( PDF ) Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C47Bl/6 infectados por Plasmodium berghei cepa NK65

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NORINNE LACERDA QUEIROZ

Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C57Bl/6

infectados por Plasmodium berghei cepa NK65

Programa de Pós-Graduação em Parasitologia

Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais

Belo Horizonte

Minas Gerais, Brasil

Maio/2007

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NORINNE LACERDA QUEIROZ

Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C57Bl/6

infectados por Plasmodium berghei cepa NK65

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Parasitologia do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Minas Gerais, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em

Parasitologia.

Área de concentração: Protozoologia

Orientadora: Profa. Érika Martins Braga  Departamento de Parasitologia

Co-orientadora: Profa. Juliana Carvalho Tavares  Departamento de Fisiologia

Programa de Pós-Graduação em Parasitologia

Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais

Belo Horizonte

Minas Gerais, Brasil

Maio/2007

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043

Q3a

Queiroz, Norinne Lacerda .

Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e

C57Bl/6 infectados por Plasmodium berghei cepa NK65 [manuscrito] /

Norinne Lacerda Queiroz.  2007.

93 f. : il. ; 29,5 cm.

Orientadora : Érika Martins Braga.

Dissertação (mestrado)  Universidade Federal de Minas Gerais,

Instituto de Ciências Biológicas.

1. Malária Cerebral. 2. Plasmodium berghei  Teses. 3. Modelos animais em

pesquisa  Teses. 4. Inflamação  Teses. 5. Quimiocinas  Teses. 6.

Microscopia/Técnica  Teses. I. Braga, Érika Martins. II. Universidade Federal

de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III. Título.

iii

Enfim, cada um o que quer aprova, o senhor sabe: pão ou pães, é

questão de opiniães...

(Guimarães Rosa)

Dedico este trabalho ao meu querido avô Zacarias, que

desconhecendo, tem sido tão importante na minha

vida e minhas escolhas. Mesmo à distância você

esteve constantemente presente neste mestrado.

Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia, ICB/UFMG, pelos

conhecimentos transmitidos e pela a oportunidade de realização desta Dissertação

de Mestrado.

Agradecimentos

Agradeço imensamente aos meus pais, Antônio e Santa, alicerces da minha vida e

exemplos de dedicação. Obrigada pelo amor e apoio incondicional, a confiança e o

carinho.

Aos meus irmãos, que de formas tão diferentes me acompanham e contribuem na minha

vida.

Ao Glauber pelas lições...

Ao Vladmir por acreditar e me incentivar...

A Noelle pela presença constante, mesmo a distância, e por todo carinho e

cumplicidade.

A professora Érika Martins Braga pela orientação e pela oportunidade de trabalhar no

laboratório de Malária.

A minha orientadora e amiga Juliana Carvalho Tavares, presente em toda esta

caminhada. Sou eternamente grata a sua participação na minha vida acadêmica e

pessoal. Agradeço o apoio e confiança.

A professora Cláudia Martins Carneiro, pela colaboração neste trabalho. Agradeço a

disponibilidade, atenção e carinho.

Ao professor Antônio Lúcio Teixeira Jr, pela colaboração e disposição. Agradeço o

interesse pelo trabalho e por me incentivar.

A amiga Márcia de Carvalho Vilela, meu braço direito em muitas ocasiões, com direito

a ombro amigo...

A amiga Adriana Carvalho, que muito me ensinou durante o início da minha vida

acadêmica e sempre esteve disponível para contribuir no meu trabalho.

Aos colegas de mestrado: Ana Terezinha, Érika, Erlisson, Juliana, Lara, Leonardo,

Liliam, Natasha e Vladimir... Pelos momentos de aprendizado, tanto na sala de aula

quanto fora dela (nos churrascos e almoços...). Foi muito bom compartilhar esta

experiência com todos vocês.

Aos colegas do laboratório de Neuro-Imuno Fisiologia e Malária, em especial a técnica

Márcia Campos, pelo suporte nos trabalhos.

Ao professor Mauro Martins Teixeira por disponibilizar a infra-estrutura do laboratório

de Imunofarmacologia para parte de meus experimentos.

Aos alunos do laboratório de Imunofarmacologia, que muitas vezes me socorreram...

Ao Flávio Amaral que contribuiu no experimento de permeabilidade. Agradeço, em

vii

especial, ao David Herinque que acompanhou parte dos experimentos, estando a

disposição para ajudar e compartilhar.

As colegas de república, Cíntia e Kézia. Agradeço a experiência de dividir.

Aos amigos da minha Montes Claros: Dalila, Ângela, Thereza, Tiana, Virgínia, Hilla,

Renato, Alessandro e Tiago, pelos anos de amizade e cumplicidade. Foi muito bom

contar com todos mesmo à distância.

Aos amigos conquistados em Belo Horizonte, especialmente a Carol e a Leidi.

Aos meus familiares, especialmente meus avós (Antônia, Dja e Marcelino), minha

querida bisavó Regina e meus tios e tias (Clício, Marly, José Geraldo e Darcy).

Aos professores do Departamento de Parasitologia pela transmissão de conhecimentos.

Ao professor Ricardo Wagner de Almeida Vitor que atenciosamente cumpriu o papel de

relator desta dissertação.

Ao CNPq pelo auxílio financeiro.

Aos funcionários, especialmente a secretária Sumara, ao Seu Neri e a Rose, a quem eu

guardo tanto carinho.

Enfim, aqueles que, de alguma forma, passaram pela minha vida e deixaram alguma

contribuição.

Meu muito obrigada a todos!!!

viii

Resumo

A malária é a doença parasitária mais grave da humanidade, sendo um problema

de saúde pública em mais de 100 países. A malária cerebral (MC), causada pelo

Plasmodium falciparum, é uma das formas de manifestação mais grave da malária

humana e a principal causa de óbitos, apresentando mecanismos ainda desconhecidos. A

patogênese da malária está associada a uma resposta imune inapropriada ou excessiva

desenvolvida pelo hospedeiro para eliminar o parasito. Devido às dificuldades em

acompanhar casos humanos e da limitada possibilidade de examinar os processos

patológicos, modelos experimentais de MC foram desenvolvidos. Embora nenhum

modelo reproduza totalmente a condição humana, o modelo experimental utilizando

roedores é bem caracterizado e a grande diversidade de linhagens de camundongos,

associada à infecção com diferentes espécies de Plasmodium, tem contribuído para

elucidar aspectos envolvidos na patogênese da doença.

Assim, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar a resposta inflamatória cerebral

envolvida na patogênese da malária experimental induzida por Plasmodium berghei

cepa NK65 em camundongos jovens (seis semanas de idade) das linhagens BALB/c e

C57Bl/6.

Camundongos BALB/c e C57Bl/6 foram infectados com inóculo padronizado de

hemácias parasitadas por injeção intraperitoneal. A parasitemia foi monitorada

diariamente, a partir do terceiro dia pós-infecção (dpi), e apresentou uma evolução

gradual, com diferença significativa entre as duas linhagens ao longo da infecção

(p<0.01). Sinais clínicos e sobrevida dos animais foram avaliados durante doze dias,

com expressiva perda de massa corporal nos animais infectados em relação aos animais

controles, em ambas as linhagens. A mortalidade também apresentou um perfil diferente

entre as linhagens de camundongos, estando concentrada nos dias seis e sete pós-

infecção para C57Bl/6 e oitavo dia para BALB/c. Camundongos das duas linhagens

foram submetidos à análise histopatológica para determinação da progressão das

alterações morfológicas no cérebro. Animais C57Bl/6 apresentaram alterações teciduais

precoces, porém discretas, já no terceiro dia pós-infecção. As alterações cerebrais,

semelhantes às descritas na MC, tornaram-se mais evidentes ao longo do tempo e foram

mais intensas em camundongos da linhagem C57Bl/6 em relação à linhagem BALB/c, o

que justifica a morte precoce daquela linhagem. A interação leucócito-endotélio na

microcirculação cerebral foi avaliada através de microscopia intravital nos vasos da pia-

máter de animais infectados (5 dpi) e animais controle (não-infectados). Os animais

infectados apresentaram aumento do número de leucócitos em rolamento e aderidos na

parede do endotélio em relação aos animais controle. A contagem total e diferencial de

leucócitos (linfócitos, monócitos neutrófilos, eosinófilos e basófilos) presentes no

sangue periférico dos animais exibiu um padrão alterado da população celular geral e/ou

específica nos animais infectados em relação aos controles. A quantificação do

extravasamento do corante azul de Evans para o parênquima cerebral sugeriu

modificações na permeabilidade vascular da BHE, em decorrência da infecção.

Utilizando o método de ELISA, verificamos que houve um aumento significativo das

concentrações da citocinas TNF-α e IFN-γ, e das quimiocinas murinas MCP-1/CCL2,

RANTES/CCL5 e MIG/CXCL9 em homogenato de cérebro e no soro dos animais

infectados (5 dpi) quando comparado aos animais controle.

Este trabalho sugere que a infecção por P. berghei cepa NK65 em camundongos

BALB/c e C57Bl/6 foi capaz de induzir manifestações clínicas e alterações

morfológicas cerebrais, típicas da malária grave por P. falciparum, especialmente na

linhagem C57Bl/6, o que pode representar um bom modelo para o estudo da MC.

Abstract

Malaria is the most important parasitic disease of the humankind, representing a

public health problem in more 100 countries. Cerebral malaria (CM), caused by

Plasmodium falciparum, is one of more serious manifestations of human malaria and

the main cause of death by an as-yet unknown mechanism. The pathogenesis is

associated with an inappropriate or excessive immune response by the host in response

to the parasite. Due the difficulty to following human cases and the restriction to

examine the pathologies, experimental models of CM have been developed. However,

there is any model that repeats the human condition. The suitability of rodents

experimental models is well characterized and the huge diversity of mouse strains

associated with the infection by different species of Plasmodium have contributed to

elucidated some features involved in the pathogenesis of the disease.

The aim of the present study was to evaluate the cerebral inflammatory response

involved in the pathogenesis of experimental malaria induced by Plasmodium berghei

NK65 in young BALB/c and C57Bl/6 mice (six weeks).

BALB/c and C57Bl/6 mice were infected with standard inoculums of 10

parasitized erythrocytes by intraperitoneal injection. The parasitemia was monitored

daily, until the third day post-infection (dpi), and presented a gradual evolution, with

significant differences between strains (p<0.01). Clinical signals and survival of the

animals were evaluated over twelve days, and exhibited a significant loss of weight in

infected mice compated to controls, in both strains. Mortality was also different between

the strains of mice, ocuring during six - seven days post-infection for C57Bl/6 and on

the eighth day for BALB/c. Brain samples from C57Bl/6 and BALB/c mice were

evaluated by histopathological techniques in order to determinate progress of the

morphological changes. C57Bl/6 mice showed early tissues alterations, however mild

brain alterations were observed on the third day post-infection, as described for human

CM. The cerebral alterations, as in human CM, became more evident over time and

were more intense in C57Bl/6 mice compared to BALB/c, explaining the early death.

Leukocyte-endothelium interactions in the cerebral microcirculation were evaluated by

intravital microscopy in the pial matter vessels in infected animals (5 dpi) and control

animals (non-infected). The infected animals showed an increase in the number of

leukocyte rolling and adhesion on the vessel wall in comparison to control animals. The

total and differential number of leukocytes (lymphocytes, monocytes, neutrophils,

eosinophils and basophils) in the peripheral blood showed a different profile of the

global and/or specific cellular population in infected animals, when compared to

controls. The evaluation of Evans blue leakage to cerebral parenchyma suggests

changes in vascular permeability of blood-brain barrier (BBB), as consequence of the

infection. Using ELISA methods, we noted a significant increase in TNF-α and IFN-γ

cytokines concentrations, as well as in MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 and

MIG/CXCL9 levels, in brain and serum of infected animals (5 dpi) in comparison to

controls animals.

This work showed that young mice BALB/c and C57Bl/6 infected by P. berghei

strain NK65 were able to induce clinical manifestations and cerebral morphological

alterations typical of severe malaria by P. falciparum. Finally, experimental malaria

model induced by P. berghei NK65 may represent a good model to study the

pathogenesis of CM.

Sumário

Lista de Abreviaturas e Siglas ........................................................................................................................................1

Lista de Gráficos ............................................................................................................................................................3

Lista de Figuras, Quadros e Tabelas...............................................................................................................................4

1 1

1 -

- IN TR OD U Ç ÃO

IN TRO D U ÇÃ O IN TRO D U ÇÃ O

IN TRO D U ÇÃ O ......................................................................................................................................... 5

1.1 - A SITUAÇÃO DA MALÁRIA NO MUNDO.............................................................................................. 6

1.2 - A DOENÇA ........................................................................................................................................ 6

1.3 - MALÁRIA CEREBRAL HUMANA....................................................................................................... 10

1.4 - MODELOS EXPERIMENTAIS DE MALÁRIA CEREBRAL...................................................................... 12

1.5  INTERAÇÕES PARASITO-HOSPEDEIRO............................................................................................. 14

1.6  CARACTERÍSTICAS DO PLASMODIUM BERGHEI ............................................................................... 15

1.7 - MEDIADORES INFLAMATÓRIOS....................................................................................................... 16

1.8 - RECRUTAMENTO CELULAR............................................................................................................. 17

1.9 - QUIMIOCINAS ................................................................................................................................. 18

2 2

2 -

- JU STIFIC ATIV A

JU STIFICATIV A JU STIFICATIV A

JU STIFICATIV A .................................................................................................................................... 22

3 3

3 -

- O BJE TIVO S

OB JETIV OS OB JETIV OS

OB JETIV OS ............................................................................................................................................ 25

3.1 - OBJETIVO GERAL............................................................................................................................ 26

3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 26

4 4

4 -

- M ATE RIA L E M ÉTOD O S

M ATER IAL E M ÉTO D O S M ATER IAL E M ÉTO D O S

M ATER IAL E M ÉTO D O S ....................................................................................................................... 27

4.1 - ANIMAIS......................................................................................................................................... 28

4.2 - PARASITO E INFECÇÃO DOS ANIMAIS .............................................................................................. 28

4.3 - DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA ................................................................................................. 28

4.4 - HISTOLOGIA ................................................................................................................................... 29

4.4.1 - Fixação do tecido e recorte dos órgãos ................................................................................ 29

4.4.2 - Desidratação, diafanização e inclusão em parafina ............................................................. 30

4.4.3 - Microtomia ............................................................................................................................ 30

4.4.4 - Coloração.............................................................................................................................. 30

4.4.4.1 - Hematoxilina-Eosina......................................................................................................................30

4.4.4.2  Cresil Violeta.................................................................................................................................31

4.4.5 - Análise Histopatológica ........................................................................................................ 31

4.5 - MICROSCOPIA INTRAVITAL ............................................................................................................ 32

4.6  CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS....................................................................... 33

4.7 - AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR................................................................................ 34

4.8 - MEDIDA DOS NÍVEIS DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS NO SORO E CÉREBRO POR ELISA.................... 35

4.8.1 - Preparo de homogenato de cérebro de camundongo............................................................ 35

4.8.2 - Obtenção de soro de camundongos....................................................................................... 35

4.8.3 - Determinação de citocinas por ELISA .................................................................................. 35

4.9 - ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................................... 36

5 5

5 -

- R ESU LTA D OS

R ESU LTA D O S R ESU LTA D O S

R ESU LTA D O S........................................................................................................................................ 38

5.1 - EVOLUÇÃO DA PARASITEMIA ......................................................................................................... 39

5.2 - MORTALIDADE............................................................................................................................... 42

5.3 - SINAIS CLÍNICOS............................................................................................................................. 42

5.4 - HISTOLOGIA ................................................................................................................................... 45

5.5 - INTERAÇÃO LEUCÓCITO-ENDOTÉLIO .............................................................................................. 50

5.6  CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS....................................................................... 53

5.7 - AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR................................................................................ 56

5.8 - DOSAGEM DAS CITOCINAS TNF-Α E IFN-Γ E DAS QUIMIOCINAS KC/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-

1Α/CCL3, MCP-1/CCL2 E RANTES/CCL5.......................................................................................... 58

6 6

6 -

- D ISCU SSÃO

D ISCU SSÃO D ISCU SSÃO

D ISCU SSÃO ........................................................................................................................................... 62

7 7

7 –

––

– CO N CLU SÕ ES

CON C L U SÕ E S CON C L U SÕ E S

CON C L U SÕ E S ....................................................................................................................................... 75

8. P ER SPE CTIV A S

8. P ER SPE CTIV A S8. P ER SPE CTIV A S

8. P ER SPE CTIV A S ...................................................................................................................................... 78

9 9

9 -

- R EF ER ÊN CIAS B IBL IO G

R EF E RÊ N CIAS BIB LIO G R EF E RÊ N CIAS BIB LIO G

R EF E RÊ N CIAS BIB LIO G R ÁF ICAS

RÁ FICA SRÁ FICA S

RÁ FICA S ....................................................................................................... 80

Lista de Abreviaturas e Siglas

ANOVA  Análise de variância

BHE  barreira hematoencefálica

BSA  Albumina de soro bovino

CEBIO  Centro de Bioterismo

CETEA  Comitê de Ética em Experimentação Animal

CCL2/MCP-1  proteína quimioatraente de macrófagos e monócitos (monocyte-

chemotactic protein-1)

CCL3/MIP-1α  proteína quimioatraente de macrófagos, monócitos e linfócitos T

CD8+ (macrophage-inflammatory protein-1 alpha)

CCL5/RANTES  proteína quimioatraente de linfócitos T ativados e eosinófilos

(regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted)

CXCL8/Kc  proteína quimioatraente de neutrófilos

CXCL9/MIG  monocina induzida por IFN-γ (monokine induced by IFN-γ)

