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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
AVALIAÇÃO DE UM MODULADOR A AR COMPRIMIDO
PARA GC×GC E SUA APLICAÇÃO PARA
DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS
PIRETRÓIDES EM UVA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Caroline do Amaral Friggi
Santa Maria, RS, Brasil
2008
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ii
AVALIAÇÃO DE UM MODULADOR A AR COMPRIMIDO PARA
GC×GC E SUA APLICAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DE
RESÍDUOS DE PESTICIDAS PIRETRÓIDES EM UVA
por
Caroline do Amaral Friggi
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Química, Área de Concentração em Química Analítica, da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito
parcial para obtenção do grau de MESTRE EM QUÍMICA
Orientador: Renato Zanella
Santa Maria, RS, Brasil
2008
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iii
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Química
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a
Dissertação de Mestrado
AVALIAÇÃO DE UM MODULADOR A AR COMPRIMIDO PARA
GC×GC E SUA APLICAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DE
RESÍDUOS DE PESTICIDAS PIRETRÓIDES EM UVA
elaborada por
Caroline do Amaral Friggi
como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química
Comissão Examinadora
__________________________________________
Prof. Dr. Renato Zanella – Orientador
Universidade Federal de Santa Maria
___________________________________________
Prof. Dra. Carin von Mühlen
Centro Universitário FEEVALE
___________________________________________
Profa. Dra. Martha Bohrer Adaime
Universidade Federal de Santa Maria
Santa Maria, 22 de fevereiro de 2008
iv
Aos meus pais, Zuleina e Vilson, que com
tanto amor e carinho me conduziram pelos
caminhos da vida, vocês que sempre me
apoiaram nos momentos mais difíceis e
principalmente me incentivaram a lutar pelos
meus sonhos, muito obrigada será sempre muito
pouco para demonstrar a minha eterna gratidão.
Amo vocês!
Ao meu filho Matheus, que suportou a
saudade enquanto estive longe para a realização
deste trabalho, a você que enche a minha vida
de orgulho e satisfação, o meu carinho e amor
eterno. Te amo muito!
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Renato Zanella pela amizade, apoio e incentivo, por todas as
oportunidades que me foram proporcionadas dentro do grupo, meu muito obrigada
por tudo.
A Prof. Dr
a
. Martha Bohrer Adaime que apesar de exercer um cargo de grande
responsabilidade como diretora do CCNE, bem como todas as suas outras
atividades dentro do departamento de Química, sempre se mostrou uma pessoa
acessível e disposta a ajudar. Agradeço também ao teu carinho e amizade. A ti,
minha eterna admiração.
À Prof. Dr
a
. Carin von Mühlen pela sua valiosa participação tanto no exame de
qualificação como na defesa da dissertação, suas sugestões e questionamentos.
Ao Prof. Dr. René Vreuls da Free University (Amsterdã/Holanda) pela orientação,
acolhida em seu grupo de pesquisa e ensinamentos que foram essenciais para a
realização deste estudo.
Aos meus grandes amigos Márcia e Fábio que sempre se dispuseram a me ensinar
e ajudar. Agradeço a amizade, carinho e incentivo por todos esses anos de
convivência, que não foram muitos, mas que com certeza foram intensos. A vocês
minha admiração e carinho.
Aos meus colegas do LARP, especialmente aos também amigos Osmar e Samile,
com quem convivi por muito tempo, pela amizade, companheirismo e parceria para a
realização deste trabalho.
vi
A secretária do LARP, Márcia Botega, pela competência, amizade, conselhos e
companheirismo. Saiba que você torna o nosso ambiente de trabalho sempre mais
alegre e divertido.
A secretaria do CCNE, Sandra Botega, pela amizade, conselhos e companhia
sempre prazerosa desde o tempo da graduação.
À minha grande amiga, Ana Paula Lima, por me escutar e aconselhar, por estar
sempre ao meu lado nos momentos mais difíceis e também nos mais felizes.
Obrigada pelo carinho e amizade por todos estes anos.
Aos meus irmãos, Daniela e Marcos, pelo carinho, incentivo, torcida e ajuda que
vocês sempre me deram.
À UFSM pela oportunidade, principalmente pelo ensino gratuito e de qualidade.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Química da UFSM pela
contribuição na minha formação.
Aos funcionários do PPGQ, Ademir e Valéria, por sempre me recepcionarem bem e
resolverem qualquer problema com agilidade e competência.
Agradeço à Deus, por ter iluminado sempre o meu caminho, por me conceder
saúde, paz e sabedoria para vencer mais esta etapa.
vii
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Química
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
AVALIAÇÃO DE UM MODULADOR A AR COMPRIMIDO PARA GC×GC E SUA
APLICAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS
PIRETRÓIDES EM UVA
AUTOR: CAROLINE DO AMARAL FRIGGI
ORIENTADOR: PROF. DR. RENATO ZANELLA
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 22 de fevereiro de 2008
Neste trabalho foi desenvolvido um novo modulador, simples, robusto e de
baixo custo de operação. Este modulador utiliza ar comprimido para resfriar duas
pequenas porções da segunda coluna cromatográfica de um sistema GC×GC.
Para avaliar o processo de modulação utilizaram-se soluções de alcanos C
7
a C
29
e pesticidas (bifentrina, ciflutrina, cipermetrina, esfenvalerato, fenitrotiona, fipronil,
trifloxistrobina e trifluralina) e análise por GC×GC-FID. Os resultados mostraram
pequenas variações das áreas dos picos, entre 0,67 e 2,80% para alcanos e entre
0,24 e 5,34% para pesticidas. O desvio padrão (SD) para o tempo de retenção na
primeira coluna (
1
t
R
) de alcanos e pesticidas foi em torno de 0,05 min. Para o
tempo de retenção na segunda coluna (
2
t
R
), o SD foi de 0,04 s para a maioria dos
compostos, exceto para ciflutrina e permetrina (0,08 s). A faixa linear situou-se
entre 0,1 e 5,0 mg L
-1
com coeficiente de determinação (r
2
) maior que 0,9945 para
os pesticidas analisados por GC×GC-FID. O sistema GC×GC proposto foi
aplicado na determinação de pesticidas piretróides (bifentrina, cipermetrina,
deltametrina, fenvalerato e esfenvalerato, e permetrina cis e trans) em amostras
de uva cultivar Itália fortificadas em 3 níveis (0,02; 0,05 e 0,5 mg kg
-1
). As
amostras foram extraídas pelo método de mini-Luke modificado (método da
acetona) e os pesticidas quantificados por GC×GC-µECD. Os parâmetros
avaliados de validação do método foram: curva analítica, linearidade, limite de
detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), precisão (em termos de
repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação), bem como o
efeito matriz na resposta cromatográfica. Todas as curvas analíticas
apresentaram faixa linear entre 0,02 e 0,5 mg L
-1
com valores de r
2
maiores que
0,9956 e 0,9994 para as curvas preparadas em solvente (acetato de etila) e
extrato da matriz (uva), respectivamente. A partir dos resultados obtidos através
do cálculo do efeito matriz percentual concluiu-se que os pesticidas piretróides
avaliados apresentaram considerável efeito matriz negativo. Os valores de LOQ
do método foram de 0,01 a 0,02 mg kg
-1
para todos os piretróides. A recuperação
para os 3 níveis de fortificação ficou entre 94,3 e 115,2%, com boa precisão
(RSD<18,4%), o que mostrou que o desempenho do método mini-Luke
modificado empregado para as extrações é satisfatório. Este estudo mostrou
também, que o sistema GC×GC-µECD com modulador de duplo jato de ar
comprimido tem potencial para aplicação nas análises de resíduos de pesticidas
piretróides em uva, uma vez que fornece baixos valores de LOD e LOQ, e boa
precisão da resposta analítica.
Palavras Chave: GC×GC; moduladores; pesticidas; frutas
viii
ABSTRACT
Master Dissertation
Post-Graduate Program in Chemistry
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
EVALUATION OF A COMPRESSED AIR MODULATOR FOR GC×GC AND
APPLICATION TO DETERMINATION OF PYRETHROID PESTICIDES
RESIDUES IN GRAPE
AUTHOR: CAROLINE DO AMARAL FRIGGI
ADVISOR: PROF. DR. RENATO ZANELLA
Santa Maria, February, 2008
In this study, a new modulator that is simple, robust and presents low
operation costs was developed. This modulator uses compressed air to cool two
small portions of the second chromatographic column of a GC×GC system. To
evaluate the modulation process, solutions of alkanes C
7
to C
29
, and pesticides
(bifenthrin, cyfluthrin, cypermethrin, esfenvalerate, fenitrotion, fipronil,
trifloxystrobin and trifluralin) were analyzed by GC×GC-FID. The results showed
small variations of the peaks areas, between 0.67 and 2.80% for alkanes and
between 0.24 and 5.34% for pesticides. The standard deviation (SD) for the
retention time in the first column (
1
t
R
) was around 0.05 min, for alkanes and
pesticides. For retention times in the second column (
2
t
R
), the SD was 0.04 s for
the majority of the compounds, except for cyfluthrin and permethrin (0.08 s). The
linear range was between 0.1 and 5.0 mg L
-1
with a coefficient of determination (r
2
)
greater than 0.9945 for pesticides analyzed by GC×GC-FID. The GC×GC system
proposed was applied in the determination of pyrethroid pesticides (bifenthrin,
cypermethrin, deltamethrin, fenvalerate and esfenvalerate and permethrin cis and
trans) in grape samples Italy cultivar spiked at 3 levels (0.02, 0.05 and 0.5 mg kg
-
1
). Samples were extracted by the mini-Luke modified method (acetone method)
and pesticides were quantified by GC×GC-µECD. The parameters evaluated in
the validation of the method were: analytical curve, linearity, limit of detection
(LOD), limit of quantification (LOQ), precision (in terms of repetitivity and
intermediate precision) and accuracy (recovery), as well as the matrix effect on the
chromatographic response. All analytical curves showed a linear range between
0.02 and 0.5 mg L
-1
with r
2
greater than 0.9956 and 0.9994 for the curves prepared
in solvent (ethyl acetate) and matrix extract (grape), respectively. From the results
obtained by calculation of the matrix effect percentage it can be concluded that the
pyrethroid pesticides showed a considerable negative matrix effect. The values of
method LOQ were 0.01 to 0.02 mg kg
-1
for all pyrethroids. The values of recovery
for the 3 spiked levels were between 94.3 and 115.2%, with good precision
(RSD<18.4%), demonstrating that the performance of the mini-Luke modified
method employed for the extractions is satisfactory. This study also showed that
the GC×GC-µECD system using a modulator with a double jet of compressed air
has potential for application in the analysis of pyrethroid pesticide residues in
grapes, since it supplies low values of LOD and LOQ, and good accuracy in the
analytical response.
Keywords: GC×GC; modulators; pesticides; fruits
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema geral de um sistema GC×GC, adaptado de
ADAHCHOUR (2006)....................................................................
5
Figura 2.
Esquema geral do modulador por varredura térmica (Sweeper)..
10
Figura 3. Esquema geral de um Sistema Criogênico Longitudinalmente
Modulado (LMCS).........................................................................
11
Figura 4. Esquema geral de um modulador com duplo jato de CO
2
...........
12
Figura 5. Geração e interpretação dos dados em GC×GC: (A)
Cromatograma linear mono-dimensional, (B) separação do
cromatograma inicial em segmentos, (C) alinhamento dos
cromatogramas lado a lado gerando uma matriz de dados (D)
transformação da matriz de dados em imagem (gráfico
bidimensional), adaptado de GÓRECKI et al.
(2006)............................................................................................
17
Figura 6. Diferentes representações para o espaço de separação de uma
análise realizada por GC×GC para uma amostra de Eucalyptus
dunnii, onde: A) diagrama de contorno, B) diagrama de cores,
C) diagrama de bolhas e D) diagrama de ápices, adaptado de
MÜHLEN et al. (2007a).................................................................
19
Figura 7. Fórmulas estruturais dos pesticidas selecionados para
determinação em uva....................................................................
25
Figura 8. Diagrama demonstrando a forma de estabelecimento dos
valores de LOD e LOQ..................................................................
33
x
Figura 9. Materiais utilizados para a execução do método de extração
mini-Luke modificado A) homogeneizador ultraturrax, B) frascos
dos solventes utilizados com dispensadores, C) banho
termostatizado de água e D) interior da centrífuga.......................
49
Figura 10. Representação esquemática do método de análise de resíduos
de pesticidas em uva, utilizando o método de extração mini-
Luke modificado............................................................................
50
Figura 11. Esquema do modulador a ar comprimido para GC×GC: A)
modulador com duplo jato ar comprimido original e B)
modulador com duplo jato de ar comprimido modificado..............
53
Figura 12. Representação do modulador com duplo jato de ar comprimido
modificado.....................................................................................
54
Figura 13. Sistema GC×GC utilizado: A) controle do modulador, B)
modulador (visualização da parte superior do forno) e C)
modulador (visualização da parte interior do forno)......................
55
Figura 14. Três frações de cromatogramas lineares obtidos por GC×GC-
FID com modulador a ar comprimido a partir de soluções
padrões de alcanos: A) modulação insatisfatória, B) modulação
aceitável e C) modulação perfeita.................................................
56
Figura 15. Cromatograma linear obtido por GC×GC-FID a partir de uma
solução contendo 18 alcanos. As condições cromatográficas
estão descritas no item 3.1............................................................
57
Figura 16. Visualização dos diagramas: A) de ápices e B) de cores obtidos
por GC×GC-FID a partir de uma solução padrão da mistura de
alcanos e pesticidas (Tabela 5) preparada em solvente orgânico
(metanol).......................................................................................
61
Figura 17. Cromatograma do “branco” dos solventes e reagentes obtido
por GC×GC-µECD nas condições descritas no item
3.2..................................................................................................
63
Figura 18. Cromatograma obtido por GC×GC-µECD para o extrato
“branco” da uva.............................................................................
68
xi
Figura 19. Cromatograma de uma solução analítica na concentração de
0,05 mg L
-1
dos pesticidas analisados por GC×GC-
µECD
preparados em A) solvente orgânico (acetato de etila), B) no
extrato da uva; e C) extrato “branco da matriz” fortificado com os
pesticidas piretróides ao nível de 0,05 mg kg
-1
(identificação de
acordo com a Tabela 7).................................................................
69
Figura 20. Diagrama de cores de uma solução analítica na concentração
de 0,05 mg L
-1
dos pesticidas analisados por GC×GC-µECD
preparados em A) solvente orgânico (acetato de etila), B) no
extrato da uva; e C) extrato “branco da matriz” fortificado com os
pesticidas piretróides ao nível de 0,05 mg kg
-1
(identificação de
acordo com a Tabela 7).................................................................
70
Figura 21. Curva analítica do pesticida bifentrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas
condições cromatográficas descritas no item 3.2..........................
71
Figura 22. Curva analítica do pesticida cipermetrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas
condições cromatográficas descritas no item 3.2..........................
72
Figura 23. Curva analítica do pesticida deltametrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas
condições cromatográficas descritas no item 3.2..........................
72
Figura 24. Curva analítica do pesticida fenvalerato preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas
condições cromatográficas descritas no item 3.2..........................
73
Figura 25. Curva analítica do pesticida permetrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas
condições cromatográficas descritas no item 3.2..........................
73
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação dos pesticidas quanto à toxicidade.........................
22
Tabela 2. Pesticidas analisados e Limites Máximos de Resíduos (MRL).....
26
Tabela 3. Pesticidas analisados por GC×GC-FID.........................................
42
Tabela 4. Pesticidas analisados por GC×GC-µECD.....................................
43
Tabela 5. Parâmetros usados para avaliar o desempenho do modulador
com ar comprimido para alcanos e pesticidas..............................
59
Tabela 6. Equação da reta, coeficiente de determinação (r
2
) e faixa linear
para os pesticidas selecionados e analisados por GC×GC-FID...
60
Tabela 7. Pesticidas analisados por GC×GC-µECD, tempos de retenção
na primeira e na segunda coluna..................................................
62
Tabela 8. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas em
acetato de etila..............................................................................
64
Tabela 9. Resultados para as curvas analíticas dos pesticidas no extrato
da matriz........................................................................................
65
Tabela 10. Valores de LOD e LOQ para os pesticidas...................................
66
Tabela 11. Recuperação, RSD
r
, RSD
pi
do método para os pesticidas...........
