( PDF ) Papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e do ácido N-acetilaspártico em encéfalo de ratos

Download PDF

ads:

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica

Papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e

do ácido N-acetilaspártico em encéfalo de ratos

Carolina Didonet Pederzolli

Tese de Doutorado

Porto Alegre, 2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica

Papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e do ácido

N-acetilaspártico em encéfalo de ratos

Carolina Didonet Pederzolli

Orientador

Prof. Dr. Carlos Severo Dutra Filho

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito parcial à obtenção do título de

Doutor

Porto Alegre, 2008

ads:

III

Dedico essa tese aos meus pais.

Agradecimentos

Ao meu orientador, professor Dr. Carlos Severo Dutra Filho, pelo enorme

aprendizado e crescimento proporcionados e pela orientação repleta de compreensão,

carinho e amizade;

Aos outros professores do Grupo de Erros Inatos do Metabolismo Angela, Clóvis e

Moacir, pelas valiosas contribuições, e aos demais professores e funcionários deste

Departamento, em especial à Cléia, pela eficiência e prontidão, e à Fátima, Valeri e demais

funcionários do CEPEA, que sempre atenderam prontamente aos meus pedidos;

À CAPES, e também ao CNPq, FAPERGS e PRONEX, pelo apoio financeiro;

À professora Ângela de Mattos Dutra, pela oportunidade de aprofundar meus

estudos, e às bolsistas Nicoli e Eline, pelo carinho e ajuda extrema;

A todos os colegas dos laboratórios 34, 36A e 38, pela ajuda e ótima convivência;

Aos colegas do laboratório 36, em especial à Mirian e aos bolsistas Alessandra,

Amanda, Andrea, Bernardo, Bethânia, Bianca, Caroline, Evelise, Fernanda Scapin,

Fernanda Zanin, Franciele, Kátia e Lúcia, pela ajuda fundamental e amizade, pelo carinho e

ótimo ambiente de trabalho;

A todos os amigos queridos, pela amizade preciosa, pelo apoio, pelo convívio

gratificante e pelos maravilhosos momentos de descontração, em especial à Ana Rita,

Ângela, Cássia, César, Cris Matté, Cuca, Fran, Gabi, Guilhian, Ivan, Rafa e Xuxa;

À toda minha família, pelo carinho e apoio;

E em especial aos meus pais, tão especiais, pela compreensão, pelo incentivo e

amor incondicional, e por estarem sempre ao meu lado.

Sumário

PARTE I

Resumo ............................................................................................................................ 2

Abstract ............................................................................................................................ 3

Lista de Abreviaturas ....................................................................................................... 4

INTRODUÇÃO

1.1 – 5-Oxoprolina .......................................................................................................... 5

1.1.1 – Papel Fisiológico .............................................................................................. 5

1.1.2 – Ações Neurotóxicas da 5-OP ............................................................................ 6

1.1.3 – Deficiência de GS ............................................................................................. 7

1.1.3.1 – Manifestações Clínicas ............................................................................... 8

1.1.3.2 – Alterações Bioquímicas e Neuropatológicas.............................................. 8

1.1.3.3 – Diagnóstico............................................................................................... 10

1.1.3.4 – Tratamento ............................................................................................... 10

1.2 – Ácido N-acetilaspártico ...................................................................................... 11

1.2.1 – Papel Fisiológico ............................................................................................ 11

1.2.2 – Ações Neurotóxicas do NAA e do NAAG ..................................................... 13

1.2.3 – Doença de Canavan ........................................................................................ 13

1.2.3.1 – Manifestações Clínicas ............................................................................. 14

1.2.3.2 – Alterações Bioquímicas e Neuropatológicas............................................ 15

1.2.3.3 – Diagnóstico............................................................................................... 16

1.2.3.4 – Tratamento ............................................................................................... 17

1.3 – Radicais Livres .................................................................................................... 18

1.3.1 – Definição ........................................................................................................ 18

1.3.2 – Efeitos das Espécies Reativas (ER) em Sistemas Biológicos......................... 19

1.3.3 – Defesas Antioxidantes .................................................................................... 21

1.3.3.1 – Enzimas Antioxidantes ............................................................................. 21

1.3.3.2 – Antioxidantes Não-enzimáticos ............................................................... 23

1.3.4 – Estresse Oxidativo .......................................................................................... 25

1.3.4.1 – Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas ................................. 26

OBJETIVOS.................................................................................................................. 28

PARTE II

Capítulo I

5-oxoproline reduces non-enzymatic antioxidant defenses in vitro in rat brain ........ 31

Capítulo II

Acute administration of 5-oxoproline induces oxidative damage to lipids and proteins

and impairs antioxidant defenses in cerebral cortex and cerebellum of young rats ........ 47

Capítulo III

N-acetylaspartic acid promotes oxidative stress in cerebral cortex of rats ............... 79

Capítulo IV

N-acetylaspartic acid impairs enzymatic antioxidant defenses in rat brain: relevance

to Canavan Disease .......................................................................................................... 88

Capítulo V

Intracerebroventricular administration of N-acetylaspartic acid impairs antioxidant

defenses and promotes protein oxidation in cerebral cortex of rats .............................. 121

Capítulo VI

Efeitos in vitro do ácido N-acetilaspartilglutâmico sobre parâmetros de estresse

oxidativo em córtex cerebral de ratos................................................................................154

PARTE III

DISCUSSÃO

1. 5-Oxoprolina ....................................................................................................... 158

2. Ácido N-acetilaspártico ...................................................................................... 173

REFERÊNCIAS

.......................................................................................................... 193

ANEXOS

........................................................................................................................ 219

Lista de Figuras ........................................................................................................... 220

Lista de Tabelas ........................................................................................................... 221

PARTE I

Resumo

A 5-oxoprolina (ácido L-piroglutâmico) se acumula na deficiência de glutationa

sintetase, uma doença genética autossômica recessiva clinicamente caracterizada por

anemia hemolítica, acidose metabólica e sintomas neurológicos severos. Considerando que

os mecanismos de dano cerebral nessa doença são pouco conhecidos, e que recentemente

demonstramos que a 5-oxoprolina é capaz de promover estresse oxidativo in vitro,

resolvemos investigar os efeitos in vivo da 5-oxoprolina sobre parâmetros de estresse

oxidativo, afim de melhor esclarecer seu papel na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e sua

participação nos mecanismos neuropatológicos da deficiência de glutationa sintetase. Para

isso, os efeitos da administração subcutânea aguda de 5-oxoprolina foram estudados sobre

o potencial antioxidante total (TRAP); a quimiluminescência espontânea; as substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS); o conteúdo de carbonilas, ácido ascórbico,

glutationa reduzida (GSH), peróxido de hidrogênio, tióis e dissulfetos (e a razão SH/SS),

assim como sobre as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido

dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), e a atividade da glicose 6-fosfato

desidrogenase (G6PD) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida. Os

resultados obtidos indicaram que in vivo a 5-oxoprolina causa lipoperoxidação e oxidação

protéica, compromete as defesas antioxidantes cerebrais e aumenta o conteúdo de peróxido

de hidrogênio, indicando que a 5-oxoprolina promove estresse oxidativo in vivo em córtex

cerebral e cerebelo de ratos jovens, mecanismo possivelmente envolvido na neuropatologia

da deficiência de glutationa sintetase, na qual a 5-oxoprolina está acumulada.

O ácido N-acetilaspártico, por outro lado, se acumula na Doença de Canavan, uma

leucodistrofia severa causada pela deficiência da enzima aspartoacilase e clinicamente

caracterizada por retardo mental severo, hipotonia e macrocefalia, e também por

convulsões tônico-clônicas generalizadas em aproximadamente metade dos pacientes. O

ácido N-acetilaspártico é um precursor imediato para a biossíntese enzimática do ácido N-

acetilaspartilglutâmico, cuja concentração também está elevada nos pacientes afetados pela

Doença de Canavan. Considerando que os mecanismos de dano cerebral nessa doença

permanecem pouco esclarecidos, investigamos o papel do estresse oxidativo na

neurotoxicidade dos ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico, a fim de avaliar o

possível envolvimento dos mesmos na neuropatologia da Doença de Canavan. Os efeitos in

vitro dos ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico, assim como os efeitos das

administrações subcutânea e intracerebroventricular (i.c.v.) de ácido N-acetilaspártico e da

administração i.c.v. do ácido N-acetilaspartilglutâmico, foram estudados sobre os seguintes

parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos: TRAP; TAR;

quimiluminescência espontânea; TBA-RS; conteúdos de GSH, peróxido de hidrogênio,

tióis totais e carbonilas; atividades das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx; e

atividade da G6PD. Os resultados indicaram que apenas o ácido N-acetilaspártico é capaz

de aumentar o conteúdo de peróxido de hidrogênio, estimular a lipoperoxidação e a

oxidação protéica e de comprometer as defesas antioxidantes em cérebro de ratos,

promovendo estresse oxidativo, que pode estar envolvido nos mecanismos patofisiológicos

responsáveis pelo dano cerebral observado nos pacientes afetados pela Doença de Canavan,

cujo marcador bioquímico clássico é o acúmulo de ácido N-acetilaspártico.

Abstract

5-Oxoproline (L-pyroglutamic acid) accumulates in glutathione synthetase

deficiency, an autossomic recessive inherited disorder clinically characterized by hemolytic

anemia, metabolic acidosis and severe neurological symptoms. Considering that the

mechanisms of brain damage in this disease are poorly known, and that oxidative stress is

elicited by 5-oxoproline in vitro, we decided to study the in vivo effects of this metabolite

on oxidative stress parameters, in order to further clarify its role in 5-oxoproline

neurotoxicity and its participation on the neuropathological mechanisms of patients affected

by glutathione sintetase deficiency. The effects of acute subcutaneous administration of 5-

oxoproline were studied on a wide spectrum of oxidative stress parameters, such as total

radical-trapping antioxidant potential (TRAP); spontaneous chemiluminescence;

thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS); and carbonyl, ascorbic acid, reduced

glutathione (GSH), hydrogen peroxide, thiol and disulfide contents (and SH/SS ratio), as

well as on the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase

(SOD) and glutathione peroxidase (GPx), and on the activity of glucose 6-phosphate

dehydrogenase (G6PD) in cerebral cortex and cerebellum of 14-day-old rats. The results

indicated that in vivo 5-oxoproline causes lipid peroxidation and protein oxidation, impairs

brain antioxidant defenses and increases hydrogen peroxide content, indicating that 5-

oxoproline elicits oxidative stress in vivo in cerebral cortex and cerebellum of young rats, a

mechanism that may be involved in the neuropathology of gluthatione synthetase

deficiency, in which this metabolite accumulates.

N-acetylaspartic acid, on the other hand, accumulates in Canavan Disease, a severe

leukodystrophy characterized by swelling and spongy degeneration of the white matter of

the brain. This inherited metabolic disease, caused by deficiency of the enzyme

aspartoacylase, is clinically characterized by severe mental retardation, hypotonia and

macrocephaly, and also generalized tonic and clonic type seizures in about half of the

patients. N-acetylaspartic acid is an immediate precursor for the enzyme-mediated

biosynthesis of N-acetylaspartylglutamic acid, whose concentration is also increased in

urine and cerebrospinal fluid of patients affected by Canavan Disease. Considering that the

mechanisms of brain damage in this disease remain poorly understood, in the present study

we investigated whether oxidative stress is elicited by N-acetylaspartic acid or its

metabolite, N-acetylaspartylglutamic acid. The in vitro effects of N-acetylaspartic acid and

N-acetylaspartylglutamic acid, as well as the effect of the acute subcutaneous

administration of N-acetylaspartic acid, and the intracerebroventricular administration of N-

acetylaspartic acid or N-acetylaspartylglutamic acid, were studied on oxidative stress

parameters: TRAP, TAR, spontaneous chemiluminescence, TBA-RS, reduced glutathione

content, sufhydryl content, carbonyl content, and on enzyme activities of CAT, SOD and

GPx as well as on GSH and hydrogen peroxide contents and on G6PD activity, in the

cerebral cortex of rats. Our results indicated that only N-acetylaspartic acid promotes

oxidative stress by stimulating lipid peroxidation, protein oxidation and by impairing

antioxidant defenses and enhancing hydrogen peroxide content in rat brain. This could be

involved in the pathophysiological mechanisms responsible for the brain damage observed

in patients affected by Canavan Disease, in which N-acetylaspartic acid accumulation is the

biochemical hallmark.

Lista de Abreviaturas

CAT catalase

SNC Sistema Nervoso Central

ER Espécies Reativas

ERN Espécies Reativas de Nitrogênio

ERO Espécies Reativas de Oxigênio

GPx glutationa peroxidase

G6PD glicose 6-fosfato desidrogenase

GS glutationa sintetase

GSH glutationa reduzida

peróxido de hidrogênio

LCR líquido cefalorraquidiano

NAA ácido N-acetilaspártico

NAAG ácido N-acetilaspartilglutâmico

•

••

•

óxido nítrico

•

••

•−

−−

−

radical superóxido

oxigênio singlet

•

••

•

radical hidroxila

ONOO

peroxinitrito

ONOOH ácido peroxinitroso

5-OP 5-oxoprolina

•

••

•

radical alcoxila

•

••

•

radical peroxila

SH tiol

SS dissulfeto

SOD superóxido dismutase

TAR reatividade antioxidante total

TBA-RS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TRAP potencial antioxidante total

INTRODUÇÃO

1.1 – 5-Oxoprolina

1.1.1 – Papel Fisiológico

A 5-oxoprolina (5-OP), também conhecida como ácido L-piroglutâmico ou ácido

pirrolidona carboxílico, é uma molécula endógena que participa do ciclo γ–glutamil, o qual

por sua vez está relacionado à síntese e degradação de glutationa reduzida (GSH) e também

ao transporte intracelular de aminoácidos livres (Meister, 1991) (Figura 1).

Figura 1. Ciclo γ-glutamil. Enzimas envolvidas:  = γ-glutamilcisteína sintetase;  = glutationa sintetase;  = γ-glutamil transpeptidase;

 = γ-glutamil ciclotransferase;  = 5-oxoprolinase;  = dipeptidase. Fonte: Marks et al., 1996.

Nesse ciclo, a biossíntese da GSH é catalisada pela ação consecutiva das enzimas γ-

glutamilcisteína sintetase e glutationa sintetase (GS). Através de feedback negativo, a GSH

inibe a atividade da γ-glutamilcisteína sintetase, enzima marca-passo do ciclo. O passo

inicial de degradação da GSH é catalisado pela γ-glutamil transpeptidase, que transfere o













grupo γ-glutamil a um aminoácido. O γ-glutamil aminoácido formado é utilizado pela γ-

glutamil ciclotransferase, que catalisa a liberação do resíduo γ-glutamil na forma de 5-OP, a

qual é então convertida a glutamato por ação da 5-oxoprolinase. Em humanos, deficiências

hereditárias para cinco das seis enzimas do ciclo já foram identificadas, sendo a mais

comum delas a deficiência de GS (Larsson e Anderson, 2001; Ristoff e Larsson, 2007).

1.1.2 – Ações Neurotóxicas da 5-OP

Várias ações neurotóxicas foram atribuídas a 5-OP (Rieke et al., 1984; Rieke et al.,

1989; Rothstein et al., 1993), cujo acúmulo é o principal marcador bioquímico da

deficiência de GS. Sua excitotoxicidade já foi demonstrada; a 5-OP se liga aos receptores

glutamatérgicos (Barone e Spignoli, 1990) e também inibe a captação de glutamato por

sinaptossomas (Bennet et al., 1973; Dusticier et al., 1985). Além disso, as membranas

celulares podem ser um outro sítio de interação da 5-OP, a qual é capaz de inibir a atividade

da NA

-ATPase, enzima essencial para a função e desenvolvimento cerebrais

(Escobedo e Cravioto, 1973; Rieke et al., 1984). A 5-OP pode também promover um dano

ao metabolismo energético cerebral, visto que inibe a produção de CO

e diminui os níveis

de ATP e a síntese de lipídios, além de reduzir a atividade dos complexos I + III e

complexo IV da cadeia respiratória, indicando que a cadeia respiratória é bloqueada em

pelo menos dois pontos distintos (Silva et al., 2001). A inibição da síntese de lipídios, por

sua vez, pode vir a ser danosa ao sistema nervoso central (SNC), visto que prejudicaria a

sinaptogênese, a mielinização e outros eventos, dependentes de lipídios, necessários para

um desenvolvimento cerebral normal (Silva et al., 2001).

Ainda, a infusão intracerebral aguda e crônica de 5-OP produz lesões neuronais

dose-dependentes em estriado, hipocampo, córtex cerebral e cerebelo de ratos, além de

provocar alterações comportamentais, assimetria postural, ataxia, descoordenação motora,

tremor e discinesias (Rieke et al., 1984; Rieke et al., 1989).

1.1.3 – Deficiência de GS

Descrita pela primeira vez por Jellum e colaboradores em 1970, essa desordem

hereditária caracteriza-se pela presença de altos níveis de 5-OP no líquido

cefalorraquidiano (LCR), sangue e outros tecidos dos pacientes afetados, juntamente com a

elevada excreção urinária da mesma, sendo essa condição denominada 5-oxoprolinúria ou

acidúria piroglutâmica (Larsson et al., 1985; Larsson e Anderson, 2001; Njalsson, 2005).

Até o presente momento, foram descritos aproximadamente 70 pacientes com

deficiência de GS (MIM 266130) (Njalsson, 2005; Ristoff e Larsson, 2007). O padrão de

herança é autossômico recessivo, e a doença é monogênica; porém, mais de vinte mutações

diferentes já foram identificadas, o que pode explicar a heterogeneidade fenotípica

encontrada. Muitas mutações parecem afetar a capacidade de ligação do ligante ou a

catálise, enquanto outras provavelmente afetam a dimerização ou o enovelamento protéico

(Ristoff e Larsson, 1998; Polekhina et al., 1999; Ristoff, 2002). As mutações que afetam a

capacidade catalítica da GS podem fazê-lo por diminuir a afinidade pelo substrato, a

velocidade máxima ou a estabilidade da enzima (Njalsson et al., 2000). Supõe-se que a

forma mais branda da doença seja devida a uma mutação que afeta primariamente a

estabilidade da enzima, enquanto que a forma severa seja devida a mutações que afetam as

propriedades catalíticas da enzima (Spielberg et al., 1978). Independente do tipo de

mutação, todos os pacientes apresentam algum grau de atividade enzimática residual (1-

30%) (Dahl et al., 1997; Ristoff e Larsson, 1998; Ristoff et al., 2000).

1.1.3.1 – Manifestações Clínicas

De uma forma geral, a deficiência de GS é clinicamente caracterizada por anemia

hemolítica e acidose metabólica severa; além disso, quase metade dos pacientes também

desenvolve sintomas neurológicos progressivos, incluindo convulsões, retardo mental,

ataxia, retardo psicomotor, espasticidade e grau variado de psicose, entre outros (Robertson

et al., 1991; Larsson e Anderson, 2001; Ristoff et al., 2001). Aproximadamente 25% dos

pacientes morrem no período neonatal (Njalsson e Norgren, 2005). O fenótipo clínico dos

pacientes sobreviventes é bastante variado, podendo se apresentar de forma leve, moderada

ou severa (Ristoff, 2002). A 5-oxoprolinúria ocorre em todos os pacientes, porém é mais

pronunciada nos pacientes mais severamente afetados (Njalsson, 2005).

Na doença, a acidose metabólica é devida a uma diminuição na inibição por

feedback da enzima γ–glutamilcisteína sintetase no ciclo γ-glutamil, o que levará ao final à

superprodução e acúmulo de 5-OP, causando acidose metabólica (Larsson e Anderson,

2001; Ristoff, 2002).

Infecções bacterianas recorrentes também acometem esses pacientes, sendo

atribuídas provavelmente a uma função granulocítica deficiente (Ristoff et al., 2001). A

administração de Vitamina E normaliza a função de leucócitos polimorfonucleares

(granulócitos) em pacientes com deficiência de GS sem, no entanto, normalizar os níveis de

GSH, sendo recomendada sua suplementação para evitar a ocorrência de infecções

freqüentes nesses pacientes (Boxer et al., 1979).

1.1.3.2 – Alterações Bioquímicas e Neuropatológicas

As alterações bioquímicas observadas por Marstein et al. (1981) em órgãos

provenientes da autópsia de um paciente com deficiência de GS incluem uma redução

marcante na atividade da GS e altos níveis de 5-OP em todos os tecidos analisados,

particularmente nos rins e no cérebro. O conteúdo de glutationa se encontrava muito

reduzido em todas as regiões cerebrais. O conteúdo de glutamato, neurotransmissor

excitatório das células granulosas, estava fortemente diminuído no córtex cerebelar, bem

como o conteúdo de ácido γ-aminobutírico, refletindo provavelmente a perda de células de

Purkinje, neurônios cerebelares eferentes que utilizam ácido γ-aminobutírico como seu

neurotransmissor inibitório (Marstein et al., 1981).

Dentre os achados neuropatológicos da deficiência de GS estão a atrofia seletiva da

camada celular granulosa do cerebelo, lesões focais no córtex frontoparietal e lesões

bilaterais no córtex visual e tálamo, observando-se perda neuronal e astrocitose no córtex

visual (Skullerud et al., 1980; Marstein et al., 1981). Em pacientes que morrem no período

neonatal é possível observar uma atrofia cerebelar generalizada, desmielinização e necrose

cerebral (Ristoff, 2002). Cabe aqui ressaltar que as lesões cerebrais desses pacientes são

bastante similares àquelas vistas após intoxicação por mercúrio, que afeta principalmente o

cerebelo e algumas regiões do córtex cerebral (Skullerud, 1980; Marstein et al., 1981).

Nessa condição, os neurônios são presumivelmente danificados por alterações oxidativas

resultantes da ação quelante do mercúrio em grupos sulfidrílicos (–SH) vitais. Assim, é

possível que na deficiência de GS perdas neuronais similares possam ocorrer devido à

ineficiente manutenção dos grupos –SH em sua forma reduzida (Marstein et al., 1981). No

entanto, o mecanismo de dano cerebral da deficiência de GS permanece ainda pouco

esclarecido.

1.1.3.3 – Diagnóstico

O diagnóstico precoce de desordens metabólicas é fundamental para proporcionar

uma melhora no quadro clínico dos pacientes. Geralmente suspeita-se de deficiência de GS

em recém-nascidos que apresentam um quadro de anemia hemolítica juntamente com

acidose metabólica. Nesses casos, o diagnóstico consiste na detecção de baixa atividade

enzimática da GS e baixos níveis de GSH no sangue e/ou cultura de fibroblastos do

paciente, bem como de altos níveis de 5-OP no sangue e na urina, devido à elevada

excreção urinária da mesma. A 5-OP pode ser detectada através de cromatografia gasosa

acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) (Hoffmann et al., 1989). Pode-se detectar

também a presença de mutações no gene da GS através de técnicas de biologia molecular.

O diagnóstico pré-natal pode ser realizado através da análise de mutações em

vilosidade coriônica, através da análise da 5-OP em líquido amniótico (Erasmus et al.,

1993; Manning et al., 1994), ou ainda através da análise da atividade enzimática da GS em

cultura de amniócitos ou de vilosidade coriônica.

1.1.3.4 – Tratamento

Atualmente, o tratamento primário consiste apenas na correção da acidose

metabólica. Como os pacientes apresentam baixos níveis de glutationa, acredita-se que

estejam mais suscetíveis ao estresse oxidativo e, por isso, tem-se sugerido a utilização de

antioxidantes na terapêutica dessas desordens hereditárias do ciclo γ–glutamil (Jain et al.,

1994; Ristoff, 2002).

1.2 – Ácido N-acetilaspártico

1.2.1 – Papel Fisiológico

O ácido N-acetilaspártico (NAA) é um dos derivados de aminoácido mais

abundantes do SNC de mamíferos, estando presente em concentrações cerebrais de até 20

mM (Baslow, 2003; Harte et al., 2005). O NAA é normalmente sintetizado a partir de

acetil-CoA e ácido L-aspártico por ação da enzima acetil-CoA-L-aspartato N-

acetiltransferase, sendo hidrolizado a aspartato e acetato por ação da enzima aspartoacilase

(Figura 2) (Beaudet, 2001).

Figura 2. Síntese e degradação do ácido N-acetilaspártico. Fonte: Madhavarao et al., 2005.

Apesar de sua alta concentração, o papel do NAA no metabolismo cerebral

permanece ainda pouco esclarecido (Benarroch, 2008). No entanto, várias hipóteses têm

sido recentemente lançadas na literatura. Dentre as possíveis funções do NAA, especula-se

que o mesmo possa apresentar um papel importante na mielinogênese, pela possibilidade de

atuar como uma fonte de grupos acetil, que serão posteriormente incorporados em lipídios

cerebrais (Chakraborty et al., 2001; Kirmani et al., 2002; Madhavarao et al., 2005;

Namboodiri et al., 2006). Além disso, supõe-se que o NAA possa atuar também como um

osmólito intracelular (Baslow, 2002); como uma forma de armazeamento de aspartato

(Beaudet, 2001) ou de glutamato (Clark et al., 2006); e como um carreador para a remoção

do excesso de nitrogênio do cérebro (Moffett et al., 2007).

Ainda, especula-se que uma das funções mais importantes do NAA seja a de atuar

como um precursor imediato da biossíntese enzimática de N-acetilaspartilglutamato

(NAAG), um dos neuropeptídeos mais abundantes do tecido nervoso de mamíferos (Gehl et

al., 2004; Arun et al., 2006; Moffett et al., 2007), alcançando concentrações cerebrais de

até 2,7 mM (Coyle, 1997; Pouwels e Frahm, 1997). O NAAG é sintetizado a partir de

NAA e glutamato, havendo a produção de aproximadamente uma molécula de NAAG para

cada molécula de NAA sintetizada; sob condições de steady-state, a relação NAA:NAAG é

mantida na proporção 10:1 (Baslow e Guilfoyle, 2006). Como um composto neuroativo, o

NAAG pode agir primariamente como um agonista de receptores metabotrópicos

glutamatérgicos do tipo II (mGluRII), especificamente mGluR3, pré-sinápticos, levando à

inibição da liberação de glutamato na fenda sináptica (Wroblewska et al., 1997; Benarroch,

2008); em concentrações mais altas o NAAG é um fraco agonista de receptores N-metil-D-

aspartato (NMDA) (Neale, 2000; Pliss et al., 2000; Shave et al., 2001; Zhao et al., 2001). O

NAAG pode ser hidrolizado pela enzima dipeptidase ácida α–ligada N-acetilada,

produzindo glutamato e regenerando NAA (Thomas et al., 2000; Benarroch et al., 2008).

Concentrações aumentadas de NAA na urina, sangue, LCR e cérebro dos pacientes

afetados, juntamente com um aumento das concentrações de NAAG, ocorrem na Doença de

Canavan, uma leucodistrofia severa e progressiva caracterizada por edema cerebral e

degeneração espongiforme da substância branca (Matalon e Michals-Matalon, 2000).

1.2.2 – Ações Neurotóxicas do NAA e do NAAG

O papel do NAA na patogênese da Doença de Canavan é ainda pouco esclarecido.

No entanto, a presença de concentrações aumentadas desse ácido orgânico no cérebro dos

pacientes afetados por essa doença sugere a possibilidade de que o NAA ou algum

metabólito relacionado possa exercer efeitos tóxicos (Beaudet, 2001).

De fato, achados recentes sugerem que o metabolismo do NAA na Doença de Canavan

encontra-se alterado também na retina neural, o que pode estar relacionado à neuropatia

óptica observada nessa doença (Baslow, 2003; George et al., 2004). No cérebro, ações

neurotóxicas do NAA também foram demonstradas. A administração

intracerebroventricular de NAA a ratos normais se mostrou capaz de induzir convulsões,

provavelmente por uma excitação excessiva através de receptores metabotrópicos

glutamatérgicos (Akimitsu et al., 2000; Kitada et al., 2000; Yan et al., 2003). O NAA

também é capaz de aumentar a concentração intracelular de cálcio em cultura de células

(Rubin et al., 1995). O NAAG, por sua vez, também já mostrou ações neurotóxicas no

cérebro, tanto in vitro (Thomas et al., 2000) quanto in vivo (Pliss et al., 2000; Pliss et al.,

2002; Pliss et al., 2003; Bubeníková-Valesová et al., 2006), incluindo a indução de

neurodegeneração, alteração comportamental e clivagem do DNA neuronal.

1.2.3 – Doença de Canavan

A Doença de Canavan, descrita pela primeira vez em 1931 por Myrtelle Canavan, é

uma doença hereditária autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima

aspartoacilase (MIM 271900) (Matalon e Michals-Matalon, 2000), sendo mais freqüente

entre a população de Judeus Ashkenazi (Matalon et al., 1995a). Nessa população, a

freqüência de portadores pode variar entre 1:37 e 1:40 (Matalon e Michals-Matalon, 1999;

Leone et al., 2000) e a incidência da doença é estimada em aproximadamente 1:6000

nascidos vivos (Matalon e Michals-Matalon, 1999; Gordon, 2000).

1.2.3.1 – Manifestações Clínicas

A Doença de Canavan é clinicamente caracterizada por retardo mental severo e

progressivo, com incapacidade de aquisição de funções motoras normais durante o

desenvolvimento. Apesar dos pacientes afetados geralmente parecerem normais no

primeiro mês de vida, podem exibir fixação visual deficitária, irritabilidade e apatia já ao

nascimento (Traeger e Rapin, 1998). Após 5-6 meses de vida, os pacientes desenvolvem

também hipotonia e macrocefalia, com dificuldade de sustentar a cabeça (Matalon e

Michals-Matalon, 2000; Matalon et al., 2006). Esses sintomas progridem posteriormente

para hipertonicidade com paralisia pseudobulbar; convulsões geralmente tônico-clônicas

ocorrem em aproximadamente metade dos pacientes (Traeger e Rapin, 1998; Beaudet,

2001). Freqüentemente, os pacientes apresentam neuropatia óptica e atrofia óptica (Matalon

e Michals-Matalon, 1999; Surendran et al., 2003). Os pacientes afetados se tornam cada

vez mais debilitados com o passar do tempo, geralmente com incapacidade de se mover

voluntariamente; não desenvolvem a habilidade de andar, sentar, caminhar e falar

(Surendran et al., 2003). A morte tipicamente ocorre antes da adolescência, mas alguns

pacientes com formas mais leves da doença podem sobreviver até seus 20 anos (Moffett et

al., 2007).

A Doença de Canavan é monogênica, com padrão de herança autossômico

recessivo. O fenótipo é variável, de acordo com o tipo de mutação envolvida; mutações que

desfaçam a conformação do sítio ativo da aspartoacilase resultarão em quase total perda de

atividade e, conseqüentemente, em um fenótipo mais severo (Surendran et al., 2003).

Enquanto apenas duas mutações são a base molecular da Doença de Canavan em 98% dos

pacientes Judeus Ashkenazi, uma ampla variedade de mutações pode ser encontrada em

pacientes não-judeus (Matalon e Michals-Matalon, 1999; Namboodiri et al., 2006).

1.2.3.2 – Alterações Bioquímicas e Neuropatológicas

Apesar de o marcador bioquímico clássico da Doença de Canavan ser o aumento

das concentrações de NAA em plasma, urina, LCR e cérebro dos pacientes afetados (Tsai e

Coyle, 1995; Blüml, 1999; Surendran et al., 2003), o NAAG também pode ser encontrado

em concentrações elevadas na urina e no LCR dos pacientes afetados (Burlina et al., 1999;

Krawczyk e Gradowska, 2003; Burlina et al., 2006).

Dentre as alterações neuropatológicas, pode-se observar edema cerebral e

degeneração espongiforme da substância branca do cérebro; à medida que a doença

progride, o cérebro se torna atrófico e a substância cinzenta é também envolvida (Matalon e

Michals-Matalon, 2000). A atrofia cerebral aumenta progressivamente ao longo do tempo

em pacientes com Doença de Canavan, juntamente com o aumento progressivo da

concentração tecidual de NAA (Janson et al., 2006). Pode-se observar edema astrocitário

com a presença de mitocôndrias alongadas e distorcidas (Adachi et al., 1972), extensiva

perda de mielina, edema e vacuolização na substância branca e no tronco cerebral (Kumar

et al., 2006; Skiranth et al., 2007), e um aumento no número de oligodendrócitos e de

astrócitos protoplásmicos (Beaudet, 2001).

Até o presente momento existem poucas hipóteses acerca de possíveis mecanismos

neuropatológicos envolvidos na Doença de Canavan. Madhavarao e colaboradores (2005)

demonstraram um comprometimento na síntese de lipídios de mielina, e sugeriram o

envolvimento de uma síntese de mielina deficiente, resultante de uma deficiência de acetato

derivado do NAA, na patogênese da doença. Outra hipótese considera o envolvimento do

NAA como um osmólito intracelular na patogênese dessa desordem, à medida que o

aumento patológico de NAA levaria a um desequilíbrio osmótico com acúmulo de excesso

de fluido no cérebro (Baslow, 2002). Apesar das presentes hipóteses, o papel do NAA na

patogênese da Doença de Canavan permanece ainda pouco esclarecido.

1.2.3.3 – Diagnóstico

O diagnóstico da Doença de Canavan pode ser confirmado através da detecção de

níveis aumentados de NAA na urina, sangue e LCR dos pacientes (Surendran et al., 2003).

No cérebro, o aumento de NAA pode ser detectado in vivo de forma não-invasiva através

de ressonância nuclear magnética de prótons (

H-RMN) (Tsai e Coyle, 1995; Blüml, 1999;

Gordon, 2000; Harte et al., 2005). O diagnóstico de escolha consiste na detecção de altos

níveis de NAA na urina (aumento de 10 a 100 vezes) (Surendran et al., 2003).

O diagnóstico pré-natal da doença pode ser feito através da medida da concentração

de NAA no fluido amniótico, quando o aumento da concentração é expressivo (devendo ser

maior que 5 a 10 vezes o normal), ou por análise de DNA, quando as mutações são

conhecidas na família (Matalon et al., 1995b; Gordon, 2000). No entanto, a diversidade de

mutações associadas à Doença de Canavan em pacientes não-judeus limita o uso da análise

de DNA para diagnóstico pré-natal nesses pacientes (Namboodiri et al., 2006).

1.2.3.4 – Tratamento

Até o presente momento não há nenhum tratamento específico para a Doença de

Canavan, sendo atualmente apenas sintomático, devendo-se principalmente controlar a

ocorrência de convulsões (Matalon e Michals-Matalon, 1999). Recentemente foi sugerida a

suplementação dietária de acetato como adjuvante no tratamento da Doença de Canavan,

baseando-se na hipótese de que a alteração na síntese de lipídios por uma produção anormal

de acetato no cérebro possa contribuir para a fisiopatologia dessa doença (Namboodiri et

al., 2006). A possibilidade de terapia gênica tem sido avaliada, mas se encontra ainda em

estágio de estudos preliminares (McPhee et al., 2006; Matalon et al., 2006).

1.3 – Radicais Livres

1.3.1 – Definição

Um radical livre é qualquer espécie capaz de existência independente e que

contenha um ou mais elétrons desemparelhados (Southorn e Powis, 1988; Halliwell e

Gutteridge, 2007), situação energeticamente instável que confere alta reatividade a essas

espécies. Quando um radical livre reage com um não-radical, outro radical livre pode ser

formado, desencadeando reações em cadeia de transferência de elétrons (Maxwell, 1995;

Boveris, 1998). Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, o oxigênio

molecular (O

) sofre redução tetravalente, resultando na formação de duas moléculas de

água (H

O) (Bergendi et al., 1999). No entanto, aproximadamente 5% do oxigênio

utilizado

na cadeia respiratória mitocondrial não é completamente reduzido à água, sendo convertido

a intermediários reativos como radical superóxido (O

•−

), radical hidroxila (OH

•

), e

peróxido de hidrogênio (H

) (Cohen, 1989; Cadenas e Davies, 2000; Turrens, 2003)

(Figura 2), o que pode ser exacerbado em condições patológicas (Boveris e Chance, 1973).

•−

•

2 H

radical peróxido de radical

superóxido hidrogênio hidroxila

Figura 3. Redução tetravalente do oxigênio molecular (O

) na mitocôndria até a formação de água. Adaptado de Boveris, 1998.

O termo genérico Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) é usado para incluir não só

os radicais formados pela redução do O

•−

e OH

•

), mas também alguns não-radicais

derivados do oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H

), o oxigênio singlet (

), o

ácido hipocloroso e o ozônio (Halliwell e Gutteridge, 2007). Além das ERO, existem

diversas outras espécies radicalares, como os radicais de carbonato, de enxofre, de cloreto,

de brometo e ainda as Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN), sendo as principais

representantes o óxido nítrico (NO

•

) e o peroxinitrito (ONOO

), formado a partir da reação

do NO

•

com o O

ou, mais comumente, a partir da combinação do NO

•

com o O

•−

. De uma

forma geral, o termo Espécies Reativas (ER) é usado para englobar todas essas espécies.

1.3.2 – Efeitos das Espécies Reativas (ER) em Sistemas Biológicos

As ER ocorrem tanto em processos fisiológicos quanto patológicos do organismo.

Fisiologicamente, as ER apresentam diversas funções, dentre as quais a participação na

fagocitose (Bergendi et al., 1999), na síntese e regulação de proteínas, na plasticidade

sináptica e na sinalização celular, incluindo vias envolvidas nos processos de crescimento e

diferenciação celular (Ward e Peters, 1995; Serrano e Klann, 2004; Valko et al., 2007).