CCR  receptor de quimiocina tipo CC

CSF  fluido cerebroespinhal (cerebrospinal fluid)

CXCR  receptor de quimiocina tipo CXC

dpi  dias pós-infecção (days post-infection)

ELISA  Ensaio imuno-sorvente por enzima ligada (Enzyme-linked immunosorbent assay)

EPM  erro padrão da média

GAG  glicosaminoglicanos

HE  coloração Hematoxilina-Eosina

ICAM  Molécula de adesão intercelular (Intercellular adhesion molecule)

IFN-γ  Interferon gamma

Ig - imunoglobulina

IL  interleucina

i.p.  intraperitoneal

i.v.  intravenoso

Kg  kilograma

LPS  lipopolissacarídeo

MC  malária cerebral

MCE  malária cerebral experimental

MHC  Complexo principal de histocompatibilidade (Major Histocompatibility

Complex)

µL  microlitro

NO  óxido nítrico

NK  célula Natural Killer

nm  nanômetro

OMS  Organização Mundial de Saúde

PBS  salina tampão fosfato (Phosphate buffered saline)

PfEMP1  proteína 1 de membrana do eritrócito do P. falciparum

r.p.m.  rotações por minuto

SNC  Sistema Nervoso Central

TNF- α  fator de necrose tumoral alfa

Lista de Gráficos

Gráfico 1  Média das parasitemias diárias de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens,

a partir do terceiro dia pós-infecção.. ............................................................................. 40

Gráfico 2  Curva de sobrevida de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens............... 43

Gráfico 3  Determinação da variação da massa corporal (%) de animais BALB/c e

C57Bl/6 jovens. .............................................................................................................. 44

Gráfico 4  Número de leucócitos em processo de rolamento e de adesão na

microvasculatura da pia-máter de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens. ............... 52

Gráfico 5  Número total de leucócitos no sangue periférico de camundongos BALB/c e

C57Bl/6 jovens................................................................................................................53

Gráfico 6  Níveis de azul de Evans extravasado para o parênquima cerebral em

camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens........................................................................56

Gráfico 7  Níveis da concentração da citocina TNF-α em sobrenadante de homogenato

de cérebro e em soro de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens.................................59

Gráfico 8  Níveis da concentração da citocina IFN-γ e das quimiocinas Kc/CXCL8,

MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 em sobrenadante de

homogenato de cérebro de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens............................60

Lista de Figuras, Quadros e Tabelas

Figura 1 - Ciclo do Plasmodium....................................................................................... 8

Figura 2 - Mecanismo de recrutamento de leucócitos ................................................... 17

Figura 3 - Interações das moléculas de quimiocinas com os diferentes receptores.. ..... 21

Figura 4 - Foto do sistema de microscopia intravital. .................................................... 32

Figura 5 - Fotomicrografias de esfregaços sangüíneos corados com Giemsa............... 40

Figura 6 - Fotomicrografias do córtex cerebral de camundongos BALB/c e C57Bl/6

não-infectados................................................................................................................. 45

Figura 7 - Fotomicrografias do córtex cerebral de camundongos C57Bl/6 infectados,

eutanaziados no terceiro dia de infecção.........................................................................46

Figura 8 - Fotomicrografias do córtex-cerebral de camundongos infectados,

eutanaziados no sexto dia de infecção.............................................................................47

Figura 9 - Fotomicrografias do córtex-cerebral de camundongos BALB/c infectados,

eutanaziados no nono dia de infecção.............................................................................48

Figura 10  Micrografia de videomicroscopia intravital.................................................50

Quadro 1  Infecção por Plasmodium em diferentes linhagens de camundongos..........13

Tabela 1 - Número percentual dos tipos celulares presentes no sangue periférico de

camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens........................................................................54

Tabela 2  Quantificação diferencial dos tipos celulares presentes no sangue periférico

de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens (x 10

células/mL)....................................54

1 1

1 -

- Introdução

Introdução Introdução

Introdução

1.1 - A situação da malária no mundo

A malária é a doença parasitária mais grave da humanidade, considerada uma

doença negligenciada que permanece como grave problema de saúde pública, apesar

dos esforços dispensados para seu controle. Segundo dados da Organização Mundial de

Saúde (WHO, 2006), em torno de 3,2 bilhões de pessoas vivem em áreas de transmissão

da doença, compreendendo 107 países e territórios. Apresenta incidência anual de 350-

500 milhões de casos, que resultam na morte de 1,5-2 milhões de pessoas. Os países da

África Tropical respondem por mais de 90% dos casos clínicos de malária no mundo e

pela maioria dos casos letais, sendo as crianças as principais vítimas. A prevalência

restante está distribuída entre o Sudeste Asiático, Oceania e América Latina.

Na América Latina, o maior número de casos (99%) é verificado na Amazônia

brasileira (incluindo os Estados do Amazonas, Pará, Acre, Roraima, Rondônia, Amapá,

Mato Grosso, Tocantins e Maranhão), com uma incidência anual de 400-700 mil casos.

Além disso, o grande fluxo migratório da região Amazônica para outros estados

brasileiros tem levado ao surgimento de surtos de malária em áreas consideradas livres

de transmissão da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, BRASIL, 2005).

Apesar das campanhas mundiais de erradicação da malária iniciadas na década de

1960 e das intensas ações de controle atuais, a doença permanece afligindo as

populações mais carentes. O desenvolvimento de resistência às drogas antimaláricas

usuais, muitas vezes utilizadas indiscriminadamente, a dificuldade do controle eficiente

do mosquito vetor, em decorrência das mudanças nos parâmetros ecológicos e

ambientais, e o crescimento econômico limitado de muitos países têm justificado a

incapacidade dos países em desenvolvimento, da faixa tropical, no controle da malária.

Em adição, a doença contribui, significativamente, para a permanente estagnação

econômica destes países (GOOD et al., 2005).

1.2 - A doença

A malária é uma doença causada pelo protozoário do gênero Plasmodium,

parasito descoberto em 1880, por Laveran. São parasitos intracelulares obrigatórios que

apresentam dois hospedeiros, um vertebrado e outro invertebrado (GARNHAN, 1966).

Exibe notável complexidade biológica, com formas evolutivas apresentando diferentes

características antigênicas e variado potencial patogênico, somado ao desenvolvimento

de vários mecanismos de escape do parasito à ação do sistema imunológico (GOOD et

al., 2005). É naturalmente transmitido ao hospedeiro vertebrado através da picada da

fêmea do mosquito Anopheles infectado, considerado o único vetor nos casos humanos.

O principal vetor no Brasil, Anopheles darlingi, apresenta hábitos antropofílicos com

atividade cíclica contínua durante toda à noite, com pico nos crepúsculos matutino e

noturno (TADEI & THATCHER, 2000).

Durante o repasto sangüíneo, o mosquito vetor inocula esporozoítos na derme do

hospedeiro, que inicia um processo de migração para o fígado. Esta forma infectante

apresenta um comportamento de migração complexo e singular, muito estudado através

de microscopia de epifluorescência associado à expressão de uma proteína fluorescente

pelo parasito (NATARAJAN et al., 2001; FRANKE-FAYARD et al., 2004). Os esporozoítos

apresentam na derme seu movimento, denominado gliding, de forma tortuosa e intensa.

Esta motilidade exibida na derme difere do perfil manifestado in vitro, que ocorre em

uma velocidade constante e de forma circular. Para abandonar o sítio de inoculação, os

esporozoítos, como esperado, são capazes de invadir vasos sangüíneos através de uma

interação direta com a parede do vaso. Adicionalmente, foi demonstrado que são

capazes de invadir vasos linfáticos. A presença de esporozoítos no interior de vasos

linfáticos foi confirmada por microscopia confocal após a injeção intradermal com

formas marcadas. Esporozoítos drenados para vasos linfáticos podem eventualmente

alcançar a corrente sangüínea e, posteriormente, o fígado, onde podem invadir as únicas

células as quais podem desenvolver in vivo, isto é, os hepatócitos (AMINO et al., 2006).

No interior dos hepatócitos, os esporozoítos iniciam um processo de

esquizogonia tecidual e diferenciam em uma nova forma invasiva, denominada

merozoíto hepático, capaz de invadir eritrócitos. Para ganhar a corrente circulatória, e

assim ter acesso aos eritrócitos, os merozoítos liberados pela esquizogonia tecidual

necessitam alcançar o lúmem do sinusóide hepático através do espaço de Disse, uma

camada de matriz extracelular e o endotélio sinusóide. Desta forma, os merozoítos

hepáticos precisam ganhar a corrente sangüínea de modo a evitar a fagocitose por

macrófagos residentes, as células de Kupffer, presentes em grande número nos

sinusóides hepáticos. Recentemente, foi descrita a formação de vesículas, denominadas

merosomos, contendo merozoítos hepáticos maduros e infectantes, que se destacam de

hepatócitos. Merosomos de vários tamanhos são formados e liberados após o destaque

da célula do hospedeiro. Este processo garante uma liberação segura dos merozoítos

para a circulação, evitando a destruição pelas células fagocíticas presentes nos capilares

sinusóides hepáticos (STURM et al., 2006). Desta forma, os merozoítos que chegam à

circulação são capazes de invadir eritrócitos, iniciando a fase eritrocítica da infecção

(Figura 1).

Figura 1- Ciclo do Plasmodium. Retirado de www.imm.ul.pt.

Os sintomas clínicos da malária são, primariamente, decorrentes da ruptura de

eritrócitos parasitados, já que nesta etapa ocorre a liberação na circulação sangüínea de

antígenos constituintes do parasito e os formados em conseqüência de seu metabolismo,

que causam uma intensa ativação do sistema imune (DE SOUZA & RILEY, 2002).

Adicionalmente, o parasito altera dramaticamente a fisiologia e processos bioquímicos

dos eritrócitos, com alterações na permeabilidade da membrana do eritrócito infectado e

aumento do consumo de glicose (KIRK, 2001). Vale ressaltar que a proporção

significativa do ciclo de vida do Plasmodium ocorre dentro dos eritrócitos e, como estes

não são contidos em um sítio tecidual específico, mecanismos imunes contra o parasito

podem afetar vários órgãos (GOOD et al., 2005). O baço exerce um papel crucial na

eliminação do parasito da circulação e proporciona uma forte resposta hematopoiética

Fase hepática

Fase eritrocítica

durante a infecção (ALVES et al., 1996). Outra manifestação clínica observada em

indivíduos infectados é o quadro de anemia, que pode ser decorrente de um somatório

de eventos responsáveis pelo seu desenvolvimento, entre eles o processo de destruição

de eritrócitos durante a liberação do parasito, o aumento da eritrofagocitose esplênica e

a deficiência do mecanismo de eritropoiese (CHANG & STEVENSON, 2004).

Dezenas de espécies de Plasmodium são capazes de infectar uma ampla faixa de

espécies animais, como répteis, aves e mamíferos. Quatro espécies de Plasmodium são

descritas como agentes causadores da doença em humanos: Plasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale, sendo a primeira mais

virulenta e a principal causadora de morte. Nas infecções por P. vivax, P. malariae e P.

ovale, predomina a forma não complicada da doença, caracterizada por febre

intermitente, sudorese, mal estar, vômitos e intensa debilidade física. As infecções por

P. falciparum podem levar a forma complicada, denominada malária grave, considerada

uma doença multissistêmica capaz de causar malária cerebral (MC), anemia grave,

insuficiência renal aguda, edema pulmonar, hipoglicemia, colapso circulatório e acidose

metabólica. Entretanto, é importante ressaltar que o curso clínico da doença depende de

fatores associados tanto ao parasito quanto ao hospedeiro, além de questões geográficas

e sociais (MILLER et al., 2002).

O grande número de óbitos se concentra em crianças africanas, especialmente

aquelas que vivem em áreas rurais remotas, com difícil acesso aos serviços de saúde. As

manifestações que predominam nesta faixa etária são, principalmente, a anemia grave e

a MC, freqüentemente associadas à hipoglicemia (MARSH et al., 1996). Quando o

diagnóstico da malária ocorre precocemente e o tratamento é instituído de forma

correta, a doença costuma ter curso benigno e evoluir sem complicações. Entretanto, o

tratamento retardado ou inadequado aumenta a tendência para evolução desfavorável da

doença.

Sabe-se que o desenvolvimento de complicações na malária está diretamente

relacionado à resposta imune do hospedeiro. Habitantes de áreas de intensa transmissão

da doença, como em algumas regiões da África, após vários anos de exposição

desenvolvem certo tipo de imunidade protetora contra as manifestações clínico-

patológicas da malária, embora não estejam protegidos da presença do parasito na

circulação ou da reinfecção (GOOD et al, 2005).

1.3 - Malária cerebral humana

A MC humana é a manifestação mais grave e principal causa de óbitos em

crianças jovens (menores de cinco anos) e primíparas vivendo em área endêmica,

formando os principais grupos de risco (MARSH et al., 1996). Esta síndrome apresenta

uma patogênese complexa, sendo definida como um estado de coma, com exclusão de

outras encefalopatias, associado às manifestações neurológicas resultantes do dano

endotelial e seqüestro de eritrócitos parasitados na microcirculação cerebral. Alterações

morfológicas, como ativação da micróglia, redistribuição de astrócitos, modificações na

barreira hematoencefálica (BHE) e dano neuronal, já foram identificadas nos portadores

da MC. Entretanto, o perfil da patologia não é uniforme entre os pacientes (TURNER,

1997). O curso desta síndrome não é obrigatoriamente letal, porém, os sobreviventes

desta manifestação podem desenvolver danos neurológicos permanentes (MEDANA et

al., 2002).

O seqüestro de eritrócitos é um mecanismo complexo que envolve interações

entre antígenos polimórficos localizados na superfície de eritrócitos infectados com

estágios maduros assexuados e receptores expressados nas células endoteliais do

hospedeiro. Este mecanismo é importante para a sobrevivência do parasito, evitando

sua destruição no baço, não obstante pode ter grave conseqüência para o hospedeiro

(BERENDT et al., 1990).

O parasito se desenvolve no interior de eritrócitos, células que não expressam

moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Entretanto, os

eritrócitos parasitados com estágios maduros expõem, na sua superfície, antígenos

produzidos pelo parasito (GOOD et al, 2005). A proteína 1 de membrana do eritrócito do

P. falciparum (PfEMP1) é a molécula de maior destaque, sendo codificada por uma

larga e diversa família de genes que está envolvida na variação antigênica clonal e tem

um papel central na patogênese. Os múltiplos domínios localizados na região

extracelular da PfEMP1 podem simultaneamente reconhecer vários receptores

expressados pelo hospedeiro. Diversos receptores do hospedeiro, incluindo CD36,

molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), sulfato de condroitina A (CSA), molécula

de adesão celular plaquetária/endotelial-1 (PECAM-1/CD31), molécula de adesão

celular vascular-1 (VCAM-1), trombospondina e E-seletina, têm sido identificados nas

células endoteliais como potentes mediadores para a citoaderência de eritrócitos

infectados (revisado por SHERMAN et al, 2003). A molécula ICAM-1 parece ser o

principal ligante envolvido no seqüestro nos capilares cerebrais. Um aumento da

expressão deste receptor no endotélio cerebral resulta em citoaderência, cujos danos são

responsáveis pelas complicações da MC (MILLER et al., 2002). Além de apresentarem

um papel importante no mecanismo de interação eritrócito-endotélio, estudos em

modelos experimentais de malária grave têm demonstrado que as moléculas de adesão

também podem estar envolvidas nas interações leucócito-endotélio (GRAU & KOSSODO,

1994; SUN et al., 2003) e plaquetas-endotélio (CHANG et al., 2003; GRAU et al., 2003).

Existem duas grandes teorias para explicar a patogênese da MC humana. A teoria

da obstrução mecânica, proposta por Marchiafava e Bignami há mais de cem anos e

confirmada por numerosos estudos posteriores, sugere que a MC é uma conseqüência

direta do seqüestro de eritrócitos, que acarreta na obstrução do fluxo cerebral e hipóxia

cerebral (BERENDT et al., 1994). Por outro lado, a teoria da inflamação sugere que a MC

é resultado de uma resposta imune exacerbada, na qual citocinas tipo Th1,

especialmente TNF-α e IFN-γ, apresentam um papel central no processo (CLARK &

ROCKETT, 1994). O mérito relativo destas duas teorias tem sido extensivamente

debatido, com um consenso em considerar uma hipótese conciliatória (VAN DER HEYDE

et al., 2006).

Estudos recentes têm demonstrado o envolvimento de micropartículas como um

elemento chave na patogênese da MC. Estas estruturas são produzidas através de

remodelamento da membrana de diversos tipos celulares, especialmente plaquetas e

leucócitos, tanto de forma constitutiva quanto induzida, durante uma condição

inflamatória. A produção de citocinas, como TNF-α, induz a vesiculação e liberação

contínua destas micropartículas, que mantém um ambiente inflamatório favorável ao

agravamento da lesão endotelial, através de propriedades pró-coagulantes e pró-

inflamatórias destes elementos (COLTEL et al, 2006).

Vários estudos demonstram que a secreção de citocinas é um evento importante no

desenvolvimento da MC humana (BROWN et al., 1999). Porém, a análise da resposta

imune em humanos muitas vezes é confinada ao estudo de células e moléculas do

sangue periférico (LAMB et al., 2006). Uma vez que os mecanismos envolvidos na

patogênese da MC humana são complexos, seu entendimento permanece com lacunas

ainda não elucidadas (HUNT et al., 2006).