67
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µECD – micro Detector por Captura de Elétrons, do inglês micro-Electron Capture
Detector
1D-GC – Cromatografia Gasosa Monodimensional, do inglês one-Dimensional
Gas Chromatography
1
t
R
– tempo de retenção na primeira dimensão
2
t
R
– tempo de retenção na segunda dimensão
ACAS – Analytical Chemistry & Applied Sciences
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC – Association of Official Analytical Chemists
CCPR – Comitê do Codex Alimentarius sobre resíduos de pesticidas, do inglês
Codex Alimentarius Commitee on Pesticide Residues
DL50 – Dose letal mediana
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAO – Organização do Alimento e Agricultura, do inglês Food and Agriculture
Organization
FID – Detector por Ionização de Chama, do inglês Flame Ionization Detector
GC – Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography
GC×GC-µECD – Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada ao
micro Detector por Captura de Elétrons
GC×GC-FID – Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada a
Detector por Ionização de Chama
GC×GC-TOFMS – Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente acoplada ao
Detector de Espectrometria de Massas por Tempo de Vôo
xiv
GC-GC – Cromatografia Gasosa Bidimensional
GC-MS – Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas, do inglês
Gas Chromatography Mass Spectrometry
GPC – Cromatografia por Permeação em Gel, do inglês Gel Permeation
Chromatography
IDA – Ingestão Diária Aceitável
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia
ISO – International Standardization Organization
IUPAC – International Union of Pure Applied Chemistry
JMPR – Joint Meeting on Pesticide Residue
LC-GC – Cromatografia Líquida acoplada com Cromatografia Gasosa
LC-MS – Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas, do inglês
Liquid Chromatography Mass Spectrometer
LLE – Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction
LMCS – Sistema Criogênico Longitudinalmente Modulado, do inglês
Longitudinally Modulated Cryogenic System
LOD – Limite de Detecção, do inglês Limit of Detection
LOQ – Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification
LOQ
m
– Limite de Quantificação do Método
MAE – Extração Assistida por Microondas, do inglês Microwave-Assisted
Extraction
MRL – Limite máximo de resíduo, do inglês Maximun Residue Limit
MS – Espectrometria de Massas, do inglês Mass Spectrometry
MSPD – Dispersão da Matriz em Fase Sólida, do inglês Matrix Solid-Phase
Dispersion
N – número de medidas
NPD – Detector de Nitrogênio e Fósforo, do inglês Nitrogen and Phosphorus
Detector
PIONA – parafinas, isoparafinas, olefinas, naftalenos e hidrocarbonetos
aromáticos
PLE – Extração por Líquido Pressurizado, do inglês Pressurised Liquid Extraction
P
M
– Período de modulação, do inglês Modulation Time ou Modulation Period
PSA – Amina primária secundária, do inglês Primary Secondary Amine
xv
PTFE – Politetrafluretileno - Teflon
QuEChERS – Rápido, fácil, econômico, robusto e seguro, do inglês Quick, Easy
Cheap, Rugged and Safe
r – coeficiente de correlação
r
2
– coeficiente de determinação
RSD – Desvio padrão relativo, do inglês Relative Standard Deviation
RSD
pi
– Desvio Padrão Relativo para Precisão Intermediária
RSD
r
– Desvio Padrão Relativo para Repetitividade
s – estimativa de desvio padrão absoluto
SBSE – Extração Sortiva em Barra de Agitação, do inglês Stir-Bar Sorptive
Extraction
SD – desvio padrão, do inglês Standard Desviation
SFE – Extração por Fluído Supercrítico, do inglês Supercritical Fluid Extraction
SPE – Extração em Fase Sólida, do inglês Solid-Phase Extraction
SPME – Microextração em Fase Sólida, do inglês Solid-Phase Micro-Extraction
TOFMS – Detector de espectrometria de massas por tempo de vôo, do inglês
time-of-flight mass spectrometer
USEPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, do inglês United
States Environmental Protection Agency
VWA – Ministério da agricultura na Holanda, Food and Product Safety Authority
x
i
– valores individuais
x
m
– média das medidas em replicatas
∆t – intervalo de tempo
xvi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................
3
2.1 Princípios da técnica GC×GC.......................................................
5
2.1.1 Colunas para GC×GC...................................................................
7
2.1.2 Moduladores para GC×GC...........................................................
9
2.1.3 Detectores freqüentemente usados para GC×GC........................
14
2.1.4 Geração e visualização dos cromatogramas em GC×GC............
15
2.2 Pesticidas.......................................................................................
19
2.2.1 Pesticidas piretróides selecionados para determinação em uva..
23
2.3 Preparo de amostra para análises de resíduos de pesticidas..
26
2.3.1 Métodos de extração para análises de resíduos de pesticidas....
27
2.3.1.1 Método de extração Luke.......................................................... 28
2.3.1.2 Método de acetato de etila.........................................................
29
2.3.1.3 Método QuEChERS...................................................................
29
2.4 Validação de métodos cromatográficos para a determinação
de pesticidas em uva............................................................................
30
2.4.1 Curva analítica e linearidade........................................................ 31
2.4.2 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ).......... 32
2.4.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)........................
34
2.4.4 Exatidão........................................................................................
35
2.4.5 Efeito matriz..................................................................................
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................
38
xvii
3.1 Instrumentação utilizada na avaliação do novo modulador e
condições instrumentais empregadas para as análises realizadas
por GC×GC-FID.....................................................................................
38
3.2 Instrumentação utilizada para aplicação do modulador
desenvolvido na validação de método analítico e condições
instrumentais empregadas para as análises por GC×GC-
µECD......................................................................................................
39
3.3 Equipamentos................................................................................
40
3.4 Gases..............................................................................................
41
3.5 Reagentes, Solventes e Materiais................................................
41
3.6 Pesticidas selecionados............................................................... 42
3.7 Preparo das soluções analíticas .................................................
43
3.7.1 Soluções analíticas utilizadas na avaliação do novo modulador..
43
3.7.2 Soluções analíticas utilizadas para aplicação do modulador na
validação de método analítico................................................................
44
3.8 Análise dos solventes e reagentes pelo método de extração
mini-Luke modificado...........................................................................
45
3.9 Validação do método de extração mini-Luke modificado para
análise de resíduos de pesticidas em uva.........................................
46
3.9.1 Determinação da linearidade das curvas analíticas..................... 46
3.9.2 Limite de detecção e limite de quantificação................................
46
3.9.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)........................
47
3.9.4 Ensaios de fortificação e extração empregando o método mini-
Luke modificado para avaliação da recuperação...................................
47
3.9.5 Avaliação do efeito matriz dos extratos de uva analisados por
GC×GC-µECD........................................................................................
51
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES......................................................
52
4.1 Desenvolvimento de um novo modulador fixo a ar e
avaliação do processo de modulação utilizando alcanos e
pesticidas e análise por GC×GC-FID..................................................
52
4.1.1 Design de um novo modulador usando ar comprimido para
GC×GC- FID...........................................................................................
52
4.1.2 Desempenho da modulação.........................................................
55
xviii
4.1.3 Análise de pesticidas por GC×GC-FID utilizando o modulador
com ar.....................................................................................................
60
4.2 Aplicação do modulador a ar comprimido na avaliação do
método mini-Luke modificado para extração de pesticidas
fortificados em uva e análise por GC×GC-µECD...............................
62
4.2.1 Análise dos solventes e reagentes pelo método de extração
mini-Luke modificado..............................................................................
63
4.2.2 Validação do método de extração mini-Luke modificado para
análise de resíduos de pesticidas em uva..............................................
63
4.2.1.1 Linearidade das curvas analíticas..............................................
64
4.2.2.2 Limite de detecção e limite de quantificação.............................
66
4.2.2.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária).....................
66
4.2.2.4 Ensaios de fortificação e extração empregando o método
mini-Luke modificado para avaliação da recuperação............................
67
4.2.2.5 Efeito matriz dos extratos de uva nas análises por GC×GC-
µECD......................................................................................................
71
5. CONCLUSÃO....................................................................................
75
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.................................... 77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................
78
1
1. INTRODUÇÃO
Após a sua introdução, em 1991, a Cromatografia Gasosa Bidimensional
Abrangente (GC×GC, do inglês Comprehensive two-Dimensional Gas
Chromatography) tornou-se uma das ferramentas analíticas mais poderosas para
a análise de misturas complexas. Esta técnica é baseada no acoplamento, em
série, de duas colunas cromatográficas com diferentes fases estacionárias. Desta
forma, os compostos são submetidos a dois mecanismos independentes de
separação, sendo estes transferidos da primeira para a segunda coluna através
de uma interface, denominada modulador.
O modulador possui três funções principais: (a) acumular pequenas frações
do efluente da primeira coluna enquanto procede normalmente a separação na
primeira dimensão, (b) focalizar as frações acumuladas no tempo ou no espaço e
(c) liberar as frações acumuladas na forma de pulsos estreitos para a segunda
dimensão (DALLÜGE et al., 2003). Os moduladores tipicamente usados em
GC×GC podem ser classificados dentro de duas categorias principais: baseados
em válvulas ou térmicos (HARYNUK & GÓRECKI, 2003).
Com moduladores baseados em válvulas, apenas uma pequena porção do
efluente é transferido da primeira para a segunda coluna. Devido ao fato de uma
grande parte da amostra original não ser transferida para a segunda coluna, há
pouco ou nenhum aumento do sinal, o que torna estes moduladores menos
atrativos para a análise de traços (HARYNUK & GÓRECKI, 2003).
Tradicionalmente os moduladores térmicos utilizam um segmento de um
capilar de filme espesso, ou resfriamento criogênico, para acumular os analitos. A
principal vantagem destes moduladores é que toda a amostra é submetida a uma
segunda separação, resultando em um aumento do sinal, o que torna estes
moduladores compatíveis com a análise de traços (HARYNUK & GÓRECKI,
2003).
Mesmo a GC×GC sendo uma técnica poderosa de separação, a sua
aplicação em análises de rotina tem um alto custo devido ao uso de moduladores
criogênicos. A utilização de CO
2
ou N
2
para modular os compostos eleva o custo
da análise.
2
Os pesticidas são utilizados na agricultura para prevenir e controlar pragas
e doenças, aumentando de forma inquestionável a produção agrícola. Entretanto,
o uso indiscriminado destas substâncias apresenta riscos à saúde humana e ao
meio ambiente.
Considerando a necessidade de reduzir o custo das análises de rotina de
resíduos de pesticidas e a importância de monitorar os níveis de resíduos de
pesticidas para que estes não proporcionem danos ao homem e ao meio
ambiente, este trabalho tem como objetivo geral o desenvolvimento de um novo
modulador fixo a ar comprimido e sua aplicação para determinação de pesticidas
em uva empregando um sistema GC×GC-µECD. Os objetivos específicos do
trabalho são: (i) desenvolver um modulador fixo a ar e avaliar o processo de
modulação utilizando alcanos e pesticidas em um sistema GC×GC-FID e (ii)
otimizar e validar um método de extração utilizando o método de extração mini-
Luke modificado e análise por GC×GC-µECD dos pesticidas piretróides bifentrina,
cipermetrina, deltametrina, fenvalerato e esfenvalerato, e permetrina cis e trans
em uva.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Desde a sua descoberta, a cromatografia evoluiu como uma ferramenta
essencial para a separação de diversos compostos em diferentes amostras.
Entretanto, apesar do alto poder de separação das modernas técnicas
cromatográficas convencionais, em uma dimensão, algumas amostras são
simplesmente muito complexas para serem analisadas de forma eficaz por estas
técnicas (GÓRECKI et al., 2006).
Exemplos de análises de misturas complexas podem ser encontrados em
diferentes áreas como, por exemplo, na indústria petroquímica (onde a
caracterização apropriada de frações diferentes produtos do petróleo é da maior
importância), no setor forense, na indústria de alimentos e etc., onde uma análise
mais sensível e mais seletiva a nível de traço dos analitos alvo é exigida
juntamente com a habilidade de caracterizar inteiramente amostras
desconhecidas (GÓRECKI et al., 2006).
Em todos os exemplos citados acima, é praticamente impossível conseguir
uma separação completa de todos os componentes da amostra com apenas um
mecanismo de separação e, isto foi o que motivou e impulsionou o
desenvolvimento de técnicas cromatográficas multidimensionais (GÓRECKI et al.,
2006). Em trabalho publicado em 1984, GIDDINGS descreveu e introduziu
definições fundamentais e critérios para as técnicas de separação
multidimensionais. Desde então, estas técnicas são usadas em muitas áreas da
ciência da separação (GIDDINGS, 1990).
Análises multidimensionais em cromatografia podem ser consideradas
como qualquer técnica que combine duas ou mais separações distintas, ou
etapas analíticas, onde pelo menos uma das etapas envolva uma separação
cromatográfica. Sendo assim, Cromatografia Líquida acoplada com Cromatografia
Gasosa (LC-GC), Cromatografia Gasosa Bidimensional (GC-GC) e Cromatografia
Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS) são técnicas tipicamente
multidimensionais (SHOENMAKERS et al., 2003).
Como exemplo em cromatografia gasosa, as separações multidimensionais
tiveram inicialmente como base as técnicas de GC-GC do tipo heart-cut, onde
4
pequenas frações do efluente da primeira coluna são transferidas para uma
segunda coluna, desta forma, a seletividade diferenciada desta segunda coluna
fornece um aumento da resolução dos picos cromatográficos gerados
(BERTSCH, 1990). Entretanto, um aumento significativo no tempo de análise (em
torno de algumas horas) é observado (GEUS et al., 1996).
Mesmo com o desenvolvimento dos mais modernos detectores, tais como
o Detector de Espectrometria de Massas por Tempo de Vôo (TOFMS, do inglês
Time-of-Flight Mass Spectrometer), a identificação de compostos em misturas
muito complexas permaneceu freqüentemente insatisfatória. Conseqüentemente,
a chave para melhorar o poder de separação e de identificação deveria ser
encontrado na multidimensionalidade da separação cromatográfica (GÓRECKI et
al., 2006).
Como alternativa para resolver os problemas descritos acima foi
introduzida por LIU & PHILLIPS (1991) a técnica de Cromatografia Gasosa
Bidimensional Abrangente (GC×GC, do inglês Comprehensive two-Dimensional
Gas Chromatography).
O termo abrangente está relacionado a critérios, tais como, toda a amostra
deve ser submetida a mecanismos independentes de separação, os quais devem
ser realizados em colunas com fases estacionárias diferentes, onde todos os
compostos separados na primeira coluna são transferidos para a segunda coluna
(SHOENMAKERS et al., 2003).
Segundo GIDDINGS (1984), para abreviar o termo bidimensional
abrangente, deve-se usar um sinal de multiplicação “×”, denotando a
ortogonalidade entre os mecanismos de separação, e desta maneira, deixando
clara a diferença entre GC×GC e as técnicas do tipo heart-cut, onde o hífen é
utilizado (GC-GC, LC-GC).
A ortogonalidade em GC×GC está relacionada com a utilização de colunas
com fases estacionárias diferentes, as quais proporcionam mecanismos
independentes de separação na primeira e na segunda dimensão, conforme será
discutido no item 2.1.1. As separações ortogonais realizadas em GC×GC não
necessariamente resultam na resolução ótima da amostra, entretanto, esse tipo
de separação proporciona as melhores condições para a utilização máxima do
espaço de separação (separation space) que é a região no gráfico bidimensional
5
de cromatografia multidimensional abrangente onde os compostos são
distribuídos (MÜHLEN et al., 2007a; RYAN et al., 2005).
A GC×GC é uma técnica relativamente nova, capaz de separar os
compostos de interesse de outros e, mais importante, do background da matriz.
Com a introdução desta técnica há aproximadamente 15 anos atrás, tornou-se
possível a separação e a identificação de muitos compostos em amostras
complexas (ADAHCHOUR et al., 2003; DALLÜGE et al., 2003; SHELLIE et al.,
2001).
2.1 Princípios da técnica GC×GC
A técnica GC×GC é caracterizada pela utilização de duas colunas
cromatográficas acopladas em série, contendo fases estacionárias diferentes,
sendo uma de tamanho convencional e outra curta (do tipo de coluna usada para
fast-GC), de forma que todo efluente da primeira coluna ou uma parte
representativa do mesmo é conduzido para a segunda coluna através de um
modulador, conforme ilustrado na Figura 1 (MÜHLEN et al., 2006).
Figura 1. Esquema geral de um sistema GC×GC, adaptado de ADAHCHOUR
(2006)
6
O sistema modulação entre as duas colunas causa uma compressão da
banda cromatográfica que elui da primeira coluna e esta é direcionada para a
coluna curta, de forma que a separação na segunda coluna é extremamente
rápida (MÜHLEN et al., 2006).
Os períodos de modulação devem ser ajustados a fim de que sejam
compatíveis com o tempo de separação na segunda coluna, minimizando o
alargamento da banda comprimida (MÜHLEN et al., 2006). Desta forma, a
sensibilidade é significativamente incrementada (relação sinal/ruído 10 vezes
maior) e a resolução aumenta de forma expressiva, se comparada à técnica de
cromatografia gasosa monodimensional (1D-GC, do inglês one-Dimensional Gas
Chromatography) (DALLÜGE et al., 2003; MARRIOT & SHELLIE, 2002; MÜHLEN
et al., 2006). Uma discussão mais detalhada sobre os moduladores será
apresentada no item 2.1.2.
Em GC×GC, a eficiência da separação cromatográfica é
desfavoravelmente afetada e a estrutura ordenada é perdida quando picos de
diferentes ciclos de modulação co-eluem (DALLÜGE et al., 2003). Portanto, as
condições experimentais são geralmente ajustadas de tal maneira que, o período
de modulação (P
M
, do inglês Modulation Time or Modulation Period) que
corresponde à duração de um ciclo completo de modulação, o qual é igual ao
tempo entre duas injeções sucessivas na segunda dimensão, seja maior do que o
tempo de retenção dos compostos mais fortemente retidos na segunda dimensão
(P
M
>
2
t
R
) (DALLÜGE et al., 2003; SHOENMAKERS et al., 2003). Caso contrário,
quando P
M
<
2
t
R
, analitos não eluiriam em seu próprio ciclo de modulação, o que
causaria o denominado pico fora do ciclo (wrap-around) (DALLÜGE et al., 2003;
MÜHLEN et al., 2007a).
A combinação de duas colunas cromatográficas com mecanismo de
separação ortogonal entre si é o que leva a um significativo aumento da
seletividade em GC×GC (MÜHLEN et al., 2006). Tais características tornaram
esta técnica extremamente útil para análise de amostras complexas, ou amostras
que apresentam outras características que limitam sua caracterização por 1D-GC,
como no caso das separações enantioméricas (DALLÜGE et al., 2003; MARRIOT
& SHELLIE, 2002).
7
Os picos modulados que eluem da coluna da segunda dimensão em
GC×GC são cerca de 10 a 50 vezes mais estreitos do que os picos obtidos por
1D-GC, conseqüentemente, faz se necessário o uso de detectores com aquisição
rápida de dados, conforme será discutido no item 2.1.3.
Outra característica específica em GC×GC é o processamento dos dados.
