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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ANALISE ANTIGÊNICA DE HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 (BoHV-1) E 5
(BoHV-5) COM ANTICORPOS MONOCLONAIS
Suzana Pereira de Melo Borges Caixeta
Porto Alegre
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ANALISE ANTIGÊNICA DE HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 (BoHV-1) E
5 (BoHV-5) COM ANTICORPOS MONOCLONAIS
Suzana Pereira de Melo Borges Caixeta
Dissertação apresentada como requisito para
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias na área de Medicina Veterinária
Preventiva – Virologia Veterinária.
Orientador: Paulo Michel Roehe
Porto Alegre
2008
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Dedico esse trabalho a minha
mãe, uma guerreira que sempre
lutou pelo o que há de mais
precioso: a vida. E ao meu pai,
meu eterno herói.
Agradecimentos
Aos meus pais, José Alberto e Eula, pela vida, pelo amor e pela luta. Esse sim
foi o meu maior aprendizado.
Aos meus irmãos, Bruno e Simone, por não terem me deixado desistir dessa
conquista.
A minha avó, Dália e ao meu amigo, irmão, pai, tio Marquinho pelo carinho e
conselhos.
A minha grande (no tamanho e no coração) família, pelo ombro e por estarem
tão perto, mesmo distante.
As minhas amigas Carol, Kelly e Michelle, por serem verdadeiras irmãs.
A Denise e a Wilia, pela paciência, ajuda e companheirismo em todos os
momentos.
Um agradecimento especial aos meus novos e eternos amigos Diógenes, Thais,
Carine, Ju e Samuca, pela ajuda, compreensão e incentivo.
Ao meu orientador, Dr. Paulo Michel Roehe, pela oportunidade, orientação e
ensinamentos obtidos.
A professora Ana Cláudia Franco, por estar sempre pronta a me ajudar,
compartilhando seus conhecimentos de uma forma clara e simples.
Ao IPVDF, que permitiu o desenvolvimento do meu trabalho.
Agradeço ainda, aos animais, que foram os principais responsáveis para que eu
escolhesse essa profissão e sempre serão os principais responsáveis para que eu
continue apaixonada pela Medicina Veterinária.
ANALISE ANTIGÊNICA DE HERPESVÍRUS BOVINO TIPOS 1 (BoHV-1) E 5
(BoHV-5) COM ANTICORPOS MONOCLONAIS
RESUMO
Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) são responsáveis
por uma série de patologias em bovinos. A diferenciação entre tipos e subtipos desses
vírus é importante para a compreensão da epidemiologia das infecções associadas a
eles, assim como para permitir a tomada de medidas de controle adequadas. No presente
estudo foram efetuadas análises antigênicas utilizando anticorpos monoclonais (AcMs)
preparados contra antígenos específicos de herpesvírus bovinos. Quarenta e cinco
amostras virais foram examinadas com um painel de 36 AcMs previamente preparados,
em testes de imunoperoxidase em monocamada. Quatro amostras virais, sendo três
BoHV-1 e uma BoHV-5, não apresentaram reatividade frente a nenhum dos AcMs
avaliados. Oito dos 36 AcMs reagiram com todas as demais 41 amostras de herpesvírus
bovinos. Por outro lado, oito amostras virais (três BoHV-5 e cinco BoHV-1) reagiram
com todos os AcMs testados. Um AcM foi capaz de diferenciar o subtipo “c” do BoHV-
5 das demais amostras. Os demais resultados obtidos sugerem que não há uma clara
correlação entre tipos e subtipos genomicamente determinados de herpesvírus bovinos e
os AcMs aqui avaliados.
ANTIGENIC ANALISIS OF BOVINE HERPESVIRUS TYPE 1 (BoHV-1) AND
(BoHV-5) USING MONOCLONAL ANTIBODIES.
ABSTRACT
Bovine herpesvirus 1(BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are associated to different
clinical conditions of cattle. The differentiation between types and subtypes of these
viruses maybe important for a better understanding of the epidemiology of bovine
herpesvirus infections, as well as to provide support for adequate control measures. In
the present study, antigenic analyses were performed with monoclonal antibodies
(Mabs) prepared to bovine herpesviruses specific antigens. Fourty five virus
isolates/strains were examined with a panel of 36 previously prepared Mabs,
immunoperoxidase monolayer assays. Four virus isolates, of which three BoHV-1 and
one BoHV-5, did not react with any of the Mabs tested. Eight of the 36 Mabs reacted
with all other 41 bovine herpeviruses. On the other hand, eight viruses (three BoHV-5
and five BoHV-1) reacted with all Mabs tested. One Mab was capable of distinguishing
BoHV-5 subtype “c” from the other subtypes. Additional results revealed that no
clearcut correlation could be established between bovine herpesviruses types and
subtypes determinated by molecular methods and the Mabs here evaluated.
LISTA DE ABREVIATURAS
BICP: bovine infected cell protein
BoHV-1: Herpesvírus bovino tipo 1
BoHV-1.1: Herpesvírus bovino tipo 1 subtipo 1
BoHV-1.2a: Herpesvírus bovino tipo 1 subtipo 2a
BoHV-1.2b: Herpesvírus bovino tipo1 subtipo 2b
BoHV-1.3: Herpesvírus bovino tipo 1 subtipo 3
BoHV-5: Herpesvírus bovino tipo 5
BoHV-5a: Herpesvírus bovino tipo 5 subtipo a
BoHV-5b: Herpesvírus bovino tipo 5 subtipo b
DMEM: Meio mínimo essencial modificado de Dulbecco
DICC
50
:
Doses infectantes para 50% cultivos celulares
E: Classe de genes expressos cedo após a infecção (early)
ECP: efeito citopático
EDTA: ácido etileno diaminotetra-acético
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
HSV: Herpes simplex vírus
ICAM-I: Moléculas de adesão intracelular tipo I
IE: imediatamente precoses (“immediate early”)
IFN (α/β): Interferon
IgA: Imunoglobulina A
IgD: Imunoglobulina D
IgE: Imunoglobulina E
IgG: Imunoglobulina G
IgM: Imunoglobulina M
IL: Interleucinas
IPB: Balanopostite pustular infecciosa
IPV: Vulvovaginite pustular infecciosa
IPVDF: Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor
IPX: Imunoperoxidase
IR: Seqüência repetida interna
L: Classe de genes expressos tardiamente após a infecção (late)
LAT: Transcrito associado à latência
LR: Região relacionada à latência
MDBK: Células de rim de bovino Madin-Darby
MEM: Meio mínimo essencial de Eagle
MHC-I: Complexo maior de histocompatibilidade tipo I
NK: natural killer cells
Kbp: Kilo (10
3
) pares de bases
PBMCs: Células mononucleares periféricas do sangue
PBS: solução de tampão salino com fosfatos
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PRV: Vírus da Pseudo-raiva (Herpesvírus suíno tipo 1)
REA: Análise com enzimas de restrição
SDS: Sódio dodecil-sufato
SN: Soroneutralização
Th1: Linfócito T helper 1
Th2: Linfócito T helper 2
TNF (-α): Fator de necrose tumoral
TR
s
: Seqüência repetida terminal
UL: Segmento longo único
US: segmento curto único
Vhs: Virus-host shut off
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Microscopia eletrônica de um virion de um alphaherpesvirus 15
Figura 2 - Organização genômica dos alphaherpesvirus 16
Figura 3 - Reação negativa ao teste de imunoperoxidase 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais glicoproteínas de BoHV-1 e BoHV-5 20
Tabela 2 - Amostras virais 36
Tabela 3 - Tipagem/Isotipagem dos AcMs 39
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Perfil de reatividade dos BoHV frente aos AcMs em teste de IPX 43
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 13
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 15
2.1. Características gerais dos herpesvírus 15
2.2. Comparação genômica e antigênica entre BoHV-1 e BoHV-5 16
2.3. Glicoproteínas virais 17
2.4. Replicação Viral 20
2.4. Latência 22
2.5. Transmissão 23
2.6. Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) 23
2.7.1. Rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) 24
2.7.2. Vulvovaginite pustular infecciosa (IPV) e balanopostite
pustular infecciosa (IBP)
25
2.8. Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) 25
2.8.1. Encefalites 27
2.9. Resposta Imune 27
2.9. 1. Resposta imune inata 27
2.9.1. Resposta imune adaptativa humoral 28
2.9.3. Resposta imune adaptativa celular 29
2.10. Diagnóstico 29
2.10.1. Diagnóstico Laboratorial 29
2.10.1.2. Diagnóstico Sorológico 30
a) Soroneutralização (SN) 30
b) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 30
c) Imunoperoxidase (IPX) 31
2.11. Anticorpos 32
2.11.1. Anticorpos Monoclonais (AcM) e o BoHV 32
3. OBJETIVOS 34
4. MATERIAL E MÉTODOS 35
4.2. Células 35
4.1. Amostras Virais 35
4.3. Multiplicação das amostras virais 36
4.4. Anticorpos Monoclonais 37
4.5. Isotipagem dos AcMs 37
4.6 Teste de imunoperoxidase em monocamada (IPX) 37
5. RESULTADOS 39
5.1. Isotipagem dos AcMs 39
5.2. Caracterização das Amostras de BoHV 39
5.3. Teste de imunoperoxidase 39
6. DISCUSSÃO 42
7. CONCLUSÃO 45
8. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 46
9. ANEXOS 61
13
1. INTRODUÇÃO
A espécie bovina é hospedeira natural de vários membros da família
Herpesviridae, dentre os quais aqui serão destacados os herpesvírus bovino tipos 1 e 5
(BoHV-1 e BoHV-5) (Murphy et al., 1999; Knipe et al., 2001). Ambos os vírus
compartilham diversas propriedades biológicas, antigênicas e moleculares (Delhon et al.
2003). Apesar da grande similaridade, o BoHV-1 e o BoHV-5 podem ser diferenciados
por análises de restrição enzimática de seus genomas (Engels et al., 1986; Bulach &
Studdert, 1990), por testes de neutralização cruzada (Bagust & Clarck, 1972; Metzler et
al., 1986), pela cinética de neutralização (Bratanich et al., 1991), por SDS-PAGE com
polipeptídeos marcados (Metzler et al., 1986), pela reatividade com anticorpos
monoclonais (AcMs) (Engels et al. 1986, Metzler et al. 1986, Bratanich et al. 1991,
Roehe et al. 1997, D'Arce et al. 2002, Souza et al. 2002) e pela caracterização dos genes
que codificam as glicoproteínas gC (Chowdhury, 1995), gD (Abdelmagid et al., 1992),
gG (Engelhardt & Keil, 1996), gH (Meyer et al., 1999) e gE (Chowdhury et al., 2000).
