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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Arioldo Carvalho Vasconcelos Junior
Análise da Resposta Imune Celular de Pacientes com Tuberculose
Pulmonar Ativa Contra os Antígenos Recombinantes MPT-51, GLcB,
ESAT-6, Ag 85A e a Proteína do Filtrado de Cultura (CFP) de
Mycobacterium tuberculosis.
Orientadora:
Profª Dra Ana Paula Junqueira Kipnis
Dissertação de Mestrado
Goiânia-GO, 2008
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Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e
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e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo
com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para
fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção
científica brasileira, a partir desta data.
11. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese
12. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a): Arioldo Carvalho Vasconcelos Junior
CPF: 854205651-53 E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não
Vínculo Empregatício do autor Aluno
Agência de fomento: Coordenação de Pessoal de Nível Superior,
Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e
Tecnológico
Sigla: CAPES,
CNPq
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título:
Análise da Resposta Imune Celular de Pacientes com Tuberculose Pulmonar Ativa Contra os
Antígenos Recombinantes MPT-51, GLcB, ESAT-6, Ag 85A e a Proteína do Filtrado de Cultura
(CFP) de Mycobacterium tuberculosis
Palavras-chave: Tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, Antígenos recombinantes,
Resposta imune celular
Título em outra língua:
Analysis of Cellular Immune Response Against MPT-51, GLcB, ESAT-6, Ag 85A
Recombinant Antigens and the Culture Filtered Protein (CFP) from Mycobacterium
tuberculosis from Patients with Active Pulmonary Tuberculosis
Palavras-chave em outra língua: Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Recombinant
antigens, cellular immune response
Área de concentração: Imunologia
Data defesa: (21/02/2008)
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical-Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública
Orientador(a): Ana Paula Junqueira Kipnis
CPF: 370146921-00 E-mail: [email protected]
Co-orientador(a):
CPF: E-mail:
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_______________________________________ Data: ____ / ____ / ___
Assinatura do(a) autor(a)
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
1
ii
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Arioldo Carvalho Vasconcelos Junior
Análise da Resposta Imune Celular de Pacientes com Tuberculose
Pulmonar Ativa Contra os Antígenos Recombinantes MPT-51, GLcB,
ESAT-6, Ag 85A e a Proteína do Filtrado de Cultura (CFP) do
Mycobacterium tuberculosis.
Orientadora:
Profª Dra Ana Paula Junqueira Kipnis
Dissertação submetida ao
CPGMT/IPTSP/UFG como requisito
para obtenção do Título de
Mestre em Medicina Tropical na Área
de Concentração em Imunologia.
Este trabalho foi realizado com o auxílio financeiro do CNPq, CAPES e
FUNAPE-UFG.
Goiânia-GO, 2008
iii
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Vasconcelos Júnior, Arioldo Carvalho.
V331a Análise da resposta imune celular de pacientes com
tuberculose
pulmonar ativa contra os antígenos recombinantes MPT-51,
GLcB,
ESAT-6, Ag 85A e a proteína do filtrado de cultura(CFP) de
Myco-
bacterium tuberculosis / Arioldo Carvalho Vasconcelos Júnior.
–
2008.
xii,119f : figs., tabs.
Orientadora: Profª Drª Ana Paula Junqueira Kipnis.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás.
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2008.
Bibliografia: f.81-110.
Inclui listas de abreviaturas e de figuras.
Anexos.
1. Tuberculose 2. Mycobacterium tuberculosis 3. Antígenos
protéicos 4. Resposta imune I. Kipnis, Ana Paula Junqueira
II. Universidade Federal de Goiás. Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública III. Título.
CDU: 616-002.5
iv
O segredo da vida não é fazer o que se gosta,
mas sim gostar do que se faz.
v
Dedico este trabalho, primeiramente a DEUS por ter me concedido à vida.
Aos meus pais: Arioldo e Maria Eunice, pelo amor,
dedicação e apoio nos momentos difíceis de minha vida.
A minha querida namorada: Tasmânia, pelo amor, companheirismo,
compreensão e paciência.
Agradecimentos
A minha eterna gratidão a minha orientadora Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis, por ter me aceitado
em seu laboratório, pelo empenho na orientação deste trabalho e por ter me mostrado a importância de
ser um pesquisador; ao Dr. André Kipnis pelo apoio no trabalho.
vi
A todos os meus amigos do Laboratório de Imunopatologia das Doenças Infecciosas: Eduardo,
Cristina, Bruna, João, Ediane, Michelle, Rafael, Loanda, Fernando, Rogério e Hidelbrando pelo
companheirismo e amizade.
A enfermeira Colombina, do Hospital Anuar Auad, pela ajuda no recrutamento de pacientes para este
trabalho.
Ao Dr. João Alves pelo atendimento aos pacientes e o seu carinho com os mesmos, o que facilitou a
pesquisa e o acompanhamento dos doentes.
A Dra. Elisangela Ribeiro pela grande generosidade em nos conceder seu laboratório no Hospital
Araújo Jorge para a aquisição das amostras.
As doutoras Miriam Leandro Dorta e Fátima Ribeiro Dias pelo uso do seu laboratório.
A Dra. Elisangela Ribeiro, Dra. Mara Carvalhaes Silva e Dra. Aline Carvalho Batista pela
contribuição na banca de qualificação.
A todos os meus amigos de outros laboratórios: Adriano, Lucas, Ludmila, Alexsander, Hélio,
Rosidete, Hermínio, Vânia, Yana, Lorena e Camila pela convivência.
Aos funcionários do IPTSP/UFG, José Clementino “Zezinho”, Kariny, Fernando, Divina,
Aparecida pela atenção e competência.
A CAPES pela assistência financeira através da bolsa de estudos.
SUMÁRIO
Bibliografia: f.81-110. ........................................................................................................ iv
1. Tuberculose 2. Mycobacterium tuberculosis 3. Antígenos ......................................................... iv
vii
protéicos 4. Resposta imune I. Kipnis, Ana Paula Junqueira ................................................. iv
II. Universidade Federal de Goiás. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública III.
Título. ..................................................................................................................................................... iv
CDU: 616-002.5 ............................................................................................................................. iv
I – Introdução Geral ............................................................................................................................... 1
1 – Histórico .................................................................................................................. 3
2 – Epidemiologia .......................................................................................................... 4
3 – Etiologia e Patogenia ............................................................................................... 5
4 – Agente Etiológico .................................................................................................... 8
5 – Resposta Imune Inata ............................................................................................. 10
6 - Resposta Imune Celular ......................................................................................... 12
As células Th17 representam um novo subtipo de células TCD4 e oferecem
proteção contra microrganismos extracelulares. No entanto, em humanos, as
propriedades das células Th17 são parcialmente conhecidas. Sabe-se que a
presença de células Th17, produz IL-17 e IFN-. Os clones apresentaram expressão
seletiva de IL-23R, CCR6 e fator de transcrição RORt, além de exibirem
características funcionais tais como habilidade de ajudar as células B, baixa
toxicidade e pobre susceptibilidade de regulação pelas células T regulatórias
autólogas (ANNUNZIATO et al., 2007). ............................................................... 22
6.1 Formação do Granuloma ................................................................................... 22
7 – Mecanismos Micobacterianos de Evasão .............................................................. 25
8 – Proteínas do M. tuberculosis ................................................................................. 29
9 – Vacinas .................................................................................................................. 32
9.1 Bacilo Calmette-Guérin (BCG) ......................................................................... 32
9.2 Novos modelos de vacinas ................................................................................ 35
IV - Hipótese ......................................................................................................................................... 41
Objetivos Específicos: ................................................................................................. 42
1 - População de Estudo .............................................................................................. 43
2 - Antígenos Protéicos ................................................................................................ 43
3 - Coleta de Amostras ................................................................................................ 44
4 - Obtenção de PBMC (Células Mononucleares do Sangue Periférico) e Cultura
Celular ......................................................................................................................... 44
5 – Análise de IL-10 e IFN- γ intracelular em células T CD4 e CD8 por Citometria de
Fluxo ........................................................................................................................... 45
6 – Análise Estatística .................................................................................................. 46
VII - Resultados ................................................................................................................................... 47
1 - População em Estudo ............................................................................................. 47
2 - Histogramas dos linfócitos T CD4+ de pacientes com tuberculose pulmonar ativa
e controles saudáveis positivos para IFN- γ ................................................................. 47
3 - Linfócitos T CD4+ positivos para IFN- γ nas populações em estudo, em resposta
aos antígenos micobacterianos. ................................................................................... 51
4 - Histogramas dos linfócitos T CD8+ de pacientes com tuberculose pulmonar ativa
e controles saudáveis positivos para IFN- γ ................................................................. 51
5 – Análise de linfócitos T CD8 positivos para IFN- γ nas populações em estudo, em
resposta aos antígenos micobacterianos. ..................................................................... 52
6 - Histogramas dos linfócitos T CD4+ e CD8+ positivos para IL-10 de pacientes
com tuberculose pulmonar ativa e controles saudáveis .............................................. 52
viii
7 – Análise de linfócitos T CD4 e CD8 positivos para IL-10 nas populações em
estudo, em resposta aos antígenos micobacterianos. .................................................. 59
8- Análise comparativa de linfócitos T CD4 e CD8 positivos para IFN- γ e IL-10 entre
amostras de pacientes antes e após tratamento, em resposta aos antígenos
micobacterianos. ......................................................................................................... 60
XI - Referências Bibliográficas ............................................................................................................. 81
1- Termo de Concentimento dos Voluntários ............................................................ 111
2- Questionários Aplicados aos Voluntários ............................................................. 113
3- Documentos Referentes a Aprovação do Projeto de Pesquisa .............................. 115
ix
ABREVIATURAS
Ag- Antígeno
AM- Arabinomanana
APC- Célula Apresentadora de Antígeno
BAAR- Bacilo Álcool Àcido Resistente
BCG- Bacilo Calmette-Guérin
CD- Marcador de Diferenciação
Célula NK- Célula Matadora Natural
CFP- Proteína do Filtrado de Cultura
CFU- Unidade Formadora de Colônia
CNPq- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CR- Receptor de Complemento
CTL- Linfócito T Citotóxico
DC- Célula dendrítica
DNA- Ácido Desoxirribonucléico
DP- Desvio Padrão
ELISA- Ensaio Imunoenzimático
ESAT-6- Early Secreted Antigenic Target (Antígeno Alvo de Secreção Primária)
Fe- Ferro
FITC- Isotiocianato de Fluoresceína
FUNAPE- Fundação de Apoio à Pesquisa
GLcB- Malato sintase G
GM-CSF- Fator Estimulador de Colônias Monocíticas e Granulocíticas
HIV- Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA-DM- Antígeno Leucocitário Humano
IFN-γ- Interferon Gama
IL- Interleucina
iNOS- Óxido Nítrico Sintetase induzível
kDa- Quilodalton
LAM- Lipoarabinomanana
LM- Lipomanana
MD2- Proteína assessória extracelular
MHC- Complexo de Histocompatibilidade Principal
v
MIP-1- Proteína Inflamatória de Macrófagos 1
MPT-51- Proteína Micobacteriana de 27kDa com função de ligação a
fibronectina
MyD88- Molécula adaptadora da ativação celular
NFκB- Fator de Transcrição nuclear kappa B
NO- Óxido Nítrico
NTM-Micobactérias não Causadoras de Tuberculose
OMS ou WHO- Organização Mundial de Saúde
PAMPs- Padrões Moleculares Associados ao Patógeno
PBMC- Células Mononucleares do Sangue Periférico
PBS- Tampão de Salina Fosfato
PDIMs- Fetiodiolona Dimicocerosatato
PE- Ficoeritrina
PEcy5- Ficoeritrina cianina 5
PHA- Fitohemaglutinina
PIMs- Manosídeo Fosfatidilinositol
PNCT- Programa Nacional de Controle da Tuberculose
PPD- Derivado de Proteína Purificada de Mycobacterium tuberculosis
PRR- Receptor de Reconhecimento de Padrões
RD-1- Região de Diferença Genética 1
RIC- Resposta Imune Celular
SIDA- Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SNC- Sistema Nervoso Central
Tγδ- Linfócito T Gama Delta
TACO- Aspartato Triptofano Cisteína
TB- Tuberculose
TGF-β- Fator de Crescimento Tumoral Beta
Th- Linfócito T Auxiliar
TLR- Receptor Semelhante ao Toll
TNF-α- Fator de Necrose Tumoral Alfa
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática dos componentes da parede celular do
Mycobacterium tuberculosis.. ..........................................................................09
Figura 2. Representação esquemática da estrutura de um granuloma............25
Figura 3. Histograma de linfócitos T CD4
+
IFN-γ
+
em estimulo aos antígenos
recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB e Ag85A do Mycobacterium
tuberculosis........................................................................................................50
Figura 4. Porcentagem de linfócitos T CD4
+
INF-γ
+
estimulados in vitro com os
antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB e Ag85A do Mycobacterium
tuberculosis e com PHA e CFP..................................................................... 54
Figura 5. Histogramas de linfócitos T CD8
+
IFN-γ
+
em estimulo a antígenos
recombinantes do Mycobacterium tuberculosis.................................................55
Figura 6. Porcentagem de linfócitos T CD8
+
INF-γ
+
estimulados in vitro com os
antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB e Ag85A do Mycobacterium
tuberculosis e com PHA e CFP.........................................................................56
Figura 7. Histograma de linfócitos T CD4
+
IL-10
+
estimulados pelo painel de
antígenos do Mycobacterium tuberculosis.........................................................57
Figura 8. Histograma de linfócitos T CD8
+
IL-10
+
estimulados pelo painel de
antígenos do Mycobacterium tuberculosis.........................................................58
Figura 9. Porcentagem de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
positivos para IL-10
estimulados in vitro com os antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB e
Ag85A do Mycobacterium tuberculosis e com PHA e CFP...............................62
Figura 10. Porcentagem de linfócitos T CD4
+
IFN-γ
+
de pacientes com
tuberculose ativa antes e após o tratamento estimulados in vitro com os
antígenos recombinantes MPT-51(A), ESAT-6(B), GLcB(C) e Ag85A(D) do
Mycobacterium tuberculosis..............................................................................63
Figura 11. Porcentagem de linfócitos T CD8
+
IFN-γ
+
de pacientes com
tuberculose ativa antes e após o tratamento estimulados in vitro com os
antígenos recombinantes MPT-51(A), ESAT-6(B), GLcB(C) e Ag85A(D) do
Mycobacterium tuberculosis..............................................................................64
Figura 12. Porcentagem de linfócitos T CD4
+
IL-10
+
de pacientes com
tuberculose ativa antes e após o tratamento estimulados in vitro com os
antígenos recombinantes MPT-51(A), ESAT-6(B), GLcB(C) e Ag85A(D) do
Mycobacterium tuberculosis...............................................................................65
vii
Figura 13. Porcentagem de linfócitos T CD8
+
IL-10
+
de pacientes com
tuberculose ativa antes e após o tratamento estimulados in vitro com os
antígenos recombinantes MPT-51(A), ESAT-6(B), GLcB(C) e Ag85A(D) do
Mycobacterium tuberculosis..............................................................................66
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados clínicos e epidemiológicos da população em estudo.............49
Tabela 2. Média e desvio padrão do número de T CD4
+
positivas para IFN-γ e
IL-10 de controles e pacientes antes e após o tratamento................................67
Tabela 3. Média e desvio padrão do número de T CD8
+
positivas para IFN-γ e
IL-10 de controles e pacientes antes e após o tratamento................................68
ix
RESUMO
Este trabalho avaliou a resposta imune celular dos linfócitos TCD4 e TCD8 de
pacientes com tuberculose pulmonar ativa antes e após o tratamento, contra os
antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A e o Filtrado Protéico
de Cultura (CFP) de Mycobacterium tuberculosis atendidos no Hospital de
Doenças Tropicais Anuar Auad. A população de estudo, composta de 37
indivíduos, foi dividida em dois grupos experimentais. 1) 22 pacientes com
tuberculose pulmonar, selecionados de acordo com idade, diagnóstico
confirmado por baciloscopia (BAAR), radiografia evidente de tuberculose,
HIV1/2 negativos. 2) 15 controles saudáveis negativos para prova tuberculinica
(PT) e HIV1/2, pareados por faixa etária e sexo aos pacientes selecionados.
