( PDF ) Análise da expressão de RNAs intrônicos não-codificadores em carcinomas de célula renal

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE RNAs

INTRÔNICOS NÃO-CODIFICADORES EM

CARCINOMAS DE CÉLULA RENAL

GLAUBER COSTA BRITO

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Moraes Rego Reis

Tese de Doutoramento apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade de São Paulo

São Paulo

Data do Depósito na SPG:

08/10/2007

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2

GLAUBER COSTA BRITO

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE RNAs

INTRÔNICOS NÃO-CODIFICADORES EM

CARCINOMAS DE CÉLULA RENAL

Tese apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Doutor em

Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Moraes Rego Reis

São Paulo

2007

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3

Glauber Costa Brito

Análise da expressão de RNAs intrônicos não-codificadores em carcinomas de

célula renal

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Doutor em

Bioquímica

Aprovado em: ____________

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________________________________________

Instituição: ___________________________________________________

Assinatura: ___________________________________________________

Prof. Dr. _____________________________________________________

Instituição: __________________________________________________

Assinatura: ___________________________________________________

Prof. Dr. _____________________________________________________

Instituição: __________________________________________________

Assinatura: ___________________________________________________

Prof. Dr. _____________________________________________________

Instituição: __________________________________________________

Assinatura: ___________________________________________________

Prof. Dr. _____________________________________________________

Instituição: __________________________________________________

Assinatura: ___________________________________________________

4

A Eurico Gracindo de Brito (in memoriam) e Lindaura da Costa de Brito, que sempre

batalharam pela minha educação. Essa tese é fruto dessa batalha.

5

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Eduardo Reis, pela paciência na orientação e tirocínio lógico-

dedutivo, indispensáveis para indicar, muito acertadamente, a incoerência de muitas das

minhas idéias. Obrigado por mostrar que "uma câmera na mão e uma idéia na cabeça" só

funciona bem com o Glauber do cinema.

Ao Prof. Dr. Sergio Verjovski, pela dedicação ao projeto dessa tese e pela estrutura de

laboratório, ambiente científico e condições de trabalho incomuns num país como o nosso.

Poder usufruir disso foi um privilégio.

À Universidade de São Paulo, pela minha formação acadêmica nesses quase 15 anos e, por

extensão, ao Departamento de Bioquímica do IQ/USP.

A Renato, Denise, Adriana e Camile pelos momentos agradáveis de bandejão, e também,

claro, pelo auxílio técnico.

A Fabrício, à época funcionário do Instituto Ludwig, por ter me ensinado as técnicas de análise

de metilação.

Ao Prof. Dr. André Vettore, à época pesquisador do Instituto Ludwig, pela colaboração nas

análises de metilação.

A Ana Paula Lopes Vidal, indispensável na minha relação com a Fapesp e na organização

burocrática do laboratório.

A Tarik, pelas discussões científicas e culturais, por compartilhar idéias e opiniões.

A Ângela, pela colaboração com dados de pacientes, amostras e RNAs.

A Mílton, Apuã e Abimael, pelas dicas de Perl e Unix.

A Thiago, pelas opiniões científicas, quase sempre discordantes das minhas.

A Jeferson, pelos papos de cafezinho e ajuda no laboratório.

Aos demais colegas de laboratório, especialmente a Ana Cláudia, Kátia, Renato, Denise, Ana

Paula, Tarik, Jeferson, Felipe, Camila, Hélder, Yuri, Giulliana, Lauren, Rodrigo e Ricardo, por

terem tornado o ambiente de trabalho mais leve e divertido.

A Rosane, a quem não dediquei o tempo merecido, em função do tempo dedicado a essa tese.

A Tatiana, grande amiga.

Ao apoio financeiro da FAPESP e CNPq.

6

“E não me esquecer, ao começar o trabalho, de me preparar

para errar. Não esquecer que o erro muitas vezes havia se

tornado o meu caminho. Todas as vezes em que não dava certo

o que eu pensava ou sentia - é que se fazia enfim uma brecha, e,

se antes eu tivesse tido coragem já teria entrado por ela. Mas

eu sempre tivera medo de delírio e erro. Meu erro, no entanto,

devia ser o caminho de uma verdade: pois só quando erro é que saio

do que conheço e do que entendo. Se a “verdade” fosse aquilo

que posso entender - terminaria sendo apenas uma verdade pequena,

do meu tamanho. A verdade tem que estar exatamente no que

não poderei jamais compreender.”

Clarice Lispector, A paixão segundo G.H.

7

RESUMO

Brito, G. C. Análise da expressão de RNAs intrônicos não-codificadores

em carcinomas de célula renal. 2007. 126 p.. Tese (Doutorado) - Programa

de Pós-Graduação em Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São

Paulo, São Paulo.

O carcinoma de célula renal (CCR) subtipo célula clara é o câncer mais letal e

prevalente do sistema urinário. A transformação maligna no CCR está

possivelmente associada à mudanças no perfil de expressão de oncogenes e

genes supressores de tumor, e acredita-se que estas alterações sejam críticas

para o desenvolvimento do fenótipo maligno. Para identificar novos genes e

vias moleculares associadas à transformação maligna no CCR célula clara,

foram analisados perfis de expressão gênica de amostras pareadas de tumor e

tecido não tumoral adjacente de 6 pacientes. Foi utilizada uma plataforma de

microarrays de cDNA contendo 2.292 sondas mapeando éxons de genes

codificadores e 822 sondas de RNAs não-codificadores mapeando em regiões

intrônicas. A transcrição intrônica foi detectada em todos os tecidos normais e

neoplásicos. Utilizando uma combinação de dois testes estatísticos e uma

validação por leave-one-out, foi selecionado um subconjunto de 64 transcritos

com expressão significativamente alterada em CCR célula clara em relação ao

tecido não tumoral adjacente, estando a maior parte (86%) com expressão

diminuída em CCR. Entre os transcritos com expressão diminuída, 49

mapearam em regiões não-traduzidas ou éxons de genes codificadores e 6

mapearam em regiões intrônicas de genes codificadores conhecidos. Os níveis

de expressão diminuída de SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP e NDE1 (p < 0,02), e de

transcritos intrônicos derivados dos loci de SND1 e ACTN4 (p < 0,05), foram

confirmados em CCR célula clara por Real-time RT-PCR. Um subconjunto de

25 transcritos se mostrou alterado em 6 amostras adicionais de CCR

não−célula clara, indicando alterações transcricionais comuns em CCR

independentemente do subtipo histológico ou do estado de diferenciação do

tumor. Além disso, foi analisado o perfil de metilação dos genes com expressão

diminuída em tumor SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP e GPX3. Nossos resultados

indicam um novo conjunto de candidatos a gene supressor de tumor, que

8

podem desempenhar um papel importante na transformação maligna de

células renais normais.

Palavras-chave: carcinoma de célula renal, RNA não codificante, transcrição

intrônica, microarrays de cDNA, supressor de tumor.

9

ABSTRACT

Brito, G. C. Expression analysis of intronic noncoding RNAs in renal cell

carcinomas. 2007. 126 p.. Thesis (Doctoral) - Graduate Program in

Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

The clear cell subtype of renal cell carcinoma (RCC) is the most lethal and

prevalent cancer of the urinary system. The carcinogenesis in RCC is thought to

be associated with changes in the expression of several genes, and this

alteration in gene expression is believed to be critical to the development of the

malignant phenotype. To investigate new genes and molecular pathways

associated with malignant transformation in clear cell RCC, gene expression

profiles of matched samples of tumor and adjacent non-neoplastic tissue

obtained from 6 patients were analysed. A custom-built cDNA microarray

platform was used, comprising 2,292 probes that map to exons of genes and

822 probes for noncoding RNAs mapping to intronic regions. Intronic

transcription was detected in all normal and neoplastic renal tissues. A subset

of 64 transcripts with levels significantly deregulated in clear cell RCC relative to

the matched non-tumor tissue, mostly (86%) downregulated in CCR, was

identified by a combination of two statistical tests and leave-one-out patient

cross-validation. Among the down-regulated transcripts, 49 mapped to

untranslated or coding exons and 6 were intronic relative to known exons of

protein-coding genes. Lower levels of expression of SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP

and NDE1 (p < 0.02), and of intronic transcripts derived from SND1 and ACTN4

loci (p < 0.05), were confirmed in clear cell RCC by Real-time RT-PCR. A

subset of 25 transcripts was deregulated in additional 6 non-clear cell RCC

samples, pointing to common transcriptional alterations in RCC irrespective of

the histological subtype or differentiation state of the tumor. In addition, the

methylation profile of SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP, and GPX3 was analyzed. Our

results indicate a novel set of tumor suppressor gene candidates, including

noncoding intronic RNAs, which may play a significant role in malignant

transformations of normal renal cells.

Keywords: Renal Cell Carcinoma, noncoding RNA, intronic transcription, cDNA

microarray, tumor suppressor.

10

LISTA DE ABREVIATURAS

bp

Pares de bases

CCR

Carcinoma de Célula Renal

CAGE

Cap Analysis Gene Expression

CGAP

Cancer Genome Anatomy Project

ChIP

Imunoprecipitação da cromatina

CT

Cycle Threshold

ENCODE

The Encyclopedia of DNA Elements

EST

Expressed Sequence Tag

FDR

False Discovery Rate

GEO

Gene Expression Omnibus

GO

Gene Ontology

HCGP

Human Cancer Genome Project

kb

Quilobase

miRNA

Micro RNA

MPSS

Massively Parallel Signature Sequencing

mRNA

RNA mensageiro

MSP-PCR

Methylation-Specific PCR

ncRNA

RNA não-codificador para proteínas

nt

Nucleotídeos

OMIM

Online Mendelian Inheritance in Man

ORF

Open Reading Frame

PCR

Reação em Cadeia da Polimerase

qPCR

PCR quantitativo

RACE

Rapid Amplification of cDNA Ends

RefSeq

Reference Sequence

RT-PCR

Transcrição Reversa − Reação em Cadeia da Polimerase

SAGE

Serial Analysis of Gene Expression

SAM

Significance Analysis of Microarrays

11

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 – Esquema da determinação do status de metilação de ilhas CpG

utilizando as técnicas de BSP e MSP

26

Figura 2 – Desenho esquemático das hibridizações realizadas 38

Figura 3 – Imagem representativa das hibridizações de CCR com microarray

enriquecido em RNAs não-codificadores

39

Figura 4 – Normalização dos dados de expressão 40

Figura 5 – Dependência entre a intensidade média e o desvio-padrão das

réplicas

41

Figura 6 – Matriz de correlação das medidas de intensidade 47

Figura 7 – Expressão de transcritos codificadores para proteínas, e ncRNAs

intrônicos e intergênicos em tecido renal.

49

Figura 8 – Perfil de expressão de CCR célula clara 50

Figura 9 – Perfil de expressão de CCR independente do subtipo histológico 54

Figura 10 – Locus genômico de TACC1 e SLC2A1 55

Figura 11 – Genes diferencialmente expressos em um maior número de

amostras pareadas tendem a estar diminuídos em CCR

57

Figura 12 – Avaliação dos genes alterados em CCR segundo a marcação com

Cy3 ou Cy5

59

Figura 13 – Genes alterados em CCR em diversos estudos 61

Figura 14 – Expressão por Real-Time PCR de candidatos a marcadores de

CCR

62

Figura 15 – Região genômica do cromossomo 16 contendo os loci de MYH11

e NDE1

63

Figura 16 – Verificação do tratamento com bissulfito 65

Figura 17 – Perfil de metilação de sítios CpG de genes sub-expressos em

CCR

66

Figura 18 - Gráfico de saída do programa SAM AnexoII

12

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 – Estudos publicados em CCR utilizando Microarrays 22

Tabela 2 – Dados clínico-patológicos dos pacientes 35

Tabela 3 – Primers usados para PCR em tempo real 43

Tabela 4 – Primers usados em BSP 45

Tabela 5 – Relação dos 83 transcritos diferencialmente expressos em CCR 51

13

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 15

1.1 O Carcinoma de Célula Renal (CCR) ............................................................ 15

1.2 Genética do CCR ............................................................................................ 16

1.3 Características Clínicas do CCR .................................................................... 18

1.4 Identificação de marcadores moleculares em CCR ........................................ 20

1.5 Metilação e Câncer ......................................................................................... 24

1.6 RNAs intrônicos não-codificadores................................................................ 27

1.7 Papel dos RNAs não-codificadores no câncer ................................................ 31

2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 33

2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................. 33

2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 33

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 34

3.1 Amostras de pacientes .................................................................................... 34

3.2 Extração de RNA e marcação de alvos fluorescentes.....................................36

3.3 Hibridização de alvos fluorescentes com microarrays enriquecidos

em ncRNAs intrônicos ................................................................................... 37

3.4 Filtragem e normalização dos dados de expressão gênica ............................. 39

3.5 Identificação de transcritos diferencialmente expressos em CCR.................. 41

3.6 PCR em Tempo Real ...................................................................................... 42

3.7 Análise de Metilação ...................................................................................... 44

4. RESULTADOS .................................................................................................. 47

4.1 Avaliação da qualidade das hibridizações realizadas ..................................... 47

4.2 Expressão de RNAs intrônicos em CCR ........................................................ 48

4.3 Identificação de genes diferencialmente expressos ........................................ 49

4.5 Análise do padrão de metilação de genes com expressão

diminuída em CCR ......................................................................................... 65

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 69

5.1 Desenho experimental utilizado para identificação de transcritos

diferencialmente expressos em CCR .............................................................. 69

5.2 Comparação dos genes identificados com outros estudos de CCR ................ 70

5.3 Expressão de RNAs não-codificadores em CCR ........................................... 71

5.4 Análises de metilação ..................................................................................... 73

5.5 Genes diferencialmente expressos em CCR ................................................... 74

6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 81

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................. 82

ANEXO I − Curriculum Vitae

ANEXO II − Abordagens estatísticas utilizadas para seleção de genes

diferencialmente expressos

14

ANEXO III − Artigo submetido para publicação

15

1. INTRODUÇÃO

1.1 O Carcinoma de Célula Renal (CCR)

O Carcinoma de Célula Renal (CCR) é o tipo de câncer mais comum entre

aqueles que surgem no rim de indivíduos adultos, representando 3% de todos os

cânceres no mundo (Kopper et al. 2006). Trata-se de uma doença histopatologicamente

heterogênea, sendo que a maior parte dos casos (70-80% dos CCRs) é do tipo

histológico célula clara, 15-20% são CCR subtipo papilar, 4-5% CCR subtipo

cromófobo, < 1% carcinoma do ducto coletor de Bellini e <1% carcinoma medular renal

(Eble et al. 2004). Os CCRs podem ser classificados em subtipos específicos usando o

sistema de classificação histopatológica da OMS (Organização Mundial de Saúde). Esta

classificação é um preditor importante de comportamento clínico (Yin-Goen et al.

2006). Cada subtipo de tumor renal no sistema da OMS é definido por critérios

patológicos específicos, que enfatizam o padrão de crescimento, morfologia nuclear e

características morfológicas e citoplasmáticas (Amin et al. 2002). Algumas

características adicionais do tumor (Grau nuclear Fuhrman e estadiamento) e variáveis

clínicas, incluindo trombocitose peri-operatória, também são correntemente usadas

como fatores prognósticos para prever a evolução da doença (O'Keefe et al. 2002).

Os diferentes tipos de CCRs podem ser normalmente distinguidos por

características histológicas e anatômicas. Tipicamente os CCRs célula clara são

caracterizados por uma massa infiltrante solitária com padrões de crescimento sólido,

alveolar ou acinar e contendo células de tumor “claras” associadas a anastomose de

vasos sangüíneos. O aspecto “claro” dessas células na microscopia óptica está associado

à presença de lipídeos no citoplasma. Já os tumores CCR papilares são descritos como

16

uma massa circunscrita com cápsula fibrosa, contendo células neoplásicas num padrão

de crescimento papilar, imersas em áreas de necrose. Os CCRs cromófobos apresentam

padrão de crescimento alveolar, com células tumorais contendo núcleos irregulares,

halos perinucleares e citoplasma eosinofílico claro ou granular. Apesar dos critérios

microscópicos evidentes, os tumores CCR freqüentemente apresentam mais de um

componente, fazendo com que muitas vezes a identificação do subtipo histológico seja

difícil e subjetiva. Por exemplo, tumores epiteliais de qualquer tipo podem apresentar

padrões de crescimento sólido, alveolar ou papilar, conter células neoplásicas com

citoplasma claro ou granular, ou apresentar a variante histológica sarcomatóide, a qual

embora não faça parte formalmente do sistema de gradação nuclear (grau Fuhrman),

apresenta um prognóstico bastante negativo, com muitos pacientes morrendo em menos

de 12 meses. A variante sarcomatóide é definida pelo elevado pleomorfismo de suas

células, que apresentam grau variável de células epiteliais claras ou granulares que

caracterizam o CCR (Cangiano et al. 1999).

1.2 Genética do CCR

A maioria dos casos de CCR é esporádica, sendo os principais fatores de risco a

obesidade, o tabagismo e a exposição ocupacional a fatores carcinogênicos. Embora

correspondam a menos de 3% do total de casos. o número absoluto de casos de

síndromes de CCR hereditárias não é desprezível, e apresentam implicações clínicas

importantes. Deve-se suspeitar de uma síndrome herdada quando o CCR é bilateral e/ou

multifocal, ou surge em tenra idade. O diagnóstico pode ser confirmado pela análise dos

principais genes de predisposição (VHL, MET, FH, BHD) (Kopper et al. 2006). O

principal CCR célula clara de origem hereditária está associado à doença de von Hippel-

Lindau (VHL), uma síndrome dominante autossômica de suscetibilidade a tumor (Inoue

17

et al. 2007). Esta doença é causada pela perda de função por mutação em células

embrionárias do gene supressor de tumor VHL no cromossomo 3p25. Além disso, a

perda de função de VHL é a alteração genética mais comum em CCR célula clara

esporádico. Mutações em VHL promovem hipervascularização tumoral; a proteína VHL

atua na ubiquitinização e degradação de HIF1A (fator 1 alfa induzível por hipoxia), o

regulador positivo primário de angiogênese (Na et al. 2003). Raramente o CCR célula

clara surge em outras condições hereditárias, sendo uma exceção a síndrome de

translocação constitucional do cromossomo 3, mapeada em vários sítios de quebra

distintos do locus de VHL (Van Erp et al. 2003).

Os subtipos histológicos de tumor renal estão associados a lesões citogenéticas

distintas, sugerindo a importância da classificação tumoral a partir de marcadores

moleculares e o potencial papel do diagnóstico molecular no tratamento clínico. Várias

abordagens citogenéticas e moleculares têm sido utilizadas para identificar as alterações

genéticas subjacentes ao CCR (Furge et al. 2004). Análise de cariótipo, perda de

heterozigosidade e hibridização genômica comparativa são técnicas que têm contribuído

para estabelecer correlações entre alterações cromossômicas e subtipos histológicos,

resultando num modelo de subclassificação molecular para este câncer (Furge et al.

2004). Os CCRs célula clara tem sido caracterizados por apresentarem deleção do

cromossomo 3p ou ganho de 5q combinados com deleções de dois ou mais

cromossomos 6q, 8p, 9p ou 14q; o CCR papilar é caracterizado por um ganho de dois

ou mais cromossomos 3q, 7, 8, 12, 16, 17 ou 20 e nenhuma perda de 3p; finalmente, o

CCR cromófobo é caracterizado pela perda de dois ou mais cromossomos 1, 2, 6, 10, 13

ou 17. Além disso, evidências sugerem que um ganho do cromossomo 5q em tumores

célula clara pode significar um prognóstico mais favorável, enquanto que uma perda de

14q pode resultar num prognóstico menos favorável (Furge et al. 2004).

18

1.3 Características Clínicas do CCR

Um terço dos pacientes diagnosticados com CCR apresenta ou apresentará

lesões metastáticas durante o curso da doença (Flanigan et al. 2003). O CCR metastático

é atualmente um dos tumores malignos mais resistentes ao tratamento. A quimioterapia

citotóxica clássica apresenta pouca atividade antitumoral contra o CCR (Motzer et al.

2000), sendo que o CCR célula clara apresenta a mais alta taxa de invasão local,

metástase e mortalidade dentre os tumores renais em adultos (Moch et al. 2000; Adjei et

al. 2003) . Os carcinomas papilares e cromófobos são relativamente indolentes, mas

podem metastatizar ou se transformar em malignidades sarcomatóides de grau elevado.

Além disso, o CCR papilar apresenta uma taxa mais elevada de multifocalidade e

associação com doença renal em estágio final em comparação com os outros subtipos de

CCR (Amin et al. 2002).

A nefrectomia radical é a terapia padrão para o CCR localizado, que pode ser

curado por cirurgia. No entanto, 25-40% dos casos apresentam crescimento extra-renal

ou metástase (Amin et al. 2002), e um terço das lesões aparentemente localizadas

desenvolve metástase no período pós-operatório (Gieseg et al. 2002). Para o CCR célula

clara em estágio avançado, a terapia sistêmica de primeira linha envolve interleucina-2

(IL-2) e interferon-alfa (IFN-α). No entanto, a maioria dos tumores subtipo célula clara

não apresenta resposta satisfatória à imunoterapia (Atkins et al. 2004), que em geral

tampouco apresenta bons resultados em subtipos de CCR com histologia diferente de

célula clara (Motzer et al. 2000). As taxas de resposta objetiva com IFN-α variam de

10% a 15% em estudos de Fase III, com aumento de sobrevida mediana de apenas 3-7

meses em comparação à terapia equivalente com placebo (Fossa 2000). Assim, o

19

prognóstico para pacientes com CCR avançado é extremamente ruim e a sobrevida

mediana é de aproximadamente 10 meses (Motzer et al. 2000).

Alguns avanços na elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à

progressão do CCR, tem levado à identificação de alvos promissores para o tratamento

deste tumor e uma mudança no padrão de desenvolvimento de novos fármacos de uma

abordagem por seleção aleatória para uma mais mecanística e racional (Sosman et al.

2007). Inibidores da tirosina quinase, como sorafenib e sunitinib, já foram aprovados

para o tratamento de CCR avançado (Sosman et al. 2007). Outros agentes, como

bevacizumab, um anticorpo direcionado contra o fator de crescimento vascular

endotelial (VEGF) A, também apresentou atividade clínica promissora (Sosman et al.

2007). Os benefícios desses agentes foram reconhecidos devido a elevadas taxas de

resposta objetiva (sunitinib), aumento significativo de sobrevida sem doença (sunitinib,

sorafenib e bevacizumab) ou melhora significativa de sobrevida sem progressão de

doença (temsirolimus) (Sosman et al. 2007). No entanto, a resposta do CCR em estágio

avançado à terapia sistêmica com essas novas drogas ainda é insuficente para aumentar

significativamente a sobrevida de pacientes após 5 anos, que correspondem a menos de

10% dos casos (Motzer et al. 2000).