Por meio dessas técnicas as amostras de BoHV-1 foram subdivididas em dois
subtipos, denominados BoHV-1.1 e BoHV-1.2. O subtipo BoHV-1.2 ainda foi
subdividido em BoHV-1.2a e BoHV-1.2b (Metzler et al., 1985). O subtipo 1 (BoHV-
1.1) geralmente está relacionado ao grupo que causa doença respiratória clássica; o
subtipo 2a (BoHV-1.2a) abrange as cepas associadas com a rinotraqueite infecciosa
bovina/vulvovaginite pustular infecciosa (IBR/IPV) e abortos, enquanto o subtipo 2b
(BoHV-1.2b) causa vulvovaginite ou balanopostite, mas geralmente não está associado
com abortos (Miller, 1991).
O BoHV–5 é o agente etiológico da encefalite herpética bovina (Roizman &
Pellett, 2001). Amostras de BoHV-5 eram no passado consideradas “variantes
encefalitogênicas” de BoHV-1, sendo chamadas de BoHV-1.3, devido às amplas
reações cruzadas entre estes dois vírus encontradas em testes sorológicos (Bratanich et
al., 1991, Teixeira et al., 1998). Entretanto, características epidemiológicas distintas
destas infecções, amparadas em estudos antigênicos e moleculares, levaram a criação do
tipo 5 para enquadrar este agente encefalitogênico em um taxon diferente (Roizman et
al., 1992). Estudos comparativos entre amostras brasileiras e de outros países, utilizando
enzimas de restrição, mostraram que o BoHV-5 subdivide-se em BoHV-5a, BoHV-5b e
BoHV-5 “não a-não b”, ou “c” (D’Arce et al., 2002).
14
Contudo, não existe nenhuma associação definitiva entre tipo/subtipo e quadro
clínico, principalmente porque o BoHV-5 já foi isolado de sêmen (Gomes et al., 2003),
tecidos de fetos abortados (Carrillo et al., 1983; Suarez Heinlen et al., 1993) e de órgãos
(baço e pulmão) de animais com infecções sistêmicas (Suarez et al. 1993). Por outro
lado, BoHV-1 tem sido ocasionalmente isolado do sistema nervoso central de animais
apresentando doenças neurológicas (Magyar et al., 1993; Furuoka et al., 1995; Ely et
al., 1996; Roels et al., 2000; Penny et al., 2000; Silva et al., 2007). Além disso, isolados
genitais, quando inoculados experimentalmente, podem causar infecções respiratórias
(Spilki et al., 2004).
Visto que há uma grande similaridade entre os tipos e subtipos do BoHV, os
testes sorológicos tradicionais de diagnóstico são incapazes de diferenciar a resposta
induzida por uma amostra de BoHV-5 daquela induzida pelo BoHV-1 (Teixeira et al.,
1998). Em conseqüência disso, até o presente não existem dados corretos sobre as reais
prevalências de infecções causadas por BoHV-1 ou BoHV-5 (Souza et al., 2002).
Os anticorpos monoclonais podem constituir-se em importantes ferramentas na
distinção das infecções causadas pelos herpesvírus bovinos. Dependendo de suas
especificidades, os AcMs podem permitir estudos sobre a biologia dos herpesvírus, tais
como a caracterização de sua composição protéica e a análise das variantes (Souza et
al., 2002; D’Arce et al., 2002). Um de seus usos mais freqüentes tem sido a busca da
caracterização antigênica de amostras (Meyer et al., 1999; Souza et al., 2002; Oldoni et
al., 2004). As evidências levantadas pela aplicação dos AcMs têm contribuído para o
desenvolvimento de testes diagnósticos, alguns deles inclusive capazes de diferenciar
tipos e subtipos do vírus (apesar de ainda escassos até o presente). Como ferramenta
diagnóstica, os AcMs também podem ser de grande utilidade na precisa identificação
de um agente suspeito, apresentando o potencial de permitir a determinação correta do
agente causador de determinado quadro.
Em estudo prévio (Oliveira, 2006), 48 AcMs foram produzidos através da
imunização de camundongos BALB-C com antígenos de BoHV-1 e BoHV-5. No
presente estudo, 36 destes AcMs foram utilizados para analisar as caracteisticas
antigênicas de 45 amostras de BoHV-1 e BoHV-5.
15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Características gerais dos herpesvírus
Os herpesvírus pertencem à família Herpesviridae, a qual inclui mais de 200
vírus isolados de diferentes espécies, incluindo moluscos, peixes, anfíbios, répteis, aves
e mamíferos (Roizman et al., 2001). Essa variedade de hospedeiros evidencia a
capacidade de adaptação dos herpesvírus na natureza, assim como sua co-evolução
junto a diferentes espécies ao longo do tempo (Davison, 2002).
Os herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BoHV-1, BoHV-5) estão classificados na
subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ICTV, 2007). Os membros dessa
subfamília caracterizam-se por apresentarem um ciclo de replicação curto, porém com
rápida disseminação em cultivos celulares e pela indução de lise nas células infectadas.
Outra característica importante desta subfamília é a capacidade de estabelecer infecções
latentes em gânglios nervosos (Fenner et al., 1993).
Os herpesvírus possuem um nucleocapsídeo icosaédrico com 100 -110 nm de
diâmetro, consistindo em 162 capsômeros (150 hexâmeros e 12 pentâmeros). O virion é
circundado por uma zona eletrodensa de material amorfo denominado tegumento e por
um envelope lipídico onde glicoproteínas virais projetam-se da superfície em forma de
espículas, sendo as glicoproteínas B, C e D as mais abundantes (Thiry et al., 2007).
Todo este conjunto forma um virion pleomórfico de 120-300nm de diâmetro (Figura 1)
(Roizman & Pellett, 2001).
Figura 1. Microscopia eletrônica de um virion de um alphaherpesvirus (HSV) (Frank Fenner, com
modificações, John Curtin School, Australian National University -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB.html).
16
O genoma dos alphaherpesvírus consiste em uma fita dupla de DNA linear com
aproximadamente 135-140 mil pares de base (Kpb) (Muyklens et al., 2007). A
disposição genômica é típica dos herpesvírus do grupo “D”, em que o genoma pode ser
dividido em um segmento longo único (“unique long”, ou UL) de aproximadamente 102
a 104 Kpb e um segmento curto único (“unique short”, US) de aproximadamente 10,5 a
11 Kpd, flanqueado por regiões repetidas invertidas de aproximadamente 24 Kpb,
denominadas repetição interna (IR) e terminal (TR) (Figura 2) (Roizman & Knipe,
2001).
Figura 2. Organização genômica dos alphaherpesvirus. O genoma consiste em uma fita dupla de DNA
linear. O rearranjo contém um segmento longo único (UL) e um curto único (US) flanqueado por duas
seqüências invertidas repetidas: repetição interna (IR) e repetição terminal (TR). O segmento US pode
apresentar duas possíveis orientações enquanto que o segmento UL apresenta predominantemente uma
orientação (representado pelas flechas, a flecha pontilhada ilustra que a orientação do segmento UL pode
variar em torno de 5%) (Thiry et al., 2007).
2.2. Comparação genômica e antigênica entre BoHV-1 e BoHV-5
O BoHV-1 e 5 apresentam uma homologia de 82% a 85% no genoma (Engels et
al., 1986; Delhon et al., 2003). As diferenças na seqüência de nucleotídeos entre esses
dois vírus estão distribuídas por todo o genoma (Engels et al.,1981; Chowdhury, 1995).
Estudos comparativos entre esses dois vírus mostraram que o BoHV-5 possui,
aproximadamente, 138.390 pares de bases (pb) e uma taxa de guanina/citosina (G/C) de
72 %. Já o BoHV-1 possui 2.518 pb a mais totalizando em 75 % de G/C (Schwyzer &
Ackermann, 1996; Meyer et al., 1997; Delhon et al., 2003; Thiry et al., 2007). O
genoma do BoHV-1 compreende 67 genes únicos, enquanto que o BoHV-5 apresenta
68 genes únicos. Ambos apresentam dois genes duplicados, que codificam para as
proteínas BICP4 e BICP22, localizados nas repetições internas (Delhon et al., 2003).
Antigênicamente, o BoHV-1 e 5 são homólogos em 95% (Delhon et al., 2003).
As proteínas que possuem maior identidade com o BoHV-1 são aquelas envolvidas na
replicação do DNA viral (codificada pelos genes UL5, UL15, UL29 e UL39) e as que
17
compõem o tegumento (codificadas pelos genes Ul14, UL48) e o capsídeo (codificadas
pelos genes UL19, US6) do vírion (Delhon et al., 2003).
Análises com anticorpos monoclonais (AcMs) têm demonstrado diferenças
antigênicas entre as principais glicoproteínas (gB, gC e gD) do BoHV-5 e do BoHV-1.
Diferenças na ligação da gC do BoHV-1 e 5 aos seus receptores pode indicar uma
modulação na habilidade do vírus se espalhar para o sistema nervoso central (Liman et
al., 2000), contribuindo para as diferenças na patogênese da doença respiratória e da
doença neurológica entre esses dois vírus (Chowdhury, 1995).
2.3. Glicoproteínas virais
O genoma do BoHV codifica mais de 70 produtos, entre os quais 10 a 12 são
glicoproteínas do envelope (Tikoo et al., 1995). Estas glicoproteínas desempenham um
papel fundamental na interação vírus-célula e estão envolvidas nos diferentes processos
do ciclo viral, tais como reconhecimento e adsorção, penetração, disseminação de célula
para célula, maturação e liberação do vírus (Tabela 1) (Thiry et al., 2007).
O segmento UL inclui genes que codificam as glicoproteínas gB (UL27)
(Whitbeck et al., 1988), gC (UL44) (Fitzpatrick et al., 1988), gH (UL22) (Baranowski
et al., 1995), gL (UL1) (Khattar et al., 1996), gK (UL53) (Khadr et al., 1996)e gM
(UL10) (Wu et al., 1998), enquanto que o segmento US abriga os genes que
correspondem a gG (US4) (Keil et al., 1996), gD (US6) (Tikoo et al., 1990), gI (US6)
(Rijsewijk et al., 1995) e gE (US8) (Rijsewijk et al., 1993).