Coletou-se aproximadamente 20 ml de sangue com heparina. O sangue total
foi processado e cultivado por 96 horas na presença dos antígenos
recombinantes e os linfócitos TCD4 e TCD8 foram analisados quanto à
positividade para as citocinas IL-10 e IFN-γ por citometria de fluxo. As
porcentagens de linfócitos responsivos aos diversos antígenos de M.
tuberculosis apresentaram-se em geral superiores aos controles. A
porcentagem dos linfócitos TCD4
+
IFNγ
+
(5,63±2,43) e IL-10
+
(5,83±2,19) foram
maiores em pacientes com tuberculose pulmonar ativa em comparação com os
linfócitos TCD4
+
IFNγ
+
(1,75±0,71) e IL-10
+
(1,47±0,90) dos controles (p<0,01).
Também, as porcentagens dos linfócitos TCD8
+
IFNγ
+
(4,33±1,45) e IL-10
+
(4,01
±1,14) dos pacientes foram maiores que os linfócitos TCD8
+
IFNγ
+
(1,49±0,42) e
IL-10
+
(1,62±0,59) dos controles (p<0,01). Não houve diferença significativa
antes (5,63±2,43) e após (5,0±2,0) o tratamento nas populações celulares
TCD4
+
e TCD8
+
positivas para IFN-γ e IL-10 quando estimuladas com o painel
x
de antígenos (p>0,05). Com estes resultados podemos considerar que todos os
antígenos testados (MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A) são reconhecidos pelos
linfócitos TCD4+ e TCD8+ de pacientes com tuberculose pulmonar ativa.
Palavras-chave: Tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, Antígenos
recombinantes, resposta imune celular.
ABSTRACT
This work characterized the specific cellular immune response of TCD4 and
TCD8 lymphocytes against recombinant Mycobacterium tuberculosis at the
Hospital Anuar Auad, Goiania Brazil, and constituted of two experimental
groups: 1) 22 active TB patients with positive acid fast aputum, X-ray indicative
of tuberculosis, smear culture positive for M. tuberculosis and HIV negative. 2)
15 sex and age matched healthy controls, tuberculin skin test and HIV negative.
Venous blood was drawn and processed to obtain PBMC that were cultivated
for 96 hours with the specific antigens (1µg/10
6
cells). TCD8 and TCD4 cells
were analyzed by flow citometry for IL-10 and IFN-γ production. In general, the
percentage of positive TCD4 and TCD8 cells for IFN-γ and IL-10 were superior
among the TB patients. Additionally, TCD4
+
IFNγ
+
(5,63±2,43) and IL-10
+
(5,83±
2,19) cells were significantly higher in TB patients than in healthy controls
(TCD4
+
IFNγ
+
=1,75±0,71 and IL-10
+
=1,47±0,90), (p<0,01). Regarding the
percentage of TCD8 cells, a higher percentage of IFNγ
+
(4,33±1,45) and IL-10
+
(4,01±1,14) among TB patients than controls (TCD8
+
IFNγ
+
= 1,49±0,42 and IL-
10
+
1,62±0,59) was observed (p<0,01). TB treatment did not alter the response
xi
to the tested antigens immediately after the treatment initiation. In conclusion,
the recombinant antigens MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A were recognized by
the specific immune response of active TB patients.
Key words: Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Recombinant antigens,
Cellular immune response.
xii
I – Introdução Geral
A tuberculose é um dos maiores problemas de saúde pública mundial,
agravado depois de 1980 pelo surgimento de casos de infecção com HIV 1/2 e
o aumento da multidrogarresistência aos antibióticos. São notificados
aproximadamente 9 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes por ano,
sendo que 80% destes casos se encontram nos países em desenvolvimento. O
Brasil encontra-se em 16º lugar no “ranking” dos 22 países com maior índice de
prevalência de tuberculose (WHO, 2006).
A infecção pelo Mycobacterium tuberculosis começa com a chegada dos
bacilos aos alvéolos pulmonares (MOSMANN & SAD, 1996). A maioria dos
pacientes que desenvolvem a tuberculose apresenta sintomas que são restritos
ao pulmão (tuberculose pulmonar). Neste tipo de tuberculose os linfócitos e os
macrófagos representam os dois tipos celulares mais importantes na defesa do
organismo (SILVA & BOÉCHAT, 2004). Durante a infecção, os macrófagos são
ativados e podem eliminar as bactérias intracelulares e participar da resposta
celular do tipo Th1. As células Th1 secretam IL-2 e IFN-γ, que ativam os
mecanismos microbianos dos macrófagos, enquanto que os linfócitos Th2
produzem interleucinas do tipo IL-4, IL-5 e IL-10, que dão ênfase a produção de
anticorpos e inibem a ativação dos macrófagos (CORRIGAN & KAY, 1992;
SILVA & BOÉCHAT, 2004). As citocinas secretadas pelos linfócitos Th1/Th2
podem mutuamente regular e inibir as funções um do outro (SHER et al.,
1992). Segundo SILVA & BOÉCHAT (2004) na tuberculose existe uma
predominância dessas citocinas inibitórias, mesmo na presença de citocinas
1
ativadoras. Por outro lado, nas infecções micobacterianas, as citocinas do tipo
Th1 parecem ser essenciais na imunidade protetora (FLYNN & CHAN, 2001).
Devido ao ressurgimento e a importância da tuberculose, diversos
pesquisadores tem se dedicado a estudar vários antígenos protéicos de M.
tuberculosis com o propósito de controlar a enfermidade através do
desenvolvimento de novas vacinas, descobrir proteínas antigênicas como
ferramenta de diagnóstico eficaz, principalmente nos casos cujo diagnóstico é
impreciso, ou ainda identificar alguns antígenos específicos de determinadas
fases e tipos de tuberculose humana.
Dentre os antígenos de M. tuberculosis estudados encontram-se MPT-
51 (MIKI et al., 2004), ESAT-6 (PORSA et al., 2006), GLcB (SINGH et al.,
2006), Ag85A (HIBBERT et al., 1999) e Filtrado Protéico de Cultura (CFP). A
escolha desses antígenos, principalmente do ESAT-6, deve-se ao fato deste
ser produto da região genômica RD1 e estar presente em todas as cepas de
M. tuberculosis e cepas patogênicas de M. bovis e ainda estar ausente em M.
bovid BCG (MAHAIRAS et al., 1996; BEHR et al., 1999). Entretanto, em paises
com alta exposição ao M. tuberculosis faz-se necessária a avaliação de outros
antígenos, uma vez que o ESAT-6 não é capaz de discriminar pacientes com
tuberculose latente e ativa (CARDOSO et al., 2002; CHAPMAN et al., 2002).
Este trabalho avaliou a resposta imune celular dos linfócitos CD4 e CD8
aos antígenos MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A e CFP de pacientes com
tuberculose pulmonar atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad.
2
II - Revisão da Literatura
1 – Histórico
Há relatos de casos de tuberculose desde a história antiga, pois
pesquisadores confirmaram à existência de tuberculose em múmias do antigo
Egito que datam de 2050 a.C.(KONOMI et al. 2002; ZINK et al. 2002), porém
somente em 24 de março de 1882 foi isolado o agente causador da
tuberculose, o Mycobaterium tuberculosis, pelo cientista alemão Heinrich
Hermann Robert Koch (SHIMAO 2003 ; SHIMAO 2005).
No Brasil a trajetória da tuberculose apresentou-se diferente do curso
observado nos países industrializados, nos quais, a mudança epidemiológica
da tuberculose efetuou-se num período anterior. Nesses países, após atingir
patamares muito elevados durante o início da revolução industrial, a tendência
de declínio da enfermidade começou já na primeira metade do século XIX.
Antes mesmo da era microbiológica, sua incidência e mortalidade decresceram
principalmente em função da melhora acentuada nas condições de vida. A
introdução da quimioterapia, a partir dos anos 40, determinou nesses países
impacto de menor importância do que o verificado nas regiões não
industrializadas (DUBOS & DUBOS 1996). O período marcado pela
mortalidade mais elevada (até os anos 40) correspondeu, no Brasil, à quase
completa negligência dos órgãos e serviços públicos de saúde, os quais
estiveram prioritariamente engajados na atenção a doenças epidêmicas de
maior interesse para a política econômica. Nessa fase, a tuberculose
praticamente só foi contemplada por esforços beneficentes e iniciativas
3
privadas, que não alteraram a trajetória de sua morbi-mortalidade (MONTEIRO
1995).
Durante toda a primeira metade do século XX, a doença caracterizou-
se por elevadas taxas de mortalidade e foi uma das principais causas de óbito
nas capitais brasileiras, em geral somente superadas pelas diarréias e
pneumonias.
Estima-se que a tuberculose tenha respondido nesse período por quase
10% do total de óbitos ocorridos em São Paulo, com valores ainda maiores no
Rio de Janeiro. A faixa etária desses óbitos acompanhou os padrões
observados nos países de alta prevalência, com coeficientes mais elevados
para os menores de 5 anos de idade, entre 20 e 49 anos e 60 anos ou mais,
com predomínio do grupo de 20 a 49 anos. Em contraste com a maior
prevalência da tuberculose no sexo masculino, observada nos dias atuais, a
mortalidade devida à doença distribuíu-se com relativa eqüidade entre
mulheres e homens (GALESI 1999).
2 – Epidemiologia
De acordo com dados fornecidos pela Organização Mundial de Saúde
(OMS) a Tuberculose é uma pandemia com aproximadamente 9 milhões de
casos novos de tuberculose por ano, levando à morte 3 milhões de pessoas,
sendo que 80% destes casos se concentram em 22 países: os da África (29%
de todos os casos de tuberculose), China, Bangladesh, Indonésia, Paquistão,
Filipinas e Brasil (WHO 2006).
4
No Brasil, a tuberculose continua sendo um grave problema de saúde
pública a qual o Brasil é classificado em 16º no ranking dos 22 países com
maior índice de casos de Tuberculose sendo, juntamente com o Peru,
responsável por 50% dos casos de Tuberculose na América Latina. De acordo
com a OMS, em 2004 o Brasil notificou 110.000 casos novos de Tuberculose
(USAID 2006).
Segundo o Programa Nacional de Controle a Tuberculose (PNCT) em
Goiás há dois municípios prioritários, Goiânia e Aparecida de Goiânia. Em 2003
foram registrados 1.099 casos novos de tuberculose nestas cidades, que
representam 92,3% dos casos em todo estado de Goiás.
3 – Etiologia e Patogenia
A Tuberculose Pulmonar é uma doença causada pelo Mycobacterium
tuberculosis, transmitida de uma pessoa doente pela eliminação de gotículas e
aerossóis quando tossem e estas pequenas partículas infectantes podem
permanecer suspensas no ar por períodos prolongados (JAMES et al. 2000;
JOKLIK et al. 1994). A infecção pelo M. tuberculosis ocorre pela interação de
fatores exógenos como o contato com um paciente infectante, duração do
contato, infectividade do bacilo e o ambiente onde ocorre esse contato, uma
vez que a maior possibilidade de transmissão ocorre quando pessoas doentes
apresentam baciloscopia positiva, podem infectar 50% dos seus contactantes
(DAFFÉ & ETTIENNE 1999).
5
O M. tuberculosis entra no organismo através do trato respiratório e se
estabelece preferencialmente nos pulmões, já que é um microrganismo aeróbio
e prefere locais com alta concentração de oxigênio. A tuberculose pulmonar
pode ser classificada em primária e pós-primária (reativação ou secundária). A
tuberculose pulmonar primária ocorre pelo contato com o bacilo, e destes, 90%
desenvolvem uma resposta imune protetora levando a contenção do bacilo,
outros 5% apresentarão doença primária progressiva e outros 5% apresentarão
um desenvolvimento tardio da tuberculose, que se denomina Tuberculose de
reativação ou secundária. A forma primária da tuberculose se observa com
maior freqüência em crianças e adolescentes e em 25% dos casos o foco
primário é subpleural, nos segmentos médios pulmonares onde o fluxo aéreo é
maior e favorece o depósito dos bacilos inalados. Na maior parte dos casos, o
foco pulmonar primário consiste de apenas uma lesão. Em todos esses focos
se observam infiltrados de linfócitos, macrófagos e monócitos. Os macrófagos
fagocitam os bacilos e logo, por via linfática, os levam aos gânglios linfáticos
ocasionando adenopatias (JAMES et al. 2000; JOKLIK et al. 1994).
Na maior parte dos casos, as lesões parenquimatosas e ganglionares
curam de maneira espontânea, com calcificação, radiologicamente visíveis, o
que se denomina complexo de Ghon. Algumas vezes estas adenomegalias
podem comprimir os brônquios e causar uma obstrução, com uma erosão da
parede brônquica e consequente disseminação da infecção. Em pacientes com
transtornos imunes como a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Humana
(SIDA) e em pacientes com idade avançada, o foco primário pode se
transformar em uma área de infecção ativa chamada de tuberculose pulmonar
primária progressiva, que pode causar cavitação e disseminarem através dos
6
brônquios. Em outros casos, a primo-infecção pelo bacilo se dissemina por via
linfohematogênica produzindo lesões em mucosas, gânglios linfáticos e até
disseminação miliar (DAFFÉ & ETTIENNE 1999; JOKLIK et al. 1994).
Durante as primeiras fases da doença, os sinais e sintomas são
inespecíficos e consistem principalmente em febre, sudorese noturna, perda de
peso, anorexia, mal-estar geral e debilidade. Posteriormente a pessoa
apresenta sinais como expectoração purulenta e hemoptises. A hemoptise se
produz por erosão ou ruptura de um vaso sanguíneo na parede de uma
cavidade. Nos casos de tuberculose inativa, a hemoptise brusca pode ocorrer
devido a uma co-infecção por Aspergillus sp. nas cavidades residuais,
formando aspergilomas (JAMES et al. 2000; JOKLIK et al. 1994).
A co-infecção M. tuberculosis e Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
é uma condição clínica epidemiológica grave. Os pacientes com HIV/SIDA
apresentam um comprometimento da imunidade celular, o que favorece a
susceptibilidade à infecção pelo M. tuberculosis ou a reativação de uma
infecção prévia. A tuberculose pode se apresentar nestes pacientes de formas
variadas de acordo com o grau de imunossupressão. Quando a imunidade está
parcialmente comprometida, a tuberculose pulmonar apresenta um padrão
típico de infiltrados no lóbulo superior com cavitação, sem adenopatias
importantes. Nos casos em que a imunidade está muito comprometida pode-se
observar uma doença cavitária, disseminada, de progressão rápida e fatal
(BROOKS et al. 1999).
7
4 – Agente Etiológico
O M. tuberculosis é o agente etiológico da tuberculose pertencente à
ordem dos Actinomycetales, subordem Corynebacteriaceae, família
Mycobacteriacea, são bacilos aeróbios, não formadores de esporos, sem
flagelos, intracelular facultativo, medindo de 1 – 4 µm de comprimento por 0,3 –
0,6 µm de largura. Seu crescimento é dependente da disponibilidade de
oxigênio, nutrientes e pH, devido a isso, para serem cultivados in vitro são
necessários uso de meios enriquecidos, sólidos ou líquidos, como Lowenstein-
Jensen e Middlebrook 7H10 ou 7H11 (CRUMP et al. 2003; ADLER et al. 2005).
As bactérias do gênero Mycobacterium são bastonetes delgados, retos
ou ligeiramente curvados. Caracterizam-se por serem álcool-ácido resistentes
(BAAR). Essa resistência atribui-se a certos lipídeos de alto peso moleculares
denominados ácidos micólicos, encontrados na parede celular (MADEGAN &
PARKER 1994).
O M. tuberculosis apesar de não produzir toxinas apresenta uma
estratégia de sobrevivência que lhe é peculiar: devido ao seu crescimento
lento, consegue-se manter-se quase inativo permanecendo em estado de
latência fisiológica. A natureza química da sua parede celular e sua capacidade
de manter-se quase inativa, ou seja, a capacidade de permanecer em estado
de latência fisiológica por décadas para depois se reativar, dificulta o
diagnóstico, o tratamento e o ritmo das pesquisas (MADEGAN & PARKER
1994).
8
A parede celular do M. tuberculosis tem como principais constituintes os
lipídeos, polissacarídeos e proteínas (BRENNAN & NIKAIDO 1995; DAFFE &
DRAPER 1998). Os lipídeos constituem-se de um complexo de ácidos
micólicos, arabinogalactanas e peptidoglicano (do inglês mycolyl
arabinogalactan-peptidoglican, mAGP). O M. tuberculosis apresenta também
glicolipídeos como lipoarabinomana (LAM), lipomanana (LM) que parece ser
um precursor de LAM e fosfatidil inositol manosídeo (do inglês
phosphatidylinositol mannosides, PIMs)(MCNEIL et al 1990; DAFFE &
DRAPER 1998; MIKUSOVA et al 2000), que são fatores corda (como
dimicolato de trealose) um dos fatores de virulência que em meio glicerinado,
leva a bactéria a crescer em formato de corda (HOBDAY 1997).
