a seis carboidratos (mannose, galactose,
fucose, N-acetil-glucosamina, N-acetil-galactosamina, e lactose), que estão presentes no
tegumento de esporocistos de S. mansoni, sendo que BSA-galactose, BSA-mannose e BSA-
fucose foram capazes de induzir a produção de metabólitos reativos de oxigênio – ROS.
Alguns estudos (Van der Knaap et al., 1981; McKerrow et al., 1985) demonstraram
que enzimas lisossomais, capazes de degradar material biológico, estão presentes em
hemócitos de moluscos. Em estudos de análise da ultraestrutura do confronto entre os
hemócitos e esporocistos in vitro, utilizando esporocistos de S. mansoni e hemócitos de
linhagem resistente de Lymnaea stagnalis, foi verificada a presença de peroxidase no espaço
compreendido entre o tegumento do esporocisto encapsulado e a membrana do hemócito
(Dikkeboom et al., 1988c). Douglas et al. (1993) mediram, in vitro, a fagocitose e morte de
Proteus vulgaris por hemócitos de B. glabrata infectados ou não por S. mansoni. Embora os
hemócitos de caramujos infectados apresentaram uma baixa capacidade fagocitária, estes
exibiram uma atividade microbicida elevada 3 semanas após a infecção, em relação aos
caramujos não infectados. Os autores não demonstraram nenhuma atividade microbicida no
plasma dos caramujos infectados ou não.
Em um ensaio in vitro de citotoxidade mediada por célula, Boehmler et al. (1996)
demonstraram que o tratamento do plástico com poli-L-lisina, permite a visualização dos
hemócitos encapsulando os esporocistos e desta forma permite a quantificação da mortalidade
dos esporocistos. Neste estudo, os autores utilizaram 4 linhagens de B. glabrata (2 suscetíveis
e 2 resistentes) e demonstraram que nas primeiras 7 horas de incubação não houve diferenças
significativas na mortalidade de esporocistos de S. mansoni entre as quatro linhagens testadas,
porém diferenças significativas foram observadas a partir de 21 horas de incubação, até
46
mesmo entre as linhagens resistentes. Após 42 e 49 horas de incubação, não há diferenças
significativas entre as linhagens resistentes, porém estas são marcantes entre as resistentes e
as suscetíveis.
Desta maneira, o esclarecimento dos mecanismos responsáveis pela destruição de
esporocistos de S. mansoni pelo molusco gastropoda dependerá do conhecimento detalhado
da população de hemócitos e de fatores responsáveis pela sua ativação.
47
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos Gerais
3.1.1. Caracterizar fenotipica e funcionalmente os hemócitos circulantes de linhagens
de B. glabrata e B. tenagophila, de linhagens resistente (Taim) e suscetível (Cabo Frio),
durante a infecção por S. mansoni.
3.2. Objetivos específicos
3.2.1. Analisar, comparativamente, através da citometria de fluxo, alterações no
perfil morfológico de hemócitos circulantes de B. glabrata, B. tenagophila Cabo Frio e B.
tenagophila Taim, durante a infecção por S. mansoni.
3.2.2. Verificar alterações no perfil morfológico dos hemócitos circulantes de
caramujos B. glabrata e B. tenagophila, obtido pela citometria de fluxo, após o tratamento
com sílica.
3.2.3. Estabelecer o perfil de marcação dos hemócitos circulantes de B. glabrata e B.
tenagophila, utilizando as lectinas ConA, PNA, SBA e WGA conjugadas com FITC, antes e
após infecção experimental com S. mansoni.
3.2.4. Analisar, comparativamente, in vitro, a adesão celular dos hemócitos
circulantes isolados de B. glabrata, B. tenagophila Cabo Frio e B. tenagophila Taim, a
superfície dos esporocistos de S. mansoni e, posteriormente, analisar a capacidade destas
células em destruir as larvas do parasito.
48
3.2.5. Analisar, comparativamente, a ação de carboidratos no mecanismo de adesão
celular de hemócitos circulantes de B. glabrata, B. tenagophila Cabo Frio e B. tenagophila
Taim e na destruição dos esporocistos de S. mansoni.
3.2.6. Analisar, comparativamente, a produção de radicais de nitrogênio por
hemócitos circulantes sob o estímulo da infecção pelo S. mansoni e re-estímulo com antígenos
solúveis de ovos ou esporocistos do parasito in vitro.
49
4. Caracterização do perfil morfológico da população de hemócitos circulantes
de caramujos B. glabrata e B. tenagophila durante a infecção experimental pelo S.
mansoni e após o tratamento com sílica.
A citometria de fluxo tem sido um instrumento importante na qualificação e
quantificação de aspectos biofísicos, bioquímicos e moleculares de partículas biológicas. Esta
tecnologia pode ser usada para executar medidas em células inteiras e também em preparação
de constituintes celulares, tais como núcleo e organelas, particularmente importante para
pesquisas biológicas. Permite análises qualitativas e quantitativas de quaisquer células ou
constituintes celulares que tenham sido tratados com uma ampla variedade de reagentes
disponíveis comercialmente, tais como corantes e anticorpos monoclonais. Durante esta
análise, as células/ partículas podem ser separadas de acordo com seu tamanho, granulosidade
e/ou a partir dos vários tipos de fluorescência (Jaroszeki e Radcliff, 1999).
A análise morfométrica a laser vem sendo cada vez mais utilizada na caracterização
de células circulantes presentes na hemolinfa, denominadas hemócitos, de várias espécies de
invertebrados, como insetos (Willott et al., 1994; Tirowvanziam et al., 2004), aracnídeos
(Kuhn, 1996), tunicatos (Raftos et al., 1990; Raftos & Hutchinson, 1995) crustáceos
(Cardenas et al., 2000; Cardenas et al., 2004) e moluscos (Franceschi et al., 1991; Amen et al.,
1992; Bousseau et al., 2000; Johnston & Yoshino 2001; Allam et al., 2002; Goedken e De
Guise 2004).
Em moluscos, esta análise de fluxo mostrou-se como uma ferramenta importante
para monitorar a transformação dos hemócitos de caramujos Mya arena durante a fagocitose
de metais pesados in vitro (Bousseau et al., 2000). Allam et al. (2002) utilizaram a citometria
de fluxo em um estudo em que foram comparados, por tamanho e granulosidade, os
hemócitos circulantes de 3 espécies de moluscos ( Ruditapes philippinarum, Mercenaria
50
mercenaria e Crassostrea virginica) e demonstraram que as referidas espécies apresentam
dois grupos de hemócitos morfologicamente similares denominados agranulócitos e
granulócitos. Goedken & De Guise (2004) apresentam a citometria de fluxo como uma
ferramenta utilizada para caracterizar quantitativamente e funcionalmente as células
envolvidas no sistema de defesa de ostras (Crassostrea virginica), sendo caracterizadas três
populações de hemócitos (granulócitos hialinócitos e células intermediárias) a partir da
capacidade fagocitária e produção de H
2
O
2
.
Johnston & Yoshino (2001) analisando as células da hemolinfa de B. glabrata, por
citometria de fluxo, caracterizaram a população de hemócitos circulantes como sendo uma
população constituída por duas subpopulações celulares. Uma subpopulação foi caracterizada
como células de tamanho pequeno e arredondadas, medindo entre 5 e 6 µm de diâmetro, e
com pouca granulosidade, enquanto que o outro tipo celular era constituído por hemócitos
grandes (entre 6,5 e 8 µm de diâmetro) mais granulosos, capazes de aderir fortemente à
superfície do vidro com uma extensa emissão de filópodes. Hemócitos de ambas as
populações celulares foram marcados por conjugados fluorescentes de proteínas
excretadas/secretadas de S. mansoni (ESPs), sendo que a marcação foi mais intensa na
subpopulação de hemócitos pequenos quando comparada com aos grandes. A ligação de
antígenos do parasito (ESPs) à superfície dos hemócitos foi inibida pela incubação com vários
açúcares, sugerindo que este reconhecimento pode ser mediado por lectinas.
A importância dos hemócitos na interação com o S. mansoni, vêm sendo discutida
por vários autores. Dentre eles, Martins-Souza et al., (2003) demonstraram que a inoculação
da sílica em caramujos resistentes e parcialmente susceptíveis a infecção, resulta na alteração
do grau de resistência e suscetibilidade destes caramujos. A inoculação de partículas de sílica
induz uma diminuição significativa e temporária (até 4 dias após inoculação) do número de
51
granulócitos circulantes na hemolinfa de B. tenagophila. Como esta redução é seletiva, para
uma subpopulação de granulócitos, o tratamento com sílica pode ser utilizado na tentativa de
melhor caracterizar as alterações na população de hemócitos circulantes, analisados pela
citometria de fluxo.
A técnica de citometria de fluxo, apresenta-se como uma ferramenta valiosa para a
caracterização das subpopulações de hemócitos de moluscos de linhagens resistentes e
suscetívies da espécie B. tenagophila, que é a proposta deste trabalho. Ela também permitirá
analisar o comportamento destas células durante a infecção por S. mansoni, ou seja, a partir
do momento da penetração do miracídio até a liberação de cercárias.
Portanto, o objetivo deste trabalho consiste em analisar, comparativamente, através
da citometria de fluxo, alterações no perfil morfológico de hemócitos circulantes de B.
glabrata, B. tenagophila Cabo Frio e B. tenagophila Taim, durante a infecção por S. mansoni;
além de verificar alterações neste perfil após o tratamento com sílica.
52
4.1. MATERIAL E MÉTODOS
4.1.1. Caramujos
No presente trabalho foram utilizadas duas espécies de caramujos: B. glabrata e B.
tenagophila. A linhagem de B. glabrata utilizada foi proveniente da Lagoa da Pampulha –
Belo Horizonte (MG), denominada linhagem BH. Esta linhagem apresenta taxas de
susceptibilidade de cerca de 80% a infecção pelo S. mansoni.
Os experimentos aqui reportados utilizam duas linhagens de B. tenagophila: Cabo
Frio (CF) e Taim. A linhagem CF foi originária da região de Cabo Frio (RJ) e apresenta cerca
de 40 a 60% de suscetibilidade à infecção pela cepa LE do parasito (Martins-Souza et al.,
2003). A linhagem Taim foi proveniente da Reserva Biológica do Taim (RS) e apresenta total
resistência frente à infecção pelo S. mansoni da cepa LE (Corrêa et al., 1979; Santos et al.,
1979; Bezerra et al., 1997: Martins-Souza et al., 2003; Coelho et al., 2004; Rosa et al., 2005).
As linhagens de B. glabrata e B. tenagophila utilizadas neste estudo foram mantidas
nos moluscários do Grupo Interdepartamental de Estudos sobre Esquistossomose (GIDE) –
ICB – UFMG.
4.1.2. O Parasito
Foi utilizada a cepa LE de S. mansoni, isolada por Pellegrino de um paciente (Luís
Evangelista) de fase aguda de esquistossomose infectado em Belo Horizonte e vem sendo
mantida no laboratório do GIDE por 40 anos. A cepa LE foi selecionada para este estudo,
pois, segundo dados obtidos rotineiramente nos laboratório do GIDE, as linhagens de B.
tenagophila se apresentam mais resistentes a esta cepa de S. mansoni (Corrêa et al., 1979;
53
Santos et al., 1979), o fato que facilita os estudos referentes aos mecanismos que interferem
na associação parasito-molusco.
4.1.3. Infecção de caramujos
Hamsters (Mesocricetus auratus) infectados com S. mansoni da cepa LE foram
sacrificados entre 45 e 50 dias após infecção para obtenção de miracídios (Pellegrino & Katz,
1968). Os fígados destes animais foram retirados, lavados em solução fisiológica (0,85 % de
NaCl) e homogeneizados em liquidificador com água desclorada. Esta suspensão foi
transferida para um cálice de sedimentação a 4
0
C por cerca de 40 minutos. O sobrenadante
foi descartado e o sedimento contendo os ovos do parasito ressuspenso em água desclorada
em temperatura ambiente e colocado sob a luz de uma luminária, para a eclosão dos
miracídios. Amostras deste material foram recolhidas e os miracídios quantificados com
auxílio de microscópio estereoscópico.
Exemplares de B. glabrata e B. tenagophila apresentando conchas com diâmetro de
12 a 14 mm foram transferidos individualmente para poços de placas de cultura (6 wells)
contendo 20 miracídios de S. mansoni. Estes moluscos foram mantidos nestas condições por
18-24h sob luz artificial. Após este período, os caramujos foram transferidos para aquários de
experimentação, onde permanecem até serem utilizados.
4.1.4. Tratamento com sílica
Inicialmente, 54 caramujos das duas espécies, B. glabrata e B. tenagophila, foram
anestesiados em solução contendo 0,4 mg/ml de Pentobarbital Sódico (Hypnol-Cristália)
durante 8 horas, segundo a técnica de Martins-Souza et al., (2001).
54
Em seguida, utilizando uma seringa de insulina de 500 µl (Manoject 50 unit), os
caramujos foram inoculados com 10 µl de Solução Salina Balanceada de Chernin - CBSS
(47,7 mM de NaCl, 2,0 mM de KCl, 0,49 mM de Na
2
HPO
4
anidro, 1,8 mM de MgSO
4
. 7H
2
O, 3,6 mM de CaCl
2
. 2 H
2
O, 0,59 mM de NaHCO
3
, 5,5 mM de glicose e 3 mM de trealose,
pH 7.2) contendo 0.1 mg/ml Sílica (0.5-10 microns, Sigma, USA), conforme Martins-Souza,
et al., (2003). Um grupo controle foi inoculado com 10 µl de CBSS sem sílica.
4.1.5. Coleta da hemolinfa e isolamento de hemócitos
A coleta da hemolinfa foi realizada através da punção da região cardíaca segundo
Zelck & Becker, (1990) e Bezerra et al., (1997). Resumidamente, a concha de cada caramujo
foi desinfetada com álcool 70
0
GL e seca com papel absorvente. Posteriormente, utilizando-se
uma seringa plástica de 3 ml (Plastipak) com agulha de 21G x 1, a concha do molusco foi
perfurada até atingir a região cardíaca.
Para se manter a integridade dos hemócitos e permitir os estudos de caracterização
propostos neste trabalho, todas as soluções nas quais os hemócitos foram mantidos, tiveram a
osmolaridade acertada para 0,8 - 0,9 mOsm, que corresponde a osmolaridade da hemolinfa,
estabelecida em estudos prévios.
Para evitar a aglutinação celular, a hemolinfa foi coletada diretamente em CBSS
contendo Citrato /EDTA [50 mM Citrato de Sódio, 10 mM EDTA, e 25 mM de sacarose] pH
7,2, a temperatura ambiente, na proporção de 1 de solução para 2 de hemolinfa. Em seguida, a
hemolinfa total foi colocada em tubos de eppendorf e mantida em gelo. Após a sedimentação
de partículas sólidas (fragmentos de concha e tecidos, partículas sólidas, etc), por cerca de 5
minutos, a hemolinfa juntamente com as células, foram transferidas para um novo tubo
eppendorf e mantidas no gelo.
55
Amostra de hemolinfa de caramujos B glabrata e B. tenagophila da linhagem CF e
da linhagem Taim, coletadas como descrito acima, foram processadas e suas células foram
contadas e posteriormente utilizadas para estabelecer o padrão fenotípico da população de
hemócitos circulantes pela citometria de fluxo. Inicialmente, o padrão fenotípico foi
estabelecido com a utilização de hemócitos de caramujos normais e em seguida, foram
analisadas as possíveis alterações neste perfil decorrentes da infecção pelo S. mansoni e da
inoculação de sílica.
Para avaliar alterações da população de hemócitos circulantes, a hemolinfa de 9
caramujos (em cada ponto de análise) foi retirada, após infecção pelo S. mansoni, e os
hemócitos foram analisados durante as primeiras 24 horas de infecção (2, 5, 8, 12, 16, 20 e 24
horas de infecção), em seguida após 3, 5, 10, 15, 20 e 30 dias de infecção. Para o estudo do
efeito do tratamento de sílica, a hemolinfa foi recolhida 24 horas após a inoculação de sílica
ou CBSS, antes da infecção e após 5, 24, 72, 96 e 120 horas de infecção. Em cada ponto
foram analisados triplicatas de hemolinfa, sendo que cada amostra das triplicatas continha a
hemolinfa total extraída de três caramujos, que foram processadas e coradas como descrito
posteriormente.
4.1.6. Contagem diferencial de hemócitos e viabilidade
Amostras da hemolinfa total recolhida dos diferentes grupos experimentais, em
diferentes períodos de infecção, foram diluídas 1\10 em CBSS pH 7.4 contendo 0,05% de
vermelho neutro (Sigma). A diferenciação celular foi realizada levando-se em consideração a
capacidade de granulócitos de englobar o corante, apresentando-se com coloração
avermelhadas. A viabilidade dos hemócitos foi estimada através da incubação das células em
meio CBSS contendo 0,4% de Azul de Tripan (diluição 1:10). Tanto para contagem
56
diferencial quanto para determinar a viabilidade as células, a contagem, em câmara de
Neubauer, foi feita imediatamente após a adição do corante. Sendo assim, as células coradas
de azul foram consideradas mortas (Martins-Souza, 1999).
4.1.7. Caracterização fenotípica de hemócitos circulantes de B. tenagophila
Para a obtenção de um perfil com a mínima interferência de fragmentos ou células
mortas, os hemócitos foram corados simultaneamente com Brometo de Etídio e Laranja de
Acridina, permitindo a identificação das populações celulares e sua discriminação dos
fragmentos e/ou células mortas. O corante fluorescente brometo de etídio (BE) consegue
atravessar uma membrana polarizada, mas só se liga às cadeias do DNA quando a célula não
possui um sistema de transporte ativo que expulsa este fluorocromo, ou seja quando a célula
está morta (Midgley,1987). Já o laranja de acridina é um corante específico de DNA de
células viáveis.
A solução estoque de Brometo de Etídio e Laranja de Acridina contendo 25 e 7,5
mg/ml, respectivamente, diluídos em etanol 95% (Parks et al., 1979), foi diluída na proporção
de 1:1000 em CBSS e acrescida a três amostras contendo hemolinfa total de três caramujos,
na proporção de 1:1. Após a adição do corante, os hemócitos foram incubados por 1 hora em
gelo, no escuro, e após este período foram submetidos à análise no Citômetro de Fluxo.
A análise em citometria de fluxo - FACSCalibur - foi inicialmente realizada através
da aquisição de 20000 eventos com os seguintes ajustes: FSC (E00, AmpGain 2.00, Mode
Lin), SSC (Voltage 349, AmpGain 1.00, Mode Lin), FL1 (Voltage 547, AmpGain 1.00, Mode
Log), FL2 (Voltage 548, AmpGain 1.00, Mode Log) e FL3 (Voltage 600, AmpGain 1.00,
Mode Log). Além dos ajuste de compensação FL1 – 0% FL2, FL2 – 24,7% FL1, FL2 –
20,0% FL3 e FL3 – 0% FL2; e Threshold parâmetro FSC, valor 90.
57
Os perfis de hemócitos foram estabelecidos a partir dos parâmetros Fluorescência 1
(FL1 – verde) correspondente a coloração com Acridina, e Fluorescência 3 (FL3 – vermelho)
equivalendo ao Brometo. A partir daí, foi possível separar e marcar somente os hemócitos
viáveis baseando-se em suas características de marcação com os corantes empregados,
excluindo-se os “debris” e células mortas. Posteriormente, os hemócitos foram analisados
quanto ao tamanho e granulosidade desta população celular. Após a aquisição dos perfis das
subpopulações dos hemócitos circulantes, estes foram analisados através do “software Cell
Quest
@
”.
4.1.8. Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados, utilizando–se análise de variância
ou teste t de Student para os dados paramêtricos e teste de Kruskal Wallis para dados não
paramêtricos.
58
4.2. RESULTADOS
4.2.1. Caracterização do perfil fenotípico de hemócitos de caramujos B. glabrata
e B. tenagophila através da citometria de fluxo:
Inicialmente, foi possível notar que os hemócitos tanto nas linhagens Cabo Frio e
Taim de B. tenagophila, quanto na espécie B. glabrata não infectados apresentaram o mesmo
padrão de coloração. O perfil apresentado na figura 1, é representativo das espécies B.
glabrata e B. tenagophila.