1.4 - Modelos experimentais de Malária Cerebral

Devido às dificuldades em acompanhar casos de MC humana e da limitada

possibilidade de examinar os processos patológicos, alguns modelos experimentais de

MC foram desenvolvidos. O modelo experimental utilizando roedores é bem

caracterizado e útil para a pesquisa científica. Modelos murinos (Quadro 1) oferecem a

oportunidade de desvendar mecanismos imunológicos que podem estar envolvidos na

doença, uma vez que há similaridades entre a resposta imune e características

patológicas da infecção em humanos e camundongos (LAMB et al., 2006).

A grande diversidade de linhagens de camundongos associada à infecção com

diferentes espécies de Plasmodium tem contribuído para elucidar alguns aspectos

envolvidos na patogênese da doença (DE SOUZA & RILEY, 2002).

Entretanto, a maioria dos estudos provém do modelo de infecção por P. berghei

ANKA, que apresenta uma divisão segura entre linhagens de camundongos resistentes

(BALB/c e A/J) e susceptíveis (C57Bl/6 e CBA). Estudos demonstraram que

camundongos geneticamente susceptíveis e infectados com a cepa ANKA podem

apresentar angústia respiratória com acidose láctica, anemia e nefrite, indicando que os

mesmos podem desenvolver manifestações clínicas semelhantes à malária por P.

falciparum (VAN DER HEYDE et al., 2001). Estas linhagens também desenvolvem sinais

neurológicos e sintomas típicos da MC (coma, paralisia e convulsão), assim como

alterações morfológicas cerebrais, como ativação de células endoteliais e micróglia,

identificadas em portadores desta manifestação (MEDANA et al., 1997a). Em

contrapartida, as linhagens resistentes exibem uma resposta diferencial ao parasito, não

desenvolvem MC e morrem, aproximadamente, 20 dias após a infecção devido à anemia

grave e hiperparasitemia (KOSSODO & GRAU, 1993).

Estudos em camundongos BALB/c infectados com P. berghei ANKA

demonstraram que estes não desenvolvem nenhuma lesão cerebral (GRAU et al., 1987).

Entretanto, pouco se sabe sobre a infecção utilizando a cepa NK65 de P. berghei. Este é

um aspecto importante a ser considerado, uma vez que tem sido amplamente estudado

na malária humana e experimental o envolvimento do polimorfismo de cepas do

parasito na determinação da resposta imunológica e da patogênese da infecção (HEY,

1999).

Parasito Cepa Linhagem do

camundongo

Letalidade Uso experimental

P. chabaudi

chabaudi

CBA

C57Bl/6

BALB/c

129sv

A/J

DBA/2

CBA

C57Bl/6

Não letal

Letal

Mecanismo imune

Sinais clínicos associados à malária e

seqüestro

Patogênese

Quimioterapia

Resistência e susceptibilidade

Mecanismo imune

P. chabaudi

adami

C57Bl/6

BALB/c

Não letal

Mecanismo imune

P. berghei ANKA

K173

C57Bl/6

BALB/c

CBA

C57Bl/6

BALB/c

CBA

DBA

Letal

Patogênese

Malária cerebral experimental (MCE)

Seqüestro

Controle para MCE e patogênese

P. yoelii 17XL

17XNL

C57Bl/6

BALB/c

CBA

DBA

Swiss

C57Bl/6

BALB/c

CBA

DBA

C57Bl/6

BALB/c

CBA

DBA

Letal

Não letal

Mecanismo imune

Patogênese

Seqüestro

Malária cerebral experimental (MCE)

Vacina

Patogênese

Hipoglicemia

Resposta imune

Vacinação

P. vinckei

vinckei

BALB/c

Letal

Sinais clínicos associados a malária e

seqüestro

Patogênese

Quimioterapia

P. vinckei

petteri

CR C57Bl/6

BALB/c

Não letal

Mecanismos imunes

Quadro 1. Infecção por Plasmodium em diferentes linhagens de camundongos.

Extraído de Li et al., 2001.

Entretanto, é importante ser cauteloso quando se relaciona o modelo animal à

doença humana. A extrapolação dos resultados obtidos no modelo murino de MC deve

ser realizada com cuidado, pois estes apresentam diferenças significativas. No modelo

murino, o leucócito é o tipo celular predominantemente seqüestrado na microcirculação

cerebral de camundongos, e não os eritrócitos, como na MC humana (ADAMS et al.,

2000; NEILL & HUNT, 1992). Desta forma, muitos autores consideram que não existem

modelos para a MC. Entretanto, a presença de monócitos no endotélio cerebral já foi

comprovada, pelo menos, na MC pediátrica (GRAU & KOSSODO, 1994).

Uma vantagem do modelo experimental murino é a disponibilidade de diferentes

ferramentas genéticas (animais knockout) e moleculares que facilitam a compreensão

dos mecanismos envolvidos na patogênese. Desta forma, modelos de malária

experimental podem providenciar informações valiosas sobre os mecanismos básicos

envolvidos nos desenvolvimento da doença (HUNT & GRAU, 2003).

1.5  Interações parasito-hospedeiro

As interações resultantes das características genéticas do parasito e do hospedeiro

estão associadas à virulência da infecção, sendo esta definida como a severidade com

que um agente infeccioso provoca lesões no hospedeiro. A especificidade desta

interação fornece a base da dinâmica da infecção. Entretanto, a literatura ignora como a

especificidade do genótipo do parasito ou da linhagem do hospedeiro participa na

virulência e patogênese, enfatizando somente o papel de um destes componentes. Desta

forma, alguns modelos assumem que uma determinada linhagem de um parasito

apresenta fenótipo de virulência que é estável em amplo genótipo do hospedeiro. Porém,

sabe-se que a virulência do parasito sofre variação em diferentes hospedeiros. Em

alguns casos, algumas linhagens de patógenos podem causar mais danos, com efeitos

mais pronunciados em certos genótipos de hospedeiro (GRECH et al, 2006).

Na malária, tem sido reconhecido que fatores do hospedeiro e do parasito podem

afetar o curso da doença. Exemplos de fatores de resistência/susceptibilidade associados

ao hospedeiro humano são: a anemia falciforme e alelos MHC particulares. Já alguns

fenótipos produzidos pelo parasito, como a citoaderência e formação de rosetas,

contribuem para a gravidade da doença (revisado por GRECH et al, 2006).

Além disso, perfis de susceptibilidade e resistência coexistem em camundongos na

geração F1 (BALB/c X C57Bl/6) infectados com P. berghei ANKA. Os animais velhos

(15-20 semanas) apresentam reversão dos sintomas da MC (HEARN et al., 2000). Logo,

a susceptibilidade pode estar também associada à idade dos animais utilizados no

estudo.

Em síntese, podemos sugerir que o curso da infecção e o progresso da doença

dependem da combinação dinâmica e específica das propriedades do hospedeiro e do

parasito.

1.6  Características do Plasmodium berghei

A espécie Plasmodium berghei é a mais utilizada nos estudos experimentais e

pertence ao grupo das espécies de Plasmodium que infectam roedores murinos da África

Central, juntamente com P. vinckei, P. chabaudi e P. yoelii. A espécie P. berghei foi

isolada em 1948, por Vincke e Lips no Zaire, em glândulas salivares da espécie silvestre

de Anopheles dureni. Posteriormente (1954), Vincke encontrou o parasito no sangue dos

roedores silvestres Thamnomys surdaster, Praomys jacksoni e Leggada bella

(GARNHAN, 1966). Trabalhos recentes têm demonstrado a capacidade de Anopheles

stephensi, Anopheles gambiae e Aedes aegypti atuarem como vetores de P. berghei

(ALAVI et al., 2004).

Uma cepa do parasito é considerada uma amostra retirada em uma única ocasião

do seu hospedeiro natural e, também, pode ser referida como isolado. A cepa NK65 de

P. berghei foi isolada em 1964, em um exemplar de Anopheles dureni, enquanto a cepa

ANKA foi isolada posteriormente, em 1966, na mesma espécie (KILLICK-KENDRICK, 1978). A

cepa NK65 de P. berghei causa uma infecção fulminante com altas taxas de parasitemia

que evolui rapidamente para um curso letal (YOSHIMOTO et al., 1998).

O ciclo de vida, bem como a morfologia dos estágios de desenvolvimento do

parasito, está conservado nas diferentes espécies que infectam mamíferos. Algumas

diferenças restritas ao tempo de desenvolvimento dos diferentes estágios do ciclo e

outras relacionadas com a interação do parasito com seu hospedeiro foram identificadas

(GARNHAN, 1966).

O P. berghei, no hospedeiro vertebrado, apresenta preferência em invadir

reticulócitos, podendo também invadir eritrócitos maduros (DEHARO et al., 1996). Em geral,

prevalece a produção de 12-18 merozoítos por esquizonte quando há desenvolvimento

em reticulócitos. O ciclo assexuado em laboratório requer 22-25 horas, sendo

usualmente assincrônico, com os diferentes estágios sangüíneos presentes,

simultaneamente, no sangue ao longo da infecção. Infecções múltiplas de eritrócitos são

descritas, com poliparasitismo tão extensivo que a massa citoplasmática parece ser

contínua, com aspecto de esquizonte maduro. A retenção de esquizontes maduros no

baço e fígado é um evento comum e já relatado para esta espécie (LANDAU & BOULARD, 1978).

Nenhuma proteína de superfície de eritrócitos infectados, equivalente a membros da

PfEMP, foi descrita em espécies de roedores, com os mecanismos do seqüestro ainda

desconhecidos.

A imunidade para malária em uma diversidade de hospedeiros, inclusive

humanos, é marcadamente dependente da espécie do parasito, linhagem e variante-

específica. Em adição a fatores genéticos, fatores do hospedeiro como idade, via e dose

de infecção, também influenciam o curso da infecção (BAKKER et al, 1992).

1.7 - Mediadores inflamatórios

O fator de necrose tumoral (TNF-α) induz, em humanos e camundongos, a

superexpressão de moléculas de adesão endotelial que têm sido implicadas no seqüestro

de células na microvasculatura cerebral e outros órgãos. Na resposta imune

inflamatória, uma função do TNF-α é estimular o recrutamento de neutrófilos e

monócitos para o sítio de infecção e induzir a expressão de outros mediadores

inflamatórios, em uma cascata de eventos (BROWN et al., 1999). Porém, a produção

excessiva desta citocina por monócitos/macrófagos desempenha um papel chave na

patogênese da MC humana e MC experimental (GRAU et al., 1987).

O desenvolvimento de complicações na malária está diretamente relacionado à

resposta imune do hospedeiro. Acredita-se que a susceptibilidade seja dependente das

diferenças na sensibilidade das células endoteliais ao TNF-α, com evidências favoráveis

de que esta é a citocina chave na patogênese da MC (LUCAS et al., 1997). Entretanto,

outro estudo demonstrou que o TNF-α pode ter um papel na gravidade da doença,

porém não está diretamente relacionada à MC (LOOAREESUWAN et al., 1999).

Em adição a produção sistêmica, a liberação local destas citocinas pode contribuir

para a patogênese órgão-específica. Um estudo demonstrou a produção de TNF-α por

astrócitos e micróglia em modelo de MCE e seu envolvimento com a imunopatogênese

(MEDANA et al., 1997b).

1.8 - Recrutamento celular

Sob condições normais, os leucócitos são mantidos no centro dos vasos

sangüíneos, onde o fluxo é rápido. Durante uma resposta inflamatória, o aumento dos

níveis de TNF-α estimula a expressão seqüencial de diferentes moléculas de adesão no

endotélio, envolvidas no recrutamento de leucócitos do sangue para o espaço

intersticial. É um processo multifásico, envolvendo uma seqüência de etapas

controladas por moléculas de adesão, fatores de ativação e quimiocinas. As etapas da

migração celular ocorrem geralmente nas vênulas pós-capilares e consistem de um

contato inicial de leucócitos com a parede do vaso, rolamento destes ao longo do

endotélio, seguido de uma adesão firme e migração transendotelial (Figura 2) (PICCIO et

al., 2002). O termo recrutamento de leucócitos abrange todos os eventos que mobilizam

a saída de leucócitos circulantes para o tecido inflamado.

Figura 2: Mecanismo de recrutamento de leucócitos.

Nas últimas décadas, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos nas

interações leucócito-endotélio têm sido largamente investigados nos mais diversos

tecidos e condições inflamatórias. A utilização da técnica de microscopia intravital para

avaliar o recrutamento celular em modelos inflamatórios tem ampliado as informações a

respeito deste processo (LEY, 2001). Entretanto, deve-se salientar que a primeira

descrição do recrutamento de leucócitos durante o processo inflamatório, através de

microscopia intravital, foi realizada há mais de um século por Cohnheim (citado por

KUBES & KERFOOT, 2001).

O mecanismo de rolamento é mediado por uma família de moléculas de adesão,

glicoproteínas conhecidas como seletinas (P-seletina, E-seletina e L-seletina), que

promovem uma fraca ligação inicial dos leucócitos às vênulas nos sítios de inflamação

(KERFOOT & KUBES, 2002). Em presença do fluxo sangüíneo, após um primeiro contato

com a parede do vaso, os leucócitos diminuem sua velocidade e começam a rolar ao

longo da superfície endotelial, o que favorece as interações entre leucócitos e endotélio

(KUBES & KERFOOT, 2001). Posteriormente, os leucócitos podem ser ativados através de

mudança conformacional de integrinas, moléculas presentes em sua superfície celular,

(CD11/CD18, VLA-2, VLA-4, α4β7, α3β1) e, conseqüentemente, podem aderir de

forma estável ao endotélio via membros da superfamília das imunoglobulinas (ICAM,

VCAM, PECAM, MAdCAM) (KERFOOT & KUBES, 2002; KUBES, 2002).

A última etapa é a migração dos leucócitos através de espaços inter-endoteliais

para o tecido extravascular, o que requer uma reorganização do citoesqueleto, com

formação e retração de pseudópodes. Moléculas presentes em junções intercelulares do

endotélio, como PECAM-1 (CD31), também estão envolvidas na migração. Uma vez no

tecido conectivo, os leucócitos aderem a matriz extracelular via integrinas β1 e CD44

(KERFOOT & KUBES, 2002; KUBES, 2002).

O recrutamento de leucócitos também envolve a participação das quimiocinas, que

agem sobre a expressão de moléculas de adesão e estão envolvidas na migração dirigida

das células através de um gradiente de concentração (ONO et al, 2003).

1.9 - Quimiocinas

As quimiocinas constituem uma família de proteínas de baixo peso molecular (8-

14 kDa), importantes tanto para a organização celular dos órgãos linfóides em

condições fisiológicas, como na regulação do recrutamento de células durante a

inflamação (BIBER et al., 2002). As quimiocinas são produzidas por diferentes tipos

celulares (linfócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células endoteliais),

apresentando uma expressão temporal durante o processo inflamatório. Em adição, estas

proteínas também podem atuar na apoptose, hematopoiese, angiogênese, mitose,

metástase tumoral, cicatrização e secreção de mediadores inflamatórios, como citocinas,

radicais livres e óxido nítrico (DAMBROSIO et al., 2003).

A classificação das quimiocinas é baseada no número e disposição de resíduos

de aminoácidos entre os resíduos de cisteína conservados na cadeia N-terminal da

molécula. Desta forma, as famílias foram agrupadas em C, CC, CXC e CX3C e seus

receptores XCR, CCR, CXCR e CX3CR (BIBER et al., 2002). As quimiocinas que

pertencem ao grupo CC são caracterizadas por duas cisteínas adjacentes; as do grupo

CXC ou CX3C apresentam um e três aminoácidos entre as cisteínas, respectivamente,

enquanto que as XC apresentam apenas um resíduo de cisteína (BANISOR et al., 2005).

Os pares receptor-ligante das quimiocinas não apresentam especificidade absoluta,

demonstrando uma alta redundância neste sistema (Figura 3). Por exemplo, o receptor

CCR1 pode interagir com múltiplas quimiocinas (CCL3, CCL5, CCL7 e CCL8) (ONO

et al., 2003).

A estrutura dos receptores baseia-se em uma cadeia polipeptídica, composta por

aproximadamente 350 aminoácidos, com sete domínios transmembrana que sinalizam

através de uma proteína G acoplada. A interação entre uma quimiocina e seu receptor é

iniciada pela ativação da proteína G, que induz um influxo de Ca

, efetivo para

estimulação de outras quimiocinas e ampliação da resposta inflamatória (ONO et al.,

2003). A ativação de vias de sinalização intracelulares culmina no rearranjo de

filamentos de actina, modificação da forma e movimentação da célula (BAGGIOLINI,

1998).

Além da interação com seus receptores, as quimiocinas também podem se ligar a

glicosaminoglicanos (GAGs) de superfície celular do endotélio vascular e da matriz

extracelular (KUSCHERT et al., 1999). Tem sido sugerido que esta interação seja capaz

de inibir a difusão das quimiocinas localmente produzidas e, conseqüentemente,

promover a formação de um gradiente de concentração, por imobilização dessas

quimiocinas, que favorece a migração celular (KUSCHERT et al., 1999; PROUDFOOT,

2006).

Os membros da família CXC, que incluem IL-8/CXCL8, MIG/CXCL9, IP-

10/CXCL10 e MIP-2/CXCL2, são, preferencialmente, quimiotáticos para neutrófilos,

monócitos e células T. Este grupo apresenta uma uniformidade estrutural, porém é

subdividido em duas classes, de acordo com a presença da seqüência de aminoácidos

Glu, Leu, Arg (ELR) presente na região N-terminal. Membros expressando este motivo,

como IL-8/CXCL8, são geralmente quimiotáticos para neutrófilos (BAGGIOLINI et al,

1994), que são as primeiras células a chegarem em grande número aos locais de

infecção (ONO et al., 2003). Entre as que não possuem o motivo ERL, destacam-se IP-

10/CXCL10 e MIG/CXCL9, ambas induzidas por IFN-γ, que apresentam atividade em

outras populações celulares. Em humanos, MIG/CXCL9 tem sido associada com

infiltrado de células T em doenças inflamatórias no SNC, como na esclerose múltipla

(SIMPSON et al., 2000).