Figura 1. Esquema da parede celular micobacteriana.
Fonte: http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/roese-lars-2004-06-
09/HTML/chapter1.html
9
O M. tuberculosis juntamente com M. africanum, M. bovis, M.bovis
Bacilo Calmette Guérin (BCG) e M. microti formam um complexo conhecido
como Complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) os três primeiros desse
grupo causam tuberculose em humanos e juntos com o M. leprae são as
únicas micobactérias que causam infecções e são transmitidas de pessoa para
pessoa. A identificação destes patógenos e a diferenciação de micobactérias
que não causam tuberculose (NTM) são importantes para a escolha de uma
terapia adequada. Esses membros do complexo Mtb são de crescimento lento,
com um tempo de duplicação entre 12 – 20 h., crescem em uma temperatura
entre 34 – 38ºC, e formam colônias visíveis de 2 a 6 semanas (ROBERTS
1991).
5 – Resposta Imune Inata
Os mecanismos inatos de defesa que envolvem: os macrófagos
alveolares, as células dendríticas, os neutrófilos, os linfócitos B, as células
epiteliais, as células alveolares tipo I ou tipo II e fatores solúveis como a
mucina, lisosima, lactoferrina, surfactantes, defensinas, imunoglobulinas e
proteínas do complemento, apresentam a função de manter a homeostasia
pulmonar e a eliminação de partículas e microorganismos que entram pelo trato
respiratório (KNOWLES & BOUCHER 2002; VAN CREVEL et al. 2002).
A chegada do M. tuberculosis até os alvéolos pulmonares significa que
ele superou a barreira mucociliar do trato respiratório, entretanto, faz-se
necessário que os macrófagos alveolares reconheçam o M. tuberculosis. Este
primeiro contato é crucial para definir o controle da infecção ou o
10
desenvolvimento da doença. A fagocitose do M. tuberculosis é realizada
principalmente pelos macrófagos através de diversos mecanismos, sendo
favorecida pelo surfactante A, produzido pelas células epiteliais alveolares tipo
II, aumentando a interação entre a micobactéria e os macrófagos (FREGUSON
& SCHELESINGER 2000).
O M. tuberculosis tem desenvolvido diferentes mecanismos para entrar
nos macrófagos e induzir sua própria fagocitose através de diferentes
receptores como: CD14, receptores Fc, quando a micobactéria é opsonizada
por anticorpos e receptores de complemento, já que ao ativar a via alternativa
do complemento, o componente C3b é depositado na superfície da
micobactéria e é reconhecido por CR1 e CR3/CR4 presentes na superfície dos
macrófagos. Na ausência do fator C3b, um componente da superfície do M.
tuberculosis muito parecido com a molécula C4, pode unir-se diretamente a
C2a para formar C3 convertase que cliva C3 e produz C3b. O C3b se liga à
superfície da micobactéria e facilita a sua união com o CR1 ou com os
receptores de manose que interagem com LAM, os receptores scavengers e os
receptores para o surfactante A (ERNEST 1998; ADEREM & UNDERHILL
1999).
Alguns componentes da micobactéria (arabinogalactanas,
peptideoglicanas, LAM, proteínas) podem interagir com os receptores Toll/
TLR2/ TLR4 dos macrófagos e induzir a produção de IL-1β e TNF α. Tanto IL-
1β/ IL-1R e o complexo TLR/CD14/MD2/Antígeno utilizam vias comuns de
sinalização intracelular que incluem principalmente a molécula adaptadora
11
MyD88. (UNDERHILL et al. 1999; DOHERTY & ARDITE 2004; QUESNIAUX et
al. 2004).
Apesar dos mecanismos de escape durante a fagocitose, a micobactéria
é incluída em um fagossoma, e destruída no fagolisossoma por enzimas
lisossomais e alguns de seus antígenos são processados e apresentados aos
linfócitos T CD4 via (MHC II) e CD8 via (MHC I). Os macrófagos, além de
serem as células efetoras, funcionam como células apresentadoras de
antígenos (APC) e podem definir o curso da resposta imune adaptativa (Th1 ou
Th2) (RUSSEL 1999). Este é o passo de transição entre a resposta imune
inata e a resposta imune adaptativa, que se baseia no reconhecimento
específico entre diferentes células e a secreção de fatores solúveis como as
citocinas e quimiocinas. WANG et al. 2005 observou que o M. tuberculosis
inibe a expressão do gene HLA-DR in vitro, a qual é regulada normalmente por
IFN-γ, o que pode dar lugar ao desenvolvimento de uma infecção latente,
podendo justificar porque alguns indivíduos controlam a infecção enquanto
outros são susceptíveis.
6 - Resposta Imune Celular
O desenvolvimento da resposta imune adaptativa depende em grande
parte da eficiência da resposta imune inata. Acredita-se que existem dois tipos
de respostas imunes adaptativas. A resposta imune humoral (Th2) e
regulatória, que não é protetora para tuberculose e que se caracteriza pela
produção de citocinas como IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-10 e TGF-β. Estas
citocinas antagonizam a resposta imune celular (RIC) tipo Th1, eficiente nas
infecções causadas por microrganismos intracelulares e caracterizadas pela
12
produção de citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 e TNF-α (SCHLUGER
2001; FLYNN & CHAN 2001).
Na tuberculose pulmonar, o M. tuberculosis entra no organismo por via
aérea e alcança os alvéolos pulmonares interagindo com células epiteliais tanto
do alvéolo como do espaço peribronquial, as quais podem secretar quimiocinas
e alguns peptídeos antimicrobianos que eliminarão pequena quantidade destas
micobactérias. Posteriormente, a micobactéria é fagocitada pelos macrófagos
residentes não ativados e controlam a infecção e ao mesmo tempo produzem
citocinas como IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α, importantes para o recrutamento e
ativação de células do sistema imunológico (SILVA & BOÉCHART et al. 2004).
A IL-12 é uma citocina de produção precoce sendo produzida
principalmente pelos monócitos, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas.
Estruturalmente, a IL-12 se encontra constituída por duas subunidades, a p35 e
a p40, que se unem covalentemente para formar a molécula biologicamente
ativa p70. A produção de IL-12 é induzida por citocinas como IFN-γ, TNF-α e
GM-CSF, enquanto que IL-10, IL-4 e TGF-β têm um efeito antagonista sobre as
células que produzem IL-12. A IL-12 tem um papel importante no controle da
infecção, pois favorece uma resposta imune celular na tuberculose tendo
funções importantes como: 1) induzir a produção de IFN-γ, pelos linfócitos T
CD4 e CD8, 2) induzir a proliferação de linfócitos T CD4, 3) favorecer a
expansão clonal de células Th1 e 4) aumentar a citotoxicidade dos linfócitos
CD8 e das células NK (TRINCHIERI 1995; SANO et al. 1999; XING &
SANTOSUOSSO 2000). Além desses efeitos, a IL-12 ativa células do sistema
imune inato, mais diretamente as células NK (Natural Killer) que aumentam a
13
secreção de interferon-gama (IFN-γ) (MAHESHWARI et al 2002; JUNQUEIRA-
KIPNIS et al 2003).
O IFN-γ age sobre os macrófagos estimulando a fagocitose e os
mecanismos de ativação celular, levando a maior produção de TNF-α e a
produção de mediadores da oxidação, como intermediários do oxigênio e
nitrogênio, elementos importantes para a destruição da bactéria dentro do
macrófago (MURRAY et al 1985; CHAN et al 1992; CIFONE et al 2001).
Estudos realizados com monócitos humanos e macrófagos de
camundongos infectados com M. tuberculosis, Staphylococcus aureus mortos e
partículas de látex de diferentes diâmetros, por meio da técnica de RT-PCR e
ELISA, demonstraram que a fagocitose constitui um sinal potente para induzir a
expressão e produção de IL-12, mostrando que a expressão da subunidade
p40 começa em 3 horas, alcançando níveis máximos entre 3 – 6 horas. e
diminuindo entre 18 – 24 horas. (TRINCHIERI 1995; GATELY et al 1998). A IL-
12 tem um papel fundamental na indução da produção de IFN-γ , citocina esta
que desempenha uma importante função na resposta do tipo Th1 (Van
CREVEL et al 2002; ORME 2004). Na tuberculose humana a IL-12 foi
encontrada em infiltrados pulmonares (CASARINI et al 1999; TAHA et al 1997),
no líquido pleural (ZHANG et al. 1994), em granulomas (BERGERON et al.
1997) e em linfoadenite (LIN et al 1996). A expressão dos receptores para IL-
12 também esta aumentada no sítio da infecção (ZHANG et al 1999). Por outro
lado, outra citocina, a IL-1 produzida por macrófagos, promove a produção de
IL-2 e a expressão do receptor para IL-2 com uma subseqüente expansão
14
clonal de linfócitos T CD4, assim como a IL-12 produzida pelos macrófagos
(ORME & COOPER 1999).
Várias subpopulações de linfócitos T estão envolvidas na resposta à
tuberculose, além de mecanismos múltiplos de reconhecimento de antígenos e
funções efetoras distintas no controle do M. tuberculosis (STENGER &
MODLIN 1999). Fenotipicamente, as células T que contribuem para uma
imunidade protetora incluem os linfócitos T CD4
+
, CD8
+
, TCR αβ e γδ, e as T
duplo negativas. Os antígenos peptídicos e não peptídicos podem ser
reconhecidos pelas células T (CONSTANT et al 1994; PORCELLI 1995;
NEWPORT et al 1996).
Um fato importante na resposta imune ao Mycobacterium sp é o
mecanismo que leva a apresentação de seus antígenos. Até recentemente,
acreditava-se que a resposta imune ocorria apenas aos peptídeos derivados de
proteínas de Mycobacterium sp, que seriam apresentadas às células T, em
moléculas de complexo de histocopatibilidade principal de classe I ou II (MHC I
ou II). Entretanto, hoje se sabe que estruturas não protéicas como lipídeos
micobacterianos, podem ser reconhecidas pelas células T de humanos em
moléculas de MHC não polimorficas como a CD1 (PORCELLI et al 1992;
ROSAT et al 1999).
Na resposta imune efetora ao M. tuberculosis, em humanos, observa-se
que os linfócitos TCD4 produzem IFN-γ e podem também ter uma função
citolítica, particularmente na resposta imune nos pulmões. Além dos linfócitos
TCD4 e as células NK, outra fonte importante de IFN-γ são os linfócitos TCD8
(TCR αβ), os quais reconhecem antígenos micobacterianos em moléculas
15
MHC I ou CD1 em humanos, apresentando funções de citotoxicidade sobre as
células infectadas através de um mecanismo dependente de grânulos que são
secretados no espaço intercelular e que posteriormente entram na célula
infectada para exercer sua função citolítica. Nesses grânulos se encontram
proteínas importantes como as perforinas, as quais formam trímeros que se
inserem na membrana celular e facilitam a entrada de granzimas e
granulisinas, sendo estas últimas, as responsáveis pela ativação da via das
caspases que culminará com a morte por apoptose da célula infectada e
consequentemente do bacilo (STENGER et al 1998; ORME & COOPER 1999;
TAN et al 2000; RAJA 2004; KAUFMANN 2004).
O IFN-γ produzido por diferentes populações de linfócitos T e células NK
interage com seu receptor, IFN-γ R, expresso na membrana dos macrófagos. O
receptor do IFN-γ é formado por uma cadeia α e uma cadeia β (IFN-γ R1 e IFN-
γ R2 respectivamente) e são responsáveis em iniciar os sinais intracelulares, o
qual disparará a expressão de genes envolvidos na ativação dos mecanismos
bactericidas das células fagocíticas. O IFN-γ induz à produção de
intermediários do oxigênio; intermediários do nitrogênio; a acidificação do
fagossoma e a fusão do fago-lisossoma; a expressão de iNOS2 para a
produção de óxido nítrico utilizando L-arginina como substrato; a redução de
ferro intracelular para limitar o desenvolvimento da micobactéria através da
desregulação do receptor para transferrina; o aumento das moléculas MHC I e
II envolvidas na apresentação de antígenos; e o aumento da capacidade de
fagocitar, além de induzir a produção de IL-12 (FLYNN & CHAN 2001; BOEHM
1997).
16
Na tuberculose pulmonar humana existe uma correlação entre a
produção de IFN-γ e as manifestações clínicas da doença, quanto mais severa
a doença, níveis mais baixos de IFN-γ são produzidos pelas células
mononucleares do sangue periférico (SODHI et al 1997). No entanto, à medida
que se avança na quimioterapia, o IFN-γ começa a expressar-se novamente
(TORRES et al 1998). A importância do IFN-γ foi confirmada quando pacientes
com alterações genéticas no Receptor de IFN-γ, mostraram maior
susceptibilidade a infecções disseminadas e os monócitos não foram ativados
adequadamente (TORRES et al 1998).
Estudos realizados in vitro com células mononucleares de pacientes com
infecções micobacterianas causadas por BCG, M. avium, M. abscessus e
outras micobactérias atípicas têm demonstrado a existência de alterações
genéticas, que incluem mutações pontuais, deleções e substituições nos genes
que codificam as subunidades do receptor de IFN-γ (IFN-γ R1 e R2), gerando
proteínas não funcionais que impedem a ativação dos monócitos, o qual
determina a susceptibilidade a infecções disseminadas causadas por
patógenos intracelulares. A disseminação neste caso pode ser conseqüência
da falta de formação de granuloma, devido à falta de produção de citocinas,
principalmente TNF-α e quimiocinas envolvidas neste processo. Também, as
vezes, o IFN-γ exógeno não ativa os monócitos/macrófagos, e estas células
passam a ser permissivas para a multiplicação das micobactérias (DUPUIS et
al 2000; BONECINI-ALMEIDA et al 2004)
Além das alterações genéticas nos IFN-γ R, outros estudos têm
demonstrado que as alterações genéticas da subunidade p40 de IL-12 e de
17
uma subunidade de seu receptor provocam uma produção deficiente de IFN-γ
facilitando as infecções disseminadas por micobactérias (JOUANGUY et al
1999). Estes estudos evidenciam a importância da interação e co-regulação
entre o IFN-γ e IL-12, uma vez que quando a produção de alguma destas
citocinas e seus receptores se encontram alterados por processos infecciosos,
principalmente intracelulares, ou por alterações genéticas, se observa uma
resposta imune deficiente do hospedeiro diante de infecções intracelulares
(DUPUIS et al 2000; JOUANGUY et al 1999).
Outra citocina importante na resposta imune celular contra o M.
tuberculosis é o fator de necrose tumoral (TNF-α), principal mediador da
resposta inflamatória aguda frente a microrganismos intracelulares, este
mediador também é responsável por muitas complicações sistêmicas das
infecções graves. A principal fonte celular de TNF-α são os monócitos e
macrófagos ativados, mas também podem ser secretadas por linfócitos T
estimulados por antígenos, células NK e mastócitos. O sinergismo do TNF-α
com o IFN-γ contribui para a resistência ao M. tuberculosis porque induz a
expressão da enzima iNOS2 nos fagócitos mononucleares e produção de óxido
nítrico, óxido nitroso e nitrito, moléculas envolvidas na destruição da
micobactéria. Há evidências experimentais que mostram a importância do
óxido nítrico na defesa do paciente com tuberculose pulmonar humana. Estudo
histoquímico tem detectado altos níveis de iNOS2 em macrófagos obtidos de
lavado brônquico alveolar de pacientes com tuberculose pulmonar, quando
comparados a macrófagos de pessoas sadias (NICHOLSON et al 1996). Uma
das funções mais importantes do TNF-α é a indução da formação do
granuloma, que constitui um mecanismo de defesa para evitar a disseminação
18
da infecção. Também o TNF-α induz a expressão de RANTES, MCP-1 e IL-8
que recrutam células do sistema imune para o local da infecção (SADEK et al
1998).
O epitélio pulmonar que cobre cerca de 70 m
2
do trato respiratório é
outra fonte importante de quimiocinas durante a tuberculose pulmonar. Foi
demonstrado que células epiteliais alveolares humanas tipo II (A549) são
capazes de produzir IL-8 ao serem infectadas in vitro com M. tuberculosis
H37Rv. O mecanismo de sinalização intracelular envolvido neste evento é
dependente de IL-1β produzida pelos monócitos como conseqüência da
fagocitose do M. tuberculosis, tendo como fator de transcrição nuclear o NFĸβ
(WICKREMÁSINGHE et al 1999).
Infecção com diferentes cepas vivas de M. tuberculosis H37Ra, H37Rv,
menos o M. avium induzem a produção de MCP-1 e IL-8 em níveis
comparáveis, mostrando assim que a quantidade de quimiocinas produzida é
independente da virulência do M. tuberculosis, mas dependente do crescimento
de micobactérias, já que a presença de micobactérias mortas não induz a
produção destas quimiocinas (WICKREMÁSINGHE et al 1999).