Por outro lado, quando formadas em excesso, as ER têm potencial de oxidar as

biomoléculas do organismo (Maxwell, 1995). Diversas ER podem promover diretamente

lipoperoxidação na bicamada lipídica (com exceção de H

, NO

●

e O

●-

), e podem reagir

também com proteínas das membranas celulares, alterando as características de fluidez de

membrana e levando, assim, à perda de seletividade na troca iônica e à liberação de

subprodutos potencialmente tóxicos, como o malondialdeído e o 4-hidroxinonenal (Ferreira

e Matsubara, 1997; Halliwell e Whiteman, 2004). Oxidando as proteínas, as ER podem

levar à inativação protéica, afetando a função de enzimas, receptores e proteínas de

transporte, levando conseqüentemente à alteração da função celular (Stadtman e Levine,

2003; Halliwell e Gutteridge, 2007). Na reação das ER com o DNA e RNA, o dano

oxidativo pode causar alteração de bases púricas e pirimídicas, levando a mutações

somáticas e a distúrbios de transcrição (Delanty e Dichter, 1998; Halliwell e Gutteridge,

2007).

As ER apresentam diferentes reatividades; em termos gerais, pode-se dizer que

, NO

•

e O

•−

reagem apenas com algumas poucas biomoléculas, enquanto que OH

•

reage rapidamente com quase todas as biomoléculas; as demais ER apresentam reatividades

intermediárias (Halliwell e Whiteman, 2004). Por não ser muito reativo, o O

•−

promove

um dano biológico altamente seletivo à inativação de algumas enzimas e oxidação de

poucas moléculas (Halliwell, 2001; Liang e Patel, 2004; Halliwell e Gutteridge, 2007); o

dano promovido pelo O

•−

geralmente envolve sua reação com outros radicais, como o NO

•

(gerando ONOO

), ou geração de outras espécies, como o H

(por dismutação espontânea

ou catalítica). Este, por sua vez, apesar de ser também pouco reativo, é capaz de gerar OH

•

altamente reativo, sempre que entrar em contato com íons Cu

ou Fe

(Reação de Fenton)

(Halliwell, 2001). Ao contrário do O

•−

, que não é capaz de iniciar a lipoperoxidação por

não ser suficientemente reativo para abstrair hidrogênios de lipídios, o OH

•

pode reagir

com todas as biomoléculas e inclusive iniciar prontamente a lipoperoxidação. O

é uma

forma especialmente reativa do oxigênio capaz de oxidar diversas moléculas, incluindo os

lipídios de membrana, gerando com isso hidroperóxidos lipídicos (Bergendi et al., 1999). A

partir da reação de radicais centrados em carbono com o O

, ou ainda a partir da

decomposição de peróxidos orgânicos, podem ser formados os radicais peroxila (RO

•

) e

alcoxila (RO

•

), excelentes agentes oxidantes que podem abstrair hidrogênios de outras

moléculas, sendo também importantes na lipoperoxidação (Halliwell e Gutteridge, 2007). O

ONOO

, formado principalmente a partir de NO

•

e O

•−

, é capaz de depletar grupos –SH e

outros antioxidantes e promover dano oxidativo a lipídios, DNA e proteínas (Halliwell,

2006; Halliwell e Gutteridge, 2007). Em pH fisiológico, o ONOO

é rapidamente protonado

à ácido peroxinitroso (ONOOH), extremamente reativo, capaz de oxidar e nitrar

diretamente lipídios, DNA e proteínas (Alvarez e Radi, 2003). O ONOOH pode ainda

causar um dano adicional, visto que pode sofrer fissão homolítica gerando OH

•

(Halliwell,

2006).

1.3.3 – Defesas Antioxidantes

Em condições normais, nosso organismo é protegido contra o dano oxidativo

induzido por ER pela atuação de vários antioxidantes, com diferentes funções, que

constituem um sistema de defesa tanto independente quanto cooperativo, ou mesmo

sinérgico. Por definição, antioxidante é qualquer substância capaz de retardar, prevenir ou

remover o dano oxidativo a uma molécula alvo (Halliwell e Gutteridge, 2007). Embora

diferindo de tecido para tecido em sua composição, as defesas antioxidantes estão

amplamente distribuídas e compreendem principalmente as enzimas antioxidantes, que

removem cataliticamente as ER, e os antioxidantes não-enzimáticos, agentes de baixo peso

molecular, que são preferencialmente oxidados pelas ER a fim de preservar biomoléculas

mais importantes.

1.3.3.1 – Enzimas Antioxidantes

As enzimas de defesa antioxidante operam como um sistema coordenado e

equilibrado, e atuam juntamente com outros antioxidantes ditos não-enzimáticos (como α-

tocoferol, ácido ascórbico e glutationa) a fim de proteger o organismo da injúria celular

causada pelo dano oxidativo.

A superóxido dismutase (SOD) é uma metaloenzima que catalisa a dismutação do

•-

, formando H

e O

•-

+ O

•-

+ 2H

→ H

+ O

) (Fridovich e McCord, 1969;

Bergendi et al., 1999; Halliwell e Gutteridge, 2007). As diferentes formas de SOD

presentes em animais compreendem: a CuZnSOD, formada por duas subunidades idênticas

contendo um Cu

e um Zn

em cada subunidade (Fridovich, 1975), que ocorre no citosol,

lisossomos, núcleo celular, espaço mitocondrial intermembranas e peroxissomas

(Fridovich, 1975; Fridovich, 1995; Ward e Peters, 1995); a SOD extracelular (EC-SOD),

subtipo da CuZnSOD, presente em fluidos extracelulares (Abrahamsson et al., 1992); e a

MnSOD, mitocondrial, com 4 subunidades, cada qual contendo um átomo de manganês. A

MnSOD mitocondrial é essencial; camundongos knock-out para MnSOD, que apresentam

uma redução de 30 a 80% na atividade dessa enzima, apresentam neurodegeneração com

morte celular e distúrbios motores severos, não sendo capazes de sobreviver mais do que

alguns dias após o nascimento (Melov et al., 1998; Gao et al., 2008).

A dismutação do O

•-

catalisada pelas SOD gera H

, que será decomposto

diretamente a O

por ação subseqüente da enzima antioxidante catalase (CAT). O

mecanismo de reação da CAT é, assim como o da SOD, essencialmente uma dismutação;

uma molécula de H

é reduzida a H

O e a outra é oxidada a O

(2 H

→ 2 H

O + O

A CAT está principalmente localizada nos peroxissomas, que contêm várias enzimas

produtoras de H

, e também no citosol (Chance et al., 1979; Ward e Peters, 1995).

A glutationa peroxidase (GPx) também atua decompondo o H

, através do

acoplamento de sua redução a H

O com a concomitante oxidação da glutationa reduzida

(GSH) ao dissulfeto de glutationa (GSSG) (H

+ 2 GSH → GSSG + 2 H

O). A GPx

geralmente localiza-se nas membranas celulares e é específica para GSH como doador de

hidrogênios, mas pode agir em outros peróxidos que não o H

, como hidroperóxidos

lipídicos, havendo a redução do grupo peróxido a um álcool, sendo por esse motivo

considerada um dos principais sistemas de defesa antioxidante presentes no organismo

humano, particularmente eficiente na proteção contra a lipoperoxidação (Wendel, 1981).

Existem basicamente dois tipos de GPx: uma que utiliza selênio como cofator (citosólica e

mitocondrial); e outra que não depende de selênio (citosólica, responsável pela

metabolização de hidroperóxidos orgânicos). A primeira apresenta quatro subunidades,

cada uma contendo um átomo de selênio em seu sítio ativo. Daí a importância da ingestão

de traços de selênio na dieta, elemento essencial, que irá proporcionar o cofator necessário

para a ação desta GPx.

1.3.3.2 – Antioxidantes Não-enzimáticos

Os antioxidantes não-enzimáticos podem ser definidos como substâncias que, em

baixas concentrações em relação ao substrato oxidável, retardam ou previnem a oxidação

desse substrato, dessa forma protegendo contra a oxidação de biomoléculas por ER

(Halliwell e Gutteridge, 2007; Fang et al., 2002). Dentre eles, destacam-se o ácido

ascórbico, o α-tocoferol e a GSH.

O ácido ascórbico, também conhecido como Vitamina C, é uma vitamina

hidrossolúvel essencial, devendo ser obtida através da dieta por incapacidade de ser

sintetizada (Halliwell e Gutteridge, 2007). Está presente em altas concentrações no SNC,

em níveis maiores no LCR do que no plasma (Lonnrot et al., 1996). Tem como funções a

regeneração do α-tocoferol, e a importante atuação como scavenger de ER, incluindo o O

•-

, RO

•

, RO

•

, OH

•

, ONOOH,

, além de outras espécies (Halliwell, 2001; Halliwell e

Gutteridge, 2007).

Já o α-Tocoferol, por ser lipossolúvel, está presente nas membranas celulares, nas

mitocôndrias e em lipoproteínas plasmáticas. Quando reage com uma ER, forma-se o

radical tocoferoxil, que pode ser regenerado à α-tocoferol pelo ácido ascórbico ou pela

GSH (Sokol, 1989; Ward e Peters, 1995; Halliwell e Gutteridge, 2007). É um antioxidante

muito potente capaz de inibir a lipoperoxidação (Valko et al., 2007), visto que seu

grupamento fenólico –OH rapidamente reage com RO

•

, convertendo-os em radicais

tocoferoxila, inibindo com isso a propagação dessa reação em cadeia (Halliwell, 2001).

A GSH, por sua vez, é um tripeptídio formado por glutamato, cisteína e glicina,

sendo o principal tiol intracelular de baixo peso molecular presente na maioria das células.

É um antioxidante endógeno que atua sinergicamente com o α-tocoferol e com o ácido

ascórbico, sendo fundamental para mantê-los nas suas formas reduzidas. Atua também

como um cofator enzimático, sendo particularmente importante na reação catalisada pela

GPx, enzima que decompõe peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos lipídicos. Além disso,

desempenha outras funções como a proteção de grupos –SH de proteínas contra oxidação, e

a manutenção da comunicação intercelular, além de servir como uma forma atóxica de

depósito e armazenamento de cisteína (Meister, 1991; Anderson, 1998; Halliwell e

Gutteridge, 2007). A GSH que foi oxidada será posteriormente regenerada às custas de

NADPH através da ação da enzima glutationa redutase (GSSG + NADPH + H

→ 2 GSH

+ NADP

) (Chance et al., 1979; Ward e Peters, 1995). Com isso garante-se que a glutationa

esteja na maior parte em sua forma reduzida, o que é essencial para sua ação como redutora

de outras moléculas biológicas.

1.3.4 – Estresse Oxidativo

Em condições normais, a produção de ER é em sua maior parte balanceada pelos

sistemas de defesa antioxidante do organismo. No entanto, quando há um desequilíbrio

entre a produção de ER e a defesa antioxidante, tem-se a condição de estresse oxidativo.

Esse distúrbio no equilíbrio pró-oxidante/antioxidante, com favorecimento do primeiro,

pode resultar tanto de uma diminuição das defesas antioxidantes quanto de uma produção

aumentada de ER, bem como da liberação de metais de transição ou a combinação de

quaisquer desses fatores (Halliwell, 2001). A diminuição dos níveis de antioxidantes pode

ocorrer por mutações que afetem as atividades enzimáticas ou toxinas que as depletem, ou

ainda por deficiências de minerais e/ou antioxidantes essenciais provenientes da dieta. Já a

produção aumentada de ER pode ser devida à exposição a níveis aumentados de O

ou à

toxinas que sejam elas próprias ER, ou que sejam metabolisadas gerando ER, como o

pesticida Paraquat, ou ainda pela excessiva ativação de sistemas fisiológicos de geração de

ER, como a hiperativação fagocitária em doenças inflamatórias crônicas (Halliwell e

Whiteman, 2004). As conseqüências do estresse oxidativo podem incluir: adaptação (que

geralmente resulta em up-regulation da síntese de sistemas de defesa antioxidante a fim de

restaurar o equilíbrio oxidante/antioxidante); injúria celular (que envolve dano às

biomoléculas do organismo, sendo esse dano oxidativo ou por alteração nos níveis de íons

ou por ativação de proteases), que pode gerar produtos altamente neurotóxicos como o

malondialdeído e o 4-hidroxinonenal; ou ainda morte celular por necrose ou apoptose

(Halliwell e Gutteridge, 2007).

1.3.4.1 – Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas

O estresse oxidativo pode ser extremamente danoso ao SNC; um dano às proteínas

do citoesqueleto dos neurônios, por exemplo, pode levar à disfunção neuronal, podendo

inclusive chegar à degeneração axonal e morte neuronal (Halliwell e Gutteridge, 2007).

Esse potencial exacerbado de dano oxidativo ao cérebro deve-se à particular

susceptibilidade do mesmo ao estresse oxidativo, especialmente devido: ao seu elevado

consumo de oxigênio, já que processa uma grande quantidade de O

por unidade de massa

tecidual; ao seu alto conteúdo de ferro, que pode favorecer a lipoperoxidação; ao seu alto

conteúdo lipídico, principalmente lipídios de cadeia lateral altamente poliinsaturada, que

são extremamente suscetíveis à lipoperoxidação; à sua modesta defesa antioxidante, sendo

os níveis de catalase particularmente baixos em muitas regiões cerebrais; alta taxa de fluxo

de cálcio através das membranas neuronais; e a presença de neurotransmissores auto-

oxidáveis, entre outros fatores (Halliwell, 1996; Halliwell e Gutteridge, 2007).

De fato, as ER e o estresse oxidativo parecem estar envolvidos na patogênese dos

danos neurológicos de várias doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer,

Parkinson e Huntington, a esclerose múltipla e a esclerose lateral amiotrófica, doenças

cerebrovasculares, epilepsia, desmielinização e demência, entre outras (Reznick e Packer,

1993; Maxwell, 1995; Delanty e Dichter, 1998; Emerit et al., 2004; Halliwell e Gutteridge,

2007). Ainda, diversos estudos realizados em nosso grupo de pesquisa revelaram que o

estresse oxidativo parece estar aumentado em modelos experimentais químicos de alguns

erros inatos do metabolismo, como a hiperprolinemia tipo II (Delwing et al., 2003), a

hiperargininemia (Wyse et al., 2001), a fenilcetonúria (Kienzle-Hagen et al., 2002) e a

homocistinúria (Matté et al., 2004), e também em um modelo experimental knock-out de

acidemia glutárica tipo I (Latini et al., 2007). Porém, existem ainda incertezas e

controvérsias no que diz respeito ao estresse oxidativo ser a causa ou a conseqüência das

doenças nas quais está envolvido (Halliwell, 1994).

Experimentalmente, a medida de parâmetros de estresse oxidativo pode incluir:

* A avaliação das defesas antioxidantes não-enzimáticas, através das medidas do

Potencial Antioxidante Total (TRAP) e da Reatividade Antioxidante Total (TAR), que

avaliam, respectivamente, a quantidade e a reatividade dos antioxidantes não-enzimáticos

presentes no tecido, e também através das medidas do conteúdo de antioxidantes não-

enzimáticos específicos, como ácido ascórbico e glutationa;

* A avaliação das defesas antioxidantes enzimáticas, através da medida das

atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e

glutationa peroxidase (GPx), e também através da medida da atividade da enzima glicose-6

fosfato desidrogenase (G6PD), que é a principal fonte celular de NADPH;

* A avaliação de dano oxidativo a lipídios, através das medidas de

quimiluminescência espontânea e de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBA-

RS);

* A avaliação de dano oxidativo protéico, através das medidas do conteúdo de

carbonilas e de tióis totais;

* A avaliação do status redox celular, através da medida do conteúdo de tióis (SH),

dissulfetos (SS), e da razão SH/SS; e

* A avaliação da formação de espécies reativas, através das medidas de

fluorescência da diclorofluoresceína (DCF) e do conteúdo de peróxido de hidrogênio.

OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi investigar o possível papel do estresse oxidativo

na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e do ácido N-acetilaspártico, bem como de seu

metabólito, o ácido N-acetilaspartilglutâmico, através do estudo dos efeitos in vitro e in

vivo desses ácidos orgânicos sobre diversos parâmetros de estresse oxidativo em cérebro de

ratos, a fim de avaliar o envolvimento de ER nos mecanismos responsáveis pela disfunção

neurológica observada nos pacientes afetados pela deficiência de GS, na qual se encontra

acumulada a 5-oxoprolina, e pela Doença de Canavan, na qual se encontram acumulados os

ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico.

Os objetivos específicos deste trabalho foram:

* Estudar os efeitos in vitro da 5-oxoprolina sobre os conteúdos de carbonilas e de

tióis totais, para avaliar o dano oxidativo protéico, e sobre a fluorescência da

diclorofluoresceína (DCF), para avaliar a formação de espécies reativas, em córtex cerebral

e cerebelo de ratos de 14 dias de vida.

* Estudar os efeitos da administração aguda de 5-oxoprolina em córtex cerebral e

cerebelo de ratos de 14 dias de vida sobre o Potencial Antioxidante Total (TRAP), e os

conteúdos de glutationa reduzida (GSH) e ácido ascórbico, para avaliar as defesas

antioxidantes não-enzimáticas do tecido; a quimiluminescência espontânea e os níveis de

Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBA-RS), ambos parâmetros de

lipoperoxidação; o conteúdo de carbonilas; o conteúdo de peróxido de hidrogênio; o

conteúdo de tióis e dissulfetos, para avaliar a razão SH/SS; a medida da atividade das

enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase

(GPx), para acessar as defesas antioxidantes enzimáticas do tecido; e a medida da atividade

da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD), para avaliar a principal fonte celular de

NADPH (via da pentose fosfato).

* Estudar os efeitos in vitro e in vivo do ácido N-acetilaspártico sobre TRAP, TAR e

conteúdo de GSH; quimiluminescência espontânea e TBA-RS; conteúdos de tióis totais e

de carbonilas; conteúdo de peróxido de hidrogênio; atividades das enzimas antioxidantes

CAT, SOD e GPx; e atividade da G6PD em córtex cerebral de ratos de 14 e 30 dias de vida.

* Estudar os efeitos in vitro e in vivo do ácido N-acetilaspartilglutâmico sobre

TRAP e conteúdo de GSH; quimiluminescência espontânea e TBA-RS; conteúdo de

carbonilas; atividades das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx; e atividade da enzima

G6PD em córtex cerebral de ratos de 14 e 30 dias de vida.

PARTE II

Capítulo I

5-oxoproline reduces non-enzymatic antioxidant defenses in vitro in rat

brain*

Artigo publicado na revista Metabolic Brain Disease

Metab. Brain Dis. 22: 51-65, 2007.

* Nesse capítulo, os resultados referentes à essa tese de doutorado são apenas os

demonstrados nas Figuras 3, 4 e 5 desse artigo.

Capítulo II

Acute administration of 5-oxoproline induces oxidative damage to lipids and

proteins and impairs antioxidant defenses in cerebral cortex and cerebellum

of young rats

Artigo submetido à revista Molecular and Cellular Biochemistry

Acute administration of 5-oxoproline induces oxidative damage to lipids and

proteins and impairs antioxidant defenses in cerebral cortex and cerebellum of

young rats

Carolina Didonet Pederzolli

1,2

, Caroline Paula Mescka

, Bernardo Remuzzi Zandoná

Daniella de Moura Coelho

, Ângela Malysz Sgaravatti

1,2

, Mirian Bonaldi Sgarbi

, Angela

Terezinha de Souza Wyse

1,2

, Clóvis Milton Duval Wannmacher

1,2

, Moacir Wajner

1,2,3

Carmen Regla Vargas

and Carlos Severo Dutra-Filho

1,2

Affiliation:

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brazil.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, Instituto de Ciências

Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.

Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), Porto Alegre,

RS – Brazil.

* Corresponding Author:

Carlos Severo Dutra Filho

Departamento de Bioquímica, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua

Ramiro Barcelos, 2600 - Anexo, CEP 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil, Phone: +55 51

3308 5573

Fax: +55 51 3308 5535

E-mail: dutra@ufrgs.br

Abstract

5-Oxoproline accumulates in glutathione synthetase deficiency, an autossomic

recessive inherited disorder clinically characterized by hemolytic anemia, metabolic

acidosis, and severe neurological symptoms whose mechanisms are poorly known. In the

present study we investigated the effects of acute subcutaneous administration of 5-

oxoproline to verify whether oxidative stress is elicited by this metabolite in vivo in

cerebral cortex and cerebellum of 14-day-old rats. Our results showed that the acute

administration of 5-oxoproline is able to promote both lipid and protein oxidation, to impair

brain antioxidant defenses, to alter SH/SS ratio and to enhance hydrogen peroxide content,

thus promoting oxidative stress in vivo, a mechanism that may be involved in the

neuropathology of gluthatione synthetase deficiency.

Keywords: 5-Oxoproline; glutathione synthetase deficiency; oxidative stress;

antioxidant defenses

Introduction

5-Oxoproline (5-OP), also known as L-pyroglutamic acid, accumulates in

cerebrospinal fluid, blood and urine from patients affected by moderate and severe forms of

glutathione synthetase (GS) deficiency, an autosomal recessive inherited disorder of the γ-

glutamyl cycle [1-5]. About 70 patients have been described worldwide with GS deficiency

(MIM 266130) [4]. Patients with the severe form of the disease present hemolytic anemia

and metabolic acidosis; moreover, almost half of the patients also develop progressive

neurological symptoms, including seizures, mental retardation, ataxia, psychomotor delay

and spasticity [3,5,6]. Approximately 25% of all affected patients die during childhood [7].

The neuropathological findings of GS deficiency include selective atrophy of the granule

cell layer of the cerebellum, focal lesions in frontoparietal cortex and bilateral lesions in

visual cortex [8,9].

The mechanisms of brain damage in this disease remain not fully understood.

However, 5-OP exhibits neurotoxic actions [10,11], promotes excitotoxicity [12-15] and

inhibits brain energy metabolism [16,17]. Recent findings from our laboratory showed that

5-OP causes protein oxidation, reactive species production and decreases the non-

enzymatic antioxidant defenses in vitro in rat brain homogenates [18].

Since excitotoxicity and brain energy metabolism impairment have already been

related to oxidative stress [19-21], it seems feasible that altogether these processes may act

sinergistically in vivo. So, in the present study we investigated the in vivo effects of 5-OP

on oxidative stress parameters in rat cerebral cortex and cerebellum of 14-day-old rats. To

accomplish this, the effect of acute subcutaneous administration of 5-OP was studied on the

following oxidative stress parameters: spontaneous chemiluminescence and thiobarbituric

acid-reactive substances (TBA-RS), to assess lipid peroxidation; protein carbonyl content,

to evaluate protein oxidation; total radical-trapping antioxidant potential (TRAP), as well as

ascorbic acid and reduced glutathione (GSH) contents, to evaluate non-enzymatic

antioxidant defenses; activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide

dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), to assess enzymatic antioxidant

defenses; activity of glucose 6-phospate dehydrogenase (G6PD), to evaluate the main

cellular source of NADPH (pentose phosphate pathway); thiol (SH) and disulfide (SS)

contents, to evaluate SH/SS ratio; and hydrogen peroxide content.

Materials and Methods

Materials

All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA) except for 2,2’-

azo-bis-(2-amidinopropane) that was purchased from Wako Chemicals (USA). 5-OP

solutions were freshly prepared in saline solution, and the pH was adjusted to 7.4.

Animals

Fourteen-day-old Wistar rats bred in the Department of Biochemistry, ICBS,

UFRGS, from both sexes, were used. Rats were kept with dams until they were killed. The

dams had free access to water and a 20% (w/w) protein commercial chow (Supra, Porto

Alegre, RS, Brazil). They were kept in a room with 12:12 h light/dark cycle (lights on

07:00-19:00 h) and with air-conditioned controlled temperature (22°C ± 1°C). The NIH

‘Guide for the Care and Use of Laboratory Animals’ (NIH publication # 80-23, revised

1996) (National Institutes of Health, 1996) was followed in all experiments.

Acute administration of 5-OP and tissue preparation

Rats received subcutaneously the dose of 1g/kg body weight of 5-OP or saline

solution (controls). One hour after a single injection of saline or 5-OP solution, rats were

killed by decapitation, and the brain was immediately removed and kept on a Petry dish

placed on ice. The olfactory bulb, pons and medulla were discarded and cerebral cortex and

cerebellum were dissected, weighed and kept chilled until homogenization. These

procedures lasted up to 3 min. Cerebral cortex and cerebellum were homogenized in 10

volumes (1:10, w/v) of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 containing 140 mM KCl.

Homogenates were centrifuged at 750 g for 10 min at 4ºC to discard nuclei and cell debris

[22,23]. The pellet was discarded and the supernatant was immediately separated and used

for the measurements.

5-oxoproline quantification

To ensure that the dose of 5-OP injected subcutaneously achieved satisfactory

plasma and brain levels, aliquots were taken to measure the levels of this organic acid in

plasma and brain of rats submitted to acute administration of 5-OP. One hour after

receiving a single subcutaneous injection of 5-OP at a dose of 1g/kg body weight, rats were

killed by decapitation and had their blood collected into heparinized tubes and processed

for plasma separation. Their brain was also rapidly removed and homogenized in saline

solution (0.9% NaCl). Plasma samples and cerebral homogenates were centrifuged at 400 g

for 10 min and 750 g for 10 min, respectively. The supernatants obtained were carefully

removed for 5-OP determination. 5-OP content was determined by Gas Cromatography-

Mass Spectrometry (GC/MS) [24] using margaric acid as the internal standard.

Spontaneous chemiluminescence

Samples were assayed for spontaneous chemiluminescence in a dark room [23]

using a beta liquid scintillation spectrometer Tri-Carb 2100TR. The background

chemiluminescence was measured for 5 min in vials containing 3.5 mL of the same buffer

used for homogenization. An aliquot of 0.5 mL of supernatant was added and spontaneous

chemiluminescence was measured for 10 minutes at room temperature. The background

chemiluminescence was subtracted from the total value. Spontaneous chemiluminescence

was calculated as counts per second (CPS)/mg protein.

Thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS)

TBA-RS was measured according to Ohkawa et al. (1979) [25]. Briefly, to glass

tubes were added, in order of appearence: 500 µL of tissue supernatant; 50 µL of SDS

8.1%; 1500 µL of 20% acetic acid in aqueous solution (v/v) pH 3.5; 1500 µL of 0.8 %

thiobarbituric acid; and 700 µL of distilled water. The mixture was vortexed and the

reaction was carried out in a boiling water bath for 1 hour. The mixture was allowed to cool

on water for 5 min, and was centrifuged 750 g for 10 min. The resulting pink stained TBA-

RS were determined spectrophotometrically at 535 nm. A calibration curve was generated

using 1,1,3,3-tetramethoxypropane as a standard. TBA-RS were calculated as nmol TBA-

RS/mg protein.

Protein carbonyl content

Oxidatively modified proteins present an enhancement of carbonyl content [26,27].

In this study, protein carbonyl content was assayed by a method based on the reaction of

protein carbonyls with dinitrophenylhydrazine forming dinitrophenylhydrazone, a yellow

compound, measured spectrophotometrically at 370 nm [28]. Briefly, 100 µL of

homogenate were added to plastic tubes containing 400 µL of 10 mM

dinitrophenylhydrazine (prepared in 2 M HCl). This was kept in the dark for 1 hour and

vortexed each 15 minutes. After that, 500 µL of 20% trichloroacetic acid were added to

each tube. The mixture was vortexed and centrifuged at 20,000 g for 3 minutes. The

supernatant obtained was discarded. The pellet was washed with 1 mL ethanol:ethyl acetate

(1:1, v/v), vortexed and centrifuged at 20,000 g for 3 minutes. The supernatant was

discarded and the pellet re-suspended in 600 µL of 6 M guanidine (prepared in a 20 mM

potassium phosphate solution pH 2.3). The sample was vortexed and incubated at 60

C for

15 minutes. After that, it was centrifuged at 20,000 g for 3 minutes and the absorbance was

measured at 370 nm (UV) in a quartz cuvette. Results were represented as protein carbonyl

content (nmol/mg protein).

Total radical-trapping antioxidant potential (TRAP)

TRAP was determined by measuring the chemiluminescence intensity of luminol

induced by 2,2’-azo-bis-(2-amidinopropane) (ABAP) thermolysis [29,30] in a Wallac 1409

Scintillation Counter. Three mL of ABAP 10 mM, dissolved in 50 mM sodium phosphate

buffer pH 7.4, plus 10 µL of luminol (5.6 mM) were added to a glass scintillation vial, and

the initial chemiluminescence was measured. Ten µL of 160 µM Trolox (water-soluble α-

tocopherol analogue, used as a standard) or 10 µL of tissue supernatant were then added to

that vial, producing a decrease in the initial chemiluminescence value. This value is kept

low until the antioxidants present in the sample are depleted, then chemiluminescence

returns to its initial value. The time taken by the sample to keep chemiluminescence low is

directly proportional to the antioxidant capacity of the tissue, so TRAP represents the

amount (quantity) of non-enzymatic antioxidants present in the sample. Results were

represented as nmol Trolox/mg protein.

Ascorbic acid content

Ascorbic acid content was measured according to Omaye et al. (1979) [31]. The

method is based on the reduction of dichlorophenolindophenol (DCIP) by ascorbic acid at

pH 3-4.5, which promotes a decrease in the absorbance measured spectrophotometrically at

520 nm. The non-specific reduction of DCIP by thiolic compounds was inhibited by the

addition of p-hydroxymercurobenzoic acid (pHMB) to the buffer. Initially, 600 µL of the

tissue homogenates were added to plastic tubes containing 300 µL of citrate/acetate buffer

pH 4.15 with pHMB. Each sample was then vortexed and reacted with 300 µL of DCIP and

the absorbance at 520 nm was read after 30 seconds. A calibration curve was generated

using commercial ascorbic acid solution as a standard. Ascorbic acid content was expressed

as µg ascorbic acid/mg tissue.

Reduced glutathione (GSH) content

This method is based on the reaction of GSH with the fluorophore ο-phtalaldeyde

(OPT) after deproteinizing the samples, and was measured according to Browne and

Armstrong (1998) [32]. Initially, metaphosphoric acid was used to deproteinize the

samples, which were then centrifuged at 1000 g for 10 min. Briefly, to 100 µL of each

supernatant were added 2 mL of sodium phosphate buffer pH 8.0 and 100 µL OPT 1

mg/mL (prepared in metanol). The mixture was vortexed and allowed to stand in the dark

for exactly 15 minutes. After that, the fluorescence was measured at λ

= 420 nm and λ

350 nm. A calibration curve was also performed with a commercial GSH solution, and the

results were expressed as µmol GSH/mg protein.

Catalase assay

CAT activity was assayed using a double-beam spectrophotometer with temperature

control (Hitachi U-2001). This method is based on the disappearance of H

at 240 nm in

a reaction medium containing 20 mM H

, 0.1% Triton X-100, 10 mM potassium

phosphate buffer pH 7.0, and 0.1-0.3 mg protein/mL [33]. One CAT unit is defined as one

µmol of hydrogen peroxide consumed per minute and the specific activity is expressed as

CAT units/mg protein.

Superoxide dismutase assay

This method for the assay of SOD activity is based on the capacity of pyrogallol to

autoxidize, a process highly dependent on O

●-

, which is substrate for SOD [34]. The

inhibition of autoxidation of this compound occurs in the presence of SOD, whose activity

can be then indirectly assayed spectrophotometrically at 420 nm, using a double-beam

spectrophotometer with temperature control (Hitachi U-2001). A calibration curve was

generated with purified SOD as a standard, in order to calculate the activity of SOD present

in the samples. The results were expressed as SOD units/mg protein.

Glutathione peroxidase assay

GPx activity was measured using tert-butyl-hydroperoxide as substrate [35].

NADPH disappearance was monitored at 340 nm using a double-beam spectrophotometer

with temperature control (Hitachi U-2001). The medium contained 2 mM glutathione, 0.15

U/mL glutathione reductase, 0.4 mM azide, 0.5 mM tert-butyl-hydroperoxide and 0.1 mM

NADPH. One GPx unit is defined as one µmol of NADPH consumed per minute and the

specific activity is expressed as GPx units/mg protein.

Glucose 6-phosphate dehydrogenase assay

G6PD activity was measured according to Leong and Clark (1984) [36]. The

method is based on the formation of NADPH at 340 nm in a rection medium containing

100 mM Tris-Hydrochloryde buffer pH 7.5, 10 mM magnesium chloryde, 0.1% triton X-

100, 0.5 mM NADP

, 1 mM glucose 6-phosphate and 0.1-0.3 mg protein/mL. One G6PD

unit is defined as one µmol of NADPH produced per minute and the specific activity is

expressed as G6PD units/mg protein.

Hydrogen peroxide content

The method used to measure hydrogen peroxide was based on the horseradish

peroxidase-mediated oxidation of phenol red by hydrogen peroxide, which results in the

formation of a compound with increased absorbance at 610 nm [37]. Briefly, 400 mg

cerebral cortex and 100 mg cerebellum were chopped with a McIlwainn chopper and cut in

two perpendicular directions to produce 400 µm wide prisms. Cortical or cerebellar prisms

were pooled and added to a glass vial containing 5.5 mM dextrose buffer pH 7.0, and the

mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After that, a 60 µL

supernatant aliquot was taken and reacted with 235 µL of a medium containing 50 mM

sodium phosphate buffer pH 7.4, 85 µL of horseradish peroxidase and 1 mg/mL phenol red

(phenolsulfonphtalein). The reaction was carried out protected from light for 10 minutes.

After that, 5 µL of 1 N NaOH were added to each tube and the absorbance was read at 610

nm. A calibration curve was performed with commercial solution of hydrogen peroxide.

Results were expressed as nmol hydrogen peroxide/mg tissue.

Thiol and disulfide content (SH/SS ratio)

Thiols (SH) and disulfides (SS) were determined according to Zahler and Cleland

(1968) [38]. The method is based on the reaction of DTNB with the samples, producing a

yellow product, thionitrobenzoic acid (TNB). For total thiol and disulfide determination,

the reaction medium consisted of 25 µL of 50 mM Tris buffer pH 9.0, 25 µL of 3 mM

dithiothreitol (DTT) and 100 µL of sample supernatant. After 15 min at room temperature,

50 µL of 1.0 M Tris buffer pH 8.1 and 700 µL of sodium arsenite were added. After 3 min,

25 µL of 3 mM 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) in 50 mM acetate buffer pH 5.0

were added and the absorbance was recorded for 3 min at 412 nm. For thiol determination,

almost the same procedure was performed, only being ommited DTT and sodium arsenite

from the reaction medium. Instead of them, an equal volume of distilled water was added to

the medium. The disulfide content was calculated through the difference between the two

determinations. The SH/SS ratio was also calculated. Results were expressed as nmol

TNB/mg protein.

Protein determination

Protein concentration was determined in cerebral cortex and cerebellum

supernatants using bovine serum albumin (BSA) as a standard [39].

Statistical analysis

Statistical analysis was performed by the Student’s t test for unpaired samples. All

analyses were performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS)

software in a PC-compatible computer. A value of p < 0.05 was considered to be

significant.

Results

Initially, we measured plasmatic and cerebral levels of 5-OP after a single

subcutaneous injection of 5-OP (1g/kg body weight). Plasma and brain average levels of 5-

OP determined by GC-MS were 2.82 mM and 0.80 mM (number of rats = 4), respectively.

Control rats receiving equal volume of saline showed 5-OP levels of 0.06 mM in plasma,

whereas 5-OP was not detected in the brain.

Next we investigated spontaneous chemiluminescence and TBA-RS, considered as

lipid peroxidation parameters. Figure 1A depicts that 5-OP markedly enhanced spontaneous

chemiluminescence in cerebral cortex [t(10)=8.17; p<0.01] and cerebellum [t(10)=8.47;

p<0.01] homogenates. Acute administration of 5-OP also caused a significant enhancement

of TBA-RS levels in both cerebral cortex [t(10)=5.19, p<0.01] and cerebellum [t(10)=5.72,

p<0.01] (Figure 1B). These results indicate the promotion of lipid peroxidation by 5-OP.

We also investigated whether tissue proteins were affected by acute administration

of 5-OP. To accomplish that, we measured protein carbonyl content. Figure 1C shows that

protein carbonyl content was significantly enhanced in cerebral cortex [t(10)=5.64; p<0.01]

and in cerebellum [t(10)=5.01; p<0.01], indicating the occurrence of oxidized proteins.

Next, we evaluated the in vivo effect of 5-OP on non-enzymatic antioxidant

defenses in rat cerebral cortex and cerebellum. Initially we measured TRAP, which

evaluates the quantity of non-enzymatic antioxidants present in the samples. Figure 1D

shows that TRAP was significantly reduced by 5-OP in vivo as compared to control both in

cerebral cortex [t(10)=4.94; p<0.01] and cerebellum [t(10)=4.30; p<0.01]. After that, we

evaluated the contents of the specific non-enzymatic antioxidants ascorbic acid and GSH.

Their contents were not affected by acute administration of 5-OP (Table 1). Ascorbic acid

content was not altered both in cerebral cortex [t(6)=0.37; p>0.05] and in cerebellum of

young rats [t(6)=0.84; p>0.05]. GSH content was equally not affected by acute

administration of 5-OP neither in cerebral cortex [t(14)=0.36; p>0.05] nor in cerebellum

[t(14)=0.99; p>0.05].

Then we decided to study the effect of acute administration of 5-OP on the brain

enzymatic antioxidant defenses. The activities of the antioxidant enzymes CAT, SOD and

GPx were assayed, as well as the activity of glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD).