As glicoproteínas são importantes alvos para a resposta imune do hospedeiro
devido à sua localização no envelope viral e superfície (membrana plasmática) da célula
infectada. Desta forma, elas desenvolvem funções relevantes na patogênicidade do vírus
à célula hospedeira, estando relacionadas com os mecanismos de entrada, dispersão
(Baranowski et al., 1996; Spear,1993) e modulação da resposta imune do hospedeiro
(Dubin et al., 1991). Além disso, as propriedades imunogênicas atribuídas as
glicoproteínas são importantes para o desenvolvimento de vacinas e testes de
diagnósticos (Thiry et al., 2007).
Geralmente, as glicoproteínas interagem entre si (Davis-Poynter et al., 1994),
formando homo - ou heterodímeros estáveis, tais como gH com gL e gE com gI
(Johnson et al., 1988; Hutchinson et al., 1992; Tyborowska et al., 2000). Alguns destes
complexos são essenciais para a multiplicação viral e além de funcionar como
receptores para imunoglobulinas (Scwyzer et al., 1996; Khattar et al., 1996). Outros se
18
ligam ao fator C3b do complemento, interferindo na modulação da resposta imune pelo
hospedeiro (Bryant et al., 2003).
A gC é a glicoproteína de maior divergência entre esses vírus, seguido da gB e
gD (Thiry et al., 2007). A gC mantém a eficiência da replicação viral no hospedeiro
(Liang et al., 1992), mediando a ligação a receptores presentes na superfície celular, tais
como heparina (Okazaki et al., 1991). A seqüência de aminoácidos (aa) do segmento
amino-terminal da gC é consideravelmente menor no BoHV-5 do que no BoHV-1
(Collins et al., 1993; Chowdhury, 1995; Roehe et al., 1997). Isso contribui para a
ausência de dois sítios prováveis de glicolisação no BoHV-5 e para diferenças nas
cargas das regiões amino-terminal de ambos os vírus. Essas diferenças podem influenciar
nas propriedades biológicas do BoHV-5, incluindo a neuroinvasividade (Chowdhury,
1995).
A gB é uma das principais glicoproteínas do envelope viral e também é
encontrada na membrana plasmática de células infectadas (van Drunen Littel-van Den
Hurk et al., 1984; Marshall et al., 1986). Essa glicoprteína induz uma forte resposta por
anticorpos neutralizantes (Babiuk et al., 1987) e é reconhecida por linfócitos T CD4+
(Hutchings et al., 1990; Leary & Splitter, 1990). Estudos preliminares identificaram
importantes epítopos presentes na gB que estão envolvidos na indução de anticorpos
neutralizantes (Fitzpatrick et al., 1990). A gB, totalmente glicosilada (gBa), apresenta uma
massa molecular de 130kDa e é parcialmente clivada por proteases celulares, gerando duas
subunidades, a gBb (75kDa) e a gBc (55kDa) (Marshall et al., 1986; Okazaki et al., 1986;
van Drunen Littel-van Den Hurk et al., 1984, 1992). A clivagem da gB é necessária para a
disseminação do vírus entre células (Kopp et al., 1994;
Keil et al, 2005).
Quatro co-receptores para a glicoproteína D foram identificados (HveA, B, C, D
e HigR) (Geraghty et al., 1998; Montgomery et al., 1996; Warner et al., 1998). A
interação da gD com receptores celulares resulta uma ligação estável (Karger &
Mettenleiter, 1993; Spear, 1993) o que facilita a disseminação viral intercelular (Liang
et al., 1995). Desta forma, a gD confere uma conformação adequada para a ligação de
outras glicoproteínas (Schroder et al., 1997). Além disso, células expressando a gD
resistem a infecção pelo vírus homólogo e heterologo (HSV e PRV), um fenômeno
conhecido como interferência. A interferência ocorre em nível de penetração nas
células, sugerindo o uso de receptores em comum para a rota de entrada viral
(Campadelli-Fiume et al., 1988; Johnson & Spear, 1989). O mesmo não ocorre quando
estas mesmas células são infetadas com BoHV-5, podendo-se inferir que BoHV-5
19
utilize receptores alternativos na infecção celular (Dasika & Letchworth, 2000). A gD
do BoHV consegue induzir uma resposta imune no hospedeiro mais forte e consistente
que a gB e a gC, resultando em redução significativa da replicação e excreção viral (van
Drunen Littel-van Den Hurk et al., 1993) Assim a gD é a glicoproteína de escolha para
a produção de vacinas de subunidade. (Tikoo et al., 1995).
A gE é uma glicoproteína transmembrana do tipo I presente em menor
quantidade no envelope viral, em contraste com as glicoproteínas imunodominantes gB,
gC e gD (Rebordosa et al., 1994). A gE do BoHV-1 associa-se formando um heterodímero
com a gI, logo após a sua síntese (Johnson et al., 1988; Whitbeck et al., 1996). Esse
complexo gE/gI mostrou-se importante para a virulência e disseminação do vírus entre a
células (Chowdury et al., 2000). Em alguns herpesvírus
, este complexo funciona como
receptor Fc (FcR) específico para a imunoglobulina G (IgG) (Johnson et al., 1988).
Mutantes virais dos quais foram deletados os genes codificantes para gE e gI,
apresentaram redução da virulência (Dingwell et al., 1994; Dingwell et al., 1995;
Kaashoek et al., 1995a; van Engelenburg et al., 1995; Rebordosa et al., 1996; Hübner et
al., 2005). Em cultivos celulares essas cepas defectivas apresentam como característica
um fenótipo de formação de placas menores (Balan et al., 1994; Whitbeck et al., 1996). A
glicoproteína US9 é uma proteína do tipo II bastante concervada nos herpesvírus
neurotrópicos.
Atua em conjunto a gE e gI promovendo uma eficiente infecção
transneural anterógrada no sistema nervoso(Enquist et al., 2002).
20
Tabela 1: Principais glicoproteínas de BoHV-1 e BoHV-5 (Esteves 2001, com modificações).
Glicoproteínas
Nomenclatura Características
gB
Altamente imunogênica, induz anticorpos neutralizantes, essencial
para os processos de adsorção, penetração e difusão (Tikoo et al.,
1995; Schwyzer et al., 1996).
gC
Altamente imunogênica, não essencial à replicação viral, durante a
adsorção liga-se a receptores de heparina. Relacionada a virulência
(Hecht et al., 1995; Tikoo et al., 1995; Schwyzer et al., 1996).
gH
Essencial, conservada, atua no processo de entrada, difusão e saída
do vírus (Schwyzer et al., 1996).
gK
Não essencial, participa da fusão do vírus à célula (Khadr et al.,
1996; Schwyzer et al., 1996).
gL
Não essencial, participa do transporte e da modelagem da gH
(Khattar ey al., 1996; Schwyzer et al., 1996).
Região
UL
gM
Não essencial, participa do processo de difusão célula-célula
(Schwyzer et al., 1996; Wu et al., 1998).
gD
Altamente imunogênica, induz anticorpos neutralizantes, não
essencial (Schroder et al., 1999), liga-se a receptores de manose
(Schwyzer et al., 1996), induz apoptose (Meyer et al., 1998)
gE
Não essencial, participa da difusão viral e, quando complexada a gI
atua como receptore para a região Fc de IgG (Schwyzer et al., 1996;
Chowdhury et al., 2000)
gG
Não essencial (Schwyzer et al., 1996), atua no processo de difusão
célula a célula (Nakamichi et al., 2000).
Região
US
gI
Não essencial, participa do processo de difusão e quando
complexada a gE atua como receptor para a região Fc da IgG (Tikoo
et al., 1995; Schwyzer et al., 1996; Chowdhury et al., 2000).
2.4. Replicação Viral
O início da infecção pelo BoHV-1 e pelo BoHV-5 em células permissivas ocorre
com a ligação de glicoproteínas virais aos receptores celulares (Tikoo et al. 1995).
Existem pelo menos quatro classes de moléculas que compõem os receptores celulares,
21
porém acredita-se que a nectina-1 (membro da família das imunoglobulinas) é o
receptor de maior participação no processo de adsorção viral (Geraghty et al., 1998).
As principais glicoproteínas envolvidas no processo de adsorção viral são a gC e
gB que se ligam com os receptores já reconhecidos de glucosaminoglicano sulfato de
heparina (Li et al., 1995; Meyer et al., 1998) seguidos da gD que interage com outros
receptores de forma estável (Campadelli-Fiume et al., 2000). Finalmente, ocorre a
interação de outras glicoproteínas que atuam como coadjuvantes na adsorção, porém
seus efeitos são essenciais para o processo de entrada viral (Klupp et al., 1991)
A penetração do vírus requer a fusão do envelope viral com a membrana
plasmática e depende da ação das gB, gD, gH e gL (Spear et al., 2000). Após a fusão, o
nucleocapsídeo é transportado ao núcleo através de microtúbulos celulares. No núcleo,
os processos de transcrição iniciam de maneira temporalmente regulada por três classes
de RNA menssageiro (mRNA) denominadas “immediate early” (IE ou α), “early” (E ou
β) e “late” (L ou γ) que são transcritas pela RNA polimerase II (RNApol II) celular
(Fenner et al., 1993; Tikoo et al., 1995; Roizmman, 1996).
O estágio IE é mediado pela ação do fator α-transindutor (α-TIF), que é uma
proteína estrutural presente no tegumento e responsável pela transcrição dos genes IE
juntamente com os fatores de transcrição celular (Oct-2) (Misra et al., 1995). As
proteínas IE (BICP0, BICP4, BICP22, BICP 27 e BICP 47), funcionam induzindo a
transcrição de genes E, traduzindo-os em proteínas tais como timidina quinase e DNA
polimerase (Fenner et al. 1992, Tikoo et al. 1995, Jones, 2003). As proteínas E são
predominantemente envolvidas na replicação do DNA viral e na indução de síntese de
proteínas L, tais como gB, gD e gC, as quais são expressas tardiamente na infecção
(Roizman, 1996).
A replicação do genoma e a montagem do nucleocapsídeo ocorrem no núcleo
das células infectadas. Os ciclos de replicação do DNA viral iniciam com a
desnaturação do material genético pela proteína UL9. Helicases e outras proteínas que
se ligam ao DNA de fita simples, associam-se ao complexo DNApolimerase para a
síntese de DNA. Uma vez que o crescimento da nova fita progride, a estrutura circular
da replicação é cortada para formar um intermediário de um círculo rolante. As fitas de
DNA são “encapsidadas” pela interação de proteínas de clivagem/empacotamento com
sinais específicos de empacotamento (seqüências "a") no fim dos genomas virais
(Wagner, 2007).
