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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)
KARINA HELENA MORAIS CARDOZO
Estudos de compostos fotoprotetores da radiação
ultravioleta em algas:
aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)
São Paulo
Data do Depósito na SPG:
05/11/2007
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KARINA HELENA MORAIS CARDOZO
Estudos de compostos fotoprotetores da radiação
ultravioleta em algas:
Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)
Tese apresentada ao Instituto de
Química da Universidade de São Paulo para
obtenção do Título de Doutor em Ciências
(Bioquímica)
Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo
São Paulo
2007
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Karina Helena Morais Cardozo
Estudos de compostos fotoprotetores da radiação ultravioleta em algas:
Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica).
Aprovado em: ____________
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Ao David pelo amor, paciência, dedicação e incentivo.
A minha avó, meus pais e irmãos pelo amor, compreensão
e apoio de sempre. Sem vocês eu não teria chegado aqui.
AGRADECIMENTOS
Ao meu querido orientador Dr. Pio Colepicolo, cuja confiança, estímulo e
carinho foram essenciais nestes anos para o meu amadurecimento científico.
Ao meu querido amigo Ernani por toda ajuda, suporte, carinho e apoio
incondicional. Obrigada por ter estado ao meu lado em todos os momentos que
precisei, sempre torcendo por mim. Seu incentivo durante minha carreira científica
fez com que eu chegasse aqui.
Ao Betão pela colaboração, amizade e ajuda constante. Obrigada por ter me
ensinado muito além da técnica de espectrometria de massas. Sua participação e
dedicação foram importantíssimas para que este trabalho fosse concluído.
Ao Dr. Donat P. Häder, do Institut für Botanik und Pharmazeutische Biologie,
Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen, Alemanha pela colaboração científica e
incentivo ao meu aprimoramento profissional.
A Profa. Dra. Eliane Marinho Soriano, da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte por ter coletado e identificado as macroalgas utilizadas neste trabalho.
A minha querida e grande amiga Thais pela amizade, estímulo e suporte. O
mais legal de todo este trabalho foi ter colaborado com você. Nunca esqueça que
sem você eu não teria conseguido.
A Van pela amizade, carinho e preciosos conselhos. Todos estes anos de
convivência mostraram que poucas pessoas podem ser como você: sincera, amiga,
bem humorada e com um coração enorme.
Ao Val por sua amizade e valiosa contribuição nos experimentos por
espectrometria de massas.
As minhas amigas do coração Van, Tha, Angelita e Drica. Sinto-me lisonjeada
em ter amigas como vocês. Obrigada por todos os momentos, felizes e tristes, em
que passamos juntas.
Aos companheiros de laboratório de diferentes épocas: Paty Lopes, Tona,
Teresa, Jac, Helô, Alcely, Keith, Marcelo, Sara, Maísa, Lígia, Ana Maria, Anderson,
João, Diogo, Patrícia, Douglas, Paula, Faby, Vânia, Felipe, Meron, Sidney e
Humberto pela convivência e amizade. Em especial a Faby que me ajudou muito na
realização de vários experimentos.
Aos meus queridos amigos que fiz durante meu estágio na Alemanha que me
acolheram tão bem e me ajudaram em tudo que fosse possível: Sebb, Jenny,
Manfred, Martin e Peter. Obrigada também as minhas amigas Cyn, Julia, Birgit e aos
amigos Sebb e Achim que tornaram minha vida na Alemanha muito mais fácil e
inesquecível.
Aos iniciações científicas Dani, Vitor, Luiza e Evandro pela ajuda e discussões
nos experimentos.
Ao Ed, pelo carinho e ajuda valiosa em todos os momentos.
Ao Diogo e Felipe pela amizade e discussões científicas que foram muito
produtivas e importantes para o desenvolvimento desta tese.
Ao Marconi pela grande ajuda na parte estatística.
A Bruna Mohovic pela discussão e valiosos comentários nos experimentos de
exposição ao UV;
A Lu do Instituto de Biologia pela colaboração e disposição para responder
várias questões minhas sobre algas.
Ao meu mais recente colaborador Mario Carignan do Instituto Nacional de
Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP), Mar de Plata, Argentina, que em
poucos dias tornou-se um amigo muito especial. Obrigada por toda ajuda e
sugestões preciosas na etapa final deste trabalho.
Ao pessoal da pós-graduação pela disposição em atender bem e excelente
trabalho;
A Tati pela revisão deste trabalho.
A minha avó, meus pais, meus irmãos e familiares pelo amor, compreensão e
apoio de sempre. Obrigada por entenderem minha ausência.
Ao meu querido sogro Edmur pelo carinho, incentivo e por acreditar em mim.
Ao David pelo amor, incentivo e compreensão. Sem sua ajuda eu não teria
conseguido. A sua presença faz com que minha vida seja plena
Ao DAAD (Deutscher Akademischer Austausch Dienst) pelo auxílio financeiro
que possibilitou o estágio na Alemanha.
À Fapesp pelo apoio financeiro essencial para o desenvolvimento deste
trabalho.
“
Cada qual cuide de seu enterro, impossível não há”
Jorge Amado
RESUMO
Cardozo, K.H.M. Estudos de compostos fotoprotetores da radiação ultravioleta em
algas: Aminoácidos tipo Micosporinas (MAAs). 2007. 168p. Tese (Doutorado) -
Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Instituto de Química,
Universidade de São Paulo, São Paulo.
Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos responsáveis pela
fotoproteção no ultravioleta de diversos organismos aquáticos. São sintetizados pela
via do ácido chiquímico por algas, bactérias e fungos, de maneira similar à síntese
de flavonóides em plantas superiores.
Neste trabalho foram conduzidos estudos relacionados a estes compostos em
algas. Protocolos de extração de diferentes algas foram testados alterando-se
parâmetros como solventes, temperatura e condições de incubação. Os resultados
mostraram que dependendo da alga estudada, diferentes condições podem mudar a
concentração de MAAs extraída, ressaltando a importância de se testar diversos
parâmetros na extração, evitando assim valores sub- ou superestimados de
concentrações. O desenvolvimento de um método por HPLC permitiu a separação
de 6 MAAs com boa resolução. A caracterização estrutural foi realizada
majoritariamente por espectrometria de massas utilizando diferentes tipos de
analisadores. Estas análises permitiram a proposição de mecanismos de
fragmentação descritos pela primeira vez para esta classe de compostos e
possibilitaram a identificação de diferentes MAAs em algumas micro e macroalgas.
Ensaios in vitro foram realizados com o extrato obtido da macroalga Gracilaria
domingensis no intuito de avaliar seu potencial uso em formulações cosméticas
direcionadas à fotoproteção. Os testes de estabilidade quanto ao pH, temperatura e
exposição à radiação ultravioleta bem como os ensaios de citotoxicidade,
fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar sugeriram que este extrato
pode ser promissor quando incorporado em formulações direcionadas para a
fotoproteção. Este extrato não apresentou atividade antioxidante significativa.
Os estudos com o dinoflagelado Prorocentrum minimum isolado de duas
regiões diferentes, quando exposto às radiações ultravioleta, mostraram que houve
uma indução das MAAs em ambas linhagens em todos os tratamentos realizados no
período de 72 h. A indução foi mais rápida e pronunciada na linhagem oriunda de
Lisboa, em Portugal do que na linhagem proveniente de Kattegat, na Dinamarca.
Estes dados estão de acordo com as características do local de origem das
linhagens, uma vez que os dinoflagelados originários de Portugal em seu meio
natural estavam sujeitos a maiores irradiações. Medidas do rendimento quântico do
fotossistema II indicaram que a síntese e acúmulo de MAAs em P. minimum isolada
de Lisboa ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético e na supressão
de espécies reativas de oxigênio desta microalga quando comparada aos indivíduos
da mesma espécie de regiões com menores irradiações.
Palavras-chave: Aminoácidos tipo micosporinas, MAAs, Compostos Fotoprotetores,
Algas, Radiação Ultravioleta, Espectrometria de Massas.
ABSTRACT
Cardozo, K.H.M. Studies of ultraviolet sunscreen compounds in algae: Mycosporine-
like amino acids (MAAs). 2007. 168p. PhD Thesis - Graduate Program in
Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Mycosporine-like amino acids (MAAs) are chemically related water soluble
compounds responsible for UV photoprotection in many aquatic organisms. They are
biosynthesized via the shikimate pathway by algae, bacteria and fungi in a similar
manner to the biosynthesis of UV-screening flavonoids in terrestrial plants.
In this work, studies related to this class of compounds were performed with
algae. Extraction protocols of some algae were tested using diverse solvents at
different temperature. The results showed that depending on the organism examined,
both solvent concentration and temperature affected extraction efficiency and final
MAA concentration. The improvement of a HPLC method separated a mix of 6 MAAs
with good resolution. The structural characterization was made by mass
spectrometry using different analyzers. The analysis by mass spectrometry allowed
the proposition of new mechanisms of fragmentation and identification of different
MAAs in some micro and macroalgae.
In vitro preliminary assays were performed to evaluate the potential use of
Gracilaria domingensis extract in suncare products. The extract showed no
antioxidant activity, however the pH, temperature and UV exposure stability, as well
the citotoxicity, phototoxicity and sun protection factor showed a potential commercial
utilization for the extracts.
The UV exposure experiments with the dinoflagellate Prorocentrum minimum
isolated from Lisbon, Portugal and Kattegat, Denmark, showed that MAAs were
induced in all treatments during 72 h. The induction was faster in the species from
Lisbon than the ones from Kattegat. These data are in agreement with local isolation
place, since the dinoflagellates from Portugal are submitted to high irradiance regime
in their natural environment. The quantum yield of photosystem II suggested that the
over production of MAAs by P. minimum from Lisbon protects the photosynthetic
apparatus, indicating that MAAs act as spectrally specific UV sunscreens in
phytoplankton.
Keywords: Mycosporine-like amino acids, MAAs, Sunscreen Compounds, Algae
Ultraviolet Radiation, Mass Spectrometry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Espectro da radiação ultravioleta. ..............................................................22
Figura 2. Vias de interconversão de diferentes MAAs propostas por Carreto e
colaboradores (2005). Os retângulos tracejados indicam compostos ainda não
caracterizados. Adaptado de Carreto et al., 2005. ....................................................27
Figura 3. Conversão por bactérias de chinorina em micosporina-glicina (moderado
antioxidante) e deoxigadusol (forte antioxidante) por bactérias (Dunlap & Shick,
1998). ........................................................................................................................29
Figura 4. Intermediários e enzimas da via do ácido chiquímico. DAHP: 3-deoxi-
arabino-heptulosonato-7-fosfato; EPCP: 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato. Enzimas:
(1) DAHP sintase; (2) DHQ sintase; (3) DHQ dehidratase; (4) chiquimato
desidrogenase; (5) chiquimato quinase; (6) EPCP sintase; (7) corismato sintase. R
2
:
aminoácidos e aminoálcools caracterizando diferentes MAAs (adaptado de Shick &
Dunlap, 2002)............................................................................................................33
Figura 5. Esquema simplificado da absorção de luz por um fotoprotetor mostrando
vias de dissipação por calor (indicada por ∆) e pela formação de espécies reativas.
SOD: superóxido dismutase; LH: lipídio poliinsaturado (modificado de Dunlap et al.,
1998b). ......................................................................................................................39
Figura 6. Análogos sintéticos de MAAs para uso em fotoprotetores e respectivos
comprimentos de onda máximos de absorção (
λ
max
). ...............................................41
Figura 7. Esquema simplificado dos componentes principais de um espectrômetro de
massas que indicam os modos de introdução da amostra, ionização e analisadores
utilizados neste trabalho............................................................................................44
Figura 8. Esquema simplificado de uma fonte de ionização por electrospray. O
analito é inserido no sistema por meio de um capilar (à esquerda). A diferença de
potencial entre o capilar e o cone leva à formação de gotículas carregadas que
sofrem evaporação. Adaptado de Gates et al., 2006. ...............................................46
Figura 9. Esquema simplificado do analisador do tipo quadrupolo (adaptado de
Gates, 2007)..............................................................................................................47
Figura 10. Esquema de um analisador Ion trap (adpatado de Gates, 2007).............49
Figura 11. Esquema de um analisador TOF (adaptado de Gates, 2007)..................51
Figura 12. Esquema simplificado de um analisador FT-ICR. ....................................52
Figura 13. Organismos escolhidos para os estudos das MAAs: Gracilaria
tenuistipitata, Gracilaria domingensis (foto: Eliane Marinho-Soriano), Gracilaria
birdiae (foto: Eliane Marinho-Soriano) e o dinoflagelado Prorocentrum minimum.....56
Figura 14. A) Espectro da radiação solar simulada e B) detalhe do espectro entre
250 e 400 nm. ...........................................................................................................63
Figura 15. Passos gerais utilizados na extração das MAAs......................................64
Figura 16. Protocolo de extração das MAAs presentes em Gracilaria tenuistipitata.66
Figura 17. Reação de DPPH com uma molécula antioxidante doadora de próton
(LH). ..........................................................................................................................77
Figura 18. Medidas da fluorescência da clorofila utilizando o método do pulso de
saturação. Detalhes das equações estão mostrados no texto. Extraído de Mohovic,
2005. .........................................................................................................................84
Figura 19. Formação de DCF altamente fluorescente a partir da oxidação de DCFH-
DA por espécies reativas geradas intracelularmente pela exposição à UVR.
Adaptado de He & Hader, 2002. ...............................................................................86
Figura 20. Perfil cromatográfico do extrato GT-2 com monitoramento em 330 nm e
espectros de absorção no UV das frações coletadas. TR (min) / λ
max
(nm): F1: 3,7 /
320; F2: 4,2 / 330; F3: 6,9 / 334; F4: 9,6 / 332; F5: 17,0 / 360. .................................91
Figura 21. Análise da fração F1 por LC-UV-MS. A) Cromatograma com detecção no
UV; B) Cromatograma obtido pela somatória dos íons totais (TIC); C) Espectro de
massas para o pico com tempo de retenção igual a 4,4 min e D) Espectro de massa
para o pico com tempo de retenção igual a 3,8 min. Energia de colisão: 20 eV. ......93
Figura 22. ESI-MS
2
das MAAs (a) palitina, (b) palitina deuterada, (c) asterina, (d)
asterina deuterada, (e) palitinol, (f) palitinol deuterado, (g) chinorina e (h) chinorina
deuterada. A abundância relativa foi de 3 x 10
7
a 3 x 10
8
. Energia de colisão: 20eV.
..................................................................................................................................94
Figura 23. Mecanismo proposto de fragmentação para as MAAs identificadas como
palitina, chinorina, asterina e palitinol. A-M: principais íons produtos para as
moléculas não marcadas (quando X=H) e para as moléculas marcadas (quando
X=D). Y= H ou D dependendo da fragmentação inicial (ver detalhes no texto). .......97
Figura 24. A) espectro MS
2
da fração F5 não deuterada e B) espectro MS
2
do
análogo deuterado. .................................................................................................100
Figura 25. Mecanismo proposto de fragmentação para a fração F5 identificada como
paliteno e/ou usujireno (PM = 284,3 g.mol
-1
). A) Molécula não deuterada com m/z
285 e B) molécula deuterada com m/z 290. ............................................................101
Figura 26. Espectros de MS
2
da nova MAA isolada de corais A) composto não
deuterado e B) análogo deuterado..........................................................................104
Figura 27. Estrutura provável da nova MAA identicada como palitina-treonina. .....104
Figura 28. Perfil cromatográfico das frações coletadas por Sephadex LH-20
contendo MAAs. A) frações 30-35; B) 36-39, pico 5 (TR=17min); C) 40-45, pico 5
(TR=17 min); D) 46-47, pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min), pico 4 (TR=9,6
min); E) 48-50, pico 1 (TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min); F) 51-
54, igual fração E; G) 55-62, pico 1 (TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min); H) 63-65; e I)
66-76 igual fração G; J) 77-85.................................................................................106
Figura 29. Espectros MS
2
e MS
3
de alta resolução obtidos para o palitinol em FT-
ICR-MS
n
. A) Espectro MS
2
de m/z 303; B) espectro MS
3
de m/z 288 proveniente de
(A); C) espectro MS
3
de m/z 244 proveniente de (A); D) espectro MS
3
de m/z 230
proveniente de (A); e E) espectro MS
3
de m/z 186 proveniente de (A)...................107
Figura 30. Mecanismo de fragmentação proposto para três MAAs analisadas por alta
resolução mostrando a quebra homolítica que gera a perda inicial do radical metil. A
ordem da rota A pode mudar dependendo da energia utilizada..............................108
Figura 31. A: Perfil cromatográfico das MAAs presentes no extrato GT-1 monitorado
em 330 nm e espectros no UV. TR (min) / m/z [M+H]
+
– pico 1 – chinorina: 6,9 / 333;
pico 2 –: palitina: 7,8 / 245; pico 3 – asterina: 8,8 / 289; pico 4 – porphyra-334: 9,2 /
347; pico 5 – palitinol: 11,4 / 303; pico 6 – paliteno e/ou usujireno: 25,9 / 285. B:
Detalhe da separação entre 6 e 13 min. .................................................................110
Figura 32. Perfil cromatográfico em 330 nm dos extratos de G. tenuistipitata, G.
domingensis, G. birdiae, P. minimum e da matéria-prima Helioguard 365
®
e
espectros de absorção no UV. TR (min): pico 1: 8,1; pico 2: 9,3; pico 3: 10,6; pico 4:
10,9; pico 5: 12,1; pico 6: 14,1; pico 7: 15,0; pico 8: 17,5; pico 9: 19,7; pico 10: 21,1;
pico 11: 24,4; pico 12: 24,5; pico 13: 25,6. O espectro no UV do pico 10 (não
identificado) não foi apresentado (λ
max
= 325 nm)....................................................115
Figura 33. Espectros MS
2
obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z
333 (TR= 8,2 min); B: m/z 245 (TR= 9,4 min); C: m/z 347 (TR= 11,1 min) e D: m/z
285 (TR= 24,9 min) presentes em P. minimum. Os losangos azuis indicam a
molécula protonada.................................................................................................116
Figura 34. Espectros MS
2
obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z
246 (TR= 12,5 min); B: m/z 329 (TR= 15,2 min); C: m/z 347 (TR= 17,8 min), D: m/z
303 (TR= 21,7 min) e E: m/z 299 (TR= 25,9 min) presentes em P. minimum. Os
losangos azuis indicam a molécula protonada........................................................117
Figura 35. Perfil cromatográfico do extrato obtido a partir do produto Helioguard 365
e espectros no UV. TR (min): pico 1- chinorina: 5,8; pico 2 - palitina: 6,0 e pico 3 –
porphyra-334: 13,1. Detalhes das condições experimentais ver itens 3.4.1 e 3.5 ( 120
Figura 36. Espectros de MS
2
por nanospray no modo negativo em analisador Q-TOF
das MAAs A) chinorina (m/z 333) e B) Porphyra-334 (m/z 245)..............................121
Figura 37. Mecanismo de fragmentação proposto para a MAAs di-ácidas chinorina
(m/z 332) e porphyra-334 (m/z 346)........................................................................123
Figura 38. Estruturas analisadas por RMN
1
H. R=H, chinorina e R=CH
3
, porphyra-
334. .........................................................................................................................124
Figura 39. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata. Os retângulos
superiores em branco e preto indicam os períodos de claro e escuro,
respectivamente. Os experimentos foram feitos em triplicatas e as barras indicam os
desvios padrões. Os asteriscos indicam diferenças signficativas entre as últimas
horas de claro e as primeiras de escuro (ANOVA p<0,01)......................................125
Figura 40. Perfil de absorção no UV das amostras GD-1, GD-2 e Helioguard 365
.
................................................................................................................................127
Figura 41. Dados de porcentagem de inibição da formação do radical DPPH A) pelos
extratos contendo MAAs de G. tenuistipitata, G.domingensis e Helioguard 365
®
e B)
pelos flavonóides rutina e a mistura quercetina e isoquercetrina............................129
Figura 42. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1 de G.domingensis em
soluções de diferentes pHs a temperatura ambiente. .............................................131
Figura 43. Monitoramento da absorção no UV em 327 nm ao longo do tempo e em
diferentes temperaturas do extrato aquoso de G. domingensis. .............................133
Figura 44. Espectros de absorção no UV do extrato aquoso (pH= 6,8) de
G.domingensis. A: 20 °C e B: 70 °C........................................................................135
Figura 45. A) Citoxicidade do extrato GD-1 em função da concentração e B)
Fotoxicidade............................................................................................................137
Figura 46. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1, Helioguard 365
e dos
filtros sintéticos MCX e ASB obtidas em espectrofotômetro com monitoramento entre
200-400 nm. As soluções do extrato GD-1 e do Helioguard 365
foram diluídas 10x,
enquanto que dos filtros sintéticos MCX e ASB 1000x. ..........................................140
Figura 47. Medidas do rendimento efetivo do PSII em Prorocentum minimum isolada
de duas regiões diferentes e expostas às radiações PAR e PAR+UVR. Os
retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h
escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01). ...142
Figura 48. Medidas de fluorescência do DCF em culturas de Prorocentum minimum
(Liss) e P. minimum (Katt) após exposição às radiações PAR e PAR+UVR durante
72 h. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h
claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p<
0,01). .......................................................................................................................142
Figura 49. Espectros de absorção no VIS-UV das espécies expostas a PAR+UVR.
A) Prorocentrum minimum isolado de Lisboa e B) P. minimum isolada de Kattegat.
................................................................................................................................144
Figura 50. Perfil cromatográfico em λ igual a 330 nm das MAAs presentes em P.
minimum (Liss) após 48 h de experimento no tratamento com PAR+UVR. TR (min):
pico 1: 2,1; pico 2: 2,6; pico 3: 3,1; pico 4: 4,0; pico 5: 5,2; pico 6: 12,1; pico 7: 16,0;
pico 8: 16,4..............................................................................................................145
Figura 51. Espectros de absorção no UV dos picos obtidos por separação em HPLC.
λ
max
(nm): A) pico 1: 332, pico 3: 310, pico 5: 337, pico 6: 333 e B) pico 2:334, pico 4:
320, pico 7: 357, pico 8: 360. ..................................................................................145
Figura 52. Perfil da variação do conteúdo total das MAAs (pmol.célula
-1
) em culturas
do dinoflagelado P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72
h. As culturas foram expostas a radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os
retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h
escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01). ...146
Figura 53. Concentração das diferentes MAAs (pmol.célula
-1
) em culturas do
dinoflagelado P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h.
As culturas foram expostas a radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os
retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h
escuro......................................................................................................................150
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição de MAAs* em algumas cianobactérias, microalgas e
macroalgas................................................................................................................31
Tabela 2 – Diferentes métodos de ionização para análises por espectrometria de
massas......................................................................................................................45
Tabela 3 – Comprimento de onda máximo (λ
max
), coeficiente de extinção molar
(ε),massa molecular (MM) e principais fragmentos obtidos por ESI-MS
2
de diferentes
MAAs.........................................................................................................................53
Tabela 4 – Protocolos testados para a extração das MAAs......................................65
Tabela 5 – Métodos testados por HPLC para as análises das MAAs. Detalhes das
colunas encontram-se descritos acima. ....................................................................72
Tabela 6 – Porcentagens relativas dos diferentes protocolos de extração para G.
tenuistipitata. .............................................................................................................89
Tabela 7 – Rendimentos das diversas etapas de isolamento das MAAs em Gracilaria
tenuitipitata. ...............................................................................................................91
Tabela 8 – Íons precursores e principais íons produtos das frações F1 a F3 isoladas
de G. tenuistipitata. As razões m/z correspondem às MAAs não deuteradas e m/z
D
2
O aos análogos deuterados. Detalhes de cada produto íon (A-M) serão discutidos
adiante.......................................................................................................................95
Tabela 9 – Dados de alta resolução para as moléculas não marcadas obtidos em Q-
TOF. Condições experimentais estão descritas no item 3.6. ..................................102
Tabela 10 – Dados de alta resolução de MS
2
e MS
3
da fragmentação do palitinol
obtido por ESI-FTICR-MS
n
. As fórmulas moleculares, massas teóricas e massas
experimentais foram listadas para os íons produtos majoritários............................109
Tabela 11 – Íon precursor e principais fragmentos das MAAs identificadas em G.
tenuistipitata utilizando três espectrômetros diferentes...........................................111
Tabela 12 – Identificação dos picos separados pelo método D (Tabela 5), valores
calculados de resolução (Rs) entre dois picos adjacentes e de concentração (ng.mg
extrato
-1
). .................................................................................................................112
Tabela 13 - MAAs identificadas pelo método E, Tabela 5 em espectrômetro com
analisador Ion trap nas diferentes algas estudadas:. Gt: G. tenuistipitata, Gd: G.
domingensis, Gb: G. birdiae, Pu: Porphyra umbilicalis e Pm: Prorocentrum minimum
................................................................................................................................119
Tabela 14 – Valores de citotoxicidade obtidos para o extrato GD-1, cloreto de sódio e
dodecil sulfato de sódio sendo os dois últimos para comparação...........................136
Tabela 15 - Valores de FPS calculados para as diferentes amostras.....................138
Tabela 16 – MAAs identificadas em P. minimum pelos tempos de retenção em
HPLC, espectros no UV e por espectrometria de massas. .....................................146
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABAP: 2,2’-azobis (2-amidinopropano)
ACN: acetonitrila
ANOVA: análise de variância
CFCs: clorofluorcarbonos
CHCl
3
: clorofórmio
CID: dissociação induzida por colisão (collision-induced dissociation)
COLIPA: The European Cosmetic Toiletry and Perfumary Association
D
2
O: água deuterada
Da: daltons
DAD: detector de arranjo de diodos
DAHP: 3-deoxi-arabino-heptulosonato-7-fosfato
DC: corrente direta
DCF: diclorofluoresceína
DCFA: 2,7,-diclorodihidrofluoresceína diacetato
DCFH: 2,7-diclorodihidrofluoresceína
DCFH-DA: 2,7-diclorodihidrofluoresceína diacetato
3-DHQ: 3-dehidroquinato
DME: dose mínima de eritema
DMEM: Dulbecco´s Modified Eagles Medium
DNA: ácido desoribunucléico
DPPH: 1,1-difenil-2-picril-hidrazil
λ
max
: comprimento de onda máximo
ε: coeficiente de extinção molar
EtOH: etanol
EPCP: 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato.
EROs: espécies reativas de oxigênio
ESI : ionização por electrospray
F: fluorescência mínima da clorofila-a medidas em amostras iluminadas
Fm: fluorescência máxima da clorofila-a em amostras adaptadas no escuro após a
incidência de um pulso saturante de luz branca
Fm’: fluorescência máxima da clorofila-a obtida após a incidência de um pulso
saturante de luz branca em amostras iluminadas
Fo: fluorescência mínima da clorofila-a em amostras adaptadas no escuro
FDA: Food and Drugs Administration
FEP: fosfoenol piruvato
FPS: Fator de proteção Solar
FT-ICR: ressonância ciclotrônica de íons (Fourier Transform/Ion Cyclotron
Resonance)
h: hora
HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid
chromatography)
LC-MS: cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas
m/z: razão massa-carga
M: mol.L
-1
MAAs: Aminoácidos tipo micosporinas (mycosporine-like amino acids)
MALDI: Ionização e dessorção por laser assistida por matriz
MeOH: metanol
MHz: megahertz
min: minuto
MM: massa molecular
MRM: monitoramento de reações múltiplas
MS
2
: tandem MS
nanoESI: ionização por nanospray
PAM: fluorescência de pulso de amplitude modulada
PAR: radiação fotossinteticamente ativa
PF: peso fresco
pH: potencial hidrogeniônico
PIF: Fator de Foto-Irritação
ppm: partes por milhão
PS II: fotossistema II
Q: quadrupolo
Q1: primeiro quadrupolo
q2: câmara de colisão
Q3: terceiro quadrupolo
QA: plastoquinona A
Q
P
: extinção fotoquímica da fluorescência da clorofila
q
N
: extinção não-fotoquímica da fluorescência da clorofila
Q-TOF: analisador quadruplo-tempo de vôo
Φ
PSII
: rendimento quântico efetivo do PS II
Φ
P0
: máximo rendimento quântico fotoquímico do PS II
RF: radiofreqüência
RMN
1
H: ressonância nuclear magnética de próton
RNA: ácido ribonucléico
rpm: rotações por minuto
SDS: dodecil sulfato de sódio
TFA: ácido trifluoracético
TIC:Cromatograma dos íons totais
TMS: tetrametilsilano
TOF: tempo de vôo
TR: tempo de retenção
u.m.a: unidade de massa atômica
UV: ultravioleta
UVA: radiação ultravioleta A
UVB: radiação ultravioleta B
UVC: radiação ultravioleta C
UVR: radiação ultravioleta
UVRs: radiações ultravioleta
UV-Vísivel: ultravioleta-visível
SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................................7
ABSTRACT.................................................................................................................9
SUMÁRIO .................................................................................................................18
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................21
1.1. A radiação ultravioleta e seus efeitos em organismos aquáticos ............22
1.2. Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs).....................................................24
1.2.1. Contexto histórico.................................................................................24
1.2.2. Estrutura e propriedades ......................................................................26
1.2.3. Ocorrência e Distribuição .....................................................................28
1.2.4. Modulação da Biossíntese....................................................................32
1.2.5. Funções................................................................................................37
1.2.6. Aplicação comercial..............................................................................38
1.2.7. Métodos de análises de MAAs .............................................................41
1.2.7.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)...........................41
1.2.7.2. Espectrometria de massas...........................................................43
1.3. Algas versus estresse ambiental.................................................................54
2. OBJETIVOS..........................................................................................................57
3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................59
3.1. Reagentes e materiais...................................................................................60
3.2. Cultivo e coleta das micro e macroalgas ....................................................61
3.3. Condições experimentais.............................................................................62
3.3.1. Gracilaria tenuistipitata .........................................................................62
3.3.2. Prorocentrum minimum ........................................................................62
3.4. Extração das MAAs.......................................................................................64
3.4.1. Gracilaria tenuistipitata .........................................................................64
3.4.2. Gracilaria domingensis e Gracilaria birdiae ..........................................67
3.4.3. Prorocentrum minimum ........................................................................69
3.4.4. Isolamento das MAAs chinorina e porphyra-334 ..................................69
3.4.5. Experimentos de variação diária das MAAs em G. tenuistipitata..........70
3.5. Análises das MAAs por HPLC......................................................................70
3.5.1. Gracilarias.............................................................................................70
3.5.2. Prorocentrum minimum ........................................................................72
3.6. Análises das MAAs por espectrometria de massas...................................73
3.7. Ensaios in vitro..............................................................................................76
3.7.1. Testes antioxidantes.............................................................................76
3.7.2. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade ...........................................78
3.7.3. Testes de estabilidade..........................................................................80
3.7.4. Fator de Proteção Solar (FPS) .............................................................80
3.8. Medidas de fotossíntese...............................................................................81
3.9. Medidas in vivo de EROs..............................................................................85
3.10. Análises estatísticas ...................................................................................86
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................87
4.1. Extração e Análises das MAAs ....................................................................88
4.1.1. Gracilaria tenuistipitata .........................................................................88
4.1.1.1. Experimentos em Triplo Quadrupolo............................................92
4.1.1.2. Experimentos em FT-ICR...........................................................105
4.1.1.3. Experimentos em Ion Trap .........................................................110
4.1.2. Gracilaria domingensis, Gracilaria birdiae e Prorocentrum minimum .113
4.2. Isolamento de chinorina e porphyra-334...................................................120
4.3. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata.......................125
4.4. Ensaios in vitro............................................................................................127
4.4.1. Estimativa da concentração total das MAAs de G. domingensis........127
4.4.3. Testes de estabilidade........................................................................130
4.4.4. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade .........................................135
4.4.5. Fator de proteção solar.......................................................................137
4.5. Experimentos de exposição à UVR de Prorocentrum minimum.............141
4.5.1. Medidas de fotossíntese.....................................................................141
4.5.2. Medidas in vivo de EROs....................................................................142
4.5.4. Análises das MAAs.............................................................................143
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................152
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................157
LISTA DE ANEXOS................................................................................................168
1. INTRODUÇÃO
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
22
1.1. A radiação ultravioleta e seus efeitos em organismos aquáticos
A radiação solar que chega à superfície terrestre é constituída de radiações
do tipo infravermelho (>800 nm), visível (radiação fotossinteticamente ativa, PAR,
400-750 nm), ultravioleta A (UVA, 320-400 nm) e ultravioleta B (UVB, 280-320 nm).
A radiação ultravioleta C (UVC, 200-280 nm) é a mais energética entre as radiações
ultravioleta (UVRs) emitidas pelo sol, porém é completamente absorvida pelo ozônio
e o oxigênio, não atingindo a superfície terrestre (Figura 1). A UVR representa cerca
de 6% da energia solar total que chega à superfície terrestre, sendo que
aproximadamente 90% correspondem a UVA e o restante a UVB (Neale, 2005).
Figura 1. Espectro da radiação ultravioleta.
Os ambientes terrestre e marinho sempre estiveram sujeitos às radiações UV.
Entretanto, a diminuição da camada de ozônio por origem antropogênica, pela
emissão de poluentes atmosféricos como clorofluorcarbonos (CFCs), organo-
clorados e organo-bromados, trouxe como conseqüência um aumento no fluxo das
UVRs para a superfície da Terra (Kerr & McElroy, 1993; Lubin & Jensen 1995,
Tabazadeh et al., 2000). Este aumento é extremamente maléfico para os
organismos, em especial os fotossintetizantes. Danos em biomoléculas como ácidos
Radiação ultravioleta
Raios X
UVC
UVB
UVA
100
150
200
250 300
350
400
Comprimento
de
onda
(nm)
Luz
visível
Absorção de ozônio
Produz
ozônio
Germicida
Eritema
Radiação ultravioleta
Raios X
UVC
UVB
UVA
100
150
200
250 300
350
400
Comprimento
de
onda
(nm)
Luz
visível
Absorção de ozônio
Produz
ozônio
Germicida
Eritema
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
23
nucléicos, lipídios e proteínas, alterações na mobilidade e na pigmentação celular,
inibições da fotossíntese e de crescimento são alguns exemplos dos efeitos deste
excesso de UVR que podem levar o organismo à morte (Franklin & Forster, 1997).