De acordo com DIELI et al (2000) os linfócitos Tγδ têm uma função
importante na tuberculose pulmonar: esses linfócitos são uma das primeiras
células recrutadas até o sítio de infecção e secretam quimiocinas e citocinas. A
subpopulação dos linfócitos T γδ Vγ9δ2 participam da resposta imune protetora
contra o M. tuberculosis por produzirem citocinas que têm a capacidade de
matar macrófagos infectados com M. tuberculosis, mediante mecanismos de
citotoxicidade dependente de grânulos similares aos linfócitos T CD8. No
19
entanto, estudos realizados com PBMC e lavado brônquico provenientes de
pacientes com tuberculose têm demonstrado que a infecção por M.
tuberculosis induz uma diminuição na população de linfócitos T Vγ9 e Vδ2
comparados com indivíduos sadios e indivíduos com doenças granulomatosas
como a sarcoidose (Li et al 1996). Nesse caso, parece que esta diminuição
seja devido a apoptose induzida pela via Fas/ Fas ligante dos linfócitos T Vγ9
/Vδ2 reativos a antígenos de M. tuberculosis (LI et al 1998; ORDWAY et al
2004; ORDWAY ET al 2005,).
O mecanismo de apoptose das células infectadas pelo M. tuberculosis,
induzido pelos linfócitos Tγδ, tem sido explorado como um mecanismo de
evasão da resposta imune (MANFREDI et al 1998), pois tem sido demonstrado
que o óxido nítrico produzido pelos macrófagos infectados e ativados impede
os linfócitos Tγδ de morrerem por apoptose ao bloquear a acumulação
intracelular de ceramidas e a ativação das caspases envolvidas neste processo
sem afetar a expressão de CD95 e CD95L (SCIORATI et al 1999).
A resposta imune celular na tuberculose envolve a participação dos
linfócitos T CD4 (αβ TCR), CD8 (αβ TCR) e linfócitos Tγδ que têm funções
similares, mas ao mesmo tempo cada um destes linfócitos tem características
particulares. A primeira particularidade é que os linfócitos T CD8 e linfócitos
Tγδ têm uma vantagem sobre os linfócitos T CD4 porque estes não
reconhecem moléculas MHC I que é expressa praticamente por todas as
células do hospedeiro, enquanto que moléculas de MHC II são expressas
apenas por certas células do hospedeiro, como os fagócitos mononucleares
(APCs). Ainda que o M. tuberculosis infecta principalmente estes fagócitos, as
20
células epiteliais alveolares do pulmão são infectadas, e estas podem ser
reconhecidas por linfócitos T CD8 e linfócitos Tγδ e não por linfócitos T CD4. A
segunda particulariedade é quanto à cinética de ativação: os linfócitos Tγδ são
os primeiros a chegar ao local da infecção; e os linfócitos TCD4 e CD8
provavelmente não têm função efetora tão rápida, mas durante a infecção
estas células aparecem na seguinte ordem: polimorfonucleares, células NK,
linfócitos T γδ, linfócitos T αβ (CD4, CD8) (CHAN & KAUFMAN 1994).
As células T regulatórias, T reg, são um subtipo de células TCD4 que
são essenciais na prevenção da autoimunidade. Essas células também
suprimem a resposta imune a microrganismos. Em pulmões de camundongos
infectados com M. tuberculosis, as células Treg se acumulam em elevados
números em todos os locais onde as células TCD4 são encontradas, incluindo
as regiões perivascular/peribronquial e nos granulomas (SCOTT-BROWNE et
al., 2007a).
A regulação de eventos pró-inflamatórios na resposta imune ao M.
tuberculosis é crítica para prevenir injúrias teciduais. Sendo assim, a IL-10 é
uma importante citocina anti-inflamatória secretada na tuberculose humana,
porém pouco se sabe a respeito do modo como essa citocina é liberada
(SCOTT-BROWNE et al., 2007b). A IL-10 é um mediador da diminuição do
IFN-γ na resposta a doenças por patógenos intracelulares. Como os próprios
patógenos induzem a produção de IL-10 pelos fagócitos mononucleares,
anticorpos para esta citocina aumentam a produção de IFN-γ pelas PBMC em
resposta a antígenos micobacterianos (CARVALHO et al., 1994). As
micobactérias e outros patógenos intracelulares são potentes indutores de IL-
21
10 e o desenvolvimento da tuberculose está freqüentemente associado com a
falha na produção de IFN-γ (ZHANG et al., 1995). Segundo GONG et al. (1996)
o mecanismo pelo qual a IL-10 inibe a resposta imune Th1 é através de
citocinas e moléculas co-estimulatórias como CTLA-4.
As células Th17 representam um novo subtipo de células TCD4 e
oferecem proteção contra microrganismos extracelulares. No entanto, em
humanos, as propriedades das células Th17 são parcialmente conhecidas.
Sabe-se que a presença de células Th17, produz IL-17 e IFN- . Os clones
apresentaram expressão seletiva de IL-23R, CCR6 e fator de transcrição ROR
t,
além de exibirem características funcionais tais como habilidade de ajudar as
células B, baixa toxicidade e pobre susceptibilidade de regulação pelas células
T regulatórias autólogas (ANNUNZIATO et al., 2007).
6.1 Formação do Granuloma
A reação granulomatosa é um padrão de reação inflamatória crônica no
qual há predominância de macrófagos, com uma aparência semelhante a uma
célula epitelial, neste tipo de lesão têm-se uma agregação de células
epitelióides, juntamente com macrófagos e células gigantes e intensa
deposição de cálcio na lesão. As células epitelióides ocupam, inicialmente, a
porção central do granuloma. Na periferia, são observados linfócitos do tipo T,
os quais caracterizam uma resposta de hipersensibilidade tardia, acredita-se
que modulem a resposta dos macrófagos. Mais na periferia ainda prolifera
fibroblastos e vasos sangüíneos, os primeiros para dar suporte a estrutura
22
granulomatosa e os segundos, para nutri-la. Segundo TSAI et al. (2006) o
tecido granulomatoso de camundongos infectados com M. tuberculosis são
relativamente aeróbios, sugerindo que o modelo de tuberculose persitente pode
não ser o mais adequado para o estudo da resposta hipóxica de M.
tuberculosis. Com o passar do tempo e o crescimento do granuloma, sua
porção central pode sofrer necrose caseosa, devido à carência nutricional.
Formam-se, então, um centro necrótico na região central e tal agregação é
geralmente circundada por linfócitos e, ocasionalmente, por plasmócitos.
(DANNENBERG 1991; GONZALEZ-JUARRERO et al 2001; ALGOOD et al
2005; TSAI et al 2006). O tecido granulomatoso tem estrutura organizada, cuja
formação é regulada por recrutamento de células imunes específicas e que
exibem relação espacial uma com a outra. O agregado de linfócitos B é uma
característica proeminente tanto no camundongo quanto nos humanos.
O mecanismo que desencadeia a formação do granuloma ocorre
inicialmente com uma resposta imune ao M. tuberculosis (WANGOO et al;
2005), após à exposição ao antígeno, o fator de necrose tumoral (TNF-α) pré-
estocado é liberado pelos macrófagos, recrutando neutrófilos e monócitos
circulantes. Ao mesmo tempo, o IFN-γ produzido pelas NK e Tγδ, ativa
macrófagos e células dendríticas. Essas células liberam quimiocinas, TNF-α e
IL-1, as quais alteram a microcirculação local e facilita o tráfego celular para o
tecido. Após algum tempo, as células dendríticas carregadas com antígenos,
migram para os linfonodos drenantes, iniciando a resposta linfocítica. Essas
células dendríticas produzem interleucina-12 (IL-12) e apresentam o antígeno
para as células TCD4
+
naïve (SAUNDERS et al 2002). Sobre a influência da IL-
12, as TCD4
+
virgem diferenciam-se em Th1. Estas por sua vez secretam IL-2,
23
que leva a expansão clonal destas células antígeno específicas. Assim estas
células Th1 ativadas vão para o local onde ocorreu a alteração da
microcirculação. A interação entre Th1 e macrófagos ativados através das
moléculas CD28/B7, levando as células Th1 a produzirem IFN-γ, esta por sua
vez ativará outros macrófagos. Estes depois de ativados se transformarão em
células gigantes multinucleadas ou células epitelióides (ARDELEANU et al
1999; CIPRIANO et al 2003), que ativam os fibroblastos, os quais produzem
colágeno, elastina que promoverão uma lesão endurecida e tumefeita, o
granuloma (GOLDSBY et al 2000; WANGOO et al 2005).
24
Figura 2. Principais células que formam o granuloma de tuberculose.
Fonte:GOLDSBY et al. (2000)
7 – Mecanismos Micobacterianos de Evasão
A patogenicidade das micobactérias é multifatorial e depende dos
seguintes fatores: capacidade de colonizar a superfície das mucosas,
penetração nas células do hospedeiro, multiplicação no tecido hospedeiro,
resistência, lesão dos tecidos e interferência nos mecanismos de defesa do
hospedeiro. Em relação a este último aspecto, é importante mencionar os
mecanismos que utiliza o M. tuberculosis como estratégia para poder escapar
dos mecanismos imunológicos e sobreviver nas células do hospedeiro (DAFFÉ
& ETTIENE 1999). Como exemplo, observa-se que a micobactéria induz
diminuição na expressão de moléculas MHC II reduzindo a apresentação de
antígenos o que assegura a persistência dentro de seu nicho (HMAMA et al
1998; KEANE et al 1997).
25
Bactéria
intracelular
Macrófagos
ativados
Célula gigante
multinucleada
Célula
epitelióide
Célula Th1
A parede celular das micobactérias patogênicas influi notavelmente na
resistência passiva aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Através de
microscopia eletrônica, em células infectadas observa-se que a parede celular,
vista como uma zona eletrotransparente, separa as micobactérias do conteúdo
fagolisossomal, potencialmente tóxico. Presume-se que o conteúdo lipídico da
parede celular impede a degradação da bactéria, pelas enzimas das células de
defesa do hospedeiro assim como impede o contato das enzimas com as
estruturas micobacterianas proteicas. Além disso, na parede celular existem
substâncias como o superperóxido dismutase, catalase, peroxidase e o sistema
tioredoxina, que são capazes de inativar radicais livres de oxigênio e outras
substâncias que poderiam atravessar a parede celular da micobactéria (DAFFÉ
& ETTIENE 1999; MALDONADO 1999).
Componentes específicos da parede, como o LAM, são considerados
importantes imuno-moduladores que afetam a resposta imunológica do
hospedeiro frente a uma infecção por micobactérias. LAM isolado de M.
tuberculosis e M. leprae tem se mostrado como causa da supressão da
proliferação de linfócitos T (CHATTERJEE et al 1991), interferindo também na
ativação dos macrófagos mediado pelo IFN-γ (SIBLEY et al 1988). Esta
molécula está envolvida na evasão aos radicais livres de oxigênio, inibe a
ativação da proteína quinase (CHAN et al 1991) e fator estimulador de colônia
monocíticas e granulocíticas (GM-CSF) em células humanas (BARNES et al
1992). LAM também está envolvida na produção de citocinas por células
mononucleares (SIBLEY et al 1988) e na ativação do sistema complemento
(HETLAND et al 1998).
26
A linfoproliferação pode também ser inibida de forma não específica por
glicolipídios fenólicos e por fosfatidil inositol de bactérias. Estes lipídeos
também são capazes de inibir a proliferação de monócitos induzidos pelos
antígenos das micobactérias. A ação destas substâncias traz como
conseqüência uma troca na produção de citocinas e a não ativação dos
macrófagos, assim inibem os principais mecanismos bactericidas
(MOHAGHEGHPOUR et al 1998). O composto sulfatado SL – I e componentes
do complexo antigênico 85, especificamente as proteínas de 30-31kDa
induzem a secreção de TNF-α pelos monócitos, que pode explicar parte das
manifestações da patologia como a formação de granulomas, febre e caquexia.
Também estimula a secreção de IL-1β que ocasiona o aumento de cortisol
tissular, aumento da produção de IL-10 e disfunção dos macrófagos (DAFFÉ &
ETTIENE 1999; MALDONADO 1999). Entre as substâncias produzidas pelos
bacilos, analisadas de cepas virulentas de M. tuberculosis, a mais estudada é o
fator Corda ou Trehalose 6,6 dimicolato, que forma parte da parede celular.
Esta substância permite que os bacilos se unam em forma paralela, compacta,
formando cordões serpenteantes nos meios de cultivo. Nos tecidos vivos, esta
substância atua sobre as mitocôndrias inibindo a respiração e a fosforilação
oxidativa, tem atividade granulomatogênica e inibe a migração de leucócitos
polimorfonucleares. Devido à trehalose 6,6 dimicolato se encontrar nas
camadas mais internas da parede celular, sua atividade tóxica poderia ser
exercida apenas quando as micobactérias infectantes são destruídas pelo
sistema imune. A atividade desta substância é aumentada pelos sulfatados,
constituintes da parede celular (DAFFÉ & ETTIENNE 1999).
27
As micobactérias patogênicas são capazes de inibir a fusão dos
fagossomas e lisossomas, este fenômeno está associado à liberação
bacteriana de derivados sulfatados a partir de uma glicoproteína de sua parede
celular (trehalose 2-sulfato), que detém a maturação do lisossoma no estágio
de endossoma primário. Também, existe a retenção da proteína de superfície
que contém aspartato e triptofano (TACO) no fagossoma primário, prevenindo
a fusão com os lisossomas maduros (KEANE et al 1997). Caso ocorra a união
do fagossoma com o lisossoma, as micobactérias liberam grandes quantidades
de amônio e alcalinizam o conteúdo intralisossomal, inativando muitas enzimas
(PACHECO et al 1992; FLYNN & CHAN 2001; STUGILL-KOSZYCKI et al 1994;
ULRICH & KAUFMANN 2002). Também, recentemente se identificou que uma
mutação no gene mmpL 7, que é responsável pelo transporte de tiocerol
dimicoserosato nas micobactérias e tem um papel importante na evasão. Os
ésteres de tiocerol dimicocerosato (PDIMs) (HOTTER et al 2005), presente na
superfície da parede do bacilo, facilitam o crescimento e a persistência das
micobactérias no tecido pulmonar (CHRISTENSEN 2000).
A micobactéria tem um requerimento obrigatório de ferro para
sobreviver, enquanto que os macrófagos requerem ferro (Fe
3+
) como co-fator
para indução de mecanismos bactericidas, o qual estabelece uma competição
entre a célula do hospedeiro e o M. tuberculosis para a aquisição desta
molécula essencial. A célula adquire o Fe através do receptor transferrina (TfR)
que captura o Fe extracelular e o internaliza unida a transferrina e a
lactoferrina, depois este complexo se dirige ao compartimento onde se reciclam
nos endossomas primários e as condições de pH facilitam a liberação do Fe da
transferrina. Existem algumas estratégias que o M. tuberculosis tem
28
desenvolvido para ter acesso a esta fonte de Fe: a) o fagossoma
micobacteriano está restringido em sua maturação e permanece na via de
reciclagem endossomal de maneira que a micobactéria tem livre acesso ao TfR
com o Fe unido a transferrina. B) a micobactéria tem moléculas especializadas
que se unem ao Fe denominadas sideróforos que tem alta afinidade por Fe
intracelular, e o transferem para moléculas micobacterianas denominadas
micobactinas, que são fatores quelantes de Fe que competem com a ferritina e
a transferrina para capturá-lo; estas se localizam na parede celular da
micobactéria (WANG et al 2005). Estudos in vitro utilizando gálio que interfere
no metabolismo do Fe adquirido por M. tuberculosis, têm demonstrado que os
macrófagos humanos tratados com gálio causam a morte da micobactéria
(OLAKANMI et al 2000).
Existem outros mecanismos de dano aos tecidos do hospedeiro que não
estão bem esclarecidos. Entre eles se encontra a atividade hemolítica
dependente de contato produzida pelas fosfolipases micobacterianas e o
escape do M. tuberculosis dos fagossomas e a subseqüente multiplicação
extracelular (DAFFÉ & ETTIENNE 1999).