Acute administration of 5-OP significantly inhibited the activity of CAT (Figure 2A) in

cerebral cortex of young rats [t(6)=4.08; p<0.01]. However, this organic acid caused no

effect on this activity in the cerebellum [t(10)=1.29; p>0.05]. Likewise, the activity of GPx

(Figure 2B) was also inhibited by 5-OP in cerebral cortex [t(12)=2.55; p<0.05] but not in

the cerebellum [t(10)=1.59; p>0.05]. The activity of SOD (Figure 2C) was not altered by

acute administration of 5-OP in cerebral cortex [t(6)=0.28; p>0.05] and cerebellum

[t(10)=0.30; p>0.05] (Figure 7B). The activity of G6PD (Figure 2D), on the other hand,

was inhibited by 5-OP in vivo only in cerebral cortex [t(6)=4.36; p<0.01] and not in

cerebellum [t(6)=1.84; p>0.05]. These results clearly show an impairment in the enzymatic

antioxidant defenses in cerebral cortex of rats submitted to acute administration of 5-OP.

Since hydrogen peroxide is a substrate for both CAT and GPx and the activities of

these enzymes were inhibited by 5-OP, we decided to measure hydrogen peroxide content.

We found that acute administration of 5-OP was able to enhance hydrogen peroxide content

both in cerebral cortex [t(14)=2.52; p<0.05] and cerebellum [t(10)=8.11; p<0.01] (Figure

3).

Finally we measured thiol and disulfide content, as well as the SH/SS ratio in brain

homogenates. Table 2 shows that 5-OP acute administration caused no alteration on SH

content neither in cerebral cortex [t(8)=1.63; p>0.05] nor in the cerebellum [t(10)=0.07;

p>0.05]. In contrast, SS content was interestingly enhanced in cerebral cortex [t(8)=3.21;

p<0.05] and also in cerebellum [t(10)=3.19; p<0.05]. In fact, the increase of SS content was

high enough to reduce SH/SS ratio both in cerebral cortex [t(7)=3.41; p<0.05] and in the

cerebellum [t(8)=7.55; p<0.01].

Discussion

Patients affected by severe forms of GS deficiency present 5-OP accumulation as a

biochemical hallmark and are clinically characterized by progressive neurological

dysfunction with mental retardation, ataxia, spasticity and seizures. The underlying

mechanisms of brain damage in this disorder remain far poorly known. Although low GSH

levels were postulated as a mechanism of cerebral injury in GS deficiency, recent studies

suggest that low GSH levels are not the only determinant of neurodegeneration in these

patients, and that 5-OP itself may be deleterious to the CNS [4,6,40,41].

Along with the already reported neurotoxic actions for 5-OP of excitotoxicity

[11,12,14] and impairment of brain energy metabolism [10,16,17], we have recently

reported a role of oxidative stress in 5-OP neurotoxicity [18].

In the present study we investigated the in vivo effects of 5-OP on oxidative stress

parameters in rat cerebral cortex and cerebellum of 14-day-old rats. Initially, we measured

plasmatic and cerebral levels of 5-OP induced by a single dose of 1 g/kg body weight of 5-

OP injected subcutaneously to rats. Blood and CSF levels of 5-OP in GS-deficient patients

reported in the literature are in the range of 2-5 mM and 1-3 mM, respectively [42,43]

while physiological concentrations of 5-OP are approximately 40 µM in CSF and 50 µM in

plasma [44]. The values obtained in our study were similar to those present in GS-deficient

patients, ensuring that our acute model could be further used to study the in vivo effects of

5-OP on oxidative stress parameters.

We then investigated the effect of acute administration of 5-OP on the lipid

peroxidation parameters spontaneous chemiluminescence and TBA-RS. We observed that

5-OP administration significantly enhanced spontaneous chemiluminescence and TBA-RS

levels in cerebral cortex and cerebellum indicating that 5-OP promotes lipid peroxidation in

vivo in rat cerebral cortex and cerebellum. Light in the chemiluminescence assay can arise

mainly from excited carbonyls,

, ONOO

and from peroxidizing lipids as a result of

increased reactive species production; TBA-RS levels, on the other hand, reflects the

amount of malondialdehyde, which is end product of lipid peroxidation [45]. Therefore, the

enhancement of these parameters promoted by 5-OP in vivo indicates an induction of lipid

oxidative damage by this compound. Since these results were not observed previously in

vitro [18], it is suggested that 5-OP may not directly elicit lipid peroxidation but rather

induce an indirect effect, probably involving enhanced generation of reactive species that

trigger lipid peroxidation. It should be pointed out that some reactive species, such as H

●-

, and NO

●

, are not directly able to trigger lipid peroxidation whereas OH

●

and ONOO

can directly initiate oxidative damage to lipids [45].

We also verified that protein carbonyl content was significantly enhanced in

cerebral cortex and cerebellum by 5-OP in vivo administration, indicating protein oxidative

damage. These results corroborate our previous in vitro findings [18], and so it seems

feasible to conclude that 5-OP is able to promote oxidation of proteins both in vitro and in

vivo.

With regard to the antioxidant defense system, 5-OP significantly reduced the

overall content of non-enzymatic antioxidants, measured as TRAP, both in cerebral cortex

and cerebellum, which is in line with our previous in vitro findings [18]. However, ascorbic

acid and GSH levels were not affected by acute administration of 5-OP, suggesting that

TRAP reduction observed in vivo is not due to a decrease of GSH or ascorbic acid. In the

brain, there are other non-enzimatic antioxidants that may account for the TRAP values,

including α-tocopherol, metal-binding proteins, melatonine, and carnosine [46,47].

Considering that antioxidant proteins account for aproximately 40% of the TRAP values

[30] and that in the present study 5-OP promoted oxidative damage to proteins, it seems

possible that the TRAP reduction observed could be, at least in part, due to a reduction in

the antioxidant action of proteins, which could be impaired by the oxidative damage

promoted by 5-OP.

On the other hand, with respect to the enzymatic antioxidant defenses, the acute

administration of 5-OP significantly inhibited the activities of CAT and GPx in cerebral

cortex of young rats, with no alteration of these enzyme activities in cerebellum. As CAT

and GPx activities were not affected in vitro by 5-OP [18], it is presumed that the inhibition

of these enzymes in vivo occurred through an indirect effect of this organic acid. In

contrast, the activity of SOD was not altered by acute administration of 5-OP in cerebral

cortex and cerebellum. Altogether, these results show an impairment in the enzymatic

antioxidant defenses in cerebral cortex of rats subjected to acute administration of 5-OP.

Interestingly, absolute and relative activities of the antioxidant enzymes are higher in

cerebellum than in cerebral cortex, which could generate different responses to oxidative

stress [48,49].

The activity of G6PD was also measured in cerebral cortex and cerebellum

homogenates from rats subjected to acute administration of 5-OP. G6PD is the key

regulatory enzyme of the pentose phosphate pathway and, as such, controls the flow of

carbon through the oxidative phase of this pathway and produces reducing equivalents in

the form of NADPH to meet cellular needs for reductive biosynthesis and maintenance of

the cellular redox state [50]. In mammals, most of the NADPH is produced by the pentose

phosphate pathway [51]. In the present study, we also found that the acute administration of

5-OP was able to inhibit G6PD activity in cerebral cortex from young rats, which could

promote an impairment in the production of NADPH and a dysruption in the cellular redox

balance. This is probably in line with the observed inhibition of GPx activity, since the

activity of this enzyme depends on the regeneration of reduced glutathione by glutathione

reductase, which in turn relies on NADPH that is dependent on a normal activity of G6PD

[51,52]. It has also been reported that G6PD is strongly inactivated by 4-hydroxy-2-

nonenal, a toxic product of membrane peroxidation [53].

We measured thiol and disulfide contents, as well as the SH/SS ratio. Acute

administration of 5-OP caused no alteration of SH content but enhanced the SS content and

reduced SH/SS ratio in cerebral cortex and in cerebellum. Enhanced generation of reactive

species and/or impaired antioxidant detoxification functions provokes an imbalance

between oxidative and reductive reactions, altering the thiol/disulfide redox status [54].

Reduction of the SH/SS ratio reflects an oxidized redox state of the cell that may eventually

lead to oxidative stress [55]. Therefore, considering that disulfide content was significantly

enhanced by acute administration of 5-OP and that SH/SS ratio was significantly reduced,

it is suggested that 5-OP is able to disturb the thiol redox status in cerebral cortex and

cerebellum of young rats in vivo, which could also be contributing to the brain damage

observed in GS-deficient patients.

The present study showed greater alterations of oxidative stress parameters in

cerebral cortex than in cerebellum, suggesting that cerebral cortex may be more susceptible

to oxidative stress. This hypothesis is corroborated by reports showing greater reductive

potential (calculated as NADPH/NADP

and GSH/GSSG ratios) [49] and greater

antioxidant enzyme activities [48,56] in the cerebellum compared to the cerebral cortex,

suggesting a greater resistance of cerebellum to oxidative stress. Prooxidant factors that

directly or indirectly induce free radical generation also differ among brain structures. For

instance, levels of iron, which catalyses OH

●

formation from hydrogen peroxide through

the Fenton reaction, are higher in cerebral cortex than in cerebellum [57]. So, the higher

iron levels along with increased hydrogen peroxide content may contribute to the higher

susceptibility of cerebral cortex to oxidative stress promoted by 5-OP.

Together, the present results demonstrated that 5-OP elicits oxidative stress in vivo

which may act synergistically with excitotoxicity [11,12,14] and impairment of energy

metabolism [10,16] to induce more significant neural cell damage in inherited disorders of

the γ-glutamyl cycle in which 5-OP accumulates. Understanding the underlying

mechanisms of brain damage that occurs in these disorders may be helpful in the

development of effective therapy to ameliorate the neurological dysfunction of the affected

patients.

Acknowledgments

This work was supported by the research grants from Programa de Núcleos de

Excelência (PRONEX), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and

FINEP Rede Instituto Brasileiro de Neurociência (IBN-Net #01.06.0842-00).

References

[1] Jellum E, Kluge T, Borrensen HC et al. (1970) Pyroglutamic aciduria: a new inborn

error of metabolism. Scand J Clin Lab Invest 26: 327-335.

[2] Larsson A, Wachtmeister L, von Wendt L et al. (1985) Ophtalmological, psychometric

and therapeutic investigation in two sisters with hereditary glutathione synthetase

deficiency (5-oxoprolinuria). Neuropediatrics 16: 131-136.

[3] Larsson A, Anderson ME (2001). Glutathione synthetase deficiency and other disorders

of the γ

γγ

γ-glutamyl cycle. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, (eds) The

Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, McGraw-Hill, New York, pp

2205-2216.

[4] Njalsson R (2005) Glutathione synthetase deficiency. Cell Mol Life Sci 62: 1938-1945.

[5] Ristoff E, Larsson A (2007) Inborn errors in the metabolism of glutathione. Orphanet J

Rare Dis 2: 16.

[6] Ristoff E, Mayatepek E, Larsson A (2001) Long-term clinical outcome in patients with

glutathione synthetase deficiency J Pediatr 139: 79-84.

[7] Njalsson R, Norgren S (2005) Physiological and pathological aspects of GSH

metabolism. Acta Paediatr 94: 132-137.

[8] Skullerud K, Marstein S, Schrader H et al. (1980) The cerebral lesions in a patient with

generalized glutathione deficiency and pyroglutamic aciduria (5-oxoprolinuria). Acta

Neuropathol 52: 235-238.

[9] Marstein S, Jellum E, Nesbakken R et al. (1981) Biochemical investigations of biopsied

brain tissue and autopsied organs from a patient with pyroglutamic acidemia (5-

oxoprolinemia). Clin Chim Acta 111: 219-228.

[10] Rieke GK, Scarfe AD, Hunter JF (1984) L-pyroglutamate: an alternate neurotoxin for

a rodent model of Huntington’s Disease. Brain Res Bull 13: 443-456.

[11] Rieke GK, Smith J, Idusuyi OB et al. (1989) Chronic intrastriatal L-pyroglutamate:

neuropathology and neuron sparing like Huntington’s Disease. Exp Neurol 104: 147-

154.

[12] Bennet Jr. JP, Logan WJ, Snyder SH (1973) Amino acids as central nervous

transmitters: the influence of ions, amino acid analogues, and ontogeny on transport

systems for L-glutamic and aspartic acids and glycine into central nervous

synaptosomes. J Neurochem 2: 1533-1550.

[13] Dusticier N, Kerkerian L, Errami M et al. (1985) Effects of pyroglutamic acid on

corticostriatal glutamatergic transmission. Neuropharmacology 24: 903-908.

[14] Barone D, Spignoli G (1990) Investigations on the binding properties of the nootropic

agent pyroglutamic acid. Drugs Exp Clin Res 16: 85-99.

[15] Rothstein JD, Jin L, Dykes-Hoberg M et al. (1993) Chronic inhibition of glutamate

uptake produces a model of slow neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA 90: 6591-

6595.

[16] Escobedo M, Cravioto J (1973) Studies on the malabsorption syndromes. Inhibition of

-K

-ATPase of small intestine microvilli by pyrrolidone carboxylic acid. Clin Chim

Acta 49: 147-151.

[17] Silva AR, Silva CG, Ruschel C et al. (2001) L-Pyroglutamic acid inhibits energy

production and lipid synthesis in cerebral cortex of young rats in vitro. Neurochem Res

26: 1277-1283.

[18] Pederzolli CD, Sgaravatti AM, Braum CA et al. (2007) 5-oxoproline reduces non-

enzymatic antioxidant defenses in vitro in rat brain. Metab Brain Dis 22(1): 51-65.

[19] Lees GJ (1993) Contributory mechanisms in the causation of neurodegenerative

disorders. Neuroscience 54(2): 287-322.

[20] Nicholls DG, Budd SL (1998) Mitochondria and neuronal glutamate excitotoxicity.

Biochim Biophys Acta 1366: 97-112.

[21] Hazel AS (2007) Excitotoxic mechanisms in stroke: an update of concepts and

treatment strategies. Neurochem Int 50: 941-953.

[22] Llesuy SF, Milei J, Molina H et al (1985) Comparison of lipid peroxidation and

myocardial damage induced by adriamycin and 4'-epiadriamycin in mice. Tumori 71:

241-249.

[23] Lissi E, Caceres T, Videla LA (1986) Visible chemiluminescence from rat brain

homogenates undergoing autoxidation. I. Effect of additives and products accumulation.

Free Radic Biol Med 2: 63-69.

[24] Sweetman L (1991). Organic acid analysis. In: Hommes FA (ed) Techniques in

diagnostic human biochemical genetics: A laboratory mannual. Wiley-Liss, New York,

pp 143–176.

[25] Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K (1979) Assay for lipid peroxides in animal tissues by

thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 95: 351-358.

[26] Stadtman EA (1990) Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical

mechanism and biological consequences. Free Radic Biol Med 9: 315-325.

[27] Stadtman ER, Levine RL (2003) Free-radical mediated oxidation of free amino acids

and amino acid residues in proteins. Amino Acids 25: 207-218.

[28] Reznick AZ, Packer L (1994) Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric

method for carbonyl assay. Meth Enzymol 233: 357-363.

[29] Lissi E, Pascual C, Del Castillo MD (1992) Luminol luminescence induced by 2,2’-

azo-bis-(2-amidinopropane) thermolysis. Free Radic Res Commun 17: 299-311.

[30] Evelson P, Travacio M, Repetto M et al. (2001) Evaluation of total reactive antioxidant

potential (TRAP) of tissue homogenates and their cytosols. Arch Biochem Biophys 388:

261-266.

[31] Omaye ST, Turnbull JD, Sauberlich HE (1979) Selected methods for the determination

of ascorbic acid in animal cells, tissues and fluids. Meth Enzymol 62: 3-11.

[32] Browne RW, Armstrong D (1998) Reduced glutathione and glutathione disulfide. Meth

Enzymol 108: 347-352.

[33] Aebi H (1984) Catalase in vitro. Meth Enzymol 105: 121-126.

[34] Marklund SL (1985). Pyrogallol autoxidation. In: Greenwald RA (ed) CRC Handbook

of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton, pp 243-247.

[35] Wendel A (1981) Glutathione peroxidase. Meth Enzymol 77: 325-332.

[36] Leong SF Clark JB (1984) Regional enzyme development in rat brain. Enzymes

associated with glucose utilization. Biochem J 218: 131-138.

[37] Pick E, Keisari Y (1980) A simple colorimetric method for the measurement of

hydrogen peroxide produced by cells in culture. J Immunol Methods 38: 161-170.

[38] Zahler WL, Cleland WW (1968) A specific and sensitive assay for disulfides. J Biol

Chem 243: 716-719.

[39] Lowry OH, Rosebrough NJ, Lewis-Farr A et al. (1951) Protein measurement with the

Folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265-275.

[40] Dahl N, Pigg M, Ristoff E et al. (1997) Missense mutations in the human glutathione

synthetase gene result in severe metabolic acidosis, 5-oxoprolinuria, hemolytic anemia

and neurological dysfunction. Hum Mol Genet 6: 1147-1152.

[41] Nygren J, Ristoff E, Carlsson K et al. (2005) Oxidative DNA damage in cultured

fibroblasts from patients with hereditary glutathione synthethase deficiency. Free Radic

Res 39: 595-601.

[42] Meister A (1974) The γ-glutamyl cycle. Diseases associated with specific deficiencies.

Annals Intern Med 81: 247-253.

[43] Jain A, Buist NRM, Kennaway NG et al. (1994) Effect of ascorbate or N-

acetylcysteine treatment in a patient with hereditary glutathione synthetase deficiency. J

Pediatr 124: 229-233.

[44] Hoffmann GF, Meier-Augenstein W, Stöckler S et al. (1993) Physiology and

pathophysiology of organic acids in cerebrospinal fluid. J Inherit Metab Dis16: 648-

669.

[45] Halliwell B, Gutteridge JMC (2007). Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford

University Press Inc., New York

[46] Anisimov VN, Popovich IG, Zabezhinski MA et al. (2006) Melatonin as antioxidant,

geroprotector and anticarcinogen. Biochim Biophys Acta 1757: 573-589.

[47] Halliwell B (2006) Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J

Neurochem 97: 1634-1658.

[48] Hussain S, Slikker Jr. W., Ali SF (1995) Age-related changes in antioxidant enzymes,

superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione in different

regions of mouse brain. Int J Devl Neurosci 13: 811-817.

[49] Yang MS, Chan HW, Yu LC (2006) Glutathione peroxidase and glutathione reductase

activities are partially responsible for determining the susceptibility of cells to oxidative

stress. Toxicology 226: 126-130.

[50] Kletzien RF, Harris PKW, Foellmi LA (1994) Glucose 6-phosphate dehydrogenase: a

“housekeeping” enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients and

oxidant stress. FASEB J 8: 174-181.

[51] Hashida K, Sakakura Y, Makino N (2002) Kinetic studies on the hydrogen peroxide

elimination by cultured PC12 cells. Biochim Biophys Acta 1572: 85-90.

[52] Williams AC, Ford WCL (2004) Functional significance of the pentose phosphate

pathway and glutathione reductase in the antioxidant defenses in human sperm. Biol

Reprod 71: 1309-1316.

[53] Ninfali P, Ditroilo M, Capellacci S et al. (2001) Rabbit brain glucose-6-phosphate

dehydrogenase: biochemical properties and inactivation by free radicals and 4-hydroxy-

2-nonenal. Neuroreport 12: 4149-4153.

[54] Moriarty-Carige SE, Jones DP (2004) Extracellular thiols and thiol/disulfide redox in

metabolism. Annu Rev Nutr 24: 481-509.

[55] Sultana R, Piroddi M, Galli F et al. (2008) Protein levels and activities of some

antioxidant enzymes in hippocampus of subjects with amnestic mild cognitive

impairment. Neurochem Res Online First DOI 10.1007/s11064-008-9593-0.

[56] Campese VM, Sindhu RK, Ye S et al. (2007) Regional expression of NO synthase,

NAD(P)H oxidase and superoxide dismutase in the rat brain. Brain Res 1134: 27-32.

[57] Beard JL, Connor JR, Jones BC (1993) Iron in the brain. Nutr Rev 51 (6): 157-170.

Table 1. Effect of acute administration of 5-oxoproline (5-OP) on ascorbic acid and

reduced glutathione contents in cerebral cortex and cerebellum from 14-day-old rats.

Cerebral cortex

Ascorbic acid

(µg/mg tissue)

Glutathione

(µmol/mg protein)

Control

2.10 ± 0.43 8.35 ± 1.40

5-OP

2.29 ± 0.94 8.62 ± 1.60

Cerebellum

Ascorbic acid

(µg/mg tissue)

Glutathione

(µmol/mg protein)

Control

4.70 ± 0.33 8.01 ± 0.91

5-OP

4.31 ± 0.88 8.52 ± 1.14

Results are mean ± SD (n=4-8) for independent experiments performed in duplicate. No

significant differences were detected (Student’s t test for unpaired samples).

Table 2. Effect of acute administration of 5-oxoproline (5-OP) on thiol (SH) and disulfide

(SS) contents, as well as on SH/SS ratio, in cerebral cortex and cerebellum from 14-day-old

rats.

Cerebral cortex

SH content

(nmol TNB/mg

protein)

SS content

(nmol TNB/mg

protein)

SH/SS ratio

Control

59.98 ± 5.05 3.65 ± 1.47 14.10 ± 4.37

5-OP

67.44 ± 8.91 13.82 ± 6.92 * 6.00 ± 2.77 *

Cerebellum

SH content

(nmol TNB/mg

protein)

SS content

(nmol TNB/mg

protein)

SH/SS ratio

Control

81.53 ± 4.08 9.74 ± 2.48 7.60 ± 0.95

5-OP

81.82 ± 8.80 17.02 ± 5.02 * 4.35 ± 0.17 **

Results are mean ± SD (n=5-6) for independent experiments performed in duplicate.

* p<0.05 and ** p<0.01 compared to control (Student’s t test for unpaired samples).

Figure Captions

Fig. 1 Effect of acute administration of 5-oxoproline (5-OP) on various parameters of

oxidative stress in cerebral cortex and cerebellum from 14-day-old rats: spontaneous

chemiluminescence (A), thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) (B), protein

carbonyl content (C) and total radical-trapping antioxidant potential (TRAP) (D). Results

are mean ± SD (n=6) for independent experiments performed in duplicate. ** p<0.01

compared to control (Student’s t test for unpaired samples)

Fig. 2 Effect of acute administration of 5-oxoproline (5-OP) enzyme activities in cerebral

cortex and cerebellum from 14-day-old rats: catalase (CAT) (A), glutathione peroxidase

(GPx) (B) superoxide dismutase (SOD) (C) and glucose 6-phosphate dehydrogenase

(G6PD) (D). Results are mean ± SD (n=4-6) for independent experiments performed in

duplicate. * p<0.05 and ** p<0.01 compared to control (Student’s t test for unpaired

samples)

Fig. 3 Effect of acute administration of 5-oxoproline (5-OP) on hydrogen peroxide content

in cerebral cortex and cerebellum from 14-day-old rats. Results are mean ± SD (n=6-8) for

independent experiments performed in duplicate. * p<0.05 and ** p<0.01 compared to

control (Student’s t test for unpaired samples)

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Capítulo III

N-acetylaspartic acid promotes oxidative stress in cerebral cortex of rats

Artigo publicado na revista International Journal of Developmental Neuroscience

Int. J. Dev. Neurosci. 25: 317-324, 2007.

Capítulo IV

N-acetylaspartic acid impairs enzymatic antioxidant defenses in rat brain:

relevance to Canavan Disease

Artigo submetido à revista Neurochemistry International

N-acetylaspartic acid impairs enzymatic antioxidant defenses in rat brain:

relevance to Canavan Disease

Carolina Didonet Pederzolli

, Caroline Paula Mescka

, Alessandra Selinger Magnusson

Kátia Bueno Deckmann

, Evelise de Souza Streck

, Ângela Malysz Sgaravatti

, Mirian

Bonaldi Sgarbi

, Angela Terezinha de Souza Wyse

1,2

, Clóvis Milton Duval Wannmacher

1,2

Moacir Wajner

1,2

and Carlos Severo Dutra-Filho

1,2

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, Instituto de Ciências

Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.

* Corresponding Author:

Carlos Severo Dutra Filho

Departamento de Bioquímica, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua

Ramiro Barcelos, 2600 - Anexo, CEP 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil, Phone: +55 51

3308 5573

Fax: +55 51 3308 5535

E-mail: [email protected]

Running title: N-acetylaspartic acid impairs antioxidant defenses

Abstract

N-Acetylaspartic acid accumulates in Canavan Disease, a severe inherited

neurometabolic disease clinically characterized by severe mental retardation, hypotonia,

macrocephaly and generalized tonic and clonic type seizures. Considering that the

mechanisms of brain damage in this disease remain poorly understood, in the present study

we investigated the effect of N-acetylaspartic acid on the enzymatic antioxidant status in rat

brain. The in vitro effect of N-acetylaspartic acid (10-80 mM) was studied on the activities

of catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase, as well as on hydrogen

peroxide content in cerebral cortex of 14-day-old rats. The effect of acute administration of

0.6 mmol N-acetylaspartic acid/g body weight on the same parameters was also studied.

Catalase and glutathione peroxidase activities were significantly inhibited, while hydrogen

peroxide content was significantly enhanced by N-acetylaspartic acid both in vitro and in

vivo. In contrast, superoxide dismutase activity was not altered by N-acetylaspartic acid.

Our results clearly show that N-acetylaspartic acid impairs the enzymatic antioxidant

defenses in rat brain. This could be involved in the pathophysiological mechanisms

responsible for the brain damage observed in patients affected by Canavan Disease.

Keywords: N-Acetylaspartic acid; Canavan Disease; hydrogen peroxide; catalase;

glutathione peroxidase; rat brain

N-acetylaspartic acid (NAA) is normally synthesized from acetyl-CoA and L-

aspartic acid by acetyl-CoA:L-aspartate N-acetyltransferase (EC 2.3.1.17) and hydrolyzed

to aspartate and acetate by N-acyl-L-aspartate amidohydrolase (EC 3.5.1.15,

aspartoacylase) (Beaudet, 2001). In spite of reaching cerebral concentrations up to 20 mM

(Baslow, 2003), the role of NAA on brain metabolism remains unclear (Matalon and

Michals-Matalon, 1999).

Massive excretion of NAA in the urine is the biochemical hallmark of Canavan

Disease (CD), an autossomal recessive inherited metabolic disease caused by deficiency of

the enzyme aspartoacylase (Matalon and Michals-Matalon, 2000). CD, found more

frequently among the Ashkenazi Jews, is a severe progressive leukodystrophy characterized

by swelling and spongy degeneration of the white matter of the brain; as the disease

progresses, the brain becomes atrophic and the gray matter becomes involved as well

(Matalon and Michals-Matalon, 2000). Brain atrophy progressively increases over time in

CD patients and this occurs in parallel with NAA rise (Janson et al., 2006). Diagnosis is

confirmed by elevated NAA levels in the urine, blood and spinal fluid and also in the brain

in vivo by the use of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (Gordon, 2000).

Patients affected by CD present severe mental retardation with inability to gain

developmental milestones, as well as hypotonia and macrocephaly (Traeger and Rapin,

1998; Matalon and Michals-Matalon, 2000). About half of the patients also develop

generalized tonic and clonic convulsions (Traeger and Rapin, 1998; Beaudet, 2001). The

affected children become increasingly debilitated with age, often with inability to move

voluntarily or swallow. Death typically occurs before adolescence, but some Canavan

patients with milder forms survive into their 20s or beyond (Moffett et al., 2007).

Neuropathological findings of CD include extensive loss of myelin with intramyelinic

splitting, edema and vacuolation in the white matter and brain stem (Kumar, et al., 2006;

Skiranth et al., 2007) increase of oligodendroglia and protoplasmic astrocytes (Beaudet,

2001), the presence of swollen astrocytes, and distorted and elongated mitochondria

(Adachi et al., 1972).

Although the role of NAA in the pathogenesis of CD is still unclear, increased

concentrations of NAA in the brain would suggest the possibility that NAA or related

metabolites might have toxic effects (Beaudet, 2001). Indeed neurotoxic actions for NAA

in the brain have already been demonstrated, as it is able to induce seizures after

intracerebroventricular administration to normal rats, probably by neuronal overexcitation

through metabotropic glutamate receptors (Akimitsu et al., 2000; Kitada et al., 2000; Yan et

al., 2003). It was also proposed that the defective myelin synthesis results from a deficiency

of NAA-derived acetate (Madhavarao et al., 2005; Namboodiri et al., 2006), and that an

osmotic imbalance with a build up of excessive fluid in the brain is a consequence of the

pathological accumulation of NAA, which was suggested to act as a ‘molecular water

pump’, leading to demyelination (Baslow, 2002).

Recent work from our research group demonstrated the role of NAA inducing

oxidative stress, and it was hypothesized the participation of this accumulating metabolite

in the brain damage pathomechanisms responsible for the neurological impairment

observed in CD patients (Pederzolli et al., 2007). Our data indicated that NAA may

promote oxidative stress in vitro and in vivo in cerebral cortex of young rats by decreasing

non-enzymatic antioxidant defenses and stimulating oxidative damage to both lipids and

proteins, probably by enhancing reactive species in cerebral cortex.

In the present study we investigated the effect of NAA on the enzymatic antioxidant

status in rat brain in order to further clarify the role of oxidative stress in NAA

neurotoxicity and to try to better understand its participation in the mechanisms of brain

damage responsible for the neurological impairment observed in CD patients. To

accomplish this, the in vitro effect of N-acetylaspartic acid (10-80 mM) was studied on the

activities of the antioxidant enzymes hydrogen-peroxide:hydrogen-peroxide oxidoreductase

(EC 1.11.1.6; catalase, CAT), superoxide:superoxide oxidoreductase (EC 1.15.1.1;

superoxide dismutase, SOD) and glutathione:hydrogen-peroxide oxidoreductase (EC

1.11.1.9; glutathione peroxidase, GPx), as well as on the hydrogen peroxide content in

cerebral cortex of 14-day-old rats. The effect of acute administration of NAA was also

studied on the same parameters in the brain.

Experimental Procedures

Materials

All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA). N-acetylaspartic

acid solutions were freshly prepared in 20 mM sodium phosphate buffer with 140 mM KCl

pH 7.4 or saline solution, and the pH was adjusted to 7.4.

Animals

Fourteen-day-old Wistar rats bred in the Department of Biochemistry, ICBS,

UFRGS, from both sexes and different litters, were used. Rats were kept with dams until

they were killed. The dams had free access to water and a 20% (w/w) protein commercial

chow (Supra, Porto Alegre, RS, Brazil). They were kept in a room with 12:12 h light/dark

cycle (lights on 07:00-19:00 h) and with air-conditioned controlled temperature (22°C ±

1°C). The NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication # 80-

23, revised 1996) was followed in all experiments.

Tissue preparation

Rats were killed by decapitation, and the brain was immediately removed and kept

on an ice-plate. The olfactory bulb, pons and medulla were discarded and the cerebral

cortex was dissected, weighed and kept chilled until homogenization. These procedures

lasted up to 3 min. Cerebral cortex was homogenized in 10 volumes (1:10, w/v) of 20 mM

sodium phosphate buffer, pH 7.4 containing 140 mM KCl. Homogenates were centrifuged

at 750 g for 10 min at 4 ºC to discard nuclei and cell debris (Llesuy et al., 1985; Lissi et al.,

1986). The pellet was discarded and the supernatant was immediately separated and used

for the measurements. The homogenates used were from individual animals and they were

never pooled. All experiments were repeated with different animals.

In vitro experiments

Cerebral cortex supernatants were used for the measurements in the presence or

absence of NAA, with and without pre-incubation. In the experiments without pre-

incubation, NAA was tested at final concentrations ranging from 10 to 80 mM. In the

experiments with pre-incubation, 80 mM NAA was pre-incubated with cerebral cortex

supernatants for 1 hour at 37°C. Controls were incubated only with 20 mM sodium

phosphate buffer, pH 7.4 containing 140 mM KCl, without NAA.

Acute administration of NAA

NAA was dissolved in saline solution and the pH was adjusted to 7.4. NAA at a

dose of 0.6 mmol/g body weight was administered subcutaneously. Controls received saline

solution. One hour after injections, rats were killed by decapitation and tissue was prepared

as mentioned above. Cerebral cortex supernatants were used to measure antioxidant

enzyme activities and hydrogen peroxide content.

Catalase assay

CAT activity was assayed using a double-beam spectrophotometer with temperature

control (Hitachi U-2001). This method is based on the disappearance of H

at 240 nm in

a reaction medium containing 20 mM H

, 0.1% Triton X-100, 10 mM potassium

phosphate buffer pH 7.0, and 0.1-0.3 mg protein/mL (Aebi, 1984). One CAT unit is defined

as one µmol of hydrogen peroxide consumed per minute and the specific activity is

calculated as CAT units/mg protein.

Superoxide dismutase assay

SOD activity was determined using the RANSOD kit from RANDOX (Antrim,

UK). The method is based on the formation of red formazan from the reaction of 2-(4-

iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride and superoxide radical

produced in the incubation medium from xanthine-xanthine oxidase reaction system, which

is assayed spectrophotometrically at 505 nm. The inhibition of the produced chromogen is

proportional to the activity of the SOD present in homogenates. A 50% inhibition is defined

as one unit of SOD and the specific activity is calculated as SOD units/mg protein.

Glutathione peroxidase assay

GPx activity was measured using tert-butyl-hydroperoxide as substrate (Wendel,

1981). NADPH disappearance was monitored at 340 nm using a double-beam

spectrophotometer with temperature control (Hitachi U-2001). The medium contained 2

mM glutathione, 0.15 U/mL glutathione reductase, 0.4 mM azide, 0.5 mM tert-butyl-

hydroperoxide and 0.1 mM NADPH. One GPx unit is defined as one µmol of NADPH

consumed per minute and the specific activity is represented as GPx units/mg protein.

Hydrogen peroxide content

This method is based on the horseradish peroxidase-mediated oxidation of phenol

red by hydrogen peroxide, which results in the formation of a compound demonstrating

increased absorbance at 610 nm (Pick and Keisari, 1980). Briefly, 400 mg cerebral cortex

were chopped with a McIlwainn chopper in cortical prisms (400 µm), which were added to

a glass vial containing 5.5 mM dextrose buffer pH 7.0, and the mixture was allowed to

stand at room temperature for 1 hour. After that, a 60 µL supernatant aliquot was taken and

reacted with 235 µL of a medium containing 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 85

µL of horseradish peroxidase and 1 mg/mL phenol red (phenolsulfonphtalein). The reaction

was carried out in the dark for 10 minutes. After that, 5 µL of 1 N NaOH was added to each

tube, and the absorbance was read at 610 nm. A calibration curve was performed with

commercial solution of hydrogen peroxide. Results were calculated as nmol hydrogen

peroxide/mg tissue.

Protein determination

Protein concentration was determined in cerebral cortex supernatants using bovine

serum albumin as a standard (Lowry et al., 1951).

Statistical analysis

For the experiments with more than two groups in comparison, statistical analysis

was performed by the one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Tukey test

for multiple comparisons when the F value was significant. For the experiments with only

two groups, statistical analysis was performed by the Student’s t test. All analyses were

performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software in a PC-

compatible computer. A value of p < 0.05 was considered to be significant. The enzyme

kinetic parameters were calculated using the GraphPad Prism 5 software.

Results

In the present study we evaluated the in vitro and in vivo effects of NAA on the

enzymatic antioxidant defenses and on hydrogen peroxide content in cerebral cortex of 14-

day-old rats.

NAA markedly inhibits CAT activity in an uncompetitive manner

We started measuring the effect of NAA on CAT activity in vitro by measuring the

enzyme activity in cerebral cortex homogenates in the presence or the absence of NAA at

final concentrations ranging from 10 to 80 mM, without and with 1 hour pre-incubation.

Figures 1A and 1B show that CAT activity was markedly inhibited by the presence of NAA

in the reaction medium at all concentrations tested with no pre-incubation [F(4,15)=14.87;

p<0.01] and with 1 hour pre-incubation [t(6)=17.28; p<0.01], showing a strong inhibition

of up to 44% compared to control. Similar results were obtained with a purified commercial

CAT preparation (EC 1.11.1.6, from bovine liver) (Figure 1C), in the absence of cerebral

cortex homogenates, indicating a possible direct interaction of NAA with CAT. We also

tested the effect of acute administration of 0.6 mmol NAA/g body weigth to 14-day-old rats

on CAT activity in order to verify if the effect observed in vitro was also detected in vivo.

We found that CAT activity was significantly reduced by acute administration of NAA

[t(14)=3.19; p<0.01] (Figure 2). Next, we performed kinetic studies on the interaction

between NAA and CAT. The Hanes-Woolf plot (Figure 3) was analyzed over the range of

2.5-20 mM hydrogen peroxide as substrate in the absence and presence of 1-20 mM NAA.

value was calculated as the intersection of inhibitor line with x-axis, whereas V

max

was

calculated as the slope of the inhibitor line. Considering that the different inhibitor curves

intercepted the x-axis at different points and that those lines presented different slopes, our

data indicated that the inhibition of CAT activity caused by NAA was uncompetitive,

because both K

values and maximal velocity were altered with increasing NAA

concentrations. Apparent K

for hydrogen peroxide as substrate and V

max

of CAT were

15.09 mM and 9.69 µmol H

consumed per minute per mg protein, respectively. The K

’

value (uncompetitive inhibition constant) was 15.19 mM. A similar inhibition profile was

obtained with the Lineweaver-Burk double reciprocal plot, which was also analyzed in the

same conditions.

