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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
ANA GABRIELA LEDO SANTOS DA SILVA
A INTERLEUCINA-4 BLOQUEIA A
PROLIFERAÇÃO DE PROGENITORES E
AUMENTA A DIFERENCIAÇÃO DE
FOTORRECEPTORES NA RETINA POR VIAS
DE SINALIZAÇÃO DISTINTAS
Rio de Janeiro
2008
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ANA GABRIELA LEDO SANTOS DA SILVA
A INTERLEUCINA-4 BLOQUEIA A
PROLIFERAÇÃO DE PROGENITORES E
AUMENTA A DIFERENCIAÇÃO DE
FOTORRECEPTORES NA RETINA POR VIAS
DE SINALIZAÇÃO DISTINTAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica), Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas
(Biofísica).
Orientador: Alfred Sholl Franco
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2008
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Neurogênese, Programa de
Neurobiologia, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF), Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), sob orientação do professor Alfred Sholl Franco,
na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado
do Rio de Janeiro (FAPERJ), e pelo Programa de Apoio a Núcleos de Excelência
(PRONEX).
ii
Silva, Ana Gabriela Ledo Santos da
A Interleucina-4 bloqueia a proliferação de progenitores e aumenta a
diferenciação de fotorreceptores na retina por vias de sinalização
distintas / Ana Gabriela Ledo Santos da Silva. – Rio de Janeiro: UFRJ /
IBCCF, 2007.
XVII, 192f.: 28 il.; 29,7 cm.
Orientador: Alfred Sholl-Franco.
Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2008.
Referências bibliográficas: f. 114-134.
1. Neuroimunologia 2.Citocinas 3. Interleucina-4 4. Retina 5.
Desenvolvimento 6. IL-4Rα I. Sholl-Franco, Alfred. II. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas, Biofísica. IV. Título.
FOLHA DE APROVAÇÃO
“A Interleucina-4 bloqueia a proliferação de progenitores e
aumenta a diferenciação de fotorreceptores na retina por
vias de sinalização distintas”
ANA GABRIELA LEDO SANTOS DA SILVA
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Rio de Janeiro, 12 de fevereiro de 2008.
_____________________________________________
DRA. PATRÍCIA FRANCA GARDINO
_____________________________________________
DRA. ANA LÚCIA MARQUES VENTURA
_____________________________________________
DR. PEDRO MUANIS PERSECHINI
_____________________________________________
DR. ALFRED SHOLL FRANCO
(ORIENTADOR)
_____________________________________________
DRA. MARIANA SOUZA DA SILVEIRA
(REVISORA)
iii
Dedico este trabalho a minha amada mãe Cida, a
minha linda avó Zélia e ao meu querido orientador Alfred.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter muita saúde e poder estar aqui agora muito feliz
agradecendo isso tudo a vocês! Deus, muito obrigada por nos amparar nos
momentos difíceis, nos dar força interior para superar as dificuldades, mostrar-nos o
caminho certo nas horas incertas e nos suprir em todas as necessidades. Que Deus
nos abençoe sempre!!!
À minha linda, querida e amada Mamãe Cida, por sempre me ensinar o que é
o amor incondicional. Minha melhor amiga que eu amo e me orgulho demais,
obrigada por ter me dado a vida, porque a minha vida é maravilhosa!Te amo muito!
Agradeço pelo seu eterno incentivo, ajuda, amor, carinho, e principalmente por ter
rezado muito por mim. Nunca esquecerei das frases cativantes: “boa sorte,
excelente prova” e “boa sorte, excelente apresentação”. Mamy: “todo amor que
houver nessa vida”.
Ao meu querido “Papai Oscar”, por todo o amor e carinho.Pai, te amo muito!!!
À minha linda, querida e amada Vovó Zélia, te amo muito! Seu amor foi muito
importante durante esse tempo... ASNF...a son never forgets...
Ao meu vovô Antonio Ledo, de 95 anos, que ainda está vivo para ver isso!!!Te
amo lindoh!
À minha linda, querida e amada tia Sylvia, tb te amo muito! Ao mestre com
carinho...minha tia-avó super poderosa!!!
Ao meu tio Edu que sempre me incentivou a estudar, principalmente inglês, e
inclusive já foi um grande “paitrocinador” de cursos rss...
À toda a minha família, a qual amo muito. Dinda Fátima e Tio Sam, Tio
Armando, por ajudar a carregar os muitos livros e artigos quando eu saía de casa
com a “casa” nas costas, prima Bruna, pelo seu computador que usei várias vezes,
Tia Tereza. Agradeço a todos pelo incentivo, amor e carinho.
Ao Curso de Pós-Graduação do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
(IBCCF) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela excelência de trabalho
organizacional e operacional.
Às instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ), e Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX).pelo suporte
financeiro.
v
Ao Prof. Dr. Alfred Sholl Franco, meu querido Orientador, com muito carinho,
agradeço pela bela amizade, pela excelente orientação. Agradeço pela constante
presença em todos os meus seminários e reuniões de dados. Agradeço por ter me
proporcionado esta maravilhosa vivência acadêmica (seminários, cursos, disciplinas,
congressos, simpósios) a qual vem me acrescentando muito, tanto em âmbito
profissional quanto pessoal. Agradeço pela maravilhosa companhia em todos os
Congressos, os quais tive a oportunidade de participar. Querido Alf, você é o meu
Príncipe Encantado da Ciência. Obrigada de todo o coração por tudo!
Ao Prof. Dr. Rafael Linden, por ter aberto as portas do Laboratório de
Neurogênese para mim.
A Prof
a
. Dr
a
Mariana Silveira por ter sido a revisora desta tese.
A Prof
a
. Dr
a
Paula Campello pela sua colaboração, e também por todos os
momentos simpáticos os quais pudemos vivenciar juntas nos Congressos, os quais
tive a oportunidade de participar. Aproveito para agradecer a enorme simpatia de
todos os membros da UFF, que tive o prazer de conhecer em Congressos,
Palestras, Cursos, etc.
A Fernanda Chagas, Fernandinha, pela amizade e carinho, por torcer e
acreditar em mim, pelos diversos experimentos que fizemos juntas e pelos
momentos alegres e divertidos no Congresso da Fesbe/2006. A “Lammy” Arciolanda
Macamma, por ter torcido e acreditado muito em mim, por ter sido uma incentivadora
incansável, pelo seu carinho e amizade e também pela sua companhia maravilhosa
na Fesbe/2005 e em outros Cursos que fizemos juntas.
A todos os Membros do Laboratório de Neurogênese agradeço muitíssimo
pelas inúmeras ajudas que recebi na bancada (preparo de soluções e
experimentos), cortes no criostato, perfusões, microscópio, e especialmente pelas
inúmeras perguntas respondidas sobre os pontos do THE CELL.
A todos os Membros do Laboratório de Fisiologia da Respiração os quais
fizeram parte das etapas finais desta tese (a formatação e as intermináveis
referências) e com isso me brindaram com uma dose extra de entusiasmo.
Aos meus amigos da Pós-Graduação.
vi
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho
original.”
Albert Einstein
vii
RESUMO
A Interleucina-4 (IL-4) é uma citocina anti-inflamatória que tem sido relacionada com
a diferenciação da retina de roedores in vitro. Entretanto, a presença constitutiva da
IL-4 ou do seu receptor ainda não foi relatada neste tecido. Neste trabalho nós
examinamos a expressão da IL-4 e da subunidade α do seu receptor (IL - 4Rα).
Verificamos que a IL-4Rα é expressa por células neurais retinianas e por tecidos
não-neurais oculares, enquanto a expressão da molécula de IL-4 é mais restrita ao
tecido não-neural. Nós caracterizamos um novo papel trófico para a IL-4 na retina,
onde esta molécula inibe a proliferação de células retinianas (~40%) através da
ativação da via AMPc-PKA. Além disso, este efeito está relacionado a uma redução
na expressão de ciclina D1 e a um aumento na expressão de p27
kip1
. A IL-4 também
promove a diferenciação de bastonetes. Este efeito foi dependente da ativação de
tirosinas cinases, da proteína cinase C, da proteína cinase ativada por mitógenos da
família da Erk e independente da liberação de outros fatores tróficos na cultura.
Juntos, os resultados mostram, pela primeira vez, que a IL-4 modula diretamente a
proliferação de células retinianas e a diferenciação de bastonetes, através de vias de
sinalização distintas.
viii
ABSTRACT
Interleukin-4 (IL-4), an anti-inflammatory cytokine, has been related to the
differentiation of the rodent retina in vitro, but constitutive presence of either IL-4 or of
IL-4 receptor in the retina has not been reported. In this work we examined the
expression of IL-4 and its specific receptor α subunit (IL-4Rα). IL-4Rα is expressed
both in neural retina and non-neural ocular tissue, while IL-4 is found mainly in non-
neural tissue. We characterized a novel trophic effect of IL-4 upon the retina. We
showed that IL-4 can inhibit the proliferation of retinal cells (~40%) through the
cAMP-PKA pathway and associated with a reduction of cyclin D1 and increase of
p27
kip1
. IL-4 also promotes the differentiation of rod photoreceptors. Activation of
tyrosine kinases, protein kinase C, and mitogen activated kinases of the Erk family
were required for IL-4-induced rod photoreceptor differentiation, independent of the
release of other trophic factors in culture. Taken together, our results show, for the
first time, that IL-4 directly modulates proliferation of retinal cells and rod
photoreceptor differentiation, through distinct signaling pathways.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPc adenosina monofosfato cíclica
BCGF-1 fator-1 de crescimento de células B
BDNF fator neurotrófico derivado do cérebro
BFA brefeldina
BSA albumina de soro bovino
BSF-1 fator estimulante de células B
CDK cinases dependentes de ciclinas
ChCl cloreto de queleritrina
CKI ciclinas inibidoras de cinases
CNTF fator neurotrófico ciliar
CRE elemento responsivo ao AMPc
CREB elemento de ligação responsivo ao AMPc
DAB tetrahidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina
DAG diacilglecerol
DHA ácido docosahexanóico
DIV dia in vitro
DMEM meio de Eagle modificado por Dulbecco
FCS soro fetal bovino
FGFb fator de crescimento de fibroblasto básico
GCL camada de células ganglionares
GDNF fator neurotrófico derivado da glia
GMPc guanina monofosfato cíclica
GTP trifosfato de guanosina
IAP proteína inibidora de apoptose
IL interleucina (e.g. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 dentre outras)
IL-13Rα
1
subunidade α
1
do receptor de IL-13
IL-2Rγ subunidade γ do receptor de IL-2
IL-4Rα subunidade α do receptor de IL-4
ILM membrana limitante interna
INL camada nuclear interna
iNOS óxido nítrico sintase do tipo induzida
IP
3
inositol-trifosfato
IPL camada plexiforme interna
JAK janus cinase (e.g. JAK1, JAK2, dentre outras)
LIF fator inibidor de leucemia
MAPK cinase ativada por mitógeno
NBL camada neuroblástica
NGF fator de crescimento de nervo
NMDA N-metil-D-aspartato
NT neurotrofina (e.g. NT-3, NT-4/5, NT-6 e NT-7)
OL camada de fibras do nervo óptico
OLM membrana limitante externa
ONL camada nuclear externa
OPL camada plexiforme externa
OS segmentos externos de fotoreceptores
P1 dia pós-natal 1
PBS salina tamponada com fosfato
x
PDGF fator de crescimento derivado de plaquetas
PI3K fosfoinositol 3 cinase
PIP
2
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
PKA proteína cinase dependente de AMPc
PKC proteína cinase dependente de cálcio
PLC fosfolipase C
p-L-l poli-L-lisina
PM peso molecular
pRB proteína supressora de tumor de retinoblastoma
pRGCs subgrupo de células ganglionares da retina fotossensíveis à luz
RGC células ganglionares da retina
RPC células progenitoras retinianas
RPE epitélio pigmentado da retina
RS retículo sarcoplasmático
SEM erro padrão da média
SN sistema nervoso
SNC sistema nervoso central
SNP sistema nervoso periférico
STAT proteína de transdução de sinal e ativador transcricional (e.g. STAT6)
TGF-β fator de crescimento tumoral β
TNF-α fator de necrose tumoral-α
VN vermelho neutro
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Corte esquemático do globo ocular .......................................... 19
Figura 2 Esquema da passagem de luz pelo globo ocular e a estrutura
da retina .................................................................................... 23
Figura 3 Retinogênese em camundongo, galinha, rato, coelho e
humanos ................................................................................... 26
Figura 4 Esquema mostrando o desenvolvimento do tecido retiniano
de roedores ...............................................................................
29
Figura 5 Esquema representando as fases do ciclo celular.................... 31
Figura 6 Esquema mostrando as principais famílias de proteínas que
regulam a progressão do ciclo celular durante as fases G1/S.. 35
Figura 7 Morfologia dos fotorreceptores (cones e bastonetes)............... 38
Figura 8 Superfamília de receptores para citocinas ............................... 46
Figura 9 Representação espacial da estrutura molecular da
Interleucina-4 ............................................................................ 50
Figura 10 Os receptores tipo I e tipo II para IL-4 ...................................... 54
Figura 11 Ativação do receptor para IL-4 leva a ativação de vias de
sobrevida, proliferação e diferenciação celular ........................ 55
Figura 12 IL-4 é expressa na retina e no tecido ocular adjacente não
neural ........................................................................................ 74
Figura 13
IL-4Rα é abundantemente expressa na retina e no tecido
ocular adjacente não neural .....................................................
75
Figura 14
Imunolocalização de IL-4Rα em diferentes estágios do
desenvolvimento retiniano pós-natal ........................................
77
Figura 15 A IL-4 reduz a proliferação de células da retina através da
atividade da PKA ..................................................................... 79
Figura 16 IL-4 aumenta os níveis intracelulares de AMPc ....................... 81
Figura 17 IL-4 reduz a proliferação de precursores retinianos através da
modulação da expressão de ciclina D1 e de p27
kip1
................. 83
Figura 18 A IL-4 não altera a incorporação de [
3
H]-timidina nas
primeiras 4 e 8 horas in vitro .................................................... 84
Figura 19 IL-4 aumenta o número de células Rho 4D2+ positivas ........... 86
Figura 20 IL-4 aumenta o número de células positivas para Rho 4D2
+
em culturas de monocamada e aumenta a expressão de
rodopsina .................................................................................. 87
Figura 21 A IL-4, mas não a IL-2 e nem a IL-8, aumenta o número de
células positivas para Rho 4D2
+
de maneira dose e tempo
dependente .............................................................................. 88
Figura 22 O efeito específico de IL-4 na diferenciação de
fotorreceptores ....................................................................... 90
Figura 23 A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é
independente do seu efeito anti-proliferativo ............................ 92
Figura 24 A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é
dependente da atividade das proteínas tirosina cinase ............ 95
Figura 25 A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é
dependente da atividade de Erk e de PKC ............................... 96
xii
Figura 26 A fosforilação de Erk induzida pela IL-4 é dependente da
atividade de PKC .................................................................... 98
Figura 27 Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove seu efeito
anti-proliferativo em células da retina de camundongos P0...... 106
Figura 28 Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove a
diferenciação de bastonetes em células da retina de
camundongos P0....................................................................... 111
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 O efeito da IL–4 na diferenciação de bastonetes é
independente da liberação de outros fatores de crescimento na
cultura .......................................................................................... 90
Tabela 2 O efeito da IL–4 na diferenciação de fotorreceptores é
independente da ativação das vias de JAK, Src, p38 e JNK....... 94
xiv
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .......................................................................................... 17
VISÃO ............................................................................................ 17
1.1.1 Anatomia do olho .............................................................. 17
1.1.2 A retina como modelo experimental ................................. 24
1.1.3 Estrutura e desenvolvimento da retina ............................. 24
1.1.4 Ciclo celular e proliferação na retina ................................ 29
Células fotorreceptoras: cones e bastonetes ................... 35
1.1
1.1.5
1.1.5.1 Diferenciação de fotorreceptores (bastonetes) 38
CITOCINAS E O SISTEMA NERVOSO ........................................ 42
1.2.1 Interleucinas: sinalizadores no sistema nervoso?......…… 47
1.2.1.1 A Interleucina-4 (IL-4) ....................................... 48
1.2.1.2 IL-4R e vias de transdução ............................... 53
1.2
1.2.1.3 A Interleucina-4 e o sistema visual ................... 56
2
OBJETIVOS ............................................................................................... 58
3
MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 59
3.1 MATERIAIS .................................................................................... 59
TRATAMENTO EXPERIMENTAL .................................................. 60
3.2.1 Cultura de monocamada .................................................. 60
3.2.2 Cultura de explantes da retina .......................................... 61
3.2
3.2.3 Cultura de células do baço ............................................... 62
3.3 WESTERN BLOTS ........................................................................ 63
PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS ........................................... 65
3.4.1 Criopreservação e realização dos cortes dos explantes e
retina ................................................................................. 65
3.4.2 Imunohistoquímica ............................................................ 66
3.4
3.4.3 Coloração com vermelho neutro …………………………. 68
3.5 INCORPORAÇÃO DE [H
3
]-TIMIDINA ………………………………. 68
3.6 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS INTRACELULARES DE AMPc . 69
3.7 ANALISE E QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS Rho 4D2
+
.............. 71
3.8 APRESENTAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISES ESTATÍSTICAS .. 71
4
RESULTADOS ........................................................................................... 72
4.1
LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR
DE IL-4 NO TECIDO RETINIANO .................................................
72
IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITO-
RAS EM RETINAS P0 ................................................................... 78
4.2.1 IL-4 aumenta os níveis intracelulares de AMPc em
retinas P0 .......................................................................... 80
4.2
4.2.2 IL-4 regula a expressão de Ciclina D1 e de p27
kip1
em
retinas P0 .......................................................................... 82
4.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES EM RETINA P0 .. 84
4.3.1 IL-4 aumenta a expressão e o número de células
contendo rodopsina........................................................... 84
4.3.2 O efeito da IL-4 na diferenciação de bastonetes é
específico .......................................................................... 89
4.3.3 A diferenciação de bastonetes induzida por IL-4 é
independente do seu efeito anti-proliferativo..................... 91
4.3.4 A atividade das proteínas tirosinas cinases, a
fosforilação de Erk, e a atividade de PKC estão
relacionadas com a diferenciação de bastonetes
induzida pela IL-4.............................................................. 93
5
DISCUSSÃO .............................................................................................. 99
5.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO
RECEPTOR DE IL-4 NO TECIDO RETINIANO........................ 100
5 2 IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS
PROGENITORAS...................................................................... 103
5.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES........................ 107
6
CONCLUSÕES .......................................................................................... 113
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 114
8 ANEXO I
MANUSCRITO JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY .. 135
1 INTRODUÇÃO
1.1 VISÃO
1.1.1 ANATOMIA DO OLHO
Os globos oculares (Figura 1) estão alojados em cavidades denominadas
órbitas, formadas por um conjunto de ossos (frontal, maxilar, zigomático, esfenóide,
etmóide, lacrimal e palatino), onde se encontram associadas estruturas tais como
pálpebras, supercílios (sobrancelhas), conjuntiva, músculos oculares e aparelho
lacrimal. Cada globo ocular compõe-se de três túnicas (uma mais externa ou fibrosa,
uma média ou vascular/muscular e uma mais interna ou sensorial) e de quatro meios
transparentes (Presland, 2007, para revisão).
O olho, estrutura altamente especializada, além de detectar, localizar e
processar inicialmente a informação luminosa proveniente do ambiente, apresenta
uma organização destinada a otimizar o foco da imagem visual para a retina, com
a mínima distorção óptica (Cepko, 2000). Na parte anterior do olho encontramos a
córnea, uma camada curva e transparente que funciona como lente, sendo
responsável por dois terços da capacidade de focalização que o olho humano
possui. A superfície da córnea encontra-se em continuidade com a da esclera, que
circunda todo o globo ocular, sendo comumente conhecida como o “branco dos
olhos”. Internamente e adjacente à esclera e em continuidade à íris temos a
coróide, que une a esclera ao tecido epitelial pigmentado e à retina neural. Dado
que a córnea não possui vasos sanguíneos, esta é nutrida em sua superfície
externa, pelo filme aquoso proveniente do fluido lacrimal (lágrima), que é
continuamente reposto pelo piscar das pálpebras, e posteriormente pelo humor
aquoso, um líquido cristalino, que preenche a câmara anterior do olho, entre a
córnea e o cristalino banhando-os. Este fluido é composto de água, aminoácidos,
ácido ascórbico e glicose. A quantidade de humor aquoso é um fator determinante
para a pressão intra-ocular, que em humanos em condições normais é menor que
22 mmHg (22 torr). Um problema de drenagem do humor aquoso, realizado pelo
canal de Schlemm, pode levar à cegueira, pois com o aumento da pressão intra-
ocular a irrigação da retina é dificultada, o que provoca a lesão do nervo óptico
(Patil e Dowd, 2000; Smerdon, 2000; Presland, 2007).
Posteriormente à câmara anterior, sendo banhada pelo humor aquoso,
encontramos a íris, que possui pigmentação diferenciada e proporciona a grande
variedade de cores dos olhos. A íris funciona como um diafragma, regulando a
quantidade de luz que penetra no olho. A abertura por onde passa a luz chama-se
pupila. A pupila e a íris são recobertas em sua superfície externa pela córnea, a
primeira lente onde incidem os raios luminosos. Em ambientes mal iluminados, por
ação do sistema nervoso simpático, o diâmetro da pupila aumenta e permite a
entrada de maior quantidade de luz. Em locais muito claros, a ação do sistema
nervoso parassimpático acarreta diminuição do diâmetro da pupila e da entrada de
luz. Esse mecanismo evita o ofuscamento e impede que a luz em excesso lese os
fotorreceptores. O diâmetro da pupila pode variar de 1,5mm a 8,0mm, em humanos,
sendo que são necessários cerca de 5 segundos para a pupila se contrair (miose) ao
máximo e 300 segundos para se dilatar (midríase) ao máximo (Patil e Dowd, 2000;
Presland, 2007).
Vasos Sangüneos
da Retina
Figura 1 – Corte esquemático do globo ocular. 1, Camada externa ou fibrosa,
composta pelos músculos extra-oculares, córnea e esclera; 2. Camada média ou
vascular/muscular, composta pelo humor vítreo, cristalino, íris, pupila, câmara
anterior e posterior, corpo ciliar, coróide, disco óptico, mácula e vasos sanguíneos da
retina e nervo óptico 3. Camada interna ou sensorial que contém a retina.
(Modificado de Presland, 2007).
Em seguida, encontramos o cristalino, estrutura gelatinosa, porém
consistente, que funciona como uma lente biconvexa responsável por praticamente
um terço do poder de focalização da luz na retina. O cristalino é uma lente com raio
de curvatura variável, graças aos músculos ciliares que estão situados no corpo
ciliar. Esse processo de mudar a curvatura do cristalino gerando um poder de
focalização adicional chama-se acomodação. Após a luz ter passado pelo cristalino
1
2
3
Músculos extra-oculares
Humor Vítreo
Cristalino
Íris
Pupila
Córnea
Esclera
Coróide
Retina
Nervo Óptico
Câmara anterior
Corpo Ciliar
Câmara Posterior
Disco Óptico
Mácula
Vasos Sangüneos da Retina
ela encontra a câmara posterior, que é preenchida pelo humor vítreo, substância
transparente, porém mais viscosa do que o humor aquoso e responsável pela
manutenção de uma pressão interna essencial para que o globo ocular permaneça
esférico. Como o índice de refração do humor vítreo é pouco distinto do cristalino, a
luz desvia muito pouco sua trajetória. A câmara posterior do olho, em sua face
posterior entra em contato direto com a retina propriamente dita (Patil e Dowd, 2000;
Presland, 2007).
A retina é uma fina camada de tecido neural que contém uma intrincada rede
de diversos tipos neuronais (Masland, 2001), com espessura de aproximadamente
0,5 mm em humanos e localizadas a frente do epitélio pigmentado (PE), envolve
quase toda a superfície interna do olho (Figura 2) (Presland, 2007). É na retina que
ocorre a conversão da imagem luminosa em impulsos elétricos, os quais são
enviados pelo nervo óptico (NO) as outras áreas centrais encefálicas. A retina é
muito sensível, chegando ao limite de detecção de um único fóton em algumas
regiões (Presland, 2007). De acordo com a figura 2, após a conversão do sinal
luminoso em sinal elétrico pelos dois tipos de fotorreceptores presentes na retina,
cones e bastonetes, cujos corpos celulares se encontram na camada nuclear
externa (ONL), a informação visual é transmitida através da camada plexiforme
externa (OPL) aos interneurônios presentes na camada nuclear interna (INL). Essa
transmissão, feita pelos fotorreceptores, é modulada por células horizontais que, por
sua vez, também se contactam com as células bipolares. Na retina interna, as
células bipolares fazem conexões, na camada plexiforme interna (IPL), com as
células amácrinas e as células ganglionares, estas últimas presentes na camada de
células ganglionares (GCL). As células amácrinas não só modulam os sinais vindos
das células bipolares através de uma inibição direta nas células ganglionares, como
também modulam a liberação da transmissão vinda das células bipolares (Cepko,
2000).
A informação gerada pela luz deixa a retina via os axônios das células
ganglionares, os quais coletivamente formam o nervo óptico. Estas células são os
neurônios de projeção da retina, responsáveis por gerar potenciais de ação e por
propagá-los ao longo do nervo óptico, até os centros visuais superiores (Cepko,
2000). Vale citar que um subgrupo de células ganglionares da retina fotossensíveis à
luz foi recentemente identificado e caracterizado por formar uma via paralela e
independente da atividade dos fotorreceptores clássicos (pRGCs; Berson et al.,
2002; Hattar et al., 2002), cuja função principal é a de modular várias respostas
comportamentais e fisiológicas em relação à presença ou ausência de luz (Hattar et
al., 2002). Inclusive, estudos recentes sobre a expressão de pigmentos
fotossensíveis mostraram evidências de que a melanopsina é realmente o
fotopigmento das pRGCs, embora o seu mecanismo de transdução da informação
luminosa ainda permanece como uma questão em aberto (Peirson e Foster, 2006).
As células do epitélio pigmentado da retina (RPE) possuem um pigmento
preto, a melanina, que absorve a luz não capturada que passa pela retina. Este
mecanismo previne a degradação da imagem visual, impedindo que a luz seja
refletida da parte posterior do olho de volta para a retina neural (Fain et al., 1996).
Todas as outras células da retina estão na frente dos fotorreceptores, próximas ao
cristalino, o que implica que a luz precisa atravessar toda a retina antes que atinja os
fotorreceptores. De fato, os processos celulares localizados nas camadas proximais
da retina são amielínicos, permitindo, desta forma, que estas camadas sejam
relativamente transparentes (Cepko, 2000)
Vale salientar ainda que na região próxima ao local de emergência do NO
encontramos a mácula (Figura 1) e no centro desta uma depressão chamada fóvea
(Figura 2), onde os corpos celulares neuronais encontram-se estrategicamente
deslocados para o lado, com o propósito de que os fotorreceptores desta região
recebam a imagem visual em sua forma menos distorcida. Assim, as imagens
formadas na fóvea têm grande acuidade, o que permite boa nitidez, principalmente
em sua porção mais central (fovéola), região que apresenta um deslocamento ainda
mais acentuado. Opostamente, no local onde emerge o NO é gerada uma região
chamada de disco óptico ou ponto cego. Esta região é desprovida de qualquer tipo
de fotoreceptores. Desta forma, uma imagem projetada nesta região não pode ser
detectada e sua percepção depende exclusivamente do processamento central da
informação (Cepko, 2000; Presland, 2007).
Figura 2 – Esquema da passagem de luz pelo globo ocular e a estrutura da
retina. Fotorreceptores: cones (C) e bastonetes (R), células bipolares (B), células
ganglionares (G), células amácrinas (A), células horizontais (H), células ganglionares
fotossensíveis a luz (pRGCs), camada plexiforme externa (ONL), camada plexiforme
interna (INL) (Modificado de Cepko, 2000; Foster e Hankins, 2007).