Conforme observados na figura 1A, os hemócitos circulantes recuperados na
hemolinfa de Biomphalaria, podem ser separados, inicialmente, através da coloração com
laranja de acridina (fluorescência 1) e brometo de etídio (fluorescência 3), de debris e células
mortas. A partir da análise por tamanho e granulosidade foram observadas 2 subpopulações,
denominadas hemócitos pequenos e hemócitos grandes (figura 1B). Apesar dos valores
apresentados nos eixos do gráfico B da figura 1, não refletirem dimensões, a população de
hemócitos pequenos foi caracterizada por células de menor tamanho (entre 200 e 500) e com
menor granulosidade, .enquanto que as células da população de hemócitos grandes são
maiores (de 500 a 1000) e mais granulosas (figura 1B).
A população total de hemócitos circulantes na espécie B. glabrata é composta por
56% de hemócitos pequenos e 44 de grandes, enquanto nas linhagens de B. tenagophila, Cabo
Frio e Taim, a população de hemócitos pequenos representa 38% e os grandes representaram
62 (figura 2). A diferença da proporção de hemócitos pequenos e grandes observada entre B.
glabrata e B. tenagophila não infectadas é estatisticamente significativa (p < 0,05), entretanto
não foi verificada diferença estatisticamente significativa na proporção de hemócitos
circulantes entre B. tenagophila das linhagens Cabo Frio e Taim.
59
.
Figura 1: Exemplo da análise do perfil da população dos hemócitos circulantes de
caramujos Biomphalaria pela citometria de fluxo (FACSCalibur), separados a partir da
granulosidade versus tamanho.
A: Leitura da hemolinfa total.
B: Leitura após eliminação de células mortas e debris.
60
Fluorescência 1
Fluorescência 3 Tamanho
Granulosidade
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
A
B
Fluorescência 1
Fluorescência 3 Tamanho
Granulosidade
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
Fluorescência 1
Fluorescência 3 Tamanho
Granulosidade
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
A
B
Figura 2: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B. glabrata
da linhagem BH (BG-BH), B. tenagophila linhagem Cabo Frio (BT-CF) e B. tenagophila
linhagem Taim (BT-T) livres de infecção por S. mansoni, obtida na citometria de fluxo. *
representa diferença significativa (p < 0,05) em relação as subpopulações de B. glabrata (sem
infecção).
0
20
40
60
80
100
120
BG - BH BT - CF BT - T
% de hemócitos circulantes
*
61
Hemócitos grandes
Hemócitos pequenos
Em B. glabrata, a infecção por S. mansoni não resultou em diferenças
estatisticamente significativas no perfil das subpopulações de hemócitos circulantes durante
as primeiras 24 horas de infecção (figura 3A). Análise posterior, realizada de 1 – 30 dias de
infecção, revelou que somente no 30º dia após infecção houve uma diminuição significativa
na proporção de hemócitos pequenos em relação ao padrão presente nos caramujos não
infectados (figura 3B).
62
A
B
Figura 3: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B. glabrata
nas primeiras 24 horas (A) e durante 30 dias (B) de infecção com S. mansoni, obtida através
da citometria de fluxo. * Diferenças significativas (p < 0,05) em relação a caramujos não
infectados (ponto 0).
63
Hemócitos grandes
Hemócitos pequenos
0
20
40
60
80
100
0 2 5 8 12 16 20 24
Horas após infecção
0
20
40
60
80
100
0 1 3 5 10 15 20 30
Dias após infecção
*
% de hem ócito s circulantes
Em contraste com o padrão observado em B. glabrata, a infecção com S. mansoni
em B. tenagophila, das linhagens Cabo Frio e Taim, induz uma variação significativa no
perfil dos hemócitos circulantes já nas primeiras horas de infecção (figuras 4 e 5). Em B.
tenagophila Cabo Frio a infecção por S. mansoni resultou em um aumento significativo da
porcentagem de hemócitos pequenos em relação aos grandes que pode ser observado após 2 e
24 horas de infecção (figura 4A). Esta mesma alteração, também foi observada em 1, 15, 20 e
30 dias após infecção, quando comparado ao padrão de hemócitos circulantes presentes nos
caramujos não infectados (figura 4B).
Com relação a linhagem Taim de B. tenagophila, as alterações foram muito mais
intensas e persistentes, em comparação a linhagem Cabo Frio e a espécie B. glabrata. Foi
observado um aumento significativo da porcentagem de hemócitos pequenos, em relação ao
padrão não infectado que permaneceu significativo durante quase todo o período de infecção.
A diferença entre as subpopulações de hemócitos se manteve durante as primeiras 24 horas de
infecção, acontecendo nos períodos de 5,16, 20 e 24 horas (figura 5A) e ao longo dos 30 dias
de infecção (figura 5B).
64
A
B
Figura 4: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B.
tenagophila da linhagem Cabo Frio nas primeiras 24 horas (A) e durante 30 dias (B) de
infecção com S. mansoni, obtida através da citometria de fluxo. * Representa diferenças
significativas (p < 0,05) em relação a caramujos não infectados (ponto 0).
65
Hemócitos grandes
Hemócitos pequenos
0
20
40
60
80
100
0 2 5 8 12 16 20 24
Horas após infecção
*
*
0
20
40
60
80
100
0 1 3 5 10 15 20 30
Dias após infecção
*
*
*
*
% de hem ócito s circulantes
A
B
Figura 5: Perfil da população de hemócitos circulantes na hemolinfa de B.
tenagophila da linhagem Taim nas primeiras 24 horas (A) e durante 30 dias (B) de infecção
com S. mansoni, obtida através da citometria de fluxo. * Representa diferenças significativas
(p < 0,05) em relação a caramujos não infectados (ponto 0).
66
Hemócitos grandes
Hemócitos pequenos
0
20
40
60
80
100
0 2 5 8 12 16 20 24
Horas após infecção
*
*
*
*
0
20
40
60
80
100
0 1 3 5 10 15 20 30
Dias após infecção
*
*
*
*
*
*
% de hem ócito s circulantes
Durante a análise do perfil da granulosidade dos hemócitos de caramujos B. glabrata
e B. tenagophila das linhagens Cabo Frio Taim, não foram observadas alterações marcantes
na granulosidade de hemócitos pequenos e grandes, tanto nos caramujos livres de infecção,
quanto nos caramujos infectados (dado não mostrado).
67
4.2.2. Efeito da inoculação de sílica no perfil de hemócitos circulantes de
caramujos do gênero Biomphalaria
Caramujos B. glabrata, B. tenagophila Cabo Frio e B. tenagophila Taim, que
receberam a inoculação de sílica, apresentaram uma diminuição do número de granulócitos,
durante as primeiras horas após a infecção por S. mansoni. Na tabela 1, pode-se verificar que
o número de granulócitos recuperados da hemolinfa de B. glabrata, tratados com sílica e
infectados por S. mansoni, foi estatisticamente inferior ao recuperado de caramujos não
tratados e infectados. Esta diferença foi observada antes da infecção, 5 e 24 horas após
infecção, entre os grupos tratados com sílica e os tratados com CBSS. Resultados semelhantes
também foram encontrados nas linhagens Cabo Frio e Taim de B. tenagophila.
68
Tabela 1: Número de granulócitos (x 10
-5
/ ml) de hemolinfa retirada de caramujos B.
glabrata e B. tenagophila, tratados ou não com sílica, observados ao microscópio óptico. Os
valores representam média + desvio padrão de triplicadas com hemolinfa de três caramujos.
Número de granulócitos x 10
-5
B. glabrata B. tenagophila
Cabo Frio
B. tenagophila
Taim
h
pi
C
BSS
Síli
ca
CBS
S
Síli
ca
C
BSS
Sí
lica
0
*
1,
1 ± 0,1
0,5
± 0,08
1,6
± 0,5
0,4
± 0,2
0,
9 ± 0,4
0,
2 ± 0,04
5 0,
9 ± 0,3
0,3
± 0,07
1,3
± 0,15
0,4
± 0,15
0,
7 ± 0,2
0,
2 ± 0,03
2
4
1,
4 ± 0,2
0,8
± 0,2
1,5
± 0,4
0,5
± 0,1
0,
8 ± 0,3
0,
2 ± 0,06
7
2
0,
8 ± 0,6
0,7
± 0,2
1,5
± 0,6
1,1
± 0,4
0,
7 ± 0,2
0,
5 ± 0,2
9
6
1
± 0,6
0,7
± 0,4
1,2
± 0,4
1,2
± 0,2
0,
9 ± 0,2
0,
7 ± 0,15
1
20
1
± 0,5
1 ±
0,3
1,4
± 0,6
1,8
± 0,5
0,
8 ± 0,4
1
± 0,4
hpi = horas após infecção
Os números em negrito representam diferenças significativas com p<0,05, em relação ao grupo
tratado com CBSS.
* representa ponto em que os caramujos não foram infectados, mas apresentavam 24 horas de
inoculação de sílica.
69
Hemócitos circulantes recolhidos da hemolinfa dos caramujos (B. glabrata, B.
tenagophila Cabo Frio e Taim), tratados ou não com sílica, também foram analisados por
citometria de fluxo durante os primeiros 5 dias de infecção com S. mansoni. A análise
demonstrou que a inoculação de CBSS não resultou em alteração significativa no perfil de
hemócitos circulantes, ou seja, porcentagem de hemócitos pequenos e grandes durante a
infecção pelo S. mansoni em B. glabrata com padrão semelhante ao observado em caramujos
não inoculados. Entretanto, em B. glabrata tratada com sílica foi observada a diminuição da
população de hemócitos pequenos no período de 0 a 24 horas de infecção (figura 6A e B), em
comparação com o observado nos inoculados com CBSS.
70
A
B
Figura 6: Efeito da inoculação de sílica na porcentagem das populações de hemócitos
circulantes na hemolinfa de B. glabrata, nas primeiras 120 horas de infecção por miracídios
de S. mansoni. A: Caramujos inoculados com CBSS e B: Caramujos inoculados com sílica. *
Diferenças significativas em relação a caramujos não infectados (ponto 0) e # diferenças entre
os grupos (p < 0,05). Cada ponto representa média + desvio padrão de triplicatas da hemolinfa
total de 3 caramujos. O ponto 0 representa caramujos com 24 horas de inoculação de sílica e
livres de infecção.
71
0
20
40
60
80
100
0 5 24 72 96 120
Horas após infecção
Hemócitos grandes
Hemócitos pequenos
0
20
40
60
80
100
0 5 24 72 96 120
Horas após infecção
*
*
*
#
#
#
% de hem ócito s circulantes
Na espécie B. tenagophila da linhagem Cabo Frio, inoculados com CBSS 24 horas
antes da infecção por S. mansoni, os hemócitos pequenos, que compreendiam 45% do total de
hemócitos circulantes antes da infecção, aumentam para 55% após 5 horas de infecção e este
aumento se manteve até o último ponto de observação, sendo significativo no ponto 72, 96 e
120 horas após infecção (figura 7 A). Entretanto, em B. tenagophila Cabo Frio que recebeu a
inoculação de sílica, 24 horas antes da infecção, a porcentagem dos hemócitos pequenos deste
grupo, manteve-se inalterada após 5 e 24 horas de infecção (42 e 45%), sendo que neste
período a porcentagem destas células, foi estatisticamente diferente entre os caramujos que
receberam CBSS e os que foram inoculados com sílica. Um aumento significativo, na
porcentagem de hemócitos pequenos, só pode ser observados após 72 horas de infecção,
passando a representar 70% da população total (figura 7 B).
72
A
B
Figura 7: Efeito da inoculação de sílica na porcentagem das populações de hemócitos
circulantes na hemolinfa de B tenagophila da linhagem Cabo Frio, nas primeiras 120 horas de
infecção por miracídios de S. mansoni. A: Caramujos inoculados com CBSS e B: Caramujos
inoculados com sílica. * Diferenças significativas antes e após infecção e # representa as
diferenças significativas entre sílica e CBSS (p < 0,05). Cada ponto representa média + desvio
padrão de triplicatas da hemolinfa total de 3 caramujos. O ponto 0 representa caramujos com
24 horas de inoculação de sílica e livres de infecção.
73
0
20
40
60
80
100
0 5 24 72 96 120
Horas após infecção
Hem ócitos grandes
Hem ócitos pequenos
0
20
40
60
80
100
0 5 24 72 96 120
Horas após infecção
*
*
#
#
*
*
*
*
% de hem ócito s circulantes
O efeito do tratamento de sílica em B. tenagophila da linhagem de Taim, provoca
uma diminuição na proporção de hemócitos pequenos, vista nas primeiras horas após a
infecção, quando comparadas ao grupo tratado com CBSS (figura 8 A e B). Foi observado, no
grupo sem tratamento com sílica, um aumento na proporção da população de hemócitos
pequenos, após 5 horas de infecção (65%), esta se manteve maior proporção que dos
hemócitos grandes ao longo das primeiras horas de infecção (figura 8A). Já no grupo que
recebeu sílica, a proporção da população dos hemócitos pequenos se manteve menor que a
população dos hemócitos grandes até às 72 horas de infecção (35, 31, 36 e 43%) e se
restabelece após 96 horas de infecção (66%) (figura 8B).
74
A
B
Figura 8: Efeito da inoculação de sílica na porcentagem das populações de hemócitos
circulantes na hemolinfa de B tenagophila da linhagem do Taim, nas primeiras 120 horas de
infecção por miracídios de S. mansoni. A: Caramujos inoculados com CBSS e B: Caramujos
inoculados com sílica. * Diferenças significativas antes e após infecção e # representa as
diferenças significativas entre sílica e CBSS (p < 0,05). Cada ponto representa média + desvio
padrão de triplicatas da hemolinfa total de 3 caramujos. O ponto 0 representa caramujos com
24 horas de inoculação de sílica e livres de infecção.
75
0
20
40
60
80
100
0 5 24 72 96 120
Horas após infecção
Hem ócitos grandes
Hem ócitos pequenos
0
20
40
60
80
100
0 5 24 72 96 120
Horas após infecção
#
#
*
*
*
*
*
*
A freqüência das subpopulações de hemócitos, caracterizadas pela citometria de
fluxo, foi empregada numa análise complementar através do cálculo do valor absoluto de
células/mm
3
de hemolinfa.
A análise em citometria de fluxo das subpopulações de hemócitos de caramujos
tratados ou não com sílica mostrou-se semelhante nas duas espécies analisadas (B. glabrata e
B. tenagophila). Foi observado que o tratamento de sílica acarretou alterações marcantes nas
subpopulações de hemócitos pequenos (tabelas 2, 3 e 4), tanto em B. glabrata quanto em B.
tenagophila, nas linhagens Cabo Frio (Tabela 3) quanto Taim (Tabela 4).
Em B. glabrata, o grupo não tratado pela sílica manteve o número de hemócitos
pequenos maior que de hemócitos grandes, o que se inverte no grupo não tratado em B.
tenagophila. O tratamento com sílica resulta em uma diminuição marcante nos hemócitos
pequenos, durantes as primeiras 72 horas de infecção, nas duas espécies e linhagens testadas.
76
Tabela 2: Número hemócitos circulantes (x10
-5
) na hemolinfa de caramujos
Biomphalaria glabrata infectados por S. mansoni tratados ou não pela sílica, analisada pela
técnica de citometria de fluxo. Os valores representam média + desvio padrão de triplicadas
com hemolinfa de três caramujos.
População de hemócitos circulantes
Número de hemócitos pequenos Número de hemócitos grandes
h
pi
CBSS Sílica CBSS Sílica
0
*
0,6 ± 0,2 0,2 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,3
5 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,2
2
4
0,8 ± 0,2 0,6 ± 0,3 0,8 ± 0,1 1,0 ± 0,3
7
2
0,7 ± 0,5 0,6 ± 0,5 0,3 ± 0,2 0,6 ± 0,3
9
6
0,8 ± 0,5 0,7 ± 0,3 0,6 ± 0,2 0,2 ± 0,1
1
20
0,9 ± 0,3 0,8 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,1
hpi = horas após infecção
* representa ponto em que os caramujos não foram infectados, mas apresentavam 24 horas de
inoculação de sílica.
77
Tabela 3: Número hemócitos circulantes (x10
-5
) na hemolinfa de caramujos
Biomphalaria tenagophila da linhagem Cabo Frio infectados por S. mansoni tratados ou não
pela sílica, analisada pela técnica de citometria de fluxo. Os valores representam média +
desvio padrão de triplicadas com hemolinfa de três caramujos.
População de hemócitos circulantes
Número de hemócitos pequenos Número de hemócitos grandes
h
pi
CBSS Sílica CBSS Sílica
0
*
0,7 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1
5 0,5 ± 0,2 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,3 0,6 ± 0,1
2
4
0,7 ± 0,2 0,5 ± 0,3 0,6 ± 0,1 0,9 ± 0,2
7
2
0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1
9
6
0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,7 ± 0,1
1
20
1,0 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,7 ± 0,1
hpi = horas após infecção
* representa ponto em que os caramujos não foram infectados, mas apresentavam 24 horas de
inoculação de sílica.
78
Tabela 4: Número hemócitos circulantes (x10
-5
) na hemolinfa de caramujos
Biomphalaria tenagophila da linhagem Taim infectados por S. mansoni tratados ou não pela
sílica, analisada pela técnica de citometria de fluxo. Os valores representam média + desvio
padrão de triplicadas com hemolinfa de três caramujos.
População de hemócitos circulantes
Número de hemócitos pequenos Número de hemócitos grandes
h
pi
CBSS Sílica CBSS Sílica
0
*
0,6 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,7 ± 0,2 0,5 ± 0,2
5 0,5 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1
2
4
0,8 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,6 ± 0,2 0,3 ± 0,2
7
2
0,7 ± 0,2 0,6 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1
9
6
1,0 ± 0,3 0,7 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,0
1
20
1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,1
hpi = horas após infecção
* representa ponto em que os caramujos não foram infectados, mas apresentavam 24 horas de
inoculação de sílica.
79
O tratamento com a sílica não acarretou alterações na granulosidade dos hemócitos
pequenos e grandes da espécie B. glabrata (Figura 9 A e B), nem na linhagem Cabo Frio de
B. tenagophila, infectados ou não (Figura 10 A e B). Porém, na linhagem Taim de B.
tenagophila, foram observadas alterações significativas na granulosidade dos hemócitos
grandes tratados com sílica (Figura 11A e B). Essa alteração foi observada nos caramujos sem
infecção (Figura 11 A) e foi maior ainda naqueles com 5 horas de infecção (Figura 11 B).
80
Figura 9: Granulosidade dos hemócitos circulantes de B. glabrata. A: caramujos
livres de infecção e após 24 horas da inoculação da sílica e B: caramujos com 5 horas de
infecção e 30 horas de inoculação de sílica. Hemócitos analisados pela Citometria de Fluxo
81
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemóciotospequenos
Hemócitos grandes
A
B
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
Granulosidade
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
Sílica
A
B
CBSS
N ú m e r o d e c é l u l a s
Figura 10: Granulosidade dos hemócitos circulantes de B. tenagophila Cabo Frio. A:
caramujos livres de infecção e após 24 horas da inoculação da sílica e B: caramujos com 5
horas de infecção e 30 horas de inoculação de sílica. Hemócitos analisados pela Citometria de
Fluxo
82
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
A
B
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
Hemóciotospequenos
Hemóciotosgrandes
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
Granulosidade
CBSS
Sílica
A
B
N ú m e r o d e c é l u l a s
Figura 11: Granulosidade dos hemócitos circulantes de B. tenagophila Taim. A:
caramujos livres de infecção e após 24 horas da inoculação da sílica e B: caramujos com 5
horas de infecção e 30 horas de inoculação de sílica. Hemócitos analisados pela Citometria de
Fluxo
83
Hemóciotos
pequenoss
Hemóciotos grandes
Hemóciotospequenos
Hemóciotos grandes
Granulosidade
Sílica
A
B
Hemóciotos
pequenoss
Hemóciotos grandes
Hemócitos
pequenos
Hemócitos grandes
Hemócitos pequenos
Hemócitos grandes
Granulosidade
CBSS
A
B
N ú m e r o d e c é l u l a s
4.3. DISCUSSÃO
A caracterização dos hemócitos circulantes de moluscos do gênero Biomphalaria
vem sendo realizada por vários autores (Amen et al., 1991; Matricon-Gondran & Letorcart,
1999; Johnston & Yoshino, 2001), tendo como base características morfológicas e
bioquímicas destas células. O diferencial deste trabalho é que a caracterização dos hemócitos
foi realizada com células vivas sendo analisada a dinâmica de seu comportamento frente a
infecção pelo S. mansoni. Além disso, como no trabalho de Johnston & Yoshino (2001), a
citometria de fluxo se mostrou uma ferramenta útil para a análise dos hemócitos circulantes.