Estes danos celulares podem ocorrer por reações fotoquímicas (efeitos diretos) ou
via fotodinâmica (efeitos indiretos) pela formação de espécies reativas de oxigênio
(EROs) (Vincent & Neali, 2005).
Como efeitos diretos das UVRs, moléculas que absorvem nesta região do
espectro, como proteínas e ácidos nucléicos, são fotoquimicamente transformadas
ou degradadas, resultando numa perda parcial ou mesmo total de suas funções
biológicas. Assim, danos em RNA e DNA (e.g., dímeros de timina)
podem ser
observados pela grande sensibilidade destas biomoléculas à exposição ao UV
(Vincent & Neali, 2005).
Nos efeitos indiretos, as UVRs podem ser absorvidas por componentes
celulares dentro e fora da célula, produzindo assim as EROs tais como, oxigênio
singlete (
1
O
2
), ânion superóxido (O
2
•-
), radical hidroxila (
•
OH) e peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
). Estas espécies reativas podem também ser resultantes da
incompleta transferência de elétrons para o oxigênio (e.g., cadeia de transporte de
elétrons) ou de reações de auto-oxidação que ocorrem normalmente na célula
(Cadenas, 1989).
As EROs reagem com lipídios, proteínas, pigmentos e DNA, inativando suas
funções biológicas. Estudos em mamíferos sugerem a participação das EROs como
agentes significativos no desenvolvimento de diversas patologias pulmonares,
hepáticas e cardíacas decorrentes de lipoperoxidação e alterações histopatológicas
(Halliwell & Gutteridge, 1999).
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
24
Os efeitos da radiação solar no ambiente aquático vêm sendo bastante
estudados nos últimos anos (Hader & Worrest, 1997; Dunlap & Shick, 1998, Rozema
et al., 2002). Os diversos danos causados pela exposição excessiva ao UV, por
mecanismos diretos ou indiretos, podem levar a uma diminuição da biomassa
fotossintetizante que pode ser refletida em toda cadeia trófica. Isto poderia resultar
numa diminuição da biodiversidade aquática, na captação de dióxido de carbono da
atmosfera (Takahashi et al., 1997) e nos produtos de consumo para o homem
(Hader & Worrest, 1997; Hader et al., 1998), trazendo como conseqüência um
desequilíbrio na composição e integridade do ecossistema (Rezanka et al., 2004).
Os organismos aquáticos desenvolveram diversas estratégias adaptativas
para atenuar os efeitos maléficos das UVRs tais como movimentação vertical na
coluna de água (Smith et al., 1992), reparo no DNA por fotoreativação e excisão
(Britt, 1995) e acúmulo de antioxidantes (hidrossolúveis, lipossolúveis e sistema
enzimático) (Dunlap & Yamamoto, 1995). Além destas estratégias, outro importante
mecanismo de defesa desenvolvido por cianobactérias, micro e macroalgas é a
síntese e o acúmulo de compostos que absorvem a radiação ultravioleta, conhecidos
como “aminoácidos tipo micosporinas” (mycosporine-like amino acids, MAAs) (Shick
& Dunlap, 2002, Carreto et al., 2007).
1.2. Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)
1.2.1. Contexto histórico
Estudos envolvendo compostos que absorvem a radiação ultravioleta foram
publicados anteriormente a 1938 (Kalle, 1938 citado em Carreto et al., 2007). Em
1960, Wittenburg isolou pela primeira vez compostos com alta absorção no UV a
partir das glândulas de gás da caravela Physalia physalis (Wittenburg, 1960). Um
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
25
ano mais tarde, Tsujino observou em algas vermelhas (rodófitas) compostos com a
mesma característica de forte absorção no UV (Tsujino, 1961). Já em 1969, Shibata
observou que diversos extratos aquosos de corais e cianobactérias obtidos na
Grande Barreira de Corais, na Austrália, possuíam forte absorção no UV (Shibata,
1969). Estas substâncias, denominadas S-320, mostraram uma banda larga de
absorção com comprimento de onda máximo de absorção (λ
max
) entre 315-323 nm,
sugerindo que S-320 era um grupo de compostos similares e não uma substância
pura. A primeira evidência do papel fotoprotetor de S-320 foi descoberta por
Maragos em 1972, e mostrava que em colônias do coral Porites lobata a
concentração de S-320 variava inversamente em relação à profundidade,
provavelmente compensando os diferentes níveis de UV do ambiente (Shick &
Dunlap, 2002). Uma década depois, foi demonstrado experimentalmente que S-320
diminuía em tecidos dos corais da espécie Pocillopora damicornis sem exposição ao
UV por longo tempo, evidenciando que S-320 era produzido em resposta à
exposição a UVR (Jokiel & York, 1982).
Em 1977, químicos de Nagoya, Japão, pesquisando a toxina palitoxina no
coral Palythoa tuberculosa, observaram um composto solúvel em água com λ
max
em
310 nm (Ito & Hirata, 1977). Este metabólito possuía a estrutura-base idêntica à
família de metabólitos primeiramente descritos em fungos terrestres (chamados de
micosporinas) e foi identificado como micosporina-glicina. Após esta descoberta,
Hirata e colaboradores isolaram diversos derivados iminos de micosporinas
(iminomicosporinas), que foram então denominados de “aminoácidos tipo
micosporinas” (MAAs), incluindo palitina, palitinol e paliteno isolados do coral
Palythoa tuberculosa (Hirata et al., 1979); asterina isolada da estrela-do-mar
Asterina pectinifera (Nakamura et al., 1981); porphyra-334, chinorina e usujireno
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
26
isolados respectivamente das algas vermelhas Porphyra tenera, Chondrus yendoi e
Palmaria palmata (Takano et al., 1979; Tsujino et al., 1980; Sekikawa et al., 1980).
Desde então muitos outros compostos similares e com características de absorção
no UV foram identificados em diferentes organismos aquáticos e genericamente
classificados como MAAs (Carreto et al., 2007, Karentz, 2001).
1.2.2. Estrutura e propriedades
As MAAs, com duas exceções (micosporina-glicina e micosporina-taurina),
são iminomicosporinas, caracterizados por um anel aminociclohexenimina ligado a
um aminoácido, um aminoálcool ou grupo amino (Bandaranayake, 1998). São
altamente polares, de baixo peso molecular (< 400 g.mol
-1
) e apresentam absorção
máxima entre 310 e 360 nm com alto coeficiente de extinção molar (ε= 28100-50000
M
-1
cm
-1
). As diferenças apresentadas nos espectros de absorção referem-se aos
diferentes grupos no C1, além de diferentes substituintes no átomo de nitrogênio
(Figura 2).
Alguns exemplos de MAAs e micosporinas marinhas encontradas em
organismos aquáticos, bem como as suas interconversões, estão apresentadas na
Figura 2 (Carreto et al., 2005).
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
27
O
OH
HO
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
O
O
NH
HO
HO
O
SO
3
-
gadusol 4-deoxigadusol
micosporina
taurina
HO
HO
O
N
N
HO
HO
CO
2
-
O
CO
2
-
-
O
2
C
+
N
NH
HO
HO
CO
2
-
O
CO
2
-
+
- valina
NH
CO
2
-
N
NHO
HO
CO
2
-
O
CO
2
-
+
micosporina
glicina-ácido glutâmico
micosporina
glicina
micosporina
2-glicina
NHHO
HO
O
+
NH
CO
2
-
HO
micosporina
glicina-valina
+ valina
+ ácido glutâmico
- ácido glutâmico
+ taurina
- taurina
O
+ glicina
- glicina
chinorina
HO
HO
O
+
NH
CO
2
-
HO
CO
2
-
NH
CO
2
-
porphyra-334
HO
HO
O
+
NH
CO
2
-
HO
NH
micosporina
metilamino-treonina
HO
HO
O
+
NH
CO
2
-
NH
NHHO
HO
O
+
NH
CO
2
-
HO
micosporina
metilamino-serina
NH
HO
HO
O
+
NH
HO
palitinol
CO
2
-
HO
HO
O
+
NH
CO
2
-
NH
CO
2
-
ácido palitênico Z/E
HO
HO
O
+
NH
CO
2
-
NH
2
HO
-
O
3
SO
O
+
NH
CO
2
-
NH
2
HO
HO
O
+
NH
CO
2
-
HO
HO
-
O
3
SO
O
+
NH
CO
2
-
HO
NH
2
palitina treonina-sulfato
HO
HO
O
+
NH
NH
CO
2
-
usujireno (isômero cis)
paliteno (isômero trans)
NHHO
HO
O
+
NH
HO
asterina-330
CO
2
-
NH
2
NH
2
HO
HO
O
+
NH
HO
palitina serina
NH
2
HO
-
O
3
SO
O
+
NH
CO
2
-
HO
palitina serina-sulfato
palitina
+ HOSO
3
-
+ HOSO
3
-
+ HOSO
3
-
+ glicina
- glicina
+
t
r
e
o
n
i
n
a
-
t
r
e
o
n
i
n
a
+
s
e
r
i
n
a
-
s
e
r
i
n
a
- H
2
O
+ H
2
- CO
2
- CO
2
- CO
2
- CO
2
- CH
3
- CH
3
- CH
3
- CH
3
+ H
2
O (H
+
)
CH
O
-
- NH
3
+ NH
3
1
2
3
4
5
6
Figura 2. Vias de interconversão de diferentes MAAs propostas por Carreto e colaboradores (2005).
Os retângulos tracejados indicam compostos ainda não caracterizados. Adaptado de Carreto et al.,
2005.
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
28
Nas MAAs geralmente uma subunidade de glicina está presente no C3 do
anel (Figura 2), embora em alguns corais a glicina possa ser substituída por
metilamina (e.g., micosporina metilamino-serina) (Teai et al., 1997). Algumas MAAs
podem ainda conter ésteres sulfatados (e.g., palitina serina-sulfato, Figura 2) (Wu
Won et al., 1997), ligações covalentes com oligossacarídeos (Bohm et al., 1995) e
até mesmo ligações entre elas (Carreto et al., 2001). Recentemente, uma nova
MAA, euhalothece-362, contendo o aminoácido alanina, foi isolada da cianobactéria
Euhalothece sp. (Volkmann et al, 2006). Até hoje, aproximadamente 20 MAAs foram
caracterizadas, mas este número vem crescendo nos últimos anos em conseqüência
do aumento no número das espécies estudadas e do desenvolvimento de técnicas
de análises mais eficientes e sensíveis (Carreto et al., 2006, Whitehead & Hedges,
2002, 2003).
1.2.3. Ocorrência e Distribuição
Apesar de as MAAs estarem presentes numa variedade enorme de
organismos aquáticos, apenas bactérias, fungos e algas possuem a capacidade de
sintetizar estas substâncias, uma vez que a via pela qual elas são sintetizadas (via
do ácido chiquímico) está ausente em animais. Os demais organismos aquáticos
adquirem estes compostos por meio de simbioses (como é o caso de corais e
zooxanthelae), dieta ou associações com bactérias (Shick et al., 1992; Carrol &
Shick, 1996).
As MAAs já foram identificadas em bactérias heterotróficas (Arai et al., 1992),
cianobactérias (Garcia-Pinchel & Castenholz, 1993), microalgas (Carreto et al.,
1990; Shashar et al., 1997; Groniger et al., 2000), macroalgas (Dunlap & Shick,
1998), organismos simbiontes (algas e invertebrados) (Stochaj et al., 1994; Shick et
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
29
al., 1991), invertebrados (Carroll & Shick, 1996) e vertebrados (Dunlap et al., 1989)
Em bactérias do gênero Micrococcus sp. foi identificada a MAA chinorina (Arai et al.,
1992), mas sabe-se que diversas espécies do gênero Pseudoalteromonas e Vibrio
são capazes de converter as MAAs chinorina e porphyra-334 em micoporina-glicina
e no intermediário 4-deoxigadusol, como apresentado na Figura 3 (Dunlap & Shick,
1998, Dunlap et al., 1998a).
Figura 3. Conversão por bactérias de chinorina em micosporina-glicina (moderado antioxidante) e
deoxigadusol (forte antioxidante) por bactérias (Dunlap & Shick, 1998).
Na maioria das cianobactérias, as MAAs estão distribuídas de forma
homogênea no citoplasma, sem associação à parede celular ou às membranas
fotossintéticas (Garcia-Pinchel & Castenholz, 1993). Já nas microalgas, supõe-se
que estes compostos encontrem-se ao redor de organelas sensíveis a UVR,
aumentando a eficácia destas estruturas (Neale et al., 1998), embora outros fatores,
como forma e distribuição destas organelas no citoplasma, também estejam
envolvidos na proteção contra UV. Laurion e colaboradores mostraram que a
maneira como as MAAs estão distribuídas em dois dinoflagelados aumenta a
proteção de organelas específicas contra a radiação UV (Laurion et al., 2004).
Altos conteúdos de MAAs são encontrados em microalgas da divisão
Cryptophyta, Dinophyta, Prymnesiophyta e Raphidophyta. Entretanto, espécies das
divisões Bacillariophyta, Chlorophyta, Cyanophyta e Euglenophyta possuem baixos
Vibrio harveyi
95%
Vibrio sp
N
NH
CO
2
H
HO
HO
CO
2
H
O
O
NH
CO
2
H
HO
O
O
OH
HO
O
Chinorina
Micosporina
glicina
Pseudoalteromonas haloplanktis ou P. atlantica
Deoxigadusol
(antioxidante)
HO HO
OH
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
30
conteúdos de MAAs (Jeffrey et al., 1999). Em macroalgas, a divisão Rhodophyta é a
mais rica nestes compostos (Karentz, 2001; Karsten et al., 1998a, 1998b). Nas
espécies da divisão Rhodophyta são encontradas diversas MAAs em altas
concentrações, diferentemente das dos gêneros Phaeophyta (algas pardas) e
Chlorophyta (algas verdes), que provavelmente dependem de outros compostos
absorvedores, como phlorotannins em algas pardas (Pavia et al., 1997). Fatores
como posição geográfica e condições do ambiente influenciam na concentração e
diversidade de MAAs em micro e macroalgas. Por esse motivo, em espécies
tropicais estes compostos ocorrem em maiores concentrações, provavelmente pela
exposição destes organismos a maiores quantidades de UVR (Shick & Dunlap,
2002).
Exemplos de MAAs identificadas em algumas cianobactérias, microalgas e
macroalgas são apresentados na Tabela 1 (Groniger et al., 2000). A identificação de
MAAs em diferentes organismos aquáticos encontra-se descrita na literatura (Sinha
et al., 1998; Karsten et al.,1998a; Groniger et al., 2000; Carreto et al., 2007).
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
31
Tabela 1. Distribuição de MAAs* em algumas cianobactérias, microalgas e macroalgas.
Espécies Coleta MG PT AS PL PR CH PE
Cianobactérias
Gloeocapsa sp. EUA
+ +
Nostoc commune
China
+
Microalgas
Lingulodinium polyedrum
Cultura
+ + + +
Prorocentrum micans
Portugal
+ +
Thalassiosira sp. Antártida
+ +
Macroalgas
Ulva lactuca
Alemanha
+
Sargassum oligocystum
China
+ + +
Gracilaria changii
China
+ + + + + +
*MAAs: MG-Micosporina-glicina; PT-palitina; AS-asterina; PL-palitinol; PR-porphyra-334; CH-chinorina; PE-paliteno.
Invertebrados vivendo em simbiose com microalgas (cianobactérias,
dinoflagelados principalmente Symbiodinium spp.) possuem MAAs em diferentes
concentrações, dependendo da profundidade do ambiente onde estes organismos
se encontram (Dunlap & Shick, 1998; Shick et al., 1996). As microalgas simbiontes
transferem as MAAs para os organismos em simbiose dada a incapacidade da
síntese destes compostos por estes organismos. Em alguns recifes de corais que
contêm de duas a dez espécies diferentes de microalgas, pelo menos 13 MAAs
foram identificadas (Shick et al., 1999; Gleason & Wellington, 1995). As MAAs são
geralmente mais concentradas nos tecidos do hospedeiro do que no simbionte
isolado deles, provavelmente mostrando uma resposta adaptativa na proteção do
tecido mais exposto a UVR (Ishikura et al., 1997; Shick et al., 1995).
As MAAs ocorrem também em tecidos de diversos peixes tropicais,
equinodermas, moluscos, cordatas, entre outros (McCkintock & Karentz, 1997;
Dunlap et al., 1989). Não é claro o papel das MAAs identificadas nestes organismos;
porém, para as encontradas em tecidos dos olhos de peixes tropicais, têm sido
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
32
discutidas as funções de agente filtrante de radiações de alta energia (como UV) e
de amplificadores de contraste óptico no ambiente aquático. Como já foi
mencionado, estes animais adquirem as MAAs por meio da dieta, possuindo a
capacidade de concentrá-las nos diferentes tecidos (Dunlap & Shick, 2002).
As MAAs não são encontradas em plantas superiores, nas quais a proteção
contra UVR é feita pelos flavonóides
(Rozema et al., 1997; Pietta, 2000), nem em
vertebrados superiores, nos quais a função protetora é assumida pela melanina.
1.2.4. Biossíntese
Embora diversos passos ainda precisem ser elucidados na biossíntese das
MAAs, a hipótese de que estas substâncias são sintetizadas pela via do ácido
chiquímico foi mostrada por Favre-Bonvin e colaboradores (Favre-Bovin et al.,
1987). Os autores mostraram que o intermediário da via do ácido chiquímico, o 3-
dehidroquinato (3-DHQ), é o precursor do anel de seis carbonos comum em
micosporinas de fungos. A síntese de micosporinas fungais provavelmente ocorre a
partir do intermediário 3-DHQ, via gadusol ou deoxigadusol (Figura 4), sendo estes
dois últimos compostos os possíveis precursores da micosporina-glicina (Shick &
Dunlap, 2002; Bandaranayake, 1998).
Experimentos realizados com o coral Stylophora pistillata em simbiose com
microalgas, em que a síntese de MAAs foi bloqueada utilizando-se N-
fosfometilglicina (inibidor específico da via do ácido chiquímico), mostraram pela
primeira vez evidências diretas de que estas substâncias devem ser sintetizadas por
meio desta via (Shick et al., 1999). As enzimas DAHP sintase e DHQ sintase
catalisam respectivamente o primeiro e o segundo passos da via do ácido
chiquímico e necessitam como cofator o íon Co
+2
. A quelação deste íon pelo N-
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
33
fosfometilglicina inibe a ação destas duas enzimas, além de inibir o sexto passo da
via por competição com fosfoenolpiruvato (FEP), que é um cofator para a enzima
EPCP sintase (Bentley, 1990). Com a inibição destas três enzimas, demonstrou-se
que a síntese ocorre via 3-DHQ, o que não seria comprovado se este inibidor
bloqueasse apenas o penúltimo passo, o qual não impediria a acumulação das
MAAs (Figura 4).
O
OH
OH
HO
OH
O
H
2
O
3
PO
O
OH
OH
H
2
O
3
PO
OH
O
OH
OH
HO
OH
O
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OPO
3
H
2
OH
O
OH
O
HO
O
HO
O
O
HO
OH
HO
O
OH
OPO
3
H
2
OH
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
OH
NH
O
HO
O
HO
OH
O
NH
O
HO
N
HO
OH
O
R
1
DAHP
+
Fosfoenolpiruvato (FEP)
Eritrose-4-fosfato
3
4
5
ATP
ADP
3-Dehidroquinato
3-Dehidrochiquimato
Chiquimato
Chiquimato-3-fosfato
+FEP
EPSP
Corismato
glicina
Fenilalanina
Tirosina
Triptofano
Folato
Cofatores
Isopropanóides
Quinonas
Ressonânia
Tautômeros
Micosporina-glicina
Imino-MAAs
XNH
2
H
2
O
3
PO
2
6
7
Deoxygadusol
R
R = H , Deoxigadusol
R = OH, Gadusol
Figura 4. Intermediários e enzimas da via do ácido chiquímico. DAHP: 3-deoxi-arabino-heptulosonato-
7-fosfato; EPCP: 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato. Enzimas: (1) DAHP sintase; (2) DHQ sintase; (3)
DHQ dehidratase; (4) chiquimato desidrogenase; (5) chiquimato quinase; (6) EPCP sintase; (7)
corismato sintase. R
2
: aminoácidos e aminoálcools caracterizando diferentes MAAs (adaptado de
Shick & Dunlap, 2002).
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
34
Em outros experimentos, o uso de aminoácidos isotopicamente marcados
(
14
C-glicina e
14
C-serina) foi incorporado nas cadeias das MAAs micosporina-glicina
e chinorina, demonstrando que estes aminoácidos livres são seus precursores
(Portwich & Garcia-Pichel, 2003). Estes mesmos autores mostraram que
micosporina-glicina é o precursor direto da MAA chinorina.
Embora muitos experimentos evidenciem a possível rota para a biossíntese
das MAAs, pouco ainda foi explorado quanto à biotransformação destes compostos
em algas e organismos simbiontes. A grande diversidade das MAAs presentes
nestes organismos provavelmente deriva da biotransformação de micosporina-
glicina, chinorina, porphyra-334 e outras MAAs bisubstituídas por aminoácidos
(Shick, 2004; Callone et al., 2006). Segundo uma classificação sugerida por Shick,
as MAAs podem ser divididas em primárias (micosporina-glicina, chinorina e
porphyra-334) e secundárias, as quais seriam sintetizadas a partir das primárias
(Shick, 2004). Estudos com o dinoflagelado Alexandrium excavatum exposto a altas
radiações fotossinteticamente ativa (PAR) mostraram que a síntese destes
compostos é acompanhada de mudanças seqüências no espectro de absorção,
indicando possíveis interconversões entre as diferentes MAAs (Carreto et al., 1990).
Recentemente, Callone e colaboradores observaram que a síntese destes
compostos no dinoflagelado Alexandrium tamarense ocorre em dois estágios após a
exposição a altas PAR: um primeiro estágio, em que há um aumento das MAAs
primárias, principalmente porphyra-334, e um segundo, em que há um aumento nos
conteúdos da MAA secundária paliteno, acompanhada do declínio nos níveis das
MAAs primárias (Callone et al., 2006). As interconversões possíveis entre as
diferentes MAAs identificadas em organismos aquáticos foram apresentadas na
Figura 2.
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
35
Embora as MAAs possam ser induzidas e acumuladas em uma variedade
enorme de organismos aquáticos, tais processos não se aplicam para todas as
espécies (Jeffrey et al., 1999; Hannach & Sigleo, 1998). Mesmo dentro de uma
mesma espécie, diferenças nos conteúdos e até mesmo na variedade das MAAs
dependem do lugar de origem e do estágio de vida do organismo (Jeffrey et al.,
1999). Espécies da microalga marinha Phaeocystis pouchetii possuem MAAs
apenas nos seus estágios coloniais do ciclo de vida e a concentração destes
compostos parecem ser maiores nas espécies isoladas da Antártica quando
comparada a regiões de zonas temperadas (Riegger & Robinson, 1997).
A biossíntese pode ser influenciada por condições de irradiação como tempo
de exposição e intensidade da radiação. No dinoflagelado Alexandrium excavatum
observou-se uma mudança na composição das MAAs e um aumento no espectro de
absorção no UV em questão de horas, quando este organismo foi transferido de
uma condição de baixa intensidade de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) para
uma de alta (Carreto et al., 1990). No dinoflagelado Prorocentrum micans, as
concentrações de MAAs foram muito maiores nas culturas que cresceram durante
21 dias sob radiação UV quando comparadas às culturas que cresceram sem
exposição ao UV (Lesser, 1996a, 1996b). Experimentos in situ com a macroalga
Gracilaria chilensis mostraram que, por ser encontrada em regiões bentônicas, onde
a UVR é mais atenuada, a mesma apresentou baixas concentrações de MAAs que
não variaram durante seu crescimento (Gómez et al., 2005). Estudos com duas
espécies de Porphyra (uma crescida na superfície e outra em profundidade)
mostraram que as espécies de superfície apresentaram uma maior capacidade de
adaptação quando expostas as altas irradiações se comparadas às espécies de
profundidade (Figueroa et al., 2003). Por outro lado, na macroalga Gracilaria cornea
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
36
não foi observada indução de MAAs por exposição à UV ou UV+PAR, ainda que as
MAAs presentes nesta alga tenham se mostrado bastante estáveis às UVRs e altas
temperaturas (Sinha et al., 2000).
A composição da radiação à qual estes organismos são expostos é um
importante fator a considerar, que também varia de espécie para espécie. Em geral,
luz azul é mais efetiva na indução de MAAs do que luz verde e vermelha, e
radiações UVA e UVB aumentam fortemente o acúmulo destes compostos (Carreto
et al., 1990). A indução da biossíntese na microalga Phaeocystis antarctica ocorre
predominantemente no UVB e em comprimentos curtos do UVA, enquanto
diatomáceas respondem principalmente a comprimentos de onda mais longos do
UVA e a PAR (Riegger & Robinson, 1997). No dinoflagelado marinho Gyrodinium
dorsum, a biossíntese ocorre sobre moderada irradiação induzida
predominantemente por UVB, sendo que tanto UVA como PAR mostraram poucos
efeitos biossintéticos (Klisch & Hader, 2002).
Além da quantidade e qualidade da irradiação, outros fatores de estresse,
como nutrientes, também podem estimular ou inibir a síntese destes compostos
(Korbee et al., 2005). Korbee e colaboradores mostraram que a síntese de MAAs foi
estimulada quando duas espécies de Porphyra foram cultivadas em meio
enriquecido de amônia (Korbee et al., 2005). Por outro lado, uma baixa
concentração de nitrogênio no meio diminuiu a síntese de MAAs em alguns
dinoflagelados, indicando que os níveis de nitrogênio nas células influenciam a
síntese destes compostos (Litchman et al., 2002).
Com esses exemplos é possível notar que, independentemente dos
mecanismos de indução, as respostas cinéticas variam substancialmente entre os
organismos. Em algumas espécies é possível observar a indução em questão de
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
37
horas, como no caso do dinoflagelado Alexandrium tamarense (Callone et al., 2006)
enquanto para outras a resposta pode levar de dias a semanas (Karsten et al., 1999;
Hoyer et al., 2002).
1.2.5. Funções
A função mais importante e estudada das MAAs é a fotoprotetora contra a
UVR, análoga à exercida por flavonóides em plantas terrestres. Esta função pode
ser atribuída a estes compostos por possuírem eficientes propriedades de absorção,
tanto no UVA quanto no UVB, e freqüente observação que a exposição a UVR, no
ambiente natural ou em condições experimentais, induz a síntese e acúmulo destes
compostos (Bandanarayake, 1998; Shick & Dunlap, 2002; Rezanka et al., 2004).
Entretanto, somente nas últimas décadas evidências diretas do seu papel
fotoprotetor foram comprovadas, uma vez que altas quantidades destes compostos
presentes em dinoflagelados inibiram os efeitos da UVR na fotossíntese (Neale et.
al, 1998; Lesser, 1996a, 1996b) e na motilidade destes organismos (Klisch et al.,
2001).
A função protetora oferecida pelas MAAs não é necessariamente restrita aos
organismos que as produzem. As MAAs presentes no fitoplâncton podem oferecer
proteção a outros organismos, atenuando a radiação UV na coluna de água (Vernet
& Whitehead, 1996). Isto pode ser mais efetivo ainda se houver uma liberação de
MAAs no meio. Na literatura, foi demonstrado que em florações do dinoflagelado
Lingulodinium polyedrum houve liberação de MAAs no meio quando da exposição
ao UVB. Entretanto, não é claro se a detecção destes compostos na água foi por
processos ativos na célula ou por lise das mesmas (Vernet & Whitehead, 1996).
Além das MAAs, outros compostos devem agir como fotoprotetores no
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
38
fitoplâncton. Em florações de dinoflagelados do gênero Gyrodinium, um pigmento
similar a citonemina foi relatado, embora não tenha sido caracterizado quimicamente
(Llewellyn & Mantoura, 1997). Analogamente, um biopolímero de composição
variada denominado esporopolemina, que também pode ter funções fotoprotetoras
contra UV, foi isolado de algas verdes (Xiong et al., 1997).
Além da função fotoprotetora, sugere-se que as MAAs também possuem
funções osmóticas, principalmente em cianobactérias que vivem em ambientes
hipersalinos (Oren, 1997), regulatórias da reprodução (Bandaranayake & Rocher,
1999) e antioxidantes (Dunlap & Yamamoto, 1995). Dunlap & Yamamoto
demonstraram que as micosporinas marinhas (micosporina-glicina e micosporina-
taurina, Figura 2) possuem moderada atividade antioxidante, podendo funcionar
como antioxidantes biológicos em organismos marinhos (Dunlap & Yamamoto,
1995). O suposto intermediário da biossíntese, 4-deoxigadusol (Figura 2), possui
atividade antioxidante comparada ao ascorbato, diferentemente das
iminomicosporinas como chinorina, porphyra-334, palitina, asterina e palitinol, que
não apresentaram atividade antioxidante (Dunlap & Yamamoto, 1995). Suh e
colaboradores demonstraram que micosporina-glicina suprime
1
O
2
com alta
eficiência (Suh et al., 2003).
1.2.6. Aplicação comercial
O uso de protetores solares aumentou significativamente nas últimas
décadas, principalmente em razão de os mesmos diminuírem de maneira drástica a
incidência de câncer de pele e os processos de foto-envelhecimento (Maier &
Korting, 2005). Desta maneira, o uso de MAAs como naturais protetores contra a
UVR é comercialmente atrativo.
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
39
Para um composto ser um eficiente filtro solar, são necessárias duas
características básicas além da absorção na região do UV: (i) ter um alto coeficiente
de extinção molar na faixa de absorção do UV e (ii) dissipar a energia absorvida com
o mínimo impacto para os tecidos da epiderme e derme, impedindo a formação de
EROs como
1
O
2
e O
2
•-
, conforme apresentado na Figura 5 (Torres et al., 2006,
Dunlap et al., 1998b). Além disso, fatores econômicos (baixo custo), estéticos
(inodoro, incolor) e antialergênicos são importantes para sua aceitação comercial.
Radical
Superóxido
Peróxido de
Hidrogênio
Radical
Hidroxila
Radical
Alquil
Hidroperóxido
Radical
Peroxila
Oxigênio
Singlete
[Fotoprotetor]
Fotoprotetor
Figura 5. Esquema simplificado da absorção de luz por um fotoprotetor mostrando vias de dissipação
por calor (indicada por ∆) e pela formação de espécies reativas. SOD: superóxido dismutase; LH:
lipídio poliinsaturado (modificado de Dunlap et al., 1998b).
Alguns trabalhos na literatura já demonstraram a alta fotoestabilidade das
MAAs, tanto in vivo quanto em in vitro (Shick et al., 2000; Conde et al., 2000;
Whitehead & Hedges, 2005). Trabalhos conduzidos com as iminomicosporinas
chinorina e porphyra-334 mostraram que estas, quando irradiadas, não geram
radicais e nem intermediários reativos, comprovando a eficiente forma de dissipar a
energia absorvida no UV pelo calor (Shick et al., 2000, Conde et al., 2000).
Experimentos de fotodegradação e fotosensitização com diversas MAAs
demonstraram a resistência de diferentes MAAs a fotodegradação (Whitehead &
Hedges, 2005). Recentemente, foi mostrado que a MAA palitina, muito comum em
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
40
algas, cnidários e organismos planctônicos, é altamente fotoestável em soluções
aquosas e que o decaimento desta molécula irradiada ocorre majoritariamente por
formas não radiativas, conforme demonstrado anteriormente para a chinorina e
porphyra-334 (Conde et al., 2007).
Além de testes de fotoestabilização, ensaios verificando a estabilidade das
MAAs em diferentes pHs e temperaturas foram descritos (Zhang et al., 2005).
Soluções contendo porphyra-334 mostraram ser estáveis em diferentes pHs (entre 1
e 11) à temperatura ambiente. Em pHs mais alcalinos (13 e 14), a absorção
monitorada em 334 nm diminuiu drasticamente nas primeiras 4 horas. Com o
aumento da temperatura, a absorvância diminui rapidamente, principalmente a 80
°C. No entanto, mesmo a 60 °C, a absorvância das soluções de porphyra-334
diminuiu vagarosamente, demonstrando que estes compostos são estáveis a
temperaturas inferiores a 60 °C (Zhang et al., 2005). De fato, Sinha e colaboradores
mostraram que soluções de porphyra-334 e chinorina foram estáveis a temperaturas
de até 75 °C por cerca de 6 horas (Sinha et al., 2000).
As propriedades de absorção de extratos metanólicos da alga
Aphanizomenon flos-aquae na região do UV em comparação a dois filtros solares
comerciais demonstraram que o extrato apresentou uma alta proteção na região do
UVA e com valores significativos de proteção no UVB (FPS=4) (Torres et al., 2006).
O uso em protetores solares e fotoestabilizadores de aditivos em plásticos,
pinturas e vernizes vem sendo pesquisado (Bandaranayake, 1998), sendo objeto de
patentes requeridas (Schmid et al., 2004; Llewellyn & Galley, 2002; Gerald et al.,
2001). Além disto, diversos análogos sintéticos de MAAs estão sendo desenvolvidos
para fins comerciais (Dunlap et al., 1998b). Análogos da micosporina-glicina,
genericamente chamados de 3-alquilamino-2-metoxiciclohex-2-enonas (Figura 6),
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
41
não foram suficientemente estáveis para aplicações comerciais em fotoprotetores
(Dunlap & Chalker, 1985). Entretanto, derivados de tetrahidropiridina (Figura 6)
mostraram baixa reatividade quando comparados a diversos fotoprotetores
comerciais (Dunlap et al.,1998b, 1998c). O produto chamado Helioguard 365
, que
contém MAAs isoladas da macroalga vermelha Porphyra umbilicalis, encontra-se
disponível comercialmente.
O
NH
R
N
R
3
O
R
2
R
1
N
R
3
O
R
1
λ
max
=309-314 nm
λ
max
=305-309 nm
λ
max
=307-311 nm
3-alquilamino-2-
metoxiciclohex-2-enonas
derivados de tetrahidropiridina
Figura 6. Análogos sintéticos de MAAs para uso em fotoprotetores e respectivos comprimentos de
onda máximos de absorção (λ
max
).
Investigações têm sido conduzidas para a produção comercial do 4-
deoxigadusol utilizando a via de retro-síntese, com o objetivo do uso deste
antioxidante natural em indústria cosmética e alimentícia (Dunlap et al., 1998a).