Retina
Fóvea
Nervo Óptico
Luz
Nervo Óptico
Luz
Retina
Interna
Retina
Externa
Epitélio
Pigmentado
1.1.2 A RETINA COMO MODELO EXPERIMENTAL
O desenvolvimento do sistema nervoso (SN) vem sendo amplamente estudado
através de abordagens multidisciplinares, o que tem gerado uma grande diversidade
de modelos experimentais, dentre os quais destacamos o tecido retiniano.
A retina é um tecido extremamente delgado e translúcido com a mesma origem
do sistema nervoso central (SNC), o ectoderma neural embrionário, mas que possui
uma localização periférica privilegiada, a qual permite sua fácil obtenção livre do tecido
conjuntivo adjacente e de outras populações neuronais e gliais (Dowling, 1991). Estas
características, aliadas a uma organização histotípica em camadas sinápticas e
nucleares, muito semelhante ao observado em outras estruturas do SN, tornam a
retina um excelente modelo experimental para os estudos de sobrevida, proliferação e
degeneração neuronal uma vez que as populações neuronais e gliais da retina podem
ser identificadas e acompanhadas desde os estágios mais precoces do desenvolvi-
mento até a sua perda natural ou patológica in vitro e in vivo (Adler, 1993; Cepko et al.,
1996).
1.1.3 ESTRUTURA E DESENVOLVIMENTO DA RETINA
A correta formação e funcionalidade da retina dependem de uma precisa
coordenação temporal dos múltiplos processos que ocorrem durante o seu
desenvolvimento (Martins e Pearson, 2007, para revisão). Dentre estes processos,
destacam-se a proliferação de precursores, a gênese dos diferentes tipos celulares
retinianos, sinaptogênese e morte celular programada, de forma a se obter a
citoarquitetura funcional clássica de uma retina madura (Liversey e Cepko, 2001;
Klassen et al., 2004).
A retina, como muitas outras estruturas do SNC, contém grande diversidade
de tipos neuronais (Masland, 2001), que se comunicam por meio de conexões
sinápticas com um arranjo anatômico ordenado em camadas.
Durante a retinogênese, os seis tipos de células neuronais, os fotorreceptores
(cones e bastonetes), células amácrinas, células horizontais, células bipolares e
células ganglionares e o tipo de célula glial predominante em roedores (a glia de
Müller) são gerados em uma ordem temporal, a qual é geralmente conservada entre
as espécies (Carter-Dawson e LaVail, 1979; Young, 1985; Stiemke e Hollyfield,
1995; Belecky-Adams et al., 1996; Cepko et al., 1996; Hu e Easter, 1999; Martins e
Pearson, 2007). Vale citar que astrócitos e células microgliais também podem estar
presentes na retina (Fischer e Reh, 2003).
Como pode ser visto na figura 3, em diferentes espécies, sempre as primeiras
células a serem geradas na retina de vertebrados são as células ganglionares, entre
o 14º e o 20º dia embrionário (Reese e Colello, 1992; Marquardt e Gruss, 2002). Em
seguida, temos a gênese das células horizontais, cones e células amácrinas. As
últimas células a deixarem o ciclo celular são os precursores dos bastonetes, das
células bipolares e das células de Müller (Holt et al., 1988; Wetts e Fraser, 1989;
Prada et al., 1991; Hu e Easter, 1999; Das et al., 2003).
A retinogênese possui duas características importantes: (1) os diferentes tipos
de células presentes na retina são derivados de progenitores multipotentes comuns,
as células progenitoras retinianas (RPC), as quais retêm a habilidade de gerar
diferentes tipos de células mesmo durante a retinogênese tardia; (2) embora haja
uma ordem conservada para a gênese dos diferentes tipos celulares presentes na
retina, muitos estudos sobre as “datas de nascimento” dessas células revelaram que
existe uma extensa sobreposição durante os períodos nos quais cada tipo celular é
produzido (Young, 1985; Turner e Cepko, 1987; Holt et al., 1988; Turner et al., 1990;
Jensen e Raff, 1997). Estas e outras descobertas (Austin et al., 1995; Belliveau e
Cepko,1999) deram origem ao atual modelo de retinogênese no qual as decisões do
destino celular são governadas por um coordenado conjunto de fatores intrínsecos e
extrínsecos que atuam de uma maneira dependente do estágio de desenvolvimento
no qual a célula se encontra. (Cepko, 1999; Livesey e Cepko, 2001; Marquardt e
Gruss, 2002).
Em camundongos neonatos (P0-P1; figura 4) a retina é composta por dois
extratos celulares, a GCL e a camada neuroblástica (NBL) separadas pelos
primórdios da IPL. As células ganglionares estão entre os primeiros tipos celulares a
Figura 3 – Retinogênese em camundongo, galinha, rato, coelho e humanos.
E, embrionário; P, pós-natal; wk, semanas (Modificado de Martins e Pearson,
2007).
Células
Ganglionares
Fotorreceptor
Cone
Célula
Horizontall
Fotorreceptor
Bastonete
Célula
Bipolar
Célula
Amácrina
Glia
de Müller
Galinha
Camundongo
Humano
Coelho
Rato
E9
emergirem da NBL em direção a membrana limitante interna (ILM), uma membrana
glial, formada por projeções membranosas, que separa a retina neural do humor
vítreo (Maslim e Stone, 1986; Zimmerman et al., 1988). Com o término desta
migração, estas células começam a estender dendritos horizontais, iniciando a
formação da IPL (Maslim e Stone, 1986). As células amácrinas deslocadas, geradas
no período pré-natal, atingem a GCL entre o primeiro e o quinto dia pós-natal (Perry
et al., 1983; Sengelaub et al., 1986; Reese e Colello, 1992) e constituem 40-50% da
população de células da GCL em roedores adultos (Perry et al., 1983). A NBL é
composta principalmente por células indiferenciadas e em proliferação (Chiarini et
al., 2003).
A divisão celular continua dentro da NBL até pelo menos o final da primeira
semana pós-natal (Alexiades e Cepko, 1996). Entre o 4º e o 5º dia após o
nascimento (P4-P5), a OPL aparece devido ao progresso da diferenciação de
células horizontais (Craft et al., 1982), A região de início da formação da OPL
coincide com a região de término da atividade mitótica na retina central (Rapaport e
Stone, 1984; Robison et al., 1985).
A INL contém os núcleos das células bipolares, amácrinas, interplexiformes,
horizontais e ganglionares deslocadas. Células bipolares e bastonetes terminam o
ciclo celular neste período pós-natal (Araki et al., 1988) e são os últimos neurônios
adicionados ao circuito sináptico (Maslim e Stone, 1986).
Assim, a partir da primeira semana pós-natal, as células amácrinas estão
dispostas entre a GCL e a NBL, sendo esta última camada formada por células pós-
mitóticas e células ainda proliferantes. As células horizontais, já em pleno processo
de diferenciação, estão uniformemente localizadas na porção intermediária na NBL
(Linden et al., 1999). Nesta fase, a NBL está restrita à porção intermediária da retina
e na porção mais externa estão presentes os fotorreceptores, fazendo com que a
retina assuma, em roedores, um aspecto morfológico intermediário entre a retina
neonatal e a retina adulta (Figura 4). Ao longo da segunda semana pós-natal, os
demais tipos celulares se diferenciam e formam o circuito de conexões nas camadas
plexiformes (OPL e IPL) antes da abertura dos olhos, que em ratos ocorre
aproximadamente no final da segunda semana pós-natal (14º dia pós-natal) e que
caracteriza o início da chegada de estímulos visuais aos fotorreceptores.
Em camundongos adultos, a camada de fibras do nervo óptico (OL) ocupa a
posição mais ao centro do globo ocular, seguida pela GCL, onde se encontram os
somas de células amácrinas deslocadas e células ganglionares, enquanto a camada
de células epiteliais pigmentadas, RPE, ocupa a porção mais externa, adjacente à
coróide e à esclera. Mais externamente à ONL podemos observar uma camada
formada apenas pelos segmentos externos (OS) dos fotorreceptores. A INL contém
os núcleos das células amácrinas, bipolares, horizontais, sendo esta camada
separada da ONL pela OPL, a qual aparece 4 a 5 dias após o nascimento, em ratos
(Linden et al., 1999). O soma das células de Müller está localizado na INL e seus
prolongamentos se estendem por todas as camadas da retina, desde a OL até a OS
(Newman e Reichenbach, 1996; Figura 4).
A retina, portanto, apresenta uma estrutura com camadas diferenciadas, em
que os diversos tipos neuronais e gliais, assim como as regiões de contatos
sinápticos são bem definidas. Além disso, as diferentes classes celulares
apresentam marcadores bioquímicos que permitem a localização específica dos
tipos e subtipos celulares presentes em uma mesma camada.
1.1.4 CICLO CELULAR E PROLIFERAÇÃO NA RETINA
Dado que todas as células progenitoras retinianas são multipotentes e podem
gerar diferentes tipos celulares retinianos, numa ordem de nascimento característica,
podemos dizer que tanto a proliferação quanto a saída do ciclo celular devem ser
precisamente regulados durante o desenvolvimento. Desta forma, as células
NBL
Padrão em P0-P1 Padrão em P6-P7 Padrão em Adultos
RPE
IPL
GCL
ILM
OL
OLM
RPE
OS
ONL
INL
IPL
GCL
ILM
OL
OPL
OLM
Figura 4 – Esquema mostrando o desenvolvimento do tecido retiniano de
roedores. A ilustração é dividida conforme três padrões distintos do
desenvolvimento: no recém-nascido (P0-P1); na primeira semana pós-natal (P6-P7);
no adulto. Pode-se observar o crescimento retiniano a partir da progressão na
organização celular retiniana em camadas nucleares e de plexos. RPE, epitélio
pigmentar da retina; OLM, camada limitante externa; NBL, camada neuroblástica;
IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares; ILM, camada
limitante interna; OL, camada do nervo óptico; OS, segmentos externos dos
fotorreceptores; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear interna.
NBL
progenitoras precisam regular estas duas forças opostas: enquanto muitos
progenitores retinianos precisam sair do ciclo celular para que assim produzam os
tipos celulares que possuem um nascimento mais precoce outros, entretanto, devem
continuar proliferando para assim produzirem o número suficiente de células que irão
gerar os tipos celulares que nascem mais tardiamente. Se houver algum desbalanço
precoce entre estas duas forças opostas (proliferação x saída do ciclo celular), os
tipos celulares que seriam gerados mais tardiamente ficariam desfalcados. Caso
aconteça o oposto, ou seja, se os progenitores não saírem do ciclo celular na hora
exata para darem origem aos tipos celulares que são gerados mais precocemente,
neste caso, estes tipos celulares também ficarão desfalcados na retina, e teríamos
uma retina com excesso celular dos tipos celulares gerados mais tardiamente.
Ambos cenários resultariam em uma retina apresentando uma histogênese atípica e
não funcional (Cepko et al., 1996).
Em 1839, Schleiden e Sachwann propuseram a teoria celular, estabelecendo
que cada organismo é composto de uma ou mais células e que cada nova célula era
originada da divisão de outra célula pré-existente. Com o desenvolvimento das
pesquisas, foi visto que as células ao se dividirem repartem seus componentes com
as células filhas. Isso acontece durante o ciclo celular, um conjunto de processos
que tem início no momento em que a célula toma a decisão de dividir-se e não
termina até que as novas células sejam originadas.
Apesar das diferenças em alguns detalhes do ciclo celular em eucariotos, os
pontos essenciais são comuns. Geralmente, para que sejam originadas células filhas
idênticas, o DNA deve ser duplicado antes que finalmente a célula original se divida
em duas células independentes, cada uma com carga genética idêntica. O ciclo
celular divide-se em dois períodos: intérfase e mitose (Figura 5):
Intérfase: fase responsável pelo crescimento. As células estão muito ativas,
sintetizando os componentes que irão constituir as células filhas. Esta fase se
subdivide em três:
• G1: período entre o final da mitose e o início da fase S.
• Fase S: fase onde ocorre a replicação do DNA. Sinais citoplasmáticos
são enviados ao núcleo induzindo-o a iniciar a replicação. Nesta fase
as células podem ser marcadas com [
3
H]-timidina, um nucleotídeo
derivado da timina, utilizado exclusivamente para a síntese de DNA.
• G2: período entre o fim da fase S e o início da mitose. Uma célula que
completa a fase S e entra na G2 condensa seus cromossomos e segue
para mitose. Este é um período de preparação para a produção de
fatores cruciais que disparam a mitose.
Fase M (mitose): fase onde ocorre a divisão celular.
Figura 5 – Esquema representando as fases do ciclo celular. (Retirado de
Calzada et al., 2000).
As fases G1 e G2 proporcionam um tempo adicional para o crescimento.
Durante a fase G1, a célula analisa se as condições ambientais são adequadas para
começar o processo de divisão celular. Quando o sinal induz a célula a atravessar o
ponto de partida, se as condições ambientais são favoráveis, há um
comprometimento irreversível da célula iniciando-se assim, a progressão no ciclo
celular. Se as condições são desfavoráveis para a entrada no ciclo, a célula entra
em um período de quiescência denominado G0, no qual ela pode permanecer por
um longo tempo. Se estas condições ambientais voltarem a ser favoráveis, a célula
pode sair dessa fase G0 e iniciar seu ciclo de divisão. Na fase G2, a célula analisa
se a fase S foi realizada de forma correta e decide se será iniciada a mitose, ou se
espera para que sejam realizados reparos necessários ao DNA devido a erros
ocorridos durante a fase S.
O ciclo celular precisa ser altamente controlado e para isso possui vários
pontos de checagem. O ponto de restrição da etapa de transição da fase G1 para a
S possui destaque dentre os demais, por ser o período que os progenitores saem do
ciclo celular e se diferenciam. Esta decisão é determinada por interações complexas
de fatores extrínsecos e intrínsecos. A transição da fase G1 para S é controlada por
proteínas chaves da maquinaria do ciclo celular como as ciclinas, CDKs (cinases
dependentes de ciclinas) e inibidores das CDKs (família INK e Cip/Kip). As CDKs
são cinases serina-treonina e apresentam atividade cinase somente quando
complexadas com as ciclinas. A formação deste complexo induz a passagem da
fase G1 para S pela fosforilação das proteínas retinoblastoma (Rb), p107 e p130. A
hiperfosforilação dessas proteínas por sua vez libera o fator de transcrição E2F
permitindo a transcrição de genes pró-mitóticos (Figura 6) (Dyer e Cepko, 2001).
O nível de expressão das ciclinas é regulado em várias fases do ciclo. O
ponto de checagem da fase G1 do ciclo celular é regulado por diferentes complexos
de ciclinas-CDKs. O complexo ciclina D/CDK4/6 atua na fase inicial da G1 e é
regulado por sinais mitogênicos. As ciclinas D são sintetizadas durante a fase G1, e
sua inibição previne a entrada da célula na fase S (Resnitzky et al., 1994).
A Ciclina D1 é importante para a proliferação dos progenitores da retina. As
evidências que indicam esse papel no controle da proliferação em retinas de
camundongos foram baseadas em animais nocautes para ciclina D1 que
apresentam uma redução considerável no número de células em todas as camadas
da retina neural devido à falha na proliferação dos progenitores durante o
desenvolvimento deste tecido. Além disso, essa proteína está altamente expressa no
período proliferativo da retina normal desses animais (Sicinski et al., 1995).
O outro complexo que promove a transição da fase G1 para a fase S é o
ciclina E/CDK2. A especificidade deste complexo é bem ampla, apresentando como
substratos as proteínas histonas H1, a proteína Rb, a proteína p27/Kip1 e outros
substratos necessários para a passagem da fase G1 para S (Blow e Nurse, 1990).
Esses dois complexos apresentam funções diferentes durante a progressão do ciclo
celular. A ciclina D atua como sensor de sinais mitogênicos. A principal função do
complexo formado por esta ciclina seria a de promover a interação entre fatores
extracelulares e outras proteínas chaves que participam do ciclo celular, como o
complexo ciclina E/CDK2. A atividade deste último complexo é independente de
sinal externo, porém essencial para a progressão do ciclo celular (Matshushime et
al.,1994; Taya, 1997).
Existem duas famílias de proteínas inibidoras das CDKs (CKIs; ciclinas
inibidoras de cinases): a Cip/Kip e a INK 4. As proteínas p27, p21 e p57 são
membros da família Cip/Kip e as proteínas p15, p16, p18 e p19 são membros da
família INK 4. Os membros da família INK4 inibem especificamente a subunidade
catalítica das CDK4 e CDK6. Já as proteínas da família Cip/Kip apresentam uma
atividade inibitória mais ampla, que afeta as cinases dependentes de ciclina A, D e E
(Sherr e Roberts, 1999). Com base em estudos de estrutura, acredita-se que uma α
hélice das proteínas Cip/Kip interage com a ciclina e uma segunda hélice com a
subunidade catalítica da CDK, provavelmente bloqueando o seu carregamento de
ATP (Russo et al., 1996).
Além das evidências de que fatores intrínsecos regulem a proliferação dos
progenitores da retina, como ciclina D1 e p27/Kip1, existem evidências crescentes
do envolvimento de neurotransmissores na regulação da proliferação celular (Martins
e Pearson, 2007; Pearson et al., 2002).
1.1.5 CÉLULAS FOTORRECEPTORAS: CONES E BASTONETES
Os fotorreceptores são neurônios sensoriais altamente especializados em
detectar luz (Schulte e Bumsted-O`Brien, 2007, para revisão). Os dois tipos de
fotorreceptores (cones e bastonetes) presentes na retina de vertebrados diferem em
vários aspectos (Rodieck, 1998). Primeiramente, a distribuição dos tipos particulares
de fotorreceptores na retina não é uniforme (Ahnelt e Kolb, 2000; Raymond e
Barthel, 2004; Peichl, 2005). Além disso, os bastonetes superam em grande número
os cones. Nos humanos, os bastonetes são em cada olho, cerca de 120 milhões,
Figura 6 – Esquema mostrando as principais famílias de proteínas que regulam
a progressão do ciclo celular durante as fases G1/S.
A
s proteínas da família do
retinoblastoma encontram-se ativas quando defosforiladas e podem ser fosforiladas
pelo complexo Ciclina/CDK. A fosforilação induz a perda da afinidade do
retinoblastoma pelo fator de transcrição E2F. Uma vez liberado este fator induz a
transcrição de enzimas necessárias para a fase S do ciclo celular.
A
s proteínas
KIP/CIP inibem a formação do complexo ciclina/CDK, impedindo a fosforilação da
proteína retinoblastoma e a transcrição de genes pró-mitóticos (Retirado de Dyer e
Cepko, 2001).
enquanto os cones são cerca de 6,5 milhões por olho (Rodieck, 1998; Cepko, 2000).
Em camundongos, 75% de todas as células da retina são fotorreceptores, e 97%
destas são bastonetes (Morrow et al., 1998b). Bastonetes são especializados para
visão de baixa intensidade luminosa (visão escotópica), enquanto os cones são
especializados para a visão em alta intensidade luminosa de forma a mediarem a
visão a cores (visão fotópica). Os bastonetes, por sua vez, são mais sensíveis à luz
por possuírem mais fotopigmento do que os cones (Jacobs, 1996; Schulte e
Bumsted-O`Brien, 2007). Dado que a visão de camundongos é principalmente
mediada por bastonetes e também pelo fato destes animais apresentarem
comportamento crepuscular e noturno, observa-se a necessidade de uma visão
sensível aos baixos níveis de luminosidade (Morrow et al., 1998b)
A maioria dos vertebrados possui apenas um único tipo de bastonete e
diversos tipos de cones. Os humanos possuem três tipos de cones, ou seja,
possuem uma visão tricromática, devido a presença de 3 tipos distintos de opsinas:
(1) opsinas-S, sensíveis a ~420nm (comprimentos de ondas curtos; cones azuis); (2)
opsinas-M, sensíveis a ~530nm (comprimentos de ondas médios; cones verdes); (3)
opsinas-L, sensíveis a ~560nm (comprimentos de ondas longos; cones
vermelhos)(Jacobs, 1996). Na maioria dos vertebrados os cones são encontrados
em alta densidade na fóvea. Na fóvea, encontramos apenas cones verdes e
vermelhos, enquanto que os cones azuis são encontrados fora da fóvea, nas regiões
mais excêntricas da retina (Cepko, 2000).
Vale ressaltar ainda que a maior parte dos roedores tem uma visão
dicromática, ou seja, possuem apenas dois tipos de pigmentos visuais.
Camundongos, entretanto, possuem opsinas-S (sensíveis a faixa entre 360-365nm)
e opsinas-M (sensíveis a faixa entre 509-512nm) (Jacobs et al., 2004).
Morfologicamente, tanto os bastonetes como os cones possuem três regiões
funcionais principais (Figura 7): o segmento externo, localizado na superfície externa
ou distal da retina, e que contém fotopigmento, é especializado para a
fototransdução; o segmento interno, localizado na região mais proximal da retina,
que contém o núcleo da célula e a maioria da maquinaria celular; e um terminal
sináptico, que estabelece contato com as células-alvo dos fotorreceptores. Os
segmentos externos são preenchidos com pigmentos visuais que absorvem luz
(Kandel et al., 2003). Desta forma, como em camundongos 97% dos fotorreceptores
presentes na retina são bastonetes (Morrow et al., 1998b) a rodopsina passa a ser a
proteína fototransdutora mais abundante, com localização subcelular restrita ao
segmento externo (OS), nos animais adultos (Morrow et al., 1998a, 1998b). Isto
torna a rodopsina um excelente marcador para os estágios de diferenciação, onde a
mesma estará presente abundantemente no corpo celular, e estágios de
manutenção, onde ela se mostrará restrita aos OS dos fotorreceptores.
Figura 7 – Morfologia dos fotorreceptores (cones e bastonetes). (modificado
apartir da figura obtida no endereço eletrônico http://thebrain.mcgill.ca/flash/index_
d.html).
1.1.5.1 DIFERENCIAÇÃO DE FOTORRECEPTORES (BASTONETES)
A especificação dos tipos celulares retinianos envolve uma complexa
interação de fatores extrínsecos e intrínsecos. Fatores intrínsecos são responsáveis
por controlar o destino celular durante o ciclo celular enquanto fatores extrínsecos
influenciam temporalmente, proporcionalmente e funcionalmente os diferentes tipos
celulares após a saída do ciclo celular, ou seja, durante a diferenciação retiniana
(Reh, 1991; Cepko et al., 1996; Jean et al., 1998; Reh e Levine, 1998; Adler, 2000;
Fuhrmann et al., 2000; Lupo et al., 2000; Galli-Resta, 2001; Liversey e Cepko, 2001;
Marquardt e Gruss, 2002; Zhang, 2002; Bailey et al., 2004; Boulton e Albon, 2004;
Segmentos
Externos
Segmentos
Externos
Segmentos
Internos
Segmentos
Internos
Cone
Bastonete
Hatakeyama e Kageyama, 2004; Malicki, 2004; Rapaport et al., 2004; Adler e
Raymond, 2007)
Todos os tipos de células neuronais da retina são derivados de um pool
comum de progenitores multipotentes (Turner e Cepko,1987), gerados em uma
ordem conservada, com grande sobreposição temporal (Young, 1985; Turner e
Cepko, 1987; Holt et al., 1988; Turner et al., 1990; Jensen e Raff, 1997). Em
roedores (Figura 3), os cones são gerados no período embrionário E11,5–E18,5,
enquanto a gênese dos bastonetes envolve um período bem mais longo, que se
estende desde a fase embrionária E12,5 até o 7º dia pós-natal (P7) tendo um pico
em P0 (Carter-Dawson e LaVail, 1979; Young, 1985). Entretanto, existe um
significativo atraso para que os fotorreceptores pós-mitóticos comecem a expressar
o seu tipo específico de opsina, assim como para a ativação de outros genes
específicos que lhes conferem o fenótipo maduro (Watanabe e Raff, 1990; Cepko et
al., 1996). Durante esta lacuna temporal, os precursores de fotorreceptores parecem
estar num estado “plástico” e, portanto, podem ser induzidos a se diferenciar em
diferentes subtipos de fotorreceptores, dependendo dos fatores regulatórios
intrínsecos e extrínsecos a que forem expostos (Nishida et al., 2003; Cheng et al.,
2006; MacLaren et al., 2006; Roberts et al., 2006).
A regulação intrínseca dos bastonetes é mediada por uma rede de fatores de
transcrição específicos de fotorreceptores, como por exemplo, o Crx, um fator de
transcrição pertencente a família de fatores com homodomínio semelhante à Otx.
Outros fatores regulatórios transcripcionais também estão implicados no
desenvolvimento dos fotorreceptores, dentre eles: Otx2 (Nishida et al., 2003); Nrl
(Swaroop et al., 1992; Mears et al., 2001; Strettoi et al., 2004); Rb (Zhang et al.,
2004); receptor nuclear órfão específico para rodopsina Nr2e3
(Akhmedov et al.,
2000; Haider et al., 2001; Cheng et al., 2004; Peng et al., 2005; Chen et al., 2005).
Desta forma, consistente com seus papéis na regulação gênica dos fotorreceptores,
mutações em humanos no gene Crx e no Nr2e3 resultam em retinopatias (Swain et
al., 1997; Swaroop et al., 1999). Recentemente, Oh e colaboradores (2007)
relataram que o Nrl não é somente essencial, mas também suficiente para a
diferenciação de bastonetes.
Dentre os fatores extrínsecos relacionados ao desenvolvimento dos
bastonetes temos o fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ou FGF-2),
sonic hedgehog, taurina e laminina-β 2 (Hicks e Courtois, 1992; Hunter et al., 1992;
Altshuler et al., 1993; Libby et al., 1996; Levine et al., 1997). No entanto, o fator
neurotrófico ciliar (CNTF) e o fator inibidor de leucemia (LIF), membros da família de
fatores hematopoiéticos, inibem a diferenciação de fotorreceptores em mamíferos,
fazendo com que as células destinadas a se tornar bastonetes passem a apresentar
fenótipo de neurônios bipolares (Ezzeddine et al.,1997). Entretanto, estudos in vitro
na retina de galinha sugerem que o CNTF pode desempenhar um papel regulatório
transitório, promovendo o desenvolvimento dos fotorreceptores por aumentar a
expressão de opsinas (Fuhrmann et al., 1998).
O fator neurotrófico derivado de glia (GDNF) pode também desempenhar um
papel na regulação do desenvolvimento dos fotorreceptores, pelo menos in vitro
(Rothermel e Layer, 2003), onde, dependendo do estágio de desenvolvimento, este
fator pode influenciar a proliferação, diferenciação e sobrevida dos bastonetes ou de
seus precursores. As proteínas hedgehog também são fortes candidatas a
promoverem a diferenciação de fotorreceptores. Tanto os subtipos indian hedgehog
quanto sonic hedgehog promovem a diferenciação de bastonetes de mamíferos
mantidos em cultura (Levine et al., 1997).
O ácido retinóico também foi descrito como capaz de promover a
diferenciação de fotorreceptores em retinas de zebrafish, galinha, roedores e
humanos in vitro (Stenkamp et al.,1993; Kelley et al., 1994, 1995, 1999; Hyatt et al.,
1996) e in vivo (Levine et al., 2000). Além disso, o ácido retinóico modula a
expressão de diversos genes específicos para os fotorreceptores, inclusive arrestina
e crx (Li et al., 2002; Boatright et al., 2002; Li et al., 2003). A Activina A, uma
proteína da família do fator de crescimento tumoral β (TGF-β), também é uma
importante reguladora da diferenciação de fotorreceptores na retina em
desenvolvimento, tanto in vitro quanto in vivo (Davis et al., 2000). Recentemente, o
DHA (ácido docosahexanóico) também foi descrito como promotor da diferenciação
de fotorreceptores sem, entretanto, alterar a expressão de Crx (Garelli et al., 2006).