A família das quimiocinas CC é a mais diversa e numerosa, apresentando

moléculas de expressão constitutiva e induzida. Os membros da família CC incluem

MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 e RANTES/CCL5, que atraem e ativam

monócitos, linfócitos T, basófilos e eosinófilos que são recrutados tardiamente para os

sítio de infecção (ONO et al., 2003).

Trabalhos anteriores mostraram a expressão de algumas quimiocinas (MIP-

1α/CCL3 e IL-8/CXCL8) no soro de pacientes portadores de malária aguda

(BURGMANN et al., 1995). Um estudo comparativo da produção de citocinas e

quimiocinas em modelos experimentais de MC induzida por P. berghei ANKA

demonstrou um aumento na expressão localizada das quimiocinas IP-10/CXCL10,

MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 em tecido cerebral de camundongos infectados

(HANUM et al, 2003).

As células residentes do SNC, como astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e

neurônios, quando induzidas por um estímulo inflamatório são capazes de expressar

receptores funcionais de quimiocinas (BIBER et al., 2002).

O Sistema Nervoso Central (SNC) é considerado um sítio imunologicamente

privilegiado, possuindo uma limitada reatividade imune e inflamatória. Tal fato deve-se

à presença da barreira hematoencefálica (BHE), formada por uma bainha de endotélio,

composta por junções intercelulares especializadas. Este complexo juncional recobre

continuamente a superfície dos capilares cerebrais, sendo responsável por limitar o

acesso celular e o tráfego de moléculas para o microambiente cerebral. Porém, durante

condições inflamatórias, a permeabilidade da barreira pode ser alterada, permitindo o

desenvolvimento de resposta imune no SNC (ADAMS et al., 2002). A disfunção na

permeabilidade da BHE, acarretada por condições patológicas, pode ser avaliada através

da quantificação do extravasamento do corante azul de Evans da circulação para o

parênquima cerebral (BELAYEV et al., 1996)

Figura 3: Interações das moléculas de quimiocinas com os diferentes tipos de

receptores. Extraído de Rot & von Andrian, 2004.

Quimiocinas Quimiocinas Receptores

2 2

2 -

- Justificativa

Justificativa Justificativa

Justificativa

As dificuldades na definição de mecanismos patogênicos em humanos por

razões éticas e as similaridades entre vias de resposta imune em camundongos e

humanos justificam o uso do modelo murino de MC. Modelos experimentais utilizando

camundongos são versáteis e permitem a análise completa de interações moleculares e

celulares. Estudos detalhados da progressão da infecção ajudam a esclarecer

informações relevantes da seqüência de eventos que levam ao quadro de malária grave.

Devido às diferenças significativas entre o modelo animal e a doença humana,

muitos autores consideram que não existem modelos apropriados para a MC.

Entretanto, estudos recentes indicam um acúmulo significativo de plaquetas e leucócitos

na MC humana, que têm favorecido a comparação dos achados da infecção de

camundongos com P. berghei com a infecção humana.

A maioria dos estudos de imunopatogênese da malária grave provém do modelo

de infecção por P. berghei ANKA, com uma definição segura de resistência e

susceptibilidade entre linhagens de camundongos. Entretanto, é reconhecido o

envolvimento de polimorfismo de cepas do parasito na determinação da resposta

imunológica e na patogênese da infecção. Outra característica que deve ser levada em

consideração é a presença de múltiplas vias de progressão da doença. Logo, o estudo em

modelos murinos não deve se deter em apenas um único modelo já definido, o que pode

limitar a compreensão dos mecanismos envolvidos na MC.

Neste estudo avaliamos a resposta inflamatória cerebral da infecção experimental

por P. berghei cepa NK65 em camundongos jovens das linhagens BALB/c e C57Bl/6,

que apresentam perfis de resistência e de susceptibilidade bem determinados para a

infecção por P. berghei ANKA.

Desta forma, buscou-se associar estudos de microscopia intravital com

parâmetros histopatológicos e perfil de quimiocinas em camundongos jovens infectados

com P. berghei NK65 para a compreensão de fatores determinantes da resposta

inflamatória na MC. A escassez de estudos que empregam a técnica de microscopia

intravital no cérebro para estudar recrutamento celular e de dados sobre o perfil de

quimiocinas no tecido cerebral, torna o trabalho original, com informações que vão

além das já descritas na literatura.

O estudo de microscopia intravital neste modelo inflamatório serve de

ferramenta para ampliar as informações a respeito das interações leucócito-endotélio,

e/ou endotélio-plaqueta-leucócito. A análise das interações leucócito-endotélio cerebral

e dos níveis de quimiocinas, in locu, em camundongos infectados é relevante para

compreender os mecanismos de resposta imune e o envolvimento do SNC na progressão

da doença.

3 3

3 -

- Objetivos

Objetivos Objetivos

Objetivos

3.1 - Objetivo geral

Caracterizar a infecção por P. berghei cepa NK65 em linhagens de camundongos

BALB/c e C57Bl/6 jovens, avaliando suas implicações inflamatórias no Sistema

Nervoso Central.

3.2 - Objetivos específicos

3.2.1 - Avaliar parasitemia e parâmetros clínicos da malária em camundongos

BALB/c e C57Bl/6 infectados com P. berghei cepa NK65.

3.2.2 - Determinar as alterações histopatológicas cerebrais nos camundongos

BALB/c e C57Bl/6 ao longo da infecção por P. berghei cepa NK65.

3.2.3 - Avaliar in vivo os processos de rolamento e adesão de leucócitos no

endotélio vascular da pia-máter nos camundongos infectados através da técnica de

microscopia intravital.

3.2.4 - Quantificar o número total e diferencial de leucócitos presentes no sangue

periférico dos animais controle e infectados.

3.2.5 - Verificar as possíveis alterações na permeabilidade vascular da BHE

acarretadas pela infecção.

3.2.6 - Quantificar a concentração das citocinas TNF-α e IFN-γ e das quimiocinas

murinas Kc/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 no

tecido cerebral e no soro do modelo de malária experimental induzida por P. berghei

cepa NK65.

4 4

4 -

- M aterial e M étodos

M aterial e M étodos M aterial e M étodos

M aterial e M étodos

4.1 - Animais

Camundongos das linhagens BALB/c e C57Bl/6, fêmeas, jovens, com idade de

seis semanas, obtidos no Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO-ICB-UFMG) foram utilizados neste

estudo. Os animais foram mantidos com água e ração ad libitum. Este projeto foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA), protocolo

número 005/05.

4.2 - Parasito e infecção dos animais

A cepa NK65 de P. berghei foi isolada na África em 1964, em um exemplar de

Anopheles dureni e vem sendo conservada como um isolado desde então (KILLICK-

KENDRICK, 1978). Uma amostra foi cedida pela Dra. Luzia Helena Carvalho do Laboratório

de Malária do Centro de Pesquisa René Rachou FIOCRUZ/MG e vem sendo mantida

no laboratório de Malária do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal de

Minas Gerais desde o ano de 2000. O parasito é criopreservado e para a infecção, uma

amostra foi estavelmente descongelada e inoculada em animal para uma primeira

passagem que serviu de fonte dos parasitos.

Os camundongos foram infectados intra-peritonealmente (i.p.) com inóculo

padronizado de 10

hemácias parasitadas em solução tampão fosfato estéril (PBS) para

garantir um grau de infecção uniforme nos diferentes grupos (GRAU et al., 1986).

4.3 - Determinação da parasitemia

Para determinação da evolução diária da parasitemia, um grupo de dez animais de

cada linhagem foi infectado e monitorado até o óbito. Esfregaços sangüíneos foram

confeccionados a partir do terceiro dia pós-infecção, fixados em metanol (P.A.) e

posteriormente corados pelo Giemsa (solução a 10%). Os esfregaços foram utilizados

para a contagem da parasitemia, permitindo evidenciar a presença do parasito dentro das

hemácias, confirmando a infecção. Os esfregaços sangüíneos, devidamente

identificados, foram examinados ao microscópio óptico (aumento 1000X - imersão)

com um retículo acoplado à ocular. Uma área do esfregaço com distribuição uniforme

de eritrócitos foi selecionada e o número total de eritrócitos do campo foi contado. A

parasitemia foi estimada em 1000 eritrócitos contados. A contagem foi realizada em

campos adjacentes para evitar variações intensas.

O eritrócito contendo dois ou mais parasitos foi considerado como um eritrócito

parasitado. A parasitemia foi expressa em percentagem:

% parasitemia = número de eritrócitos parasitados X 100

1000

Um acompanhamento da variação de peso dos animais foi realizado ao longo da

infecção, juntamente com observações qualitativas de manifestações clínicas nos

animais. Os animais que sobreviveram ao longo da realização de todas as etapas dos

experimentos foram adicionados à curva de sobrevida.

4.4 - Histologia

Para avaliar a cinética das alterações histopatológicas cerebrais pós-infecção, 40

animais de cada linhagem foram utilizados. Em cada grupo, três animais foram retirados

e utilizados como controles (sem infecção). O restante, isto é 37 animais de cada

linhagem, foram infectados com o P. berghei NK65 e a partir desta data, três

camundongos foram sacrificados diariamente, o que permitiu um acompanhamento das

mudanças patológicas acarretadas pela infecção. Este acompanhamento foi realizado até

o nono dpi para os animais da linhagem BALB/c e sétimo dpi para animais C57Bl/6, em

virtude da mortalidade de alguns animais ao longo do tempo.

4.4.1 - Fixação do tecido e recorte dos órgãos

Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Durante a

necropsia, o cérebro foi coletado e fixado por imersão em solução de formol tamponado

a 4%, pH 7.2, com o objetivo de preservar a morfologia e a composição do tecido. Após

o período de fixação, os tecidos foram recortados e seccionados transversalmente. A

cada animal foi dado um código que apenas foi revelado ao final de todas as análises.

4.4.2 - Desidratação, diafanização e inclusão em parafina

Os tecidos foram submetidos à desidratação em concentrações crescentes de

álcool (70%, 80%, 90% e absoluto) sendo que os fragmentos permaneceram imersos por

um período de 30 minutos em cada álcool.

Após a etapa de desidratação, foi realizado o processo de diafanização, que tem

como objetivo tornar o tecido translúcido. A diafanização consistiu em submeter os

fragmentos a dois banhos de xilol com duração de 20 minutos cada. Posteriormente, os

tecidos foram impregnados e incluídos em parafina.

4.4.3 - Microtomia

Os blocos de parafina, contendo o fragmento do órgão, foram submetidos à

microtomia, sendo obtidos dois cortes seriados com 4 micrômetros de espessura. Cada

corte foi colocado em banho-maria para que as fitas fossem esticadas e logo depois as

lâminas foram colocadas na estufa para secarem a temperatura de 60

4.4.4 - Coloração

4.4.4.1 - Hematoxilina-Eosina

A coloração de rotina HE (Hematoxilina-Eosina) foi realizada nas lâminas com

cortes do tecido cerebral para uma observação geral das alterações histopatológicas.

O processo de coloração se iniciou com a imersão das lâminas em dois banhos de

xilol, de duração de 15 minutos cada, para desparafinização. Em seguida estas lâminas

foram imersas em banhos de álcool absoluto, álcool 90%, álcool 80%, álcool 70%, e

água sendo cada um dos banhos de 5 minutos para hidratação. Após a hidratação, as

lâminas foram imersas no corante Hematoxilina (corante ácido) por 10 minutos, em

seguida lavadas em água corrente por 5 minutos. A seguir foi feita a diferenciação com

a passagem rápida das lâminas em álcool-acidulado. Novamente as lâminas foram

lavadas em água corrente por 5 minutos. Finalizada esta etapa, as lâminas foram imersas

no corante Eosina (corante básico), por 30 segundos, e em seguida lavadas em água

corrente por 1 minuto. Logo após, as lâminas foram imersas em três banhos de álcool

absoluto rapidamente e levadas à estufa a 60

C por alguns minutos para secagem.

Depois de secas, as lâminas foram imersas em xilol e montadas com Entellan (Merck) e

lamínula.

4.4.4.2  Cresil Violeta

Em adição a coloração Hematoxilina-Eosina, foi realizada a coloração pelo

método do Cresil Violeta no tecido cerebral, o qual permite a identificação do dano

neuronal, além das observações histopatológicas gerais. Para a realização desta

coloração, as lâminas foram desparafinizadas e hidratadas assim como na coloração pela

HE. Depois foram coradas pelo Cresil Violeta por 10 minutos e diferenciadas em

solução tampão ácido acético/acetato, por tempo variável (observação visual) até a

descoloração parcial das estruturas. Em seguida as lâminas foram colocadas na estufa a

C para secagem. A montagem das lâminas foi realizada com Entellan e lamínula.

4.4.5 - Análise Histopatológica

As lâminas coradas pela HE e Cresil violeta foram avaliadas utilizando-se a

objetiva de 10 e 40X. Nos cortes histológicos o processo inflamatório foi avaliado de

forma qualitativa e caracterizado como: ausente, discreto (pequeno número de células

inflamatórias ou apresentando degeneração  até 10 células por campo), moderado

(moderado número de células inflamatórias ou apresentando degeneração  entre 10 e

50 células por campo) ou intenso (acentuado número de células inflamatórias ou

apresentando degeneração  mais de 50 células por campo). Nos vasos foram avaliados

o acúmulo e extravasamento de hemácias e leucócitos também caracterizados como

discreto, moderado ou intenso de acordo com a quantidade de vasos comprometidos

utilizando-se a objetiva de 10 X (discreto: um vaso por campo; moderado: entre dois e

três vasos por campo e intenso: mais de três vasos por campo).

4.5 - Microscopia intravital

Animais controle, não-infectados, (n=7) e animais com cinco dias de infecção

(n=7) de cada grupo foram submetidos à técnica da microscopia intravital, para

visualização da microvasculatura cerebral.

Figura 4- Foto do sistema de microscopia intravital.

Os animais foram anestesiados via intra-peritoneal com uma mistura de xilazina

(10 mg/kg, Rompun

, Bayer) e Ketamina (150 mg/Kg, Laboratório Cristália, SP). A

veia da cauda foi canulada para administração do corante rodamina 6G (Sigma) e

volumes adicionais de anestésico quando necessário. A rodamina 6G é um corante

fluorescente, com a habilidade de marcar mitocôndrias seletivamente. Devido a esta

propriedade, o corante tem sido usado para o estudo de leucócitos em ensaios de

microscopia intravital, com o objetivo de examinar a cinética in vivo destas células

mesmo na presença da alta velocidade do fluxo sangüíneo (BAATZ et al., 1995). A

temperatura corporal dos animais foi continuamente monitorada com um sensor e

mantida a 37

C com uma manta térmica (Fine Science Tools, Canadá) colocada em

contato com o corpo do animal. A craniotomia foi realizada na região parietal utilizando

uma mini-broca (Dremel, USA). A dura-máter e a aracnóide foram removidas, sendo

formada uma janela para visualização dos vasos sangüíneos da pia-máter. Este

procedimento não rompe a barreira vascular cerebral. A superfície cerebral dos animais

foi continuamente superfundida com uma solução de fluido cerebroespinhal (CSF)

artificial (composição iônica em mmol/L: NaCl 132, KCl 2.95, CaCl

1.71, MgCl

0.64,

NaHCO

24.6, dextrose 3,71 e uréia 6.7) à temperatura de 37ºC, pH 7,35, que mantém a

preparação estável, sem evidência de inflamação no nível basal (CARVALHO-TAVARES

et al., 2000).

Um microscópio (Olympus BX40), com objetiva 10X, foi utilizado para observar

os eventos microcirculatórios nos vasos cerebrais. Após a localização dos vasos a serem

estudados, injetou-se intravenosamente (i.v.) uma pequena quantidade (0,5mg/kg) do

corante rodamina 6G. A fluorescência associada à rodamina 6G foi visualizada com epi-

iluminação a 510-560 nm, usando um filtro de emissão de 590 nm. Uma câmera de

vídeo (Optronics) projetou as imagens que foram gravadas em vídeo-cassete (VHS,

Semp Toshiba, modelo x685) para posterior análise. O número de leucócitos em

rolamento e adesão foi determinado através da análise dos vídeos, em uma área

determinada (100µm). O rolamento de leucócitos é definido como células movendo a

uma velocidade menor que o fluxo sangüíneo. Os leucócitos são considerados aderidos

quando permanecem estacionários ao endotélio por um período de 30 segundos. O

rolamento, por ser um processo dinâmico, foi expresso como número de células

/minuto. A adesão leucocitária foi expressa como células aderidas ao endotélio vascular

(em 100µm de comprimento do vaso).

4.6  Contagem total e diferencial de leucócitos

Para a contagem total de leucócitos, 5µl do sangue de cada animal foi coletado e

diluído em 95µl de solução de Turk. Após homogenização, 10µl da solução foi

colocada em câmera de Neubauer para a contagem total das células. A contagem foi

realizada em microscópio óptico, em aumento de 10X. O valor encontrado foi

multiplicado pela diluição e o fator de correção da câmera de Neubauer.

nº total de leucócitos = n x 20 (diluição) x 10

(fator de correção)/mL

A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em esfregaços sangüíneos

corados com May-Gruwald e Giemsa, o que permite a identificação dos tipos celulares

presentes no sangue periférico dos animais infectados e controles. Os esfregaços

sangüíneos, devidamente identificados, foram examinados ao microscópio óptico

(aumento 1000X - imersão). A contagem percentual dos diferentes tipos celulares foi

estimada em 100 células, com auxílio de um contador diferencial.