1.2.7. Métodos de análises de MAAs
1.2.7.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
O método mais aplicado para a separação e isolamento das MAAs é a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção no UV-Visível
(Nakamura et al., 1982; Dunlap & Chalker, 1986; Shick et al., 1999; Carreto et al.,
2005). A caracterização geralmente é feita comparando-se o perfil dos espectros de
absorção no UV e o tempo de retenção (TR) com padrões autênticos ou com
padrões de algas que contenham específicas MAAs.
O método clássico é baseado em fase reversa (coluna C18) eluindo
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
42
isocraticamente com ácido acético 0,02% em água a 15
ο
C (Nakamura et al., 1982).
Este método separa entre 7 e 9 MAAs, possuindo a desvantagem de não eluir as
MAAs mais hidrofóbicas, como paliteno e usujireno, e não separar as mais
hidrofílicas recentemente isoladas de corais (Shick et al., 1999).
Dunlap & Chalker introduziram o uso de coluna C8 eluída isocraticamente
com ácido acético (0,1% em água) contendo 10% de metanol. Nesta condição, as
MAAs menos ácidas (micosporina-glicina, palitina, asterina, palitinol e paliteno) são
resolvidas cromatograficamente, enquanto as mais ácidas (chinorina e porphyra-
334) coeluem (Dunlap & Chalker , 1986). Entretanto, com o isolamento e a
caracterização das MAAs micosporina-2-glicina e micosporina-taurina (Stochaj et al.,
1994) houve a adição de um outro problema: separar micosporina-2-glicina de
porphyra-334 e micosporina-taurina de micosporina-glicina. Foi mostrado que
concentrações acima de 75% de metanol na fase móvel separam as MAAs
altamente polares, apesar de não separarem em uma mesma corrida as MAAs mais
ácidas das menos ácidas (Stochaj et al., 1994). Este tipo de separação foi alcançada
utilizando-se diferentes sistemas isocráticos para o grupo das mais ácidas e outro
para as menos ácidas (Adams & Shick, 2001; Shick & Dunlap, 2002).
Este último método descrito ainda não permitia a separação entre
micosporina-glicina e micosporina-taurina e entre os isômeros usujireno e paliteno
numa mesma corrida. Wu Won e colaboradores utilizaram cromatografia de troca
iônica em coluna amino e conseguiram separar micosporina-glicina de micosporina-
taurina, além de resolver algumas misturas de micosporinas sulfatadas (Wu Won et
al., 1997).
Carreto e colaboradores utilizaram gradientes com acetonitrila e água e
mostraram que uma mistura de MAAs ácidas e neutras pode ser separada numa
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
43
única corrida (Carreto et al., 2001). Este método permite ainda a separação do
crítico par de isômeros usujireno e paliteno, além de ter revelado novas MAAs de
baixa polaridade. Por outro lado, não é possível separar algumas MAAs de alta
polaridade como chinorina de micosporina-2-glicina e palitina-serina. Recentemente,
um método em fase reversa (C18) e gradiente com ácido trifluoracético (TFA) e
hidróxido de amônio resolveu cromatograficamente uma mistura contendo 20 MAAs.
Este método emprega duas colunas C18 em série a 35 °C com gradiente utilizando
TFA (0.2% em água), metanol e acetonitrila. Com este método é possível separar as
MAAs mais polares (chinorina de micosporina-2-glicina e palitina-serina), as de
média polaridade e as de baixa polaridade, como os isômeros usujireno e paliteno.
O trabalho desenvolvido por este grupo possui a vantagem de separar uma mistura
de 20 MAAs e atualmente é o único método por HPLC que consegue resolver tantos
compostos numa única corrida (Carreto et al., 2005).
Um grande problema relacionado a este tipo de análise é que muitas MAAs
possuem espectros e tempos de retenção semelhantes, além de a técnica não
fornecer muitos dados estruturais, limitando a caracterização de novas MAAs. O
acoplamento desta técnica a espectrometria de massas vem ganhando espaço nos
últimos anos por ser uma ferramenta muito útil na identificação e caracterização
destes compostos.
1.2.7.2. Espectrometria de massas
A espectrometria de massas é uma técnica que teve seu nascimento no final
do século XIX, quando o físico britânico Joseph John Thomson estudava os efeitos
de descargas elétricas sobre gases utilizando o tubo de raios catódicos. Nos últimos
anos, esta técnica passou a ser bastante empregada com o advento de novos
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
44
métodos de ionização, como eletrospray e MALDI, que permitiram a análise de
substâncias não-voláteis e termossensíveis como proteínas. Estas descobertas
renderam aos seus pesquisadores, Jonh Bennett Fenn e Koichi Tanaka o prêmio
Nobel de 2002 em Química.
A espectrometria de massas é uma técnica analítica muito poderosa na
caracterização estrutural de biomoléculas, sobretudo quando a quantidade de
material obtido é escassa, uma vez que este tipo de análise apresenta maior
sensibilidade que outros métodos de caracterização estrutural.
A análise por espectrometria de massas pode ser dividida em três principais
estágios. As análises iniciam com a introdução da amostra (sólida, líquida ou
gasosa), que pode ser feita diretamente (inserção direta) ou por meio de um sistema
cromatográfico. Os analitos são convertidos a íons na fonte de ionização, por meio
da perda ou do ganho de carga, da protonação ou desprotonação, da formação de
adutos ou da ejeção de elétrons. Estes íons gerados são então separados de acordo
com suas relações massa/carga (m/z) no analisador e suas intensidades relativas
medidas no detector. Por último, a aquisição e o processamento dos dados geram
os espectros de massas que são produzidos em função da intensidade de cada íon
versus sua razão m/z. Um esquema simplificado dos principais componentes de um
espectrômetro de massas é apresentado na Figura 7.
Figura 7. Esquema simplificado dos componentes principais de um espectrômetro de massas que
indicam os modos de introdução da amostra, ionização e analisadores utilizados neste trabalho.
Introdução
da amostra
Fonte
de ionização
Analisador
Detector
Controle e
tratamento
de dados
9 HPLC
9 Inserção direta
9 Electrospray
9 Triplo Quadrupolo
9FT-ICR
9Ion trap
9Q-TOF
Introdução
da amostra
Fonte
de ionização
Analisador
Detector
Controle e
tratamento
de dados
9 HPLC
9 Inserção direta
9 Electrospray
9 Triplo Quadrupolo
9FT-ICR
9Ion trap
9Q-TOF
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
45
A análise por espectrometria de massas é baseada na relação massa-carga
(m/z) e nas características físico-químicos das moléculas. Uma vez que este tipo de
técnica permite apenas a detecção de moléculas eletronicamente carregadas, é
necessária uma etapa de ionização dos analitos. Atualmente, existem diversos
métodos de ionização, alguns apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 – Diferentes métodos de ionização para análises por espectrometria de massas.
Métodos de ionização Sigla
Ionização por elétrons EI (electron ionization)
Ionização química CI (chemical ionization)
Ionização por electrospray ESI (electrospray ionization)
Ionização química à pressão atmosférica APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
Ionização e dessorção por laser
assistida por matriz
MALDI (matrix-assisted laser
(desorption Ionization)
Fotoionizacao à pressão atmosférica APPI (atmospheric pressure photoionization)
Ionização e dessorção por electrospray DESI (desorption electrospray ionization)
Plasma acoplado indutivamente ICP (inductively coupled plasma)
Nos experimentos com as MAAs foi utilizado ionização por electrospray (ESI).
A ionização por electrospray ocorre à pressão atmosférica e, embora seja
considerada uma fonte de ionização, na verdade é um processo de transferência de
íons já presentes na fase aquosa para a fase gasosa.
Na ESI, uma solução contendo um analito atravessa um capilar mantido em
alto potencial, que provoca a separação das cargas no solvente. Quando um
potencial positivo, por exemplo, é aplicado na solução, os íons negativos são
atraídos pela parede do capilar e os íons positivos tendem a se afastar para uma
região menos repulsiva, resultando na formação de uma gota enriquecida em íons
positivos. As diferenças de potenciais entre o capilar e o cone levam a uma
deformação cônica da gota carregada positivamente (cone de Taylor - Cole, 1997).
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
46
A extremidade do capilar passa a desprender gotículas carregadas que
sofrem evaporação durante a trajetória até o analisador. O aumento da densidade
de carga na superfície leva a um aumento na repulsão entre os íons, que são então
ejetados para a fase gasosa. Os íons em fase gasosa são atraídos para o analisador
auxiliados pelos gradientes de potencial e de pressão. Neste processo são gerados
principalmente moléculas protonadas ou desprotonadas ([M+H]
+
ou [M-H]
-
)
dependendo do sinal do potencial elétrico aplicado e ainda adutos por coordenação
com íons presentes na solução ([M+Na]
+
, [M+K]
+
, [M+Cl]
-
etc) (Crotti et al., 2006a). A
Figura 8 apresenta um esquema simplificado dos componentes presentes em uma
fonte de ESI.
Figura 8. Esquema simplificado de uma fonte de ionização por electrospray. O analito é inserido no
sistema por meio de um capilar (à esquerda). A diferença de potencial entre o capilar e o cone leva à
formação de gotículas carregadas que sofrem evaporação. Adaptado de Gates et al., 2006.
Os íons produzidos na fonte de ionização são acelerados em direção ao
analisador no qual uma combinação de campos magnéticos, campos elétricos e/ou
radiofreqüência (RF) operam para separar os íons de acordo com suas razões m/z
(Gates et al., 2006). Os analisadores podem ser de diversos tipos como setor
magnético, quadrupolo (Q), tempo de vôo (TOF), Ion Trap e ressonância ciclotrônica de
íons (FT-ICR). Análises em tandem MS são possíveis pela combinação destes
analisadores, como no caso do Q-TOF e triplo quadrupolo, e em equipamentos do tipo
fluxo de N
2
(g)
capilar
capilar de
transferência
PRESSÃO ATMOSFÉRICA
Bombeamento
gotículas
analito/solvente
(spray)
Cone
para o
analizador
introdução
analito/eluente
fluxo de N
2
(g)
capilar
capilar de
transferência
PRESSÃO ATMOSFÉRICA
Bombeamento
gotículas
analito/solvente
(spray)
Cone
para o
analizador
fluxo de N
2
(g)
capilar
capilar de
transferência
PRESSÃO ATMOSFÉRICA
Bombeamento
gotículas
analito/solvente
(spray)
Cone
para o
analizador
introdução
analito/eluente
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
47
Ion trap e FT-ICR. Os analisadores podem ser de baixa e alta resolução, dependendo
da capacidade de separação das m/z. Os de baixa resolução, como quadrupolo e Ion
trap, conseguem detectar m/z com diferenças de 1 unidade de massa atômica (u.m.a),
enquanto os de alta resolução, TOF e FT-ICR, permitem obter massas moleculares
com exatidão.
O analisador do tipo quadrupolo consiste em quatro hastes paralelas nas
quais os íons produzidos na fonte passarão pelo seu centro (Figura 9). As hastes são
conectadas em pares opostos; em um dos pares é aplicada uma voltagem de RF, e no
outro, uma de corrente direta (DC). A movimentação dos íons dependerá do potencial
elétrico, sendo que, para cada combinação de RF e DC, apenas íons de determinada
m/z entrarão em ressonância e passarão para o detector. Os demais íons gerados
serão desviados da trajetória principal e eliminados durante o percurso até o detector.
Além disto, ao variar o potencial elétrico em um quadrupolo, pode-se variar a faixa da
relação m/z transmitida, possibilitando uma varredura espectral. A Figura 9 apresenta
um esquema simplificado de um analisador do tipo quadrupolo.
Figura 9. Esquema simplificado do analisador do tipo quadrupolo (adaptado de Gates, 2007).
hastes do quadrupólo
íon ressonante
(detectado)
íon não-ressonante
(não detectado)
fenda de saída
fenda de entrada
ÍONS
DETECTOR
hastes do quadrupólo
íon ressonante
(detectado)
íon não-ressonante
(não detectado)
fenda de saída
fenda de entrada
ÍONS
DETECTOR
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
48
Alguns instrumentos comerciais são equipados com três quadrupolos (QqQ)
seqüenciais, permitindo análises em tandem MS, que geralmente são do tipo MS/MS
ou MS
2
. Nos triplos quadrupolos, o primeiro (Q1) e o terceiro quadrupolos (Q3) são
utilizados para selecionar um ou vários íons ou varrer um determinado intervalo de
m/z. O segundo quadrupolo (q2) na verdade é uma câmara de colisão preenchida
por um gás inerte, como hélio, argônio ou nitrogênio.
Existem diferentes modos de varredura que podem ser realizados num triplo
quadrupolo. O mais comum é a varredura dos produtos de dissociação. Neste
modo de aquisição, o íon de interesse é selecionado no Q1 e transferido para a
câmara de colisão. No q2 (câmara de colisão), interage com as moléculas de gás,
sofrendo fragmentação por meio de um processo denominado dissociação induzida
por colisão (collision-induced dissociation, CID). Os íons produtos gerados são
separados no Q3 e posteriormente detectados. Na aquisição por varredura do íon
precursor, o Q3 é ajustado para selecionar um único íon produto, sendo que o Q1
varre um intervalo de m/z que pode ter gerado este específico íon produto. Outro
modo de operação é a varredura de perda neutra. Nesta aquisição, tanto o Q1
como o Q3 varrem intervalos de m/z que permitem adquirir espectros de íons
precursores correspondentes à perda de massa de um fragmento neutro
considerado. Este tipo de análise é bastante empregada para compostos que
apresentam perdas característica de um mesmo grupamento químico, como as
MAAs.
Análises por MS
2
apresentam duas grandes vantagens: o aumento de
sensibilidade e da seletividade quando comparado à espectrometria de massas
clássica. O aumento da sensibilidade está relacionado à diminuição do ruído químico
provocado por outros componentes da amostra analisada. A seleção dos íons e a
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
49
possibilidade de seleção de um determinado íon levam a um ganho na relação
sinal/ruído. A seletividade acontece pelo fato de a probabilidade de duas moléculas
gerarem íons precursores e íons produtos idênticos por MS
2
ser muito baixa
(Carvalho, 2001). Em análises quantitativas, um modo de aquisição bastante
sensível e seletivo é o monitoramento de reações múltiplas (MRM). Nesta
aquisição, os dois quadrupolos Q1 e Q3 são programados para selecionar a
passagem de massas fixas. Diferentemente da varredura dos produtos de
dissociação, o Q3 não efetua uma varredura dos íons produtos, mas seleciona m/z
específicos gerados na câmara de colisão otimizada para a produção do(s)
mesmo(s).
Os analisadores do tipo Ion Trap são instrumentos compactos e relativamente
baratos que possuem uma configuração tridimensional do analisador do tipo
quadrupolo. Um esquema do analisador Ion Trap é apresentado na Figura 10.
Figura 10. Esquema de um analisador Ion trap (adpatado de Gates, 2007).
Nestes analisadores, potenciais RF e DC são aplicados aos eletrodos para
criar um campo elétrico similar ao do analisador quadrupolar. Todavia, o modo de
operação é diferente, uma vez que no analisador linear do tipo quadrupolo os íons
passam pelos quadrupolos em direção ao detector, e no Ion Trap os íons são
aprisionados e focalizados em órbitas próximas ao centro do analisador. Os
ÍONS
ÍONS
eletrodo de saída
eletrodo de saída
lente de
saída
espaçadores
eletrodos
focalizador
contenção
de íons
ÍONS
ÍONS
eletrodo de saída
eletrodo de saída
lente de
saída
espaçadores
eletrodos
focalizador
contenção
de íons
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
50
espectros de massas são adquiridos aplicando-se diferentes voltagens de RF e DC
que desestabilizam os íons e resultam na ejeção seqüencial de íons de valores
menores a maiores de m/z. Este analisador permite ainda aprisionar íons específicos
e realizar experimentos em tandem MS. Neste caso, a aplicação de um potencial
aumenta a energia cinética do íon selecionado, levando à sua fragmentação pela
colisão com os átomos de gás hélio presente na armadilha. Como estas etapas de
fragmentação são realizadas num mesmo espaço físico, é possível adquirir
espectros de MS
n
.
O analisador do tipo tempo de vôo (TOF) possui múltiplas vantagens, entre
elas a sensibilidade, a faixa de massas que podem ser detectadas e a rapidez na
aquisição dos dados, que possibilitam maior número de análises. Os íons
provenientes da fonte de ionização ou de um primeiro analisador (como no caso do
Q-TOF) são acelerados por um potencial elétrico, resultando numa mesma energia
cinética inicial para todos. Como suas velocidades são inversamente proporcionais
às raízes quadradas de suas massas, os íons mais leves de alta velocidade chegam
ao detector antes que os íons mais pesados de baixa velocidade. Com este
mecanismo de análise, o instrumento detecta todos os íons de acordo com suas
chegadas, conferindo a esta técnica alta sensibilidade (Van Bramer, 1998; Crotii et
al., 2006b). Um esquema simplificado do analisador TOF é apresentado na Figura
11.
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
51
Figura 11. Esquema de um analisador TOF (adaptado de Gates, 2007).
A ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (Fourier
Transform/Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) é o mais complexo método de
análises por massas. Atualmente, é a técnica mais sensível e exata para detecção
de um íon, que permite analisar massas com alta precisão e realizar experimentos
em tandem MS. No FT-ICR, os íons gerados na fonte passam em seguida por
diversos estágios em que há um aumento gradativo de vácuo. A separação dos íons
depende do campo magnético dentro da célula, gerado por um imã supercondutor.
Quando os íons passam por este campo magnético, são direcionados para um
movimento circular perpendicular ao plano do campo que dependem de suas
relações m/z. A excitação de cada íon é alcançada por uma varredura de voltagens
RF por meio dos eletrodos transmissores. Com a aplicação da freqüência, o íon
absorve energia, mudando sua velocidade e seu raio de órbita. Esta oscilação é
detectada pelos eletrodos receptores, produzindo uma corrente de freqüência igual à
do íon. A tradução desses sinais pelo método da transformada de Fourier converte
as freqüências em valores de m/z (Van Bramer, 1998). Um esquema simplificado do
analisador FT-ICR é apresentado na Figura 12.
Detector
Linear
Reflectron
Íons
vácuo
Fonte
Detector
Reflectron
Detector
Linear
Reflectron
Íons
vácuo
Fonte
Detector
Reflectron
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
52
Figura 12. Esquema simplificado de um analisador FT-ICR.
No estudo das MAAs, a espectrometria de massas vem sendo utilizada nos
últimos anos (Whitehead et al., 2001; Whitehead & Hedges, 2002, 2003; Volkmann &
Gorbushina, 2006, Volkmann et al., 2006). Whitehead e colaboradores foram os
primeiros pesquisadores a utilizar esta técnica acoplada a HPLC na caracterização e
quantificação de MAAs em fitoplâncton (Whitehead et al., 2001). Empregando ESI
no modo positivo e analisador do tipo quadrupolo eles desenvolveram um método de
quantificação para 7 MAAs utilizando o íon precursor [M+H]
+
(Whitehead & Hedges,
2002). Outros trabalhos envolvendo caracterização destes compostos mostraram
que as MAAs apresentam perfis de fragmentação em comum que podem ser
utilizados para a varredura de novas MAAs em diferentes organismos aquáticos
(Whitehead & Hedges 2003). Na Tabela 3 são apresentados algumas parâmetros
físico-químicos de algumas MAAs identificadas em diferentes organismos aquáticos,
bem como os principais fragmentos gerados por análises por ESI-MS
2
.
Tabela 3 – Comprimento de onda máximo (λ
max
), coeficiente de extinção molar (ε),massa molecular (MM) e principais fragmentos obtidos por ESI-MS
2
de
diferentes MAAs.
MAAs
λ
max
(nm)
ε
(M
-1
cm
-1
)
MM (g.mol
-1
) Íon precursor e principais fragmentos Referência
Z-ácido palitênico 337 29200 328
[M+H]
+
329, 314, 296, 283, 268, 251, 241,
237, 225, 197, 193, 182, 175, 150, 138
Whitehead et al, 2001
asterina 330 43800 288
[M+H]
+
289, 273, 243, 230, 213, 199, 197,
186, 168, 150, 137
289, 274, 230, 212, 197, 186,168, 150, 137
Whitehead et al., 2001
nesta tese
chinorina 333 44668 332
[M+H]
+
333, 255, 241, 230, 211, 197, 186,
185, 168, 137
333, 318, 274, 230, 212, 186
Whitehead et al., 2001
nesta tese
dehidroxiusujireno 356 267 [M+H]
+
268, 224, 209 Zhang et al., 2007
euhalothece 362 362 330 [M+H]
+
331, 316, 272, 242, 228, 213 Volkmann et al., 2006
M-320 320 559
[M+H]
+
560
[M-H]
-
558
Carreto et al., 2001
M-335/360 335 (360) 598
[M-H]
-
597
Carreto et al., 2001
metil éster chinorina 333 346
[M+H]
+
347
[M+H]
+
347, 332, 317, 288, 270, 244, 229
Carreto et al., 2001
nesta tese
micosp. metilamino-serina 325 16600 288 [M+H]
+
289, 274 Teai et al., 1997
micosp. metilamino-treonina 330 33000 302
[M+H]
+
303
Wu Won et al., 1997
micosporina-2-glicina 332 302 [M+H]
+
303, 288, 244, 200, 185, 164, 151 Volkmann et al., 2006
micosporina-glicina 310 28800 245 [M+H]
+
246, 228, 210, 200, 182, 168, 146 nesta tese
micosporina-taurina 309 295
[M+H]
+
296
Stochaj et al., 1994
palitene 360 50000 284
[M+H]
+
285, 241, 223, 205, 197, 195, 193,
179, 166, 149, 137
285, 270, 241, 226, 197
Whitehead et al., 2001
nesta tese
palitina 320 36200 244
[M+H]
+
245, 230, 209, 199, 186, 184, 162,
155, 150, 137
245, 230, 227, 209, 186, 150, 137
Whitehead et al., 2001
nesta tese
palitina-serina 320 10500 274 [M+H]
+
275, 260 Teai et al., 1997
palitina-treonina 320 288 [M+H]
+
289, 274, 245, 230, 169, 151 nesta tese
palitina-serina sulfato 321 353 ESI modo negativo Wu Won et al, 1997
palitina-treonina sulfato 321 367 ESI modo negativo Wu Won et al, 1997
palitinol 332 43500 302
[M+H]
+
303, 288, 243, 231, 199, 197, 186,
168, 150, 137
303, 288, 244, 235, 230, 226, 197, 186,168,
151, 150, 138, 137
Whitehead et al., 2001
nesta tese
porphyra-334 334 42300 346
[M+H]
+
347, 303, 243, 200, 197, 186, 185,
168, 151, 137
[M+H]
+
347, 332, 303, 288, 227, 186
Whitehead et al., 2001
nesta tese
usujirene 357 284
[M+H]
+
285
285, 270, 241, 226, 197
Sekikawa et al., 1986
nesta tese
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
54
1.3. Algas versus estresse ambiental
Os mecanismos de adaptação dos organismos às pressões ambientais, como
alta intensidade luminosa, raios UV, extremos de temperatura, radiações ionizantes,
poluentes e patógenos, originaram uma grande diversidade estrutural de metabólitos
secundários durante a sua evolução, com funções ecológicas diversas (Sze, 1998).
Os oceanos, responsáveis por 70% da superfície do globo terrestre, abrigam cerca
de 200.000 espécies marinhas, entre plantas, animais e microrganismos (Sze,
1998). A investigação de várias espécies deste habitat demonstra que o ambiente
marinho é uma fonte rica em compostos bioativos, com diversas ações biológicas
como fotoprotetores, antiinflamatórios, antioxidantes, entre outros (Asai et al., 2004;
Hay, 1996; Mundt et al., 2001; Okai et al., 1996; Vries & Beart, 1995; Yoon et al.,
2003).
Entre os organismos marinhos, uma classe bastante explorada
comercialmente são as macroalgas vermelhas (Rhodophyta). O uso intensivo destas
macroalgas está relacionado à produção de ficocolóides (ágar e carragenana), que
apresentam uma larga aplicação industrial e biotecnológica, sendo que desde o final
da década de 80 já eram produzidas em larga escala em “fazendas no mar” ou
diretamente extraídas de bancos naturais (Santelices & Doty 1989; Oliveira & Alveal,
1990). As espécies do gênero Gracilaria são bastante exploradas comercialmente
para este fim por serem uma das principais fontes de extração de agaranas
(Armisen, 1995; Critchley, 1993; Zemke-White & Ohno, 1999). Este gênero é
bastante distribuído geograficamente e a maioria das espécies descritas é
proveniente de regiões entre-marés de áreas tropicais e subtropicais (Critchley,
1993). Quanto às MAAs, sabe-se que as espécies da divisão Rhodophyta
apresentam uma grande variedade e altos conteúdos destes compostos quando
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
55
comparadas a outras macroalgas das divisões Phaeophyta e Chlorophyta sendo
portanto organismos-modelo interessantes para estudos destes compostos (Shick &
Dunlap, 2002).
A macroalga da divisão Rhodophyta Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et
Xia (Figura 13) foi escolhida para os estudos desenvolvidos neste trabalho. Esta
linhagem é originária do sul da China e exibe uma grande tolerância a variações de
salinidade e temperatura (Haglund & Pédersen, 1993). Além disto, esta espécie é
bastante resistente ao ataque de epífitas e tem um ótimo crescimento em
laboratório. Duas espécies do mesmo gênero, Gracilaria domingensis (Kützing)
Sonder ex Dickie e Gracilaria birdiae Plastino et Oliveira (Figura 13), originárias do
litoral nordeste brasileiro também foram utilizadas neste trabalho. G. domingensis
vem sendo empregada na alimentação humana enquanto que G. birdiae é bastante
explorada para a extração de ágar, pois apresenta agaranas de alta qualidade
(Marinho-Soriano, 2005).
Entre as microalgas, uma classe de grande interesse ecológico é a dos
dinoflagelados. Os dinoflagelados marinhos são economicamente importantes por
produzirem neurotoxinas, cujos efeitos prejudiciais são potencializados durante
eventos de marés vermelhas (Landsberg, 2002). Esse fenômeno tem sido bastante
estudado em razão do aporte de nutrientes em corpos hídricos, provenientes de
efluentes domésticos e industriais, fertilizantes agrícolas e de outras fontes, que
podem propiciar condições ideais para a proliferação dessas microalgas. Como no
caso das algas da divisão Rhodophyta, os representantes desta divisão
normalmente são muito ricos em MAAs. Diversos estudos relacionados a indução,
acúmulo e biotransformação de MAAs foram realizados com dinoflagelados (Lesser,
1996a, 1996b; Neale et al., 1998; Klisch & Häder, 2000, 2001, 2002; Banaszak &
1. Introdução
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
56
Trench, 2001; Taira et al., 2004; Callone et al., 2006). A síntese de MAAs em
questão de horas e a facilidade de cultivo destes organismos em laboratório são
atrativos fortes para o emprego destas microalgas em estudos envolvendo as MAAs.
Para os estudos da função fotoprotetora das MAAs foi selecionado o dinoflagelado
marinho Prorocentrum minimum (Pavillard) Schiller (Figura 13) isolado de duas
regiões diferentes: Lisboa, em Portugal, e da baía de Kattegat, situada entre a
Dinamarca e a Suécia.
Figura 13. Organismos escolhidos para os estudos das MAAs: Gracilaria tenuistipitata, Gracilaria
domingensis (foto: Eliane Marinho-Soriano), Gracilaria birdiae (foto: Eliane Marinho-Soriano) e o
dinoflagelado Prorocentrum minimum.
Gracilaria domingensis
Gracilaria birdiae
Gracilaria tenusitipitata
5.0 µm
1 cm
Prorocentrum minimum
Gracilaria domingensis
Gracilaria birdiae
Gracilaria tenusitipitata
5.0 µm5.0 µm
1 cm1 cm
Prorocentrum minimum
2. OBJETIVOS
2. Objetivos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
58
O objetivo geral deste trabalho foi o estudo da composição e das alterações
na biossíntese de compostos fotoprotetores da radiação UV conhecidos como
aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) de algumas micro e macroalgas.
Para isso, foram realizadas as seguintes etapas:
(i) Desenvolvimento de métodos de extração e isolamento de MAAs de
Gracilaria tenuistipitata por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
com detecção no UV-Visível;
(ii) Otimização de métodos de análises por espectrometria de massas para a
elucidação estrutural de MAAs de G. tenuistipitata;
(iii) Investigação da biossíntese de MAAs nos dinoflagelados Prorocentrum
minimum isolados de duas regiões diferentes: Lisboa, em Portugal e baía
de Kattegat situada entre a Dinamarca e a Suécia;
(iv) Determinação da eficiência da fotossíntese para os dinoflagelados P.
minimum utilizando a técnica de fluorescência de pulso de amplitude
modulada (PAM) durante exposição à UVRs;
(v) Avaliação dos níveis de espécies reativas de oxigênio in vivo por
fluorescência para as espécies de P. minimum expostas à UVR;
(vi) Avaliação do potencial de aplicabilidade comercial do extrato de Gracilaria
domingensis contendo MAAs em produtos fotoprotetores por meio da:
9 Determinação da atividade antioxidante medida pela capacidade
de abstração de próton (ensaio com DPPH)
9 Medida da estabilidade quanto a diferentes temperaturas e pHs
para extratos
9 Avaliação da citotoxicidade e fototoxicidade;
9 Avaliação do Fator de Proteção Solar (FPS).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
60
3.1. Reagentes e materiais
Os solventes hexano, clorofórmio (CHCl
3
), acetonitrila (ACN), etanol (EtOH) e
metanol (MeOH) utilizados para as extrações das MAAs foram de grau analítico
(Neon, Vetec). Nas análises em HPLC, espectrômetro de massas e por coluna
Sephadex LH-20 (80 cm x 5,0 cm, Sigma-Aldrich) foram usados solventes de grau
cromatográfico (Tedia, J. Baker Fisher, Merck, Vetec). As soluções de trietilamina
(Sigma-Aldrich), formiato de amônio (Sigma-Aldrich) e dos ácidos acético (HAc)
(Sigma-Aldrich, Vetec, Merck), trifluoracético (Sigma-Aldrich), fórmico (Sigma-
Aldrich), heptafluorobutírico (Acros Organics), clorídrico (Merck) e fosfórico (Sigma-
Aldrich) foram preparadas com água deionizada tratada pelo sistema Milli-Q
(Millipore). Nas análises de ressonância nuclear magnética de próton (RMN
1
H) e de
marcação com deutério foi empregada água deuterada (Sigma-Aldrich).
Nos ensaios antioxidantes os reagentes 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH),
ácido linolêico e 2,2’-azobis (2-amidinopropano) (ABAP) foram obtidos da Sigma-
Aldrich e dodecil sulfato de sódio (SDS) da Bio Rad. A matéria-prima Helioguard
365
foi gentilmente cedida pela Galena Química e Farmacêutica Ltda.
Nos ensaios de cito e fototoxicidade foram utilizados Células 3T3 (linhagem
estabelecida de fibroblasto de pele de camundongo neonato), Dulbecco´s Modified
Eagles Medium (DMEM), soro fetal bovino e o corante Neutral Red (corante) cedidos
pela Natura Indústria de Cosméticos.
A solução de lugol, utilizada para fixação das células para contagem, foi
obtida da Sigma-Aldrich. A sonda fluorescente 2,7,-diclorodihidrofluoresceina
diacetato (DCFA), utilizada nas medidas EROs in vivo, foi obtida da Molecular
Probes.
Os filtros utilizados nos experimentos de exposição ao UV foram: 395 nm
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
61
(Ultraphan UV Opak, Digefra, Alemanha) para a remoção de UVC, UVB e UVA, 320
nm (10155099, Folex, Alemanha) para a remoção de UVB e UVC e 295 nm
(Ultraphan, Digefra, Alemanha) para a remoção de UVC.
3.2. Cultivo e coleta das micro e macroalgas
A macroalga Gracilaria tenuistipitata, originária de Haikou, China, foi coletada
e isolada de contaminantes pelo Prof. Dr. Eurico Cabral de Oliveira (IB, USP) em
1993 e desde então cultivada em laboratório. As culturas foram mantidas em frascos
de 2 L em incubadoras com fotoperíodo de 12 h claro (luz branca fluorescente, 90
µmol fótons.m
-2
.s
-1
) por 12 h escuro, a 20°C e sob aeração constante. O meio de
cultura utilizado foi o von Stosch em água do mar estéril com salinidade de 21‰
(Edward, 1970).
As macroalgas Gracilaria domingensis e Gracilaria birdiae foram coletadas na
Praia do Cotovelo (05°56'S - 035°09'W), localizada no litoral sul do Estado do Rio
Grande do Norte, Brasil, com a colaboração do grupo da Profa. Dra. Eliane Marinho-
Soriano (DOL, UFRN). As amostras foram mantidas em freezer -80 °C até o início
das extrações das MAAs.
Os dinoflagelados Prorocentrum minimum (Katt), isolado da baía de Kattegat,
situada entre a Suécia e a Dinamarca, e Prorocentrum minimum (Liss), isolado de
Lisboa, em Portugal, foram cultivados em Guillard F/2 (Guillard & Ryther, 1962)
preparado com água artificial (Tropic Marine, Dr Bienle GmbH, Alemanha). As
culturas foram mantidas em frascos de 500 mL com aeração constante a 19 °C sob
luz constante (luz branca fluorescente, 50 µmol fótons.m
-2
.s
-1
).
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
62
3.3. Condições experimentais
Todas as microalgas e macroalgas utilizadas nos diferentes experimentos se
encontravam em fase exponencial de crescimento.
3.3.1. Gracilaria tenuistipitata
Para obtenção do melhor período de coleta, foi feita uma curva de
crescimento para G. tenuistipitata por meio de pesagens a cada 3 dias, sempre na 6
a
hora de luz, por um período de 52 dias em condições-padrão de cultivo (item 3.2.).
Com os dados obtidos a partir da curva de crescimento, estabeleceu-se que as
culturas seriam renovadas entre 7 e 10 dias e as coletas, a cada 2 semanas. A
massa obtida era imediatamente congelada em nitrogênio líquido e armazenada em
freezer -80 °C até que uma biomassa razoável fosse obtida para o início das
extrações das MAAs. Para a verificação da existência de variação diária de algumas
MAAs presentes em G. tenuistipitata, culturas foram crescidas sob as condições-
padrão descritas no item 3.2. As amostras foram coletadas a cada três horas
durante 48 h, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer -80 °C
para análises posteriores.