Em suma, os bastonetes são considerados como um caso especial em termos
de re-especificação pós-mitótica, uma vez que muitos fatores têm sido descritos
como capazes de influenciar positivamente e/ou negativamente a sua diferenciação
pós-mitótica in vitro (Levine et al., 2000). Neste sistema, as células pós-mitóticas,
comprometidas em se tornar células fotorreceptoras geradas durante o período
embrionário tardio são mantidas em um estado indiferenciado pela forte ativação do
fator de transcrição STAT3 (transdutor e ativador de transcrição do tipo 3), o qual é
induzido por fatores extrínsecos difusíveis, tais como o CNTF (Caffe et al.,2001;
Neophytou et al., 1997; Rhee et al., 2004; Zhang et al.,2004). Dado que a expressão
de CNTF é alta na retina embrionária, porém declina na idade pós-natal (Kirsch e
Hofmann, 1994; Schulz-Key et al., 2002), esta diminuição parece ser a responsável
pela baixa regulação da ativação de STAT3 em P0, o que por sua vez levaria ao
início da expresão de rodopsina e a diferenciação dos bastonetes (Ozawa et al.,
2004). Entretanto, embora a ativação de STAT3 na maioria das células
fotorreceptoras já tenha diminuído substancialmente em P0, se comparada com E18
(4,5 vezes) (Ozawa et al., 2004), o início da expressão de rodopsina não começa
simultaneamente em todas as células pós-mitóticas. De fato, existem duas fases
distintas na diferenciação dos fotorreceptores: uma fase mais precoce e uma fase
mais tardia. Sendo assim, devem existir outros sistemas regulatórios capazes de
reduzir a ativação de STAT3 residual presente em cada célula pós-mitótica
fotorreceptora até um nível baixo o bastante para o início da expressão de
rodopsina. De fato, a proteína SOCS3 é requerida para este ajuste fino e sua
expressão tem sido relacionada a uma rápida diminuição na ativação de STAT3, o
que permite que os bastonetes se diferenciem (Ozawa et al., 2007).
1.2 CITOCINAS E O SISTEMA NERVOSO
Citocinas são polipeptídeos de pequeno peso molecular, mediadores cruciais
nas comunicações intercelulares e em processos de regulação da atividade celular
(Nicod, 1993; Holtmann e Resch, 1995;Haddad, 2002; Gao e Miller, 2006). Atuam
como reguladoras humorais, em concentrações nano- a picomolares, de maneira
autócrina, parácrina, ou como mensageiros endócrinos, agindo tanto em processos
fisiológicos quanto patológicos (Raber et al., 1998). Estas moléculas podem atuar
também modulando atividades durante os mais diversos eventos no SNC e no
sistema nervoso periférico (SNP), de forma imuno- ou neuromodulatória. (Parkin,
2001; Szelényi, 2001; Haddad, 2002; Gao e Miller, 2006; Murphy e Saravanapavan,
2006; Owens et al., 2006).
De modo geral, podemos dizer que o termo citocinas engloba uma ampla
gama de moléculas, nomeadas em grupos afins conforme os tipos celulares
produtores, como as interleucinas, linfocinas, monocinas e interferons (Nicod, 1993;
Debets e Savelkoul, 1996; Haddad, 2002; Holloway et al., 2002). Atualmente se
sabe que estas moléculas são produzidas por uma variedade de tipos celulares e
que apresentam populações-alvo bem distintas daquelas inicialmente descritas.
Inicialmente, as citocinas foram descritas como importantes mediadores da
resposta inflamatória. Por conseguinte, de acordo com o balanço final de suas ações
no sistema imune elas foram classificadas em pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias.
(Haddad, 2002). Desta forma, células T do tipo Th1, tidas como estimulatórias,
secretam citocinas do tipo 1, conhecidas como pró-inflamatórias, tais como:
interleucina (IL)-2, interferon-γ (IFN-γ), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e
linfotoxinas. As células T do tipo Th2, tidas como inibitórias, secretam citocinas tipo
2, conhecidas como anti-inflamatórias, tais como as IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13
(Opal e DePalo, 2000; Haddad, 2002; Li et al., 2004; Odbileg et al, 2005).
Diversas citocinas e células produtoras de citocinas têm sido descobertas
através das técnicas inovadoras de biologia molecular, entretanto, classificar e dividir
todas as citocinas em classes tem sido uma questão de grande polêmica entre
vários pesquisadores (Haddad, 2002). Elas podem ser secretadas por monócitos,
macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, linfócitos B e T (Holtmann e Resch,
1995), adipócitos (para revisão ver Coppack, 2001; Fain, 2006), dentre outros tipos
celulares como os neurônios e as células gliais (e.g. astrócitos, e células microgliais)
(Brodie, 1996; Aschner, 1998; Szelényi, 2001), e sua produção pode ser constitutiva
ou estimulada (Arai et al., 1990; Korshing, 1993; Cavaillon, 1994; Holtmann e Resch,
1995; Rouveix, 1997; Boraschi et al., 1998; Dinarello, 2000; Oppenheim, 2001;
Haddad, 2002; Holloway et al., 2002). Desta forma, a classificação mais plausível e
aceita por diversos pesquisadores é a que destaca apenas as classes mais
representativas para este nome genérico “citocinas”, as quais compreendem fatores
de crescimento, neurotrofinas, interleucinas, interferons e outros fatores que
são capazes de direcionar a diferenciação de uma determinada população celular,
como os fatores neuro-hematopoiéticos (Patterson, 1993; Holtmann e Resch,
1995; Haddad, 2002).
A constatação de que citocinas atuam como importantes mediadores entre
células dos sistemas imune e nervoso consolidou várias linhas de pesquisa visando
a caracterização dos mecanismos de interação entre estes sistemas e a
compreensão dos diferentes eventos-chave observados durante o desenvolvimento
ou após lesão (Dantzer, 2004; Konsman et al., 2002; Dantzer e Winther, 2001;
Dantzer et al., 2000; Mehler e Kessler, 1997; Sholl-Franco et al., 2001a, 2001b,
2002). De fato, sabe-se que no SN citocinas estão implicadas na liberação de
neurotransmissores e regulação hormonal (Hopkins e Rothwell, 1995), sobrevida
neuronal (para revisão, Levi Montalcini, 1987; Davies, 1994; Lewin e Barde, 1996,
Huang e Reichardt 2001) regulação da diferenciação neuronal e axonal, crescimento
dendrítico, funcionamento sináptico, diferenciação celular, migração e proliferação,
assim como plasticidade funcional neuronal (McAllister et al., 1999; Cepko, 1999;
Levine et al., 2000; Schinder e Poo, 2000; Jankowsky e Patterson, 2001; Poo, 2001;
Sholl-Franco et al., 2001a, 2002). Além disso, têm sido amplamente relacionadas a
diferentes quadros patológicos presentes nos SNP e SNC (Szelényi, 2000; Murphy e
Saravanapavan, 2006; Owens et al., 2006).
As citocinas, assim como os hormônios e os outros sinalizadores
intercelulares polipeptídicos, iniciam suas ações ligando-se aos seus receptores
específicos de alta afinidade (Rose-John e Heinrich,1994; Holloway et al., 2002).
Estes receptores podem estar presentes na membrana plasmática das células-alvo
ou também em sua forma solúvel (receptores solúveis), e pode-se observar o
compartilhamento de subunidades transdutoras de sinal entre várias citocinas (Rose-
John e Heinrich, 1994; Haddad, 2002; Kelly-Welch, 2003, 2005).
Desta forma, as citocinas geram sinais que além de promover respostas de
curta ou média duração ao nível citoplasmático e de membrana, podem levar a
ativação de fatores transcricionais que irão alterar a expressão gênica (Gadina et al.,
2001; Holloway et al., 2002; Grötzinger, 2002; Haddad, 2002) de forma ampla e
muitas das vezes dependente de co-estimulação por outras citocinas, hormônios,
neurotransmissores e outros fatores. Assim, podemos observar ações pleiotrópicas,
redundantes, aditivas, sinérgicas e/ou antagônicas entre os mais variados fatores em
um mesmo tipo celular, de modo a se formar uma rede de interações nomeada como
rede de citocinas (Nicod, 1993; Holtmann e Resch, 1995; Haddad, 2002).
Um dos mais bem conhecidos mecanismos pelos quais as citocinas
transduzem sinais nas células-alvo envolve o recrutamento de proteínas tirosinas
cinases associadas a receptores denominadas de Janus cinases (JAKs), com
subseqüente ativação de membros da família de fatores de transcrição chamados
STATs. As vias de sinalização JAK/STAT são usadas por todos os receptores de
citocinas, os quais podem ser classificados como receptores tipo I ou tipo II, como
ilustrado na figura 8 (Kirken et al., 1988; Haddad, 2002; Hanada e Yoshimura, 2002).
Figura 8 – Superfamília de receptores para citocinas. Receptores para citocinas
tipo I e tipo II, classificados, conforme suas características estruturais. (Retirado de
Mehler e Kessler, 1997).
1.2.1 INTERLEUCINAS: SINALIZADORES NO SISTEMA NERVOSO?
Em adição aos polipeptídeos com ação trófica e de diferenciação classicamente
descritos para o SN como, por exemplo, as neurotrofinas e as citocinas neuro-
hematopoiéticas, tem sido descrita uma série de linfocinas e monocinas produzidas
por linfócitos T e B, células do estroma, macrófagos, fibroblastos ou por outros tipos
celulares. Estas glicoproteínas são as Interleucinas (Holtmann e Resch, 1995, para
revisão).
Os estudos a respeito das ações de interleucinas no SNC estão, na maioria das
vezes, relacionados ao crescimento, diferenciação, sobrevivência neuronal, respostas
inflamatórias e processos degenerativos, assim como no SNP eles se voltam para a
regeneração de nervos periféricos e a plasticidade do fenótipo neuronal. Por exemplo,
as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7 e IL-8 têm sido descritas como fatores estimuladores
da neuritogênese em células ou linhagens de células neuronais (Hanisch e Quirion,
1996; Sarder et al., 1993; Kamegai et al., 1990). Além disso, vários pesquisadores têm
sugerido papéis de fatores neurotróficos, fatores de diferenciação ou ainda de fatores
de lesão para as diferentes citocinas conforme o paradigma experimental. Neurônios
de várias áreas do SNC (e.g. retina, córtex, hipocampo, prosencéfalo basal e região do
septo) têm sua sobrevida aumentada in vitro após tratamento com as IL-2, IL-4, IL-5,
IL-7 e IL-8 em baixas concentrações (nM ou µM) sugerindo um papel neurotrófico para
estas citocinas (Araujo e Cotman, 1993; Sholl-Franco et al., 2001a). A modulação
fenotípica de diferentes tipos neuronais por ILs também tem sido alvo intenso de
estudos, bem como a regulação da atividade neuronal e a liberação e captação de
diferentes neurotransmissores (Mennicken et al., 1994; Hopkins e Rothwell, 1995;
Mehler e Kessler, 1997; Sholl-Franco et al., 2000, 2001b, 2002).
1.2.1.1 A INTERLEUCINA-4 (IL-4)
A IL-4 é uma citocina anti-inflamatória, inicialmente descrita como um fator
estimulante de células B (BSF-1) ou como fator-1 de crescimento de células B
(BCGF-1), tendo sido sua ação inicialmente relacionada à proliferação dessas
células quando da co-estimulação por anticorpos anti-IgM (Farrar et al., 1983). Além
disso, foi descrita como uma citocina de ação pleiotrópica sobre várias populações
celulares, podendo atuar em vários estágios da diferenciação celular (Banchereau et
al., 1994; Duschl e Sebald, 1996).
A IL-4 foi identificada pela primeira vez em 1982 por Chomarat e Banchereau
(1997, para revisão) como uma citocina multifuncional secretada por células Th2,
basófilos e mastócitos. A IL-4 promove a diferenciação de células T em células do
tipo Th2 (Paul,1991). Ela é uma glicoproteína de peso molecular de 20 KDa,
secretada principalmente pelos linfócitos T CD4
+
da subpopulação Th2 (Holtmann e
Resch, 1995; Crane et al., 1998), atuando como uma importante citocinas de ação
central na diferenciação de células T CD4
+
em células Th2, porém sem apresentar,
ainda, funções definidas na diferenciação das células Th1 (Li et al., 2004).
Recentemente foi descrito que a IL-4 é capaz de induzir células progenitoras da
medula óssea a se diferenciarem em células Th2 inatas in vitro (Chen et al., 2004).
Em linfócitos B, por sua vez, a IL-4 participa dos processos de ativação,
proliferação e diferenciação celular, promovendo a produção de IgG1 e IgE (Vitetta
et al., 1985; Coffman et al., 1986; Nelms et al., 1999; Ansel et al., 2006). A IL-4 induz
a transcrição dos genes IgCγ1 e Cε como um precedente, e como é a principal
estimuladora da troca de classe de Ig para o isotipo IgE, faz isso induzindo ou
aumentando a expressão de moléculas MHC classe II, Thy-1, CD23 nas células B e
T (Coffman et al., 1986; Snapper e Paul, 1987; Snapper et al., 1988). Além disso,
tem sido mostrado que a IL-4 atua como fator de sobrevida prevenindo a apoptose
de diferentes tipos celulares, incluindo células T e B e mastócitos (Foote et al., 1996;
Zamorano, et al., 1996).
A IL-4 é composta por 129 aminoácidos e apresenta 20% de homologia de
sequência de aminoácidos com a IL-13. Esta é outra citocina anti-inflamatória
também derivada de células Th2, que compartilha inúmeras propriedades biológicas,
estruturais e funcionais com a IL-4 (Chomarat e Banchereau, 1997; Müeller et al.,
2002). A IL-4 possui uma estrutura molecular peculiar sendo formada por 4 α-hélices
orientadas de forma ‘up-up-down-down’ (LaPort et al., 2005) e duas longas alças
terminais (Mueller et al., 2002), como pode ser observado na figura 9.
Figura 9 – Representação espacial da estrutura molecular da interleucina-4.
(Retirada do endereço eletrônico: http://www.mcld.co.uk/hiv).
Em adição às suas funções imunomodulatórias, a IL-4 tem sido descrita, nas
últimas décadas, atuando sobre células do SNC adulto ou em desenvolvimento
(Sholl-Franco et al., 2001a; Sholl-Franco et al., 2001b; Sholl-Franco et al., 2002;
Sredni-Kenigsbuch, 2002; Schroeter e Jander, 2005). Entretanto, poucos são os
dados disponíveis a respeito das populações produtoras desta citocinas, ficando, na
maior parte das vezes, a informação restrita à descrição de seus efeitos sobre
populações neuronais e/ou gliais específicas.
Na década de 1990, os trabalhos pioneiros de Brodie (1996) e de Araújo e
Cotman (1993, 1995) mostravam o envolvimento principalmente de células gliais
como as populações-alvo desta citocina. Em 2005, Butovsky e colaboradores
mostraram que a IL-4 e o IFN-γ induziam indiretamente a neurogênese e
oligodendrogênese de células progenitoras neurais, em camundongos adultos. Foi
demonstrado que células microgliais tratadas com IL-4 co-cultivas com células
progenitoras neurais estimulam, nestas últimas, a oligodendrogênese (Butovsky et
al., 2005). Além disso, já foi demonstrado que a IL-4 diminui a proliferação de
astrócitos em humanos (Estes et al., 1993, Barna et al., 1995) e aumenta o efeito
anti-proliferativo do TNF-α em uma linhagem celular de glioblastoma (Iwasaki et al.,
1993). Ainda em glioblastomas, foi demostrado, em células C6, que a IL-4 induz um
efeito proliferativo bifásico, levando a um aumento da proliferação celular em baixas
concentrações e inibição em altas concentrações.(Iwasaki et al., 1993).
A indução da síntese e secreção de NGF pela IL-4 também foi observada em
células astrogliais de ratos (Awatsuji et al., 1993), em células de linhagem C6 (Brodie
e Goldreich, 1994) e em astrócios corticais e cerebelares de camundongos (Brodie
et al.,1998). Estudos desenvolvidos in vitro mostraram ainda que a IL-4 atua inibindo
a liberação de agentes neurotóxicos, tais como o IL-1 β, TNF-α e o óxido nítrico
(Chao et al., 1993; Lee et al., 1995; Mori et al., 1995) e antagonizando os efeitos do
IFN-γ (Fiorentino et al., 1991).
Os efeitos diretos da IL-4 na sobrevida de diferentes populações neuronais
foram avaliados in vitro como, por exemplo, sobre neurônios hipocampais de
embriões de ratos (Araujo e Cotman, 1993) ou sobre células ganglionares da retina
(Sholl-Franco et al., 2001a). Entretando, a ação neuroprotetora da IL-4 in vivo pôde
ser confirmada por estudos que utilizaram a expressão desta citocina, através de
transferência gênica, com o uso de adenovírus associado. Neste trabalho foi
demonstrado o aumento da sobrevida das células ganglionares da retina 14 dias
após axotomia (Koeberle et al., 2004). Esse efeito foi observado com a
administração do vetor nos colículos superiores ou intravitriamente (Koeberle et al.,
2004).
Outros estudos têm demonstrado que a IL-4 também exerce uma importante
ação anti-inflamatória no cérebro. Experimentos realizados in vivo mostram que a IL-
4 pode regular a inflamação cerebral induzindo a morte da microglia ativada e
aumentando, conseqüentemente, a sobrevida neuronal (Park et al., 2005). Além
disso, Mössner e colaboradores (2001) mostraram que a IL-4 é capaz de diminuir o
número de transportadores de serotonina (5-HTT) em linfócitos B imortalizados.
Essas células representam um modelo prático para o estudo do que ocorre com
neurônios serotoninérgicos, visto que os efeitos do polimorfismo no RNAm para 5-
HTT e na proteína 5-HTT são semelhantes em células periféricas e no cérebro
humano. A diminuição nos níveis de 5-HTT reduz a quantidade de serotonina
disponível para ser liberada nos sítios de inflamação. Como a serotonina faz parte
da cascata inflamatória, a IL-4 também exerceria, desta forma, um papel anti-
inflamatório.
Nolan e colaboradores (2005) demostraram a presença funcional de
receptores para IL-4 em células granulares do giro denteado de ratos e que a
ativação deste receptor é regulada durante o desenvolvimento desta estrutura, onde
é marcante a diminuição com o avanço da idade do animal. De fato, doenças
neurodegenerativas relacionadas com a idade estão fortemente associadas com
uma alteração significativa no balanço funcional entre citocinas pró- e anti-
inflamatórias, o que poderia estar acarretando em pertubação na eficiência sináptica
(Maher et al., 2005).
1.2.1.2 IL-4R E VIAS DE TRANSDUÇÃO
A IL-4 exerce suas atividades biológicas através da interação com os seus
receptores de superfície (Lischke et al., 1998), os quais são compostos de duas
proteínas transmembrana (Dushl e Sebald, 1996; Wells e DeVos, 1996, para
revisão). A resposta celular a esta citocina depende da presença do componente α
(IL-4Rα), também denominado CD 124 (Hinton e Welham, 1999), com peso
molecular de 140 kDa (Keegan e Pierce, 1994; Galizzi et al., 1990), e responsável
pelo processo de dimerização formador dos dois tipos de receptores para IL-4 (IL-
4R) já descritos (Figura 10). Nos IL-4R do tipo I, presentes em linhagens de células
hematopoiéticas, a outra subunidade formadora do complexo é a cadeia IL-2γc
(CD132) (Russell et al., 1993; Hinton e Welham, 1999.), a qual é compartilhada
ainda por receptores para outras citocinas como, por exemplo, a IL-2, IL-7, IL-9 e IL-
15 e IL-21 (Müller et al., 2002; Kelly-Welch et al., 2003; 2005). O IL-4R do tipo II está
presente em linhagens celulares de células não hematopoiéticas, sendo formado
pela interação do IL-4Rα com o IL-13Rα1, ao invés de IL-2Rγc (Nelms et al., 1999;
Müller et al., 2002; Pernis e Rothman, 2002; Kelly-Welch et al., 2003, 2005).
Entretanto, a IL-13 também é capaz de se ligar ao complexo formado pela
heterodimerização do IL-4Rα com o IL-3Rα1 (Kelly-Welch et al., 2003)
Figura 10 – Os receptores tipo I e tipo II para IL-4. A, O receptor tipo I para IL-4,
composto pelo IL-4Rα e pelo IL-2Rγc e todas as outras interleucinas já descritas que
compartilham a subunidade γc: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, e IL-21. B, O receptor tipo
II para a IL-4, composto pelo IL-4Rα e o pelo IL-13Rα1, também pode ser ativado
pela IL-13. (Modificado de Ozaki e Leonard, 2002).
A dimerização do IL-4R ativa membros da família de janus cinases (JAK),
composta por quatro componentes (JAK1, JAK2, JAK3 e Tyk2), os quais podem
estar associados com a região citoplasmática do receptor (figura 11). O receptor tipo
I ativa predominantemente as JAK1 e JAK3, enquanto o receptor tipo II ativa as
JAK1, JAK2 e Tyk2. Resíduos de tirosina, presentes na cauda citoplasmática do IL-
4Rα, tornam-se fosforilados e atuam como sítios de ligação para outras moléculas
sinalizadoras (Murata et al., 1998; Müeller et al., 2002; Kelly-Welch et al., 2003). Na
via mais clássica de ativação do receptor para IL-4, o primeiro resíduo tirosina
citoplasmático (Y1) interage com proteínas ligadoras de resíduo tirosina (PTB),
enquanto os resíduos de tirosina de 2 a 4 interagem com domínios SH2 de
transdução de sinal e o ativador transcricional 6 (STAT6). A STAT6 fosforilada, se
dimeriza, migra para o núcleo e se liga a promotores de genes, atuando como um
ativador ou repressor transcricional (Takeda et al., 1997; Hebenstreit et al., 2006).
Figura 11 – Ativação do receptor para IL-4 leva a ativação de vias de
sobrevida, proliferação e diferenciação celular. (disponível no endereço
eletrônico: http://www.biocarta.com/pathfiles/il4pathways.asp).
A transdução de sinais através dos receptores de IL-4 envolve três principais
vias de sinalização: JAK-STAT6, Raf-MEK-MAPK e fosfatidilinositol-3`- cinase
(PI3K)-Akt (para revisão, Nelms et al., 1999; Kelly-Welch, 2003). Adicionalmente, um
aumento citoplasmático nos níveis de cálcio livre e de AMPc (Finney et al., 1990),
assim como um aumento na atividade da proteína cinase C (PKC) (Ikizawa et al.,
1996; Yanagihara et al., 1997) podem também desencadear as respostas celulares
da IL-4. A possibilidade de ativação de múltiplas vias setorizadamente e de maneira
compartimentalizada colaboram para os fenômenos de pleiotropismo, antagonismo,
sinergismo e redundância desencadeados pelas ações da IL-4 e de outras citocinas
nos mais diversos tipos celulares (Guzdek et al., 2000).
1.2.1.3 A INTERLEUCINA-4 E O SISTEMA VISUAL
Na retina de ratos em desenvolvimento, foi demonstrado que a IL-4 aumenta
a sobrevida de células ganglionares axotomizadas após 48h em cultura de maneira
dose-dependente (Sholl-Franco et al., 2001a), assim como a diferenciação de
células amácrinas colinérgicas e GABAérgicas (Sholl-Franco et al., 2001b, 2002).
Reforçando a hipótese de agente neuroprotetor, estudos recentes mostram que a
transfecção gênica da IL-4 mediada por adenovírus (Ad.IL-4) aumenta a sobrevida
das células ganglionares da retina in vivo, após axotomia. Esse efeito foi observado
tanto na administração intraocular do vetor como na sua injeção nos colículos
superiores. O Ad.IL-4 também diminuiu a imunorreatividade à nitrotirosina, sugerindo
que a IL-4 protege as RGC da formação de peroxinitrito, que resultaria da síntese de
óxido nítrico por células gliais ativadas (Koeberle et al., 2004).
Entretanto, a sua presença constitutiva, ou a presença da subunidade α
específica para o seu receptor (IL-4Rα) ainda não foram demonstradas na retina.
Adicionalmente, dada a literatuta atual não se sabe se interleucinas podem afetar a
proliferação e diferenciação de fotorreceptores (Morrow et al., 1998; Liversey e
Cepko, 2001), que particularmente são dependentes de fatores de crescimento
derivados de células não-neurais do epitélio pigmentar (Tanihara et al., 1997;
Behling et al., 2002).
Fukuda e colaboradores (2002) demonstraram a expressão do RNAm para
os componentes do receptor tipo I e tipo II de IL-4 (IL-4R): IL-4Rα, IL-2Rγc, IL-
13Rα1, e IL-13Rα2 em culturas de fibroblastos da córnea humana. Adicionalmente,
mostraram que a expressão das proteínas IL-4Rα e IL-2Rγc também estavam
presentes na superfície dos fibroblastos da córnea humana. De fato, nestas células
a IL-4 pode atuar via seus receptores tipo I e tipo II (Kelly-Welch et al., 2003, 2005).
2 OBJETIVOS
A IL-4, citocina anti-inflamatória com efeitos neuromoduladores, tem sido
implicada com a diferenciação e sobrevida das células retinianas. Assim, dividimos
nossos objetivos da seguinte forma:
Gerais:
Avaliar a presença e ação da IL-4 na retina.
Específicos:
Avaliar a expressão de IL-4 no tecido retiniano.
Verificar e localizar a expressão de IL-4 no tecido retiniano.
Verificar e localizar a expressão da subunidade α do receptor de IL-4.
Avaliar o papel da IL-4 na proliferação das células progenitoras retinianas.
O efeito da IL-4 na proliferação das células precursoras retinianas.
A modulação da expressão de duas proteínas reguladoras do ciclo
celular: Ciclina D1 e p27
kip1
pela IL-4.
As vias de sinalização envolvidas neste efeito.
Avaliar o papel da IL-4 na diferenciação de células fotorreceptoras.
O efeito da IL-4 na diferenciação das células fotorreceptoras na retina
durante o desenvolvimento in vitro.
A modulação da expressão da proteína rodopsina pela IL-4.
As vias de sinalização envolvidas neste efeito.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os animais utilizados foram tratados segundo as normas estabelecidas
pela ARVO (Statement for the use of animals in ophtalmic and vision resarch) e pelo
Comitê de Experimentação Animal do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
3.1 MATERIAIS
IL-4 recombinante humana (atividade específica, 5,0 x 10
6
U/mg), IL-2
recombinante humana (atividade específica, 2,0 x 10
8
U/mg), IL-8 recombinante
humana (atividade específica, 2,0 x 10
6
U/mg), anticorpo primário anti-bFGF
(bioatividade, ND
50
=2,0 µg/mL), anticorpo anti-IL-4R (bioatividade, ND
50
=2,0 µg/mL)
foram obtidos da Peprotech (USA). Os anticorpos primários anti-IL-4 (bioatividade,
ND
50
=2,1 µg/mL), anti-IL-4Rα, anti-Erk2, anti-phospho-Erk1/2, e anti-actin foram
obtidos da Santa Cruz Biotechnology (USA). O anticorpo primário anti-rodopsina
(Rho 4D2) foi gentilmente cedido pelo Dr. R. Molday (1998, University of British
Columbia, Vancouver, Canada). O meio de inclusão (OCT) foi obtido da Tissue-Tek,
Sakura Finetek U.S.A Inc. (USA). A poli-L-lisina (p-L-l), a fluorodeoxiuridina (FDUR),
o inibidor I de JAK, o PP1, a poli-l-ornitina (p-L-O), o HEPES, a penicillina G, o
sulfato de estreptomicina, a glutamina L, e o tetrahidrocloreto de 3,3’-
diaminobenzidina (DAB) foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Luis, USA). O
H89 (inibidor de PKA), a forscolina (ativadora da adenilil ciclase), o PD98059
(inibidor de MAPK),o LY294002 (inibidor de PI3K);U0126 (inibidor de MEK), o
inibidor de Jak1 (inibidor da via JAK-STAT) foram obtidos da Calbiochem (USA). O
kit peroxidase (HRP)-ABC foi obtido da Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA).
A tripsina foi obtida da Worthington Biochemical Co. (Freehold, NJ, USA). Os
anticorpos secundários foram obtidos da Cell Signalling (USA). A genisteína foi
obtida da RBI (Research Biochemicals Int. Natick, MA, USA). O K-252a, a brefeldina
A, o cloreto de queleritrina (ChCl), SB239063, SB203580, e SP600125 foram obtidos
da Biomol (PA, USA). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Dulbecco's
modified Eagle medium) e o soro fetal bovino (FCS, fetal calf seerum) foram obtidos
da GIBCO (BRL). [metil-
3
H]-timidina (atividade específica, 47,0 Ci/mmol) e o kit ECL
Plus foram obtidos da Amersham Int. Plc. (Buckinghamshire, UK). As placas Petri
(35mm) foram obtidas de Corning (NY, USA). O entelan foi obtido da Merck
(USA).Todos os outros reagentes utilizados foram obtidos a partir de fornecedores
de escala analítica.