22
O capsideo contendo o material genético migra através da membrana nuclear
para tornar-se envelopado. As glicoproteínas virais são traduzidas no reticulo
endoplasmático rugoso e então transportadas para o complexo de Golgi em vesículas
para continuar o processo de glicosilação. As glicoproteínas são transportadas então nas
vesículas até a membrana nuclear ou plasmática. O capsideo viral associa-se com as
membranas modificadas pelo vírus, podendo envolver a interação com as proteínas da
matriz, codificadas pelo vírus. A liberação final do virion envelopado da célula envolve
o vírus sendo incorporado em vesículas exocíticas sendo a seguir liberado da célula
como vírus infeccioso livre.
2.5. Latência
Uma importante característica biológica dos vírus da subfamília
Alphaherpesvirinae é o estabelecimento de latência. Nessa situação, os animais
infectados tornam-se portadores inaparentes, com episódios esporádicos de reexcreção
viral e potenciais transmissores do vírus. Essa característica determina a perpetuação e
disseminação da infecção pelo BoHV no rebanho (Pastoret et al., 1982).
A infecção latente ocorre nos neurônios sensoriais, geralmente nos gânglios
trigêmeo ou sacral, dependendo do local da primo-infecção (Jones 2003). O processo
ocorre com o transporte do vírus através dos microtubulos dos axônios até o corpo do
neurônio (Thiry et al., 2007), onde os genomas virais associam-se com histonas do
hospedeiro e persistem como mini-cromossomas (Mettenleiter et al., 2006).
Evidências mostram que o BoHV-1, BoHV-5 e outros alfaherpesvírus também
estabelecem latência em outros locais como os centros germinativos das tonsilas
faríngeas (Winkler et al., 2000). Além disso, BoHV-1 tem sido encontrado em
linfócitos T CD4+ e em células mononucleares periféricas do sangue (Winkler et al.,
2000; Lovato et al., 2000).
Após a entrada do vírus nas células, a expressão de genes virais é extinta, com
exceção do gene que codifica a transcriptase associada à latência (LAT) (Jones 2003).
Tikoo et al. (1995) demonstraram que o mecanismo da latência ocorre devido a um
conjunto de fatores: o primeiro sugere que o mRNA do LAT controla a expressão dos
genes IE. Outro fator é a de que o mesmo mRNA codifica uma proteína regulatória de
transcrição. Os mesmos autores sugerem a hipótese de existirem mecanismos
específicos das células nervosas que interferem de maneira negativa sobre fatores de
transcrição. A manutenção da latência é definida como um período em que as partículas
23
virais infecciosas não são detectadas por procedimentos padrões de isolamento viral
(Barbosa, 2004).
Animais latentemente infectados servem de reservatório natural para o vírus
durante toda a vida (Devireddy & Jones, 1998). Fatores externos como estresse (ex.:
transporte, introdução do animal em um novo rebanho, precárias condições de manejo,
ocorrência de infecções ou infestações respiratórias) ou tratamento com corticoídes
podem reativar o vírus latente, ocorrendo a síntese de novas partículas virais infecciosas
e restabelecendo novamente o ciclo lítico e disseminação viral (Rock, 1994; Van
Oirschot, 1995).
2.6. Transmissão
A transmissão do BoHV-1 e BoHV-5 pode ocorrer de forma direta através de
aerossóis e contato com secreções (respiratórias, oculares, genitais) de animais
infectados (Wyler et al., 1989; Mars et al., 2000) e de forma indireta através da fômites,
inseminação artificial e transferência de embriões (van Oirschot et al., 1993; Wyler et
al., 1989; Bielanski & Dubuc, 1994).
O vírus penetra no animal principalmente pelas mucosas oro-nasal, genital e
ocular. Nas células epiteliais dessas regiões ocorrem a replicação e posteriormente a
disseminação célula a célula do BoHV, causando lise destas e produzindo infecção
localizada. A infecção sistêmica acontece quando partículas virais invadem linfonodos e
vasos linfáticos seguido de uma viremia associada a linfócitos e disseminação pelo
organismo (Engels & Ackermann 1996).
O período de incubação varia entre 2 e 6 dias, dependendo da dose e rota de
inoculação (Kahrs, 1977). Disseminação viral em secreções nasais foi encontrada num
período entre 12 e 18 dias, embora haja relatos de isolamento viral intermitente num
período de até 578 dias (Studert, 1989).
Conseqüente a uma pronunciada resposta imune, esta infecção é geralmente
auto-limitada ocorrendo a recuperação em uma ou duas semanas. As lesões locais
podem facilitar infecções secundárias gerando outros quadros clínicos como
pneumonias, enterites, mastites, metrites, dermatites e tonsilites (Blood et al., 1988).
2.7. Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1)
O BoHV-1 é um importante agente infeccioso de bovinos, que causa perdas
significativas na pecuária (Hage et al. 1996). Este vírus pode ser dividido em dois
24
subtipos, BoHV-1.1 e BoHV-1.2, e este último em 2a e 2b, através de análises de
restrição enzimática e de reações antigênicas frente a anticorpos monoclonais (Engels et
al, 1986, Rijsewijk et al., 1999; D’Arce et al., 2002; Souza et al., 2002). As afecções
causadas pelo BoHV-1 e seus subtipos estão geralmente relacionadas com problemas de
ordem respiratória e reprodutiva.
O BoHV-1 possui distribuição mundial e, tanto bovinos quanto outras espécies
animais (suínos, ovinos, caprinos e búfalos, além de espécies selvagens como cervos)
apresentam anticorpos reagentes contra BoHV-1 (Teixeira 1998, Straub 2001).
No Brasil, grande parte das propriedades apresentam animais sorologicamente
positivos para o BoHV-1 (Ravazzolo et al., 1989; Lovato et al., 1995; Vidor et al.,
1995). Estima-se que pelo menos 30 % do rebanho nacional esteja infectado com este
vírus, isso equivaleria a cerca de 50 milhões de bovinos infectados, para um rebanho
próximo a 170 milhões de cabeças. Em alguns países da Europa, a infecção já se
encontra erradicada ou em vias de erradicação (Ackermann & Engels, 2006).
2.7.1. Rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR)
A infecção de animais por BoHV-1.1 e BoHV-1.2a pode desencadear alterações
associadas a problemas respiratórios (IBR) e a problemas reprodutivos como abortos e
reabsorção embrionária (Edwards et al., 1991; Miller et al., 1991; Spilki, 2001). A IBR
apresenta-se de forma aguda e possui como sinais clínicos febre (40,5 - 42°C), anorexia,
dispnéia, tosse, corrimento nasal seroso ou sero-hemorrágico e, posteriormente
purulento, hiperemia, pústulas e erosões da mucosa nasal (Kaashoek et al., 1996). À
auscultação pulmonar nota-se aumento do murmúrio vesicular, em conseqüência da
obstrução parcial das vias respiratórias altas. Em alguns casos podem ser observadas
conjuntivite, sialorréia e ulcerações na mucosa oral (Fenner et al., 1992; Riet-Correa et
al., 1996).
O aborto pode ocorrer quando a vaca prenhe é infectada com amostras virais de
alta virulência, principalmente entre o 5° e o 8° mês de gestação e após um período de
incubação de 3 a 6 semanas (Wyler et al., 1989). A doença geralmente é mais grave em
bovinos confinados do que em bovinos de leite ou de corte mantidos a campo por
estarem os primeiros em condições de estresse (Riet-Correa et al. 1996).
Na forma respiratória, o índice de morbidade pode chegar a 100 %, a
mortalidade, embora incomum, pode chegar a 10% podendo aumentar quando o quadro
é complicado com infecções bacterianas secundárias ou infecções víricas superpostas
25
(Kahrs 1981). A manifestação clínica reprodutiva é uma das principais causas de perdas
econômicas (Wyler et al., 1989).
2.7.2. Vulvovaginite pustular infecciosa (IPV) e balanopostite pustular infecciosa
(IBP)
As infecções genitais estão associadas principalmente com o BoHV-1.2b. Nas
fêmeas, a IPV caracteriza-se por hiperemia e edema da mucosa vulvovaginal com
disseminação de pequenas pústulas que evoluem formando úlceras. O animal pode
apresentar descarga vaginal mucopurulenta, causada por infecção bacteriana secundária
(Wyler et al., 1989).
Nos machos, a sintomatologia clínica da IBP inclui lesões localizadas nas
mucosas do pênis e no prepúcio. A infecção em touros é de extrema importância para a
inseminação artificial, já que o vírus é eliminado pelo sêmen e, desta forma, pode ser
transmitido para fêmeas susceptíveis (Miller 1991, Fenner et al. 1992, Riet-Correa et al.
1996, Rocha et al. 1999, Puente 2003).
Na ausência de infecções secundárias, a fase aguda da IPB e IBP tem um curso
clínico de quatro a sete dias. Muitos casos são subclínicos ou inaparentes e podem
passar despercebidos, dificultando o controle da infecção (Riet-Correa et al. 1996,
Rocha et al. 1999, Puente 2003).
Apesar do subtipo 1.2b do BoHV-1 estar relacionado a uma manifestação clínica
genital, estudos demonstram que a inoculação experimental de isolados genitais
ocasionaram infecções respiratórias (Spilki et al., 2004), sugerindo que as infecções
estão mais relacionadas as vias de infecção e ao manejo do que a características
inerentes aos subtipos do BoHV-1. O BoHV-1 também já foi detectado no encéfalo de
bovinos, com ou sem doença neurológica, sugerindo que o mesmo possa estar associado
com doença neurológica (D’Offay et al., 1995; Roels et al., 2000; Penny et al., 2002;
Silva et al., 2007).
2.8. Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5)
O BoHV-5 é o agente etiológico da encefalite herpética bovina (Roizman &
Pellett, 2001), causando infecções caracterizadas por meningocefalites fatais em
bovinos de até 8 meses e, ocasionalmente, em animais até dois anos de idade (French,
1962; Bulach & Studert, 1990).
26
Este vírus apresenta uma distribuição geográfica restrita, sendo mais
freqüentemente detectado no hemisfério sul do que no hemisfério norte (D’Arce et al.
2002). Já foi relatado em países como Austrália (Gardiner & Nairn, 1964; Johoston et
al, 1962), Hungria (Bartha et al., 1969), Canadá (Gough & James, 1975), Estados
Unidos (Barentus et al,1963; Reed et al., 1973; Eugster et al., 1974) , Itália (Ros &
Belák, 1999) e Argentina (Carrilo et al, 1983). No Brasil, existem dados de isolamento
deste vírus desde 1989 (Weiblen et al., 1989; Riet-Correa et al., 1989; Salvador et al.,
1998).