Para o cálculo do número diferencial dos tipos celulares presentes no sangue

periférico foi utilizada a seguinte regra:

nº diferencial = nº total de leucócitos x nº percentual

100

4.7 - Avaliação da permeabilidade vascular

Para a avaliação da permeabilidade da BHE, utilizou-se o corante azul de Evans

como um marcador do extravasamento de albumina, como descrito previamente por

Belayev et al., (1996), em protocolo modificado. O método consiste na determinação

espectrofotométrica da quantidade de azul de Evans extravasado para o parênquima

cerebral.

Animais controle (n=6) e com cinco dias de infecção (n=6), de cada linhagem,

foram anestesiados via intra-peritoneal com uma mistura de xilazina (10 mg/kg,

Rompun

, Bayer) e Ketamina (150 mg/Kg, Laboratório Cristália, SP). Posteriormente, a

veia da cauda foi canulada e foi administrado 0,2 mL de Azul de Evans (2%)

intravenosamente. Ao final de uma hora, os animais foram sacrificados e perfundidos

com salina fisiológica (5 mL por animal). O cérebro foi retirado e colocado em uma

placa de petri para secagem por 48 horas em estufa a 40°C. Em seguida, as amostras

foram pesadas e foi acrescentado ao tecido 1mL de formamida para extração do corante

por 48 horas. O corante extraído do tecido foi quantificado em leitor de ELISA (650nm)

(Molecular Devices, USA) e a concentração determinada através de uma curva padrão

com concentração inicial de 20 pg/mL de Azul de Evans. O resultado da leitura

espectofotométrica foi normalizado e expresso em pg de Azul de Evans por 100mg de

tecido seco.

4.8 - Medida dos níveis de citocinas e quimiocinas no soro e cérebro por ELISA

4.8.1 - Preparo de homogenato de cérebro de camundongo

Os cérebros de oito animais não-infectados (controle) e de dez animais com

cinco dias de infecção foram retirados, devidamente acondicionados e, quando

necessário, estocados a -20

C. As amostras foram posteriormente pesadas (100 mg) e

colocadas em 1 mL de solução inibidora de protease, adequada para extração de

citocinas [NaCl 0,4 M; Tween 20 0,05%; Albumina de soro bovino (BSA) 0,5%;

Fluoreto de fenilmetilsufonila (PMSF) 0,1mM; cloreto de benzetônio 0,1 mM; EDTA

10 mM; 20 UI de aprotinina], preparada a partir de uma solução de tampão fosfato

(NaCl 8 g, KCl 0,2 g e Na

HPO

.12H

O 2,89 g diluídos em 1 litro). As amostras foram

maceradas por um homogenizador de tecidos (Ultra-Turrax) e o homogenato foi

centrifugado a 10000 r.p.m./10 min, a 4

C. O sobrenadante foi recolhido, aliquotado e

estocado a 20

C até o uso (DOS SANTOS et al., 2005).

4.8.2 - Obtenção de soro de camundongos

Após anestesia, oito camundongos infectados (5dpi) e sete animais controle de

cada linhagem sofreram exsanguinação através do plexo retro-orbital, e o sangue foi

coletado em tubos individuais. Para obtenção do soro, as amostras foram mantidas

durante uma hora em temperatura ambiente e uma hora a 4

C. Posteriormente, o

material foi centrifugado a 3000 r.p.m./10 min e o soro foi recuperado e estocado a 

C até o uso.

4.8.3 - Determinação de citocinas por ELISA

Os kits para ELISA para dosagem das citocinas TNF-α e IFN-γ e das

quimiocinas murinas Kc/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2 e

RANTES/CCL5 foram obtidos da R&D Systems (DuoSet) e utilizados de acordo com

os procedimentos previamente descritos pelo fabricante. As concentrações das citocinas

TNF-α e IFN-γ e das quimiocinas MCP-1/CCL2, Kc/CXCL8, RANTES/CCL5,

MIG/CXCL9 e MIP-1α/CCL3 foram avaliadas no sobrenadante de homogenato de

cérebro em diluição 1:3 em PBS contendo 0,1% de soro albumina bovina (BSA).

Adicionalmente, a concentração sistêmica de TNF-α foi avaliada no soro dos animais

em um protocolo semelhante (diluição 1:3 em PBS/BSA 0,1%).

Em placas de 96 poços (Nunc. Immunosorb, Naperville), foram adicionados 100

µl/poço do anticorpo de captura, sendo este específico para cada molécula e em

concentração adequada. Esta solução permaneceu em contato com a placa durante 18 h

a 4

C e foi, posteriormente, lavada cinco vezes com PBS/Tween 0,1%, utilizando um

lavador de placas automático (ELX50, Bio-Tet Instruments, INC). Logo após, foram

adicionados 200 µl/poço de solução de bloqueio (PBS/BSA 1%). O tempo de bloqueio

foi de duas horas sob agitação. Transcorrido este tempo, houve nova lavagem das placas

e 100 µl de cada amostra foram adicionados à placa. Paralelamente, para o

estabelecimento de cada curva padrão, foram utilizadas diferentes diluições das

quimiocinas, a partir das seguintes concentrações iniciais: TNF-α, 2000 pg/mL; IFN-γ,

2000 pg/mL; Kc/CXCL8, 1000pg/mL; MCP-1/CCL2, 500pg/mL; RANTES/CCL5,

2000pg/mL; MIG/CXCL9, 1000 pg/mL; MIP-1α/CCL3, 1000 pg/mL. As placas foram

incubadas por mais 18 h a 4

C. As placas foram lavadas e foram adicionados 100

µl/poço de solução de anticorpo de detecção, biotinilado e específico para cada

molécula. As placas foram incubadas por uma hora e foram lavadas em seguida.

Transcorrida esta etapa, foram adicionadas a cada placa uma solução contendo

estreptavidina ligada à peroxidase (HRP, Pharmingen). Após 30 minutos, a placa foi

novamente lavada, a continuação foi adicionado o tampão substrato contendo o-

fenilenodiamina (OPD, Sigma) e H

(Merck). Após cerca de 30 minutos, a reação foi

interrompida com 50 µl de ácido sulfúrico (H

) 1M. O produto da oxidação do OPD

foi detectado por colorimetria em leitor de placas a 492 nm (Molecular Devices, USA).

A concentração referente a cada amostra foi calculada a partir da curva padrão

correspondente.

4.9 - Análise estatística

Os dados foram analisados no programa Prisma 4.0 e apresentados com média +

erro padrão da média (EPM). Dados de parasitemia foram avaliados através do teste

Two-way ANOVA. Para análise estatística da sobrevida foi utilizado o teste

Generalized Wilcoxon. Os resultados da microscopia intravital foram submetidos à

análise de variância (One-way ANOVA) seguida pelo teste de Newman-Keuls, que

realiza comparações múltiplas. Para a contagem de leucócitos, dosagem de quimiocinas

e avaliação de permeabilidade vascular, o teste t-student foi realizado. A significância

estatística foi estabelecida em p<0,05.

5 5

5 -

- Resultados

Resultados Resultados

Resultados

5.1 - Evolução da parasitemia

O curso da infecção foi monitorado diariamente e a evolução da parasitemia foi

acompanhada através de esfregaços sangüíneos, a partir do terceiro dia pós-infecção. A

observação microscópica dos esfregaços sangüíneos confirmou a infecção em todos os

animais que desenvolveram aumento gradual de parasitemia (Gráfico 1), demonstrando

uma alta capacidade de multiplicação do parasito. Os animais C57Bl/6 tiveram a

parasitemia avaliada até sétimo dia pós-infecção, devido à morte precoce destes. Esta

linhagem, ainda, desenvolveu uma parasitemia menor quando comparado com os

animais BALB/c. Através de análise estatística, verificamos que esta evolução foi

significativamente diferente ao longo do tempo (p<0.0001) e, entre as linhagens no

sexto dia pós-infecção (p<0.01).

Diferentes formas evolutivas de P. berghei NK65 foram visualizadas nos

esfregaços sangüíneos analisados. Trofozoítos jovens e maduros e esquizontes foram

detectados no esfregaço. Também foram verificadas, nos esfregaços sangüíneos,

anormalidades morfológicas envolvendo a membrana celular dos eritrócitos (Figura 5).

Gráfico 1  Média das parasitemias diárias de camundongos BALB/c e C57Bl/6, a

partir do terceiro dia pós-infecção, infectados com P. berghei NK65 com um inóculo

padronizado de 10

hemácias parasitadas pela via intraperitoneal. A parasitemia foi

avaliada através de esfregaços sangüíneos sob microscopia óptica (aumento 1000X -

imersão). Os dados foram analisados pelo teste Two-way ANOVA, onde ** (p<0.01) e

*** (p<0,0001) indicam diferenças significativas entre os níveis de parasitemia entre as

linhagens, tanto no sexto dia pós-infecção quanto ao longo do curso da infecção (n=10

para cada grupo). O experimento foi repetido e confirmado.  representa a morte dos

animais.

3 4 5 6 7 8

BALB/c

C57Bl/6

***



Dias após a infecção

Parasitemia (%)

Figura 5- Fotomicrografias de esfregaços sangüíneos corados com Giemsa, X1000.

A- Parasitemia leve, com 3% de hemácias parasitadas, B- Parasitemia moderada, com

35% de hemácias parasitadas e C- Parasitemia acentuada, com 66% de hemácias

parasitadas, estas apresentando deformidades estruturais.

5.2 - Mortalidade

A infecção por P. berghei cepa NK65 desenvolveu-se de forma aguda com curso

letal para as duas linhagens. A mortalidade foi expressa como percentagem de sobrevida

e apresentou um perfil diferente para as duas linhagens (Gráfico 2). A mortalidade dos

animais da linhagem BALB/c iniciou-se no sétimo dia e perdurou até o décimo

primeiro, com um pico no oitavo dia pós-infecção. Os animais C57Bl/6 apresentaram

uma letalidade precoce, com intervalo de confiança (95%) nos dias seis e sete pós-

infecção. Houve diferenças significativas na sobrevida em relação ao tempo (p<0.0001)

e entre as linhagens (p<0.001).

5.3 - Sinais clínicos

A análise de variação da massa corporal dos animais de cada linhagem foi

mensurada em animais controle e infectados, ao longo do tempo (Gráfico 3). Os animais

infectados apresentaram uma perda de massa acentuada ao longo da infecção, sendo

compatíveis com as altas parasitemias e com a mortalidade dos animais. Animais

controle da linhagem BALB/c apresentaram um aumento gradual da massa ao longo das

observações. Já os animais infectados desta linhagem, no sexto dia pós-infecção,

apresentaram uma queda expressiva da massa (-10,99 ± 1,99 %), um quadro que

persiste no oitavo dia (-24,11 ± 0,60 %) (Gráfico 3-A). Para a linhagem C57Bl/6 foi

encontrado um perfil semelhante após a infecção. Os animais controle C57Bl/6

mantiveram o peso ao longo das observações, enquanto animais infectados

apresentaram uma perda da massa no sexto dia pós-infecção (-13,26 ± 2,38 %), que

também persistiu no oitavo dia (-14,69 ± 12,16 %) (Gráfico 3-B).

A observação das vísceras de camundongos infectados durante a necropsia

confirmou hepatoesplenomegalia, uma característica comum na infecção humana.

Notou-se também nestes animais, a partir do quinto dia pós-infecção, um processo de

anorexia, através da ausência de conteúdo estomacal e intestinal nos animais, o que

pode justificar a perda de peso nos animais. Os camundongos de ambas as linhagens,

BALB/c e C57Bl/6, também apresentaram hemoglobinúria a partir do sexto dia de

infecção.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

100

BALB/c

C57Bl/6

***

Dias após a infecção

Sobrevida (%)

Gráfico 2  Curva de sobrevida de camundongos BALB/c e C57Bl/6 expressa como

percentagem durante o curso da infecção. Os animais de ambas as linhagens foram

monitorados diariamente a partir da infecção com Plasmodium berghei NK65, com um

inóculo padronizado de 10

hemácias parasitadas pela via intraperitoneal. Para análise

estatística foi utilizado o teste Generalized Wilcoxon e *** indica diferença

significativa (p<0.001) na sobrevida entre as duas linhagens. (n=20 para linhagem

BALB/c e n=27 para animais C57Bl/6). Os resultados foram obtidos de três

experimentos independentes.

4 d 6 d 8 d 4 dpi 6 dpi 8 dpi

-30

-20

-10

Controle

Infectado

BALB/c

Variação da massa corporal (%)

4 d 6 d 8 d 4 dpi 6 dpi 8 dpi

-30

-25

-20

-15

-10

-5

Controle

Infectado

C57Bl/6

Variação da massa corporal (%)

Gráfico 3- Variação da massa corporal (%) de animais BALB/c (A) e C57Bl/6 (B)

infectados com Plasmodium berghei NK65, inóculo padronizado de 10

hemácias

parasitadas pela via intraperitoneal, em relação aos controles não-infectados. (n=10 para

o grupo infectado de cada linhagem e n=5 para o grupo controle).

5.4 - Histologia

Os animais não-infectados (Figuras 6A-D), juntamente com aqueles sacrificados

no primeiro e segundo dia pós-infecção, apresentaram aspecto histológico cerebral

compatível com quadro de normalidade.

A análise morfológica do cérebro confirmou que as alterações histopatológicas

tornaram-se mais evidentes ao longo da infecção. No terceiro dia pós-infecção, os

animais BALB/c mantiveram o padrão histológico compatível com normalidade. Por

outro lado, os animais C57Bl/6 já mostraram discretas alterações teciduais (Figura 7 A-

D). Foi possível observar neste grupo a presença de congestão, raros focos de

hemorragia e um predomínio de linfócitos no parênquima cerebral circunvizinho ao

vaso sangüíneo (Figura 7-D). A partir deste dia, em ambos os grupos, verificaram-se

alterações semelhantes às descritas na MC tais quais: congestão, hemorragia

parenquimal, discreto extravasamento de linfócitos, proliferação da glia, obstrução

vascular, edema, acúmulo de eritrócitos e acúmulo e adesão de leucócitos nos vasos.

O parasitismo das hemácias na luz dos vasos ou no parênquima tecidual foi

confirmado, a partir do sexto dia pós-infecção e variou entre os animais.

No sexto dia pós-infecção os animais BALB/c apresentaram alterações moderadas

(Figura 8 A-D) quando comparados aos animais C57Bl/6 (Figura 8 E-H) onde estas

alterações foram intensas. Em contrapartida, no nono dia pós-infecção, as alterações

histológicas dos animais BALB/c que sobreviveram até este período foram intensas

(Figura 9 A-H), semelhantes àquelas descritas para os animais C57Bl/6 no sexto dia de

infecção (Figura 8 E-H).

Figura 6 - Fotomicrografias representativas do córtex cerebral de camundongos

BALB/c e C57Bl/6 não-infectados. A- Aspecto histológico normal: ausência de

infiltrado inflamatório, alterações degenerativas ou hemorrágicas, 300X; B- Detalhe da

figura anterior, 600X; C- Grande vaso apresentando hemácias em sua luz, 300X,

Hematoxilina Eosina. D- Cerebelo: aspecto histológico normal, 600X, Cresil violeta.

Figura 7 - Fotomicrografias do córtex cerebral de camundongos C57Bl/6

infectados eutanaziados no terceiro dia de infecção. A, B e C- Vasos apresentando

hemácias e leucócitos aderidos ao endotélio, 600X; D- Infiltrado inflamatório discreto e

difusamente distribuído com predomínio de linfócitos (seta), 600X. A, B e D:

Hematoxilina Eosina. C: Cresil violeta.

Figura 8- Fotomicrografias do córtex-cerebral de camundongos infectados,

eutanaziados no sexto dia de infecção. BALB/c (A-D) e C57Bl/6 (E-H) A- Vaso

apresentando acúmulo moderado de hemácias e leucócitos na luz e aderidos ao

endotélio; hemorragia moderada, 300X; B- Detalhe da figura anterior, 600X; C- Foco

hemorrágico moderado e presença de infiltrado inflamatório moderado e difuso, 600X;

E- Intenso acúmulo e adesão de leucócitos e hemácias à parede endotelial, 600X; F e

G: Intensos focos hemorrágicos, X600, Hematoxilina Eosina. D e H- Vasos repletos de

hemácias; H- Hemorragia, 600X, Cresil violeta.

BALB/c C57Bl/6

Figura 9 - Fotomicrografias do córtex-cerebral de camundongos BALB/c

infectados, eutanaziados no nono dia de infecção. A- Córtex cerebral: inúmeros vasos

com intensa quantidade de hemácias e células inflamatórias, com adesão ao endotélio,

100X; B- Detalhe da figura anterior, 600X; C- Grande vaso apresentando hemácias e

monócitos acumulados na luz e aderidos ao endotélio com extravasamento de hemácias

para o interstício, 300X; D- Detalhe da figura anterior, 600X; E- Presença intensa de

focos hemorrágicos, 100X; F- Detalhe da figura anterior, 600X. G e H- Cerebelo:

hemorragia intensa, 600X. A-G: Hematoxilina Eosina H: Cresil Violeta.