Johnston & Yoshino (2001) realizaram a análise dos hemócitos, com a citometria de fluxo,
em caramujos B. glabrata não infectados. No presente trabalho, além de estabelecer o perfil
da população de hemócitos presentes na hemolinfa de caramujos livres de infecção,
procuramos caracterizar alterações no perfil destas células durante a infecção pelo S. mansoni.
A análise através da citometria de fluxo também permitiu comparar as alterações dos
hemócitos em diferentes espécies: B. glabrata e B. tenagophila e entre diferentes linhagens de
B. tenagophila (Cabo Frio – linhagem suscetível e Taim – linhagem resistente).
Com relação à metodologia empregada na análise pela citometria de fluxo, a
separação consistente dos subtipos de hemócitos só foi possível com a utilização de Tampão
CBSS/Citrato/EDTA/Sacarose, pH 7.2. De acordo Cardenas et al. (2000), o qual utilizou
tampão de antiagregação celular, a coleta de hemolinfa de moluscos tem que ser feita em
tampão gelado, porém neste estudo a coleta da hemolinfa em temperatura ambiente se
mostrou de fundamental importância para o estabelecimento do perfil celular. Do mesmo
modo a coloração simultânea com Brometo de Etídio e Laranja de acridina, permitiu a
separação dos hemócitos circulantes viáveis das células mortas e pequenos fragmentos, sendo
possível analisar o perfil das populações de hemócitos vivos em relação ao tamanho e
84
granulosidade de cada célula. Cardenas et al., (2000) analisaram hemócitos de camarões de
água doce em citometria de fluxo e demonstraram que a utilização de tampão anticoagulante
também foi essencial para a observação de subpopulações celulares distintas.
A análise da hemolinfa total de caramujos B. glabrata e B.tenagophila mostrou duas
subpopulações distintas em tamanho e granulosidade, com um padrão similar ao apresentado
por Johnston & Yoshino (2001). Apesar de serem duas espécies diferentes, o perfil das duas
subpopulações se apresentou semelhante nas espécies B. glabrata e B. tenagophila,
diferenciando-se apenas no que diz respeito à porcentagem de hemócitos que compõe cada
subpopulação: Hemócitos pequenos e Hemócitos grandes.
Em trabalhos anteriores (Barraco et al., 1993; Martins-Souza et al., 2003), a
contagem diferencial dos hemócitos circulantes demonstrou que as células coradas pelo
vermelho neutro (granulócitos) representam cerca de 70 a 80% do total de células circulantes
presentes na hemolinfa, ao passo que as células não coradas pelo vermelho neutro
(hialinócitos) representam 20 a 30% do total. Quando analisados pela citometria de fluxo, a
proporção dos subtipos dos hemócitos circulantes se mostrou composta por cerca de 44% de
hemócitos pequenos e 56% de grandes em B. glabrata e cerca 60% de hemócitos pequenos e
40% grandes em B. tenagophila. Acredita-se que a diferença entre as porcentagens dos
subtipos da população de hemócitos circulantes, obtida pela citometria e contagem diferencial
pela microscopia ótica, reforçam a hipótese de que a subpopulação de hemócitos pequenos
compreendem os hialinócitos e os pequenos granulócitos que são evidenciados claramente
através da utilização do vermelho neutro, (Bezerra et al., 1997; Martins-Souza, 1999).
Durante a infecção pelo S. mansoni, pode-se observar alterações na porcentagem de
células que compõem as populações de hemócitos pequenos e grandes, em caramujos B.
tenagophila. Acredita-se que esta alteração seja devido a resposta celular ao estímulo, que no
85
caso é a infecção pelo S.mansoni. E se caracterizaram pelo aumento da população de
hemócitos pequenos nas linhagens Cabo Frio e Taim e podem estar associadas à resistência
parcial da linhagem Cabo Frio e total de Taim, onde as alterações foram mais marcantes. A
falta de alteração na proporção dos hemócitos circulantes em B. glabrata sugere que a
presença do parasito não favorece a retenção dos hemócitos ou de um tipo celular ao sítio de
infecção, como é visto através de estudos histológicos, o que justifica o seu alto grau de
susceptibilidade a infecção pelo S. mansoni. Vários estudos histológicos mostram intenso
infiltrado celular ao redor do parasito recém penetrado (Newton, 1952; Brooks,1953; Coelho
& Barbosa, 1956; Coelho, 1957, 1962; Lie et al.,1987; Guaraldo et al, 1981; Martins-Souza,
1999). Martins-Souza (1999), demonstrou a presença de tal infiltrado nas linhagens Cabo Frio
(com menor intensidade) e Taim (com maior intensidade) de B. tenagophila durante a
infecção pelo S. mansoni.
Em adição, alterações observadas nas subpopulações de hemócitos podem ainda ser
explicadas pelo fato de que, sendo os granulócitos as células efetoras do mecanismo de defesa
dos moluscos, elas migram para o local de penetração do parasito, o que justifica sua
diminuição na hemolinfa circulante (Bezerra et al., 1997). Além disso, alguns autores
consideram os hialinócitos como sendo precursores dos granulócitos o que justificaria o seu
aumento.
Diante do efeito da inoculação de sílica, relatado em trabalho anterior (Martins-
Souza et al., 2003), que resultou em diminuição parcial do número de hemócitos circulantes
de caramujos B. tenagophila, tornou-se importante a análise da hemolinfa de caramujos
tratados ou não com sílica, em citometria de fluxo. Tal análise demonstrou que a inoculação
da sílica não alterou o padrão do perfil das subpopulações de hemócitos circulantes, podendo
ser observadas as populações de hemócitos pequenos e grandes. Tal fato é justificado pelo uso
86
dos corantes, brometo de etídio e laranja de acridina. Com esta coloração, no momento da
análise dos dados, foi possível observar que a não alteração do perfil reforça o fato que a
sílica não elimina totalmente um tipo celular, ou até mesmo sugere que as células sob ação da
sílica não são destruídas, e sim se tornam incapacitadas ou fisiologicamente sem função.
Quando se observa o efeito da sílica nos hemócitos, podemos notar que o tratamento
afeta de maneira distinta as duas subpopulações, tanto a analisada pela microscopia ótica,
quanto por citometria de fluxo. Ao observar os hemócitos analisados por microscopia ótica,
durante o tratamento com sílica, o número de hialinócitos aumenta enquanto que os
granulócitos caem (Martins-Souza, 2003). Por outro lado, os dados da citometria mostram que
a população de hemócitos pequenos cai enquanto que a de hemócitos grandes aumenta. Esses
dados, a princípio, parecem controversos, se considerarmos que os hemócitos pequenos
correspondem aos hialinócitos, enquanto que os hemócitos grandes aos granulócitos. Porém,
tal fato pode ser explicado porque a microscopia ótica analisa aspectos funcionais da
fagocitose e a citometria de fluxo os aspectos meramente morfométricos. Baseando-se na
hipótese de que os granulócitos tratados com sílica perderiam a habilidade de fagocitose, a
microscopia ótica não os identificaria. Assim, parte dos hialinócitos, identificados pela
microscopia ótica, após tratamento com sílica, poderiam ser na verdade granulócitos não
funcionais, que não fagocitaram o vermelho neutro. Além do mais, acredita-se que a
população de hemócitos pequenos analisada pela citometria de fluxo abranja os hialinócitos,
observados ao microscópio, e pequenos granulócitos que possuem capacidade fagocitária e
coram-se pelo vermelho neutro. Além disso, a sílica agiria sobre estes pequenos granulócitos
compreendidos entre os pequenos hemócitos.
Durante a infecção e o tratamento com a sílica, podemos observar que a sílica
manteve a população de hemócitos pequenos em níveis semelhantes ao do ponto 0 (sem
87
infecção), durante as primeiras 72 horas da infecção. Nos caramujos que receberam a
inoculação do tampão CBSS, tanto o perfil quanto o número de células totais praticamente
não se alteram durante as primeiras horas de infecção.
A diminuição no número de célula, como já foi mencionada por Martins-Souza
(2003) e a alteração no perfil das células analisadas pela citometria de fluxo, pode ser devida a
migração destas células para o local da infecção, sendo restabelecida 24 horas após infecção,
no grupo tratado com CBSS e por volta de 72 horas no grupo tratado com sílica. As análises
feitas pela citometria sugerem que, principalmente em B. tenagophila, a sílica deleta os
hemócitos pequenos, reforçando a hipótese de que esta população compreende além dos
hialinócitos, pequenos granulócitos com capacidade fagocitária que sofreram a ação da sílica
e não foram percebidos na análise pela citometria de fluxo.
A análise pela citometria de fluxo demonstra, mais uma vez, o comportamento
diferencial dos hemócitos de linhagem Taim de B. tenagophila, em se tratando da análise da
granulosidade, durante o tratamento com sílica, somente as células desta linhagem
apresentaram alterações significativas principalmente nas primeiras 5 horas de infecção. A
alteração na granulosidade pode ser considerada devida ao tratamento com sílica uma vez que
caramujos que receberam CBSS, não apresentaram alterações marcantes. Tal fato pode
reforçar a hipótese levantada anteriormente em que a sílica, ao ser incorporada pelos
hemócitos, não necessariamente levaria a sua destruição e, sim, o hemócitos permaneceria
íntegro, porém sem sua capacidade fagocitária.
Com base nos resultados apresentados, a citometria se apresentou uma ferramenta
útil na caracterização da população de hemócitos circulantes, além de ajudar na análise
comportamental dos hemócitos ao longo da infecção pelo S. mansoni, em linhagens
resistentes e susceptíveis.
88
5. Papel de lectina e ação de carboidratos na interação de hemócitos circulantes
de B. glabrata e B. tenagophila com S. mansoni.
Dentre os fatores relatados pela literatura, como envolvidos no reconhecimento de
parasito e na ativação dos hemócitos, estão algumas proteínas presentes na fração solúvel da
hemolinfa de Biomphalaria. O estudo de Fryer & Bayne (1996) reforça a importância dos
componentes solúveis da hemolinfa na interiorização de partículas pelos hemócitos. Neste
estudo, foi mostrado que as partículas de poliestireno tratadas com fatores solúveis da
hemolinfa de linhagens parcialmente resistentes de B. glabrata são significativamente mais
fagocitadas por hemócitos de linhagens suscetíveis do que as partículas não tratadas.
Loker et al. (1984) e Renwrantz (1986) detectaram na hemolinfa de moluscos fatores
que aglutinam e opsonisam partículas. Bayne (1983) sugere que proteínas, designadas de
lectinas, presentes na hemolinfa de gastrópodes poderiam mediar o reconhecimento de
partículas e/ou parasitos. Lectinas são proteínas capazes de ligar-se a radicais específicos de
monossacarídeos e possuem dois ou mais locais de ligação para as unidades glicídicas. Nos
moluscos, as lectinas são secretadas pelos hemócitos e podem estar solúveis na hemolinfa ou
na superfície dos hemócitos circulantes (Richards & Renwrantz, 1991). Desta forma, lectinas
poderiam, funcionalmente, intermediar a ligação dos hemócitos ao tegumento de larvas de
trematódeos (van der Knapp & Loker, 1990).
Corroborando a possível participação de lectinas no processo de reconhecimento
celular de esporocistos de S. mansoni, Johnston & Yoshino (1996) identificaram na hemolinfa
de B. glabrata, lectinas semelhantes às isoladas de Conavalia ensiformis (ConA), Erythrina
corallodendrom (ECA), Glycine max (SBA), Tetragonolobus purpureas (TPA) e Triticum
vulgaris (WGA). Segundo estes autores, estas lectinas também foram capazes de se ligarem à
89
superfície do esporocisto de S. mansoni. Posteriormente, Castillo & Yoshino (2002) relataram
que o tegumento do esporocisto de S. mansoni se apresenta altamente glicosilado e alguns
destes oligossacarídeos são estágio específico. Estes autores também demonstraram que a
adesão da linhagem de células embrionárias de B. glabrata (Bge), ao esporocisto primário de
S. mansoni, foi reduzida, in vitro, pelo tratamento prévio com fucoidina, que possui um grupo
sulfato carregado negativamente ligado a uma espinha dorsal de unidades repetitivas de
mono/dissacarídeos de fucose. Este resultado sugere que a ligação de lectinas/glicoproteinas
pode representar o mecanismo primário para iniciar a reação de encapsulamento do
esporocisto pelos hemócitos.
A ligação lectina-carboidrato possivelmente leva a uma mudança conformacional do
complexo, que pode induzir a ativação do hemócito (Bayne 1990), resultando em aumento da
atividade fagocitária (Fryer et al., 1989) e/ou da geração de derivados reativos de oxigênio
(ROI) (Hahn et al., 2000). Por esta razão, a resistência ou suscetibilidade de espécies ou
linhagens de Biomphalaria a infecção por S. mansoni pode estar relacionadas a diferenças
qualitativas e/ou quantitativas na produção de determinadas lectinas (Zelck & Becker, 1990)
e, conseqüentemente, no reconhecimento do parasito.
Desta forma, lectinas podem ser importantes marcadores de ativação celular para
hemócitos de Biomphalaria. Estes poderão explicar as variações nos níveis de suscetibilidade
à infecção pelo S. mansoni observado nas diferentes linhagens geográficas de B. tenagophila,
além de auxiliar no entedimento do processo de destruição do parasito.
O objetivo deste trabalho consiste em estabelecer o perfil de marcação dos hemócitos
circulantes de B. glabrata e B. tenagophila, utilizando as lectinas ConA, PNA, SBA e WGA
conjugadas com FITC, antes e após infecção experimental com S. mansoni. Além disso,
analisar comparativamente, in vitro, a adesão celular dos hemócitos a superfície dos
90
esporocistos de S. mansoni e a ação de carboidratos neste mecanismo. Posteriormente analisar
a capacidade dos hemócitos de B. glabrata, B. tenagophila Cabo Frio e B. tenagophila Taim
em destruir esporocistos de S. mansoni.
91
5.1. MATERIAL E MÉTODOS
5.1.1. Caramujos
Assim como citado no capítulo 1, os caramujos utilizados pertencem às espécies B.
glabrata e B. tenagophila, ambas mantidas nos moluscários do Grupo Interdepartamental de
Estudos sobre Esquistossomose (GIDE) – ICB – UFMG. A linhagem de B. glabrata, utilizada
é proveniente da Lagoa da Pampulha – Belo Horizonte (MG), denominada linhagem BH. As
linhagens de B. tenagophila são duas: uma proveniente de Cabo Frio (CF) e outra da reserva
ecológica do Taim - RS.
5.1.2. O Parasito
Os caramujos acima referidos foram infectados com a cepa LE de S. mansoni que
vem sendo mantida no laboratório do GIDE por 35 anos.
5.1.3. Infecção de caramujos
Hamsters (Mesocricetus auratus) infectados com S. mansoni da cepa LE foram
sacrificados entre 45 e 50 dias após infecção para obtenção de miracídios e os caramujos
foram infectados, individualmente, com 20 miracídios de acordo com a técnica de Pellegrino
& Katz (1968) (com algumas modificações já citadas no capítulo 1).
5.1.4. Marcações das moléculas expressam na superfície de hemócitos
circulantes.
A marcação da superfície dos hemócitos foi feita com lectinas isoladas de
Concanavalin A (ConA), Glycine max (SBA), Triticum vulgaris (WGA) e Arachis hypogaea
92
(PNA) conjugadas com Isotiocianato de fluoresceina (FITC) (EY laboratories - San Mateo) e
analisados sob microscopia de fluorescência. A hemolinfa total foi recolhida, através de
punção cardíaca, de B. glabrata ou B. tenagophila da linhagem CF (susceptíveis à infecção
por S. mansoni) e Taim (resistente ao parasito) não infectados e após 5, 24, 72 e 120 h da
infecção com 20 miracídios de S. mansoni. A hemolinfa foi coletada na ausência de tampão
anticoagulante, sendo utilizado um pool de 15 caramujos de cada linhagem, em cada período.
Os hemócitos presentes em cada pool foram separados da hemolinfa e lavados com solução
balanceada de Chernin – CBSS, livre de glicose e trealose, através de centrifugação (200 g
por 3 min. à temperatura ambiente). O sedimento de hemócitos foi ressuspendido em 1 ml de
CBSS sem glicose e trealose, contendo 2% de albumina bovina e as células foram
quantificadas em Câmara de Neubauer. A viabilidade dos hemócitos foi feita através da
coloração com Azul de Tripan (Martins-Souza et al., 2003). Para incubação com cada lectina
marcada, foi utilizado 1 x 10
5
hemócitos por tubo tipo ependorff, sendo que o tratamento foi
realizado em triplicata. Paralelamente, cada marcação também contou com um controle para
especificidade da ligação lectina-hemócito, realizado com 1x10
5
hemócitos, em triplicata.
Após a distribuição dos hemócitos, estes tubos foram centrifugados (200 g/3 min), as células
foram ressuspendidas em 200 µl de CBSS contendo 10 µg/ml de diferentes lectinas
conjugadas com FITC e incubadas por 1 h à temperatura ambiente, no escuro. Para confirmar
a especificidade da ligação entre as lectina-FITC e as glicoproteínas da superfície dos
hemócitos, após a incubação, os hemócitos dos tratamentos controles foram novamente
centrifugados e ressuspendidos em CBSS livre de glicose e trealose contendo 0.2 M de
carboidratos competidores. Foi utilizado Manose para competir com a ligação da lectina
ConA/hemócito, N-acetilglicosamina no tratamento contendo WGA e D–galactose nos
tratamento contendo PNA e SBA.
93
Após o tratamento com as lectinas marcadas e a adição dos carboidratos, no caso dos
tratamentos controle, os hemócitos foram lavados, centrifugados (200 g) e ressuspendidos em
100 µl de CBSS sem glicose e trealose e observados em microscópio de epifluorescência
(Olympus IX 70). Esta análise foi realizada em um aumento de 60x, com filtro FITC: EX450
– EM535 e a contagem total dos hemócitos foi feita em dez campos diferentes de cada
amostra, sendo diferencialmente quantificados a presença ou não de marcação fluorescente
em hemócitos pequenos, médios e grandes.
5.1.5. Ação das lectinas e de carboidratos na interação de hemócitos com
esporocistos transformados in vitro.
5.1.5.1. Transformação de miracídios de S. mansoni em esporocistos in vitro
Os esporocistos foram obtidos a partir da transformação de miracídios recuperados
de ovos dos parasitos isolados do fígado de hamsters, após 45 a 50 dias da infecção com S.
mansoni (Chaia, 1956). Para a transformação, os miracídios recuperados foram lavados em
CBSS gelado e incubados em meio completo RPMI-1640 contendo 5 % de soro fetal bovino
por 24 horas a 27
0
C com 5 % de CO
2
(Martins-Souza, 1999). Após a transformação,
confirmada pela perda do tegumento ciliado do miracídio, os esporocistos foram novamente
lavados com CBSS, quantificados e utilizados em testes in vitro.
5.1.5.2. Efeito da adição de carboidratos na associação hemócitos e esporocistos de
S. mansoni, in vitro.
Para estudar a interação de esporocistos de S. mansoni e hemócitos in vitro, foi
retirada a hemolinfa de 15 caramujos de cada espécie estudadas B. glabrata BH e B.
tenagophila Cabo Frio e Taim. Os hemócitos foram separados da hemolinfa e lavados com
94
CBSS livre de glicose e trealose, através de centrifugação (200 g/5 min/T.A.). Os hemócitos
foram ressuspensos em CBSS sem glicose e trealose, contendo 2% de albumina bovina e em
seguida foram contados e incubados com esporocistos de S. mansoni transformados in vitro.
A fração solúvel recuperada do sobrenadante da hemolinfa total, foi novamente centrifugada a
(3000 g/30 min/4
0
C) e mantida em gelo até o momento do uso.