Uma revisão da literatura não identificou nenhum marcador capaz de

individualmente diagnosticar ou prognosticar com eficácia o surgimento ou evolução

deste câncer (Ficarra et al. 2002). Assim, a identificação de genes diferencialmente

expressos entre tecido normal e tumoral, o foco do presente trabalho, pode contribuir

para o desenvolvimento de novos marcadores tumorais capazes de diagnosticar

prematuramente o CCR e conseqüentemente aumentar a chance de sobrevida ou cura

dos pacientes. Uma outra aplicação da identificação de genes diferencialmente

expressos em tumores renais é fornecer subsídios para o desenvolvimento de

20

ferramentas anti-neoplásicas que tenham como alvo estes genes ou as vias de regulação

em que estes estão envolvidos. Por exemplo, pode-se desenvolver anticorpos

terapêuticos como aqueles descritos contra o receptor de fator de crescimento

epidérmico, os quais apresentaram atividade in vitro contra o carcinoma de célula renal

(Michael et al. 2003).

1.4 Identificação de marcadores moleculares em CCR

Os métodos clássicos de análise de expressão gênica, como northern blot e RT-

PCR, se limitam a avaliação de um número limitado de genes e amostras. Por outro

lado, os microarrays de DNA são ferramentas poderosas porque podem quantificar o

nível de expressão de milhares de transcritos de uma única vez. Os chamados chips de

DNA são matrizes sólidas (tipicamente lâminas de vidro) contendo milhares de

elementos arranjados com alta densidade, sendo cada elemento (chamados de “sondas”)

constituido por moléculas de DNA identicas. Nos experimentos de expressão gênica, os

microarrays são hibridizados contra cDNA ou cRNA derivados de mRNA das amostras

biológicas que se pretende estudar (chamados “alvos”), tipicamente marcados com uma

molecula fluorescente. A quantidade de alvos fluorescentes hibridizados por

complementaridade com as sondas representadas nos microarrays fornecem uma

medida relativa da expressão gênica (Quackenbush 2002). Há fortes evidências recentes

de que o perfil de expressão gênica global possa revelar subtipos clínicos com base na

heterogeneidade subjacente dos mecanismos neoplásicos do CCR (Takahashi et al.

2001; Young et al. 2001; Skubitz et al. 2002). Assim, o uso clínico do perfil de

transcrição pode resultar em diagnósticos mais exatos e objetivos, bem como melhores

prognósticos de doença ou de resposta a tratamento.

21

Utilizando microarrays de DNA, é possível comparar simultaneamente os níveis

de expressão relativa de vários milhares de genes em diferentes tipos celulares.

Considerando que dos 20.000 - 25.000 genes humanos, segundo recente estimativa do

IHGSC (International Human Genome Sequencing Consortium) (2004), menos da

metade desses tem sua função compreendida, sendo que a análise em larga escala da

expressão pode revelar genes co-regulados pertencentes a uma mesma via

eventualmente implicada na patologia do CCR. Deve-se ressaltar ainda que menos de

3% dos genes identificados foram caracterizados em doença renal, sugerindo a

necessidade de técnicas de genômica funcional nesta área de pesquisa (Kurella et al.

2001). Nesse sentido, o uso de microarrays de DNA tem se constituído uma importante

abordagem na identificação de genes diferencialmente expressos e de eventos

moleculares envolvidos no CCR, particularmente a subclasse histológica célula clara.

Vários grupos avaliaram se a expressão gênica poderia complementar o exame

histopatológico para classificação de tumores renais (Boer et al. 2001; Young et al.

2001; Gieseg et al. 2002; Skubitz et al. 2002; Higgins et al. 2003; Takahashi et al. 2003;

Yamazaki et al. 2003; Furge et al. 2004; Schuetz et al. 2005; Sultmann et al. 2005; Yao

et al. 2005; Rohan et al. 2006), auxiliar na classificação prognóstica (Motzer et al. 1999;

Takahashi et al. 2001; Twine et al. 2003; Vasselli et al. 2003; Kosari et al. 2005) ou

identificar expressão diferencial entre tecido tumoral e tecido não-tumoral adjacente

(Moch et al. 1999; Boer et al. 2001; Takahashi et al. 2001; Young et al. 2001; Gieseg et

al. 2002; Skubitz et al. 2002; Higgins et al. 2003; Hirota et al. 2006). Um resumo dos

trabalhos realizados em CCR, indicando as amostras analisadas e a plataforma utilizada

em cada um deles é apresentado na Tabela 1.

22

Tabela 1 - Estudos publicados em CCR utilizando microarrays.

ESTUDO AMOSTRAS PLATAFORMA OBSERVAÇÕES

Yang et al., 2006 9-CC-CCR, 4 P-CCR, 2

CM-CCR, 1 ONC

cDNA (21.632

clones)

Classificação diagnóstica

Sultmann et al.,

2005

65 CC-CCR, 13 P-CCR, 9

CM-CCR

cDNA (4.200

clones)

Classificação diagnóstica;

classificação prognóstica;

correlação com citogenética

Yao et al., 2005 29 CC-CCR, 3 CM-CCR, 1

TW

Affymetrix U95A

(10.000 genes)

Classificação diagnóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Yao et al., 2005 29 CC-CCR, 3 CM-CCR, 1

TW

Affymetrix U95A

(10.000 genes)

Classificação diagnóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Schuetz et al.,

2005

13 CC-CCR, 5 P-CCR, 4

CM-CCR, 3 ONC, 6 AML

Affymetrix HG-

Focus (8.700

genes)

Classificação diagnóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Furge et al., 2004 60 CC-CCR, 5 P-CCR, 16

CM-CCR, pareado

cDNA (23.000

clones)

Classificação diagnóstica,

inferência de anormalidades

citogenéticas

Liou et al., 2004 Pool de CC-CCR e de

linhagens celulares de CCR

Affymetrix Hugene

FL (5.600 genes)

Discriminação de CCR de rim

não-neoplásico

Higgins e al.,

2003

28 convencionais (CC-

CCR), 4 P-CCR, 3 CM-

CCR, 2 ONC, 1 AML

cDNA (23.000

clones)

Classificação diagnóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Takahashi et al.,

2003b

39 CC-CCR, 8 P-CCR, 5

CM-CCR, 6 G-CCR, 5 S-

CCR, 2 ONC, 3 CU, 5 TW,

rim não-neoplásico.

cDNA (23.000

clones)

Classificação diagnóstica;

classificação prognóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Lenburg et al,

2003

18 CC-CCR, 9 pareados Affymetrix

U133A/B (45.000

sondas)

Discriminação entre CCR e rim

não-neoplásico; comparação

com perfis de expressão de

outros estudos

Copland et al.,

2003

CCR localizado ou

metastático, linhagens

celulares de CCR

Affymetrix U95A

(10.000 genes)

Identificação de TGF-β

aberrante como envolvido na

carcinogênese e progressão do

CCR

Yamazaki et al.,

2003

10 CC-CCR, 2 P-CCR, 3

CM-CCR

Affymetrix U95A

(10.000 genes)

Classificação diagnóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Vasselli et al.,

2003

58 CCR estágio IV, 8

pareados

cDNA (64.000

clones)

Classificação prognóstica

Young et al.,

2001; Young et

al., 2003

4 CC-CCR, 3 P-CCR, 2

CM-CCR, 1 ONC, pareado

cDNA (7.000

clones)

Classificação diagnóstica;

identificação de marcadores

imunohistoquímicos

Skubitz e Skubitz,

2002

8 CC-CCR, 11 amostras

normais e 8 tumorais, 256

outros tecidos

Affymetrix U95

(63.000 sondas)

Padrão de expressão para

diferenciar CCR de rim não-

neoplásico e de outros tecidos

Gieseg et al., 2002 9 CC-CCR, 2 CM-CCR, 1

CU, 1 AM, 8 amostras

pareadas

Affymetrix Hugene

FL (5.600)

Classificação diagnóstica;

discriminação entre CCR de rim

não-neoplásico

Takahashi et al.,

2001

29 CC-CCR, pareado cDNA (22.000

clones)

Classificação prognóstica

Boer et al., 2001 37 tumores renais, pareado cDNA (31.500

clones)

Classificação diagnóstica;

correlação com estágio do tumor

CC-CCR: Carcinoma de célula renal (CCR) subtipo célula clara; P-CCR: CCR subtipo papilar; CM-CCR:

CCR subtipo cromófobo; G-CCR: CCR granular; S-CCR: CCR subtipo sarcomatóide; ONC:

23

Oncocitoma; AML: Angiomiolipoma; CU: carcinoma urotelial; TW: tumor de Wilms; AM: adenoma

metanéfrico. Tabela baseada em Yin-Goen et al., 2006.

Boer et al. estudaram 32 CCRs primários e 5 metastáticos utilizando um chip de

cDNA com 31.500 seqüências (21.875 transcritos distintos), das quais

aproximadamente 30% representavam genes conhecidos, enquanto que o restante eram

ESTs que não mapeavam em genes conhecidos (Boer et al. 2001). Nesse estudo, foram

identificados 1.738 genes diferencialmente expressos entre tecido tumoral e normal

adjacente. Muitos dos genes identificados com expresão aumentada em CCR estavam

envolvidos em adesão celular e metabolismo de ácido nucléico. Por outro lado, genes

que codificam proteínas de transporte e proteínas envolvidas em transporte de elétrons

estavam com expressão diminuída. Em um estudo subseqüente, o mesmo grupo estudou

um conjunto mais amplo de 112 CCRs, onde foram identificados 32 genes marcadores

capazes de discriminar entre os carcinomas célula clara, papilar e cromófobo. Nesse

estudo foi possível correlacionar as alterações de expressão gênica com anormalidades

cariotípicas, presença de metástases e progressão do tumor (Sultmann et al. 2005).

Outros investigadores exploraram a função geral de grupos de genes com

expressão alterada e encontraram resultados semelhantes. Liou et al., utilizando

microarrays de oligonucleotídeo Affymetrix, estudaram seis amostras de CCR célula

clara em comparação a tecidos normais adjacentes (Liou et al. 2004). Estes

investigadores observaram que genes de adesão celular tendiam a apresentar expressão

aumentada, enquanto que os genes de transporte estavam diminuídos. Gieseg et al.

estudaram oito rins normais em comparação a nove CCRs célula clara, dois carcinomas

cromófobos, um carcinoma urotelial e um adenoma metanéfrico. Eles identificaram que

o CCR célula clara apresenta expressão relativamente elevada de genes envolvidos em

transdução de sinal, organização de matriz celular e adesão (Gieseg et al. 2002). Um

estudo utilizando um array de 60.000 elementos comparou amostras de CCR célula

24

clara com rim norma, identificando 151 genes e 115 ESTs com nível de expressão em

CCR quatro vezes maior do que no rim normal e 35 genes e 19 ESTs 10 vezes menos

expressos em CCR em comparação ao rim normal (Skubitz et al. 2002). Jones e

colaboradores compararam amostras de rim normal com CCR célula clara identificando

como diferencialmente expressos em tumores genes que codificam especificamente para

proteínas secretadas e receptores de superfície celular (Jones et al. 2005). O racional

desta abordagem foi que proteínas secretadas representam potenciais candidatos a

diagnóstico sérico, enquanto que os receptores poderiam ser potenciais alvos

terapêuticos (Jones et al. 2005). Lenburg et al. utilizaram um chip Affymetrix com

45.000 seqüências para estudar 18 amostras de CCR, identificando por meio desta

abordagem 1.234 genes diferencialmente expressos entre tecido tumoral e normal. A

análise mostrou que os genes com expressão alterada em tumores estavam associados a

hipoxia, angiogênese, fator de necrose de tumor, apoptose, interferon, resistência a

medicamento e metástase (Lenburg et al. 2003).

Embora esses trabalhos tenham revelado diversos genes e vias metabólicas

associadas a malignidade dos tumors renais, o conhecimento gerado a partir de análises

globais de expressão gênica não se traduziu até o momento no desenvolvimento de

novas abordagens mais efetivas para o diagnóstico, prognóstico ou tratamento do CCR.

1.5 Metilação e Câncer

No genoma de mamíferos, a metilação do DNA é escassa e ocorre apenas em

bases de citosina localizadas a 5’ de uma guanosina num dinucleotídeo CpG e resulta da

atividade de uma família de enzimas DNA metiltransferases (DNMT 1, 3a ou 3b) que

catalisam a adição de um grupo metila da S-adenosilmetionina (SAM) para o carbono 5

25

da citosina em dinucleotídeos CpG (Bird 2002). Este dinucleotídeo está sub-

representado no genoma, porém regiões curtas de até 4 kb, conhecidas como ilhas CpG,

são ricas em conteúdo CpG (Bird 2002; Takai et al. 2002).

Em eucariotos superiores, a maior parte das ilhas CpG se localiza na vizinhança

de regiões promotoras, próximas ao início de transcrição. Cerca de metade dos genes de

mamíferos apresentam ilhas CpG nas regiões promotoras, que geralmente encontram-se

não-metiladas em células normais. A hipermetilação de ilhas CpG em promotores é a

alteração epigenética mais bem caracterizada em neoplasias e é encontrada em

virtualmente todos os tipos de câncer, estando associada ao silenciamento transcricional

inadequado de genes (Jones et al. 1999; Baylin et al. 2000). O silenciamento da

expressão gênica causado por hipermetilação da região promotora é tão comum em

tumores quanto a inativação clássica de genes supressores de tumor por meio de

mutação. De fato, quase 50% dos genes que causam formas hereditárias de câncer

quando mutados em células germinativas, apresentam também silenciamento mediado

por metilação em várias formas esporádicas de câncer (Jones et al. 2007).

Existem vários métodos para detecção de alterações do padrão de metilação em

ilhas CpG, sendo que a maioria dessas técnicas utiliza tratamento com bissulfito de

sódio para detecção do estado de metilação do DNA (Grunau et al. 2001). O bissulfito

de sódio induz a conversão de citosina não-metilada em uracila, a qual é convertida a

timina em uma reação de PCR subsequente. A citosina metilada, 5-metilcitosina, é

resistente ao tratamento com bissulfito e desse modo é amplificada no PCR como

citosina. O status de metilação da região de interesse pode ser determinada através de

seqüenciamento de DNA tratado com bissulfito. Para executá-lo, é necessário antes

26

amplificar uma determinada região da ilha CpG utilizando primers complementares ao

DNA convertido por bissulfito (BSP −Bisulfite-Specific PCR) (Jeronimo et al. 2001).

Alternativamente, o status de metilação de uma determinada região pode ser

avaliado através da amplificação por PCR do DNA tratado com bissulfito utilizando

pares de primers que discriminam citosinas metiladas e não-metiladas (MSP −

Methylation-Specific PCR). Um esquema das técnicas de BSP e MSP é apresentado na

Figura 1 a seguir.

Figura 1 – Esquema da determinação do status de metilação de ilhas CpG utilizando as técnicas

de BSP e MSP. Na análise de BSP (Bissulfite-Specific PCR), apenas o DNA tratado com

bissulfito é amplificado, já que o par de primers diferencia citosina não convertida em uracila

(U) da citosina convertida em U. Na análise por MSP (Methylation-Specific PCR), são

utilizados dois pares de primers, um deles específico para citosina metilada, e o outro par,

específico para citosina não-metilada. A obteção de produto indica o estado de metilação do

DNA na região dos primers utilizados.

Existe na literatura uma lista crescente de genes metilados em CCR,

incluindo VHL, p16INK4A, APC, GSTP, DAPK, CDH1I, RASSFA1, DAL-1/4.1B, γ-

catenina, SPINT2 e HOXB13 (Breault et al. 2005; Morris et al. 2005; Okuda et al. 2006;

Yamada et al. 2006). No entanto, a maioria desses genes supressores de tumor apresenta

uma freqüência relativamente baixa de metilação em CCR. Diferente de outros

27

carcinomas, as freqüências de metilação anormal da maioria dos genes supressores de

tumor clássicos, como VHL, p16, APC, GSTP, ARF, DAPK, CHFR, MLH1 e CDH1 são

menores que 30% em CCR (Herman et al. 1994; Sanz-Casla et al. 2003; Dulaimi et al.

2004; Okuda et al. 2006) sugerindo que esses genes não são provavelmente os alvos

principais para silenciamento por metilação nesse câncer. Assim, são necessários mais

estudos para identificar potenciais biomarcadores epigenéticos com um perfil de

metilação mais robusto para uso em diagnóstico ou prognóstico de CCR. Neste trabalho

foi investigado o padrão de metilação de genes com expressão diminuída em CCR com

o objetivo de avaliar a frequência de alterações epigenéticas do tipo hipermetilação da

região promotora em tumores renais.

1.6 RNAs intrônicos não-codificadores

A transcrição de RNA é a primeira etapa na transferência de informações

codificadas num genoma a fim de produzir as características fenotípicas de um

organismo. Até recentemente, o esforço de caracterização da atividade transcricional

nas células foram desenvolvidos no sentido de caracterizar a abundância e/ou variações

na sequência (polimorfismos, splicing alternativo) de transcritos codificadores para

proteínas. Estudos recentes têm demonstrado que a maior parte do genoma humano é

transcrito na forma de RNAs, embora apenas uma pequena fração (2 a 5% do total)

corresponda a regiões exônicas de genes codificadores para proteína (Shoemaker et al.

2001; Kapranov et al. 2002; Bertone et al. 2004; Cheng et al. 2005). Esses estudos são

principalmente baseados na utilização de tiling arrays genômicos, onde sondas são

colocadas em intervalos regulares ao longo de todo o genoma ou de uma região de

interesse, independente de anotação ou evidência anterior de transcrição (Shoemaker et

28

al. 2001; Kapranov et al. 2002; Bertone et al. 2004). Utilizando tilling arrays cobrindo a

seqüência genômica dos cromossomos 21 e 22, foi possível observar um número de

regiões transcricionalmente ativas entre 2 a 10 vezes maior do que o esperado para

regiões exônicas dos genes humanos conhecidos (Kapranov et al. 2002; Rinn et al.

2003; Kampa et al. 2004).

Um estudo recente realizado por nosso grupo, analisando o conjunto de

seqüências expressas no Genebank, identificou que 74% dos genes humanos apresentam

evidência de transcrição intrônica (Nakaya et al. 2007). Um oligoarray com 44 mil

elementos contendo sondas para um conjunto de transcritos intrônicos selecionados

aleatoriamente foi hibridizado com 3 tecidos humanos diferentes e revelou que esses

transcritos são expressos com orientação senso ou antisenso em frações equivalentes

(Nakaya et al. 2007). Interessantemente, os ncRNAs intrônicos mais abundantes

mapeiam em genes codificandores para proteína que têm função relacionada com a

regulação da transcrição (Nakaya et al. 2007). A análise dos dados identificou ainda

conjutos de ncRNAs totalmente ou parcialmente intrônicos com expressão tecido-

específica, alguns dos quais apresentam padrão de expressão correlacionado

(diretamente ou inversamente) com o do transcrito codificante para proteína

correspondente (Nakaya et al. 2007).

Mais recentemente, o projeto ENCODE se propôs catalogar todos os elementos

funcionais do genoma humano utilizando vários métodos de análise em larga-escala,

começando por coletar e analisar dados em 1% do genoma (~ 300 Mb) na fase piloto do

projeto. Um aspecto importante do projeto ENCODE é que estão sendo utilizadas

técnicas diferentes para se abordar a mesma questão, combinando microarrays de DNA

e técnicas de seqüenciamento com análises computacionais. Os primeiros resultados

29

obtidos nesse estudo colaborativo confirmam as observações anteriores de que uma

parte muito maior do que se acreditava do DNA genômico é transcrita na forma de

RNAs não-codificadores para proteínas (ncRNAs) (Birney et al. 2007). Embora ainda

seja desconhecida a função da maior parte dos ncRNAs, estudos em outros organismos

têm demonstrado que em mamíferos o número de RNAs não-codificadores é

substancialmente maior que em eucariotos inferiores, especialmente quando se

considera que o número de genes codificadores para proteínas não diverge

significativamente entre espécies muito distantes em termos evolutivos. Essa

observação tem sido utilizada como argumento para explicar o aumento da

complexidade dos eucariotos superiores a partir da expansão do número de ncRNAs

nesses organismos, que constituiriam uma camada adicional de elementos controladores

da expressão gênica (Mattick 2003; Mattick 2004).

Alguns ncRNAs podem produzir silenciamento transcricional através da

regulação da estrutura da cromatina. O exemplo mais clássico dessa regulação em

eucariotos é a inativação transcricional do segundo cromossomo X em fêmeas

(compensação de dose). Isto envolve um ncRNA muito grande, conhecido como X-

inactive-specific transcript (Xist). A transcrição de Xist no cromossomo X é crucial

para manutenção do estado inativo, porém seu mecanismo exato não é bem esclarecido

(Goodrich et al. 2006). Recentemente, foi mostrado que ncRNAs curtos, além de ter por

alvo a estrutura de cromatina, onde atuam para silenciar a expressão gênica, eles

também direcionam a degradação de RNA e bloqueiam a tradução. Os ncRNAs

envolvidos apresentam tipicamente 21-28 nucleotídeos de comprimento, e são

coletivamente conhecidos como microRNAs (miRNAs) e RNAs curtos de interferência

(siRNAs), cujo funcionamento se dá por meio de seqüências homólogas em genes alvos

(Almeida et al. 2005). O silencimento mediado por RNA foi inicialmente caracterizado

30

em Arabidopsis thaliana, e mais recentemente foi também identificado em células

humanas, mostrando que este mecanismo de controle de transcrição é conservado

(Almeida et al. 2005). No caso dos siRNAs, a transcrição é bloqueada quando eles,

como parte integrante de um grande complexo protéico, são direcionados para

seqüências homólogas em genes. Isto resulta no recrutamento de fatores, como a DNA

metiltransferase e a histona metiltransferase que metilam DNA e histonas,

respectivamente, resultando no silenciamento da transcrição a partir de regiões-alvo do

genoma. Os siRNAs podem portanto direcionar a regulação gene-específica de

modificações da cromatina, e assim controlar a transcrição (Almeida et al. 2005).

Análises informáticas dos bancos de dados de seqüências expressas (Yelin et al.

2003) e experimentos de tiling arrays (Kapranov et al. 2005) revelaram que uma fração

significativa dos RNAs transcritos no genoma humano formam pares senso-antisenso. A

maioria desses transcritos antisenso é codificada em cis, ou seja, são transcritos a partir

da fita oposta do mesmo loci genômico a partir de seus pares senso. Resultados

semelhantes foram observados a partir da análise do transcriptoma de camundongo,

sugerindo que a transcrição de pares senso-antisenso tenha uma função biológica

relevante e que por isso tenha sido mantida ao longo da evolução (Kiyosawa et al. 2003;

Katayama et al. 2005; Siddiqui et al. 2005).