8 – Proteínas do M. tuberculosis
O MPT-51 (Rv3803c) é um antígeno de 27 KDa codificado na região
FbpC1 adjacente ao gene FbpA do M. tuberculosis também denominado como
Ag.85 D ou MPB 51 (NAGAI et al 1991; RAMBUKKANA et al 1993). Apesar de
possuir 40% de homologia ao complexo Ag85 este não possui atividade micolil
transferase (RINKE de WIT et al 1993; WILSON et al 2003; 2004)
caracterizando-o como uma nova família não catalítica que liga-se a
29
fibronectina (KITAURA et al 2000). O MPT51 é expresso em outras
micobactérias como M. leprae (RINKE de WIT et al. 1993), M. avium (OHARA
et al 1997a) e M. bovis BCG (OHARA et al 1997b). Este antígeno tem se
mostrado um bom marcador para diagnóstico de tuberculose principalmente
em pacientes co-infectados com HIV (SINGH et al 2005).
O ESAT-6 (Rv3875) com peso molecular de 6-KDa, (do inglês early
secretory antigenic target 6) caracterizado por Sorensen et al (1995), é uma
proteína codificada na região RD-1 (do inglês regions of difference) (Brodin et
al 2006) de várias espécies do complexo M. tuberculosis, exceto nos subtipos
do M bovis BCG (SORENSE et al. 1995; MAHAIRAS et al 1996; BERTHET et
al 1998). Estudos em animais infectados com M. tuberculosis, tratados e
reinfectados, foi observado o desenvolvimento de forte resposta de células T
ao ESAT-6, sugerindo que esta proteína é relevante fonte de imunidade
protetora na infecção pelo M. tuberculosis (HAUBNER 1994; FAN et al 2006; LI
et al 2006).
O gene GlcB foi identificado no Mycobacterium tuberculosis e codifica
uma malato sintase G (MSG) (referência Rv 1837c). O antígeno GlcB é uma
proteína monomérica de 80 kDa com 741 resíduos de aminoácidos, sendo
homóloga a malato sintases (AceB) da bactéria Gram positiva
Corynebacterium glutamicum e a MSG da bactéria Gram negativa Escherichia
coli, com cerca de 60% de identidade (FLORCZYK et al 2001). Sabe-se que
durante a infecção persistente pelas micobactérias, as mesmas necessitam
mudar o metabolismo para o ‘bypass‘ glioxilato. Nesta via as duas enzimas
presentes são a isocitrato liase (ICL) e a malato sintase (GlcB). No ‘bypass’
glioxilato a ICL e a GlcB atuam seqüencialmente para converter isocitrato a
30
succinato mais glioxilato e glioxilato mais acetil-CoA a malato e CoA,
respectivamente. Juntas estas duas enzimas propiciam o ‘bypass’ de duas
etapas oxidativas do ciclo do ácido tricarboxílico, permitindo a incorporação de
carbono nas cadeias durante o crescimento da maioria dos microorganismos,
de acetato ou ácidos graxos como fonte primária de carbono. È fundamental
salientar que os mamíferos não utilizam esta via metabólica. Especificamente a
GlcB catalisa a condensação do glioxilato e acetil-CoA para formar o
intermediário malil-CoA, o qual é subseqüentemente hidrolisado para liberar os
produtos malato e coenzima A. Devido a importância do GlcB para o
estabelecimento e a persistência da infecção pelo M. tuberculosis, a mesma
parece ser um alvo promissor para o desenvolvimento de novos agentes
inibidores, principalmente tendo-se em mente que o desenvolvimento de
drogas que atuem nas vias de persistência da infecção são fundamentais na
luta antituberculosa. A organização ‘TB Alliance’ em conjunto com a ‘Rockfeller
University’ e o laboratório ‘GlaxoSmithKline’ trabalham para o desenvolvimento
de inibidores de malato sintase (FLORCZYK et al 2001; SMITH et al 2003).
As proteínas do complexo 85 são produzidas por M. tuberculosis em
abundância e tem sido demonstrado que proporciona imunogenicidade nos
coelhos infectados com M. tuberculosis, a importância e relevância destas
proteínas se devem, provavelmente, ao seu papel na síntese da parede celular
da micobactéria. De modo igual, demonstrou-se que quando os monócitos
humanos são infectados por M. tuberculosis, estas micobactérias secretam o
complexo 85 (WHO 2004; HAUEBNER 1994; VORDERMEIER et al 2006;
SABLE et al 2007).
31
O cultivo in vitro de M. tuberculosis resulta em acúmulo no meio
extracelular de um complexo de proteínas chamado CFP. A característica mais
notável dessa fração protéica é a sua imunodominância (Sonnenberg & Belisle,
1997). Segundo Seibert & Munday, o CFP são os melhores antígenos de
reposição envolvidos na resposta imune à tuberculose. Tem sido observada
forte resposta humoral (LAAL et al 1997) e celular (ANDERSEN 1994;
ROBERTS et al 1995) contra estas frações proteicas.
9 – Vacinas
9.1 Bacilo Calmette-Guérin (BCG)
A história do bacilo Calmette-Guérin (BCG) começa em 1908 quando
Albert Calmette e Camille Guérin iniciaram seu trabalho a partir de uma cepa
virulenta de Mycobacterium bovis chamada Lait Nocard, esta foi isolada por
Nocard em vaca com mastite tuberculosa. Calmette e Guérin subcultivaram o
organismo cada semana em um meio de papa glicerinada, meio prevalente na
época, ao qual acrescentaram bílis bovina para assegurar uma melhor
homogeneização do cultivo. Animais de experimentação foram infectados
regularmente com esta cepa que perdeu a virulencia logo no décimo quinto
subcultivo e não provocou lesões nos coelhos e cobaias (BENENSON 1997;
WHO 2004).
Em 1921 depois de 13 anos e 230 subcultivos, o BCG havia perdido sua
virulência em animais. O primeiro menino imunizado com BCG em julho de
1921 foi um recém-nascido cuja avó tinha tuberculose (MARTIN 2005, BLOOM
et al 1999, GRANGE et al 1993). Nesse mesmo ano, utilizou-se pela primeira
32
vez na França a BCG por via oral, com fins de vacinação. Desde então foram
administradas mais de 3.000 milhões de doses no mundo. A BCG foi
incorporada dentro do esquema de vacinação infantil em 1974 no Brasil
(BENENSON 1997).
Da cepa original do BCG foram produzidas várias cepas “filhas”. As
cepas recentes de BCG foram mantidas como cultivos frescos através de uma
série de subcultivos em um meio de papa-bilis ou papa-Sauton. Esta repetição
de subcultivos resultou em cepas de BCG que diferem entre si. Apresentam
características heterogêneas in vitro como à morfologia da colônia, a
viabilidade em meios de cultivo, composição e atividade bioquímica, resistência
a drogas, imunogenicidade em animais e humanos, e virulência em animais
(ABOU-ZEID et al., 1987). Em 1950 a Organização Mundial de Saúde (OMS)
em um esforço para limitar a variabilidade genética entre cepas de BCG,
promoveu uma série de recomendações para sua produção. A homogeneidade
da cepa de vacinas pode manter-se com o uso de organismos que não são
mais de quatro gerações do primeiro lote de bacilos (WHO 2004, MANDELL et
al. 1995). Em 1982 a responsabilidade para o controle da qualidade
internacional das vacinas de BCG foi confiada ao ‘States Serum Intitute’ em
Copenhagem, o qual supervisiona a padronização de BCG, distribui bacilos e
realiza treinamento para a produção de vacinas (WHO 2004; MANDELL et al.
1995).
Desde 1985 tem-se realizado estudos de controle de caso utilizando
diferentes cepas de BCG, têm se observado que a eficácia da vacina é em
torno de zero a 80% (SMITH, 1987). Em crianças, a proteção estimada é de 52
a 100%, para a prevenção de meningite tuberculosa, e de 2 a 80% na
33
prevenção de tuberculose pulmonar (ROMANUS, 1975; PADUNGCHAN et al.,
1986; TIDJANI et al., 1986). Entretanto, poucos estudos têm calculado a
eficiência em pessoas que receberam vacinação na vida adulta. De 1968 a
1971 foi realizada uma prova controlada quanto à proteção da vacinação com
BCG no sul da Índia e ficou demonstrado que não houve eficácia de proteção
em adultos ou crianças, após cinco anos da vacinação. Decorridos 15 anos foi
realizada nova avaliação e a proteção foi de 17% em pessoas que foram
vacinadas quando crianças (TRIPATHY, 1987).
A vacina está contra indicada para pacientes com HIV, recém-nascidos
com peso menor que dois quilogramas, pacientes imunocomprometidos, ou
que apresentam alguma afecção cutânea grave, aqueles que estão submetidos
a algum tratamento prolongado com esteróides ou drogas imunossupressoras
e doenças infecciosas como sarampo e varicela, mulheres grávidas e pessoas
com prova de PPD positivo. Para os indivíduos HIV positivos, com ausência de
sinais clínicos, a vacinação não é considerada uma contra indicação (PAUL &
FINE 2001). A vacina de BCG é geralmente administrada para proteger contra
a tuberculose, no entanto tem se notado que ela confere proteção contra
hanseníase (20-80%); também há evidências que a BCG confere proteção
contra infecção por M. ulcerans e contra doenças glandulares atribuídas a
outras micobactérias em particular o M. avium-intracellulare (PAUL & FINE
2001).
Quanto à variabilidade da eficácia da vacina BCG, várias hipóteses tem
sido propostas, uma destas é que infecção anterior com uma micobactéria não
tuberculosa confere proteção contra a tuberculose ativa. Isto foi demonstrado
34
com provas realizadas em áreas onde as micobactérias não tuberculosas eram
prevalentes, resultando uma baixa eficácia da vacina. Outros sugerem que uma
infecção prévia com micobactérias pode aumentar ou diminuir a imunidade
protetora (PAUL & FINE 2001; HUEBNER 1994).
9.2 Novos modelos de vacinas
Esforços para modificar o Mycobacterium bovis do BCG ou o M.
tuberculosis por tecnologia do DNA recombinante com o fim de produzir uma
nova vacina atenuada contra a tuberculose estão em progresso. Um destes
métodos consiste na expressão de uma variedade de antígenos heterólogos no
M. bovis (PAUL & FINE 2001; HUEBNER 1994). Outro método seria eliminar
os genes do M. tuberculosis responsáveis pela virulência ou pela sua
sobrevivência no interior dos macrófagos.
A seguridade da BCG é uma preocupação crescente, devido à alta
prevalencia de infecção por HIV. Para prevenir os efeitos adversos da BCG em
indivíduos imunocomprometidos, bactérias modificadas têm sido propostas. Os
resultados mostram que estas cepas são seguras em camundongos com
imunodeficiência severa combinada e demonstrou a mesma proteção nos
camundongos normais susceptíveis à tuberculose, sugerindo que este poderia
ser um método mais seguro de vacinação (HUEBNER 1994).
As proteínas CFP-10 (Rv3874), GroES (Rv3418c) e complexo 85 já
foram usadas como antígenos recombinantes, e sua capacidade para
promover uma resposta proliferativa de células T humanas tem sido estudada.
Estes antígenos foram similares ao induzir resposta Th1 protetora em
camundongos, sugerindo assim que nenhum deles são imunodominantes
35
(SEIBERT & MUNDAY, 1932; HUEBNER, 1994). Também o ESAT-6 (Rv3875)
caracterizado por SORENSEN et al. (1995), tem sido amplamente utilizado
para a produção de vacinas (SORENSEN et al. 1995; MAHAIRAS et al. 1996;
BERTHET et al. 1998). Foi confirmado por BRANDT et al. (2000) que avaliaram
o potencial do ESAT-6 em modelo de vacina e demonstraram que a vacinação
com este antígeno induz resposta de célula T e proteção semelhante à obtida
com o BCG. RIGANO et al (2006) utilizando plantas transgênicas (Arabidopsis
thaliana) para expressarem uma proteína de fusão contendo o antigeno ESAT-
6 do M. tuberculosis e uma enterotoxina (LTB) da Escherichia coli (LTB-ESAT-
6), elaboraram ração para camundongos e os imunizaram por via oral. Após o
desafio com M. tuberculosis, apesar do aumento na produção de IFN-γ pelas
células T CD4+ dos linfonodos mesentéricos, não se observou uma boa
proteção. Estes resultados sugerem que além de ser imunogênica, uma boa
vacina depende da via de administração para ser protetora.
Tem sido demonstrado que as proteínas do complexo 85 proporcionam
imunogenicidade em coelhos infectados com M. tuberculosis. A importância e
relevância destas proteínas se devem, provavelmente, ao seu papel na síntese
da parede celular da micobactéria. De modo igual, demonstrou-se que quando
os monócitos humanos são infectados por M. tuberculosis, estas micobactérias
secretam as proteínas do complexo 85. Esta propriedade poderia ser vantajosa
para desenvolver uma vacina, visto que a liberação destas proteínas é de suma
importância para o processamento intracelular deste patógeno via MHCII
(WHO 2004; HUEBNER 1994, VORDERMEIER et al 2006, SABLE et al 2007).
A imunização de camundongos utilizando plasmídeo de DNA expressando o
Ag85 induz a resposta immune humoral e mediada por células, conferindo
36
significante proteção, quando desafiados com M. tuberculosis e BCG
(HUYGEN et al., 1998).
O MPT-51 (Rv3803c) tem se mostrado um bom marcador para
diagnóstico de tuberculose, principalmente em pacientes co-infectados com
HIV (SINGH et al. 2005). AOSHI (2005) descreveram um sistema de expressão
retroviral que permitem que peptídeos grandes e pequenos serem expressos
no citoplasma e, portanto, serem apresentados por moléculas MHC de classe I.
Os autores imunizaram células T de camundongos com vacina de DNA
expressando MPT-51 contra linhagens celulares MHC-I compatíveis. Estas
células foram capazes de expressar de 120-140 aminoácidos da molécula de
MPT-51. Segundo os autores, o sistema de expressão retroviral pode ser
adaptado para expressão de epítopos de células T reconhecidos em doenças
infecciosas e contra antígenos de células tumorais. A Mtb 72F foi a primeira
vacina recombinante contra TB, testada em humanos (SHEIKY et al 2004).
Essa proteína é obtida da fusão dos antígenos Mtb39 e Mtb32, e foi testada
como subunidades vacinais (SKEIKY et al 2004) e na estratégia de “primer-
boost” como reforço a BCG (BRANDT et al 2004).
Uma nova abordagem em vacinas que atualmente vem sendo
empregada na busca de um substituto para a BCG são as vacinas de DNA. A
possibilidade de usar vacinas de DNA é uma alternativa arriscada, construída
para codificar vários antígenos, os quais podem ser selecionados para que não
interfiram nas provas de sensibilidade cutânea. A seleção do antígeno usado
nas vacinas de DNA está limitada pela imunogenicidade da proteína. Várias
vacinas de DNA contendo plasmídeo com genes de antígenos micobacterianos
como os membros das micolil-transferase (complexo 85) (HUYGEN 1998) e
37
proteínas do choque térmico (Hsp60, 65, 70) (LOWRIE & SILVA 2000,
FERRAZ et al. 2004, LOWRIE 2003, JOHANSEN et al. 2003), tem sido
extensivamente testado contra tuberculose em modelos animais. As vacinas de
DNA não somente geram Th1 específicos como também TCD8, nos quais são
consideradas importantes na proteção contra tuberculose. Associou-se a
proteção neste caso, à produção do fenótipo CD8/CD44
hi
INF-γ, que foi
predominante após a infecção (LOWRIE et al 1994; SILVA et al 1996;
BONATO et al 1998; SILVA et al 1999, LOWRIE et al 1999).
M. Vaccae e M. microti vivos, tem sido sugerido como candidatos a
vacina da tuberculose, mas quando utilizados em animais tem mostrado grande
variabilidade na proteção (de BRUYN & GARNER 2003). Recentemente, M.
tuberculosis mutante com defeito em um lipídeo micobacteriano (Mtb drrC)
mostrou ser mais protetor que a BCG quando administrado em camundongos
(PINTO et al 2004).
Vetores vivos, como as vacinas virais recombinantes ou Salmonella
modificada contendo genes imunodominantes de M. tuberculosis, são
candidatos à vacina que tem mostrado boa proteção em modelos animais
(MCSHANE et al 2001; MOLLENKOPF et al 2001). As vacinas virais
recombinantes expressando Ag85A (MVA 85A) têm sido testadas pré-
clínicamente usando diferentes estratégias de vacinação em humanos
(Homólogas ou Heterólogas) sendo a primeira candidata a vacina a entrar na
fase de testes clínicos 1. Entretanto, este tipo de vacina ainda tem problemas
em provocar resposta imune contra o vetor, limitando o número de possíveis
imunizações (MCSHANE et al 2004).