A associação entre os hemócitos e os esporocistos foi realizada em placa de cultura
de células com 96 poços. Como controle de sobrevivência do esporocisto às condições de
cultivo in vitro, 50 esporocistos foram incubados, em triplicatas, em CBSS suplementado com
1% de glutamina (2mM), 2% de aminoácidos, 1% de HEPES, 1% de antibiótico (penicilina e
estreptomicina) e 2% de albumina, mas sem glicose e trealose. O efeito dos hemócitos na
sobrevivência do parasito foi estimado nos tratamentos, em triplicata, com 50 esporocistos
incubados com 1x10
5
hemócitos. O mesmo tratamento foi realizado em triplicata na presença
de 10% de plasma dos caramujos, previamente separado da hemolinfa total.
Em outros tratamentos contendo esporocistos e hemócitos, foram adicionados
carboidratos na tentativa de inibir a ligação de lectinas durante o processo de reconhecimento
do parasito. Previamente, para se estabelecer à concentração ideal dos carboidratos, N-
acetilglicosamina e galactosamina, 50 esporocistos ou 1x10
5
hemócitos foram incubados
separadamente com 100, 50, 25 e 5 mM de cada carboidrato para certificação da ausência de
efeito do carboidrato na sobrevivência das células ou do parasito. A partir deste teste, os
experimentos foram montados utilizando-se as concentrações de 100, 25, 5 e 1 mM para N-
acetilglicosamina e 25, 12, 6 e 3 mM para galactosamina.
Na placa de 96 poços, foram estabelecidos os tratamentos nos quais, 50 esporocistos
foram incubados com 1x10
5
hemócitos, em triplicata, sendo adicionado as diferentes
concentrações dos carboidratos, N-acetilglicosamina e galactosamina, na presença ou não de
95
hemolinfa, em CBSS suplementado. Após 2, 6 e 24 horas de incubação em estufa de 5% de
CO
2
a 28
0
C, foi avaliado o índice de adesão celular e, em seguida, foi verificada a viabilidade
dos esporocistos.
5.1.6. Índice de adesão celular (IAC).
A avaliação do número de hemócitos ligados ao esporocisto foi realizada de maneira
semelhante ao descrito por Castillo & Yoshino (2002), após 2 e 6 horas de incubação.
Resumidamente, em cada poço da placa de cultura, inicialmente foram fotografados dez
campos diferentes de cada amostra da triplicada. Nesta avaliação foi atribuído um valor
arbitrário, de 0 a 3, para cada esporocisto, baseado no número de hemócitos aderidos a sua
superfície. Este valor arbitrário, denominado índice de adesão celular – IAC, foi determinado
da seguinte maneira: o valor 0 foi dado aos esporocistos que não apresentaram hemócitos
aderidos a sua superfície (figura 12A); o valor 1 para aqueles que apresentavam até 10 células
aderidas (figura 12B); valor 2 para os que apresentaram de 10 a cinqüenta hemócitos aderidos
(figura 12C) e valor 3 para esporocistos com mais de 50 células (figura 12D).
5.1.7. Viabilidade dos esporocistos
Após 6 e 24 horas de incubação, posteriormente à análise de adesão celular, foi
realizada a contagem dos esporocistos mortos a partir da coloração destes com 20 µl de
solução de 0,4% de Azul de Tripan. Todos os esporocistos presentes nos poços foram
contados e os que se apresentavam corados foram considerados mortos.
96
5.1.8. Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados, utilizando–se análise de variância
ou teste t de Student para os dados paramétricos e teste de Kruskal Wallis para não
paramétricos.
97
Figura 12: Hemócitos aderidos à superfície dos esporocistos de S. mansoni - Índice
de adesão celular – IAC.
98
A) IAC = 0 B) IAC = 1
C) IAC = 2 D) IAC = 3
5.2. RESULTADOS
5.2.1. Marcação dos hemócitos circulantes de caramujos do gênero
Biomphalaria com lectinas fluorescentes
Do total de células recuperadas de B. glabrata não infectado, 10 e 13%,
apresentaram fluorescência em sua superfície, quando incubadas com PNA e SBA,
respectivamente. Enquanto que, 50 e 37% estavam fluorescentes após incubação com ConA e
WGA. Com relação aos hemócitos circulantes recuperados de B. tenagophila da linhagem
Cabo Frio, 52% se mostraram fluorescentes após a incubação com ConA, 24% com PNA,
37% foram marcados com SBA e 70% com WGA. Na linhagem Taim as lectinas PNA e
WGA apresentaram as maiores porcentagens de marcação, 64 e 73%, respectivamente (figura
13). A marcação dos hemócitos da linhagem Cabo Frio de B. tenagophila com SBA foi
significativamente maior em comparação com a marcação em B. glabrata, porém não foi
diferente nos hemócitos da linhagem Taim (figura 13). Com relação da linhagem Taim de B.
tenagophila, a marcação dos hemócitos, em comparação com B. glabrata e a linhagem Cabo
Frio, foi significativamente menor com ConA e significativamente maior com PNA (figura
13).
A especificidade da ligação das lectinas com hemócitos foi confirmada pela adição
de solução concentrada de carboidrato: Manose para ConA, N-acetilglicosamina para WGA e
Galactosamina para PNA e SBA. Em todos os casos, o tratamento com o carboidrato
correspondente resultou em eliminação ou redução significativa da marcação fluorescente dos
hemócitos.
99
Figura 13: Porcentagem de hemócitos presentes na hemolinfa total de caramujos
Biomphalaria marcados com lectinas conjugadas com FITC (ConA, PNA, SBA e WGA). BG
- B. glabrata, BT-CF – B. tenagophila da linhagem Cabo Frio e BT-T – B. tenagophila da
linhagem Taim. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação a B. glabrata e
# representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação a B. glabrata e a linhagem
Cabo Frio.
100
0
20
40
60
80
100
BG BT-CF BT-T
% de células marcadas
ConA
PNA
SBA
WGA
*
*
*
#
#
Em hemócitos isolados de B. glabrata não infectados, foi observada uma marcação
de baixa intensidade com ConA e WGA, principalmente em células pequenas ou médias.
Poucas células pequenas foram marcadas por PNA ou SBA (figura 14).
A marcação de hemócitos isolados de B. tenagophila não infectados com lectinas
fluorescentes foi, geralmente, mais intensa que B. glabrata, com células grandes apresentando
uma clara marcação na membrana. Porém, essa intensidade na marcação não pode ser
observada com ConA (figura 15 e 16). Outra diferença marcante foi o elevado número de
hemócitos marcados por PNA, especialmente em B. tenagophila Taim, sendo observados
muitos hemócitos grandes com marcação intensa (figura 16).
101
Figura 14: Marcação da superfície de hemócitos circulantes de caramujos B.
glabrata, com lectinas conjugadas a FITC. a e b: marcação com WGA; c e d: marcação com
ConA; e e f: marcação com PNA. a, c e e: Nomarski; b, d e f: microscopia de fluorescência.
Aumento 600x.
102
Figura 15: Marcação da superfície de hemócitos circulantes de caramujos B.
tenagophila Cabo Frio, com lectinas conjugadas a FITC. a e b: marcação com WGA; c e d:
marcação com PNA; e e f: marcação com ConA. a, c e e: Nomarski; b, d e f: microscopia de
fluorescência. Aumento 600x.
103
Figura 16: Marcação da superfície de hemócitos circulantes de caramujos B.
tenagophila Taim, com lectinas conjugadas a FITC. a e b: marcação com WGA; c e d:
marcação com PNA. a e c: Nomarski; b e d: microscopia de fluorescência. Aumento 600x.
104
A marcação de células circulantes isoladas de B. glabrata, com lectinas, durante as
primeiras 120 horas da infecção por S. mansoni, mostrou um aumento de hemócitos marcados
com ConA, entre 5 e 24 hpi, sendo esta elevação conseqüência do maior número de células
pequenas marcadas. O pequeno número de hemócitos grandes com ConA praticamente
desaparece após 5 horas da infecção. De uma maneira geral, o número de células circulantes
(pequenas, médias e grandes) marcados com ConA diminuiu após 72 hpi (figura 17A). Já com
PNA, o número total de hemócitos marcados foi muito pequeno e constituem quase que
exclusivamente células pequenas. Após a infecção por S. mansoni o número de hemócitos,
marcados com PNA, se mantive até 72 horas e, posteriormente, houve um aumento ainda
maior após 120 hpi, devidos aos hemócitos pequenos (figura 17B). Com relação à marcação
com SBA, poucas células apresentaram-se marcadas pelas lectinas fluorescentes e
praticamente só ocorreu nos hemócitos pequenos. A infecção por S. mansoni induziu um
aumento da marcação por SBA (figura 17C). Analisando o padrão de marcação de hemócitos
de B. glabrata com WGA, foi observado um grande número de células marcadas, sendo que a
maioria representada por hemócitos pequenos. Porém o número de hemócitos médios e
grandes que se apresentaram marcados pela WGA foi consideravelmente maior que o das
demais lectinas. Durante a infecção foi observado uma queda no número de hemócitos médios
marcados após 5 horas de infecção e um aumento de hemócitos grandes marcados após 72
horas (figura 17D).
105
Figura 17: Padrão de marcação de hemócitos circulantes de B. glabrata com lectinas
conjugadas com FITC, durante as primeiras 120 horas de infecção pelo S. mansoni. Em A:
marcação com ConA, B: marcação com PNA, C: marcação com SBA e D: marcação com
WGA.
106
Horas após infecção
A
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
B
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
C
D
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Total
Pequena
Média
Grande
N úmero de hem ócitos marcados x 10
4
Da mesma forma, a incubação de hemócitos circulantes isolados de B. tenagophila
da linhagem Cabo Frio, com ConA-FITC resultou na marcação de um grande número de
hemócitos pequenos, médios e grandes, sendo que a maioria foi representada por hemócitos
pequenos, não sendo alterado pela infecção pelo S. mansoni (figura 18A).
Com relação a PNA e SBA, inicialmente o número de células marcadas foi pequeno,
sendo que a infecção induziu um aumento significativo neste número, principalmente devido
ao aumento do número de hemócitos pequenos marcados. Este aumento se manteve até 120
horas de infecção (figura 18B e C).
Já com relação a WGA, a diferença de marcação entre os tipos celulares não foi
marcante em relação as demais lectinas e, mesmo assim, os hemócitos pequenos são os que
mais marcaram (figura 18D). A infecção também não induz alterações marcantes no perfil de
marcação dos hemócitos de B. tenagophila Cabo Frio incubados com WGA (figura 18D).
107
Horas após infecção
Figura 18: Padrão de marcação de hemócitos circulantes de B. tenagophila da
linhagem Cabo Frio, com lectinas conjugadas com FITC, durante as primeiras 120 horas de
infecção pelo S. mansoni. Em A: marcação com ConA, B: marcação com PNA, C: marcação
com SBA e D: marcação com WGA.
108
Total
Pequena
Média
Grande
A
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
B
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
C
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
D
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
N úmero de hem ócitos marcados x 10
4
Na linhagem do Taim de B. tenagophila, assim como em Cabo Frio e na espécie B.
glabrata, os hemócitos pequenos foram o tipo celular que apresentou maior número de células
marcadas, com as quatro lectinas utilizadas (ConA, PNA, SBA e WGA). Com relação a
infecção, diferente do que foi observado em B. glabrata e na linhagem Cabo Frio, após 5
horas de infecção foi observada uma diminuição marcante do número de hemócitos
circulantes com todas as lectinas testadas (figura 19).
Com relação a ConA, de maneira geral, após o período 5 hpi, houve um aumento
significativo no número de hemócitos marcados, que se manteve até as 120 hpi. (figura 19A).
A marcação dos hemócitos grandes com ConA foi muito baixa e não se alterou ao longo da
infecção (figura 19A). Com PNA e SBA, a marcação se deu principalmente em hemócitos
pequenos e poucos hemócitos médios, mantendo-se até as 120 hpi (figura 19B e C). Mais uma
vez a marcação dos hemócitos grandes com PNA e SBA foi muito baixa e não se alterou com
a infecção (figura 19B e C). Já com a WGA, a marcação dos hemócitos pequenos e médios se
apresentou praticamente estável ao longo da infecção, destacando-se apenas uma leve
diminuição na marcação dos hemócitos pequenos por volta de 24 horas de infecção (figura
19D). A marcação dos hemócitos grandes mostrou uma diminuição marcante durantes às 5
hpi, o que representou a diminuição dos hemócitos totais. Após este período, o número de
hemócitos grandes aumentou e se manteve até 120 hpi (figura 19D).
109
Horas após infecção
Figura 19: Padrão de marcação de hemócitos circulantes de B. tenagophila da
linhagem Taim, com lectinas conjugadas com FITC, durante as primeiras 120 horas de
infecção pelo S. mansoni. Em A: marcação com ConA-FITC, B: marcação com PNA-FITC,
C: marcação com SBA-FITC e D: marcação com WGA-FITC.
110
A
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
B
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
C
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
D
0 25 50 75 100 125 150
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
N úmero de hem ócitos marcados x 10
4
5.2.2. Ação de carboidratos na interação de hemócitos com esporocistos
transformados in vitro.
5.2.2.1. Adesão dos hemócitos aos esporocistos
Nas concentrações de 1, 5, 25 e 100 mM e 3, 6, 12 e 25 mM, de n-acetilglicosamina
e Galactosamina, respectivamente, cerca de 90% dos esporocistos permaneceram viáveis
mesmos após 24 horas de incubação, o mesmo sendo observado na incubação com hemócitos
tanto de B. glabrata quanto de B. tenagophila.
A análise realizada após 2 h revelou que o índice de adesão celular (IAC) foi baixo,
tanto em B. glabrata quanto em B. tenagophila (Cabo Frio e Taim), mesmo na ausência de
carboidratos. Desta forma, a avaliação da adesão de hemócitos à superfície de esporocistos
(IAC), realizada após 6 h de incubação, será apresentada para os diversos tratamentos nas
diferentes espécies e linhagens Biomphalaria. Foi verificado que a maioria dos esporocistos
de S. mansoni (67 %) incubados com hemócitos circulantes de B. glabrata não infectados não
apresentou células aderidas a sua superfície, ou seja, apresentaram IAC=0, e o restante dos
esporocistos (33 %) apresentou de 1 a 10 hemócitos aderidos, IAC=1 (figura 20A). A adição
de N-acetilglicosamina, na concentração final de 1 e 5 mM, resultou em um aumento
significativo na proporção de esporocistos com poucos hemócitos aderidos, IAC=1, embora
não tenha sido observados os índices IAC=2 ou IAC=3 (figura 20A). Em concentrações de 25
e 100 mM de N-acetilglicosamina, não foi notada alteração no padrão de adesão celular dos
esporocistos, permanecendo semelhante ao observado nos controles (figura 20A). Resultados
semelhantes foram observados em testes em que se adicionou 10% da fração solúvel de
hemolinfa de B. glabrata juntamente com hemócito e esporocisto (figura 20B). Na presença
destes fatores solúveis, foi observado um pequeno aumento na porcentagem de esporocistos
de S. mansoni com IAC = 0 (75%), sendo poucos com hemócitos aderidos apresentaram IAC
111
= 1. A adição de diferentes concentrações de N-acetilglicosamina não alterou
expressivamente este perfil de adesão de hemócitos ao tegumento de esporocistos, não sendo
observados esporocistos com IAC = 2 ou IAC = 3 em nenhum tratamento (figura 20B).
A adição de galactosamina na incubação de hemócitos B. glabrata com esporocisto
não foi testado, devido ao pequeno número de células desta espécie que expressam
carboidratos ligantes para PNA.
112
Figura 20: Adesão de hemócitos circulantes de B. glabrata, ao tegumento de
esporocistos de S. mansoni, após 6 horas de incubação in vitro. Índice de adesão expresso
como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento IAC = 0,
esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50 hemócitos
aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A: Esporocistos
de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com células na presença
de hemolinfa de B. glabrata. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação
ao controle.
113
A
B
ABC
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 1 m M 5 m M 25 m M 100 m M
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 1 m M 5 m M 25 m M 100 m M
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos
IAC=0
IAC=1
IAC=2
IAC=3
*
*
*
*
*
*
*
*
A adesão de hemócitos de B. tenagophila (Taim e Cabo Frio) ao esporocisto de S.
mansoni foi maior que a observada em B. glabrata. Na presença de hemócitos da linhagem
Cabo Frio, 50 % dos esporocistos não apresentaram células aderidas em sua superfície
(IAC=0), 20 % mostraram IAC=1 e 30 % IAC=2. Na adição de concentrações crescentes de
N-Acetilglicosamina foi observado um aumento significativo do número de esporocistos com
o IAC=1 nas concentrações de 1, 25 e 100 mM de N-acetilglicosamina, em conseqüência
especialmente da redução da porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos (IAC = 0)
(nas concentrações de 25 e 100 mM) e de esporocistos com IAC = 2 (a 100 mM) (figura
21A). A presença de hemolinfa, durante a incubação de hemócitos com esporocistos, resultou
em alterações nos índices de adesão celular ao tegumento do parasito; ou seja, apenas 10%
apresentaram IAC=0, 60% IAC=1 e 30% IAC=2. Não foi observado nenhum esporocisto com
mais de 50 células aderidas a sua superfície (figura 21B). A adição de N-acetilglicosamina,
reverteu o padrão de adesão de hemócitos ao esporocisto, aumentando significativamente a
porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos e diminuição significativa daqueles com
IAC=1 nas concentrações 1, 5, 25 e 100 mM e dos com IAC=2 na concentração de 1 mM
(figura 21B). Entretanto, foram observados esporocistos com IAC=3 nos testes com adição de
1, 5 e 25 mM de N-acetilglicosamina, porém estes desaparecem na concentração de 100 mM
(figura 21B).
114
Figura 21: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Cabo
Frio ao tegumento de esporocistos de S. mansoni, após 6 horas de incubação in vitro. Índice
de adesão expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento
IAC = 0, esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50
hemócitos aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A:
Esporocistos de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com
células na presença de hemolinfa de B. tenagophila Cabo Frio. * representa diferenças
significativas com p < 0,05 em relação ao controle.
115
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos
IAC=0
IAC=1
IAC=2
IAC=3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
A incubação de hemócitos de B. tenagophila Cabo Frio com esporocistos de S.
mansoni na presença de Galactosamina, resultou em diminuição significativa de esporocistos
com IAC=0 nas concentrações de 3 e 6 mM e, conseqüentemente, um aumento do IAC=1
nestas mesmas concentrações. Também foi observada uma diminuição de esporocistos, com
IAC=2, nas concentrações de 12 e 25 mM e o aparecimento de IAC=3 na concentração de 3
mM (figura 22A). Quando os esporocistos e hemócitos foram incubados com Galactosamina
na presença de hemolinfa, foi observado um aumento dos esporocistos com IAC=0, em todas
as concentrações de Galactosamina, sendo este aumento significativo nas concentrações de 12
e 25 mM e uma diminuição de IAC=1 nas concentrações de 3 e 25 mM. Além disso, foi
observada uma diminuição significativa de esporocistos com IAC= 2, com 6 e 12 mM e o
aparecimento de esporocistos com IAC=3 nas concentrações de 3 e 6 mM que já não mais
visto nas concentrações de 12 e 25 mM (figura 22B).
116
A
B
Figura 22: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Cabo
Frio ao tegumento de esporocistos de S. mansoni, após 6 horas de incubação in vitro. Índice
de adesão expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento
IAC = 0, esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50
hemócitos aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A:
Esporocistos de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com
células na presença de hemolinfa de B. tenagophila Cabo Frio. * representa diferenças
significativas com p < 0,05 em relação ao controle.