A regulação por transcritos antisenso parece estar envolvida em muitos aspectos

da regulação gênica, incluindo regulação da tradução, imprinting genômico,

interferência de RNA, splicing alternativo, inativação do cromossomo X, edição de

RNA e silenciamento da heterocromatina (revisados em (Lavorgna et al. 2004)), além

de estados patológicos como câncer (Lavorgna et al. 2004; Reis et al. 2004) ou doenças

neurológicas (Korostishevsky et al. 2004; Korneev et al. 2005). Estudos recentes têm

31

sugerido que a regulação antisenso é provavelmente um mecanismo de regulação gênica

bastante comum em humanos, podendo atuar de modo positivo ou negativo (Chen et al.

2005; Chen et al. 2005). No entanto, os aspectos funcionais dessa regulação não estão

bem estabelecidos, de modo que a identificação de pares senso-antisenso regulados em

diferentes contextos pode lançar luz sobre os mecanismos subjacentes a esses processos.

1.7 Papel dos RNAs não-codificadores no câncer

O câncer tem sido considerado há quase três décadas como uma doença

resultante de mutações que afetam a expressão ou a estrutura de ongenes e/ou genes

supressores de tumor codificadores de proteína. No entanto, com a identificação de

genes que produzem RNAs sem uma ORF significativa, tornou-se evidente que a

complexidade do câncer não poderia mais ser abordada exclusivamente através da

porção do genoma que codifica para proteínas. Dessa mudança de paradigma, resultou a

percepção de que transcritos não-codificadores poderiam auxiliar no diagnóstico e

prognóstico do câncer. Por exemplo, as alterações no nível de expressão dos

microRNAs (miRNAs) - pequenos RNAs não-codificadores de 20-22 nucleotídeos

envolvidos em processos biológicos importantes, incluindo desenvolvimento,

diferenciação, apoptose e proliferação - foram identificadas inicialmente em leucemia

linfocítica crônica de célula B (Calin et al. 2002). O mecanismo de ação de microRNAs

no silenciamento da expressão gênica já é bastante conhecido atualmente, e envolve a

regulação transcricional e/ou pós-transcricional de mRNAs-alvo dependente de

pareamento entre o miRNA e o mRNA–alvo e ativação de sistemas enzimáticos

específicos (Bartel 2004). Alterações nos níveis de miRNAs foram posteriormente

detectadas por vários grupos em diferentes tipos de tumores humanos (Calin et al. 2004;

32

Iorio et al. 2005; Lu et al. 2005; Volinia et al. 2006). O potencial uso de microRNAs na

clínica é evidenciado pelo trabalho de Lu e colaboradores, que utilizaram o perfil de

expressão de miRNAs para classificar corretamente 12 de 17 carcinomas mal-

diferenciados, enquanto que um método baseado em apenas mRNAs classificou

corretamente somente um desses carcinomas (Lu et al. 2005).

Utilizando um microarray de DNA inovador, enriquecido em fragmentos de

seqüências expressas em íntrons de genes conhecidos e em regiões intergênicas, nosso

grupo mostrou pela primeria vez que ncRNAs intrônicos longos, sem splicing,

apresentam transcrição ubíqua no tecido prostático humano, e que os níveis de

expressão de um subconjunto desses ncRNAs intrônicos se correlacionam com o grau

de malignidade de tumores de próstata (Reis et al. 2004). Mais recentemente, nosso

grupo também mostrou que ncRNAs intrônicos regulados por andrógeno podem

modular, provavelmente agindo em cis, a abundância ou o padrão de uso de éxon em

uma linhagem celular de tumor próstata em cultura (Louro et al. 2007).

Uma característica comum a todos os trabalhos de análise da expressão gênica

em CCR baseados em microarrays de DNA é que as plataformas utilizadas estavam

enriquecidas em sondas para transcritos codificadores de proteínas. Neste estudo,

pretendemos extender a caracterização da expressão de ncRNAs intrônicos a amostras

de CCR de modo a avaliar um possível papel dessa classe de transcritos nos processos

de transformação maligna de tumores renais. Além de contribuir para o entendimento

das bases moleculares do CCR, esse estudo também pretende colaborar para a

identificação de novos marcadores tumorais, incluindo ncRNAs intrônicos, com

potencial aplicação no diagnóstico e/ou tratamento da doença.

33

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

• Analisar perfis de expressão gênica em amostras clínicas de tecido renal para

determinar o padrão de expressão de RNAs intrônicos não-codificadores.

• Identificar novos candidatos a marcadores moleculares para diagnóstico ou alvos

para tratamento de CCR.

2.2 Objetivos Específicos

• Obter perfis de expressão gênica de uma coleção de amostras de carcinoma de

célula renal e tecido não-tumoral adjacente utilizando microarrays de DNA

contendo sondas para RNAs não-codificadores intrônicos e transcritos codificadores

para proteína.

• Identificar genes diferencialmente expressos entre o tecido tumoral e não-tumoral

adjacente em amostras de CCR subtipo histológico célula clara.

• Validar a expressão de transcritos com expressão alterada em CCR por metodologia

independente (RT-PCR quantitativo).

• Avaliar o padrão de metilação da região promotora de genes com expressão

diminuída em CCR.

34

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Amostras de pacientes

Foram analisados perfis de expressão gênica de 24 amostras pareadas de tumor e

tecido não-tumoral adjacente de 12 pacientes com CCR submetidos a nefrectomia

radical no Instituto Nacional de Câncer − INCA (Rio de Janeiro, Brasil). Nos

experimentos de validação por qRT-PCR, foram analisadas 10 amostras adicionais de

tecido tumoral/não-tumoral adjacente pareadas, obtidas de 5 pacientes com CCR. As

amostras de tecido fresco foram obtidas de pacientes submetidos a nefrectomia radical,

sendo congeladas em nitrogênio líquido até cerca de 15 minutos após a ressecção

cirúrgica e mantidas nessa condição até o processamento para extração do RNA. Todos

os pacientes assinaram termo de consentimento informado autorizando a utilização das

amostras para este projeto de pesquisa, também aprovado pelo Comitê de Ética do

INCA. Posteriormente, todas os fragmentos de tecido foram revisados e classificados

por um mesmo patologista de acordo com a “WHO Histological Classification of

Tumors of the Kidney” (Eble et al. 2004) e diagnosticadas como CCR célula clara (10

amostras de tumor), CCR papilar (4 amostras de tumor), CCR cromófobo (1 amostra), 1

CCR célula clara com extensa diferenciação sarcomatóide e 1 CCR com origem não

determinada. O grau Fuhrman das amostras variou de II a IV. A maior parte dos

tumores apresentou evidência de necrose (76%) e tamanho maior que 5 cm (82%). O

estado clínico da doença se mostrou heterogêneo entre os pacientes: seis apresentaram

metástase, três apresentaram doença localmente avançada e quatro apresentaram

tumores localizados. A análise de seções coradas de tecido utilizando

35

hematoxilina/eosina (HE) mostrou que o estroma estava pouco desenvolvido entre todas

as amostras analisadas. Os fragmentos de tecido não-tumoral adjacente foram

analisados por HE para verificar a ausência de células neoplásicas. Os dados

anatomopatológicos das amostras de tumor analisadas estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 – Dados clínico-patológicos dos pacientes cujas amostras foram utilizadas nas análises

de microarray, metilação e qRT-PCR.

Paciente

n°

Grau

Nuclear

Fuhrman

Subtipo

Histológico

Dimensões

do Tumor

Primário

(cm)

Evidência

de

Necrose

Estádio

Clínico

Acompanhamento

(mêses)

Estadio da

Doença

3 IV célula clara 6 x 7 x 4 Sim pT3bN0M1 21 metastático

5 II/IV célula clara 8 x 8 x 5 Sim pT2N1M1 6 metastático

9 II célula clara 8 x 6 Sim pT3aN0Mx 54 localmente

avançado

12 II célula clara 4 x 3 x 2 Não pT1aN0Mx n.a.* localizado

15 IV célula clara 10 x 10 x 8 Sim T3N2Mx n.a. n.a.

24 IV célula clara 15 x 11 x 7 Sim pT3aN0Mx 16 metastático

26 II célula clara 7 x 6 x 5 Não T3aNXM0 58 localizado

28 III célula clara 5 x 3 x 3 Sim pT1bN0Mx 20 localizado

31 II célula clara 8 x 6 Sim pT3bN2M1 40 metastático

32 II célula clara 13 x 8 Não pT3aN0Mx 17 localmente

avançado

27 III cromófobo 7 x 6 x 3 Não pT2N0Mx 68 localizado

4 III/IV papilar 16 x 11 x 8 Sim pT3aN0Mx n.a. n.a.

14 IV papilar 8 x 7 x 6 Sim pT3bN0M0 58 localmente

avançado

16 III papilar 16 x 12 Sim pT3aN2Mx n.a. n.a.

19 III papilar 8 x 7 Sim pT3aN0Mx 49 n.a.

23 IV sarcomatóide

(célula clara)

9 x 7 Sim pT3bN0Mx n.a. metastático

22 II CCR não-

classificado

15 x 10 x 9 Sim pT3aN0Mx 7 metastático

n.a.: informação não disponível.

36

3.2 Extração de RNA e marcação de alvos fluorescentes

Para isolamento do RNA total, cerca de 200 mg de tecido das amostras

congeladas foram pulverizados em um almofariz contendo nitrogênio líquido,

ressuspendidos no reagente TRIZOL (Invitrogen), seguido por extração com

clorofórmio e precipitação com álcool de acordo com as instruções do fabricante.

Alíquotas de RNA total extraído de cada amostra foram separadas em gel de agarose

para avaliação da integridade do RNA, medida pela observação de bandas intactas

correspondentes às subunidades 28S e 18S do RNA ribossomal. A quantidade de RNA

nas frações foi estimada pela leitura da absorbância a 260 nm. O grau de pureza das

prepações de RNA em relação a contaminantes protéicos foi avaliada pela leitura e

cálculo da razão 260/280 nm. Foi definido como critério de qualidade que todas as

amostras utilizadas nas análises de microarray deveriam apresentar razão 260/280 > 1,8

e, por inspeção visual, as bandas 28S e 18S deveriam apresentar razão igual ou superior

a 1.

A marcação fluorescente das amostras de RNA para obtenção de alvos para

hibridização foi realizada através de reação de transcrição reversa, com a utilização de

primers randômicos e oligo-dT, além de análogos fluorescentes de dCTP, utilizando o

kit CyScribe first-strand cDNA labeling kit (GE Healthcare), de acordo com o protocolo

do fabricante. Esta marcação foi realizada com o uso da química Cy3 ou Cy5 de modo a

obter duas populações diferentes de cDNAs marcados, o que permitiu realizar

comparações diretas, na mesma lâmina, entre as duas amostras em estudo (RNA de

tecido tumoral ou não-tumoral adjacente do mesmo paciente). Em cada marcação foram

utilizados 10 μg de RNA total. Os cDNAs marcados foram purificados utilizando placas

de filtro (Millipore), transferidos para cubetas de quartzo e quantificados medindo-se a

37

absorbância da solução a 550 nm (Cy3) ou 650 nm (Cy5). Antes da hibridização, os

alvos de cDNA marcados com Cy3 ou Cy5 foram combinados e evaporados num

speedvac a 30ºC. Imediatamente antes da hibridização com os microarrays, os alvos de

cDNA foram ressuspensos num volume total de 300 µl de solução de hibridização

(Microarray hybridization Buffer v.2 – Amersham Biosciences) em formamida 50% e

incubados a 92ºC por 2 minutos para desnaturação do cDNA.

3.3 Hibridização de alvos fluorescentes com microarrays enriquecidos em

ncRNAs intrônicos

As sondas de cDNA depositadas no microarray foram selecionadas a partir de

uma coleção de 1 milhão de clones de ESTs gerados durante o Human Cancer Genome

Project, uma iniciativa de seqüenciamento em larga escala de ESTs que utilizou

bibliotecas de cDNA geradas a partir de mRNA com poli(A) derivado de 20 tipos

diferentes de tumores (Dias-Neto et al. 2000; Camargo et al. 2001). Após análise

bioinformática do conjunto de ESTs relacionadas com câncer, nosso grupo observou

que quase 30% das seqüências transcritas mapeavam em regiões intrônicas ou não-

anotadas do genoma humano (Reis et al. 2004). Com base na evidência de transcrição

em pelo menos 2 bibliotecas de cDNA diferentes, um subconjunto de aproximadamente

4.000 sondas de cDNA foi selecionado em nosso grupo para amplificação e deposição

em lâminas de vidro Tipo 7 STAR utilizando o robô Generation III Microarray Spotter

(GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), como descrito em Reis et al. 2004. As sondas

selecionadas incluíam 2.292 ESTs representando exons codificadores para proteínas já

relacionados com câncer identificados a partir de buscas nos bancos de dados Entrez,

OMIM e CGAP, com funções relacionadas a apoptose, carcinogênese, metástase,

38

metabolismo e progressão do câncer. Foi incluído no microarray um conjunto de clones

sem similaridade com genes conhecidos amostrados aleatoriamente, dos quais 822

foram posteriormente mapeados em regiões intrônicas de genes codificadores, e 241

em regiões intergênicas do genoma. O tamanho médio das sondas de cDNA

depositadas é de 600 pb. A incubação das lâminas de microarray com os alvos

marcados e todas as etapas de lavagem foram realizadas em um processador automático

de lâminas (ASP − GE HealthCare) a 42

o

C por 16 horas. Em cada hibridização foram

comparadas amostras de RNA de tumor e tecido não-tumoral adjacente (margem livre

de tumor) do mesmo paciente marcadas com Cy5 ou Cy3, respectivamente. Todas as

hibridizações foram feitas em duplicata, sendo que na réplica foi feita a troca do

fluoróforo entre o RNA de tumor e tecido normal adjacente (dye-swap), a fim de

controlar possíveis artefatos resultantes da incorporação preferencial de um dos

análogos fluorescentes de dCTP no resultado dos experimentos (Figura 2). Como cada

microarray contem duas réplicas para cada sonda foram geradas 4 réplicas das medidas

de intensidade de transcrito, para cada amostra analisada.

Figura 2 – Desenho esquemático das hibridizações realizadas. Amostras de tumor (TUMOR) e

de tecido não-tumoral adjacente (NORMAL) provenientes de cada paciente foram marcadas

com fluoróforos distintos (Cy 3 ou Cy5) e hibridizadas na mesma lâmina (Réplica A). Foi

realizada também uma segunda hibridização em outra lâmina (Réplica B) onde os fluoróforos

foram invertidos (“dye-swap”). Cada lâmina possui 2 cópias de todos os cDNAs depositados

(“spots”). Portanto, no total foram obtidas 4 réplicas técnicas da expressão de cada gene, para

cada tecido tumoral e não-tumoral analisado.

39

3.4 Filtragem e normalização dos dados de expressão gênica

Após a hibridização, as imagens do array foram obtidas usando o Generation III

Array Scanner (Molecular Dynamics) e visualizadas com o programa ImageQuant

(Molecular Dynamics). Um exemplo de imagem obtida é apresentado na Figura 3.

Figura 3 – Imagem representativa das hibridizações de CCR com microarray enriquecido em

RNAs não-codificadores. Lâmina do paciente P9, típica de uma hibridização de tecido tumoral

de rim (marcado com Cy3) contra tecido normal adjacente (marcado com Cy5). Na figura é

apresentado apenas o lado direito da lâmina.

As intensidades de fluorescência de Cy3 e Cy5 de cada sonda no array foram

extraídas usando o software ArrayVision (Imaging Research Inc.). Para cada lâmina, as

intensidades de Cy3 e Cy5, subtraídas do ruído (background), foram normalizadas para

remover efeitos dependentes do canal, assim como a incorporação diferencial de

40

fluoróforos pela transcriptase revesa (Quackenbush 2002) usando o algoritmo LOWESS

escrito em R (http://www.r-project.org/).

A correção por LOWESS utiliza uma função de regressão ponderada dentro de

cada intervalo pré-definido a partir da abscissa do gráfico da razão versus intensidade, R

x I , onde R = log2(Cy5 / Cy3), e I = 0,5 * log2(Cy5 * Cy3), de modo a detectar desvios

sistemáticos e corrigí-los usando aquela função de regressão (Quackenbush 2002)

(Figura 4).

Figura 4 - Normalização dos dados de expressão. A) O gráfico R-I (R = log2(Cy5/Cy3) e I =

0,5*log2 (Cy5*Cy3)) apresenta o logaritmo (base 2) da razão (Cy5/Cy3) para cada gene no chip

como uma função do produto das intensidades (I), revelando assim efeitos sistemáticos

dependentes da intensidade. B) O uso de LOWESS para corrigir a variação sistemática

observada no painel A): LOWESS calcula uma função (linha vermelha, painel A) que melhor

descreve os dados apresentados no gráfico e ajusta os mesmos para razão local média igual a 1

(igual a zero na escala logarítmica) com base naquela função.

As intensidades normalizadas por LOWESS foram então processadas no

software ArrayStat (Imaging Research Inc.) para detecção e eliminação de valores

espúrios de baixa qualidade, utilizando um modêlo de distribuição de erro estimado a

partir de todas as réplicas de todas as sondas analisadas (Figura 5). Primeiro, o

programa centraliza os dados de intensidade das 4 réplicas de cada sonda. Em seguida,

41

foram eliminadas as sondas com menos de 3 entre 4 réplicas com menos de 3 desvios

absolutos da mediana (MADs), sendo calculada a média das sondas restantes. Para cada

amostra, foi calculada a média trimada excluindo os valores 20% menores e os 20%

maiores. Média esta que em seguida foi usada para normalizar os dados entre os

experimentos e torná-los comparáveis (Spotfire Decision Site, Spotfire Inc.).

Figura 5 – Dependência entre a intensidade média e o desvio-padrão das réplicas. A linha azul

indica a função de regressão dos dados plotados entre a intensidade média (eixo X, “Mean”) e o

desvio-padrão das réplicas (eixo Y, “Standard Deviation”). Para cada faixa de intensidade, o

programa ArrayStat exclui como “outliers” as réplicas que apresentam valor maior que 3

desvios absolutos da mediana (MAD).

3.5 Identificação de transcritos diferencialmente expressos em CCR

A fim de garantir maior confiabilidade aos resultados obtidos, foram utilizados

dois programas estatísticos com a finalidade de identificar transcritos diferencialmente

expressos entre as amotras de tumor e de tecido normal, Significance Analysis of

Microarrays (SAM) (Tusher et al. 2001) e teste-Z (Nadon et al. 2002). Cada um desses

programas foi executado com base nos mesmos dados de expressão, sendo os resultados

comparados entre si a fim de identificar e selecionar para análises subsequentes apenas

42

os transcritos identificados em ambas as análises. Acreditamos que este procedimento é

bastante estringente pois considera como válidos apenas os resultados que satisfizeram

dois critérios baseados em métodos diferentes de estimativa estatística, o que diminui a

probabilidade de falso-positivos (erro Tipo I). No anexo I é apresentada uma descrição

detalhada de cada uma das abordagens estatísticas utilizadas para seleção de transcritos

diferencialmente expressos em CCR.

3.6 PCR em Tempo Real

Os níveis de expressão dos selecionados foram medidos em amostras de CCR e

tecido não-tumoral adjacente por RT-PCR quantitativo. Para evitar contaminação com

DNA genômico, alíquotas de RNA total (2 μg) foram tratadas com 1 unidade de DNAse

RQ1 sem RNAse (Promega) por 30 minutos a 37ºC num volume de 15μl na presença de

20 unidades de inibidor de ribonuclease RNasin (Promega). Para os transcritos

exônicos, foram usados 2 μg de RNA total para gerar cDNA em reações de 20 μl

contendo 1 unidade de Superscript III (Invitrogen) e primers oligo-dT. Para os

transcritos intrônicos, o RNA total tratado com DNAse (~600 ng), obtido com o kit de

purificação RNAeasy (Qiagen), foi linearmente amplificado para produzir RNA

complementar (cRNA) (Adams et al. 2000; Wang et al. 2000). Em torno de 600 ng de

cRNA foram subseqüentemente usados como "template" em reações de transcrição

reversa usando como iniciadores primers de 9 oligonucleotídeos aleatórios.

Para quantificação relativa da abundância dos transcritos exônicos e intrônicos

nas amostras de tumor e tecido não-tunoral adjacente foram utilizados 2,5 μl do cDNA

obtido por transcrição reversa como "template" em reações de PCR em tempo real (20

μl de volume total) num equipamento GeneAmp 5700 (Applied Biosystems) usando o

43

kit SYBR Green PCR e seguindo as instruções do fabricante (Applied Biosystems).

Para cada amostra, como controle negativo foi feita uma reação paralela sem adição de

transcriptase reversa para verificar a ausência de contaminação genômica. Os primers

usados no PCR em tempo real estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3- Primers usados para PCR em tempo real.

Locus gênico

Mapeamento em

Éxon/íntron

Seqüência

SND1 íntron F: CTTCGTAATTCGTGCCTTATCAGA

R: GGAGTGAATAGGAAAGCAAGCAA

HDAC5

íntron F: GCCTGTGCTTCCTGTTTGC

R: TCTCCCACCAGCCTGTCACT

ACTN4 íntron F: AGGAGTCAGGGACTGACCTCTGT

R: CATGCTGCGGGACACACA

NIBP

íntron F: TGATTGGTCTGTGCTGTCTTTCA

R: GCCTTCACATCACAGCTCAGAA

SYNJ2BP éxon F: TGGATCCA GCTATTTGGTTTGA

R: CCAAGTATGTAACCAACAATAGAAGAAGTAG

SIN3B éxon F: CTCGATCTCGTTGAGCAAGCT

R: AGGCTGTGAACTTCAAGCAGAAC

TRIP3 éxon F: AATAGTGATGAGGAAGAAGACAGAGTTTC

R: ACCATCAACTGCCTGAGGTGT

MYH11 éxon F: GACCTGGTCAGCTCCAAGGAT

R: GCTGCGTCTTCATCTCCTCC

NDE1 éxon F: CAGCAAGAACAGAGATGGCG

R: GACCTGGTTGTT GATTTGGACA

F: seqüência direta; R: seqüência reversa.

Para a quantificação relativa dos transcritos nas várias amostras, os níveis de

cada transcrito detectado por PCR quantitativo em tempo real foram normalizados

tomando como referência o nível do gene estrutural β-tubulina, e representado como

variação usando o método ΔCt (Pfaffl 2001). Para cada par de amostras pareadas, os

níveis de transcrito na amostra de tumor foram expressos na amostra de tumor como

44

variação relativa ao valor no tecido não-tumoral adjacente, o qual foi considerado como

sendo igual à unidade.