Amostras de BoHV-5 eram no passado consideradas “variantes
encefalitogênicas” de BoHV-1, sendo chamadas de BoHV-1.3, baseado nas amplas
reações cruzadas entre estes dois vírus encontradas em testes sorológicos (Bratanich et
al., 1991, Teixeira et al., 1998) e no efeito citopático em cultivo de células (Friedly &
Metzler, 1987). Atualmente o BoHV-5 é reconhecido como um agente distinto do
BoHV-1 (Roizamann, 1992). A principal diferença está relacionada à neuroinvasividade
e neurovirulência (Bagust & Clark, 1972; Belknap et al., 1994; Meyer et al., 2001). De
acordo com perfis eletroforéticos de clivagens utilizando enzimas de restrição e frente à
reação com anticorpos monoclonais o BoHV-5 subdividi-se em BoHV-5a, BoHV-5b e
BoHV-5 não a/não b (D’Arce et al. 2002).
Em testes de diagnóstico convencionais, a resposta induzida por uma amostra de
BoHV-5 não é claramente diferenciado daquela induzida pelo BoHV-1 (Teixeira et al.,
1998). Devido a essa grande semelhança antigênica e genômica (Engels et al., 1986;
Delhon et al., 2003) e ao fato de que a vacinação contra o BoHV-1 pode mascarar as
infecções causadas pelo BoHV-5 (Cascio et al., 1999) é que a real prevalência do
BoHV-5 continua desconhecida (Roehe et al., 1997).
Embora a infecção pelo BoHV-5 já tenha sido relatada em países do hemisfério
norte, a diferenciação entre as duas infecções permanece um problema essencialmente
sul-americano. No Brasil, os estados do Mato Grosso e Mato Grosso do Sul apresentam
grande incidência dessa doença, demonstrando baixa morbidade e taxas de mortalidade
próximas a 100 %, afetando animais de 6 a 60 meses (Salvador et al., 1998; Roel set al.,
2000; Colodel et al., 2000). Sanches et al. (2000) consideram o BoHV-5 como sendo a
segunda maior causa de doenças víricas do sistema nervoso central, superado apenas
pelo vírus rábico.
27
2.8.1. Encefalite
O BoHV-5 chega ao sistema nervoso central através das terminações nervosas
do nervo trigêmeo (ramos maxilar e mandibular) (Hall et al., 1966; Wyler et al., 1989,
Meyer et al. 2001), do nervo olfatório (Meyer et al. 2001) e das meninges (Furuoka et
al., 1995). Os sinais clínicos que caracterizam a infecçãodo SNC por esse vírus
consistem em depressão, anorexia, incoordenação, hipersalivação, ataxia, tremor
muscular, cegueira, ranger de dentes e, eventualmente, morte (Wyler et al., 1989; Meyer
et al., 2001; Perez et al., 2002, Colodel et al., 2002).
Análises histopatológicas no sistema nervoso central descrevem
meningoencefalites não supurativa, com infiltrados de células mononucleares no
parênquima cerebral e meninges, necrose neuronal, gliose focal e difusa, hemorragias,
ruptura de neuropila, neurofagia e satelitose (Hubner, 2004).
A infecção pelo BoHV-5 também foi relacionado a abortos (Heinlen et al. 1993;
Ely et al. 1996) assim como infecções por BoHV-1 parecem estar envolvidas com
encefalites (D’Offay et al., 1993) uma vez que o sistema nervoso central (SNC) possui
receptores para todas as variantes de BoHV, incluindo os tipos 1 e 5. Além disso, a
inoculação experimental do BoHV-5 em bezerros resulta em doença respiratória
(Belknap et al. 1994, Vogel et al. 2004).
2.9. Resposta Imune
2.9.1. Resposta imune inata
Durante a infecção primária a síntese de proteínas virais induz uma série de
eventos que estimulam a imunidade inespecífica do hospedeiro (Babiuck et al., 1996).
A resposta imune inespecífica consiste na primeira tentativa de defesa do hospedeiro,
tendo como objetivo eliminar ou amenizar a infecção viral. Nesta fase ocorre a
produção e liberação de interferon que age modulando o transporte de leucócitos e de
outras células efetoras como as células mononucleares periféricas (PMNCs),
macrófagos, células natural killers (NK) ao local da infecção (Bielefeldt Ohman et al.,
1991).
Citocinas inflamatórias produzidas nas fases iniciais da infecção são
responsáveis pelo aumento da expressão das moléculas de adesão (seletina P e ICAM-I
- moléculas de aderência intracelular tipo l), facilitando a passagem de leucócitos e das
células efetoras do vaso sanguíneo para o sitio da infecção. Neste local, neutrófílos e
macrófagos liberam oxido nítrico (NO), metabólitos do ácido aracdônico e enzimas para
28
eliminar partículas virais e células infectadas (Campos et al., 1986; Campos et al., 1989;
Shappell et al., 1989; Machado et al., 2004).
Outras citocinas, como a interleucina 2 (IL-2), possuem participação importante
na fase inicial. A IL-2 induz a produção de INF-γ, que por sua vez estimula as células
NK e macrófagos a eliminar células infectadas (Campos et al., 1989; Jensen & Schultz,
1990). A IL-2 também participa da diferenciação de células T auxiliares 0 (Th0) em
células T auxiliares 1 (Th1), influenciando no desenvolvimento de resposta imune
específica (Muylkens et al., 2006).
2.9.2. Resposta imune adaptativa humoral
A resposta imune específica é também ativada na infecção primária, sendo a
resposta imune humoral detectada a partir do 7° dia pi (pós-inoculação), persistindo por
vários anos (Wyler et al., 1989; Babiuk et al., 1996; Spilki et al., 2001). A produção de
anticorpos contra o BoHV parece ter menos importância na fase inicial da infecção, pois
o pico ocorre quando o hospedeiro já se encontra em recuperação.
Os anticorpos detectados são as imunoglobulinas M (IgM), IgG e IgA. A
IgM e a IgG atingem os maiores níveis séricos a partir do 14° dia pi, porém, após esse
período, as taxas de IgM são rapidamente reduzidas enquanto que as taxas de IgG
declinam mais lentamente (Madick et al., 1995). A atividade neutralizante da IgA é
detectada em secreções nasais e genitais principalmente entre os dias 4-30 pi (Wyler et
al., 1989; Spliki et al., 2001). Animais recém-nascidos adquirem anticorpos
principalmente após a ingestão do colostro que podem apenas amenizar a agressividade
da doença e não impedir a infecção.
O papel da resposta humoral é questionável, na infecção primária, eles
parecem não participar da disseminação viral célula a célula, uma vez que o vírus
apresenta mecanismos de escape e persiste mesmo na presença de anticorpos
neutralizantes (Wyle et al., 1989; Babiuk et al., 1996). Porém, numa infecção
secundária ou numa reativação viral, a imunidade humoral auxilia prevenindo a
infecção, pois os anticorpos exercem maior atividade nas partículas virais extracelulares
(Babiuk et al., 1996). Alternativamente, os anticorpos podem ser adjuvantes no
mecanismo de citotoxicidade celular dependente de anticorpos, ao se ligarem às células
infectadas, permitindo a ação de células NK (Machado et al., 2004).
Anticorpos neutralizantes permanecem circulantes por vários anos após o
primeiro contágio (Mechor et al., 1987; Van der Poel et al., 1995; Kaashoek et al.,
29
1996c). No caso de uma reativação viral, os níveis de anticorpos podem ou não sofrer
alterações (Madic et al., 1995).
2.9.3. Resposta imune adaptativa celular
A resposta imune mediada por células é detectada entre os 7-10 dias pós-
infecção, com a ativação de linfócitos T (LT). Os LT vão exercer citotoxicidade pelo
reconhecimento de epitopos virais, como os epítopos das glicoproteínas gB, gC, gD, gE,
gI e gG, associados à moléculas de MHC na superfície das células infectadas, causando
lise destas (Denis et al., 1993; Denis et al., 1996; Babiuk et al., 1996; Machado et al.,
2004). Linfócitos T CD8+ reconhecem epítopos virais associados a proteínas de MHC-l
e linfócitos T CD4+ à epitopos associados à MHC-ll. Os linfócitos CD4+ também
contribuem com as células B na produção de anticorpos (Wang & Slitter, 1998;
Machado et al., 2004).
Linfócitos sensibilizados agem em conjunto a interleucinas, linfotoxinas, fator
quimiotático e prostaglandinas para eliminação do vírus intracelular, ao qual os
anticorpos não têm acesso.
2.10. Diagnóstico
2.10.1. Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da infecção pelo BoHV-1 e BoHV-5 não deve ser baseado apenas
em sinais clínicos, pois estes são sugestivos, mas não patognomônicos, devendo então
ser o mesmo confirmado por exames laboratoriais. Um diagnóstico completo em nível
laboratorial deve ser baseado no isolamento do vírus em cultivo celular ou, ainda,
através de métodos moleculares e identificação de componentes virais ou de anticorpos
específicos para o BoHV (Van Donkersgoed & Babiuk 1991; Roehe et al., 1997; OIE
2002).
O isolamento viral em cultivo celular é um dos métodos mais utilizados para a
identificação do agente (Halfen & Vidor 1998, Flores 1999, Schynts et al. 1999). Nos
casos de IBR, IPB ou IPV, os espécimes clínicos geralmente utilizados são esfregaços
de secreções nasais, oculares, genitais e sêmen (Rocha et al. 1999), além de material de
fetos abortados (como órgãos e/ou os cotilédones placentários) (Flores 1999, OIE
2002). Em casos de encefalites, fragmentos do cérebro são utilizados (Roehe et al,
1997).
O vírus se multiplica bem em uma grande variedade de células como as de rim,
pulmão e testículo de bovino, células derivadas de pulmão fetal, traquéia ou ainda em
30
linhagens estabelecidas como a Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) (Madin et al.,
1956; McKercher, 1963; Baugust & Clark, 1972).
In vitro, a infecção por BoHV causa efeito citopático característico, isto é,
ruptura do tapete celular com células arredondadas e agrupadas, formando placas virais
entre 2 a 4 dias pi. Para confirmação do agente viral, outras técnicas podem ser
empregadas, tais como as que seram descritas a seguir.