3.3.2. Prorocentrum minimum
Os experimentos de exposição à UVR foram realizados no laboratório do Prof.
Dr. Donat-P Häder, da Universidade de Nurenberg-Erlangen, em Erlangen,
Alemanha. Os dinoflagelados P. minimum isolados de diferentes regiões foram
expostos durante 72 h com ciclos de 12 h claro e 12 h escuro sem nenhum
tratamento prévio. A escolha dos mesmos foi realizada pelo fato de os
dinoflagelados, conjuntamente com as cianobactérias e algas vermelhas, serem o
grupo que possui maiores quantidades destes compostos. Além disto, o cultivo dos
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
63
mesmos já era bem estabelecido no grupo de pesquisa em questão. Para obtenção
da radiação solar artificial (PAR+UVR), foi utilizada uma lâmpada solar (Dr Hönle
Martinsried, Alemanha). Os organismos foram expostos em recipientes de poliéster
abertos, cobertos externamente com adesivo plástico preto para evitar reflexões. Os
recipientes foram cobertos na parte superior com filtros UV 395 nm (exposição
somente à radiação PAR – controle) e 295 nm (exposição às radiações
PAR+UVA+UVB ou PAR+UVR – tratados). Os recipientes foram colocados a 118 cm
da lâmpada solar e a intensidade da irradiação foi medida com um radiômetro duplo
monocromador (QL 754, Optronic Laboratories, Orlando, EUA). As intensidades das
irradiações foram 51,2 ± 0,5 W.m
-2
, 12,1 ± 0,3 W.m
-2
e 0,29 ± 0,03 W.m
-2
para PAR,
UVA e UVB, respectivamente. O espectro obtido da lâmpada artificial solar está
apresentado na Figura 14.
Figura 14. A) Espectro da radiação solar simulada e B) detalhe do espectro entre 250 e 400 nm.
200 300 400 500 600 700 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Irradiância (W . m
-2
nm
-1
)
Comprimento de onda (nm)
240 270 300 330 360 390 420
Comprimento de onda (nm)
A
B
200 300 400 500 600 700 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Irradiância (W . m
-2
nm
-1
)
Comprimento de onda (nm)
240 270 300 330 360 390 420
Comprimento de onda (nm)
A
B
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
64
As amostras foram coletadas a cada 12 h para análises de MAAs, EROs,
fotossíntese e contagem de células. Para as medidas de MAAs, as amostras foram
coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenados em
freezer -80 °C até o momento das análises. Já as medidas de EROs e de
fotossíntese foram realizadas no mesmo momento da coleta. Para a contagem de
células, 1 mL da suspensão foram coletados e fixados em lugol.
3.4. Extração das MAAs
3.4.1. Gracilaria tenuistipitata
Diversos protocolos foram testados para a extração das MAAs contidas em G.
tenuistipitata. Parâmetros como diferentes proporções de solventes, métodos de
rompimento celular, temperatura e tempo de extração foram avaliados quanto à
eficiência na extração destas substâncias. Os passos utilizados para cada protocolo
estão descritos Figura 15.
Figura 15. Passos gerais utilizados na extração das MAAs.
Adicionar solvente inicial
(Concentração igual a 0,1 g.mL-1)
Filtrar em membranas de 0,45 µm
e injetar HPLC
Macerar a biomassa em nitrogênio líquido
Incubar o extrato
(tempo e temperatura)
Evaporar o sobrenadante em Speed Vac
Resuspender em metanol
Evaporar o sobrenadante em Speed Vac
Resuspender em ácido acético (0,2%)
ou TFA a 0,2%
10000 rpm/10 min
10000 rpm/10 min
Adicionar solvente inicial
(Concentração igual a 0,1 g.mL-1)
Filtrar em membranas de 0,45 µm
e injetar HPLC
Macerar a biomassa em nitrogênio líquido
Incubar o extrato
(tempo e temperatura)
Evaporar o sobrenadante em Speed Vac
Resuspender em metanol
Evaporar o sobrenadante em Speed Vac
Resuspender em ácido acético (0,2%)
ou TFA a 0,2%
10000 rpm/10 min
10000 rpm/10 min10000 rpm/10 min
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
65
As condições utilizadas em cada protocolo testado estão resumidas na Tabela
4. Nos protocolos I a VI a massa de alga (peso fresco, PF), o volume de metanol
para resuspender a amostra, bem como o ácido utilizado, foram 200 mg, 2 mL e HAc
a 0,2% (200 µL). O volume injetado em HPLC foi de 100 µL.
Tabela 4 – Protocolos testados para a extração das MAAs.
Protocolo Solvente Tempo (h)
Temperatura (°C)
I MeOH: H
2
O (1:4, v/v) 2,5 45
II MeOH: H
2
O (1:4, v/v) 24 4
III MeOH: H
2
O (1:1, v/v) 2,5 45
IV MeOH: H
2
O (1:1, v/v) 24 4
V MeOH 2,5 45
VI MeOH 24 4
Os protocolos de extração foram avaliados de acordo com os perfis
cromatográficos obtidos. A extração mais eficiente, avaliada pelo protocolo I, foi
aquela que os picos de interesse apresentaram maior área (considerado 100%). As
porcentagens foram obtidas pela razão entre os demais picos e o pico de maior
área. As análises por HPLC foram realizadas segundo o método A (Tabela 5).
Para a extração em maior escala das MAAs foi utilizado o protocolo descrito
na Figura 16. As frações F1 a F5 coletadas em HPLC semipreparativo (método B,
Tabela 5) foram posteriormente analisadas por espectrometria de massas em
analisador triplo quadrupolo.
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
66
Figura 16. Protocolo de extração das MAAs presentes em Gracilaria tenuistipitata.
Nas análises por espectrometria de massas de alta-resolução (FT-ICR)
realizados em Bristol, Inglaterra, as amostras foram preparadas utilizando coluna
Sephadex LH-20 no laboratório do Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes (FCFRP,
USP). Aproximadamente 600 g de alga congelada foram trituradas em liquidificador
com 600 mL de MeOH/H
2
O (1:1, v/v). Após sonicação em banho ultrassom por 30
min a 10
o
C e extração a 4
o
C por 24 h, o extrato foi filtrado e ao precipitado foi
adicionado 600 mL de MeOH/H
2
O (1:1, v/v). Este procedimento foi efetuado mais 2
vezes e 1/3 do sobrenadante foi centrifugado (10000 rpm/ 20 min/ 4
o
C) e liofilizado.
Resuspender em 3 mL de HAc (0,2%)
Filtrar em membranas de 0,45 µm
Injetar em HPLC semipreparativo
Reunir os sobrenadantes
10000 rpm/10min
180 g G. tenuistipitata
Extrato
Triturar com N
2
(l) em liquidificador
24 h / 4°C
Precipitado (1)
Repetir passos (1) a (3)
até extração total das MAAs
(1)
(2)
(3)
Filtrar
Sobrenadante (1)
300 mL MeOH:H
2
O (1:1, v/v)
Sobrenadantes (2), (3), (n)
Sobrenadantes
Extração líquido-líquido
CHCl
3
:MeOH:H
2
O (7:6:3, v/v/v)
Fração polar (~160 mL)
Precipitado GT-1 (2,5 mg)
Evaporar em Speed Vac
Evaporar em Speed Vac
Precipitado GT-2 (1,5 mg)
F1 F2 F3 F4
F5
Resuspender em 3 mL de HAc (0,2%)
Filtrar em membranas de 0,45 µm
Injetar em HPLC semipreparativo
Reunir os sobrenadantes
10000 rpm/10min
180 g G. tenuistipitata
Extrato
Triturar com N
2
(l) em liquidificador
24 h / 4°C
Precipitado (1)
Repetir passos (1) a (3)
até extração total das MAAs
(1)
(2)
(3)
Filtrar
Sobrenadante (1)
300 mL MeOH:H
2
O (1:1, v/v)
Sobrenadantes (2), (3), (n)
Sobrenadantes
Extração líquido-líquido
CHCl
3
:MeOH:H
2
O (7:6:3, v/v/v)
Fração polar (~160 mL)
Precipitado GT-1 (2,5 mg)
Evaporar em Speed Vac
Evaporar em Speed Vac
Precipitado GT-2 (1,5 mg)
F1 F2 F3 F4
F5
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
67
O extrato liofilizado (14,5 g) foi resuspendido em 30 mL de MeOH (para precipitação
de sais e açúcares), centrifugado e o sobrenadante evaporado. O precipitado
resultante foi resuspendido novamente em 5 mL de MeOH e aplicado em coluna
Sephadex LH-20 (80 cm x 5 cm) utilizando metanol como eluente com fluxo de 2,4
mL.min
-1
. As frações coletadas (aproximadamente 250) foram monitoradas por
espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu). As amostras com absorção máxima
entre 310 e 360 nm foram evaporadas, resuspendidas em 0,2% TFA em água (5
mg.mL
-1
), filtradas em membrana de polietileno 0,45 µm e injetadas em HPLC
semipreparativo (método B, Tabela 5). As frações contendo palitina e seus derivados
foram coletadas e armazenas em freezer -80
o
C para análises posteriores.
Para os experimentos de variação diária a extração foi feita seguindo o
protocolo IV mostrado na Tabela 4. A massa de alga, o volume de metanol para
resuspender a amostra, bem como o ácido utilizado, foram 0,2 g (peso fresco), 1,0
mL e ácido trifluoracético a 0,2% em água (500 µL), respectivamente. O volume
injetado em HPLC foi de 20 µL. As amostras foram quantificadas pelo método C
(Tabela 5) utilizando a somatória das áreas integradas de cada pico em 330 nm por
mg de peso fresco de alga.
3.4.2. Gracilaria domingensis e Gracilaria birdiae
Os protocolos II e IV de extração foram testados para estas macroalgas
(Figura 15, Tabela 4). A massa de alga, o volume de metanol para resuspender a
amostra, bem como o ácido utilizado, foram 0,5 g, 2,5 mL e ácido trifluoracético a
0,2% em água (1 mL), respectivamente. O volume injetado em HPLC foi de 100 µL.
Outras duas misturas de solventes, EtOH:H
2
O (1:4, v/v) e EtOH:H
2
O (1:1, v/v)
também foram testadas.
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
68
Para extração das MAAs contidas em G. domingensis em larga escala,
aproximadamente 700 g de alga congelada foram trituradas em liquidificador com
800 mL de etanol:água (1:4, v/v). Após a extração durante 24 h a 4
o
C, o extrato foi
filtrado e o precipitado resultante foi re-extraído algumas vezes até a extração total
das MAAs (monitoração em espectrofotômetro UV-Visível entre 300-400 nm). Os
sobrenadantes das extrações foram agrupados, centrifugados (10000 rpm/ 10 min) e
concentrados em rotoevaporador para retirada do etanol. O sobrenadante restante
foi evaporado em Spray Dry (Mini Spray Dryer Buchi B-290) na Natura Indústria de
Cosméticos utilizando os seguintes parâmetros: temperatura de entrada: 150
o
C;
aspirador: 100%; bomba: 10%; vácuo: 25 – 30 psi). O extrato de coloração rosa
obtido (m = 2,36 g), denominado GD-1, foi analisado por LC-MS segundo o método
D (Tabela 5) e utilizado para os testes de estabilidade, atividade antioxidante,
citotoxicidade, fototoxicidade e de avaliação do fator de proteção solar (FPS).
Para uma estimativa em massa das MAAs presentes neste extrato foi utilizada
a matéria-prima Helioguard 365
como referência. Segundo os fabricantes, esta
amostra contém 1 mg.mL
-1
de MAAs por solução. As medidas foram realizadas em
espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu) entre 200 e 450 nm. Além da estimativa
em massa do extrato GD-1, foi utilizado outro extrato preparado seguindo as etapas
acima descritas, sendo modificada, porém, a etapa de secagem em Spray Dry,
substituída por secagem em Speed Vac
®
(extrato denominado de GD-2). Os extratos
e o Helioguard 365
foram preparados em água numa concentração final de 0,1
mg.mL
-1
para os extratos e de 0,005 mg.mL
-1
para o Helioguard 365
. O mesmo
procedimento de extração em larga escala foi realizado para a macroalga G. birdiae
(extrato final denominado de GB). Os extratos também foram quantificados pelo
método de Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
69
3.4.3. Prorocentrum minimum
Nos experimentos de exposição ao UV do dinoflagelado P. minimum as MAAs
foram extraídas segundo o protocolo descrito em Klisch & Häder (Klisch & Häder,
2002). Em resumo, ao precipitado armazenado em freezer -80 °C (item 3.3.2) foi
adicionado 1,5 mL de metanol e a extração foi deixada a 4 °C durante 16 h. Após
este período as amostras foram centrifugadas (10000 rpm/ 10 min) e os
sobrenadantes utilizados para leituras em espectrofotômetro (DU 70, Beckman,
EUA) entre 250 e 700 nm. Os sobrenadantes foram então evaporados em Speed
Vac
®
e resuspendidos em 200 µL de água. Para a extração de pigmentos e clorofilas
foram adicionados 100 µL de CHCl
3
em cada amostra. As amostras foram agitadas e
logo em seguida centrifugadas por 15 min a 10000 rpm. As fases superiores foram
coletadas, filtradas em membranas de 0,45 µm e injetadas em HPLC (50 µL).
3.4.4. Isolamento das MAAs chinorina e porphyra-334
Para o isolamento em maior quantidade de chinorina e porphyra-334 foi
utilizada a matéria-prima Helioguard 365
®
. Inicialmente foram feitas extrações
líquido-líquido com hexano para retirada de compostos mais apolares. A fração polar
foi coletada, evaporada e injetada em HPLC semipreparativo (método C, Tabela 5,).
Os picos correspondentes a chinorina e porphyra-334 foram coletados e
concentrados em Speed Vac
®
. A identidade de cada pico foi realizada utilizando
espectrometria de massas de baixa e alta resolução. As amostras foram também
submetidas a análises por RMN de hidrogênio (
1
H). Para isso os precipitados obtidos
(~ 1 mg) foram resuspendidos em 600 µL de água deuterada e os espectros de RMN
de
1
H foram adquiridos em espectrômetro BRUKER DPX 500, a 500 MHz em tubos
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
70
de 5 mm em D
2
O. Os deslocamentos estão relacionados ao tetrametilsilano (TMS).
A reprodutibilidade dos dados de deslocamento químico é estimada +/- 0,01 ppm.
A curva de calibração foi preparada com as soluções dos padrões em água
(1-500 µg.mL
-1
). A concentração foi calculada por meio da absorvância medida em
espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu), utilizando os valores do coeficiente de
extinção molar (ε=44700 M
-1
.cm
-1
para chinorina e 42300 M
-1
.cm
-1
para porphyra-
334). O gradiente utilizado foi o mesmo empregado para o isolamento (tabela 5,
método C) e o volume injetado foi de 20 µL para cada padrão.
3.4.5. Experimentos de variação diária das MAAs em G. tenuistipitata
As condições experimentais foram descritas no item 3.3.1. A extração foi feita
seguindo o protocolo IV mostrado na Tabela 4. A massa de alga, o volume de
metanol para resuspender a amostra, bem como o ácido utilizado, foram 0,2 g (peso
fresco), 1,0 mL e ácido trifluoracético a 0,2% em água (500 µL), respectivamente. O
volume injetado em HPLC foi de 20 µL. As amostras foram analisadas pelo método
C (Tabela 5) e as áreas integradas em 330 nm e normalizadas por peso fresco (PF)
de alga.
3.5. Análises das MAAs por HPLC
3.5.1. Gracilarias
As análises foram conduzidas em dois sistemas Shimadzu. O primeiro SCL-
10AVP era composto por duas bombas LC-6AD, detector de arranjo de diodos SPD-
M10AVP equipado com cela analítica e preparativa, injetor automático SIL-10AF,
coletor de frações FRC-10A e programa Class-VP 6.14. O segundo composto por
duas bombas LC-10AD, detector Diode Array SPD-M10AVP, detector eletroquímico
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
71
Coulochem III (ESA) e injetor automático SIL-10ADVP, todos controlados pelo
módulo SCL-10AVP e programa Class-VP 6.14. As colunas utilizadas foram: Luna
C18 (2) (Phenomenex
®
, 250 x 4,6 mm, 5 µm), Synergi Fusion-RP (Phenomenex
®
,
250 x 4,6 mm, 4 µm), Synergi Polar RP (Phenomenex
®
, 250 x 4,6 mm, 4 µm),
LiCrospher RP 18 (Merck
®
, 250 x 4,6 mm, 5 µm) e como semipreparativa Luna C18
(2) (Phenomenex
®
, 250 x 10,0 mm, 5 µm) todas com pré-colunas. Os comprimentos
de onda para monitoração foram 330 nm e 360 nm, fluxo de 1,0 mL.min
-1
para
coluna analítica e de 4,7 mL.min
-1
para semipreparativa. O tempo de corrida variou
de 20 a 40 minutos, dependendo do método empregado. O volume injetado para as
análises em coluna analítica variou de 20 a 100 µL e para a coleta em coluna
semipreparativa de 500 µL. Os espectros no ultravioleta-visível (UV-VIS) dos picos
obtidos pelo detector de arranjo de diodos (DAD) foram monitorados (250 a 700 nm)
e comparados aos encontrados na literatura para algumas MAAs (Sinha et al.,
1998). Diversos gradientes e fases móveis foram testados. A Tabela 5 apresenta os
parâmetros empregados para cada método de análise por HPLC.
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
72
Tabela 5 – Métodos testados por HPLC para as análises das MAAs. Detalhes das colunas
encontram-se descritos acima.
Método Fase móvel Gradiente Coluna
A B
A
Ácido Acético
0,2% (pH=3,0)
0-20min – 100%A Luna C18
B
Ácido Acético
0,2% (pH=3,0)
Metanol 100%
0-10min – 0% B
10-30min – 0-100% B
Luna C18
C
TFA 0,2%
(pH=1,6)
Metanol 100%
0-10min – 0% B
10-30min – 0-100% B
Luna C18 (25 °C)
D
Ácido fórmico
0,1% (pH=3,15)*
Metanol 100%
0-10min – 0% B
10-30min – 0-100% B
Synergi Fusion-
RP+ Synergi
Polar-RP (30 °C)
E
Ácido fórmico
0,2% (pH=3,15)*
Metanol 100%
0-10min – 0% B
10-30min – 0-100% B
Synergi Fusion-
RP+ Synergi
Polar-RP (30 °C)
F
Ácido acético
0,02%
Metanol 100%
0-5min – 0% B
5-20min – 0-100% B
LiCrospher RP
C18
* O pH destas soluções foram ajustados com NH
4
OH.
3.5.2. Prorocentrum minimum
No caso das amostras dos dinoflagelados Prorocentrum minimum, as análises
por HPLC foram conduzidas num sistema Waters com detector de arranjo de diodos
(Waters 990; Waters, EUA) utilizando a faixa de comprimento de onda entre 250 e
400 nm para a monitoração. Para a separação foi utilizado o gradiente descrito no
método F (Tabela 5). As MAAs foram identificadas comparando os tempos de
retenção com padrões disponíveis no laboratório do Prof. Dr. Donat Häder e
quantificadas pela curva de calibração obtida para a porphyra-334 utilizando as
relações dos coeficientes de extinção molar. As integrações foram realizadas nos
comprimentos de onda máximos de cada MAA utilizando o programa Millenium. Os
resultados foram expressos em pmol.célula
-1
. Posteriormente, as MAAs presentes
nos extratos de ambos dinoflagelados foram identificadas por espectrometria de
massas (Ion trap).
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
73
3.6. Análises das MAAs por espectrometria de massas
As análises por espectrometria de massa foram realizadas em colaboração
com o Dr. Valdemir Melechco Carvalho, do Instituto Fleury de Pesquisa, com o Prof.
Dr. Norberto P. Lopes (FCFRP, USP) e com o Dr. Paul Gates, da Universidade de
Bristol, Inglaterra.
O método de ionização aplicado foi majoritariamente por electrospray (ESI) no
modo positivo. Alguns experimentos foram também realizados por nanospray
(nanoESI) no modo negativo. Diferentes espectrômetros de massas foram
empregados:
(i) Triplo-quadrupolo Quattro-LC (Micromass/Waters). As análises foram
realizadas por infusão direta pela bomba de seringa integrada ao espectrômetro com
fluxo de 2-5 µL.min
-1
. O monitoramento dos íons mais abundantes foi compreendido
entre m/z 150-500. Os diversos parâmetros de análises (potencial capilar, voltagens
do cone, do extrator e das lentes RF) foram ajustados procurando maximizar a
intensidade dos íons mais abundantes. Os espectros MS
2
dos íons produtos foram
adquiridos utilizando gás argônio como gás de colisão (4x10
-3
mbar) com energia de
colisão de 20 eV. Outros parâmetros foram: voltagem capilar: 4 kV; voltagem do
cone: 35 V; temperatura capilar e de desolvatação: 80 e 250 °C, respectivamente.
Nos experimentos por LC-MS em espectrômetro de massas triplo quadrupolo
(Quattro-LC, Micromass/Waters) foi utilizado um sistema de HPLC Shimadzu
composto por duas bombas LC-10AT controladas pelo módulo SCL-10Avp e como
injetor o sistema 215 Liquid Handler (Gilson) equipado com uma válvula de injeção
819. Um detector DAD (SPD-10Avp) com comprimento de onda ajustado em 330 nm
foi utilizado em linha. A condição cromatográfica empregada foi: Coluna Luna C
18
(2)
(Phenomenex
®
, 5 x 2 mm, 3 µm) eluída isocraticamente com uma fase móvel
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
74
composta de 95% de uma solução de ácido fórmico a 0,1% e ácido
heptafluorobutírico a 0,05% mais 5% metanol a um fluxo de 0,3 mL.min
-1
. Nestas
análises foram utilizadas as frações F1 a F5 isoladas de G. tenuistipitata como
descrito no item 3.4.1. As frações foram resuspendidas em solução de
água:acetronitrila (1:1,v/v) com 0,1% de ácido fórmico nas análises por ESI no modo
positivo e em uma solução de ACN:H
2
O (1:1, v/v) com 0,1% de trietilamina nas
análises no modo negativo (concentraçao final de 10 µg.mL
-1
). Nos experimentos de
marcação isotópica com deutério as mesmas frações foram analisadas.
Aproximadamente 0,1 mg de cada fração foi incubada com 10 mL de D
2
O por 24 h.
As amostras foram evaporadas em Speed Vac
®
, resuspendidas em água deuterada
e analisadas por ESI-MS
2
. Este procedimento foi repetido até que houvesse a troca
total dos hidrogênios lábeis (hidroxila (-OH), amino (-NH ou -NH
2
) ou carboxila (-
CO
2
H)) por deutério. Para confirmação dos dados obtidos em baixa resolução as
frações não deuteradas foram analisadas por alta resolução utilizando um
espectrômetro quadrupolo-tempo de vôo (Q-TOF, Micromass/Waters). As voltagens
da agulha e do cone foram 3,3 kV e 35 V, respectivamente. Nitrogênio foi utizado
como gás nebulizador e argônio como gás de colisão com energia de colisão de 4
eV.
(ii) FT-ICR Apex 4e 7.0 Tesla (Bruker Daltonics). As amostras foram
injetadas na fonte ESI por infusão direta pela bomba de seringa integrada ao
espectrômetro com fluxo de 100 µL.h
-1
. Os espectros de MS
n
foram obtidos a partir
do isolamento da molécula protonada (íon precursor) usando CO
2
como gás de
colisão. Em alguns casos foi necessário um duplo isolamento dos íons produtos. As
condições da célula foram ajustadas para obtenção de espectros da molécula
protonada com boa intensidade dentro da faixa de análise (m/z 100-500). Os
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
75
espectros de massas e os experimentos de isolamento foram obtidos com uma
resolução de aproximadamente 50.000 e os espectros de MS
n
com resolução de
80.000. Normalmente entre 8 e 16 varreduras eram combinadas para gerar um
espectro de massas com boa relação sinal/ruído e em alguns casos onde o sinal
obtido foi pouco intenso cerca de 40 varreduras foram necessárias. As relações m/z
obtidas quando comparadas aos dados teóricos ficaram na faixa de erro de ± 1 ppm.
Nestas análises foram utilizadas as amostras isoladas segundo item 3.4.1 que foram
resuspendidas em MeOH:H
2
O (1:1, v/v) com 0,05% de ácido fórmico numa
concentração final de 0,1 mg.mL
-1
.
iii) Ion trap Esquire HCT (Bruker Daltonics). Os experimentos foram
realizados por LC-MS e por inserção direta. Nos experimentos por LC-MS foi
utilizado um sistema Shimadzu composto por duas bombas LC-20AD controladas
pelo módulo CBM-20A com injetor automático SIL-20AC e detector DAD (SPD-
M20A). O programa para a aquisição dos dados foi o “LabSolutions – LCsolution
Version 1.21 SP1”. A condição cromatográfica empregada foi a descrita na Tabela 5
(método D). Para a aquisição e análise dos dados por espectrometria de massa foi
utilizado o programa “EsquireControl Version 5.3.” e o “DataAnalysis Version 3.3”.
Um divisor de fluxo foi colocado em série com o espectrômetro de massas e o fluxo
resultante no espectrômetro foi de 50 µL.min
-1
. O monitoramento foi feito entre m/z
150-400 Da utilizando os seguintes parâmetros: nebulizador: 10 psi; temperatura de
dessolvatação de 250
o
C; fluxo de gás do dessolvatador de 4 L.min
-1
; trap drive:
110%. Nestas análises foram utilizados os extratos GT-1, GB-1 e GD preparados
segundo os itens 3.4.1 e 3.4.2 e os extratos de P. minimum obtidos segundo item
3.4.3. Nas análises de infusão direta as amostras foram resuspendidas em uma
solução de MeOH:H
2
O (1:1, v/v) com 0,1% de ácido fórmico e injetadas com fluxo de
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
76
10 µL.min
-1
e nas análises por LC-MS as amostras foram resuspendidas em TFA a
0.2% em água sendo que o volume injetado foi entre 5 e 20 µL. A concentração das
amostras variou de 10 a 100 µg.mL
-1
.
(iv) Quadrupolo-tempo de vôo (Q-TOF) QStar-XL (Applied Biosystems). As
análises neste espectrômetro foram feitas por nanoESI no modo negativo utilizando
um sistema de nanospray automático (Advion Biosciences, UK). Para as análises, 5
µL da solução era aspirada e nebulizada por chip Nanomate 400 a 1,45 V com
pressão de nitrogênio de 0,4 psi. Parâmetros da fonte: 2700 V de voltagem no spray
de íons, 75 V de potencial de declustering, focalizador a 280 V, nitrogênio como gás
secante. As MAAs chinorina e porphyra-334 isoladas da matéria-prima Helioguard
365
®
foram resuspendidas em MeOH:H
2
O (1:1,v/v) numa concentração final de
0,1µg.mL
-1
.
3.7. Ensaios in vitro
Com o objetivo de avaliar o potencial da aplicabilidade dos extratos de algas
contendo MAAs em fotoprotetores comerciais, foram realizados alguns ensaios in
vitro. Alguns destes experimentos foram feitos em colaboração com a Natura
Indústria e Comércio de Cosméticos Ltda (projeto Fapesp / Natura Campus
03/08735-8).
3.7.1. Testes antioxidantes
O ensaio antioxidante utilizando DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) é baseado
na propriedade deste radical estável em extrair prótons de moléculas doadoras
conforme apresentado na Figura 17. Quando radical, o DPPH apresenta absorção
máxima no visível em torno de 517 nm. Após a reação com moléculas que possuem
atividade antioxidante, esta absorção é diminuída.
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
77
N
N
NO
2
O
2
N
NO
2
N
NH
NO
2
O
2
N
NO
2
+ LH
+ L
Figura 17. Reação de DPPH com uma molécula antioxidante doadora de próton (LH).
Para isso foram preparadas soluções de DPPH 1 mM em metanol e soluções
dos extratos (2,5 mg.mL
-
1) a serem testados em metanol:água (1:1, v/v). Em uma
microplaca foram adicionados 10 µL da solução de DPPH, diferentes volumes dos
extratos para obtenção de concentrações de 0,1; 0,5; 1; 1,5 e 2 mg.mL
-
1 para um
volume final de 100 µL completados com metanol. Para cada concentração do
extrato foram descontados os brancos. Após o preparo, as amostras foram levadas
ao espectrofotômetro Elisa (Molecular Devices-Versa Max) e incubadas por 30 min
em temperatura de 25
o
C no escuro. As amostras foram feitas em triplicata e as
leituras monitoradas a 517 nm (Pellati et al., 2004; Yokozawa.et al., 1998; Ferreres
et al., 2006).
Com as leituras de absorvância obtidas, foram calculadas as porcentagens de
inibição, dada pela equação:
100(%) x
Abs
AbsAbs
Inibição
DPPH
AmostraDPPH
−
= Equação 1
Nestes ensaios foram utilizados os extratos de G. tenuistipitata (GT-2) obtido
como descrito no item 3.4.1, G. domingensis (GD-1) e G. birdiae (GB) obtidos
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
78
segundo o item 3.4.2 e a matéria-prima Helioguard 365
disponível comercialmente.
Além dos extratos das algas e a título de comparação foram utilizados padrões dos
flavonóides rutina e a mistura de quercetina e isoquercetrina nas mesmas
condições.
3.7.2. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade
Os testes de citotoxicidade e fotoxicidade foram feitos em colaboração com
Natura Indústria de Cosméticos com o intuito de avaliar a viabilidade da aplicação
comercial dos extratos contendo MAAs obtidos das macroalgas.
Para os ensaios de citotoxicidade, células do tipo 3T3 foram plaqueadas em
meio de cultura DMEM em placas de 96 poços estéril, em uma densidade de 1x10
4
células.poço
-1
por 24 h. Após este período, as células foram incubadas com os
extratos solubilizados em água nas seguintes concentrações: 3,16 mg.mL
-1
; 1
mg.mL
-1
; 0,316 mg.mL
-1
; 0,1 mg.mL
-1
; 0,0316 mg.mL
-1
; 0,01 mg/mL
-1
; 0,00316
mg.mL
-1
e 0,001 mg.mL
-1
. As amostras foram resuspendidas em 100 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO) e ao sistema foi adicionado meio de cultura com 5% de
soro fetal bovino (SFB). As células foram incubadas por 24 h na presença dos
extratos e posteriormente incubadas com o corante Neutral Red durante 3 h
(Borenfreund & Puerner, 1985). O excesso de corante foi retirado e os cristais
formados dissolvidos com uma mistura de etanol:ácido acético:água (50:1:49, v/v/v).
A leitura de absorvância foi realizada em espectrofotômetro em 540 nm e com estes
dados calculou-se a concentração em que 50% das células foram viáveis (IC50).
Este valor classifica a amostra como potencialmente citotóxica ou livre de potencial
citotóxico.
Nos testes de fototoxicidade, as células 3T3 foram plaqueadas exatamente
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
79
como descrito acima, porém neste caso foram preparadas duas placas idênticas
(controle e irradiada com UV). Após incubação por 1 h no escuro das duas placas
com os extratos das macroalgas nas mesmas concentrações descritas acima, uma
das placas foi irradiada com UVA (5 J.cm
-2
) por 50 min. As duas placas foram
lavadas com tampão fosfato contendo cálcio e magnésio e após a adição de meio de
cultura com 10 % de SFB foram deixadas para um período de recuperação de
aproximadamente 12 h. No segundo dia de ensaio, as células são incubadas com o
corante Neutral Red durante 3 h. Os procedimentos de lavagem do corante e de
leitura em espectrofotômetro são os mesmos dos ensaios de citotoxicidade acima
descritos. A razão entre o valor de IC
50
sem exposição ao UV (IC
50
-UV) e de IC
50
com exposição ao UV (IC
50
+UV) é igual ao Fator de Foto-Irritação (PIF), que
classifica a amostra como potencialmente fototóxica ou livre de potencial fototóxico:
UVIC
UVIC
PIF
+
−
=
50
50
Equação 2
Quando PIF ≥ 5, a amostra é fototóxica. Caso não tenha sido obtido o valor
de IC
50
para citotoxicidade até a concentração máxima testada e em presença de UV
observou-se ação fototóxica, calcula-se IC
50
e determina-se
>
PIF segundo a
equação:
)(
)max(
50
UVIC
UVC
PIF
+
−
=>
Equação 3
onde C
max
é a máxima concentração testada na curva de citotoxicidade e IC
50
(+UV)
é IC
50
com exposição ao UV. Quando
>
PIF é maior que 1 a amostra é fototóxica.
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
80
Estes ensaios são procedimentos de padrão internacional (National Institute
of Health, 2001).
3.7.3. Testes de estabilidade
Parâmetro: pH
As amostras foram preparadas na concentração de 0,1 mg. mL
-1
em soluções
de diferentes pHs (1-12). Para o acerto dos respectivos pHs, soluções de ácido
clorídrico e hidróxido de sódio 0,1 mol.L
-1
foram utilizadas. As leituras foram feitas
utilizando cubetas de quarto em espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu)
equipado com celas com controle de temperatura. A monitoração foi feita entre 200
e 400 nm a cada hora num período total de 6 h. Os experimentos foram feitos em
triplicata e os resultados apresentados em função da absorvância versus
comprimento de onda.
Parâmetro: Temperatura
Para estes ensaios os extratos foram preparadas diluindo 0,1 mg dos extratos
em 1 mL de água (pH= 6,7; 0,01% em massa). As amostras foram mantidas a 20 °C,
50 °C, 70 °C e 90 °C e a monitoração foi feita a cada hora num período total de 6 h.
Os parâmetros utilizados no espectrofotômetro foram os mesmos do citado
anteriormente. Os resultados foram apresentados em função da absorvância em 327
nm versus área entre 290 e 360 nm.
3.7.4. Fator de Proteção Solar (FPS)
Nestes testes em colaboração com a Natura Indústria e Comércio de
Cosméticos Ltda, o FPS foi medido em um espectrofotômetro com detecção via
esfera de integração (SPF-290, Optometrics). A monitoração foi feita entre 290 e 400
nm e os dados foram acumulados em intervalos de 5 nm. Com os dados de
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
81
transmitância, o programa calcula o valor de FPS da amostra. Embora estes dados
in vitro sejam uma estimativa das respostas in vivo, numa primeira etapa esta
ferramenta é importante para dar indícios do potencial de aplicabilidade do produto.