SOD activity is not affected by NAA

The effect of NAA on SOD activity was also studied. Results are depicted in Figure

4. We evaluated the in vitro effect of NAA on SOD activity in cerebral cortex homogenates

in the presence or absence of NAA, at final concentrations ranging from 10 to 80 mM,

without and with 1 hour pre-incubation. NAA caused no effect on this enzyme activity at

all concentrations tested without pre-incubation [F(4,25)=1.11; p>0.05] (Figure 4A) or after

1 hour pre-incubation [t(6)=0.08; p>0.05] (Figure 4B). The in vivo acute administration of

NAA also caused no effect on SOD activity [t(14)=0.26; p>0.05] (Figure 5), which is in

line with the in vitro results.

NAA strongly inhibits GPx activity

Next, we evaluated the in vitro effect of NAA on GPx activity in cerebral cortex

homogenates in the presence or absence of NAA. GPx activity was inhibited (27% to 34%

compared to control) in vitro by the presence of NAA in the reaction medium at

concentrations as low as 20 mM without pre-incubation [F(4,15)=6.60; p<0.01] (Figure

6A) and with 1 hour pre-incubation [t(6)=5.03; p<0.01] (Figure 6B). Similar results were

obtained with a purified commercial GPx preparation (EC 1.11.1.9, from bovine

erythrocytes) (Figure 6C), in the absence of cerebral cortex homogenates, indicating a

possible direct acting effect of NAA with GPx. GPx activity was also significantly reduced

by acute administration of NAA [t(14)=2.97; p<0.05] (Figure 7).

Hydrogen peroxide content is enhanced by NAA

Altogether, the inhibition of CAT and GPx activities by NAA points to the possible

involvement of hydrogen peroxide in NAA neurotoxicity mechanism, since this reactive

100

species is the substrate for both enzymes. To confirm this hypothesis, we measured

hydrogen peroxide content both in vitro and in vivo (Figure 8). After 1 hour pre-incubation

of 80 mM NAA with cerebral cortex slices, hydrogen peroxide content was significantly

higher in the presence of NAA as compared to control [t(6)=3.77; p<0.01] (Figure 8A). The

acute administration of NAA was also able to significantly enhance hydrogen peroxide

content in cerebral cortex of rats [t(12)=3.41; p<0.01] (Figure 8B). These results suggest

that an increase of hydrogen peroxide content may be involved in NAA neurotoxicity.

Discussion

NAA brain accumulation is the biochemical hallmark of patients affected by CD,

which is clinically characterized by severe neurological dysfunction with progressive

mental retardation, hypotonia, macrocephaly and seizures. Although the underlying

mechanisms of brain damage in this disorder remain unclear, increased concentrations of

NAA in tissues and fluids suggest the possibility that NAA or related metabolites might

have toxic effects (Beaudet, 2001) and that excess NAA may be deleterious to the CNS.

Although the exact mechanisms underlying its toxicity remain not fully understood, there

are some reports in the literature showing neurotoxic actions for NAA. In this context,

NAA was able to induce an inward current, acting on the G protein-coupled metabotropic

glutamate receptors, resulting in excitation of the neurons, thereby contributing to the

occurence of epileptic seizures (Akimitsu et al., 2000; Yan et al., 2003). In addition,

Klugmann et al. (2005) showed that a partial reduction of NAA levels in the brain of

genetically aspartoacylase-deficient rats (tremor rats) results in modulation of both seizure

length and frequency, suggesting that increased NAA levels in the tremor rat brain

101

participate in the course of epilepsy. Interestingly, epileptic seizures have already been

related to oxidative stress (Bruce and Baudry, 1995; Trotti et al., 1998; Liang et al., 2000;

Liang and Patel., 2004; Patel, 2004), a condition that occurs when the delicate balance

between production of reactive species and antioxidant defense systems seen in healthy

aerobes is upset, or repair system fails. This can be due both from diminished antioxidant

defenses and/or increased production of reactive species, which can potentially lead to

biomolecular oxidative damage (Halliwell and Gutteridge, 2007a).

In fact, a recent study from our research group has demonstrated a possible role of

oxidative stress on NAA neurotoxicity, as the results obtained indicated that NAA may

promote oxidative stress in vitro and in vivo in cerebral cortex of 14-day-old rats by

decreasing the non-enzymatic antioxidant defenses and stimulating oxidative damage to

both lipids and proteins, probably by enhancing reactive species in cerebral cortex

(Pederzolli et al., 2007). By that time, we demonstrated that NAA significantly reduces the

non-enzymatic antioxidant capacity in rat brain both in vitro and in vivo, by reducing tissue

non-enzymatic antioxidant content (TRAP), the antioxidant reactivity (TAR) and GSH

content. We also showed that NAA was able to cause oxidative damage to proteins

(increased carbonyl content) and lipids (increased chemiluminescence and TBA-RS levels)

both in vitro and in vivo. Interestingly, it was observed that ascorbic acid plus Trolox

completely prevented the NAA-elicited increase in TBA-RS levels in cerebral cortex

homogenates.

In order to identify mechanisms by which oxidative stress plays a role in NAA

neurotoxicity, in the present work we investigated the in vitro and in vivo effects of this

organic acid on major enzymatic antioxidant defenses and on hydrogen peroxide content in

cerebral cortex of 14-day-old rats.

102

We started measuring the effect of NAA on the activity of CAT, the antioxidant

enzyme that catalyses direct decomposition of hydrogen peroxide to ground-state O

. We

found that CAT activity from cerebral cortex homogenates was markedly inhibited (44% to

69% inhibition compared to control) in vitro by the presence of NAA in the reaction

medium at all concentrations tested (10 mM and higher) without pre-incubation. We also

showed that 80 mM NAA also markedly decreased CAT activity after 1 hour exposition of

cerebral cortex homogenates to this metabolite. Furthermore, similar results were obtained

with a purified commercial CAT preparation, indicating a possible direct interaction of

NAA with CAT. Finally, we observed that acute administration of 0.6 mmol NAA/g body

weigth to 14-day-old rats significantly inhibited cortical CAT activity, corroborating our in

vitro findings. In order to investigate the mechanism of NAA inhibition on CAT activity,

we performed kinetic studies on the interaction between NAA and CAT from cerebral

cortex homogenates. Values of K

and V

max

obtained (15.09 mM and 9.69 µmol.min

-1

.mg

prot

-1

, respectively) were similar to the ones reported previously in rat brain (Somani and

Husain, 1996). Our results have also shown that NAA inhibits CAT activity in an

uncompetitive manner and that K

’ for NAA (15.19 mM) was lower than the concentrations

found in the brain of patients affected by CD.

Next, we studied the effect of NAA on activity of SOD, the antioxidant enzyme

which dismutates superoxide to produce hydrogen peroxide and water, being highly

efficient in the catalytic removal of superoxide radicals. NAA caused no effect on this

enzyme activity in vitro and in vivo.

We then evaluated the effect of NAA on GPx activity, which removes hydrogen

peroxide by coupling its reduction to H

O with oxidation of reduced glutathione (GSH).

Although being more specific for GSH as a hydrogen donor, it can also act on peroxides

103

other than hydrogen peroxide, where the peroxide group is reduced to an alcohol. GPx

activity from cerebral cortex homogenates was also inhibited in vitro by NAA in the

reaction medium without previous incubation and after 1 hour of pre-incubation. NAA was

also able to inhibit commercial GPx preparation, indicating a possible direct interaction of

NAA with GPx. Similarly to CAT, GPx activity was also significantly reduced by the acute

administration of NAA, reinforcing our in vitro findings. Taken together, the inhibition of

CAT and GPx activities may indicate an impairment of detoxification of its shared

substrate hydrogen peroxide. So, we then measured the effect of NAA on hydrogen

peroxide content both in vitro and in vivo. We found that exposition of cerebral cortex

homogenates to 80 mM NAA for 1 hour significantly enhanced hydrogen peroxide content.

The acute administration of NAA was also able to significantly enhance hydrogen peroxide

content in cerebral cortex of 14-day-old rats, in accordance with our in vitro findings. These

results suggest that an enhancement in hydrogen peroxide content is probably involved in

NAA neurotoxicity and may be secondary to the reduction of CAT and GPx activities. In

this context, hydrogen peroxide mixes readily with water and can diffuse within and

between cells and is toxic to many cells in the 10 to 100 µM range, causing senescence and

apoptosis, and at higher levels it promotes necrotic cell death (Halliwell and Gutteridge,

2007b). Considering that in our previous work we showed that ascorbic acid plus Trolox,

which are scavengers of OH

●

, were able to completely prevent the NAA-elicited increase in

TBA-RS levels in cerebral cortex homogenates (Pederzolli et al., 2007) and that in the

present work we found a NAA-mediated increase in hydrogen peroxide content it may be

suggested the participation of hydrogen peroxide, and probably of OH

●

that is produced

from the former by the Fenton reaction, on NAA neurotoxicity.

104

Altogether, our present findings clearly show that NAA may promote an

impairment of enzymatic antioxidant defenses in cerebral cortex of young rats both in vitro

and in vivo, by inhibiting CAT and GPx activities, compromising the eficiency of reactive

species detoxification, which could lead to oxidative damage to biomolecules. Moreover,

NAA promotes an enhancement of hydrogen peroxide content in vitro and in vivo, which

could be possibly involved in the progression and maintenance of the neurodegeneration

characteristic of CD.

Regarding to the pathophysiology relevance of our present data, it must be

emphasized that the alteration of the oxidative stress parameters occurred with

concentrations of NAA observed in plasma and cerebrospinal fluid of patients affected by

CD (up to 4-fold elevated) (Tsay and Coyle, 1995; Surendran et al., 2003). Although it is

difficult to extrapolate our findings to the human condition, in case the antioxidant defense

impairment elicited by NAA in our study also occurs in the brain of patients affected by

CD, it is possible that it may contribute, along with other mechanisms, to the neurological

dysfunction characteristic of this disease. Finally, our present results showing an

impairment in enzymatic antioxidant defenses and an enhancement of hydrogen peroxide

content, together with our previous results of NAA decreasing non-enzymatic antioxidant

defenses and stimulating protein and lipid oxidative damage in cerebral cortex of 14-day-

old rats, indicate that NAA may promote oxidative stress in vitro and in vivo both by

enhancing reactive species (hydrogen peroxide, and possibly hydroxyl radical) and by

diminishing antioxidant defenses. Based on these results, it is reinforced here the

proposition that administration of antioxidants, especially vitamins E and C, should be

considered as a potential and beneficial adjuvant therapy for patients affected by CD.

However, the exact underlying mechanisms of NAA neurotoxicity and its participation in

105

the brain damage of these patients remain to be further elucidated.

Acknowledgements

This work was supported by the research grants from Programa de Núcleos de

Excelência (PRONEX), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) and FINEP

Rede Instituto Brasileiro de Neurociência (IBN-Net #01.06.0842-00).

References

Adachi, M., Torii, J., Schneck, L., Volk, B.W., 1972. Electron microscopy and enzyme

histochemical studies of the cerebellum in spongy degeneration (van Bogaert and

Bertrand type). Acta Neuropathol. (Berl) 20, 22.

Aebi, H., 1984. Catalase in vitro. Meth. Enzymol. 105, 121-126.

Akimitsu, T., Kurisu, K., Hanaya, R., Iida, K., Kiura, Y., Arita, K., Matsubayashi, H.,

Ishihara, K., Kitada, K., Serikawa, T., Sasa, M., 2000. Epileptic seizures induced by N-

aspartate in rats: in vivo and in vitro studies. Brain Res. 861, 143-150.

Baslow, M.H., 2002. Evidence supporting a role for N-acetyl-L-aspartate as a molecular

water pump in myelinated neurons in the central nervous system – An analytical

review. Neurochem. Int. 40, 295-300.

Baslow, M.H., 2003. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.

106

Neurochem. Res. 28, 941-953.

Beaudet, A., 2001. Aspartoacylase Deficiency (Canavan Disease). In: Scriver, C.R.,

Beaudet, A. L., Sly, W.S., Valle, D. (Eds.) The Metabolic and Molecular Bases of

Inherited Disease, McGraw-Hill, New York, pp. 5799-5805.

Bruce, A.J., Baudry, M., 1995. Oxygen free radicals in rat limbic structures after kainate-

induced seizures. Free Radic. Biol. Med. 18, 993-100.

Gordon, N., 2000. Canavan disease: A review of recent developments. Eur. J. of Paediatr.

Neurol. 5, 65-69.

Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., 2007a. Cellular responses to oxidative stress: adaptation,

damage, repair, senescence and death. In: Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. (Eds.) Free

Radicals in Biology and Medicine, Oxford University Press, Oxford, pp. 351-425.

Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., 2007b. The chemistry of free radicals and related

'reactive species'. In: Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. (Eds.) Free Radicais in Biology

and Medicine, Oxford University Press, Oxford, pp. 37-104.

Janson, C.G., McPhee, S.W.J., Francis, J., Shera, D., Assadi, M., Freese, A., Hurh, P.,

Haselgrove, J., Wang, D.J., Bilaniuk, L., Leone, P., 2006. Natural history of Canavan

Disease revealed by Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-MRS) and

Diffusion-weighted MRI. Neuropediatrics 37, 209-221.

Kitada, K., Akimitsu, T., Shigematsu, Y., Kondo, A., Maihara, T., Yokoi, N., Kuramoto,

T., Sasa, M., Serikawa, T., 2000. Accumulation of N-acetylaspartate in the brain of the

tremor rat, a mutant exhibiting absence-like seizure and spongiform degeneration in the

central nervous system. J. Neurochem. 74, 2512-2519.

Klugmann, M., Leichtlein, C.B., Wymond Symes, C., Serikawa, T., Young, D., During,

107

M.J., 2005. Restoration of aspartoacylase activity in CNS neurons does not ameliorate

motor deficits and demyelination in a model of Canavan Disease. Mol. Ther. 11, 745-

753.

Kumar, S., Mattan, N.S., de Vellis, J., 2006. Canavan disease: a white matter disorder.

Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 12, 157-65.

Liang, L.P., Ho, Y.S., Patel, M., 2000. Mitochondrial superoxide production in kainate-

induced hippocampal damage. Neuroscience 101, 563-570.

Liang, L.P., Patel, M., 2004. Mitochondrial oxidative stress and increased seizure

susceptibility in Sod2(−/+) mice. Free Radic. Biol. Med. 36, 542-554.

Lissi, E., Caceres, T., Videla, L.A., 1986. Visible chemiluminescence from rat brain

homogenates undergoing autoxidation. I. Effect of additives and products

accumulation. Free Radic. Biol. Med. 2, 63-69.

Llesuy, S.F., Milei, J., Molina, H., Boveris, A., Milei, S., 1985. Comparison of lipid

peroxidation and myocardial damage induced by adriamycin and 4'-epiadriamycin in

mice. Tumori 71, 241-249.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Lewis-Farr, A., Randall, R.J., 1951. Protein measurement

with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.

Madhavarao, C.N., Arun, P., Moffett, J.R., Szucs, S., Surendran, S., Matalon, R., Garbern,

J., Hristova, D., Johnson, A., Jiang, W., Namboodiri, M.A.A., 2005. Defective N-

acetylaspartate catabolism reduces brain acetate levels and myelin lipid synthesis in

Canavan`s Disease. PNAS 102, 5221-5226.

Matalon, R., Michals-Matalon, K., 1999. Biochemistry and molecular biology of Canavan

Disease. Neurochem. Res. 24, 507-513.

108

Matalon, R., Michals-Matalon, K., 2000. Spongy degeneration of the brain, Canavan

Disease: biochemical and molecular findings. Front. Biosci. 5, d307-d311.

Moffett, J.R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C.N., Namboodiri, A.M.A., 2007. N-

acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog. Neurobiol.

81, 89-131.

Namboodiri, A.M.A., Peethambaran, A., Mathew, R., Sambhu, P.A., Hershfield, J.,

Moffett, J.R., Madhavarao, C.N., 2006. Canavan disease and the role of N-

acetylaspartate in myelin synthesis. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 216-223.

Patel, M., 2004. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress: cause and consequence of

epileptic seizures. Free Radic. Biol. Med. 37, 1951-1962.

Pederzolli, C.D., Mescka, C.P., Scapin, F., Rockenbach, F.J., Sgaravatti, A.M., Sgarbi,

M.B., Wyse, A.T.S., Wannmacher, C.M.D., Wajner, M., Dutra-Filho, C.S., 2007. N-

acetylaspartic acid promotes oxidative stress in cerebral cortex of rats. Int. J. Devl.

Neurosci. 25, 317-324.

Pick, E., Keisari, Y., (1980). A simple colorimetric method for the measurement of

hydrogen peroxide produced by cells in culture, J. Immunol. Meth. 38, 161-170.

Skiranth, S.G., Chandrashekar, H.S., Nagarajan, K., Jayakumar, P.N., 2007. Restricted

diffusion in Canavan Disease. Childs Nerv. Syst. 23, 465-468.

Somani, S.M., Husain, K., 1996. Exercise training alters kinetics of antioxidant enzymes in

rat tissues. Biochem. Mol. Biol. Int. 38, 587-595.

Surendran, S., Michals-Matalon, K., Quast, M.J., Tyring, S.K., Wei, J., Ezell, E.L.,

Matalon, R., 2003. Canavan disease: a monogenic trait with complex genomic

interaction. Mol. Genet. Metab. 80, 74-80.

109

Traeger, E.C., Rapin, I., 1998. The clinical course of Canavan Disease. Pediatr. Neurol. 18,

207-212.

Trotti, D., Danbolt, N.C., Volterra, A., 1998. Glutamate transporters are oxidant-

vulnerable: a molecular link between oxidative stress and excitotoxic

neurodegeneration? Trend. Pharmacol. Sci. 19, 328-334.

Tsai, G., Coyle, J.T., 1995. N-acetylaspartate in neuropsychiatric disorders. Prog.

Neurobiol. 46, 531-540.

Wendel, A., 1981. Glutathione peroxidase. Meth. Enzymol. 77, 325-332.

Yan, H.D., Ishihara, K., Serikawa, T., Sasa, M., 2003. Activation by N-acetyl-L-aspartate

of acutely dissociated hippocampal neurons in rats via metabotropic glutamate

receptors. Epilepsia 44, 1153-1159.

110

FIGURE LEGENDS

Figure 1. In vitro effect of N-acetylaspartic acid (NAA) on catalase (CAT) activity: (A) in

cerebral cortex, without previous incubation; (B) in cerebral cortex, with 1 hour pre-

incubation at 37°C; and (C) in a purified commercial CAT preparation, without previous

incubation. Results are mean ± SD (n=4) for independent experiments performed in

duplicate. ** p<0.01 compared to control (Tukey test or Student’s t test).

Figure 2. Effect of acute administration of 0.6 mmol NAA/g body weigth to 14-day-old

rats on catalase (CAT) activity in cerebral cortex homogenates. Results are mean ± SD

(n=8) for independent experiments performed in duplicate. ** p<0.01 compared to control

(Student’s t test).

Figure 3. Kinetic analysis of the inhibition of catalase (CAT) caused by N-acetylaspartic

acid (NAA) in vitro in cerebral cortex homogenates from 14-day-old rats. The figure shows

the Hanes-Woolf plot of the CAT activity for hydrogen peroxide concentrations (2.5-20

mM) in the absence of NAA and in the presence of 1 mM, 5 mM, 10 mM and 20 mM

NAA. All experiments were performed at least four independent times, and similar results

were obtained. Data presented were from individual experiments.

Figure 4. In vitro effect of N-acetylaspartic acid (NAA) on superoxide dismutase (SOD)

activity: (A) in cerebral cortex, without previous incubation; and (B) in cerebral cortex,

111

with 1 hour pre-incubation at 37°C. Results are mean ± SD (n=4-6) for independent

experiments performed in duplicate. No significant differences were detected from control

(Tukey test or Student’s t test).

Figure 5. Effect of acute administration of 0.6 mmol NAA/g body weigth to 14-day-old

rats on superoxide dismutase (SOD) activity in cerebral cortex homogenates. Results are

mean ± SD (n=8) for independent experiments performed in duplicate. No significant

differences were detected from control (Student’s t test).

Figure 6. In vitro effect of N-acetylaspartic acid (NAA) on glutathione peroxidase (GPx)

activity: (A) in cerebral cortex, without previous incubation; (B) in cerebral cortex, with 1

hour pre-incubation at 37°C; and (C) in a purified commercial GPx preparation, without

previous incubation. Results are mean ± SD (n=4) for independent experiments performed

in duplicate. * p<0.05 and ** p<0.01 compared to control (Tukey test or Student’s t test).

Figure 7. Effect of acute administration of 0.6 mmol NAA/g body weigth to 14-day-old

rats on glutathione peroxidase (GPx) activity in cerebral cortex homogenates. Results are

mean ± SD (n=8) for independent experiments performed in duplicate. ** p<0.01 compared

to control (Student’s t test).

Figure 8. In vitro and in vivo effects of N-acetylaspartic acid (NAA) on hydrogen peroxide

content from 14-day-old rats: (A) in vitro in cerebral cortex homogenates, with 1 hour pre-

incubation at 37°C; and (B) in vivo in cerebral cortex homogenates from rats subjected to

112

an acute administration of 0.6 mmol NAA/g body weigth. Results are mean ± SD (n=4-7)

for independent experiments performed in duplicate. ** p<0.01 compared to control

(Student’s t test).

113

Figure 1

114

Figure 2

115

Figure 3

116

Figure 4

117

Figure 5

118

Figure 6

119

Figure 7

120

Figure 8

121

Capítulo V

Intracerebroventricular administration of N-acetylaspartic acid impairs

antioxidant defenses and promotes protein oxidation in cerebral cortex of

rats

Artigo submetido à revista Metabolic Brain Disease

122

Intracerebroventricular administration of N-acetylaspartic acid impairs

antioxidant defenses and promotes protein oxidation in cerebral cortex of rats

Carolina Didonet Pederzolli

, Francieli Juliana Rockenbach

, Fernanda Rech Zanin

Nicoli Taiana Henn

, Eline Coan Romagna

, Ângela Malysz Sgaravatti

, Angela Terezinha

de Souza Wyse

1,2

, Clóvis Milton Duval Wannmacher

1,2

, Moacir Wajner

1,2

, Ângela de

Mattos Dutra

and Carlos Severo Dutra-Filho

1,2

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brasil.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, Instituto de Ciências

Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brasil.

Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Ciências da Saúde de

Porto Alegre, Porto Alegre, RS – Brasil.

* Corresponding Author:

Carlos Severo Dutra Filho

Departamento de Bioquímica, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua

Ramiro Barcelos, 2600 - Anexo, CEP 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil, Phone: +55 51

3308 5573 Fax: +55 51 3308 5535

E-mail: [email protected]

Suggested running head: N-acetylaspartic acid and oxidative stress in the brain

123

Abstract

N-acetylaspartic acid (NAA) is the biochemical hallmark of Canavan Disease, an

inherited metabolic disease caused by deficiency of aspartoacylase activity. NAA is an

immediate precursor for the enzyme-mediated biosynthesis of N-acetylaspartylglutamic

acid (NAAG), whose concentration is also increased in urine and cerebrospinal fluid of

patients affected by CD. This neurodegenerative disorder is clinically characterized by

severe mental retardation, hypotonia and macrocephaly, and generalized tonic and clonic

type seizures. Considering that the mechanisms of brain damage in this disease remain not

fully understood, in the present study we investigated whether intracerebroventricular

administration of NAA or NAAG elicits oxidative stress in cerebral cortex of 30-day-old

rats. NAA significantly reduced total radical-trapping antioxidant potential, catalase and

glucose 6-phosphate dehydrogenase activities, whereas protein carbonyl content and

superoxide dismutase activity were significantly enhanced. Lipid peroxidation indices and

glutathione peroxidase activity were not affected by NAA. In contrast, NAAG did not alter

any of the oxidative stress parameters tested. Our results indicate that

intracerebroventricular administration of NAA impairs antioxidant defenses and induces

oxidative damage to proteins, which could be involved in the neurotoxicity of NAA

accumulation in CD patients.

Keywords: N-acetylaspartic acid; N-acetylaspartylglutamic acid; aspartoacylase deficiency;

Canavan Disease; oxidative stress; rat brain

124

Introduction

N-acetylaspartic acid (NAA) is present at exceptionally high concentrations in

mammalian brain, reaching up to 20 mM (Baslow, 2003) but its metabolic and

neurochemical functions remain unclear (Moffett et al., 2007). However, it has been

postulated that NAA may serve as a source of the acetyl group to be incorporated into brain

lipids (Chakraborty et al., 2001; Kirmani et al., 2002; Madhavarao et al., 2005; Namboodiri

et al., 2006), as an intracellular osmolite (Baslow, 2002) and as a storage form of aspartate

(Beaudet, 2001). In addition, NAA is an immediate precursor for the biosynthesis of N-

acetylaspartylglutamate (NAAG), which is one of the most abundant neuropeptides in

mammalian nervous tissue (Gehl et al., 2004; Arun et al., 2006; Moffet et al., 2007) with

brain concentrations ranging from 0.5 to 2.7 mM (Pouwels and Frahm, 1997). In rat brain,

NAAG is synthesized from NAA and glutamate at a rate of about one molecule of NAAG

for every 10 molecules of NAA synthesized and under steady-state conditions this ratio is

maintained (Baslow and Guilfoyle, 2006). As a neuroactive compound, NAAG acts

primarily as an agonist at metabotropic glutamate receptors of group II (mGluR II), and, at

higher concentrations, NAAG is a weak agonist of N-methyl-D-aspartate receptors

(NMDA-R) (Neale, 2000; Pliss et al., 2000; Shave et al., 2001; Zhao et al., 2001).

Interestingly, NAAG can be hydrolized by N-acetylated α-linked acidic dipeptidase

(NAALADase), regenerating NAA (Thomas et al., 2000).

Canavan Disease (CD) is an autossomal recessive inherited neurometabolic disorder

in which NAA accumulation is the biochemical hallmark. This severe and progressive

leukodystrophy is caused by deficiency of the enzyme aspartoacylase, which hydrolyzes

NAA to acetate and aspartate (Beaudet, 2001; Matalon and Michals-Matalon, 2000).

125

Patients with CD present severe mental retardation, hypotonia and macrocephaly, and about

half of them also present generalized tonic and clonic seizures (Traeger and Rapin, 1998;

Matalon and Michals-Matalon, 2000; Beaudet, 2001). The diagnosis of CD can be

established by the detection of increased NAA levels in patient urine, blood and spinal fluid

and in the brain in vivo by the use of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy

(Gordon, 2000). Increased NAAG concentrations have also been reported in urine and

cerebrospinal fluid of patients affected by CD (Burlina et al., 1999; Krawczyk and

Gradowska, 2003). Neuropathological findings of CD include an extensive loss of myelin

(Kumar et al., 2006) with intramyelinic splitting, edema and vacuolation in the white matter

and the brain stem (Skiranth et al., 2007), leading to brain “swelling” or sponginess

characteristic of this disease, an increase in numbers of oligodendroglia and protoplasmic

astrocytes (Beaudet, 2001), and the presence of swollen astrocytes, as well as distorted and

elongated mitochondria (Adachi et al., 1972). As CD progresses, the brain becomes

atrophic, and the gray matter becomes involved as well (Matalon and Michals-Matalon,

2000). Brain atrophy progressively increases over time in CD patients, and whole-brain

NAA rises linearly and continuously (Janson et al., 2006).

Possible underlying mechanisms of brain damage in CD include a defective myelin

synthesis resulting from a deficiency of NAA-derived acetate (Madhavarao et al., 2005;

Namboodiri et al., 2006; Kumar et al., 2006) and a osmotic imbalance due to the

pathological accumulation of NAA, which lead to a build up of excessive fluid in the brain

(Baslow, 2002). Although the role of NAA in the pathogenesis of CD is still unclear,

increased concentrations of NAA in tissues and fluids would suggest the possibility that

NAA or related metabolites might have toxic effects (Beaudet, 2001). In fact,

126

intracerebroventricular administration of NAA to normal rats was able to induce seizures,

probably by neuronal overexcitation through metabotropic glutamate receptors (Akimitsu

et al., 2000; Kitada et al., 2000; Yan et al., 2003). In this scenario, epilepsy has already

been related to oxidative stress (Bruce and Baudry, 1995; Trotti et al., 1998; Liang et al.,

2000; Liang and Patel, 2004; Patel, 2004). In addition, recent data from our laboratory

indicated that subcutaneous administration of NAA promotes oxidative stress in cerebral

cortex of young rats by decreasing non-enzymatic antioxidant defenses and stimulating

oxidative damage to both lipids and proteins (Pederzolli et al., 2007), but it was not clear

whether these results were caused by NAA or by its derivative NAAG.

In the present study we investigated the effect of intracerebroventricular

administration of NAA and NAAG to 30-day-old rats on various parameters of oxidative

stress in cerebral cortex, in order to evaluate whether these accumulating metabolites could

induce oxidative stress in the brain, that could be related to the mechanisms of brain

damage responsible for the neurological impairment observed in CD patients. To

accomplish this, the following oxidative stress parameters were studied: spontaneous

chemiluminescence and thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), to assess lipid

peroxidation; carbonyl content, to evaluate protein oxidation; total radical-trapping

antioxidant potential (TRAP), to evaluate non-enzymatic antioxidant defenses; glucose 6-

phosphate dehydrogenase (G6PD) activity, to evaluate the main cellular source of NADPH

(pentose phosphate pathway); and the activities of the antioxidant enzymes glutathione

peroxidase (GPx), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD), to assess enzymatic

antioxidant defenses.

127

Materials and Methods

Materials

All chemicals were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA) except 2,2’-azo-

bis-(2-amidinopropane) that was purchased from Wako Chemicals (USA). NAA and

NAAG solutions were freshly prepared in artificial cerebrospinal fluid containing 12 mM

NaCl, 0.35 mM KCl, 0.125 mM NaH

, 0.13 mM MgCl

, 2.6 mM NaHCO

, 0.2 mM

CaCl

and 1.1 mM glucose, prepared as previously described by Zielke et al. (2002). The

pH was adjusted to 7.4 when necessary.

Animals

Thirty-day-old male Wistar rats bred in the Animal House of Universidade Federal

de Ciências da Saúde de Porto Alegre were used. Rats had free access to water and a 20%

(w/w) protein commercial chow (Supra, Porto Alegre, RS, Brazil). They were kept in a

room with 12:12 h light/dark cycle (lights on 07:00-19:00 h) and with air-conditioned

controlled temperature (22°C ± 1°C). The NIH Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals (NIH publication # 80-23, revised 1996) was followed in all experiments.

Intracerebroventricular (i.c.v.) administration of NAA and NAAG

After deeply anesthetized with sodium pentobarbithal (Nembutal, 45 mg/kg body

weight, i.p.), tricotomy was done and the rats were fixed in a stereotaxic apparatus. An

incision of about 12-15 mm long was made through the scalp to expose the bone. Using the

128

stereotaxic apparatus (David Kopf Instruments, California, USA), the needle of a Hamilton

syringe was inserted into the lateral cerebral ventricule through a drilled opening using the

following coordinates, according to Paxinos and Watson (2004): -0.1 mm caudally from

bregma (anteroposterior); 1.4 mm from the sagittal suture (lateral); and 3.9 mm from the

skull surface (dorsoventral). The volume of 5 µL of artificial cerebrospinal fluid containing

8 µmol NAA (Akimitsu et al., 2000) or 0.8 µmol NAAG (Pliss et al., 2003) was slowly

infused over two minutes into the lateral cerebral ventricule. Control rats received the same

volume of artificial cerebrospinal fluid alone. The needle was left in situ for another 2

minutes before withdrawal. Sham rats were subjected to the same surgical procedure, but

received no i.c.v. administration, and showed no significant difference from control (data

not shown).

Tissue preparation

Rats were killed by decapitation 15 or 60 minutes after i.c.v. administration, and the

brain was immediately removed and kept on an ice-plate. The olfactory bulb, pons and

medulla were discarded and the cerebral cortex was dissected, weighed and kept chilled

until homogenization. These procedures lasted up to 3 min. Cerebral cortex was

homogenized in 10 volumes (1:10, w/v) of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4

containing 140 mM KCl. Homogenates were centrifuged at 750 g for 10 min at 4ºC to

discard nuclei and cell debris (Llesuy et al., 1985; Lissi et al., 1986). The pellet was

discarded and the supernatant was immediately separated and used for the measurements.

The homogenates used were from individual animals, and they were never pooled. All

experiments were repeated with different animals.

129

Spontaneous chemiluminescence

Samples were assayed for spontaneous chemiluminescence in a dark room (Lissi et

al., 1986) using a beta liquid scintillation spectrometer Tri-Carb 2100TR in the out of

coincidence mode. The background chemiluminescence was measured for 5 min in vials

containing 3.5 mL of the same buffer used for homogenization. An aliquot of 0.5 mL of

supernatant was added and spontaneous chemiluminescence was measured for 10 minutes

at room temperature. The background chemiluminescence was subtracted from the total

value. Spontaneous chemiluminescence was represented as counts per second (CPS)/mg

protein.

Thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS)

TBA-RS was measured according to Ohkawa et al., 1979. Briefly, to glass tubes

were added, in order of appearence: 500 µL of tissue supernatant; 50 µL of SDS 8.1%;

1,500 µL of 20% acetic acid in aqueous solution (v/v) pH 3.5; 1,500 µL of 0.8 %

tiobarbituric acid; and 700 µL of distilled water. The mixture was vortexed and the

reaction was carried out in a boiling water bath for 1 hour. The mixture was allowed to

cool on water for 5 min, and was centrifuged at 750 g for 10 min. The resulting pink

stained TBA-RS obtained were determined spectrophotometrically at 535 nm in a

Beckman DU



640 Spectrophotometer. A calibration curve was generated using 1,1,3,3-

tetramethoxypropane as a standard, being subjected to the same treatment as that of the

samples. TBA-RS were represented as nmol/mg protein.

130

Carbonyl content

Oxidatively modified proteins present an enhancement of carbonyl content

(Stadtman and Levine, 2003). In this paper, carbonyl content was assayed by a method

based on the reaction of protein carbonyls with dinitrophenylhydrazine forming

dinitrophenylhydrazone, a yellow compound, measured spectrophotometrically at 370 nm

(Reznick and Packer, 1994). Briefly, 100 µL of homogenate were added to plastic tubes

containing 400 µL of 10 mM dinitrophenylhydrazine (prepared in 2 M HCl). This was kept

in the dark for 1 hour and vortexed each 15 minutes. After that, 500 µL of 20 %

trichloroacetic acid were added to each tube. The mixture was vortexed and centrifuged at

20,000 g for 3 minutes. The supernatant obtained was discarded. The pellet was washed

with 1 mL ethanol:ethyl acetate (1:1, v/v), vortexed and centrifuged at 20,000 g for 3

minutes. The supernatant was discarded and the pellet re-suspended in 600 µL of 6 M

guanidine (prepared in a 20 mM potassium phosphate solution pH 2.3). The sample was

vortexed and incubated at 60

C for 15 minutes. After that, it was centrifuged at 20,000 g

for 3 minutes and the supernatant was used to measure absorbance at 370 nm. Results were

represented as carbonyl content (nmol/mg protein).

Total radical-trapping antioxidant potential (TRAP)

TRAP was determined by measuring the chemiluminescence intensity of luminol

induced by 2,2’-azo-bis-(2-amidinopropane) (ABAP) thermolysis (Lissi et al., 1992;

Evelson et al., 2001) in a Wallac 1409 Scintillation Counter working in the out of

coincidence mode. Three mL of the reaction mixture containing 10 mM ABAP and 0.02

mM luminol in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 were added to a glass scintillation

131

vial and the initial chemiluminescence was measured. Ten µL of 160 µM Trolox (water-

soluble α-tocopherol analogue, used as standard) or 10 µL of tissue supernatant were then

added to that vial, producing a decrease in the initial chemiluminescence value. This value

is kept low until the antioxidants present in the sample are depleted, then

chemiluminescence returns to its initial value. The time taken by the sample to keep

chemiluminescence low is directly proportional to the antioxidant capacity of the tissue, so

TRAP represents the amount (quantity) of non-enzymatic antioxidants present in the

sample. The results were represented as nmol Trolox/mg protein.

Glucose 6-phosphate dehydrogenase assay

G6PD activity was measured according to Leong and Clark (1984). The method is

based on the formation of NADPH at 340 nm in a rection medium containing 100 mM

Tris-Hydrochloryde buffer pH 7.5, 10 mM magnesium chloryde, 0.1% triton X-100, 0.5

mM NADP

, 1 mM glucose 6-phosphate and 0.1-0.3 mg protein/mL. One G6PD unit is

defined as one µmol of NADPH produced per minute and the specific activity is

represented as G6PD units/mg protein.

Glutathione peroxidase assay

GPx activity was measured using tert-butyl-hydroperoxide as substrate (Wendel,

1981). NADPH disappearance was monitored at 340 nm using a double-beam

spectrophotometer with temperature control (Hitachi U-2001). The medium contained 2

mM glutathione, 0.15 U/mL glutathione reductase, 0.4 mM azide, 0.5 mM tert-butyl-

hydroperoxide and 0.1 mM NADPH. One GPx unit is defined as one µmol of NADPH

132

consumed per minute and the specific activity is represented as GPx units/mg protein.

Catalase assay

CAT activity was assayed using a double-beam spectrophotometer with temperature

control (Hitachi U-2001). This method is based on the disappearance of H

at 240 nm in

a reaction medium containing 20 mM H

, 0.1% Triton X-100, 10 mM potassium

phosphate buffer pH 7.0, and 0.1-0.3 mg protein/mL (Aebi, 1984). One CAT unit is defined

as one µmol of hydrogen peroxide consumed per minute and the specific activity is

represented as CAT units/mg protein.