117
0
20
40
60
80
100
Controle 3 mM 6 mM 12 mM 25 mM
Conce ntração de Galactos am ina
% de esporocistos
IAC=0
IAC=1
IAC=2
IAC=3
0
20
40
60
80
100
Controle 3 mM 6 mM 12 mM 25 mM
Conce ntração de Galactosam ina
% de esporocistos
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Esporocistos de S. mansoni incubados com os hemócitos isolados de B. tenagophila
do Taim mostraram um grande número de células aderidas ao tegumento do parasito. Mesmo
na ausência de hemolinfa, somente 10% dos esporocistos se encontravam sem hemócitos
aderidos a sua superfície, IAC=0, sendo que 45% dos esporocistos apresentaram IAC=1, 35%
IAC=2 e 5% mais de 50 células aderidas a sua superfície (IAC=3) (figura 23A). A adição de
N-acetilglicosamina, resultou inicialmente, em um aumento significativo na porcentagem de
esporocistos com IAC=3, na presença de 1 e 5 mM do carboidrato, entretanto, nas
concentrações de 25 e 100 mM, observou-se um aumento significativo de esporocistos sem
hemócitos aderidos e conseqüente diminuição de esporocistos com IAC=2 e IAC = 3 (figura
23A).
Na presença de fatores solúveis da hemolinfa desta linhagem de caramujo, os
hemócitos de B. tenagophila do Taim aumentaram significativamente a capacidade de aderir
ao tegumento dos esporocistos (figura 23B). Na ausência de carboidratos, não foram
encontrados esporocistos sem hemócitos aderidos a sua superfície, ao passo que 16,7%
apresentaram IAC=1, 50% IAC=2 e 33,3% IAC=3. A presença de concentrações crescentes
de N-acetilglicosamina resultou em um aumento progressivo e significativo na porcentagem
de esporocistos com IAC=0 e com IAC=1 em conseqüência da diminuição progressiva e
significativa na porcentagem do IAC=2. Os esporocistos com IAC=3 diminuíram na presença
de 5 mM de N-acetilglicosamina, não sendo observados esporocistos encapsulados por
hemócitos (IAC = 3) na presença de 25 e 100 mM (figura 23B).
118
Figura 23: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Taim ao
tegumento de esporocistos de S. mansoni, após 6 horas de incubação in vitro. Índice de
adesão expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento
IAC = 0, esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50
hemócitos aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A:
Esporocistos de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com
células na presença de hemolinfa de B. tenagophila Taim. * representa diferenças
significativas com p < 0,05 em relação ao controle.
119
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos
IAC=0
IAC=1
IAC=2
IAC=3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
A adesão de hemócitos de B. tenagophila do Taim a superfície dos esporocistos de S.
mansoni, in vitro, foi alterada pela adição de galactosamina, sendo observado aumento nos
índices de adesão de esporocistos com IAC=1, IAC=2 e IAC=3 na concentração de 3 mM do
açúcar. Entretanto, foi observada diminuição nos índices de adesão nas concentrações de 6 e
12 mM e, em 25 mM, os índices são semelhantes ao controle. Na presença de hemolinfa, a
adição de galactosamina resultou em inibição de adesão de hemócitos aos esporocistos, sendo
observado um aumento significativo de esporocistos com IAC=0 e IAC=1 e conseqüente
diminuição com IAC=2 e IAC=3, em todas as concentrações testadas (figura 24B).
Entretanto, a inibição observada com adição de 6mM não aumentou nas concentrações
maiores do açúcar, mas alguns esporocistos com IAC=3 continuaram presentes (figura 24B).
120
Figura 24: Adesão de hemócitos circulantes de B. tenagophila da linhagem Taim ao
tegumento de esporocistos de S. mansoni, após 6 horas de incubação in vitro. Índice de
adesão expresso como porcentagem de esporocistos sem hemócitos aderidos ao tegumento
IAC = 0, esporocistos com até 10 hemócitos aderidos IAC = 1, esporocistos com até 50
hemócitos aderidos IAC = 2 e esporocistos com mais de 50 hemócitos aderidos IAC = 3. A:
Esporocistos de S. mansoni incubados com hemócitos e B: Esporocistos incubados com
células na presença de hemolinfa de B. tenagophila Taim. * representa diferenças
significativas com p < 0,05 em relação ao controle.
121
B
A
0
20
40
60
80
100
Controle 3 mM 6 mM 12 mM 25 mM
Conce ntr ação de Galactos am ina
% de esporocistos
IAC=0
IAC=1
IAC=2
IAC=3
0
20
40
60
80
100
Controle 3 mM 6 mM 12 mM 25 mM
Conce ntr ação de Galactos am ina
% de esporocistos
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
5.2.2.2. Mortalidade de esporocistos
Os resultados mostraram baixa porcentagem de esporocistos mortos pelos hemócitos
da espécie B. glabrata. Por outro lado, os esporocistos incubados com hemócitos das
linhagens Cabo Frio e Taim revelaram porcentagens de mortalidade maiores que as da espécie
B. glabrata.
A incubação dos esporocistos de S. mansoni com hemócitos, na presença ou não da
fração solúvel da hemolinfa de B .glabrata, não resultou em diferenças significativas na
porcentagem de esporocistos mortos após 6 horas de incubação. Além disso, não houve
alterações significativas na mortalidade de esporocistos com a adição de concentrações
crescentes de N-acetilglicosamina (figura 25).
122
Figura 25: Porcentagem de esporocistos de S. mansoni mortos após 6 horas de
incubação com hemócitos na presença ou não do extrato solúvel da hemolinfa de caramujos
B. glabrata. * representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação ao controle.
123
0
20
40
60
80
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos mortos
Hemócitos
Hemócitos e Hemolinfa
Em B. tenagophila da linhagem Cabo Frio, após 6 horas de incubação dos
esporocistos de S. mansoni nas diferentes concentrações de N-acetilglicosamina, inicialmente
apresentou porcentagem de mortalidade significativamente maior quando comparados ao
grupo sem adição de N-acetilglicosamina (figura 26). Na concentração de 1 mM observou-se
um aumento significativo na porcentagem de esporocistos mortos, na presença da fração
solúvel da hemolinfa (20 %) (figura 26A). Na concentração de 25 foi observada uma
diminuição brusca na porcentagem de esporocistos mortos (0%), quando estes foram
incubados somente com os hemócitos, porém um aumento significativo da mortalidade na
presença da fração solúvel da hemolinfa. Os valores na porcentagem de esporocistos mortos
observados quando os hemócitos foram incubados com a fração solúvel da hemolinfa
apresentaram diferenças significativamente maiores que a incubação somente com os
hemócitos, nas concentrações de 1, 25 e 100 mM de N-acetilglicosamina (figura 26A).
Quando os esporocistos de S. mansoni são incubados com os hemócitos da linhagem
Cabo Frio de B. tenagophila, na presença de Galactosamina, observamos um aumento
significativo na porcentagem de mortos na concentração de 6 mM, em relação ao controle
sem o carboidrato. Na concentração de 12 mM, pode-se observar uma diminuição
significativa na mortalidade (figura 26B). Mais uma vez, a presença da fração solúvel da
hemolinfa acarretou um aumento significativo na porcentagem de esporocistos mortos,
quando comparado a incubação somente com os hemócitos e, na presença da hemolinfa, foi
observada uma tendência de diminuição da porcentagem de mortos na presença de 3, 6 e 12
mM de galactosamina (figura 26B).
124
Figura 26: Porcentagem de esporocistos de S. mansoni mortos após 6 horas de
incubação com hemócitos na presença ou não de extrato solúvel da hemolinfa de caramujos
B. tenagophila da linhagem Cabo Frio. Em A: esporocistos incubados na presença de
diferentes concentrações de N-acetilglicosamina e em B: esporocistos incubados na presença
de diferentes concentrações de Galactosamina. * representa diferenças significativas com p <
0,05 em relação ao controle e # representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação a
presença da hemolinfa.
125
A
B
0
20
40
60
80
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos mortos
Hemócitos
Hemócitos e Hemolinfa
*
*
*
*
#
#
0
20
40
60
80
100
Controle 3 mM 6 mM 12 mM 25 mM
Concentração de Galactosamina
% de esporocistos mortos
*
*
*
*
*
*
#
#
#
*
*
#
Após 6 horas de incubação dos esporocistos de S. mansoni com hemócitos de B.
tenagophila da linhagem do Taim, foi observado um aumento significativo na porcentagem
de esporocistos mortos, entre o controle sem a adição de carboidrato e a incubação na
presença de 1mM de N-acetilglicosamina. Entretanto, nas concentrações de 25 e 100 mM, foi
observada uma diminuição significativa na porcentagem de esporocistos mortos quando estes
são incubados com hemócitos na presença ou não da fração solúvel da hemolinfa (figura
27A).
Em relação a incubação dos esporocistos em variadas concentrações de
Galactosamina, foi observada a tendência a diminuição na porcentagem mortos na
concentração mais alta (25 mM) quando se compara o grupo controle (sem galactosamina),
principalmente na presença da fração solúvel da hemolinfa (figura 27B). Como em outros
grupos testados, a presença do extrato solúvel da hemolinfa resultou em aumento significativo
na porcentagem de esporocistos mortos, principalmente no grupo controle e na concentração
de 3 mM de Galactosamina. (figura 27B).
126
Figura 27: Porcentagem de esporocistos de S. mansoni mortos após 6 horas de
incubação com hemócitos na presença ou não de extrato solúvel da hemolinfa de caramujos
B. tenagophila da linhagem Taim. Em A: esporocistos incubados na presença de diferentes
concentrações de N-acetilglicosamina e em B: esporocistos incubados na presença de
diferentes concentrações de Galactosamina. * representa diferenças significativas com p <
0,05 em relação ao controle e # representa diferenças significativas com p < 0,05 em relação a
presença de hemolinfa.
.
127
A
B
A
B
0
20
40
60
80
100
Controle 1 mM 5 mM 25 mM 100 mM
Concentração de N-acetilglicosamina
% de esporocistos mortos
Hemócitos
Hemócitos e Hemolinfa
*
*
*
*
#
#
0
20
40
60
80
100
Controle 3 mM 6 mM 12 mM 25 mM
Concentração de Galactosamina
% de esporocistos mortos
#
#
*
*
*
*
*
5.3. DISCUSSÃO
No sistema interno de defesa dos moluscos do gênero Biomphalaria, vários estudos
destacam a importância do fator humoral juntamente com o celular, na determinação do
sucesso ou fracasso da infecção por trematodas (Van der Knaap & Loker, 1990; Zelck &
Becker, 1990; Uchikawa & Loker, 1991; Johnston & Yoshino, 1996; Martins-Souza 1999;
Bayne et al., 2001;Johnston & Yoshino, 2001; Castilho & Yoshino, 2002).
A interação de lectinas com carboidratos também possui um papel importante neste
sistema de defesa (Fryer et al., 1989). Van der Knaap & Loker (1990) descrevem a
importância das lectinas como sendo responsável pela ligação entre os hemócitos e a
superfície tegumentar do S. mansoni. Além disso, estes autores demonstram que elas podem
estar presentes solúveis na hemolinfa ou expressas na superfície dos hemócitos. Tal fato
possibilitaria vários tipos de ligações entre o hemócito e o parasito: 1. a ligação direta da
lectina expressa na membrana do hemócito e os carboidratos do tegumento do parasito; 2. a
lectina como uma ponte entre carboidratos da membrana do hemócito e carboidratos do
tegumento do parasito; e 3. as lectinas, estando presentes no tegumento do parasito, ligam-se
aos carboidratos da membrana do hemócitos.
A composição do tegumento do esporocisto de S. mansoni é outro fator de
fundamental importância para a comunicação entre o parasito e seu molusco hospedeiro. O
tegumento larval serve como alvo para o sistema interno de defesa, no qual os hemócitos
reconhecem, encapsulam e destroem os esporocistos após a invasão em caramujos resistentes
(Bayne & Yoshino, 1989; Loker, 1994; Yoshino & Vasta, 1996). Sendo assim, carboidratos
da membrana, especialmente aqueles associados a glicoproteínas e glicolipídios, representam
o principal componente químico do miracídio e do esporocisto de S. mansoni (Uchikawa &
Loker, 1991). Acredita-se que o principal mecanismo de ligação dos hemócitos ao tegumento
128
dos esporocistos se dá através do reconhecimento, por parte das lectinas, dos carboidratos
presentes no tegumento do parasito (Johnston & Yoshino, 1996).
Os resultados apresentados no presente trabalho sugerem que a membrana dos
hemócitos presentes na hemolinfa de caramujos Biomphalaria apresenta uma variedade de
receptores em sua superfície o que é justificado pela marcação de uma variedade de lectinas
(ConA, PNA, SBA e WGA). A heterogeneidade da população de hemócitos circulantes,
presentes na hemolinfa de caramujos do gênero Biomphalaria, vem sendo demonstrada por
vários autores levando em consideração aspectos morfológicos, bioquímicos e funcionais
(Harris, 1975; Yoshino, 1976; Joky et al., 1983; Lie et al., 1987; Ottaviani, 1992; Barraco et
al., 1993;Bezerra et al., 1997; Matricon-Gondran & Letorcart, 1999; Johnston & Yoshino,
2001 e Martins-Souza et al., 2003). Pouco se sabe a respeito da caracterização molecular
destas células.
Quando analisamos de maneira geral a marcação dos hemócitos de B. glabrata e B.
tenagophila das linhagens Cabo Frio e Taim, com as lectinas testadas (ConA, PNA, SBA e
WGA), podemos concluir que na superfície destas células são encontrados vários receptores
(carboidratos), porém a distribuição dos mesmos difere entre as espécies e os diferentes tipos
celulares. O fato dos hemócitos pequenos, tanto de B. glabrata quanto B. tenagophila,
apresentarem receptores para todas as lectinas testadas, poderia estar relacionado à hipótese
de que células (que compreendem os hialinócitos) podem ser precursoras dos hemócitos
grandes (granulócitos) mais diferenciados (Sminia, 1981). Sendo uma célula indiferenciada,
elas apresentariam uma quantidade maior de carboidratos em sua superfície, assim como uma
variedade maior dos tipos de carboidratos.
As diferenças no número de hemócitos marcados e a intensidade da marcação
observadas na espécie B. glabrata e nas linhagens Cabo Frio e Taim de B. tenagophila,
129
podem ser justificadas pelas diferenças no grau de resistência entre as espécies, o que é
demonstrado por vários autores (Bezerra et al., 1997; Martins-Souza et al., 2003; Coelho et
al., 2004; Rosa et al., 2005). Além disso, o fato dos hemócitos de B. tenagophila serem mais
eficientes na destruição dos esporocistos de S. mansoni, destruição esta comprovada por
estudos histológicos (Martins-Souza, 1999), também explicaria as diferenças na marcação dos
hemócitos no decorrer da infecção pelo S. mansoni, quando comparadas a B. glabrata.
Acredita-se que, assim como as lectinas, os produtos excretados e secretados pelos
esporocistos estão relacionadas a ativação dos hemócitos (Bayne et al., 1980b; Bayne et al.,
1984; Boehmler et al., 1996), e o fato dos caramujos estarem infectados, poderia levar a uma
aumento de receptores presentes na superfície dos hemócitos. A importância da resposta
celular a infecção, na marcação dos hemócitos, pode ser comprovada pelos resultados
observados na linhagem Taim de B. tenagophila, onde observamos uma diminuição no
número de hemócitos circulantes após 5 horas de infecção. Esta diminuição pode ser devida
aos hemócitos, efetivamente capazes de destruírem o parasito, estarem migrando para o local
da penetração do miracídio, (Bezerra et al., 1997), sugerindo que estes sejam marcado pela
lectinas testadas, principalmente pela WGA.
A importância da ligação de lectinas à superfície dos hemócitos já foi demonstrada
em outros trabalhos, em que, o tratamento de hemócitos de B. glabrata com ConA aumenta a
capacidade destes a aderirem ao vidro (Yoshino, 1981).
A especificidade da ligação entre lectinas e a superfície dos hemócitos foi
confirmada através do confronto in vitro do hemócito e esporocistos de S. mansoni. Relatos
presentes na literatura demonstraram que a fagocitose de leveduras por hemócitos de B.
glabrata pode ser inibida quando estes são incubados com de carboidratos (Fryer et al., 1989).
No presente trabalho, podemos observar que a adesão dos hemócitos, principalmente da
130
linhagem do Taim de B. tenagophila, a superfície dos esporocistos de S. mansoni pode ser
inibida pelo carboidrato, sugerindo que a ligação entre os hemócitos e o tegumento do
esporocisto se dá através da lectina. Além disso, os resultados demonstram que esta inibição é
dose dependente.
Quando analisamos a adesão dos hemócitos ao tegumento do esporocisto,
observamos mais uma vez que os hemócitos de B. glabrata não são eficientes no processo de
encapsulamento do esporocisto, o que justifica o seu alto grau de susceptibilidade a infecção
pelo S. mansoni, relatado por vários autores (Correa et al, 1979; Santos et al., 1979; Bezerra et
al., 1997). Ao contrário, as linhagens de B. tenagophila apresentam maior grau de resistência
a infecção pelo S. mansoni (Bezerra et al., Martins-Souza et al., 2003; Coelho et al., 2004;
Rosa et al., 2005), conseqüentemente apresentam maiores índices de adesão celular. Além
disso, nestas linhagens, a adição da fração solúvel da hemolinfa resultou em um aumento do
número de hemócitos aderidos a superfície dos esporocistos, o que sugere haver na hemolinfa
destas linhagens, fatores (lectinas e ou carboidratos) que potencializam o reconhecimento e
encapsulamento do esporocisto. Tal hipótese é suportada por trabalhos como o de Zelck &
Becker (1990).
Com relação a adição de carboidratos em concentrações menores, foi observado um
aumento do número de células na superfície dos esporocistos, tanto na presença de hemócitos
de B. glabrata, quanto de B. tenagophila. Acredita-se que, inicialmente, a presença de
carboidrato proporcione uma maior interação entre a superfície dos hemócitos e o tegumento
do esporocisto. Em contradição às concentrações mais elevadas de carboidratos, estes
passariam a competir pelas lectinas presentes tanto na superfície dos hemócitos quanto no
tegumento do esporocisto, bloqueando os sítios de ligação e impedindo a ligação dos
hemócitos ao parasito.
131
Com relação à taxa de mortalidade dos esporocistos, esta já pode ser observada a
partir de 6 horas de incubação e como era esperado mostrou-se praticamente inexistente em
B. glabrata e com valores consideráveis nas linhagens Cabo Frio e Taim de B. tenagophila.
Nestas linhagens, tanto a adição de carboidratos, quanto da fração solúvel da hemolinfa
resultou em alterações na adesão celular e à morte dos esporocistos.
Os resultados obtidos neste estudo indicam haver uma correlação entre o número de
células aderidas ao tegumento do esporocisto e sua mortalidade. Quando incubados com
hemócitos de B. glabrata, os esporocistos apresentaram poucas células aderidas ao seu
tegumento (ICA=1) e conseqüentemente praticamente não houve mortalidade. Mesmo a
adição de carboidratos não alterou estes resultados. Acredita-se que os hemócitos desta
espécie não sejam capazes de encapsular de maneira efetiva os esporocistos. Porém, na
linhagem Taim de B. tenagophila, observamos esporocistos com mais de cinqüenta hemócitos
aderidos ao seu tegumento (IAC=3) e as maiores taxas de mortalidade. Quando a adesão dos
hemócitos é inibida pelas altas concentrações de carboidratos, a mortalidade diminui
significativamente.
Na linhagem de Cabo Frio, a adição da fração solúvel da hemolinfa e de carboidratos
(N-acetilglicosamina e galactosamina) resultou em aumento da adesão dos hemócitos ao
tegumento dos esporocistos e, conseqüentemente, em um aumento da taxa de mortalidade dos
esporocistos. De acordo com dados divulgados em outros trabalhos, a hemolinfa possui
alguns fatores que potencializam a interação entre os hemócitos e o esporocisto (Bayner et al,
1980 a,b; Granath & Yoshino, 1984; Fryer & Bayner, 1996; Adema et al, 1997; Martins-
Souza, 1999). Dentre estes fatores, destaca-se a presença de carboidratos e lectinas. Com
relação a linhagem do Taim, a presença da hemolinfa, juntamente com N-acetilglicosamina
em maiores concentrações, parece inibir a adesão dos hemócitos ao tegumento dos
132
esporocistos e conseqüentemente, a morte destes. Acredita-se que na hemolinfa desta
linhagem exista lectina semelhante a WGA. Isso seria justificado pela diminuição da adesão
celular e da taxa de mortalidade dos esporocistos devida a adição de altas concentrações de N-
acetilglicosamina e da hemolinfa da linhagem do Taim. A presença de WGA, na hemolinfa
resgataria os carboidratos adicionados impedindo que estes potencializem a adesão celular e,
conseqüentemente, a morte dos esporocistos. Além disto, o fato de não se observar esta
inibição, quando a hemolinfa é adicionada na presença de Galactosamina, reforça a hipótese
de que uma das lectinas presentes na hemolinfa de B. tenagophila do Taim seja a WGA.