A determinação das áreas dos analitos não é direta como em 1D-GC, pois devido
ao processo de modulação, cada pico obtido em 1D-GC é segmentado em várias
partes. Desta forma, a interpretação dos cromatogramas complexos gerados
requer um tratamento de dados mais sofisticado do que o convencionalmente
usado. O tratamento dos dados é realizado por meio de softwares específicos
para esta técnica, os quais convertem os cromatogramas complexos gerados em
diagramas, sendo que estes serão abordados no item 2.1.4.
A quantificação em GC×GC é de fato muito similar a 1D-GC, pois os
cromatogramas em GC×GC são gerados a partir de um cromatograma linear.
Devido a este fator podemos calcular a soma das área dos picos modulados,
sendo esta uma tarefa extremamente morosa, entretanto, atualmente, pacotes
comerciais de softwares têm sido desenvolvidos e disponibilizados.
Uma das vantagens mais importantes em GC×GC é a natureza dos
cromatogramas obtidos por este sistema, onde cada analito é identificado por no
mínimo dois tempos de retenção, o que torna esta técnica mais confiável quando
comparada a 1D-GC (DALLÜGE et al., 2003).
Resultados satisfatórios têm sido relatados em termos de eficiência de
separação e, também, na classificação de compostos baseada na presença de
estruturas ordenadas obtidas nos cromatogramas em GC×GC. Além disso, um
aumento expressivo no poder de separação e diminuição do tempo de análise é
observado quando comparada às técnicas convencionais acopladas (DALLÜGE
et al., 2003).
2.1.1 Colunas para GC×GC
Para que condições de separação ortogonal sejam realizadas em um
sistema GC×GC, é necessário utilizar colunas que forneçam mecanismos
8
independentes de separação na primeira e na segunda dimensão. Sendo assim,
deve-se considerar que toda separação em GC×GC é baseada em dois
parâmetros: (a) na volatilidade do analito e (b) na sua interação com a fase
estacionária por meio de pontes de hidrogênio, interações π-π, efeitos estéricos,
etc. (BEENS et al., 1998a).
Assim como na 1D-GC, devemos considerar que em uma coluna apolar a
volatilidade dos analitos é o único parâmetro que governa a separação. Em todas
as outras colunas, a separação é governada tanto pela interação específica com a
coluna “polar” selecionada quanto pela volatilidade (DALLÜGE et al., 2003).
Cada pequena fração individual eluída da primeira coluna apolar contém
analitos com volatilidades muito semelhantes. A separação subseqüente na
segunda dimensão é tão rápida, em torno de poucos segundos, que é realizada
sob condições essencialmente isotérmicas. Em outras palavras, para analitos com
igual volatilidade somente a interação com a fase estacionária específica governa
a retenção dos analitos na segunda dimensão (DALLÜGE et al., 2003).
Em princípio, todos os tipos de fases estacionárias podem ser usadas na
primeira dimensão de um sistema GC×GC. Fases estacionárias 100%
dimetilpolisiloxano ou 5% fenil / 95% dimetilpolisiloxano são geralmente usadas
na primeira coluna. Na prática, a seleção da primeira coluna é também
influenciada pela disponibilidade de um método já otimizado em 1D-GC. Fases
estacionárias 35 a 50% fenil / 65 a 50% dimetilpolisiloxano, polietilenoglicol
(Carbowax), carborano (HT8) e cianopropil-fenil-dimetilpolisiloxano são
tipicamente usadas na segunda coluna (DALLÜGE et al., 2003).
Deve ficar claro que resultados obtidos em uma separação apolar x polar
pode, em princípio, não ser realizada por uma combinação polar x apolar ou polar
x polar. Em ambos os casos, os resultados obtidos na primeira separação
dependem da combinação entre dois fatores: volatilidade e polaridade dos
analitos. No entanto, a volatilidade também desempenha um papel importante na
separação, quando uma segunda coluna apolar é utilizada, consequentemente, a
separação na primeira e na segunda dimensão não acontecerá de forma
ortogonal (DALLÜGE et al., 2003).
Em geral, o tamanho convencional das colunas usadas na primeira
dimensão, é tipicamente de 15 a 30 m de comprimento, 0,25 a 0,32 mm de
9
diâmetro interno e 0,1 a 1,0 µm de espessura de filme. A seleção das dimensões
desta coluna também depende da separação desejada. Em muitos casos, onde já
existe um método otimizado em um sistema 1D-GC para a amostra em análise, a
primeira dimensão selecionada para a separação em GC×GC será aquela que é
convencionalmente utilizada para a separação em 1D-GC (DALLÜGE et al.,
2003).
A separação na segunda coluna deve ser realizada em poucos segundos,
e o alargamento da banda dos pulsos estreitos gerados pelo modulador deve ser
minimizado (DALLÜGE et al., 2003). Portanto, colunas curtas e estreitas são
comumente usadas na segunda dimensão, com tamanhos tipicamente de 0,5 a
2,0 m de comprimento, 0,1 mm de diâmetro interno e 0,1 µm de espessura de
filme (ADAHCHOUR et al., 2005). Em 2003 ADAHCHOUR et al. relataram o uso
de colunas com 0,05 mm de diâmetro interno, as quais permitiram uma separação
ultra-rápida, em torno de 1 s, na segunda dimensão.
2.1.2 Moduladores para GC×GC
O modulador pode ser considerado o “coração” de um sistema GC×GC e,
conseqüentemente, nos primeiros anos muitos esforços foram dedicados para o
desenvolvimento de um modulador robusto e com uma ampla faixa de aplicação
(DALLÜGE et al., 2003).
Independente do seu design um modulador deve desempenhar três
funções: (a) acumular pequenas frações do efluente da primeira coluna enquanto
procede normalmente a separação na primeira dimensão; (b) focalizar as frações
acumuladas no tempo ou no espaço; (c) liberar as frações acumuladas na forma
de pulsos estreitos para a segunda dimensão (DALLÜGE et al., 2003).
Os moduladores utilizados para executar as separações em GC×GC
podem ser classificados em duas categorias principais: os térmicos e os
baseados em válvulas (HARYNUK & GÓRECKI, 2003).
Os primeiros moduladores desenvolvidos para GC×GC utilizavam
dessorção térmica, tais como o modulador de dois estágios aquecidos (dual-
10
stage thermal modulator), os quais não foram muito robustos além de serem de
difícil fabricação (LIU & PHILLIPS, 1991).
Os primeiros moduladores disponíveis comercialmente foram os
moduladores por varredura térmica (thermal sweeper) caracterizados pelo uso
de um capilar de filme espesso, posicionado entre a primeira e a segunda coluna,
para reter e acumular o analito no final da primeira coluna, empregando razão de
fases como efeito de focalização (PHILLIPS et al., 1999).
O modulador por varredura térmica (Figura 2) utilizava um aquecedor
rotativo, o qual passava ao longo do capilar de filme espesso (tubo modulador), a
uma temperatura aproximadamente 100 ºC acima da temperatura do forno. A
fração acumulada era então transferida para fora do tubo modulador quando as
fendas do aquecedor passavam ao longo deste tubo, resultando na liberação da
fração anteriormente acumulada para dentro da segunda coluna (SHELLIE et al.,
2002).
Figura 2. Esquema geral do modulador por varredura térmica (Sweeper)
A principal desvantagem deste modulador foi a limitada faixa de aplicação
(temperatura máxima de eluição a 230 ºC), pois para evitar o super-aquecimento
da fase estacionária da coluna na região modulada, a temperatura máxima do
forno não deveria exceder 100 ºC (BERTSCH, 2000; DALLÜGE et al., 2003).
Além desta desvantagem, problemas relacionados à instalação e operação,
injetor
detector
Coluna
primeira dimensão
Coluna
segunda dimensão
tubo
modulador
aquecedor
rotativo
conectores
11
devido à presença de várias partes móveis, limitaram o uso deste modulador
(DALLÜGE et al., 2003). Por outro lado, em um review publicado em 2003 por
DALLÜGE et al. foi relatado que até a presente data, aproximadamente 30% dos
artigos de pesquisa publicados utilizavam o sweeper como modulador o que
comprova o grande uso inicial dessa geração de moduladores.
Na próxima geração de moduladores, partes móveis foram evitadas ou o
seu movimento foi simplificado, e o aquecimento foi substituído pelo resfriamento
por meios criogênicos (HARYNUK & GÓRECKI, 2002; LEDFORD &
BILLESBACH, 2000).
KINGHORN & MARRIOT (1999) desenvolveram o primeiro sistema
criogênico (Figura 3) denominado Sistema Criogênico Longitudinalmente
Modulado (LMCS, do inglês Longitudinally Modulated Cryogenic System), o qual
utiliza expansão de CO
2
líquido, como armadilha criogênica, para acumular e
focalizar os analitos nos primeiros centímetros da segunda coluna. Logo após um
período de tempo pré-fixado, a armadilha criogênica, a qual é movida por um
pistão, é rapidamente transferida para a posição de liberação. A zona contendo o
analito focalizado é agora exposta ao ar do forno do GC e, conseqüentemente, o
analito é rapidamente re-volatilizado e re-injetado como uma banda muito estreita
na segunda coluna. Como vantagem este modulador apresenta uma ampla faixa
de aplicação, embora analitos voláteis não sejam suficientemente retidos.
Figura 3. Esquema geral de um Sistema Criogênico Longitudinalmente
Modulado (LMCS)
Coluna
primeira dimensão
Coluna
segunda dimensão
injetor
detector
focalização
liberação
modulador
móvel
CO
2
conector
12
Nos últimos anos, vários tipos de moduladores baseados em jatos, tanto
com dióxido de carbono quanto nitrogênio líquido para o resfriamento, começaram
a dominar o campo dos moduladores e lentamente substituir os LMCS. É
importante salientar que, em um período de 12 meses, de 2003 a 2004 no mínimo
10 novos moduladores foram relatados na literatura científica. A principal
vantagem nesta nova geração de moduladores é a ausência de qualquer peça
móvel, o que tornou este sistema de jatos muito mais robusto (ADAHCHOUR et
al., 2006).
Não existe, até o momento, um consenso sobre qual é, ou deveria ser o
melhor design para este modulador como, por exemplo, jato simples, dois ou
quatro jatos moduladores (ADAHCHOUR et al., 2006). Entretanto, um estudo
comparativo realizado por KRISTENSSON et al. em 2003 mostrou que o
modulador de duplo jato com CO
2
líquido para o resfriamento (Figura 4) é uma
interface totalmente satisfatória e robusta para praticamente todas as aplicações,
e neste caso, larguras de pico a meia altura foram encontradas em torno de 45-95
ms para uma variedade de compostos testados. A determinação de compostos
com volatilidades muito baixas, com pontos de ebulição menores do que o hexano
é a principal exceção. Para este tipo de análise, nitrogênio líquido ou gasoso é
necessário para o resfriamento, pois a faixa de aplicação de 100 a 500 ºC (pontos
de ebulição de C
8
a C
36
) pode ser ampliada para aproximadamente -160 a 500 ºC
(C
1
a C
36
) (GAINES & FRYSINGER, 2004).
Figura 4. Esquema geral de um modulador com duplo jato de CO
2
Coluna
primeira dimensão
Coluna
segunda dimensão
injetor
detector
CO
2
jatos
conector
válvulas
13
O modulador térmico com resfriamento a ar, foi descrito por LIBARDONI
et al (2005), o qual é ligado eletricamente e não utiliza materiais criogênicos e gás
comprimido para o funcionamento. Este modulador de estágio simples é ligado
por pulsos de corrente através de uma fonte de alimentação de corrente
diferencial e resfriado por uma unidade de refrigeração convencional de dois
estágios. A unidade de refrigeração, juntamente com um trocador de calor e a
bomba de recirculação, resfria o modulador a uma temperatura de
aproximadamente -30 ºC. O tubo modulador de aço inoxidável é revestido com
um filme interno de dimetilpolisiloxano, com dimensões de 0,18 mm de diâmetro
interno x 8 cm de comprimento (LIBARDONI et al., 2005).
O modulador descrito é muito simples e robusto. As únicas partes
mecânicas neste sistema são a bomba de recirculação de ar e a unidade de
refrigeração convencional, sendo que ambas necessitam de poucas
manutenções. Custos de operação são muito menores do que os moduladores
que utilizam meios criogênicos para o resfriamento. Entretanto, o ar utilizado para
o resfriamento neste modulador não é capaz de assegurar temperaturas tão
baixas quanto os moduladores criogênicos, sendo esta uma limitação deste
modulador com relação à análise de compostos muito voláteis (LIBARDONI et al.,
2005).
Outra classe de moduladores está baseada na modulação através de
válvulas, as quais podem ser classificadas em: válvulas de diafragma ou válvulas
com modulação diferencial da vazão.
Os moduladores de válvulas de diafragma permitem a liberação e a
injeção somente de uma pequena e estreita fração do analito, uma vez que,
menos de 2% deste é transferido para dentro da segunda coluna. Devido a esta
característica, estes moduladores tornaram-se inadequados para a análise de
traços (BRUCKNER et al., 1998; FRAGA et al., 2002).
Os moduladores baseados em válvulas com modulação diferencial da
vazão permitem a transferência de aproximadamente 80% do analito da primeira
para a segunda coluna (SEELEY et al., 2000).
Ambos os moduladores baseados em válvulas apresentam uma
temperatura limite de operação relativamente baixa (cerca de 175 ºC), o que limita
muito suas aplicações (DALLÜGE et al., 2003).
14
2.1.3 Detectores freqüentemente usados para GC×GC
A separação muito rápida realizada na coluna da segunda dimensão,
resulta em picos com larguras de base, tipicamente, de 100 a 600 ms (DALLÜGE
et al., 2003). A largura do pico depende do tipo de modulador usado, da vazão do
gás na coluna cromatográfica, das dimensões da segunda coluna e, uma vez que
esta separação é isotérmica, do tempo de retenção nesta dimensão (DALLÜGE et
al., 2003).
Picos estreitos requerem detectores rápidos com um volume interno
pequeno e uma elevada taxa de aquisição dos dados para assegurar uma correta
reconstrução do cromatograma na segunda dimensão. Até recentemente a
detecção em GC×GC era limitada a utilização de Detecção por Ionização de
Chama (FID, do inglês Flame Ionization Detection) (DALLÜGE et al., 2003). Os
FIDs modernos possuem um volume interno insignificante e podem adquirir dados
a uma freqüência que varia de 50 a 200 Hz, o que os tornam compatíveis com
esta técnica (BEENS et al., 1998b).
Embora o FID seja o detector mais adequado para a detecção de
hidrocarbonetos e também, seja utilizado freqüentemente na identificação e na
quantificação de produtos petroquímicos (REDDY et al., 2007), para a
determinação de pesticidas ele não é o detector mais apropriado, pois existem
detetores mais seletivos, como o µECD e o NPD.
Atualmente, o micro Detector por Captura de Elétrons (µECD, do inglês
micro-Electron Capture Detector) tem sido muito usado em GC×GC; além do
mais, o seu volume interno de 30 a 150 µL pode causar um aumento do sinal
(KORYTÁR et al., 2002; KRISTENSSON et al., 2003). A freqüência de aquisição
dos dados de um µECD é tipicamente 50 Hz, compatível com o sistema GC×GC
(DALLÜGE et al., 2003). O µECD é amplamente utilizado para determinação de
compostos halogenados tais como, bifenilas policloradas (PCBs) em amostras
ambientais e de alimentos (BORDAJANDI et al., 2005; KORYTAR et al., 2005).
O emprego da Detecção de Nitrogênio e Fósforo (NPD, do inglês Nitrogen
and Phoshorus Detection) na GC×GC oferece boa sensibilidade para compostos
que contenham fósforo e nitrogênio, para a análise de resíduos de pesticidas em
amostras de vegetais (KHUMMUENG et al., 2006). A freqüência de aquisição dos
15
dados de um NPD pode chegar a 200 Hz, o que o torna compatível com técnica
de GC×GC (MÜHLEN et al., 2007b).
Os detectores mencionados acima permitem identificação dos picos, mas
não fornecem informação estrutural. O uso da detecção espectrométrica,
especificamente a Espectrômetria de Massas (MS, do inglês Mass Spectrometry),
é, portanto, indispensável para assegurar a identificação dos numerosos
compostos separados. Atualmente, somente o TOFMS pode adquirir 50 ou mais
espectros por segundo, os quais são necessários para a correta recombinação
dos picos modulados em GC×GC bem como para a devida quantificação
(ADAHCHOUR et al., 2006; DALLÜGE et al., 2003).
O TOFMS combinado ao sistema GC×GC fornece uma das ferramentas
mais poderosas de separação e identificação disponível atualmente (GÓRECKI et
al., 2006). Entretanto, o custo elevado resultante deste acoplamento, restringe o
acesso desta instrumentação para muitos laboratórios.
Resultados utilizando GC×GC-TOFMS para análises de amostras
petroquímicas, óleos essenciais e determinação a nível traço de pesticidas em
vegetais, tem sido relatados. Eles demonstram uma excelente compatibilidade
entre o mecanismo de separação e o sistema de detecção (DALLÜGE et al.,
2003).
2.1.4 Geração e visualização dos cromatogramas em GC×GC
A primeira diferença entre os dados obtidos por 1D-GC e GC×GC é o
cromatograma gerado. Enquanto que na 1D-GC cada pico representa um
composto, ou mais de um composto, no caso de co-eluição, em GC×GC cada
pico primário (do inglês Parent Peak), que corresponde ao pico o qual dá origem
aos picos modulados obtidos por GC×GC, obtido por 1D-GC é dividido em vários
segmentos, denominados picos modulados (Modulated Peak), que são gerados
pela separação na segunda coluna, após o processo de modulação, sendo que
estes quando agrupados representam o pico primário (GÓRECKI et al., 2006;
MÜHLEN et al., 2007a; SEELEY, 2002). Se levarmos em consideração apenas
este efeito, a complexidade do cromatograma aumentaria em 3, 4, ou mais vezes,
16
dependendo do número de modulações realizadas por pico primário (MÜHLEN,
2007).