Superoxide dismutase assay

This method for the assay of SOD activity is based on the capacity of pyrogallol to

autoxidize, a process highly dependent on O

, which is substrate for SOD (Marklund,

1985). The inhibition of autoxidation of this compound occurs in the presence of SOD,

whose activity can be then indirectly assayed spectrophotometrically at 420 nm, using a

double-beam spectrophotometer with temperature control (Hitachi U-2001). A calibration

curve was generated with purified SOD as a standard, in order to calculate the activity of

SOD present in the samples. The results were represented as SOD units/mg protein.

Protein determination

Protein concentration was determined in cerebral cortex supernatants using bovine

serum albumin as a standard (Lowry et al., 1951).

133

Statistical analysis

Statistical analysis was performed by the Student’s t test. All analyses were

performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software in a PC-

compatible computer. A value of p < 0.05 was considered to be significant.

Results

In the present work, the oxidative stress parameters were analyzed in cerebral cortex

from 30-day-old rats after 15 or 60 minutes of a single i.c.v. injection of NAA or NAAG.

Initially, we evaluated the effect of these compounds on the lipid peroxidation

parameters spontaneous chemiluminescence and TBA-RS. As it can be seen in Figure 1A,

NAA was not able to alter spontaneous chemiluminescence in cerebral cortex homogenates

obtained from 30-day-old rats after 15 minutes [t(14)=0.52; p>0.05] and after 60 minutes

[t(10)=0.48; p>0.05] after i.c.v. injection. Similar results were obtained with NAAG at 15

minutes [t(10)=0.39; p>0.05] or 60 minutes [t(10)=0.58; p>0.05] after i.c.v. injection

(Figure 1B). TBA-RS levels were equally not affected by i.c.v. administration of NAA (15

minutes after injection, [t(14)=0.70; p>0.05]; 60 minutes after injection, [t(10)=0.42;

p>0.05]; Figure 2A) or of NAAG (15 minutes after injection, [t(10)=1.81; p>0.05]; 60

minutes after injection, [t(10)=1.20; p>0.05]; Figure 2B). Altogether, the data demonstrated

that i.c.v. administration of NAA or NAAG does not promote lipid oxidative damage.

We also investigated whether oxidation of tissue proteins were affected by i.c.v.

administration of NAA or NAAG, by measuring carbonyl content. Figure 3A shows that

carbonyl content was significantly enhanced by NAA in cerebral cortex homogenates after

134

15 minutes [t(14)=5.60; p<0.01] and 60 minutes of i.c.v. injection [t(10)=4.43; p<0.01],

indicating protein oxidative damage. However, i.c.v. administration of NAAG was not able

to affect carbonyl content at 15 minutes [t(10)=1.21; p>0.05] or 60 minutes [t(10)=0.80;

p>0.05] after injection, as depicted in Figure 3B. These results show that NAA, but not

NAAG, was able to induce oxidative damage to proteins.

The next set of experiments was performed to evaluate the effect of i.c.v.

administration of NAA and NAAG on non-enzymatic antioxidant defenses, by measuring

TRAP. Figure 4A shows that TRAP was significantly reduced by NAA, as compared to

control at 15 minutes [t(14)=4.46; p<0.01] and 60 minutes [t(10)=2.84; p<0.05] after

injection, suggesting that this organic acid reduces the non-enzymatic antioxidant defenses.

However, TRAP was not affected by i.c.v. administration of NAAG at 15 minutes

[t(10)=0.51; p>0.05] and 60 minutes [t(10)=1.29; p>0.05] after injection (Figure 4B).

We also studied the effect of i.c.v. administration of NAA or NAAG on G6PD

activity, which is is the key regulatory enzyme of the pentose phosphate pathway (Table I).

We found that G6PD activity was significantly reduced by i.c.v. administration of NAA

only at 60 minutes after injection [t(10)=5.90; p<0.01], whereas at 15 minutes no effect was

observed [t(14)=0.18; p>0.05]. NAAG, on the other hand, did not alter G6PD activity at 15

minutes [t(10)=1.22; p>0.05] or 60 minutes [t(10)=0.79; p>0.05] after injection.

The effect of i.c.v. administration of NAA or NAAG was also tested on the

antioxidant enzyme activities of GPx, CAT and SOD (Table I). We observed that at 15

minutes after NAA injection, CAT activity was significantly reduced [t(14)=7.83; p<0.01],

while SOD [t(14)=1.30; p>0.05] and GPx [t(14)=1.34; p>0.05] activities were not affected

by i.c.v. NAA administration. Furthermore, 60 minutes after NAA administration, CAT

135

activity was also significantly reduced [t(10)=2.95; p<0.05], GPx activity not affected

[t(10)=0.42; p>0.05] and, interestingly, SOD activity was significantly enhanced

[t(10)=4.51; p<0.01]. In contrast, i.c.v. administration of NAAG was not able to induce

alterations in CAT activity (15 minutes, [t(10)=0.02; p>0.05]; 60 minutes, [t(10)=1.05;

p>0.05]), SOD activity (15 minutes, [t(10)=1.52; p>0.05]; 60 minutes, [t(10)=0.93;

p>0.05]) and GPx activity (15 minutes, [t(10)=1.59; p>0.05]; 60 minutes, [t(10)=1.95;

p>0.05]). These results clearly indicate that i.c.v. administration of NAA impairs enzymatic

antioxidant defenses, whereas NAAG causes no effect.

Discussion

We have previously reported that NAA at concentrations similar to those found in

CD patients promotes oxidative stress in vitro and in vivo (acute subcutaneous

administration) in cerebral cortex of 14-day-old rats (Pederzolli et al., 2007). NAAG also

accumulates in the brain of CD patients and recent findings showed that

intracerebroventricular administration of NAAG to rats is able to alter their behaviour and

to induce neurodegeneration, with significant changes in cell morphology and cleavage of

DNA (Pliss et al., 2003; Bubeníková-Valesová et al., 2006) which in turn can be produced

by oxidative damage (Halliwell and Gutteridge, 2007).

Therefore, in the present study, we extended our previous investigation by

evaluating the influence of i.c.v. administration of NAA or also of NAAG on oxidative

stress parameters in cerebral cortex of rats. We found that spontaneous chemiluminescence

and TBA-RS were not affected by NAA or NAAG, suggesting that oxidative damage to

136

lipids is not elicited by i.c.v. administration of these compounds to 30-day-old rats. This

effect is not in accordance with our previous results, which clearly showed a promotion of

oxidative damage to lipids by NAA in vitro or when subcutaneously administered to 14-

day-old rats (Pederzolli et al., 2007). The lack of effect of NAA on 30-day-old rats may

possibly be due to the better antioxidant status present at this age compared to younger rats

(Mavelli et al., 1982; Schreiber et al., 1995; Driver et al., 2000) or to other unknown

mechanisms.

On the other hand, NAA, but not NAAG, was able to cause oxidative damage to

proteins, as verified by the significant increase of carbonyl content. These results

corroborate our previous findings showing that NAA in vitro and in vivo (subcutaneous

administration) increased carbonyl content in cerebral cortex of rats (Pederzolli et al.,

2007).

We also demonstrated here that NAA significantly reduced TRAP in cerebral cortex

of rats subjected to i.c.v. administration of NAA. Considering that TRAP measures the

content of non-enzymatic antioxidants (Lissi et al., 1995), these results indicate that NAA

reduces the non-enzymatic antioxidant capacity in rat brain by reducing non-enzymatic

antioxidant content (TRAP), which is in line with our previous results.

We observed that NAA was able to significantly reduce G6PD activity in cerebral

cortex after 60 minutes of i.c.v. injection, while NAAG produced no effect on this enzyme

activity. G6PD is the key regulatory enzyme of the pentose phosphate pathway, which is

regulated by a number of factors including hormones, nutrients and oxidative stress

(Kletzien et al., 1994). G6PD is the rate-limiting enzyme in the GSH- and NADPH-

dependent H

elimination, suggesting the importance of G6PD in the antioxidant

function of brain and pathogenesis of oxidative stress-related diseases (Hashida et al.,

137

2002). Thus, G6PD activity may provide an early marker of oxidative stress since it is able

of responding rapidly to the increased demand for NADPH necessary for the maintenance

of the cellular redox state (Kletzien et al., 1994). The reduction of G6PD activity caused by

NAA could elicit an impairment of NADPH production.

With regard to the effects of NAA and NAAG on the antioxidant enzymes CAT,

SOD and GPx from cerebral cortex, NAAG did not alter these activities. However, CAT

activity was significantly reduced by NAA i.c.v. injection, whereas GPx activity was not

affected and SOD activity was significantly increased in cerebral cortex. CAT is a ferric

heme protein that directly catalyses the decomposition of H

to water, being the major

defense to remove H

when in excess (Halliwell and Gutteridge, 2007). On the other

hand, the increased activity of SOD may reflect a rebout effect of higher de novo synthesis

of this enzyme in an effort to remove the superoxide radical.

Our data on the effects of NAA on the major antioxidant enzymes reinforce the

view that oxidative stress responses do not always involve a coordinated expression of all

antioxidant enzymes and that their expression is regulated by different mechanisms

(Röhrdanz et al., 2000; Wilson and Johnson, 2000). Our results showing an enhancement of

SOD activity and a reduction of CAT and G6PD activities by NAA administered

intracerebrocentricularly suggest a possible impairment in H

detoxification. Considering

that SOD expression is readily induced after 1 hour exposition of cell cultures

to H

(Yoo et al., 1999; Rojo et al., 2004), our finding of an increase of SOD activity

may also involve enhanced expression of this antioxidant enzyme in response to oxidative

stress promoted by NAA.

Altogether, our present findings show that i.c.v. administration of NAA promotes

impairment of antioxidant defenses in cerebral cortex of 30-day-old rats, by reducing

138

TRAP, CAT and G6PD activities, compromising therefore the efficiency of reactive

species detoxification, which could eventually lead to the deleterious consequences of

oxidative damage to biomolecules, and also to an impairment in NADPH production and a

dysruption in the cellular redox balance. Considering that oxidative stress can be elicited by

the imbalance between free radical production and antioxidant defenses, and since NAA

promoted protein damage, as well as diminished antioxidant defenses, it might be

postulated that oxidative stress is induced in cerebral cortex of 30-day-old rats by i.c.v.

administration of NAA, the major metabolite accumulating in CD.

Pliss and coworkers (2003) recently found that NAAG i.c.v. was able to induce

DNA cleavage, which was thought that could be mediated by oxidative stress. In the

present study we found that i.c.v. administration of NAAG is not able to promote oxidative

stress up to 60 minutes after being administered, since it was unable to alter any of the

parameters tested. Thus, it seems that the neurotoxic effects observed earlier by other

investigators (Pliss et al., 2000; Pliss et al., 2002; Pliss et al., 2003; Bubeníková-Valesová

et al., 2006) may not be mediated by oxidative stress.

Even though the i.c.v. administration doses of NAA and NAAG used in our assays

are similar to those reported previously that caused neurotoxic effects (Akimitsu et al.,

2000; Pliss et al., 2003), it is difficult to extrapolate our findings to the human condition.

However, if the effects observed here, together with previous findings (Pederzolli et al.,

2007), also occur in brain of patients affected by CD, it is possible that they may

contribute, at least in part, to the mechanisms responsible for the brain damage observed in

those patients and the therapeutic use of antioxidants should be considered.

139

Acknowledgements

This work was supported by the research grants from Programa de Núcleos de

Excelência (PRONEX), CAPES, Brazilian National Research Council (CNPq),

PROPESQ/UFRGS, PIC/UFCSPA and FINEP – Rede Instituto Brasileiro de Neurociência

(IBN-Net) #01.06.0842-00.

References

Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126.

Adachi, M., Torii, J., Schneck, L., and Volk, B.W. (1972). Electron microscopy and

enzyme histochemical studies of the cerebellum in spongy degeneration (van Bogaert

and Bertrand type). Acta Neuropathologica (Berl) 20: 22.

Akimitsu, T., Kurisu, K., Hanaya, R., Iida, K., Kiura, Y., Arita, K., Matsubayashi, H.,

Ishihara, K., Kitada, K., Serikawa, T., and Sasa, M. (2000). Epileptic seizures induced

by N-aspartate in rats: in vivo and in vitro studies. Brain Res. 861: 143-150.

Arun, P., Madhavarao, C.N., Moffett, J.R., and Namboodiri, A.M.A. (2006). Regulation of

N-acetylaspartate and N-acetylaspartylglutamate biosynthesis by protein kinase

activators. J. Neurochem. 98: 2034-2042.

Baslow, M.H. (2002). Evidence supporting a role for N-acetyl-L-aspartate as a molecular

water pump in myelinated neurons in the central nervous system – An analytical

review. Neurochem. Int. 40: 295-300.

Baslow, M.H. (2003). N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.

Neurochem. Res. 28(6): 941-953.

Baslow, M.H., and Guilfoyle, D.N. (2006). Functions of N-acetylaspartate and N-

140

acetylaspartylglutamate in brain: evidence of a role in maintenance of higher brain

integrative activities of information processing and cognition. Adv. Exp. Med. Biol.

576: 95-112.

Beaudet, A. (2001). Aspartoacylase Deficiency (Canavan Disease). In (Scriver, C.R.,

Beaudet, A. L., Sly, W.S., and Valle, D., eds.), The Metabolic and Molecular Bases of

Inherited Disease, McGraw-Hill, New York, pp. 5799-5805.

Bruce, A.J., and Baudry, M. (1995). Oxygen free radicals in rat limbic structures after

kainate-induced seizures. Free Radic. Biol. Med. 18: 993-100.

Bubeníková-Valesová, V., Balcar, V., Tejkalová, H., Langmeier, M., and St’astny, F.

(2006). Neonatal administration of N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate induces early

neurodegeneration in hippocampus and alters behaviour in young adult rats.

Neurochem. Int. 48: 515-522.

Burlina, A.P., Ferrari, V., Divry, P., Gradoeska, W., Jakobs, C., Bennet, M.J., Sewell, A.C.,

Dionisi-Vici, C., and Burlina, A.B. (1999). N-acetylaspartylglutamate in Canavan

disease: an adverse effector? Eur. J. Pediatr. 158: 406-409.

Chakraborty, G., Mekala, P., Yahya, D., Wu, G., and Ledeen, R. (2001). Intraneuronal N-

acetylaspartate supplies acetyl groups for myelin lipid synthesis: evidence for myelin-

associated aspartoacylase. J. Neurochem. 78: 736-745.

Driver, A.S., Kodavanti, P.R.S., Mundy, W.R. (2000). Age-related changes in reactive

oxygen species production in rat brain homogenates. Neurotoxicol. Teratol. 22: 175-

181.

Evelson, P., Travacio, M., Repetto, M., Escobar, J., Llesuy, S.F., and Lissi E. (2001).

Evaluation of total reactive antioxidant potential (TRAP) of tissue homogenates and

141

their cytosols. Arch. Biochem. Biophys. 388: 261-266.

Gehl, L.M., Saab, O.H., Bzdega, T., Wroblewska, B., and Neale, J.H. (2004). Biosynthesis

of NAAG by an enzyme-mediated process in rat central nervous system neurons and

glia. J. of Neurochem. 90: 989-997.

Gordon, N. (2000). Canavan disease: A review of recent developments. Eur. J. of Paediatr.

Neurol. 5: 65-69.

Halliwell, B., and Gutteridge, J.M.C. (2007). Cellular responses to oxidative stress:

adaptation, damage, repair, senescence and death. In (Halliwell, B., and Gutteridge,

J.M.C., eds.), Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford University Press Inc.,

Oxford, pp. 187-267.

Janson, C.G., McPhee, S.W.J., Francis, J., Shera, D., Assadi, M., Freese, A., Hurh, P.,

Haselgrove, J., Wang, D.J., Bilaniuk, L., and Leone, P. (2006). Natural history of

Canavan Disease revealed by Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-MRS) and

Diffusion-weighted MRI, Neuropediatrics 37: 209-221.

Kirmani, B.F., Jacobowitz, D.M., Kallarakal, A.T. and Namboodiri, M.A.A. (2002).

Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS:

therapeutic implications for Canava Disease. Mol. Brain Res. 107: 176-182.

Kitada, K., Akimitsu, T., Shigematsu, Y., Kondo, A., Maihara, T., Yokoi, N., Kuramoto,

T., Sasa, M., and Serikawa, T. (2000). Accumulation of N-acetylaspartate in the brain

of the tremor rat, a mutant exhibiting absence-like seizure and spongiform degeneration

in the central nervous system. J. Neurochem. 74(6): 2512-2519.

Kletzien, R.F., Harris, P.K.W., and Foellmi, L.A. (1994). Glucose 6-phosphate

dehydrogenase: a “housekeeping” enzyme subject to tissue-specific regulation by

142

hormones, nutrients and oxidant stress, FASEB J. 8: 174-181.

Krawczyk, H., and Gradowska, W. (2003). Characterization of the 1H and 13C NMR

spectra of N-acetylaspartylglutamate and its detection in urine from patients with

Canavan disease. J. Pharm. Biomed. Anal. 31: 455-463.

Kumar, S., Mattan, N.S., and de Vellis, J. (2006). Canavan disease: a white matter disorder.

Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 12: 157-65.

Leong, S.F., and Clark, J.B. (1984). Regional enzyme development in rat brain, Enzymes

associated with glucose utilization. Biochem. J. 218: 131-138.

Liang, L.P., Ho Y.S., and Patel, M. (2000). Mitochondrial superoxide production in

kainate-induced hippocampal damage. Neuroscience 101: 563-570.

Liang, L.P., and Patel, M. (2004). Mitochondrial oxidative stress and increased seizure

susceptibility in Sod2(−/+) mice. Free Radic. Biol. Med. 36: 542-554.

Lissi, E., Caceres, T., and Videla, L.A. (1986). Visible chemiluminescence from rat brain

homogenates undergoing autoxidation. I. Effect of additives and products

accumulation. Free Radic. Biol. Med. 2: 63-69.

Lissi, E., Pascual, C., and Del Castillo, M.D. (1992). Luminol luminescence induced by

2,2’-azo-bis-(2-amidinopropane) thermolysis. Free Radic. Res. Commun. 17: 299-311.

Lissi, E., Salim-Hanna, M., Pascual, C., and Del Castillo, M.D. (1995). Evaluation of total

antioxidant potential (TRAP) and total antioxidant reactivity from luminol-enhanced

chemiluminescence measurements. Free Radic. Biol. Med. 18: 153-158.

Llesuy, S.F., Milei, J., Molina, H., Boveris, A., and Milei, S. (1985). Comparison of lipid

peroxidation and myocardial damage induced by adriamycin and 4'-epiadriamycin in

mice. Tumori 71: 241-249.

143

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Lewis-Farr, A., and Randall, R.J. (1951). Protein

measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Madhavarao, C.N., Arun, P., Moffett, J.R., Szucs, S., Surendran, S., Matalon, R., Garbern,

J., Hristova, D., Johnson, A., Jiang, W., Namboodiri, M.A.A. (2005). Defective N-

acetylaspartate catabolism reduces brain acetate levels and myelin lipid synthesis in

Canavan`s Disease. PNAS 102: 5221-5226.

Marklund, S.L. (1985). Pyrogallol autoxidation. In (Greenwald, R.A., ed.), Handbook of

Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, pp. 243-247.

Matalon, R., and Michals-Matalon, K. (2000). Spongy degeneration of the brain, Canavan

Disease: biochemical and molecular findings. Frontiers in Bioscience 5: d307-311.

Mavelli, I., Rigo, A., Federico, R., Ciriolo, M.R., Rotilio, G. (1982). Superoxide dismutase,

glutathione peroxidase and catalase in developing rat brain. Biochem. J. 204: 535-540.

Moffett, J.R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C.N., and Namboodiri, A.M.A. (2007). N-

acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology, Prog. Neurobiol.

81: 89-131.

Namboodiri, A.M.A., Peethambaran, A., Mathew, R., Sambhu, P.A., Hershfield, J.,

Moffett, J.R., and Madhavarao, C.N. (2006). Canavan disease and the role of N-

acetylaspartate in myelin synthesis. Mol. Cell. Endocrinol. 252: 216-223.

Neale, J.H., Bezdega, T., and Wroblewska, B. (2000). N-acetylaspartylglutamate: the most

abundant peptide neurotransmitter in the mammalian central nervous system. J.

Neurochem. 75(2): 443-452.

Ohkawa, H., Ohishi, N., and Yagi, K. (1979). Assay for lipid peroxides in animal tissues by

144

thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem, 95: 351-358.

Patel, M. (2004). Mitochondrial dysfunction and oxidative stress: cause and consequence of

epileptic seizures. Free Radic. Biol. Med. 37(12): 1951-1962.

Paxinos, G., and Watson, C. (2004). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Elsevier,

New York.

Pederzolli, C.D., Mescka, C.P., Scapin, F., Rockenbach, F.J., Sgaravatti, A.M., Sgarbi,

M.B., Wyse, A.T.S., Wannmacher, C.M.D., Wajner, M., and Dutra-Filho, C.S. (2007).

N-acetylaspartic acid promotes oxidative stress in cerebral cortex of rats. Int. J. Dev.

Neurosci. 25 (5): 317-324.

Pliss, L., FitzGibbon, T., Balcar, V.J., and St’astn y, F. (2000). Neurotoxicity of NAAG in

vivo is sensitive to NMDA antagonists and mGluR II ligands. Neuroreport. 11 (16):

3651-3654.

Pliss, L., Jezová, D., Mares, V., Balcar, V.J., and St’astny, F. (2002). N-Acetyl-L-aspartyl-

L-glutamate changes functional and structural properties of rat blood-brain barrier.

Neurosci. Let. 317: 85-88.

Pliss, L., Balcar, V.J., Bubeníková, V., Pokorn y, J., FitzGibbon, T., and St’astn y, F. (2003).

Morphology and ultra-structure of rat hippocampal formation after i.c.v. administration

of N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate. Neuroscience 122: 93-101.

Pouwels, P.J., and Frahm, J. (1997). Differential distribution of NAA and NAAG in human

brain as determined by quantitative localized proton MRS. NMR Biomed. 10(2): 73-78.

Reznick, A.Z., and Packer, L. (1994). Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric

method for carbonyl assay. Meth. Enzymol. 233: 357-363.

Röhrdanz, E., Obertrifter, B., Ohler, S., Tran-Thi, Q., Kahl, R. (2000). Influence of

Adriamycin and paraquat on antioxidant enzyme expression in primary rat hepatocytes.

145

Arch. Toxicol. 74: 231-237.

Rojo, A.I., Salinas, M., Martín, D., Perona, R., Cuadrado, A. (2004). Regulation of Cu/Zn-

superoxide dismutase expression via the phosphatidylinositol 3 kinase/Akt pathway and

Nuclear Factor-kB. J. Neurosci. 24(33): 7324-7334.

Schreiber, S.J., Megow, D., Raupach, A., Victorov, I.V., Dirnagl, U. (1995). Age-related

changes of oxygen free radical production in the rat brain slice after hypoxia: on-line

measurement using enhanced chemiluminescence. Brain Res. 703: 227-230.

Shave, E., Pliss, L., Lawrance, M.L., FitzGibbon, T., St’astny, F., and Balcar, V.J. (2001).

Regional distribution and pharmacological characteristics of [

H]N-acetyl-aspartyl-

glutamate (NAAG) binding sites in rat brain. Neurochem. Int. 38: 53-62.

Skiranth, S.G., Chandrashekar, H.S., Nagarajan, K., and Jayakumar, P.N. (2007). Restricted

diffusion in Canavan Disease. Childs Nerv. Syst. 23: 465-468.

Stadtman, E.R., Levine, R.L. (2003). Free-radical mediated oxidation of free amino acids

and amino acid residues in proteins. Amino Acids 25: 207-218.

Thomas, A.G., Vornov, J.J., Olkowski, J.L., Merion, A.T., Slusher, B.S. (2000). N-

acetylated α–linked acidic dipeptidase converts N-acetylaspartylglutamate from a

neuroprotectant to a neurotoxin. JPET 295: 16-22.

Traeger, E.C., and Rapin, I. (1998). The clinical course of Canavan Disease. Pediatric

Neurol. 18(3): 207-212.

Trotti, D., Danbolt, N.C., and Volterra, A. (1998): Glutamate transporters are oxidant-

vulnerable: a molecular link between oxidative stress and excitotoxic

neurodegeneration? Trends Pharmacol. Sci. 19: 328-334.

Yan, H.D., Ishihara, K., Serikawa, T., and Sasa, M. (2003). Activation by N-acetyl-L-

146

aspartate of acutely dissociated hippocampal neurons in rats via metabotropic glutamate

receptors. Epilepsia 44(9): 1153-1159.

Zielke, H.R., Zielke, C.L., Baab, P.J., and Collins, R.M. (2002). Large neutral acids auto

exchange when infused by microdialysis into the rat brain: implication for maple syrup

urine disease and phenylketonuria. Neurochem. Int. 40: 347-354.

Zhao, J., Ramadan, E., Cappiello, M., Wroblewska, B., Bzdega, T., and Neale, J.H. (2001).

NAAG inhibits KCl-induced [

H]-GABA release via mGluR3, cAMP, PKA and L-type

calcium conductance. European Journal of Neuroscience 13: 340-346.

Wendel, A. (1981). Glutathione peroxidase. Meth. Enzymol. 77: 325-332.

Wilson, D.O., Johnson, P. (2000). Exercise modulates antioxidant enzyme gene expression

in rat myocardium and liver. J. Appl. Physiol. 88: 1791-1796.

Yoo, H.Y., Chang, M.S., Rho, H.M. (1999). The activation of the rat cooper/zinc

superoxide dismutase gene by hydrogen peroxide through the hydrogen peroxide

responsive element and by paraquat and heat shock through the same heat shock

element. J. Biol. Chem. 274(34): 23887-23892.

147

Table I. Effect of intracerebroventricular (i.c.v.) administration of N-acetylaspartic acid

(NAA) and N-acetylaspartylglutamic acid (NAAG) on the activities of glucose 6-phosphate

dehydrogenase (G6PD), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione

peroxidase (GPx) in cerebral cortex of 30-day-old rats.

NAA

G6PD activity

(U/mg protein)

CAT activity

(U/mg protein)

SOD activity

(U/mg protein)

GPx activity

(U/mg protein)

15 min

60 min 15 min 60 min 15 min 60 min 15 min 60 min

Control

11.45 ±

0.21

17.00 ±

0.72

4.40 ±

0.36

5.42 ±

0.24

6.04 ±

0.68

6.91 ±

0.71

16.38 ±

1.88

19.24 ±

0.58

NAA

11.30 ±

1.29

14.42 ±

0.79 **

3.04 ±

0.34 **

4.52 ±

0.71 *

5.68 ±

0.48

8.35 ±

0.34 **

15.40 ±

0.88

18.98 ±

1.38

NAAG

G6PD activity

(U/mg protein)

CAT activity

(U/mg protein)

SOD activity

(U/mg protein)

GPx activity

(U/mg protein)

15 min

60 min 15 min 60 min 15 min 60 min 15 min 60 min

Control

14.39 ±

1.64

11.65 ±

0.87

3.36 ±

0.47

3.58 ±

0.45

6.07 ±

0.55

5.93 ±

0.59

16.78 ±

2.39

14.79 ±

1.82

NAAG

13.45 ±

0.95

12.13 ±

1.18

3.35 ±

0.45

3.88 ±

0.52

5.61 ±

0.49

5.70 ±

0.20

14.89 ±

1.69

12.96 ±

1.40

Results are mean ± SD for six-to-eight independent experiments (animals) performed in duplicate. *p<0.05

and **p<0.01 compared to control (Student’s t test for unpaired samples).

Time after i.c.v. injection.

148

Figure 1. Effect of intracerebroventricular (i.c.v.) administration of N-acetylaspartic acid

(NAA) (A) or N-acetylaspartylglutamic acid (NAAG) (B) on spontaneous

chemiluminescence in cerebral cortex from 30-day-old rats. Rats were killed 15 or 60

minutes after injection. Results are mean ± SD (n=6-8) for independent experiments

(animals) performed in duplicate. No significant differneces were detected from control

(Student’s t test).

Figure 2. Effect of intracerebroventricular (i.c.v.) administration of N-acetylaspartic acid

(NAA) (A) or N-acetylaspartylglutamic acid (NAAG) (B) on thiobarbituric acid reactive

substances (TBA-RS) in cerebral cortex from 30-day-old rats. Rats were killed 15 or 60

minutes after injection. Results are mean ± SD (n=6-8) for independent experiments

(animals) performed in duplicate. No significant differences were detected from control

(Student’s t test).

Figure 3. Effect of intracerebroventricular (i.c.v.) administration of N-acetylaspartic acid

(NAA) (A) or N-acetylaspartylglutamic acid (NAAG) (B) on carbonyl content in cerebral

cortex from 30-day-old rats. Rats were killed 15 or 60 minutes after injection. Results are

mean ± SD (n=6-8) for independent experiments (animals) performed in duplicate. *

p<0.05 and ** p<0.01 compared to control (Student’s t test).

149

Figure 4. Effect of intracerebroventricular (i.c.v.) administration of N-acetylaspartic acid

(NAA) (A) or N-acetylaspartylglutamic acid (NAAG) (B) on non-enzymatic antioxidant

defenses: total radical-trapping antioxidant potential (TRAP) in cerebral cortex from 30-

day-old rats. Rats were killed 15 or 60 minutes after injection. Results are mean ± SD (n=6-

8) for independent experiments (animals) performed in duplicate. * p<0.05 and ** p<0.01

compared to control (Student’s t test).

150

FIGURE 1

151

FIGURE 2

152

FIGURE 3

153

FIGURE 4

154

Capítulo VI

Efeitos in vitro do ácido N-acetilaspartilglutâmico sobre parâmetros de

estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos

155

Avaliamos também no presente trabalho os efeitos in vitro do ácido N-

acetilaspartilglutâmico, outro metabólito acumulado na doença de Canavan, sobre alguns

parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos. Considerando que o pico

máximo de concentração do ácido N-acetilaspartilglutâmico se dá entre os dias 8 e 14 de

vida pós-natal em ratos, e que esse ácido orgânico apresenta maior toxicidade em ratos de

aproximadamente 15 dias de vida do que em ratos adultos (Bubeníková-Valesová et al.,

2006), neste experimento foram utilizados ratos de 14 dias de vida. Os homogeneizados de

córtex cerebral foram incubados por 1 hora a 37°C na presença ou ausência de ácido N-

acetilaspartilglutâmico nas concentrações de 1, 5 e 10 mM. Após a incubação foram

medidos os seguintes parâmetros de estresse oxidativo: Potencial Antioxidante Total

(TRAP), para avaliar as defesas antioxidantes não-enzimáticas; quimiluminescência

espontânea e Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBA-RS), para avaliar dano

oxidativo a lipídios; e conteúdo de carbonilas, para avaliar o dano oxidativo protéico.

Observamos nesse estudo que o ácido N-acetilaspártico in vitro não foi capaz de alterar

significativamente os parâmetros de estresse oxidativo avaliados em córtex cerebral de

ratos de 14 dias de vida (Tabela I), não sendo, portanto, capaz de promover estresse

oxidativo in vitro.

156

Tabela I. Efeitos in vitro do ácido N-acetilaspartilglutâmico (NAAG) sobre parâmetros

gerais de estresse oxidativo: potencial antioxidante total (TRAP), quimiluminescência

espontânea, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e conteúdo de

carbonilas em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida.

NAAG in vitro

TRAP

(nmol Trolox/mg

proteína)

Quimiluminescência

espontânea

(CPS/mg proteína)

TBA-RS

(nmol/mg

proteína)

Conteúdo de

carbonilas

(nmol/mg proteína)

Controle

43,56 ± 0,86 62,01 ± 1,87 4,00 ± 0,58 2,61 ± 0,42

NAAG 1 mM

42,80 ± 3,54 61,45 ± 5,15 3,99 ± 0,35 2,82 ± 0,17

NAAG 5 mM

42,42 ± 1,50 62,63 ± 4,08 4,11 ± 0,49 2,88 ± 0,30

NAAG 10 mM

41,66 ± 4,16 62,44 ± 2,94 4,24 ± 0,64 2,90 ± 0,49

Resultados expressos como média ± desvio padrão para um n de quatro experimentos independentes

realizados em duplicata. Não foram detectadas diferenças significativas em relação ao controle (ANOVA).

157

PARTE III

158

DISCUSSÃO

1. 5-Oxoprolina

Apesar de apresentarem ampla heterogeneidade genética e fenotípica, os pacientes

afetados pela deficiência de GS, na qual há um acúmulo de 5-OP, geralmente manifestam

um quadro de disfunção neurológica progressiva caracterizada por retardo mental, ataxia e

convulsões, entre outros sintomas. No entanto, os mecanismos responsáveis pelo dano

cerebral observado nesses pacientes permanecem ainda pouco conhecidos.

Sabe-se que esses pacientes apresentam, além de altos níveis de 5-OP, níveis

diminuídos do antioxidante GSH no cérebro, e por esse motivo tem sido postulado que

pacientes com deficiência de GS poderiam ter uma sensibilidade aumentada ao estresse

oxidativo (Ristoff et al., 2001; Larsson e Anderson, 2001). Apesar de os baixos níveis de

GSH terem sido até então postulados como o principal mecanismo responsável pelos danos

cerebrais nesses pacientes, estudos recentes realizados em pacientes afetados por essa

desordem revelaram não haver correlação entre a atividade da GS, os níveis de GSH, os

níveis de γ–glutamilcisteína e a presença ou ausência de sintomas neurológicos (Dahl et al.,

1997; Ristoff et al., 2001; Njalsson et al., 2005; Nygren et al., 2005), não tendo sido

avaliados os níveis sangüíneos de 5-OP em nenhum desses estudos. Nygren e

colaboradores (2005) observaram ausência de dano oxidativo ao DNA nuclear em

fibroblastos de pacientes afetados pela deficiência de GS, e ausência de correlação entre os

níveis de GSH ou de γ–glutamilcisteína e a proteção contra dano oxidativo ao DNA. Esses

pesquisadores sugerem, então, que a oxidação de outros compostos celulares, a alteração

do potencial redox celular ou efeitos tóxicos de precursores de GSH, como a 5-OP, sejam

explicações mais plausíveis para os mecanismos responsáveis pelos sintomas clínicos

159

associados à deficiência de GS (Nygren et al., 2005).

Ainda, é interessante observar que indivíduos com deficiência de 5-oxoprolinase,

que constitui outro erro inato do ciclo γ–glutamil, também apresentam altas concentrações

teciduais de 5-OP e manifestações clínicas neurológicas similares às encontradas na

deficiência de GS; no entanto, não apresentam níveis diminuídos de GSH (Larsson e

Anderson, 2001).

Em conjunto, essas evidências sugerem que os níveis reduzidos de GSH talvez não

sejam os únicos determinantes da neurodegeneração nesses pacientes. Considerando que a

5-OP apresenta diversas ações neurotóxicas (Bennet et al., 1973; Escobedo e Cravioto,

1973; Rieke et al., 1984; Dusticier et al., 1985; Rieke et al., 1989; Barone e Spignoli, 1990;

Silva et al., 2001), é possível que a 5-OP por si só tenha, ao menos em parte, algum papel

no dano cerebral observado nesses pacientes. No entanto, os mecanismos responsáveis pela

sua toxicidade permanecem ainda pouco esclarecidos.

Dentre os efeitos neurotóxicos da 5-OP, tem-se sua ligação a receptores

glutamatérgicos e inibição da captação de glutamato, promovendo excitotoxicidade

(Bennet et al., 1973; Rieke et al., 1984; Barone e Spignoli, 1990); a inibição, tanto em

neurônios quanto em células gliais, da Na

-ATPase, enzima fundamental na

manutenção do gradiente iônico de Na

e K

através das membranas neuronais e da

excitabilidade neuronal (Escobedo e Cravioto, 1973; Rieke et al., 1984; Stahl, 1984; Lees,

1991); e o comprometimento do metabolismo energético cerebral, pela redução da

produção de CO

, dos níveis de ATP e da síntese de lipídios, além da inibição da atividade

dos complexos I + III e complexo IV da cadeia respiratória (Silva et al., 2001). Cabe

salientar que tanto o mecanismo de excitotoxicidade, quanto a inibição da Na

-ATPase

160

e a inibição dos complexos da cadeia respiratória já foram relacionados a ER (Hexum e

Fried, 1979; Kukreja et al., 1990; Pellegrini-Giampietro, 1990; Cleeter et al., 1992; Bondy

e Le Bel, 1993; Lees, 1993; Nicholls e Budd, 1998; Halliwell e Gutteridge, 2007), sendo

por isso possível que todas essas ações promovidas pela 5-OP sejam de fato mediadas pela

produção de ER. Além disso, cabe salientar que pacientes com deficiência de GS

apresentam alterações neuropatológicas muito semelhantes àquelas observadas nos casos

de intoxicação por mercúrio, na qual o envolvimento de uma produção aumentada de ER já

foi também demonstrado (Marstein et al., 1981). Em conjunto, todas essas evidências

sugerem o possível envolvimento do estresse oxidativo na neurotoxicidade da 5-OP.

Recentemente demonstramos que a 5-OP pode comprometer in vitro as defesas

antioxidantes não-enzimáticas em cérebro de ratos, visto que diminuiu significativamente e

de forma dose-dependente tanto o TRAP quanto o TAR, que medem quantidade e

reatividade dos antioxidantes não-enzimáticos do tecido, respectivamente (Pederzolli et al.,

2007). No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro da 5-OP sobre parâmetros de

dano oxidativo a proteínas e sobre a produção de ER em córtex cerebral e cerebelo de

ratos. Observamos que a 5-OP pode promover in vitro dano oxidativo protéico, já que

alterou os conteúdos de carbonilas e de tióis totais, provavelmente através do aumento da

produção de ER no córtex cerebral e cerebelo de ratos jovens, visto que aumentou a

fluorescência do DCF, ensaio que mede a produção generalizada, e não específica, de ER

(Pederzolli et al., 2007). Dessa forma, considerando que o estresse oxidativo pode ser

gerado pelo desequilíbrio entre a produção de ER e as defesas antioxidantes, e que a 5-OP

diminui as defesas antioxidantes não-enzimáticas, aumenta a produção de ER e promove

dano oxidativo protéico, postula-se que a 5-OP é capaz de induzir estresse oxidativo in

161

vitro, sendo esse mais um possível mecanismo envolvido em sua neurotoxicidade.