Os extratos testados foram dissolvidos em etanol:água (2:1, v/v) na
concentração de 6,6 mg.mL
-1
(0,66% em massa) e aplicados em placas de
polimetilmetacrilato formando um filme de espessura igual 10 µm (1 mg.cm
-2
). Após
a secagem do filme (5 min), a placa foi posicionada no equipamento e as leituras de
transmitância no intervalo entre 290 e 400 nm foram realizadas em triplicata para
cada amostra. Antes de cada leitura foi lido um branco (placa+ etanol:água (2:1,v/v))
para o desconto dos valores de transmitância. Como parâmetro de comparação
utilizou-se dois filtros solares sintéticos comercialmente empregados,
metoxicinamato de 2-etil hexila (MCX, hidrofóbico, proteção UVB) e ácido sulfônico
fenileno benzimidazol (ASB, hidrofílico, proteção UVB) além do produto Helioguard
365
®
.
Além das medidas feitas em placas de polimetilmetacrilato, o perfil de
absorção no UV destas amostras foi monitorado em espectrofotômetro (UV-1650PC,
Shimadzu) entre 200 e 450 nm. Para as leituras, as amostras dos filtros sintéticos
foram diluídas 1000 vezes, enquanto as amostras do extrato de G. domingensis e do
Helioguard 365
®
, 10 vezes. Os resultados foram apresentados em função da
absorvância versus comprimento de onda.
3.8. Medidas de fotossíntese
1
Foi utilizada a técnica da fluorescência de pulso de amplitude modulada
1
Grande parte das informações contidas neste texto foi baseada na tese da Dra. Bruna Mohovic intitulada “Proteção contra a
radiação UV no fitoplâncton marinho: um novo método de estimativa baseado na fluorescência in vivo e os efeitos do aumento
de UV-B em duas latitudes” (Mohovic, 2005).
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
82
(PAM) para as medidas do rendimento quântico do fotossistema II nos
dinoflagelados expostos a UVR (item 4.3.2).
A análise da fluorescência in vivo da clorofila permite medidas não-invasivas e
quase instantâneas de aspectos-chave do processo de captura de luz pela
fotossíntese e transporte de elétrons (Campbell et al., 1998). Estas medidas podem
ser feitas utilizando um fluorímetro PAM. Neste equipamento, medidas do
rendimento quântico do fotossistema II (PS II) utilizando o método do pulso de
saturação podem ser empregadas para o cálculo de diversos parâmetros
relacionados à fotossíntese.
O princípio básico do método do pulso de saturação é o de que, por meio da
aplicação de um pulso de luz suficientemente forte, o aceptor da cadeia de
transporte de elétrons, plastoquinona A (QA), é totalmente reduzido e, assim, a
extinção da fluorescência pela fotoquímica é suprimida. A extinção de energia
restante é não-fotoquímica (non-photochemical quenching, q
N
).
A análise da fluorescência depende do fenômeno no qual elétrons dos
átomos de uma molécula (neste caso, um pigmento) absorvem a energia de fótons e
vão para um estado eletrônico excitado. Para retornarem ao seu estado
fundamental, há essencialmente 4 rotas: (i) reações fotoquímicas nas quais o elétron
excitado deixa a molécula de pigmento e entra numa cadeia de transporte de
elétrons, como ocorre em clorofilas específicas dos centros de reação da
fotossíntese; (ii) dissipação de calor, na qual o elétron excitado retorna ao estado
fundamental por meio de perda de calor; (iii) transferência da energia de excitação
para um pigmento adjacente, como ocorre nos sistemas antena (LHC, Light
Harvesting Complexes) de organismos fotossintetizantes; e (iv) emissão de um fóton
por fluorescência, em um comprimento de onda mais longo do que aquele do fóton
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
83
inicialmente absorvido (Campbell et al., 1998).
O máximo rendimento quântico fotoquímico do PS II (Φ
po
) é o parâmetro
obtido a partir de amostras adaptadas ao escuro (com todos os centros de reação
abertos), no qual, com a aplicação de um pulso saturante de luz branca, a
fluorescência é elevada do seu valor de estado de repouso (Fo), induzida por uma
luz vermelha fraca, para um valor máximo (Fm) (Figura 18). Nesta situação, o
primeiro receptor de elétrons do PSII, QA, está totalmente reduzido. Seu valor
máximo, quando medido sob condições não-estressantes, é quase constante para
muitas espécies fotossintetizantes, sendo em torno de 0,6 a 0,8 em algas verdes
saudáveis. Esses valores podem ser diminuídos, por exemplo, pela fotoinibição,
poluição da água e vários outros fatores de estresse naturais e antrópicos. Desta
maneira, este parâmetro pode ser um indicador de fotoinibição ou de outro tipo de
dano causado aos complexos do PS II.
Para uma amostra adaptada ao escuro:
Fm
Fo
Fm
FoFm
Fm
Fv
po
−=
−
== 1
φ
10
<
<
po
φ
Equação 4
onde Fm é a fluorescência máxima obtida após a incidência de um pulso saturante
de luz branca em amostras adaptadas no escuro e Fo a fluorescência no estado de
repouso em amostras adaptadas no escuro.
Em células adaptadas no claro com luz constante actínica, a fluorescência do
estado de repouso (F) é maior que a fluorescência Fo medida em amostras
adaptadas no escuro (Figura 18). A aplicação de um pulso saturante de luz nesta
situação induz uma fluorescência Fm’, que é menor quando comparada a Fm obtida
com adaptação no escuro. Isto se deve ao estimulo de vias de dissipação da energia
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
84
por processos não radiativos (dissipação por calor, processos não fotoquímicos),
uma vez que nem todos os centros de reação estavam abertos no momento do
pulso. O rendimento quântico efetivo do PSII (Φ
PSII
) é obtido a partir destes dois
parâmetros F e Fm’, como mostrado na Equação 5.
'
'
' Fm
FFm
Fm
F
PSII
−
=
∆
=
φ
Equação 5
onde Fm’ é a fluorescência máxima obtida após a incidência de um pulso saturante
de luz branca e F a fluorescência no estado de repouso.
Outros parâmetros que podem ser calculados a partir destes valores são q
P
(dissipação por processos fotoquímicos) e q
N
(dissipação por processo não
radiativos), como mostrado na Figura 18.
Figura 18. Medidas da fluorescência da clorofila utilizando o método do pulso de saturação. Detalhes
das equações estão mostrados no texto. Extraído de Mohovic, 2005.
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
85
Para estas medidas, 1,0 mL de suspensão de células foram transferidas para
cubetas de plásticos e as leituras realizadas em fluorímetro PAM-101 (Walz,
Alemanha). Os parâmetros Fm’ e F foram utilizados nos cálculos segundo a
Equação 5.
3.9. Medidas in vivo de EROs
O ensaio utilizado para as medidas de EROs nas células dos dinoflagelados
P. minimum expostos a radiação UV foram feitos utilizando a sonda 2,7-
diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), segundo protocolo descrito em He
e colaboradores (He et al., 2002). A membrana celular é permeável a DCFH-DA não
fluorescente e pode diacetilar este composto por meio de esterases para gerar o
análogo hidrolizado 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH), quando este é absorvido
pelas células vivas. DCFH é rapidamente oxidado in vivo por EROs e outros
peróxidos a diclorofluoresceina (DCF), um composto altamente fluorescente. A
formação do DCF é apresentada na Figura 19.
As amostras foram preparadas adicionando 2,5 µL de DCFH-DA 2 mM a 1 mL
de suspensão de células imediatamente após a coleta (item 3.3.2) e incubadas por 1
h no escuro sob agitação. Como controle, amostras sem adição da sonda foram
incubadas seguindo o mesmo procedimento. As leituras de fluorescência foram
realizadas em fluorímetro (RF-5000, Shimadzu, Japão) utilizando com comprimento
de excitação 485 nm e emissão entre 500-600 nm. A fluorescência obtida em 520
nm foi utilizada para determinar a produção de EROs. Os resultados foram
corrigidos subtraindo a fluorescência obtida das amostras controle (suspensão de
células sem adição da sonda).
3. Materiais e Métodos
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
86
O
H
Cl
OOCCH
3
H
3
CCOO
Cl
O
H
Cl
OHHO
Cl
O
Cl
O
HO
Cl
DCFH-DA
DCF
DCFH
Peroxidase/H
2
O
2,
RO
2,
RO , OH,
HOCl, ONOO
-
,
mas não O
2
ou H
2
O
2
esterase (intracelular)
COO
-
COO
-
Figura 19. Formação de DCF altamente fluorescente a partir da oxidação de DCFH-DA por espécies
reativas geradas intracelularmente pela exposição à UVR. Adaptado de He & Hader, 2002.
3.10. Análises estatísticas
Os dados foram expressos como médias ± desvio-padrão e as análises
estatísticas foram realizadas por meio do programa SPSS 8.0 for Windows. Para a
verificação do pressusposto de normalidade foi empregado o teste de normalidade
(Shapiro-Wilk) com nível de significância de 95%. A igualdade de variância entre as
amostras foi verificada por meio do teste de Levene, pela combinação das n
amostras tomadas duas a duas. Foi empregada a análise de variância com um
critério de classificação (ANOVA-one way) para comparação entre as médias das
variáveis controles e tratados nos intervalos de tempo sob investigação com nível de
significância de 99%. Para comparações múltiplas entre as médias foi utilizado o
teste de Bonferroni.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
88
4.1. Extração e Análises das MAAs
4.1.1. Gracilaria tenuistipitata
Para determinar o melhor período de coleta e manutenção da cultura de G.
tenuistipitata foi realizada uma curva de crescimento. Os dados mostraram que a
fase de crescimento exponencial estava entre o 7
o
e 20
o
dia. Porém, foi possível
observar a presença de epífitas (cianofíceas e dinoflagelados) a partir do 15
o
dia. A
partir destes resultados foi estabelecido que as coletas e a renovação do meio de
cultura ocorreriam entre 7 e 12 dias.
Na literatura existem diversos protocolos de extração descritos para as MAAs.
Parâmetros como temperatura e tempo de extração, bem como diferentes misturas
de solventes, são variados. Por exemplo, soluções de etanol e água (50% a 80%) e
metanol e água (20% a 100%) são empregadas, além de diferentes temperaturas de
incubação que podem variar de -20 a 50 °C (Tartarotti & Sommaruga, 2002). Os
valores obtidos das concentrações finais de MAAs de diferentes organismos podem
variar muito dependendo do protocolo empregado. Por este motivo é de suma
importância o estabelecimento de um protocolo de extração eficiente para o
organismo em estudo a fim de evitar-se valores subestimados ou superestimados.
As análises por HPLC segundo o método A (Tabela 5) dos diferentes extratos
obtidos a partir dos protocolos descritos na Tabela 4 apresentaram quatro picos
majoritários (dados não apresentados). Conforme descrito no item 3.4.1, as áreas
integradas dos picos foram utilizadas para avaliar a eficiência de cada um dos
protocolos de extração que foram calculadas em relação ao protocolo I (Tabela 4),
para esta macroalga o mais eficiente. Os resultados estão apresentados na Tabela
6.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
89
Tabela 6 – Porcentagens relativas dos diferentes protocolos de extração para G. tenuistipitata.
* valores significativamente diferentes (ANOVA, p<0.05).
Protocolo
/Picos
1 (%) 2 (%) 3 (%) 4 (%) Total das
MAAs (%)
I 100 100 100 100 100
II 75,4 95,6 65,2 68,9 81,3*
III 95,1 94,6 99,3 99,3 96,5
IV 92,5 94,1 95,1 94,7 94,3
V 77,8 70,4 93,2 93,7 80,0*
VI 82,2 84,8 98,9 90,7 87,4*
Os resultados mostraram que os protocolos utilizando altas temperaturas (45
°C) e com misturas de MeOH e H
2
O foram mais eficientes que aqueles realizados a
4
°C ou com MeOH 100%. O menos eficiente foi o protocolo II e não houve variação
significativa entre os protocolos I e III. O aumento da polaridade do solvente incial
diminuiu a extração dos picos 1 e 2 (com exceção do protocolo II). Embora o
protocolo IV tenha apresentado um rendimento menor que os protocolos I e III, este
foi escolhido para as extrações em larga escala. Na literatura alguns trabalhos
mostram que as iminomicosporinas porphyra-334 e chinorina são muito estáveis a
temperaturas maiores que 45
°C (Sinha et al., 2000). Entretanto, como neste
trabalho foram utilizadas algas que não haviam sido estudadas quanto à diversidade
das MAAs, optou-se pelo protocolo IV, pois as condições mais brandas de extração
poderiam manter a integridade das MAAs presentes nestas algas, caso existisse
moléculas diferentes das já descritas e menos estáveis. Além disto, o protocolo IV
em comparação ao protocolo I utiliza menos água na extração inicial (MeOH:H
2
O,
1:1, v:v), o que acarreta em duas vantagens: uma quantidade menor de agaranas no
extrato bruto uma vez que estes compostos são altamente polares e em um tempo
menor para concentração do extrato em Speed Vac
®
.
Na extração em larga escala algumas etapas foram adicionadas e outras
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
90
modificadas do protocolo IV (item 3.4.1 de materiais e métodos). A extração líquido-
líquido com a mistura de CHCl
3
:MeOH:H
2
O (7:6:3, v/v/v) foi realizada para extrair
pigmentos, como carotenóides e clorofilas e outros compostos mais hidrofóbicos.
Tentativas anteriores com outros solventes e misturas (e.g., hexano, clorofórmio)
não foram tão eficientes na extração de compostos de alta, média e baixa
hidrofobicidade quanto à mistura de CHCl
3
:MeOH:H
2
O empregada. Outro passo
adicionado foi a precipitação do ágar com etanol a baixas temperaturas. Embora
este procedimento seja usual para a precipitação deste polissacarídeo (Falcão et al.,
2006), ele não foi tão eficiente neste caso, uma vez que a macroalga em estudo
apresenta uma grande quantidade de ágar podendo chegar a aproximadamente
53% de seu peso seco (Macchiavello et al., 1999).
Para as análises por HPLC do extrato GT-2 obtido segundo o item 3.4.1,
diversos gradientes binários, fases móveis e colunas foram testados. O método
isocrático anteriormente utilizado na avaliação da eficiência dos protocolos de
extração (método A, Tabela 5) foi substituído por métodos binários, pois algumas
MAAs (e.g., paliteno e usujireno) possuem caráter menos hidrofílico pela presença
de uma cadeia alifática no substituinte R do grupamento imino (Figura 2).
Após diversas tentativas, o gradiente utilizado para separação em HPLC foi o
método B (Tabela 5). O perfil cromatográfico e os espectros de absorção no UV do
extrato GT-2 estão apresentados na Figura 20. Os rendimentos de cada etapa estão
listados na Tabela 7.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
91
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 500 1000
0
5
0
1
0
1
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 500 1000
0
5
0
1
0
1
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 500 1000
0
5
0
1
0
2
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 500 1000
0
5
0
1
0
2
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 50 100 150
0
5
0
1
0
1
5
3
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 50 100 150
0
5
0
1
0
1
5
3
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 200 400
0
2
0
4
0
4
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 200 400
0
2
0
4
0
4
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 200 400
0
2
0
4
0
5
nm
260 280 300 320 340 360 380 400
0 200 400
0
2
0
4
0
5
Figura 20. Perfil cromatográfico do extrato GT-2 com monitoramento em 330 nm e espectros de
absorção no UV das frações coletadas. TR (min) / λ
max
(nm): F1: 3,7 / 320; F2: 4,2 / 330; F3: 6,9 / 334;
F4: 9,6 / 332; F5: 17,0 / 360.
Tabela 7 – Rendimentos das diversas etapas de isolamento das MAAs em Gracilaria tenuitipitata.
Extratos/Frações GT-1 GT-2 F1 F2 F3 F4 F5
massa (g)
2,56 1,53 0,013 0,019 0,011 0,012 0,009
rendimento (%)
1,42 0,85 0,007 0,01 0,006 0,006 0,005
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
92
Utilizando um gradiente de eluição com MeOH foi possível observar outros
picos (F5 e outros minoritários entre 20 e 25 min, Figura 20) que provavelmente não
eram eluídos da coluna utilizando o método isocrático com ácido acético. Os
rendimentos obtidos foram satisfatórios e cada fração coletada foi analisada por
espectrometria de massas.
4.1.1.1. Experimentos em Triplo Quadrupolo
As frações F1 a F5 isoladas da macroalga G. tenuistipitata foram analisadas
por infusão direta no espectrômetro de massas por ESI no modo positivo, pois
tentativas anteriores no modo negativo não resultaram em espectros razoáveis para
interpretação.
Os espectros de massas adquiridos por infusão direta no intervalo m/z 150-
500 (full scan) das frações mostraram majoritariamente a presença dos íons m/z 245
e 333 (fração F1), m/z 289 (fração F2), m/z 347 (fração F3), m/z 303 (fração F4) e
m/z 285 (F5), além de outros íons (dados não apresentados). Análises por LC-MS
mostraram que as frações coletadas previamente por HPLC semipreparativo não
estavam puras. Na fração F1, por exemplo, foi possível observar a presença de mais
de um componente como mostrado na Figura 21.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
93
Figura 21. Análise da fração F1 por LC-UV-MS. A) Cromatograma com detecção no UV em 330
nm; B) Cromatograma obtido pela somatória dos íons totais (TIC); C) Espectro de massas para o pico
com tempo de retenção igual a 4,4 min e D) Espectro de massa para o pico com tempo de retenção
igual a 3,8 min. Energia de colisão: 20 eV.
As análises por infusão direta das frações deuteradas e não deuteradas (F1 a
F5) para obtenção dos espectros de MS
2
forneceram um perfil de fragmentação
muito rico em informação estrutural. Os espectros de MS
2
das frações F1 a F3 estão
apresentados na Figura 22.
FA-6 0.3m
g
1 - F
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
Time
0
100
%
0
100
%
031226-09 UV
An1
2.44e4
3.72
2.66
031226-09 Scan ES+
TIC
5.38e7
3.81
3.79
2.84
2.67
1.75
1.27
0.81
0.45
2.98
3.84
4.00
4.10
4.42
4.56
4.63
12.11
7.07
6.29
11.84
12.29
17.64
19.89
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
m/z 0
100
%
0
100
%
031226-09 441 (4.424) Cm (433:461-44:111) Scan ES+
5.39e5 333.2
150.0
150.2
198.1
157.2
162.1
172.3 183.0
194.1
259.1
258.8
236.0
199.2
220.1
206.1
275.0
260.0
277.1
319.1
334.2
355.3
371.3
031226-09 380 (3.812) Cm (365:412-57:166) Scan ES+
3.78e6 245.0
333.2
300.0
277.0
274.9
D
B
A
C
m/z
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
x4 186.2 245.1230.1
209.1
199.1
197.2
227.1
x4 251.1192.1 236.1
213.1
203.1
232.1
x2 289.1230.1
186.2
199.2197.0
212.1
274.1
x2 295.1
236.2
191.2
217.2
204.2
201.1
280.1
x6 303.1186.1 244.2
230.1
199.1 226.2
235.2
288.1
x6 309.1191.1 250.2
235.2
204.3
294.1
x6 333.1
230.1
186.1
197.1 212.1
199.1
274.3
300.1
318.1
x6 340.1
237.2
191.2
306.2
281.1
325.2
202.1
197.0
231.2
201.1
217.2
218.2
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Figura 22. ESI-MS
2
das MAAs (a) palitina, (b) palitina deuterada, (c) asterina, (d) asterina deuterada, (e) palitinol, (f) palitinol deuterado, (g) chinorina e (h)
chinorina deuterada. A abundância relativa foi de 3 x 10
7
a 3 x 10
8
. Energia de colisão: 20eV.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
95
Na Tabela 8, os m/z dos íons precursores e os principais íons produtos das
frações F1 a F3 e seus análogos deuterados estão mostrados. Os detalhes de cada
fragmentação serão discutidos a seguir.
Tabela 8 – Íons precursores e principais íons produtos das frações F1 a F3 isoladas de G.
tenuistipitata. As razões m/z correspondem às MAAs não deuteradas e m/z D
2
O aos análogos
deuterados. Detalhes de cada produto íon (A-M) serão discutidos adiante.
Palitina Asterina Palitinol Chinorina íon
precursor/
íon produto
m/z
m/z
D
2
O
m/z
m/z
D
2
O
m/z
m/z
D
2
O
m/z
m/z
D
2
O
Molécula
protonada 1
245 251
Molécula
protonada 2
289 295 303 309 333 340
A
230 236
B
186 192 186 191 186 191 186 191
C
227 232
D
227 232
E
209 213
F
274 280 288 294 318 325
G
230 236 244 250 274 281
H
212 217 212 217/218
I
212 217 212 218
J
230 235
K
226 231
L
226 231
M
230 237
Fração F1
O espectro full scan adquirido no intervalo m/z 150-500 da fração F1 confirma
a presença dos íons m/z 245 e 333 quando o solvente utilizado foi acetonitrila/ácido
fórmico (Figura 22) e os íons m/z 251 e 340 quando o solvente foi água deuterada
(dados não apresentados). As discussões que se seguem são feitas para o íon m/z
245 e seu análogo deuterado m/z 251. O outro íon (m/z 333) será discutido mais
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
96
adiante.
A diferença de 6 u.m.a. entre os íons m/z 245 e seu análogo deuterado m/z
251 está de acordo com a presença de 5 hidrogênios lábeis na estrutura da palitina
(Figura 23, molécula 1 onde X=H) sendo 1 u.m.a. atribuído à carga do átomo de
deutério (D
+
). O espectro de MS
2
da palitina e seu análogo deuterado estão
mostrados na Figura 22 (a) e (b). Perdas iniciais de 15 e 44 u.m.a. resultando nos
íons A e B (Tabela 8 e Figura 23) são observadas nas duas amostras (não
deuterada e deuterada). Isso implica que estes passos não envolvem hidrogênios
lábeis. A perda de 15 u.m.a. foi atribuída ao radical metil ligado ao oxigênio do C2 da
molécula protonada [M+H]
+
. De acordo com Whitehead & Hedges esta perda para
palitina foi proposta sendo o grupamento NH (Whitehead & Hedges, 2003). Como
mostrado nestes experimentos, esta perda deve corresponder ao radical metil, uma
vez que nesta eliminação não há envolvimento de hidrogênios lábeis. Se este passo
de fragmentação envolvesse o grupamento NH, a perda deveria ser de 16 u.m.a. Já
a perda de 44 u.m.a. gerando o íon produto m/z 186 (não deuterado) e 192
(deuterado) pode se dar após descarboxilação dos íons m/z 230 e 236,
respectivamente.
Além dos mecanismos envolvendo a perda inicial do radical metil,
observaram-se vias em que houve eliminação neutra de água produzindo o íon
produto m/z 227 (Figura 23, íons produtos C e/ou D). Na molécula deuterada esta
perda foi de 19 u.m.a. indicando a presença de um átomo de deutério nesta
eliminação (Figura 23, íons produtos C e/ou D quando X=D). Provavelmente a
eliminação neutra de água ocorre em duas porções diferentes da molécula: (i) uma
envolvendo o grupamento OH do grupo aminoácido do C5 (Figura 23, íon produto C)
e (ii) uma que envolve o grupo OH do grupo aminoácido do C3 gerando um ceteno
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
97
(Figura 23, íon produto D). Ambos os íons produtos C e D podem perder outra
molécula de água gerando o íon produto E (Figura 23, m/z 209 quando X=H e m/z
213 quando X=D).
NX
NX
XO
XO
O
CH
3
H
O
OX
NX
NX
O
C
O
OX
H
X
+
X
+
NX
NX
CO
2
X
O
X
+
OX
NX
NX
O
XO
XO
C
O
Molécula protonada (1)
C
A
E
D
NX
NX
XO
XO
O
O
O
X
+
X
- HXO
- HXO
N
NXXO
XO
CO
2
X
O
CH
3
X
+
Molécula protonada (2)
F
OX
N
NX
XO
XHO
CO
2
X
O
X
+
R
H
R
R = H, CH
3
, CO
2
X
G
N
NX
XO
XO
O
X
+
R
OX
XO
M
N
NXXO
XO
O
X
+
H
If R=CO
2
X
I
N
NX
O
X
+
OX
H
N
NXXO
XO
O
X
+
H
XO
OX
K
N
NX
O
X
+
OH
J
NH
NXXO
XO
CO
2
X
O
X
+
- CO
2
B
NY
NX
XO
XO
O
X
+
L
N
NXXO
XO
O
X
+
If R=CH
3
OH
XO
R
XO
R
XO
H
X
H
X
H
X
H
X
H
X
H
X
H
X
H
H
H
H
H
H
H
X
+
- CO
2
- HXO
- CH
3
H
X
X
H
H
Y
H
Y
- CH
3
- CO
2
- HXO
- HXO
- CO
2
- D
2
O- HXO
X = H or D
X = H or D
- HXO
- HXO
- HXO
or
- HXO
1
2
3
4
5
6
Figura 23. Mecanismo proposto de fragmentação para as MAAs identificadas como palitina, chinorina,
asterina e palitinol. A-M: principais íons produtos para as moléculas não marcadas (quando X=H) e
para as moléculas marcadas (quando X=D). Y= H ou D dependendo da fragmentação inicial (ver
detalhes no texto).
Fração F2
Os espectros MS
2
da fração F2 estão mostrados na Figura 22 (c) e (d). O
composto deuterado e não deuterado mostraram picos-base em m/z 289 e 295,
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
98
respectivamente. A perda de 15 u.m.a. do íon precursor produzindo o íon produto F
(Figura 23) também sugere a eliminação de radical metil. O íon produto F, por sua
vez, pode perder 44 u.m.a. (CO
2
) gerando m/z 230 e 236 (Figura 23, íon produto G
onde X=H e X=D, respectivamente). Fragmentações de G podem dar origem ao íon
produto m/z 186 (X=H e Y=H) e 191 (X=D e Y=X), respectivamente pela perda da
cadeia lateral do C1 (Figura 23). As perdas neutras de água neste caso ocorrem
após a perda do radical metil. Essas perdas podem ocorrer a partir do grupo
hidroxila ligado na cadeia lateral (C1) ou do grupo hidroxila do C5. A eliminação de
19 u.m.a (HDO) está de acordo com os mecanismos propostos (Figura 23).
Fração F3
Como mostrado na Figura 22 (e) e (f) a fração F3 mostrou um pico-base m/z
303 (não deuterado) e 309 (deuterado). O perfil de fragmentação desta MAA seguiu
os mecanismos propostos para a palitina e asterina. Entretanto, a perda da cadeia
lateral do C1 é proveniente do íon [M+H-15]
+
(Figura 23, íon produto J), enquanto na
asterina esta eliminação é derivada do íon [M+H-59]
+
. A descarboxilação deste
fragmento (J) resultaria no íon produto m/z 186 (não deuterado) e 191 (deuterado).
Os demais mecanismos de fragmentação são mostrados na Figura 23.
Fração F4
Os espectros MS
2
desta fração mostram picos-base em m/z 347 para a
molécula não deuterada e m/z 354 no análogo deuterado (dados não apresentados).
Estes resultados estão condizentes com a estrutura da porphyra-334 que apresenta
seis hidrogênios lábeis. O perfil de fragmentação obtido para esta MAA foi
semelhante ao da chinorina que será discutido a seguir.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
99
Fração F1
Os espectros MS
2
da fração F1 confirmam a presença dos íons m/z 333 e m/z
340 na molécula não deuterada e deuterada, respectivamente (Figura 22 (g) e (h)).
Estes resultados, como no caso da porphyra-334, estão de acordo com a estrutura
da chinorina, que contém seis hidrogênios lábeis (1 u.m.a. é proveniente da carga do
átomo de deutério). A eliminação de 15 seguida de 44 u.m.a. também foi observada
para este composto, embora a abundância relativa dos íons [M+H-15]
+
e [M+D-15]
+
tenha sido bem menor quando comparada as demais MAAs analisadas (Figura 22).
Este dado também foi obtido para a porphyra-334 (dados não apresentados). Alguns
dados da literatura mostraram que muitas vezes não foi observado este fragmento
para estas MAAs. Isto sugere que, quanto maior o número de substituintes a
molécula apresentar (no grupo imino do C1), menor será a intensidade do pico
[M+H-15]
+
. O fragmento m/z 300 (não deuterada) ou m/z 306 (deuterada) pode ser
gerado a partir do íon produto F quando X=H e X=D, respectivamente, pela
eliminação neutra de água (Figura 23). O mesmo íon produto F pode sofrer duas
descarboxilações gerando M via íon produto G (Figura 23). Após a perda da cadeia
lateral de G o íon comum a todas as MAAs não marcadas m/z 186 (Figura 23, íon
produto B quando X=H e Y=H) pode ser observado. No análogo deuterado o íon foi
observado m/z 191 (Figura 23, B quando X=D e Y=H). Outros mecanismos
propostos de fragmentação (eliminação neutra de água) podem ser observados na
Figura 23 e estão de acordo como os dados experimentais obtidos.
Como esperado, em razão da semelhança nas suas estruturas, as MAAs até
agora mostradas geraram fragmentos característicos como os m/z 230 e 186. Além
disto, os íons m/z 191 (Tabela 8, íon produto B quando X=D e Y=H) para asterina,
palitinol e chinorina e m/z 192 (Tabela 8, íon produto B quando X=D e Y=D) para a
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
100
palitina nos análogos deuterados, correspondem ao mesmo íon m/z 186 (Tabela 8,
íon produto B quando X=H e Y=H) nos experimentos sem deuteração. Estes dados
confirmam os mecanismos propostos, pois na palitina deuterada a substituição do
hidrogênio do grupo imino no C1 por um átomo de deutério ocorre inicialmente,
elevando em 1 u.m.a. este íon quando comparado as demais MAAs deuteradas.
Fração F5
O espectro de massas por ESI obtido no intervalo de m/z 150-500 (full scan)
da fração F5 mostrou que esta fração separada por HPLC estava menos
contaminada que as demais (dados não apresentados). Os espectros MS
2
da fração
F5 não deuterada e deuterada, respectivamente, estão mostrados na Figura 24.
Figura 24. A) espectro MS
2
da fração F5 não deuterada e B) espectro MS
2
do análogo deuterado.
Na Figura 25 os mecanismos de fragmentação propostos para a fração F5 e
seu análogo deuterado são apresentados.
m/z
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
%
0
100
1.02e8197.1
153.0
152.0
138.1
195.1
285.1
241.1
226.2
239.1
270.1
070509 PICO 5 DEUTERADO DAUGHTERS OF 290 20EV 1 (2.014) Sm (Mn, 1x0.60) Daughters of 290ES+
5.95e7
290.1
201.1
200.1
156.0
231.2
275.2
245.1
243.1
m/z
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
%
0
100
1.02e8197.1
153.0
152.0
138.1
195.1
285.1
241.1
226.2
239.1
270.1
070509 PICO 5 DEUTERADO DAUGHTERS OF 290 20EV 1 (2.014) Sm (Mn, 1x0.60) Daughters of 290ES+
5.95e7
290.1
201.1
200.1
156.0
231.2
275.2
245.1
243.1
A
B
m/z
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
%
0
100
1.02e8197.1
153.0
152.0
138.1
195.1
285.1
241.1
226.2
239.1
270.1
070509 PICO 5 DEUTERADO DAUGHTERS OF 290 20EV 1 (2.014) Sm (Mn, 1x0.60) Daughters of 290ES+
5.95e7
290.1
201.1
200.1
156.0
231.2
275.2
245.1
243.1
m/z
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
%
0
100
1.02e8197.1
153.0
152.0
138.1
195.1
285.1
241.1
226.2
239.1
270.1
070509 PICO 5 DEUTERADO DAUGHTERS OF 290 20EV 1 (2.014) Sm (Mn, 1x0.60) Daughters of 290ES+
5.95e7
290.1
201.1
200.1
156.0
231.2
275.2
245.1
243.1
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
101
m/z 285
H
+
N
NH
HO
HO
CO
2
H
O
CH
3
N
NH
HO
HO
O
N
NH
HO
HO
O
C
m/z 270
m/z 226
- CO
2
O
O
H
+
H
+
- CH
3
•
H
m/z 290
D
+
N
NDDO
DO
CO
2
D
O
CH
3
N
NDDO
DO
O
N
NDDO
DO
O
C
m/z 275
m/z 231
- CO
2
O
O
D
+
D
+
- CH
3
•
D
H
H
H
N
HO
HO
O
H
+
H
D
H
N
DO
DO
O
D
+
D
N
DO
DO
O
D
+
H
m/z 197
m/z 200m/z 201
AB
ND
NH
D
H
HH
ND
HH
-
-
-
Figura 25. Mecanismo proposto de fragmentação para a fração F5 identificada como paliteno e/ou
usujireno (PM = 284,3 g.mol
-1
). A) Molécula não deuterada com m/z 285 e B) molécula deuterada
com m/z 290.
Com estes dados foi proposto que esta fração corresponde ao(s) isômero(s)
paliteno e/ou usujireno. Os íons característicos m/z 230 e 186 observados nas
fragmentações das demais MAAs analisadas, não foram detectados para esta MAA.
Possivelmente, a quebra é dificultada pela presença da dupla ligação contida no
grupo R (C1) que torna a estrutura mais rígida. Na literatura também foi observada a
ausência destes fragmentos para o ácido palitênico (Figura 2), para o qual o
fragmento mais abundante, como no caso do paliteno, foi o íon m/z 197 (Whitehead
& Hedges, 2003).
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
102
O uso da espectrometria de massas, no caso da análise desta molécula, não
possibilitou diferenciar os isômeros trans e cis, pois os íons produtos gerados foram
idênticos e de mesma abundância nas análises por MS
2
(Figura 33D). O espectro de
absorção no UV mostrou que este composto tem λ
max
em 360 nm . Estes dados
sugerem que a MAA presente em G. tenuistipitata é o paliteno e não usujireno (λ
max
=357 nm). Além disto, dados da literatura mostraram a presença de paliteno e não
usujireno em macroalgas do gênero Gracilaria (Karsten et al., 1998b).
Para confirmar os dados obtidos por espectrometria de massas de baixa
resolução foram realizados alguns experimentos em espectrômetro de massas de
alta resolução (Q-TOF). Os resultados estão mostrados na Tabela 9.