3.7 Análise de Metilação

O programa MethPrimer (Amin et al. 2002) foi utilizado para identificar as

ilhas CpG em trechos de 1.000 nucleotídeos flanqueando cada lado do sítio de início de

transcrição dos genes selecionados (parâmetros: extensão da janela ≥ 200 nt, %GC ≥ 55,

CpG obervado/CpG esperado ≥ 0,65), e para desenhar primers para amplificação por

PCR de ilhas CpG identificadas usando DNA modificado por bissulfito. Os critérios

para seleção dos primers utilizados para amplificação e seqüenciamento das ilhas CpG

identificadas dos genes foram basicamente os mesmos critérios utilizados para seleção

de primers num PCR convencional: evitar formação de self-annealing e

complementaridade entre os primers forward e reverse, conteúdo GC e temperatura de

desnaturação (Tm). O programa leva em consideração que no caso de uma seqüência

tratada com bissulfito, todas as citosinas não-metiladas são transformadas em uracilas,

que por sua vez são transformadas em timina na reação de PCR. Em virtude desse

tratamento, que resulta no aumento do número de timinas, o programa restringe o

número de repetições consecutivas de bases “T” a no máximo oito, enquanto que para

os outros nucleotídeos o padrão é cinco. Além disso, como a modificação por bissulfito

nem sempre é completa, é importante a amplificação seletiva apenas de seqüência

totalmente tratada. Para tanto, é necessário desenhar os primers a partir de uma região

com número suficiente de citosinas não-CpG na seqüência original não-tratada.

45

Os primers usados para amplificação de fragmentos de DNA modificado por

bissulfito estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4 - Primers usados em BSP

Gene Seqüência

Temperatura de

Anelamento (°C)

Tamanho

do amplicon

(pb)

SIN3B (1A) F: GAAAGTAGGTAGAGAAGTTAGGTAAA

R: ATACTCTTTAAAAAACTCTTCTAAAAACCT

55 284

NDE1 F: GTAGAGTAGTAGTTAATGGGAGG

R: AACAAAAAAACTTTTCAACC

51 212

SIN3B (1B) F: AATTATTAATTATGATATTAATTTTAAGGA

R: AAATCCAAAAAATAAATTCCCC

55 331

SIN3B (2) F: GGGGAATTTATTTTTTGGATTT

R: AAATACTACCCATTTCCATTTTTATTAC

57 507

SYNJ2BP

F: TTATTTTATGTTTGGTTTTGGGAAT

R: ACCCTCTAATAAAATTAATCTCTTCCTC

65 287

TRIP3 F: TTTTGTTAAGAATAAGTAGATGAGATGG

R: TTAAACTTCTCCAAACAAATCAC

55 500

GPX3 F: TGTTTAGATTTGTTTATGTTATTGT

R: CCTAAAAATTACCCATCTAAC

51 441

F: seqüência direta; R: seqüência reversa.

O perfil de metilação das regiões promotoras preditas dos genes selecionados

como sub-expressos em CCR (SIN3B, NDE1, SYNJ2BP, GPX3 e TRIP3) foi avaliado

em amostras pareadas (tecido tumoral e não-tumoral adjacente) de 4 pacientes com

CCR (P9, P15, P27 e P32). O DNA foi isolado e submetido a tratamento com bissulfito

basicamente como descrito em (Jeronimo et al. 2001). Este tratamento converte as

citosinas não-metiladas em uracila, que é então convertida em timidina durante a etapa

de PCR subseqüente, resultando em diferenças entre DNA metilado e não-metilado, que

são por conseguinte analizados por seqüenciamento dideoxi. Inicialmente, 2 μg de DNA

genômico foram desnaturados em 500 μL de solução bissulfito (1,4 ml NaOH 3 M +

500 μL hidroquinona 1 M + 5 mL bissulfito 3 M) por 3 horas a 70°C. Em seguida, o

46

DNA modificado por bissulfito foi purificado usando Wizard™ DNA Cleanup System

(Promega) seguido por precipitação em etanol. O PCR foi realizaod em 25 μL de

volume total contendo 2 μL de DNA modificado por bissulfito, 2,5 μL de tampão PCR,

2,0 μL de deoxinucleotídeo trifosfatos 2,5 mM, 0,5 μL de cada solução 20 μM de cada

primer e 0,2 μL Platinum

®

Taq DNA Polymerase (Invitrogen). O PCR foi realizado em

40 ciclos como segue: 95°C por 1 minuto, 95°C por 30 segundos, anelamento a 52-65°C

por 45 segundos, 68°C por 45 segundos e uma extensão final a 68°C por 1 minuto. Para

cada amostra testada, o DNA não-tratado foi testado em paralelo como controle

negativo no ensaio. Os produtos de PCR foram separados em gel de agarose 1%, corado

com brometo de etídio e visualizado sob luz UV. Os produtos de PCR foram purificados

e seqüenciados pelo método dideoxi usando um seqüenciador ABI Prism 3700 DNA de

modo direto (GPX3) ou após clonagem no vetor de seqüenciamento pGEM T-Easy

(Promega) (SIN3B, NDE1, SYNJ2BP, TRIP3). Foram gerados cinco a doze leituras

(reads) para cada produto gênico seqüenciado, para cada amostra. Caso não fosse

detectada evidência de metilação de CpG nas primeiras duas amostras tumorais

analisadas, o gene foi considerado como não regulado por metilação e nenhum

seqüenciamento adicional foi realizado.

47

4. RESULTADOS

4.1 Avaliação da qualidade das hibridizações realizadas

A precisão das medidas de expressão é dada por altos coeficientes de correlação

entre as réplicas técnicas no mesmo slide (intra-slide) ou numa hibridização diferente

(inter-slide) após a normalização. A correlação média das réplicas intra-slide das 24

amostras hibridizadas foi de 0,98 +

0,03 e a média das correlações inter-slides foi de

0,82 +

0,12. Vale notar que foi também observada alta correlação média entre medidas

de amostras diferentes, o que indica que os níveis de expressão da maior parte dos

transcritos são relativamente constantes entre as amostras (correlação média de 0,79 +

0,12). A Figura 6 mostra os valores individuais de correlação entre as amostras. Pode-

se observar que a maior parte das correlações com valores menores que 0,7 (células

hachuradas em vermelho) foram melhoradas após a normalização por LOWESS.

Figura 6 – Matriz de correlação das medidas de intensidade. A matriz apresenta o coeficiente

de correlação de Pearson entre cada par de amostras utilizando os respectivos dados de

intensidade. Foram considerados apenas os spots que apresentaram intensidade maior que o

sinal do background. Em azul, as correlações maiores que 0,7, e em vermelho, aquelas menores

que 0,7. São mostrados os valores antes da normalização (triângulo inferior) e após a

normalização (triângulo superior).

48

As altas correlações médias observadas após normalização inter-slide foram

independentes do estado patológico do tecido (tumor ou tecido normal adjacente), sendo

a correlação média inter-slide das amostras igual a 0,84 + 0,06 e 0,84 + 0,05 para

amostras de tumor e de tecido não-tumoral adjacente, respectivamente. Os valores de

correlação observados são altos, especialmente para uma plataforma de cDNA espotado,

e indicando uma elevada reprodutibilidade das medidas de expressão geradas. Essa

análise indicou que os dados de expressão gênica de tecidos tumorais e não-tumorais

dos 12 pacientes hibridizados apresentavam qualidade adequada para a as análises

subsequentes.

4.2 Expressão de RNAs intrônicos em CCR

A expressão dos ncRNAs representados no microarray foi avaliada nas 24

amostras isoladas de tumor ou tecido renal não-tumoral adjacente de 12 pacientes com

CCR. Para serem consideradas expressas numa dada amostra, a intensidade da sonda

tinha que exceder um limiar definido pela intensidade média mais três desvios-padrões

de um conjunto de spots contendo DNA de planta, sem similaridade com sequências

humanas, utilizados como controles de hibridização inespecífica nos experimentos

(controles negativos de hibridização).

Foi observado que uma fração comparável de transcritos intrônicos, intergênicos

e exônicos são detectados nas amostras de rim com neoplasia ou não-tumorais, sendo

que quase 80% das sondas em cada classe de transcritos (intrônicos, intergênicos e

exônicos) estão expressas em pelo menos 5 amostras, independente da histologia da

amostra analisada (tumor ou tecido não-tumoral adjacente) (Figura 7).

49

Figura 7 - Expressão de transcritos codificadores para proteínas, e ncRNAs intrônicos e

intergênicos em tecido renal. As lâminas de microarray foram hibrizadas com 24 amostras

pareadas de tumor e tecido não-tumoral adjacente. Para ser considerada como expressa, cada

sonda teria que apresentar intensidade pelo menos 3 desvios absolutos da mediana acima do

sinal mediano de ruído dos controles negativos. A percentagem de sondas expressas em cada

uma das 3 classes de transcritos (exônicos, intrônicos ou intergênicos) se refere ao número

mínimo de amostras de tumor ou tecido não-tumoral adjacente em que a expressão foi

observada. O número total de sondas em cada classe é mostrado entre parênteses.

Em seguida, foram avaliados os valores de intensidade média nas três classes de

transcritos exônicos, intrônicos e intergênicos, expressos em pelo menos a metade das

amostras, os quais apresentaram valores de intensidade média de 5,7, 4,7 e 3,2,

respectivamente. Portanto, observamos uma intensidade média menor dos transcritos

não-codificadores, sugerindo uma menor abundância desses transcritos no tecido renal

em comparação aos transcritos codificadores para proteínas.

4.3 Identificação de genes diferencialmente expressos

Para identificar genes alterados no subtipo histológico mais prevalente de CCR,

o perfil de expressão de 6 amostras de CCR célula clara foi comparado de forma

pareada com o de 6 amostras não-tumorais adjacentes. A fim de reduzir o número de

falso-positivos (erro tipo I), foram utilizadas duas abordagens estatísticas independentes

50

(teste Z e o SAM). A intersecção de 181 transcritos diferencialmente expressos

identificados por SAM (FDR < 10%) com uma lista de 227 transcritos identificados por

teste Z (p < 0,001) resultou num conjunto de 83 transcritos identificados em ambas

análises, incluindo 8 seqüências que mapeiam em regiões intrônicas (Figura 8 e Tabela

5).

Figura 8 - Perfil de expressão de CCR célula clara. Heat map dos níveis de expressão de 83

genes (linhas) que apresentaram níveis de expressão significativamente alterado (p < 0,001 e

FDR < 10%) entre 12 amostras pareadas de tumor (T) e tecido não-tumoral adjacente (N) de 6

pacientes com CCR célula clara (colunas). Para cada transcrito, os valores de expressão relativa

são apresentados como log

2

(T/N): vermelho indica expressão maior em tumor; azul, expressão

maior em tecido não-tumoral adjacente. Os trancritos intrônicos são indicados por setas e são

referidos pelo nome do gene no qual eles mapeiam.

51

Tabela 5 - Relação dos 83 transcritos diferencialmente expressos em CCR.

Probe

accession

Locus Gênico

Mapeamento

em

Éxon/Íntron

Log2

(T/N)

Anotação

Validação

por LOO

Alterado

em CCR

não-

célula

clara

AW83703

6

GPX3 Exônico -3,7 Glutathione peroxidase 3 6/6 não

AW88343

9

PRKAG1 Exônico -2,8 AMPK-gamma1 5/6 sim

AW60339

5

YEATS4 Exônico -2,5 Glioma amplified sequence 41 5/6 sim

AW36502

7

CSNK1G2 Exônico -2,5 Casein kinase 1, gamma 2 6/6 sim

AW93599

8

FUS Exônico -2,5 Fusion t(12;16) in malignant

liposarcoma)

6/6 sim

BF751544 ICT1 Exônico -2,5 Immature colon carcinoma

transcript 1

5/6 sim

AW84274

8

SIN3B Exônico -2,4 SIN3 homolog B, transcription

regulator (yeast)

6/6 sim

CK327135 SYNJ2BP Exônico -2,4 Synaptojanin 2 binding protein 5/6 sim

BF087349 MAP3K7IP1 Exônico -2,4 Mitogen-activated protein kinase

kinase kinase 7 interacting

protein 1

5/6 sim

BF368747 SLC2A1 Intrônico -2,4 Solute carrier family,member 1 6/6 sim

BF922962 CTSB Exônico -2,3 Cathepsin B 5/6 sim

BE762727 FVT1 Exônico -2,3 Follicular variant translocation

gene

5/6 sim

BG876687 MYH11/NDE1 Exônico -2,3 Myosin heavy chain, smooth

muscle isoform / NUDE1

6/6 sim

AW17599

1

FLJ34165 Exônico -2,3 CDNA FLJ34165 fis, clone

FCBBF3014770

5/6 sim

BF890754 UQCRH Exônico -2,2 Ubiquinol cytochrome c reductase

hinge protein

5/6 sim

AW75312

8

P2RY1 Exônico -2,2 Purinoceptor P2Y1 5/6 sim

BF857797 C10orf104 Exônico -2,1 Chromosome 10 open reading

frame 104

6/6 sim

AW83674

7

EPAS1

Exônico -2,1 Endothelial PAS domain protein 1 6/6 sim

AW37394

3

CAPNS1 Exônico -2,0 Calpain, small subunit 1 6/6 sim

BF378949 RAB27A Exônico -2,0 RAB27A 5/6 sim

BE697369 C16orf34 Exônico -2,0 Chromosome 16 open reading

frame 34

6/6 sim

AW36443

5

LDLRAD3 Exônico -2,0 Hypothetical protein LOC143458 6/6 sim

AW88467

5

MTMR9 Exônico -2,0 Myotubularin related protein 9 5/6 sim

AW86249

1

KIAA0984 Exônico -2,0 Hypothetical protein LOC23329 5/6 não

BF892704 GSN Exônico -1,9 Gelsolin 6/6 sim

BF831599 VRK2 Exônico -1,9 Vaccinia related kinase 2 5/6 não

BF089987 SND1 Intrônico -1,8 Staphylococcal nuclease and tudor

domain containing 1

6/6 não

BF155287 SRF Exônico -1,7 Serum response factor 5/6 não

52

BF882783 ACTN4 Intrônico -1,7 Actinin alpha 4 5/6 não

BF898656 TRIP3 Exônico -1,6 Thyroid hormone receptor

interactor 3

6/6 sim

BQ349967 PRDX3 Exônico -1,6 Peroxiredoxin 3 6/6 não

BF736784 SFPQ Exônico -1,6 Splicing factor proline/glutamine-

rich

5/6 não

AW81977

0

RAB4A Exônico -1,6 Ras associated protein Rab4 5/6 não

AW36926

5

ERCC5 Exônico -1,5 Excision repair, group 5 6/6 não

BF891123 TFEC Exônico -1,5 Transcription factor EC 6/6 não

BE836304 NR4A3 Exônico -1,5 Nuclear receptor subfamily 4,

group A, member 3

6/6 não

BF333281 NIBP Intrônico -1,4 NIK and IKK binding protein 5/6 não

AW88317

5

CASP7 Exônico -1,3 Caspase 7 5/6 sim

BE816027 TFDP2 Exônico -1,3 Transcription factor DP2 5/6 não

BF365294 TACC1 Intrônico -1,3 Transforming, acidic coiled-coil

containing protein 1

6/6 não

BF751539 FOXK2 Exônico -1,2 Forkhead box K2 5/6 não

BE153247 MBD2 Exônico -1,2 Methyl CpG binding domain

protein 2

5/6 não

BF990000 ENPP1 Exônico -1,2 Ectonucleotide

pyrophosphatase/phosphodiesteras

e 1

5/6 não

BE720500 S100A2 Exônico -1,1 S100 calcium binding protein A2 5/6 não

BF946916 CHEK1 Exônico -1,0 Cell cycle checkpoint kinase 5/6 não

BF856925 WDR23 Exônico -1,0 WD repeat domain 23 5/6 não

AW36106

4

PICALM Exônico -1,0 Phosphatidylinositol binding

clathrin assembly protein

5/6 não

AW85997

9

FLJ39067 Exônico -1,0 CDNA FLJ39067 fis, clone

NT2RP7014910

5/6 não

BQ366120 PRCC Exônico -1,0 Renal cell carcinoma, papillary 1 5/6 não

BE697269 SH3PX3 Exônico -0,9 Hypothetical protein MGC32065 5/6 não

BF922401 EPB41 Exônico -0,9 Erythrocyte membrane protein

band 4,1

5/6 não

AW93942

1

MAP2K3 Exônico -0,9 Mitogen-activated protein kinase

kinase 3

4/6 não

BQ314686

MSH3 Exônico -0,9 MutS homolog 3 5/6 não

BF946928 DEPDC5 Exônico -0,9 DEP domain containing 5 5/6 não

BG010306 HDAC5 Intrônico -0,9 Histone deacetylase 5 5/6 não

BF994346 NDC80 Exônico -0,8 Kinetochore complex component

(S. cerevisiae)

4/6 não

BF360792 RAB25 Intrônico -0,8 Ras associated protein RAB25 4/6 não

BF082556 Intergênico -0,7 4/6 não

BQ338721 MCM2 Exônico -0,6 Minichromosome maintenance

protein 2

3/6 não

BF092089 TCF3 Exônico -0,6 Transcription factor 3 4/6 não

BE163794 ZBED4 Exônico -0,5 Zinc finger BED domain

containing 4

3/6 não

AW74871

4

ZNF447 Exônico -0,4 Hypothetical protein FLJ12895 5/6 não

BE697330 SAT2 Exônico -0,4 Spermidine/spermine N1-

acetyltransferase 2

4/6 não

AW83704

3

IL11RA Exônico -0,4 Interleukin 11 receptor alpha 4/6 não

53

BF087474 GAA Exônico 0,1 Lysosomal alpha glucosidase 3/6 não

AW85212

5

AK055564 Exônico 0,1 AK055565 3/6 não

BE935243 MDM2 Exônico 0,1 Transformed 3T3 cell double

minute 2

2/6 não

AW79606

6

TP53I3 Exônico 0,1 p53 induced gene 3 2/6 não

BG005977 MLLT7 Exônico 0,1 Myeloid/lymphoid, translocated to

7

3/6 não

BE070310 SDC2 Exônico 0,1 Syndecan 2 2/6 não

BF810617 ADORA2A Exônico 0,1 Adenosine A2 receptor 2/6 não

BF871631 FOXK1 Exônico 0,1 Forkhead box K1 3/6 não

BF957566 TMF1 Exônico 0,1 TATA element modulatory factor

1

2/6 não

BF949348 TCF2 Exônico 0,3 Transcription factor 2 2/6 não

BE837647 POFUT2 Exônico 0,3 Protein O-fucosyltransferase 2 5/6 não

BF987726 H2AFY Intrônico 0,3 H2A histone family member Y 5/6 não

BE702107 MAP4 Exônico 0,6 Microtubule associated protein 4 5/6 não

AW88061

4

RBMX Exônico 0,7 RNA binding motif protein, X-

linked

5/6 não

BF997724 PAPPA/AY623011 Exônico 0,7 Pregnancy associated plasma

protein A / DIPLA1-antisense

mRNA

5/6 não

BF328211 AK091566 Exônico 1,1 AK091566 5/6 não

AW90112

7

ARNTL Exônico 1,1 Aryl hydrocarbon receptor nuclear

translocator-like

5/6 não

AW37737

0

POLL Exônico 1,1 DNA polymerase lambda 5/6 não

AW38394

7

CD68 Exônico 1,7 CD68 antigen 6/6 não

Para limitar a contribuição individual das amostras analisadas para a

identificação de genes diferencialmente expressos em CCR célula clara, realizamos uma

análise de leave-one-out, que consiste na retirada de um paciente do conjunto analisado

e a subseqüente reanálise dos pacientes remanescentes em cada ciclo, obtendo-se assim

um conjunto de genes diferencialmente expressos para cada ciclo de leave-one-out. Por

fim, é obtida uma freqüência com que cada gene é identificado no conjunto dos ciclos.

Assim, observamos que 64 dos 83 transcritos (77%), inicialmente identificados como

diferencialmente expressos por teste Z e SAM, estavam também presentes em pelo 5

dos 6 ciclos possíveis de leave-one-out.

Em seguida, foi avaliado se os transcritos identificados como diferencialmente

expressos em CCR célula clara estavam também alterados em outros estados ou

54

subtipos histológicos de CCR. Para isso, analisamos os perfís de expressão de um

conjunto adicional de 12 amostras pareadas de pacientes com CCR, incluindo quatro

amostras de CCR papilar, uma amostra de CCR célula clara, mas com extenso

componente sarcomatóide e uma amostra de CCR de origem não-classificada (ver

Tabela 2). Esta nova análise resultou em um conjunto de 104 transcritos com níveis

significativamente alterados utilizando SAM (FDR = 5%) em tumor em comparação ao

tecido não-tumoral adjacente. A análise de leave-one-out das amostras de CCR não-

célula clara identificou 84 transcritos presentes em pelo menos 5 de 6 ciclos de leave-

one-out.

O cruzamento desta lista de 84 transcritos com a lista de 64 transcritos obtida

após leave-one-out das amostras de CCR célula clara resultou na identificação de 25

transcritos alterados em amostras de CCR independente do estado de diferenciação ou

subtipo histológico (Tabela 5, Figura 9).

Figura 9 - Perfil de expressão de CCR independente do subtipo histológico. Heat map dos

níveis de expressão de 25 genes (linhas) comuns resultantes do cruzamento do conjunto de 64

genes obtidos por leave-one-out em CCR célula clara e o conjunto de 84 genes obtidos por

leave-one-out em CCR não-célula clara. Para cada transcrito, os valores de expressão relativa

são apresentados como log

2

(T/N): vermelho indica expressão maior em tumor; azul, expressão

maior em tecido não-tumoral adjacente. Os trancritos intrônicos são indicados por setas e são

referidos pelo nome do gene no qual eles mapeiam.

55

A significância da sobreposição destas duas listas de genes foi avaliada por 1

milhão de amostragens aleatórias com reposição, resultando numa alta significância

estatística (p < 10

-6

), indicando que a sobreposição dos 25 genes não foi ao acaso.

Entre os 25 transcritos identificados, observamos transcritos mapeando em

regiões intrônicas dos genes SLC2A1 ou TACC1 (Figura 10).

Figura 10 – Locus genômico de TACC1 e SLC2A1. A; Região genômica do cromossomo 1

contendo o locus de SLC2A1. A seta vermelha indica a seqüência depositada no microarray que

corresponde a um fragmento do transcrito de SLC2A1. B; Região genômica do cromossomo 8

contendo o locus de TACC1. A seta vermelha indica o fragmento depositado no chip do

transcrito de TACC1. Observe que em A o transcrito depositado no chip é unspliced, enquanto

que em B temos um transcrito spliced.