Considerando que tanto a excitotoxicidade quanto o dano ao metabolismo

energético cerebral são igualmente promovidos pela 5-OP, e que ambos já foram

relacionados ao estresse oxidativo, parece possível que esses processos possam agir de

forma sinérgica in vivo. Assim, resolvemos investigar os efeitos in vivo da 5-OP sobre

parâmetros de estresse oxidativo a fim de melhor esclarecer seu papel na neurotoxicidade

desse ácido orgânico. Para isso, ratos de 14 dias de vida foram submetidos à administração

aguda de solução salina (ratos controle) ou de 5-OP, administradas por via subcutânea,

sendo os animais mortos 1 hora após a injeção. Efetuamos em nosso estudo a medida dos

níveis plasmáticos e cerebrais atingidos por uma dose única de 5-OP (1g/kg de peso

corporal). A escolha da dose de 5-OP baseou-se em estudo prévio realizado por Caccia e

colaboradores (1982), que mostrou que a administração oral de igual dose de 5-OP a ratos

produziu concentrações plasmáticas similares às encontradas nos pacientes afetados pela

deficiência de GS. Cabe ressaltar que os níveis de 5-OP no plasma e LCR dos pacientes

afetados pela deficiência de GS se encontram na faixa de 2 a 5 mM e de 1 a 3 mM,

respectivamente (Meister, 1974; Jain et al., 1994), enquanto que as concentrações

fisiológicas de 5-OP são aproximadamente 50 µM no plasma e 40 µM no LCR (Hoffmann

et al., 1993). Os níveis plasmáticos e cerebrais de 5-OP obtidos em nosso estudo (2,82 mM

e 0,80 mM, respectivamente) são similares aos encontrados no plasma e LCR de pacientes

com deficiência de GS, assegurando que nosso modelo agudo atinge concentrações

satisfatórias para avaliar os efeitos in vivo da 5-OP.

Foram avaliados os efeitos da administração aguda de 5-OP sobre a

quimiluminescência espontânea e sobre os níveis de substâncias reativas ao ácido

162

tiobarbitúrico (TBA-RS), sendo ambos considerados parâmetros de lipoperoxidação. A

quimiluminescência espontânea mede a luz emitida pelos lipídios peroxidados resultantes

de um aumento na produção de ER (Halliwell e Gutteridge, 2007), enquanto o TBA-RS

reflete a quantidade de malondialdeído formado na degradação de lipídios promovida pela

lipoperoxidação (Esterbauer e Cheeseman, 1990). Observamos que a administração aguda

de 5-OP aumenta significativamente a quimiluminescência espontânea e os níveis de TBA-

RS em córtex cerebral e cerebelo, indicando que a 5-OP é capaz de promover

lipoperoxidação in vivo em cérebro de ratos, resultados que não haviam sido observados

anteriormente in vitro (Pederzolli et al., 2007). Cabe lembrar que nem todas as ER são

capazes de iniciar a lipoperoxidação; OH

●

, RO

●

, NO

●

e ONOOH podem prontamente

fazê-lo. Por outro lado, H

, NO

•

e O

•−

não são suficientemente reativos para abstrair um

hidrogênio de um lipídio poliinsaturado, não sendo capazes de iniciar diretamente a reação

em cadeia de lipoperoxidação (Halliwell e Whiteman, 2004; Halliwell e Gutteridge, 2007).

Considerando que o estímulo à lipoperoxidação promovido pela 5-OP foi observado apenas

in vivo, e não in vitro, sugere-se que a 5-OP possa apresentar um efeito indireto sobre esse

parâmetro, provavelmente envolvendo produção in vivo de ER capazes de iniciar a

lipoperoxidação (Halliwell e Gutteridge, 2007). Além disso, é importante ressaltar que nos

experimentos in vitro, o córtex cerebral e o cerebelo foram expostos à 5-OP somente após a

homogeneização desses tecidos, processo que promove o rompimento de membranas

celulares, excluindo-se nesse tipo de experimento o envolvimento de mecanismos como o

da excitotoxicidade, por exemplo, que exige a presença de membranas e sinapses neuronais

íntegras. Cabe lembrar que a promoção de excitotoxicidade pela 5-OP já foi demonstrada

(Bennet et al., 1973; Rieke et al., 1989; Barone e Spignoli, 1990), e que a excitotoxicidade

163

por si só já foi relacionada a estresse oxidativo (Lees, 1993; Hazel, 2007). O excesso de

liberação neuronal de glutamato pode ativar diversos receptores glutamatérgicos pré- e pós-

sinápticos, gerando um conseqüente aumento intracelular de cálcio, que pode levar à

disfunção mitocondrial, superprodução de ER e ativação de proteases, fosfolipases e

endonucleases, culminando com a morte celular (Halliwell e Gutteridge, 2007; Hazel et al.,

2007). Assim, a possível contribuição da excitotoxicidade para os efeitos promovidos pela

5-OP in vivo não deve ser desconsiderada, podendo ter havido um sinergismo de efeitos

para a promoção de lipoperoxidação pela 5-OP in vivo.

Em relação ao dano oxidativo protéico, sabe-se que diversas ER podem oxidar

resíduos de aminoácidos em proteínas formando produtos contendo grupos carbonila, que

podem ser quantificados através de sua reação com a dinitrofenilhidrazina (Halliwell e

Gutteridge, 2007). Verificamos no presente trabalho que o conteúdo de carbonilas é

significativamente aumentado em córtex cerebral e cerebelo de ratos submetidos à

administração aguda de 5-OP, indicando dano oxidativo protéico. Esses resultados

corroboram nossos resultados anteriores in vitro (Pederzolli et al., 2007), sugerindo que a

5-OP é capaz de promover a oxidação de proteínas tanto in vitro quanto in vivo.

Observamos ainda que o TRAP, que avalia a quantidade de antioxidantes não-

enzimáticos presentes no tecido, é significativamente reduzido pela 5-OP in vivo tanto em

córtex cerebral quanto em cerebelo de ratos, o que está de acordo com nossos resultados in

vitro (Pederzolli et al., 2007). No entanto, os níveis de ácido ascórbico e de GSH, dois

importantes antioxidantes não-enzimáticos cerebrais, não são afetados pela administração

aguda de 5-OP, sugerindo que a redução do TRAP observada in vivo não seja

especificamente devida à redução de ácido ascórbico ou GSH. No cérebro, outros

164

importantes antioxidantes não-enzimáticos incluem o α-tocoferol (Vitamina E, principal

antioxidante lipofílico cerebral), proteínas quelantes de metais como a ceruloplasmina e a

metalotioneína, e ainda a carnosina (neuropeptídeo) e a melatonina (hormônio pineal)

(Stvolinski et al., 1999; Coyle et al., 2002; Boldyrev et al., 2004; Guelman et al., 2004;

Vassiliev et al., 2005; Halliwell, 2006; Anisimov et al., 2006; Jimenez-Jorge et al., 2007;

Carpenè et al., 2007), entre outros. Dessa forma, além do ácido ascórbico e da GSH,

diversos outros antioxidantes não-enzimáticos podem contribuir para os valores do TRAP

(Halliwell e Gutteridge, 2007). Especificamente as proteínas com funções antioxidantes

contribuem para aproximadamente 40% dos valores medidos do TRAP em

homogeneizados de cérebro de ratos (Evelson et al., 2001). Considerando que no presente

estudo observamos um significativo dano oxidativo protéico promovido pela 5-OP in vivo,

parece possível que a redução do TRAP promovida pela 5-OP possa ter sido ao menos em

parte devida a uma redução de proteínas com ações antioxidantes, que podem ter tido seu

funcionamento normal comprometido pelo dano oxidativo promovido pela 5-OP.

Quanto às defesas antioxidantes enzimáticas, a administração aguda de 5-OP reduz

significativamente as atividades das enzimas antioxidantes CAT e GPx apenas em córtex

cerebral de ratos jovens. A atividade da SOD, por sua vez, não é alterada em nenhuma das

estruturas cerebrais estudadas. Os diferentes padrões de alteração encontrados em nosso

estudo para as atividades enzimáticas estão de acordo com o fato de que o sistema

antioxidante endógeno é complexo (Halliwell e Gutteridge, 2007), e com o fato de que as

atividades de enzimas antioxidantes (defesas enzimáticas) e o conteúdo de antioxidantes de

baixo peso molecular (defesas não-enzimáticas) apresentam diferentes padrões de alteração

entre tecidos periféricos e estruturas cerebrais, alterando-se também com a idade (Hussain

165

et al., 1995; Ferri et al., 2005; Yang et al., 2006; Campese et al., 2007). Ainda, estudos

mostram que as regiões cerebrais apresentam diferentes atividades enzimáticas e padrões

de alteração das mesmas, a fim de reestabelecer a homeostase redox; especificamente as

atividades das enzimas antioxidantes são maiores no cerebelo do que no córtex cerebral, o

que pode gerar respostas distintas de cada região ao estresse oxidativo (Hussain et al.,

1995; Yang et al., 2006). Essas variações de resposta podem ocorrer em parte devido às

características específicas de cada região cerebral, como o consumo de oxigênio, a taxa de

atividade metabólica, a susceptibilidade aos oxidantes, entre outros (Kaushik e Kaur,

2003). Além disso, fatores pró-oxidantes que direta ou indiretamente induzem a geração de

ER também diferem entre órgãos e entre estruturas cerebrais; o conteúdo de ferro, por

exemplo, é maior no córtex cerebral do que no cerebelo de ratos em desenvolvimento

(Beard et al., 1993). Apesar dos diferentes efeitos encontrados após a administração aguda

de 5-OP sobre as atividades das enzimas antioxidantes, os resultados obtidos mostram

claramente que a 5-OP pode prejudicar in vivo as defesas antioxidantes enzimáticas em

cérebro de ratos. Como as atividades da CAT e da GPx não haviam sido alteradas in vitro

pela 5-OP (Pederzolli et al., 2007), presume-se que a inibição dessas enzimas pela 5-OP in

vivo tenha ocorrido através de um mecanismo indireto da 5-OP sobre as atividades

enzimáticas da CAT e da GPx. Novamente, não podemos descartar um possível

envolvimento do mecanismo de excitotoxicidade nesse efeito. De qualquer forma, a

redução das atividades da CAT e GPx pela 5-OP in vivo pode indicar um

comprometimento na detoxificação de seu substrato, o H

. Em baixas concentrações, o

é metabolisado principalmente pela GPx, que apresenta maior atividade cerebral do

que a CAT; no entanto, em altas concentrações de H

, a CAT passa a ser a principal

166

responsável pela sua detoxificação

(Kaushik e Kaur, 2003). No presente trabalho,

avaliamos o conteúdo de H

em córtex cerebral e cerebelo de ratos submetidos à

administração aguda de 5-OP. Foi possível observar que a 5-OP aumenta

significativamente o conteúdo de H

in vivo, o que sugere que um aumento de H

pode

estar envolvido na neurotoxicidade da 5-OP. Apesar de ser pouco reativo, o H

pode ser

citotóxico (causando senescência, apoptose e morte celular necrótica) e pode ainda inativar

diretamente algumas enzimas, geralmente por oxidação de grupos –SH essenciais para a

atividade catalítica das mesmas (Halliwell e Gutteridge, 2007). Além disso, o H

atravessa facilmente as membranas celulares e, apesar de ser per se pouco reativo, é capaz

de gerar OH

•

, altamente reativo, sempre que entrar em contato com íons Cu

ou Fe

(Reação de Fenton) (Halliwell, 2001). Andreoli e colaboradores (1993) demonstraram que

o H

é capaz de reduzir significativamente os níveis de ATP em cultura de células, sendo

esse efeito prevenido pela adição de CAT ao meio. Considerando que os níveis de ATP são

reduzidos tanto por H

quanto pela 5-OP (Silva et al., 2001), e considerando que o

conteúdo de H

é aumentado pela 5-OP, é possível que in vivo haja um sinergismo entre

esses efeitos, potencializando a diminuição dos níveis de ATP. É interessante observar que

nossos resultados mostram um maior aumento do conteúdo de H

pela 5-OP no córtex

cerebral do que no cerebelo. Considerando que o conteúdo de ferro é também maior no

córtex cerebral do que no cerebelo (Beard et al., 1993), e considerando também que o ferro

é um catalisador da reação de Fenton, na qual há formação de radicais OH

●

a partir de

, é possível que tenha havido uma maior geração de OH

●

a partir de H

no córtex

cerebral do que no cerebelo.

A atividade da G6PD também foi medida em córtex cerebral e cerebelo de ratos

167

submetidos à administração aguda de 5-OP. A G6PD é a enzima regulatória da via da

pentose fosfato e, como tal, controla o fluxo de carbonos através da fase oxidativa dessa via

e produz equivalentes redutores na forma de NADPH para suprir as necessidades celulares

para biossíntese e manutenção do status redox celular (Kletzien et al., 1994). Em

mamíferos, a maior parte do NADPH é produzida pela via da pentose fosfato (Hashida et

al., 2002), que é regulada por diversos fatores como hormônios, nutrientes e estresse

oxidativo (Kletzien et al., 1994). Dessa forma, a atividade da G6PD pode representar um

marcador precoce de estresse oxidativo, já que é capaz de responder rapidamente ao

aumento na demanda de NADPH necessário para a manutenção do status redox celular

(Kletzien et al., 1994). Além disso, como a atividade da G6PD pode limitar a taxa de

produção de NADPH, pode também comprometer a capacidade de detoxificação de

peróxidos pela GPx, já que o funcionamento normal dessa enzima depende da regeneração

da GSH pela glutationa redutase, que por sua vez depende de NADPH (Hashida et al.,

2002; Williams e Ford, 2004). Dessa forma, a G6PD pode ser crucial para a função

antioxidante, particularmente na eliminação de peróxidos, visto que é a enzima marca-

passo na regeneração de GSH (Hashida et al., 2002). No presente estudo, foi possível

observar que a administração aguda de 5-OP é capaz de reduzir significativamente a

atividade da G6PD em córtex cerebral de ratos, o que pode causar uma alteração na

produção de NADPH e no equilíbrio redox celular. Recentemente, Hashida e colaboradores

(2002) sugeriram que a vulnerabilidade das células cerebrais ao dano oxidativo é em

grande parte devida à baixa capacidade de fornecimento de NADPH, que é necessário para

a remoção de baixas concentrações de H

. Visto que o funcionamento normal da GPx

depende da regeneração de GSH pela glutationa redutase, que por sua vez depende do

168

NADPH produzido pela G6PD (Hashida et al., 2002; Williams e Ford, 2004), e que tanto a

GPx quanto a G6PD têm suas atividades reduzidas pela 5-OP, é possível que in vivo haja

um sinergismo entre esses efeitos, podendo gerar efetivamente um comprometimento na

detoxificação do H

. Além disso, também já foi relatado que a G6PD é fortemente

inativada por 4-hidroxinonenal, um produto tóxico da lipoperoxidação (Ninfali et al.,

2001), processo esse que também é induzido pela 5-OP in vivo.

Também medimos o conteúdo de tióis (SH) e dissulfetos (SS), o que nos permitiu

calcular a razão SH/SS. A administração aguda de 5-OP não causou alteração no conteúdo

de SH, mas aumentou o conteúdo de SS e diminuiu a razão SH/SS em córtex cerebral e

cerebelo. A produção aumentada de ER e/ou funções antioxidantes comprometidas

provocam um desequilíbrio entre reações oxidativas e redutoras, alterando o status redox

SH/SS (Moriarty-Craige e Jones, 2004). A redução da razão SH/SS reflete um status redox

oxidado da célula que pode, por fim, levar ao estresse oxidativo (Sultana et al., 2008).

Assim, considerando que o conteúdo de SS é significativamente aumentado pela

administração aguda de 5-OP e que a razão SH/SS é significativamente reduzida, pode-se

sugerir que a 5-OP é capaz de alterar in vivo o status redox tiólico em córtex cerebral e

cerebelo de ratos jovens. Considerando que tanto o conteúdo de SS quanto de H

são

aumentados pela 5-OP, e que o H

é capaz de inativar algumas enzimas diretamente pela

oxidação de grupos –SH essenciais (Halliwell e Gutteridge, 2007), postula-se que a

oxidação de grupos –SH, bem como o aumento do H

, possam estar de fato envolvidos

nos mecanismos de neurotoxicidade da 5-OP. É interessante observar que a enzima

-ATPase contém grupos –SH essenciais para a atividade catalítica, os quais são

suscetíveis ao ataque oxidativo (Andreoli et al., 1993), e essa enzima é prontamente

169

inativada por ER, que promovem uma inibição irreversível de sua atividade (Hexum e

Fried, 1979; Kukreja et al., 1990). Andreoli e colaboradores (1993) demonstraram que o

é capaz de promover uma inibição direta da atividade da Na

-ATPase em cultura

de células, sendo que a adição de CAT ao meio é capaz de prevenir completamente a

presença dessas alterações. Considerando que a Na

-ATPase, que apresenta grupos –SH

oxidáveis essenciais para sua atividade catalítica, é inibida tanto pela 5-OP (Escobedo e

Cravioto, 1973; Rieke et al., 1984) quanto por H

(Andreoli et al., 1993), e que a 5-OP é

capaz de aumentar os conteúdos de H

e de SS, é possível que in vivo a redução da

-ATPase seja ainda mais significativa.

De uma forma geral, nossos resultados mostraram a presença de alterações mais

proeminentes dos parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral, com menos efeitos

no cerebelo, que por sua vez apresentou maior capacidade antioxidante e maiores

atividades das enzimas antioxidantes, sugerindo que o córtex cerebral parece mais

suscetível ao estresse oxidativo. Diferenças regionais nas atividades dos sistemas

antioxidantes e taxas metabólicas variáveis podem aumentar a vulnerabilidade ao estresse

oxidativo em regiões cerebrais específicas, podendo provocar dano oxidativo com

intensidades diferentes (Cardozo-Pelaez et al., 2000). Yang e colaboradores (2006)

demonstraram que, dentre as diferentes regiões cerebrais, a que apresenta o maior potencial

redutor (calculado através da relação NADPH/NADP

e GSH/GSSG), ou seja, a estrutura

mais resistente a danos oxidativos, é o cerebelo. Nossos resultados estão de acordo com

alguns trabalhos que mostram menores atividades de enzimas antioxidantes (Hussain et al.,

1995; Campese et al., 2007) e maior conteúdo de carbonilas (marcador de oxidação

protéica) (El-Mohsen et al., 2005) em córtex cerebral do que em cerebelo. Cabe lembrar

170

ainda que o conteúdo de ferro, catalisador da formação de OH

●

, é maior no córtex cerebral

do que no cerebelo (Beard et al., 1993). Todos esses fatores podem estar contribuindo para

a maior sensibilidade do córtex cerebral ao estresse oxidativo promovido pela 5-OP.

Considerando que a 5-OP diminui significativamente as defesas antioxidantes não-

enzimáticas, aumenta a produção de ER e promove dano oxidativo protéico tanto in vitro

quanto in vivo, e considerando que, além disso, a 5-OP in vivo promove também dano

oxidativo a lipídios e diminuição das defesas antioxidantes cerebrais enzimáticas,

juntamente com o aumento do conteúdo de H

, com a redução da atividade da G6PD

(possivelmente prejudicando, com isso, a produção de NADPH) e com a alteração da razão

SH/SS (alterando o equilíbrio redox celular), podemos postular que a 5-OP é capaz de

promover estresse oxidativo in vitro e in vivo em cérebro de ratos jovens. Vale lembrar que

Nygren e colaboradores (2005), ao observarem ausência de dano oxidativo ao DNA em

fibroblastos de pacientes afetados pela deficiência de GS e ausência de correlação entre os

níveis de GSH e a proteção contra dano oxidativo ao DNA, sugeriram que a oxidação de

outros compostos celulares, a alteração do potencial redox celular ou efeitos tóxicos de

precursores de GSH, como a 5-OP, fossem explicações mais plausíveis para os

mecanismos responsáveis pelos sintomas clínicos associados à deficiência de GS (Nygren

et al., 2005). E de fato, demonstramos no presente trabalho diversos efeitos neurotóxicos

da 5-OP, incluindo o dano oxidativo a lipídios e proteínas, comprometimento das defesas

antioxidantes e alteração do status redox celular. Se esses efeitos também ocorrerem nos

pacientes afetados pela deficiência de GS, é possível que possam contribuir para a

neuropatologia dessa doença. Além disso, já que tanto a excitotoxicidade (Bennet et al.,

1973; Rieke et al., 1989; Barone e Spignoli, 1990) quanto o bloqueio da cadeia respiratória

171

(Silva et al., 2001), ambas ações promovidas pela 5-OP, podem também levar

indiretamente à geração de ER (Bondy e Le Bel, 1993; Nicholls e Budd, 1998), é possível

que esses mecanismos possam agir de forma sinérgica na indução de um dano neuronal

significativo. A formação excessiva de ER pode promover dano mitocondrial, incluindo a

oxidação do DNA, lipídios e proteínas, e abertura do póro de transição de permeabilidade

mitocondrial, evento relacionado à degeneração e morte celular (Calabrese et al., 2005).

Por outro lado, um dano mitocondrial, como o causado pela 5-OP através da inibição de

complexos da cadeia respiratória, além de poder diminuir a produção de ATP, pode

provocar a desorganização da cadeia respiratória, permitindo com isso que elétrons possam

escapar mais facilmente por haver uma redução incompleta do O

a H

O, podendo levar à

formação aumentada de ER como O

●-

, H

e OH

●

, resultando em um círculo vicioso

(Milatovic et al., 2001; Gupta et al., 2002; Halliwell e Gutteridge, 2007). Apesar de não ser

possível precisar qual seria o evento iniciador da cascata de efeitos promovida pela 5-OP, é

possível que estejam todos de fato intimamente relacionados. A 5-OP promove dano

oxidativo protéico, podendo estar inativando algumas enzimas; de fato, além de inibir a

-ATPase (Escobedo e Cravioto, 1973) e complexos da cadeia respiratória

mitocondrial (Silva et al., 2001), a 5-OP á capaz de inibir as enzimas antioxidantes CAT e

GPx, detoxificadoras de H

, o qual por sua vez é aumentado pela 5-OP. Considerando

que a 5-OP é capaz de aumentar os conteúdos de SS e de H

, o qual por sua vez é capaz

de oxidar diretamente grupos –SH, é possível que tanto o aumento do H

quanto a

oxidação de grupos –SH estejam envolvidos nos mecanismos de neurotoxicidade da 5-OP.

A capacidade de detoxificação do H

pela CAT, que atua em altas concentrações de

, e pela GPx, que atua em baixas concentrações de H

, parece estar em grande parte

172

comprometida devido à inibição dessas enzimas pela 5-OP, podendo acumular H

, que

pode se transformar em ER mais danosas através da reação de Fenton. O funcionamento

normal da GPx, por outro lado, depende em grande parte do funcionamento normal da

G6PD, que fornece NADPH para regenerar GSH, cuja oxidação ocorre acoplada à reação

catalisada pela GPx. A G6PD, no entanto, também é inibida pela 5-OP, podendo realmente

comprometer a eficiência da detoxificação de H

pela GPx. A G6PD, por sua vez, é

também inibida por 4-hidroxinonenal, produto tóxico da lipoperoxidação. A

lipoperoxidação, também promovida pela 5-OP, só pode ser iniciada por algumas ER,

excluindo-se o H

. Dessa forma, imagina-se que in vivo tenha ocorrido a produção de ER

mais reativas, mais danosas, com real potencial de oxidar lipídios e proteínas, ambas ações

promovidas pela 5-OP. Além de tudo isso, vale lembrar que a 5-OP compromete as defesas

antioxidantes cerebrais, podendo com isso tornar o cérebro ainda mais suscetível ao

estresse oxidativo, o qual pode então ser potencializado, levando ao dano oxidativo. Dessa

forma, todos esses efeitos podem estar conjuntamente envolvidos nos mecanismos de

neurotoxicidade da 5-OP, podendo contribuir para o dano cerebral observado nos pacientes

com deficiência de GS.

Apesar de as concentrações de 5-OP utilizadas serem similares às observadas no

plasma e LCR dos pacientes afetados pela deficiência de GS (1-5 mM) (Eldjarn et al.,

1972; Eldjarn et al., 1973; Meister, 1974; Meister, 1991; Jain et al., 1994), é difícil

extrapolar nossos achados para a condição humana. No entanto, se esses efeitos também

ocorrerem no cérebro dos pacientes afetados é possível que possam contribuir, ao menos

em parte, para a disfunção neurológica característica da deficiência de GS, na qual a 5-OP

se encontra acumulada, podendo-se sugerir o envolvimento do estresse oxidativo na

173

neuropatologia dessa doença. Nos pacientes afetados pela deficiência de GS, é possível que

haja ainda um sinergismo entre o acúmulo de 5-OP e a deficiência de GSH, aumentando a

produção de ER e diminuindo as defesas antioxidantes, levando assim ao estresse

oxidativo. Não foi esclarecido ainda qual o principal mecanismo responsável pela

neurotoxicidade da 5-OP no dano cerebral desses pacientes, podendo estar envolvidos o

dano à produção energética cerebral, a inibição da Na

-ATPase, a excitotoxicidade, o

estresse oxidativo ou uma combinação de quaisquer desses fatores. Entender os

mecanismos responsáveis pelo dano cerebral que ocorre nos pacientes com deficiência de

GS pode ser útil no desenvolvimento de uma terapêutica efetiva para amenizar a disfunção

neurológica desses pacientes.

2. Ácido N-acetilaspártico

O acúmulo de NAA é o marcador bioquímico da Doença de Canavan, um erro inato

do metabolismo clinicamente caracterizado por disfunção neurológica severa caracterizada

por retardo mental progressivo, hipotonia, macrocefalia e convulsões. Até o presente

momento, não há tratamento específico para essa desordem, sendo apenas sintomático,

controlando-se principalmente a ocorrência de convulsões. Cabe lembrar que a presença de

níveis elevados de NAAG, um metabólito do NAA, já foi também relatada na urina e LCR

de pacientes afetados pela Doença de Canavan (Burlina et al., 1999; Krawczyk e

Gradowska, 2003).

Até o presente momento existem poucas hipóteses acerca de possíveis mecanismos

neuropatológicos envolvidos nessa doença. Foi sugerido que poderiam estar envolvidos: (a)

o comprometimento na síntese de lipídios de mielina, resultante de uma deficiência de

174

acetato derivado do NAA (Madhavarao et al., 2005); e (b) o desequilíbrio osmótico com

acúmulo de excesso de fluido cerebral promovido pelo aumento patológico de NAA, que

atuaria como um osmólito intracelular (Baslow, 2002). No entanto, essas hipóteses têm

sido recentemente discutidas na literatura (Baslow, 2003; Moffett et al., 2007), e o papel do

NAA na patogênese da Doença de Canavan permanece ainda pouco esclarecido.

Apesar de os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral nessa desordem serem

ainda pouco compreendidos, a presença de concentrações aumentadas de NAA nos tecidos

e fluidos corporais sugere a possibilidade de que o NAA e/ou metabólitos relacionados,

como o NAAG, possam exercer efeitos tóxicos (Beaudet, 2001), e que o excesso desses

ácidos orgânicos possa ser deletério ao SNC. Apesar de os mecanismos pelo qual exercem

sua toxicidade não terem sido ainda completamente esclarecidos, diversos relatos na

literatura mostram ações neurotóxicas tanto para o NAA quanto para o NAAG, ambos

acumulados nos pacientes afetados pela Doença de Canavan. O NAA, por exemplo, é

capaz de agir sobre receptores glutamatérgicos metabotrópicos acoplados à proteína G,

resultando em excitação neuronal e contribuindo, assim, para a ocorrência de convulsões

epiléticas (Akimitsu et al., 2000; Yan et al., 2003). Klugmann e colaboradores (2005)

mostraram que a redução parcial dos níveis de NAA no cérebro de ratos geneticamente

deficientes de aspartoacilase (ratos tremor) resulta na modulação tanto da duração quanto

da freqüência das convulsões, sugerindo que os níveis cerebrais aumentados de NAA no

rato tremor participam de fato no curso da epilepsia. Estudos em animais mostraram que

convulsões epiléticas resultam em produção de ER e dano oxidativo a proteínas celulares,

lipídios e DNA (Bruce e Baudry, 1995; Liang et al., 2000), enquanto que o estresse

oxidativo mitocondrial crônico, bem como sua disfunção resultante, podem tornar o

175

cérebro mais suscetível a convulsões epiléticas (Trotti et al., 1998; Liang e Patel, 2004);

em conjunto, essas evidências sugerem que parece haver um papel para o estresse oxidativo

tanto como causa quanto como conseqüência de convulsões epiléticas (Patel, 2004). Além

disso, o NAA também é capaz de aumentar a concentração intracelular de cálcio em cultura

de células (Rubin et al., 1995). É interessante ressaltar que o estresse oxidativo é capaz de

desregular o metabolismo do cálcio, geralmente causando um aumento na concentração

intracelular de cálcio (Halliwell e Gutteridge, 2007). ER podem danificar o sistema de

captação de cálcio pelo retículo endoplasmático e interferir no efluxo de cálcio através da

membrana plasmática, por oxidarem grupos –SH essenciais de canais transmembrana,

podendo promover a abertura de canais que permitam a entrada de cálcio na célula

(Halliwell e Gutteridge, 2007). Por esses motivos, é possível que o aumento da

concentração intracelular de cálcio promovido pelo NAA tenha sido de fato mediado por

estresse oxidativo.

O NAAG, por sua vez, também apresenta diversas ações neurotóxicas relatadas na

literatura. Observou-se que o NAAG pode exibir neurotoxicidade in vitro em culturas

primárias corticais (Thomas et al., 2000), e in vivo pode induzir morte neuronal (Pliss et

al., 2000) e alterar as propriedades funcionais e estruturais da barreira hemato-encefálica

(Pliss et al., 2002). Estudos recentes mostraram que a administração intracerebroventricular

de NAAG a ratos é capaz de alterar o comportamento dos mesmos e induzir

neurodegeneração hipocampal, com alterações significativas na morfologia celular e

clivagem do DNA (Pliss et al., 2003; Bubeníková-Valesová et al., 2006). Apesar de o

DNA sofrer decomposição espontânea e fisiológica diariamente, o estresse oxidativo

acelera enormemente o dano ao DNA (Halliwell e Gutteridge, 2007). Com isso, parece

176

possível que a quebra de fitas de DNA observada após administração de NAAG possa ter

sido mediada por ER, que podem ter promovido dano ao DNA.

Considerando que nenhum estudo até o presente momento havia investigado o

papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade do NAA e do NAAG, resolvemos estudar

os efeitos in vitro e in vivo desses ácidos orgânicos sobre alguns parâmetros de estresse

oxidativo em córtex cerebral de ratos de 14 e 30 dias de vida. O objetivo geral desse estudo

foi avaliar se a produção de ER pode ser gerada por esses metabólitos, o que poderia estar

relacionado ao dano neurológico observado nos pacientes com Doença de Canavan, nos

quais tanto NAA quanto NAAG se encontram acumulados. Nos experimentos in vitro, os

homogeneizados de córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida foram incubados por 1 hora

a 37°C na presença ou ausência de NAAG nas concentrações de 1; 5,0 ou 10,0 mM e na

presença ou ausência de NAA nas concentrações de 10; 20; 40 ou 80 mM no meio de

incubação. Apenas nos ensaios enzimáticos o efeito in vitro do NAA foi testado com e sem

essa pré-incubação. Nos experimentos in vivo, ratos de 14 dias de vida foram submetidos à

administração aguda de salina (ratos controle) ou de NAA nas doses de 0,1; 0,3 ou 0,6

mmol/g peso corporal, administradas por via subcutânea, sendo os animais mortos 1 hora

após a injeção; e ratos de 30 dias de vida foram submetidos à administração

intracerebroventricular de LCR artificial (ratos controle) ou NAA (8 µmol) ou NAAG (0,8

µmol), sendo os animais mortos em 15 ou 60 minutos após a injeção.

Demonstramos que o NAA reduz significativamente tanto o TRAP quanto o TAR

em córtex cerebral in vitro, e reduz o TRAP também in vivo, tanto através da administração

subcutânea quanto da intracerebroventricular de NAA a ratos de 14 e 30 dias de vida,

respectivamente. Considerando que o TRAP mede o conteúdo de defesas antioxidantes

177

não-enzimáticas, enquanto que o TAR reflete a capacidade do tecido de modular o dano

associado a uma produção aumentada de ER (Lissi et al., 1995), esses resultados indicam

que o NAA reduz a capacidade antioxidante não-enzimática em cérebro de ratos tanto in

vitro quanto in vivo, através da redução do conteúdo de antioxidantes não-enzimáticos

(TRAP) e da redução da reatividade desses antioxidantes (TAR). Demonstramos ainda que

o NAA reduz significativamente in vitro o conteúdo de GSH, o principal antioxidante não-

enzimático cerebral (Rice e Russo-Menna, 1998), o que sugere que as reduções do TRAP e

do TAR observadas anteriormente na presença de NAA na verdade podem ter ocorrido às

expensas de uma redução de GSH. Assim, os resultados indicam claramente que o NAA é

capaz de comprometer as defesas antioxidantes não-enzimáticas em cérebro de ratos, tanto

in vitro quanto in vivo.

Conforme previamente citado, diversas ER podem oxidar resíduos de aminoácidos

em proteínas formando produtos contendo grupos carbonila, que podem ser quantificados

através de sua reação com a dinitrofenilhidrazina (Halliwell e Gutteridge, 2007). Além

disso, resíduos de proteína contendo grupos –SH são alvos particularmente suscetíveis à

oxidação, podendo haver a abstração de hidrogênios desses grupos por parte de ER,

oxidando o grupo –SH e formando pontes dissulfeto. Dessa forma, além da alteração no

conteúdo de carbonilas, a oxidação dos grupos –SH é também usada como marcador de

oxidação protéica, medindo-se o conteúdo de tióis totais (Aksenov e Markesbery, 2001).

Foi possível observar que in vitro o NAA é capaz de aumentar o conteúdo de carbonilas e

diminuir o de tióis totais (havendo oxidação de grupos –SH a dissulfetos), e in vivo é

também capaz de aumentar o conteúdo de carbonilas tanto após administração subcutânea

quanto após administração intracerebroventricular de NAA. Assim, pode-se sugerir que o

178

NAA é capaz de causar dano oxidativo protéico in vitro e in vivo em córtex cerebral de

ratos de 14 e 30 dias de vida. Portanto, parece possível que o dano oxidativo às proteínas

esteja envolvido na neurotoxicidade do NAA, o que pode então estar relacionado à

neuropatologia da Doença de Canavan, na qual as concentrações de NAA estão

expressivamente aumentadas.

Observamos também que a quimiluminescência espontânea e o TBA-RS foram

aumentados in vitro pela presença de NAA no meio de incubação, assim como in vivo pela

administração aguda de NAA, sugerindo que o NAA é capaz de induzir lipoperoxidação

em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida. No entanto, a quimiluminescência

espontânea e o TBA-RS não foram afetados pela administração intracerebroventricular de

NAA a ratos de 30 dias de vida. Esses resultados sugerem que o dano oxidativo aos lipídios

é estimulado pelo NAA in vitro e in vivo em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida,

mas não é estimulado pelo NAA in vivo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida.

Considerando que a superprodução de ER gera altos níveis de TBA-RS, por estimular a

lipoperoxidação (Halliwell e Gutteridge, 2007), investigamos a influência de vários

antioxidantes sobre os níveis aumentados de TBA-RS induzidos por NAA 80 mM in vitro.

Observamos que a mistura de ácido ascórbico mais Trolox foi capaz de prevenir

completamente o aumento dos níveis de TBA-RS promovido pelo NAA em córtex

cerebral. Esses resultados podem sugerir a participação de OH

●

nesse efeito, visto que essa

ER é seqüestrada pelos antioxidantes usados na mistura (Bains e Shaw, 1997; Halliwell e

Gutteridge, 2007). Por outro lado, H

e O

●-

provavelmente não estejam envolvidos, já

que tanto CAT quanto SOD, que atuariam sobre esses substratos, não foram capazes de

prevenir o aumento dos níveis de TBA-RS causados pelo NAA. Ainda, como o ditiotreitol

179

(protetor de grupos –SH) e a GSH foram capazes de prevenir apenas parcialmente o

aumento dos níveis de TBA-RS induzido por NAA, não devemos excluir a possibilidade de

que a oxidação de grupos –SH esteja envolvida nos efeitos neurotóxicos do NAA. No

entanto, NO

●

provavelmente não esteja envolvido nesse efeito, visto que o L-NAME

(inibidor da óxido nítrico sintase) não foi capaz de reduzir o aumento dos níveis de TBA-

RS promovido pelo NAA.