3.2 TRATAMENTO EXPERIMENTAL
Os tratamentos das culturas de explantes feitos com as drogas ou com os
anticorpos de bloqueio foram feitos 1 hora antes do período de incubação das
culturas.
3.2.1 CULTURA DE MONOCAMADA
As culturas primárias de células retinianas foram preparadas utilizando os
procedimentos previamente descritos (Sholl-Franco et al., 2000). Primeiramente,
camundongos C57bl/6 neonatos (dia pós-natal 0, P0) foram sacrificados por
decaptação, e os globos oculares são acumulados em uma solução salina sem
cálcio e sem magnésio (CMF, composta por: NaCl -131,0 mM; KCl - 4,09 mM;
Na
2
HPO
4
- 0,92 mM; KH
2
PO
4
- 0,45 mM; NaHCO
3
- 9,4 mM; Glicose - 12,2 mM). As
retinas são dissecadas em CMF e, livres do epitélio pigmentado, transferidas para
um tubo de ensaio contendo CMF. A dissociação das células foi realizada, primeira-
mente, com tripsina (Worthington, USA) na concentração de 0.05% por aproxima-
damente 20 min, a 37°C. Após o período de tratamento enzimático, adiciona-se o
meio de cultura completo que consiste de BME suplementado com 2 mM de
glutamina L , 100 µg/mL de sulfato de streptomicina, 100 U/mL de penicilina G, 20
mM de HEPES e 5% de soro fetal bovino (FCS). Em seguida, as preparações eram
lavadas duas vezes com meio de cultura completo. Finalizando o processo de
dissociação, passavam-se os tecidos de 20 a 30 vezes através de uma pipeta
Pasteur de ponta afilada. Este processo de trituração fornecia uma suspensão
homogênea de células. Após contagem, em um hemocitômetro, o número de células
contidas na suspensão era estimado. Em seguida, procede-se à diluição desejada.
A densidade de plaqueamento utilizada nos diferentes experimentos foi de 1,0
x 10
5
células por cm
2
da placa de Petri. O plaqueamento das células foi feito em
placas de Petri de 35mm previamente tratadas com poli-l-ornitina (50 µg/mL) em um
volume de 1,0 ml. O volume final de 2,0 ml foi obtido pela adição de meio de cultura
controle ou experimental, conforme o caso. Esta adição foi realizada no momento do
plaqueamento, ou após um período de adesão que varia de 0 a 4 horas. As culturas
em monocamadas foram mantidas a 37°C em atmosfera de 5 % de CO
2
e 95 % de
ar, por períodos de tempo que variam conforme o experimento. Trocas de meio de
cultura controle ou experimental eram realizadas a cada 3 dias.
3.2.2 CULTURA DE EXPLANTES DA RETINA
Camundongos C57bl/6 P0 foram sacrificados por decaptação, os olhos foram
rapidamente removidos e transferidos para uma placa de Petri contendo CMF. As
retinas foram dissecadas livres da esclera e do RPE e cortadas com auxílio de bisturi
(lâmina n
o
15), em explantes de aproximadamente 1mm
2
(Rehen et al., 1996) em
meio de cultura BME completo.Os explantes foram incubados por vários períodos de
tempo, a 37
o
C, em um agitador orbital na rotação de 80-90rpm, No período de
cultura, não foi relatada nenhuma mudança nem na estrutura geral e nem na
laminação do tecido retiniano, quando comparado com a retina in situ (para revisão
Linden et al., 1999), conforme constatado pela análise por coloração com vermelho
neutro (dado não mostrado).
3.2.3 CULTURA DE CÉLULAS DO BAÇO
As células do baço foram obtidas utilizando-se os procedimentos
modificados do protocolo previamente descrito por Sholl-Franco e colaboradores
(2000). Primeiramente, camundongos C57bl/6 adultos foram sacrificados por
anestesia profunda com clorofórmio, os baços foram removidos e suspensões
homogêneas do tecido foram preparadas através da passagem por uma malha
plástica (peneira de 50-gauge) em CMF. A suspensão otida foi centrifugada e
ressuspendida em meio de cultura (RPMI), para a seguir ser deixada em repouso,
por 1 hora, em placas de Petri plásticas (100mm) para permitir a adesão dos
macrófagos. A suspensão contendo as células não aderentes foi aspirada, lavada e
adicionada a frascos de cultura (75cm
2
) em uma densidade de plaqueamento de
10
7
células/mL, em meio de cultura completo (RPMI) suplementado com 25 µM de 2-
mercaptoetanol e 5µg/mL de concanavalina A (ConA). Os esplenócitos foram
incubados por aproximadamente 12 horas, a 37°C, em uma atmosfera de 5% CO
2
e
95% ar.
3.3 WESTERN BLOTS
Os extratos protéicos totais foram preparados a partir de células retinianas
mantidas em monocamada ou explantes por diferentes períodos de tempo em meio
de cultura controle ou tratado. Para a observação tanto de IL-4 quanto da IL-4Rα
foram utilizados vários extratos, descritos a seguir: extrato de tecidos adjacentes à
retina neural, que compreendem células da esclera, coróide e RPE obtidos de
camundongos P0 (identificados como E); extrato de retina neural, obtidos de
camundongos P0 (R); extrato de tecido cérebro-cortical total, obtido de
camundongos P0 (C); esplenócitos (células do baço) mantidas em cultura por 12 h
na presença de ConA (S).
Todos os extratos protéicos foram obtidos a partir da incubação de diferentes
tecidos ou células em PBS gelado por 5 min e posteriormente com tampão de lise
(20 mM Tris HCl, pH7,.4, 250 mM sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM
glicerofosfato de sódio, 50 mM fluoreto de sódio, 5 mM pirofosfato de sódio, 1%
Triton X-100, 1 mM ortovanadato de sódio, 1 mM benzamidina, 5g/mL leupeptina,
0,2 mM PMSF, 0,1% 2-mercaptoetanol), no gelo, por 5 min. Em seguida, as
preparações foram vortexadas e incubadas, no gelo, por 5 minutos adicionais. Este
procedimento foi repetido três vezes. A seguir, os extratos protéicos totais foram
submetidos a centrifugação e os sobrenadantes recolhidos e armazenados a -20º C.
A quantidade total de proteína contida nas amostras foram dosadas pelo método de
Lowry (Lowry et al., 1951), que usa o BSA como padrão.
Quantidades estipuladas de proteína (25 µg) das amostras foram aplicadas
nas colunas de um gel de acrilamida/bis-acrilamida (7,5% gel de corrida e 3,9%
stacking gel). O gel foi submetido a uma voltagem de 100V durante
aproximadamente 15 minutos (ou até que a proteína chegasse ao gel de corrida) e
150V por aproximadamente quarenta e cinco minutos em tampão de corrida. A
transferência da proteína do gel para a membrana de nitrocelulose aconteceu a uma
amperagem constante de 200mA, durante 90 minutos, em tampão de transferência.
A transferência foi verificada pela marcação da membrana com o vermelho de
Ponceau. Após esse procedimento, a membrana foi lavada três vezes, durante
quinze minutos cada, com TBS-T e depois incubada com BSA 5% em TBS-T por 1
hora e trinta minutos sob leve agitação, quando então foram adicionados os
anticorpos anti-rodopsina (Rho 4D2), anti-IL-4, anti-IL-4Rα, anti-ciclina D1, anti-
p27
kip1
ou anti-fosfo-Erk (p-Erk) overnight, a 4°C, também sob leve agitação. A
membrana foi novamente lavada com TBS-T, três vezes, de quinze minutos cada, e
incubadas com o anticorpo secundário IgG específico, conjugado a peroxidase de
raiz forte (HRP) em leite integral (molico) 5%, em TBS-T, por duas horas, a
temperatura ambiente. Lavou-se novamente a membrana por três vezes de quinze
minutos com TBS-T e então a presença da atividade peroxidase na membrana foi
revelada utilizando-se ECL plus.
Para o reaproveitamento das membranas com o objetivo de incubação com
outros anticorpos, estas foram submetidas a um protocolo de stripping.
Resumidamente, elas eram lavadas com tampão tris-HCL (tris base + SDS + β-
mercaptoetanol, pH 6,7), por 30 minutos, a 56ºC, mexendo ocasionalmente. Lavou-
se a membrana com TBS-T e recomeçou-se o blotting incubando a membrana com
o anticorpo primário anti-Erk2 (1:3000) ou anti-actina (1:2000) e secundário IgG de
cabra contra coelho acoplado a HRP (1:4000) repetindo-se todo o processo já
descrito anteriormente.
3.4 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS
3.4.1 CRIOPRESERVAÇÃO E REALIZAÇÃO DOS CORTES DOS EXPLANTES
DA RETINA E DO GLOBO OCULAR.
Os explantes de retina foram fixados por imersão em paraformaldeído 4%
diluído em tampão fosfato, 0,1M, pH 7,4, por 1h. Em seguida foi realizada lavagem
dos mesmos em tampão fosfato, 0,1M, pH 7,4 e armazenagem a 4ºC. Vinte e quatro
horas antes da realização dos cortes, o tecido foi imerso em solução de sacarose
30% no mesmo tampão, a fim de conferir ao tecido crioproteção, impedindo sua
destruição pelo congelamento. Os explantes foram orientados transversalmente em
orientadores de explantes (Rehen et al., 1996), os quais já estavam preenchidos
com meio inerte para inclusão (OCT). Posteriormente foram congelados em
nitrogênio líquido e cortados na espessura de 10µm. Os cortes obtidos foram
recolhidos em lâminas previamente tratadas com poli-L-lisina (200µg/mL), com o
objetivo de facilitar a aderência dos mesmos.
Para a obtenção dos cortes de olhos inteiros os camundongos P0 foram
sacrificados por decaptação, enquanto animais P14 e P60 (adultos) foram
anestesiados e perfundidos com solução salina seguida de solução de para-
formaldeído a 4%. Todos os globos oculares foram fixados, ou no caso de P14 e de
P30 pós-fixados por imersão em paraformaldeído 4% diluído em tampão fosfato,
0,1M, pH 7,4, por 2h. Em seguida foi realizada lavagem dos mesmos em tampão
fosfato, 0,1M, pH 7,4 e armazenagem a 4ºC. Vinte e quatro horas antes da
realização dos cortes, o tecido foi imerso em solução de sacarose 30% no mesmo
tampão, a fim de conferir ao tecido crioproteção, impedindo sua destruição pelo
congelamento. Os globos oculares foram orientados transversalmente em
orientadores de olhos, previamente preenchidos com OCT, e posteriormente
congelados em nitrogênio líquido e cortados coronalmente na espessura de 10µm.
Os cortes obtidos foram recolhidos em lâminas previamente tratadas com poli-L-
lisina (200µg/mL), com o objetivo de facilitar a aderência dos mesmos e mantidos à -
20 ºC.
3.4.2 IMUNOHISTOQUÍMICA
PARA RODOPSINA
Para a imunodetecção dos fotorreceptores bastonetes as lâminas foram
lavadas, por 3 vezes de 5min, em uma salina tamponada com fosfato (PBS), 0.1M,
pH 7,4. Logo após, os cortes foram permeabilizados por incubação com Triton X-100
(0,5%) em PBS, por 15min. As preparações foram novamente lavadas por 3 vezes
de 5 min com PBS e, em seguida, bloquearam-se os sítios de ligação não
específicos pela incubação com albumina de soro bovino (BSA) 1% em PBS (PBS-
BSA 1%), por 30min. A próxima etapa consistiu em incubar os cortes com o
anticorpo monoclonal Rho 4D2 (1:200) (Molday, 1989), diluído em PBS-BSA 1%, a
37
ο
C, em câmara úmida overnight. Após esta incubação as preparações foram
lavadas em PBS, incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo
(1:200), diluído em PBS-BSA 1%, por 30min, a 37
ο
C. Ao final do período de
incubação, foram realizadas 3 lavagens de 5 min com PBS, seguidas pela
incubação com os reagentes A + B (kit ABC de peroxidase), por 30min, à
temperatura ambiente, seguida por 3 lavagens de 5 min em PBS. A revelação da
peroxidase, para visualização das células positivas para rodopsina (Rho 4D2
+
), foi
realizada por incubação com o cromógeno DAB, que na presença dessa enzima e
do peróxido de hidrogênio presente na solução, forma um precipitado marrom.
Controles negativos para a reação de imunohistoquímica foram obtidos pela
substituição do anticorpo primário pela incubação apenas com PBS-BSA 1%. Os
cortes foram analisados (Microscópio Axiophot, Nikkon) em um aumento de 1000x e
fotografados digitalmente (Câmera Nikkon) em microscopia óptica convencional.
PARA IL-4Rα (IMUNOHISTOQUÍMICA DE FLUORESCÊNCIA)
Para a imunodetecção de IL-4Rα as lâminas foram lavadas, por 3 vezes de
5min, em uma salina tamponada com fosfato (PBS), 0,1M, pH 7,4, e em seguida,
bloqueou-se os sítios de ligação não específicos pela incubação com albumina de
soro bovino (BSA) 1% em PBS (PBS-BSA 1%), por 30min. A próxima etapa consistiu
em incubar os cortes com o anticorpo primário policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα)
(1:200), diluído em PBS-BSA 1%, a 4
ο
C, em câmara úmida overnight. Após esta
incubação as preparações foram lavadas por três vezes de 5 min em PBS, e em
seguida incubadas com anticorpo secundário fluorescente Alexa 488 verde (1:200),
diluído em PBS-BSA 1%, por 2 horas, em câmara úmida, a temperatura ambiente,
protegidas da luz. Ao final do período de incubação, foram realizadas 3 lavagens de
5 min com PBS, seguidas pela incubação com DAPI (intercalante de DNA; cor azul),
por 30 segundos, à temperatura ambiente, seguida por 3 lavagens consecutivas de
PBS. Finalmente, as lâminas foram montadas em meio de montagem para
fluorescência (n-propilgalato em glicerol 80%) e conservadas a 4 °C, protegidas da
luz.
Controles negativos para a reação de imunohistoquímica foram obtidos pela
substituição do anticorpo primário pela incubação apenas com PBS-BSA 1%. Os
cortes foram analisados (Microscópio Axiophot, Nikkon) em um aumento de 1000x e
fotografados digitalmente (Câmera Nikkon) em microscopia óptica convencional de
fluorescência.
3.4.3 COLORAÇÃO COM VERMELHO NEUTRO
As lâminas foram inicialmente lavadas, por 2min, em uma solução de tampão
acetado 5% , pH 3,3. A próxima etapa consistiu em incubar as lâminas em solução
de vermelho neutro por aproximadamente 10 seg. Ao final desse período as lâminas
foram lavadas com o mesmo tampão inicialmente utilizado, por duas vezes. A seguir,
as preparações foram colocadas para secar, em temperatura ambiente por um dia.
Para a montagem, as lâminas foram seqüencialmente incubadas em álcool absoluto,
por 5s, e em Xilol, por 5 min. As preparações foram montadas com lamínulas
utilizando-se entelan como meio de montagem.
3.5 INCORPORAÇÃO DE [H
3
]-TIMIDINA
A incorporação de timidina foi realizada em culturas (explantes e
monocamadas) de retina, realizadas como descrito no item 3.2 Resumidamente,
uma hora antes do final de cada experimento, as culturas (monocamada ou
explantes) foram lavadas por duas vezes com BME sem FCS, a 37
o
C e então
incubadas com 0,5µCi/mL de [metil-
3
H]-timidina, em 1mL do mesmo meio por mais
1h, a 37
o
C, em atmosfera umidificada. Em seguida as culturas foram lavadas quatro
vezes, com meio sem FCS, a 37 ºC para a retirada do excesso de [metil-
3
H]-timidina
não incorporada. Seqüencialmente, o meio de cultura foi retirado, sendo adicionado
200µL/poço de NaOH 0,4N, por 15min. O conteúdo de cada poço foi raspado e
transferido para tubos de vidro, acondicionados sobre gelo, junto com 3mL de água
(MILIQ). A cada tubo foi adicionado 300µL de TCA 100%, seguida por uma
incubação de 30min. As amostras foram passadas por filtros Whatman GF/B sob
pressão negativa, gerada por uma bomba de sucção, onde o excesso de
radioatividade não incorporado no DNA foi retirado. Os tubos de vidro onde estavam
as amostras foram lavados com 2mL de TCA 5%, por três vezes. Em seguida, os
filtros foram submetidos à secagem a 100
o
C, por 30 min, e transferidos para frascos
de cintilação com solução de cintilação (5mL tolueno absoluto acrescido de 2,5-
difenil-oxazol 0,4%). A contagem da radioatividade presente nas amostras foi feita
em um contador de cintilação líquida e corrigida segundo a quantidade de proteína
presente em cada amostra, dosada de acordo com o método de Lowry e
colaboradores (1951).
3.6 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS INTRACELULARES DE AMPc
Os níveis intracelulares de AMPc foram quantificados de acordo com uma
modificação do método competitivo de ligação de Gilman (1970), descrito
previamente por Varella e colaboradores (1999). Explantes de retinas, obtidos como
descrito no item 3.2, foram deixados em repouso na presença de DMEM, a 37
ο
C,
por 30 min. A seguir, os tecidos foram pré-incubados por 15 min, a 37
ο
C, em DMEM
contendo isobutilmetilxantina (inibidor de fosfodiesterase) 0,5 mM e ácido ascórbico
100 µM, e estimulados com IL-4 ou forscolina, sendo esta última utilizada como um
controle positivo, por ser um agente capaz de aumentar os níveis de AMPc
intracelular pela ativação direta da adenilil ciclase. Após períodos estabelecidos de
incubação, a reação foi interrompida pela adição de TCA na concentração final de
5%. O sobrenadante foi transferido para um tubo e congelado até a etapa seguinte.
Posteriormente, as amostras foram descongeladas e centrifugadas a 15.000
rpm por 20-30 min; o sobrenadante foi recolhido e submetido a uma coluna de troca
iônica previamente tratada (resina DOWEX 50) para que o TCA e outros
nucleotídeos fossem eliminados; o pellet foi ressuspendido em 0,5mL NaOH 1N e
posteriormente utilizado para dosagem de proteína pelo método de Lowry (Lowry et
al., 1951).
As frações obtidas, a partir da passagem do sobrenadante pelas colunas, e
que continham as maiores quantidades do traçador [
3
H]-AMPc, por grupo
experimental, foram determinadas e submetidas a um ensaio competitivo para a
determinação da quantidade de AMPc endógeno. Para isso, as amostras foram
incubadas com PKA e [
3
H]-AMPc, na presença de 50 mM de acetato de sódio, pH
4,0, por 100 minutos, a 4ºC. Ao término da incubação a reação foi interrompida com
200 mM de tampão fosfato, pH 6,0. Nesse momento, as amostras foram filtradas, em
pressão negativa, em filtros Millipore, com o auxílio de um aparato Kitasato. Após a
secagem dos filtros por 30 min, a 100 ºC, os mesmos foram colocados em frascos
de cintilação contendo líquido de cintilação para quantificação da radioatividade
referente ao [
3
H]-AMPc presente em cada amostra em um contador de cintilação
líquida. Os valores obtidos foram corrigidos conforme a quantidade de proteína
presente.
3.7 ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS Rho 4D2
+
A análise de células Rho 4D2
+
foi feitas em seções de grupos de células
presentes nas culturas de monocamada distribuídos randomicamente dentro dos
grupos experimentais. Em todos os casos, foi tido cuidado em se distinguir o que era
marcação inespecífica ou de fundo (background) e o que era realmente marcação
para DAB. Nos experimentos apresentados não houve nenhuma diferença
significativa nas taxas de morte celular (verificado por análise de núcleos com perfis
picnóticos em coloração com vermelho neutro ou por marcação nuclear com DAPI).
Pelo menos 27 campos de pelo menos 3 lamínulas por grupo experimental foram
contados em cada ponto experimental, usando o microscópio Zeiss na magnificação
de 1000x, em campo claro.
3.8 APRESENTAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM)
de um mínimo de três experimentos realizados, pelo menos, em triplicata. A
significância estatística foi inicialmente obtida pela análise de variância em uma via
(one-way ANOVA) e a comparação dos múltiplos grupos foi obtida pelo teste de
comparação Newman–Keuls (Programa GraphPad Prism 4.00 for Windows
GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Os valores estatísticos considerados
foram aqueles com valores de p inferiores a 0,05 (p<0,05) ou inferiores a 0,001
(p<0,001).
4. RESULTADOS
O conjunto dos resultados apresentados nesta dissertação compõem o
Manuscrito (Anexo I) intitulado: “interleukin-4 blocks proliferation of retinal
progenitor cells and increases rod photoreceptor differentiation through
distinct signaling pathways” submetido ao Journal of Neuroimmunology
(Manuscript ID: JNI-S-07-00552; Status: aceito).
4.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR DE IL-4 (IL-
4Rα) NO TECIDO RETINIANO.
Muitos trabalhos vêm descrevendo a expressão de diversos fatores de
crescimento e de seus receptores, os quais por sua vez desempenham papéis
importantes durante o desenvolvimento, na retina neural e no RPE (Tanihara et al.,
1997). Entretanto, apesar de várias ações para a IL-4 já terem sido descritas na
retina (Sholl-Franco et al., 2001a, 2001b, 2002; Koeberle et al., 2004), a presença
constitutiva ou induzida desta molécula ou da subunidade específica do seu receptor
ainda não foram descritas neste tecido até o presente momento. Sendo assim,
procuramos, primeiramente, avaliar se a IL-4 e a subunidade IL-4Rα estariam
presentes em células da retina neural e no tecido não-neural adjacente à retina.
Os resultados presentes na figura 12 mostram que a IL-4 encontra-se
presente abundantemente no tecido não neural adjacente à retina (células do RPE,
coróide e esclera), assim como em esplenócitos estimulados com concavalina A
(controle positivo). Na retina neural, entretanto, a quantidade de IL-4 presente foi
muito baixa, o que levanta a hipótese desta citocina ser predominantemente
secretada pelo RPE nesta idade do desenvolvimento (P0). Além disso, não foi
possível a detecção da IL-4, por imunohistoquímica, em células neurais retinianas
(dados não mostrados). Extratos de tecido córtico-cerebral foram utilizados como
controle negativo para a presença de IL-4 no SNC (Figura 12).
A subunidade α do IL-4R, diferentemente da molécula de IL-4, foi encontrada
abundantemente tanto na retina não neural (células do RPE, coróide e esclera),
quanto na retina neural (Figura 13). O IL-4Rα também estava presente em extratos
das células do baço (esplenócitos estimulados com concavalina A, controle positivo)
e ausente nos extratos de tecido córtico-cerebral (controle negativo; Figura 13).
Figura 12 – IL-4 é expressa na retina e no tecido ocular adjacente não neural. A,
diferentes extratos protéicos foram avaliados por western blot com um anticorpo
policlonal contra IL-4 (painel superior) e então re-avaliados com um anticorpo contra
actina, proteína constitutiva (painel inferior). E, extrato de proteína de tecidos não-
neurais adjacentes à retina (epitélio pigmentado da retina, RPE; coróide; esclera); R,
extrato protéico de retina neural; C, extrato protéico de tecido córtico-cerebral; S,
extrato protéico de esplenócitos (células do baço) estimulados com concavalina A
por 12 horas. B, análise de densidade óptica relativa (densitometria) de três western
blots diferentes, comparando a expressão de IL-4 normalizada com a expressão de
actina. Os valores estão expressos como média ± SEM de três experimentos
independentes.
actina
18 KDa
43 KDa
E R C S
IL-4
A
ERCS
0
1
2
3
4
5
Densidade Óptica Relativa
B
Figura 13 – IL-4Rα é abundantemente expressa na retina e no tecido ocular
adjacente não neural. A, Diferentes extratos protéicos avaliados por western blot
com um anticorpo policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα) (painel superior) e então re-
avaliados com um anticorpo contra actina, proteína constitutiva (painel inferior). E,
extrato de proteína de tecidos não-neurais adjacentes à retina (epitélio pigmentado
da retina, RPE; coróide; esclera); R, extrato protéico de retina neural; C, extrato
protéico de tecido córtico-cerebral; S, extrato protéico de esplenócitos (células do
baço) estimulados com concavalina A por 12 horas. B, análise de densidade óptica
relativa (densitometria) de três western blots diferentes, comparando a expressão de
IL-4Rα normalizada com a expressão de actina. Os valores estão expressos como
média ± SEM de três experimentos independentes.
ERCS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Densidade Óptica Relativa
B
A
140KDa
43KDa
E R C S
IL-4R
α
actina
Adicionalmente, devido a sua forte expressão na retina neural, fez-se uma
análise, por imunohistoquímica, da localização e distribuição do IL-4Rα no tecido
retiniano. Foram utilizadas retinas em três estágios do desenvolvimento pós-natal:
P0, P14 e P60 (adulto). A detecção de IL-4Rα foi analisada por imunofluorescência,
usando um anticorpo primário policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα) e marcação
nuclear com DAPI (intercalante de DNA, em azul). Controles foram realizados com a
omissão do anticorpo primário de modo a se evitar a presença de marcação
inespecífica com os anticorpos secundários. Nossos resultados mostram que o IL-
4Rα encontra-se expresso em todas as camadas da retina pós-natal P0 (Figura 14
A-D), assim como na retina não neural, embora a marcação na camada plexiforme
interna (IPL) tenha se mostrado mais intensa.
No momento da abertura dos olhos, aproximadamente na segunda semana
de vida (P14), a marcação para IL-4Rα se mostrou mais intensa nos segmentos
externos dos fotorreceptores. Entretanto, a marcação para o IL-4Rα pode ser
claramente vista nos corpos celulares de fotorreceptores (ONL; Figura 14 E-G). A
marcação para o IL-4Rα também está presente nas camadas plexiformes (IPL e
OPL), exibindo um padrão consistente com o de processos de células de Muller. Em
adultos, a expressão do IL-4Rα foi observada predominantemente nos segmentos
externos dos fotorreceptores, podendo ser observada em um número restrito de
células na INL, apresentando morfologia semelhante à de células horizontais (Figura
14 I-L).
Figura 14 – Imunolocalização de IL-4Rα em diferentes estágios do
desenvolvimento retiniano pós-natal. Imagens de imunohistoquímica de
fluorescência de retinas de camundongos P0 (A, B, C, D), P14 (E, F, G, H), adulto (I,
J, K, L). Seções ópticas de microscopia óptica de contraste de fase (A, E, I); DAPI (B,
F, J; azul); imunomarcação para IL-4Rα (C, G, K; green) e a sobreposição (D, H, L).
Escala no canto inferior correspondente a 50 µm. Sc, esclera; PE, epitélio pigmentado;
OS,segmentos externos; ONL, camada nuclear externa; OPL, camada plexiforme
externa; NBL, camada neuroblástica; INL, camada nuclear interna; IPL, camada
plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares.
4.2 IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS EM
RETINAS P0
Com o objetivo de verificar se a ação da IL-4 nas células retinianas estaria
relacionada ao controle de células precursoras retinianas em proliferação,
analisamos se esta citocina regularia a proliferação nestas células e comparamos o
seu efeito com aquele obtido com o uso da forscolina, um agente farmacológico
capaz de aumentar os níveis intracelulares de AMPc e de modular a proliferação de
células retinianas in vitro através, da ativação da PKA (Stork e Schmitt, 2002;
Fogarty et al., 2007).
Culturas de células da retina, obtidas de camundongos P0, foram pré-
incubadas por 30 min com 1µM de H89, um inibidor de PKA. Em seguida, foram
tratadas com forscolina e/ou IL-4, e então mantidas por 3 dias in vitro (DIV). Na
última hora, as culturas foram submetidas ao ensaio de incorporação de [
3
H]-
timidina. Os resultados demonstram que tanto a IL-4 quanto a forscolina (50µM)
bloquearam em ∼40% a incorporação de [
3
H]-timidina das células retinianas no
período estudado (Figura 15). O tratamento das culturas com o H-89 bloqueou
completamente o efeito anti-proliferativo da IL-4, assim como aquele induzido pela
forscolina, indicando, assim, que a atividade de PKA está envolvida no efeito anti-
proliferativo da IL-4. Adicionalmente, não foi observado nenhum efeito aditivo
quando tratamos as culturas concomitantemente com IL-4 e forscolina.