38
D’ SOUZA et al (2002) em um modelo de tuberculose experimental usou
uma vacina com os antígenos Ag85 A, Ag85B ou PstS-3 de M. tuberculosis
encapsulados em lipossomos catiônicos em camundongos, e verificaram que
houve indução de resposta imune celular e humoral, sendo protetora em
ambas vias de imunização (intramuscular e intranasal). Após a quarta semana
de infecção, o Ag85 promoveu quase meio log de proteção (CFU de 5,8
comparada com 5,5 do BCG).
Conquanto estes antígenos tenham sido testados em ensaios
experimentais como antígenos vacinais na infecção animal, a capacidade
imunogenica destes e de outros antígenos na resposta imune celular de
pacientes com tuberculose ativa ainda não foi esclarecida.
39
III - Justificativa
Embora a ciência tenha avançado muito, a tuberculose pulmonar
continua a ser um dos principais problemas de saúde pública. A Organização
Mundial de Saúde (OMS) acredita que um terço da população mundial está
infectada com o bacilo e que surgem a cada ano aproximadamente 8,8 milhões
de novos casos, resultando em 2 a 3 milhões de mortes a cada ano. Destas,
80% estão concentradas nos países em desenvolvimento, onde os recursos
são limitados (WHO 2006). No Brasil os números são alarmantes. Em 2002,
foram notificados 96.323 casos novos e são estimados 50 milhões de
brasileiros infectados pelo bacilo da TB. A taxa anual de incidência notificada
no Brasil em 2002 foi de 44,5 por 100.000 habitantes, no Estado de Goiás
21,34 e em Goiânia 23,5 para o mesmo período (USAID 2006). Esta grande
incidência se deve a fatores como: descuido dos governos no controle da
doença, programas de controle de tuberculose mal administrados, pobreza,
crescimento e migração populacional, resistência do patógeno às drogas e o
significante aumento de casos do vírus da imunodeficiência humana (HIV).
Deve-se ressaltar que a tuberculose representa o principal fator de risco para
mortalidade entre indivíduos com infecção pelo HIV (USAID 2006).
A identificação da imunogenicidade de proteínas recombinantes do M.
tuberculosis pela resposta imune celular humana permitirá a seleção de novos
candidatos a vacinas de subunidades protéicas.
40
IV - Hipótese
Se os antígenos protéicos MPT-51, GlcB, Ag85A ESAT-6 e CFP são
expressos em altas concentrações quando o M. tuberculosis é submetido in
vitro a condições de estresse que mimetizam o interior de uma célula, estes
antígenos devem ser processados e apresentados aos lintócitos T de
indivíduos com tuberculose ativa induzindo resposta imune específica.
41
V – Objetivo Geral
Avaliar a resposta imune celular de pacientes com tuberculose pulmonar
ativa contra os antígenos protéicos recombinantes MPT-51, GlcB, ESAT-6,
Ag.85A e as Proteínas do Filtrado de Cultura (CFP) do M. tuberculosis para
caracterizar sua imunogenicidade.
Objetivos Específicos:
- Avaliar o padrão de reconhecimento dos antígenos protéicos recombinantes
MPT-51, GlcB, ESAT-6,Ag.85A e as Proteínas do Filtrado de Cultura (CFP)
por linfócitos T CD4 e CD8 positivos do sangue periférico de indivíduos com
tuberculose pulmonar ativa.
- Determinar se os antígenos são capazes de induzir a produção de IFN-γ por
linfócitos T CD4 e CD8 de pacientes com tuberculose pulmonar ativa.
- Determinar se os antígenos são capazes de induzir a produção de IL-10 por
linfócitos T CD4 e CD8 de pacientes com tuberculose pulmonar ativa.
- Comparar a resposta imune celular T CD4 e CD8 dos pacientes com
tuberculose pulmonar antes e após o tratamento.
42
VI - Material e Métodos
1 - População de Estudo
A população de estudo composta de 37 indivíduos foi dividida em dois
grupos experimentais: 1. 22 Pacientes com tuberculose pulmonar ativa,
selecionados de acordo com os critérios de inclusão como: idade variando
entre 22 e 63 anos, apresentando diagnóstico de tuberculose pulmonar ativa
confirmado por baciloscopia (BAAR), radiografia evidente de tuberculose e a
prova tuberculínica (PT). 2. 15 Controles saudáveis, pareados por faixa etária e
sexo aos pacientes selecionados. Para melhor classificação dos controles, os
mesmos foram submetidos à prova tuberculínica. Os indivíduos foram
recrutados no Hospital de Doenças Tropicais de Goiânia-Go entre 2005 e 2007
onde todos concordaram e assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido para inclusão no estudo. Os critérios de exclusão foram: indivíduos
portadores de imunodeficiência ou infectados pelo Vírus da Imunodeficiência
Humana (HIV). Dentre os 22 pacientes com tuberculose pulmonar ativa, oito
foram acompanhados durante todo o tratamento (seis meses) e no máximo
duas semanas após este período, os indivíduos foram recrutados para a
avaliação da resposta imune celular.
2 - Antígenos Protéicos
Os antígenos recombinantes MPT-51 (Rv 3803c), ESAT-6 (Rv 3875),
Ag85A (Rv3804c), GLcB (Rv 1837c) e CFP (Culture Filtrate Proteins) foram
43
produzidos pela Universidade Norte-Americana do estado do Colorado
(Colorado State University) e cedido ao Laboratório de Imunopatologia de
Doenças Infecciosas da Universidade Federal de Goiás mediante o convênio
firmado pelo contrato de Nº NO1-AI – 75320.
3 - Coleta de Amostras
Indivíduos TB positivos incluídos na pesquisa doaram 20 ml de sangue
periférico coletados com heparina, antes e após o tratamento. Estas amostras
foram processadas para obtenção de células mononucleares do sangue
periférico (PBMC).
4 - Obtenção de PBMC (Células Mononucleares do Sangue
Periférico) e Cultura Celular
O sangue total foi diluído em solução salina 0,9% estéril (1:2) em
seguida pipetado cuidadosamente em 3 vezes o volume em solução de Ficoll-
Paque
TM
(Amersham Biosciences) sendo posteriormente centrifugado a 1000 g
por 20 minutos a 4ºC formando assim uma interface entre os líquidos (anel
branco), onde foi coletado o anel leucocitário usando pipeta pasteur. Após a
transferência para um novo tubo de poliestireno foi adicionado salina 0,9%, e
os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 1000 xg a 4ºC. Após
ressuspender as células em meio RPMI completo (RPMI Médium 1640
GIBCO
TM
+ 0,15% de Bicabornato de sódio , 10% de soro bovino fetal, 1mg/ml
de L-glutamina 2mM SIGMA
®
, 100 UI/ml de Penicilina-estreptomicina SIGMA
®
,
44
1% de Piruvato de sódio SIGMA
®
, 1 mg/ml de Aminoácidos não essenciais
100X SIGMA
®
). A concentração celular foi ajustada para 2x10
5
por orifício,
após a contagem em câmara de Neubauer. Foram pipetados 200µl da
suspensão celular em cada orifício da placa de cultura celular (Cell Wells
TM
) de
96 orifícios em poliestireno, com PHA a 1µg/ml (Phytohemagglutinin GibcoBRL
Cat. Nº 10576-015 Life Technologies
TM
) e os antígenos MPT-51, ESAT-6,
GLcB, Ag 85A e CFP na concentração de 1µg/ml. As placas foram incubadas
em estufa 5% de CO
2
a 37ºC por 96 horas.
5 – Análise de IL-10 e IFN-
γ
intracelular em células T CD4 e CD8
por Citometria de Fluxo
As culturas de PBMC foram tratadas com monensina para o bloqueio do
complexo de golgi (Golgi Stop BD
TM
) e incubadas por 6 horas a 37ºC em estufa
a 5% de CO
2
. Após incubação, foram acrescentados 200 µl por orifício de PBS
e azida sódica e nova incubação por 15 minutos a 4ºC. Após centrifugação a
5000 xg por 5 minutos a 4ºC, as suspensões celulares foram divididas em dois
grupos de eppendorfs um para o painel 1 onde foram pipetados 10 µl de anti-
CD8 PE-Cy5 (Ficoeritrina cianina 5 - BD Phamingen
TM
) e o outro para o painel
2 onde foram pipetados 10 µl de anti-CD4 PE-Cy5 - BD Phamingen
TM
. Após
incubação por 30 minutos a 4°C, fixaram-se as suspensões celulares com PBS
paraformoldeído 0,4%; azida sódica 0,1% por 15 minutos a 4°C. Depois de
centrifugadas a 5000 x g por 10 minutos, 100 µl de Perm Wash
(PERMA/WASH
TM
Buffer 10x stock) foi adicionado a cada tubo, que foram
incubados por 5 minutos a 4°C. Após centrifugação a 5000 xg por 5 minutos a
45
4ºC, 10 µl de anti-IFN γ FITC (Isotiocianato de fluoresceína 2.0 µg/ml) e 10 µl
de anti-IL-10 PE (Ficoeritrina) foram adicionados e os tubos foram incubados
por 30 minutos a 4ºC. Em seguida foi acrescentado Perm wash 1X e
centrifugado em 5000 xg por 5 minutos a 4ºC. As células foram ressuspendidas
em PBS, azida sódica 0.1%. As aquisições foram realizadas em citometro de
fluxo (BD FAC Scalibur, San Jose, Califórnia) do Hospital Araújo Jorge
(Associação de Combate ao Câncer do Estado de Goiás).
6 – Análise Estatística
Para análise da aquisição foi utilizado o programa Summit
®
V3.1. A
tabulação e construção dos gráficos foram feitas através dos programas
GraphPad Prism 4 Microsoft
®
e Excel
®
. Para a analise estatística foram
utilizados o teste de variância (Kruskal Wallis) e teste t de student, considerado
p<0,05 estatisticamente significativo.
46
VII - Resultados
1 - População em Estudo
A Tabela 1 mostra o perfil clínico e epidemiológico dos pacientes
incluídos neste trabalho. A maioria dos pacientes com TB selecionados foi do
sexo masculino com idade média de 36 anos (22-63). Alguns pacientes não
souberam informar se foram vacinados ou não com BCG e não apresentavam
cicatriz vacinal que confirmasse imunização por via intradérmica. Devido à
possibilidade deles terem sido vacinados na década de 60 e 70, quando a
vacinação era por via oral, os mesmos foram classificados como sem
informação (SI) (Tabela 1). A maioria dos pacientes com tuberculose pulmonar
era positiva para prova tuberculínica (PT), enquanto todos os controles
saudáveis eram PT negativa (Tabela 1).
2 - Histogramas dos linfócitos T CD4
+
de pacientes com
tuberculose pulmonar ativa e controles saudáveis positivos
para IFN-
γ
Para a definição da população de linfócitos T CD4 nas culturas de PBMC
estimulados ou não com antígenos, cada amostra foi adquirida e analisada no
programa Cell quest (BD, Biosciences).
47
As células foram digitalizadas quanto ao tamanho (FFC) e granulosidade
(SSC) e a população celular com tamanho e granulosidade menor que 250 foi
selecionada em uma janela como a população total de linfócitos. Foram
adquiridos 10 mil eventos para todas as populações celulares e cerca de 70%
das células adquiridas foram incluídas nesta janela. Com esta seleção
realizada, após a definição na escala logarítima das células FL-3(CD4-CD8PE-
Cy5) positivas (neste caso com fluorescência maior que 10
2
), as células foram
analisadas quanto à fluorescência no canal FL-1(IFN-γ FITC). Nas figuras 3 A
e B apresentamos um exemplo dos histogramas obtidos de um paciente com
tuberculose pulmonar ativa comparado com um indivíduo saudável.
48
Tabela 1: Dados clínicos e epidemiológicos da população em estudo
Grupos Controles
a
N=15
TB
b
N=22
Sexo (M/F) 9/6 15/7
Mediana da idade (anos) 28(19-59) 36(22-63)
BCG (vacinados/SI
∗
)
15 19/3
PT (positivos/negativos/SI
∗
)
0/15/0 16/6/0
a
Controles saudáveis: Prova Ttuberculinica negativa, HIV negativos e com
baixo risco de outras doenças imunossupressoras, pareados por sexo e idade
(±6 anos) com os pacientes tuberculosos.
b
Tuberculose ativa: Indivíduos portadores de tuberculose pulmonar ativa, com
diagnóstico confirmado por baciloscopia ou cultura e aqueles em que o médico,
com base nos dados clínico-epidemiológicos e no resultado de exames
complementares, firmou o diagnóstico de tuberculose.
∗
SI-não informados pelo indivíduo.
49
Figura 3: Eventos adquiridos na janela de linfócitos (R1= Linfócitos totais, R2=
Seleção dos linfócitos T CD4
+
) (A), histogramas de células T CD4
+
IFNγ
+
de um
controle saudável e um paciente com tuberculose pulmonar pareados por sexo
e idade (± 6 anos) em estimulo a antígenos recombinantes do Mycobacterium
tuberculosis (B).
Controle
e
Paciente
Antígeno
1,32
Meio
MPT-51
4,22
19,12
PHA
8,89
ESAT-6
7
Ag85A
1,98
1
1,48
1,47
A
B
12,95
GLcB
CD4
+
1
8,98
50
3 - Linfócitos T CD4
+
positivos para IFN-
γ
nas populações em
estudo, em resposta aos antígenos micobacterianos.
Buscando caracterizar a resposta induzida pelo painel de antígenos,
avaliou-se a presença de células T CD4
+
positivas para IFN-γ em resposta aos
antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A e Filtrado Protéico
de Cultura (CFP) de M. tuberculosis por citometria de fluxo, em indivíduos
saudáveis (Figura 4A) e com tuberculose pulmonar ativa (Figura 4B).
A porcentagem de células T CD4
+
IFN-γ
+
em pacientes com tuberculose
pulmonar ativa (MPT-51= 5,25±2,47, ESAT-6= 5,63±2,43, CFP= 5,38±2,15,
GLcB= 4,72±2,10, Ag85A= 3,23±0,75) foi maior que os controles saudáveis
(MPT-51= 1,76±0,75, ESAT-6= 1,75±0,71, CFP= 1,53±0,81, GLcB= 1,89±0,71,
Ag85A 1,60±0,69) para todos os antígenos (p< 0,01). Observou-se que PBMC
de pacientes com tuberculose pulmonar quando estimuladas com Ag85A
apresentaram menor porcentagem de linfócitos T CD4
+
IFN-γ
+
em relação a
todos os antígenos testados (Figura 4).
4 - Histogramas dos linfócitos T CD8
+
de pacientes com
tuberculose pulmonar ativa e controles saudáveis positivos
para IFN-
γ
Para a análise da população de linfócitos T CD8
+
, utilizou-se uma janela
considerando a granulosidade e o Log de fluorescência acima de 10
2
no canal
51
FL-3 (CD8 PE-Cy5) (Figura 5A). A população de T CD8
+
IFN-γ
+
foi
demonstrada por meio de histograma (Figura 5B).
5 – Análise de linfócitos T CD8 positivos para IFN-
γ
nas
populações em estudo, em resposta aos antígenos
micobacterianos.
Sabendo-se que as células T CD8 são também importantes na resposta
efetora contra patógenos intracelulares, analisou-se por citometria de fluxo as
células T CD8 IFN-γ
+
em resposta ao painel de antígenos micobacterianos em
indivíduos saudáveis (Figura 6A) e indivíduos com tuberculose pulmonar ativa
(Figura 6B). A porcentagem de T CD8
+
IFN-γ
+
foram maiores em pacientes com
tuberculose pulmonar ativa (MPT-51= 3,78±2,02, ESAT-6= 4,33±1,45, CFP=
3,46±1,64, GLcB= 4,46±2,70, Ag85A= 4,34±1,92) quando comparadas com
indivíduos saudáveis (MPT-51= 1,33±0,61, ESTA-6= 1,49±0,42, CFP= 1,22±
0,59, GLcB= 1,58±, Ag85A= 1,65±0,66) (p<0,01) (Figura 6).
6 - Histogramas dos linfócitos T CD4
+
e CD8
+
positivos para IL-
10 de pacientes com tuberculose pulmonar ativa e controles
saudáveis
As células T CD4
+
e T CD8
+
foram selecionadas através de janela de
seleção considerando a granulosidade e o Log de fluorescência acima de 10
2
52
no canal FL3
.
Os histogramas das Figuras 7A-B, 8A-B, demonstram a
porcentagem de células T CD4
+
e T CD8
+
positivas para IL-10.
53
Figura 4: Porcentagem de linfócitos T CD4
+
IFN-γ
+
estimulados in vitro com o
mitógeno PHA e os antígenos ESAT-6, MPT-51, GLcB, Ag85A e CFP
do Mycobacterium tuberculosis. A. Controles saudáveis. B. Pacientes
com tuberculose pulmonar.
* Diferença significativa entre controle e paciente, p < 0,01.