5.5 - Interação leucócito-endotélio

As interações leucócito-endotélio na microvasculatura da pia-máter foram

avaliadas através da visualização de leucócitos marcados com o fluorocromo rodamina

6G, utilizando a técnica de microscopia intravital. A partir dos resultados da

histopatologia cerebral, demonstrando alterações morfológicas marcantes no quinto dia

pós-infecção, determinou-se esta data para a realização da microscopia intravital nos

animais infectados. Animais que foram submetidos à técnica em uma data posterior ao

5º dia de infecção não sobreviveram aos procedimentos, uma vez que estavam muito

debilitados. Animais infectados de ambas as linhagens apresentaram aumento nos

processos de rolamento e adesão leucocitária no endotélio cerebral, etapas envolvidas

no mecanismo de recrutamento de leucócito durante processo inflamatório (Figura 10).

Camundongos BALB/c com cinco dias de infecção apresentaram aumento no

processo de rolamento de leucócitos (11,74 ± 3,17 leucócitos rolando/min) em relação

aos animais controle da mesma linhagem (0,51 ± 0,22 leucócitos rolando/min). A

diferença foi significativa quando comparamos estes grupos (**p<0,01). Os animais

C57Bl/6 apresentaram o mesmo perfil, com aumento significativo (***p<0,001) no

processo de rolamento no grupo infectado (25,82 ± 3,21 leucócitos rolando/min) em

relação aos animais controle (0,72 ± 0,12 leucócitos rolando/min) (Gráfico 4-A).

Ao compararmos o perfil dos eventos de rolamento de leucócitos entre os

animais infectados das duas linhagens (BALB/c X C57Bl/6) também encontramos

diferença significativa (**p<0.01), com o grupo C57Bl/6 apresentando o maior valor

neste parâmetro (Gráfico 4-A).

Nos camundongos BALB/c infectados, o número de leucócitos aderidos no

endotélio dos vasos da pia-máter (37,29 ± 9,69 leucócitos aderidos/100µm) foi superior

ao observado no grupo de animais controle (1,29 ± 0,61 leucócitos aderidos/100µm). A

diferença foi estatisticamente significativa quando comparamos estes grupos

(**p<0,01). Os animais C57Bl/6 apresentaram o mesmo perfil, com aumento

significativo (***p<0,001) no número de leucócitos aderidos no endotélio dos vasos da

pia-máter do grupo infectado (18,45 ± 1,555 leucócitos aderidos/100µm) em relação aos

animais controle (1,18 ± 0,22 leucócitos aderidos/100µm) (Gráfico 4-B).

Ao avaliarmos o perfil dos eventos de adesão entre os animais infectados das

duas linhagens (BALB/c X C57Bl/6) também observamos diferença significativa

(p<0.001), sendo os animais Balb/c os que apresentam maior número de adesão

(Gráfico 4-B).

Figura 10  Micrografia de videomicroscopia intravital demonstrando o aumento de

leucócitos em processo de rolamento e adesão na microvasculatura da pia-máter de

camundongos infectados com P. berghei NK65 (B) em relação a animais controle (A).

Controle Infectado

Balb/c jovem

C57Bl/6 jovem

Número de leucócitos rolando/minuto

***

Controle Infectado

Balb/c jovem

C57Bl/6 jovem

***

Número de leucócitos aderidos/

área (100

)

Gráfico 4  Número de leucócitos em processo de rolamento (A) e de adesão (B) na

microvasculatura da pia-máter de camundongos BALB/c e C57Bl/6. Grupo de animais

com cinco dias de infecção (n=7 para cada linhagem), com inóculo padronizado de 10

hemácias parasitadas pela via intraperitoneal, em comparação ao grupo controle não-

infectado (n=7 para cada linhagem). Os resultados foram submetidos à análise de

variância seguida do teste de Newman-Keuls, onde ** (p<0.01) e *** (p<0.001)

representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos assinalados.

5.6  Contagem total e diferencial de leucócitos

A contagem total de leucócitos no sangue periférico dos diferentes grupos

experimentais demonstrou uma diminuição destas células nos animais infectados em

relação aos respectivos controles. Animais BALB/c infectados apresentaram uma média

inferior de células totais (5,13 x 10

± 7,62 x 10

leucócitos/mL) em relação a animais

controle (7,71 x 10

± 1,06 x 10

leucócitos/mL), com p=0,0646. Tal dado demonstra

uma tendência para a diminuição do número de leucócitos no sangue periférico de

animais infectados, porém sem diferença significativa. Os animais da linhagem C57Bl/6

apresentaram um perfil diferenciado, com animais infectados apresentando um menor

número de leucócitos totais (2,68 x 10

± 3,62 x 10

leucócitos/mL) em relação ao grupo

controle (6,14 x 10

± 8,21 x 10

leucócitos/mL), com p< 0,01 (Gráfico 5).

A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em esfregaços sangüíneos

corados com May-Gruwald e Giemsa, o que permitiu a identificação e quantificação dos

diferentes tipos celulares presentes no sangue periférico dos animais infectados e

controles. As médias percentuais (Tabela 1) demonstram que animais BALB/c

infectados (5dpi) e controles mantiveram o perfil dos tipos celulares. Já os animais

infectados da linhagem C57Bl/6 apresentaram uma modificação nas médias percentuais

dos tipos celulares, em relação aos animais controle. Houve uma diminuição

significativa (p<0.001) na proporção de linfócitos presentes no sangue periférico de

animais infectados (33,9 ± 4,5%) em relação ao grupo controle (62,4 ± 2,5%). Um perfil

semelhante foi obtido para monócitos (p<0.001), com valores de 37,7 ± 3,7% e 18,6 ±

1,7% para animais infectados e controle, respectivamente. Já a população percentual de

neutrófilos sofreu um incremento significativo (p<0.05) nos animais infectados 28,1 ±

1,7% em relação ao controle 18,8 ± 1,7%.

Entretanto, a avaliação mais adequada para verificar a alteração da quantidade de

determinado tipo celular é realizada através da quantificação do tipo celular/mL. A

mudança significativa no perfil de células em animais infectados em comparação aos

controles ocorreu apenas na população de linfócitos, com diminuição nos animais

infectados. Nos animais BALB/c, houve uma redução de linfócitos, p<0,01, nos animais

infectados (2,06 x 10

± 0,31 x 10

linfócitos/mL) em relação ao grupo controle (3,95 x

± 0,94 x 10

linfócitos/mL). Na linhagem C57Bl/6, o perfil foi semelhante, com

p<0,001 (Tabela 2).

B/c co

trol

nfe

tro

6 i

3.0×10

6.0×10

9.0×10

Leucócitos/mL

Gráfico 5  Número total de leucócitos no sangue periférico de camundongos BALB/c

e C57Bl/6. Animais com cinco dias de infecção (n=8 para ambas as linhagens), inóculo

padronizado de 10

hemácias parasitadas pela via intraperitoneal, em relação ao grupo

controle não-infectado (n=7 para ambas as linhagens). Os resultados de cada linhagem

foram submetidos ao teste t-student, onde ** (p<0.01) representa diferença significativa.

Tabela 1. Número percentual dos tipos celulares presentes no sangue periférico de

camundongos BALB/c e C57Bl/6 (%).

Grupos

Linfócitos

Neutrófilos

Monócitos

Eosinófilos

BALB/c controle

40,0 ± 3,7 37,9 ± 3,1 22,1 ± 2,7 0,0 ± 0,0

BALB/c infectado

40,6 ± 2,2 43,2 ± 3,7 15,6 ± 2,1 0,4 ± 0,3

C57Bl/6 controle

62,4 ± 2,5 19,9 ± 2,5 18,6 ± 1,7 0,6 ± 0,3

C57Bl/6 infectado

33,9 ± 4,5

28,1 ± 1,7

37,7 ± 3,7

0,2 ± 0,2

Número percentual de leucócitos no sangue periférico de camundongos BALB/c

e C57Bl/6. Animais infectados (n=8 para ambas as linhagens), cinco dias pósinfecção,

com Plasmodium berghei NK65, com inóculo padronizado de 10

hemácias parasitadas

pela via intraperitoneal, em relação aos controles não-infectados (n=7 para ambas as

linhagens). Os resultados de cada tipo celular foram submetidos ao teste t-student, onde

p<0,001 e

p<0,05 quando comparados com o grupo C57Bl/6 controle.

Tabela 2. Quantificação diferencial dos tipos celulares presentes no sangue periférico

de camundongos BALB/c e C57Bl/6 (x 10

células/mL).

Grupos

Linfócitos

Neutrófilos

Monócitos

Eosinófilos

BALB/c controle

3,95 ± 0,94

2,98

± 0,41 1,03

± 0,20 0,00 ± 0,00

BALB/c infectado

2,06

± 0,31

2,18

± 0,36

0,85

± 0,22

0,02

± 0,01

C57Bl/6 controle

3,73

± 0,62

1,09

± 0,20

1,15

± 0,20

0,03

± 0,02

C57Bl/6 infectado

0,88

± 0,17

0,74

± 0,10

1,05

± 0,21

0,00 ± 0,00

Número diferencial de leucócitos no sangue periférico de camundongos BALB/c

e C57Bl/6. Animais infectados (n=8 para ambas as linhagens), cinco dias pósinfecção,

com Plasmodium berghei NK65, com inóculo padronizado de 10

hemácias parasitadas

pela via intraperitoneal, em relação aos controles não-infectados (n=7 para ambas as

linhagens). Os resultados de cada tipo celular foram submetidos ao teste t-student, onde

p<0,01 quando comparado com BALB/c controle e

p<0,001 quando comparado com

C57Bl/6 controle.

5.7 - Avaliação da permeabilidade vascular

Através da quantificação do extravasamento do corante de azul de Evans

para o parênquima cerebral pode-se avaliar indiretamente a permeabilidade da BHE.

Através da determinação espectrofotométrica da quantidade de azul de Evans presente

no tecido cerebral, verificou-se um aumento significativo da concentração do corante no

parênquima cerebral de animais infectados (5dpi) em relação ao grupo controle, para

ambas as linhagens. Desta forma, há indícios de modificações na permeabilidade da

BHE em decorrência da infecção.

Animais infectados da linhagem BALB/c apresentaram uma concentração

superior do corante no parênquima cerebral (9,65 ± 1,08 pg de azul de Evans/100mg de

tecido cerebral), quando comparados com o grupo controle (6,40 ± 0,38 pg de azul de

Evans/100mg de tecido cerebral), com p<0,05 (Gráfico 6).

Camundongos C57Bl/6 não-infectados apresentaram uma concentração menor

de azul de Evans no tecido cerebral (4,28 ± 0,67 pg de azul de Evans/100mg de tecido

cerebral) em relação ao grupo dos animais infectados (9,26 ± 1,23 pg de azul de

Evans/100mg de tecido cerebral), com p<0,01 (Gráfico 6).

Gráfico 6 - Concentração do corante azul de Evans extravasado para o parênquima

cerebral de camundongos BALB/c e C57Bl/6. Animais com cinco dias de infecção (n=6

para ambas as linhagens), inóculo padronizado de 10

hemácias parasitadas pela via

intraperitoneal, em relação ao grupo controle não-infectado (n=6 para ambas as

linhagens). Os resultados de cada linhagem foram submetidos ao teste t-student, onde *

(p<0,05) e ** (p<0.01) representam diferenças significativas.

ALB/c

ole

l/6 c

ntrole

C57B

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

Azul de Evans

(pg/100mg de tecido)

5.8 - Dosagem das citocinas TNF-α e IFN-γ e das quimiocinas Kc/CXCL8,

MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5.

Considerando que houve um aumento no recrutamento de leucócitos na

microcirculação cerebral após a infecção com P. berghei NK65, foi realizada a

quantificação, in locu, de citocinas e quimiocinas no tecido cerebral de animais controle

e infectados. Adicionalmente, a concentração de TNF-α foi mensurada também no soro

dos animais para avaliar uma possível participação sistêmica desta citocina na

patogênese da infecção.

Portanto, avaliamos as concentrações das citocinas TNF-α e IFN-γ e quimiocinas

Kc/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 em

sobrenadante de homogenato de cérebro e soro de camundongos infectados (n=10) com

P. berghei NK65 e animais controle sem infecção (n=8) das diferentes linhagens.

A concentração de TNF-α no homogenato de cérebro apresentou aumentada nos

animais BALB/c infectados (63,25 ± 4,53 pg/mL) em relação ao seu controle (48,64 ±

5,15 pg/mL), porém sem nível de significância. Em contrapartida, um perfil distinto foi

encontrado nos animais da linhagem C57Bl/6, onde animais infectados (63,38 ± 5,43

pg/mL) apresentaram uma concentração maior que os animais controles (41,65 ± 3,41

pg/mL), com p< 0,01 (Gráfico 7-A).

A quantificação desta citocina no soro dos animais demonstrou um aumento

significativo da sua concentração nos animais infectados em relação a animais controle.

Em animais da linhagem BALB/c, a concentração foi de 15,23 ± 8,09 pg/mL nos

controles e 108,2 ± 31,16 pg/mL em animais infectados (p< 0.001). Em animais

C57Bl/6 do grupo controle e infectado, as concentrações foram, respectivamente, 0,0 ±

0,0 pg/mL e 43,99 ± 5,72 pg/mL, com p< 0.001 (Gráfico 7-B).

A concentração da citocina IFN-γ em homogenato de cérebro não apresentou

diferença estatística entre animais infectados (131,5 ± 8,6 pg/mL) e controle (145,0 ±

5,64 pg/mL) da linhagem BALB/c. Contudo, animais da linhagem C57Bl/6

apresentaram aumento da concentração no grupo infectado (169,1 ± 10,69 pg/mL) em

relação ao controle (134,9 ± 4,77 pg/mL), com p< 0,05 (Gráfico 8-A).

O nível da quimiocina Kc/CXCL8 no cérebro não sofreu variação após a infecção.

Camundongos BALB/c não-infectados apresentaram a concentração desta quimiocina

de 237,9 ± 31,00 pg/mL enquanto no grupo infectado foi de 310,2 ± 30,49 pg/mL, com

p>0.05. Animais controles da linhagem C57Bl/6 apresentaram uma concentração de

265,7 ± 35,34 pg/mL e os animais infectados 340,0 ± 31,57 pg/mL, com p>0,05

(Gráfico 8-B).

A concentração da quimiocina MIG/CXCL9 sofreu variação significativa no

tecido cerebral após a infecção. Camundongos BALB/c não-infectados apresentaram a

concentração desta quimiocina de 66,24 ± 10,11 pg/mL enquanto no grupo infectado foi

de 352,1 ± 60,25 pg/mL (p<0,001). Animais controles da linhagem C57Bl/6

apresentaram uma concentração de 63,71 ± 9,06 pg/mL e os animais infectados 169,2 ±

16,19 pg/mL, com p<0,001 (Gráfico 8-C).

Após a infecção com P. berghei NK65, houve um aumento não-significativo da

quimiocina MIP-1α/CCL3 no cérebro de camundongos BALB/c (13,39 ± 4,39 pg/mL)

em relação aos animais não infectados (0 ± 0 pg/mL), com p>0.05. Já nos camundongos

C57Bl/6, a concentração desta quimiocina em condição controle foi 30,1 ± 7,16 pg/mL

e em animais infectados foi 45,08 ± 12,31 pg/mL, com p<0,05 (Gráfico 8-D).

Ao avaliarmos a quimiocina MCP-1/CCL2 em camundongos BALB/c, houve

um aumento significativo (p< 0.001) na produção desta quimiocina. No grupo controle

a concentração foi de 295,3 ± 29,53 pg/mL e no grupo infectado uma concentração de

900,5 ± 111,6 pg/mL. Da mesma forma, nos camundongos C57Bl/6, encontramos uma

diferença significativa (p<0,001) entre os animais controle (267,6 ± 25,33 pg/mL) e os

animais infectados (1023 ± 101,7 pg/mL) (Gráfico 8-E).

Adicionalmente, observamos um aumento da concentração da quimiocina

RANTES/CCL5 no tecido cerebral de camundongos BALB/c infectados (310,8 ± 85,66

pg/mL) quando comparamos com o grupo controle (154,3 ± 25,54 pg/mL), entretanto

este aumento não foi significativo (p>0.05). Camundongos C57Bl/6 infectados

apresentaram um aumento significativo da concentração desta quimiocina (232,0 ±

37,93 pg/mL) quando comparado com os animais controle (27,24 ± 6,64 pg/mL), com

p<0,001 (Gráfico 8-F).

Houve, portanto, um aumento significativo dos níveis das citocinas TNF-α e

IFN-γ e das quimiocinas MIG/CXCL9, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 nos animais

C57Bl/6 infectados, com relação aos respectivos controles. Enquanto o aumento das

concentrações na linhagem BALB/c foi significativo apenas para o TNF-α sistêmico e

para as quimiocinas MIG/CXCL9 e MCP-1/CCL2.

Gráfico 7 - Níveis da concentração da citocina TNF-α em sobrenadante de homogenato

de cérebro (A) e em soro (B) de camundongos BALB/c e C57Bl/6. Animais com cinco

dias de infecção (n=10 para ambas as linhagens), inóculo padronizado de 10

hemácias

parasitadas pela via intraperitoneal, em relação ao grupo controle não-infectado (n=8

para ambas as linhagens). Os resultados de cada linhagem foram submetidos ao teste t-

student, onde ** (p<0.01) e *** (p<0.001) representam diferenças significativas. ND-

não detectado.

Cérebro

B/c cont

B/c in

ect

57B

l/6 co

tro

C57Bl/6 infectado

100

TNF-

pg/mL

Soro

ntrole

ado

/6 con

/6 i

tado

100

***

TNF-

pg/mL

Gráfico 8 - Níveis da concentração da citocina IFN-γ (A) e das quimiocinas Kc/CXCL8

(B), MIG/CXCL9 (C), MIP-1α/CCL3 (D), MCP-1/CCL2 (E) e RANTES/CCL5 (F) em

sobrenadante de homogenato de cérebro de camundongos BALB/c e C57Bl/6. Animais

com cinco dias de infecção (n=10 para ambas as linhagens), inóculo padronizado de 10

hemácias parasitadas pela via intraperitoneal, em relação ao grupo controle não-

infectado (n=8 para ambas as linhagens). Os resultados de cada linhagem foram

submetidos ao teste t-student, onde * (p<0.05), ** (p<0.01) e *** (p<0.001)

representam diferenças significativas. ND- não detectado.