Figura 15 – A IL-4 reduz a proliferação de células da retina através da atividade
da PKA. Células da retina mantidas em cultura foram pré-incubadas por 30 min com
1µM H89, um inibidor de PKA, e então tratadas com a forscolina e/ou IL-4 e
mantidas por 3 dias in vitro. Na última hora as culturas foram submetidas ao ensaio
de incorporação de [
3
H]-timidina. Os valores da [
3
H]-timidina foram normalizados e
expressos como porcentagem em relação ao grupo controle (100% control =
3,820.87 ± 176,32 cpm/mg protein). Os valores estão expressos como média ± SEM
de três experimentos independentes feitos em triplicata * p < 0.001 vs controle
(culturas não tratadas).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
5.0 U/mL IL-4
- + - + - + - +
*
*
*
*
*
50 µM Forscolina
- - + + - - + +
1µM H-89
- - - - + + + +
Incorporação de [H
3
]-Timidina
(% do controle)
4.2.1 IL-4 AUMENTA OS NÍVEIS INTRACELULARES DE AMPc EM RETINAS P0
A atividade da PKA tem sido relacionada ao processo de interrupção do
estado proliferativo e o inicio da diferenciação em vários tipos celulares, sempre de
modo dependente do aumento nos níveis citoplasmáticos de AMPc (Sherwood et al.,
2000; Stork e Schmitt, 2002; Fogarty et al., 2007). Em nosso resultado anterior, a
ação anti-proliferativa da IL-4 mostrou-se dependente da ativação de PKA, indicando
o envolvimento da IL-4 na produção de AMPc. Assim, explantes de retina de
camundongos P0 foram estimulados, por 30min, com IL-4 (em diferentes
concentrações) ou forscolina (50µM; controle positivo). Os resultados apresentados
na figura 16 mostram que a IL-4 aumenta, de maneira dose-dependente, os níveis
de AMPc intracelular, sendo este aumento na ordem de aproximadamente sete
vezes em relação ao controle. Desta forma, conclui-se que a ativação da PKA pela
IL-4, mimetizada pela forscolina, se dá a partir do aumento nos níveis
citoplasmáticos de AMPc, e que este mecanismo é o iniciador do efeito anti-
proliferativo de IL-4 nas células progenitoras.
Figura 16 – IL-4 aumenta os níveis intracelulares de AMPc. Avaliação dos níveis
citoplasmáticos de AMPc. Explantes de retina de camundongo P0 foram tratados
com IL-4 (0.1, 0.5, 5.0, 50 U/mL) ou com 50µM de forscolina por 10 min. A seguir o
tecido foi processado para a determinação da quantidade de AMPc acumulado
citoplasmaticamente. Os valores estão expressos como média ± SEM de quatro
experimentos independentes feitos em triplicata * p < 0.001 vs controle (culturas não
tratadas).
0
250
500
750
1000
1250
1500
IL-4 (U/mL)
- 0.1 0.5 5.0 50 -
*
*
*
*
*
Forscolina (µM)
- - - - - 50
Acúmulo de AMPc Intracelular
(pmol/mg de proteína)
4.2.2 IL-4 REGULA A EXPRESSÃO DE CICLINA D1 E DE p27
kip1
EM RETINAS P0
A Ciclina D1 é uma importante reguladora positiva do ciclo celular e, além
disso, está altamente expressa no período proliferativo da retina normal de
camundongos (Sicinski et al., 1995). Em contrapartida, a proteína p27
Kip1
, um inibidor
do ciclo celular encontra-se altamente expressa no período de saída dos
progenitores do ciclo celular, diminuindo drasticamente na retina madura (Levine et
al., 2000). Desta forma, a nossa proposta foi analisar se a regulação da proliferação
celular mediada pela IL-4, quantificada pelo ensaio de incorporação de [
3
H]-timidina,
estaria relacionada a modulação da expressão de p27
kip1
e de ciclina D1. Nossos
dados mostram que retinas P0 tratadas com 5.0 U/mL de IL-4 por diferentes
períodos de tempo (4 ou 8 horas) diminuem a expressão de ciclina D1 e aumentam
a expressão de p27
kip1
apenas após as primeiras 8 horas in vitro (figuras 17A-B),
sem que haja qualquer alteração nos níveis de incorporação de timidina (figura 18).
Alterações nos níveis de incorporação de timidina só foram observadas após as
primeiras 12 horas in vitro (dado não mostrado).
Figura 17 – IL-4 reduz a proliferação de precursores retinianos através da
modulação da expressão de ciclina D1 e de p27
kip1
. A, western blot de extratos
protéicos obtidos de células da retina de camundongos P0 tratados com 5.0 U/mL de
IL-4 por 4 ou 8 horas e depois avaliados com um anticorpo policlonal contra ciclina
D1 (painel superior) e então reavaliados com um anticorpo contra p27
kip1
(painel do
meio) e para a proteína constitutiva Erk2 (painel inferior). B, análise de densidade
óptica relativa (densitometria) de três westerns blots diferentes, comparando a o
efeito de IL-4 na modulação da expressão de ciclina D1 e de p27
kip1
com a
expressão normalizada de Erk2. Os valores são expressos como media ± SEM de
três experimentos independentes.
Ciclina D1
p27
kip1
A
44KDa
Erk 2
5.0U/mL IL-4
- + - +
4 h 8 h
CT IL-4 CT IL-4
0
25
50
75
100
125
150
175
*
*
4 horas
8 horas
Ciclina D1
p27
kip1
Densidade Óptica
(% do Controle)
B
Figura 18 – A IL-4 não altera a incorporação de [
3
H]-timidina nas primeiras 4 e 8
horas in vitro. As culturas foram tratadas com 5.0 U/mL de IL-4 e então mantidas
por 4 ou 8 horas em cultura. Na última hora as culturas foram submetidas a ensaio
de incorporação de [
3
H]-timidina. Os valores do ensaio de incorporação [
3
H]-timidina
foram normalizados e expressos como porcentagem do grupo controle (100%
controle 4 h = 3,283.62 cpm/mg protein). Os valores são expressos como media ±
SEM de três experimentos independentes feitos em triplicata em * p < 0.001 vs
controle (culturas não tratadas).
4.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES EM RETINAS P0
4.3.1 IL-4 AUMENTA A EXPRESSÃO E O NÚMERO DE CÉLULAS CONTENDO
RODOPSINA
A IL-4 tem sido descrita como um potente fator de diferenciação durante o
desenvolvimento das células retinianas (Sholl-Franco et al., 2001a, 2001b, 2002).
Aliado ao seu efeito anti-proliferativo, avaliamos se esta citocina apresentaria efeito
0
25
50
75
100
125
150
Controle
5.0 U/mL IL-4
4 horas
8 horas
Incorporação de [
3
H]-Timidina
(% do Controle de 4 horas)
sobre a diferenciação de fotorreceptores do tipo bastonete, a população mais
numerosa a se diferenciar neste estágio de desenvolvimento retiniano in vivo, uma
vez que a localização do IL-4Rα está presente nas células retinianas desde o
primeiro dia pós-natal até o animal adulto (Figura 14).
O número de células positivas para rodopsina (Rho 4D2
+
) foi avaliado quando
do tratamento com várias concentrações de IL-4 em explantes mantidos por 3 DIV.
As fotomicrografias presentes na figura 19 mostram que a IL-4 aumenta
significantemente o número de células Rho 4D2
+
em todas as concentrações
utilizadas (0,5; 5,0; 50 e 100 U/mL). Adicionalmente, a incubação de explantes de
retina com altas concentrações de IL-4, como 50 e 100U/mL (Figura 19 D-E) não
interferiu na estrutura celular retiniana ou no número de núcleos com perfis
picnóticos após coloração com vermelho neutro (dados não mostrados).
A análise quantitativa nesta preparação é dificultada devido a estrutura
compacta dos explantes. Desta forma, optou-se pelo uso de culturas em
monocamada para se quantificar o efeito da IL-4 (Figura 20A-D). Na figura 21
podemos observar que a IL-4 aumenta, de modo dose- e tempo- dependentes, o
número de células Rho 4D2
+
(Figuras 21A e 21D, respectivamente), assim como a
expressão de rodopsina (Figura 20E) ao longo do tempo em cultura. Este efeito não
foi reproduzido por outras citocinas, como no caso do tratamento com as IL-2 e IL-8
(Figuras 21 B-C).
Figura 19 – IL-4 aumenta o número de células Rho 4D2+ positivas.
Imunohistoquímica para rodopsina (anticorpo Rho 4D2) em seções transversais da
retina de camundongos P0 pós-natais mantidos por 3 dias in vitro: A, controle (não
estimulado); B, 0,5U/mL; C, 5,0 U/mL; D, 50 U/mL, e E, 100 U/mL de IL-4.
Representação esquemática das células retinianas e das camadas estão presentes
no topo a esquerda. pc, células fotorreceptoras; nc, células da neuroblástica; mc,
célula de Müller; ac, célula amácrina; gc, célula ganglionar; nbl, camada
neuroblástica; inl, camada nuclear interna; ipl, camada plexiforma interna; gcl,
camada de células ganglionares. Escala no canto inferior correspondente a 50µm.
nbl
ipl
gc
gc
ac
mc
nc
pc
inl
AB
C D E
Figura 20 – IL-4 aumenta o número de células positivas para Rho 4D2 em
culturas de monocamada e aumenta a expressão de rodopsina.
Fotomicrografias de células retinianas marcadas para rodopsina (A e C) ou com
DAPI (B e D) mantidas por 3 dias in vitro. A e B, controle; C e D tratadas com 5.0
U/mL de IL-4. E, exemplos de western blots de extratos totais de proteína de
monocamadas mantidas por 1 ou 3 dias in vitro (DIV) avaliadas com um anticorpo
policlonal contra rodopsina (Rho 4D2, painel superior) e então re-avaliados com um
anticorpo para a proteína constitutiva Erk2 (painel inferior). Escala no canto inferior
correspondente a 20µm.
A
B
C
D
CT
44
39
KD
IL-4 CT
IL-4
3 DIV1 DIV
Erk
Rho
E
Figura 21 – A IL-4, mas não a IL-2 e nem a IL-8, aumenta o número de células
positivas para Rho 4D2+ de maneira dose e tempo dependente. O número de
células Rho 4D2+ cells foi quantificado em culturas de monocamada mantidas por
diferentes tempos em cultura. A, B e C Curva dose resposta para IL-4, IL-2 e IL-8,
respectivamente. D, Análise temporal para IL-2, IL-4 e IL-8. Os valores são
expressos como média ± SEM de cinco experimentos independentes feitos em
triplicata. * p < 0.001 vs controle em A, B, C e em D vs respectivos tempos controle
em A, B, C.
B
0
50
100
150
200
250
300
IL-4 (U/mL)
- 0.1 0.5 1.0 5.0 50
*
*
*
*
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
A
0
25
50
75
100
125
150
IL-2 (U/mL)
- 0.5 5.0 50 100 200
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
C
0 1 2 3 4
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
CT
50 U/mL IL-2
20 ng/mL IL-8
50 U/mL IL-4
Dias in Vitro
Número de Células Rho 4D2
+
. 10
3
/mm
2
D
0
25
50
75
100
125
150
IL-8 (ng/mL)
- 0.2 2.0 20 100 200
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
4.3.2 O EFEITO DA IL-4 NA DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES É ESPECÍFICO
Diversos fatores de crescimento, como por exemplo o FGFb (Hicks e
Courtois, 1992) e o VEGF (Yourey et al., 2000), são conhecidos reguladores da
proliferação de precursores e diferenciação de fotorreceptores, assim como da
manutenção e sobrevida de células retinianas (Gauthier et al., 2005; Elliot et al.,
2006). Dessa forma, testamos se o efeito da IL-4 na diferenciação de bastonetes
poderia estar sendo mediado por fatores de crescimento liberados na cultura, tais
como o FGFb ou neurotrofinas. Interessantemente, nem a brefeldina-A (BFA), um
inibidor da secreção vesicular de peptídeos, nem o K252a, um inibidor da
sinalização do receptor de neutrofinas, assim como nem anticorpos bloqueadores
para o FGFb (anti-FGFb) bloquearam o efeito diferenciador da IL-4 (tabela 1).
Entretanto, uma redução significante no número de células Rho 4D2
+
foi
documentado nas culturas controles, quando estas foram tratadas com BFA (∼52.68
%), K252a (∼49.46 %), ou com anticorpos anti-FGFb (∼69.35 %), indicando assim a
importância da liberação constitutiva desses fatores de crescimento in vitro para a
expressão de rodopsina durante o processo de diferenciação de células fotorrecep-
toras.
Para confirmar o efeito específico da IL-4 na diferenciação de fotorreceptores,
culturas foram incubadas com um anticorpo de bloqueio para a subunidade IL-4Rα
(anti-IL-4Rα). A figura 22 mostra que o tratamento das culturas com concentrações
crescentes deste anticorpo (0,02-2,0 µg/mL), bloqueou em ~ 20% o número de
células Rho 4D2
+
nas culturas controle. Adicionalmente, a diluição de 2,0 µg/mL de
anti-IL-4Rα inibiu completamente o efeito estimulatório da IL-4.
Tabela 1 – O efeito da IL–4 na diferenciação de bastonetes é independente da
liberação de outros fatores de crescimento na cultura.
Controle 5.0 U/mL IL–4
Sem tratamento 100 265.42 ± 16.51*
30 ng/mL BFA 37.32 ± 4.89* 237.76 ± 21.72*
50 nM K252a 50.56 ± 2.45* 278.57 ± 10.05*
100 µM anti-bFGF
30.65 ± 1.65* 235.02 ± 20.51*
Número de células Rho 4D2+ em culturas mantidas por 3 dias in vitro (% do
controle). Cada valor representa a média ± SEM de três experimentos
independentes realizados em quadruplicata. * Significativamente diferente do
controle (100%, p<0.001).
Figura 22 – O efeito específico de IL-4 na diferenciação de fotorreceptores.
Culturas obtidas de camundongos P0 foram pré-incubadas por 30 minutos com
diferentes concentrações do anticorpo policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα)
(anticorpo de bloqueio) e então mantidas por 3 dias in vitro. Os valores são
expressos como média ± SEM de cinco experimentos independentes feitos em
triplicata p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).
0
50
100
150
200
250
300
*
*
- 0.002 0.02 0.2 2.0
*
*
Anti-IL-4R (µg/mL)
IL-4 + Anti-IL-4R (µg/mL)
*
*
*
*
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
4.3.3 A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES INDUZIDA POR IL-4 É
INDEPENDENTE DO SEU EFEITO ANTI-PROLIFERATIVO
Anteriormente (item 4.2) demonstramos que a ativação da PKA, promovida
pelo aumento nos níveis citoplasmáticos de AMPc, está relacionada ao efeito anti-
proliferativo mediado pala IL-4 (figura 15). De fato, a diferenciação de bastonetes em
nossas preparações poderia estar sendo promovida pela inibição do estado
proliferativo das células precursoras. Assim, buscamos avaliar se o tratamento com
a forscolina seria capaz de aumentar o número de células Rho 4D2
+
. O resultado
apresentado na figura 23 mostra que o aumento nos níveis citoplasmáticos de
AMPc, assim como a atividade de PKA, não estão relacionados com a diferenciação
de bastonetes mediada pela IL-4 in vitro. O tratamento das culturas com 1µM de
H89, um inibidor específico da atividade de PKA, não alterou o efeito da IL-4 no
número de células Rho 4D2
+
, embora tenha revertido a ação anti-proliferativa desta
citocina. Assim, estes resultados nos mostram que a via de sinalização AMPc-PKA é
ativada pela IL-4 para reduzir a proliferação de precursores na retina, mas não para
mediar a diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4. Adicionalmente, para
confirmar a desvinculação entre a inibição do estado prolliferativo do processo de
diferenciação induzido pela IL-4, realizamos o co-tratamento das culturas com 20µM
de fluorodeoxiuridina (FDUR), um inibidor de divisão celular. Nossos resultados
(tabela 2) mostram que o efeito da IL-4 não passa simplesmente pela inibição da
divisão celular na cultura.
Figura 23 – A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é
independente do seu efeito anti-proliferativo. O número de células positivas para
Rho 4D2+ foi quantificado em culturas de monocamada mantidas por 3 dias in vitro.
As culturas foram pré-incubadas por 30 min com 1µM de H89, inibidor da atividade
da PKA, e então tratadas com a forscolina e/ou com a IL-4. Os valores são
expressos como média ± SEM de três experimentos independentes feitos em
triplicata * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).
0
50
100
150
200
250
300
5.0 U/mL IL-4
- + - + - + - +
*
*
*
*
50 µM Forskolin
- - + + - - + +
1µM H-89
- - - - + + + +
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
4.3.4 A ATIVIDADE DAS PROTEÍNAS TIROSINAS CINASES, A FOSFORILAÇÃO
DE ERK E A ATIVIDADE DE PKC ESTÃO RELACIONADAS COM A
DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES INDUZIDA PELA IL-4
A transdução de sinais mediada pelo IL-4R envolve três principais vias de
sinalização conhecidas: JAK-STAT6, Raf-MEK-MAPK e PI3K-Akt (Nelms et al., 1999
para revisão). Desta forma, com a finalidade de caracterizar as vias de sinalização
envolvidas na diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 primeiramente
analisamos o envolvimento da via JAK-STAT, através do pré-tratamento das culturas
com 1 ou 5 nM do inibidor de JAK I, um potente inibidor das proteínas JAKs. Os
nossos resultados (tabela 2) mostram que a via clássica JAK3-STAT6 não está
envolvida no aumento no número de células Rho 4D2
+
. Ainda na tabela 2 pode-se
analisar que não há o envolvimento das proteínas tirosinas cinases associadas ao
receptor da família das Src (inibidas com 1 µM de PP1), da JNK e p38 MAPK
(inibidas com 20µM de SB239063, 10µM de SB203580 ou 20µM de SP600125) e da
PI3K (inibida com 25 µM de LY294002) no efeito da IL-4.
Tabela 2– O efeito da IL–4 na diferenciação de fotorreceptores é independente
da ativação das vias de JAK, Src, p38 e JNK.
Controle 5.0 U/mL IL–4
Sem tratamento 100 254.56 ± 12.34*
20 µM FDUR
110.45 ± 3.45 290.32 ± 22.42*
1 nM JAK inhibitor I 96.45 ± 7.56 256.04 ± 23.81*
5 nM JAK inhibitor I 101.20 ± 3.74 270.93 ± 45.52*
1 µM PP1
105.52 ± 2.50 258.54 ± 18.62*
20 µM SB239063
95.06 ± 3.67 260.30 ± 18.43*
10 µM SB203580
102.45 ± 4.34 255.89 ± 23.03*
20 µM SP600125
105.67 ± 10.34 240.92 ± 16.75*
25 µM LY294002
110.54 ± 9.45 234.59 ± 14.64*
Número de células Rho 4D2+ em culturas mantidas por 3 dias in vitro (% do
controle). Cada valor representa a média ± SEM de três experimentos
independentes realizados em quadruplicata. * Significativamente diferente do
controle (100%, p<0.001).
Na figura 24 podemos observar que 30 µM de genisteína, um inibidor não
específico da atividade tirosina cinase, inibiu totalmente o efeito da IL-4.
Adicionalmente, o tratamento com 1,25 µM de cloreto de queleritrina (ChCl), um
inibidor da atividade de PKC, mostrou que o aumento no número de células Rho
4D2
+
, induzido pela IL-4, é dependente desta via de sinalização (figura 25). Nossos
dados mostram ainda que o efeito da IL-4 na diferenciação de bastonetes é
dependente de atividade MAPK-Erk. Para se avaliar melhor este envolvimento,
realizamos o pré-tratamento das culturas com 50 µM de PD98059 ou com 20 µM de
U0126, inibidores da atividade da Erk e, em seguida, tratamos com a IL-4. Os
resultados presentes na figura 25 mostram que o número de células Rho 4D2
+
tanto
no controle, quanto nas culturas tratadas pela IL-4, depende da atividade de Erk, em
semelhança ao observado para a atividade da PKC.
Figura 24 – A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é dependente
da atividade das proteínas tirosina cinase. O número de células Rho 4D2+ foi
quantificado em culturas de monocamada mantidas por 3 dias in vitro. As culturas
foram pré-incubadas por 30 minutos com 30µM de genisteína, um inibidor das
proteínas tirosinas cinases, e então tratadas com IL-4. Os valores estão expressos
como média ± SEM de quatro experimentos feitos em triplicata. * p < 0.001 vs
controle (culturas não tratadas).
0
50
100
150
200
250
300
5.0 U/mL IL-4
-
*
*
+
*
30 µM genisteina
+
+
+--
-
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
Figura 25 – A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é dependente
da atividade de Erk e de PKC. O número de células Rho 4D2+ foi quantificado em
culturas de monocamada mantidas por 3 dias in vitro. Culturas foram pré-incubadas
por 30 com 1.25 µM de cloreto de queleritrina (ChCl), um inibidor de PKC, 50 µM de
PD98059, um inibidor de MAPK, ou 20 µM de U0126, um inibidor de Erk, e então
tratadas com IL-4. Os valores estão expressos como média ± SEM de quatro
experimentos independentes feitos em triplicata.. * p < 0.001 vs controle (culturas
não tratadas).
0
50
100
150
200
250
300
5.0 U/mL IL-4
-
*
*
*
*
50 µM PD98059
+
20 µM U0126
*
*
*
1.25 µM ChCl
+
+++
++
+
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Número de Células Rho 4D2
+
(% do Controle)
Uma vez que a ação da IL-4 mostrou-se dependente da atividade da Erk,
analisou-se, a seguir, o efeito da IL-4 nos níveis intracelulares de Erk1/2 fosforiladas.
Realmente, a IL-4 induz fosforilação de Erk1/2 de modo dose- e tempo-dependentes
em explantes de retina (Figura 26A). Verificamos que as retinas de animais P0,
quando estimuladas por 30 minutos com diferentes concentrações de IL-4 (0,5 U/mL;
5,0 U/mL; 50 U/mL; Figura 26A) apresentam um aumento significativo nos níveis de
fosforilação deste substrato. Adicionalmente, nossos resultados mostram que o
aumento na fosforilação de Erk1/2 obtido pela estimulação com 5,0 U/mL de IL-4 foi
bloqueado pelo pré-tratamento com PD98059, um inibidor da atividade MAPK
(Figura 26B).
Como os dados apresentados até o momento sobre a fosforilação de Erk1/2
referem-se ao tratamento de explantes recém-dissecados e os dados sobre a
diferenciação de bastonetes foram baseados em ensaios de monocamada,
buscamos verificar os níveis de Erk1/2 fosforiladas neste modelo. Outra questão a
ser respondida é como as vias da PKC e da Erk1/2 poderiam estar interagindo para
a produção no efeito observado. Assim, analisou-se a fosforilação de Erk1/2 em
culturas de monocamada estimuladas com IL-4 na presença de 50 µM de PD98059
ou de 1,25 µM de ChCl. Os resultados presentes na figura 26C mostram que o
aumento na fosforilação de Erk1/2, induzida pela manutenção de culturas com 5,0
U/mL de IL-4, por 30 min é dependente da atividade da PKC e de MAPK, sugerindo
assim que a ativação de PKC esteja upstream à fosforilação de Erk1/2, em nossa
preparação.
Figura 26 – A fosforilação de Erk induzida pela IL-4 é dependente da atividade
de PKC. Western blot representativos obtidos a partir de extratos proteicos de
explantes de retina P0 (A, B) ou de monocamadas mantidas por 4 horas in vitro (C)
avaliadas com o uso de um anticorpo contra phospho-Erk1/2 (p-Erk1/2, painéis
superiores) e posteriormente re-avaliados para a quantidade total de Erk2 (painéis
inferiores). A, tecido incubado por 30 min com diferentes concentrações de IL-4 (0,5;
5,0 ou 50 U/mL) ou com a concentração fixa de 5,0 U/mL IL-4 por diferentes
períodos de tempo (5, 15, 30 ou 60 min); B, tecido retiniano foi pré-tratado por 30
min com 50 µM PD98059, um inibidor de MAPK, e depois com ou sem 5,0 U/mL IL-
4 por adicionais 30 min. C, monocamadas de células retinianas foram pré-incubadas
com 1,25 µM de cloreto de queleritrina (ChCl), um inibidor da PKC, or 50 µM
PD98059, um inibidor da MAPK, e depois incubadas por mais 30 min com 0,5 U/mL
IL-4.
B
50 µM PD98059
5U/mL IL4
- +
+ +
- -
- +
pErk1/2
44KDa
Erk 2
5U/mL IL4
50 µM PD98059
-
1.25 µM ChCl
+
+ +
+
- -
-
- - -
- + +
+
-
-
-
pErk1/2
44KDa
Erk 2
C
pErk1/2
44KDa
Erk 2
IL4 (U/mL)
CT 0.5 5.0 50
A
min
0 5 15 30 60
IL4 (5U/mL)
5. DISCUSSÃO
A descrição de diferentes citocinas como importantes mediadores entre
células dos sistemas imune e nervoso permitiu a consolidação de várias linhas de
pesquisa visando a caracterização dos mecanismos de interação entre estes
sistemas e a compreensão dos diferentes eventos-chave observados durante o
desenvolvimento ou quando da presença de quadros traumáticos, inflamatórios ou
degenerativos (Mehler e Kessler, 1997; Dantzer et al., 2000; Dantzer, 2004; Gao e
Miller, 2006; Murphy e Saravanapavan, 2006; Owens et al., 2006).
O papel da IL-4 no SNC e em particular sobre diferentes populações celulares
retinianas tem sido explorado nos últimos anos. Em 2001, Sholl-Franco e
colaboradores (2001a) mostraram que a IL-4 aumenta a sobrevida de células
ganglionares de ratos neonatos axotomizadas durante o desenvolvimento, estudo
que foi ampliado por Koeberle e colaboradores (2004), a partir de experimentos in
vivo utilizando-se da técnica de transferência gênica de IL-4 e o uso de vetores virais
diretamente na retina ou nos colículos superiores. Além disso, esta citocina se
mostrou importante para a diferenciação in vitro de células amácrinas colinérgicas e
GABAérgicas na retina de ratos em desenvolvimento (Sholl-Franco et al., 2001b,
2002). Recentemente, foi demonstrado por Adão-Novaes (2007) que a IL-4 pode
agir sobre outra população retiniana específica, a de fotorreceptores, bloqueando
sua morte em um modelo de indução de morte por tapsigargina (Chiarini et al.,
2003). Este conjunto de dados mostra que vários tipos celulares retinianos são
responsivos a esta citocina, sem, contudo ter sido ainda descrita a presença dos
receptores ou a(s) possível(is) fonte(s) desta citocina no tecido retiniano. Os dados
apresentados nesta dissertação mostram, pela primeira vez, a presença do receptor
de alta afinidade para a IL-4 no tecido retiniano, assim como associa o RPE como
principal fonte fisiológica da IL-4 para o tecido retiniano. Outrossim, caracterizamos
mais dois papéis importantes para esta citocina durante o desenvolvimento pós-natal
na retina de camundongos: (i) a inibição da proliferação de células retinianas; (ii) o
aumento na expressão e no número de células imunorreativas para rodopsina.