Investigamos também no presente estudo o efeito da administração

intracerebroventricular de NAA sobre a atividade da G6PD em córtex cerebral de ratos de

30 dias de vida. Como previamente dito, a G6PD é a enzima marca-passo da via da pentose

fosfato, sendo regulada por vários fatores, dentre os quais o estresse oxidativo (Kletzien et

al., 1994). A G6PD é a enzima limitante da detoxificação de H

dependente de GSH e

NADPH, o que mostra sua importância na função antioxidante cerebral (Adams et al.,

2001; Hashida et al., 2002). Por esse motivo a medida da atividade dessa enzima

regulatória pode ser considerada como um marcador precoce de estresse oxidativo

(Kletzien et al., 1994). Observamos em nosso trabalho que o NAA é capaz de reduzir

significativamente a atividade da G6PD, o que pode comprometer a produção de NADPH e

alterar o equilíbrio redox celular em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida.

Quanto às defesas antioxidantes enzimáticas, medimos primeiramente o efeito do

NAA sobre a atividade da CAT, que catalisa diretamente a decomposição do H

oxigênio molecular (Aebi, 1984). Observamos que a atividade dessa enzima é fortemente

inibida in vitro pelo NAA, com ou sem incubação prévia, e também in vivo, tanto através

da administração aguda quanto intracerebroventricular de NAA a ratos de 14 e 30 dias de

vida, corroborando nossos resultados in vitro. Além disso, resultados similares foram

180

obtidos com uma preparação comercial de CAT purificada, indicando uma possível

interação direta do NAA com a CAT. Na tentativa de avaliar o mecanismo de inibição da

CAT pelo NAA, realizamos estudos cinéticos sobre a interação do NAA com a CAT em

homogeneizados de córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida. Os valores de K

e V

max

obtidos foram similares aos relatados previamente em cérebro de ratos (Somani e Husain,

1996; Baud et al., 2004). Nossos resultados mostraram também que o NAA inibe a

atividade da CAT de forma acompetitiva, e que o K

’ (constante de inibição de inibidor

acompetitivo) para o NAA foi menor que as concentrações encontradas no cérebro de

pacientes afetados pela Doença de Canavan, sugerindo que a inibição da CAT pelo NAA

pode ter relevância fisiopatológica.

Estudamos também o efeito do NAA sobre a atividade da GPx, que decompõe H

através de sua redução à H

O, com a concomitante oxidação da GSH; apesar de ser

praticamente específica para GSH como doadora de hidrogênios, a GPx pode também atuar

em outros peróxidos orgânicos, sendo os mesmos reduzidos a um álcool correspondente

(Wendel, 1981). A atividade da GPx é inibida in vitro pela presença de NAA no meio de

reação, sem incubação prévia, e também com 1 hora de pré-incubação. Além disso, o NAA

também inibe a atividade da preparação comercial de GPx purificada, indicando uma

possível interação direta com a enzima. Apesar de a administração intracerebroventricular

de NAA a ratos de 30 dias de vida não alterar a atividade da GPx, a administração

subcutânea de NAA a ratos de 14 dias de vida é capaz de reduzir significativamente a

atividade cortical dessa enzima, corroborando nossos resultados in vitro. A inibição das

atividades da CAT e GPx pode indicar um possível comprometimento da detoxificação de

, substrato igualmente decomposto pelas duas enzimas. Observamos ainda no presente

181

trabalho que a exposição dos homogeneizados de córtex cerebral ao NAA 80 mM por 1

hora é capaz de aumentar significativamente in vitro o conteúdo de H

. In vivo, o

conteúdo de H

em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida também foi

significativamente aumentado após administração aguda de NAA, o que está de acordo

com nossos resultados in vitro. Esses resultados sugerem que o aumento no conteúdo de

está provavelmente envolvido na neurotoxicidade do NAA e pode ser secundário à

redução das atividades da CAT e GPx promovidas pelo NAA. Por outro lado, o aumento

no conteúdo de H

é capaz de promover a auto-inativação da CAT (Aebi, 1984), inibindo

irreversivelmente a atividade dessa enzima; a GPx, no entanto, é menos suscetível à

inativação mediada por H

(Baud et al., 2004). Apesar de apresentarem diferentes

afinidades pelo H

, ambas são requeridas para a detoxificação de H

, sendo a

toxicidade do H

enormemente potencializada quando CAT e/ou GPx são inibidas (Baud

et al., 2004). Cabe ressaltar que o H

se mistura facilmente com a água e pode difundir

para o meio intracelular, sendo tóxico a diversos tipos celulares na faixa de 10 a 100 µM,

causando senescência e apoptose, e em concentraçãoes mais elevadas pode promover morte

celular necrótica (Halliwell e Gutteridge, 2007). Além disso, o H

é capaz de abrir canais

catiônicos na membrana plasmática, permitindo a entrada de cálcio em certos neurônios e

glia, entre outros tipos celulares, levando conseqüentemente ao aumento na concentração

intracelular de cálcio (Halliwell e Gutteridge, 2007). Como um dos efeitos neurotóxicos

apresentados pelo NAA é justamente o aumento na concentração intracelular de cálcio

(Rubin et al., 1995), e como foi observado que o NAA é capaz de aumentar o conteúdo de

, é possível que o aumento da concentração de cálcio seja potencializado in vivo por

um sinergismo desses efeitos. É interessante observar que o efeito de aumento da

182

concentração intracelular de cálcio foi observado em concentrações relativamente baixas de

NAA (10 mM) (Rubin et al., 1995), sendo então possível que concentrações de NAA

maiores, como as observadas nos pacientes afetados pela Doença de Canavan, promovam

uma exacerbação desse efeito. Aumentos transitórios da concentração de cálcio regulam

diversos processos fisiológicos, como a proliferação celular e a liberação de

neurotransmissores; no entanto, aumentos descontrolados da concentração de cálcio

intracelular podem estimular a óxido nítrico sintase, a fosfolipase A2, calpaínas e

proteases, promovendo alterações de citoesqueleto e podendo desencadear a transição de

permeabilidade mitocondrial, que abre póros na membrana mitocondrial interna e causa um

colapso no potencial de membrana (Halliwell e Gutteridge, 2007). Esse evento requer a

presença de agentes indutores, que podem ser peróxidos orgânicos, agentes oxidantes de

grupos –SH (como o H

, que é aumentado pelo NAA) e o ONOO

. À medida que solutos

escapam da matriz através do póro, ocorre um desequilíbrio osmótico e edema

mitocondrial, que podem culminar com morte celular necrótica ou apoptótica (Halliwell e

Gutteridge, 2007). De fato, Baud e colaboradores (2004) observaram em cultura de células

a presença de edema celular em quase 100% das células expostas por 1 hora ao H

. Vale

lembrar que dentre os achados neuropatológicos da Doença de Canavan há edema

astrocitário e cerebral, com a presença de mitocôndrias alongadas e distorcidas (Adachi et

al., 1972), podendo tais alterações estarem relacionadas ao aumento da concentração

intracelular de cálcio, que pode ser exacerbado pelo aumento do conteúdo de H

promovido pelo NAA, caso esses efeitos também ocorram no cérebro dos pacientes

afetados pela Doença de Canavan.

Avaliamos ainda o efeito do NAA sobre a atividade da SOD, enzima antioxidante

183

que dismuta o O

●-

, produzindo H

e H

O. O NAA não é capaz de alterar a atividade

dessa enzima em córtex cerebral nem in vitro (com ou sem pré-incubação) nem in vivo pela

administração subcutânea de NAA a ratos de 14 dias de vida. Por outro lado, a

administração intracerebroventricular de NAA é capaz de aumentar significativamente a

atividade da SOD medida 1 hora após a injeção em córtex cerebral de ratos de 30 dias de

vida. Alguns trabalhos mostram que há um aumento na atividade da SOD em cérebro de

ratos adultos, bem como um aumento gradual e progressivo na geração mitocondrial de

●-

, em relação ao cérebro de ratos de 12 dias de vida (Schreiber et al., 1995; Tsay et al.,

2000). Tem sido relatado também que ratos zitter, que são ratos Sprague-Dawley mutantes

caracterizados por tremores, hipomielinização, edema astrocitário e degeneração

espongiforme precoce, exibem também alterações no metabolismo cerebral de ER (Kondo

et al., 1995; Nakadate et al., 2006). Gomi e colaboradores (1994) demonstraram um

aumento significativo na atividade da SOD e uma redução significativa na atividade da

CAT

no cérebro de ratos zitter adultos, mas tais alterações não foram observadas no

cérebro de ratos zitter neonatos. Ainda, Ueda e colaboradores (2002) observaram acúmulo

de H

no cérebro de ratos zitter adultos, sugerindo que a atividade aumentada da SOD e

a atividade reduzida da CAT, também observadas no cérebro de ratos zitter adultos, podem

levar ao acúmulo excessivo de H

no tecido cerebral (Gomi et al., 1994),

potencializando o dano celular. Esses resultados observados em ratos zitter, que

apresentam alterações neuropatológicas similares às observadas na Doença de Canavan, na

qual o NAA está acumulado, corroboram nossos achados de um aumento da atividade da

SOD e diminuição da atividade da CAT promovidos pelo NAA administrado por via

intracerebroventricular no cérebro de ratos de 30 dias de vida. Além disso, o fato de que o

184

NAA é capaz de aumentar significativamente o conteúdo de H

in vitro e in vivo em

cérebro de ratos de 14 dias de vida sugere que o conteúdo de H

possa estar também

aumentado no cérebro de ratos de 30 dias de vida. Considerando que nesses animais a

atividade da SOD está aumentada, a atividade da CAT está reduzida e a atividade da

G6PD, que fornece o NADPH necessário para o funcionamento normal da GPx, está

também reduzida, pode-se sugerir que a detoxificação de H

esteja de fato comprometida

no cérebro de ratos de 30 dias de vida submetidos à administração intracerebroventricular

de NAA. Alguns trabalhos mostram que condições que alterem o metabolismo de ER são

capazes de aumentar a atividade da SOD (Rister e Baehner, 1976; Lièvre et al., 2000).

Rister e Baehner (1976) mostraram que cobaias expostos à condições hiperóxicas

apresentam aumento de O

●-

e indução da SOD, com redução simultânea da CAT e GPx; o

fato não haver indução correspondente da CAT e GPx torna muito difícil a manutenção da

concentração de H

em níveis normais, e o excesso de H

provavelmente resultará na

formação de ER mais danosas, como o OH

●

, através da reação de Fenton. Além disso,

Lièvre e colaboradores (2000) observaram que a atividade da SOD é significativamente

aumentada em 1 hora após a hipóxia/reperfusão aplicada à cultura de neurônios, e

sugeriram que isso possa significar a mobilização de enzimas pré-existentes ou o resultado

de uma indução muito precoce do gen da SOD em resposta ao estresse oxidativo. A

transcrição do gen da SOD é regulada em resposta a diversos estímulos, como citocinas

pró-inflamatórias, fatores de crescimento e estresse oxidativo, que gera uma up-regulation

da expressão da SOD (Zelko et al., 2002). A importância específica de ER ou de alterações

no status redox celular na transdução de sinal e regulação de genes está se tornando cada

dia mais evidente, estando atualmente bem estabelecido que o H

é a principal ERO

185

mediadora de sinalização celular (Aslan e Özben, 2003). Diversos estudos mostram que o

agrotóxico Paraquat, agente gerador de O

●-

, é capaz de induzir a SOD (Nicotera et al.,

1989; Yoo et al., 1999). Além disso, o gen da SOD é particularmente regulado por NF-κB,

fator de transcrição essencial a diversos processos celulares, como inflamação, imunidade,

proliferação celular e apoptose (Warner et al., 1996; Manna et al., 1998). O NF-κB, por

sua vez, além de ser controlado pelo status redox celular, é ativado rapidamente por

diversas ER, principalmente por H

, mas também por

, HOCl e ONOO

(Wang et al.,

2002; Gloire et al., 2006). De fato, o tratamento de diversas linhagens celulares com H

é capaz de aumentar significativamente a expressão da SOD já a partir de 1 hora de

exposição, indicando que o H

está de fato diretamente envolvido na indução dessa

enzima antioxidante (Warner et al., 1996; Yoo et al., 1999; Rojo et al., 2004).

Considerando que a expressão da SOD pode aumentar já a partir de 1 hora de exposição ao

, pode-se sugerir que a indução do gen da SOD pode se dar rapidamente em resposta

ao estresse oxidativo. É interessante observar que a expressão da SOD aumenta

significativamente em córtex cerebral de ratos Wistar expostos a um estresse agudo, mas

não crônico (Filipovic e Radojcic, 2005). O fato de que a expressão da SOD pode ser

prontamente induzível por H

faz com que essa enzima possa funcionar como uma

resposta protetora eficiente contra o estresse oxidativo (Yoo et al., 1999), e a ativação da

via desencadeada pelo NF-κB, ativado por H

, pode reforçar a capacidade antioxidante

celular e proporcionar proteção efetiva contra estresse oxidativo através da up-regulation

de genes que codificam enzimas antioxidantes (Rojo et al., 2004). A resposta ao estresse

oxidativo, no entanto, nem sempre ocorre através de uma expressão coordenada de todas as

enzimas antioxidantes, visto que a expressão gênica das mesmas é regulada por diferentes

186

mecanismos (Röhrdanz et al., 2000; Wilson e Johnson, 2000). Considerando que nossos

resultados demonstraram um aumento na atividade da SOD em 1 hora após a administração

intracerebroventricular de NAA em cérebro de ratos de 30 dias de vida, considerando que a

redução da CAT e G6PD juntamente com o aumento da SOD observados nesses animais

podem promover um comprometimento na detoxificação de H

, que provavelmente

esteja acumulado no cérebro dos mesmos, e considerando ainda que a expressão da SOD

pode ser prontamente e rapidamente induzível por H

, sugere-se que o aumento da SOD

observado em nosso estudo possa ter havido por um aumento na expressão dessa enzima

antioxidante, em resposta ao estresse oxidativo promovido pelo NAA.

Considerando que o ácido ascórbico é capaz de prevenir o dano celular induzido

por H

(Avshalumov et al., 2004), e que a mistura de ácido ascórbico mais Trolox,

scavengers de OH

●

, (Halliwell e Gutteridge, 2007), foi capaz de prevenir completamente o

aumento dos níveis de TBA-RS em homogeneizados de córtex cerebral e que observamos

um aumento no conteúdo de H

mediado pelo NAA, pode-se sugerir a participação

efetiva de H

, e possivelmente OH

●

, que é produzido a partir do H

através da reação

de Fenton, na neurotoxicidade do NAA.

Cabe lembrar que previamente a mistura de CAT

mais SOD, que detoxificam H

e O

●-

, respectivamente, não havia sido capaz de prevenir

o aumento dos níveis de TBA-RS promovido pelo NAA in vitro em córtex cerebral de

ratos de 14 dias de vida, e por isso se imaginou que o H

●-

provavelmente não

estivessem envolvidos nos efeitos do NAA. No entanto, sabe-se agora que o NAA é capaz

de inibir fortemente a atividade da CAT, sendo possível que a CAT estivesse então inibida

na medida dos níveis de TBA-RS, e por isso não tivesse sido capaz de prevenir o aumento

dos níveis de TBA-RS induzido por NAA.

187

Ainda, considerando que o NAA é capaz de aumentar significativamente o

conteúdo de H

, considerando que o H

pode oxidar diretamente grupos –SH

(Halliwell e Gutteridge, 2007), e considerando que tanto o ditiotreitol (protetor de grupo –

SH) quanto a GSH foram capazes de prevenir apenas parcialmente o aumento dos níveis de

TBA-RS induzido por NAA, não devemos excluir a possibilidade de que a oxidação de

grupos –SH esteja também envolvida nos efeitos neurotóxicos do NAA.

Em conjunto, nossos resultados indicam que o NAA pode promover estresse

oxidativo in vitro e in vivo em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida, através da

diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas e da geração de dano

oxidativo a lipídios e proteínas, provavelmente pelo aumento de ER no córtex cerebral.

Além disso, a administração intracerebroventricular de NAA pode comprometer as defesas

antioxidantes também em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida, por reduzir o TRAP e

a atividade da CAT, comprometendo assim a eficiência da detoxificação de ER; pode

promover dano oxidativo protéico; e também comprometer a produção de NADPH e alterar

o equilíbrio redox celular, podendo-se sugerir que o NAA é também capaz de promover

estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Especificamente a

redução das defesas antioxidantes enzimáticas, através da inibição das atividades da CAT e

GPx, pode de fato comprometer a eficiência da detoxificação de ER, o que pode levar por

fim ao dano oxidativo às biomoléculas. Além disso, o NAA pode promover um aumento no

conteúdo de H

in vitro e in vivo, o que pode estar envolvido na neurotoxicidade do

NAA e, possivelmente, na progressão e manutenção da neurodegeneração característica da

Doença de Canavan. Nosso estudo introduz outro possível mecanismo patológico para o

dano cerebral observado nos pacientes afetados, sugerindo-se que o estresse oxidativo pode

188

estar envolvido na neuropatologia da Doença de Canavan, cujo marcador bioquímico é o

acúmulo de NAA.

De uma forma geral, observamos nesse trabalho a presença de alterações de

parâmetros de estresse oxidativo promovidas pelo NAA muito mais proeminentes no

cérebro de ratos de 14 dias de vida do que no cérebro de ratos de 30 dias de vida. Cabe

ressaltar que aos 14 dias de vida o cérebro de ratos está ainda em pleno desenvolvimento,

estando ainda imaturo, havendo um pico de mielinização, crescimento cerebral e

neurogênese em torno dessa idade; já aos 30 dias de vida, há uma redução significativa de

todos esses processos (Morgane et al., 2002). Sabe-se que mamíferos neonatos podem

exibir uma capacidade menor de metabolizar diversas substâncias e xenobióticos, estando

portanto mais suscetíveis à toxicidade aguda de certas toxinas (Lotti et al., 2002). Além

disso, nossos resultados estão de acordo com diversas evidências existentes na literatura

que mostram que o cérebro de ratos em desenvolvimento pode ser mais sensível ao estresse

oxidativo do que o cérebro de ratos adultos. Khaing e colaboradores (2000) demonstraram

que o cérebro imaturo de ratos neonatos responde à infusão cerebral de uma excitotoxina

com fragmentação de DNA de forma muito mais proeminente e abundante do que no

cérebro de ratos adultos, sugerindo que um insulto excitotóxico neonatal resulta em morte

celular mais extensiva do que a provocada por semelhante insulto ao cérebro adulto. Vale

lembrar que a excitotoxicidade já foi relacionada ao estresse oxidativo (Pellegrini-

Giampietro et al., 1990; Lees, 1993). Di Toro e colaboradores (2007) demonstraram que a

formação cerebral de ER aumenta significativamente com a idade dos ratos após o

nascimento, culminando em aproximadamente 10 dias de vida, decaindo significativamente

aos 30 dias de vida e estabilizando aos 90 dias de vida. Baud e colaboradores (2004)

189

observaram que oligodendrócitos em desenvolvimento são mais vulneráveis ao H

mais sensíveis ao estresse oxidativo do que oligodendrócitos maduros, e que a CAT de

oligodendrócitos em desenvolvimento é inativada pela exposição a H

. Além disso, o

é degradado mais rapidamente e induz a formação de menos ER intracelulares nos

oligodendrócitos maduros do que nos imaturos; o clearance de H

nos oligodendrócitos

maduros é expressivamente maior do que nos imaturos, e portanto apresentam uma

capacidade antioxidante pelo menos 8 vezes maior do que as células imaturas (Baud et al.,

2004). Driver e colaboradores (2000) observaram que a produção de ER estimulada por

ferro no cérebro de ratos de 14 dias é significativamente maior do que no cérebro de ratos

adultos, sugerindo que ratos em desenvolvimento apresentam uma maior sensibilidade à

produção cerebral de ER após a exposição a toxinas do que ratos adultos. Essa maior

sensibilidade pode estar na verdade relacionada ao status antioxidante cerebral. De fato, as

enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx são encontradas em baixos níveis no cérebro de

ratos neonatos e aumentam com a idade (Mavelli et al., 1982; Schreiber et al., 1995),

sugerindo que ratos neonatos estariam menos protegidos contra um aumento patológico de

ER e, por isso, estariam mais suscetíveis ao estresse oxidativo. Dessa forma, pode-se

concluir que nossos achados demonstrando uma maior susceptibilidade de ratos nenonatos

ao estresse oxidativo está de acordo com as evidências existentes na literatura.

Quanto aos efeitos do NAAG, metabólito do NAA também acumulado nos

pacientes afetados pela Doença de Canavan, sobre parâmetros de estresse oxidativo

avaliados em nosso estudo, foi possível observar que o NAAG não é capaz de alterar o

TRAP nem in vitro nem in vivo. Observamos também que esse ácido orgânico não é capaz

de causar dano oxidativo protéico, à medida que não altera o conteúdo de carbonilas nem in

190

vitro nem in vivo. Observamos que a quimiluminescência espontânea e o TBA-RS não são

afetados pela administração intracerebroventricular de NAAG, e também não são afetados

in vitro pelo NAAG presente no meio de incubação, sugerindo que o dano oxidativo aos

lipídios não é estimulado por esse ácido orgânico em córtex cerebral de ratos de 30 dias de

vida. Assim como já havia sido observado com os demais parâmetros de estresse oxidativo,

novamente o NAAG não é capaz de alterar as atividades das enzimas antioxidantes CAT,

SOD e GPx, nem a atividade da G6PD. Apesar de Pliss e colaboradores (2003) terem

recentemente relatado que a administração intracerebroventricular de NAAG é capaz de

induzir clivagem de DNA, pensando-se que esse efeito poderia ter sido mediado por

estresse oxidativo, no presente trabalho constatamos que o NAAG não é capaz de induzir

estresse oxidativo, já que não alterou nenhum dos parâmetros testados nem in vitro nem in

vivo. No entanto, quebra de fitas também ocorre durante o reparo do DNA e não pode ser

atribuída unicamente ao estresse oxidativo (Halliwell e Gutteridge, 2007). Parece possível

que os efeitos neurotóxicos exercidos pelo NAAG, observados anteriormente por outros

pesquisadores (Pliss et al., 2000; Pliss et al., 2002; Pliss et al., 2003; Bubeníková-Valesová

et al., 2006), não tenham sido mediados por estresse oxidativo, já que em nosso estudo o

NAAG não alterou o status antioxidante e não promoveu dano oxidativo a biomoléculas.

Além disso, nesses estudos a possibilidade de efeitos sinérgicos entre NAA e NAAG, já

que o NAAG pode ser convertido enzimaticamente a NAA, não foi investigada, e não deve

ser descartada. Enquanto parece que o NAA pode estar realmente relacionado aos

mecanismos responsáveis pelo dano cerebral observado nos pacientes com Doença de

Canavan, o papel neuroquímico do NAAG na patogênese dessa doença deve ser melhor

elucidado.

191

Apesar de as concentrações de NAA usadas em nosso trabalho serem similares às

observadas no plasma, cérebro e LCR de pacientes afetados pela Doença de Canavan, nos

quais se pode observar um aumento nos níveis de NAA de até 4 vezes (Tsai e Coyle, 1995;

Blüml, 1999; Surendran et al., 2003), é difícil extrapolar nossos achados para a condição

humana. No entanto, esses resultados estão de acordo com Tsai e colaboradores (1998) que

estudaram a associação entre estresse oxidativo e discinesia tardia. Foi observado que

pacientes com discinesia tardia também apresentam concentrações fortemente aumentadas

de NAA no LCR (até 100 mM), da mesma forma que ocorre na Doença de Canavan. Os

sintomas da discinesia tardia mostraram correlação positiva com os marcadores de

neurotransmissão excitatória e com conteúdo de grupos carbonila (Tsai et al., 1998). Níveis

elevados de dienos conjugados e TBA-RS no LCR de pacientes com discinesia tardia já

foram também relatados (Pall et al., 1987; Lohr et al., 1990). A hipótese de dano oxidativo

nos pacientes com discinesia tardia é reforçada por relatos de que a Vitamina E é capaz de

reverter os sintomas dos pacientes afetados por essa condição (Adler et al., 1993; Lohr e

Caligiuri, 1996; Zhang et al., 2004). O aumento do conteúdo de carbonilas e dos níveis de

produtos de dano oxidativo a lipídios (MDA e dienos conjugados) no LCR indica a

ocorrência de proteínas oxidadas e de lipoperoxidação aumentada em pacientes com

discinesia tardia, que também apresentam elevações expressivas dos níveis de NAA, e

estão de acordo com nossos achados de um aumento de oxidação protéica e de

lipoperoxidação promovidos pelo NAA em córtex cerebral de ratos.

Concluindo, nossos resultados mostrando o comprometimento das defesas

antioxidantes (enzimáticas e não-enzimáticas) e a geração de dano oxidativo tanto a

lipídios quanto a proteínas, sugerem que o NAA é capaz de promover estresse oxidativo

192

tanto in vitro quanto in vivo em córtex cerebral de ratos de 14 e 30 dias de vida, apontando

para um importante papel do H

, e provavelmente do OH

●

, na patogênese da Doença de

Canavan. Em conjunto, pode-se sugerir que o comprometimento das defesas antioxidantes,

o dano oxidativo aos lipídios e proteínas, o aumento do conteúdo de H

, a oxidação de

grupos –SH, o comprometimento na produção de NADPH e alteração no status redox

celular resultem em estresse oxidativo e estejam de fato envolvidos na neurotoxicidade do

NAA. Se esses efeitos também ocorrerem no cérebro de pacientes afetados pela Doença de

Canavan, é possível que possam contribuir, juntamente com outros mecanismos, para a

disfunção neurológica característica dessa doença. Baseado nesses resultados, propõe-se

que a administração de antioxidantes, especialmente das vitaminas E e C, seja considerada

como adjuvante na terapêutica dos pacientes afetados pela Doença de Canavan.

193

REFERÊNCIAS

194

Abrahamsson, T.; Brandt, U.; Marklund, S.L.; Sjoqvist, P.O. Vascular bound recombinant

extracellular superoxide dismutase type C protects against the detrimental effects of

superoxide radicals on endothelium-dependent arterial relaxation. Circ. Res. 70: 264-

271, 1992.

Adachi, M.; Torii, J.; Schneck, L.; Volk, B.W. Electron microscopy and enzyme

histochemical studies of the cerebellum in spongy degeneration (van Bogaert and

Bertrand type). Acta Neuropathol. 20: 22, 1972.

Adams, J.D.; Klaidman, L.K.; Chang, M.L.; Yang, J. Brain oxidative stress – analytical

chemistry and thermodynamics of glutathione and NADPH. Curr. Top. Med. Chem. 1:

473-482, 2001.

Adler, L.A.; Peselow, E.; Rotrosen, J.; Duncan, E.; Lee, M.; Rosenthal, M.; Angrist, B.

Vitamin E treatment of tardive dyskinesia. Am. J. Psychiatry 150: 1405-1407, 1993.

Aebi, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126, 1984.

Akimitsu, T.; Kurisu, K.; Hanaya, R.; Iida, K.; Kiura, Y.; Arita, K.; Matsubayashi, H.;

Ishihara, K.; Kitada, K.; Serikawa, T.; Sasa, M. Epileptic seizures induced by N-

acetylaspartate in rats: in vivo and in vitro studies. Brain Res. 861: 143-150, 2000.

Aksenov, M.Y.; Markesbery, W.R. Change in thiol content and expression of glutathione

redox system gene in the hippocampus and cerebellum in Alzheimer’s disease.

Neurosci. Lett. 302: 141-145, 2001.

Alvarez, B.; Radi, R. Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins. Amino Acids

25: 295-311, 2003.

195

Anderson, M.E. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chemico-

Biological Interactions 111-112: 1-14, 1998.

Andreoli, S.P.; McAteer, J.A.; Seifert, S.A.; Kempson, S.A. Oxidant-induced alterations in

glucose and phosphate transport in LLC-PK

cells: mechanisms of injury. Am. J.

Physiol. 265: F377-F384, 1993.

Anisimov, V.N.; Popovich, I.G.; Zabezhinski, M.A.; Anisimov, S.V.; Vesnushkin, G.M.;

Vinogradova, I.A. Melatonin as antioxidant, geroprotector and anticarcinogen.

Biochim. Biophys Acta 1757: 573-589, 2006.

Arun, P.; Madhavarao, C.N.; Moffett, J.R.; Namboodiri, A.M.A. Regulation of N-

acetylaspartate and N-acetylaspartylglutamate biosynthesis by protein kinase activators.

J. Neurochem. 98: 2034-2042, 2006.

Avshalumov, M.V.; MacGregor, D.G.; Sehgal, L.M.; Rice, M.E. The glial antioxidant

network and neuronal ascorbate: protective yet permissive for H

signaling. Neuron

Glia Biol. 1: 365-376, 2004.

Aslan, M.; Özben, T. Oxidants in receptor tyrosine kinase signal transduction pathways.

Antioxid. Redox Signal. 5: 781-788, 2003.

Bains, J.S.; Shaw, C.A. Neurodegenerative disorders in humans: the role of glutathione in

oxidative stress-mediated neuronal cell death. Brain Res. Rev. 25: 335-358, 1997.

Barone, D.; Spignoli, G. Investigations on the binding properties of the nootropic agent

pyroglutamic acid. Drugs Exp. Clin. Res. 16: 85-99, 1990.

Baslow, M.H. Evidence supporting a role for N-acetyl-L-aspartate as a molecular water

pump in myelinated neurons in the central nervous system – An analytical review.

Neurochem. Int. 40: 295-300, 2002.

196

Baslow, M.H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.

Neurochem. Res. 28: 941-953, 2003.

Baslow, M.H.; Guilfoyle, D.N. Functions of N-acetylaspartate and N-

acetylaspartylglutamate in brain: evidence of a role in maintenance of higher brain

integrative activities of information processing and cognition. Adv. Exp. Med. Biol.

576: 95-112, 2006.

Baud, O.; Greene, A.E.; Li, J.; Wang, H.; Volpe, J.J.; Rosenberg, P.A. Glutathione

peroxidase-catalase cooperativity is required for resistance to hydrogen peroxide by

mature rat oligodendrocytes. J. Neurosci. 24: 1531-1540, 2004.

Beard, J.L.; Connor, J.R.; Jones, B.C. Iron in the brain. Nutr. Rev. 51: 157-170, 1993.

Beaudet, A. 2001. Aspartoacylase Deficiency (Canavan Disease). In: Scriver, C.R.;

Beaudet, A. L.; Sly, W.S.; Valle, D. (Eds.). The Metabolic and Molecular Bases of

Inherited Disease. New York: McGraw-Hill, 2001. P. 5799-5805.

Benarroch, E.E. N-acetylaspartate and N-acetylaspartylglutamate: neurobiology and

clinical significance. Neurology 70: 1353-1357, 2008.

Bennet Jr., J.P.; Logan, W.J.; Snyder, S.H. Amino acids as central nervous transmitters: the

influence of ions, amino acid analogues, and ontogeny on transport systems for L-

glutamic and aspartic acids and glycine into central nervous synaptosomes. J.

Neurochem. 2: 1533-1550, 1973.

Bergendi, L.; Benes, L.; Durackova, Z.; Ferencik, M. Chemistry, physiology and pathology

of free radicals. Life Sci. 65: 1865-1874, 1999.

Blüml, S. In vivo quantitation of cerebral metabolite concentrations using natural

abundance

C MRS at 1.5 T. Journal of Magnetic Resonance 136: 219-225, 1999.

197

Boldyrev, A.; Bulygina, E.; Leinsoo, T.; Petrushanko, I.; Tsubone, S.; Abe, H. Protection

of neuronal cells against reactive oxygen species by carnosine and related compounds.

Comp. Biochem. Physiol. 137: 81-88, 2004.

Bondy, S.C.; Le Bel, C.P. The relationship between excitotoxicity and oxidative stress in

the central nervous system. Free Radic. Biol. Med. 14: 633-642, 1993.

Boveris, A. Biochemistry of free radicals: from electrons to tissues. Medicina (Buenos

Aires) 58: 350-356, 1998.

Boveris, A.; Chance, B. The mitocondrial generation of hydrogen peroxide. Biochem. J.

134: 707-716, 1973.

Boxer, L.A.; Oliver, J.M.; Spielberg, S.P.; Allen, J.M.; Schulman, J.D. Protection of

granulocytes by vitamin E in glutathione synthetase deficiency. New Engl. J. Med. 301:

901-905, 1979.

Bruce, A.J.; Baudry, M. Oxygen free radicals in rat limbic structures after kainate-induced

seizures. Free Radic. Biol. Med. 18: 993-100, 1995.

Bubeníková-Valesová, V.; Balcar, V.; Tejkalová, H.; Langmeier, M.; St’astny, F. Neonatal

administration of N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate induces early neurodegeneration in

hippocampus and alters behaviour in young adult rats. Neurochem. Int. 48: 515-522,

2006.

Burlina, A.P.; Ferrari, V.; Divry, P.; Gradowska, W.; Jakobs, C.; Bennett, M.J.; Sewell,

A.C.; Dionisi-Vici, C.; Burlina, A.B. N-acetylaspartylglutamate in Canavan disease: an

adverse effector? Eur. J. Pediatr. 158: 406-409, 1999

Burlina, A.P.; Ferrari, V.; Burlina, A.B.; Ermani, M.; Boespflug-Tanguy, O.; Bertini E.;

and the Clinical European Network on Brain Dysmielinating Disease. N-

198

acetylaspartylglutamate (NAAG) in Pelizaeus-Merzbacher Disease. Adv. Exp. Med.

Biol. 576: 353-359, 2006.

Caccia, S.; Garattini, S.; Ghezzi, P.; Zanini, M.G. Plasma and brain levels of glutamate and

pyroglutamate after oral monosodium glutamate to rats. Toxicol. Lett. 10: 169-175,

1982.

Cadenas, E.; Davies, K.J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and

aging. Free Radic. Biol. Med. 29: 222-230, 2000.

Calabrese, V.; Lodi, R.; Tonon, C.; D’Agata, V.; Sapienza, M.; Scapagnini, G.;

Mangiameli, A.; Pennisi, G.; Stella, A.M.G.; Butterfield, D.A. Oxidative stress,

mitochondrial dysfunction and cellular stress response in Friedreich’s ataxia. J. Neurol.

Sci. 233: 145-162, 2005.

Campese, V.M.; Sindhu, R.K.; Ye, S.; Bai, Y.; Vaziri, N.D.; Jabbari, B. Regional

expression of NO synthase, NAD(P)H oxidase and superoxide dismutase in the rat

brain. Brain Res. 1134: 27-32, 2007.

Cardozo-Pelaez, F.; Brooks, P.J.; Stedeford, T.; Song, S.; Sanchez-Ramos, J. DNA

damage, repair, and antioxidant systems in brain regions: a correlative study. Free

Radic. Biol. Med. 28: 779-785, 2000.

Carpenè, E.; Andreani, G.; Isani, G. Metallothionein functions and structural

characteristics. J. Trace Elem. Med. Biol. 21: 35-39, 2007.

Chakraborty, G.; Mekala, P.; Yahya, D.; Wu, G.; Ledeen, R. Intraneuronal N-

acetylaspartate supplies acetyl groups for myelin lipid synthesis: evidence for myelin-

associated aspartoacylase. J. Neurochem. 78: 736-745, 2001.

Chance, B.; Sies, H.; Boveris, A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs.

199

Physiol. Rev. 59: 527-605, 1979.

Clark, J.F.; Doepke, A.; Filosa, J.A.; Wardle, R.L.; Lu, A.; Meeker, T.J.; Pyne-Geithman,

G.J. N-acetylaspartate as a reservoir of glutamate. Med. Hypotheses 67: 506-512, 2006.

Cleeter, M.W.J.; Cooper, J.M.; Schapira, A.H.V. Irreversible inhibition of mitochondrial

complex I by 1-methyl-4-phenylpyridinium: evidence for free radical involvement. J.

Neurochem. 58: 786-789, 1992.

Cohen, M. V. Free radicals in schemic and reperfusion myocardial injury: is this time for

clinical trials? Ann. Intern. Med. 111: 918-931, 1989.

Coyle, J. T. The nagging question on the function of N-acetylaspartylglutamate. Neurobiol.

Dis. 4: 231-238, 1997.

Coyle, P.; Philcox, J.C.; Rofe, A.M. Metallothionein: the multipurpose protein. Cell. Mol.

Life Sci. 59: 627-647, 2002.

Dahl, N.; Pigg, M.; Ristoff, E.; Gali, R.; Carlsson, B.; Mannervik, B.; Larsson, A.; Board,

P. Missense mutations in the human glutathione synthetase gene result in severe

metabolic acidosis, 5-oxoprolinuria, hemolytic anemia and neurological dysfunction.

Hum. Mol. Genet. 6: 1147-1152, 1997.

Delanty, N.; Dichter, M. A. Oxidative injury in the nervous system. Acta Neurol. Scand.

98: 145-153, 1998.

Delwing, D.; Bavaresco, C.S.; Wannmacher, C.M.D.; Wajner, M.; Dutra-Filho, C.S.;

Wyse, A.T.S. Proline induces oxidative stress in cerebral cortex of rats. Int. J. Dev.

Neurosci. 21: 105-110, 2003.

Di Toro, C.G.; Di Toro, P.A.; Zieher, L.M.; Guelman, L.R. Sensitivity of cerebellar

glutathione system to neonatal ionizing radiation exposure. Neurotoxicology 28: 555-

200

561.

Driver, A.S.; Kodavanti, P.R.S.; Mundy, W.R. Age-related changes in reactive oxygen

species production in rat brain homogenates. Neurotoxicol. Teratol. 22: 175-181, 2000.

Dusticier, N.; Kerkerian, L.; Errami, M.; Nieoullon, A. Effects of pyroglutamic acid on

corticostriatal glutamatergic transmission. Neuropharmacology 24: 903-908, 1985.

Eldjarn, L.; Jellum, E.; Stokke, O. Pyroglutamic aciduria: studies on the enzymic block and

on the metabolic origin of pyroglutamic acid. Clin. Chim. Acta 48: 461-476, 1972.