A interpretação dos resultados produzidos em GC×GC requer um
tratamento de dados mais sofisticado do que em 1D-GC, em virtude do aumento
de volume e complexidade de informação analítica (GÓRECKI et al., 2006;
MÜHLEN, 2007). A transformação do sinal analítico em imagem pode ser
realizada por softwares específicos desenvolvidos por diferentes grupos de
pesquisa, ou mais recentemente, por outros softwares comercialmente
disponíveis (GÓRECKI et al., 2006; HARYNUK et al., 2002).
O detector grava um sinal contínuo, desta forma, o cromatograma linear
produzido é de elevada complexidade considerando o número de picos gerados
devido à modulação (Figura 5A). Sendo assim, o cromatograma linear deve ser
convertido em matrizes de dados para que esta possa ser transformada em outra
imagem e, posteriormente analisada (GÓRECKI et al., 2006).
Softwares apropriados conduzem esta tarefa, os quais utilizam intervalos
de tempo de retenção (∆t), que correspondem aos períodos de modulação P
M
para segmentar os cromatogramas continuamente, formando assim
cromatogramas secundários individuais (Figura 5B). Quando ocorre a injeção na
segunda coluna, os tempos de retenção são marcados em t
1
, t
2
e t
3
, e tornam-se
os tempos de retenção na 1ª dimensão para todos os picos secundários que
eluem em um dado período de modulação (GÓRECKI et al., 2006). O segundo
tempo de retenção de cada pico é calculado como a diferença entre o tempo de
retenção absoluto de um dado pico e o tempo de injeção, para um dado ciclo de
modulação (HARYNUK et al., 2002). Por exemplo, para o pico marcado com um
asterisco na Figura 5A, o tempo de retenção na segunda dimensão é igual t
x
-t
1
(GÓRECKI et al., 2006).
Os cromatogramas individuais, obtidos na segunda dimensão, são
alinhados lado a lado de acordo com os intervalos de tempo ∆t, gerando assim
um gráfico tridimensional como ilustrado na Figura 5C, onde o eixo x representa o
tempo de retenção na primeira coluna, o eixo y o tempo de retenção na segunda
coluna, e o eixo z a intensidade do sinal (GÓRECKI et al., 2006).
Nesta representação, os picos secundários que pertencem ao mesmo
composto são visualizados em diversos segmentos consecutivos, com tempos de
17
sinal
1
º
t
e
m
p
o
d
e
r
e
t
e
n
ç
ã
o
2
º
t
e
m
p
o
d
e
r
e
t
e
n
ç
ã
o
2
º
tempo de retenção
1
º
tempo de retenção
sinal
1
º
t
e
m
p
o
d
e
r
e
t
e
n
ç
ã
o
2
º
t
e
m
p
o
d
e
r
e
t
e
n
ç
ã
o
2
º
tempo de retenção
1
º
tempo de retenção
retenção idênticos na segunda coluna. Devido a esta característica, é possível
recombinar os picos individuais gerados nos cromatogramas na segunda
dimensão e converter a uma imagem (GÓRECKI et al., 2006).
As matrizes de dados gerados (Figura 5C) são então convertidas em uma
imagem através de softwares específicos, no qual cada pico reconstruído é
caracterizado por dois tempos de retenção e intensidade do sinal, como mostra a
Figura 5D (GÓRECKI et al., 2006).
Figura 5. Geração e interpretação dos dados em GC×GC: (A) Cromatograma
linear mono-dimensional, (B) separação do cromatograma inicial em
segmentos, (C) alinhamento dos cromatogramas lado a lado gerando uma
matriz de dados (D) transformação da matriz de dados em imagem (gráfico
bidimensional), adaptado de GÓRECKI et al. (2006)
18
A imagem gerada pelos softwares permite a visualização do sinal analítico
de diversas formas, como por exemplo, diagramas tridimensionais, diagramas de
cores, diagramas de contorno, diagramas de bolhas e diagrama de ápices, os
quais serão descritos brevemente a seguir. Neste trabalho, foram utilizados os
diagramas de cores e de ápices para a visualização dos analitos no espaço de
separação.
Diagrama tridimensional – gráfico tridimensional que representa uma
separação bidimensional abrangente (DALLÜGE et al., 2003). Neste diagrama, o
eixo x representa o tempo de retenção na primeira dimensão, o eixo y o tempo de
retenção na segunda dimensão e o eixo z a intensidade do sinal (MÜHLEN et al.,
2007a).
Diagrama de contorno (Figura 6A) – gráfico bidimensional que representa
uma separação bidimensional abrangente, onde as intensidades de sinal
semelhantes são conectadas por uma linha, resultando em uma forma
geométrica, que representa uma vista superior de parte de um pico
cromatográfico. Neste e nos próximos diagramas, o eixo x representa o tempo de
retenção na primeira dimensão e o eixo y o tempo de retenção na segunda
dimensão (MÜHLEN et al., 2007a).
Diagrama de cores (Figura 6B) – gráfico bidimensional que representa
uma separação bidimensional abrangente, onde as cores representam a
intensidade do sinal detectado. A escala de cores mostra que a intensidade do
sinal cromatográfico varia de mais intenso (cores próximas ao amarelo) ao menos
intenso (cores próximas ao verde). Nesta imagem, cada mancha visualizada no
diagrama de cores representa a vista superior de um pico cromatográfico em três
dimensões (MÜHLEN et al., 2007a).
Diagrama de bolhas (Figura 6C) – gráfico bidimensional que representa
uma separação cromatográfica bidimensional abrangente, onde cada pico é
representado por um círculo (MÜHLEN et al., 2007a). A área de cada círculo
correlaciona-se à medida quantitativa da soma das áreas dos picos modulados
que geram o pico tridimensional (SHELLIE et al., 2003). O centro de cada círculo
representa as coordenadas de tempo em cada dimensão (MÜHLEN et al., 2007a).
Diagrama de ápices (Figura 6D) – gráfico bidimensional que representa
uma separação cromatográfica bidimensional abrangente, onde os máximos de
19
cada pico são representados por símbolos (MÜHLEN et al., 2007a; SHELLIE et
al., 2003).
Figura 6. Diferentes representações para o espaço de separação de uma
análise realizada por GC×GC para uma amostra de Eucalyptus dunnii, onde:
A) diagrama de contorno, B) diagrama de cores, C) diagrama de bolhas e D)
diagrama de ápices, adaptado de MÜHLEN et al. (2007a)
2.2 Pesticidas
De acordo com a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
(USEPA, do inglês United States Environmental Protection Agency) pesticida é
definido como qualquer substância ou mistura de substâncias destinada a
prevenir, destruir, repelir, ou mitigar eventuais pragas, as quais podem ser
A)
B)
C)
D)
20
insetos, ratos, outros animais, plantas indesejadas (ervas daninhas), fungos ou
microorganismos, como bactérias e vírus (USEPA, 2007a).
O termo pesticida é usado para designar, de maneira geral, qualquer
composto manufaturado a ser empregado na agricultura visando atender os
objetivos acima citados, incluindo os inseticidas, fungicidas, herbicidas,
acaricidas, fumigantes, reguladores de crescimento, defolhantes, dessecantes,
etc. (EMBRAPA, 2006).
O resíduo de pesticida é definido como sendo qualquer substância
específica presente no alimento, “in natura” ou não, ou ainda em ração animal,
proveniente do uso de pesticidas, como os produtos de conversão, metabólitos,
produtos de reações e impurezas consideradas com alguma significância
toxicológica. Este termo inclui resíduos de substâncias desconhecidas ou de
fontes inevitáveis (como o meio ambiente), bem como o uso de produtos químicos
conhecidos (FAO, 2005).
O Decreto Federal nº 4074, de 04 de janeiro de 2002, define como
“agrotóxicos e afins” todos os “produtos e agentes de processos físicos, químicos
e biológicos, destinados ao uso no setor de produção, no armazenamento e
beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas,
nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos
e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim
de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como
as substâncias e produtos empregados como defolhantes, dessecantes,
estimuladores e inibidores de crescimento”.
A ampla utilização de pesticidas em plantações, trouxe para a sociedade
aspectos positivos e negativos. A principal vantagem é o controle eficaz de pragas
e de outros elementos nocivos às plantações, ocasionando a aceleração do
crescimento da produção de alimentos, suprindo assim grande parte da demanda
mundial. Em contrapartida a este avanço, o uso descontrolado de pesticidas tem
provocado à contaminação de águas, solos e alimentos. Este tipo de
contaminação é a causa de problemas que comprometem a qualidade de vida
tanto das pessoas que trabalham expostas aos pesticidas nas lavouras, bem
como para o consumidor final, se estes alimentos estiverem contaminados, em
níveis acima dos aceitáveis.
21
A importância dos pesticidas em garantir patamares elevados de
produtividade das principais culturas, tem sido inquestionável. No entanto,
existem questionamentos referentes ao meio ambiente e à saúde humana que
têm preocupado a população mundial devido à utilização excessiva ou
inadequada desses compostos (EMBRAPA, 2006).
Nas últimas décadas, o consumo de pesticidas no Brasil tem aumentado a
taxas bem elevadas. Em 1964, o consumo total de pesticidas foi de 16 mil
toneladas, enquanto em 1981 passou para 60 mil toneladas e, em 2000, para 140
mil toneladas. Isso representou um aumento no consumo de pesticidas de 276%
entre 1964 e 1991 e de 176% entre 1991 e 2000 (EMBRAPA, 2006).
Devido à grande diversidade de produtos existentes (somente no Brasil são
cerca de 500 produtos diferentes comercializados como agrotóxicos), os
pesticidas podem ser classificados de diversas formas, como por exemplo, de
acordo com a sua finalidade e poder tóxico (BARBOSA, 2004).
Quanto à finalidade os pesticidas podem ser classificados de acordo com o
tipo de peste: algicidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas; inseticidas; moluscidas,
nematicidas; ovicidas, rodenticidas, vampiricidas, entre outros (SANCHES, 2003;
ANVISA, 2005).
A classificação quanto à toxicidade é fundamental, uma vez que diferentes
tipos de intoxicação podem ser causados por pesticidas, os quais, por sua própria
natureza, são compostos altamente perigosos para a saúde humana. Entretanto
esse perigo varia muito de um composto para outro e os efeitos que eles, ou
qualquer substância química, podem causar nos organismos vivos, incluindo o
homem. Esses efeitos podem ser classificados em agudos ou crônicos
(BARBOSA, 2004). O efeito agudo é observado após o contato com uma única
dose do veneno. A magnitude desse efeito depende da toxicidade da substância,
da dose, do tipo de contato e do organismo em particular (BARBOSA, 2004). O
efeito crônico ocorre quando o organismo é exposto a pequenas doses de uma
única substância potencialmente perigosa por um longo período de tempo. A
ingestão de alimentos contaminados com resíduos de pesticidas é um exemplo de
exposição que pode levar a efeitos crônicos sobre o sistema nervoso central, ou
mesmo, câncer, dependendo do tipo de composto e da quantidade ingerida
(BARBOSA, 2004).
22
No Brasil, a classificação toxicológica compreende quatro classes distintas
de compostos, conforme apresentado na Tabela 1. Esta classificação obedece
aos resultados de testes ou estudos realizados em laboratório, os quais buscam
estabelecer os valores de DL
50
(dose letal mediana), ou seja, a dose a partir da
qual se observa a morte de 50% dos animais de uma população expostos
(BARBOSA, 2004). Na Tabela 1 estão listadas as diferentes classes toxicológicas
de acordo com os valores de DL
50
e as cores correspondentes aos rótulos das
formulações de pesticidas.
Tabela 1. Classificação dos pesticidas quanto à toxicidade
Classe
DL
50
(mg kg
-1
)
Classificação
Cor da faixa no rótulo da
embalagem
I 0-50 Extremamente tóxico Vermelho vivo
II 50-500 Altamente tóxico Amarelo intenso
III 500-5000 Mediamente tóxico Azul intenso
IV >5000 Pouco tóxico Verde intenso
Fonte: LARINI, 1999
A regulamentação quanto ao uso dos pesticidas não está baseada
somente no controle das classes químicas dos princípios ativos autorizados para
uso como pesticidas, mas também no estabelecimento de um nível de referência,
que corresponde à quantidade máxima aceita de resíduo de um determinado
pesticida em cada alimento destinado ao consumo humano (NUNES & RIBEIRO,
1999).
Para garantir que a população não corra o risco de consumir alimentos com
níveis perigosos de pesticidas, para todo produto registrado existe um limite
máximo de resíduo (MRL, do inglês Maximun Residue Limit) permitido por lei para
cada produto agrícola ou processado. Esses limites máximos são obtidos com
23
base em estudos realizados, seguindo-se as boas práticas agrícolas. (BARBOSA,
2004).
Em tese, o cumprimento destes MRL permite preservar a saúde do
consumidor da ação tóxica dos pesticidas. Neste sentido, diversos organismos
nacionais e internacionais estão encarregados de estabelecer tais limites.
No Brasil (2002) o Decreto nº 4074, os MRL foram definidos como sendo a
“quantidade máxima de resíduos de agrotóxico ou afim oficialmente aceita no
alimento, em decorrência da aplicação adequada numa fase específica, desde a
produção até o consumo, expressa em partes (em peso) do agrotóxico, afim ou
seus resíduos por partes de alimento (em peso) (ppm ou mg kg
-1
)”.
O MRL é definido pelo Codex Alimentarius, como sendo a concentração
máxima do resíduo de um pesticida (expresso em mg kg
-1
) recomendado pelo
comitê do Codex Alimentarius sobre resíduos de pesticidas (CCPR, do inglês
Codex Alimentarius Committe on Pesticides Residues) como sendo legalmente
permitido no alimento ou na ração animal. Em geral, o assessoramento científico
dos organismos internacionais tem sido efetuado pelo JMPR (do inglês, Joint
FAO/WHO Meeting on Pesticides Residues) (FAO, 2005).
Um parâmetro importante para a determinação dos MRL é a chamada
Ingestão Diária Aceitável (IDA), que corresponde à quantidade do pesticida que
pode ser ingerida diariamente, durante toda a vida do indivíduo, sem que isso
cause risco apreciável à sua saúde. Com base nos valores de IDA e,
considerando a dieta média dos indivíduos de uma sociedade, os especialistas
calculam os valores de limites máximos permitidos de resíduos dos diversos
pesticidas e outros produtos químicos em alimentos e água (BARBOSA, 2004).
Portanto, os valores de MRL e IDA estão interligados, de modo a assegurar que
os pesticidas utilizados não apresentem riscos à saúde dos consumidores.
2.2.1 Pesticidas piretróides selecionados para determinação em uva
O monitoramento de pesticidas é de grande importância para o comércio
exterior, já que uma grande parte da produção agrícola brasileira é destinada às
exportações. Tanto para o setor vitícola como para o de frutas, com relação às
24
exportações brasileiras, a uva de mesa é o principal produto. As exportações
desta cultura continuam em ritmo crescente, em 2006 foram exportadas 62,250
mil toneladas de uvas, sendo observado um aumento de 21,5% em relação ao
ano anterior (EMBRAPA, 2007).
Os piretróides fazem parte de um grupo relativamente novo de pesticidas
usados amplamente na agricultura em uma variedade de frutas e vegetais para o
controle de insetos (SANNINO et al., 2003). Estes pesticidas são compostos
sintéticos que agem de maneira similar as piretrinas, as quais são derivadas
naturalmente das flores de crisântemo (USEPA, 2007b). O uso destes inseticidas
tem aumentado rapidamente desde o desenvolvimento do primeiro piretróide
fotoestável em 1973 (SANNINO et al., 2003), devido a sua eficácia em doses
baixas, curta persistência em termos ambientais, e relativamente baixa toxicidade
quando comparado aos organofosforados, organoclorados e carbamatos (CHEN
& WANG, 1996). Experimentos toxicológicos executados provaram que os
metabólitos dos piretróides são atóxicos ou de baixa toxicidade (COLUMÉ et al.,
2001).
Outra vantagem destes pesticidas é que eles admitem a sinergia, ou seja, a
potencialização pela adição de outra substância, gerando um aumento na
eficácia. Além disso, são os compostos de mais rápida ação na interferência da
transmissão de impulsos nervosos podendo possuir efeito repelente, espantando
os insetos ao invés de eliminá-los (SANCHES, 2003; ANVISA, 2005). Os
piretróides sintéticos têm boa estabilidade sob luz e temperatura ambiente.
Degradam-se por hidrólise e oxidação, sendo caracterizados também pela rápida
degradação por microrganismos presentes no meio ambiente (SANCHES, 2003;
ANVISA, 2005).
Devido os piretróides serem o maior grupo de inseticidas amplamente
utilizados no mundo, a determinação dos resíduos destes pesticidas em
commodities, alimentos e matrizes ambientais é necessária para monitorar e
regulamentar o seu uso (SANNINO, 2003). Na Figura 7 estão representadas as
fórmulas estruturais dos pesticidas selecionados para este estudo.
25
CH
3
CH
3
CH
2
(
Z
)
-
(
1
R
)
-
c
i
s
-
(
Z
)
-
(
1
S
)
-
c
i
s
-
C
CH
CH
3
CH
3
C
F
3
C
H
H
O
O
CH
2
Cl
C
CH
CH
3
CH
3
CF
3
C
H
H
O
O
C
l
O
C
CH
CH
3
CH
3
C
l
C
O
O
C
l
C
N
C
C
CH
3
CH
3
B
r
H
C
H
H
O
O
B
r
CN
OC
H
O
CH
2
C
CH
CH
3
CH
3
C
l
C
O
O
C
l
CH
CH
CH
3
CH
3
C
O
O
O
CH
CN
Cl
Deltametrina
Bifentrina Fenvalerato
Cipermetrina Permetrina
OC
C
N
O
C
CH(CH
3
)
2
C
l
O
H
H
Esfenvalerato
Figura 7. Fórmulas estruturais dos pesticidas selecionados para
determinação em uva
26
Na Tabela 2 estão listados os valores de MRL estabelecidos pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2007), Codex Alimentarius (2007) e
pela União Européia (2007) para os compostos determinados na uva.