A resistência da linhagem Taim de B. tenagophila foi, mais uma vez, confirmada
através dos resultados obtidos neste trabalho, no qual foi observado que, quando os
esporocistos são incubados com hemócitos na presença ou não da fração solúvel da
hemolinfa, estes apresentam os maiores índices de adesão celular e taxa de mortalidade. Além
dos hemócitos, o presente trabalho reforça a importância também da hemolinfa do Taim na
destruição dos esporocistos de S. mansoni. A presença de hemolinfa potencializa a adesão dos
hemócitos, a superfície dos esporocistos e aumentam a porcentagem de esporocistos mortos
pelos hemócitos, quando estes são incubados na ausência de carboidratos. Tais resultados são
concordantes com trabalhos anteriores (Martins-Souza, 1999; Martins-Souza, 2003).
133
6.Análise da interação dos hemócitos com antígenos e esporocistos de S.
mansoni.
Os mecanismos pelos quais os hemócitos destroem o parasito ainda não foram
completamente elucidados. Dependendo do tamanho, os organismos (ou partículas) podem
ser fagocitados pelos hemócitos ou encapsulados (como no caso de larvas de Digenea) e
subseqüentemente lesados por metabólitos secretados pelos hemócitos ativados (Adema et al.,
1997a).
Um dos principais mecanismos envolvidos na morte do parasito mediada por células
parece ser a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelo hemócitos. Hemócitos de
gastrópoda produzem ROS (Dikkeboom et al., 1988a) e este processo, semelhante a
citotoxidade oxidativa de macrófagos de mamíferos, é induzido em resposta à infecção por
trematódeos parasitos (Dikkeboom et al., 1988b). Segundo Adema et al. (1991), a produção
de radicais livres de oxigênio pode ser encontrada em muitas, mas não em todas espécies de
moluscos investigadas. Simultaneamente, Shozawa et al., (1989) relatam que os hemócitos de
B. glabrata produzem ROS.
O envolvimento direto de ROS na morte de trematódeos foi demonstrado por Adema
et al., (1994), usando esporocistos de T. ocellata e hemócitos de L. stagnalis, bem como S.
mansoni e B. glabrata. Neste estudo foi demonstrado que, quando a produção de ROS pelos
hemócitos é inibida, a habilidade destes matarem o parasito é comprometida.
De acordo com Babior (1999), o “burst respiratório” das células fagocitárias e
conseqüente produção de ROS, é resultado da ativação de um complexo NADPH oxidase na
membrana plasmática de fagócitos.
Adicionalmente, muitos tipos de células fagocitárias possuem óxido nítrico sintase
induzível (iNOS), na presença de iNOS a arginina é transformada em citrulina e esta óxido
134
nítrico (NO). Embora NO tenha atividade citotóxica local, ele é rapidamente reativo com O
2
-
para formar oxidante mais reativo, peroxinitrito (ONOO
-
) (Bayne et al., 2001). A toxidade ou
não de NO dependerá do balanço entre a produção de NO e ROS.
De maneira semelhante aos mamíferos, hemócitos de alguns moluscos podem gerar
HOCl (Schlenk et al., 1991; Torreilles et al., 1997) e NO (Conte & Ottaviani et al., 1995;
Torreilles & Guerin, 1999; Arumugam et al., 2000). Assim, os hemócitos têm um potencial
para a produção de ambos, oxidantes altamente reativos (O
2
-
, -OH,
1
O
2
, HOCl e ONOO
-
) e
outros oxidantes (NO e H
2
O
2
) (Bayne et al., 2001).
O objetivo deste trabalho é analisar comparativamente, a produção de radicais de
nitrogênio por hemócitos circulantes de caramujos B. glabrata e B.tenagophila (Cabo Frio e
Taim), sob o estímulo da infecção pelo S. mansoni e re-estímulo com antígenos solúveis de
ovos ou esporocistos do parasito in vitro.
135
6.1. MATERIAL E MÉTODOS
6.1.1. Caramujos
Assim como nos demais capítulos, os caramujos utilizados pertencem às espécies B.
glabrata e B. tenagophila, ambas provenientes dos moluscários do Grupo Interdepartamental
de Estudos sobre Esquistossomose (GIDE) – ICB – UFMG. A linhagem de B. glabrata
utilizada é proveniente da Lagoa da Pampulha – Belo Horizonte (MG), denominada linhagem
BH. Enquanto que nas linhagens de B. tenagophila, os experimentos aqui reportados utilizam
duas linhagens: Cabo Frio (CF) e Taim.
6.1.2. O Parasito
Os caramujos acima referidos foram infectados com a cepa LE de S. mansoni que
vem sendo mantida no GIDE por 35 anos.
6.1.3. Infecção de caramujos
Hamsters (Mesocricetus auratus) infectados com S. mansoni da cepa LE são
sacrificados entre 45 e 50 dias após infecção para obtenção de miracídios e os caramujos
foram infectados de acordo com a técnica de Pellegrino & Katz, 1968 (com algumas
modificações já citadas no capítulo 1).
6.1.4. Contagem diferencial de hemócitos e viabilidade
Amostras da hemolinfa total recolhidas de cerca de 15 caramujos dos diferentes
grupos experimentais, em diferentes períodos de infecção, foram diluídas 1\10 em CBSS pH
7.4 contendo 0,4% de Azul de Tripan. A diferenciação celular foi realizada levando-se em
136
consideração os diferentes tamanhos dos hemócitos. As células foram contadas em câmara de
Neubauer e as células coradas de azul foram consideradas mortas (Martins-Souza, 1999).
6.1.5. Análise da interação dos hemócitos com antígenos e esporocistos de S.
mansoni.
7.1.5.1. Obtenção de antígenos solúveis de ovos de S. mansoni - SEA
O antígeno dos ovos de S. mansoni foi obtido de acordo com a técnica modificada de
Goes et al. (1989). Inicialmente, foram obtidos ovos do parasito, através da homegenização de
fígados de camundongos com cerca de 45 dias de infecção, em liquidificador com salina
1,7%. O homogenato foi passado por várias peneiras de diâmetro de malhas diferentes (425,
106 e 45 µm), sendo os ovos retidos na ultima malha de 45µm. Em seguida a peneira foi
lavada e os ovos foram concentrados através de centrifugação por 5 minutos a 2500 rpm.
Após os ovos serem isolados, estes foram triturados em virtiz por cerca de 40
minutos ou até que não se possa verificar a presença de ovos inteiros. Em seguida, o material
é centrifugado a 13000g, a 4
0
C por 60 minutos e o sobrenadante foi dialisado por 48 horas
em salina 0,9%. Após a diálise, foi feita a dosagem de proteínas pelo método de Lowry.
6.1.5.2. Transformação de miracídios de S. mansoni em esporocistos in vitro
Os esporocistos foram obtidos a partir do isolamento de miracídios do fígado de
hamsters com 45 a 50 dias de infecção com S. mansoni (Chaia, 1956) e mantidos em meio
completo RPMI-1640, contendo 5 % de soro fetal bovino por 18 horas a 27
0
C com 5 % de
CO
2
(Martins-Souza, 1999).
137
6.1.5.3. Quantificação dos radicais reativos de nitrogênio em hemócitos a partir da
estimulação pela infecção por S. mansoni e reestimulação por SEA ou esporocistos.
Cerca de 10
5
hemócitos de caramujos normais e infectados pelo S. mansoni, após
diferentes períodos de infecção, são incubados em CBSS suplementado com 1% de glutamina
(2mM), 2% de aminoácidos, 1% de HEPES, 1% de antibiótico (penicilina e streptomicina) e
10% de soro fetal bovino, na presença ou não de estímulos (50 µg de SEA ou 100
esporocistos/ 10
5
hemócitos) durante 18 horas a 27
0
C com 5 % de CO
2.
Após a estimulação, uma amostra do sobrenadante foi recolhida para a quantificação
da presença de nitrito. A dosagem de óxido nítrico foi realizada de forma indireta, medindo-se
a concentração de nitrato de acordo com o método de Greene usando uma curva padrão com
NaNO
2
Resumidamente, 100µl do sobrenadante de cada amostra é colocada em contato com
100 µl do reagente de Greiss (NEED-naphtyuletyleno-diamida-0,1% em água + sulfanilamida
1% em H
3
PO
4
2,5%). Em seguida, é realizada a leitura em leitor de ELISA a 540 nm e a
concentração de óxido nítrico foi estimada de acordo com as concentrações de NaNO
2
da
curva padrão.
6.1.6. Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados, utilizando–se análise de variância
ou teste t de Student para os dados paramétricos e teste de Kruskal Wallis para dados não
paramétricos.
138
6.2. RESULTADOS
6.2.1. Produção de NO
Hemócitos circulantes de B. glabrata e B. tenagophila são capazes de produzir NO,
quando estimulados com antígenos de ovo de Schistosoma (SEA). Porém não há diferenças
significativas na produção de NO, quando se comparam as duas espécies de Biomphalaria
testadas (B. glabrata e B. tenagophila), nem nas duas linhagens de B. tenagophila (Cabo Frio
e Taim). Além disso, o aumento significativo destes produtos no sobrenadante de cultura foi
observado após 18 horas de incubação (figura 28).
Quando se observam períodos de incubação superiores a 18 horas, a medida de NO é
comprometida pela contaminação do meio (dado não mostrado). A partir do que foi
estabelecido durante a cinética de incubação, 18 horas foi o período estabelecido para se dosar
os níveis de NO nos experimentos seguintes. O próximo passo foi estabelecer em que período
da infecção pode-se obter os níveis mais elevados de NO.
139
Figura 28: Cinética de incubação dos hemócitos de caramujos livres de infecção,
estimulados com SEA, para medida de nitrito. BG: caramujos B. glabrata, BT-CF: caramujos
B. tenagophila da linhagem Cabo Frio e BT-Taim: caramujos B. tenagophila da linhagem
Taim. * representa diferenças significativas entre os tempos de incubação.
140
0
20
40
60
80
100
3 6 9 18
Horas de incubação
Concentração de nitrito
(nM)
BG
BT CF
BT Taim
Durante a infecção dos caramujos, podemos observar um aumento na produção de
NO, nos períodos de 1, 3 e 7 dpi, sendo este aumento mais significativo no 1º dia de infecção,
(figura 29). Entretanto, não se pode observar diferenças significativas na produção de NO,
entre as linhagens de B. tenagophila e a espécie B. glabrata, apesar de uma leve tendência de
aumento na espécie B. glabrata, principalmente após 1 dia de infecção e na linhagem Taim de
B. tenagophila. Passados 20 dias de infecção, os níveis de NO, produzidos pelo hemócitos,
tendem aos níveis dos hemócitos livres de infecção.
Os dados mostram resultados semelhantes aos que foram apresentados com o SEA,
quando se utiliza esporocisto de S. mansoni transformados in vitro (dados não mostrados).
141
0
20
40
60
80
100
120
0 0,2 1 3 20
Dias após infecção
Concentração de nitrato (nM)
B. glabrata
B. tenagophila CF
B. tenagophila Taim
Figura 29: Cinética da produção de Nitrato pelo hemócitos circulantes de caramujos
B. glabrata e B. tenagophila das linhagens Taim e Cabo Frio, durante a infecção pelo S.
mansoni sob reestímulo de SEA. * representa diferenças significativas entre os tempos de
infecção.
142
6.3. DISCUSSÂO
Os resultados deste estudo demonstraram que os hemócitos de caramujos
Biomphalaria são sensíveis tanto aos antígenos solúveis do ovo de S. mansoni, quanto ao
esporocisto transformado in vitro.
Ao contrário do que se esperava, foi observada a produção de NO, tanto em espécies
e linhagens suscetíveis ao S. mansoni, como é o caso da B. glabrata e da linhagem Cabo Frio
de B. tenagophila, quanto na linhagem resistente: a linhagem Taim de B. tengophila. Esses
dados sugerem que a produção de NO não esteja diretamente ligada à resistência ao S.
mansoni. Hahn et al., (2001) demonstram a presença de diferentes metabólitos reativos de
oxigênio e nitrogênio envolvidos no processo de encapsulamento e morte de esporocistos de
S. mansoni por hemócitos de linhagens resistentes de B. glabrata. A ausência de diferenças
significativas entre os níveis de NO, produzidos pelo hemócitos de B.glabrata e pelas
linhagens Cabo Frio e Taim de B. tenagophila, poderia ser justificada devido ao fato de, neste
estudo, ter se medido apenas os níveis de NO, sendo desconsiderado os ROS.
Os dados aqui apresentados, também sugerem que o período de incubação torna-se
importante para a quantificação dos níveis de NO. A partir da cinética da produção de NO,
pode-se concluir que 18 horas de incubação dos hemócitos, com seus devidos estímulos,
apresenta-se com o melhor período para se realizar a dosagem de NO, uma vez que neste
período tem-se uma quantidade considerável de NO, com o mínimo de interferência de
contaminação.
Durante as primeiras 24 horas de infecção, a produção de NO pelos hemócitos
circulantes apresenta níveis mais elevados. De acordo com a literatura, é neste período que os
hemócitos se encontram ativados e migram para o local de penetração do parasito. Segundo
143
Bayne et al., (1980) o fato de estar ativado não implica na destruição do parasito, o que
justificaria a presença de altos níveis de NO na espécie e na linhagem suscetível utilizadas no
presente estudo.
Com relação ao tipo de estímulo, no que diz respeito ao tempo de incubação e o
período de infecção, os resultados mostram-se semelhantes, tanto com a utilização do
antígeno solúvel de ovos, quanto esporocistos transformados in vitro,. Apesar disso, os dados
mostraram que os esporocistos de S. mansoni, estimulam melhor os hemócitos, quando
comparado aos antígenos solúveis de ovos (SEA), por apresentarem níveis mais elevados de
NO no sobrenadante de cultura. O fato de se utilizar os esporocistos transformados in vitro, na
incubação com hemócitos circulantes, representa a situação mais próxima da realidade do que
acontece durante a infecção in vivo, o que justificaria os níveis mais altos de NO na presença
de esporocistos.
Os dados obtidos no capítulo 2, sugerem que a quantidade de células aderidas ao
tegumento do esporocisto, está diretamente relacionada à taxa de mortalidade dos
esporocistos; porém neste capítulo observamos que os maiores níveis de NO foram
produzidos pelos hemócitos de B. glabrata, e estes por sua vez não de aderem ao tegumento
do esporocisto. Tal fato reforça a hipótese de que o NO não seja o principal responsável no
mecanismo de morte do parasito. Outros fatores podem estar relacionados de uma maneira
mais direta, como é o caso dos ROS, peroxinitrito e outros oxidantes superóxidos (Hahn et al.,
2001). Além disso, acredita-se que a toxicidade do NO e conseqüente destruição do parasito,
seja resultado do balanço entre a produção de ROS e de NO.
144
7. CONCLUSÕES
A população de hemócitos circulantes isoladas de Biomphalaria apresenta duas
subpopulações, pela análise em citometria de fluxo, que são denominadas hemócitos
pequenos e hemócitos grandes. Estas duas populações de hemócitos circulantes são detectadas
tanto na espécie B. glabrata, quanto nas linhagens Cabo Frio e Taim de B.tenagophila.
Entretanto, a proporção de hemócitos pequenos e grandes difere significativamente entre B.
glabrata e B. tenagophila.
A infecção pelo S. mansoni não acarreta alteração no perfil dos hemócitos circulantes
de B. glabrata, porém leva as alterações marcantes no perfil de hemócitos circulantes de B.
tenagophila sendo estas observadas de maneira mais intensa e rápida na linhagem Taim de B.
tenagophila.
A inoculação de sílica acarreta diminuição da proporção hemócitos pequenos de B.
tenagophila e esta redução se mantêm por 72 h após a infecção pelo S. mansoni. Além disso,
a inoculação de sílica acarreta alteração na granulosidade dos hemócitos, principalmente na
linhagem Taim de B. tenagophila.
Os hemócitos circulantes de B. glabrata e B. tenagophila são especificamente
marcados pela lectinas ConA, PNA, SBA e WGA conjugadas com FITC. Porém, a proporção
de hemócitos marcados, o tipo celular e a intensidade desta marcação, são diferentes em cada
espécie e linhagens testadas. Em B. tenagophila, é observada uma maior proporção de células
145
marcadas por lectinas, sendo detectado marcação intensa em hemócitos pequenos, médios e
grandes, especialmente por WGA e PNA.
A infecção pelo S. mansoni induz alteração na proporção de células marcadas pelas
lectinas. Especificamente, é detectado aumento na proporção de hemócitos circulantes de B.
glabrata marcados por ConA e WGA, enquanto que, 5 h após a infecção,é observada uma
diminuição no número de hemócitos marcados por todas as lectinas testadas (ConA, PNA,
SBA e WGA), na linhagem do Taim de B. tenagophila. Este período coincide com aquele em
que os hemócitos (granulócitos) migraram para o local de penetração do parasito.
Ensaios in vitro demonstraram que o nível de adesão dos hemócitos ao tegumento do
parasito está associado ao grau de susceptibilidade do molusco. Os maiores índices de adesão
celular são observados na linhagem Taim de B. tenagophila. A ligação dos hemócitos da
linhagem Cabo Frio, ao tegumento de esporocistos de S. mansoni, foi potencializada através
da adição de carboidratos N-acetilglicosamina e Galactosamina e da fração solúvel da
hemolinfa. Já em relação à adesão celular de hemócitos da linhagem do Taim, esta é
potencializada em baixas concentrações de carboidratos e inibida nas concentrações mais
altas, mesmo na presença da fração solúvel da hemolinfa.
As taxas de mortalidade corroboram com os dados da adesão celular, em que
observamos, na linhagem Cabo Frio de B. tenagophila, aumento da mortalidade dos
esporocistos, quando se adiciona carboidratos e fração solúvel da hemolinfa. Ao passo que na
146
linhagem Taim, a adição de altas concentrações de carboidratos resulta em redução
significativa da taxa de mortalidade dos esporocistos.
Os hemócitos circulantes de Biomphalaria, infectados ou não pelo S. mansoni, são
capazes de produzir NO, na presença de antígenos solúveis de ovos (SEA) de S. mansoni ou
de esporocistos transformados in vitro.
Os resultados obtidos demonstram a importância da interação do componente celular
e dos fatores solúveis da hemolinfa na destruição do parasito nas linhagens resistentes.
147
8. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
ABDEL-MALEK, E. T. Susceptibility of the Biomphalaria boissyi to infection with certain
strains of Schistosoma mansoni, Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 887-894, 1950.
ADEMA, C. M. & LOKER, E. S. Specificity and immunobiology of larval digenean-sanil
associations. In: B. FRIED AND T. K. GRACZYK (Eds.). Advances in trematode biology.
Boca Raton, Florida: CRC Press, 229-264, 1997a.
ADEMA, C. M., HARRIS R. A. & VAN DEUTEKOM-MULDER, E. C. A comparative
study of hemocytes from six different snails: morphology and functional aspects. J. Invertebr.
Pathol. 59: 24-32, 1992.
ADEMA, C. M., VAN DER KNAAP. W. P. W. & SMINIA, T. Molluscan haemocyte-
mediated cytotoxicity: the role of reactive oxygen intermediates. Crit. Rev. Aquat. Sci., 4:
201-203, 1991.
ADEMA, C. M., VAN DEUTEKOM-MULDER, E. C., VAN DER KNAAP. W. P. W. &
SMINIA, T. NADPH-oxidase activity - the probable source of reactive oxygen intermediate
generation in hemocytes of the gastropod Lymnaea stagnalis. J. Leukocyte Biol., 54: 379-383,
1993.
ADEMA, C. M., VAN DEUTEKOM-MULDER, E. C., VAN DER KNAAP, W. P. W.
SMINIA, T. Schistosomicidal activities of Lymnaea stagnalis hemocytes: role of oxygen
radicals. Parasitology 109: 479-485, 1994.