LB/

B/c

100

150

200

IFN-

pg/mL

BALB/c controle

BALB/c

ado

C57

C57Bl/6

ado

100

200

300

400

Kc/CXCL8 (pg/mL)

BAL

BALB

c i

fectado

C57B

C57Bl

6 i

fectado

100

200

300

400

500

***

MIG/CXCL9 (pg/mL)

ontrole

MIP-1

/CCL3 (pg/mL)

LB/

B/c

200

400

600

800

1000

1200

***

MCP-1/CCL2 (pg/mL)

BALB/

BALB/c infectado

C57Bl/6 controle

C57Bl/6 infectado

100

200

300

400

***

RANTES/CCL5 (pg/mL)

6 6

6 -

- D iscussão

D iscussão D iscussão

D iscussão

Parâmetros parasitológicos e clínicos da infecção em camundongos BALB/c e

C57Bl/6 jovens

Este estudo permitiu caracterizar, através de parâmetros parasitológicos e

imunológicos, a infecção por P. berghei NK65 e avaliar aspectos envolvidos na

patogênese do modelo de MC experimental em duas linhagens, BALB/c e C57Bl/6,

descritas na literatura com perfis distintos de resistência e susceptibilidade para a cepa

de P. berghei ANKA.

Ambas as linhagens apresentaram uma evolução gradual e progressiva da

parasitemia. Porém, os animais C57Bl/6 desenvolveram uma parasitemia de forma mais

branda, quando comparada com os animais BALB/c, com diferença significativa no

sexto dia pós-infecção. Em contrapartida, aquela linhagem apresentou mortalidade

precoce. Desta forma, a taxa de parasitemia e a sobrevida não podem ser explicadas por

uma relação direta. Portanto, diante destes dados, podemos sugerir que P. berghei NK65

causa uma infecção de curso agudo e letal mais pronunciado na linhagem C57Bl/6,

considerada susceptível pela literatura.

Os animais infectados das duas linhagens apresentaram perda de peso acentuada

ao longo da infecção, sendo compatível com as altas parasitemias e o óbito dos animais.

Animais com parasitemia acentuada apresentaram uma tendência para deformidades

estruturais dos eritrócitos. Sabe-se que o parasito é capaz de induzir inúmeras alterações

no eritrócito parasitado, evidentes principalmente na membrana celular. Alterações em

proteínas de membrana, como a calmodulina e ATPase, são descritas e acarretam em

modificações no equilíbrio iônico da célula (Kirk, 2001).

Diferentes formas evolutivas do P. berghei NK65 foram observadas nos

esfregaços sangüíneos analisados durante o curso da infecção. Desta forma, podemos

sugerir uma multiplicação assincrônica das diferentes formas de desenvolvimento

sangüíneo do parasito. Infecções múltiplas de eritrócitos, com poliparasitismo

extensivo, também foram identificadas, um fato que pode ser decorrente da baixa

especificidade de invasão das hemácias pelos merozoítos desta espécie.

Sabe-se que o baço exerce um papel crucial na eliminação do parasito da

circulação (ALVES et al., 1996). A hepatoesplenomegalia verificada durante a necropsia

pode ser sugestiva para o quadro de retenção destas formas nestes órgãos. Os animais de

ambas as linhagens também apresentaram hemoglobinúria a partir do sexto dia de

infecção, sugerindo uma hemólise intravascular excessiva e intensa em conjunto com o

comprometimento renal nestes animais.

Cabe ressaltar que componentes do parasito, liberados após a ruptura dos

eritrócitos infectados, são potencialmente envolvidos na produção de resposta

inflamatória, como o glicosilfosfatidilinositol (GPI). A GPI é uma molécula ubíqua e

expressa em abundância em parasitos, sendo envolvida primariamente no ancoramento

de certas proteínas de superfície celular. Esta molécula, em sinergismo com o IFN-γ, é

capaz de induzir a liberação de citocinas (TNF-α e IL-1) envolvidas no

desenvolvimento da resposta imune pelo hospedeiro (SCHOFIELD & HACKETT, 1993).

O processo de anorexia verificado nos animais, através da ausência de conteúdo

estomacal e intestinal, pode ser conseqüência da produção prolongada e sistêmica de

TNF-α, capaz de gerar graves distúrbios metabólicos (GRIMBLE, 1998; TRUJILLO et al.,

2003). A caquexia, que leva à supressão do apetite, é caracterizada pelos eventos de

anorexia, perda de peso e depleção das reservas protéicas e lipídicas (MATTHYS &

BILLIAU, 1997). O envolvimento de TNF-α nesta síndrome tem sido amplamente

estudado, inclusive em outros modelos animais de doenças parasitárias. Animais

BALB/c infectados por Trypanosoma cruzi desenvolvem os processos de caquexia

durante a fase aguda da infecção, um quadro que pode ser revertido após tratamento

com anticorpo monoclonal anti-TNF-α (TRUYENS et al., 1995). Os sinais da

manifestação e a conseqüente perda de massa corporal verificados nos animais

infectados por P. berghei NK65 guardam relação direta com as altas taxas de

parasitemia e aumento sistêmico da concentração de TNF-α, em ambas as linhagens,

dado constatado no quinto dia pós-infecção.

A falta de sinais clínicos evidentes para avaliar de forma precisa os sintomas

clássicos do comprometimento cerebral (coma e paralisia), dificultou a investigação

desta manifestação nos animais estudados.

Sabe-se que a infecção por P. berghei exibe uma resposta imune marcante, com os

animais apresentando manifestações clínicas sistêmicas. Tal dado somado aos

resultados obtidos neste trabalho sugere que a infecção por P. berghei NK65 também

causa uma doença com acometimento multi-sistêmico nos animais das linhagens

estudadas.

Alterações histopatológicas

É sabido que a malária é uma doença sistêmica, com acometimento em vários

órgãos. Desta forma, o comprometimento cerebral pode ser extenso, caracterizado por

edema cerebral, hemorragias cerebrais e infiltrado de leucócitos.

Através da análise histopatológica, demonstrou-se que animais C57Bl/6, no

terceiro dia pós-infecção, apresentaram alterações cerebrais precoces em relação aos

animais da linhagem BALB/c. No sexto dia pós-infecção, as alterações histopatológicas

foram mais acentuadas nos animais C57Bl/6 em relação à outra linhagem. Em

contrapartida, a análise histológica em animais BALB/c no nono dia pós-infecção

revelou um quadro histológico semelhante àquele descrito para C57Bl/6 no sexto dia.

Assim, podemos verificar que o desenvolvimento de lesões cerebrais em decorrência da

infecção foi mais intenso e precoce em camundongos da linhagem C57Bl/6 em relação

à linhagem BALB/c. Tal fato pode estar relacionado a morte precoce naquela linhagem

e comprova uma resposta diferencial das linhagem do hospedeiro frente a infecção por

P. berghei NK65. Este resultado corrobora os dados encontrados por Amani et al.,

(1998), que sugeriram que diferentes linhagens do hospedeiro apresentavam relevância

para o desenvolvimento de MC, da mesma forma que diferenças entre parasitos

parecem ter igual importância na determinação da virulência.

As análises histopatológicas de cérebros de camundongos infectados revelaram, a

partir do terceiro dia de infecção, alterações semelhantes às descritas na MC que

refletem as perturbações locais induzidas pela infecção. Desta forma, não podemos

descartar o envolvimento cerebral nestes animais, em conjunto com outras repercussões

acarretadas pela infecção.

Um estudo utilizando a cepa NK65 de P. berghei demonstrou que a infecção com

a forma sangüínea do parasito em camundongos C57Bl/6 causa infiltrado de células

mononucleares no fígado e, conseqüentemente, dano hepático maciço (YOSHIMOTO et

al., 1998). No nosso estudo, através da análise histopatológica do tecido hepático, foi

encontrado um perfil de lesão nas duas linhagens (dados não mostrados), que pode ser

um dos fatores diretamente envolvidos na patogênese da manifestação grave que

acometeu os animais. Entretanto, não foi objetivo deste trabalho avaliar o envolvimento

hepático neste modelo.

Avaliação da resposta inflamatória cerebral através da técnica de microscopia

intravital

Sob condições normais, os leucócitos são mantidos no centro dos vasos

sangüíneos. Durante a resposta inflamatória, a indução de moléculas de adesão nas

células endoteliais, bem como na superfície dos leucócitos, favorece o deslocamento

destes para a periferia dos vasos e, conseqüentemente, a interação com o endotélio e

extravasamento vascular. Na malária, as moléculas de adesão estão envolvidas no

seqüestro das células dentro da microcirculação cerebral e em outros órgãos. Além de

ICAM-1, outras moléculas de adesão, como P-seletina (UDOMSANGPECH et al., 1997),

VCAM-1 (JACKOBSEN et al., 1994) e PECAM-1 (TREUTIGER et al., 1997), parecem

estar implicadas no mecanismo de adesão do eritrócito parasitado ao endotélio. Além de

apresentarem um papel importante no mecanismo de interação eritrócito-endotélio, as

moléculas de adesão estão envolvidas nas interações leucócito-endotélio (CHANG et al.,

2003) e plaqueta-endotélio (SUN et al., 2003), as quais já foram descritas em modelos

experimentais de malária grave. Uma característica importante de se salientar é a

analogia entre seqüestro de eritrócitos parasitados e recrutamento de leucócitos. Já foi

demonstrado que a ligação de eritrócitos não é unicamente estática, uma vez que pode

acontecer uma interação semelhante ao processo de rolamento (COOKE et al., 1994).

No presente estudo, através da técnica de microscopia intravital nos vasos da

pia-máter, foram verificadas as interações leucócitos-endotélio durante o processo de

recrutamento. O potencial aumento do recrutamento basal induzido pela manipulação

cirúrgica foi considerado, o que justifica o uso de animais sem infecção que são

submetidos a todos os procedimentos da técnica e utilizados como controle.

Foi verificado nas duas linhagens, através do uso desta técnica, um aumento

significativo no número de leucócitos em processo de rolamento e adesão nos animais

infectados (5dpi) em relação a animais controles não-infectados. Estes resultados foram

corroborados com os dados da análise histopatológica, demonstrando um aumento do

influxo de leucócitos para o parênquima cerebral e lesão inflamatória dos animais

infectados quando comparados com o grupo controle. Uma importante limitação da

técnica é a incapacidade de distinguir as subpopulações de leucócitos recrutados

(neutrófilos, eosinófilos, monócitos, linfócitos T), o que deve ser realizado por

metodologias complementares (LEY, 2001). Através da análise histopatológica realizada

no tecido cerebral de animais infectados, verificou-se um acúmulo de linfócitos no

parênquima cerebral de animais C57Bl/6 infectados, como demonstrado na Figura 7-D.

Desta forma, a diminuição deste tipo celular no sangue periférico de ambas as

linhagens, detectada através de esfregaço sangüíneo no quinto dia pós-infecção, pode

ser conseqüência direta do recrutamento predominante de linfócitos para o parênquima

cerebral e de outros órgãos, como fígado e baço (dados não mostrados).

Para a técnica de microscopia intravital, as características do tecido avaliado

apresentam relevância e devem ser consideradas. A investigação do recrutamento de

leucócitos por microscopia intravital em tecidos translúcidos, como mesentério e fáscia

espermática, permite que as etapas de rolamento, adesão e transmigração possam ser

visualizadas sem a utilização de métodos de contraste. Entretanto, para órgãos não

translúcidos, como o tecido cerebral, o estudo é viável somente com a utilização da

epifluorescência, e permite a visualização dos processos de rolamento e adesão (LEY,

2001). Visto que a adesão é uma etapa essencial para que ocorra a transmigração através

do endotélio para o sítio de inflamação (KERFOOT & KUBES, 2002), o aumento da

adesão leucocitária observado pela microscopia intravital está diretamente associado ao

infiltrado inflamatório identificado nos animais infectados por técnicas histológicas.

Os resultados da microscopia intravital demonstraram uma diferença numérica não

proporcional entre os eventos de rolamento e adesão de leucócitos, quando se analisa

cada linhagem. Camundongos infectados da linhagem BALB/c apresentaram menor

número de células rolando (11,74 ± 3,166 células rolando/min) em relação ao número

de células aderidas (37,29 ± 9,690 células aderidas/100µm). Um perfil oposto foi

verificado nos animais C57Bl/6 infectados, com predomínio de células em processo de

rolamento (25,82 ± 3,212 células rolando/min) em relação ao número de células

aderidas (18,45 ± 1,555 células aderidas/100µm). Entretanto, sabe-se que os processos

de rolamento e adesão são dois eventos moleculares distintos, onde o rolamento não é

um pré-requisito obrigatório para a adesão. A importância do rolamento na

microcirculação cerebral não foi totalmente esclarecida. Estudos demonstraram que um

rolamento transiente pode acarretar em adesão rápida de leucócitos, em um processo

facilitado por plaquetas ligadas a microcirculação, que também expressam P-seletina.

Assim, na microcirculação cerebral, os leucócitos podem interagir preferencialmente

nas plaquetas do que diretamente no endotélio cerebral (CARVALHO-TAVARES et al.,

2000). Desta forma, parâmetros fisiológicos, como interação de leucócitos a outros

elementos sangüíneos e propriedades do endotélio, modulam e determinam o sucesso do

recrutamento (LEY, 2001).

Adicionalmente, o acúmulo de leucócitos e plaquetas na microcirculação cerebral

tem papel direto na patogênese da MC, sendo capaz de amplificar os processos

inflamatórios. Estudos demonstram que plaquetas podem estar diretamente envolvidas

na citoaderência de eritrócitos parasitados, uma vez que podem atuar como ponte entre

as células endoteliais e o eritrócito, em um mecanismo alternativo. Entretanto, este

modelo proposto não exclui o já existente  o de adesão direta do eritrócito ao endotélio

(WASSMER et al., 2004). A adesão de plaquetas a células endoteliais é estimulada por

TNF-α, durante uma condição inflamatória (LOU et al., 1997). Estudos postmortem em

crianças africanas com MC têm demonstrado acúmulo de plaquetas no sítio de seqüestro

de eritrócitos parasitados (GRAU et al., 2003).

A adesão de eritrócitos parasitados, leucócitos e plaquetas podem resultar na

disfunção da BHE, com efeitos deletérios sobre a integridade do endotélio (WASSMER et

al., 2006). Já foi reportado que neutrófilos e plaquetas podem acumular no tecido e/ou

são capazes de produzir moléculas citolíticas, como metaloproteinases, que podem lesar

as células endoteliais (CHEN et al., 2000; GRAU et al., 2003). A liberação de

micropartículas por plaquetas pode alterar o metabolismo das células do endotélio,

induzindo a produção de ciclooxigenase-2 (COX-2) e prostaglandinas (PG), que podem

afetar a permeabilidade vascular e induzir apoptose de células endoteliais (BALLABH et

al., 2004).

Alteração na permeabilidade vascular da BHE

Durante condições inflamatórias, vários mediadores químicos liberados, como a

bradicinina, a ciclooxigenase-2 (COX-2) e prostaglandinas (PG), induzem o aumento da

permeabilidade da barreira, facilitando o acesso de leucócitos ativados para o

parênquima do SNC (BALLABH et al., 2004). O aumento do tráfego de leucócitos para o

parênquima cerebral, comprovado por estudos de microscopia intravital e histologia,

sugere possíveis alterações na permeabilidade da BHE. Vários estudos têm demonstrado

que a BHE é comprometida durante a infecção por P. berghei ANKA (PIGUET et al.,

2000; THUMWOOD et al., 1988). Estudos utilizando o extravasamento de corantes para o

parênquima cerebral têm demonstrado que a permeabilidade vascular é marcadamente

aumentada no cérebro, sendo um importante evento para a patogênese da malária (VAN

DE HEYDE et al., 2001). Neill & Hunt (1992), em um estudo utilizando camundongos

CBA infectados com P. berghei ANKA, reportaram o aumento do extravasamento do

corante azul de Monostral em todos os órgãos analisados (cérebro, pulmão, fígado, baço

e rim). Desta forma, para comprovar a hipótese de aumento da permeabilidade vascular

da BHE neste modelo, utilizou-se um protocolo de permeabilidade da BHE através da

determinação espectrofotométrica do corante azul de Evans extravasado da vasculatura

para o tecido cerebral.

O azul de Evans quando injetado na corrente sangüínea se liga a proteínas

plasmáticas, especialmente a albumina. Alterações na permeabilidade vascular

acarretam a saída do corante do lúmen vascular para o tecido intersticial. Estudos

demonstraram que na malária experimental, o escape do corante para o parênquima

cerebral coincide com áreas de hemorragias (VAN DE HEYDE et al., 2001). O dano

endotelial acarretado por mediadores inflamatórios tem sido implicado como uma causa

provável da disfunção da integridade da BHE (WASSMER et al., 2006).

Os resultados da quantificação do extravasamento do azul de Evans indicam um

grau de disfunção da BHE em animais infectados, com cinco dias de infecção, em

relação aos animais controle. Este dado comprova a disfunção da BHE acarretada pela

infecção e demonstra a capacidade desta metodologia para avaliação da permeabilidade

vascular da barreira de animais infectados com P. berghei NK65.