Tabela 2. Pesticidas analisados e Limites Máximos de Resíduos (MRL)
MRL (mg kg
-1
)
Pesticida
ANVISA Codex Alimentarius União Européia
Bifentrina 0,1 n.e. 0,2
Cipermetrina n.e. n.e. 0,5
Deltametrina n.e. 0,2 0,1
Fenvalerato
a
n.e. n.e. 0,02
Permetrina
b
n.e. 2,0 0,05
n.e. = não estabelecido, a = soma dos isômeros esfenvalerato e fenvalerato; b = soma dos
isômeros cis e trans
2.3 Preparo de amostra para análises de resíduos de pesticidas
O preparo da amostra é a etapa crucial dentro de um método analítico,
principalmente quando se tratam de amostras sólidas ou semi-sólidas, tais como
amostras ambientais e de alimentos, as quais geralmente não podem ser
analisadas sem uma etapa prévia de preparo da amostra, devido aos baixos
níveis de concentração em que os analitos estão presentes nestas matrizes
(KRISTENSSON, 2005).
Os procedimentos de preparo de amostra, tais como extração,
concentração e clean-up, influenciam potencialmente na confiabilidade e exatidão
das análises (AHMED, 2001). Nos últimos anos, muitas inovações nos processos
analíticos que podem ser aplicados no preparo de amostras ambientais e
alimentos para extração e determinação de resíduos de pesticidas, têm sido
desenvolvidos (PICÓ et al., 2007).
27
Devido aos baixos limites de detecção exigidos pelas agências reguladoras
e a natureza complexa das matrizes nas quais os compostos de interesse estão
presentes, eficiência no preparo da amostra, detecção e quantificação a níveis
traços são aspectos importantes para métodos analíticos (TORRES et al., 1996).
2.3.1 Métodos de extração para análises de resíduos de pesticidas
Métodos clássicos, tais como Extração Líquido-Líquido (LLE, do inglês
Liquid-Liquid Extraction) e Extração por Soxhlet, para a determinação de
poluentes a nível de traços em amostras ambientais são geralmente
procedimentos que envolvem inúmeras etapas tipicamente baseada na extração
exaustiva da matriz e a subseqüente remoção do material co-extraído por
sucessivas etapas de clean-up anterior a análise. Tal preparo da amostra envolve
uma grande quantidade de amostra, sorvente (s), alta qualidade dos solventes
orgânicos e requer muito trabalho manual para a obtenção dos extratos. Ou seja,
esses métodos são dispendiosos em termos de tempo e consumo de material,
desta forma o desenvolvimento de procedimentos, rápidos, mais efetivos e
ambientalmente corretos são necessários (KRISTENSSON, 2005).
Recentemente, muitas técnicas de extração tais como Extração por Fluído
Supercrítico (SFE, do inglês Supercritical Fluid Extraction), Extração Assistida por
Microondas (MAE, do inglês Microwave-Assisted Extraction) e Extração por
Líquido Pressurizado (PLE, do inglês Pressurised Liquid Extraction) têm sido
desenvolvidas na tentativa de superar as principais limitações dos métodos
convencionais, como tempo de extração e consumo de solventes orgânicos. Em
geral, estas técnicas alternativas permitem uma extração mais eficiente para os
analitos presentes na matriz, devido ao maior contato do solvente de extração
com os analitos de interesse (KRISTENSSON, 2005).
Procedimentos de Extração em Fase Sólida (SPE, do inglês Solid-Phase
Extraction) têm sido amplamente utilizados para análises de resíduos de
pesticidas em amostras ambientais e de alimentos, os quais incluem várias
abordagens, tais como Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSDP, do inglês
Matrix Solid-Phase Dispersion), Micro-Extração em Fase Sólida (SPME, do inglês
28
Solid-Phase Micro-Extraction) e Extração Sortiva por Barra de Agitação (SBSE,
do inglês Stir-Bar Sorptive Extraction). Estes métodos de extração representam
uma possibilidade de redução do tempo de análise, consumo de solvente e
diminuição de custos (PICÓ et al., 2007).
Atualmente, os métodos multirresíduos mais comumente utilizados para as
análises de pesticidas em frutas e vegetais, envolvem uma extração inicial com
acetona, acetonitrila, ou acetato de etila, a partir da qual os analitos de interesse
são transferidos para uma camada orgânica, deixando na fase aquosa os co-
extrativos indesejáveis e alguns pesticidas altamente polares (SHERMA, 2001;
HIEMSTRA & KOK, 2007).
2.3.1.1 Método de extração Luke
O método Luke é a base dos métodos multirresíduos de pesticidas mais
frequentemente usados para o monitoramento de alimentos, estudos de avaliação
de riscos e análises de rotina em amostras não gordurosas, tais como frutas e
vegetais (SHERMA, 2001). Este método consiste em uma extração inicial dos
pesticidas com acetona seguida de uma partição líquido-líquido com solventes
apolares, éter de petróleo e diclorometano, logo após adiciona-se cloreto de sódio
para remover a água co-extraída (SCHENK et al., 2002), forçando assim com que
os pesticidas polares presentes na fase aquosa, sejam conduzidos para a fase
orgânica (DIÉZ et al., 2006).
Na década de 80, o ministério da agricultura na Holanda (VWA, Food and
Consumer Product Safety Authority) desenvolveu em seu laboratório o método de
extração mini-Luke, o qual é uma miniaturização do método de extração Luke
original (LUKE et al., 1975), omitindo-se a etapa de particionamento com cloreto
de sódio. Este método de extração é o mais rápido disponível atualmente em
análises de rotina de pesticidas em laboratórios, e tem mostrado bons resultados
de recuperação para uma grande variedade de pesticidas em diversas matrizes
(HIEMSTRA & KOK, 2007).
As maiores vantagens deste método de extração, além da velocidade, é a
limpeza relativa dos extratos, embora não seja aplicada uma etapa de clean-up, e
29
a compatibilidade com a maioria dos detectores comumente usados para análises
de pesticidas. Além disso, a miniaturização deste método possibilitou a redução
da quantidade de amostra bem como de solventes utilizados. Entretanto, valores
baixos de recuperação foram obtidos para pesticidas polares, como metamidofós,
ometoato, monocrotofós entre outros (HIEMSTRA & KOK, 2007).
Como um método de extração alternativo, desenvolveu-se no VWA uma
modificação do método de extração mini-Luke nos anos 90, onde se adicionou
sulfato de sódio na etapa de extração, levando assim, a uma melhor extração dos
pesticidas polares e consequentemente, melhores valores de recuperações foram
obtidos para estes pesticidas (HIEMSTRA & KOK, 2007).
2.3.1.2 Método de acetato de etila
KRIJGSMAN et al. (1976), introduziram o método de acetato de etila como
uma alternativa, a fim de substituir o método Luke para extração de amostras não
gordurosas devido a sua maior rapidez, simplicidade, limpeza dos extratos e bons
valores de recuperação. Todas as vantagens deste método fizeram dele o método
de extração oficial adotado por algumas agências reguladoras européias (DIÉZ et
al., 2006).
O método de acetato de etila envolve uma extração com acetato de etila
com uma subseqüente adição de Na
2
SO
4
e uma etapa de clean-up utilizando
Cromatografia por Permeação em Gel (GPC, do inglês Gel Permeation
Chromatography) ou florisil. Este método não somente aumentou a extração de
compostos polares, quando comparado ao método Luke, mas também aumentou
a quantidade de interferentes polares extraídos da matriz (DIÉZ et al., 2006).
2.3.1.3 Método QuEChERS
ANASTASSIADES et al. publicaram em 2003 um método provido com
resultados de alta qualidade com um número mínimo de etapas e um baixo
consumo de solvente. Ao método foi atribuída a sigla QuEChERS (do inglês
30
Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), a qual reflete as suas maiores
vantagens (rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro).
Este método envolve uma extração inicial com acetonitrila, seguida por
uma etapa de partição líquido-líquido após adição de uma mistura de sais anidros
(MgSO
4
e NaCl), os quais facilitam a remoção de uma quantidade significante de
componentes polares da matriz (ANASTASSIADES et al., 2003). Finalmente, uma
etapa simples de purificação denominada extração em fase sólida dispersiva
(SPE) é efetuada, onde um sorvente amina primária secundária (PSA, do inglês
Primary Secundary Amine) é adicionado diretamente ao extrato da matriz
(MASTOVSKA & LEHOTAY, 2004).
A principal desvantagem do método QuEChERS, comparado a outros
métodos de extração, é que a relação amostra:extrato final, de 1 g mL
-1
, é mais
baixa do que 2-5 g mL
-1
obtido pela maioria dos métodos tradicionais. (LEHOTAY
et al., 2005). Portanto, se a matriz não for uma fonte limitante de ruído nas
análises, isto pode conduzir a uma redução de sensibilidade.
2.4 Validação de métodos cromatográficos para a determinação de
pesticidas em uva
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através
de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez
mais reconhecida e exigida (RIBANI et al., 2004). Para garantir que um método
analítico novo assegure informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra,
ele deve ser submetido a uma avaliação denominada validação (RIBANI et al.,
2007).
Validação é o ato ou efeito de validar, dar validade, tornar válido, tornar
legítimo ou legal (LANÇAS, 2004). A validação do método analítico envolve um
procedimento o qual prova que o método fornece os resultados esperados com
credibilidade, precisão e exatidão adequadas (LANÇAS, 2004).
A validação de um método é um processo contínuo que começa no
planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu
desenvolvimento (RIBANI et al., 2004). Consequentemente, antes de um método
31
analítico ser implementado para análises de rotina, ele deve primeiramente ser
validado para demonstrar que é adequado para seu uso pretendido (ROZET et
al., 2007).
Os parâmetros para validação de métodos têm sido definidos em diferentes
grupos de trabalho de organizações nacionais e internacionais (RIBANI et al.,
2007). Infelizmente, algumas definições são diferentes entre as diversas
organizações (RIBANI et al., 2004), sendo assim, um grande esforço no sentido
de harmonizar guias para recuperação de informação em medidas analíticas foi
efetuado por intermédio de trabalho em conjunto entre grupos do sistema ISO (do
inglês International Standardization Organization), IUPAC (do inglês International
Union of Pure Applied Chemistry) e AOAC (do inglês Association of Official
Analytical Chemists) (LANÇAS, 2004).
Neste trabalho, os parâmetros utilizados para a validação de método
analítico foram: curva analítica e linearidade, limite de detecção e limite de
quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão, os
quais foram avaliados seguindo as orientações sobre validação de métodos e
ensaios químicos estabelecidos pelo INMETRO. Atualmente, é praticamente
consenso entre muitos laboratórios, que as soluções analíticas dos pesticidas
devem ser preparadas em extrato da matriz ao invés de em solventes puros, a
menos de que se tenha sido provada a insignificância do efeito matriz. Desta
forma, é de suma importância avaliar este efeito, uma vez que este pode
influenciar nos resultados das análises (PRESTES, 2007).
2.4.1 Curva analítica e linearidade
A resposta para um procedimento analítico corresponde à relação, dentro
de uma faixa específica, entre a resposta (sinal, área, altura do pico, absorção) e
a concentração (quantidade) do analito na amostra (ROZET et al., 2007). Neste
trabalho a resposta adotada será área do pico.
Na maior parte dos casos, a relação matemática entre o sinal e a
concentração ou massa da espécie de interesse, deve ser determinada
empiricamente, a partir de sinais medidos para massas ou concentrações
32
conhecidas dessa espécie (AUGUSTO et al., 2004). Essa relação matemática
muitas vezes, pode ser expressa por uma equação de reta chamada curva de
analítica, a qual é geralmente aceita com um mínimo de 5 pontos (NETO et al.,
2002; LANÇAS, 2004).
A linearidade refere-se à relação entre a quantidade introduzida no
instrumento e a quantidade calculada a partir da curva de analítica, a qual
relaciona a resposta instrumental e a concentração (ROZET et al., 2007). A
equação de regressão linear (Equação 1) que relaciona as duas variáveis é:
y = ax + b Equação (1)
onde:
y = resposta medida (área do pico);
x = concentração;
a = inclinação da curva analítica = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x = 0
Além dos coeficientes a e b, também é possível calcular, a partir dos
pontos experimentais, o coeficiente de correlação r, o qual fornece uma estimativa
da qualidade da curva analítica obtida (CHUI et al., 2001). A regressão linear deve
ter alto coeficiente de determinação (r
2
> 0,999) (PIMENTEL & NETO, 1996), ou
de correlação (r) > 0,99 (ANVISA, 2003) ou > 0,9 (INMETRO, 2003), o que
evidencia um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão.
2.4.2 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)
Em análises onde são realizadas determinações na faixa de concentração
de traços e ultra-traços de analitos é imprescindível que, medidas sejam feitas na
região do LOD e LOQ (RIBANI et al., 2007).
33
Tempo (min)
Ruído
LOD
3
S/R
LOQ
10
S/R
Resposta
O limite de detecção (LOD, do inglês limit of detection) representa a menor
concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não
necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento
experimental (ICH, 1995; INMETRO, 2003). O LOD pode ser calculado por
diferentes métodos, sendo o método baseado na relação sinal:ruído mais
comumente utilizado, porém este método somente pode ser aplicado em sistemas
analíticos que apresentam ruído para a linha base (RIBANI et al., 2007).
O limite de quantificação (LOQ, do inglês limit of quantification) é o menor
valor de concentração em que o analito pode ser quantificado com certo limite de
confiança, ou seja, abaixo deste valor medições não apresentam suficiente
confiança para quantificação (THOMPSON et al., 2002). O método para
determinação do LOQ deve ser considerado com a incerteza da medida de um
componente dentro de um intervalo linear (RIBANI et al., 2007).
Estes limites são estabelecidos por meio da análise de soluções de
concentrações conhecidas e decrescentes do analito. O LOD e o LOQ são
geralmente expressos em unidades de concentração (BRASIL, 2003;
FRANCOTTE et al., 1996).
O LOD e o LOQ foram estabelecidos com base na Figura 8, onde o LOD
corresponde a 3 vezes o ruído da linha de base e o LOQ corresponde à
concentração que produz uma relação sinal:ruído superior a 10.
Figura 8. Diagrama demonstrando a forma de estabelecimento dos valores
de LOD e LOQ
34
2.4.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)
Precisão é um termo geral para avaliar a dispersão de resultados entre
ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras
semelhantes ou padrões, em condições definidas (INMETRO, 2003). A precisão
em validação de métodos pode ser considerada em três níveis diferentes:
repetitividade (medidas em um mesmo dia), precisão intermediária (medidas
realizadas ao longo de vários dias) e reprodutibilidade (medidas realizadas em
laboratórios diferentes) (RIBANI et al., 2004).
A repetitividade representa a concordância entre os resultados de
medições sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas
condições de medição, chamadas condições de repetitividade: mesmo
procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas
condições; mesmo local; com repetições efetuadas em um curto intervalo de
tempo (RIBANI et al., 2004).
A precisão intermediária indica o efeito das variações dentro do laboratório
devido a eventos como diferentes dias ou analistas, ou diferentes equipamentos
ou uma combinação destes fatores (ICH, 1995). Recomenda-se, para o cálculo da
precisão intermediária, um mínimo de dois dias diferentes com analistas
diferentes (BRASIL, 2003). O objetivo da precisão intermediária na validação é
verificar que, no mesmo laboratório, o método fornecerá os mesmos resultados
(RIBANI et al., 2004).
Ambas repetitividade e precisão intermediária podem ser expressas
através da estimativa do desvio padrão relativo (RSD, do inglês relative standard
desviation) (RIBANI et al., 2004), sendo que, em métodos de análises de traços,
são aceitos RSD de até 20%, dependendo da complexidade da amostra (HUBER,
1998).
O valor numérico usado para avaliar a precisão, RSD, pode ser calculado
através da Equação (2) (CAUSON, 1997; GARP, 1999).
35
100
x
s
RSD
m
×=
Equação (2)
onde:
s = estimativa de desvio padrão absoluto
s = {∑(x
i
– x
m
)
2
/ N- 1}
1/2
x
i
= valores individuais
x
m
= média das medidas em replicatas
N = número de medidas.
2.4.4 Exatidão
Exatidão do método é definida como sendo a concordância entre o
resultado de um ensaio e o valor de referência, aceito como convencionalmente
verdadeiro. A exatidão, quando aplicada a uma série de resultados de ensaio,
implica numa combinação de componentes de erros aleatórios e sistemáticos
(tendência) (INMETRO, 2003).
Os processos normalmente utilizados para avaliar a exatidão são entre
outros: uso de materiais de referência, participação em comparações
interlaboratoriais e realização de ensaios de recuperação.
Quando materiais de referência não estão disponíveis, a exatidão pode ser
avaliada através dos ensaios de recuperação (CODEX ALIMENTARIUS, 2001),
os quais são geralmente expressos em percentual.
A recuperação dos analitos pode ser estimada pela análise de amostras
fortificadas com quantidades conhecidas desta. As amostras devem ser
fortificadas com os analitos em pelo menos três diferentes concentrações, por
exemplo, próximo ao limite de detecção, próximo à concentração máxima
permissível e em uma concentração próxima à média da faixa de uso do método.
A limitação desse procedimento é a de que o analito adicionado não está
36
necessariamente na mesma forma que se apresenta na amostra (INMETRO,
2003).
Os intervalos aceitáveis de recuperação para análises de resíduos,
geralmente estão entre 70 e 120%, com precisão de até + 20% (GARP, 1999),
inclusive para análise de resíduos de pesticidas (HUBER, 1998).