ADEMA, C. M.; ARGUELLO, D. F.; STRICKER, S. A. & LOKER, E. S. A time-lapse study
of interactions between Echinostoma paraensei intramolluscan larval stages and adherent
hemocytes from Biomphalaria glabrata and Helix aspersa. J. Parasitol., 80: 719-727, 1997b.
ALLAM B, ASHTON-ALCOX KA, FORD SE. Flow cytometric comparison of haemocytes
from three species of bivalve molluscs. Fish Shellfish Immunol. 13: 141-58, 2002.
AMEN, R. I.; ATEN, J. A.; BAGGEN, J. M. C.; MEULEMAN, E. A.; DE LANGE-
DEKLERK, E. S. M. & SMINIA T. Trichobilharzia ocellata in Lymnaea stagnalis: A flow
cytometric approach to study its effects on hemocytes. J. Invertebr. Pathol., 59: 95-98, 1992.
AMEN, R. I.; TIJNAGEL, J. N.; VAN DER KNAAP, W. P.; MEULEMAN, E. A., de
LANGE-DE KLERK, E. S. & SIMINIA, T. Effects of Trichobilharzia on hemocytes of
Lymnaea stagnalis. Dev. Comp. Immunol., 15: 105-115, 1991.
ARUMUGAM, M., ROMESTAND, B., TORREILLES, J. & ROCH, P. In vitro production
of superoxide and nitric oxide (as nitrite and nitrate) by Mytillus galloprovincialis haemocytes
upon incubation with PMA or laminarin or during yeast phagocytosis. Eur.J. Cell Biol., 79:
513-519, 2000.
BABIOR, B. M. NADPH oxidase: an updade. Blood. 93: 1464-1476, 1999.
148
BAKER F. C. General Morphology. In: The Molluscan Family Planorbidae. University of
Illinois Press, 1945.
BARRACO, M. A.; STEIL, A. A. & GARGIONI, R. Morphological characterization of the
hemocytes of the pulmonate snail Biomphalaria tenagophila. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 88:
73-83, 1993.
BASCH , P. F. Intermediate host specificity in Schistosoma mansoni. Exp. Parasitol., 39:
150-169, 1976.
BAYNE, C. J. Molluscan immunobiology. In: , SALEUDDIN, A. S. M. & WILBUR, K. M.,
(Ed.). The Mollusca. New York: Academic Press, 1983. Vol. 5, Physiology, Part 2. p. 407.
BAYNE, C. J. Phagocytosis and non-self recognition in invertebrates. BioScience, 40: 723-
731, 1990.
BAYNE, C. J.; BUCKLEY, P. M. & DEWAN, P. C. Macrophagelike hemocytes of resistant
Biomphalaria glabrata are cytotocix for sporocysts of Schistosoma mansoni in vitro. J.
Parasitol., 66: 413-419, 1980a.
BAYNE, C. J.; BUCKLEY, P. M. & DEWAN, P. C. Schistosoma mansoni: Cytotoxicity of
hemocytes from suscetible snail hosts for sporocysts in plasma from resistant Biomphalaria
glabrata. Exp. Parasitol., 50: 409-416, 1980b.
BAYNE, C. J.; HAHN, U. & BRENDER, R. C. Mechanisms of molluscan host resistant and
of parasite strategies for survival. Parasitol. 123: 159-167, 2001.
BAYNE, C. J.; LOKER, E. S.; YUI M. A. & STEPHENS J. A. Immune-recognition of
Schistosoma mansoni primary sporocysts may require specific receptors on Biomphalaria
glabrata hemocytes. Parasitol. Immunol., 6: 519-528, 1984.
BAYNE, C. J. & YOSHINO, T. P. Determinants of compatibility in mollusk-trematode
parasitism. American Zoologist., 29: 399-407, 1989.
BECK, G. & HABICHT, G. S. Isolation and characterization of a primitive IL-1-like protein
from invertebrate, Asterisa forbesi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 7429-7433, 1986.
BECK, G., O’BRIEN, R. F. & HABICHT, G. S. Invertebrate cytokines: the phylogenetic
emergence of interleukin 1. BioEssays 11: 62-67, 1989.
BECK, G., O’BRIEN, R. F., HABICHT, G. S., STILLMAN, D. L., COOPER, E. L. &
RAFTOS, D. A. Invertebrate cytokines III: Invertebrate interleukin-1-like molecules stimulate
phagocytosis by tunicate and echinoderm cells. Cell. Immunol., 146: 284-299, 1993.
BEZERRA, F. S. M.; NOGUEIRA-MACHADO, J. A.; CHAVES, M. M.; MARTINS, R. L.
& COELHO, P. M. Z. Quantification of the number and phagocytary activity of hemocytes of
resistant and susceptible strains of Biomphalaria glabrata and Biomphalaria tenagophila
infected with Schistosoma mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 39: 197-201, 1997.
149
BOEHMLER, A. M.; FRYER, S. E. & BAYNE C. J. Killing of Schistosoma mansoni
sporocysts by Biomphalaria glabrata hemolymph in vitro: alteration of hemocyte behavior
after poly-L-lysine treatment of plastic and the kinetics of killing by different host strains. J.
Parasitol., 82: 332-335, 1996.
BOYER, O. O. M. O. Characterization of immunoreactive TNFα molecules in the gastropod
Biomphalaria glabrata. Develop. Comp. Immunol., 18: 211-218, 1994.
BROOKS , C. P. A comparative study of Schistosoma mansoni in Tropicorbis glabratus. J.
Parasitol., 39: 159-163, 1953.
BROUSSEAU P, PELLERIN J, MORIN Y, CYR D, BLAKLEY B, BOERMANS H,
FOURNIER M. Flow cytometry as a tool to monitor the disturbance of phagocytosis in the
clam Mya arenaria hemocytes following in vitro exposure to heavy metals. Toxicology.,
142:145-56, 2000.
BRUMPT, E. Confirmation des observations de A. Lutz sur les lesions tentaculaires de
Planorbis glabratus (P. guadelon pensis) détermines para l´evolution des miracidies de S.
mansoni. Compt. Rend. Soc. Biol., 133: 625-628, 1940.
BURKE, R. D. & WATKINS, R. F. Stimulation of starfish coelomocytes by interleukin-1.
Bioch. Bioph. Res. Commun., 180: 579-584, 1991.
CARDENAS W, JENKINS JA, DANKERT JR. A flow cytometric approach to the study of
crustacean cellular immunity. Invertebr Pathol., 76:112-119, 2000.
CARDENAS W, DANKERT JR, JENKINS JA. Flow cytometric analysis of crayfish
haemocytes activated by lipopolysaccharides. Fish Shellfish Immunol. 17:223-233, 2004.
CARVALHO, O. S.; NUNES, I. M. & CALDEIRA, R. L. First report of Biomphalaria
tenagophila in the State of Rio Grande do Sul, Brasil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 93: 39-40,
1998.
CASTILLO, M. G. & YOSHINO, T. P. Carbohydrate inhibition of Biomphalaria glabrata
embryonic (Bge) cell adhesion to primary sporocysts of Schistosoma mansoni. Parasitol.,
125: 513-525, 2002.
CHAIA, G. Técnica para concentração de miracídios. Rev. Bras. Malariol. Doenças Trop., 8:
355-357, 1956.
CHERNIN, E. Behavioral reponses of miracidia of Schistosoma mansoni and other
trematodes to substances emitted by snails. J. Parasitol., 56: 287-296. 1970.
CHERNIN, E. Some host-finding attributes of Schistosoma mansoni miracidia. Am. J. Trop.
Med. Hyg., 23: 320-327, 1974.
150
CHIEFFI, P. P. Susceptibilidade à infecção por Schistosoma mansoni de cepas de
Biomphalaria tenagophila originárias os Estados de São Paulo e Paraná. Rev. Inst. Med.
Trop. São Paulo, 17: 92-96, 1975.
COELHO, M. V. & BARBOSA, F. S. Qualidades de vetor dos hospedeiros de Schistosoma
mansoni no Nordeste do Brasil. 3 - Duração da infestação e eliminação de cercárias em
Tropicorbis centimetralis. Publicações Avulsas do Instituto Aggeu Magalhães, 5: 21-30,
1956.
COELHO, M. V. Aspectos do desenvolvimento de formas larvais de Schistosoma mansoni
em Australorbis migrican. Rev. Bras. Biol., 17: 325-337, 1957.
COELHO, M. V. Suscetibilidade de Australorbis tenagophilus à infecção por Schistosoma
mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo., 4: 289-295 1962.
COELHO, P. M. Z. Resistência e suscetibilidade à infecção por Schistosoma mansoni em
caramujos do gênero Biomphalaria. In: BARBOSA, F. S. Tópicos em Malacologia Médica,
Rio de Janeiro: Ed. Fiocruz, 1995. 208-217.
COELHO, P. M.; CARVALHO, O. S.; ANDRADE, Z. A.; MARTINS-SOUSA, R. L.;
ROSA, F. M.; BARBOSA, L.; PEREIRA, C. A.; CALDEIRA, R. L.; JANNOTTI-PASSOS,
L. K.; GODARD, A. L.; MOREIRA, L. A.; OLIVEIRA, G. C.; FRANCO, G. R.; TELES,
H..M. & NEGRAO-CORREA, D. Biomphalaria tenagophila/Schistosoma mansoni
interaction: premises for a new approach to biological control of schistosomiasis. Mem Inst
Oswaldo Cruz., 99:109-11, 2004.
CONNORS, V. A.; DE BURON, I. & GRANATH, W. O. Jr. Schistosoma mansoni:
interleukin-1 increases phagocytosis and superoxide production by hemocytes and decreases
output of cercariae in schistosome-susceptible Biomphalaria glabrata. Exp Parasitol 80: 139-
148, 1995.
CONNORS, V. A.; DE BURON, I.; JOURDANE, J.; THERON, A.; AGNER, A. &
GRANATH, W. O. Jr. Recombinant human interleukin-1-mediated killing of Schistosoma
mansoni primary sporocysts in Biomphalaria glabrata.J Parasitol. 84: 920-926, 1998.
CONTE, A. & OTTAVIANI, E. Nitric oxide syntetase activity in molluscan hemocytes.
FEBS Letres., 365: 120-124, 1995.
CORRÊA, M. C. R.; COELHO, P. M. Z. & FREITAS, J. R. Susceptibilidae de linhagens de
Biomphalaria tenagophila e Biomphalaria glabrata a duas cepas de Schistosoma mansoni –
(LE – Belo Horizonte – MG e SJ – São José dos Campos – SP). Rev. Inst. Med. Trop. São
Paulo, 21: 72-76, 1979.
DAVIDS, B. J. & YOSHINO T. P. Integrin-like RGD-dependent binding mechanism
involved in the spreading response of circulating molluscan phagocytes. Dev Comp Immunol.
22:39-53, 1998.
151
DIKKEBOOM, R., BAYNE, C. J., VAN DER KNAAP, W. P. W. & TIJNAGEL, J. M.
Possible role of reative forms of oxygen in in vitro killing of Schistosoma mansoni sporocysts
by hemocytes of Lymnaea stagnalis. Parasitol. Res,. 75: 148-154, 1988a.
DIKKEBOOM, R., VAN DER KNAAP, W. P. W., VAN DEN BOVENKAMP, W.,
TIJNAGEL, J. M. G. H. & BAYNE, C. J. The production of toxic oxygen metabolites by
hemocytes of different snail species. Dev. Comp. Immunol., 12: 509-520, 1988b.
DIKKEBOOM, R.; TIJNAGEL, J. M. G. H. & van der KNAAP, W. P. W. Monoclonal
antibody recognized hemocytes subpopulations in juvenile and adult Lymmnaea stagnalis:
functional characteristics and binding. Dev. Comp. Immunol., 12: 17-32, 1988c.
DOUGLAS, J. S.; HUNT, M. D.& SULLIVAN J. T. Effects of Schistosoma mansoni
infection on phagocytosis and killing of Proteus vulgaris in Biomphalaria glabrata
hemocytes. J. Parasitol., 79: 280-283, 1993.
ESPÍNDOLA, K. S.; MACHADO, M. M. & HOFMANN, P. R. Natural and experimental
infection of planorbids from the Island of Santa Catarina (Brazil). Rev. Inst. Med. Trop. São
Paulo., 34: 289-294, 1992.
FAUST, E. C. & HOFFMANN, W. A. Studies on schistosomiasis mansoni in Puerto Rico. I –
The extramamalian phases on lyfe-cycle. Puerto Rico J. Pub. Health Trop. Med., 10: 1-47,
1934.
FILES, V. S. & CRAM, E. B. A study on the comparative susceptibility of snails vectors to
strains of Schistosoma mansoni. J. Parasitol., 35: 555-560, 1949.
FRANCESCHI, C.; COSSARIZZA, A.; MONTI, D. & OTTAVIANI, E. Cytotoxicity and
immunocyte markers in cells from the freshwater snail Planorbarius corneus (L.) (Gastropoda
pulmonata): implications for the evolution of natural killer cells. Eur J Immunol. 489-493,
1991.
FRYER, S. E. & BAYNE, C. J. Phagocytosis of latex beads by Biomphalaria glabrata
hemocytes is modulated in a strain-specific manner by absorbed plasma components.
Develop. Comp. Immunol., 20: 23-337, 1996.
FRYER, S. E., HULL, C. J. & BAYNE, C. J. Phagocytosis of yeast by Biomphalaria
glabrata: carbohydrate specificity of receptors and a plasma opsonin. Dev. Comp. Immunol.,
13: 9-16, 1989.
GOEDKEN M. & De GUISE S. Flow cytometric as tool to quantify oyster defense
mechanisms. Fish Shellfish Immunol. 16:539-552, 2004.
GOES, A. M.; ROCHA, R. S.; GAZZINELLI, G. & DOUGHTY, B. L. Production and
characterization of human monoclonal antibodies against Schistosoma mansoni. Parasit.
Immunol. 11: 695-711, 1989.
152
GRAEFF-TEIXEIRA, C.; dos ANJOS, C.B.; de OLIVEIRA, V. C.; VELLOSO, C. F.; da
FONSECA, M. B.; VALAR, C.; MORAES, C.; GARRIDO, C. T. & do AMARAL, R.S.
Identification of a transmission focus of Schistosoma mansoni in the southernmost Brazilian
State, Rio Grande do Sul. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 94: 9-10, 1999.
GRANATH, W. O. JR. & YOSHINO T. P. Characterization of molluscan phagocyte
subpopulations based on lysosomal enzyme markers. J. Exp. Zoology, 205-226, 1983.
GRANATH, W. O. JR. & YOSHINO, T. P. Schistosoma mansoni: passive transfer of
resistence by serum in the vector snail, Biomphalaria glabrata. Exp. Parasitol., 58: 188-193,
1984.
GRANATH, W. O. JR.; CONNORS, V. A., & TARLETON, R. L. Interleukin-1 activity in
hemolymph from strains of the snail Biomphalaria glabrata varying in susceptibility to the
human blood fluke, Schistosoma mansoni: Presence, differential expression, and biological
function. Cytokine, 6: 21-27, 1994.
GUARALDO, A. M. A.; MAGALHÃES, L. A.; RANGEL, H. A. & PAREJA, G. Evolução
dos Esporocistos de Schistosoma mansoni (Sambon, 1907) em Biomphalaria glabrata (Say,
1818) e Biomphalaria tenagophila (D’Orbigny, 1835). Rev. Saúde Pública, 15: 436-448,
1981.
HAHN, U. K., BENDER, R. C. & BAYNE, C. J. Production of reative oxygen species by
hemocytes of Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specific stimulation. Dev. Comp.
Immunol., 24: 531-541, 2000.
HAHN, U. K.; BENDER R. C. & BAYNE C. J. Involvement of nitric oxide in killing of
Schistosoma mansoni sporocysts by hemocytes from resistant Biomphalaria glabrata. J
Parasitol. 87: 778-785, 2001.
HAMPTON, M. B.; KETTLE, A. J. & WINTERBOURN, C. C. Inside the neutrophil:
oxidants myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood 92: 3007-3017, 1998.
HARRIS, K. R. The Fine Structure of encapsulation in Biomphalaria glabrata. Ann. N. Y.
Acad. Sci., 266-446, 1975.
HUGHES, T. K. JR., SMITH, E. M., CHIN, R., CADET, P., SINISTERRA, J., LEUNG, M.
K., SHIPP, M. A., SCHARRER, B. & STEFANO, G. B. Interation of immunoactive
monokines (interleukin 1 and tumor necrosis factor)in the bivalve mollusk, Mytilus edulis.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 4426-4429, 1990.
HUGHES, T. K.; SMITH, E. M.; BARNETT, J. A.; CHARLES, R., & STEFANO, G. B. LPS
stimulated invertebrate hemocytes: A role for immunoreactive TNF and IL-1. Develop.
Comp. Immunol., 15: 117-122, 1991.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Estimativa de população
1997, (mimeo)/IBGE, Rio de Janeiro, 1997.
153
JAROSZESKI, M. J. & RADCLIFF G. Fundamentals of Flow Citometry. Molecular
Biotechnology. 11: 38-53, 1999.
JOHNSTON, L. A. & YOSHINO, T. P. Analysis of lectin and snail plasma binding
glycopeptides associated with the tegumental surface of the primary sporocysts of
Schistosoma mansoni. Parasitol: 469-479, 1996.
JOHNSTON, L. A. & YOSHINO, T. P. Larval Schistosoma mansoni excretory-secretory
glycoproteins (ESPs) bind to hemocytes of Biomphalaria glabrata (Gastropoda) via surface
carbohydrate binding receptors. J Parasitol., 87: 4 786-793, 2001.
JOKY, A.; MATRICON-GONDRAN, M. & BENEX, J. Fine strutural differences in the
Amoebocytes of Biomphalaria glabrata. Dev. Comp. Immunol., 7: 669-672, 1983.
JOURDANE, J.; THERON, A. & COMBES, C. Demonstration of several sporocysts
generations as a normal pattern of reproduction of Schistosoma mansoni. Acta Tropica., 37:
177-182, 1980.
KAGAN, I. G. & GEIGER, S. J. The susceptibity of three strains of Autralorbis glabratus to
Schistosoma mansoni from Brazil and Puerto Rico. J. Parasitol., 51: 622-627, 1965
KLOETZEL, K. Observações sobre o tropismo do miracídio do Schistosoma mansoni pelo
molusco Australorbis glabratus. Rev. Soc. Bras. Biol., 18: 223-232, 1958.
KUHN K, H. Mitotic activity of the hemocytes in the tick Ixodes ricinus (Acari; Ixodidae).
Parasitol Res. 82:511-517, 1996.
LIE, K. J.; HEYNEMAN, D. & JEONG¨, K. H. Studies on resistance in snails. 4. induction of
ventricular capsules and changes in amebocyte-producing organ during sensitization of
Biomphalaria glabrata snails. J. Parasitol. 62: 286-291, 1976.
LIE, K. J., JEONG, K. H. & HEYNEMAN, D. Molluscan host reactions to helminthic
infection. In: SOULSBY, E. J. L. Protozoa, Arthropods and Invertebrates. Boca Raton,
Florida, USA: CRC-Prees INC, 1987. 211-270.
Lo VERDE, P. T., GHERSON, J. and RICHARDS, C. S. Amebocytic accumulations in
Biomphalaria glabrata: fine structure. Dev. Comp. Immunol., 31: 999, 1982.
LODES, M. J. & YOSHINO, T. P. The effect of Schistosome excretory-secretory products on
Biomphalaria glabrata hemocytes motility. J. Invertebr. Pathol., 75-85, 1990.
LOKER, E. S. On being a parasite in invertebrate host: a short survival course. J. Parasitol.,
80: 728-747, 1994.
LOKER, E. S., BAYNE. C. J. & YUI. M. A. Echinostoma paraensei:Hemocytes of
Biomphalaria glabrata as targets of echinostome mediated inference with host snail
resistance to Schistosoma mansoni. Exp. Parasitol., 62: 149-154, 1986.
154
LOKER, E. S., YUI. M. A. & BAYNE. C. J. Schistosoma mansoni: Aglutination of
sporocysts, and formation of gels on miracidia transforming in plasma of Biomphalaria
glabrata. Exp. Parasitol., 58: 56-62, 1984.