5.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR DE IL-4 NO
TECIDO RETINIANO
A IL-4 pode se associar com dois complexos de receptores diferentes: o tipo I
e o tipo II. A ligação da IL-4 ao IL-4Rα induz a heterodimerização com o IL-2Rγ para
formar o receptor tipo I, enquanto a ligação da IL-4 ao complexo formado pelas
subunidades IL-4Rα e IL-13Rα
1
forma o receptor tipo II (Müeller et al., 2002; Kelly-
Welch et al., 2003). A subunidade IL-4Rα é a responsável pela associação direta e
com alta afinidade à molécula de IL-4 (Galizzi et al., 1990; Keegan e Pierce, 1994),
representando a parte funcional do complexo do receptor para as IL-4 e IL-13
(Müeller et al., 2002). Apenas em 2005, foi demonstrada a presença do IL-4Rα no
SNC. Nolan e colaboradores (2005) demonstraram a presença de receptores para
IL-4 em células granulares do giro denteado de ratos. Entretanto, não existem outros
dados consistentes sobre a localização específica do IL-4Rα em células neuronais
e/ou gliais em outras regiões do SNC até o presente momento (Sawada et al., 1993;
Brodie et al., 1998). A expressão constitutiva desta subunidade de receptor no SN é
questionada e a literatura apresenta-se inconsistente, principalmente no que se
refere aos estudos abordando o desenvolvimento. Ao olharmos para as outras
subunidades formadoras dos receptores tipos I ou II para IL-4 a situação fica mais
complicada, uma vez que não existem dados referentes à expressão de IL-13Rα
1
e
a expressão constitutiva do RNAm da subunidade de IL-2γc só foi demonstrada em
astrócitos não estimulados in vitro (Pousset et al., 1999), sendo ainda inexistentes
estudos que abordem a expressão desta subunidade em tecidos neurais in vivo.
Assim, registramos aqui a necessidade de ampliar o atual estudo, de forma a
explorar, no tecido retiniano neural e não-neural adjacente, a expressão das
subunidades IL-2γc e IL-13α
1
, assim como de outras subunidades para receptores
de citocinas.
Quanto ao tecido ocular, Fukuda e colaboradores (2002) demonstraram a
expressão do RNAm para os componentes do receptor tipo I e tipo II de IL-4: IL-
4Rα, IL-2Rγc, IL-13Rα
1
, e IL-13Rα
2
em culturas de fibroblastos da córnea humana.
Adicionalmente, estes mesmos autores mostraram que a expressão das proteínas
IL-4Rα e IL-2Rγc também estavam presentes na superfície dos fibroblastos da
córnea humana. De fato, nestas células a IL-4 pode atuar via ambos os receptores
tipos I e II (Kelly-Welch et al., 2003, 2005). No entanto, não há dados na literatura
sobre a expressão de qualquer um dos receptores para IL-4 no tecido retiniano ou
no tecido não neural adjacente à retina, assim como não há descrição sobre as
populações produtoras desta citocina, apesar de já terem sido descritos vários
papéis para esta citocina sobre populações neuronais retinianas distintas (Sholl-
Franco et al., 2001a, 2001b, 2002; Koeberle et al., 2004).
O conjunto dos resultados apresentados nesta dissertação mostram, pela
primeira vez, a expressão da molécula de IL-4 e da subunidade IL-4Rα na retina de
camundongos. Demonstramos que a IL-4 apresenta-se abundantemente expressa
no RPE, coróide e esclera de camundongos durante a fase inicial do
desenvolvimento pós-natal (P0; Figura 12). Na retina neural, entretanto, a
quantidade de IL-4 presente foi muito baixa (Figura 12) o que levanta a hipótese
desta citocina estar sendo predominantemente secretada pelo RPE nesta idade para
se difundir e atuar sobre as populações celulares retinianas, de modo semelhante ao
já descrito para o FGFb (Hicks e Courtois, 1992; Hicks et al., 1998). Este resultado,
entretanto, não exclui a possibilidade da IL-4 ter uma fonte celular retiniana.
Diferentemente da molécula de IL-4, a subunidade IL-4Rα foi encontrada
abundantemente na retina neural, assim como nos tecidos adjacentes não neurais
(Figura 13). A análise imunohistoquímica da expressão da IL-4Rα mostra que a
proteína está presente em todas as camadas da retina no primeiro dia pós-natal,
embora a marcação seja mais intensa na IPL. Com o decorrer do desenvolvimento,
quando da abertura dos olhos (P14), a marcação para IL-4Rα restringe-se mais aos
segmentos externos dos fotorreceptores. Todavia, pode ainda ser claramente vista
nos corpos celulares de fotorreceptores e nas regiões de contatos sinápticos (IPL e
OPL), indicando um padrão consistente com o de processos das células de Muller.
De fato, o soma das células de Müller está localizado na INL e seus prolongamentos
se estendem por todas as camadas da retina, desde a OL até a OS (Newman e
Reichenbach, 1996). O padrão adulto de expressão para a IL-4Rα mostra uma
restrição quase absoluta aos segmentos internos e externos dos fotorreceptores.
Sendo assim, podemos concluir que o padrão de distribuição da subunidade
IL-4Rα, acoplado aos efeitos da molécula IL-4 sobre o tecido retiniano descrito mais
adiante nesta dissertação, reforçam a proposta de que a IL-4 possa ser uma
importante molécula trófica derivada do RPE durante o desenvolvimento da retina
neural. Baseado no padrão de restrição de expressão do IL-4Rα no adulto, podemos
especular ainda que a IL-4 possa desempenhar um papel relevante na manuntenção
dos segmentos externos de bastonetes, embora outros experimentos precisem ser
desenvolvidos para corroborar tal idéia. Principalmente se levarmos em
consideração os resultados de Adão-Novaes (2007), que mostram ser a IL-4 capaz
de evitar a morte de bastonetes no modelo experimental de indução de morte de
bastonetes por tapsigargina (Chiarini et al., 2003), efeito esse que se mostrou
dependente da produção de AMPc, em animais com idade entre P6-P7.
5.2 IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS
Nesta dissertação mostramos que a IL-4 aumenta os níveis citoplasmáticos
de AMPc, do mesmo modo que já descrito em outros tipos celulares (Taieb et al.,
1991; Galea et al., 1993) e que este aumento está relacionado à inibição da
proliferação celular na retina. A IL-4 foi descrita inibindo a proliferação de células do
músculo liso vascular (Southgate e Newby, 1990; Oiso et al., 1993; Vadiveloo et al.,
1997) por uma via dependente do aumento de AMPc e outras evidências ainda
reforçam a relação existente entre o aumento nos níveis de AMPc, a inibição da
proliferação e o começo da diferenciação em vários tipos celulares através da
ativação da PKA (Sherwood et al., 2000; Stork e Schmitt, 2002; Fogarty et al., 2007).
Vários podem ser os efeitos mediados após o aumento nos níveis de AMPc
intracelular. Adão-Novaes (2007) mostrou que a ação neuroprotetora da IL-4 no
modelo de morte de fotoreceptores induzida por tapsigargina é dependente da
ativação do sistema AMPc/PKA e, ainda em 1993, Galéa e colaboradores
demonstraram que esta citocina aumenta a adesividade em células endoteliais
através da ativação da via dependente de AMPc.
É sabido que em roedores neonatos a vasta maioria das células proliferantes
eventualmente irão se diferenciar em fotorreceptores tipo bastonetes (Alexiades e
Cepko, 1996). No presente estudo, o aumento de AMPc citoplasmático e a ativação
de PKA reduziu significativamente a proliferação das células progenitoras retinianas.
Esta nossa análise difere daquela obtida em outros tipos celulares, nos quais a
ativação de PKA por AMPc está relacionada tanto na inibição da proliferação quanto
no aumento da diferenciação celular (Stork e Schmitt, 2002), uma vez que o AMPc
não promoveu a diferenciação de bastonetes como uma consequência da saída do
ciclo celular. Realmente, simplesmente bloquear a proliferação in vitro, quer seja
pelo aumento nos níveis de AMPc ou com o uso de um inibidor da divisão celular
(fluorodeoxiuridina, 20µM), não foi eficiente em induzir a diferenciação, por exemplo,
de bastonetes. Entretanto, não podemos afirmar se outros tipos celulares, como as
células horizontais, amácrinas, bipolares ou células de Muller não poderiam estar
sendo estimuladas a se diferenciar in vitro pelo aumento nos níveis de AMPc
induzido pela IL-4, uma vez que neste estágio de diferenciação o comprometimento
celular ainda está sendo estabelecido (Maslim e Stone, 1986; Araki et al., 1988; Holt
et al., 1988; Wetts e Fraser, 1989; Prada et al., 1991; Stiemke e Hollyfield, 1995;
Belecky-Adams et al., 1996; Cepko et al., 1996 Hu e Easter, 1999; Das et al., 2003).
A proliferação e a diferenciação dos progenitores são processos altamente
coordenados e regulados durante o desenvolvimento da retina. O ciclo celular é
precisamente controlado e possui vários pontos de checagem, dentre os quais o
ponto de restrição encontrado na etapa de transição das fases G1 e S tem recebido
maior atenção, pois é neste período que as células progenitoras saem do ciclo
celular para se diferenciarem. A transição da fase G1 para S é controlada por
proteínas chaves da maquinaria do ciclo celular como as ciclinas, CDKs (cinases
dependentes de ciclinas) e inibidores das CDKs (Dyer e Cepko, 2001, para revisão).
A Ciclina D1 é uma proteína chave para o controle da proliferação de RPC, sendo
que estas evidências em retinas de camundongos baseadas em animais knockouts
para ciclina D1, os quais apresentam uma redução considerável no número de
células em todas as camadas da retina neural devido à falha na proliferação dos
progenitores durante o desenvolvimento deste tecido. Nossos resultados mostram
que a IL-4 diminui a expressão desta ciclina, o que previne a entrada das células na
fase S (Resnitzky et al., 1994).
A expressão de p27
Kip1
em retinas de camundongos está correlacionada com
a saída do ciclo celular, tendo uma permanência restrita às células de Müller em
retinas de roedores adultos (Levine et al, 2000). Dentro desse contexto, Dyer e
Cepko (2001), demonstraram em retinas de camundongos que a superexpressão de
p27
Kip1
permite a saída prematura de progenitores retinianos do ciclo celular,
reforçando a nossa hipótese de que a IL-4 estaria regulando a proliferação de RPC
através da inibição da expressão de ciclina D1 e do aumento na expressão de
p27
Kip1
.
Em conclusão, podemos dizer que a IL-4 atua, nas céluas precursoras,
ativando a via de sinalização AMPc-PKA e modulando a expressão de duas
proteínas regulatórias chaves do ciclo celular, a ciclina D1 e o p27
kip1
, de forma a
promover seu efeito anti-proliferativo, como ilustrado no esquema da figura 27.
Figura 27 – Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove seu efeito anti-
proliferativo em células da retina de camundongos P0. A IL-4, através do
aumento nos níveis citoplasmáticos de AMPc e da ativação da PKA leva a
modulação nos níveis de expressão de ciclina D1 e p27
kip1
, proteínas responsáveis
pela diminuição na proliferação.
5.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES
A IL-4 tem sido descrita como uma citocina de ação pleiotrópica sobre várias
populações celulares em diferentes estágios da diferenciação celular (Banchereau et
al., 1994; Duschl e Sebald, 1996). No SN, em particular, a ação da IL-4 na
diferenciação fenotípica está mais bem descrita nas populações de células gliais,
onde ela é responsável por alterações morfológicas, acompanhadas pela indução da
expressão de GFAP e da enzima glutamina sintetase (Brodie e Goldreich, 1994).
Na retina, a IL-4 está relacionada com a diferenciação colinérgica e
GABAérgica (Sholl-Franco et al., 2001b; 2002), indicando seu importante papel
como molécula neuromoduladora durante o desenvolvimento deste tecido. Além
deste fato, a literatura atual não apresenta dados sobre interleucinas afetando a
proliferação e/ou diferenciação de fotorreceptores (Morrow et al., 1998; Liversey e
Cepko, 2001), pois o mais corrente na literatura é que estes fenômenos são
particularmente dependentes de fatores de crescimento clássicos derivados de
células não-neurais do epitélio pigmentar (Tanihara et al., 1997; Behling et al., 2002).
Alguns fatores já foram descritos como sendo importantes para o desenvolvimento
dos bastonetes, dentre os quais destacamos o bFGF, taurina e laminina-β 2 (Hicks e
Courtois, 1992; Hunter et al., 1992; Altshuler et al., 1993; Libby et al., 1996; Levine et
al., 1997). Ao contrário, o CNTF e o LIF apresentam papel inibitório sobre a
diferenciação de fotorreceptores de roedores, fazendo com que as células
destinadas a se tornar bastonetes passem a apresentar fenótipo de neurônios
bipolares (Ezzeddine et al.,1997). O GDNF também já foi descrito regulando o
desenvolvimento de fotorreceptores in vitro (Rothermel e Layer, 2003), onde,
dependendo do estágio de desenvolvimento pode influenciar a proliferação,
diferenciação e sobrevida dos bastonetes. Em adição, proteínas indian e sonic
hedgehog promovem a diferenciação de bastonetes a partir de RPC mantidos em
cultura (Levine et al., 1997).
Nesta dissertação mostramos que a IL-4 possui um efeito anti-proliferativo em
células progenitoras retinianas. Sabe-se que em roedores neonatos a vasta maioria
das células proliferantes irá se diferenciar em fotorreceptores tipo bastonetes
(Alexiades e Cepko, 1996). Dentro desse contexto, verificamos se esta citocina
apresentaria efeito sobre a diferenciação de fotorreceptores do tipo bastonete, a
população mais numerosa a se diferenciar neste estágio de desenvolvimento
retiniano in vivo (Morrow et al., 1998). O propósito desta busca foi ainda mais
estimulado por nossos resultados obtidos sobre o padrão temporal de localização de
IL-4Rα, que por sua vez indicava nitidamente justamente esta população de células
fotorreceptoras como possíveis alvos desde o primeiro dia pós-natal até o animal
adulto (figura 14).
Nossos dados mostram claramente que em explantes da retina a IL-4
aumenta significantemente o número de células Rho 4D2
+
. Demonstramos que a IL-
4 aumenta, de modo dose- e tempo- dependentes, o número de células Rho 4D2
+
em explantes ou em monocamadas. O efeito da IL-4 de aumentar a diferenciação de
bastonetes não foi mimetizado por IL-2 e nem por IL-8 (figura 21 B-C) o que de certa
forma é interessante porque tanto a IL-2 quanto a IL-8 são importantes reguladores
funcionais no SNC (Jiang e Lu, 1998; .Kadi et al., 2006). A IL-2 apresenta uma série
de ações sobre células neuronais, assim como muitas semelhanças quando
comparamos suas ações com as da IL-4 no tecido retiniano. Sholl-Franco e
colaboradores (2001a) demonstraram que ambas as citocinas apresentam efeito
neuroprotetor sobre células ganglionares da retina submetidas à axotomia.
Entretanto, embora o efeito da IL-2 pareça ser direto sobre as células ganglionares,
a ação de IL-4 mostrou-se dependente da proliferação celular e da ativação
colinérgica. A resposta de células retinianas à IL-2 indica a existência da subunidade
IL-2Rγ, embora ainda não se tenha descrição na literatura sobre a expressão desta
molécula ou do seu receptor no tecido ocular, como já demonstrado para a IL-8, em
retina embrionária humana (Juul e Dame, 2000).
Diversas citocinas, assim como seus receptores encontram-se expressos na
retina neural e no RPE, de forma a desempenhar papéis importantes no
desenvolvimento retiniano quando liberados em quantidades e em tempos definidos
(Tanihara et al., 1997; Aymerich et al., 2001; Cao et al., 2001; Machida et al., 2001;
Behlinget al., 2002). Além disso, vários autores já demonstraram que as células do
RPE mantidas em cultura são eficientes fontes de citocinas, onde podemos destacar
aqui algumas delas: FGFb, EGF, NGF e BDNF (Schweigerer et al., 1987;
Chakrabarti et al., 1990; Bost et al., 1992; Campochiaro, 1993; Cao et al., 1995;
Campochiaro et al., 1996; Ishida et al., 1997). Desta forma, o uso de da brefeldina
como potente inibidor da secreção vesicular de peptídeos (Fujiwara et al., 1988) do
K252a como inibidor da ativação de receptores neurotrofinas (Hazari et al., 2007) e
de anticorpos de bloqueio para o FGFb auxiliou na tentativa de mostrar um efeito
direto da IL-4 sobre a população a se diferenciar e a expressar rodopsina. É
interessante salientarmos que a diferenciação de células Rho 4D2
+
nas culturas
controle foi drasticamente inibida quando do uso destes agentes, o que corrobora a
importância da secreção in vitro de fatores (citocinas) pelas células retinianas no
controle da diferenciação de bastonetes, como já descrito na literatura (Hicks e
Courtois, 1992; Yourey et al., 2000),
Nossos dados mostram que a via clássica JAK-STAT6, envolvida em diversos
eventos de diferenciação celular induzidos pela IL-4 (Nelms et al., 1999, para
revisão), não medeia a diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 (tabela 2).
Vale citar que esta via de sinalização é comum a outras citocinas tais como a
INFα/β, IL-3, IL-13 e o PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas) (Patel et
al., 1996) o que sugere o envolvimento de outras vias transducionais e fatores
transcripcionais. Realmente, embora o sítio de ligação da STAT6 presente no
receptor seja suficiente para mediar a indução de certos genes pela IL-4 (Kraus et
al., 2001), muitos estudos recentes demonstraram que a STAT6 não é a única
transdutora de sinais e que a sinalização de IL-4 envolve várias vias que são
específicas para cada tipo de receptor, célula e espécie estudada (Finney et
al.,1990; Nelms et al., 1999; Doucet et al., 2000; David et al., 2001).
A transdução de sinal de IL-4R através das vias de sinalização Raf-MEK-
MAPK e PI3K-Akt (Nelms et al., 1999, para revisão) são bem conhecidas por sua
contribuição nos processos de regulação da proliferação e da sobrevida celulares.
Entre as outras possíveis vias de sinalização testadas, a atividade das proteínas
tirosinas cinases e a fosforilação de Erk, mas não a atividade específica das vias
mediadas pelas p38, JNK, Src cinases ou PI3K foi relacionada ao processo de
diferenciação de bastonetes induzida pela IL-4 (tabela 2; figuras 24, 25 e 26).
A ativação de PKC também tem sido implicada na regulação de diversos
genes alvos pela IL-4 (Ikizawa et al., 1996; Shubinsky e Schlesinger, 1996;
Yanagihara et al., 1997) e nossos resultados corroboram isso, uma vez que
demonstramos que tanto a diferenciação de bastonetes quanto a ativação de Erk1/2
induzidas pela IL-4 foram bloqueadas quando da inibição de PKC. Isso sugere a
existência de uma cascata seqüencial de sinalização entre a PKC e a Erk cinase
(figura 28), a qual já foi descrita como relacionada ao processo de diferenciação de
vários tipos celulares (Suzuki et al., 2002; Kim et al., 2005, 2007), inclusive na retina
(Ojima et al., 2006) reforçando a existência de mecanismos adicionais de interação
entre as vias transducionais ativadas pela IL-4 na retina.
Desta forma, nossos resultados demonstram, pela primeira vez, que a IL-4 é
capaz de induzir a expressão de rodopsina por células retinianas, como um indicador
da diferenciação de bastonetes. Um ponto chave a ser destacado neste trabalho é o
da integração dos eventos de sinalização intracellular disparados pelo IL-4R em
células progenitoras e nas células pós-mitóticas, o que contribuiu para o controle in
vitro da proliferação das PCRs e a diferenciação de bastonetes na retina de
camundongos em um estágio precoce do desenvolvimento pós-natal. Estudos
adicionais são necessários para que possamos analizar o papel da IL-4 endógena
no balanço entre a gênese dos tipos celulares e sua correta diferenciação durante o
desenvolvimento retiniano in vivo, assim como para avaliar a ação da IL-4 sobre
fatores de transcrição envolvidos com a deferenciação celular na retina.
Figura 28 – Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove a diferenciação
de bastonetes em células da retina de camundongos P0. A IL-4, através da
ativação da PKC promove a fosforilação da via da ERK, levando a um aumento na
expressão de rodopsina.
???
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados aqui apresentados podemos concluir que:
• A IL-4 é pouco expressa na retina neural e muito no tecido ocular adjacente
não neural (células do RPE, coróide e esclera) em animais P0.
• A IL-4Rα é expressa abundantemente na retina neural e no tecido ocular
adjacente não neural (células do RPE, coróide e esclera) em animais P0.
Além disso, esta subunidade de receptor apresenta um padrão temporal
diferenciado de expressão, conforme o estágio do desenvolvimento retiniano
pós-natal.
• P0: NBL, GCL e IPL.
• P14: OS, ONL, OPL, IPL
• P60: OS, OPL.
• Quanto ao efeito anti-proliferativo in vitro, a IL-4:
• Aumenta (∼7x) os níveis de AMPc e reduz a proliferação de células da
retina através da via AMPc-PKA.
• Modula a expressão de ciclina D1 e de p27
kip1
.
• Quanto à diferenciação de bastonetes in vitro, a IL-4:
• Aumenta a expressão de rodopsina e o número de células Rho 4D2
+
de modo dose- e tempo-dependentes.
• Apresenta efeito específico e independente da liberação de outros
fatores de crescimento na cultura.
• Apresenta ação independente do seu efeito anti-proliferativo e da
ativação das vias de JAK, Src, p38 e JNK e dependente da atividade
das proteínas tirosina cinase, Erk e PKC.
• Aumenta os níveis de fosforilação de Erk, de modo dependente da
atividade de PKC.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADÃO-NOVAES, Juliana. Regulação in vitro da morte celular de fotorreceptores
induzida por ácido ocadáico e tapsigargina: efeito neuroprotetor de citocinas.
2007. 121f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia) – Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Universidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
ADLER, R. and RAYMOND, P. A. (2007). Have we achieved a unified model of
photoreceptor cell fate specification in vertebrates? Brain Res. v. 1192: p. 134-150.
ADLER, R. (1993). Determination of cellular types in the retina. Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. v. 34: p. 1677-1682.
ADLER, R. (2000). A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog.
Retin. Eye Res. v. 20: p. 529–557.
AHNELT, P.K. and KOLB, H. (2000). The mammalian photoreceptor mosaic-adaptive
design. Prog. Retin. Eye Res.. v. 19: p. 711–777.
AKHMEDOV, N. B.; PIRIEV, N.I.; CHANG, B.; RAPOPORT, A.L.; HAWES, N.L.;
NISHINA, P.M.; NUSINOWITZ, S.; HECKENLIVELY, J.R.; RODERICK, T.H.;
KOZAK, C.A.; DANCIGER, M.; DAVISSON, M.T.; FARBER, D.B. (2000) . A deletion
in a photoreceptor-specific nuclear receptor mRNA causes retinal degeneration in the
rd7 mouse Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. v. 97: p. 5551-6.
ALEXIADES, M.R. and CEPKO, C.L. (1996). Quantitative analysis of proliferation
and cell cycle length during development of the rat retina. Dev. Dyn. v. 205: p. 293-
307.
ALTSHULER, D.; TURCO, J. L.; RUSH, J.; CEPKO, C. (1993). Taurine promotes the
differentiation of a vertebrate retinal cell type in vitro. Development. v.119: p. 1317-
1328.
ANSEL, K.M.; DJURETIC, I.; TANASA, B.; RAO, A. (2006). Regulation of Th2
differentiation and Il4 locus accessibility. Annu. Rev. Immunol. v. 24: p. 607-656.
ARAI, N.; TSUBOI, A.; IWAI, Y.; MIYATAKE, S.; YOKOTA, K.; DE WAAL
MALEFYT, R.; MURAMATSU, M.; MATSUDA, I.; NISHIDA, J. (1990). Regulation of
IL-3, IL-4 and GM-CSF genes and signal transduction by their receptors. Lymphok.
Res. v. 4: p. 551-3.
ARAKI, M.; WATANABE, K.; TOKUNAGA, F.; NONAKA, T. (1988). Phenotypic
expression of photoreceptor and endocrine cell properties by cultured pineal cells of
the newborn rat. Cell Differ. Dev. v. 25: p. 155-164.
ARAUJO, D.M. and COTMAN, C.W. (1993). Trophic effects of interleukin-4, -7 and -8
on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors.
Brain Res. v. 600 : p. 49-55.
ARAUJO, D. M. and COTMAN, C. W. (1995). Differential effects of interleukin-1 beta
and interleukin-2 on glia and hippocampal neurons in culture. Int. J. Devl. Neurosci.
v. 13: p. 201-212.
ASCHNER, M. (1998). Immune and inflammatory responses in the CNS: modulation
by astrocytes. Toxicol Lett. v.102-103: p. 283-287.
AUSTIN, C. P.; FELDMAN, D. E.; IDA, J.A.; CEPKO, C. L. (1995). Vertebrate retinal
ganglion cells are selected from competent progenitors by the action of Notch.
Development. v. 121: p. 3637-3650.
AWATSUJI, H.; FURUKAWA, Y.; NAKAJIMA, M.; FURUKAWA, S.; HAYASHI, K.
(1993). Interleukin-2 as a neurotrophic factor for supporting the survival of neurons
cultured from various regions of fetal rat brain. J. Neurosci. Res. v. 35: p. 305-311.
AYMERICH, M.S.; ALBERDI, E.M.; MARTINEZ, A.; BECERRA, S.P. (2001).
Evidence for pigment epithelium-derived factor receptors in the neural retina. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. v. 42: p. 3287-3293.
BAILEY, T.J., EL-HODIRI, H., ZHANG, L., SHAH, R., MATHERS, P.H., JAMRICH,
M. (2004). Regulation of vertebrate eye development by Rx genes. Int. J. Dev. Biol.
48, 761–770.
BANCHEREAU, J.; BRIÈRE, F.; GALIZZI, J.P.; MIOSSEC, P.; ROUSSET, F.(1994).
Human interleukin-4. J. Lipid Med.and Cell Sig. v. 9: p. 43-53.
BARNA, B.P.; ESTES, M.L.; PETTAY, J.; IWASAKI, K.; ZHOU, P.; BARNETT, G.
H.(1995). Human astrocyte growth regulation: interleukin-4 sensitivity and receptor
expression.J Neuroimmunol. v. 60; p. 75-81.
BEHLING, K. C.; SURACE, E. M.; BENNETT, J. (2002). Pigment epithelium-derived
factor expression in the developing mouse eye. Mol. Vision. v. 8: p. 449-454.
BELECKY-ADAMS, T.; COOK, B.; ADLER, R. (1996). Correlations between terminal
mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis
with the “window-labeling” technique. Dev. Biol. v. 178; p. 304–315.
BELLIVEAU, M.J. and CEPKO, C.L. (1999). Extrinsic and intrinsic factors control the
genesis of amacrine and cone cells in the rat retina. Development. v. 126; p. 555-66.
BERSON, D. M.; DUNN, F. A.; TAKAO, M. (2002). Phototransduction by retinal
ganglion cells that set the circadian clock.Science. v. 295: p. 1070-1073.
BLOW, J. J. and NURSE, P. (1990). A cdc2-like protein is involved in the initiation of
DNA replication in Xenopus egg extracts. Cell. v. 62: p. 855-862.
BOATRIGHT, J.H.; STODULKOVA, E.; DO, V.T.; PADOVE, S.A.; NGUYEN, H. T.;
BORST, D. E.; NICKERSON, J. M.(2002) The effect of retinoids and butyrate on the
expression of CRX and IRBP in retinoblastoma cells.Vision Res. v. 42: p. 933-938
BORASCHI, D.; CIFONE, M.G.; FALK, W.; FLAD, H.D.; TAGLIABUE, A.; MARTIN,
M.U. (1998). Cytokines in inflammation. Joint Workshop of the Deutsche Gesellschaft
fur Immunologie (DGfI) and the Gruppo di Cooperazione in Immunologia (GCI)
Assergi (L'Aquila, Italy), February 8-11, 1998.Eur. Cytok. Netwl. v. 9: p. 205-212.
BOST, L.M.; AOTAKI-KEEN, A.E.; HJELMELAND, L. M.(1992). Coexpression of
FGF-5 and bFGF by the retinal pigment epithelium in vitro.Exp. Eye Res. v. 55: p.
727-34
BOULTON, M and ALBON, J (2004). Stem cells in the eye. Int J Biochem & Cell
Biol. v. 36: p. 643-657.
BRODIE, C. (1996). Differential effects of Th1 and Th2 derived cytokines on NGF
synthesis by mouse astrocytes. FEBS Lett. v. 394: p. 117-120
BRODIE, C. and GOLDREICH, N. (1994). Interleukin-4 modulates the proliferation
and differentiation of glial cells. J. Neuroimmunol. v. 55: p. 91-97.