A

B

56

Nenhum dos RNAs intrônicos identificados com expressão alterada em CCR

apresenta potencial codificante, segundo análise realizada utilizando o programa

ESTScan (Iseli et al. 1999). Para investigar se os RNAs intrônicos são transcritos

primários não processados que poderiam gerar RNAs pequenos regulatórios já

descritos, a seqüência dos RNAs intrônicos alterados em CCR foi comparada com a de

346 snoRNAs (Lestrade et al. 2006) e 383 microRNAs (Griffiths-Jones et al. 2006)

documentados na literatura. Não foi observada similaridade entre os ncRNAs intrônicos

e as sequências de snoRNAs e microRNAs conhecidos, o que não significa que os

ncRNAs intrônicos não possam representar precursores de pequenos RNAs regulatórios

ainda não descritos.

Durante as análises, chamou-nos atenção a predominância de genes diminuídos

em tumor em comparação ao número de genes aumentados relativamente ao tecido não-

tumoral adjacente (Figuras 8 e 9). Assim, levantamos a hipótese de que o efeito

observado poderia ser decorrente de uma maior degradação do RNA mensageiro nas

amostras de tumor relativamente ao tecido não-tumoral adjacente. Nesse caso,

esperaria-se observar uma maior fração de genes aparentemente diminuídos no tumor

quando as amostras pareadas tumor/tecido não-tumoral adjacente fossem analisadas

individualmente. Para tanto, consideramos como diferencialmente expresso todo gene

cujo log

2

(T/N) fosse diferente de 0 (zero), onde T = expressão média normalizada do

57

gene no tecido tumoral e N = expressão média normalizada do gene no tecido não-

tumoral adjacente. Em seguida, computamos a fração resultante do número de genes

com expressão aumentada sobre o número de genes com expressão diminuída para cada

par de amostras de um mesmo paciente. Na Figura 11 estão plotadas a fração entre o

número de genes com expressão aumentada/diminuída em função do número mínimo de

amostras em que um dado gene foi identificado como diferencialmente expresso. Essa

análise sugere que, nas amostras de tumor, o maior número de genes diminuídos em

relação aos genes aumentados não é efeito de nenhuma amostra em particular, já que

esse efeito aumenta à medida que aumenta o número mínimo de amostras consideradas,

ou seja, esse efeito não parece depender de nenhuma amostra específica (Figura12).

58

Figura 11 – Genes diferencialmente expressos em um maior número de amostras pareadas

tendem a estar diminuídos em CCR. O gráfico apresenta a razão entre o número de genes

aumentados e diminuídos em tumor relativamente ao tecido não-tumoral adjacente em função

do número mínimo de amostras em que a expressão diferencial do gene é observada. Foi

considerado como diferencialmente expresso todo gene cujo log2(T/N) fosse diferente de 0

(zero), onde T = expressão média normalizada do gene no tecido tumoral e N = expressão média

normalizada do gene no tecido não-tumoral adjacente.

Levantamos em seguida uma outra hipótese, a de que, eventualmente, o maior

número de genes com expressão diminuída em tumor poderia se dever a artefatos

durante a marcação dos alvos fluorescentes de cDNA. Por exemplo, a existência de

incorporação preferencial de um dos fluoróforos nas amostras de tecido não-tumoral

adjacente poderia resultar, apesar da normalização por LOWESS e do desenho

experimental baseado em dye-swap, numa aparente predominância de expressão

diminuída em amostras de tumor. A marcação desigual do RNA poderia ser resultante

tanto da quantidade de fluoróforo incorporado na molécula quanto do efeito da emissão

desigual de fluorescência dos corantes Cy3 e Cy5, visto que a intensidade de emissão de

fluorescência de Cy3 é maior que a de Cy5. Para descartar essa possibilidade de

59

marcação desigual, refizemos as análises da Figura 11 utilizando os dados de cada

réplica separadamente, ou seja, de modo que as amostras de tumor dessa vez fossem

analisadas de acordo com o fluoróforo com que a mesma foi marcada (tumor-Cy5/não-

tumor-Cy3 e tumor-Cy3/não-tumor-Cy5). Caso houvesse algum efeito do fluoróforo

não corrigido pelo normalização LOWESS, poderíamos esperar que quando as amostras

de tumor fossem marcadas com Cy3, observaríamos uma predominância de genes

aumentados em tumor relativamente ao tecido não-tumoral adjacente, já que esse

fluoróforo emite com maior intensidade. Ao contrário, quando as amostras de tumor

fossem marcadas com Cy5, haveria predominância de genes diminuídos em tumor. No

entanto, o resultado dessa nova análise confirmou que independentemente do fluoróforo

utilizado, observa-se uma tendência de maior número de genes diminuídos em tumor à

medida que se aumenta a estringência das análises (Figura 12), sugerindo que o maior

número de genes diminuídos em relação aos aumentados em tumor não é decorrente de

um artefato da técnica.

60

Figura 12 – Avaliação dos genes alterados em CCR segundo a marcação com Cy3 ou Cy5. O

gráfico apresenta a razão entre o número de genes aumentados e diminuídos em tumor

relativamente ao tecido não-tumoral adjacente em função do número mínimo de amostras. Foi

considerado como diferencialmente expresso todo gene cujo log

2

(T/N) fosse diferente de 0

(zero), onde T = expressão média normalizada do gene no tecido tumoral e N = expressão média

normalizada do gene no tecido não-tumoral adjacente.

Fizemos ainda uma outra análise comparando estudos publicados de microarray

com amostras de CCR. Para isso, foram utilizados dados publicados de Lenburg et al.

(Lenburg et al. 2003), onde são comparados genes diferencialmente expressos

identificados em comum em pelo menos três estudos com CCR utilizando microarrays

(Figura 13). De 113 genes identificados como diferencialmente expressos em pelo

menos três trabalhos, 82 apresentaram expressão diminuída em CCR (73% dos genes

diferencialmente expressos). Esta observação está de acordo com nossos resultados, ao

mostrar a tendência de identificação de um maior número de genes diminuídos em

tumor comparativamente ao tecido não-tumoral adjacente.

61

4.4 Validação por RT-PCR em tempo real

Inicialmente, foram selecionados cinco transcritos codificadores (SIN3B, TRIP3,

SYNJ2BP, SDC-2 e MYH11) para validação por RT-PCR em tempo real da expressão

diferencial em CCR detectada nos experimentos de microarray. Estes experimentos

confirmaram que os transcritos exônicos de TRIP3 (p < 0,01), SYNJ2BP (p < 0,01) e

SIN3B (p < 0,02), apresentaram níveis significamente reduzidos em amostras de CCR

em comparação ao tecido não-tumoral adjacente (Figura 14, painéis A, B e C,

respectivamente), enquanto aqueles de MYH11 apresentaram níveis aumentados em

tumor (p < 0,02) (Figura 14, painel D). A amplificação de SDC-2 não resultou numa

banda única de RT-PCR, não sendo portanto confirmada sua expressão aumentada nas

análises de microarray.

62

Figura 13 – Genes com expressão alterada em CCR identificados em estudos de expressão

gênica em larga-escala. A figura mostra genes identificados como diferencialmente expressos

em pelo menos três estudos com microarrays analisando amostras de CCR. Nas colunas estão

os estudos, e nas linhas, os genes comuns diferencialmente expressos. Foram identificados 31

genes aumentados em tumor contra 82 genes diminuídos. Os estudos analisados foram Gieseg et

al., 2002; Young et al., 2001; Higgins et al., 2003; Takahashi et al., 2001; Boer et al., 2001 e

Lenburg et al, 2003. Figura adaptada de Lenburg et al. (2003).

Giesig Young HIggins Takahashi Boer Lenburg Giesig Young HIggins Takahashi Boer Lenburg

IGF BP3 HIBCH

ASS FLJ12541

SERPINA5 CLDN1 0

MAL SELENBP1

VEGF PECI

FBP1 FLJ10761

FLJ20920 GPD1

MT1H FLJ20315

SUCLG1 TAP1

GATM FTCD

SORD SFXN2

ANGP TL4 TIMP1

Hs.21103 DKFZP58 6B1621

ALDOB SIPL

LOX NP

KL LOC92840

PLOD2 GGH

GLYAT MGC2827

MT1L GCHFR

CALB1 Hs.18612

KNG FLJ14957

DPEP1 SLC27A2

KCNJ15 ALD H8A 1

VWF Hs.27092

CXCR4 PDZK1

HPD APOE

PCK2 HGD

TACS TD2 RGS5

SEMA3B LRP2

HSD11 B2 C3

DDC CTSH

GPC3 IF

EGF SULT1C1

SLC13A3 ATP6V1B1

PCK1 CSPG2

GPX3 C1QB

S100A2 GBP2

ADH6 IN HBB

SLC22A3 LGALS9

GRB14 LST1

MT1G FOLR1

EGLN3 FGF1

Hs.238927 ALDH6A1

CAV1 FABP1

RGS1 hS.381097

PLG SFRP1

APOC1 PAH

ALDH4A1 PCCA

PIPOX CA2

ACADS B FLJ12783

TNFAIP6 ARHGDIB

FN1 PVALB

HLA-DQB1 VIM

KIAA1949 FCGR3A

GABARAPL1 TGFA

BPHL ANXA1

PTR4

Gene com expressão aumentada em tumo

r

Gene com expressão diminuída em tumo

r

Gene ausent

e

63

Figura 14 – Expressão por Real-Time PCR de candidatos a marcadores de CCR. Os níveis

relativos de transcritos exônicos (A−D; TRIP3, SYNJ2BP, SIN3B, MYH11, e NDE1) e

intrônicos (E; ACTN4 e SND1) selecionados em amostras de tumor em comparação ao tecido

não-tumoral adjacente do mesmo paciente foram determinados por RT-PCR em tempo real. As

diferenças significativas são marcadas com um asterisco. A; TRIP3 (p < 0,01); B; SYNJ2BP (p <

0,01); C; SIN3B (p < 0,02); D; MYH11 (p < 0,02), NDE1 (p < 0,02); E; ACTN4 (p < 0,05),

SND1 (p < 0,05). Para cada gene, os ensaios foram realizados em triplicata. São mostrados os

valores médios com as respectivas barras de erro. Para cada gene testado, foi usado o gene

housekeeping TUB-B como referência para normalização.

Embora significativo, o aumento dos níveis transcricionais de MYH11 em CCR

analisado por RT-PCR em tempo real não concordou com os resultados de microarray,

que mostraram uma expressão diminuída de MYH11 em tumor relativamente ao tecido

não-tumoral adjacente.

64

Uma análise mais detalhada do locus de MYH11 revelou a presença de um outro

gene, NDE1, que se sobrepõe à extremidade 3' de MYH11 (Figura 15).

Figura 15 – Região genômica do cromossomo 16 contendo os loci de MYH11 e NDE1. A caixa

vermelha indica a seqüência depositada (GenBank Acession: BG876687) no chip e que foi

anotada como um fragmento do transcrito de MYH11. Note que uma extremidade da sonda de

cDNA é ao mesmo tempo complementar a um éxon 5’ de MYH11 e ao éxon 3’ de NDE1. A

orientação oposta dos transcritos de MYH11 e NDE1 é representada pelas cabeças de setas em

azul, que estão nas regiões intrônicas dos dois genes.

Além disso, foi observado que a sonda de cDNA dupla-fita depositada no

microarray (Genbank accession: BG876687) é complementar ao éxon 3’ exon do

transcrito NDE1 e a um éxon mais 5’ de MYH11. Como o protocolo de marcação

favorece alvos próximos à extremidade 3' de transcritos poli(A)

+

devido a utilização de

primers oligo dT, levantamos a hipótese de que o sinal medido pelo microarray foi na

verdade derivado de mensagens originadas do gene NDE1. Para testar essa hipótese,

foram realizados experimentos de RT-PCR em tempo real para medir os níveis de

NDE1 em amostras de tumor e de tecido não-tumoral adjacente. Os resultados

mostraram que dos 8 pares avaliados de amostras pareadas, NDE1 estava

significativamente sub-expresso (p < 0,02) em 3 amostras de RCC em comparação ao

tecido não-tumoral adjacente (Figura 14, painel D, pacientes P3, P27 e P32). Em duas

65

amostras adicionais, NDE1 apresentou uma tendência, embora não-significativa, de

estar com expressão reduzida em CCR (Figura 14, painel D, pacientes P5 e P26).

Quatro transcritos intrônicos não-codificadores mapeando em regiões intrônicas

de genes codificadores, SND1, ACTN4, HDAC5 e NIBP, foram selecionados para

experimentos de RT-PCR em tempo real; a sub-expressão de RNAs intrônicos foi

confirmada para transcritos mapeando íntrons de SND1 e ACTN4 (Figura 14, painel E).

Não foi possível obter a amplificação de produtos de PCR correspondentes aos

transcritos intrônicos HDAC5 e NIBP utilizando os primers disponíveis, e a diferença de

expressão desses transcritos não foi confirmada.

4.5 Análise do padrão de metilação de genes com expressão diminuída em CCR

Cinco genes identificados como sub-expressos em CCR (GPX3, NDE1,

SYNJ2BP, TRIP3 e SIN3B) foram selecionados para avaliação do perfil de metilação de

ilhas CpG localizadas em regiões promotoras dos respectivos genes em amostras

pareadas de tumor e tecido não-tumoral adjacente de pacientes com CCR. Foram

analisadas para identificação das ilhas CpG seqüências cobrindo até 2 Kb à montante

do início de transcrição do gene, acrescida do respectivo primeiro éxon e

primeiro/segundo íntrons. Como algumas ilhas CpG eram longas, foi necessário

desenhar mais de um par de primers para essas ilhas.

66

A eficiência do tratamento por bissulfito foi avaliada utilizando primers

complementares à seqüência convertida por bissulfito de uma região genômica contendo

uma ilha CpG do gene CDKN2A, cuja expressão é sabidamente regulada por metilação

da região promotora em linhagens de tecido DLD1 (carcinoma de cólon) e H1299

(câncer de pulmão) (Figura 16).

Figura 16 - Verificação do tratamento com bissulfito e análise do perfil de metilação para

região regulatória do gene CDKN2A. Reações de PCR utilizando primers MSP do gene

CDKN2A. L : marcador de peso molecular (100 pb). U: primer complementar a DNA não-

metilado, M: primer complementar a DNA metilado. 32T, 32N, 9N, 9T, 15N, 15T, 27N, 27T

correspondem a amostras de CCR (T) e tecido não-tumoral adjacente (N). Linhagens onde o

gene CDKN2A é sabidamente metilado (Controles positivos de metilação): DLD1, H1299.

Controle negativo de tratamento com bissulfito: MCF7. Linhagens onde o gene CDKN2A é

sabidamente não-metilado (controle negativo de metilação): 37L, HT1376, 18C. Esse

experimento mostra que, embora não haja metilação nos sítios interrogados pelos primers nas

amostras de CCR, o tratamento com bissulfito foi eficiente, pois foram amplificadas bandas

com tamanho compatível utilizando primers complementares à seqüência de DNA convertido.

Neste ensaio, foram realizadas reações de PCR utilizando separadamente

primers específicos para formas metiladas ou não-metiladas dos genes (Methylation-

Specific PCR – MSP). Embora não tenha sido verificada a existência de metilação na

ilha CpG testada do gene CDKN2A em amostras de CCR, a observação de uma banda

com o tamanho esperado em DNA de linhagens sabidamente metiladas e tratadas em

paralelo, confirmou que o tratamento com bissulfito nas amostras foi eficiente.

U L M U M U M U M U M U M U M

9N 9T 15N 15T 27N 27T 32N

U L M U M U M U M U M U M U M

9N 9T 15N 15T 27N 27T 32N

U L M U M U M U M U M U M U M

9N 9T 15N 15T 27N 27T 32N

150 bp150 bp150 bp150 bp

U M L U M U M U M U M U M U M

32T 18C 37L 1376 MCF7 DLD1 H1299

HT

U M L U M U M U M U M U M U M

32T 18C 37L 1376 MCF7 DLD1 H1299

U M L U M U M U M U M U M U M

U M L U M U M U M U M U M U M

32T 18C 37L 1376 MCF7 DLD1 H1299

HT

67

Foi observado que SIN3B possui evidência de metilação, em CpGs localizadas

numa região compreendendo um trecho à montante do início de transcrição até o

segundo íntron do gene (Figura 17).

Figura 17 - Perfil de metilação de sítios CpG de genes sub-expressos em CCR. Os produtos de

PCR obtidos a partir de DNA genômico tratado com bissulfito e utilizando primers flanqueando

regiões em torno do início de transcrição (TSS) de genes sub-expresssos em CCR (SIN3B,

SYNJ2BP, GPX3 e TRIP3). Para cada amostra seqüenciada, os quadrados pretos representam

CpGs onde foi observada metilação em pelo menos 20% dos clones seqüenciados. Os

quadrados cinza representam CpGs não-metilados (menos de 20% dos clones seqüenciados). Os

quadrados brancos representam sítios CpGs onde não houve seqüenciamento de qualidade. Para

cada gene analisado, os CpGs foram seqüencialmente numerados da esquerda para direita.

No entanto, não foi observada nenhuma correlação entre o perfil de metilação

dos CpGs e o padrão histológico do tecido (tecido tumoral ou tecido não-tumoral

adjacente) nos 4 pares de amostras avaliadas. Não foi observada metilação em ilhas

localizadas na região promotora de GPX3, SYNJ2BP e TRIP3 (Figura 17). Este

resultado indica que a metilação do promotor não é um fator importante na regulação

68

negativa dos genes GPX3, SYNJ2BP, TRIP3 e SIN3B em amostras de CCR. A ausência

de metilação observada para GPX3 sugere que o mecanismo de regulação negativa deste

gene em CCR seja distinto do que ocorre em adenocarcinomas de próstata, onde a

diminuição da expressão está associada ao aumento da metilação da região promotora

de GPX3 (Lodygin et al. 2005).

O seqüenciamento de DNA tratado com bissulfito apresenta desafios inerentes à

transformação de longos trechos de DNA em homopolímeros de poli-T ou poli-A. O

DNA convertido freqüentemente contém regiões de baixa complexidade que dificultam

o desenho de primers específicos e compatíveis com as condições utilizadas nas reações

de amplificação, o que limita a obtenção de produtos de amplificação específicos e/ou

em quantidade suficiente para o sequenciamento direto e/ou a clonagem em vetor para

posterior seqüenciamento. Como exemplo dessas limitações, embora tenhamos obtido

produto de amplificação usando os primers para NDE-1, não conseguimos seqüenciá-lo

diretamente com nenhum dos dois primers disponíveis.

69

5. DISCUSSÃO

5.1 Desenho experimental utilizado para identificação de transcritos

diferencialmente expressos em CCR

A abordagem utilizada neste trabalho, ou seja, a hibridização de amostras

pareadas de tecido tumoral e tecido normal adjacente na mesma lâmina (experimentos

com 2 canais) e posterior utilização de razões relativas de expressão gênica, é um

desenho experimental que garante uma precisão e acurácia maior nas medidas de

expressão em relação a estratégias baseadas na hibridização individual de cada amostra

(experimentos com 1 canal) (Yang et al. 2002; Peixoto et al. 2006). A necessidade de

medidas acuradas de expressão gênica é tanto maior quanto menor for o número de

réplicas biológicas e técnicas disponíveis. Um estudo recente avaliou o número de

amostras necessário para que haja poder de análise estatística na identificação de genes

diferencialmente expressos, a partir de dados de diversos trabalhos de expressão gênica

disponívei na literatura (Allison et al. 2006). Esse estudo demonstrou que para

desenhos experimentais onde dois grupos de amostras são avaliados para comparação

de classe (expressão diferencial), 5 amostras biológicas por grupo são geralmente

suficentes para identificação de genes diferencialmente expressos com significado

biológico, não restrito às amostras utilizadas na análise (Allison et al. 2006). Isto se

aplica unicamente a casos de comparação de classe (expressão diferencial), mas não a

predição de classe (classificação). Neste trabalho, identificamos um conjunto de 83

genes com expressão significativamente alterada em CCR tipo célula clara utilizando 12

amostras pareadas de 6 pacientes. Desse conjunto, um sub-conjunto de 25 genes

também se mostrou diferencialmente expresso em 6 outros pacientes com CCR não-

célula clara. Em função do desenho experimental empregado, acreditamos que os

70

resultados obtidos, além de possuírem significância estatística, sugerem que os genes

identificados possuam relevância biológica e poderão contribuir para o entendimento

das bases moleculares do CCR.

Durante nossas análises, chamou-nos atenção a predominância de genes

diminuídos em tumor em comparação ao número de genes aumentados relativamente ao

tecido não-tumoral adjacente. Em princípio, isso poderia ser uma conseqüência de uma

maior degradação do RNA nas amostras de tumor devido à necrose intensa que acomete

esses tecidos. Contudo, a avaliação da qualidade dos RNAs utilizados nas hibridizações

não indicou diferença na qualidade dos RNAs provenientes de tecido tumoral ou

margens cirúrgicas livres de tumor. Além disso, uma análise individual das amostras

pareadas revelou que a proporção de genes com expressão aumentada e diminuída em

tumores é comparável, e que o maior número de genes com expressão diminuída em

tumores só se torna evidente quando o conjunto das amostras é analisado. Esse

resultado indica que uma pior qualidade do RNA não deve ser um fator preponderante

para explicar a diminuição da expressão de genes nos tumores, o que é reforçado com

outros artigos já publicados mostrando a mesma tendência (Lenburg et al. 2003).

5.2 Comparação dos genes identificados com outros estudos de CCR

Embora todos os microarrays de DNA se baseiem na hibridização de ácidos

nucléicos, as variações técnicas diferem amplamente entre as plataformas (Draghici et

al. 2006). Entre as diferenças, destacam-se o comprimento das sondas, o método de

deposição do DNA na lâmina, protocolos de marcação e hibridização, etc. Cada uma

dessas abordagens exige considerações em termos da quantidade de RNA necessário,

aquisição de dados e técnicas de transformação e normalização de dados, e que resultam

71

freqüentemente em baixa reprodutibilidade das plataformas. (Draghici et al. 2006).

Essa é uma questão importante porque, dada uma hipótese biológica avaliada em duas

plataformas diferentes, cumpre saber se há diferenças específicas entre as plataformas

de modo a interferir nos resultados, mascarando assim a resposta biológica subjacente.

Nesse sentido, observamos nessa tese uma baixa sobreposição da nossa lista de

genes diferencialmente expressos com a lista de outros trabalhos publicados com CCR

utilizando metodologia de microarrays. Por exemplo, GPX3 e S100A2 foram também

descritos com expressão diminuída entre CCR em dois trabalhos publicados (Boer et al.