Tabela 9 – Dados de alta resolução para as moléculas não marcadas obtidos em Q-TOF. Condições
experimentais estão descritas no item 3.6.
molécula protonada
m/z
experimental
m/z
calculado
erro (ppm) fórmula
Palitina 245,1133 245,1138 -2,0
C
10
H
17
N
2
O
5
Chinorina 333,1306 333,1298 2,4
C
13
H
21
N
2
O
8
Asterina 289,1403 289,1400 1,0
C
12
H
21
N
2
O
6
Palitinol 303,1582 303,1556 8.6
C
13
H
23
N
2
O
6
Porphyra-334
347,1458
347,1454
1,2
C
14
H
23
N
2
O
8
Paliteno/Usujireno
285,1459
285,1451
2,8
C
13
H
21
N
2
O
5
Com a confirmação das massas moleculares em alta resolução foi proposto
que as frações F1, F2, F3, F4 e F5 isoladas de G. tenuistipitata correspondem às
MAAs chinorina/palitina, asterina, palitinol, porphyra-334 e paliteno e/ou usujireno,
respectivamente.
A detecção dos íons produtos [M+H-15]
+
e [M+H-59]
+
relacionados a
eliminação do radical metil e subseqüente eliminação de CO
2
foi observada para
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
103
todas as MAAs estudadas, mesmo que em menor intensidade nas dicarboxílicas
(chinorina e porphyra-334). O monitoramento destes fragmentos usando ferramentas
disponíveis no espectrômetro de massas, como monitoramento de reações múltiplas
(MRM) e perda neutra, podem facilitar a identificação de novas MAAs em extratos de
diversos organismos aquáticos. Embora o fragmento m/z 186 formado a partir da
perda subseqüente de 15 u.m.a., 44 u.m.a. e da cadeia lateral substituinte no grupo
imino do C1 não tenha sido onipresente, ele ainda pode ser usado para monitorar a
presença de MAAs em diferentes amostras. Entretanto, deve se levar em conta se a
cadeia lateral ligada ao C1 pode ser eliminada, como é o caso das MAAs paliteno e
ácido palitênico (Figura 2) que não apresentam este fragmento, pois a presença de
duplas ligações na cadeia lateral não permitem a perda desta parte da molécula.
Além disto, outros derivados de MAAs (Figura 2) nos quais a glicina no C3 é
substituída por outros aminoácidos (serina, metilalanina ou treonina) ou alguns
derivados sulfatados no C5 também não devem apresentar o íon m/z 186. No
entanto, a eliminação de 15 u.m.a. e 44 u.m.a. ainda podem ser monitoradas.
Como exemplo do emprego desta estratégia, identificamos uma nova MAA
presente em corais em colaboração com o Dr. Mario Carignan do Instituto Nacional
de Investigación y Dessarollo Pesquero (INIDEP) em Mar de Plata, Argentina. A
nova MAA foi isolada do coral Pocillopora eydouxi por este grupo (Carreto et al.,
2005) que nos acompanhou nos experimentos por MS
n
em Ion trap. Análises por LC-
MS mostraram um pico-base com m/z 289 e λ
max
igual a 320 nm. Os dados por MS
2
obtidos para o composto deuterado e não deuterado estão apresentados na Figura
26. Para confirmação dos dados de baixa resolução, análises em Q-TOF
confirmaram a massa exata de 289,1395 (0,346 ppm).
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
104
Figura 26. Espectros de MS
2
da nova MAA isolada de corais A) composto não deuterado e B)
análogo deuterado.
Foi possível observar que a via radicalar, pela perda inicial de 15 u.m.a., não
foi favorecida para a MAA analisada (Figura 26A e 25B). Como no caso das di-
ácidas, chinorina e porphyra-334, esta nova MAA deve apresentar grupamentos que
direcionam a via de fragmentação para uma perda inicial de 44 u.m.a. como a via
mais abundante. Após o estudo das vias de fragmentações obtidas por espectros de
MS
2
e MS
3
, os dados de alta resolução que confirmaram a fórmula molecular, e
tendo em vista que esta nova MAA seja a possível precursora da já identificada
palitina treonina-sulfato (Figura 2), foi proposto à estrutura apresentada na Figura 27
nomeada de palitina-treonina.
NH
NH
HO
HO
O
OH
HO
2
C
Figura 27. Estrutura provável da nova MAA identicada como palitina-treonina.
109.0
133.9
151.0
169.0
184.0 230.0
245.0
274.0
289.0
+MS2(289.0), 1.1min #92
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5
x10
Intens.
113.0
126.1
156.1
175.0
252.0
281.0
296.1
+MS2(296.2), 1.3min #62
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5
x10
Intens
.
50 100 150 200 250 300 350 m/z
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
105
4.1.1.2. Experimentos em FT-ICR
Em todas as MAAs estudadas, mesmo que em menor intensidade nas di-
carboxílicas (chinorina, porphyra-334 e palitina-treonina), foi observado uma perda
inicial de 15 u.m.a. proposto como perda radicalar do grupo metil. A perda deste
radical não é usual em espectrometria de massas com ionização por electrospray,
devido à baixa energia utilizada neste processo. Entretanto, este mesmo fragmento
[M+H-15]
+
já foi observado em outro trabalho e aferido como sendo perda do grupo
metil (Whitehead & Hedges, 2003). Para entender melhor os mecanismos que
envolvem esta quebra radicalar, confirmar e expandir as vias de fragmentação
propostas, alguns estudos em espectrômetro do tipo FT-ICR associados a cálculos
teóricos foram realizados. Os cálculos teóricos foram realizados pelo doutorando
Ricardo Vessecchi, do grupo do Prof. Dr. Sérgio E. Galembeck (FFCLRP, USP).
As amostras foram preparadas como descrito no item 3.4.1. As análises por
HPLC analítico (método B, Tabela 5) das frações previamente reunidas mostraram
que as MAAs eluíram entre as frações 36-76 (Figura 28B a 27I). A ordem de eluição
da coluna Sephadex LH-20 é oposta àquela obtida em coluna C18 uma vez que a
primeira tem caráter polar. Portanto, as primeiras frações em que se observa a
presença de compostos com absorção entre 310 e 360 referem-se à fração
nomeada de B (Figura 28B), que provavelmente trata-se da MAA paliteno e/ou
usujireno. Algumas frações foram selecionadas, isoladas por HPLC semipreparativo
(método B, Tabela 5) e as MAAs palitina, asterina e palitinol (pico 1, 2 e 3,
respectivamente na Figura 28) foram usadas para as análises em alta resolução.
Estes experimentos foram qualitativos e por este motivo não foram considerados os
rendimentos referentes a cada fração.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
106
Figura 28. Perfil cromatográfico das frações coletadas por Sephadex LH-20 contendo MAAs
monitorado em 330 nm. A) frações 30-35; B) 36-39, pico 5 (TR=17min); C) 40-45, pico 5 (TR=17
min); D) 46-47, pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min), pico 4 (TR=9,6 min); E) 48-50, pico 1
(TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min); F) 51-54, igual fração E; G) 55-62, pico 1
(TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min); H) 63-65; e I) 66-76 igual fração G; J) 77-85.
Os espectros de MS
2
e MS
3
obtidos para o palitinol estão apresentados na
Figura 29.
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
1
2
3
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp -329 nm
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
mAU
0
2
4
SPD-M10Avp -329 nm
fração 66-75
fração 66-75
mAU
0
20
40
mAU
0
20
40
SPD-M10Avp -329 nm
fração 63-65
fração 63-65
mAU
0
200
400
600
800
mAU
0
200
400
600
800
SPD-M10Avp -329 nm
fração 55-62
fração 55-62
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp -329 nm
Fraçao_51-54
Fraçao_51-54
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp-329 nm
fração 48-50
fração 48-50
mAU
0
20
40
60
mAU
0
20
40
60
SPD-M10Avp-329 nm
fração 46-47
fração 46-47
0
5
10
15
20
25
30
mAU
0
1
2
0
1
2
SPD-M10Avp-329 nm
fração 110-111
fração 110-111
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp-329 n m
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
6
8
mAU
0
2
4
6
8
SPD-M10Avp-329 nm
fração 115-119
fração 115-119
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
1
2
3
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp -329 nm
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
mAU
0
2
4
SPD-M10Avp -329 nm
fração 66-75
fração 66-75
mAU
0
20
40
mAU
0
20
40
SPD-M10Avp -329 nm
fração 63-65
fração 63-65
mAU
0
200
400
600
800
mAU
0
200
400
600
800
SPD-M10Avp -329 nm
fração 55-62
fração 55-62
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp -329 nm
Fraçao_51-54
Fraçao_51-54
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp-329 nm
fração 48-50
fração 48-50
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp-329 nm
fração 48-50
fração 48-50
mAU
0
20
40
60
mAU
0
20
40
60
SPD-M10Avp-329 nm
fração 46-47
fração 46-47
0
5
10
15
20
25
30
mAU
0
1
2
0
1
2
SPD-M10Avp-329 nm
fração 110-111
fração 110-111
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp-329 n m
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
6
8
mAU
0
2
4
6
8
SPD-M10Avp-329 nm
fração 115-119
fração 115-119
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
5
5
4
3
3
2
2
1
1
3
1
2
1
2
2
1
2
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
1
2
3
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp -329 nm
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
mAU
0
2
4
SPD-M10Avp -329 nm
fração 66-75
fração 66-75
mAU
0
20
40
mAU
0
20
40
SPD-M10Avp -329 nm
fração 63-65
fração 63-65
mAU
0
200
400
600
800
mAU
0
200
400
600
800
SPD-M10Avp -329 nm
fração 55-62
fração 55-62
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp -329 nm
Fraçao_51-54
Fraçao_51-54
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp-329 nm
fração 48-50
fração 48-50
mAU
0
20
40
60
mAU
0
20
40
60
SPD-M10Avp-329 nm
fração 46-47
fração 46-47
0
5
10
15
20
25
30
mAU
0
1
2
0
1
2
SPD-M10Avp-329 nm
fração 110-111
fração 110-111
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp-329 n m
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
6
8
mAU
0
2
4
6
8
SPD-M10Avp-329 nm
fração 115-119
fração 115-119
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
1
2
3
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp -329 nm
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
mAU
0
2
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SPD-M10Avp -329 nm
fração 66-75
fração 66-75
mAU
0
20
40
mAU
0
20
40
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fração 63-65
fração 63-65
mAU
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400
600
800
mAU
0
200
400
600
800
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fração 55-62
fração 55-62
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp -329 nm
Fraçao_51-54
Fraçao_51-54
Minutes
0
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mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp-329 nm
fração 48-50
fração 48-50
Minutes
0
5 10 15 20 25 30
mAU
0
10
20
30
mAU
0
10
20
30
SPD-M10Avp-329 nm
fração 48-50
fração 48-50
mAU
0
20
40
60
mAU
0
20
40
60
SPD-M10Avp-329 nm
fração 46-47
fração 46-47
0
5
10
15
20
25
30
mAU
0
1
2
0
1
2
SPD-M10Avp-329 nm
fração 110-111
fração 110-111
mAU
0
1
2
3
SPD-M10Avp-329 n m
fração 77-90
fração 77-90
mAU
0
2
4
6
8
mAU
0
2
4
6
8
SPD-M10Avp-329 nm
fração 115-119
fração 115-119
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
5
5
4
3
3
2
2
1
1
3
1
2
1
2
2
1
2
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
107
Figura 29. Espectros MS
2
e MS
3
de alta resolução obtidos para o palitinol em FT-ICR-MS
n
. A)
Espectro MS
2
de m/z 303; B) espectro MS
3
de m/z 288 proveniente de (A); C) espectro MS
3
de m/z
244 proveniente de (A); D) espectro MS
3
de m/z 230 proveniente de (A); e E) espectro MS
3
de m/z
186 proveniente de (A).
Os resultados destes experimentos confirmaram os dados obtidos em baixa
resolução, mostrando que a perda inicial de 15 u.m.a. corresponde ao grupo metil
ligado ao oxigênio do C2 e que está relacionada ao enfraquecimento da ligação C-O
do C2. Os mecanismos de fragmentação para as três MAAs analisadas, bem como
150 200 250 300 m/z
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
intensity
303.15505
288.13151
244.14174
235.10770
226.13122
150.07870
197.09209
186.09989
137.07097
230.08985
150 200 250 m/z
0
5.0e+05
1.0e+06
1.5e+06
2.0e+06
2.5e+06
intensity
137.07094
150.07870
186.09988
197.09208
230.08973
244.14177
288.13158
150 200 250 m/z
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
intensity
244.14176
226.13120
197.09215
186.09986
150.07878
137.07093
110 130 150 170 190 210 230 m/z
0
2.0e+05
4.0e+05
6.0e+05
8.0e+05
1.0e+06
1.2e+06
1.4e+06
intensity
230.08971
186.09990
150.07861
137.07094
130 150 170 190 m/z
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
intensity
186.09988
168.08935
155.08148
151.08662
150.07876
138.05478
137.07094
(a)
(b) (c)
(d) (e)
A
B C
D
E
150 200 250 300 m/z
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
intensity
303.15505
288.13151
244.14174
235.10770
226.13122
150.07870
197.09209
186.09989
137.07097
230.08985
150 200 250 m/z
0
5.0e+05
1.0e+06
1.5e+06
2.0e+06
2.5e+06
intensity
137.07094
150.07870
186.09988
197.09208
230.08973
244.14177
288.13158
150 200 250 m/z
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
intensity
244.14176
226.13120
197.09215
186.09986
150.07878
137.07093
110 130 150 170 190 210 230 m/z
0
2.0e+05
4.0e+05
6.0e+05
8.0e+05
1.0e+06
1.2e+06
1.4e+06
intensity
230.08971
186.09990
150.07861
137.07094
130 150 170 190 m/z
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
intensity
186.09988
168.08935
155.08148
151.08662
150.07876
138.05478
137.07094
(a)
(b) (c)
(d) (e)
A
B C
D
E
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
108
os dados de alta resolução de MS
2
e MS
3
do palitinol, estão apresentados na Figura
30 e Tabela 10, respectivamente. Os dados de alta resolução (Tabela 10) confirmam
os mecanismos de fragmentação propostos. A parte contendo os cálculos teóricos é
um dos temas da tese de doutorado do aluno Ricardo Vessecchi (FFCLRP, USP).
NH
NH
HO
HO
O
m/z 186
NH
NH
HO
HO
CO
2
H
O
CH
3
N
NH
HO
HO
O
H
m/z 288
NH
NH
HO
HO
O
C
O
O
H
NH
NH
O
- H
2
O
H
m/z 168
N
NH
HO
HO
O
OH
m/z 244
N
NH
O
OH
m/z 226
- H
2
O
H
OH
OH
m/z 230
N
NHHO
HO
CO
2
H
O
OH
CH
3
- CH
3
•
A
palitinol (2)
m/z 303
palitina (1)
m/z 245
- CH
3
•
O
O
H
- CO
2
B
N
NHHO
HO
CO
2
H
O
OH
CH
3
asterina (3)
m/z 289
- CH
3
•
N
NH
HO
HO
O
H
m/z 274
O
O
H
N
NH
HO
HO
O
OH
m/z 230
H
N
NH
O
OH
m/z 212
- H
2
O
OH
HO
HO
OH
H
H
A
H
B
A
H
H
perda de
H
H
H
A
OH
H
H
H
B
A
- CO
2
- CO
2
B
H
A
H
H
H H
H
perda de
Figura 30. Mecanismo de fragmentação proposto para três MAAs analisadas por alta resolução
mostrando a quebra homolítica que gera a perda inicial do radical metil. A ordem da rota A pode
mudar dependendo da energia utilizada.
Tabela 10 – Dados de alta resolução de MS
2
e MS
3
da fragmentação do palitinol obtido por ESI-FTICR-MS
n
. As fórmulas moleculares, massas teóricas e
massas experimentais foram listadas para os íons produtos majoritários.
Massas experimentais (erro em ppm)
Íon Fórmula
Molecular
Massas
teóricas
MS
2
MS
3
288 MS
3
244 MS
3
230 MS
3
186
[M+H]
+
C
13
H
23
N
2
O
6
+
303,15506 303,15505 (-0,03)
303 - CH
3
•
C
12
H
20
N
2
O
6
•
+
288,13159 288,13151 (-0,28) 288,13158 (-0,03)
288 - CO
2
C
11
H
20
N
2
O
4
•
+
244,14176 244,14174 (-0,08) 244,14177 (+0,04) 244,14176 (0)
303 - CO
3
H
8
C
12
H
15
N
2
O
3
+
235,10772 235,10770 (-0,09) - -
288 - C
3
H
6
O C
9
H
14
N
2
O
5
٠+
230,08972 230,08985 (+0,56) 230,08973 (+0,04) - 230,08971 (-0,04)
244 - H
2
O
C
11
H
18
N
2
O
3
•
+
226,13119 226,13122 (+0,13) - 226,13120 (+0,04) -
303 - C
4
H
10
O
3
C
9
H
13
N
2
O
3
+
197,09207 197,09209 (+0,10) 197,09208 (+0,05) 197,09215 (+0,41) -
230 - CO
2
C
8
H
14
N
2
O
3
•
+
186,09989 186,09989 (0) 186,09988 (-0,05) 186,09986 (-0,16) 186,09990 (+0,05) 186,09988 (-0,05)
186 - H
2
O
C
8
H
12
N
2
O
2
•
+
168,08933 - - - - 168,08935 (+0,12)
186 - CH
3
O
•
C
7
H
11
N
2
O
2
•
+
155,08150 - - - - 155,08148 (-0,13)
168 - OH
•
C
8
H
11
N
2
O
+
151,08659 - 151,08661 (+0,13) - - 151,08662 (+0,20)
168 - H
2
O
C
8
H
10
N
2
O
•
+
150,07876 150,07870 (-0,40) 150,07876 (0) 150,07878 (+0,13) 150,07861 (-1,00) 150,07876 (0)
155 - NH
3
C
7
H
8
NO
2
•
+
138,05495 - - - - 138,05478 (-1,23)
155 - H
2
O C
7
H
9
N
2
O
+
137,07094 137,07097 (+0,22) 137,07094 (0) 137,07093 (-0,07) 137,07094 (0) 137,07094 (0)
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
110
4.1.1.3. Experimentos em Ion Trap
Nestes experimentos foi utilizado o extrato GT-1 obtido segundo etapas
descritas no item 3.4.1 de materiais e métodos. As análises por LC-MS foram feitas
segundo o método E (Tabela 5) empregando duas colunas acopladas de caráter
menos hidrofóbico que as colunas C18, na tentativa de se obter uma separação
mais eficiente entre as MAAs mais polares, como a chinorina e palitina. Diversos
gradientes foram testados utilizando diferentes soluções e solventes como fase
móvel. A melhor separação alcançada foi utilizando ácido fórmico (0,2%) ao invés de
ácido acético (0,2%) ou TFA (0,2%) (métodos A, B, C; Tabela 5). O perfil
cromatográfico obtido nestas condições está apresentado na Figura 31.
Figura 31. A: Perfil cromatográfico das MAAs presentes no extrato GT-1 monitorado em 330 nm.
λ
max
(nm) – pico 1 – chinorina: 6,9 / 333; pico 2 –: palitina: 7,8 / 320; pico 3 – asterina: 8,8 / 330; pico
4 – porphyra-334: 9,2 / 334; pico 5 – palitinol: 11,4 / 330; pico 6 – paliteno e/ou usujireno: 25,9 / 360.
B: Detalhe da separação entre 6 e 13 min.
Utilizando a ferramenta de monitoramento de reações múltiplas (MRM)
descrita no item 1.2.8.2, alguns íons na faixa de massa de interesse foram
analisados. Os espectros de MS
2
obtidos foram comparados com o perfil de
fragmentação propostos anteriormente utilizando triplo quadrupolo e FT-ICR e com
0 5 10 15 20 25 30
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
Absorvância (ua)
Tempo (min)
1
2
3
4
5
6
6 8 10 12
Tempo (min)
1
2
3
4
5
AB
0 5 10 15 20 25 30
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
Absorvância (ua)
Tempo (min)
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25 30
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
Absorvância (ua)
Tempo (min)
1
2
3
4
5
6
6 8 10 12
Tempo (min)
1
2
3
4
5
AB
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
111
estes resultados foi possível identificar as mesmas MAAs diretamente no extrato
bruto de G. tenuistipitata. Os principais íons produtos obtidos das análises por MS
2
em triplo quadruplo, Ion trap e FT-ICR do extrato de G. tenuistitipitata estão
apresentados na Tabela 11.
Tabela 11 – Íon precursor e principais fragmentos das MAAs identificadas em G. tenuistipitata
utilizando três espectrômetros diferentes.
Composto [M+H]
+
Triplo Quadrupolo
m/z
Ion Trap
m/z
FT-ICR
m/z
Palitina 245 230, 227, 186, 209 230, 209, 186 230, 227, 215, 209,
197, 186, 150, 137
Asterina 289 274, 230, 212, 186 274, 230,186 274, 230, 226, 197,
186, 137
Palitinol 303 288, 244, 230, 226,
186
288, 244, 230, 186 288, 244, 235, 230,
226, 197, 186, 150, 137
Chinorina 333 318, 274, 230, 212,
186
318, 274, 230, 186 Não foi obtido espectro
Porphyra-334 347 332, 303, 288, 244,
230, 227, 186
332, 303, 288, 244,
227, 186
332, 303, 286
Paliteno/
Usujireno
285 270, 241, 226, 197 270, 241, 226, 197 Não foi obtido espectro
Após a confirmação da identidade de cada pico por espectrometria de
massas, a resolução (Rs) entre dois picos adjacentes foi calculada segundo a
Equação 6:
(
)
12
12
2
LL
tt
Rs
rr
+
−
=
Equação 6
onde tr
1
e tr
2
são os tempos de retenção de dois picos adjacentes e L
2
e L
1
são as
larguras dos respectivos picos medidas na base e nas mesmas unidades do tempo
de retenção.
Os valores calculados de Rs para o método E (Tabela 5), bem como os
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
112
conteúdos de cada MAA presente no extrato de G. tenuistipitata estão apresentados
na Tabela 12. A quantificação das MAAs foi realizada pelo Dr. Mario Carignan
utilizando o método desenvolvido por Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).
Não foi possível quantificar paliteno e/ou usujireno pela baixa concentração
encontrada no extrato. As concentrações de chinorina e porphyra-334 também foram
calculadas usando as curvas de calibração obtidas a partir do isolamento das duas
MAAs descrito no item 4.2. Os valores foram muito próximos aos obtidos pelo
método de Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).
Tabela 12 – Identificação dos picos separados pelo método E (Tabela 5), valores calculados de
resolução (Rs) entre dois picos adjacentes e de concentração (ng.mg extrato
-1
).
Pico Composto TR
(min)
Rs
λ
max
(nm)
ng.mg
extrato
-1*
[M+H]
+
1 Chinorina 6,9 1,9 (1/2) 332 26,4 333
2 Palitina 7,7 1,8 (2/3) 319 45,4 245
3 Asterina 8,5 0,9 (3/4) 330 72,8 289
4 Porphyra-334 9,2 4,6 (4/5) 333 27,8 347
5 Palitinol 11,4 332 19,7 303
6 Paliteno/Usujireno 25,8 360 - 285
*A quantificação das MAAs foi realizada pelo Dr. Mario Carignan utilizando o método desenvolvido por Carreto e colaboradores
(Carreto et al., 2005).
Valores altos de resolução significam que os compostos estão bem separados
sendo que valores acima de 1,5 indicam que as duas substâncias possuem uma
separação até a linha base (Ciola, 1998). Como pode ser observado, a resolução
entre os picos 3 e 4 foi menor que 1,5, no entanto, o emprego deste gradiente
mostrou a melhor resolução entre todos testados. As MAAs mais polares, chinorina
e palitina, que coeluíam no método com ácido acético e MeOH como fase móvel e
coluna C18 como fase estacionária (método B, Tabela 5) foram separadas entre si
(picos 1 e 2). Gradientes contendo TFA como fase móvel e coluna polar como
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
113
estacionária, também não se mostraram satisfatórios, pois porphyra-334 e palitina
coeluíam (dados não apresentados). A substituição do TFA por ácido fórmico, além
de melhorar a resolução de alguns picos, oferece a vantagem de trabalho em modo
negativo no espectrômetro de massas, pois soluções de TFA suprimem a varredura
espectral dos íons em modo negativo.
4.1.2. Gracilaria domingensis, Gracilaria birdiae e Prorocentrum minimum
Os extratos de G. domingensis e G. birdiae preparados como descrito no item
3.4.2 foram analisados por HPLC segundo o método D (Tabela 5). Os rendimentos
foram calculados utilizando o mesmo procedimento que para os extratos obtidos de
G. tenuistipitata. Não houve variação significativa na extração das MAAs mais
polares entre os métodos. Em geral a extração mais eficiente foi aquela realizada
com MeOH:H
2
O (1:1, v/v) que extraiu cerca de 1,5 vezes mais MAAs, enquanto que
a extração com EtOH:H
2
O (1:1, v/v) foi a menos eficiente. Uma vez que os ensaios
com estas macroalgas brasileiras foram realizados no intuito de avaliar o potencial
de aplicabilidade dos extratos em fotoprotetores comerciais, a extração em larga
escala foi feita utilizando a mistura EtOH:H
2
O (1:4,v/v) ao invés de MeOH:H
2
O (1:1,
v/v). A substituição de solventes é vantajosa, pois o etanol é menos tóxico, menos
agressivo ao meio ambiente e de custo mais baixo quando comparado ao MeOH.
Os experimentos por LC-MS em Ion Trap do extrato GD-1 e GB seguiram os
parâmetro descritos no método D (Tabela 5). O extrato bruto GT-1 obtido de G.
tenuistipitata, o extrato de P. minimum e a matéria-prima Helioguard 365
®
(extrato de
Porphyra umbilicalis) também foram analisados nestas condições. Os perfis
cromatográficos com detecção no UV em 330 nm dos extratos e os espectros no UV
de cada pico estão apresentados na Figura 32.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
114
Os extratos obtidos de G. domingensis e G. birdiae (GD-1 e GB,
respectivamente) apresentaram o mesmo perfil cromatográfico utilizando detecção
por UV (Figura 32). Como ambas as espécies são do gênero Gracilaria utilizamos a
ferramenta MRM para a extração das MAAs que já haviam sido identificadas
anteriormente em G. tenuistipitata. Os dados de MS
2
confirmaram a presença de
chinorina (pico 1), palitina (pico 2), porphyra-334 (pico 4), asterina (pico 3), palitinol e
paliteno e/ou usujireno (pico 11 e/ou 12), sendo estes três últimos bem pouco
intensos (dados não apresentados). As MAAs identificadas nestas macroalgas estão
apresentadas na Tabela 13. A quantificação das MAAs presentes em G.
domingensis foi realizada pelo método de Carreto e colaboradores (Carreto et al.,
2005). Os valores encontrados foram: chinorina (7,2 µg.mg extrato
-1
), palitina (1,9
µg.mg extrato
-1
) e porphyra-334 (20 µg.mg extrato
-1
).
Já os dinoflagelados P. minimum isolados de Lisboa e de Kattegat mostraram
um perfil bastante complexo de MAAs (Figura 32). Outros picos estavam presentes
além dos já identificados nas espécies de Gracilaria anteriormente analisadas.
Análises em full scan mostraram a presença de íons m/z 246, 329, 299 e 560 além
dos íons m/z 245, 285, 303, 333 e 347 (dados não apresentados). Utilizando a
ferramenta MRM, os íons mais abundantes foram extraídos e os espectros de MS
2
obtidos estão apresentados nas Figura 33 e Figura 34.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
115
Figura 32. Perfil cromatográfico em 330 nm dos extratos de G. tenuistipitata, G. domingensis, G.
birdiae, P. minimum e da matéria-prima Helioguard 365
®
e espectros de absorção no UV. TR (min):
pico 1: 8,1; pico 2: 9,3; pico 3: 10,6; pico 4: 10,9; pico 5: 12,1; pico 6: 14,1; pico 7: 15,0; pico 8: 17,5;
pico 9: 19,7; pico 10: 21,1; pico 11: 24,4; pico 12: 24,5; pico 13: 25,6. O espectro no UV do pico 10
(não identificado) não foi apresentado (λ
max
= 325 nm).
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
333 nm
Pico 1
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
0
3000
6000
9000
12000
15000
18000
320 nm
Pico 2
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-3000
0
3000
6000
9000
12000
15000
18000
21000
24000
27000
330 nm
Pico 3
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
333 nm
Pico 4
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
0
3000
6000
9000
12000
15000
18000
309 nm
Pico 5
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
330 nm
Pico 6
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-1500
0
1500
3000
4500
6000
335 nm
Pico 7
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
331 nm
Pico 8
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
318 nm
Pico 9
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
0
10000
20000
30000
40000
50000
360 nm
Pico 11
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
0
10000
20000
30000
40000
50000
357 nm
Pico 12
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
140000
150000
357 nm
Pico 13
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
0 6 12 18 24 30
Helioguard 365
P. minimum (Liss)
G.birdiae
G.domingenses
G.tenuistipitata
Tempo (minutos)
10
6
1
2
3
5
7
8
11
12
4
9
13
G. tenuistipitata
G.birdiae
G.domingenses
P. minimum
Helioguard 365
®
0 6 12 18 24 30
Helioguard 365
P. minimum (Liss)
G.birdiae
G.domingenses
G.tenuistipitata
Tempo (minutos)
10
6
1
2
3
5
7
8
11
12
4
9
13
G. tenuistipitata
G.birdiae
G.domingenses
P. minimum
Helioguard 365
®
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
116
Figura 33. Espectros MS
2
obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z 333 (TR= 8,2 min);
B: m/z 245 (TR= 9,4 min); C: m/z 347 (TR= 11,1 min) e D: m/z 285 (TR= 24,9 min) presentes em P.
minimum. Os losangos azuis indicam a molécula protonada.
118
137 151
168
186
197
212
230
241
255
265
274
287
303
318
333
+MS2(333), 8.2-8.8min #(703-748)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4
x10
Intens.
151
186
197
209
230
245
+MS2(245), 9.4-10.0min #(804-858)
0.0
0.5
1.0
1.5
4
x10
I
n
t
ens.
134
146
200
209
227
244
288
303
347
+
MS2(347)
,
10
.
9
-
11
.
5
m
i
n
#(929
-
983)
0
1000
2000
3000
4000
Intens
.
197
226
241
270
285
+MS2(285), 24.7-25.3min #(2112-2166)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
6
x10
Intens
.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
A
B
C
D
118
137 151
168
186
197
212
230
241
255
265
274
287
303
318
333
+MS2(333), 8.2-8.8min #(703-748)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4
x10
Intens.
151
186
197
209
230
245
+MS2(245), 9.4-10.0min #(804-858)
0.0
0.5
1.0
1.5
4
x10
I
n
t
ens.
134
146
200
209
227
244
288
303
347
+
MS2(347)
,
10
.
9
-
11
.
5
m
i
n
#(929
-
983)
0
1000
2000
3000
4000
Intens
.
197
226
241
270
285
+MS2(285), 24.7-25.3min #(2112-2166)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
6
x10
Intens
.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
A
B
C
D
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
117
Figura 34. Espectros MS
2
obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z 246 (TR= 12,5 min);
B: m/z 329 (TR= 15,2 min); C: m/z 347 (TR= 17,8 min), D: m/z 303 (TR= 21,7 min) e E: m/z 299 (TR=
25,9 min) presentes em P. minimum. Os losangos azuis indicam a molécula protonada.
A extração dos íons m/z 333, 347, 245, 303 e 285 identificou diversos picos
como possíveis MAAs, haja visto a grande possibilidade de isóbaros. No entanto, a
comparação do perfil de fragmentação com os obtido anteriormente para a G.
tenuistipitata em triplo quadrupolo e FT-ICR e alguns descritos na literatura
124
136
146
168
182
200
210
228
+MS2(246), 12.2-13.0min #(1043-1115)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
Intens.
95
138
159
182
197
220
235
270
283
296
314
329
+
MS2(329)
,
15
.
2
m
i
n
#1305
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4
x10
Intens
.
152
193
208
229
244
257
269
288
296
317
332
347
+MS2(347), 17.8min #1514
0
2
4
6
8
5
x10
Intens
.
229
244
257
270
288
303
+MS2(303), 21.5-22.2min #(1832-1895)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5
x10
I
n
t
ens.
211
225
255
263
284
299
+MS2(299), 25.8-26.5min #(2203-2266)
0
2
4
6
6
x10
Intens
.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
A
B
C
D
E
124
136
146
168
182
200
210
228
+MS2(246), 12.2-13.0min #(1043-1115)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
Intens.
95
138
159
182
197
220
235
270
283
296
314
329
+
MS2(329)
,
15
.
2
m
i
n
#1305
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4
x10
Intens
.
152
193
208
229
244
257
269
288
296
317
332
347
+MS2(347), 17.8min #1514
0
2
4
6
8
5
x10
Intens
.
229
244
257
270
288
303
+MS2(303), 21.5-22.2min #(1832-1895)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5
x10
I
n
t
ens.
211
225
255
263
284
299
+MS2(299), 25.8-26.5min #(2203-2266)
0
2
4
6
6
x10
Intens
.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
124
136
146
168
182
200
210
228
+MS2(246), 12.2-13.0min #(1043-1115)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
Intens.
95
138
159
182
197
220
235
270
283
296
314
329
+
MS2(329)
,
15
.
2
m
i
n
#1305
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4
x10
Intens
.
152
193
208
229
244
257
269
288
296
317
332
347
+MS2(347), 17.8min #1514
0
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4
6
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x10
Intens
.
229
244
257
270
288
303
+MS2(303), 21.5-22.2min #(1832-1895)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
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x10
I
n
t
ens.
211
225
255
263
284
299
+MS2(299), 25.8-26.5min #(2203-2266)
0
2
4
6
6
x10
Intens
.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z
A
B
C
D
E
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
118
confirmou a presença das MAAs chinorina, palitina, porphyra-334, paliteno e
usujireno. (Figura 33, Tabela 13) (Whitehead & Hedges, 2003). Um isóbaro do íon
m/z 347, bastante intenso e bem menos polar que a porphyra-334, em 17,9 min foi
detectado e provavelmente trata-se da MAA metil-éster chinorina (M-333) (Figura
34C). A identidade deste composto foi confirmada por meio de hidrólise controlada
com ácido clorídrico 0,1 M a 50
°C por 10 min que nestas condições produz
chinorina (Carreto et al., 2001). O íon com m/z 560 em 19,7 min também foi
identificado como uma provável MAA, embora a relação m/z seja alta (Tabela 13).