Entretanto, o mecanismo de passagem de macromoléculas, como proteínas,

através da barreira endotelial cerebral em condições inflamatórias tem sido

extensivamente debatido, com alguns resultados controversos. O incremento desta

permeabilidade vascular pode estar associado tanto ao aumento dos eventos de

pinocitose quanto à disfunção das junções inter-endoteliais na BHE (RISAU &

WOLBURG, 1990). Outro possível mecanismo que justifica esta disfunção pode envolver

a destruição do endotélio em decorrência dos eventos apoptóticos induzidos por vários

tipos celulares, como eritrócitos, plaquetas e leucócitos (WASSMER et al., 2006).

Esta alteração funcional da BHE seria pré-requisito necessário para

desenvolvimento e formação de edema cerebral, como demonstrado por Favre et al.

(1999). Tal dado vai de encontro ao verificado nos achados histopatológicos do nosso

trabalho, sugerindo que o edema observado é conseqüência do extravasamento de

líquido excessivo decorrente da disfunção da barreira. Alterações do metabolismo

acarretadas pela infecção, como o aumento da concentração de lactato, em conjunto

com a disfunção da BHE, podem ter implicações diretas no SNC e na mortalidade dos

animais (PENET et al., 2005).

Nossos resultados demonstram que o tecido cerebral apresentou uma mudança

pronunciada na permeabilidade vascular nos animais infectados em relação aos animais

controle.

Adicionalmente, é necessário destacar que a técnica utilizando o azul de Evans

tem se mostrado eficaz e equivalente a metodologias utilizando marcação radioativa

(VAN DE HEYDE et al., 2001).

Quantificação da concentração das citocinas e quimiocinas

A produção de citocinas pró-inflamatórias exerce um controle da parasitemia na

fase inicial da infecção. Entretanto, uma produção excessiva no sítio de infecção pode

exercer um importante papel para o recrutamento e ativação de leucócitos de forma

exagerada. Estudos em humanos demonstraram a expressão de citocinas pró-

inflamatórias, incluindo TNF-α e IFN-γ, em tecido cerebral humano postmortem

(BROWN et al., 1999). Sua produção por micróglia e astrócitos em modelo experimental

de MC sugere sua participação em manter uma resposta inflamatória (MEDANA et al.,

1997b). Desta forma, leucócitos ativados dentro do SNC seriam capazes de ativar outras

populações celulares e induzir uma maior produção de TNF-α e, conseqüente produção

de moléculas de adesão (CARVALHO-TAVARES et al., 2000), o que aumentaria o influxo

celular. Estudos em humanos demonstraram o aumento dos níveis plasmáticos de TNF-

α, IFN-γ, IL-1β e IL-6 na malária grave, com provável contribuição para a patogênese

da doença. Adicionalmente, sabe-se que o TNF-α induz apoptose e pode estar associado

à disfunção da BHE durante a MC.

Os resultados obtidos no presente estudo demonstram um aumento significativo na

concentração de TNF-α no cérebro de camundongos C57Bl/6 infectados em relação aos

controles. Tal dado corrobora com a literatura que indica o aumento da expressão local

desta citocina na infecção murina por P. berghei ANKA em linhagens consideradas

susceptíveis à MC; isto é a linhagem C57Bl/6 (JENNINGS et al., 1997). Desta forma, este

dado fortalece que a infecção por P. berghei NK65 é capaz de induzir uma resposta

semelhante à obtida pela cepa ANKA.

A produção exacerbada de TNF-α pelo hospedeiro em resposta a infecção têm

sido capaz de provocar anormalidades sistêmicas, como a anorexia e o

comprometimento renal. Os resultados obtidos da análise da concentração desta citocina

no soro de animais infectados e controles demonstraram um aumento em decorrência da

infecção. Adicionalmente, tal dado corrobora os resultados obtidos por Grau et al.

(1987), que demonstraram um aumento dos níveis séricos de TNF-α, que está

diretamente envolvido na patogênese da infecção por P. berghei ANKA.

Em conjunto com dados da literatura, a distribuição diferencial da citocina TNF-

α, de acordo com a linhagem do hospedeiro, indica um perfil distinto do envolvimento

na patogênese da doença. Animais da linhagem C57Bl/6 apresentaram uma infecção

aguda e de letalidade precoce, juntamente com alterações histopatológicas

pronunciadas. Estas características podem ser conseqüência da participação direta do

TNF-α para o comprometimento cerebral, em adição ao envolvimento sistêmico. Para a

linhagem BALB/c, que apresentou um aumento da concentração da citocina apenas no

soro dos animais infectados, as repercussões seriam limitadas às manifestações

sistêmicas apresentadas pelos animais infectados.

Embora os mecanismos que regulam a entrada de leucócitos no SNC ainda não

estejam totalmente elucidados, estudos anteriores indicam um importante papel

regulador das quimiocinas durante o recrutamento de leucócitos, inclusive nos processo

de transmigração através da BHE (BABCOCK et al., 2003). As quimiocinas exercem um

papel central em doenças que o recrutamento celular tem um papel deletério. Sua função

não é limitada ao recrutamento, uma vez que também apresenta função de ativação

celular, diferenciação e degranulação. Sabe-se que as quimiocinas controlam a migração

de células T, monócitos e micróglia dentro do parênquima cerebral (MAHAD et al.,

2003).

Entretanto, a análise da expressão de quimiocinas não pode ser focada somente

no âmbito sistêmico, despertando a idéia de analisar os níveis de quimiocinas, in locu,

uma vez que a produção local serve como evidência direta do envolvimento do SNC na

doença. Considerando que há uma escassez de dados relativos à importância das

quimiocinas para o estudo da malária experimental, utilizamos sobrenadante de

homogenato de cérebro, a fim de quantificar a produção de quimiocinas em

camundongos BALB/c e C57Bl/6, infectados com P. berghei NK65. Estes resultados

são relevantes para o entendimento do papel local de quimiocinas na imunopatogênese

da MC.

O estudo comparativo da produção de quimiocinas neste modelo experimental

de malária grave induzida por P. berghei NK65 demonstrou um aumento significativo

dos níveis das quimiocinas RANTES/CCL5, MIG/CXCL9 e MCP-1/CCL2 nos animais

infectados, com relação aos respectivos controles. Estes resultados são similares ao

estudo comparativo da produção quimiocinas realizado por Hanum et al. (2003) que

também demonstrou o aumento na expressão localizada das quimiocinas MCP-1/CCL2

e RANTES/CCL5 em tecido cerebral de camundongos infectados.

O aumento da concentração destas quimiocinas no tecido cerebral de animais

infectados sugere uma participação destas moléculas no processo inflamatório e

corrobora com os dados de microscopia intravital que demonstra aumento do processo

inflamatório no parênquima cerebral. A quimiocina MIG/CXCL9, membro da família

CXC, é descrita como molécula quimiotática responsável pelo recrutamento e

proliferação de linfócitos T (WHITING et al., 2004). Já as quimiocinas MCP-1/CCL2 e

RANTES/CCL5, membros da família CC, atraem e ativam uma ampla diversidade de

células, como monócitos, linfócitos T, basófilos e eosinófilos. O aumento da expressão

destas moléculas vai de encontro aos resultados obtidos por Hanum et al (2003), em um

modelo de MCE. Considerando que, no nosso estudo, demonstramos um aumento no

recrutamento de leucócitos, podemos sugerir que as quimiocinas poderiam estar

modulando a expressão de moléculas de adesão envolvidas nestas etapas, tais como as

seletinas e as integrinas.

A quimiocina MCP-1/CCL2 é responsável pela ativação de monócitos, induzindo

sua migração da circulação sangüínea para tornarem-se macrófagos teciduais. É

apontada como uma molécula efetiva durante a infiltração de células mononucleares

para o SNC em diferentes condições inflamatórias (KELDER et al., 1998; SCARPINI et

al., 2002). Em várias condições, astrócitos têm sido implicados como a principal fonte

desta quimiocina no SNC. Desta forma, estudos têm mostrado que sua ação está

associada com a alteração da integridade da BHE, que facilita sua distribuição para o

compartimento vascular. Cultura de células endoteliais da microvasculatura cerebral

tratada com MCP-1/CCL2, apresentou uma diminuição da expressão de proteínas

associadas às junções intercelulares da BHE, como a ocludina e a caveolina. Portanto,

essas evidências sugerem que a MCP-1/CCL2 possa induzir uma alteração na

integridade vascular da BHE, promovendo uma maior permeabilidade (SONG &

PACHTER, 2004). Por outro lado, foi demonstrado que CCR2 não é essencial ao

desenvolvimento da MCE (BELNOUE et al., 2003a).

Um outro estudo demonstrou alterações marcantes no aumento da expressão de

mRNA de moléculas de adesão, citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4), iNOS e

quimiocinas, incluindo RANTES/CCL5 e seus receptores (CCR1, CCR3 e CCR5),

durante o pico de parasitemia de camundongos da linhagem Swiss infectados com P.

yoelii 17XL (SARFO et al., 2005). Adicionalmente, um estudo anterior, realizado em

camundongos CCR5

-/-

infectados com P. berghei ANKA, demonstrou uma diminuição

de susceptibilidade a MCE, quando comparados com animais C57Bl/6 selvagens

(BELNOUE et al., 2003b). Logo, existem evidências do papel desta quimiocina,

RANTES/CCL5, no envolvimento da patogênese da malária cerebral. A quimiocina

RANTES/CCL5 e seu receptor estão envolvidos na formação de infiltrados

inflamatórios, apresentando um importante papel, em especial na manutenção, no

prolongamento da resposta inflamatória e no desenvolvimento da patologia cerebral.

A ação das quimiocinas é mediada através de receptores de superfície celular

específicos. Entretanto, a interação receptor-quimiocina é caracterizada por considerável

promiscuidade, onde um mesmo receptor interage com várias quimiocinas e uma

quimiocina é capaz de ligar a diversos receptores. Diferentes quimiocinas, membros de

uma mesma família podem ter um mesmo papel, em decorrência das características

compartilhadas entre elas (ONO et al., 2003). Logo, os fenômenos envolvidos no

recrutamento de leucócitos para o SNC não podem ser atribuídos exclusivamente ao

aumento da concentração e/ou da expressão de uma determinada quimiocina.

Adicionalmente, no mecanismo de migração transendotelial, outras moléculas são

atuantes, como as seletinas, as moléculas de adesão celular, expressadas na superfície

das células endoteliais e as integrinas expressadas nos leucócitos (LEY, 2001).

Embora, a fonte celular responsável pela expressão das quimiocinas e citocinas no

SNC não foi objetivo do estudo, um estudo demonstrou que antígenos de P. berghei

ANKA podem induzir a produção destes mediadores inflamatórios por astrócitos

(HANUM et al., 2003).

Desta forma, nossos resultados demonstram que o processo inflamatório se

assemelha a uma encefalite e são consistentes com a idéia de que a migração de células

para o tecido cerebral constitui um processo relevante para a progressão da doença.

Considerações finais

A malária é uma doença parasitária que aflige grande parte da população

mundial, apresentando uma complexa interação entre características ambientais, do

parasito e do hospedeiro. Exerce uma pressão sócio-econômica e grande interesse

científico em grupos de pesquisa, com uma extensa publicação sobre o tema. Muitos

estudos apresentam resultados aparentemente contraditórios ou inconclusivos.

Entretanto, as variações da resposta imune nos estudos em humanos podem ser, em

parte, decorrente das variações geográficas das áreas de estudo, que apresentam

diferenças na endemicidade. Estudos da patogênese da MC em adultos da Tailândia

diferem significativamente de estudos em crianças da Malásia e Quênia, demonstrando

que a MC é, na verdade um amplo espectro de entidades clínicas.

Logo, o estudo experimental da malária grave apesar dos dados conflitantes e

aparentemente contraditórios não deve ser desmerecido, tendo em vista que as variações

são decorrentes de um somatório de eventos exógenos e endógenos que podem interferir

na progressão e no espectro da doença. Portanto, a infecção por P. berghei cepa NK65

em camundongos apresenta similaridades com a infecção humana, desenvolvendo

manifestações clínicas típicas da malária grave por P. falciparum.

Estudos humanos, muitas vezes são limitados a observações postmortem. Logo a

infecção de linhagens susceptíveis de camundongos proporciona um modelo largamente

utilizado que compartilha características com a doença humana, especialmente uma

resposta imune deletéria (LOU et al., 2001).

De acordo com aspectos histológicos descritos para o modelo de MC utilizando

P. berghei ANKA (MEDANA et al., 2001), podemos verificar que o modelo estudado

compartilha características, como hemorragias, disfunção da BHE e edema. Baseando

nestes resultados podemos sugerir que há um comprometimento cerebral nos

camundongos infectados com a cepa NK65 de P. berghei, especialmente em animais da

linhagem C57Bl/6.

7 7

7 –

––

– Conclusões

Conclusões Conclusões

Conclusões

No presente trabalho, utilizando o modelo murino, foi avaliada a resposta

inflamatória cerebral envolvida na infecção de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens

com P. berghei cepa NK65. Os resultados obtidos demonstram que:

 A parasitemia em camundongos jovens infectados com a cepa NK65 de

P. berghei apresentou evolução gradual, porém mais branda na linhagem

C57Bl/6.

 A infecção por P. berghei NK65 apresenta um curso agudo e letal mais

pronunciado na linhagem C57Bl/6, com manifestações clínicas mais

evidentes.

 As alterações histopatológicas observadas em cérebro de camundongos

C57Bl/6 foram precoces e exuberantes em relação aos animais da

linhagem BALB/c, demonstrando uma maior susceptibilidade daquela

linhagem a infecção por P. berghei NK65. O quadro histológico

mimetiza alterações encontradas em infecções humanas induzidas por P.

falciparum.

 O recrutamento de leucócitos para o SNC foi evidenciado como etapa

marcante na patogenia da infecção, com um aumento de células em

rolamento e aderidas na região perivascular da pia-máter. O aumento no

processo de migração celular foi condizente com o aparecimento das

manifestações clínicas e histopatológicas da doença.

 Através do protocolo de permeabilidade da BHE com o corante azul de

Evans, demonstrou-se que a infecção por P. berghei NK65 é capaz de

modificar a permeabilidade vascular do tecido cerebral dos animais

infectados em relação aos animais controle.

 A diminuição de leucócitos totais no sangue periférico de animais

infectados pode ser conseqüência do aumento dos eventos de

recrutamento celular em decorrência da infecção.

 A redução de linfócitos no sangue periférico de animais infectados pode

estar relacionada diretamente com o seqüestro deste tipo celular no

parênquima cerebral de animais infectados.

 As citocinas TNF-α e IFN-γ e as quimiocinas MCP-1/CCL2,

RANTES/CCL5 e MIG/CXCL9 mostraram-se importantes moléculas no

modelo estudado, com um aumento dos seus níveis no tecido nervoso

durante as manifestações clínicas da doença e os eventos recrutamento de

leucócitos para o SNC.

 A investigação da interação leucocitária no endotélio da microcirculação

cerebral, através da técnica de microscopia intravital, associada a

avaliação da expressão das quimiocinas foram capazes de comprovar o

envolvimento de uma resposta inflamatória no sistema nervoso central de

camundongos experimentalmente infectados com P. berghei NK65.

 A infecção de camundongos jovens da linhagem C57Bl/6 com P. berghei

NK65 pode representar um bom modelo para estudos dos mecanismos

envolvidos na determinação do quadro de MC por P. falciparum.

8. Perspectivas

8. Perspectivas 8. Perspectivas

8. Perspectivas

A retenção de esquizontes maduros no baço e fígado é um evento comum na

infecção acarretada por P. berghei. Resultados preliminares da análise histopatológica

realizada em baço e fígado confirmou a retenção de formas maduras e de pigmento

malárico nestes órgãos. Portanto, existe o interesse para verificar as manifestações da

malária grave em diferentes órgãos (fígado, baço, pulmão e rim) e realizar a

quantificação de elementos associadas às manifestações clínicas em camundongos

BALB/c e C57Bl/6 infectados com a cepa NK65 de P. berghei.

Adicionalmente, trabalhos sugerem que a idade influencia profundamente a

parasitemia e sobrevida de ratos infectados com P. berghei (ZUCKERMAN & YOELI,

1954). Este modelo demonstrou que a idade foi inversamente relacionada à parasitemia

e mortalidade dos animais (SINGER et al., 1955).

Camundongos jovens infectados com P. berghei cepa NK65 podem apresentar

uma maior susceptibilidade à infecção, devido à deficiência no controle da infecção,

apresentando maiores complicações da malária grave. Esta hipótese é fortalecida por um

estudo realizado com camundongos (BALB/c X C57BL/6)F1 infectados com estágio

sangüíneo de P. berghei ANKA. Este experimento demonstrou um perfil de

susceptibilidade dos camundongos relacionado com a idade. A infecção por P. berghei

ANKA em camundongos considerados jovens (oito semanas) freqüentemente resulta

em sintomas neurológicos e morte precoce dos animais. Estes sintomas, característicos

da MC, demonstraram ser menos freqüentes em animais velhos (15-20 semanas)

pertencentes a mesma linhagem (HEARN et al., 2000). Resultados preliminares do nosso

grupo, utilizando camundongos BALB/c velhos (15-20 semanas) infectados com P.

berghei cepa NK65, têm demonstrado uma resposta diferencial à infecção, com controle

nas taxas de parasitemia e morte retardada. Desta forma, o impacto da idade é um fator

que não deve ser desconsiderado para o estudo da MC experimental (ADAM et al.,

2003).

Desta forma, será objetivo analisar as possíveis diferenças de susceptibilidade

relacionadas à idade, através de estudos utilizando camundongos BALB/c e C57Bl/6

com 15-20 semanas de idade.

9 9

9 -

- Referências Bibliográficas

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