2001; Takahashi et al. 2001). Não encontramos sobreposição com nenhuma lista de

genes de alguns trabalhos publicados ((Jones et al. 2005), (Young et al. 2001), (Higgins

et al. 2003), (Skubitz et al. 2002)). Acreditamos que esta baixa sobreposição se explica

principalmente por i) número limitado de genes codificadores para proteína

representados em nossa plataforma e que podem ser mapeados nas plataformas

utilizadas nos outros estudos já realizados em CCR, ii) a presença de diferentes regiões

dos transcritos, que interrogam diferentes isoformas do mesmo gene e iii) a

heterogeneidade na atribuição de identificadores para as sondas nas diferentes

plataformas.

5.3 Expressão de RNAs não-codificadores em CCR

Neste trabalho observamos a expressão ubíqua de ncRNAs intrônicos e

intergênicos em amostras de tecido tumoral renal, assim como em margens livres de

neoplasia. Também observamos que em média, a abundância dos ncRNA é menor que a

de transcritos codificadores para proteínas. Estes resultados estão de acordo com

resultados obtidos anteriormente por nosso grupo durante a análise de tumores de

72

próstata utilizando essa mesma plataforma de microarrays (Reis et al. 2004). A

expressão em menor nível de ncRNAs já foi também descrita em outros trabalhos da

literatura (Kampa et al. 2004; Sasaki et al. 2007). No trabalho anterior com tumores de

próstata foram utilizados primers oligo-dT na síntese de cDNA a partir de mRNA,

diferentemente do presente trabalho, que além de oligo-dT tambem utilizou primers

randômicos para gerar cDNA a partir de RNA total. A estratégia de utilização

combinada de oligo-dT e primers randômicos teve como intenção garantir a marcação

de alvos que não necessariamente possuissem uma cauda de poliA, além de obter uma

marcação mais eficiente de regiões 5’ de transcritos longos. A quantidade limitada de

RNA disponível para os experimentos não permitiu que fosse feito tratamento com

DNAse. Embora essa contribuição não deva ser significativa, visto que a transcriptase

reversa utiliza preferencialmente RNA no seu processo de síntese de cDNA, essa

limitação do desenho experimental pode resultar em que uma pequena fração do sinal

detectado nos microarrays seja proveniente de contaminação residual com DNA

genômico. De todo modo, a eventual contaminação com DNA genômico não afetaria a

identificação de genes diferencialmente expressos entre tumor e tecido não-tumoral

adjacente, já que isso ocorreria aleatoriamente nas amostras tumorais e não-tumorais e

em pequena quantidade.

O trabalho de nosso grupo em tumores de próstata mostrou que uma

considerável porção de RNAs com nível de expressão correlacionados ao grau de

agressividade de tumores de próstata são RNAs transcritos em regiões intrônicas,

apontando para uma possível relevância biológica dessas mensagens em doenças

complexas como o câncer (Reis et al., 2004). Uma fração desses transcritos intrônicos

mostrou pertencer a uma nova classe de RNAs longos, sem splicing, sem potencial

codificante, e expressa com orientação antisenso a genes codificantes para proteína já

73

conhecidos, sugerindo que transcritos intrônicos antisenso possam estar envolvidos no

processo de oncogênese. Uma hipótese plausível para apoiar uma função biológica é

que os transcritos intrônicos agiriam em cis, tendo como alvo sua mensagem senso

intrônica complementar (no pré-mRNA). A formação de pares antisenso-senso

intrônicos poderiam assim desempenhar um papel regulatório em alguma etapa do

processamento dos transcritos codificantes para proteína correspondentes (Reis et al.,

2005). Essa hipótese é apoiada por resultados recentes mostrando o efeito de ncRNAs

intrônicos induzidos por andrógeno sobre a estabilidade ou o padrão de splicing do

mRNA correspondente (Louro et al., 2007). A observação de que ncRNAs intrônicos

são ubíquamente expressos em tecido renal permite extender para tecidos renais as

observações feitas em tecido prostático, abrindo novas perspectivas para o estudo dos

mecanismos de regulação gênica envolvidos com a transformação maligna no CCR.

5.4 Análises de metilação

A inibição funcional de genes supressores de tumor pode ocorrer via mutações

pontuais, deleções alélicas, deleções homozigóticas ou por metilação anormal da região

promotora. A metilação de dinucleotídeos CpG na região promotora de genes

supressores de tumor, resultando em inibição transcricional, é um mecanismo

importante de inativação desses genes. A freqüência de inativação por metilação de

novo varia entre genes e entre cânceres. Assim, o espectro de genes freqüentemente

inativados por metilação difere entre os tipos de cânceres, de modo que certos tumores

podem apresentar padrões específicos de metilação (Esteller et al. 2001). Atualmente,

existe pouca informação sobre a freqüência e padrão de metilação em tumores renais em

comparação a outros cânceres (Morris et al. 2003). Além disso, a caracterização dos

74

perfís de metilação de genes supressores de tumor pode revelar mecanismos de

carcinogênese, sendo que a definição de padrões de metilação tumor-específicos abre a

possibilidade de desenvolvimento de novos testes diagnósticos. Assim, uma

conseqüência natural da análise de genes com expressão diminuída é a análise de

alterações de metilação em ilhas CpGs. Dentre os genes selecionados para análise de

metilação, SIN3B foi o único no qual observamos CpGs metiladas, mas que no entanto

não apresentou correlação entre os níveis de metilação e o status histológico, ou seja,

entre tumor ou tecido não-tumoral adjacente e, por extensão, nenhuma correlação com a

expressão diferencial. A presença de metilação em amostras de tecido não-tumoral

adjacente sugere que o uso de SIN3B como marcador epigenético em CCR para

identificação prematura de tumores não é uma boa abordagem para o desenvolvimento

de novas ferramentas diagnósticas nessa neoplasia. O perfil de metilação das regiões

promotoras foi também avaliada nos genes NDE1, SYNJ2BP, GPX3 e TRIP3, mas

nenhum deles apresentou metilação. Curiosamente, está descrito na literatura que a

hipermetilação de GPX3 causa o silenciamento deste gene em tumores de próstata

(Lodygin et al. 2005). Embora tenhamos utilizado a mesma metodologia de avaliação de

metilação e primers complementares as mesmas regiões descritas por Lodygin et al.,

não observamos metilação de GPX3 em CCR, o que indica que o silenciamento deste

gene pode ocorrer através de mecanismos distintos em diferentes neoplasias.

5.5 Transcritos diferencialmente expressos em CCR

Com relação à confiabilidade, a tecnologia de microarray apresenta

aproximadamente 90% dos genes identificados como “significativos” sendo

confirmados por uma técnica alternativa, como o RT-PCR quantitativo (Larkin et al.

75

2005). Além disso, Lenburg et al. comparando CCR com tecido normal adjacente,

observaram que, dos 37 genes também identificados como diferencialmente expressos

em três ou mais dos cinco estudos anteriores analisados, 33 deles (89%) confirmaram a

expressão diferencial (Lenburg et al. 2003). Neste trabalho, conseguimos uma taxa de

validação de 100%, ou seja, todos os genes selecionados e amplificados tiveram sua

expressão diferencial confirmada por PCR em tempo real em amostras, na maioria,

independentes. A seguir, discutimos o papel na biologia celular de alguns genes

identificados como diferencialmente expressos em CCR.

CASP7

A ativação de caspase é um evento importante na geração de alterações

bioquímicas associadas a morte celular (Twiddy et al. 2006), sendo que a caspase-7 é

uma caspase de importância central nesse processo (Korfali et al. 2004). A ativação da

caspase-7 foi relatada em células T e B em apoptose (Marsden et al. 2002). Fibroblastos

embriônicos de camundongo, células T ou B de murinos e hepatócitos deficientes em

caspase-7, no entanto, apresentam apenas uma leve vantagem de sobrevivência quando

tratados com indutores de apoptose (Lakhani et al. 2006), sugerindo uma variabilidade

na resposta de caspase-7 na propagação de morte celular. Neste trabalho, foi observada

uma diminuição da expressão do mRNA de caspase-7 em tumores de CCR, sugerindo

uma atividade supressora de tumor para este gene, reforçando a idéia de um gene pró-

apoptótico.

EPAS1

HIF é um fator de transcrição heterodimérico consistindo de uma subunidade

beta constitutivamente expressa e uma subunidade alfa regulada. HIF-2

α

, codificado

pelo gene EPAS1, apresenta alta similaridade de seqüência com HIF-1

α

, um fator de

76

transcrição com função na resposta transcricional a hipoxia (Korfali et al. 2004). HIF

não é apenas suficiente, como também necessário para formação do CCR (Iliopoulos

2006). De acordo com nossas análises, EPAS1 é sub-expresso em CCR, sugerindo uma

complexidade adicional nesta via durante a carcinogênese do CCR.

Intrônico de SND1

A família de fatores de transcrição STAT (Signal transducer and activator of

transcription) converte sinais extracelulares de citocina em respostas biológicas através

da modulação da transcrição gênica (Levy et al. 2002). A ativação constitutiva de

proteínas STAT e a sinalização STAT anormal já foram observadas em tumores sólidos,

tumores hematopoiéticos não-leucêmicos e leucemias (Levy et al. 2002). Yang et al.

identificaram a proteína p100, codificada por SND1, como uma proteína que interage

com STAT6, aumentando a ativação transcricional mediada por STAT6 (Yang et al.

2002). Neste sentido, observamos um transcrito alterado no íntron de SND1, sugerindo

um envolvimento da via STAT na carcinogênese do CCR. A proteína p100 também

interage com outros fatores de transcrição como TFIIE, c-Myb e STAT5 (Levy et al.

2002).

CHEK1

Os chekpoints de dano ao DNA são ativados a fim de bloquear células e

promover a sobrevivência sob condições genotóxicas, sendo que alguns estudos têm se

dedicado ao uso de uma quinase codificada por CHEK1 como alvo de intervenção

terapêutica (Gao et al. 2006). CHEK1 é também uma quinase essencial para preservar a

estabilidade do genoma. Estudos recentes (Syljuasen et al. 2005) propuseram que

CHEK1 é necessário durante a fase S normal para evitar início anormal da replicação do

DNA, protegendo-o assim contra quebra. Neste sentido, as células tumorais

77

freqüentemente são deficientes no chekpoint G1 devido a perda de função de p53

(estimada em 50–70% de todos os cânceres) e assim deve depender da quinase de

chekpoint CHEK1 para induzir bloqueio nas fases S e G2 a fim de sobreviver (Huang et

al. 2006). Todos esses estudos sugerem que CHEK1 atua como um importante gene

supressor de tumor em câncer, sendo que isto foi confirmado em nossas análises onde

identificamos CHEK1 sub-expresso em CCR.

Intrônico de TACC1

As proteínas TACC (Transforming acidic coiled-coil) são proteínas associadas a

centrossomo e microtúbulo, sendo essenciais para a função de fuso mitótico. A

desregulação desses genes é considerada importante no desenvolvimento e progressão

de mieloma múltiplo, câncer de mama e câncer gástrico, sendo que Lauffart et al.,

utilizando dados de SAGE, conseguiram mostrar que 78,5% dos tumores de ovário não

apresentam expressão considerável de TACC1 e/ou TACC3 (Lauffart et al. 2005).

TACC1 mapeia em 8p11, uma região amplificada e rearranjada em câncer de mama

(Still et al. 1999). Devilard et al mostraram que TACC1 apresenta níveis muito mais

elevados de expressão em carcinoma de próstata humana do que em amostras de tecido

prostático normal, tanto em nível de mRNA quanto de proteína (Devilard et al. 2006).

Intrônico de SLC2A1

SLC2A1I (ou GLUT1) codifica para uma proteína que participa da detecção de

glicose pela célula (Richardson et al. 2007). Como a membrana plasmática é

impermeável a moléculas polares, a captura de glicose necessita do uso de proteínas

carreadoras associadas a membrana, como a proteína codificada por SLC2A1I. Os

transportadores de glicose (GLUTs) facilitam a translocação de glicose através da

membrana, garantindo assim um suprimento contínuo de glicose para maioria dos

78

tecidos, sendo atualmente aceito que o aumento da captura de glicose por células

malignas está associada ao aumento da expressão de GLUTs (Suganuma et al. 2007). A

super-expressão de SLC2A1I foi descrita em câncer de fígado, pâncreas, rim (CCR

célula clara), pulmão, mama, estômago, cabeça e pescoço e de tireóide (Suganuma et al.

2007). Como o intrônico mapeando SLC2A1I foi identificado como diminuído em

tumor em nossas análises, nós postulamos que este transcrito intrônico poderia ter o

papel de diminuir o nível transcricional de SLC2A1I em células normais, sendo que o

aumento da transcrição de SLC2A1I observado em vários tumores seria paralelo à

diminuição correspondente do transcrito intrônico, como de fato observamos.

Intrônico de NIBP

NIBP atua como um facilitador (enhancer) da ativação de NF-κB mediada por

citocina. A função oncogência de NF-κB em cânceres sólidos já foi descrita

anteriormente em câncer de mama, cólon, ovário, tireóide e pâncreas (Rayet et al.

1999). Oya et al. descreveram a atividade aumentada de NF-κB em CCR, a qual está

relacionada com a capacidade de invasão tumoral (Oya et al. 2003). Nossos achados

sugerem que a diminuição de expressão do transcrito intrônico de NIBP pode estar

envolvida na via de NF-κB e pode assim estar atuando como um ator importante na

biologia de CCR. Além disso, estudos in vitro preliminares também sugerem que NIBP

pode ser um regulador da expressão do gene Bcl-xL, assim como da diferenciação

neuronal, sendo identificado como uma nova proteína ligante de NIK e IKK

β

que é

expressa principalmente em cérebro, músculo, coração e rim (Hu et al. 2005).

Uma observação extremamente interessante foi a identificação de uma possível

regulação negativa entre os genes NDE1/MYH1 em CCR a partir da formação de um

par senso-antisenso. Esses dois genes apresentam sobreposição conservada em vários

79

genomas de mamíferos, como camundongo, chimpanzé e cão, além de galinha e mosca-

de-frutas, sugerindo que eles formam um par regulatório funcional. De fato, existem

estudos com murinos sugerindo que a expressão de um parálogo de MYH11, que

codifica para uma cadeia pesada da miosina, e que é regulado pelas mensagens

antisenso transcritas na fita minus do gene (Luther et al. 2005).

Em conclusão, os transcritos codificadores e não-codificadores identificados

nesta tese representam um conjunto interessante para exploração futura, cujas vias de

regulação podem ser úteis como objeto de estudo para diagnóstico e tratamento de

CCR, assim como em estudos da biologia molecular dessa classe de tumores. Como

discutimos inicialmente, embora o uso da metilação de SIN3B como marcador precoce

em CCR possa ser dificultado pela ausência observada de metilação diferencial entre o

tumor e o tecido não tumoral adjacente, a lista apresentada de genes com expressão

diminuída representa ainda potenciais alvos de estudos adicionais de metilação, já que

estes genes podem ter tido sua expressão diminuída através de um mecanismo

envolvendo metilação da região promotora. Como existe evidência acumulada de que a

metilação é freqüente e pode ocorrer no início do processo de formação tumoral (Cairns

2007), a detecção de metilação diferencial entre tumor e o tecido normal adjacente pode

ser assim de especial interesse em tumores que se tornam clinicamente evidentes apenas

num estágio avançado, como é o caso do CCR, o qual é difícil de diagnosticar num

estágio inicial devido à ausência de sintomas clínicos evidentes. De fato, quando o CCR

se torna clinicamente sintomático, em torno de 30% dos pacientes já apresentam

metástases (Engwegen et al. 2007). Nesse sentido, vale ainda notar que se o CCR for

detectado e tratado na sua fase inicial, enquanto o tumor estiver restrito ao rim, os

pacientes apresentam uma boa sobrevida (95% em 5 anos). Porém, quando os pacientes

80

se apresentam com doença avançada, eles apresentam sobrevida de apenas 18% em dois

anos (Linehan et al. 2004).

Como discutido na introdução desta tese, a identificação de alvos promissores

para o tratamento do CCR é importante para uma mudança no padrão de

desenvolvimento de novos fármacos de uma abordagem por seleção aleatória para uma

mais mecanística e racional. Assim, nossos resultados contribuem, por meio dos genes

identificados como diferencialmente expressos, para identificação de potenciais vias

regulatórias envolvidas com a biologia do CCR e, por conseqüência, de potenciais alvos

terapêuticos merecedores de estudos mais aprofundados, com vistas ao

desenvolvimento de ferramentas de tratamento mais seguras e eficazes.

81

6. CONCLUSÕES

1) A análise dos níveis de expressão de amostras de carcinoma de célula renal e seu

tecido não-tumoral adjacente, revelou, além de transcritos codificadores, uma

fração de transcritos não-codificadores com expressão diferencial.

2) Há uma expressão ubíqua de transcritos não-codificadores nunca antes descrita

em CCR.

3) Transcritos não-codificadores não diferem essencialmente dos transcritos

codificadores em termos de amplitude de expressão, ou seja, a distribuição da

atividade transcricional desses transcritos não difere significativamente daquela

dos transcritos codificadores.

4) Foram identificados 55 transcritos com expressão significativamente diminuída

em CCR célula clara em relação ao tecido não tumoral adjacente, apontando

para novos genes e vias com possível papel supressor de tumor em CCR.

5) Entre os genes com expressão diminuída em CCR selecionados para análise de

metilação, apenas um deles (SIN3B) mostrou evidência de metilação na região

promotora. d No entanto, não foi observada metilação diferencial entre as

amostras de CCR e as amostras de tecido não-tumoral adjacente. Esses

resultados sugerem que outros mecanismos regulatórios devem ser

preponderantes na regulação dos transcritos identificados com expressão

diminuida em CCR.

6) Em conjunto, os resultados apontam para um possível papel de transcritos não-

codificadores em processos biológicos relacionados a oncogênese e/ou

progressão de CCR.

82

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90

ANEXO I − Curriculum Vitae

GLAUBER COSTA BRITO

E-mail: [email protected]

Data de nascimento: 29 de novembro de 1968 – Local: Nanuque-MG

E-mail: [email protected]

TITULAÇÃO:

Doutorado em Ciências

Departamente de Bioquímica

Universidade de São Paulo

2002 -

Mestrado em Biotecnologia

Departamente de Bioquímica

Universidade de São Paulo

2000 - 2002

Graduação em Farmácia-bioquímica

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

1993 - 1999

EXPERIÊNCIA EM ENSINO:

Monitor do Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE) da Universidade de São Paulo na

disciplina QBQ 214 - Bioquímica: Metabolismo e Biologia Molecular sob supervisão do Prof.

Dr. Mario José Politi no 2º semestre de 2005.

Monitor do Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE) da Universidade de São Paulo na

disciplina QBQ 214 - Bioquímica: Metabolismo e Biologia Molecular sob supervisão do Prof.

Dr. Mario José Politi no 2º semestre de 2004.

Professor do curso "DNA: Técnicas e Aplicações" realizado durante a XXXII Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Bioquímica (SBBq) em maio de 2003 em Caxambu/MG sob supervisão

do Prof. Dr. Bayardo Torres.

Professor do curso "DNA: Técnicas e Aplicações" realizado durante a XXXI Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Bioquímica (SBBq) em maio de 2002 em Caxambu/MG sob supervisão

do Prof. Dr. Bayardo Torres.

Professor do curso de verão "Tecnologia do DNA" realizado na Universidade de São Paulo em

janeiro de 2002 sob supervisão do Prof. Dr. Bayardo Torres.

TRABALHOS EM CONGRESSOS:

Trabalho em evento nacional:

91

1. Brito, G. C.; Fachel, A; Campos, F. S. ; Barcinski, M. A.; Verjovski, S; E. M. Reis.

Identification of Novel Candidate Markers of Renal Cell Carcinoma by cDNA Microarrays

Analysis. 51

o

Congresso Brasileiro de Genética, 2005, Águas de Lindóia, SP, Brasil.

2. Brito, G. C. ; E. M. Reis ; Fachel, A; Verjovski, S. Differential Gene Expression of Renal

Cell Carcinoma Using cDNA Microarrays. In: 50

o

Congresso Brasileiro de Genética, 2004,

Florianópolis, Brasil. p. 48-48.

3. E. M. Reis ;Brito, G. C.; Verjovski, S.. Antisense Intronic Non-coding RNA Levels

Correlate to the Degree of Tumor Differentiation in Prostate Cancer. In: 50

o

Congresso

Brasileiro de Genética, 2004, Florianópolis, Brasil. p. 53-53.

4. Brito, G. C. ; E. M. Reis ; Verjovski-Almeida, S. Gene Expression Profiling of Renal Cell

Carcinoma by Using cDNA Microarrays. In: XXXII Encontro Anual da Sociedade Brasileira de

Bioquímica, SBBq, 2003, Caxambu, Brasil. p. 12-12.

5. Torres, B.B.; Brito, G. C.. A Molecular Biology Course for Biology Teachers. In: XXXI

Encontro Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica, SBBq, 2002, Caxambu, Brasil. p. 118-

118.

Trabalho em evento internacional:

1. Brito, G.C. ; Fachel, A.A. ; Campos, F.S. ; Barcinski, M.A. ; Verjovski-Almeida, S.; Reis,

E.M. Novel molecular markers of renal cell carcinoma identified by gene expression analysis

using cDNA microarrays In: In: Keystone Symposia: Emerging Genomic Biomarkers: Impact

on Drug Discovery and Clinical Practice, 2006, Victoria, Canadá.

CURSOS:

Genomes, Browsers and Databases: Tools for Automated Data Integration Across Multiple

Genomes. Curso internacional realizado no “14th Annual Meeting of the International Society

for Computational Biology” em 6-10 de agosto de 2006. Fortaleza, Ceará.

Acessing the Human Genome Sequence. The Wellcome Trust / Cold Spring Harbor Joint

Course. Curso internacional realizado no Instituto Ludwig em 7-9 de fevereiro de 2006. São

Paulo, SP.

PUBLICAÇÕES CiENTÍFICAS:

Reis EM, Nakaya HI, Louro R, Canavez FC, Flatschart AV, Almeida GT, Egidio CM, Paquola

AC, Machado AA, Festa F, Yamamoto D, Alvarenga R, da Silva CC, Brito G.C, Simon SD,

Moreira-Filho CA, Leite KR, Camara-Lopes LH, Campos FS, Gimba E, Vignal GM, El-Dorry

H, Sogayar MC, Barcinski MA, da Silva AM, Verjovski-Almeida S. Antisense intronic non-

coding RNA levels correlate to the degree of tumor differentiation in prostate cancer. Oncogene.

2004, 23(39):6684-92.

Brito G.C., Fachel A.A., Vettore A.L., Campos F.C., Barcinski M.A., Verjovski-Almeida S.

and Reis E.M. Identification of coding and noncoding RNAs down-regulated in renal cell

carcinoma. (versão revisada re-submetida para revista Molecular Carcinogenesis em

agosto/2007).