Carreto e colaboradores mostraram que dinoflagelados podem conter MAAs
complexas, resultantes da combinação de duas ou mais estruturas (Carreto et al.,
2001). Estes autores identificaram em dinoflagelados do gênero Alexandrium uma
estrutura que denominaram de M-320 de com m/z 560 e, embora esta molécula
ainda não tenha sido caracterizada quimicamente, sugeriram como sendo a
combinação de micosporina-glicina e chinorina menos uma molécula de água
(Carreto et al., 2001). O espectro de absorção no UV e a polaridade deste composto
são condizentes com esta proposição (Carreto et al., 2006). O íon m/z 303, isóbaro
do palitinol, identificado em 21,2 min também apresentou fragmentação
característica de uma MAA com λ
max
em 325 nm. Na literatura outras duas MAAs
apresentam este peso molecular: micosporina-2-glicina e micosporina-metilamino-
treonina (Figura 2, Tabela 3). Pela baixa polaridade relativa deste composto em
coluna de fase reversa, sugere-se que esta MAA seja a metil-amino-treonina
(Carreto et al., 2006). O íon com m/z 299 em 25,9 min possivelmente trata-se de
uma nova MAA, pois na literatura não há relatos sobre MAAs com este peso
molecular. Os perfis de fragmentação obtidos por MS
n
e os espectros de absorção
no UV sugerem que este composto possa ser uma MAA. Micosporina-glicina foi
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
119
identificada pelo comprimento de onda máximo (310 nm), pela polaridade relativa
em colunas de fase reversa e pela massa da molécula protonada m/z 246.
Experimentos de MS
n
foram conduzidos e os perfis de fragmentação estão sendo
discutidos para a proposição da estrutura química destes três últimos íons (m/z 303,
299 e 246). O perfil de fragmentação do íon m/z 329 foi comparado com o da
literatura e identificado como ácido palitênico (Whitehead & Hedges, 2003). O
mesmo extrato foi analisado pelo método publicado por Carreto e colaboradores que
confirmou a presença das MAAs identificadas por espectrometria de massas
(Carreto et al., 2006). Na Tabela 13 estão apresentadas as MAAs identificadas pelo
método D (Tabela 5) e os organismos em que elas estão presentes.
Tabela 13 - MAAs identificadas por LC-MS
2
em diferentes algas: Gt: G. tenuistipitata, Gd: G.
domingensis, Gb: G. birdiae, Pu: Porphyra umbilicalis e Pm: Prorocentrum minimum
Pico Composto TR
(min)
λ
max
(nm)
[M+H]
+
Principais
fragmentos
Organismos
1 Chinorina 8,1 332 333 186, 230, 274, 303
318
Gt, Gd, Gb, Pm, Pu
2 Palitina 9,3 319 245 186, 197, 209, 230 Gt, Gd, Gb, Pm, Pu
3 Asterina 10,6 333 289 186, 209, 230, 274 Gt, Gd, Gb
4 Porphyra-334 10,9 333 347 186, 227, 288, 303,
332
Gt, Gd, Gb, Pm, Pu
5 Micosporina-
glicina
12,1 309 246 146, 168, 182, 200,
210, 228
Pm
6 Palitinol 14,1 331 303 186, 230, 244, 288 Gt, Gd, Gb
7 Ácido
palitênico
15,0 335 329 197, 235, 270, 283,
296, 314
Pm
8 Metil-éster
chinorina
17,5 331 347 229, 244, 270, 288,
317, 332
Pm
9 M-320 19,7 318 560 210, 333, 460, 474,
492, 524, 542
Pm
10 Não
identificado
21,2 325 303 229, 244, 270, 288 Pm
11 paliteno 24,4 360* 285 270, 241, 226, 197 Pm, Gt**, Gd**, Gb**
12 usujireno 24,5 357* 285 270, 241, 226, 197 Pm, Gt**, Gd**, Gb**
13 Não
identificado
25,6 357 299 225, 255, 263, 284 Pm
*a identidade destes dois isômeros foi aferida pelo λ
max
uma vez que o perfil de fragmentação foi o mesmo.
**não foi possível identificar se apenas um dos isômeros está presente ou ambos.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
120
4.2. Isolamento de chinorina e porphyra-334
O extrato Helioguard 365
obtido segundo o item 3.4.1 (Isolamento de
chinorina e porphyra-334) foi utilizado para o isolamento das MAAs chinorina e
porphyra-334. O perfil cromatográfico e os espectros de absorção no UV das
análises por HPLC em coluna semipreparativa empregando as condições descritas
no método C (Tabela 5), estão apresentados na Figura 35.
0 5 10 15 20
0
50000
100000
150000
200000
3
2
1
Absorvância (ua)
Tempo (minutos)
240 260 280 300 320 340 360 380 400
-20000
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
332 nm
Pico 1
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
320 nm
Pico 2
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
50000
100000
150000
200000
333 nm
Pico 3
Absorvância (ua)
comprimento de onda (nm)
Figura 35. Perfil cromatográfico do extrato obtido a partir do produto Helioguard 365
e espectros no
UV. TR (min): pico 1- chinorina: 5,8; pico 2 - palitina: 6,0 e pico 3 – porphyra-334: 13,1. Detalhes das
condições experimentais ver itens 3.4.1 e 3.5 ( método C, Tabela 5).
Os resultados mostraram a presença de dois picos abundantes com λ
max
em
332 e 333 nm e um terceiro, em menor concentração, com λ
max
em 320 nm (Figura
35). Os picos isolados foram analisados por espectrometria de massas (Ion Trap) e
os perfis de fragmentação obtidos por ESI no modo positivo comparados aos obtidos
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
121
anteriormente. Os picos 1, 2 e 3 foram identificados como chinorina, palitina e
porphyra-334, respectivamente. As amostras foram também analisadas por
ionização por nanospray (nanoESI) no modo negativo segundo as condições
descritas no item 3.6 de materiais e métodos. Os espectros de MS
2
bem como os
mecanismos de fragmentação propostos para chinorina e porphyra-334 estão
apresentados na Figura 36 e Figura 37, respectivamente.
Figura 36. Espectros de MS
2
por nanospray no modo negativo em analisador Q-TOF das MAAs A)
chinorina (m/z 332) e B) Porphyra-334 (m/z 346).
331.1911
313.1943
287.2136
269.2010
257.2004
225.2054
211.1881
181.1730
193.1750
345.2250
327.2138
301.2313
283.2179
257.2146
225.2064
239.1912
181.1736
207.1926
195.1911
243.2184
A
B
331.1911
313.1943
287.2136
269.2010
257.2004
225.2054
211.1881
181.1730
193.1750
345.2250
327.2138
301.2313
283.2179
257.2146
225.2064
239.1912
181.1736
207.1926
195.1911
243.2184
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
122
As análises no modo negativo (Figura 36) mostraram que não houve
eliminação radicalar de 15 u.m.a. Considerando que esta quebra não é dependente
do sítio de protonação no modo positivo, outra força deve direcionar este tipo de
fragmentação no modo negativo. Os resultados sugerem que o grupo carboxílico
deve perder o próton resultando num aumento da densidade eletrônica que,
entretanto é estabilizada por ressonância. As fragmentações em ambas as
moléculas iniciam com uma perda neutra de CO
2
seguida de eliminações de H
2
O ou
CO
2
ou de uma perda neutra de H
2
O seguida de CO
2
, respectivamente (Figura 37).
Após as eliminações neutras de H
2
O e CO
2
das cadeias laterais, as cargas
negativas nos íons resultantes devem estar localizadas nas posições mais ácidas
das moléculas. Tendo em vista esta observação, espera-se que as cargas negativas
estejam situadas nos grupos alcoxi sendo que estas duas possibilidades de
localização devem gerar íon produtos diferentes: (i) os íons m/z 225 e 243 (quando
R=H) e m/z 239 e 257 (quando R=CH
3
) podem perder metanol e gerar m/z 193 e
211 (quando R=H), e m/z 207 e 225 (quando R=CH
3
), respectivamente e (ii) m/z 181
para ambas as estruturas se a carga estiver localizada no oxigênio vizinho (Figura
37).
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
123
N
NH
HO
HO
OCH
3
C
O
O
H
HO
O
O
H
N
NH
HO
HO
OCH
3
R
C
HO
O
O
H
- CO
2
- H
2
O
N
NH
HO
HO
OCH
3
R
C
O
O
H
O
O
N
NH
HO
HO
OCH
3
C
O
O
- H
2
O
- CO
2
N
NH
O
O
OCH
3
R
C
HO
O
O
H
N
NH
O
HO
OCH
3
- CO
2
N
NH
O
O
OCH
3
C
O
O
H
- CO
2
N
NH
O
HO
OCH
3
- H
2
O
OH
R
H
H H
N
NH
O
OCH
3
R
HO
H
N
NH
O
OCH
3
- CH
3
OH
ou
H
N
NH
HO
OCH
3
C
O
O
H
HO
O
O
H
- CO
2
N
NH
HO
OCH
3
C
HO
O
O
H
N
NH
O
OCH
3
C
HO
O
OH
R
N
NH
O
OCH
3
H
C
HO
O
OH
m/z 181
R
R= H
m/z 331
R= CH
3
m/z 345
R
R R
H H
R
R
- H
2
O
R
CH
3
-
R= H
m/z 313
R= CH
3
m/z 327
R= H
m/z 313
R= CH
3
m/z 327
R= H
m/z 287
R= CH
3
m/z 301
R= H
m/z 287
R= CH
3
m/z 301
R= H
m/z 269
R= CH
3
m/z 283
R= H
m/z 269
R= CH
3
m/z 283
R= H
m/z 243
R= CH
3
m/z 257
R= H
m/z 225
R= CH
3
m/z 239
R= H
m/z 269
R= CH
3
m/z 283
R= H
m/z 269
R= CH
3
m/z 283
R= H
m/z 211
R= CH
3
m/z 225
R= H
m/z 193
R= CH
3
m/z 207
R= H
m/z 88
R= CH
3
m/z 102
Figura 37. Mecanismo de fragmentação proposto para a MAAs di-ácidas chinorina (m/z 332) e
porphyra-334 (m/z 346).
A técnica de RMN de hidrogênio (RMN de
1
H) foi utilizada como ferramenta
complementar na identificação das MAAs isoladas. O solvente utilizado nas análises
foi água deuterada e, portanto grupamentos -NH, -OH, e -COOH não são verificados
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
124
devido à troca rápida com deutério. Analisando o espectro de RMN de
1
H foi
possível identificar alguns sinais abundantes característicos de grupamentos
presentes em chinorina e porphyra-334 (Figura 38). Os dados obtidos foram
similares àqueles encontrados na literatura (Klisch et al., 2007). Os deslocamentos
químicos possíveis de serem identificados dentro dos espectros estão descritos
abaixo onde s=singleto e d=dubleto e J=constante de acoplamento: RMN de
1
H
(500
MHz; δ em ppm, D
2
O): δ 3,71 (s, Me(11)); 3,59 (s, H-C(12)) e para a porphyra-334
(R=CH
3
, Figura 38), 1,27 (d, J= 6,4 hz; Me(1)).
N
NH
HO
HO
CO
2
H
O
OH
R
CO
2
H
R=H chinorina
R=CH
3
porphyra-334
7
1
2
3
4
5
6
8
9
10
11
12
13
14
Figura 38. Estruturas analisadas por RMN
1
H. R=H, chinorina e R=CH
3
, porphyra-334.
As amostras estavam muito diluídas e a presença de impurezas podem ter
mascarado alguns sinais, sendo possível identificar apenas os grupos metilas e
metilenos nos espectros. Estas análises por si só não são conclusivas, porém como
técnica confirmatória complementar forneceu informações adicionais sobre possíves
grupamentos característicos presentes em ambas as estruturas.
A curva de calibração foi realizada para estes dois padrões utilizando medidas
em espectrofotômetro baseadas nos coeficientes de extinção molar de cada um
deles (Tabela 3). Após injeção em HPLC das soluções padrões as áreas foram
integradas e os resultados apresentados em função da área versus concentração
(µmol.L
-1
).
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
125
4.3. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata
Os resultados mostraram que o conteúdo total de MAAs foram maiores
durante a fase claro, apresentando seus máximos entre a 9
a
e a 12ª hora de luz, e
foram menores durante o período de escuro, com mínimos entre a 3ª e a 6ª hora de
escuro (Figura 39).
Figura 39. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata. Os retângulos superiores em
branco e preto indicam os períodos de claro e escuro, respectivamente. Os experimentos foram feitos
em triplicatas e as barras indicam os desvios padrões. Os asteriscos indicam diferenças signficativas
entre as últimas horas de claro e as primeiras de escuro (ANOVA p<0,01).
Já foram mostradas na literatura variações circadianas de MAAs em alguns
organismos aquáticos (Sinha et al., 2001, Taira et al., 2004, Yakovlev & Hidaka,
2004). Sinha e colaboradores observaram que cianobactérias cultivadas sob
condições naturais (PAR+UV) apresentaram um ritmo circadiano nos conteúdos de
MAAs com indução normalmente nos períodos claros (Sinha et al., 2001).
Experimentos in loco conduzidos com diferentes espécies de corais mostraram que
os níveis de MAAs estavam correlacionados com ciclo diurno da radiação solar tanto
no inverno como no verão, sendo os máximos conteúdos encontrados ao meio-dia
(Yakovlev &. Hidaka, 2004). Shick e colaboradores mostraram que concentrações
0 6 12 18 24 30 36 42 48
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
MAAs totais
(Área
330
.mg PF alga
-1
)
Tempo (horas)
*
*
*
*
0 6 12 18 24 30 36 42 48
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
MAAs totais
(Área
330
.mg PF alga
-1
)
Tempo (horas)
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
126
altas de MAAs presentes em invertebrados marinhos estavam associados a baixos
níveis de estresse oxidativo, sugerindo portanto que a presença em maior
quantidade destes compostos no período de maior irradiação solar (meio-dia) nos
tecidos dos corais podem proteger o aparato fotossintético contra danos causados
por UVR do organismo simbionte (Shick et al., 2000). Em espécies da alga
Scrippsiella sweeneyae, o perfil de variação diária das MAAs foi semelhante ao
obtido em G. tenuistipitata. Os conteúdos de MAAs começam a aumentar nas
primeiras horas de luz, atingindo seus máximos no meio do período de claro com
conseqüente diminuição (Yakovlev &. Hidaka, 2004).
Embora as condições experimentais sejam controladas e a irradiação emitida
seja majoritariamente PAR e constante, os conteúdos de MAAs foram
aproximadamente 1,5 vezes maiores nos períodos de claro quando comparados aos
períodos de escuro (Figura 39). Na macroalga Porphyra umbilicalis foi observado um
aumento nas concentrações de MAAs quando esta alga foi exposta tanto a radiação
solar como somente a radiações PAR (Groniger et al., 1999). O mesmo pode ser
observado em dinoflagelados expostos a altas radiações PAR (Callone et al., 2006,
Carreto et al., 2001). Estes resultados estão condizentes com a idéia de que a
síntese de MAAs é estimulada por exposição à luz, uma vez que estes compostos
são considerados fotoprotetores. Experimentos de variação diária em condição
padrão de cultivo são muito relevantes quando se trata do estudo de metabólitos
secundários que podem ser influenciados por condições externas. Com estes
resultados ficou estabelecido que as coletas para obtenção de biomassa para as
extrações seriam realizadas sempre na 6ª hora de luz.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
127
4.4. Ensaios in vitro
4.4.1. Estimativa da concentração total das MAAs de G. domingensis
Nos testes de atividade antioxidante, de estabilidade, citotoxicidade,
fototoxicidade e de fator de proteção solar (FPS) foi selecionado o extrato GD-1, pois
o extrato da macroalga G. birdiae apresentou composição qualitativa e quantitativa
muito similar ao extrato de G. domingensis.
Para obtenção de uma estimativa em massa das MAAs totais presentes em
GD-1 e GD-2 preparados segundo o item 3.4.2, utilizamos a matéria-prima
Helioguard 365
como referência de massa. Na Figura 40 o perfil de absorção no
UV obtido para estas amostras é apresentado.
Figura 40. Perfil de absorção no UV das amostras GD-1, GD-2 e Helioguard 365
.
Os comprimentos de onda máximos de absorção na região entre 310 e 360
nm foram muitos próximos. As leituras dos valores de absorvância foram obtidas em
330 nm e em sextuplicata para cada amostra. Os valores encontrados foram: GD-1
(0,251
± 0,014), GD-2 (0,265 ± 0,017) e Helioguard 365
(0,604 ± 0,030). A
concentração de MAAs totais estimadas para GD-1 foi de (0,0208
± 0,0014) mg.mg
extrato
-1
e GD-2 (0,0225 ± 0,0019) mg.mg extrato
-1
. Os valores estimados indicam
que não houve alteração do extrato quando este foi seco em Spray Dryer (GD-1) em
200 250 300 350 400 450
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Absorvância (UA)
Com
p
rimento de onda
(
nm
)
Helioguard 365 (0,005 mg.mL
-1
)
Extrato GD-1 (0,1 mg.mL
-1
)
Extrato GD-2 (0,1 mg.mL
-1
)
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
128
comparação ao concentrado em Speed Vac
®
(GD-2). Embora a secagem do extrato
de G. domingensis em Spray Dryer (GD-1) tenha oferecido à vantagem de ser mais
rápida que a em Speed Vac
®
e não tenha degradado as MAAs, o rendimento obtido
neste processo foi cerca de 4,5 vezes menor do obtido anteriormente para G.
tenuistipitata (GT-1) e G. domingensis (GD-2). Durante o processo de secagem em
Spray Dry, uma parte do extrato foi carregada para as bombas de vácuo. Isto
poderia ser evitado adicionando ao extrato algum composto inerte (e.g., amido) que
deixaria o material mais denso evitando perdas.
Os dados estimados sugerem que o extrato de G. domingensis (GD-1 ou GD-
2) tem aproximadamente 2,2% em massa de MAAs totais enquanto que os dados
calculados por HPLC, cerca de 2,9%. A quantificação por HPLC é muito mais
confiável uma vez que as concentrações de cada MAA são calculadas utilizando
curvas de calibração feitas com padrões autênticos.
Comparando os dados de massa do extrato GD-1 com os do extrato de G.
tenuistipitata (GT-1) foi possível observar que apesar do rendimento do extrato GD-1
ter sido muito menor, o primeiro é muito mais rico em MAAs que o segundo. O
extrato GD-1 contêm aproximadamente 0,1 mg.g PF alga
-1
e o extrato GT-1 cerca de
0,003 mg.PF alga
-1
, ou seja, cerca de 37 vezes a menos conteúdos totais de MAAs
do que GD-1. G. domingensis, comparada a G. tenuistipitata, foi coletada em regiões
de altas irradiações naturais e provavelmente por isso altos conteúdos de MAAs
foram encontrados.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
129
4.4.2. Testes antioxidantes
O ensaio utilizando-se de DPPH é bastante empregado para estudos
preliminares de atividade antioxidante de uma amostra, sendo muito utilizado para
varredura de diversos extratos.
Para verificar a capacidade antioxidante frente ao ensaio com DPPH foram
testados os extratos provenientes das algas G. tenuistipitata (GT-1), G. domingensis
(GD-1) e a matéria-prima Helioguard 365
®
. Os resultados, obtidos em porcentagem
de inibição estão mostrados na Figura 41A. O mesmo experimento foi realizado com
padrões de rutina e da mistura de quercetina e isoquercetrina, que são flavonóides
com atividade antioxidante reconhecida (Figura 41B).
Figura 41. Dados de porcentagem de inibição da formação do radical DPPH A) pelos extratos
contendo MAAs de G. tenuistipitata, G.domingensis e Helioguard 365
®
e B) pelos flavonóides rutina e
a mistura quercetina e isoquercetrina.
Assim como verificado em análises prévias de inibição da lipoperoxidação
(dados não apresentados), neste ensaio também foi obtida uma baixa atividade
antioxidante dos extratos testados. Apesar da atividade inibitória da formação do
radical DPPH exibida pelos extratos contendo MAAs ter sido baixa, pode-se
observar que o produto Helioguard 365
®
mostrou uma atividade antioxidante maior
0 500 1000 1500 2000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Helioguard 365
®
Extrato GD-1
Extrato GT-1
Concentração (µg mL
-1
)
% de Inibição
0 1020304050
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de Inibição
Concentração (µg.mL
-1
)
Rutina
Quercetina e Isoquercetrina
A
B
0 500 1000 1500 2000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Helioguard 365
®
Extrato GD-1
Extrato GT-1
Concentração (µg mL
-1
)
% de Inibição
0 1020304050
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de Inibição
Concentração (µg.mL
-1
)
Rutina
Quercetina e Isoquercetrina
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
130
em relação aos extratos. Provavelmente outros componentes presentes na
formulação possam ter contribuído para este aumento na inibição da formação de
DPPH, uma vez que a concentração final de MAAs desta solução foi estimada para
ser igual à concentração de MAAs presentes nos extratos. Por outro lado, as
análises dos flavonóides (biossintetizados por plantas exercendo função
fotoprotetora nesses organismos) mostraram uma atividade antioxidante muito alta,
sendo necessário inclusive diminuir a faixa de concentração de trabalho para que a
cinética da reação pudesse ser monitorada.
Normalmente é feita uma analogia entre as funções das MAAs presentes em
organismos aquáticos com as funções dos flavonóides exercidas em plantas
superiores (Shick & Dunlap, 2002; Bandaranayake, 1998). Apesar de ambos serem
biossintetizados para a fotoproteção dos organismos que os produzem, a alta
atividade antioxidante que é geralmente encontrada para os flavonóides e extratos
ricos nessa classe de compostos, aparentemente não é a propriedade marcante nas
MAAs. Com exceção das oximicosporinas, micosporina-glicina e micosporina-
taurina, que apresentam um papel antioxidante, as iminomicosporinas muito comum
em algas provavelmente mantêm o papel primordial de fotoprotetora da UVR
(Dunlap & Yamamoto, 1995; Suh et al., 2003).
4.4.3. Testes de estabilidade
O uso de diferentes solventes e pHs nas formulações cosméticas podem
influenciar profundamente a efetividade dos filtros químicos. As mudanças no
espectro de absorção no UV dependerão do grau de estabilidade da molécula no
seu estado fundamental ou excitado. A escolha correta do solvente e do pH pode
levar a um aumento da absorção no UV trazendo assim mais benefícios para a
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
131
aplicação do mesmo. Sendo assim, foram realizados alguns testes em relação a
diferentes pHs e temperaturas para verificar o perfil do espectro de absorção no UV
e a estabilidade destes extratos frente a estes parâmetros.
Parâmetro: pH
O perfil do espectro de absorção no UV do extrato GD-1 em pH entre 4 e 12
(temperatura ambiente) praticamente não apresentaram diferenças (Figura 42). Com
a acidificação (pHs 1-3) observa-se tanto uma diminuição da intensidade como um
deslocamento hipsocrômico do máximo de absorção de 327 para 325 nm em pH=3 e
para 324 nm em pHs= 1 e 2.
Figura 42. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1 de G.domingensis em soluções de
diferentes pHs a temperatura ambiente.
Em soluções extremamente ácidas (pH < 3), a protonação do par de elétrons
dos átomos de nitrogênio presentes nas MAAs impedirá qualquer deslocamento de
elétrons, elevando portanto a quantidade de energia necessária para ocorrer a
transição eletrônica no UV. Isto causa um deslocamento hipsocrômico
(comprimentos de ondas menores, portanto mais energéticos) que também afetam a
200 250 300 350 400 450
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Absorbância (UA)
comprimento de onda (nm)
pH 10,0
pH 6,0
pH 3,0
pH 2,0
pH 1,0
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
132
absorção e o coeficiente de extinção molar. De fato, houve uma ligeira diminuição na
absorvância em pHs 1-3, pela diminuição do grau do deslocamento dos elétrons. No
entanto estas mudanças são reversíveis, uma vez que esta protonação pode ser
reversível. Em condições básicas não houve uma variação no
λ
máx
. Estes dados
estão de acordo com os resultados mostrados por Zhang e colaboradores com
soluções contendo porphyra-334 (Zhang et al., 2005). Este trabalho também
mostrou que a absorvância de soluções de porphyra-334 depende do tempo de
estocagem. Em pHs extremamente básicos (12 e 13), a absorvância caiu
drasticamente nas primeiras 4 h e totalmente no final de 8 h, mesmo à temperatura
ambiente (Zhang et al., 2005). Em pHs menos básicos e ácidos a absorvância
destas soluções se mostrou estável mesmo após 80 dias à temperatura ambiente.
Isto mostra a grande estabilidade e portanto o grande potencial de aplicação destes
compostos.
Parâmetro: Temperatura
A temperatura teve uma grande influência na estabilidade do extrato de
G.bdomingensis (Figura 43). À temperatura ambiente (20°C) a solução foi estável
durante o período de monitoramento (Figura 43 e Figura 44A). Com o aumento da
temperatura, houve um decréscimo na absorvância após 1 h de incubação,
especialmente a 70 e 90°C (Figura 43). Dados na literatura mostraram que as
propriedades de absorção no UV de soluções de porphyra-334 e chinorina não são
alteradas a temperaturas de 75°C, mesmo em períodos maiores que 6 h (Sinha et
al., 2000). Em outro trabalho, testes efetuados com porphyra-334 mostraram que a
absorvância a temperaturas de 60°C decai vagarosamente ao longo do tempo
(Zhang et al., 2005). O extrato de G. domingensis contém além de porphyra-334 e
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
133
chinorina, outras MAAs que podem não ser estáveis a altas temperaturas. Já foi
mostrado que o rendimento na extração de algumas MAAs são maiores quando a
extração é feita a altas temperaturas (item 4.1.1.1). No entanto, optou-se pela
extração a frio, pois a estabilidade de várias MAAs não foram estudadas até o
momento. Entretanto, vale ressaltar que mesmo a temperaturas de 50
°C o extrato se
mostrou estável por 3 h, decaindo vagarosamente após este período (Figura 43).
Figura 43. Monitoramento da absorção no UV em 327 nm ao longo do tempo e em diferentes
temperaturas do extrato aquoso de G. domingensis.
Além da banda das MAAs em 327 nm, observa-se outra banda com máximo
em 210 nm (Figura 44). Provavelmente esta banda é devido à presença de
polissacarídeos que são tão polares quanto as MAAs e são portanto extraídos
usando este protocolo. Sabe-se que o gênero Gracilaria produz elevada quantidade
de agarocolóides, podendo chegar a 53% do peso seco (Macchiavello et al., 1999).
A grande quantidade destes polissacarídeos dificulta a extração das MAAs e o
monitoramento do extrato espectrofotometricamente, uma vez que o surgimento de
uma banda, devido à degradação das MAAs, pode estar sendo suprimida pela
banda intensa dos polissacarídeos. Zhang e colaboradores mostraram que em meio
0123456
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância (327 nm)
Tempo (horas)
Temp. 20
o
C
Temp. 50
o
C
Temp. 70
o
C
Temp. 90
o
C
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
134
básico e de baixa acidez, soluções de porphyra-334 apresentaram o aparecimento
de um pico em 225 nm com a simultânea diminuição da banda em 334 nm (
λ
max
de
porphyra-334) (Zhang et al., 2005). Com a diminuição da absorvância foi observado
o aparecimento de um ponto isosbéstico em 292 nm que pode indicar a relação
entre a produção de um composto com máxima de absorção em 225 nm pela
decomposição de porphyra-334 (Zhang et al., 2005).
De uma outra forma, a degradação das MAAs pode levar à quebra do anel e
por conseqüência, resultar em produtos que apresentam cromóforos que absorvem
em comprimentos de onda menores que 200 nm. Nesta faixa, o monitoramento de
espectros de absorção se torna complexa pelo fato de várias transições eletrônicas
de isolados cromóforos ocorrerem nesta região (Pavia et al., 1996).
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
135
Figura 44. Espectros de absorção no UV do extrato aquoso (pH= 6,8) de G.domingensis. A: 20 °C e
B: 70 °C.
Os resultados de estabilidade quanto ao pH e à temperatura sugerem que o
extrato de G. domingensis apresenta alta estabilidade em condições diversas,
sugerindo também um potencial de aplicabilidade complementar em fotoprotetores
comerciais.
4.4.4. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade
Nos ensaios de citotoxicidade, fibroblastos do tipo 3T3 foram incubados com
o extrato GD-1 por 24 h. A toxicidade foi então determinada em função da
viabilidade celular monitorada espectrofotometricamente após a incubação das
células com o corante Neutral Red que é incorporado pelas células vivas.
Nas concentrações testadas, o extrato GD-1 de G. domingensis não
apresentou citotoxidade (Figura 45A; Tabela 14). Para comparação, utilizou-se
200 250 300 350 400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Aborbância (UA)
Tempo (horas)
0h
1h
2h
3h
4h
5h
200 250 300 350 400
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Aborbância (UA)
Comprimento de onda (nm)
0h
1h
2h
3h
4h
5h
A
B
200 250 300 350 400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Aborbância (UA)
Tempo (horas)
0h
1h
2h
3h
4h
5h
200 250 300 350 400
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Aborbância (UA)
Comprimento de onda (nm)
0h
1h
2h
3h
4h
5h
A
B
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
136
cloreto de sódio como controle negativo e dodecil sulfato de sódio como controle
positivo. Os resultados estão mostrados na Tabela 14.
Tabela 14 – Valores de citotoxicidade obtidos para o extrato GD-1, cloreto de sódio e dodecil sulfato
de sódio sendo os dois últimos para comparação.
Amostras IC
50
(mg.mL
-1
)
Extrato GD-1 Valor não determinado
Cloreto de sódio 7,740
Dodecil sulfato de sódio 0,093
O ensaio de fototoxicidade foi baseado na comparação da citotoxicidade do
extrato GD-2 na presença e ausência de uma dose não citotóxica de radiação UVA.
A fototoxicidade foi medida pela captação do mesmo corante, Neutral Red, pelas
células que sobreviveram à incubação com o extrato em presença de radiação UVA
(Borenfreund & Puerner, 1985).
O extrato GD-2 não foi considerado fototóxico (Figura 45B). Estes resultados
corroboram com o papel fotoprotetor excercido por esta classe de composto que
absorvem radiação de alta energia dissipando sem causar danos às células e
tecidos. Como são altamente estáveis a altas temperaturas e a exposição à radiação
UV, sugere-se que o extrato GD-1 pode fazer parte de formulações de protetores
solares.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
137
Figura 45. A) Citoxicidade do extrato GD-1 em função da concentração e B) Fotoxicidade.
4.4.5. Fator de proteção solar
O fator de proteção solar (FPS) foi instituído com o objetivo de fornecer um
índice para o grau de proteção à radiação UVB, de uma determinada preparação
com filtros. É calculado segundo a FDA (Food and Drugs Administration, EUA) ou
COLIPA (The European Cosmetic Toiletry and Perfumary Association) como sendo a
energia UV necessária para produzir uma dose mínima de eritema (DME) sobre uma
pele protegida, dividida pela energia UV necessária para produzir uma DME em uma
pele não protegida:
egidaDMEdesprot
daDMEprotegi
UV
UV
FPS =
Equação 7
A
B
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
138
O FPS está relacionado à formação do eritema, que é provocado por
exposição somente a radiação UVB e sendo assim, o método para o cálculo do FPS
é válido somente para proteção contra radiação UVB. Existem outros métodos que
avaliam o poder de proteção para os filtros que absorvem UVA, embora ainda não
exista um método padronizado e mundialmente aceito, como no caso do UVB.
O método in vitro para cálculo do FPS baseia-se em métodos
espectrofotométricos a partir de parâmetros de irradiação UVB e a formação de
eritema. A partir dos cálculos de transmitância das amostras, o equipamento fornece
os dados de FPS das amostras. Numa primeira etapa, este tipo de teste é realizado,
pois além de ser de baixo custo e rápido, a correlação com os valores reais de FPS
(medidos in vivo) com os valores in vitro é muito próxima.
As medidas foram feitas em triplicatas segundo o item 3.7.4. e os valores de
FPS obtidos para o extrato de GD-1, a matéria-prima Helioguard 365
e para dois
filtros sintéticos, MCX (hidrofóbico) e ASB (hidrofílico), normalmente empregados em
formulações cosméticas. Os resultados estão apresentados na Tabela 15.
Tabela 15 - Valores de FPS calculados para as diferentes amostras.
Amostras FPS calculado
Extrato GD-1
1,03 (±0,01)
Helioguard 365
1,04 (±0,03)
MCX
1,73 (±0,08)
ASB
1,28 (±0,05)
Os valores de FPS para o extrato GD-1 e a amostra Helioguard 365
não
apresentaram valores significativos quando comparado aos filtros sintéticos e como
esperado, o filtro de caráter hidrofóbico (MCX) é mais eficiente que o hidrofílico
(ASB). Os valores baixos de FPS do extrato GD-1 e da matéria-prima Helioguard
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
139
365
provavelmente deve-se ao fato que ambos continham 3% em massa de
compostos fotoprotetores nas soluções finais, ou seja, as amostras testadas
estavam 30 vezes mais diluídas que as dos filtros sintéticos. Como as
concentrações das amostras não estavam na mesma ordem de grandeza não foi
possível concluir se os valores de FPS do extrato GD-1 e do Helioguard 365
são
satisfatórios. Os dados presentes na literatura mostram que estes compostos são
muito eficientes como fotoprotetores quando incorporado em formulações
cosméticas. Schmid e colaboradores mostraram que um creme contendo 0,005% de
MAAs (mistura de porphyra-334 e chinorina) pode neutralizar os efeitos da radiação
UVA e UVB com a mesma eficiência que um creme contendo filtros sintéticos UVA
(1%) e UVB (4%) (Schmid et al., 2004). Em outro trabalho, os valores de FPS e a
capacidade de absorção no UVA foram mostrados para a MAA porphyra-334 isolada
da cianobactéria Aphanizomenon flos-aquae (Torres et al., 2006). O valor
encontrado de FPS foi igual a 4 e a proteção no UVA medida pela razão UVA/UVB
foi considerada máxima utilizando a classificação dada por Boots Chemists Ltd.
(Torres et al., 2006).
Os perfil de absorção no UV destas amostras também foi monitorado em
espectrofotômetro com caminho óptico de 1 cm. Os resultados estão mostrados na
Figura 46. Uma grande vantagem destes compostos no uso de formulações
cosméticas é a característica de absorção tanto no UVB quanto no UVA (Figura 46).