LUTZ, A. O Schistosomum mansoni e a Schistosomatose segundo observações, feitas no
Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 11: 121-155, 1919.
LUTZ, A. Observações sobre a evolução do S. mansoni. Rev. Soc. Bras. Ciênc., 1: 41-48,
1917.
MAKINO, R.; TANAKA, T.; IIZUKA, T.; ISHIMURA, Y. & KANEGASAKI, S.
Stoichiometric conversion of oxygen to superoxide anion during the respiratory burst in
neutrophils. Direct evidence by a new method for measurement of superoxide anion with
diacetyldeuteroheme-substituted horseradish peroxidase. J Biol Chem. 261: 1444-1447, 1986.
MALDONADO, J. F. & ACOSTA-MATIENZO, J. Evolution del Schistosoma mansoni
dentro de su hosped intermediario, el caracol Australorbis glabratus. Puerto Rico J. Pub.
Health Trop. Med., 22: 374-404, 1947.
MARTINS-SOUZA, R. L. Fatores associados à resistência de Biomphalaria tenagophila na
infecção por Schistosoma mansoni. 1999. 83 f. Dissertação (Mestrado em Parasitologia)
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.
MARTINS-SOUZA, R. L.; PEREIRA, C. A.; COELHO, P. M. Z. & NEGRÃO-CORRÊA D.
Silica treatment increases the susceptibility of the Cabo Frio strain of Biomphalaria
tenagophila to Schistosoma mansoni infection but does not alter the natural resistance of the
Taim strain. Parasitol Res 91: 500-507, 2003.
MARTINS-SOUZA, R. L.; NEGRÃO-CORRÊA, D.; BEZERRA, F. S. M. & COELHO, P.
M. Z. Anesthesia of Biomphalaria spp. (Mollusca, Gastropoda): Sodium Pentobarbital is the
drug of choice. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 96: 391-392, 2001.
MATRICON-GONDRAN, M. & LETORCART M. Internal defenses of the snail
Biomphalaria Glabrata – I. Caracterization of hemocytes and fixed phagocytes. J. Invertebr.
Pathol., 74: 224-234, 1999.
McKERROW, J. H.; JEONG, K. H. & BECKSTEAD J. H. Enzyme histochemical
comparison of Biomphalaria glabrata amebocytes with human granuloma macrophages. J.
Leukoc Biol., 37: 341-347, 1985.
MELO, A. L. & COELHO, P. M. Z. Schistosoma mansoni e a Doença. In: NEVES, D. P.;
MELO, A. Ll.; GENARO, O. & LINARDI, P. M. Parasitologia Humana.10ª ed. São Paulo,
Atheneu, 174-193, 2002.
MELO, A. L.& PEREIRA, L. H. On the finding of Biomphalaria tenagophila naturally
infected with Schistosoma mansoni in the state of Minas Gerais, Brazil. Rev. Inst. Med. Trop.
São Paulo, 27: 99-101, 1985.
155
MELO, A. L.; PEREIRA, L. H. & CORREA, M. C. R. Sobre o encontro de Biomphalaria
tenagophila naturalmente infectada com Schistosoma mansoni no Município de Jaboticatubas,
MG. In: Congresso da Sociedade Brasileira de Parasitologia, 7, 1982, Porto Alegre. Anais:
180.
MILWARD DE ANDRADE, R. Primeiro encontro de Biomphalaria tenagophila (d’Orbigny,
1835) no lago da Pampulha, Belo Horizonte, MG. Cienc. Cult., 24: 375, 1972.
MITTA, G.; VANDENBULCKE, F.; HUBERT, F.; SALZET, M. & ROCH, P. Involvement
of mytilins in mussel antimicrobial defense. J Biol Chem. 275: 12954-12962, 2000.
MOORE, D. V. & SANDGROUND, J. H. The relative egg producing capacity of
Schistosoma mansoni, and Schistosoma japonicum. Am. J. Med. Hyg., 5: 831-840. 1956.
NEWTON, W. L. The conpartive tissue reaction of two strains of Autralorbis glabratus to
infection with Schistosoma mansoni. J. Parasitol., 38: 362-366, 1952.
NEWTON, W. L. The inheritance of susceptibility to infection with Schistosoma mansoni in
Autralorbis glabratus. Exp. Parasitol., 2: 242-57, 1953.
NODA, S. & LOKER, E. S. Phagocytic activity of hemocytes of M-line Biomphalaria
glabrata snails: effect of exposure to the trematode Echinostoma paraensei. J. Parasitol., 75:
261-269, 1989.
NÚÑEZ, P. E., MOLENAAR, M. J., LAGEWEG, W., LI, K. W. & JONG-BRINK, M.
Excretory-secretory products of Trichobilharzia ocellata and their modulating effects on the
internal defense system of Lymnaea stagnalis. Parasitol, 114: 135-144, 1997.
OLIVER, L. & MAO, C. P. The early larval stages of Schistosoma mansoni Sambon, 1907 in
the snail host, Australorbis glabratus (Say, 1818). J. Parasitol., 35: 267-275, 1949.
OTTAVIANI, E. Immunorecognition in the gastropod molluscs with particular reference to
the freshwater snail Planorbius corneus (L.) (Gastropoda, Pulmonata). Boll. Zool., 59: 129-
139, 1992.
OTTAVIANI, E., FRANCHINI, A., CASSANELLI, S. & GENEDANI, S. Cytokines and
invertebrate immune responses. Biol Cell, 85: 87-91, 1995.
OTTAVIANI, E.; FRANCHINI, A. & FRANCESCHI, C. Presence of several cytokine-like
molecules in molluscan hemocytes. Biochem. Biophys. Res. Comm., 195: 984-988, 1993.
PAN, C. Studies on the host-parasite relationship between Schistosoma mansoni and the snail
Australorbis galbratus. Am. J. Trop. Med. Hyg., 14: 931-976, 1965.
PARAENSE, W. L. & CORRÊA, L. R. Differential susceptibility of Biomphalaria
tenagophila populations to infection with a strain of Schistosoma mansoni. J. Parasitol., 64:
822-826, 1978.
156
PARAENSE, W. L. & CORRÊA, L. R. Probable extension of schistosomiasis to
southernmost Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 82: 577, 1987.
PARAENSE, W. L. & CORRÊA, L. R. Variation in susceptibility of populations of
Australorbis glabratus to a strain of Schistosoma mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo,
5: 15-22, 1963.
PARAENSE, W. L. Estado atual da sistemática dos planorbídeos brasileiros. Arq. Museu
Nacional, 55: 105-128, 1975.
PARAENSE, W. L. Distribuição dos caramujos no Brasil. In: Modernos conhecimentos
sobre a esquistossomose mansônica. Biblioteca da Academia Mineira de Medicina, 1986,
117-128.
PARAENSE, W. L. Planorbídeos hospedeiros intermediários de Schistosoma mansoni. In:
AS CUNHA, Esquistossomose mansoni. São Paulo: Sarvier & USP, 1970, 13-20.
PARAENSE, W. L. The Schistosome Vectors in the Americas. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 96:
7-16, 2001.
PARKS, D. R., BRYAN, V. M., OI, V. M., OI, V. T. & HERZENBERG, L. A. Antigen
specific identification and cloning of hybridomas with a Fluorescence Activated Cell Sorter
(FACS). PNAS, 76: 1962, 1979.
PELLEGRINO, J. & KATZ, N. Experimental chemotherapy of schistosomiasis mansoni.
Adv. Parasitol., 6: 233-290, 1968.
PEREIRA, L. H.; VALADARES, T. E.; da CUNHA, M. L. & CORREA, M. C. Recovery of
young daughter sporocysts from snails infected with Schistosoma mansoni. Trans. R. Soc.
Trop. Med. Hyg., 78: 563, 1984.
RAFTOS D. A, STILLMAN DL, COOPER EL. In vitro culture of tissue from the tunicate
Styela clava. In Vitro Cell Dev Biol., 26:962-970, 1990.
RAFTOS, D. A., COOPER, E. L., HABICHT, G. S. & BECK, G. Invertebrate cytokines
:Tunicate cell proliferation stimulated by an interleukin-1-like molecule. Proced. Nat. Acad.
Sci. USA, 88: 9518-9522, 1991.
RAFTOS, D. A., COOPER, E. L., STILLMAN, D. L., HABICHT, G. S. & BECK, G.
Invertebrate cytokines II: Release of interleukin-1-like molecules from tunicate hemocytes
stimulated with zymosan. Lymphok. Cytok. Res., 11: 235-240, 1992.
RAFTOS D. A, HUTCHINSON A. Cytotoxicity reactions in the solitary tunicate Styela
plicata. Dev Comp Immunol. 19: 463-471, 1995.
RENWRANTZ, L. R. Lectins in molluscs and arthropods: their occurrence, origin and roles
in immunity, in: LACKIE, A. Immune Mechanisms in Invertebrate Vectors, Ed., London:
Symposium of the Zoological Society of London, Clarendon Press, Oxford, 1986. 81.
157
RICHARDS, C. S. & RENWRANTZ, L. R. Two lectins on the surface of Helix pomoatia
haemocytes: a Ca
2+
dependent, GalNac-specific lectin and a Ca
2+
independent, mannose 6-
phosphate-specific lectin which recognizes activated homologous opsonins. J. Comp.
Physiol., 161: 43, 1991.
RICHARDS, C. S. & SHADE, P. C. The genetic variation of compatibility in Biomphalaria
glabrata and Schistosoma mansoni. Parasitol., 73: 1146-1151, 1987.
RICHARDS, C. S. Bulbous head growths of Biomphalaria glabrata: genetic studies. J.
Invertebr. Pathol., 22: 278-282, 1973.
RICHARDS, C. S. Genetics of the host-parasite relationship between Biomphalaria glabrata
and Schistosoma mansoni. Genetics aspects of host-parasite relationships. Symposia of British
Society for Parasitol, 14: 45-54, 1976 a.
RICHARDS, C. S. Schistosoma mansoni: Susceptibility reversal with age in the snails host
Biomphalaria glabrata. Exp. Parasitol., 42: 165-168, 1977.
RICHARDS, C. S. Variation in infectivity for Biomphalaria glabrata in strains of
Schistosoma mansoni from the same geographic area. Bull. WHO, 54: 706-707, 1976b.
ROSA, F. M., GODARD, A. L., AZEVEDO, V. & COELHO, P. M. Biomphalaria
tenagophila: dominant character of the resistance to Schistosoma mansoni in descendants of
crossbreedings between resistant (Taim, RS) and susceptible (Joinville, SC) strains.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 100:19-23, 2005.
ROWLEY, A. F. The evolution of inflammatory mediators. Mediators of Inflammation, 5: 3-
13, 1996.
SANTOS, M. B. L.; FREITAS. J. R.; CORREIA, M. C. R. & COELHO, P. M. Z.
Suscetibilidade ao Schistosoma mansoni de híbridos de Biomphalaria tenagophila do Taim,
RGS, Cabo Frio, RJ, e Belo Horizonte. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 21: 281-286, 1979.
SAPP, K. K. & LOKER, E. S. A compartive study of mechanisms underlying digenean-snail
specificity: In vitro interactions between hemocytes and digenean larvae. J. Parasitol., 86:
1020-1029, 2000a.
SAPP, K. K. & LOKER, E. S. Mechanisms underlying digenean-snail specificity: role of
miracidial attachment and host plasma factors. J Parasitol 86:1012-1019, 2000b.
SCHARRER, B.; PAEMEN, L.; SMITH, E. M.; HUGHES, T. K.; LUI, Y.; POPE, M. &
STEFANO, G. B. The presence and effects of mammalian signal molecules in immunocytes
of the insect Leucophaea maderae. Cell Tissue Res. 283: 93-97, 1996.
SCHLENK, D.; MARTINEZ, P. G. & LIVINGSTONE, D. R. Studies on myeloperoxidase
activity in the common mssel, Mytilus edilis L. Comp. Biochem. Physiol. 99C: 63-68, 1991.
158
SHOZAWA, A., SUTO, C. & KUNADA, N. Superoxide producdion by the hemocytes of the
freshwater snail, Biomphalaria glabrata, stimulation by miracidia of Schistosoma mansoni.
Zoolog. Science, 6: 1019-1022, 1989.
SILVA, R. E. da; MELO, A. L. de & PEREIRA L. H. Suscetibilidade de Biomphalaria
tenagophila e Biomphalaria glabrata de uma mesma região a duas cepas de Schistosoma
mansoni. Rev. Inst. Trop. São Paulo, 36: 409-415, 1994.
SMINIA, T. Struture and function of blood cells of gastropods, In: Invertebrate Blood Cell.
Eds. New York : Acad. Press, 1981. 191.
SOUZA, C. P. & LIMA, L. C. Moluscos de interesse parasitológico do Brasil. 1
ª
ed. Belo
Horizonte: Centro de Pesquisa “René Rachou”/Fiocruz, 1990. 76.
SOUZA, C. P., BORGES, C. C.; SANTANA, A. G. & ANDRADE, Z. A. Comparative
histology of Biomphalaria glabrata, B. tenagophila and B. straminea with variable degrees of
resistance to Schistosoma mansoni miracidia. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 92: 517-522, 1997.
SOUZA, C. P., CUNHA, R. C. P. & ANDRADE, Z. A. Development of Schistosoma
mansoni in Biomphalaria tenagophila, Biomphalaria straminea and Biomphalaria glabrata.
Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 87: 201-206, 1995.
SOUZA, C. P.; ARAUJO, N.; CARVALHO, O. S. & FREITAS, J. R. Potencial of
Biomphalaria tenagophila from Pampulha lake, Belo Horizonte, MG as lot of Schistosoma
mansoni. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 82: 67-70, 1987.
SOUZA, C. P.; CALDEIRA, R. L; DRUMMOND, S. C.; MELO, A. L.; GUIMARÃES, C.
T.; SOARES, D. & CARVALHO, O. Geographical distribution of Biomphalaria snails in the
State of Minas Gerais, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 96: 293-302, 2001.
STANDEN, O. D. The effect of temperature, light, and salinity upon the hatching of the ova
of S. mansoni. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 45: 225-241, 1951.
SULLIVAN, J. T.; PIKIOS, S. S. & ALONZO, A. Q. Mitotic responses to extracts of
miracidia and cercariae of Schistosoma mansoni in the amebocyte-producing organ of the
snail intermediate host Biomphalaria glabrata. J Parasitol. 90: 92-96, 2004.
SULLIVAN, J. T. & SPENCE, J.V. Transfer of resistance to Schistosoma mansoni in
Biomphalaria glabrata by allografts of amoebocyte-producing organ. J Parasitol. 80: 449-
453, 1994.
SULLIVAN, J. T.; SPENCE, J. V. & NUNEZ, J. K. Killing of Schistosoma mansoni
sporocysts in Biomphalaria glabrata implanted with amoebocyte-producing organ allografts
from resistant snails. J Parasitol. 81: 829-833, 1995.
159
SULLIVAN, J. T. & SPENCE, J. V. Factors affecting adoptive transfer of resistance to
Schistosoma mansoni in the snail intermediate host, Biomphalaria glabrata. J Parasitol.
85:1065-1071, 1999.
TIROUVANZIAM R, DAVIDSON CJ, LIPSICK JS, HERZENBERG LA. Fluorescence-
activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional
similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101: 2912-2917, 2004.
TORREILLES, J. & GUERIN, M. C. Production of peroxynitrite by zymozan stimulation of
Mytilus galloprovincialis haemocytes in vitro. Fish Shellfish Immunol. 85:1065-1071, 1999.
TORREILLES, J.; GUERIN, M. C. & ROCH, P. Peroxidase-release associated with
phagocytosis in Mytilus galloprovincialis haemocytes. Dev Comp Immunol 21: 267-275,
1997.
UCHIKAWA, R. & LOKER, E. S. Lectin-binding properties of surfaces of in vitro-
transformed Schistosoma mansoni and Echinostoma paraensei sporocysts. J. Parasitol. 77,
742-748, 1991.
VAN DER KNAAP, W. P. W. & LOKER, E. S. Immune mechanisms in trematode-snail
interactions. Parasitol. Today, 6: 175-182, 1990.
VAN DER KNAAP, W. P.; BOERRIGTER BARENDSEN, L. H.; VAN DER HOEVEN, D.
S.& SMINIA, T. Immunocytochemical demonstration of a humoral defense factor in blood
cells (Amoebocytes) of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Cell Tissue Res., 219: 291-296,
1981.
WILLOTT E, TRENCZEK T, THROWER LW, KANOST MR. Immunochemical
identification of insect hemocyte populations: monoclonal antibodies distinguish four major
hemocyte types in Manduca sexta. Eur. J. Cell. Biol., 65:417-23, 1994.
YOSHINO, T. P. The ultratructure of circulating hemolymph cells of the marine snail
Cerithidea californica (Gastropoda: Prosobranchiata), J. Morphol., 150: 148, 1976.
YOSHINO, T. P. & VASTA, G. R. Parasite-invertebrate host immune interations. In:
Invertebr. Imm. Responses, Heidelberg: Springer-Verlag., 2, 1996.
ZELCK, U. & BECKER, W. Lectin binding to cells of Schistosoma mansoni sporocysts and
surrounding Biomphalaria glabrata Tissue. J. Invertebr. Pathol., 55: 93-99, 1990.
ZELCK, U. & BECKER, W. Biomphalaria glabrata: Influence of calcium, lectins and
plasma factors on in vitro phagocytic behavior of hemocytes of non infected or Schistosoma
mansoni infected snails. Exp. Parasitol., 75: 126-136, 1992.
160
Anexo 1: Parte mole de Biomphalaria, vista do lado esquerdo, com manto
parcialmente levantado. an: ânus, c: cabeça, cl: crista dorsolateral, cm: colar do manto, cp:
cavidade pulmonar, ct: crista retal, et: estômago, ga: glândula de albúmen, gd: glândula
digestiva, ia: intestino anterior, im: intestino médio, ip: intestino posterior, mc: músculo
columelar, mf: mufla, ms: massa cefalopodal, om: orifício genital masculino, ot: ovoteste, p:
pé, pn: pneumóstoma, os: pseudobrânquia, rt: reto, te: tentáculo, tr tubo renal, vp: veia
pulmonar, vr veia renal, Fonte: Paraense, 1975.
161
Anexo 2: Sistema genital de Biomphalaria glabrata. bo: bolsa do oviduto, bp: bainha
do pênis, bv: bolsa vaginal, cc: canal coletor do ovoteste, cd: segmento proximal do canal
deferente, cd’: segmento distal do canal deferente, ces: canal da espermateca, cp: canal
prostático, e espermateca, ed: espermiduto, eg: encruzilhada genital, ga: glândula do albúmen,
gn: glâandula nidamental, mr: m´sculo retrator complexo peniano, o: oviduto, odd: segmento
distal do ovispermiduto, ot: ovoteste, p: próstata, pr: prepúcio, ut: útero, v: vagina, vs:
vesícula seminal. Fonte: Cunha, 1970.
162
Anexo 3: Sistema genital de Biomphalaria straminea. ev: enrugamento vaginal;
outras abreviaturas como no anexo 2. Fonte: Cunha, 1970
163
Anexo 4: Conchas de Biomphalaria glabrata (A), B. tenagophila (B) e B. straminea
(C). (x2). Fonte: Cunha, 1970
164
C
Anexo 5: Órgãos do manto de Biomphalaria, situados no teto da cavidade pulmonar.
Em A, aparece a crista renal pigmentada (cr) de B. glabrata adulta; em B, a linha pigmentada
(cr) no lugar da futura crista em B. glabrata jovem com 9mm de diâmetro; em C o tubo renal
liso de B. straminea adulta. O mesmo aspecto liso e escassamente pigmentado observa-se nas
outras espécies de Biomphalaria. cl: crista lateral no manto, cm: colar ou borda do manto, co:
coração, cr: crista renal ou linha pigmentada, ga: glândula do albúmen, m: meato do ureter,
pe: pericádio parcialmente retirado, pn: pneumóstoma, tr: tubo renal, u:ureter, vp:veia
pulmonar vr: veia renal. Fonte: Paraense, 1970
165
Anexo 6: Distribuição geográfica de caramujos Biomphalria glabrata, B. straminea e
B. tenagophila no continente sul americano. Fonte: Paraense, 2001
166
B. glabrata
B. straminea
B. tenagophila
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