2.10.1.2. Diagnóstico Sorológico
a) Soroneutralização (SN)
A técnica de SN é bastante utilizada, sendo considerada a técnica padrão para o
diagnóstico sorológico dos herpesvirus (Teixeira et al, 1998; OIE, 2002). A SN consiste
na neutralização da partícula viral pelos anticorpos presentes no soro do animal
infectado (House & Baker, 1971 Bitsch, 1978; Del Fava et al., 1998; Rocha et al., 2001;
Vieira et al., 2003). É uma técnica trabalhosa e que depende da existência de um
estoque de vírus e de cultivos celulares adequados, além disso, o resultado é obtido em
3 a 5 dias (Bitsch et al., 1978).
O teste de SN não permite a diferenciação precisa de animais infectados com
BoHV-1 ou BoHV-5. Cerca de 92% dos animais infectados com BoHV-1 e BoHV-5
apresentam reações cruzadas à SN (Teixeira et al., 1998).
b) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
O ELISA é uma técnica que vem substituindo provas sorológicas como a SN
(Collins et al., 1985). É uma técnica rápida e permite o processamento de um grande
número de amostras. É uma técnica onde os reagentes possuem um custo mais baixo
quando comparados a SN e que os anticorpos podem ser quantificados através do uso de
espectrofotômetro (Hilderbrand, 1979; Boton et al., 1981).
Os testes de ELISA, disponíveis até o presente, também detectam reações
cruzadas entre o BoHV-1 e 5 (Teixeira et al., 1998; Esteves et al., 1999). Entretanto,
Spilki et al. (2005) desenvolveram um ELISA associado a anticorpos monoclonais e
que permitiu a distinção entre os subtipos de BoHV-1.1 e BoHV-1.2, baseado em
diferenças na gC.
Wellenberg et al. (2001) relataram a existência de um ELISA que diferencia a
resposta imunológica do BoHV-1 e do BoHV-5 através da detecção de anticorpos
contra a gE, porém só foram analisadas seis amostras e o estudo não teve validação
31
estatística. Contudo, é de extrema importância o desenvolvimento de provas sorológicas
que sejam capazes de diferenciar a resposta imunológica entre tipos BoHV-1 e BoHV-5,
a fim de obter-se um melhor conhecimento da prevalência destas infecções nos
rebanhos bovinos.
Atualmente, o uso de vacinas diferenciais, largamente utilizadas em países
europeus (Kaashoek et al., 1994; Stegeman et al., 1994; Kaashoek et al., 1995b; Van
Oirschot et al., 1996; Strube et al., 1996; Van Oirschot et al., 1997), tem permitido a
diferenciação da resposta imunológica de animais vacinados, imunizados com cepa viral
mutante, da resposta imunológica dos animais infectados com o vírus selvagem (Van
Oirschot et al., 1997; Van Oirschot et al., 1999). Juntamente com estas vacinas, o
desenvolvimento de testes sorológicos diferenciais tem permitido um maior controle das
infecções e a implementação de programas de erradicação da doença (Kit et al., 1992).
Estes testes, principalmente do tipo ELISA de competição ou de bloqueio, baseiam-se
no uso de anticorpos monoclonais dirigidos contra domínios antigênicos da
glicoproteína viral cujo gene codificante foi deletado da amostra vacinal (Van Oirschot
et al., 1997; Van Oirschot et al., 1999; Lehman et al., 2002; Beer et al., 2003).
Testes deste tipo são importantes para uma melhor compreensão da infecção
pelo BoHV a campo, auxiliando no controle das infecções e na implementação de
programas de erradicação e controle das infecções, uma vez que permitem a
diferenciação antigênica. (Kit et al., 1992).
c) Imunoperoxidase (IPX)
A técnica de IPX também é bastante empregada na detecção de isolados virais
bem como na análise sorológica de animais suspeitos da infecção (Dereget & Prins,
1998; Wellenberg et al., 1999; Souza et al., 2002; Keuser et al., 2004). Essa técnica tem
como princípio geral a detecção da reação antígeno-anticorpo (poli ou monoclonal) por
um segundo anticorpo marcado com a peroxidase (conjugado), que, ao reagir com a
água oxigenada, produz uma coloração (Teixeira, 1998; OIE, 2002).
A IPX tem-se mostrado ser tão ou mais especifica na detecção de antígenos
virais que alguns testes sorológicos, principalmente quando se utiliza anticorpos
monoclonais. Estudos relatam que o desenvolvimento de uma IPX associada a
anticorpos monoclonais permite a caracterização de diferentes amostras de BoHV
(Wellenberg et al., 1999; Souza et al., 2002; D’Arce et al., 2002), dentre elas, a
diferenciação entre amostras de BoHV-1 e 5 (Roehe et al., 1997; Roehe et al., 2002).
32
2.11. Anticorpos
Anticorpos são proteínas pertencentes à classe das imunoglobulinas, produzidas
pelo sistema imune como parte da resposta humoral frente a infecções. As células
responsáveis pela produção e secreção de anticorpos são os linfócitos B (Alberts et al.,
1997). Cada linfócito B produz um tipo de anticorpo que reconhece um único tipo de
sítio antigênico (epítopo), esse anticorpo específico para apenas um epítopo é
denominado anticorpo monoclonal.
Em 1975, George Köhler e Cesar Milstein introduziram o primeiro método de
produzir anticorpos monoclonais in vitro. A produção destes consiste na imunização de
camundongos com um determinado antígeno. Ainda no animal, ocorre a proliferação de
células B secretoras de anticorpos específicos para aquele antígeno. O animal é
sacrificado e o baço é removido, os esplenócitos são individualizados e fusionados com
células de mieloma imortais, dando origem às células hibridas ou hibridomas. O
hibridoma secretor de anticorpo específico contra o epítopo do antígeno é então
selecionado com meio de cultura e expandido como clone individual. A vantagem dos
hibridomas é que eles são capazes de multiplicar-se em cultivos celulares, diminuindo a
utilização de animais e, podendo, assim, secretar anticorpos por tempo indeterminado
(Harlow & Lane, 1988).
A utilização de anticorpos monoclonais tem sido uma alternativa empregada em
várias áreas da saúde, sendo sua aplicação cada vez mais comum e essencial em
técnicas de diagnósticos e na pesquisa. A manipulação de anticorpos permite a sua
utilização em inúmeros processos como isolamento de um antígeno específico,
determinação da correta concentração do antígeno no organismo do hospedeiro e
identificação de outras macromoléculas que possam estar relacionadas na interação do
antígeno-anticorpo.
2.11.1 Anticorpos Monoclonais (AcM) e o BoHV
A utilização de AcMs nos estudos com BoHV aprimorou os conhecimentos
sobre a biologia do vírus, incluindo uma melhor caracterização de sua composição
protéica e também na avaliação da variabilidade antigênica do BoHV-1 e BoHV-5,
sendo empregados na classificação e diferenciação de isolados do vírus (Meyer et al.,
1999; Roehe et al., 1997; Souza et al., 2002; D’Arce et al., 2002; Oldoni et al., 2004).
Estudos mostram que a determinação de padrões de reatividade das amostras de
vírus frente aos AcMs permitiu a diferenciação entre os tipos de BoHV (BoHV-1 e
33
BoHV-5), além da diferenciação de seus subtipos BoHV-1.1, BoHV-1.2 (BoHV-1.2a
e
BoHV-1.2b), BoHV-5a e BoHV-5b (Roehe et al., 1997; Alfieri, 2000; Souza et al.,
2002; OIE 2002, D’Arce et al., 2002). A produção de um AcM reagente contra a região
amino-terminal da glicoproteína C do BoHV-1.1 e não do BoHV-1.2, permitiu também
o desenvolvimento e padronização de um ELISA capaz de diferenciar as respostas
sorológicas entre os subtipos BoHV-1.1 e BoHV-1.2 (Spilki et al., 2005). Porém, ainda
existe uma grande necessidade de se desenvolver outros testes sorológicos de rotina
capazes de diferenciar os tipos e subtipos de BoHV, uma vez que há uma extensa
reatividade cruzada entre amostras (D’Arce et al., 2002).
Anticorpos monoclonais podem ser aplicados também na identificação de
epítopos para o isolamento de proteínas virais tais como a gB, gC e gD que são os
principais imunógenos reconhecidos por anticorpos presentes no soro de animais
infectados (van Drunen Littel-van den Hurk & Babiuk, 1986). A produção e utilização
de AcM a partir de vírus com deleções genéticas são importantes para o entendimento
tanto de proteínas que possuem maior representação imunogênica quanto para aquelas
que possuem um papel ainda não muito claro. A imunização de camundongos com
antígenos de uma cepa defectiva na glicoproteína C (gC) permitiu a obtenção de AcMs
contra outras proteínas virais, estes AcMs podem ser úteis para o mapeamento de
epitopos neutralizantes nestas outras glicoproteínas que não a gC (Winkelmann et al.,
2007).
34
3. OBJETIVOS
O objetivo desse estudo foi analisar 45 isolados de BoHV frente a 36 anticorpos
monoclonais, procurando determinar características antigênicas entre as amostras virais.
35
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Células:
As células utilizadas foram as da linhagem Madin Darby Bovine Kidney
(MDBK), cultivadas em meio mínimo essencial de Eagle (EMEM - GIBCO
®
) contendo
10% de soro fetal bovino (SFB-Soraly
®
) e 0,001% de enrofloxacina (Baytril 5%,
Bayer
®
), sendo multiplicadas seguindo Freshney (1992) com uma taxa de divisão de 1:4
a 1:6.
4.2. Amostras Virais:
As amostras virais utilizadas no presente estudo foram gentilmente cedidas por
laboratórios nacionais e internacionais (Tabela 2), sendo mantidas nos estoques da
FEPAGRO Saúde Animal - Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor
(IPVDF).
Tabela 2: Amostras virais utilizadas no estudo e provável tipo (determinado com base no quadro clínico
do animal de qual a amostra foi isolada)
Vírus
Classificação
proposta
Sinais clínicos no animal
de origem
Referência/fonte
1
LA INTA BoHV 1.1
Encefalite Madin et al. (1956)
2
LAM BoHV 1.1
Rinotraqueite Van Engelenburg et al. (1994)
3
LAM gE- BoHV 1.1
Amostra recombinante
e
Franco 2002
4
LAM US9- BoHV 1.1
Amostra recombinante
f
Franco 2002
5
EVI 14/94 BoHV 1.1
Rinotraqueite Souza et al. (2002)
6
SV 56/90 BoHV 1.1
Rinotraqueite Heinlein et al. (1993)
7
COOPER BoHV 1.1
Rinotraqueite Madin et al. (1956)
8
EVI 123/98 BoHV 1.1
Rinotraqueite Souza et al. (2002)
9
T3 BoHV 1.1
Rinotraqueite FVURU
b
10
UY 2002/06 BoHV 1.2
Rinotraqueite FVURU
11
UY 2004/02 BoHV 1.2
Bálanopostite FVURU
12
SV 265/96 BoHV 1.2
Rinotraqueite UFSM
c
13
SV 265/96 gE- BoHV 1.2
Amostra recombinante
g
Franco et al., 2002
14
SV 453/93 BoHV 1.2
Vulvovaginite Canabarro et al. (1993)
15
PG 1779/03 BoHV 1.2
Aborto IPVDF
a
16
Retiro BoHV 1.2
Vulvovaginite Roehe et al. (2002).