Eldjarn, L.; Jellum, E.; Stokke, O. Pyroglutamic aciduria: rate of formation and degradation

of pyroglutamate. Clin. Chim. Acta 49: 311-323, 1973.

El-Mohsen, M.M.A.; Iravani, MM; Spencer, J.P.E.; Rose, S.; Fahim, A.T.; Motawi,

T.M.K.; Ismail, N.A.F.; Jenner, P. Age-associated changes in protein oxidation and

proteasome activities in rat brain: modulation by antioxidants. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 336: 386-391, 2005.

Emerit, J.; Edeas, M.; Bricaire, F. Neurodegenerative diseases and oxidative stress.

Biomed. Pharmacother. 58: 39-46, 2004.

Erasmus, E.; Mienie, L.J.; de Vries, W.N.; de Wet, W.J.; Carlsson, B.; Larsson, A. Prenatal

analysis in two suspected cases of glutathione synthetase deficiency. J. Inherit. Metab.

Dis. 16: 837-843, 1993.

Escobedo, M.; Cravioto, J., 1973. Studies on the malabsorption syndromes. Inhibition of

-K

-ATPase of small intestine microvilli by pyrrolidone carboxylic acid. Clin.

Chim. Acta 49: 147-151, 1973.

Esterbauer, H.; Cheeseman, K.H. Determination of aldehydic lipid peroxidation products:

malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Meth. Enzymol. 186: 407-421, 1990.

201

Evelson, P.; Travacio, M.; Repetto, M.; Escobar, J.; Llesuy, S.F.; Lissi, E. Evaluation of

total reactive antioxidant potential (TRAP) of tissue homogenates and their cytosols.

Arch. Biochem. Biophys. 388: 261-266, 2001.

Fang, Y.-Z.; Yang, S.; Wu, G.W. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Nutrition 18:

872-879, 2002.

Ferreira, A.L.A.; Matsubara, L.S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema

de defesa e estresse oxidativo. Rev. Ass. Med. Brasil. 43: 61-68, 1997.

Ferri, P.; Biagiotti, E.; Ambrogini, P.; Santi, S.; Del Grande, P.; Ninfali, P. NADPH-

consuming enzymes correlate with glucose 6-phosphate dehydrogenase in Purkinje

cells: an immunohistochemical and enzyme histochemical study of the rat cerebellar

cortex. Neurosci. Res. 51: 185-197, 2005.

Driver, A.S.; Kodavanti, P.R.S.; Mundy, W.R. Age-related changes in reactive oxygen

species production in rat brain homogenates. Neurotoxicol. Teratol. 22: 175-181, 2000.

Filipovic, D.; Radojcic, M.B. CuZn superoxide dismutase in the hippocampus and brain

cortex of rats exposed to various stress conditions. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048: 366-

368, 2005.

Fridovich, I.; McCord, J.M. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein

(hemocuprein). J. Biol. Chem. 244: 6049-6055, 1969.

Fridovich, I. Superoxide dismutases. Ann. Rev. Biochem. 44: 147-157, 1975.

Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Ann. Rev. Biochem. 64: 97-

112, 1995.

Gao, L.; Laude, K.; Cai, H. Mitochondrial Pathophysiology, reactive oxygen species and

cardiovascular diseases. Vet. Clin. Small Anim. 38: 137-155, 2008.

202

Gehl, L.M.; Saab, O.H.; Bzdega, T.; Wroblewska, B.; Neale, J.H. Biosynthesis of NAAG

by an enzyme-mediated process in rat central nervous system neurons and glia. J.

Neurochem. 90: 989-997, 2004.

George, R.L.; Huang, W.; Naggar, H.A.; Smith, S.B.; Ganapathy, V. Transport of N-

acetylaspartate via murine sodium/dicarboxylate cotransporter NaDC3 and expression

of this transporter and aspartoacylase II in ocular tissues in mouse. Biochim. Biophys.

Acta 1690: 63-69, 2004.

Gloire, G.; Legrand-Poels, S.; Piette, J. NF-κB activation by reactive oxygen species:

fifteen years later. Biochem. Pharmacol. 72: 1493-1505, 2006.

Gomi, H.; Ueno, I.; Yamanouchi, K. Antioxidant enzymes in the brain of zitter rats:

abnormal metabolism of oxygen species and its relevance to pathogenic changes in the

brain of zitter rats with genetic spongiform encephalopathy. Brain Res. 653: 66-72,

1994.

Gordon, N. Canavan disease: A review of recent developments. Eur. J. of Paediatr. Neurol.

5: 65-69, 2000.

Guelman, L.R.; Pagotto, R.M.L.; Di Toro, C.G.; Zieher, L.M. Deferoxamine antioxidant

activity on cerebellar granule cells γ–irradiated in vitro. Neurotoxicol. Teratol. 26: 477-

483, 2004.

Gupta, R.C.; Milatovic, D.; Dettbarn, W.D. Depletion of energy metabolites following

acetylcholinesterase inhibitor-induced status epilepticus: protection by antioxidants.

Neurotoxicology 22: 271-282, 2002.

Halliwell, B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or

consequence? Lancet. 344: 721-724, 1994.

203

Halliwell, B. Free radicals, protein and DNA: oxidative damage versus redox regulation.

Biochem. Soc. Trans. 24: 1023-1027, 1996.

Halliwell, B. Role of free radicals in the neurodegenerative diseases. Drugs Aging 18: 685-

716, 2001.

Halliwell, B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J. Neurochem.

97: 1634-1658, 2006.

Halliwell, B.; Gutteridge, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. New York:

Oxford University Press Inc., 2007.

Halliwell, B.; Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo in

cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br. J. Pharmacol. 142:

231-255, 2004.

Harte, M.K.; Bachus, S.B.; Reynolds, G.P. Increased N-acetylaspartate in rat striatum

following long-term administration of haloperidol. Schizophr. Res. 75: 303-308, 2005.

Hashida, K.; Sakakura, Y.; Makino, N. Kinetic studies on the hydrogen peroxide

elimination by cultured PC12 cells. Biochim. Biophys. Acta 1572: 85-90, 2002.

Hazel, A.S. Excitotoxic mechanisms in stroke: an update of concepts and treatment

strategies. Neurochem. Int. 50: 941-953, 2007.

Hexum, T. D.; Fried, R. Effects of superoxide radicals on transport (Na

) adenosine

triphosphatase and protection by superoxide dismutase. Neurochem. Res. 4: 73-82,

1979.

Hoffmann, G.; Aramaki, S.; Blum-Hoffmann, E.; Nyhan, W.L.; Sweetman, L. Quantitative

analysis for organic acids in biological samples: batch isolation followed by gas

chromatographic-mass spectrometric analysis. Clin. Chem. 35: 587-595, 1989.

204

Hoffmann, G.F.; Meier-Augenstein, W.; Stöckler, S.; Surtees, R.; Rating, D.; Nyhan, W.L.

Physiology and pathophysiology of organic acids in cerebrospinal fluid. J. Inherit.

Metab. Dis.16: 648-669, 1993.

Hussain, S; Slikker Jr., W.; Ali, S.F. Age-related changes in antioxidant enzymes,

superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione in different

regions of mouse brain. Int. J. Dev. Neurosci. 13: 811-817, 1995.

Jain, A.; Buist, N.R.M.; Kennaway, N.G.; Powell, B.R.; Auld, P.A.; Martensson, J. Effect

of ascorbate or N-acetylcysteine treatment in a patient with hereditary glutathione

synthetase deficiency. J. Pediatr. 124: 229-233, 1994.

Janson, C.G.; McPhee, S.W.J.; Francis, J.; Shera, D.; Assadi, M.; Freese, A.; Hurh, P.;

Haselgrove, J.; Wang, D.J.; Bilaniuk, L.; Leone, P. Natural history of Canavan Disease

revealed by Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-MRS) and Diffusion-

weighted MRI. Neuropediatrics 37: 209-221, 2006.

Jellum, E.; Kluge, T.; Borrensen, H.C.; Stokke, O.; Eldjarn, I. Pyroglutamic aciduria: a new

inborn error of metabolism. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 26: 327-335, 1970.

Jimenez-Jorge, S.; Guerrero, J.M.; Jimenez-Caliani, A.; Naranjo, M.C.; Lardone, P.J.;

Carrillo-Vico, A.; Osuna, C.; Molinero, P. Evidence for melatonin synthesis in the rat

brain during development. J. Pineal Res. 42: 240-246, 2007.

Kaushik, S.; Kaur, J. Chronic cold exposure affects the antioxidant defense system in

various rat tissues. Clin. Chim. Acta 333: 69-77, 2003.

Khaing, Z.Z.; Weickert, C.S.; Weinberger, D.R.; Lipska, B.K. Differential DNA damage in

response to the neonatal and adult excitotoxic hippocampal lesion in rats. Eur. J.

Neurosci. 12: 4424-2233, 2000.

205

Kienzle-Hagen, M.E.; Pederzolli, C.D.; Sgaravatti, A.M.; Bridi, R.; Wajner, M.;

Wannmacher, C.M.D.; Wyse, A.T.S.; Dutra-Filho, C.S. Experimental

hyperphenylalaninemia provokes oxidative stress in rat brain. Biochim. Biophys. Acta

1586: 344-352, 2002.

Kirmani, B.F.; Jacobowitz, D.M.; Kallarakal, A.T.; Namboodiri, A.M.A. Aspartoacylase is

restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications

for Canava Disease. Mol. Brain Res. 107: 176-182, 2002.

Kitada, K.; Akimitsu, T.; Shigematsu, Y.; Kondo, A.; Maihara, T.; Yokoi, N.; Kuramoto,

T.; Sasa, M.; Serikawa, T. Accumulation of N-acetylaspartate in the brain of the tremor

rat, a mutant exhibiting absence-like seizure and spongiform degeneration in the central

nervous system. J. Neurochem. 74: 2512-2519, 2000.

Kletzien, R.F.; Harris, P.K.W.; Foellmi, L.A. Glucose 6-phosphate dehydrogenase: a

“housekeeping” enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients

and oxidant stress. FASEB J. 8: 174-181, 1994.

Klugmann, M.; Leichtlein, C.B.; Wymond Symes, C.; Serikawa, T.; Young, D.; During,

M.J. Restoration of aspartoacylase activity in CNS neurons does not ameliorate motor

deficits and demyelination in a model of Canavan Disease. Mol. Ther. 11: 745-753,

2005.

Kondo, A.; Sendoh, S.; Mivata, K.; Takamatsu, J. Spongy degeneration in the zitter rat:

ultrastructural and immunohistochemical studies. J. Neurocytol. 24: 533-44, 1995.

Krawczyk, H.; Gradowska, W. Characterization of the 1H and 13C NMR spectra of N-

acetylaspartylglutamate and its detection in urine from patients with Canavan disease.

J. Pharm. Biomed. Anal. 31: 455-463, 2003.

206

Kukreja, R.C.; Weaver, A.B.; Hess, M.L. Sarcolemmal Na

-ATPase: inactivation by

neutrophil-derived free radicals and oxidants. Int. J. Physiol. 259: H133-H136, 1990.

Kumar, S.; Mattan, N.S.; de Vellis, J. Canavan disease: a white matter disorder. Ment.

Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 12: 157-65, 2006.

Larsson, A.; Wachtmeister, L.; von Wendt, L.; Andersson, R.; Hagenfeldt, L.; Herrin, K.M.

Ophtalmological, psychometric and therapeutic investigation in two sisters with

hereditary glutathione synthetase deficiency (5-oxoprolinuria). Neuropediatrics 16:

131-136, 1985.

Larsson, A.; Anderson, M.E. Glutathione synthetase deficiency and other disorders of the

γ-glutamyl cycle. In: Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S., Valle, D. (Editores). The

Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. New York: McGraw-Hill, 2001.

Cap. 96, p. 2205-2216.

Latini, A.; Scussiato, K.; Leipnitz, G.; Gibson, K.M.; Wajner, M. Evidence for oxidative

stress in tissues derived from succinate semialdehyde dehydrogenase-deficient mice. J.

Inherit. Metab. Dis. 30: 800-810, 2007.

Lees, G.J. Inhibition of sodium-potassium-ATPase: a potentially ubiquitous mechanism

contributing to central nervous system neuropathology. Brain Res. Rev. 16: 283-300,

1991.

Lees, G.J. Contributory mechanisms in the causation of neurodegenerative disorders.

Neuroscience 54: 287-322, 1993.

Leone, P.; Janson, C.G.; Bilianuk, L.; Wang, Z.; Sorgi, F.; Huang, L.; Matalon, R.; Kaul,

R.; Zeng, Z.; Freese, A.; McPhee, S.W.; Mee, E.; During, M.J. Aspartoacylase gene

transfer to the mammalian central nervous system with therapeutic implications for

207

Canavan disease. Ann. Neurol. 48: 27-38, 2000.

Liang, L.P.; Ho Y.S.; Patel, M. Mitochondrial superoxide production in kainate-induced

hippocampal damage. Neuroscience 101: 563-570, 2000.

Liang, L.P.; Patel, M. Mitochondrial oxidative stress and increased seizure susceptibility in

Sod2(−/+) mice. Free Radic. Biol. Med. 36: 542-554, 2004.

Lièvre, V.; Becuwe, P.; Bianchi, A.; Koziel, V.; Franck, P.; Schroeder, H.; Nabet, P.;

Dauça, M.; Daval, J.-L. Free radical production and changes in superoxide dismutases

associated with hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of embryonic rat forebrain

neurons in culture. Free Radic. Biol. Med. 29: 1291-1301, 2000.

Lissi, E.; Salim-Hanna, M.; Pascual, C.; Del Castillo, M.D. Evaluation of total antioxidant

potential (TRAP) and total antioxidant reactivity from luminol-enhanced

chemiluminescence measurements. Free Radic. Biol. Med. 18: 153-158, 1995.

Lohr, J.B.; Caligiuri, M.P. A double-blind placebo-controlled study of vitamin E treatment

of Tardive dyskinesia. J. Clin. Psychiatry 57: 167-173, 1996.

Lohr, J.B.; Kuczenski, R.; Bracha, H.S.; Moir, M.; Jeste, D.V. Increased indices of free

radical activity in the cerebrospinal fluid of patients with tardive dyskinesia. Biol.

Psychiatry 28: 535-539, 1990.

Lonnrot, K.; Metsa-Ketela, T.; Molnar, G.; Ahonen, J.P.; Latvala, M.; Peltola, J.; Pietila,

T.; Alho, H. The effect of ascorbate and ubiquinone supplementation on plasma and

CSF total antioxidant capacity. Free Radic. Biol. Med. 21: 211-217, 1996.

Lotti, M. Age-related sensitivity of the nervous system to neurotoxic insults. Toxicol. Lett.

127: 183-187, 2002.

Madhavarao, C.N.; Arun, P.; Moffett, J.R.; Szucs, S.; Surendran, S.; Matalon, R.; Garbern,

208

J.; Hristova, D.; Johnson, A.; Jiang, W.; Namboodiri, A.M.A. Defective N-

acetylaspartate catabolism reduces brain acetate levels and myelin lipid synthesis in

Canavan`s Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102: 5221-5226, 2005.

Manna, S.K.; Zhang, H.J.; Yan, T.; Oberley, L.W.; Aggarwal, B.H. Overexpression of

manganese superoxide dismutase suppresses Tumor Necrosis Factor-induced apoptosis

and activation of Nuclear Transcription Factor-κB and activated Protein-1. J. Biol.

Chem. 273: 13245-13254, 1998.

Manning, N.J.; Davies, N.P.; Olpin, S.E.; Carpenter, K.H.; Smith, M.F.; Pollitt, R.J.;

Duncan, S.L.; Larsson, A.; Carlsson, B. Prenatal diagnosis of glutathione synthetase

deficiency. Prenat. Diagn. 14: 475-478, 1994.

Marks, D.B.; Marks, A.D.; Smith, C.M. Basic Medical Biochemistry: a clinical aproach.

Maryland: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. P. 143.

Marstein, S.; Jellum, E.; Nesbakken, R.; Perry, T.L. Biochemical investigations of biopsied

brain tissue and autopsied organs from a patient with pyroglutamic acidemia (5-

oxoprolinemia). Clin. Chim. Acta 111: 219-228, 1981.

Matalon, R.; Michals, K.; Kaul, R. Canavan disease: from spongy degeneration to

molecular analysis. J. Pediatr. 127: 511-517, 1995a.

Matalon, R.; Kaul, R.; Gao, G.P.; Michals, K.; Gray, R.G.; Bennett-Briton, S.; Norman,

A.; Smith, M.; Jakobs, C. Prenatal diagnosis for Canavan Disease: the use of DNA

markers. J. Inherit. Metab. Dis. 18: 215-217, 1995b.

Matalon, R.; Michals-Matalon, K. Biochemistry and molecular biology of Canavan

Disease. Neurochem. Res. 24: 507-513, 1999.

Matalon, R.; Michals-Matalon, K. Spongy degeneration of the brain, Canavan Disease:

209

biochemical and molecular findings. Frontiers in Bioscience 5: d307-311, 2000.

Matalon, R.; Michals-Matalon, K.; Surendran, S.; Tyring, S.K. Canavan disease: studies on

the knock out mouse. Adv. Med. Exp. Biol. 576: 77-93, 2006.

Matté, C.; Monteiro, S.C.; Calcagnotto, T.; Bavaresco, C.S.; Netto, C.A.; Wyse, A.T.S. In

vitro and in vivo effects of homocysteine on Na

-ATPase activity in parietal,

prefrontal and cingulate cortex of young rats. Int. J. Dev. Neurosci. 22: 185-190, 2004.

Mavelli, I.; Rigo, A.; Federico, R.; Ciriolo, M.R.; Rotilio, G. Superoxide dismutase,

glutathione peroxidase and catalase in developing rat brain. Biochem. J. 204: 535-540,

1982.

Maxwell, S.R.J. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs 49: 345-361, 1995.

McPhee, S.W.J.; Janson, C.J.; Li, C.; Samulski, R.J.; Camp, A.S.; Francis, J.; Shera, D.;

Lioutermann, L.; Feely, M.; Freese, A.; Leone, P. Immune responses to AAV in phase I

study for Canavan disease. J. Gene Med. 8: 577-588, 2006.

Meister, A. The γ-glutamyl cycle. Diseases associated with specific deficiencies. Annals

Intern. Med. 81: 247-253, 1974.

Meister, A. Glutathione deficiency produced by inhibition of its synthesis, and its reversal;

applications in research and therapy. Pharmacol. Ther. 51: 155-194, 1991.

Melov, S.; Schneider, J.A.; Day, B.J.; Hinerfeld, D.; Coskun, P.; Mirra, S.S.; Crapo, J.D.;

Wallace, D.C. A novel neurological phenotype in mice lacking mitochondrial

manganese superoxide dismutase. Nat. Genet. 18: 159-163, 1998.

Milatovic, D.; Zivin, M.; Gupta, R.C.; Dettbarn, W.D. Alterations in cytochrome c oxidase

activity and energy metabolites in response to kainic acid-induced status epilepticus.

Brain Res. 31: 67-78, 2001.

210

Moffett, J.R.; Ross, B.; Arun, P.; Madhavarao, C.N.; Namboodiri, A.M.A. N-

acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog. Neurobiol.

81: 89-131, 2007.

Morgane, P.J.; Mokler, D.J.; Galler, J.R. Effects of prenatal protein malnutrition on the

hippocampal formation. Neurosci. Biobehav. Rev. 26: 471-483, 2002.

Moriarty-Craige, S.E.; Jones, D.P. Extracellular thiols and thiol/disulfide redox in

metabolism. Annu. Rev. Nutr. 24: 481-509, 2004.

Nakadate, K.; Noda, T.; Sakakibara, S.; Kumamoto, K.; Matsuura, T.; Joyce, J.N.; Ueda, S.

Progressive dopaminergic neurodegeneration of substantia nigra in the zitter mutant rat.

Acta Neuropathol. 112: 64-73, 2006.

Namboodiri, A.M.A.; Peethambaran, A.; Mathew, R.; Sambhu, P.A.; Hershfield, J.;

Moffett, J.R.; Madhavarao, C.N. Canavan disease and the role of N-acetylaspartate in

myelin synthesis. Mol. Cell. Endocrinol. 252: 216-223, 2006.

Neale, J.H.; Bezdega, T.; Wroblewska, B. N-acetylaspartylglutamate: the most abundant

peptide neurotransmitter in the mammalian central nervous system. J. Neurochem. 75:

443-452, 2000.

Nicholls, D.G.; Budd, S.L. Mitochondria and neuronal glutamate excitotoxicity. Biochim.

Biophys. Acta 1366: 97-112, 1998.

Nicotera, T.M.; Notaro, J.; Notaro, S.; Schumer, J. Sandberg, A.A. Elevated superoxide

dismutase in Bloom’s Syndrome: a genetic condition of oxidative stress. Cancer Res.

49: 5239-5243, 1989.

Ninfali, P.; Ditroilo, M.; Capellacci, S.; Biagiotti, E. Rabbit brain glucose-6-phosphate

dehydrogenase: biochemical properties and inactivation by free radicals and 4-hydroxy-

211

2-nonenal. Neuroreport. 12: 4149-4153, 2001.

Njalsson, R. Glutathione synthetase deficiency. Cell. Mol. Life Sci. 62: 1938-1945, 2005.

Njalsson, R.; Carlsson, K.; Olin, B.; Carlsson, B.; Whitbread, L.; Polekhina, G.; Parker,

M.W.; Norgren, S.; Mannervik, B.; Board, P.G.; Larsson, A. Kinetic properties of

missense mutations in patients with glutathione synthetase deficiency. Biochem. J. 349:

275-279, 2000.

Njalsson, R.; Norgren, S. Physiological and pathological aspects of GSH metabolism. Acta

Paediatr. 94: 132-137, 2005.

Njalsson, R.; Ristoff, E.; Carlsson, K.; Winkler, A.; Larsson, A.; Norgren, S. Genotype,

enzyme activity, glutathione level, and clinical phenotype in patients with glutathione

synthetase deficiency. Hum. Genet. 116: 384-389, 2005.

Nygren, J.; Ristoff, E.; Carlsson, K.; Möller, L.; Larsson, A. Oxidative DNA damage in

cultured fibroblasts from patients with hereditary glutathione synthetase deficiency.

Free Radic. Res. 39: 595-601, 2005.

Pall, H.S.; Williams, A.C.; Blake, D.R.; Lunec, J. Evidence of enhanced lipid peroxidation

in the cerebrospinal fluid of patients taking phenothiazines. Lancet. 2 : 596-599, 1987.

Pederzolli, C.D.; Sgaravatti, A.M.; Braum, C.A.; Prestes, C.C.; Zorzi, G.K.; Sgarbi, M.B.;

Wyse, A.T.S.; Wannmacher, C.M.D.; Wajner, M.; Dutra-Filho, C.S. 5-oxoproline

reduces non-enzymatic antioxidant defenses in vitro in rat brain. Metab. Brain Dis. 22:

51-65, 2007.

Pellegrini-Giampietro, D.E.; Cherici, G.; Alesiani, M.; Carla, V.; Moroni, F. Excitatory

amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia-

induced neuronal damage. J. Neurosci. 10: 1035-1041, 1990.

212

Pliss, L.; FitzGibbon, T.; Balcar, V.J.; St’astn y, F. Neurotoxicity of NAAG in vivo is

sensitive to NMDA antagonists and mGluR II ligands. Neuroreport. 11: 3651-3654,

2000.

Pliss, L.;Jezová, D.; Mares, V.; Balcar, V.J.; St’astny, F. N-Acetyl-L-aspartyl-L-glutamate

changes functional and structural properties of rat blood-brain barrier. Neurosci. Lett.

317: 85-88, 2002.

Pliss, L.; Balcar, V.J.; Bubeníková, V.; Pokorn y, J.; FitzGibbon, T.; St’astn y, F.

Morphology and ultra-structure of rat hippocampal formation after i.c.v. administration

of N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate. Neuroscience 122: 93-101, 2003.

Polekhina, G.; Board, P.G.; Gali, R.R.; Rossjohn, J.; Parker, M.W. Molecular basis of

glutathione synthetase deficiency and a rare gene permutation event. Embo J. 18: 3204-

3213, 1999.

Pouwels, P.J.; Frahm, J. Differential distribution of NAA and NAAG in human brain as

determined by quantitative localized proton MRS. NMR Biomed. 10: 73-78, 1997.

Reznick, A.Z.; Packer, L. Free radicals and antioxidants in muscular neurological diseases

and disorders. In: Poli, G.; Albano, E.; Dianzani, M.U. (Editores). Free Radicals: from

Basic Science to Medicine. Basel: Birkäuser Verlag, 1993. P. 425-437.

Rice, M. E.; Russo-Menna, I. Differential compartmentalization of brain ascorbate and

glutathione between neurons and glia. Neuroscience 82: 1213-1223, 1998.

Rieke, G.K.; Scarfe, A.D.; Hunter, J.F. L-pyroglutamate: an alternate neurotoxin for a

rodent model of Huntington’s Disease. Brain Res. Bull. 13: 443-456, 1984.

Rieke, G.K.; Smith, J.; Idusuyi, O.B.; Semenya, J.; Howard, R. Chronic intrastriatal L-

pyroglutamate: neuropathology and neuron sparing like Huntington’s Disease. Exp.

213

Neurol. 104: 147-154, 1989.

Rister, M.; Baehner, R.L. The alteration of superoxide dismutase, catalase, glutathione

peroxidase, and NAD(P)H cytochrome c reductase in guinea pig polymorphonuclear

leukocytes and alveolar macrophages during hyperoxia. J. Clin. Invest. 58: 1174-1184,

1976.

Ristoff, E.; Larsson, A. Patients with genetic defects in the γ-glutamyl cycle. Chem. Biol.

Interac. 111-112: 113-121, 1998.

Ristoff, E.; Augustson, C.; Geissler, J.; de Riijk, T.; Carlsson, K.; Luo, J.; Andersson, K.;

Weening, R.S.; van Zwieten, S.; Larsson, A.; Ross, D. A missense mutation in the

heavy subunit of γ-glutamylcysteine synthetase gene causes hemolytic anemia. Blood

95: 2193-2197, 2000.

Ristoff, E.; Mayatepek, E.; Larsson, A. Long-term clinical outcome in patients with

glutathione synthetase deficiency. J. Pediatr. 139: 79-84, 2001.

Ristoff, E. Inborn Errors in the Metabolism of Glutathione. Tese de doutorado apresentada

ao Departament of Clinical Science, Division of Pediatrics, Karolinska Institutet,

Huddinge University Hospital, Stockholm, Sweden, 2002.

Ristoff, E.; Larsson, A. Inborn errors in the metabolism of glutathione. Orphanet J. Rare

Dis. 2: 16, 2007.

Robertson, P.L.; Buchanan, D.N.; Muenzer, J. 5-oxoprolinuria in an adolescent with

chronic metabolic acidosis, mental retardation and psychosis. J. Pediatr. 118: 92-95,

1991.

Röhrdanz, E.; Obertrifter, B.; Ohler, S.; Tran-Thi, Q.; Kahl, R. Influence of Adriamycin

and paraquat on antioxidant enzyme expression in primary rat hepatocytes. Arch.

214

Toxicol. 74: 231-237, 2000.

Rojo, A.I.; Salinas, M.; Martín, D.; Perona, R.; Cuadrado, A. Regulation of Cu/Zn-

superoxide dismutase expression via the phosphatidylinositol 3 kinase/Akt pathway and

Nuclear Factor-κB. J. Neurosci. 24: 7324-7334, 2004.

Rothstein, J.D.; Jin, L.; Dykes-Hoberg, M.; Kunet, R.C.U. Chronic inhibition of glutamate

uptake produces a model of slow neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6591-

6595, 1993.

Rubin, Y.; LaPlaca, M.C.; Smith, D.H.; Thibault, L.E.; Lenkinski, R.E. The effect of N-

acetylaspartate on the intracellular free calcium concentration in NTera2-neurons.

Neurosci. Lett. 198: 209-212, 1995.

Serrano, F.; Klann, E. Reactive oxygen species and synaptic plasticity in the aging

hippocampus. Ageing Res. Rev. 3: 431-443, 2004.

Schreiber, S.J.; Megow, D.; Raupach, A.; Victorov, I.V.; Dirnagl, U. Age-related changes

of oxygen free radical production in the rat brain slice after hypoxia: on-line

measurement using enhanced chemiluminescence. Brain Res. 703: 227-230, 1995.

Shave, E.; Pliss, L.; Lawrance, M.L.; FitzGibbon, T.; St’astny, F.; Balcar, V.J. Regional

distribution and pharmacological characteristics of [

H]N-acetyl-aspartyl-glutamate

(NAAG) binding sites in rat brain. Neurochem. Int. 38: 53-62, 2001.

Silva, A.R.; Silva, C.G.; Ruschel, C.; Helegda, C.; Wyse, A.T.S.; Wannmacher, C.M.D.;

Wajner, M; Dutra-Filho, C.S. L-Pyroglutamic acid inhibits energy production and lipid

synthesis in cerebral cortex of young rats in vitro. Neurochem. Res. 26: 1277-1283,

2001.

Skiranth, S.G.; Chandrashekar, H.S.; Nagarajan, K.; Jayakumar, P.N. Restricted diffusion

215

in Canavan Disease. Childs Nerv. Syst. 23: 465-468, 2007.

Skullerud, K.; Marstein, S.; Schrader, H.; Brundelet, P.J.; Jellum, E. The cerebral lesions in

a patient with generalized glutathione deficiency and pyroglutamic aciduria (5-

oxoprolinuria). Acta Neuropathol. 52: 235-238, 1980.

Sokol, R.J. Vitamin E and neurologic function in man. Free Radic. Biol. Med. 6: 189-207,

1989.

Somani, S.M.; Husain, K. Exercise training alters kinetics of antioxidant enzymes in rat

tissues. Biochem. Mol. Biol. Int. 38: 587-595, 1996.

Southorn, P. A.; Powis, G. Free radicals in medicine I. Chemical nature and biological

reactions. Mayo Clin. Proc. 63: 381-389, 1988.

Spielberg, S.P.; Garrik, M.D.; Corash, L.M.; Butler, J.D.; Tietze, F.; Gorgers, L.V.;

Shulman, J.D. Biochemical heterogeneity in glutathione synthetase deficiency. J. Clin.

Invest. 61: 1417-1423, 1978.

Stadtman, E.R.; Levine, R.L. Free-radical mediated oxidation of free amino acids and

amino acid residues in proteins. Amino Acids 25: 207-218, 2003.

Stahl, W. L. Na

-ATPase: function, structure and conformations. Ann. Neurol. 16:

S121-S127, 1984.

Stvolinski, S.L.; Kukley, M.L.; Dobrota, D.; Matejovicova (Vachova), M.; Tkac, T.;

Boldyrev, A.A. Carnosine: an endogenous neuroprotector in the schemic brain. Cell.

Mol. Neurobiol. 19: 45-56, 1999.

Sultana, R.; Piroddi, M.; Galli, F.; Butterfield, D.A. Protein levels and activities of some

antioxidant enzymes in hippocampus of subjects with amnestic mild cognitive

impairment. Neurochem. Res. 6, 2008. On Line First DOI 10.1007/s11064-008-9593-0.

216

Surendran, S.; Michals-Matalon, K.; Quast, M.J.; Tyring, S.K.; Wei, J.; Ezell, E.L.;

Matalon, R. Canavan disease: a monogenic trait with complex genomic interaction.

Mol. Genet. Metab. 80: 74-80, 2003.

Thomas, A.G.; Vornov, J.J.; Olkowski, J.L.; Merion, A.T.; Slusher, B.S. N-acetylated α–

linked acidic dipeptidase converts N-acetylaspartylglutamate from a neuroprotectant to

a neurotoxin. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295: 16-22, 2000.

Traeger, E.C.; Rapin, I. The clinical course of Canavan Disease. Pediatric Neurol. 18: 207-

212, 1998.

Trotti, D.; Danbolt, N.C.; Volterra A. Glutamate transporters are oxidant-vulnerable: a

molecular link between oxidative stress and excitotoxic neurodegeneration? Trends

Pharmacol. Sci. 19: 328-334, 1998.

Tsai, G.; Coyle, J.T. N-acetylaspartate in neuropsychiatric disorders. Prog. Neurobiol. 46:

531-540, 1995.

Tsai, G.; Goff, D.C.; Chang, R.W.; Flood, J.; Baer, L.; Coyle J.T. Markers of glutamatergic

neurotransmission and oxidative stress associated with tardive dyskinesia. Am. J.

Psychiatry 155: 1207-1213, 1998.

Tsay, H.J.; Wang, P.; Wang, S.L.; Ku, H.H. Age-associated changes of superoxide

dismutase and catalase actvities in the rat brain. J. Biomed. Sci. 7: 466-474, 2000.

Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol. 552: 335-

344, 2003.

Ueda, S.; Sakakibara, S.; Watanabe, E,; Yoshimoto, K.; Koibuchi, N. Vulnerability of

monoaminergic neurons in the brain-stem of the zitter rat in oxidative stress. Prog.

Brain Res. 136: 293-302, 2002.

217

Valko, M.; Leibfritz, D.; Moncol, J.; Cronin, M.T.D.; Mazur, M.; Telser, J. Free radicals

and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem.

Cell Biol. 39: 44-84, 2007.

Vassiliev, V.; Harris, Z.L.; Zatta, P. Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases. Brain

Res. Rev. 49: 633-640, 2005.

Wang, T.; Zhang, X.; Li, J.J. The role of NF-κB in the regulation of cell stress responses.

Int. Immunopharmacol. 2: 1509-1520, 2002.

Ward, R.J.; Peters, T.J. Free Radicals. In: Marshall, W.J.; Bangert, S.K. (Eds.). Clinical

Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects. New York: Churchill Livingstone,

1995. P. 765-777.

Warner, B.B.; Stuart, L.; Gebb, S.; Wispé, J.R. Redox regulation of manganese superoxide

dismutase. Am. J. Physiol. 271: L150-L158, 1996.

Wendel, A. Glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 77: 325-332, 1981.

Williams, A.C.; Ford, W.C.L. Functional Significance of the pentose phosphate pathway

and glutathione reductase in the antioxidant defenses of human sperm. Biol. Reprod.

71: 1309-1316, 2004

Wilson, D.O.; Johnson, P. Exercise modulates antioxidant enzyme gene expression in rat

myocardium and liver. J. Appl. Physiol. 88: 1791-1796, 2000.

Wroblewska, B.; Wroblewski, J.T.; Pshenichkin, S.; Surin, A.; Sullivan, S.E.; Neale, J.H.

N-acetylaspartylglutamate selectively activates mGluR3 receptors in transfected cells.

J. Neurochem. 69: 174-181, 1997.

Wyse, A.T.S.; Bavaresco, C.S.; Kienzle-Hagen, M.E.; Delwing, D.; Wannmacher, C.M.D.;

Dutra-Filho, C.S.; Wajner, M. In vitro stimulation of oxidative stress in cerebral

218

cortex of rats by the guanidino compounds accumulating in hyperargininemia. Brain

Res. 923: 50-57, 2001.

Yan, H.D.; Ishihara, K.; Serikawa, T.; Sassa, M. Activation by N-acetyl-L-aspartate of

acutely dissociated hippocampal neurons in rats via metabotropic glutamate receptors.

Epilepsia 44: 1153-1159, 2003.

Yang, M.S.; Chan, H.W.; Yu, L.C. Glutathione peroxidase and glutathione reductase

activities are partially responsible for determining the susceptibility of cells to oxidative

stress. Toxicology 226: 126-130, 2006.

Yoo, H.Y.; Chang, M.S.; Rho, H.M. The activation of the rat cooper/zinc superoxide

dismutase gene by hydrogen peroxide through the hydrogen peroxide responsive

element and by paraquat and heat shock through the same heat shock element. J. Biol.

Chem. 274: 23887-23892, 1999.

Zelko, I.N.; Mariani, T.J.; Folz, R.J. Superoxide dismutase multigene family: a comparison

of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures,

evolution and expression. Free Radic. Biol. Med. 33: 337-349, 2002.

Zhang, X.Y.; Zhou, D.F.; Cao, L.Y.; Xu, C.Q.; Chen, D.C., Wu G.Y. The effect of vitamin

E treatment on tardive dyskinesia and blood superoxide dismutase: a double-blind

placebo-controlled trial. J. Clin. Psychopharmacol. 24: 83-86, 2004.

Zhao, J.; Ramadan, E.; Cappiello, M.; Wroblewska, B.; Bzdega, T.; Neale, J.H. NAAG

inhibits KCl-induced [

H]-GABA release via mGluR3, cAMP, PKA and L-type

calcium conductance. Eur. J. Neurosci. 13: 340-346, 2001.

219

ANEXOS

220

Lista de Figuras

Figura 1. Ciclo γ-glutamil. Enzimas envolvidas:  = γ-glutamilcisteína sintetase;  =

glutationa sintetase;  = γ-glutamil transpeptidase;  = γ-glutamil ciclotransferase;  = 5-

oxoprolinase;  = dipeptidase. ..............................................................................................5

Figura 2. Síntese e degradação do ácido N-acetilaspártico. ................................................11

Figura 3. Redução tetravalente do oxigênio molecular (O

) na mitocôndria até a formação

de água. ................................................................................................................................18

221

Lista de Tabelas

Tabela I. Efeito in vitro do ácido N-acetilaspartilglutâmico (NAAG) sobre parâmetros

gerais de estresse oxidativo: potencial antioxidante total (TRAP), quimiluminescência

espontânea, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e conteúdo de

carbonilas em córtex cerebral de ratos de 14 dias de vida. ................................................156

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 