Geralmente os filtros de absorção no UVA apresentam custo mais elevado que os
filtros de absorção no UVB. Além disto, novas normas quanto ao “fator de proteção
solar” de formulações cosméticas comerciais para o UVA estão sendo padronizadas
e implementadas pelo FDA.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
140
Figura 46. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1, Helioguard 365
e dos filtros sintéticos
MCX e ASB obtidas em espectrofotômetro com monitoramento entre 200-400 nm. As soluções do
extrato GD-1 e do Helioguard 365
foram diluídas 10x, enquanto que dos filtros sintéticos MCX e ASB
1000x.
Os resultados em conjunto de citotoxicidade, fototoxicidade, estabilidade
quanto ao pH, temperatura e exposição à UVR bem como os dados preliminares de
FPS sugerem que o extrato obtido de Gracilaria domingensis é um candidato para
incorporações em fotoprotetores voltados para a proteção da pele, embora alguns
parâmetros relacionados às medidas de FPS devam ser otimizados. Ensaios de
incorporação do extrato em formulações cosméticas serão mais relevantes do que o
dado de FPS do extrato por si, uma vez que estes compostos associados a outros
filtros sintéticos podem aumentar o valor de FPS das formulações pela ação
sinergética entre os ativos, agindo como filtros complementares.
200 240 280 320 360 400 440
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Absorvância (ua)
Comprimento de onda (nm)
GD-1 (19 µg.mL
-1
de MAAs)
Helioguard 365
®
(19 µg.mL
-1
de MAAs)
MCX (6,6 µg.mL
-1
)
ASB (6,6 µg.mL
-1
)
UVB UVA
UVC
200 240 280 320 360 400 440
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Absorvância (ua)
Comprimento de onda (nm)
GD-1 (19 µg.mL
-1
de MAAs)
Helioguard 365
®
(19 µg.mL
-1
de MAAs)
MCX (6,6 µg.mL
-1
)
ASB (6,6 µg.mL
-1
)
UVB UVA
UVC
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
141
4.5. Experimentos de exposição à UVR de Prorocentrum minimum
4.5.1. Medidas de fotossíntese
Os resultados das medidas do
Φ
PSII
mostraram que as duas espécies
apresentaram inibição nas primeiras 24 h de exposição em todos os tratamentos
realizados e em ambos dinoflagelados avaliados, sendo que nas culturas expostas
às radiações PAR+UVR, os Φ
PSII
foram significativamente mais baixos quando
comparados às culturas expostas a PAR (Figura 47). O perfil de oscilação do Φ
PSII
foi semelhante entre os tratamentos e as duas linhagens de microalgas, sendo que
os maiores valores foram encontrados durante os períodos de claro e os menores
nos períodos de escuro. Nas culturas controle a inibição da fotossíntese não foi
signficativa nas primeiras 12 h, embora seja possível observar uma tendência de
queda até 24 h. Provavelmente esta diminuição no Φ
PSII
observada nas culturas
expostas às radiações PAR no primeiro dia de experimento foi uma adaptação das
mesmas a radiações mais altas, pois as condições de irradiação da manutenção do
cultivo eram diferentes das utilizadas no experimento (cerca de 5 vezes maior). Já
nas culturas expostas a PAR+UVR foi possível observar uma fotoinibição já nas
primeiras 6 h, sendo que em P. minimum (Katt) estes valores foram
signficativamente menores que em P. minimum (Liss) após 60 h (Figura 47). Sabe-
se que as radiações UVA e UVB podem diminuir a taxa fotossintética (Banaszak &
Neale, 2001; Cullen et al., 1992; Neale et al., 1998). Em diversas diatomáceas, algas
verdes e outras microalgas, o transporte de elétrons no fotossistema II foi alterado
com exposição à UVR (Nilawati et al., 1997; Ghetti et al., 1999; Schofieldm et al.,
1999). A radiação UVB, por exemplo, pode afetar o aparato fotossintético através do
bleaching dos pigmentos fotossintéticos levando assim a uma diminuição da taxa
fotossintética (Gerber & Hader, 1995).
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
142
Figura 47. Medidas do rendimento efetivo do PSII em Prorocentum minimum isolada de duas regiões
diferentes e expostas às radiações PAR e PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto
mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados
(ANOVA p< 0,01).
4.5.2. Medidas in vivo de EROs
As medidas das EROs foram realizadas como descrito no item 3.9. Os
resultados estão apresentados Figura 48.
Figura 48. Medidas de fluorescência do DCF em culturas de Prorocentum minimum (Liss) e P.
minimum (Katt) após exposição às radiações PAR e PAR+UVR durante 72 h. Os retângulos
superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa
entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01).
0 122436486072
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Rendimento efetivo do PSII
(Fm'-Ft/Fm')
Tempo de exposição (h)
0 122436486072
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Rendimento efetivo do PSII
(Fm'-Ft/Fm')
Tempo de exposição (h)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0 122436486072
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Rendimento efetivo do PSII
(Fm'-Ft/Fm')
Tempo de exposição (h)
0 122436486072
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Rendimento efetivo do PSII
(Fm'-Ft/Fm')
Tempo de exposição (h)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0 122436486072
4
8
12
16
20
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Fluorescência DCF
(UR.célula
-1
.10
-5
)
Tempo de exposição (h)
*
*
*
*
*
0 122436486072
4
8
12
16
20
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Fluorescência DCF
(UR.célula
-1
.10
-5
)
Tempo de exposição (h)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
143
Os resultados obtidos mostraram que concentrações maiores de EROs foram
encontradas durante os períodos claro em todos os tratamentos (Figura 48). A
absorção de luz por diferentes componentes celulares pode produzir indiretamente
EROs pela transferência deste excesso de energia para o oxigênio (Neale, 2005).
Além disto, o sistema de transporte de elétrons na fotossíntese em uma atmosfera
rica em O
2
é uma das principais fontes de EROs em tecidos de plantas (He & Hader,
2002). Em P. minimum (Liss), os conteúdos de EROs foram maiores nas culturas
expostas a PAR+UVR, que nas culturas controle após 36, 48 e 72 h de exposição
(Figura 48). Nas culturas de P. minimum (Katt) com exposição ao UVR, as
concentrações de EROs aumentaram após 12 h de exposição e permaneceram
constantes até 60 h, decaindo após este período. Entre as linhagens sob exposição
PAR+UVR, os conteúdos de EROs foram signficativamente maiores após 24, 48, e
60 h na espécie isolada de regiões frias.
Os resultados sugerem que o dinoflagelado isolado de Lisboa aparentemente
apresenta um sistema de reparo e/ou de prevenção mais eficiente que o
dinoflagelado de Kattegat, uma vez que sob exposição UV, os níveis de EROs foram
menores em P .minimum (Liss).
4.5.4. Análises das MAAs
As análises espectroscópicas dos extratos metanólicos preparados segundo o
item 3.4.3 mostraram um aumento de absorvância na região do UV nas amostras
expostas à radiação PAR+UVR como apresentado na Figura 49.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
144
Figura 49. Espectros de absorção no VIS-UV das espécies expostas a PAR+UVR. A) Prorocentrum
minimum isolado de Lisboa e B) P. minimum isolada de Kattegat.
As MAAs presentes nos extratos metanólicos foram separadas por HPLC
segundo o método F (Tabela 5). O perfil cromatográfico obtido está mostrado na
Figura 50.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 h
12 h
36 h
60 h
Absorbância (UA)
200 300 400 500 600 700
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 h
12 h
36 h
60 h
Absorbância (UA)
Comprimento de onda (nm)
A
B
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 h
12 h
36 h
60 h
Absorbância (UA)
200 300 400 500 600 700
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 h
12 h
36 h
60 h
Absorbância (UA)
Comprimento de onda (nm)
A
B
200 300 400 500 600 700
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0 h
12 h
36 h
60 h
Absorbância (UA)
Comprimento de onda (nm)
A
B
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
145
Figura 50. Perfil cromatográfico em λ igual a 330 nm das MAAs presentes em P. minimum após 48 h
de experimento no tratamento com PAR+UVR. TR (min): pico 1: 2,1; pico 2: 2,6; pico 3: 3,1; pico 4:
4,0; pico 5: 5,2; pico 6: 12,1; pico 7: 16,0; pico 8: 16,4.
A identificação de cada pico foi realizada com o uso de padrões previamente
isolados ou com padrões de diferentes algas, bem como pelos respectivos espectros
no UV (Figura 51). Os extratos foram também analisados por LC-MS. Os resultados
estão mostrados na Tabela 16.
Figura 51. Espectros de absorção no UV dos picos obtidos por separação em HPLC. λ
max
(nm): A)
pico 1: 332, pico 3: 310, pico 5: 337, pico 6: 333 e B) pico 2:334, pico 4: 320, pico 7: 357, pico 8: 360.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
3
AU
-0.001
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
1
2
4
5
6
7
8
A
B
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
3
AU
-0.001
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
1
2
4
5
6
7
8
A
B
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
3
AU
-0.001
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
1
2
4
5
6
7
8
A
B
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
3
AU
-0.001
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.0
0
1
2
4
5
6
7
8
A
B
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
nm
250.00 300.00 350.00 400.00
Pico 1: 332
Pico 3: 310
Pico 6: 333
Pico 5: 337
AU
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
nm
250.00 300.00 350.00 400.00
Pico 8: 360
Pico 2: 334
Pico 7: 357
Pico 4: 320
ABAB
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
nm
250.00 300.00 350.00 400.00
Pico 1: 332
Pico 3: 310
Pico 6: 333
Pico 5: 337
AU
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
nm
250.00 300.00 350.00 400.00
Pico 8: 360
Pico 2: 334
Pico 7: 357
Pico 4: 320
ABAB
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
146
Tabela 16 – MAAs identificadas em P. minimum pelos tempos de retenção em HPLC, espectros no
UV e por espectrometria de massas.
Pico Composto TR (min)
λ
máx
(nm)
[M+H]
+
e principais fragmentos
1 Chinorina 2,1 332 333, 318, 303, 274, 230, 186
2 Porphyra-334 2,6 334 347, 303, 288, 244, 227, 209, 186
3 Micosporina-glicina 3,1 310 246, 228, 210, 200, 182, `168, 152
4 Palitina 4,0 320 245, 230, 209, 186,
5 Ácido palitênico 5,2 337 329, 314, 296, 283, 261, 233, 197
6 Metil-éster chinorina 12,1 333 347, 332, 317, 296, 288, 270, 244, 229
7 Usujirene 16,0 357 285, 270, 241, 226, 197
8 Paliteno 16,4 360 285, 270, 241, 226, 197
As MAAs foram quantificadas pela curva analítica feita para a porphyra-334,
previamente isolada no laboratório do Prof. Donat Häder, utilizando as razões dos
coeficentes de extinção molar entre elas. As amostras foram expressas em
pmol.célula
-1
. Os resultados dos conteúdos totais de MAAs nas culturas de P.
minimum expostos a PAR e PAR+UVR estão apresentados na Figura 52.
Figura 52. Perfil da variação do conteúdo total das MAAs (pmol.célula
-1
) em culturas do dinoflagelado
P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h. As culturas foram expostas a
radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os
períodos de 12h claro:12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p<
0,01).
0 122436486072
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Concentração total de MAAs
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0 122436486072
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Concentração total de MAAs
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0 122436486072
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Concentração total de MAAs
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0 122436486072
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Concentração total de MAAs
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
147
A indução da síntese das MAAs pode ser observada em todos os tratamentos
ao longo do tempo, sendo significativamente mais alta em P. minimum (Liss)
exposta a PAR+UVR (Figura 52). No ínicio do experimento a MAA presente era
majoritariamente chinorina em concentrações da ordem de 1,5 .10
-4
pmol.cel
-1
em
ambas linhagens. Os maiores valores foram obtidos após 60 h de exposição em
ambas as linhagens sob PAR+UVR e foram aproximadamente 150 e 44 vezes
maiores em P. minimum (Liss) e P. minimum (Katt) respectivamente, que os
conteúdos inicialmente observados. O perfil da indução foi similar nas duas
linhagens: indução da síntese nos períodos de exposição à luz (PAR ou PAR+UVR)
e diminuição ou constância dos conteúdos nos períodos de escuro (Figura 52). A
indução e acúmulo das MAAs sob exposição PAR (~80 e 23 vezes maiores em P.
minimum (Liss) e P. minimum (Katt) respectivamente, após 60 h de experimento)
provavelmente deve-se ao fato de que as condições de irradiação utilizada no
experimento foram cerca de 5 vezes maiores quando comparadas às irradiações
empregadas na manutenção do cultivo. Entre as microalgas, os dinoflagelados são
as espécies que apresentam maior capacidade de síntese de MAAs, mesmo sob
exposição PAR somente (Carreto et al., 2001). Carreto e colaboradores mostraram
que culturas de diferentes dinoflagelados apresentam alta capacidade de acúmulo
de MAAs. Estes organismos normalmente são encontrados em florações na
superfície dos oceanos, estando sujeitos a altas irradiações (Carreto et al., 2001).
Em outro trabalho foi mostrado que dinoflagelados da espécie Alexandrium
excavatum transferidos de uma condição de baixa intensidade de PAR para uma de
alta, aumentaram seus conteúdos de MAAs em questão de horas (Carreto et al.,
1990). Já é bem descrito na literatura que altas radiações de PAR, UVA e UVB
induzem a síntese e acúmulo destes compostos em dinoflagelados (Carreto et al.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
148
1990, Lesser, 1996a, 1996b; Hannach & Sigleo 1998; Neale et al., 1998, Klisch &
Häder, 2000). Os maiores valores nos conteúdos e a maior rapidez na indução das
MAAs encontrados na espécie isolada em Lisboa está de acordo com o fato desta
espécie ser proveniente de regiões mais quentes, estando portanto mais adaptada a
condições ambientais de alta irradiação quando comparadas as espécies isoladas
de regiões com menores intensidades naturais de luz. Na literatura, alguns trabalhos
relatam que a síntese destes compostos pode reduzir diversos danos que poderiam
ser causados pela exposição à UVR, como inibição da fotossíntese, crescimento e
motilidade em algas (Neale et al., 1998; Karsten et al., 1999; Klisch et al., 2001). Os
resultados obtidos indicam que as culturas de P. minimum (Liss), adaptadas a
regiões de altas irradiações, apresentaram menores danos ao PSII e menores
concentrações de EROs após 48 h de exposição. As EROs podem ter sido
suprimidas pela indução da MAA micosporina-glicina reconhecida como um forte
antioxidante (Dunlap & Yamamoto, 1995), embora a síntese de outros antioxidantes
como os carotenóides diadinoxantina, diatoxantina e
β-caroteno possam estar
envolvidos, pois a indução dos mesmos ocorre na presença de alta PAR e UVR
(Smith et al., 1992). Embora os valores do
Φ
PSII
em P. minimum (Liss) sob exposição
ao UV não tenham atingido níveis controle (tempo de exposição igual 0 h), foi
possível observar após 60 h de experimento uma adaptação desta espécie, refletido
em um aumento do
Φ
PSII
que alcançaram valores próximos aos obtidos para as
culturas de P. minimum (Katt) exposta a PAR somente. Em culturas do dinoflagelado
Gymnodinium sanguineum altos conteúdos de MAAs diminuiram os efeitos da
inibição da fotossíntese pela exposição ao UVR (Neale et al, 1998). Estes
experimentos conjuntamente com os que demonstraram que altos conteúdos de
MAAs também protegem a motilidade de dinoflagelados, apresentaram pela primeira
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
149
vez evidências concretas do papel fotoprotetor das MAAs em espécies do
fitoplâncton (Neale et al, 1998; Klisch et al., 2001). Por outro lado, espécies do
dinoflagelado Prorocentrum minimum pré-adaptadas a altas irradiações
suplementadas com UVR, apesar de induzirem a síntese das MAAs, não impediram
a inibição da fotossíntese (Lesser, 1996a, 1996b). Alguns modelos ópticos indicam
que as MAAs não devem oferecer uma fotoproteção eficiente comparado ao
pequeno caminho óptico característico das células presentes no fitoplâncton (Garcia-
Pichel, 1994). Algumas medidas relacionadas ao “fator de proteção” oferecido pelas
MAAs mostraram uma pequena atenuação espectral (~10%) (Lesser, 1996a,
1996b). Recentemente Laurion e colaboradores mostraram que as MAAs podem
proteger células do fitoplâncton contra os efeitos adversos da UVR dependendo da
concentração, tipo e distribuição intracelular (Laurion et al., 2004). Os autores
sugeriram que o alto grau de empacotamento das MAAs concentradas ao redor de
organelas sensíveis a UVR devem aumentar a eficiência na proteção de células alvo
específicas (Laurion et al., 2004).
Os conteúdos individuais de cada MAA presente nas culturas de P. minimum
estão apresentadas na Figura 53. Para possibilitar a comparação, as escalas de
concentração foram as mesmas para as MAAs identificadas em P. minimum. As
concentrações das MAAs paliteno e usujireno foram mostradas como soma das
duas, uma vez que o perfil individual de cada uma delas foi semelhante.
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
150
Figura 53. Concentração das diferentes MAAs (pmol.célula
-1
) em culturas do dinoflagelado P.
minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h. As culturas foram expostas a
radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os
períodos de 12h claro: 12h escuro.
Como é possível observar para P. minimum (Liss) sob PAR+UVR, as
principais MAAs que contribuíram para o total foram chinorina e metil-éster chinorina
(Figura 53). As MAAs ácido palitênico e palitina apresentaram o mesmo perfil de
oscilação, com máximos nos períodos de claro e mínimos nos períodos de escuro
(Figura 53). No entanto o acúmulo entre estas duas MAAs foi diferente: para ácido
palitênico não houve um acúmulo líquido de MAAs enquanto que para a palitina
houve um acúmulo após 36 e 60 h. O mesmo ocorreu para as MAAs paliteno e
usujireno que tiveram seus níveis aumentados após 24 h de exposição (Figura 53).
Micosporina-glicina teve seus níveis aumentados nas primeiras 12 h e permanceu
constante durante o experimento e porphyra-334 não contribuiu no total das MAAs.
0
12
24
36
48
60
2
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Ácido Palitênico
(pmol.célula
-1
)
0 122436486072
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Paliteno+Usujireno
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Chinorina
(pmol.célula
-1
)
0 122436486072
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Metil-éster chinorina
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0 122436486072
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Palitina
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0
12
24
36
48
60
72
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Micosporina-glicina
(pmol.célula
-1
)
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Porphyra-334
(pmol.célula
-1
)
0
12
24
36
48
60
2
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Ácido Palitênico
(pmol.célula
-1
)
0 122436486072
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Paliteno+Usujireno
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Chinorina
(pmol.célula
-1
)
0 122436486072
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Metil-éster chinorina
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0 122436486072
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Palitina
(pmol.célula
-1
)
Tempo de exposição (h)
0
12
24
36
48
60
72
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Micosporina-glicina
(pmol.célula
-1
)
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
P.minimum (Liss) / PAR
P.minimum (Liss) / PAR+UVR
P.minimum (Katt) / PAR
P.minimum (Katt) / PAR+UVR
Porphyra-334
(pmol.célula
-1
)
4. Resultados e Discussão
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
151
Na literatura foi sugerido a classificação das MAAs em primárias
(micosporina-glicina, chinorina e porphyra-334) e secundárias, que seriam derivadas
destas (Shick, 2004). Recentemente, Callone e colaboradores propuseram
interconversões entre diferentes MAAs presentes em dinoflagelados e os resultados
indicaram que micosporina-glicina deve ser precursora de chinorina e porphyra-334
(Callone et al., 2006). Estes autores sugeriram também que chinorina provavelmente
é precursora da metil-éster chinorina. Nossos resultados estariam de acordo com
esta hipótese uma vez que inicialmente os níveis de metil-éster chinorina foram
baixos e aumentaram após indução e acúmulo da MAA chinorina (Figura 53).
Porphyra-334 não foi acumulada provavelmente pela conversão nas MAAs ácido
palitênico e palitina. Como não houve um acúmulo líquido de ácido palitênico, este
pode ter sido convertido nas MAAs paliteno e usujireno. Esta estratégia de
bioconversão é muito interessante para a proteção fisiológica e celular da microalga,
pois a presença de outras MAAs com diferentes
λ
max
pode aumentar a faixa de
absorção no UV. Um exemplo disto é a indução da MAA paliteno e usujireno que
absorvem em
λ mais longos no UV (λ
max
= 357 e 360 nm para usujireno e paliteno,
respectivamente).
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
5. Considerações Finais
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
153
9 Os resultados mostraram que diferentes protocolos de extração influenciam
na concentração final das MAAs em diferentes algas. Para G. tenuistipitata,
MeOH:H
2
O (1:1, v,v) a 45
o
C foi o mais eficiente. Além disso, concluímos que os
níveis de MAAs podem diminuir quando os extratos são preparados com
concentrações crescentes de metanol ou a baixas temperaturas nas macroalgas
testadas. Entretanto, mesmo que as extrações a baixas temperaturas não tenham
sido as mais eficientes e algumas MAAs como porphyra-334 e chinorina sejam
estáveis a 45°C (Conde et al., 2000, Sinha et al., 2000), optou-se em utilizar o
protocolo com MeOH:H
2
O (1:1, v,v) a 4
o
C, uma vez que estas condições mais
brandas de extração poderiam evitar qualquer possíveis degradações de outras
MAAs. Além disto, o período de coleta também influencia no conteúdo de MAAs
nesta macroalga. Medidas da variação diária do conteúdo de MAAs em G.
tenuistipitata mostraram que a concentração total das MAAs foram maiores durante
a fase claro apresentado seus máximos entre a 9
a
e 12
a
hora de luz e mínimos entre
a 3
a
e 6
a
hora de escuro, provavelmente variando seus conteúdos de acordo com a
irradiação sobre as quais estão sujeitas (Figura 39). Com estes dados ficou
estabelecido que as culturas seriam coletadas sempre na 6
a
hora de luz.
9 Para o isolamento das MAAs em coluna semipreparativa foi empregado
gradiente binário composto de soluções de TFA 0,2% e metanol em coluna C18. O
TFA possui a vantagem de ser mais volátil que o comumente utilizado ácido acético
e o emprego de um gradiente binário com metanol proporcionou a extração de
MAAs mais apolares que não foram eluídas utilizando sistemas isocráticos com
ácido acético. Com o emprego deste método por HPLC semipreparativo foi possível
o isolamento de duas MAAs, chinorina e porphyra-334, que foram caracterizadas por
espectrometria de massas e RMN de
1
H. Foram ainda testados gradientes contendo
5. Considerações Finais
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
154
soluções de ácido fórmico ao invés de TFA uma vez que o emprego de soluções de
TFA em análise por espectrometria de massas (principalmente em analisador do tipo
Ion trap) não é indicado, pois não possibilita o uso da ionização em modo negativo
por suprimir o sinal. O método de separação otimizado com ácido fórmico (0,2%) e
metanol como fase móvel e duas colunas acopladas como fase estacionária
apresentou boa resolução para as 6 MAAs presentes em G. tenuistipitata (método E,
Tabela 5).
9 A espectrometria de massas foi uma ferramenta muito importante na análise
destes compostos neste trabalho. Esta técnica de análises é vantajosa em diversos
aspectos, sendo que um deles é a possibilidade de estudos de uma fração mesmo
esta não estando pura. Os experimentos de marcação com deutério em triplo
quadrupolo, embora não sejam sítio específico e, portanto não permitam atribuições
sempre corretas, forneceram diversos dados para a proposição de mecanismos de
fragmentação destes compostos. Marcações em sítios-específicos com
13
C,
15
N ou
18
O
poderiam ser mais conclusivas, entretanto esta estratégia não é tão simples
tornando-se inviável para produtos naturais como as MAAs. Mesmo que a estratégia
de marcação com deutério apresente certas limitações, as análises por ESI-MS
2
forneceram informações importantes a respeito dos principais grupos contidos nas
estruturas básica das MAAs. A detecção dos íons produtos [M+H-15]
+
e [M+H-59]
+
relacionadas à eliminação do radical metil e subseqüente eliminação de CO
2
foi
observada para todas as MAAs estudadas. O monitoramento destes fragmentos
usando ferramentas disponíveis no espectrômetro de massas (e.g., monitoramento
de perda neutra, monitoramento de reações múltiplas -MRM) podem facilitar a
identificação de novas MAAs em extratos de diversos organismos aquáticos. Através
desta técnica foi possível identicar seis MAAs (chinorina, palitina, asterina, porphyra-
5. Considerações Finais
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
155
334, palitinol, paliteno e/ou usujireno) na macroalga G. tenuistipitata. Devido à
simplicidade e praticidade desta técnica de marcação com deutério, ela
provavelmente será muito útil na identificação e caracterização de novas MAAs em
diferentes organismos aquáticos, principalmente pelo fato que na maioria das vezes
estes compostos encontram-se em baixas concentrações nestes organismos. O
emprego desta estratégia possibilitou a caracterização estrutural de uma nova MAA
isolada de corais identificada como palitina-treonina. As análises por espectrometria
de massas por alta resolução em analisador FT-ICR confirmaram e expandiram os
mecanismos de fragmentação propostos anteriormente e comprovaram a hipótese
da perda inicial de 15 u.m.a. envolver grupo metil ligado ao C2 no anel das MAAs
(Figura 2). Embora esta quebra radicalar observada experimentalmente por
espectrometria de massas não seja usual devido à baixa ionização utilizada no
processo de ESI, concluiu-se através de cálculos teóricos realizados pelo grupo do
Prof. Dr. Sérgio E. Galembeck, que esta quebra é possível e está ligada ao tamanho
da ligação O-C do C2. As análises de baixa resolução em analisador Ion trap das
macroalgas Gracilaria domingensis e G. birdiae mostraram que estas macroalgas
apresentam três MAAs majoritárias (chinorina, palitina e porphyra-334). A
quantificação das MAAs presentes nestas amostras mostrou que o extrato obtido da
macroalga G. domingensis isolada do litoral nordeste brasileiro, embora tenha
apresentado baixo rendimento, foi cerca de 37 vezes mais concentrado que o de G.
tenuistipitata. Já as análises por Ion trap do extrato obtido do dinoflagelado
Prorocentrum minimum mostraram uma mistura complexa de MAAs. Foi possível
identificar 11 MAAs, sendo que 1 delas possivelmente é uma nova MAA.
9 Os testes antioxidantes in vitro utilizando ensaios com DPPH de alguns
extratos mostraram que estes compostos não apresentaram atividade antioxidante.
5. Considerações Finais
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
156
Já foi demonstrado na literatura que as iminomicosporinas comumente presentes em
algas não possuem atividade antioxidante, provavelmente mantendo o principal
papel de fotoprotetora contra UVR. Já os testes in vitro de estabilidade quanto ao pH
e temperatura, citotoxicidade, fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar
realizados com o extrato de G. domingensis mostraram que este extrato pode ser
promissor no uso em formulações direcionadas para a fotoproteção.
9 Os estudos relacionados à exposição às UVR de dois dinoflagelados isolados
de regiões diferentes mostraram que houve indução das MAAs nas duas linhagens
em todos os tratamentos realizados no período de 72 h. A indução foi mais rápida e
pronunciada na linhagem proveniente de Lisboa, em Portugal do que na linhagem
proveniente de Kattegat, na Dinamarca. Estes dados estão de acordo com as
características do local de origem das linhagens uma vez que os dinoflagelados
originários de Portugal estavam sujeitos a maiores irradiações quando comparados
às linhagens originarias de regiões mais frias como Kattegat. Os resultados do
rendimento efetivo do PSII indicam que a síntese e acúmulo de MAAs em P.
minimum de Portugal ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético
desta microalga quando comparada aos indivíduos da mesma espécie, isoladas de
regiões com menores irradiações. Os dados de espécies reativas de oxigênio
apresentaram um mesmo perfil para ambas as espécies. Observou-se um aumento
das EROs durante o período de claro, e mais pronunciado nas culturas expostas ao
UVR e nas linhagens isoladas de Kattegat. Os altos níveis de MAAs presentes em P.
minimum (Liss), dentre as quais estava presente a MAA micosporina-glicina, pode
ter auxiliado na supressão destas espécies reativas.
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Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
168
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 – Súmula curricular
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
ANEXO 1
SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS
Karina Helena Morais Cardozo
Itapetininga, 08 de março de 1977
e-mail: karinahmc@yahoo.com
FORMAÇÃO ACADÊMICA
2003 - 2007
Doutorado em Ciências – Bioquímica, Instituto de Química,
Universidade de São Paulo, USP, São Paulo. Bolsa: FAPESP
1998 - 2001
Graduação em Química – Bacharel
Universidade de São Paulo, USP, São Paulo
OCUPAÇÃO
2003 – 2007 Bolsista de Doutorado, FAPESP
IDIOMAS
Inglês
Espanhol
Fluente
Intermediário
ESTÁGIOS NO EXTERIOR
07/2005 - 08/2005
Departamento de Química, da Universidade de Bristol, Bristol,
Inglaterra, sob orientação do Dr. Paul J. Gates. Bolsa: FAPESP
10/2006 - 03/2007
Departamento de Ecofisiologia de Planta, da Universidade Friedrich-
Alexander, Erlangen, Alemanha, sob a orientação do Prof. Dr. Donat-P
Häder. Bolsa: FAPESP e DAAD
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
PUBLICAÇÕES
Artigos completos:
• Cardozo KHM, Guaratini T, Gates PJ, Pinto E, Colepicolo P, Lopes NP. Fragmentation Study
of the of Di-Acidic Mycosporine-like Amino Acids in ESI and nanoESI. European Journal of Mass
Spectrometry, em redação.
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Colepicolo P. A Theoretical and Mass Spectrometry Based Study of the Fragmentation of
Mycosporine-like Amino Acids. International Journal of Mass Spectrometry, aceito, 2007.
• Guaratini T, Cardozo KHM, Pinto E, Colepicolo, P. HPLC-DAD-ECD method for identification
and quantification of pigments from algae. Journal of Chromatographic A, submetido, 2007.
• Cardozo KHM, Guaratini T, Barros MP, Falcão VR, Tonon AP, Lopes NP, Campos S, Torres
MA, Souza AO, Colepicolo P, Pinto E. Metabolites from algae with economical impact.
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cyanobacterial bloom event. Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (3):
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oxidative/nitrosative stress in algae. Biological Rhythm Research 36 (1-2): 67-82, 2005.
• Bittencourt-Oliveira MD, Kujbida P, Cardozo KHM, Carvalho VM, Moura AD, Colepicolo P,
Pinto E. A novel rhythm of microcystin biosynthesis is described in the cyanobacterium
Microcystis panniformis Komarek et al. Biochemical and Biophysical Research Communications
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• Carvalho AM; Neto AMP; Tonon AP; Pinto E; Cardozo KHM; Brigagão MRPL; Barros MP;
Torres MA; Magalhães P; Campos SCG; Guaratini T; Sigaud-Kutner TCS; Falcão VR; Colepicolo
P. Circadian protection against oxidative stress in marine algae. Hypnós (1): 142-157, 2004.
• Leitao MAD, Cardozo KHM, Pinto E, Colepicolo P. PCB-induced oxidative stress in the
unicellular marine dinoflagellate Lingulodinium polyedrum. Archives of Environmental
Contamination and Toxicology 45 (1): 59-65, 2003.
• Cardozo KHM, de Oliveira MAL, Tavares MFM, Colepicolo P, Pinto E. Daily oscillation of fatty
acids and malondialdehyde in the dinoflagellate Lingulodinium polyedrum. Biological Rhythm
Research 33 (4): 371-381, 2002.
Capítulos de livros:
• Guaratini T, Cardozo KHM, Pavanelli DD, Colepicolo P, Pinto E. Ecotoxicologia. In:
Fundamentos de Toxicologia, editor: Oga S. Atheneu Editora, 3 ed., 2007.
Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007
Resumos em Congressos (2004-2007):
• Cardozo KHM, Guaratini T, Pinto E, Colepicolo P. Development of a new method to analyze
antioxidants from algae. V Meeting of the SFRBM- South American Group ( Montevidéu, Uruguai,
2007).
• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P. Isolation and Identification of sunscreen
compounds from algae. Apresentação oral no XI Congresso Brasileiro de Ficologia (Itajaí, Brasil,
2006).
• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P Identification of mycosporine-like amino
acids by hydrogen/deuterium exchange and ESI-MS2 in the macroalgae Gracilaria tenuistipitata.
Apresentação oral e de poster no congresso Gordon Research Conference on Marine Natural
Products (Ventura, EUA, 2006).
• Mastrorosa VO, Cardozo KHM; Pinto E, Colepicolo P. Effects of ultraviolet-B radiation on the
accumulation of mycosporine-like amino acids in the red alga Gracilaria tenuistipitata. XXXX
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (Águas de Lindóia,
Brasil, 2006).
• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Gates P, Vessecchi R, Galembeck S, Lopes NP,
Colepicolo P. Fragmentation patters of mycosporine-like amino acids from Gracilaria tenuistipitata
by electrospray ionization tanden mass spectrometry. I Congresso Brasileiro de Espectrometria
de Massas (Campinas, Brasil, 2005).
• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P. Micosporinas de Gracilaria tenuistipitata:
Isolamento e elucidação estrutural por ESI-MS2. XXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Química (Poços de Calda, Brasil, 2005).
• Cardozo KHM; Carvalho VM; Pinto E, Guaratini T, Cardozo DM; Colepicolo P Investigation of
the antioxidant properties of mycosporine-like amino acids in the marine red algae Gracilaria
tenuistipitata. XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
(Águas de Lindóia, Brasil, 2005).
• Cardozo DM; Cardozo KHM, Carvalho VM; Pinto E, Colepicolo P. Determination and
quantification of mycosporine-like amino acids during growth of the dinoflagellatte Lingulodinium
polyedrum with nutrient limitation. XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica
e Biologia Molecular (Águas de Lindóia, Brasil, 2005).
• Cardozo KHM; Carvalho VM; Pinto, E. ; Colepicolo, P. Isolation and characterization of
mycosporine-like amino acids in the marine red algae Gracilaria tenuistipitata by HPLC and liquid
chromatography / electrospray. XXXIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e
Biologia Molecular (Caxambu, Brasil, 2004).
• Cardozo KHM, Pinto E, Leitão AS, Colepicolo P Oscillation of pigments and mycosporine-like
amino acids in the marine dinoflagellate Lingulodinium polyedrum growing in batch-cultures
during starvation X Reunião da Sociedade Brasileira de Ficologia (Salvador, Brasil, 2004).
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