17
IOWA BoHV 1
Rinotraqueite Madin et al. (1956)
18 SV 299/03 BoHV 1 Rinotraqueite UFSM
19 299/03 mss BoHV 1 Rinotraqueite UFSM
36
20 SV 1613/93 BoHV 1 Rinotraqueite UFSM
21
SV 57/90 BoHV-1
Rinotraqueite UFSM
22
SV 55/02 BoHV-1
Rinotraqueite UFSM
23 SV 609/03 BoHV 1 Rinotraqueite UFSM
24
EVI 88/95 BoHV 5.a
Encefalite Souza et al. (2002)
25
EVI 88/95 TD BoHV 5.a
Amostra recombinante
h
Franco et al., 2002
26
V175 BoHV 5.a
Sêmen Esmeraldino et al. (1996)
27
A663 BoHV 5.b
Encefalite Carrillo et al. (1983)
28
ISO94/232 BoHV 5.c
Encefalite Souza et al. (2002)
29
ISO95/97 BoHV 5.c
Encefalite Souza et al. (2002)
30
ISO 87/97 BoHV 5.c
Encefalite Souza et al. (2002)
31
SV 507 BoHV 5
Encefalite Delhon et al. (2003)
32
N569 BoHV 5
Encefalite Brake and Studdert (1985)
33
EVI 99 BoHV 5
Encefalite Souza et al. (2002)
34
SV 198/05 BoHV 5
Encefalite UFSM
35
EVI 340/96 BoHV 5
Encefalite Caron et al. (2001)
36
RP BoHV 5
Encefalite Souza et al. (2002)
37
SV136/88 BoHV 5
Encefalite Souza et al. (2002)
38
T2 BoHV 5
Encefalite FVURU
39
P160/96 BoHV 5
Encefalite Souza et al. (2002)
40
AA 05 BoHV 5
Encefalite Souza et al. (2002)
41
AA 01 BoHV 5
Encefalite UEL
d
42
RIM BoHV-5
Encefalite IPVDF
43
T1 BoHV-5
Encefalite FVURU
44
EVI 130 BoHV-5
Encefalite IPVDF
45
T4 BoHV-5
Encefalite FVURU
46
EVI 192/03 PRV
IPVDF
a: Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor.
b: Universidad de la República, Uruguay
c : Universidade Federal de Santa Maria
d: Universidade Estadual de Londrina
e: Amostra LAM, cujo gene codificante para a glicoproteína E foi deletado
f: Amostra LAM, cujo gene codificante para a proteína US9 foi deletado
g: Amostra SV 265/96, cujo gene para a glicoproteína E foi deletado
f: Amostra EVI 88/95, cujo genes para as glicoproteínas E, I e para a proteína US9 foram deletados.
4.3. Multiplicação das amostras virais
Células MDBK foram mantidas em garrafas de 25 cm
2
. Uma vez formada a
monocamada confluente, num período de 24 horas após o repique, o meio foi removido,
as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfatos (PBS) e
inoculadas com 500 μL de uma suspensão vírica com titulos entre 10
6,5
e 10
7
doses
infectantes para 50 % cultivos celulares (DICC
50
). As garrafas foram incubadas por 1
37
hora a 37°C para a adsorção viral. Após, o inóculo era removido e 10 mL de EMEM
sem SFB adicionado. As garrafas eram então incubadas a 37°C até que 90% do tapete
celular apresentessem efeito citopático (ECP). A seguir, as mesmas eram congeladas a -
70°C e descongeladas, repetindo-se este processo três vezes. As suspensões obtidas
eram clarificadas por centrifugação a 1000 X g, o sobrenadante coletado e distribuído
em criotubos em volumes de 500 μL e armazenado a -70°C.
4.4. Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos monoclonais (AcMs) utilizados foram preparados em nosso
laboratório em estudo prévio (Oliveira, 2006). Os 36 AcMs foram obtidos pela
imunização de camundongos BALB-C com as amostras EVI 123/98 de BoHV-1 e EVI
88/95 de BoHV-5 (Oliveira, 2006) seguindo a técnica descrita por Harlow & Lane
(1988).
4.5. Isotipagem dos AcMs
Para a isotipagem dos anticorpos monoclonais foi utilizado um "kit" de ensaio
imunoenzimático comercial (Sigma ISO-2®). O teste utilizado, do tipo ELISA de
captura, foi executado de acordo com as recomendações do fabricante.
4.6. Teste de imunoperoxidase em monocamada (IPX)
As amostras de BoHV foram testadas frente aos AcMs pela técnica de
imunoperoxidase em monocamada (IPX) (Saunders, 1977), com algumas modificações
descritas a seguir. Utilizando placas de cultivo celular de 96 orifícios, foram
adicionados 50 μL de 100 DICC
50
de cada amostra viral (previamente titulada) a ser
testada, em todos os orifícios, exceto na última linha de orifícios na placa (linha “H”),
que foi mantida como controle negativo não infectado. A seguir, 3 X 10
4
células
MDBK/orifício foram semeadas e a placa incubada a 37°C em atmosfera contendo 5%
de CO
2.
Quando o ECP era evidente em aproximadamente 20% do tapete celular, o
meio era removido e as placas eram lavadas com PBS e secadas em estufa seca a 37°C.
Após a completa secagem dos orifícios, as placas eram congeladas a -20°C por pelo
menos uma hora. Em seguida, foi adicionado 100 μL de acetona a 20% (diluída em
PBS) em cada orifício, durante 30 minutos a 4°C. A seguir as placas foram lavadas com
PBS até a remoção total da acetona. Após, foram adicionados 50μL dos respectivos
AcMs e as placas foram incubadas por uma hora a 37°C em câmara úmida com
38
atmosfera contendo 5% de CO
2.
Após esse período, as placas foram submetidas a três
lavagens com líquido de lavagem (PBS - Tween 80; vide fórmula no anexo) e um
conjugado polivalente (Polyclonal rabbit anti-mouse Immunoglobulins-HRP, Dako)
diluído a 1:200 (em liquido de diluição; vide fórmula no anexo) sendo as placas
novamente incubadas a 37°C em câmara úmida por uma hora. Outras três lavagens
foram executadas com líquido de lavagem e a prova foi revelada com adição de
substrato (15 μL de H
2
O
2
(30 volumes); 300 μL de 3-amino-9-etilcarbazol a 4% em 5
mL de tampão acetato (pH 5.0) de acordo com Harlow & Lane (1988). A reação
antígeno-anticorpo específica foi evidenciada pela coloração carmim nas células
infectadas
39
5. RESULTADOS
5.1. Isotipagem dos AcMs
A tipagem/isotipagem dos AcMs está apresentada na Tabela 3. Dos 36 AcMs
obtidos, todos pertencem à classe IgG; 11 são do isotipo 2a, 16 do isotipo IgG2b e 9 do
isotipo 3.
Tabela 3: Tipagem/Isotipagem dos AcMs utilizados para a caracterização das amostras de BoHV. Todos
os AcMs pertecem a família G das imunoglobulinas, sendo onze da subfamília IgG2a, 16 da subfamília
IgG2b e 9 da subfamília IgG3.
Anticorpos Monoclonais Tipagem
1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 21, 22 IgG2a
8, 15, 16, 17, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 35, 36 IgG2b
7, 9, 10, 14, 18, 19, 30, 31, 33, IgG3
5.2. Caracterização das Amostras de BoHV
Os resultados obtidos com os testes de IPX estão apresentados no Quadro 2. As
amostras virais que apresentaram reatividade com os AcMs estão nas áreas negritadas,
as que não apresentaram reações estão em branco. As amostras de vírus foram dispostas
de acordo com os perfis de reatividade observados. A amostra PRV foi utilizada como
controle negativo (Figura 3).
Figura 3: Reação negativa ao teste de imunoperoxidase (IPX) usando anticorpo monoclonal. MDBK
inoculada com uma amostra de vírus da pseudo-raiva PRV (Aumento 40 X)
5.3. Teste de imunoperoxidase
Este estudo apresentou diversos padrões de reatividade entre 45 amostras virais e
36 AcMs. Dentre esses padrões destacam-se quatro perfis: o primeiro perfil
40
(apresentado nas linhas 42, 43, 44 e 45 do quadro 1) mostrou que quatro das 45
amostras virais, N569 (BoHV-5), RIM, T4 (ambos descritos genomicamente como
BoHV-1, Sousa, 2007 - dados não publicados) e Retiro (BoHV-1.2), não reagiram com
nenhum anticorpos monoclonal.
O segundo perfil apresentado foi que as demais 41 amostras reagiram com 8 dos
36 AcMs (apresentados na primeira coluna do quadro 1).
Oito amostras, SV265/96 gE-, EVI 123/95, COOPER, SV 453/93, SV 1613/93
(BoHV-1), T1, AA 01 e SV136/88 (BoHV-5) reagiram positivamente com os todos
AcMs testados (perfil apresentado nas linhas de 1 a 8).
Finalmente, o último perfil analisado (apresentado nas linhas 28, 29 e 30) foi que
as amostras ISO 94/232, ISO 95/97 e ISO 87/97 (todos genomicamente determinados
no subtipo c do BoHV-5) apresentaram o mesmo perfil, não reagindo com 10 dos 36
AcMs (apresentado nas colunas 20 a 29), destaque para o AcM 28 (coluna 21) que
apresenta reatividade com 41 amostras virais exceto com essas amostras determinadas
como BoHV-5c.
As demais reações apresentadas no quadro 1 foram consideradas reações
“atípicas”, pois a análise das amostras de herpesvírus bovino frente aos AcMs não
apresentou nenhuma relação que permitisse que fossem colocadas dentro de um perfil
de reatividade específico ou dentro de um perfil descrito acima.