2.4.5 Efeito matriz
O efeito matriz é observado quando uma considerável diferença de
resposta é obtida entre padrões preparados no solvente e aqueles preparados no
extrato da matriz, com boa precisão. Uma das maneiras de minimizar e/ou
eliminar este efeito é reduzir a quantidade de componentes da matriz que co-
eluem com os analitos no detector, para isto, métodos de extração mais seletivos
e etapas mais eficientes de clean-up devem ser desenvolvidos. Contudo
alternativas, como por exemplo, a calibração externa realizada em extrato da
matriz idêntica ou similar ao da amostra é geralmente utilizada (PICÓ et al.,
2004).
Entre as diversas maneiras utilizadas para compensar o efeito matriz em
GC, podemos citar: 1) uso do método da adição padrão; 2) uso de padrão interno
deuterado; 3) preparo das soluções analíticas no extrato da matriz (matrix
matched standards), entre outras alternativas
(PICÓ et al., 2004).
O efeito matriz pode ser calculado conforme a Equação 3. Desta forma, as
áreas obtidas das soluções analíticas preparadas em solvente e no extrato da
matriz são comparadas.
100%
2
21
x
X
XX
izEfeitoMatr
−
=
Equação (3)
onde:
X
1
= Média das áreas da solução analítica de cada pesticida, preparada em extrato
da matriz, numa dada concentração;
37
X
2
= Média das áreas da solução analítica de cada pesticida, preparada em
solvente, numa dada concentração.
Assim, verifica-se se a matriz exerce efeito positivo (aumento de sinal) ou
negativo (decréscimo de sinal) sobre o resultado da análise. Quando o resultado
for acima de 10% considera-se que o efeito matriz começa a exercer influência
nas análises (HAJSLOVÁ & ZROSTLÍKOVÁ, 2003).
38
3. MATERIAIS E MÉTODOS
O desenvolvimento experimental consistiu em duas etapas:
desenvolvimento de um novo modulador fixo a ar comprimido e avaliação do
processo de modulação utilizando alcanos e pesticidas e análise por GC×GC-FID;
e aplicação deste modulador na avaliação do método mini-Luke modificado para
extração de pesticidas fortificados em uva, sendo em seguida submetidos à
análise por GC×GC-µECD.
Este trabalho foi desenvolvido em Amsterdã (Holanda) no laboratório
Analytical Chemistry & Applied Sciences (ACAS) na Free University, com o apoio
do laboratório do Food and Consumer Product Safety Authority (VWA).
3.1 Instrumentação utilizada na avaliação do novo modulador e condições
instrumentais empregadas para as análises realizadas por GC×GC-FID
Sistema GC×GC-FID: Cromatógrafo a gás HP 6890 GC (Agilent
Tecnologies, Palo Alto, CA, USA) equipado com:
Amostrador automático série HP 7673;
Injetor split/splitless, com insersor de vidro silanizado, d.i. 4 mm;
1ª coluna capilar VF-5 (5% fenil 95% metilpolisiloxano), de sílica
fundida, 30 m de comprimento, 0,25 mm de d.i. e 0,25 µm de
espessura de filme (Varian, Holanda);
2ª coluna capilar Carbowax (polietileno glicol), 0,4 m de
comprimento, 0,1 mm de d.i. e 0,1 µm de espessura de filme
(Agilent, Holanda);
Modulador com duplo jato de ar comprimido (desenvolvido no
laboratório);
Detector por Ionização de Chama (Agilent Tecnologies)
Sistema de aquisição de dados através do software HP
Chemstation (Agilent, Revision - A.07.01) para integração dos picos;
2D Converter Program (beta version 1.0, Gerard Sharp) para
39
converter a matriz de dados em imagem e software Transform
(version 3.4, Fortner software) foi utilizado para visualizar a imagem
na forma de diagramas.
• Modo de injeção: splitless;
• Injeção realizada com o auxílio de amostrador automático;
• Temperatura do injetor: 280 °C;
• Volume de injeção: 1 µL;
• Programação de temperatura do forno da coluna: temperatura inicial de 100 °C
com incremento de temperatura de 3 °C min
-1
até 320 °C;
• Vazão do gás de arraste (hélio) constante em 0,5 mL min
-1
na coluna;
• Tempo de modulação: 3,5 s;
• Tempo total de corrida cromatográfica: 73 min;
• Temperatura do detector FID: 300 °C;
• Velocidade de aquisição dos dados pelo FID: 100 Hz;
• Vazão dos gases no detector: hidrogênio 30 mL min
-1
, ar sintético 300 mL
min
-1
e gas make up (nitrogênio) 15 mL min
-1
.
3.2 Instrumentação utilizada para aplicação do modulador desenvolvido na
validação de método analítico e condições instrumentais empregadas para
as análises realizadas por GC×GC-µECD
Sistema GC×GC-µECD: Cromatógrafo a gás HP 6890 GC (Agilent
Tecnologies, Palo Alto, CA, USA) equipado com:
Amostrador automático série HP 7673;
Injetor split/splitless, com insersor de vidro silanizado, d.i. 4 mm;
1ª coluna capilar VF-5 (5% fenil 95% metilpolisiloxano), de sílica
fundida, 30 m de comprimento, 0,25 mm de d.i. e 0,25 µm de
espessura de filme (Varian, Holanda);
2ª coluna capilar VB-50 (50% metilpolisiloxano 50%
fenilpolisiloxano), de sílica fundida, 0,5 m de comprimento, 0,1 mm
de d.i. e 0,1
µm de expessura de filme (Valco Bond, Holanda);
40
Modulador com duplo jato de ar comprimido (desenvolvido no
laboratório);
Micro Detector por Captura Elétrons (µECD) com volume de célula
de 150 µL (Agilent Tecnologies);
Sistema de aquisição de dados através do software HP
Chemstation (Agilent, Revision - A.07.01) para integração dos picos;
2D Converter Program (beta version 1.0, Gerard Sharp) para
converter a matriz de dados em imagem e software Transform
(version 3.4, Fortner software) foi utilizado para visualizar a imagem
na forma de diagramas;
• Modo de injeção: splitless;
• Injeção realizada com o auxílio de amostrador automático;
• Temperatura do injetor: 280 °C;
• Volume de injeção: 1 µL;
• Programação de temperatura do forno da coluna: temperatura inicial de 80 °C
com incremento de temperatura de 20 °C min
-1
até 200 °C; posteriormente de
5 ºC min
-1
até 300 ºC;
• Vazão do gás de arraste (hélio) constante em 1,0 mL min
-1
na coluna;
• Tempo de modulação: 5 s;
• Tempo total de corrida cromatográfica: 26 min;
• Temperatura do detector µECD: 300 °C;
• Velocidade de aquisição dos dados pelo µECD: 50 Hz;
• Vazão do gás no detector: gás make up (nitrogênio) 60 mL min
-1
.
3.3 Equipamentos
Sistema de purificação de água Milli-Q
®
- resistividade 18,2 MΩ cm
(MilliPore
®
, EUA);
Balança analítica de precisão com 4 casas decimais (Sartorius, Alemanha);
Balança analítica com 2 casas decimais (Sartorius, Alemanha);
Lavadora automática de vidrarias G 7883 CD (Miele, EUA);
41
Banho de ultrassom M3510 DHT (Branson, México);
Banho de água MP Basis (Julabo, Alemanha);
Homogeneizador ultraturrax Polytron
PT 6000 (Polytron, Suíça);
Centrífuga Harrier 18/80, refrigerada (MSE, Inglaterra).
3.4 Gases
Gases utilizados no sistema GC×GC-FID:
Gás de arraste: hélio 99,999% de pureza (Praxair, Holanda)
Gás make up: nitrogênio 99,999% de pureza (Praxair, Holanda)
Hidrogênio: 99,999% de pureza (Praxair, Holanda)
Ar sintético: 99,999% de pureza (Praxair, Holanda)
Gases utilizados no sistema GC×GC-µECD:
Gás de arraste: hélio 99,9999% de pureza (Praxair, Holanda);
Gás make up: nitrogênio 99,999% de pureza (Praxair, Holanda).
3.5 Reagentes, Solventes e Materiais
Acetato de etila, grau pesticida (Lab-scan Analytical Science, Irlanda);
Diclorometano, éter de petróleo, metanol, acetona, sulfato de sódio anidro,
todos grau pesticida, (Merck, Alemanha);
Padrões sólidos dos pesticidas (Tabela 3 e 4);
Padrões de alcanos lineares de C
7
a C
29
(exceto C
15
, C
16
, C
19
, C
26
e C
27
),
(Polyscience Corporation (PSC));
Amostras de uva (cultivar Itália) fornecidas pelo VWA;
Dispensador Optifix, capacidade 50 mL (GS, Alemanha);
Pipetador hand step
(Brand, Alemanha);
Seringas de volumes de 10, 25, 50, 100, 250, 500 e 1000 µL (Hamilton,
Suíça);
Tubos de teflon com tampa, capacidade de 250 mL fabricados sob medida
(Holanda);
Vidrarias comuns de laboratório.
42
3.6 Pesticidas selecionados
Os pesticidas selecionados para este estudo estão listados nas Tabelas 3 e
4, respectivamente para análises por GC×GC-FID e GC×GC-µECD, com sua
pureza e fornecedores.
Para a avaliação do modulador empregando o sistema GC×GC-FID, foram
utilizados os pesticidas listados na Tabela 3.
Tabela 3. Pesticidas analisados por GC×GC-FID
Pesticida Fornecedores
Grau de pureza (%)
Bifentrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
98,0
Ciflutrina Riedel-de Haën (Alemanha)
98,0
Cipermetrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
91,5
Esfenvalerato Riedel-de Haën (Alemanha)
99,9
Fenitrotiona Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
97,0
Fipronil Riedel-de Haën (Alemanha)
96,7
Permetrina cis Zeneca (Estados Unidos)
99,4
Permetrina trans Zeneca (Estados Unidos)
96,4
Trifloxistrobina Novartis (Estados Unidos)
99,9
Trifluralina Riedel-de Haën (Alemanha)
99,3
Para a aplicação do modulador na validação de método analítico
empregando o sistema GC×GC-µECD, foram utilizados os pesticidas listados na
tabela 4.
43
Tabela 4. Pesticidas analisados por GC×GC-µECD
Pesticida Fornecedores
Grau de pureza (%)
Bifentrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
98,0
Cipermetrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
91,5
Deltametrina Dr. Ehrenstorfer (Alemanha)
98,5
Esfenvalerato Riedel-de Haën (Alemanha)
99,9
Fenvalerato Riedel-de Haën (Alemanha)
99,8
Permetrina cis Zeneca (Estados Unidos)
99,4
Permetrina trans Zeneca (Estados Unidos)
96,4
3.7 Preparo das soluções analíticas
3.7.1 Soluções analíticas utilizadas na avaliação do novo modulador
Preparou-se uma solução na concentração de 30 mg L
-1
de uma mistura
contendo alcanos de C
7
a C
29
(exceto C
15
, C
16
, C
19
, C
26
e C
27
) em hexano.
Para o preparo das soluções analíticas “estoque” dos pesticidas, efetuou-
se o cálculo para determinar a quantidade de cada padrão sólido puro a ser
pesado, para obter-se soluções individuais de cada composto na concentração de
1000 mg L
-1
. Para isso, os padrões sólidos foram pesados individualmente,
diretamente dentro de frascos âmbar (tampa contendo batoque de
politetrafluoretileno (PTFE)), com capacidade de 20 mL, sendo em seguida,
dissolvidos em tolueno, e homogeneizados por 5 minutos em banho de ultrassom.
Estas soluções “estoques” apresentam estabilidade de cerca de 8 anos, desde
que armazenadas em freezer, a -20 °C, e corretamente manipuladas (PRESTES,
2007).
Em seguida preparou-se 20 mL de uma mistura de concentração 50 mg L
-1
contendo todos os pesticidas a serem estudados. Para isso, transferiu-se 1 mL de
cada solução “estoque” para balão volumétrico de 20 mL já contendo um pequeno
volume de tolueno, sendo posteriormente, o volume completado com este mesmo
44
solvente. Esta solução foi armazenada em frasco âmbar (tampa contendo
batoque de PTFE), com capacidade de 20 mL.
A partir da solução de 50 mg L
-1
preparou-se 50 mL de uma solução de
concentração 5 mg L
-1
,
para isso, transferiu-se 5 mL desta solução para balão
volumétrico de 50 mL, já contendo um pequeno volume de metanol, sendo,
posteriormente, o volume completado com este mesmo solvente. A solução
intermediária de 5 mg L
-1
, foi armazenada em frasco âmbar (tampa contendo
batoque de PTFE), com capacidade de 50 mL.
Essa solução intermediária foi utilizada para preparar as soluções
analíticas, através de sua diluição, nas concentrações de 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 e 2,5
mg L
-1
, para o estudo de linearidade e confecção das curvas analíticas, de cada
composto. Todas as soluções analíticas foram preparadas em solvente orgânico
(metanol). Em seguida foram transferidos 250 µL destas soluções analíticas para
frascos de 2 mL para amostrador automático e adicionou-se 10 µL da solução
contendo uma mistura de alcanos na concentração de 30 mg L
-1
anteriormente
preparada.
Todas as soluções analíticas foram armazenadas em freezer a -20 °C,
sendo que antes de serem utilizadas foram retiradas do freezer e deixadas atingir
a temperatura ambiente para homogeneização.
3.7.2 Soluções analíticas utilizadas para aplicação do modulador na validação de
método analítico
Para o preparo das soluções analíticas “estoques”, efetuou-se o cálculo
para determinar a quantidade de cada padrão sólido puro a ser pesado, para
obter-se soluções individuais de cada composto na concentração de 1000 mg L
-1
.
Para isso, os padrões sólidos foram pesados individualmente, diretamente dentro
de frascos âmbar (tampa contendo batoque de PTFE), com capacidade de 20 mL,
sendo em seguida, dissolvidos em tolueno, e homogeneizados por 5 minutos em
banho de ultrassom.
Em seguida foi preparada 10 mL de uma mistura de concentração 100 mg
L
-1
contendo todos os pesticidas a serem estudados. Para isso, transferiu-se 1 mL
45
de cada solução “estoque” para balão volumétrico de 10 mL já contendo um
pequeno volume de acetato de etila, sendo posteriormente, o volume completado
com este mesmo solvente. Esta solução foi armazenada em frasco âmbar (tampa
contendo batoque de PTFE), com capacidade de 20 mL.
A partir da solução de 100 mg L
-1
preparou-se 20 mL de uma solução de
concentração 10 mg L
-1
,
para isso, transferiu-se 2 mL desta solução para balão
volumétrico de 20 mL, já contendo um pequeno volume de acetato de etila,
sendo, posteriormente, o volume completado com este mesmo solvente. A
solução intermediária de 10 mg L
-1
, foi armazenada em frasco âmbar (tampa
contendo batoque de PTFE), com capacidade de 20 mL.
Essa solução intermediária foi utilizada para os ensaios de fortificação e
também para preparar as soluções analíticas, através de sua diluição, nas
concentrações de 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 e 0,5 mg L
-1
, para o estudo de
linearidade e confecção das curvas analíticas, de cada composto. Todas as
soluções analíticas foram preparadas tanto em solvente orgânico (acetato de
etila) como no extrato da matriz (uva). Dessa maneira, pôde-se avaliar o efeito da
matriz durante as análises, que será discutido no item 3.9.5. As soluções
analíticas nas concentrações de 0,02, 0,05 e 0,5 mg L
-1
, correspondem aos níveis
de fortificação de 0,02, 0,05 e 0,5 mg kg
-1
, respectivamente.
Todas as soluções analíticas foram armazenadas em freezer a -20 °C,
sendo que antes de serem utilizadas foram retiradas do freezer e deixadas atingir
a temperatura ambiente para homogeneização.
A identificação foi realizada através da injeção de cada pesticida
separadamente e a integração das áreas dos picos para a quantificação dos
pesticidas foi realizada usando o software HP Chemistation.
3.8 Análise dos solventes e reagentes pelo método de extração mini-Luke
modificado
Este procedimento tem a finalidade de verificar a pureza dos solventes e
reagentes utilizados, com relação às contaminações com resíduos dos pesticidas
estudados. Consiste em realizar todo o procedimento normal de extração das
46
amostras, porém sem a uva e, consequentemente, sem a fortificação dessa
matriz.
Para isto, pesou-se 10 + 0,1 g de sulfato de sódio anidro, dentro de tubo de
teflon de 250 mL de capacidade, e adicionou-se através de dispensador 30 mL de
cada solvente, acetona, éter de petróleo e diclorometano, sendo em seguida,
levado ao homogeneizador ultraturrax por cerca de 30 s, a 10.000 rpm.
Finalmente, levou-se o tubo para centrifugação a 3600 rpm, durante 3 min e
posteriormente, transferiu-se o conteúdo para erlenmeyer de vidro, com tampa
esmerilhada. Este extrato foi chamado de “branco” do solvente.
3.9 Validação do método de extração mini-Luke modificado para análise de
resíduos de pesticidas em uva
3.9.1 Determinação da linearidade das curvas analíticas
Avaliou-se a linearidade das curvas analíticas a partir das soluções
analíticas preparadas no item 3.7.2, tanto em solvente, quanto no extrato uva, nas
concentrações de 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 mg L
-1
. A seqüência de injeção
consistiu primeiramente na introdução de acetato de etila e em seguida injetou-se
6 vezes a seqüência das soluções analíticas.
Posteriormente, realizaram-se os cálculos da média das áreas, do RSD
(%), da equação da curva analítica bem como do coeficiente de determinação (r
2
),
e da faixa de linearidade, para cada composto analisado por GC×GC-µECD.
3.9.2 Limite de detecção e limite de quantificação
Neste trabalho, injetaram-se soluções padrão de pesticidas no extrato da
matriz na concentração de 0,01 e 0,02 mg L
-1
e mediu-se a altura do ruído
próximo ao tempo de retenção dos compostos e em seguida determinou-se a
concentração que correspondeu a 3 e 10 vezes essa altura, sendo que estas
correspondem ao LOD e LOQ respectivamente.