92

ANEXO II − Descrição das abordagens estatísticas utilizadas para seleção

de genes diferencialmente expressos

Significance Analysis of Microarrays (SAM)

A abordagem estística Significance Analysis of Microarrays (SAM) descrita em

(Tusher et al. 2001) está implementada como um add-in do Excel ou um programa

standalone no ambiente R. Trata-se de uma abordagem baseada na variação aleatória

dos dados, ou seja, considerando que a razão sinal/ruído (signal-to-noise ratio)

geralmente diminui com a diminuição do sinal, há casos em que, mesmo para um dado

nível de expressão, as variações - isto é, a variância do sinal - são gene-específicas e

independem do intervalo de intensidade ao qual pertencem. Para administrar essas

variações específicas, o programa define uma estatística baseada na diferença relativa

d(i):

0

)(

)()(

)(

sis

ixix

id

BA

+

−

=

onde

)(ix

A

e

)(ix

B

são os níveis médios de expressão do gene

)(i

nas condições A e

B, respectivamente;

)(is

é o desvio-padrão de todas as réplicas das condições A e B. A

fim de comparar os valores de

)(id

entre todos os genes e poder compará-los entre si, a

distribuição de

)(id

deve ser independente do nível de expressão do gene. Para garantir

que a variância de

)(id

seja independente da expressão do gene, já que existe uma

relação entre nível de expressão e variância, o programa adiciona uma pequena

constante positiva

0

s

ao denominador da equação acima. O coeficiente de variação de

93

)(id

é calculado como uma função de

)(is

nas janelas ao longo dos dados. O valor de

0

s

é escolhido pelo programa de modo a minimizar o coeficiente de variação de

)(id

.

Quando é construído o gráfico de

)(id

versus

)(is

a partir de amostras diferentes

(por exemplo, A e B) e amostras idênticas (por exemplo, A e A ou B e B), há no

primeiro caso uma dispersão maior dos dados, ou seja, a variância de

)(id

é maior,

resultado da expressão diferencial dos genes mais a variância técnica, a qual pode ser

avaliada comparando-a com a dispersão de

)(id

no gráfico obtido a partir de amostras

idênticas, as quais apresentam, em tese, apenas variância técnica. A fim de simular essa

situação, o programa realiza permutações entre os dados de expressão das 2 classes

sendo comparadas (A e B) gerando novos conjuntos de dados aleatórios misturando as 2

classes e calculando a diferença relativa

)(id

p

entre esses conjuntos. Para identificar

diferenças significativas na expressão dos genes, os mesmos são ordenados segundo a

magnitude de

)(id

. Para cada permutação, os genes são igualmente ordenados segundo

as diferenças relativas

)(id

p

. A diferença relativa esperada,

)(id

E

, é definida como

sendo a média entre as permutações,

∑

= pidid

ppE

/)()(

, onde p é o número de

permutações.

A fim de identificar diferenças potencialmente significativas, o programa utiliza o

gráfico da diferença relativa observada

)(id

versus a diferença relativa esperada

)(id

E

. Genes que apresentam um deslocamento (Δ) acentuado da linha que define

=)(id )(id

E

, istoé, que apresentam uma diferença relativa observada maior do que a

esperada a partir da permutação aleatória dos dados, são candidatos a expressão

diferencial entre as condições testadas. O valor de

Δ

é pré-estabelecido pelo usuário e

94

irá definir o limiar a partir do qual o programa considerará uma diferença como

significativa (Figura 18).

Figura 18 – Gráfico de saída do programa SAM mostrando a diferença relativa observada

)(id

(eixo Y no gráfico) versus a diferença relativa esperada

)(id

E

(eixo X no gráfico). A linha azul

indica a região onde

=)(id

)(id

E

. A linha preta tracejada delimita a região a partir da qual

qualquer ponto dista um valor maior que

Δ

da linha azul. No caso,

=

Δ

1,82614. Em vermelho

e verde, os genes com expressão diferencial significativa.

Para calcular o número de falso-positivos, a faixa de corte é definida a partir do

menor

)(id

entre os genes considerados significativamente induzidos e o

)(id

menos

negativo entre os genes considerados significativamente reprimidos. O número de falso-

positivos é calculado em cada permutação considerando o número de genes que

ultrapassaram aquela faixa de corte, e finalmente é calculada uma média do número de

falso-positivos entre todas as permutações.

SAM Plot

-20

-10

0

10

20

30

40

-10-8-6-4-2 0 2 4 6 810

Expected

Observed

Significant: 208

Median # false significant: 12.41454

Delta 1.82614

Fold Change

95

O programa calcula ainda um q-valor, que é a menor taxa de falso-positivo em que o

gene é considerado significativo. O q-valor mede quão significativo é um gene: à

medida que

|)(| id

aumenta, o q-valor correspondente diminui.

Teste Z (ArrayStat)

Em princípio, qualquer análise estatística para identificar genes diferencialmente

expressos depende da medida de variância dos genes nas amostras a fim de determinar

se a diferença de expressão observada entre 2 condições se deve a um evento aleatório

ou reflete de fato um fenômeno biológico. Genes com alta variância na razão de

expressão entre condições (por exemplo, entre tumor e normal) apresentam baixa

probabilidade de estarem verdadeiramente diferencialmente expressos. Esta idéia pode

ser expressa matematicamente como um teste estatístico em que o numerador contém

uma estimativa do tamanho do efeito (razão tumor/normal, por exemplo) e o

denominador inclui o valor da variância. O ponto crítico é a escolha do numerador e

denominador do teste estatístico a fim de fazer melhor uso dos dados disponíveis. O

teste t de Student, por exemplo, é calculado segundo:

Onde M

avg

é o logratio (ou razão) médio, σ

M

é o desvio-padrão das réplicas e N

o número de réplicas. Assim, quanto maior o valor de t, mais significativa é a diferença

de expressão entre as condições. Considerando esta expressão, fica evidente que um

valor de t alto pode ser o resultado ou de um M

avg

alto ou de um σ

M

baixo. Como a

N

M

t

M

avg

σ

=

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variância da população é tomada como sendo a própria variância das réplicas, este tipo

de teste pode apresentar resultados pouco satisfatórios quando aplicado a um pequeno

número de réplicas (p. ex., N = 4) porque, devido ao acaso, as réplicas podem

ocasionalmente ser muito semelhantes, produzindo um σ

M

baixo e conseqüentemente

um t elevado, resultando num falso-positivo. Para superar este inconveniente, alguns

métodos buscam obter uma medida mais precisa da variância de cada gene a partir da

estimativa da variância de todos os genes medidos no microarray. Essa estratégia é

empregada na implementação do teste Z disponível no programa ArrayStat (Imaging

Research Inc.) e baseia-se em uma propriedade já conhecida dos dados de microarray: a

dependência da variância em relação à média da intensidade dos spots, ou seja, quanto

menor a intensidade do sinal, maior a variância do mesmo (Nadon et al. 2002).

Resumidamente, dado um spot com intensidade média X, é possível estimar a sua

variância Y interpolando com a função de regressão do gráfico intensidade média versus

variância, de modo que todos os spots com intensidade dentro de um determinado

intervalo passam a ter variância correspondente à interpolação daquela função (Figura

5).

Estas estimativas do desvio-padrão são mais confiáveis do que o erro medido a partir

das poucas réplicas de cada gene na lâmina, e podem ser utilizadas para calcular

diretamente a estatística Z, usando a mesma fórmula da estatística t, mas que apresenta

uma distribuição diferente. Como o teste Z do ArrayStat faz uma estimativa da variância

da população a partir de todos os spots do array com mesma intensidade, isto permite

que se utilize menos réplicas, 4 ou 6 por exemplo, em vez das 30, no mínimo, que o

teste Z padrão preconiza. Por essa razão, o teste Z tem sido utilizado com o objetivo de

identificar genes diferencialmente expressos em análises de microarray (Comander et

al. 2004; Novoradovskaya et al. 2004; Saito et al. 2004).

97

ANEXO III − Artigo submetido para publicação

For Peer Review

Identification of protein-coding and intronic noncoding RNAs down-

regulated in clear cell renal carcinoma

Journal: Molecular Carcinogenesis

Manuscript ID: MC-07-0156

Wiley - Manuscript type: Research Article

Date Submitted by the

Author:

09-Aug-2007

Complete List of Authors: Brito, Glauber; Universidade de São Paulo, Bioquímica

Fachel, Angela; Universidade de São Paulo, Bioquímica

Vettore, André; Universidade Federal de São Paulo, Campus

Diadema

Vignal, Giselle; Instituto Nacional de Câncer, Hospital do Câncer

Gimba, Etel; Instituto Nacional de Câncer, Hospital do Câncer

Campos, Franz; Instituto Nacional de Câncer, Hospital do Câncer

Barcinski, Marcello; Instituto Nacional de Câncer, Hospital do

Câncer

Verjovski-Almeida, Sergio; Universidade de São Paulo, Bioquímica

Reis, Eduardo; Universidade de São Paulo, Bioquímica

Keywords:

renal cell carcinoma, noncoding RNA, intronic transcription, tumor

suppressor, cDNA microarray

John Wiley & Sons

Molecular Carcinogenesis

For Peer Review

1

Identification of protein-coding and intronic noncoding RNAs down-regulated in clear

cell renal carcinoma

Glauber Costa Brito

a

, Ângela A. Fachel

a

, Andre Luiz Vettore

c

, Giselle M Vignal

b

, Etel R. P.

Gimba

b

, Franz S. Campos

b

, Marcello A. Barcinski

b

, Sergio Verjovski-Almeida

a

and Eduardo

M. Reis

a*

a

Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, SP, Brasil;

b

Hospital do Câncer, Instituto Nacional de Câncer/MS, RJ, Brasil;

c

Universidade Federal de

São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.

*Corresponding author:

Dr. Eduardo M. Reis

E-mail: [email protected]

Tel. +55-11-3091-2173

Fax: +55-11-3091-2186

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For Peer Review

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Abstract

The clear cell subtype of renal cell carcinoma (RCC) is the most lethal and prevalent cancer of

the urinary system. To investigate the molecular changes associated with malignant

transformation in clear cell RCC, the gene expression profiles of matched samples of tumor and

adjacent non-neoplastic tissue were obtained from 6 patients. A custom-built cDNA microarray

platform was used, comprising 2,292 probes that map to exons of genes and 822 probes for

noncoding RNAs mapping to intronic regions. Intronic transcription was detected in all normal

and neoplastic renal tissues. A subset of 55 transcripts was significantly down-regulated in

clear cell RCC relative to the matched non-tumor tissue as determined by a combination of two

statistical tests and leave-one-out patient cross-validation. Among the down-regulated

transcripts, 49 mapped to untranslated or coding exons and 6 were intronic relative to known

exons of protein-coding genes. Lower levels of expression of SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP and

NDE1 (p < 0.02), and of intronic transcripts derived from SND1 and ACTN4 loci (p < 0.05),

were confirmed in clear cell RCC by Real-time RT-PCR. A subset of 25 transcripts was

deregulated in additional 6 non-clear cell RCC samples, pointing to common transcriptional

alterations in RCC irrespective of the histological subtype or differentiation state of the tumor.

Our results indicate a novel set of tumor suppressor gene candidates, including noncoding

intronic RNAs, which may play a significant role in malignant transformations of normal renal

cells.

Keywords: clear cell Renal Cell Carcinoma, noncoding RNA, intronic transcription, cDNA

microarray, tumor suppressor.

Running title: Intronic transcription in renal cell carcinoma

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INTRODUCTION

Renal cell carcinoma (RCC) is the most common cancer in the adult kidney, representing 3%

of all malignancies worldwide [1]. RCC is a heterogeneous disease, displaying various distinct

histological patterns, genetic alterations and clinical and biological behaviors. RCCs are

usually classified according to their histological characteristics into clear cell RCC, papillary

RCC (15–20%), chromophobe RCC (4–5%), carcinoma of the collecting ducts of Bellini

(<1%) and renal medullary carcinoma (<1%) [2]. Clear cell RCC is the most predominant form

of renal neoplastic disease, accounting for 70-80% of all RCC cases [3].

Several studies based on gene expression profiling have been conducted with the aim of

identifying the molecular alterations associated with malignant transformation of renal tissue;

they have all focused on array platforms containing probes for protein-coding genes [4-7].

These efforts have contributed greatly to delineating the changes in gene expression in renal

cancer and identifying molecular targets for prognosis and treatment. Despite these major

advances, understanding of the molecular mechanisms underlying renal carcinogenesis has

remained limited because of the complex and multifactorial nature of the disease.

Our group showed for the first time that long intronic noncoding RNAs mapping to

introns of protein-coding genes are ubiquitously transcribed in human prostate tissues, and that

the expression levels of a subset of these noncoding RNAs correlate with the degree of

malignancy of prostate tumors [8]. More recently, we showed that intronic RNAs may regulate

the abundance or the pattern of exon usage in cultured prostate cancer cells [9]. These results

are in line with a growing body of evidence in the literature indicating that noncoding RNAs

play an important role in regulating gene expression in eukaryotes [10-12] and a change in their

expression may play a role in malignancy [13].

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For Peer Review

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The possible correlation between changes in expression of noncoding RNAs and renal

cancer has not been studied. In this work, we have analyzed the expression profiles of matched

samples of RCC and non-malignant renal tissue using a microarray enriched in cancer-related

genes and noncoding intronic RNAs. We found that intronic transcription is ubiquitous in renal

tissue. Moreover, we identified an expression signature comprising both exonic and intronic

transcripts that are predominantly down-regulated in the most prevalent histological subtypes

of RCC. These provide novel insights into the general molecular mechanisms associated with

malignant transformations in renal tissue, and indicate potential new targets for diagnosis and

treatment of RCC.

MATERIALS AND METHODS

Tissue samples

A total of 24 matched samples of tumor and adjacent non-malignant tissue were obtained from

12 RCC patients submitted to radical nephrectomy at the Instituto Nacional de Câncer − INCA

(Rio de Janeiro, Brasil) and were used in microarray experiments. Ten additional matched

tumor/non-tumor tissue samples from 5 RCC patients were used in quantitative RT-PCR

validation experiments. Fresh tissue samples were obtained from the patients, with informed

consent, and fragments were frozen within 15-20 min after surgery and stored in liquid nitrogen

until use. Tissue sections from each RCC sample were reviewed and classified by a pathologist

according to the WHO histological classification of tumors of the kidney [2] as clear cell RCC

(10 samples), papillary RCC (4 samples), chromophobe RCC (1 sample), 1 clear cell RCC with

extensive sarcomatoid differentiation, and 1 RCC with unclassified origin. The Fuhrman grade

of the samples ranged from II to IV. Most tumor samples showed evidence of necrosis (76%)

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and were larger than 5 cm (82%). The clinical status of the disease was heterogeneous across

the patients: six showed metastasis, three showed locally advanced disease, four showed

localized tumors. Information regarding the evolution of the disease was not available for four

patients. Analysis of hematoxylin/eosin (HE) stained tissue sections showed that the stromal

component was poorly developed across all samples analyzed. Tumor tissue fragments

subsequently processed for RNA isolation should contain at least 80% neoplastic cells, as

determined by HE staining of tissue sections. Histologically normal adjacent renal tissue

fragments were collected from the same patients and examined by HE staining to check that no

neoplastic cells were present. Anatomopathological data from the tumor samples are given in

Table 1.

RNA isolation and target labeling

Total RNA was isolated from the tissue samples (approximately 200 mg) with Trizol reagent

(Invitrogen), quantified by UV spectrophotometry (Nanodrop ND1000) and analyzed for

integrity by inspection of the 18S/28S ribosomal RNA ratios after separation by gel

electrophoresis. For each patient, aliquots containing 20

µ

g total RNA from tumor or adjacent

non-tumor tissue were labeled in parallel with either Cy3- or Cy5-derivatized

deoxyribonucleotides (CyScribe first-strand cDNA labeling kit; GE Healthcare) using a

mixture of oligo-dT and 9-mer random oligonucleotides as primers. We used both oligo-dT and

9-mer random primers to minimize the 3’ bias of the labeled targets, thus optimizing the

detection of noncoding intronic transcripts eventually represented in the arrays by 5’ sequence

clones (see below).

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Microarray experiments

The cDNA probes spotted on the microarray were selected from the over 1 million EST clone

collections generated during the Human Cancer Genome Project, a large-scale EST sequencing

project that used cDNA libraries generated from poly(A) mRNA derived from over 20 different

types of human tumors [14,15]. The construction of the custom-spotted cDNA microarray has

been described elsewhere [8], along with its use for obtaining and comparing gene expression

profiles from a collection of prostate tumor samples. Following an informatics analysis of the

cancer EST dataset, we found that nearly 30% of the transcribed sequences mapped to intronic

or to non-annotated regions of the human genome. On the basis of several criteria, which

included evidence of transcription from at least two different cDNA libraries, we selected a

subset of approximately 4,000 cDNA clones for microarray spotting [8]. These comprised

2,292 cancer-related genes compiled from the Entrez, OMIM and CGAP databases, covering

apoptosis, tumorigenesis, metastasis, cancer metabolism and cancer progression. An additional

set of randomly-sampled no-match clones was included in the microarray, of which 822 were

putative intronic transcript fragments and 241 were fragments from unannotated genomic

regions. The average size of the cDNA probes spotted was 600 bp. Fluorescently-labeled

cDNA targets derived from tumor and non-tumor tissues from each patient were combined and

hybridized to microarrays with an automated slide processor (GE Healthcare), using the

protocols recommended by the manufacturer. Each sample was hybridized to two separate

microarrays, each containing two replicate spots for each probe. Thus, 4 replicate

measurements were generated for each probed transcript from each sample, which allowed

outliers to be excluded and expression measurements to be averaged. For each patient, a

replicate hybridization was performed with dye-swap of labeled targets. Raw and normalized

microarray intensities were deposited in the Gene Expression Omnibus database (GEO −

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under accession number GSE7367.

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Microarray analysis

After hybridization, array images were acquired using a GenerationIII Array Scanner (GE

Healthcare) and visualized with the ImageQuant program (Molecular Dynamics). Cy3 and Cy5

fluorescence intensities from each probe in the array were extracted using ArrayVision

software (Imaging Research Inc.). For each slide, the raw Cy3 and Cy5 intensities were

normalized to each other using a Locally Weighted Scatter plot Smoother (Lowess) algorithm

[16] written in R (http://www.r-project.org/) and filtered by ArrayStat software (Imaging

Research Inc.) to detect and eliminate low-quality outliers. For each sample, the trimmed mean

excluding the 20% lowest and the 20% highest values was calculated and was used to

normalize the data across the experiments [16] to make them comparable (Spotfire Decision

Site, Spotfire Inc.). Further details of microarray experiments and analyses are provided as

supplementary information. The accuracy of the expression measurements is demonstrated by

the high correlation coefficients between technical replicates in the same (intra-slide) or a

different (inter-slide) hybridization. The average correlation coefficient for the intra-slide

replicates was 0.978 + 0.026 and for the inter-slide replicates 0.824 + 0.116. Notably, a high

average correlation was also observed across measurements from different samples, which

indicates that the expression levels of most transcripts interrogated by the 4k microarray are

relatively invariable across the samples tested (average correlation 0.785 + 0.115).

Statistical Analysis

Two-class paired Significance Analysis of Microarrays (SAM) [17] and a paired Z-test [18],

implemented in the ArrayStat analysis suite (Imaging Research Inc.), were used to identify

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transcripts differentially expressed in RCC and adjacent non-tumor tissue. Lists of genes shown

by each approach (SAM or Z-test) to be differentially expressed were combined and only those

found in both lists were considered for further analysis. The robustness of the RCC gene

expression signature was evaluated by sample leave-one-out cross-validation [19]. Essentially,

one sample is removed and a new set of significantly altered genes is determined using the

remaining samples. This procedure was repeated for each of the matched tumor/adjacent non-

tumor tissue samples and the frequency with which each gene from the RCC signature

appeared in the various “leave-one-out” datasets at the chosen significance cutoff (Z-test: p <

0.001; SAM: FDR < 10%) was annotated.

Real-Time RT-PCR

The expression levels of selected transcripts were measured in RCC and matched non-tumor

RNA samples using quantitative real-time RT-PCR essentially as described [9]. To avoid

contamination with genomic DNA, all RNA samples were treated with 1 unit RQ1 RNAse-free

DNAse (Promega) for 30 min at 37ºC in a 15

µ

l volume in the presence of 20 units RNasin

ribonuclease inhibitor (Promega). For exonic transcripts, 2

µ

g total RNA were used to generate

cDNA in 20

µ

l reactions containing 1 unit Superscript III (Invitrogen) and oligo-dT primers.

For intronic transcripts, DNAse-treated total RNA (~600 ng) obtained with an RNAeasy

purification kit (Qiagen) was linearly amplified to produce complementary RNA (cRNA) [20].

The cRNA was subsequently used as template in reverse transcription reactions primed by

random 9-mer oligonucleotides. A 2.5

µ

l sample of reverse-transcribed cDNA was used as

template in real-time PCR reactions (20

µ

l total volume) on a GeneAmp 5700 (Applied

Biosystems) using the SYBR Green PCR kit as described in the manufacturer’s instructions

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(Applied Biosystems). For each sample, a reaction using the template from a mock reverse

transcription (no enzyme added) was performed as a negative control to check for the absence

of genomic contamination. The primers used for real-time PCR are shown as Supplementary

Table 1. For quantitative results, the level of each transcript detected by real-time quantitative

PCR was normalized to the level of



-tubulin and represented as fold change using the



Ct

method [21]. For each pair of matched patient samples, transcript levels in the tumor sample

were expressed as relative fold changes with respect to the value of the target transcript in the

non-tumor adjacent tissue, which was set at unity.

RESULTS

Expression of intronic RNAs in RCC

To assess the expression of intronic noncoding RNAs (ncRNAs) in the kidney, we interrogated

24 RNA samples isolated from tumor or adjacent non-tumor renal tissue from 12 RCC patients

with various histological subtypes, using custom-built microarrays. The tumor samples showed

poorly developed stromal components and the fragments processed for RNA isolation were

enriched (> 80%) in renal epithelial cells. These arrays contain probes mapping to transcribed

regions located in intronic segments of known genes (822 probes), to intergenic regions of the

genome (241 probes), or to coding or untranslated exons of protein–coding genes (2,292

probes). To be considered “expressed” in a given sample, the probe intensities had to exceed a

threshold defined by the average intensity plus three standard deviations of a set of plant-

derived negative control probes deposited in the arrays. We found that comparable fractions of

intronic, intergenic and exonic transcripts were expressed in kidney, both in tumor and in

adjacent non-tumor tissue samples (Figure 1); thus, nearly 80% of the probes in each class

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(intronic, intergenic and exonic) were expressed in at least 5 samples, irrespective of the

histology of the sample (tumor or adjacent non-tumor tissue) (Figure 1). This result shows that

intronic and intergenic RNAs are ubiquitously transcribed in kidney tissues. It also reveals that

the bulk of the intronic transcription occurs equally in tumor and non-neoplastic tissues,

indicating that these messages are likely to have roles in non-pathological cellular states.