41
Quadro 1: Perfil de reatividade das amostras de herpesvírus examinadas com anticorpos monoclonais (AcMs) em testes de imunoperoxidase (IPX). LEGENDA:
42
6. DISCUSSÃO
Neste estudo, 45 amostras de BoHV foram analisadas frente a 36 AcMs, quatro
perfis de reatividade puderam ser destacados. O primeiro perfil destacado foi que as
amostras N569, RIM, T4 e Retiro, não reagiram com nenhum dos AcMs em questão,
sugerindo estas amostras apresentam alterações protéicas que inibem a expressão de
epítopos capazes de serem reconhecidos pelos anticorpos. A manipulação excessiva, o
mau acondicionamento e a exposição acidental destas amostras a reagentes físicos e
químicos podem ter sido a causa das alterações protéicas.
Outro perfil apresentado foi que 41 amostras virais reagiram com oito dos 36
AcMs, sendo esses anticorpos os mais amplamente reativos. AcMs não discriminativos
em relação ao tipo de vírus poderão ter aplicações importantes, tais como o
desenvolvimento de testes de diagnóstico capazes de identificar tanto BoHV-1 quanto
BoHV-5 (Souza et al., 2002).
Oito amostras de BoHV-1 e 5 (EVI 123/95, COOPER, SV 453/93, SV 1613/93,
T1, AA 01 e SV136/88), incluindo uma amostra recombinante, apresentando deleção no
genoma (SV265/96 gE-), reagiram com todos os 36 AcMs. Esta análise demonstra que
os AcMs não foram capazes de estabelecer uma relação entre os tipos de BoHV
genomicamente determinados com a análise antigênica dos AcMs testados.
O último perfil apresentado foi que as amostras genomicamente determinadas
como BoHV-5c (ISO 94/232, ISO 95/97 e ISO 87/97) apresentaram o mesmo padrão,
reagindo com 26 dos 36 anticorpos. Destacando o AcM 28 que não reagiu apenas com
essas amostras, sugerindo que esse AcM possa ser capaz de diferenciar amostras do
subtipo BoHV-5c com outros isolados de BoHV-1 e BoHV-5.
Como já mencionado, o BoHV-1 relaciona-se geneticamente com BoHV-5 em
85% (Delhon et al., 2003) e antigênicamente em 95% (Delhon et al., 2003). Estudos de
mapeamento do genoma de alguns isolados de BoHV-1 e BoHV- 5, utilizando a
restrição enzimática, mostraram ser este um dos melhores métodos para diferenciar
isolados. Entretanto, Nadin-Davis et al (1996) apontam que somente ensaios de
restrição enzimática não conseguem correlacionar os tipos genéticos virais e os sinais
clínicos apresentados pelos animais infectados.
A diferenciação entre isolados de BoHV-1 e BoHV-5 através de AcMs é descrita
por alguns autores (Meyer et al., 1999; Souza et al., 2002; Roehe et al., 2002; Oldoni et
al., 2004). Assim, estudos conduzidos com o objetivo de elucidar as diferenças
43
antigênicas entre os tipos de BoHV têm-se concentrado nas glicoproteínas virais que
apresentam as maiores diferenças (gB, gC e gD) (Chowdhury, 1995). Além disso, a
determinação das diferenças genômicas e antigênicas entre os herpesvírus bovino
favorecem uma análise comparativa dos novos isolados, inclusive no que concerne ao
desenvolvimento de testes sorológicos específicos (Costa et al., 2005 MG).
Análises comparativas entre as seqüências de diferentes alfaherpesvírus
revelaram que a gC é a glicoproteína que possui maior divergência entre o BoHV-1 e
BoHV-5 (Engles et al.,1987), além de ser a mais abundante presente no envelope viral.
Por isso a maioria dos AcMs produzidos com antígenos do BoHV-1 reagem contra a gC
(Friedli & Metzler, 1987; Shen et al., 1991; Collins et al., 1993; Oldoni et al., 2004). As
principais diferenças entre a gC do BoHV-1 e do BoHV-5 estão na região amino e
terminal (Collins et al., 1993; Chowdhury, 1995) Análises utilizando AcMs produzidos
contra epítopos da gC puderam diferenciar os subtipos de BoHV-1 (Rijsewijik et al.,
1999).
Outras glicoproteínas que apresentam uma certa divergência entre os isolados de
herpesvírus bovino são a gB e a gD. Essas glicoproteínas estão presentes em grande
quantidade no envelope de vírions e na membrana de células infectadas e são bastante
imunogênicas (Babiuk et al., 1987).Ros & Belak (2001) demonstraram que o gene da
gB do BoHV-5 codifica um produto de 947 aa, 15 aa a mais do que a gB do BoHV-1.
Abdelmagid et al (1995) determinaram também que a região carboxi terminal da gD do
BoHV-5 difere da seqüência do BoHV-1.
Winkelmann (2006), produziu e caracterizou AcMs com especificidades
protéicas que não a gC, o estudo revelou que esses AcMs foram possivelmente
construídos contra epítopos das glicoproteínas B e D. Esses AcMs são importantes para
o mapeamento de epítopos específicos capazes de diferenciar os tipos e subtipos de
BoHV.
Oldoni et al (2004) produziram onze AcMs a partir de antígenos de BoHV-5
dois deles não reagiram com isolados de BoHV-1 e outros três falharam em reconhecer
uma amostra apresentando o gene que codifica para a gC deletado, indicando que esse
AcMs reagem com epítopos que não o da gC. Assim a correta identificação antigênica
desses vírus depende de anticorpos estritamente específicos para cada um destes agentes
(D'Arce et al. 2002, Souza et al. 2002, Oldoni et al. 2004).
A produção de anticorpos monoclonais com reatividade específica por tipos e/ou
subtipos de BoHV permite também o desenvolvimento de testes para diagnóstico
44
sorológico diferencial do tipo ELISA (Spilki et al., 2005). AcMs com outras
especificidades protéicas podem ser úteis para diversos estudos da biologia e das
interações do vírus com o sistema imunológico, além de apresentarem aplicação
potencial em técnicas de diagnóstico (Meyer et al., 1999; Souza et al., 2002; Oldoni et
al., 2004). Porém estudos complementares como mapeamento de epítopos neutralizantes,
análises de Western Blot e a expressão de antígenos virais em vetores poderão auxiliar em
uma melhor
identificação e caracterização de polipeptídeos virais (Marshal et al., 1986;
Metzler et al., 1986), permitindo a diferenciação entre subtipos e tipos do BoHV
(Metzeler et al., 1986; Friedli & Metzler, 1987; Souza et al., 2002).
45
7. CONCLUSÃO
No presente estudo foram avaliados 45 amostras de herpesvírus bovino frente a
36 AcMs. Quatro amostras virais das 45 analisadas, sendo três BoHV-1 e uma BoHV-5
não reagiram com nenhum dos AcMs. As 41 amostras restantes reagiram com oito dos
36 AcMs. Oito das 41 amostras (sendo quatro amostras BoHV-1, três BoHV-5 e uma
amostra BoHV-1 mutante - SV 265/96 gE-), reagiram com todos os AcMs, mostrando
que não houve nenhuma correlação entre os tipos e subtipos de herpesvirus bovino
genomicamente determinados com as análises antigênicas dos AcMs testados. E um
anticorpo não reagiu apenas com amostras do subtipo BoHV-5c (ISO 94/232, ISO 95/97
e ISO 87/97) sugerindo que esse AcM possivelmente possa diferenciar esse subtipo dos
demais BoHV.
46
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61
9. ANEXOS
9.1. SOLUÇÕES PARA CULTIVO CELULAR
9.1.1. MEM (Meio Mínimo Essencial) (pH 7.2)
MEM (Gibco) 9,6 g
Tris hidroximetilamino metano 2,4% 50 mL
H
2
O destilada qsp 1000 mL
9.1.2. Tripsina Versene (pH 7.6)
Tripsina 0,5 g
NaCl 8 g
KCl 0,4 g
EDTA 0,2 g
Vermelho de fenol 1% 1,2 mL
H
2
O destilada qsp 1000 mL
9.2. SOLUÇÕES PARA IPX
9.2.1 Líquido de Lavagem
PBS 1X 995 mL
Tween 80 5 mL
9.2.2 Líquido de Diluição
NaCl 29,5 g
Na
2
HPO
4
. 2H
2
O 1,55 g
NaH
2
PO
4
. H
2
O 0,23 g
Tween 80 5 mL
H
2
O destilada qsp 1000 mL
9.2.3 Tampão Acetato (pH 5.0)
Ácido acético glacial 0,89 mL
Acetato de sódio 2,89 g
H
2
O destilada qsp 1000 mL
9.2.4 Solução Estoque Carbazole
Aminoetil carbazole 0,16 g
n’n’dimetilformamida 24 mL
9.2.5 Substrato
Solução estoque carbazole 0,3 mL
Tampão acetato 5 mL
10 V H
2
O
2
15 μL
62
9.2.6 PBS 10X (pH 7,4)
NaCl 85,0 g
Na
2
HPO
4
2H
2
O 19,43 g
NaH
2
PO
4
H
2
O 3,11 g
H
2
O qsp 1000 mL
9.3. TESTE DE IMUNOPEROXIDASE (IPX):
• Colocar 50 μL de 100 DICC
50
do vírus a ser testado e 50 μL de 3 x 10
4
de
células/orifício. Incubar a 37°C em estufa com ambiente de 5% de CO
2
e aguardar
até que o tapete celular apresente 20% de ECP.
• Retirar com cuidado, se possível utilizando a multicanal, o meio das placas de
cultivo celular.
• Lavar com PBS (3X).
• Colocar as placas em estufa seca para secar.
• Após completamente secas, congelar a -20°C as placas por pelo menos uma hora
(nessa etapa, podem-se armazenar as plaquinhas).
• Depois de congeladas, adicionar 100 acetona e refrigerar a 4°C por meia hora.
• Lavar 3X com PBS.
• Colocar 50 μL dos Acs a serem testados e incubar por uma hora a 37 em câmara
úmida.
• Lavar 3X com liquido de lavagem.
• Colocar 50 μL do conjugado na diluição indicada (Diluir com liquido de diluiçao) e
incubar por uma hora a 37°C em câmara úmida.
• Lavar 3X com líquido de lavagem.
• Para revelar, colocar 50 μL da solução: 5mL de tampão fosfato, 300 μL e carbazole
e 60 μL de água oxigenada.
• Aguardar o aparecimento do efeito (coloração carmim) a temperatura ambiente.
• A reação pode ser parada adicionando H
2
O destilada.
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