BRODIE, C.; GOLDREICH, N.; HAIMAN, T.; KAZIMIRSKY, G. (1998) Functional IL-4
receptors on mouse astrocytes: IL-4 inhibits astrocyte activation and induces NGF
secretion. J. Neuroimmunol. v. 81: p. 20-30.
BUTOVSKY, O.; TALPALAR, A.E.; BEN-YAAKOV, K.; SCHWARTZ, M. (2005).
Activation of microglia by aggregated beta-amyloid or lipopolysaccharide impairs
MHC-II expression and renders them cytotoxic whereas IFN-gamma and IL-4 render
them protective. Mol. Cell. Neurosci. v. 29; p. 381– 393.
CAFFÉ, A. R.; SÖDERPALM, A.K.; HOLMQVIST, I.; VAN VEEN, T.(2001). A
combination of CNTF and BDNF rescues rd photoreceptors but changes rod
differentiation in the presence of RPE in retinal explants.Invest. Ophthalmol. Vis.
Sci. v. 42: p. 275-282.
CALZADA, A; BUENO, A.; SÁNCHEZ, M. (2000). El inicio de la replicación del ADN
CIENCIA AL DIA Internacional. N. 1; V. 3.
CAMPOCHIARO, P.A.; HACKETT, S.F.; VINORES, S.A. (1996).Growth factors in the
retina and retinal pigmented epithelium. Prog. Retin. Eye Res. v. 15: p. 547-567.
CAMPOCHIARO, P. A. (1993). Cytokine production by retinal pigmented epithelial
cells. Int. Rev. Cytol. v. 146: p. 75-82.
CAO, J.; HE, S.; WU, L. (1995). Cultured human retinal pigment epithelial cell
produced and secreted epidermal growth factor: its bioactivity and clinical
significance Zhonghua Yi Xue Za Zhi. v. 75: p. 609-639.
CAO, W, TOMBRAN-TINK J, ELIAS R, SEZATE S, MRAZEK D, MCGINNIS JF
(2001). In vivo protection of photoreceptor from light damage by pigment epithelium-
derived factor. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. v. 42: p. 1646-1652.
CARTER-DAWSON, L.D. and LAVAIL, M. M.(1979). Rods and cones in the mouse
retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine. J.
Comp.Neurol. v. 188: p. 263-272.
CAVAILLON, J.M. (1994). Cytokines and Macrophages. Biomed. Pharmacother. v.
48: p. 445-453
CEPKO, C.L.; AUSTIN, C.P.; YANG, X.; ALEXIADES, M.; EZZEDDINE, D. (1996).
Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. v. 93:
p. 589–595.
CEPKO, C. L. (1999). The roles of intrinsic and extrinsic cues and bHLH genes in the
determination of retinal cell fates.Curr Opin Neurobiol. v. 9: p. 37-46.
CEPKO, C.L (2000). Giving in to the blues. Nat. Gen. v. 24: p. 99-100.
CHAKRABARTI, S.; SIMA, A. A.; LEE, J.; BRACHET, P.; DICOU, E.(1990). Nerve
growth factor (NGF), proNGF and NGF receptor-like immunoreactivity in BB rat
retina. Brain Res. v. 523: p. 11-15.
CHAO, C. C.; MOLITOR, T. W.; HU, S. (1993). Neuroprotective role of IL-4 against
activated microglia. J. Immunology v. 151: p. 1473-1481.
CHEN L, GRABOWSKI KA, XIN JP, COLEMAN J, HUANG Z, ESPIRITU B, ALKAN
S, XIE HB, ZHU Y, WHITE FA, CLANCY J JR, HUANG H.(2004). IL-4 induces
differentiation and expansion of Th2 cytokine-producing eosinophils. J. Immunol. v.
172 : p. 2059-2066
CHEN, J.; RATTNER, A.; NATHANS, J. (2005). The rod photoreceptor specific
nuclear receptor Nr2e3 represses transcription of multiple cone-specific genes. J.
Neurosci. v. 25: p. 118–129.
CHENG, H.; KHANNA, H.; OH, E.C.; HICKS, D.; MITTON, K.P.; SWAROOP, A.
(2004). Photoreceptor-specific nuclear receptor NR2E3 functions as a transcriptional
activator in rod photoreceptors. Hum. Mol. Genet. v.13: p. 1563–1575.
CHENG, H.; ALEMAN, T.S.; CIDECIYAN, A.V.; KHANNA, R.; JACOBSON, S.G.;
SWAROOP, A. (2006). In vivo function of the orphan nuclear receptor NR2E3 in
establishing photoreceptor identity during mammalian retinal development. Hum.
Mol. Genet. v. 15: p. 2588–2602.
CHIARINI, L. B.; LEAL-FERREIRA, M.L.; DE FREITAS, F.G. ; LINDEN, R. (2003).
Changing sensitivity to cell death during development of retinal photoreceptors. J.
Neurosc. Res. v. 74: p. 875-883.
CHOMARAT, P. and BANCHEREAU, J. (1997). An update on interkeukin-4 and its
receptor. Eur. Cytok. Netw. v. 8: p. 333-344.
COFFMAN, R. L.; OHARA, J.; BOND, M. W.; CARTY, J.; ZLOTNIK, A.; PAUL, W.
E.(1986). B cell stimulatory factor-1 enhances the IgE response of
lipopolysaccharide-activated B cells.J. Immunol. v. 136: p. 4538-4541.
COPPACK, S.W. (2001). Pro-inflamatory cytokines and adipose tissue. Proc. Nutr.
Soc. v. 3: p. 349-356.
CRAFT, J. L.; FULTON, A. B.; SILVER, J.; ALBERT, D.M.(1982). Development of the
outer plexiform layer in albino rats.Curr Eye Res. v. 5: p. 295-299.
CRANE, I.J.; KUPPNER, M.C.; MCKILLOP-SMITH, S.; KNOTT, R.M.; FORRESTER,
J. V.(1998). Cytokine regulation of RANTES production by human retinal pigment
epithelial cells.Cell Immunol. v. 184: p. 37-44.
DAME, J. B. and JUUL, S. E. (2000). The distribution of receptors for the pro-
inflammatory cytokines interleukin IL-6 and IL-8 in the developing human fetus. Early
Hum. Dev. v. 58: p. 25-39.
DANTZER, R.; KONSMAN J. P.; BLUTHE, R. M.; KELLEY, K.W. (2000). Neural
and humoral pathways of communication from the immune system to the brain:
parallel or convergent? Autonomic Neurosci. v. 85: p. 60-65.
DANTZER V. and WINTHER, H. (2001). Histological and immunohistochemical
events during placentation in pigs. Reprod. Suppl. v. 58: p. 209-222.
DANTZER, R. (2004). Cytokine-induced sickness behaviour: a neuroimmune
response to activation of innate immunity.Eur. J. Pharmacol. v. 500: p. 399-411.
DAS, T.; PAYER, B.; CAYOUETTE, M.; HARRIS, W.A. (2003). In vivo timelapse
imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina.
Neuron. v. 37: p. 597–609.
DAVID, M.; FORD, D.; BERTOGLIO, J.; MAIZEL, A. L.; PIERRE, J. (2001). Induction
of the IL-13 receptor alpha2-chain by IL-4 and IL-13 in human keratinocytes:
involvement of STAT6 ERK and p38 MAPK pathways. Oncogene. v. 20: p. 6660-
6668.
DAVIES, A.M. (1994). The role of neurotrophins in the developing nervous system.
J. Neurobiol. v. 25: p. 1334-1348.
DAVIS, A. A.; MATZUK, M. M.; REH, T. A. (2000). Activin A promotes progenitor
differentiation into photoreceptors in rodent retina. Mol. Cell Neurosci. v. 15: p. 11–
21.
DEBETS, R. and SAVELKOUL, H.F.J. (1996). Cytokines as cellular communicators.
Mediat. Inflamm. v. 5: p. 417-423.
DINARELLO, C. A. (2000). Proinflammatory cytokines.Chest. v. 118: p. 503-508.
DOUCET, C.; JASMIN, C.; AZZARONE, B. (2000). Unusual interleukin-4 and -13
signaling in human normal and tumor lung fibroblasts. Oncogene. v. 19: p. 5898-
5905.
DOWLING, J.E. (1991). Retina. Enc. Human Biol. v. 6: p. 615-637.
DUSCHL, A. and SEBALD, W. (1996). Transmembrane and intracellular signalling by
interleukin-4: receptor dimerization and beyond. Eur. Cytok. Netw. v. 7: p. 37-49.
DYER, M. A. and CEPKO, C. L. (2001). Regulating proliferation during retinal
development. Nat. Rev. Neurosci. v. 2: p. 333-342.
ELLIOT, J.; CAYOUETTE, M.; GRAVEL, C. (2006). The CNTF/LIF signaling
pathways regulates developmental programmed cell death and differentiation of rod
precursor cells in the mouse retina in vivo. Dev. Biol. v. 300: p. 583-598.
ESTES, M. L.; IWASAKI, K.; JACOBS, B. S.; BARNA, B. P. (1993) Interleukin-4
down-regulates adult human astrocyte DNA synthesis and proliferation.Am. J.
Pathol. v. 143: p. 337-341.
EZZEDDINE, Z. D.; YANG, X.; DECHIARA, T.; YANCOPOULOS, G.; CEPKO, C.
L.(1997). Postmitotic cells fated to become rod photoreceptors can be respecified by
CNTF treatment of the retina. Development. v. 124: p. 1055–1067.
FAIN, G.L.; MATHEUS, H.R.; CORNWALL, M.C. (1996). Dark adaptation in
vertebrate photoreceptor. Trends Neurosci. v.19: p. 502-506.
FAIN, G. (2006). Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays v. 28:
p.344-354.
FARRAR, J.J.;HOWARD, M.;FULLER-FARRAR, J.;PAUL, W.E. (1983). Biochemical
and physiochemical characterization of a mouse B cell growth factor: a lymphokine
distinct from interleukin-2. J. Immunol. v. 131: p. 1838-1842.
FINNEY, M.; GUY, G.R.; MICHELL, R.H.; GORDON, J.; DUGAS, B.; RIGLEY, K.P.;
CALLARD, R.E. (1990). Interleukin 4 activates human B lymphocytes via transient
inositol lipid hydrolysis and delayed cyclic adenosine monophosphate generation.
Eur. J. Immunol. v. 20: p. 151-156.
FIORENTINO, D.F.; ZLOTNIK, A.; MOSMANN, T.R.; HOWARD, M.; O'GARRA, A.
(1991). IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J. Immunol. v.
147: p. 3815-3822.
FISCHER, A.J. and REH, T.A. (2003). Potential of Müller Glia to become neurogenic
retinal progenitor cells. Glia. v. 43: p. 70-76.
FOGARTY, M.P.; EMMENEGGER, B.A.; GRASFEDER, L.L.; OLIVER, T.G.;
WECHSLER-REYA, R.J. (2007). Fibroblast growth factor blocks Sonic hedgehog
signaling in neuronal precursors and tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. v. 104:
p. 2973-2978.
FOOTE, L.C.; HOWARD, R. G.; MARSHAK-ROTHSTEIN, A.; ROTHSTEIN, T. L.
(1996). IL-4 induces Fas resistance in B cells. J. Immunol. v. 157: p. 2749-2753.
FOSTER, R. G. and HANKINS, M. W. (2007). Circadian vision. Curr. Biol. v. 17: p.
746-751.
FUHRMANN, S.; HELLER, S.; ROHRER, H.; HOFMANN, H. (1998). A transient role
for ciliary neurotrophic factor in chick photoreceptor development. J. Neurobiol. v.
37: p. 672–683.
FUHRMANN, S.; CHOW, L.; REH, T.A. (2000). Molecular control of cell
diversification in the vertebrate retina. Results Probl. Cell Differ. v.31: p. 69–91.
FUJIWARA, T.; ODA, K.; YOKOTA, S.; TAKATSUKI, A.; IKEHARA, Y. (1988).
Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory
proteins in the endoplasmic reticulum.J.Biol.Chem. v. 263: p. 18545-18552.
FUKUDA, K.; FUJITSU, Y.; KUMAGAI, N.; NISHIDA, T. (2002). Characterization of
the interleukin-4 receptor complex in human corneal fibroblasts.
Invest.Ophthalmol.Vis. Sci. v. 43: p. 183-188.
GADINA, M.; HILTON, D.; JOHNSTON, A.; MORINOBU, A.; LIGHVANI, A.;
ZHOU,Y.; VISCONTI, R.; SHEA, J.J. (2001). Signaling by type I and II cytokine
receptors: ten years after. Curr. Opin. Immunol. v. 13: p. 363-373.
GALEA, P.; THIBAULT, G.; LACORD, M.; BARDOS, P.; LEBRANCHU, Y. (1993). IL-
4, but not tumor necrosis factor-α, increases endothelial cell adhesiveness for
lymphocytes by activating a cAMP-dependent pathway. J.Immunol. v. 151: p. 588-
596
GALIZZI, J.P.; ZUBER, C.E.; HARADA, N.; GORDAN, D.M.; DJOSSOU, O.;
KASTELE, R.; BANCHEREAU, J.; HOWARD, M.; MIYAJIMA, A. (1990). Molecular
cloning of a cDNA encoding the human interleukin-4 receptor. Int. Immunol. v. 2: p.
669-675.
GALLI-RESTA, L. (2001). Assembling the vertebrate retina: global patterning from
short-range cellular interactions. NeuroReport. v. 12: p. 103-106.
GAO, L. and MILLER, R.H. (2006). Cytokines and Development of the Nervous
System. Cytokines and the CNS. 2ª Edição (pp. 93-112). Boca Raton (FL): CRC
Press. Taylor & Francis Group.
GARELLI, A.; ROTSTEIN, N.P.; POLITI, L.E. (2006). Docosahexaenoic acid
promotes photoreceptor differentiation without altering Crx expression. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. v. 47: p. 3017-3027.
GAUTHIER, R.; JOLY, S.; PERNET, V.; LACHAPELLE, P.; DI POLO, A. (2005).
Brain-derived neurotrophic factor gene delivery to Müller glia preserves structure and
unction of light-damage photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. v. 46: p.
3383-3392.
GILMAN, A. G. (1970). A protein binding assay for adenosine 3',5' cyclic
monophosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. v. 67:p. 305-312.
GRÖTZINGER, J. (2002). Molecular mechanisms of cytokine receptor activation.
Biochim. Biophys. Acta. v. 1592: p. 215-223.
GUZDEK, A.; STALINSKA, K.; GUZIL, K.; KOJ, A. (2000). Differential responses of
hematopoietic and non-hematopoietic cells to anti-inflammatory cytokines: IL-4, IL-
13, and IL-10. J. Physiol. Pharmacol. v. 51: p. 387-399.
HADDAD, J.J. (2002). Cytokines and related receptor-mediated signaling pathways.
Biochem. Biophys. Res.Commun. v. 297: p. 700-713.
HAIDER, N.B.; NAGGERT, J.K.; NISHINA, P.M. (2001). Excess cone cell
proliferation due to lack of a functional NR2E3 causes retinal dysplasia and
degeneration in rd7/rd7 mice. Hum. Mol. Genet. v. 10: p. 1619–1626.
HANADA, T. and YOSHIMURA, A. (2002) Regulation of cytokine signaling and
inflammation.Cytokine Growth Factor Rev. v. 13: p. 413-421.
HANISCH, U. K. and QUIRION, R. (1996). Interleukin-2 as a neuroregulatory
cytokine.Brain Res. Rev. v. 21: p. 246-284.
HATAKEYAMA, J. and KAGEYAMA, R. (2004). Retinal cell fate determination and
bHLH factors. Semin. Cell Dev. Biol. v. 15: p. 83-89.
HATTAR, S.; LIAO, H. W.; TAKAO, M.; BERSON, D. M.; YAU, K. W.
(2002).Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and
intrinsic photosensitivity. Science. v. 285: p. 1065-1070.
HAZARI, M. S.; PAN, J. H.; MYERS, A. C. (2007). Nerve growth factor acutely
potentiates synaptic transmission in vitro and induces dendritic growth in vivo on
adult neurons in airway parasympathetic ganglia. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol.
Physiol. v. 292: p. 992-1001.
HEBENSTREIT, D.; WIRNSBERGER, G.; HOREJS-HOECK, J.; DUSCHL, A.(2006)
Signaling mechanisms, interaction partners, and target genes of STAT6.Cytokine
Growth Factor Rev. v. 17: p. 173-188.
HICKS, D. and COURTOIS, Y. (1992). Fibroblast growth factor stimulates
photoreceptor differentiation in vitro. J. Neurosci. v. 12: p. 2022-2033.
HICKS, D. (1998). Putative functions of fibroblast growth factors in retinal
development, maturation and survival. Semin. Cell Dev. Biol. v. 9: p. 263-269.
HINTON, H. J. and WELHAM, M. J.(1999). Cytokine-induced protein kinase B
activation and Bad phosphorylation do not correlate with cell survival of hemopoietic
cells. J. Immunol. v. 162: p. 7002-7009.
HOLLOWAY, A. F.; RAO, S.; SHANNON, M.F. (2002). Regulation of cytokines gene
transcription in the immune system. Mol. Immunol. v. 38: p. 567-580.
HOLT, C.E.; BERTSCH, T.W.; ELLIS, H.M.; HARRIS, W.A. (1988). Cellular
determination in the Xenopus retina is independent of lineage and birth date.
Neuron. v. 1: p. 15-26.
HOLTMANN H. and RESCH, K (1995). Cytokines. Naturwissenschaften. v. 82: p.
178-187.
HOPKINS S. J. and ROTHWELL, N. J. (1995). Cytokines and the nervous system.
I: Expression and recognition. Trends Neurosci. v. 18: p. 83-88.
HU, M. and EASTER, S. S. (1999). Retinal neurogenesis: the formation of the initial
central patch of postmitotic cells. Dev. Biol. v. 207: p. 309-321.
HUANG, E.J. and REICHARDT, L. F. (2001). Neurotrophins: roles in neuronal
development and function.Annu. Rev. Neurosci. v. 24: p. 677-736.
HUNTER D. D.; MURPHY M. D.; OLSSON C. V.; BRUNKEN W. J. (1992). S-laminin
expression in adult and developing retinae: a potential cue for photoreceptor
morphogenesis. Neuron. v. 8: p. 399-413.
HYATT G. A.; SCHMITT E. A.; FADOOL J. M.; DOWLING J. E. (1996). Retinoic acid
alters photoreceptor development in vivo.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. v. 93:p.
13298-13303.
IKIZAWA, K. ; KAJIWARA, K. ; BASAKI, Y. ; KOSHIO, T. ; YANAGIHARA, Y. (1996)
Evidence for a role of phosphatidylinositol 3-kinase in IL-4-induced germline C
epsilon transcription. Cell Immunol. v. 170 : p. 134-140.
ISHIDA, K.;KANEKO, K.; KUBOTA, T.; ITOH, Y.; MIYATAKE, T.; MATSUSHITA, M.;
YAMADA M.(1997). Identification and characterization of an anti-glial fibrillary acidic
protein antibody with a unique specificity in a demented patient with an autoimmune
disorder. J. Neurol. Sci. v. 151: p. 41-48.
IWASAKI, K.; ROGERS, L.R.; ESTES, M.L.; BARNA, B.P. (1993). Modulation of
proliferantion and antigen expression of a clonal human glioblastoma by Interleukin-4
alone and in combination with tumor necrosis factor-α and/m or Interferon- gamma.
Neurosurgery v. 33: p. 489-494.
JACOBS, G.H.; WILLIAMS, G.A.; CAHILL, H.; NATHANS, J. (2007). Emergence of
Novel Color Vision in Mice Engineered to Express a Human Cone Photopigment.
Science. v. 315: p. 1723-1725.
JACOBS, G.H.; WILLIAMS, G.A.; FENWICK, J.A. (2004). Influence of cone pigment
coexpression on spectral sensitivity and color vision in the mouse. Vision Res. v. 44:
p. 1615–1622.
JACOBS, G. H. (1996). Primate Photopigments and Primate Color Vision
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. v. 93: p. 577-581.
JANKOWSKY, J. L. and PATTERSON, P.H. (2001). The role of cytokines and growth
factors in seizures and their sequelae. Prog. Neurobiol. v. 63: p. 125-149.
JEAN, D.; EWAN, K.; GRUSS, P. (1998). Molecular regulators involved in vertebrate
eye development. Mech. Dev. v. 76: p. 3-18.
JENSEN, A. M. and RAFF, M. C. (1997). Continuous observation of multipotential
retinal progenitor cells in clonal density culture. Dev. Biol. v. 188: p. 267-279.
JIANG, C. L. and LU, C. L. (1998). Interleukin-2 and its effects in the central
nervous system. Biol. Sig. Recept. v. 7: p. 148-156.
KADI, L.; SELVARAJU, R.; DE LYS, P.; PROUDFOOT, A.E.; WELLS, T.N.;
BOSCHERT, U. (2006) Differential effects of chemokines on oligodendrocyte
precursor proliferation and myelin formation in vitro.J. Neuroimmunol. v. 174: p.
133-146.
KAMEGAI, M.; NIIJIMA, K.; KUNISHITA, T.; NISHIZAWA, M.; OGAWA, M.; ARAKI, M.;
UEKI, A.; KONISHI, Y.;TABIRA, T. (1990) Interleukin 3 as a trophic factor for central
cholinergic neurons in vitro and in vivo. Neuron. v. 4: p. 429-436.
KANDEL, E.R.; SCHWARTZ, J.H.; JESSELL, T.M. (2003). Princípios da
Neurociência, cap. 26 (Processamento visual da retina), 4º Ed. Manole Ltda.
KEEGAN, A.D and PIERCE, J.H. (1994). The interleukin-4 receptor: signal
transduction by a hematoitin receptor. J. Leukocyte. v. 55: p. 272-279
KELLEY, M.W.; TURNER, J.K.; REH, T.A. (1994). Retinoic acid promotes
differentiation of photoreceptors in vitro. Development. v. 120: p. 2091–2102.
KELLEY, M.W.; TURNER, J.K.; REH, T.A. (1995). Regulation of proliferation and
photoreceptor differentiation in fetal human retinal cell cultures. Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. V. 36 : p.1280-1289.
KELLEY, M.W.; WILLIAMS, R.C.; TURNER, J.K.; CREECH-KRAFT, J.M.; REH, T.A.
(1999). Retinoic acid promotes rod photoreceptor differentiation in rat retina in vivo.
Neuroreport. v. 11; p. 2389-2394.
KELLY-WELCH, A. E.; HANSON, E. M.;BOOTHBY, M. R.; KEEGAN, A. D. (2003)
Interleukin-4 and interleukin-13 signaling connections maps. Science. v. 300:p.
1527-1528.
KELLY-WELCH, A.; HANSON, E. M.; KEEGAN, A. D.(2005). Interleukin-4 (IL-4)
pathway. Sci. STKE. v. 2005: p. cm9.
KIM, S. H.; OH, S. M.; KIM, T. S. (2005). Induction of human leukemia HL-60 cell
differentiation via a PKC/ERK pathway by helenalin, a pseudoguainolide
sesquiterpene lactone. Eur. J. Pharmacol. v. 511: p. 89-97.
KIM, Y. J.; KIM, Y. S.; KIM, M. S.; RYU, J. C. (2007). The inhibitory mechanism of
methylmercury on differentiation of human neuroblastoma cells. Toxicology. v. 234:
p. 1-9.
KIRKEN, R.A.; EVANS, G.A.; DUHÉ, R.J.; DASILVA, L.; MALABARBA, M.G.; ERWIN,
R.A.; FARRAR, W.L. (1998). Mechanisms of cytokine signal transduction: IL-2, IL-4 and
prolactin as hematopoietin receptor models. Vet. Immunol. Immunnopathol. v. 63: p.
27-36.
KIRSCH, M. and HOFMANN, H. D. (1994). Expression of ciliary neurotrophic factor
receptor mRNA and protein in the early postnatal and adult rat nervous system.
Neurosci. Lett. v. 180: p. 163-166
KLASSEN, H.; SAKAGUCHI, D. S.; YOUNG, M. J. (2004). Stem cells and retinal
repair.Prog. Retin. Eye Res. v. 23: p. 149-181.
KOEBERLE P. D.; GAULDIE, J.; BALL, A. K. (2004). Effects of adenoviral-mediated
gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on
the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. v. 125: p. 903-920.
KORSHING, S. (1993). The neurotrophic factor concept: a reexamination. J.
Neurosci. v. 13: p. 2739-2748
KONSMAN, J.P.; PARNET, P.; DANTZER, R. (2002). Cytokine-induced sickness
behaviour: mechanisms and implications. TRENDS in Neurosci. v. 25: p. 154-159.
KRAUS, J.; BORNER, C.; GIANNINI, E.; HICKFANG, K.; BRAUN, H.; MAYER, P.
(2001). Regulation of mu-opioid receptor gene transcription by interleukin-4 and
influence of an allelic variation within a STAT6 transcription factor binding site. J.
Biol. Chem. v. 276: p. 43901-43908.
LAPORTE, S. L.; FORSYTH, C. M.; CUNNINGHAM, B. C.; MIERCKE, L. J.;
AKHAVAN, D.; STROUD, R. M.(2005). De novo design of an IL-4 antagonist and its
structure at 1.9 A.Proc Natl Acad Sci U S A. v. 102: p. 1889-1894.
LEE, J.D.; RHOADES, K.; ECONOMOU, J.S. (1995). Interleukin-4 inhibits the
expression of tumor necrosis factor alpha and beta, interleukins-1 beta and -6 and
interferon gama. Immunol. Cell Biol. v. 73: p. 57-61.
LEVI-MONTALCINI, R. (1987). The nerve growth factor 35 years later. Science. v.
4819: p.1154-1162.
LEVINE, E.M.; FUHRMANN, S.; REH, T. A. (2000). Soluble factors and the
development of rod photoreceptors. Cel. Mol. Life Sci. v. 57: p. 224-234.
LEVINE, E.M.; ROELINK, H.; TURNER, J.; REH, T.A. (1997). Sonic hedgehog
promotes rod photoreceptor differentiation in mammalian retinal cells in vitro. J.
Neurosci. v. 17 : p. 6277–6288.
LEWIN, G. R. and BARDE, Y. A. (1996). Physiology of the neurotrophins.Annu. Rev.
Neurosci. v. 19: p. 289-317.
LI, A.; ZHU, X.; CRAFT, C.M. (2002). Retinoic acid upregulates cone arrestin
expression in retinoblastoma cells through a cis element in the distal promoter region.
Invest. Ophthalmol. Visual Sci. v. 43: p. 1375–1383.
LI, A.; ZHU, X.; BROWN, B.; CRAFT, C. M. (2003). Gene expression networks
underlying retinoic acid-induced differentiation of human retinoblastoma cells. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. v. 44: p. 996-1007.
LI, S.; MO, Z.; YANG, X.; PRICE, S. M.; SHEN, M. M.; XIANG, M. (2004). Foxn4
controls the genesis of amacrine and horizontal cells by retinal progenitors.Neuron.
v. 43: p. 795-807.
LIBBY, R.T.; HUNTER, D.D.; BRUNKEN, W.J. (1996). Developmental expression of
laminin beta 2 in rat retina. Further support for a role in rod morphogenesis. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. v. 37: p. 1651–1661
LINDEN, R.; REHEN, S.K.; CHIARINI, L.B. (1999). Apoptosis in developing retinal
tissue. Progr. Ret. Eye Res. v. 18: p. 133-165.
LISCHKE, A; MORIGGL, R; BRÄNDLEIN, S.; BERCHTOLD, S.; KAMMER, H.;
SEBALD, W.; GRONER, B.; LIU, X.; HENNIGHAUSEN, L. AND FRIEDRICH, K.
(1998). The Interleukin-4 Receptor Activates STAT5 by a Mechanism That Relies
upon Common -Chain J. Biol. Chem. v. 273: p. 31222-31229.
LIVESEY, F.J. and CEPKO, C.L. (2001). Vertebrate neural cell-fate determination:
lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. v. 2: p. 109–118.