#
Diferença significativa entre o antígeno 85A e os demais antígenos, p
< 0,01.
*
*
*
*
*#
A B
54
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Células T CD4
+
IFN-
γ
+
(%)
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Células T CD4
+
IFN-
γ
+
(%)
Figura 5: Eventos adquiridos na janela de linfócitos (R1= Linfócitos totais, R2=
Seleção dos linfócitos T CD8
+
) (A), histogramas de células T CD8
+
IFNγ
+
de um
controle saudável e um paciente com tuberculose pulmonar pareados por sexo
e idade (± 6 anos) em estímulo a antígenos recombinantes do Mycobacterium
tuberculosis (B).
B
A
Meio
Antígeno
PHA
MPT-51
ESAT-6
Ag85A
GLcB
Controle Paciente
2,01
11,09
4,20
6,98
4,01
3,99
1
9,56
1
1,72
1,29
CD8
+
55
Figura 6. Porcentagem de linfócitos T CD8
+
IFN-γ
+
estimulados in vitro com o
mitógeno PHA e os antígenos ESAT-6, MPT-51, GLcB, Ag85A e CFP
do Mycobacterium tuberculosis. A. Controles saudáveis. B. Pacientes
com tuberculose pulmonar.
* Diferença significativa entre controle e paciente, p < 0,01.
* * *
*
*
BA
56
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
A.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Células T CD8
+
IFN-
γ
+
(%)
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Células T CD8
+
IFN-
γ
+
(%)
Figura 7: Eventos adquiridos na janela de linfócitos (R1= Linfócitos totais, R2=
Seleção dos linfócitos T CD4
+
) (A), histogramas de células T CD4
+
IL-10
+
de um
controle saudável e um paciente com tuberculose pulmonar pareados por sexo
e idade (± 6 anos) em estímulo a antígenos recombinantes do Mycobacterium
tuberculosis (B).
B
A
Meio
Antígeno
PHA
MPT-51
ESAT-6
Ag85A
GLcB
Controle Paciente
1
16,32
3,99
8,21
8,02
8,25
1,24
11,0
1,29
1
1,27
1
CD4
+
57
Figura 8: Eventos adquiridos na janela de linfócitos (R1= Linfócitos totais, R2=
Seleção dos linfócitos T CD8
+
) (A), histogramas de células T CD8
+
IL-10
+
de um
controle saudável e um paciente com tuberculose pulmonar pareados por sexo
e idade (± 6 anos) em estímulo a antígenos recombinantes do Mycobacterium
tuberculosis (B).
B
A
Meio
Antígeno
PHA
MPT-51
ESAT-6
Ag85A
GLcB
Controle Paciente
1
12,2
3
6,67
3
4,25
1,41
8,90
1
1,52
1
2,09
CD8
+
58
7 – Análise de linfócitos T CD4 e CD8 positivos para IL-10 nas
populações em estudo, em resposta aos antígenos
micobacterianos.
Á análise da população de linfócitos T CD4 e CD8 e citocinas
intracelulares foi realizada através de Citometria de Fluxo para avaliar a
resposta imune específica aos antígenos recombinantes.
A porcentagem de células TCD4 efetoras IL-10 positivas após estímulo
com antígenos recombinantes do M. tuberculosis nos pacientes com
tuberculose pulmonar ativa (MPT-51= 5,20±2,64, ESAT-6= 5,83±2,19, CFP=
5,66±2,28, GLcB= 4,92±2,29, Ag85A= 3,62±1,04) foi maior que nos controles
saudáveis (MPT-51= 1,92±0,86, ESAT-6= 1,47±0,90, CFP= 1,59±0,86, GLcB=
2,31±1,26, Ag85A= 1,95±1,23) (p<0,01) (Figura 9A). A porcentagem das
células TCD4 positivas para IL-10 nos pacientes com tuberculose, quando
estimuladas com o Ag85A, foi menor quando comparadas aos demais
antígenos testados (p<0,01) (Figura 9B).
As células T CD8 positivas para IL-10 apresentaram o mesmo padrão
observado nas células T CD4 onde a porcentagem destas células foram
maiores nos pacientes doentes (MPT-51= 3,50±1,51, ESAT-6= 4,01±1,48,
CFP= 3,78±1,27, GLcB= 4,93±2,89, Ag85A= 3,90±1,34) quando comparados
com as dos controles saudáveis ( MPT-51= 1,15± 0,42, ESAT-6= 1,62± 0,59,
CFP= 1,25± 0,67, GLcB= 1,53± 0,49, Ag85A= 1,95± 0,48) (p<0,01) (Figura 9C,
9D).
59
8- Análise comparativa de linfócitos T CD4 e CD8 positivos
para IFN-
γ
e IL-10 entre amostras de pacientes antes e após
tratamento, em resposta aos antígenos micobacterianos.
A comparação entre as porcentagens de células TCD4 e TCD8 IFN-γ
positivas, após estímulo com antígenos recombinantes de M. tuberculosis, nos
pacientes com tuberculose pulmonar ativa recém diagnosticados e após-
tratamento estão representadas nas figuras 10 e 11. Não houve diferença
significativa antes e após o tratamento na população celular de T CD4 e TCD8
positivas para IFN-γ quando estimuladas com os antígenos MPT51, ESAT-6,
GLcB e Ag85A (p>0,05).
A porcentagem de células TCD4 e TCD8 IL-10 positivas após estímulo
com antígenos recombinantes do M. tuberculosis nos pacientes com
tuberculose pulmonar ativa, antes e após o tratamento, estão representadas
nas figuras 12 e 13. Não houve diferença significativa antes e após o
tratamento na população celular de TCD4 e TCD8 positivas para IL-10 quando
estimuladas com os antígenos MPT51, ESAT-6, GLcB e Ag85A (p>0,05).
As porcentagens de células TCD4
+
IL-10
+
, TCD4
+
IFNγ
+
e TCD8
+
IL-10
+
,
TCD8
+
IFNγ
+
estão demonstrados nas Tabelas 2 e 3.
Nos pacientes antes do tratamento os linfócitos TCD4
+
IL-10
+
estiveram
nas seguintes proporções: 5,20±2,64; 5,83±2,19; 3,62±1,04; 4,92±2,29;
5,66±2,28 quando estimulados com MPT-51, ESAT-6, CFP, GLCB E Ag85A,
respectivamente. No pós-tratamento essas células estiveram marcadas nas
60
seguintes proporções: 4,19±1,97; 3,43±0,72; 5,07±2,36; 4,72±1,87; 5,24±1,90
estimuladas com os mesmos antígenos.
Na avaliação da resposta dos linfócitos TCD4
+
IFN-γ
+
(Tabela 2),
encontrou-se nos pacientes uma porcentagem de 5,25±2,47 quando
estimulados com MPT-51, 3,23±0,75 com ESAT-6, 5,38±2,15 com CFP,
4,72±2,10 com GLcB e 3,23±0,75 com Ag85A. No pós-tratamento (Tabela 2) a
porcentagem foi de 4,2±1,59; 5,47±2,28; 5,0±2,0; 4,49±1,75 e 2,72±0,75
quando estimulados com os mesmos antígenos. Quanto a porcentagem das
células TCD8
+
IL-10
+
e TCD8
+
IFN-γ
+
(Tabela 3) também não houve diferença
significativa entre antes e após o tratamento.
61
Figura 9. Porcentagem de células T CD4
+
e CD8
+
positivas para IL-10
estimuladas in vitro com o mitógeno PHA e os antígenos ESAT-6, MPT-51,
GLcB, Ag85A e CFP do Mycobacterium tuberculosis. A. Porcentagem de
células T CD4
+
positivas para IL-10 de controles saudáveis e B de pacientes
com tuberculose pulmonar ativa. C. Porcentagem de células T CD8
+
IL-10
+
de
controles saudáveis e D de pacientes com tuberculose pulmonar ativa. *
Diferença significativa entre controle e paciente, p < 0,01.
#
Diferença significativa entre o antígeno 85A e os demais antígenos
p<0,01
*
*
* *
*#
*
*
*
*
*
A B
C
D
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Céculas T CD4
+
IL-10
+
(%)
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Céculas T CD8
+
IL-10
+
(%)
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Céculas T CD8
+
IL-10
+
(%)
62
Meio
PHA
CFP
ESAT-6
MPT-51
GLcB
Ag.85A
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Céculas T CD4
+
IL-10
+
(%)
Figura 10. Porcentagem de células T CD4
+
IFN-γ
+
de pacientes com
tuberculose pulmonar ativa antes e após 15 dias do término do
tratamento estimuladas in vitro com os antígenos recombinantes MPT-
51 (A), ESAT-6 (B), GLcB (C) e Ag85A (D) do Mycobacterium
tuberculosis.
MPT-51
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IFN-
γ
+
(%)
ESAT-6
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IFN-
γ
+
(%)
GLcB
Antes tratamento Pós- tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IFN-
γ
+
(%)
Ag85A
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IFN-
γ
+
(%)
A
B
C D
63
Figura 11. Porcentagem de células T CD8
+
IFN-γ
+
de pacientes com
tuberculose pulmonar ativa antes e após 15 dias do término do
tratamento estimuladas in vitro com os antígenos recombinantes MPT-
51 (A), ESAT-6 (B), GLcB (C) e Ag85A (D) do Mycobacterium
tuberculosis.
MPT-51
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IFN-
γ
+
(%)
ESAT-6
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IFN-
γ
+
(%)
GLcB
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IFN-
γ
+
(%)
Ag85A
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IFN-
γ
+
(%)
B
A
C D
64
Figura 12. Porcentagem de células T CD4
+
IL-10
+
de pacientes com tuberculose
pulmonar ativa antes e após 15 dias do término do tratamento
estimuladas in vitro com os antígenos recombinantes MPT-51 (A),
ESAT-6 (B), GLcB (C) e Ag85A (D) do Mycobacterium tuberculosis.
MPT-51
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IL-10
+
(%)
ESAT-6
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IL-10
+
(%)
GLcB
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IL-10
+
(%)
Ag85A
Antes tratamento Pós-tratamento
2
4
6
8
10
12
CD4
+
IL-10
+
(%)
A B
C D
65
Figura 13. Porcentagem de células T CD8
+
IL-10
+
de pacientes com tuberculose
pulmonar ativa antes e após 15 dias do término do tratamento
estimuladas in vitro com os antígenos recombinantes MPT-51 (A),
ESAT-6 (B), GLcB (C) e Ag85A (D) do Mycobacterium tuberculosis.
MPT-51
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IL-10
+
(%)
ESAT-6
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IL-10
+
(%)
GLcB
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IL-10
+
(%)
Ag85A
Antes tratamento Pós-tratamento
0
2
4
6
8
10
12
CD8
+
IL-10
+
(%)
A B
C
D
66
Tabela 2: Comparação entre as porcentagens de células CD4
+
IL-10
+
e CD4
+
IFN-γ
+
de
pacientes com tuberculose pulmonar ativa, antes e após o tratamento
estimuladas in vitro com os antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB e
Ag85A do Mycobacterium tuberculosis.
CD4
+
IL-10
+
CD4
+
IFN-γ
+
Controle Paciente Pós-ttm
a
Controle Paciente Pós-ttm
a
MEIO 1,08±0,53 1,86±1,04 2,15±0,66 1,28±0,50 1,82±0,93 2,09±0,79
PHA 14,32±5,32 15,94±3,69 15,49±2,43 13,60±5,14 15,90±3,39 15,94±2,45
MPT-51 1,92±0,86 5,20±2,64 4,19±1,97 1,76±0,75 5,25±2,47 4,2±1,59
ESAT-6 1,47±0,90 5,83±2,19 5,24±1,90 1,75±0,71 5,63±2,43 5,47±2,28
CFP 1,59±0,86 5,66±2,28 5,07±2,36 1,53±0,81 5,38±2,15 5,0±2,0
GLcB 2,31±1,26 4,92±2,29 4,72±1,87 1,89±0,71 4,72±2,10 4,49±1,75
Ag. 85A 1,95±1,23 3,62±1,04 3,43±0,72 1,60±0,69 3,23±0,75 2,72±0,75
a
Pós-ttm- Pacientes com tuberculose pulmonar com até quinze dias após o tratamento com
esquema 1 (Isoniazida- Rifampicina- Pirazinamida).
67
Tabela 3: Comparação entre as porcentagem de células CD8
+
IL-10
+
e CD8
+
INF-γ
+
de
pacientes com tuberculose pulmonar ativa, antes e após o tratamento
estimuladas in vitro com os antígenos recombinantes MPT-51, ESAT-6, GLcB e
Ag85A do Mycobacterium tuberculosis.
CD8
+
IL-10
+
CD8
+
IFN-γ
+
Controle Paciente Pós-ttm
a
Controle Paciente Pós-ttm
a
MEIO 0,97±0,23 1,72±0,37 2,01±0,17 1,78±0,57 1,65±0,48 1,94±0,24
PHA 13,52±4,24 15,58±4,89 13,81±3,47 13,91±5,05 16,82±5,96 16,62±5,03
MPT-51 1,15±0,42 3,50±1,51 2,93±1,43 1,33±0,61 3,78±2,02 3,11±1,78
ESAT-6 1,62±0,59 4,01±1,48 3,97±1,42 1,49±0,42 4,33±1,45 3,82±1,40
CFP 1,25±0,67 3,78±1,27 3,0±1,48 1,22±0,59 3,46±1,64 2,77±1,49
GLcB 1,53±0,49 4,93±2,89 4,18±2,13 1,58±0,58 4,46±2,70 3,72±2,43
Ag. 85A 1,65±0,48 3,90±1,34 3,37±1,17 1,65±0,66 4,34±1,92 3,58±1,67
a
Pós-ttm- Pacientes com tuberculose pulmonar com até quinze dias após o tratamento com
esquema 1 (Isoniazida- Rifampicina- Pirazinamida).
68
VIII - Discussão
Os antígenos MPT-51, ESAT-6, GLcB, Ag85A e Filtrado Protéico de
Cultura (CFP) de M. tuberculosis estimularam resposta Th1/Th2, embora o
estímulo com Ag 85A tenha sido menor do que os demais. As células TCD4 e
CD8 apresentaram maior porcentagem nos pacientes com tuberculose do que
nos controles saudáveis. Nos pacientes tuberculosos estas células
apresentaram marcação positiva tanto para IFN-γ quanto para IL-10 quando
estimuladas pelos antígenos testados.
No grupo dos 22 pacientes com tuberculose pulmonar ativa, a maioria
dos pacientes era do sexo masculino (68,19%) e 31,81% era do sexo feminino.
Essa observação pode ser atribuída à vida social dos homens nos países em
desenvolvimento sendo mais livre e dinâmica do que das mulheres, portanto
esse sexo está mais propício à infecção pelo bacilo da tuberculose. Quanto à
faixa etária, a idade média dos pacientes com tuberculose foi de 36 anos com
variação de 22-63 anos. Dentre 590 pacientes com tuberculose, NOGUEIRA et
al. (2001) encontraram uma faixa etária de 30 a 49 anos de idade, o Ministério
da Saúde (2006) enfatiza, portanto que ambos os estudos refletem o que
ocorre no Brasil e no mundo, embora a população deste estudo foi
relativamente menor do que o realizado por NOGUEIRA et al. (2001). No
entanto, essas conclusões devem seguir a distribuição geográfica de cada
espaço onde se realiza o estudo, tanto no que diz respeito ao sexo e faixa
etária da população.
Na avaliação do calendário profilático, notou-se que 19 pessoas com
tuberculose pulmonar foram vacinadas com BCG e 3 não souberam informar
69
sobre a vacinação. Atualmente a eficácia da BCG na proteção contra a
tuberculose é muito questionada (FARER, 1986). Apesar da vacina de BCG
não oferecer proteção contra a tuberculose pulmonar ativa em adultos, a
mesma vacina oferece proteção acima de 50% contra a tuberculose infantil
(RODRIGUES et al., 1993; COLDITZ et al., 1994; ICMR, 1999). Essa
observação reflete exatamente a faixa etária média de 36,1 anos na população
deste estudo, sendo todos adultos e não estando no circulo de proteção
oferecida pela vacina de BCG, estando susceptíveis a contaminação pelo
bacilo da tuberculose.