47
3.9.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)
Neste trabalho, o estudo da precisão do instrumento foi realizado
efetuando-se seis injeções de cada concentração das soluções analíticas no
sistema GC×GC-µECD.
A precisão do método, em termos de repetitividade (RSD
r
) foi efetuada
procedendo-se a extração e análise das amostras fortificadas. Cada nível de
fortificação foi extraído seis vezes e cada extrato injetado uma vez.
Para avaliar a precisão intermediária (RSD
pi
), calculado conforme descrito
no item 2.4.3, do método por GC×GC-µECD, utilizaram-se 2 dias e 2 operadores
diferentes para a análise.
3.9.4 Ensaios de fortificação e extração empregando o método mini-Luke
modificado para avaliação da recuperação
Os ensaios de fortificação e de recuperação têm por objetivo a avaliação
da exatidão do método como um todo, uma vez que se calcula a concentração
real medida, no final de todo o procedimento, em comparação com a
concentração conhecida adicionada inicialmente na matriz. Assim, através das
recuperações obtidas dos pesticidas, pode-se avaliar a exatidão do método, e
através dos RSDs calculados, obtêm-se informações acerca da repetitividade
(precisão) dos dados obtidos.
Este procedimento de fortificação foi realizado 6 vezes (n = 6), para cada
nível de fortificação (3 níveis), e também para a uva (cultivar Itália) “branco”, que é
aquela sem a adição dos pesticidas, para verificação da real ausência desses
compostos na matriz. Este extrato da matriz é chamado de “branco” da matriz e
também foi utilizado para o preparo das soluções analíticas, quando em extrato
da matriz. A amostra ”branco” foi considerada como tal após análise por
Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas (LC-MS, do inglês
Liquid Chromatography Mass Spectrometry) realizada pelo VWA, o qual forneceu
um laudo atestando a ausência de pesticidas na amostra analisada.
48
A amostra “branco” de uva (cultivar Itália) foi fornecida pelo VWA, a qual foi
previamente homogeneizada e armazenada em tubos de polipropileno em
freezer. Pesaram-se porções de 10,0 ± 0,1 g de uva, diretamente dentro dos
tubos de teflon. Efetuou-se a fortificação, utilizando-se seringas Hamilton
®
de
injeção, para obter-se maior exatidão. Para se fortificar aos níveis de 0,02, 0,05 e
0,5 mg kg
-1
, adicionou-se, respectivamente, 20, 50 e 500 µL, de uma solução
analítica na concentração de 10 mg L
-1
, contendo os pesticidas a serem
analisados por GC×GC-µECD.
Imediatamente após a fortificação, adicionou-se 30 mL de acetona e em
seguida as amostras foram levadas para extração em homogeneizador ultraturrax
por 30 s a 3600 rpm. Logo após adicionou-se 10,0 ± 0,1g de sulfato de sódio
anidro e 30 mL dos solventes éter de petróleo e diclorometano e levou-se
novamente o extrato a homogeneizador ultraturrax por tempo e rotação iguais aos
descritos no item 3.8, bem como o procedimento de centrifugação e transferência
do líquido para erlenmeyer. A Figura 9 mostra alguns materiais utilizados durante
o procedimento de extração.
Um volume de 9 mL dos extratos obtidos foi transferido para tubos de
ensaio graduados de 10 mL, e colocados em banho de água já aquecida a 45 ºC,
sendo que em seguida esta temperatura foi aumentada até atingir 62 ºC. Os tubos
foram retirados do banho alguns minutos antes de completa secura, e deixados
em temperatura ambiente até obter-se secura total. Para a análise por GC×GC-
µECD o extrato foi reconstituído a 1 mL com acetato de etila. O fluxograma da
Figura 10 mostra as etapas efetuadas durante procedimento de extração.
49
A) B)
C) D)
Figura 9. Materiais utilizados para a execução do método de extração mini-
Luke modificado A) homogeneizador ultraturrax, B) frascos dos solventes
utilizados com dispensadores, C) banho termostatizado de água e D) interior
da centrífuga
50
Figura 10. Representação esquemática do método de análise de resíduos de
pesticidas em uva, utilizando o método de extração mini-Luke modificado
10 g de uva
homogeneizada
Fortificação em 3 níveis
(0,02; 0,05; 0,5 mg kg
-1
)
“Branco” da matriz
30 mL de acetona
Ultraturrax 30 s -10.000 rpm
10 g de sulfato de sódio
30 mL de éter de petróleo
+
30 mL de diclorometano
Transferência do extrato para
erlenmeyer
Centrifugação 3 min – 3600 rpm
Ultraturrax 30 s -10.000 rpm
Evaporação de 9 mL do extrato
(45 – 62 °C)
Redissolução em 1 mL de acetato de etila
Análise por GCxGC-µECD
Secura total em temperatura ambiente
51
3.9.5 Avaliação do efeito matriz dos extratos de uva analisados por GC×GC-
µECD
Para avaliar o efeito matriz neste trabalho, foram injetadas soluções (5
concentrações diferentes x 6 vezes cada) preparadas tanto no solvente quanto no
extrato da matriz e as áreas obtidas foram comparadas. Efetuou-se o cálculo
conforme descrito no item 2.4.5. Desta forma pode-se verificar se o efeito matriz
exerceu influência nas análises realizadas.
52
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Este capítulo foi dividido em 2 partes, sendo que a primeira compreendeu o
desenvolvimento e avaliação do modulador, e posteriormente foi abordada a
aplicação deste na validação de método analítico.
4.1 Desenvolvimento de um novo modulador fixo a ar e avaliação do
processo de modulação utilizando alcanos e pesticidas e análise por
GC×GC-FID
4.1.1 Design de um novo modulador usando ar comprimido para GC×GC-FID
O modulador de duplo jato de ar comprimido possui praticamente o mesmo
design do modulador de duplo jato de CO
2
. No modulador a ar comprimido, bem
como o modulador de duplo jato de CO
2
, duas porções da coluna capilar são
resfriadas diretamente e alternadamente nos primeiros centímetros da segunda
coluna com o objetivo de acumular e focalizar cada fração subseqüente do
analito, o qual é em seguida exposto à temperatura do forno cromatógrafo e
imediatamente re-volatilizado.
Os jatos de ar comprimido são conduzidos por meio de duas válvulas
elétricas que alternadamente abrem e fecham a linha de ar comprimido. O
modulador original de ar comprimido (JOVER et al., 2005) (Figura 11A) possui
duas tubulações para a passagem do ar até a coluna. Este modulador apresentou
o mesmo problema do modulador com duplo jato de CO
2
com relação ao ajuste
dos jatos, com o objetivo de resfriar a coluna. Após algumas injeções, o
modulador com duplo jato de ar comprimido original apresentou um pequeno
deslocamento nas tubulações, o que consequentemente levou a modulações
imperfeitas, baixa repetitividade das áreas dos picos cromatográficos e dos
tempos de retenção. Outro problema observado foi o ruído sonoro produzido pelo
ar nas tubulações.
A fim de melhorar o desempenho do modulador de ar comprimido original
(Figura 11A) e, tornar a instalação mais fácil, estável e robusta desenvolveu-se
53
um novo modelo de modulador (Figura 11B). Para isto, um bloco de alumínio foi
cortado e fixado nas duas tubulações (Figura 12) por onde o ar é conduzido até a
coluna, sendo esta fixada na peça de alumínio. Desta forma, problemas
encontrados no modulador original foram solucionados.
O modulador com ar comprimido desenvolvido foi facilmente instalado
depois de se fazer dois pequenos furos através do topo do forno do cromatógrafo.
A peça de alumínio juntamente com as tubulações são as únicas partes do
modulador que estão dentro do forno. A distância entre a coluna e o modulador é
constante, devido à fixação da coluna no modulador; sendo assim a coluna capilar
está sempre no mesmo lugar, o que tornou este modulador mais estável e robusto
comparado ao modelo original do modulador a ar comprimido (Figura 11A).
Figura 11. Esquema do modulador a ar comprimido para GC×GC: A)
modulador com duplo jato de ar comprimido original e B) modulador com
duplo jato de ar comprimido modificado
A)
B)
54
Figura 12. Representação do modulador com duplo jato de ar comprimido
modificado
No modulador com ar comprimido as colunas capilares podem ser
facilmente trocadas, pois somente um conector de vidro (press fit) é utilizado para
fazer a junção entre a primeira e a segunda coluna. Entretanto, a desvantagem
deste modulador comparado ao modulador de duplo jato de CO
2
é a faixa de
trabalho, pois o ar comprimido tem uma capacidade limitada de resfriamento
sobre a coluna.
No modulador com duplo jato de CO
2
são utilizados dois conectores de
metal para manter a segunda coluna no mesmo lugar. Os conectores são
apertados em um suporte, o qual pode ser pressionado e empurrado junto com a
coluna. A conexão coluna-conector deve ser verificada diariamente e um ajuste
semanal pode vir a ser necessário. Esta verificação é importante, pois os
conectores que prendem a coluna podem ceder devido às altas variações da
temperatura e possíveis vibrações na coluna. Para o modulador com ar
comprimido este ajuste não se faz necessário. Na Figura 13 podem ser
visualizadas algumas fotos do sistema GC×GC utilizado neste trabalho bem como
o modulador desenvolvido.
55
A) B) C)
Figura 13. Sistema GC×GC utilizado: A) controle do modulador, B)
modulador (visualização da parte superior do forno) e C) modulador
(visualização da parte interior do forno)
4.1.2 Desempenho da modulação
Na Figura 14 estão representadas três frações de cromatogramas que
apresentam modulações A) insatisfatória, B) aceitável e C) perfeita. O modulador
com CO
2
possui uma faixa de trabalho mais ampla em comparação ao modulador
a ar, pois quando o CO
2
é utilizado, o primeiro alcano que apresenta modulação
perfeita é o C
6
, diferentemente do modulador com ar, no qual modulações
satisfatórias foram obtidas somente a partir do C
17
(Figura 15).
A
C
B
56
Figura 14. Três frações de cromatogramas lineares obtidos por GC×GC-FID
utilizando o modulador a ar comprimido a partir de soluções padrões de
alcanos: A) modulação insatisfatória, B) modulação aceitável e C)
modulação perfeita
A) B) C)
57
Figura 15. Cromatograma linear obtido por GC×GC-FID a partir de uma solução contendo 18 alcanos. As condições
cromatográficas estão descritas no item 3.1
58
Com o objetivo de avaliar o desempenho do modulador proposto, injetou-se
uma mistura contendo 18 alcanos em um GC×GC-FID. A Tabela 5 fornece uma
noção geral da faixa de aplicação, relatando as variações das áreas dos picos e
as variações dos tempos de retenção tanto na primeira quanto na segunda
coluna.
Para avaliar a repetitividade e a precisão intermediária do modulador com
ar comprimido injetou-se (6 concentrações diferentes em triplicata, em dias
diferentes) uma mistura contendo 18 alcanos e 9 pesticidas. Os resultados
apresentados na Tabela 5 mostram pequenas variações das áreas dos picos,
entre 0,67 a 2,80% para alcanos e 0,24 e 5,34% para pesticidas. Estes resultados
mostram que o sistema é estável.
O desvio padrão (SD, do inglês standard desviation) dos tempos de
retenção na primeira coluna para alcanos e pesticidas foi em torno de 0,05 min.
Para os tempos de retenção na segunda coluna, o SD foi de 0,04 s para a maioria
dos compostos, exceto para ciflutrina e permetrina (0,08 s). A correta identificação
é dada pelos dois tempos de retenção, os quais devem apresentar poucas
variações.
59
Tabela 5. Parâmetros usados para avaliar o desempenho do modulador com ar comprimido para alcanos e pesticidas
Repetitividade
Precisão Intermediária
Compostos n
o
de
carbonos
Ponto de
ebulição
Area do
pico
1
t
R
SD
2
t
R
SD Area do
pico
1
t
R
SD
2
t
R
SD
(
o
C) RSD (%) (min) (min) (s) (s) RSD (%) (min) (min) (s) (s)
Heptadecano 17 302 0,93 28,5 0,05 0,8 0,04
2,77 28,5 0,05 0,8 0,04
Octadecano 18 316 1,31 31,9 0,00 0,8 0,00
2,49 31,9 0,00 0,8 0,00
Icosano 20 343 1,46 38,3 0,05 0,9 0,00
2,45 38,3 0,05 0,9 0,00
Henicosano 21 357 1.54 41,4 0,04 0,9 0,04
2,51 41,4 0,04 0,9 0,04
Docosano 22 369 1,66 44,3 0,05 0,9 0,04
2,50 44,3 0,05 0,9 0,04
Tricosano 23 380 1,69 47,0 0,06 0,9 0,05
2,33 47,0 0,06 0,9 0,05
Tetracosano 24 391 0,67 49,8 0,07 1,0 0,04
2,43 49,8 0,07 1,0 0,04
Pentacosano 25 402 1,96 52,3 0,00 1,0 0,00
1,64 52,3 0,00 1,0 0,00
Octacosano 28 432 2,55 59,4 0,05 1,1 0,04
2,74 59,4 0,05 1,1 0,04
Nonacosano 29 441 1,68 31,7 0,00 1,1 0,04
2,80 31,7 0,00 1,1 0,04
Trifluralina 13 96 0,76 27,5 0,04 1,1 0,04
3,54 27,5 0,04 1,1 0,04
Fenitrotiona 9 140 2,08 37,0 0,06 2,1 0,04
3,15 37,0 0,06 2,1 0,04
Fipronil 12 202 2,76 40,2 0,05 1,3 0,04
2,98 40,2 0,05 1,3 0,04
Trifloxistrobina 20 312 1,35 48,4 0,08 2,2 0,04
3,66 48,4 0,08 2,2 0,04
Bifentrina 23 150 1,93 51,9 0,05 1,8 0,04
5,34 51,9 0,05 1,8 0,04
Permetrina 21 200 0,24 55,9 0,05 2,1 0,08
3,33 55,9 0,05 2,1 0,08
Ciflutrina 22 138 0,24 58,0 0,06 2,3 0,08
4,71 58,0 0,06 2,3 0,08
Cipermetrina 22 220 1,42 60,6 0,05 2,3 0,05
2,09 60,6 0,05 2,3 0,05
Esfenvalerato 25 151 0,51 63,2 0,04 2,5 0,05
2,92 63,2 0,04 2,5 0,05
1
t
R
– tempo de retenção na primeira dimensão,
2
t
R
– tempo de retenção na segunda dimensão e SD – desvio padrão
60
4.1.3 Análise de pesticidas por GC×GC-FID utilizando o modulador com ar
Dados de repetitividade (Tabela 5) e linearidade (Tabela 6) das medidas
das áreas dos picos foram considerados satisfatórios, bem como a repetitividade
dos tempos de retenção na segunda dimensão para a aplicação pretendida.
Usando o sistema GC×GC-FID foi obtida uma faixa linear de 0,1 a 5,0 mg L
-1
com
um coeficiente de determinação maior do que 0,9945 para os pesticidas
analisados (Tabela 6). Os resultados mostram que é possível analisar alguns
pesticidas, usando um sistema GC×GC-FID com um modulador a ar comprimido
para avaliação do processo de modulação.
Tabela 6. Equação da reta, coeficiente de determinação (r
2
) e faixa linear
para os pesticidas selecionados e analisados por GC×GC-FID
Nº Pesticida Faixa linear Equação da reta r
2
(mg L
-1
)
1 Trifluralina 0,1-5,0 y = 2,259x + 0,10 0,9954
2 Fenitrotiona 0,25-5,0 y = 1,190x – 0,23 0,9993
3 Fipronil 0,25-5,0 y = 0,942x – 0,04 0,9985
4 Trifloxistrobina 0,1-5,0 y = 2,640x + 0,06 0,9954
5 Bifentrina 0,1-5,0 y = 3,503x + 0,23 0,9945
6 Permetrina 0,1-5,0 y = 6,011x – 0,08 0,9984
7 Ciflutrina 0,25-5,0 y = 0,322x –0,01 0,9985
8 Cipermetrina 0,25-5,0 y = 1,011x + 0,03 0,9957
9 Esfenvalerato 0,25-5,0 y = 1,332x – 0,14 0,9999
Plotando os dados dos tempos de retenção na primeira e na segunda
coluna obtêm-se um diagrama de ápices (Figura 16A) e um diagrama de cores
em 2D (Figura 16B), sendo possível identificar a posição de cada composto em
soluções padrão de alcanos e pesticidas.
61
2
t
R
segunda dimensão (
s
)
1
t
R
primeira dimensão (min)
A)
2
t
R
segunda dimensão (s)
1
t
R
primeira dimensão (min)
B)
Figura 16. Visualização dos diagramas: A) de ápices e B) de cores obtidos
por GC×GC-FID a partir de uma solução padrão da mistura de alcanos e
pesticidas (Tabela 5) preparada em solvente orgânico (metanol)
62
4.2 Aplicação do modulador a ar comprimido na avaliação do método mini-
Luke modificado para extração de pesticidas fortificados em uva e análise
por GC×GC-µECD
Os tempos de retenção de cada pesticida analisado por GC×GC-µECD na
primeira e na segunda coluna,
1
t
R
e
2
t
R
, respectivamente estão listados na Tabela
7.
Tabela 7: Pesticidas analisados por GC×GC-µECD, tempos de retenção na
primeira e na segunda coluna
Nº Pesticida Tempo de retenção na
primeira coluna (
1
t
R
) min
Tempo de retenção na
segunda coluna (
2
t
R
) s
1 Bifentrina 16,10 1,1
2 Permetrina cis 19,36 1,3
3 Permetrina trans 19,60 1,3
4 Cipermetrina I 20,94 1,3
5 Cipermetrina II 21,10 1,3
6 Cipermetrina III 21,18 1,3
7 Cipermetrina IV 21,27 1,3
8 Fenvalerato 22,61 1,4
9 Esfenvalerato 23,03 1,4
10 Deltametrina 24,03 1,5
63
min
4.2.1 Análise dos solventes e reagentes pelo método de extração mini-Luke
modificado
Ao efetuar-se o procedimento de extração descrito no item 3.8, não se
observou nenhuma contaminação dos solventes e reagentes utilizados para a
extração dos pesticidas da uva pelo método mini-Luke modificado (Figura 17).