LOWRY, O.H.; ROSEBROUGH, N.J.; FARR, A.L.; RANDALL, R.J. (1951). Protein
measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. v. 193:p. 265-275
LUPO, G. ; ANDREAZZOLI, M. ; GESTRI, G. ; LIU, Y. ; HE, R.Q. ; BARSACCHI,
G.(2000). Homeobox genes in the genetic control of eye development. Int. J. Dev.
Biol. v. 44 : p. 627-636.
MACHIDA, S.; CHAUDHRY, P.; SHINOHARA, T.; SINGH, D.P.; REDDY, V.N.;
CHYLACK, J.R. L.T.; SIEVING, P.A.; BUSH, R.A. (2001). Lens epithelium-derived
growth factor promotes photoreceptor survival in light-damage and RCS rats. Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. v. 42:p. 1087-1095.
MACLAREN, R. E; PEARSON, R. A.; MACNEIL, A.; DOUGLAS; R. H.; SALT, T. E.;
AKIMOTO, M.; SWAROOP, A.; SOWDEN, J.C.; ALI, R.R. (2006). Retinal repair by
transplantation of photoreceptor precursors. Nature v. 444: p. 203-207.
MAHER, F.O.; NOLAN, Y.; LYNCH, M.A. (2005). Downregulation of IL-4-induced
signaling in hippocampus contributes to deficits in LTP in the aged rat. Neurobiol
Aging. v. 26: p. 717-728.
MALICKI, J. (2004). Cell fate decisions and patterning in the vertebrate retina: the
importance of timing, asymmetry, polarity and waves. Curr. Opin. Neurobiol. v. 14:
p. 15–21.
MARQUARDT, T. and GRUSS, P. (2002). Generating neuronal diversity in the retina:
one for nearly all. Trends Neurosci. v. 25; p. 32–38.
MARTINS, R.A. and PEARSON, R.A. (2007). Control of cell proliferation by
neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. v. 1192: p. 37-60.
MASLAND, R.H. (2001). The fundamental plan of the retina. Nat. Neurosci. v. 4 p.
877-886.
MASLIM, J. and STONE, J. (1986). Stages in the structural differentiation of retinal
ganglion cells. J. Comp. Neurol. v. 254: p. 382-402.
MATSUSHIME, H. ; QUELLE, D.E. ; SHURTLEFF, S.A. ; SHIBUYA, M. ; SHERR.
C.J. ; KATO, J.Y. (1994) . D-type cyclin-dependent kinase activity in mammalian
cells. Mol. Cell Biol. v. 14: p. 2066-2076.
MCALLISTER, A.K.; KATZ, L.C.; LO, D.C. (1999). Neurotrophins and synaptic
plasticity. Annu. Rev. Neurosci. v. 22: p. 295-318.
MEARS, A.J., KONDO, M., SWAIN, P.K., TAKADA, Y., BUSH, R.A., SAUNDERS,
T.L., SIEVING, P.A., SWAROOP, A. (2001). Nrl is required for rod photoreceptor
development. Nat. Genet. v. 29: p. 447–452.
MEHLER, M.F. and KESSLER, J.A. (1997). Hematolymphoietic and inflammatory
cytokines in neural development. Trends Neurosci. v. 20: p. 365-370
MENNNICKEN, F; MAZZONI, I. E.; KENIGBERG, R. L.; QUIRION, R. (1994).
Interleukin-2 stimulates cholinergic neurons in septal cell cultures. Soc. Neurosci.
Abstr. v. 20: p. 667.
MOLDAY, R.S. (1989). Monoclonal antibodies to rhodopsin and other proteins of rod
outer segments. Prog. Retin. Eye Res. v. 8: p. 173-209.
MORI, N.; SHIRAKAWA, F.; MURAKAMI, S.; ODA, S.; ETO, S. (1995). Interleukin-4
inhibits the production of interleukin-1 by adult T-cell leukemia cells. Eur. J. Hematol.
v. 55: p. 121-125.
MORROW, E.M., BELLIVEAU, M.J., CEPKO, C.L. (1998a). Two phases of rod
photoreceptor differentiation during rat retinal development. J. Neurosci. v. 18; p.
3738-3748.
MORROW, E.M., BELLIVEAU, M.J., CEPKO, C.L. (1998b). Vertebrate
photoreceptor cell development and disease. Trends Cell Biol. v. 8: p. 353–358
MÖSSNER, R.; DANIEL, S.; SCHMITT, A.; ALBERT, D.; LESH, KP.(2001)
Modulation of serotonin transporter function by interleukin-4. Life Science. v. 68: p.
873-888.
MÜELLER,T.D.; ZHANG, J.; SEBALD, W.; DUSCHL, A. (2002). Structure, binding,
and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system. Bioch. Biophys. Acta. v. 1592: p.
237-250
MURATA, T.; OBIRI, N.; PURI, R. (1998). Structure of and signal transduction
through interleukin-4 and interleukin-13 receptors. Int. J. Mol. Med. v. 1: p. 551-557.
MURPHY, G.M. and SARAVANAPAVAN, P (2006). Cytokines and Neurodegeneration
Cytokines and the CNS.2ª Edição. (pp. 163-192). Boca Raton (FL): CRC Press.
Taylor & Francis Group.
NELMS K, KEEGAN AD, ZAMORANO J, RYAN JJ, PAUL WE (1999). The IL-4
receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu. Rev. Immunol. v. 17:
p. 701-738.
NEOPHYTOU, C.; VERNALLIS A. B.; SMITH A.; RAFF M. C. (1997). Muller-cell-
derived leukaemia inhibitory factor arrests rod photoreceptor differentiation at a
postmitotic pre-rod stage of development. Development. v. 124: p. 2345–2354.
NEWMAN, E. and REICHENBACH, A. (1996). Ther Müller cell: a functional element
of the retina. Trends Neurosc. v. 19: p. 307-312.
NICOD, L.P. (1993). Cytokines: overview. Thorax. v. 48: p. 660-667.
NISHIDA, A.; FURUKAWA, A.; KOIKE, C.; TANO, Y.; AIZAWA, S.; MATSUO, I.;
FURUKAWA, T. (2003) Nat. Neurosci. v. 6: p. 1255–1263.
NOLAN, Y.; MAHERT, O.F.; MARTIN, D.S.; CLARKE, R.M.; BRADY, M.T.;
BOLTON, A.E.; MILLS, K.H.G.; LYNCH, M.A. (2005). Role of interleukin-4 in
regulation of age-related inflammatory changes in the hippocampus. J. Biol. Chem.
v. 280: p. 9354-9362.
ODBILEG, R.; KONNAI, S.; OHASHI, K.; ONUMA, M.(2005). Molecular cloning and
phylogenetic analysis of inflammatory cytokines of Camelidae (llama and camel).J.
Vet. Med. Sci. v. 67: p. 921-925.
OH, E.C.; KHAN, N.; NOVELLI, E.; KHANNA, H.; STRETTOI, E.; SWAROOP, A.
(2007). Transformation of cone precursors to functional rod photoreceptors by bZIP
transcriptional factor NRL. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. v. 104: p. 1679–1684.
OISO, Y.; KOTOYORI, J.; MURASE, T.; ITO, Y.; KOZAWA, O. (1993). Effect of
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide on vaso- pressin-induced
proliferation of aortic smooth muscle cells: comparison with vasoactive intestinal
polypeptide. Biochem. Cell Biol. v. 71: p. 525-536.
OJIMA, T.; TAKAGI, H.; SUZUMA, K.; OH, H.; SUZUMA, I.; OHASHI, H.;
WATANABE, D.; SUGANAMI, E.; MURAKAMI, T.; KURIMOTO, M.; HONDA, Y.;
YOSHIMURA, N. (2006). EphrinA1 inhibits vascular endothelial growth factor-
induced intracellular signaling and suppresses retinal neovascularization and blood-
retinal barrier breakdown. Am. J. Pathol. v. 168: p. 331-339.
OPAL, S.M. and DE PALO, V.A. (2000). Anti-inflamatory cytokines. Chest. v. 117: p.
1162-1172.
OPPENHEIM, R.W. (2001). Cell death during development of the nervous system.
Ann. Neurosc. v. 14; p. 453-501.
OWENS T, WHEELER R.D.; ZEHNTNER S.P. (2006). Cytokines in CNS
Inflammation Cytokines and the CNS.2ª Edição. (pp. 113-136). Boca Raton (FL):
CRC Press. Taylor & Francis Group.
OZAKI, K. and LEONARD, W.J. (2002). Cytokine and Cytokine Receptor Pleiotropy
and Redundancy. J. Biol. Chem.. v. 277: p. 29355-29358.
OZAWA, Y.; NAKAO, K.; SHIMAZAKI, T.; SHIMMURA, S.; KURIHARA, T.; ISHIDA,
S.; YOSHIMURA, A.; TSUBOTA, K.; OKANO, H. (2007). SOCS3 is required to
temporally fine-tune photoreceptor cell differentiation. Dev. Biol. v. 15: p. 591-600.
OZAWA Y, NAKAO K, SHIMAZAKI T, TAKEDA J, AKIRA S, ISHIHARA K, HIRANO
T, OGUCHI Y, OKANO H (2004) Downregulation of STAT3 activation is required for
presumptive rod photoreceptor cells to differentiate in the postnatal retina. Mol. Cell.
Neurosci. v. 26 : p. 258-270.
PARK, K.W
.; LEE, D.Y.; JOE, E.H.; KIM, S.U.; JIN, B.K. (2005). Neuroprotective role
of microglia expressing interleukin-4. J. Neurosci. Res. v. 81: p. 397-402.
PARKIN, J. and COHEN, B. (2001). An overview of the immune system. Lancet v.
357: p. 1777–1789.
PATEL, B.K.; WANG, L.M.; LEE, C.C.; TAYLOR, W.G.; PIERCE, J.H.L.A.;
ROCHELLE, W.J. (1996). Stat-6 and Jak1 are common elements in platelet-derived
growth factor and interleukin-4 signal transduction pathways in NIH 3T3 fibroblasts.
J. Biol. Chem. v. 271: p. 22175-22182.
PATIL, B.B. and DOWD, T.C. (2000). Focus on: The eye. Physiological functions of
the eye. Current Anaesthesia &Critical Care. v. 11: p. 293-298.
PATTERSON, P.H. (1993). Cytokines and the function of the mature nervous
system. C.R. Acad. Sci. Paris. v. 316: p. 1150-1157.
PAUL, W.E. (1991). Interleukin-4: A Prototypic Immunoregulatory Lymphokine
BLOOD. v. 77: p.1859–1870.
PEARSON R, CAQTSICAS M, BECKER D, MOBBS P. (2002). Purinergic and
muscarinic modulation of the cell cycle and calcium signaling in the chick retinal
ventricular zone. J. Neurosci. v. 22: p. 7569-7579.
PEICHL L. (2005). Diversity of mammalian photoreceptor properties: adaptations to
habitat and lifestyle? Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. v. 287; p. 1001-1012.
PEIRSON, S. and FOSTER, R.G. (2006). Melanopsin: Another Way Review of
Signaling Light. Neuron. v. 49: p. 331–339.
PENG, G.H.; AHMAD, O.; AHMAD, F.; LIU, J.; CHEN, S. (2005). The photoreceptor-
specific nuclear receptor Nr2e3 interacts with Crx and exerts opposing effects on the
transcription of rod versus cone genes. Hum. Mol. Genet. v. 14: p. 747-764.
PERNIS, A.B. and ROTHMAN, P.B. (2002). JAK-STAT signaling in asthma. J. Clin.
Invest. v. 109: p. 1279-1283
PERRY, V.H.; HENDERSON, Z.; LINDEN, R. (1983). Postnatal changes in retinal
ganglion cell and optic axon population in the pigmented rat. J. Comp. Neurol. v.
219: p. 356-368.
POO, M.M. (2001). Neurotrophins as synaptic modulators. Nat. Rev. Neurosci. v.2:
p. 24-32.
POUSSET, F.; CREMONA, S.; DANTZER, R.; KELLEY, K.; PARNET, P. (1999).
Interleukin-4 and interleukin-10 regulate IL1-β induced mouse primary astrocyte
activation: A comparative study. Glia. v. 26:p. 12-21.
PRADA, C.; PUGA, J.; PEREZ-MENDEZ, L.; LOPEZ, R.; RAMIREZ, G. (1991).
Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the chick retina. Eur. J. Neurosci.
v. 3 : p. 559–569.
PRESLAND, A. (2007). Applied ocular physiology and anatomy. Anaes. .Intens.
Care Medicine. v. 8: p. 9.
RABER, J.; SORG, O.; HORN, T.F.W.; YU, N.; KOOB, G.F.; CAMPBELL, I.L. ;
BLOOM, F.E. (1998). Inflammatory cytokines: putative regulators of neuronal
and neuro-endocrine function. Brain Res. Rev. v. 26: p. 320-326.
RAPAPORT, D.H. and STONE, J. (1984) The area centralis of the retina in the cat
and other mammals: focal point for function and development of the visual system.
Neuroscience.v. 11:p. 289-301.
RAPAPORT, D.H.; WONG, L.L.; WOOD, E.D.; YASUMURA, D.; LAVAIL,
M.M.(2004). Timing and topography of cell genesis in the rat retina.J. Comp. Neurol.
v. 474: p. 304-324.
RAYMOND, P.A. and BARTHEL, L.K. (2004). A moving wave patterns the cone
photoreceptor mosaic array in the zebrafish retina.Int J. Dev. Biol. v. 48: p. 935-945.
REESE, B.E. and COLELLO, R.J. (1992). Neurogenesis in the retinal ganglion cell
layer of the rat. Neuroscience. v. 46: p. 419-429.
REH, T.A. and LEVINE, E.M. (1998) Multipotential stem cells and progenitors in the
vertebrate retina. J. Neurobiol. v. 36: p. 206–220.
REH, T. A. (1991). Determination of cell fate during retinal histogenesis: intrinsic and
extrinsic mechanisms. In Development of the Visual System. (ed. D. M. -K. Lam
and C. J. Shatz), pp. 79-94. Cambridge: MIT Press.
REHEN, S.K.; VARELLA, M.H.; FREITAS, F.G.; MORAES, M.O.; LINDEN, R. (1996).
Contrasting effects of protein synthesis inhibition and of cyclic AMP on apoptosis in
the developing retina. Development. v. 122: p. 1439-1448.
RESNITZKY, D.M.; GOSSEN, H.; BUJARD, S.; REED, I. (1994). Acceleration of the
G1/S phase transition by expression of cyclins D1 and E with an inducible system.
Mol. Cell. Biol. v. 14: p. 1669–1679.
RHEE, K.D. ; GOUREAU, O. ; CHEN, S. ; YANG, X.J. (2004). Cytokine-induced
activation of signal transducer and activator of transcription in photoreceptor
precursors regulates rod differentiation in the developing mouse retina. J. Neurosci.
v. 24 : p. 9779–9788.
ROBERTS, M.R.; SRINIVAS,M.; FORREST, D.; MORREALE, D.E.; ESCOBAR, G.;
REH, T.A. (2006). Making the gradient: thyroid hormone regulates cone opsin
expression in the developing mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. v. 103: p.
6218–6223.
ROBINSON, S.R.; RAPAPORT, D.H.; STONE, J. (1985). Cell division in the
developing cat retina occurs in two zones. Brain Res. v. 351: p. 101-109.
RODIECK, R.W. (1998). The First Steps in Seeing (Sinauer, Sunderland,
Massachusetts)
ROSE-JOHN, N. and HEINRICH, P.C. (1994). Soluble receptors for cytokines and
growth factors: generation and biological function. Biochem. J. v. 300: p. 281-290.
ROTHERMEL, A. and LAYER, P.G. (2003). GDNF regulates chicken rod
photoreceptor development and survival in reaggregated histotypic retinal spheres.
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. v. 44: p. 2221-2228.
ROUVEIX, B. (1997). Clinical pharmacology of cytokines. Eur. Cytok. Netw. v. 8: p.
291–293.
RUSSELL, S.M.; KEEGAB, A.D.; HARADA, N.; NAKAMURA, Y.; NOGUCHI, M.;
LELAND, P.; FRIEDMANN, M.C.; MIYAJIMA, A.; PURI, R.K. e PAUL, W.E. (1993).
Interleukin-2 receptor gamma chain: a functional component of the interleukin-4
receptor. Science. v 262: p. 1880-1883.
RUSSO, A. A.; JEFFREY, P.D.; PAVLETICH, N.P. (1996) Structural basis of cyclin-
depent kinaseactivation by phosphorilation. Nat. Struct. Biol. v. 3: p. 696-700.
SARDER, M.; SAITO, H.; ABE, K. (1993). Interleukin-2 promotes survival and neurite
extension of cultured neurons from fetal rat brain. Brain Res. v. 625: p. 347-350.
SAWADA, M.; ITOH, Y.; SUZUMURA, A.; MARUNOUCHI, T (1993). Expression of
cytokine receptors in cultured neuronal and glial cells. Neurosci. Lett. v. 160: p. 131-
134.
SCHINDER, A.F. and POO, M. (2000).The neurotrophin hypothesis for synaptic
plasticity. Trends Neurosci. v. 12: p. 639-45.
SCHROETER, M. and JANDER, S. (2005). T-cell cytokines in injury-induced neural
damage and repair. Neuromol. Med. v. 7: p. 183-195.
SCHULTE, D. and BUMSTED-O'BRIEN, K.M. (2007). Molecular mechanisms of
vertebrate retina development: Implications for ganglion cell and photoreceptor
patterning. Brain Res. v. 1192: p. 151-164.
SCHULZ-KEY, S.; HOFMANN, H.; BEISENHERZ-HUSS, C.; BARBISCH, C.;
KIRSCH, M. (2002). Ciliary neurotrophic factor as a transient negative regulator of
rod development in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. v. 43: p. 3099-3108.
SCHWEIGERER, L.; MALERSTEIN, B.; NEUFELD, G.; GOSPODAROWICZ, D.
(1987). Basic fibroblast growth factor is synthesized in cultured retinal pigment
epithelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 143: p. 934–940.
SENGELAUB, D.R.; DOLAN, R.P.; FINLAY, B.L.(1986). Cell generation, death, and
retinal growth in the development of the hamster retinal ganglion cell layer. J. Comp.
Neurol. v. 246: p. 527-543.
SHERR, C.J. and ROBERTS, J.M. (1999). CDK inhibitors: positive and negative
regulators ofG1-phase progression. Genes Dev. v. 13: p. 1501-12.
SHERWOOD, N.M.; KRUECKL, S.L.; MCRORY, J.E.(2000). The origin and function
of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/glucagon
superfamily. Endocr. Rev. v. 21: p. 619-670.
SHOLL-FRANCO, A.; MARQUES, P.M.B.; PAES-DE-CARVALHO, R, ARAUJO,E,G,
(2000) Effect of spleen-cell-conditioned medium on [
3
H]-choline uptake by retinal
cells in vitro is mediated by IL-2. Neuroimmunomodulation. v. 7: p. 195-207.
SHOLL-FRANCO, A.; FIGUEIREDO, K.G.A.; ARAUJO, E.G. (2001a). Interleukin-2
and interleukin-4 increase the survival of retinal ganglion cells in culture.
NeuroReport v. 12: p. 109-112.
SHOLL-FRANCO, A.; MARQUES, P.M.B.; PAES-DE-CARVALHO, R.; ARAUJO,
E.G. (2001b). Antagonistic and synergistic effects of combined treatment with
interleukin-2 and interleukin-4 on mixed retinal cell cultures. J. Neuroimmunol. v.
113: p. 40-48.
SHOLL-FRANCO, A.; FIGUEIREDO, C.M.; MARQUES, P.M.B.; ARAUJO, E.G.
(2002). Interleukin-4 increases the GABAergic phenotype in rat retinal cell cultures:
involvement of muscarinic receptors and protein kinase C. J. Neuroimmunol. v. 133:
p. 20-29.
SHUBINSKY, G. and SCHLESINGER, M. (1996). The mechanism of interleukin 4-
induced down-regulation of CD38 on human B cells. Cell Immunol. v. 173: p. 87-95.
SICINSKI, P.; DONAHER, J.L.; PARKER, S.B.; LI, T.; FAZELI, A.; GARDNER, H.;
HASLAM, S.Z.; BRONSON, R.T.; ELLEDGE, S.J.; WEINBERG, R.A. (1995). Cyclin
D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast.
Cell. v. 82: p.621-630.
SMERDON, D. (2000). Focus on the eye. Anatomy of the eye and orbit. Cur
Anaes. Critical Care v. 11; p. 286-292.
SNAPPER, C.M.; FINKELMAN, F.D.; PAUL, W.E. (1988). Regulation of IgG1 and
IgE Production by Interleukin 4. Immunol. Rev. v. 102: p. 51–75.
SNAPPER, C.M. and PAUL, W.E. (1987). Interferon-gamma and B cell stimulatory
factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production. Science. v. 236: p.944-947.
SOUTHGATE, K and NEWBY, A.C. (1990). Serum-induced proliferation of rabbit
aortic smooth muscle cells from the contractile state is inhibited by 8-Br-cAMP but not
8-Br-cGMP. Atherosclerosis. v. 82: p. 113-123.
SREDNI-KENIGSBUCH, D. (2002). Th1/Th2 cytokines in the central nervous system.
Int. J. Neurosci. v.6: p. 665-703.
STENKAMP, D.L.; GREGORY, J.K.; ADLER, R. (1993). Retinoid effects in purified
cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. v. 34 : p. 2425–2436.
STIEMKE, M.M. and HOLLYFIELD, J.G. (1995). Cell birthdays in Xenopus laevis
retina. Differentiation. v. 58 : p. 189-193.
STORK, P.J.S. and SCHMITT, J.M. (2002). Crosstalk between cAMP and Map
kinase signaling in the regulation of cell proliferation. Trends Cell Biol. v. 12:p. 258-
266.
STRETTOI, E.; MEARS, A.J.; SWAROOP, A. (2004). Recruitment of the rod pathway
by cones in the absence of rods. J. Neurosci. v. 24: p. 7576–7582.
SUZUKI, T.; INO, K.; KIKKAWA, F.; UEHARA, C.; KAJIYAMA, H.; SHIBATA, K.;
MIZUTANI, S. (2002). Neutral Endopeptidase/CD10 expression during phorbol ester-
induced differentiation of choriocarcinoma cells through the protein kinase C- and
extracellular signal-regulated kinase-dependent signalling pathway. Placenta. v. 23:
p. 475-482.
SWAIN, P.K.; CHEN, S.; WANG, Q.L.; AFFATIGATO, L.M.; COATS, C.L.; BRADY,
K.D.; FISHMAN, G.A.; JACOBSON, S.G. ; SWAROOP, A. ; STONE, E. ; SIEVING,
P.A. ; ZACK, DJ. (1997). Mutations in the cone-rod homeobox gene are associated
with the cone-rod dystrophy photoreceptor degeneration. Neuron. v. 19: p. 1329-
1336.
SWAROOP, A.; XU, J.Z.; PAWAR, H.; JACKSON, A.; SKOLNICK, C.; AGARWAL, N.
(1992). A conserved retina-specific gene encodes a basic motif/leucine zipper
domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. v. 89 : p. 266–270.
SWAROOP, A.; WANG, Q.L.; WU, W.; COOK, J.; COATS, C.; XU, S.; CHEN, S.;
ZACK, D.J.; SIEVING, PA.(1999). Leber congenital amaurosis caused by a
homozygous mutation (R90W) in the homeodomain of the retinal transcription factor
CRX: direct evidence for the involvement of CRX in the development of
photoreceptor function. Hum. Mol. Genet. v. 8: p. 299-305.
SZELÉNYI, J. (2001). Cytokines and the central nervous system. Brain Res. Bull. v.
54: p. 329-338.
TAIEB, J.; LECA, G.; AUFFREDOU, M.T.; GALANAUD, P.; VAZQUEZ, A. (1991). IL-
4 counteracts anti-µ-induced human B cell proliferation: involvement of a cAMP-
dependent inhibitory pathway. Eur .Cytok. Netw. v. 2: p. 265-272.
TAKEDA, K.; KISHIMOTO, T.; AKIRA, S. (1997). STAT6: its role in interleukin 4-
mediated biological functions. J. Mol. Med. v. 75: p.317-326.
TANIHARA, H.; INATANI, M.; HONDA, Y. (1997). Growth factors and their receptors
in the retina and pigment epithelium. Prog. Retin. Eye Res. v. 16: p. 271-301.
TAYA, Y. (1997). RB kinases and RB-binding proteins: new points of view. Trends
Biochem Sci. v. 22: p. 14-17.
TURNER, D.L. and CEPKO, C.L. (1987). A common progenitor for neurons and glia
persists in rat retina late in development. Nature. v. 328: p. 131–136.
TURNER, D.L.; SNYDER, E.Y.; CEPKO, C.L. (1990). Lineage-independent
determination of cell type in the embryonic mouse retina. Neuron. v. 4: p. 833–845.
VADIVELOO, P.K.; FILONZI, E.L.; STANTON, H.R.; HAMILTON, J.A. (1997). G1
phase arrest of human smooth muscle cells by heparin, IL-4 and cAMP is linked to
repression of cyclin D1 and cdk2. Atherosclerosis. v. 133: p. 61-69.
VARELLA, M.H.; DE MELLO, F.G.; LINDEN, R. (1999). Evidence for anti-apoptotic
role of dopamine In developing retinal tissue. J. Neurochem. v. 73: p. 485-492.
VITETTA, E.S.; OHARA, J.; MYERS, C.D.; LAYTON, J.E.; KRAMMER, P.H.; PAUL,
W.E. (1985). Serological, biochemical, and functional identity of B cell-stimulatory
factor 1 and B cell differentiation factor for IgG1. J. Exp. Med. v. 162: p. 1726–1731.
WATANABE, T. and RAFF, M.C. (1990). Rod photoreceptor development in vitro:
intrinsic properties of proliferating neuroepithelial cells change as development
proceeds in the rat retina. Neuron. v. 4: p. 461–467.
WELLS, J. A. and DE VOS, A. M. (1996). Hematopoietic receptor complexes.
Annu. Rev. Biochem. v. 65: p. 609-634.
WETTS, R. and FRASER, S.E. (1989). Multipotent precursors can give rise to all
major cell types of the frog retina. Science. v. 239: p. 1142–1145.
YANAGIHARA, Y.; BASAKI, Y.; IKIZAWA, K.; KAJIWARA, K. (1997). Possible role of
nuclear factor-kappa B activity in germline C epsilon transcription in a human Burkitt
lymphoma B cell line. Cell Immunol. v. 176: p. 66-74.
YOUNG, R.W. (1985). Cell proliferation during postnatal development of the retina in
the mouse. Brain Res. v. 353; p. 229–239.
YOUREY, P.A.; GOHARI, S.; SU, J.L.; ALDERSON, R.F. (2000). Vascular
endothelial cell growth factors promote the In vitro development of rat photoreceptor
cells. J. Neurosci. v. 20: p. 6781-6788.
ZAMORANO, J.; WANG, H.Y.; WANG, L.M.; PIERCE, J.H.; KEEGAN, A.D. (1996).
IL-4 protects cells from apoptosis via the insulin receptor substrate pathway and a
second independent signaling pathway. J. Immunol. v. 157: p. 4926–4934.
ZHANG, S.S.; WEI, J.; QIN, H.; ZHANG, L.; XIE, B.; HUI, P.; DEISSEROTH, A.;
BARNSTABLE, C.J.; FU, X.Y. (2004). STAT3-mediated signaling in the
determination of rod photoreceptor cell fate in mouse retina. Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. v. 45: p. 2407–2412.
ZHANG, S.S.; FU, X.Y. ; BARNSTABLE, C.J.(2002). Tissue culture studies of retinal
development. Methods. v. 28: p. 439–447.
ZIMMERMAN, R.P.; POLLEY, E.H.; FORTNEY, R.L. (1988). Cell birthdays and rate
of differentiation of ganglion and horizontal cells of the developing cat's retina. J.
Comp. Neurol. v. 274 :p. 77-90.
ANEXO I
Manuscrito intitulado “Interleukin-4 blocks proliferation of retinal progenitor
cells and increases rod photoreceptor differentiation through distinct
signalling pathways”
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