Dos tuberculosos, 16 foram positivos para a Prova Tuberculínica (PT) e
seis foram PT negativos. Trabalhos mostram que em pacientes em estágio
avançado da doença, os linfócitos podem não responder ao estímulo antigênico
da PT, podendo resultar em PT negativa. Segundo HARBOE (1981) a PT não é
um método de diagnóstico ideal, pois apresenta algumas desvantagens como à
necessidade do paciente retornar para efetuação da leitura do teste, bem como
a variabilidade e subjetividade na aplicação e leitura do teste. Além disso, a PT
tem baixa especificidade, pois os antígenos usados compõem uma mistura de
antígenos micobacterianos que estão presentes também em micobactérias não
tuberculosas e na cepa de vacina BCG. Apesar dos centros médicos não terem
dificuldades em realizar o diagnóstico de pacientes com tuberculose, a PT de
fato não pode ser utilizada como único meio de distinguir pacientes sadios de
doentes, principalmente em países endêmicos para essa enfermidade como é
o caso do Brasil.
A porcentagem dos linfócitos TCD4 e TCD8 IFN-γ e IL10 positivos dos
pacientes com tuberculose ativa foram maiores do que os controles saudáveis.
70
Observou-se ainda, que a porcentagem de células positivas para IL-10 foi
parecida com IFN-γ, portanto esses achados podem caracterizar o estado de
doença dos pacientes, visto que o IFN-γ tem um papel protetor no controle da
tuberculose (KAWAKAMI et al., 2004). Embora o IFN-γ seja produzido por
outras células, os linfócitos TCD4 e TCD8 são as principais células secretoras
desta citocina. As células TCD4
+
também são produtoras de citocinas anti-
inflamatórias como a IL-10 que já foi identificada em pacientes com tuberculose
ativa (GEROSA et al., 1999). Nosso trabalho, não usou marcação específica
para células T regulatórias tanto CD4
+
quanto CD8
+
(Treg), mas nossos
resultados mostram um aumento preferencial de IL-10 podendo sugerir um
papel para estas células no estabelecimento da doença clínica.
Embora não existam trabalhos caracterizando esta resposta em
humanos, quando camundongos da linhagem C57BL/6J-Rag1
tm1Mom
(Rag1
–/–
)
são infectados com M. tuberculosis, a resposta das células CD4 não está
correlacionada com o aumento da expressão de citocinas como o IFN-γ ou TNF
α ou ainda com a expressão geral de IFN-γ ou da síntese de óxido nítrico nos
órgãos infectados. Além disso, a supressão da proteção, não foi acompanhada
pelo aumento geral da expressão de IL-10 e nem pelo elevado número da
produção de linfócitos TCD4 IL-10
+
(KURSAR et al. (20007). Esses resultados
concordam com muitos estudos já realizados quanto à presença da IL-10 em
camundongos experimentalmente infectados com tuberculose (TURNER et al.,
2001; ROJAS & BALAJI, 1999; WAAL MALEFYT et al., 1993; FIORENTINO et
al., 1991) uma vez que a IL-10 tem sido apontada como uma citocina com
atividade imunossupressora, inibindo a proliferação de linfócitos T e a secreção
de IFN-γ. Baseado nesse fato, JACOBS et al. (2000); MURRAY & YOUNG
71
(1999) estudaram a função da IL-10 na susceptibilidade à tuberculose e
determinaram as funções antimicobacterianas da IL-10, testando camundongos
deficientes para esta citocina e desafiando-os com Mycobacterium bovis
bacillus Calmette-Guérin. Foi possível observar que os camundongos
desafiados tiveram menor carga bacteriana do que os controles. Entretanto, os
camundongos IL-10
/
não aumentaram os níveis de IFN-γ, sugerindo que
outros mecanismos são responsáveis pelo aumento da resistência.
Em nossa pesquisa, provavelmente houve uma regulação da resposta
imune por outras linhagens celulares, sendo necessários futuros estudos para
explicar conclusivamente o elevado nível de IL-10 nos pacientes com
tuberculose pulmonar ativa.
Os antígenos CFP, ESAT-6, MPT-51, GLcB e Ag85A foram capazes de
estimular a produção de IFN-γ e IL-10 pelas células T CD4. Entretanto, o
Ag85A foi o que menos se destacou quanto à capacidade de estimulação do
que os demais estudados. A capacidade das células CD4
+
em expressar IFN-γ
(5,38±2,15) e IL-10 (5,66±2,28), em pacientes com tuberculose pulmonar ativa,
quando estimuladas com o Filtrado Protéico de Cultura (CFP) foi elevada.
SAMANICH et al. (2000) avaliaram o soro de paciente utilizando como antígeno
o CFP por meio de ELISA com o propósito de aplicação de sorodiagnóstico de
tuberculose pulmonar. Segundo os resultados encontrados por estes autores, o
painel de antígenos do CFP, pode ser aplicado para determinar a existência da
doença e para o monitoramento da carga bacteriana na progressão da doença.
WELDINGH et al. (1999) identificaram algumas proteínas do CFP como a
CFP17, CFP20, CFP21, CFP22, CFP25 e CFP28, como indutoras da produção
de IFN-γ em camundongos infectados com M. tuberculosis e em pacientes
72
tuberculosos, entretanto, os autores não descreveram quais células foram
secretoras dessa citocina. Esses resultados concretizam os vários
questionamentos atuais no sentido de se utilizar mais de um antígeno no
estímulo da resposta imune da tuberculose, portanto espera-se assim que o
CFP por ter vários antígenos em seu conteúdo, estimulasse mais resposta
imune em comparação a um só antígeno, mesmo sendo recombinante como é
o caso do MPT-51, ESAT-6, GLcB e Ag 85.
A porcentagem de TCD4 IFN-γ positivas, estimuladas com MPT-51 (5,25
±2,47) foi cinco vezes maior nos pacientes com tuberculose pulmonar ativa,
que nos controles saudáveis (1,76±0,75). Em trabalho realizado por ACHKAR
et al. (2006) identificou-se que o MPT-51 (Rv 3803c) do M. tuberculosis é um
antígeno imunodominante reconhecido por 80% do soro de pacientes HIV
negativos e cultura positiva para tuberculose na Índia. Este trabalho é o
primeiro a identificar o reconhecimento do MPT-51 pela resposta imune celular
de pacientes com tuberculose. O efeito protetor induzido pela vacinação com
rMPT-51 em animais desafiados com M. tuberculosis, apesar de não ter
superado o induzido pelo M. bovis BCG estimulou o aumento dos níveis de
IFN-γ sérico (SUZUKI et al 2004). A avaliação da resposta imune ao MPT-51
mostrou que esse antígeno apresenta elevada imunogenicidade por estimular
mais a resposta em paciente com tuberculose pulmonar ativa do que nos
controles saudáveis.
A avaliação da capacidade do antígeno ESAT-6 em estimular linfócitos
TCD4 e CD8 IFN-γ
+
(CD4 5,63±2,40, CD8 4,33±1,45) e IL-10
+
(CD4 5,83±2,19,
CD8 4,01±1,48) foi elevada nos nossos resultados. Este trabalho concorda com
(LALVANI et al., 2001; CHAPMAN et al., 2001; PATHAN et al., 2001; ELHAY et
73
al., 1998), onde este antígeno induz a secreção de IFN-γ pelas células TCD4
+
.
A imunogenicidade do ESAT-6 tem sido empregada, principalmente para
confirmar se a reação a Prova Tuberculinica é devido à elevada exposição ao
M. tuberculosis, ou a outras espécies de Mycobacterium e ainda se a reação é
decorrente da vacinação com o BCG, uma vez que esta proteína esta ausente
na cepa vacinal (HILL et al., 2005; PORÇA et al., 2006). Geralmente, o ESAT-6
é detectado no início da tuberculose pulmonar ativa (VINCENTE et al., 2003).
Quando combinado com o CFP-10, a acurácia do ESAT-6 aumenta ainda mais
na identificação de indivíduos com tuberculose (TAVARES et al., (2007).
Devido às dificuldades em distinguir a tuberculose ativa da latente,
principalmente em países nos quais há elevada exposição ao bacilo da
tuberculose, VINCENTI et al. (2003) propuseram avaliar pacientes com
tuberculose ativa e observaram que durante esta fase, análises sorológicas de
20 dos 27 pacientes estudados responderam ao ESAT-6 e nenhum dos soros
dos controles, incluindo o TB latente, reconheceu peptídeos do antígeno. Os
autores concluíram, portanto, que esse antígeno poderá ser usado para
diferenciar tuberculose ativa da latente. Então, esse antígeno agrega algumas
características importantes para ser aplicado nos estudos em áreas endêmicas,
elicitando assim a resposta imune de pacientes com tuberculose pulmonar
ativa e latente, servindo como fonte de informações para os centros de saúde
no que diz respeito à identificação de novos casos de tuberculose.
O GLcB foi capaz também de estimular linfócitos TCD4 e TCD8
IFN-γ
+
(CD4 4,72±2,10, CD8 4,46±2,70) e IL-10
+
(CD4 4,92±2,29, CD8 4,93±2,89) de
pacientes com tuberculose pulmonar ativa. SINGH et al. (2005) avaliaram o
perfil de antígenos que são reconhecidos por anticorpos de pacientes com
74
tuberculose subclínica. Dentre esses antígenos, o GLcB foi reconhecido em
90% do soro dos pacientes TB subclínica. Entretanto, o nosso trabalho
apresenta caráter inovador quanto ao estudo deste antígeno, pois os pacientes
com tuberculose são virgens de tratamento e HIV-, portanto, permite
caracterizar a imunogenicidade sem influência de outros fatores, além de ser o
primeiro a identificar a resposta imune celular a este antígeno.
Apesar de ENTLEY-HIBBERT et al. (1999) inferirem ao Ag85A, a
capacidade de estimular forte resposta imune celular e humoral tanto em
humanos quanto em camundongos, a avaliação do Ag85A em estimular os
linfócitos TCD4
+
e TCD8
+
, no nosso trabalho, demonstrou que esse antígeno
não foi tão bem reconhecido pelas células CD4
+
IFNγ
+
(3,23±0,75) e IL10
+
(3,62
±1,04) quando comparados aos demais antígenos nos pacientes com
tuberculose ativa.
Os linfócitos TCD8
+
IFN-γ
+
quando estimulados pelos antígenos CFP
(3,46±1,64), ESAT-6 (4,33±1,45), MPT-51 (3,78±2,02), GLcB (4,46±2,70), e
Ag85A (4,34± 1,92) estiveram em maior porcentagem, comparados com os
controles (CFP 1,22±0,59, ESTA-6 1,49±0,42, MPT-51 1,33±0,61, GLcB 1,58±
0,58, Ag85A 1,65±0,66), apesar do antígeno 85A ter estimulado menor
porcentagem de células que os demais. O linfócito TCD8 apresentou
capacidade reduzida de secretar IFN-γ, quando comparados quanto ao TCD4.
Esses achados estão de acordo com as observações de NAGAI et al. (2007),
pois segundo os autores ambos os padrões de linfócitos (TCD4 e TCD8) são
capazes de produzir IFN-γ, na infecção por tuberculose, embora TCD4
responda mais ao estímulo com produção da citocina do que o TCD8. Os
autores acrescentaram ainda que durante na infecção micobacteriana, a
75
resposta do TCD8 com IFN-γ e independente da ativação das células TCD4.
Embora ambos os fenótipos de linfócitos sejam importantes na defesa contra a
tuberculose, é de se esperar que os TCD8
+
estimulados pelos antígenos
estejam em menor número, apesar de estarem em níveis mais elevados nos
pacientes com tuberculose pulmonar ativa, visto que esse padrão de célula
está em menor concentração comparada aos TCD4+ de controles saudáveis.
A IL-10 é uma interleucina do tipo reguladora que funciona como uma
citocina inibidora de macrófagos, células importantes no controle e combate da
tuberculose. Por outro lado, as citocinas do tipo Th1, IFN-γ e IL-2, são
ativadoras de mecanismos microbicidas dos macrófagos. Dependendo do
predomínio do perfil de citocinas, haverá a manifestação da tuberculose ou
inibição da progressão da infecção (SILVA & BOECHAT, 2004). Trabalhos
realizados por MURRAY et al. (1997) em camundongos que expressavam
constitutivamente IL-10, demonstraram que animais que receberam dose
subletal de micobactéria morreram, enquanto os do tipo selvagem, que
produziam quantidade menor de IL-10, sobreviveram, mostrando que a
produção exagerada dessa interleucina diminui as chances de sobreviver à
micobactéria. O papel da IL-10 em nosso estudo apresenta-se complexo por
envolver padrões de respostas imunes como Th1 e Th2, além disso, deve-se
fazer estudos futuros para esclarecer e interligar essas repostas à tuberculose
pulmonar ativa.
As avaliações dos fenótipos celulares de linfócitos TCD4 e TCD8 e as
citocinas IFN-γ e IL-10, antes e após o tratamento da tuberculose pulmonar não
demonstraram diferença. BARCELOS et al. (2006) estudaram as mudanças
fenotípicas dos leucócitos antes e após o tratamento de tuberculose pulmonar.
76
Apesar do estudo ter sido realizado sem estímulo de antígenos recombinantes,
os autores observaram que houve um predomínio de TCD4
+
em comparação
com os TCD8
+
antes do tratamento. Segundo BELKAID et al (2005) o
progresso do tratamento, poderá levar a uma diminuição da carga bacteriana e
com isso a estimulação antigênica, o que explica a diminuição dos linfócitos
TCD4
+
em resposta ao M. tuberculosis. Embora nossos estudos não relatem
diferenças significativas no perfil de reconhecimento dos antígenos estudados
com relação a presença de células IFN-γ
+
ou IL-10
+
, este é o primeiro trabalho
que avalia o fenótipo das células produtoras destas citocinas. Além do mais, os
nossos pacientes foram recrutados imediatamente após o término do
tratamento, o que pode não ter permitido a redução completa dos antígenos
bacterianos, o que manteria os níveis elevados de linfócitos efetores na
periferia.
Como houve um equilíbrio entre a resposta imune, Th1/Th2, provocada
pelos antígenos estudados, provavelmente outros tipos celulares estão
regulando essa resposta. Nesse caso, estudos futuros deverão ser efetuados
no sentido de elucidar se as células Treg ou Th17 fazem parte do controle da
resposta imune ao M. tuberculosis, pois se sabe que possuem participação na
resposta imune a tuberculose (IVANOV & LINDÉN, 2007).
Todos esses antígenos provaram ser imunogênicos tanto antes como
após o tratamento. Neste estudo, os indivíduos com tuberculose ativa
demonstraram serem responsivos aos antígenos do M. tuberculosis. Esse
aspecto foi evidenciado em um indivíduo que teve regreção da resposta imune
após o tratamento, embora todos os demais parâmetros como hemograma,
Raio X, cultura e baciloscopia estivessem iguais aos demais indivíduos que não
77
regrediu a resposta após o tratamento, dentro dos padrões considerados
normais para a espécie humana.
IX - Conclusões
78
Os antígenos recombinantes MPT-51, GlcB, e o Ag.85A, ESAT-6 e as
Proteínas do Filtrado de Cultura (CFP) do M. tuberculosis são reconhecidos
especificamente pela resposta imune celular de pacientes com tuberculose
pulmonar ativa.
Os antígenos rMPT-51, rGlcB, rAg.85A, rESAT-6 e as Proteínas do
Filtrado de Cultura (CFP) foram capazes de induzir a produção de INF-γ por
linfócitos TCD4 e TCD8 de pacientes tuberculosos.
Os antígenos rMPT-51, rGlcB, rAg.85A, rESAT-6 e as Proteínas do
Filtrado de Cultura (CFP) do M.tuberculosis demonstraram ser capazes de
estimular células TCD4 e TCD8 positivas para IL-10.
A resposta imune celular aos antígenos testados não foi influenciada
pelo tratamento.
A resposta imune celular dos pacientes com tuberculose pulmonar
mostrou-se variada com relação a positividade das células TCD4 e TCD8 para
IFN-γ e IL-10 em resposta aos antígenos testados.
X- Considerações Finais
79
Estes resultados confirmam a importância das populações de linfócitos T
CD4 e T CD8 na produção de citocinas como IFN-gama e IL-10, mas nossos
resultados sugerem a existência de outras populações com funções
consideráveis como Th17 e Treg. Portanto, a analise destas populações
celulares auxiliará o melhor entendimento da resposta imune envolvida na
defesa do hospedeiro contra o M. tuberculosis.
80
XI - Referências Bibliográficas
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International Journal of Osteoarchaeology. 14: 404-413.
110
XII – Anexos
1- Termo de Concentimento dos Voluntários
1.1 Controles Saudáveis
111
1.2 Pacientes com Tuberculose
112
2- Questionários Aplicados aos Voluntários
2.1 Controles Saudáveis
113
2.2 Pacientes com Tuberculose
114
3- Documentos Referentes a Aprovação do Projeto de
Pesquisa
3.1 Parecer da Diretoria do IPTSP
115
3.2 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa- UFGO
116
117
118
3.3 Parecer do SUS e Secretaria
119
120
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