Figura 17. Cromatograma do “branco” dos solventes e reagentes obtido por
GC×GC-µECD nas condições descritas no item 3.2
4.2.2 Validação do método de extração mini-Luke modificado para análise de
resíduos de pesticidas em uva
Todas as soluções analíticas empregadas neste estudo foram preparadas
em solvente (acetato de etila) e no extrato da uva (método de mini-Luke
modificado), assim foi possível avaliar o efeito da presença do extrato da matriz
na determinação de valores de LOD e LOQ (instrumento e método), da
linearidade das curvas analíticas (faixa linear, equação da curva e coeficiente de
determinação), uma vez que o efeito matriz pode influenciar nos resultados,
dependendo dos compostos e da técnica cromatográfica empregada.
Tanto
64
fenvalerato (soma dos isômeros esfenvalerato e fenvalerato) quanto permetrina
(soma dos isômeros cis e trans) foram quantificados somando-se as áreas dos
isômeros, de acordo com a legislação da União Européia, a qual estabelece MRL
para a soma dos isômeros destes pesticidas.
4.2.2.1 Linearidade das curvas analíticas
As Tabelas 8 e 9 apresentam as equações das curvas analíticas para os
pesticidas analisados em solvente (acetato de etila) e no extrato da matriz (uva),
respectivamente
.
Tabela 8. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas em
acetato de etila
Pesticida Equação da reta
(y=ax+b)
r
2
Intervalo linear
(mg L
-1
)
Bifentrina y = 8826,2x + 55,682 0,9979 0,01-0,5
Cipermetrina y = 14918x - 30,987 0,9994 0,02-0,5
Deltametrina y = 15848x – 7,8592 0,9989 0,01-0,5
Fenvalerato
a
y = 32024x – 2,5751 0,9991 0,01-0,5
Permetrina
b
y = 6032,5x + 55,067 0,9956 0,02-0,5
a = soma dos isômeros esfenvalerato e fenvalaerato; b = soma dos isômeros cis e trans
65
Tabela 9. Resultados obtidos para as curvas analíticas dos pesticidas no
extrato da matriz
Pesticida Equação da reta
(y=ax+b)
r
2
Intervalo linear
(mg L
-1
)
Bifentrina y = 8013x + 9,9278 1,0000 0,01-0,5
Cipermetrina y = 13752x - 119,08 0,9994 0,02-0,5
Deltametrina y = 16355x - 93,763 0,9999 0,01-0,5
Fenvalerato
a
y = 30910x - 113,87 0,9999 0,01-0,5
Permetrina
b
y = 5620,7x – 1,5159 0,9999 0,02-0,5
a = soma dos isômeros esfenvalerato e fenvalerato; b = soma dos isômeros cis e trans
A partir desses resultados pode-se concluir que a faixa linear obtida por
GC×GC-µECD foi de 2 ordens de grandeza, sendo que o primeiro ponto da curva
corresponde ao limite de quantificação do método.
Pelos coeficientes angulares (a) das equações das retas pode-se perceber
que o método apresenta maior sensibilidade para o fenvalerato (soma dos
isômeros fenvalerato e esfenvalerato) dentre os pesticidas analisados por
GC×GC-µECD.
Analisando-se as equações das retas obtidas pode-se concluir que o
modelo linear é bastante adequado já que os coeficientes de determinação (r
2
)
foram todos maiores que 0,9956 para as curvas analíticas preparadas em
solvente (acetato de etila) e maiores que 0,9999 para as curvas preparadas no
extrato da matriz (uva), o que segundo a literatura é satisfatório (BRASIL, 2003;
INMETRO, 2003).
66
4.2.2.2 Limite de detecção e limite de quantificação
A Tabela 10 apresenta os valores de LOD e LOQ para o instrumento e
método. Os limites de detecção e quantificação, os quais foram obtidos conforme
descrito no item 3.9.2, foram semelhantes para todos os pesticidas analisados.
Os valores apresentados na Tabela 10 são considerados satisfatórios, pois
permitem determinar concentrações abaixo dos limites máximos de resíduos
permitidos na Anvisa, Codex Alimentarius e União Européia (Tabela 2).
Tabela 10. Valores de LOD e LOQ para os pesticidas
Limites do instrumento
(mg L
-1
)
Limites do método
(mg kg
-1
)
Pesticida
LOD LOQ LOD
LOQ
Bifentrina 0,003 0,01 0,003 0,01
Cipermetrina 0,006 0,02 0,006 0,02
Deltametrina 0,003 0,01 0,003 0,01
Fenvalerato
a
0,003 0,01 0,003 0,01
Permetrina
b
0,006 0,02 0,006 0,02
a = soma dos isômeros esfenvalerato e fenvalerato; b = soma dos isômeros cis e trans
4.2.2.3 Precisão (repetitividade e precisão intermediária)
Os resultados de precisão para o método estão demonstrados juntamente
com os resultados de recuperação, na Tabela 11. A precisão intermediária para
os pesticidas foi realizada empregando-se dias e operadores diferentes daqueles
dos estudos de repetitividade. Os valores para a repetitividade dos pesticidas
ficaram entre 5,9 e 17,2% e para a precisão intermediária ficaram entre 2,6 e
18,4%.
67
Para validação de métodos cromatográficos, na faixa de concentração
avaliada nesse trabalho, recomenda-se que a precisão deve apresentar RSD ≤
20% (RIBANI et al., 2004). Portanto, todos os resultados obtidos estão dentro dos
limites sugeridos.
4.2.2.4 Ensaios de fortificação e extração empregando o método mini-Luke
modificado para avaliação da recuperação
A Tabela 11 apresenta os valores de recuperação obtidos para as
fortificações, em diferentes níveis de concentração, para os pesticidas, utilizando-
se o procedimento descrito no item 3.9.4. As recuperações para os pesticidas
ficaram entre 94,3 e 115,2%, com precisão menor que 18,4%.
Tabela 11. Recuperação, RSD
r
e RSD
pi
do método para os pesticidas
Repetitividade
Precisão intermediária
Pesticida
Nível de fortificação
(mg kg
-1
)
Recuperação
(%)
RSD
r
(%)
Recuperação
(%)
RSD
pi
(%)
0,02 101,9 5,9
99,9 6,6
0,05 97,6 13,2
98,4 2,6
Bifentrina
0,5 96,6 6,7
100,7 3,6
0,02 113,3 11,2
115,2 7,9
0,05 97,5 17,2
98,2 6,1
Cipermetrina
0,5 98,2 9,4
95,6 4,8
0,02 105,2 12,3
112,5 18,4
0,05 97,1 15,2
95,1 14,5
Deltametrina
0,5 97,1 10,9
103,4 6,5
0,02 107,7 7,3
110,9 10,2
0,05 99,7 12,2
94,3 9,1
Fenvalerato
a
0,5 98,4 9,8
102,7 6,5
0,02 106,6 8,7
113,7 6,7
0,05 95,3 15,2
107,5 3,8
Permetrina
b
0,5 99,0 9,0
97,3 5,0
a = soma dos isômeros esfenvalerato e fenvalerato; b = soma dos isômeros cis e trans
n = 6 (6 extrações
×
1 injeção de cada extrato)
68
A recuperação depende da amostra, do procedimento de extração e da
concentração do analito. Neste trabalho, seguiu-se a recomendação de que, para
validação de métodos cromatográficos e eletroforéticos, as recuperações devem
estar entre 70 e 120% (RIBANI et al., 2004). Todos os valores obtidos
apresentaram-se dentro desse intervalo e, portanto, o método está de acordo com
os parâmetros exigidos.
A Figura 18 apresenta o cromatograma obtido por GC×GC-µECD do
extrato da matriz “branco” preparado conforme o item 3.9.4. A Figura 19
apresenta os cromatogramas dos pesticidas piretróides obtidos por GC×GC-
µECD a partir de soluções analíticas preparadas em A) solvente orgânico (acetato
de etila) e B) no extrato da uva na concentração de 0,05 mg L
-1
. A Figura 19C
apresenta o cromatograma de um extrato da uva “branco” fortificado com os
pesticidas piretróides ao nível de 0,05 mg kg
-1
. As Figuras 20A, 20B e 20C
correspondem à visualização dos cromatogramas da Figura 19A, 19B e 19C
respectivamente em diagramas de cores.
Figura 18. Cromatograma obtido por GC×GC-µECD para o extrato “branco”
da uva
min
69
Hz
C
.
Figura 19. Cromatograma linear de uma solução analítica na concentração
de 0,05 mg L
-1
dos pesticidas analisados por GC×GC-µECD preparados em
A) solvente orgânico (acetato de etila), B) no extrato da uva; e C) extrato
“branco da matriz” fortificado com os pesticidas piretróides ao nível de 0,05
mg kg
-1
(identificação de acordo com a Tabela 7)
1
2 3
4
5
-
7
8
9 10
1
2 3
4
5
-
7
8
9
10
B
min
A
1
2 3
4
5
-
7
8
9
10
70
2
t
R
segunda dimensão (s)
1
t
R
primeira dimensão (min)
Figura 20. Diagrama de cores de uma solução analítica na concentração de
0,05 mg L
-1
dos pesticidas analisados por GC×GC-µECD preparados em A)
solvente orgânico (acetato de etila), B) no extrato da uva; e C) extrato
“branco da matriz” fortificado com os pesticidas piretróides ao nível de 0,05
mg kg
-1
(identificação de acordo com a Tabela 7)
2
t
R
segunda dimensão (s)
1
t
R
primeira dimensão (min)
1
2 3
4 5
-
7
10
8
2
t
R
segunda dimensão (s)
1
t
R
primeira dimensão (min)
1
2 3
4 5
-
7
10
8
A
B
C
8
1
2 3
4 5
-
7
9
10
9
9
71
r
2
= 1,0000
r
2
= 0,9979
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0
0,1
0,2
0,3
0,4 0,5 0,6
Solvente
4.2.2.5 Efeito matriz dos extratos de uva nas análises por GC×GC-µECD
Efeito matriz é o efeito observado pelo aumento ou decréscimo na resposta
do detector, para um determinado analito, presente no extrato da matriz,
comparado com a resposta do detector para o analito em solvente orgânico. Por
outro lado, deve-se perceber que o efeito matriz pode facilmente tornar-se maior,
em baixas concentrações do analito, pois há um decréscimo na razão da
concentração do analito:concentração da matriz (HAJSLOVÁ & ZROSTLÍKOVÁ,
2003).
O efeito matriz sempre sofre variações ao longo do tempo e também varia
dependendo da condição do instrumento utilizado, devendo, por isso, ser
constantemente avaliado, tanto na etapa de desenvolvimento do método quanto
na aplicação deste método nas análises de rotina (HAJSLOVÁ & ZROSTLÍKOVÁ,
2003).
Nas Figuras 21, 22, 23, 24, e 25 estão representadas as curvas analíticas
para os pesticidas analisados tanto em solvente (acetato de etila) quanto no
extrato da uva, onde se pode observar um efeito matriz negativo para todos os
pesticidas determinados na uva, exceto para deltametrina.
Figura 21. Curva analítica do pesticida bifentrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas condições
cromatográficas descritas no item 3.2
Área
Concentração (mg L
-
1
)
72
r
2
= 0,9994
r
2
= 0,9994
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 0,1 0,2 0,3
0,4
0,5
0,6
Solvente
Matriz
Concentração (mg L
-
1
)
Figura 22. Curva analítica do pesticida cipermetrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas condições
cromatográficas descritas no item 3.2
Figura 23. Curva analítica do pesticida deltametrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas condições
cromatográficas descritas no item 3.2
r
2
= 0,9989
r
2
= 0,9999
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
S
olvente
Matriz
Área
Concentração (mg L
-
1
)
Área
73
r
2
= 0,9991
r
2
= 0,9999
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
0 0,1
0,2
0,3 0,4 0,5 0,6
Solvente
Matriz
Área
Figura 24. Curva analítica do pesticida fenvalerato preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas condições
cromatográficas descritas no item 3.2
Figura 25. Curva analítica do pesticida permetrina preparado em solvente
orgânico (acetato de etila) e no extrato da matriz da uva nas condições
cromatográficas descritas no item 3.2
Área
r
2
= 0,9956
r
2
= 0,9999
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0
0,1
0,2
0,3
0,4 0,5 0,6
Solvente
Matriz
Concentração (mg L
-
1
)
Concentração (mg L
-
1
)
74
Os pesticidas bifentrina, cipermetrina, fenvalerato (soma dos isômeros
esfenvalerato e fenvalerato) e permetrina (soma dos isômeros cis e trans)
apresentaram considerável efeito matriz negativo, quando extraídos pelo método
de extração mini-Luke modificado. A diferença entre o sinal obtido no solvente e
na matriz pode ser atribuída a dois fatores: à interação dos componentes da
matriz com os pesticidas analisados causando uma diminuição do sinal analítico
e/ou ao aumento do ruído da linha base quando os pesticidas foram preparados
no extrato da matriz resultando em uma integração menor da área do pico
cromatográfico quando comparada às soluções dos pesticidas em solvente
orgânico. Um efeito oposto foi observado para a deltametrina, o qual pode ser
visualizado na Figura 23, onde se percebe que valores maiores de área foram
obtidos quando este pesticida foi preparado no extrato da matriz. Através do
cálculo do efeito matriz percentual valores menores que 10% foram obtidos,
sendo assim, verificou-se que para este pesticida a matriz não exerceu influência
nas análises.
De maneira geral, pode-se dizer que, para a quantificação dos resíduos de
pesticidas em extratos de uva, analisados por GC×GC-µECD, as soluções
analíticas devem ser preparadas nos extratos da matriz.
75
5. CONCLUSÃO
Neste trabalho foi demonstrado o desenvolvimento, avaliação e aplicação
de um novo modulador fixo com duplo jato de ar comprimido, com o objetivo de
reduzir o custo de análise de rotina de pesticidas, uma vez que a utilização de
nitrogênio ou dióxido de carbono para modulação, aumenta significativamente o
custo das análises.
Para a avaliação do modulador com ar comprimido foi utilizado um sistema
GC×GC-FID, o qual possibilitou a determinação de alcanos com mais de 17
carbonos e pesticidas ao nível de concentração de 0,25 mg L
-1
.
Os resultados mostraram pequenas variações das áreas dos picos, entre
0,67 e 2,80% para alcanos e 0,24 e 5,34% para pesticidas. O desvio padrão (SD)
para os tempos de retenção na primeira coluna (
1
t
R
) para alcanos e pesticidas foi
em torno de 0,05 min. Para os tempos de retenção na segunda coluna (
2
t
R
), o SD
foi 0,04 s para a maioria dos compostos, exceto para ciflutrina e permetrina (0,08
s).
A faixa linear situou-se entre 0,1 a 5,0 mg L
-1
com coeficiente de
determinação (r
2
) maior que 0,9945 para todos os pesticidas analisados por
GC×GC-FID com modulador a ar comprimido, o que mostra a possibilidade da
utilização deste sistema para a determinação de pesticidas.
Os resultados obtidos na avaliação do modulador com duplo jato de ar
comprimido mostraram que este modulador é simples, estável, robusto e de fácil
instalação, sendo possível sua utilização em análises de rotina como, por
exemplo para pesticidas. Entretanto, este modulador possui um poder de
resfriamento limitado, não sendo possível a determinação de compostos com
baixos pontos de ebulição.
O modulador desenvolvido foi aplicado na validação de método analítico
utilizando um sistema GC×GC-µECD para determinação de pesticidas piretróides
em uva, os quais foram extraídos utilizando o método de extração mini-Luke
modificado.
Na validação do método obtiveram-se resultados satisfatórios. As curvas
analíticas apresentaram valores de r
2
maiores que 0,9956 e 0,9999 para as
76
curvas preparadas em solvente orgânico (acetato de etila) e extrato da matriz
(uva), respectivamente, com faixa linear entre 0,01 a 0,5 mg L
-1
.
Os resultados obtidos através do cálculo do efeito matriz percentual
possibilitam concluir que os pesticidas piretróides avaliados apresentaram
considerável efeito matriz negativo. Devido a este fator, a quantificação deve ser
realizada em soluções preparadas no extrato da uva.
Os valores de LOQ
m
foram de 0,01 a 0,02 mg kg
-1
para todos os
piretróides. Os valores de recuperação obtidos para os níveis de fortificação 0,02,
0,05 e 0,5 mg kg
-1
ficaram entre 94,3 e 115,2%, com boa precisão (RSD<18,4%),
o que mostrou que o desempenho do método mini-Luke modificado empregado
para as extrações é satisfatório.
Este estudo mostrou também, que o sistema GC×GC-µECD com
modulador de duplo jato de ar comprimido tem potencial para aplicação nas
análises de rotina de pesticidas piretróides em uva, uma vez que obteve-se baixos
valores de LOD e LOQ, e boa precisão da resposta analítica.
77
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Desenvolvimento e validação de métodos utilizando GC×GC com modulador a ar
para separar e monitorar diferentes classes de pesticidas, tais como carbamatos,
organofosforados e organoclorados na cultura da uva;
Aplicação do modulador desenvolvido neste trabalho na comparação de
diferentes métodos de extração de pesticidas em diferentes culturas como, por
exemplo, a utilização do método QuEChERS;
Utilização do sistema GC×GC com modulador a ar para identificação e
quantificação de diferentes compostos em amostras complexas, tais como
produtos petroquímicos e amostras ambientais.
78
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