Gene expression signatures of clear cell RCC

To identify genes altered in the most prevalent histological type of RCC, we compared the

expression profiles from 6 clear cell RCC samples with those from 6 patient-matched adjacent

non-tumor tissue samples. To reduce the number of false positives (type I errors), we combined

two independent statistical approaches (Z-test and SAM, see Methods for details) to identify

transcripts differentially expressed in RCC tumors. The intersection of 181 differentially-

expressed transcripts identified by SAM (FDR < 10%) with a list of 227 transcripts identified

by the Z-test (p < 0.001) comprised a set of 83 transcripts identified in both analyses, including

8 sequences that map to intronic regions (Table 2). To limit the contribution of individual

samples to identifying a clear cell RCC gene expression signature, we performed a leave-one-

out cross-validation procedure [19]. We found that 64 of the 83 transcripts (77%) identified as

differentially expressed in clear cell RCC by both Z-test and SAM were present in at least 5 out

of the 6 leave-one-out data sets (Figure 2). Most of the selected transcripts (55 out of 64) were

down-regulated in tumors relative to matched adjacent non-malignant tissue (Table 2). Notably,

7 sequences mapped to introns of known genes among the 64-gene set, being 6 of them down-

regulated in RCC. All these intronic RNAs except one are unspliced sequences, the exception

mapping to TACC1 (Genbank accession BF365294). None of the intronic RNAs down-

regulated in RCC has coding potential as determined by ESTScan analysis [22]. To investigate

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whether these 6 intronic RNAs down-regulated in RCC are unprocessed primary transcripts

that could generate known small regulatory RNAs, we compared their sequences with those of

346 snoRNAs [23] and 383 microRNAs [24]; no similarity was found.

Next, we asked whether some of the transcripts identified in the clear cell RCC gene

expression signature were also down-regulated in other differentiation states or histological

subtypes of RCC. To that end, we analyzed the expression profiles of an additional set of 12

matched tumor and adjacent non-tumor tissue samples from 6 RCC patients, including four

samples of papillary RCC, one RCC sample with clear cell origin but exhibiting an extensive

sarcomatoid component, and one RCC sample of unclassified origin (see Table 1). This latter

analysis resulted in a set of 104 transcripts with significantly altered levels (FDR = 5%) in

tumor compared to matched adjacent non-tumor tissues. Cross-validation analysis of the non-

clear cell RCC gene signature (see Methods for details) pointed to 84 transcripts present in at

least 5 out of the 6 leave-one-out datasets. By cross-referencing the 64-gene identified in the

clear cell RCC signature with the 84-gene non-clear cell RCC signature, we found 25

transcripts that were altered in RCC tumor samples irrespective of their differentiation state or

histological subtype (Table 2 and Supplementary Figure 1). The overlap between the

expression signatures of clear cell and non-clear cell RCC was evaluated by randomly sampling

each dataset 1 million times and calculating the frequency at which an overlap of 25 or more

genes was found; this showed high statistical significance (p < 1 x10

-6

). The expression profiles

of these 25 transcripts, which included two transcripts mapping to intronic regions of SLC2A1

or TACC1, were very similar across all RCC subtypes (Supplementary Figure 1).

Validation of novel markers of clear cell RCC by real-time RT-PCR

Five protein-coding transcripts (SIN3B, TRIP3, SYNJ2BP, SDC-2 and MYH11) deregulated in

clear cell RCC were selected for validation by real-time RT-PCR. These experiments

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confirmed that the levels of exonic transcripts from TRIP3 (p < 0.01), SYNJ2BP (p < 0.01) and

SIN3B (p < 0.02) were significantly reduced in clear cell RCC compared to matched adjacent

non-tumor tissues (Figure 3A, B, and C, respectively), while those from MYH11 showed

increased levels in clear cell RCC (p < 0.02) (Figure 3D). Deregulation of these four transcripts

was confirmed in one non-clear cell (subtype chromophobe) RCC sample (Figure 3A−D,

patient P27). Amplification of SDC-2 did not result in a single PCR band and overexpression of

this gene in RCC was not confirmed. The independent validation of selected transcripts in 5

additional clear cell samples by qRT-PCR corroborates the notion that the gene expression

signature identified is consistent across clear cell RCC samples.

Although significant, the increase of MYH11 transcript levels in clear cell RCC tumors

detected by quantitative real-time RT-PCR (Figure 3D) was not in agreement with the

microarray results, which showed reduced expression of MYH11 in tumor relative to adjacent

non-tumor tissue (Table 2 and Figure 2). A more detailed analysis of the genomic region

encompassing the MYH11 locus revealed the presence of another gene, NDE1, which overlaps

the 3’ end of MYH11. In addition, we noted that the double-stranded cDNA probe deposited in

the microarray (Genbank accession: BG876687) is complementary both to the 3’ exon of the

NDE1 transcript and to the 5’- most exon of MYH11. As the labeling protocol favors the

labeling of targets near the 3’ end of poly(A)

+

transcripts, we inferred that the signals measured

in the microarrays were mainly derived from messages originating from NDE1. To test this

hypothesis, we carried out real-time RT-PCR experiments to measure the levels of NDE1

transcripts in tumor and non-tumor samples. The results showed that out of the 8 pairs of

matched samples tested, NDE1 was significantly down-regulated (p < 0.02) in 3 RCC samples

compared to adjacent normal tissues (Figure 3D, patients P3, P27 and P32). In two additional

samples, NDE1 showed a tendency (although not significant) to be reduced in RCC (Figure 3D,

patients P5 and P26).

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Four noncoding intronic transcripts mapping to intronic regions of protein-coding

genes, SND1 (regulation of transcription), ACTN4 (regulation of apoptosis and of progression

through cell cycle), HDAC5 (regulation of transcription and of progression through cell cycle)

and NIBP (enhancer of NF-kappa-B activation) were selected for real time RT-PCR

experiments; down-regulation of intronic RNAs was confirmed for transcripts mapping to

introns of SND1 and ACTN4 loci in RCC tumors relative to adjacent non-tumor tissues (Figure

3E).

Methylation analysis of promoter regions of genes downregulated in RCC

Recent studies have demonstrated that the silencing of tumor suppressor genes by

hypermethylation of promoter CpG islands is common to many types of malignancy [25,26].

Five genes that our analysis showed to be down-regulated in RCC tumors (GPX3, NDE1,

SYNJ2BP, TRIP3 and SIN3B) were tested in 8 matched samples (tumor and adjacent non-tumor

tissue) from 4 RCC patients (P9, P15, P27, and P32) (see Supplementary Information for

details) to investigate the methylation status of CpG islands in their promoter regions. Only

SIN3B showed evidence of methylation, which encompassed CpGs extending from a region

upstream from the transcription start site through the second intron of the gene (see

Supplementary Figure S2). However, no correlation between the methylation pattern of the

CpGs and the histological status of the tissue (tumor, adjacent non-tumor) was observed in the

4 pairs of tumor and matched non-tumor samples tested. This result indicates that promoter

methylation is not a key factor in the down-regulation of these genes in RCC.

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In this study, we analyzed gene expression profiles of 12 matched samples of tumor and non-

neoplastic epithelium from RCC patients using a custom-built cDNA microarray enriched in

intronic noncoding RNA probes. Using stringent statistical criteria, we identified 64 transcripts

differentially expressed in tumors and matched non-tumor tissue samples from 6 patients with

clear cell RCC. The list of genes significantly deregulated in clear cell RCC samples relative to

matched non-tumor tissue was cross-referenced to the list of transcripts deregulated in an

additional set of 6 non-clear cell RCC, and 25 genes proved to be common to both sets, with a

significant overlap (p < 1x10

-6

). The aim of this specific analysis was to identify transcripts that

are deregulated in all RCC irrespective of the differentiation state or histological subtype of the

primary tumor. The histological subtypes represent genetically and phenotypically dissimilar

entities. Nevertheless, our observation that some gene expression changes are common to

different RCC subtypes, and significantly correlated to the neoplastic phenotype, suggests that

these transcriptional alterations may play a role in the process of malignant transformation in

the kidney. Further experiments will be required to clarify these aspects.

The list of protein-coding genes found here to be downregulated in clear cell RCC

was manually cross-referenced with lists of protein-coding genes that previous microarray-

based gene expression studies had shown to be altered in RCC [4,5,27-29]. GPX3, S100A2,

CTSB and EPB41 are known to be down-regulated in RCC [4,27]. Some genes detected in the

present study showed an expression pattern in RCC that was opposite to previous reports

(SLC2A1, up-regulated in [4,27]; CD68, CAPNS1, GSN and ERCC5, up-regulated in [4]). We

found no overlap between the genes identified here with those described in [5,28,29]. Thus,

while some genes have been detected in large-scale gene expression studies comparing tumor

and non-neoplastic renal tissues, most of the protein-coding genes that this work has shown to

be down-regulated in RCC have not been documented previously, making them novel tumor

suppressor candidates for this neoplasia. The expression levels of TRIP3, SIN3B, SYNJ2BP and

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NDE1 were confirmed by real time RT-PCR to be down-regulated in RCC. Retinoic acid (RA)

modulates growth and induces differentiation and apoptosis in neuroblastoma cells in vitro; the

increased expression of TRIP3 in RA−treated cells [30] is in line with a possible tumor

suppressor role for this gene in RCC, as suggested here. SIN3B encodes a protein involved in

transcriptional inhibition through binding to histone deacetylases [31]. SYNJ2BP participates in

the activin signaling pathway [32] and has not previously been associated with cancer. The

NDE1 gene product is part of a centrosome-located protein complex, the disruption of which

leads to abnormal cell division [33].

The genomic coordinates of NDE1 overlap with those of MYH11 and the products of

both loci form a naturally-transcribed sense/antisense transcript pair. Interestingly, we verified

that MYH11 is up-regulated in RCC. MYH11 was previously shown to be up-regulated in RCC

cell lines relative to RCC tissues [6], and in acute myeloid leukemia [34]. In contrast, it is

reportedly down-regulated in metastases relative to primary solid tumors in various tissue types

[35], indicating complex expression of this gene during malignant cell transformation. The

inverse expression patterns of NDE1 and MYH11 in RCC suggests that they may form a

functional regulatory pair. NDE1 and MYH11 show sequence and mapping conservation in

several vertebrate genomes (chimpanzee, mouse, chicken). Moreover, there is evidence

indicating that mouse MYH6, a paralog of human MYH11, is regulated by a naturally-

transcribed antisense RNA [36]. These results warrant further investigation of the relevance of

these findings to the malignant transformation associated with RCC.

Recent work in the literature indicates that a large fraction of the human genome is

transcribed in the form of noncoding RNAs [12,37,38]. Several lines of investigation suggest

that these ncRNAs are not biological noise, but rather parts of yet-uncharacterized regulatory

networks that may modulate gene expression in higher eukaryotes (see [10,13,39] for reviews).

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So far, only a few reports in the literature have related altered expression of certain ncRNAs to

cancer [40-42]. Here we show that intronic ncRNAs are ubiquitously transcribed in tumor and

adjacent non-tumor kidney tissue, extending our previous observations in prostate [8] and head

and neck [43] tissues. A comparable fraction of intronic RNAs were detected in tumor and non-

tumor kidney samples, indicating that intronic transcription is not a characteristic of neoplastic

renal tissues but rather part of the transcriptional output of normal kidney cells. Notably, we

found that a subset of these intronic ncRNAs expressed in kidney was significantly

downregulated in RCC and may therefore have a role in renal carcinogenesis. Among these are

transcripts mapping to intronic segments of ACTN4, HDAC5, SND1, SLC2A1, NIBP and

TACC1. Down-regulation of intronic transcripts mapping to the ACTN4 and SND1 loci in RCC

was further confirmed by quantitative real time RT-PCR.

None of the six intronic RNAs that were downregulated in RCC have protein coding

potential, as determined by ESTScan analysis [22]. It has been proposed that these intronic

ncRNAs may act as cis-regulatory factors, modulating the stability and/or the processing of the

corresponding protein-coding transcript [9,39]. Our group has provided experimental evidence

that intronic RNAs transcribed in antisense orientation may act in cis to modulate the

abundance or the processing of the corresponding protein-coding mRNA in androgen-treated

prostate cancer cells [9]. This cis-acting effect would occur by Watson-Crick base-pairing

between the antisense intronic RNA and the corresponding premature messenger RNA. An

independent group has recently shown that expression of an intronic antisense RNA (Saf gene)

transcribed from the first intron of the FAS gene causes an alternative exon of the protein-

coding sense FAS transcript to be retained [44]. In fact, all the genomic loci that the present

work has shown to harbor intronic transcripts with significantly reduced expression in RCC are

also sources of protein-coding genes that have previously been associated with, or to have

functions that may be related to, cancer. Thus, increased expression of actinin-4, the protein

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product of ACTN4, has been shown to induce cell motility and specifically to promote lymph

node metastasis in colorectal cancer [45]. Down-regulation of HDAC5 has been documented in

patients with colorectal cancer [46,47] and acute myeloid leukemia [48]. SND1 encodes a

Stat6-interacting protein that enhances Stat6-mediated transcriptional activation and gene

expression [49]. Constitutive activation of STAT proteins and aberrant STAT signaling has

been found in solid and hematological tumors [50]. In this context, down-regulation of intronic

SND1 may indicate the involvement of the STAT pathway in RCC carcinogenesis.

Overexpression of SLC2A1 has been associated to the increase in glucose uptake observed in

clear cell RCC [51]. Down-regulation of an intronic transcript mapping to the SLC2A1 locus

raises the possibility that this intronic message may negatively regulate the transcriptional level

of protein-coding SLC2A1. On the basis of the results described above, it is conceivable that the

intronic transcripts shown here to be deregulated in RCC may modulate the level or the

processing of their protein-coding counterparts in a similar manner.

In conclusion, we have described a set of protein-coding and intronic ncRNAs that

are down-regulated in RCC and constitute a valuable resource for identifying novel tumor

suppressor candidates. Although additional studies with larger sets of samples will be required

to produce high-resolution mapping of global transcriptional alterations in intronic noncoding

RNAs in renal neoplastic tissues, the results presented in this report indicate that changes in

some of these transcripts are very homogeneous and reproducible across clear cell RCC

samples, warranting further investigation to determine their role in renal cell carcinogenesis.

Further characterization of these transcripts may shed light into yet-unappreciated molecular

mechanisms involved in tumorigenesis and progression of RCC, and may also contribute to the

development of novel biomarkers and therapeutic targets for the disease.

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ACKNOWLEDGMENTS

The authors thank Dr. Paulo Antônio Faria from the Instituto Nacional de Câncer

(INCA) for additional revision of the anatomopathological data. This work was supported by a

grant from Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP to SVA and

EMR and by fellowships from FAPESP and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico, CNPq, Brasil.

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For Peer Review

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For Peer Review

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FIGURE LEGENDS

Figure 1. Expression of intronic noncoding RNAs in renal tissue. Microarray slides were

hybridized to 24 matched samples of tumor or adjacent non-tumor tissue and positive probes

were identified (see Methods for details). To be considered "expressed", a probe should have an

intensity signal at least 3 standard deviations above the average signal of a set of plant-derived

negative control probes deposited in the arrays. The percentage of expressed probes from each

of the 3 different probe categories (exonic, intronic and intergenic) (Y axis) refers to the

minimum number of tumor or adjacent non-tumor renal tissue samples in which their

expression was observed (X axis). The total number of probes in each category is shown in

parenthesis.

Figure 2. Molecular signature of clear cell RCC. Heat map with the expression levels of 64

genes (rows) with transcript levels significantly altered (p < 0.001 and FDR < 10% in at least 5

out of 6 leave-one-out cross-validation datasets, see Methods for details) among 12 paired

samples of tumor (T) and adjacent non-tumor (N) renal tissue from 6 patients with clear cell

RCC (columns). For each transcript, the relative expression values are given as log2 ratios

(T/N): red indicates higher expression in tumor tissue; blue, higher expression in non-tumor

tissue. Intronic transcripts are indicated by arrows and each is named after the corresponding

protein-coding gene mapping in the same genomic locus.

Figure 3. Expression of candidate markers of RCC. Relative levels of selected exonic (A−D)

and intronic (E) transcripts in tumor tissue samples compared to matched adjacent non-tumor

renal tissue from the same patient were determined by real-time RT-PCR. Genes significantly

altered in tumors relative to matched adjacent non-tumor samples below the p-value threshold

(within parenthesis) are marked with an asterisk: TRIP3 (p < 0.01) (A); SYNJ2BP (p < 0.01)

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For Peer Review

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(B); SIN3B (p < 0.02) (C); MYH11 and NDE1 (p < 0.02) (D); ACTN4 and SND1 (p < 0.05) (E).

For each gene, assays were performed in triplicate. Mean values with error bars are shown. For

each gene tested, the house-keeping gene TUBB was used as the reference for normalization

across patient samples.

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For Peer Review

Table 1. Clinicopathological data from renal cell carcinoma tissue samples.

Patient n° Fuhrman

nuclear

Grade

Histological

subtype

Primary tumor

size (cm)

Evidence of

necrosis

Pathological

staging

Follow-up

(months)

Disease

status

3 IV clear cell 6x7x4 Yes pT3bN0M1 21 metastatic

5 II/IV clear cell 8x8x5 Yes pT2N1M1 6 metastatic

9 II clear cell 8x6 Yes pT3aN0Mx 54 Locally

advanced

12 II clear cell 4x3x2 No pT1aN0Mx n.a. Localized

15 IV clear cell 10x10x8 Yes T3N2Mx n.a. n.a.

24 IV clear cell 15x11x7 Yes pT3aN0Mx 16 metastatic

26 II clear cell 7x6x5 No T3aNXM0 58 Localized

28 III clear cell 5x3x3 Yes pT1bN0Mx 20 Localized

31 II clear cell 8x6 Yes pT3bN2M1 40 metastatic

32 II clear cell 13x8 No pT3aN0Mx 17 Locally

advanced

27 III chromophobe 7x6x3 No pT2N0Mx 68 Localized

4 III/IV papillary 16x11x8 Yes pT3aN0Mx n.a. n.a.

14 IV papillary 8x7x6 Yes pT3bN0M0 58 Locally

advanced

16 III papillary 16X12 Yes pT3aN2Mx n.a. n.a.

19 III papillary 8X7 Yes pT3aN0Mx 49 n.a.

23 IV sarcomatoid

(clear cell)

9x7 Yes pT3bN0Mx n.a. metastatic

22 II unclassified 15x10x9 Yes pT3aN0Mx 7 metastatic

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For Peer Review

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Table 2. The 83-gene set found to be differentially expressed in clear cell renal cell carcinoma.

Probe

accession

Gene locus

Exon/intron

mapping

Log2

T/N

Annotation

Leave-one-out

cross-

validation

Altered in

non-clear

cell RCC

AW837036

GPX3 Exonic -3.7 Glutathione peroxidase 3 6/6 no

AW883439

PRKAG1 Exonic -2.8 AMPK-gamma1 5/6 yes

AW603395

YEATS4 Exonic -2.5 Glioma amplified sequence 41 5/6 yes

AW365027

CSNK1G2 Exonic -2.5 Casein kinase 1, gamma 2 6/6 yes

AW935998

FUS Exonic -2.5 Fusion t(12;16) in malignant liposarcoma) 6/6 yes

BF751544

ICT1 Exonic -2.5 Immature colon carcinoma transcript 1 5/6 yes

AW842748

SIN3B Exonic -2.4 SIN3 homolog B, transcription regulator

(yeast)

6/6 yes

CK327135

SYNJ2BP Exonic -2.4 Synaptojanin 2 binding protein 5/6 yes

BF087349

MAP3K7IP1 Exonic -2.4 Mitogen-activated protein kinase kinase

kinase 7 interacting protein 1

5/6 yes

BF368747

SLC2A1 Intronic -2.4 Solute carrier family,member 1 6/6 yes

BF922962

CTSB Exonic -2.3 Cathepsin B 5/6 yes

BE762727

FVT1 Exonic -2.3 Follicular variant translocation gene 5/6 yes

BG876687 MYH11/NDE1 Exonic -2.3 Myosin heavy chain, smooth muscle

isoform / NUDE1

6/6 yes

AW175991

FLJ34165 Exonic -2.3 CDNA FLJ34165 fis, clone FCBBF3014770 5/6 yes

BF890754

UQCRH Exonic -2.2 Ubiquinol cytochrome c reductase hinge

protein

5/6 yes

AW753128

P2RY1 Exonic -2.2 Purinoceptor P2Y1 5/6 yes

BF857797

C10orf104 Exonic -2.1 Chromosome 10 open reading frame 104 6/6 yes

AW836747

EPAS1 Exonic -2.1 Endothelial PAS domain protein 1 6/6 yes

AW373943

CAPNS1 Exonic -2.0 Calpain, small subunit 1 6/6 yes

BF378949

RAB27A Exonic -2.0 RAB27A 5/6 yes

BE697369

C16orf34 Exonic -2.0 Chromosome 16 open reading frame 34 6/6 yes

AW364435

LDLRAD3 Exonic -2.0 Hypothetical protein LOC143458 6/6 yes

AW884675

MTMR9 Exonic -2.0 Myotubularin related protein 9 5/6 no

AW862491

KIAA0984 Exonic -2.0 Hypothetical protein LOC23329 5/6 yes

BF892704

GSN Exonic -1.9 Gelsolin 6/6 yes

BF831599

VRK2 Exonic -1.9 Vaccinia related kinase 2 5/6 no

BF089987

SND1 Intronic -1.8 Staphylococcal nuclease and tudor domain

containing 1

6/6 no

BF155287

SRF Exonic -1.7 Serum response factor 5/6 no

BF882783

ACTN4 Intronic -1.7 Actinin alpha 4 5/6 no

BF898656

TRIP3 Exonic -1.6 Thyroid hormone receptor interactor 3 6/6 yes

BQ349967 PRDX3 Exonic -1.6 Peroxiredoxin 3 6/6 no

BF736784

SFPQ Exonic -1.6 Splicing factor proline/glutamine-rich 5/6 no

AW819770

RAB4A Exonic -1.6 Ras associated protein Rab4 5/6 no

AW369265

ERCC5 Exonic -1.5 Excision repair, group 5 6/6 no

BF891123

TFEC Exonic -1.5 Transcription factor EC 6/6 no

BE836304

NR4A3 Exonic -1.5 Nuclear receptor subfamily 4, group A,

member 3

6/6 no

BF333281

NIBP Intronic -1.4 NIK and IKK binding protein 5/6 no

AW883175

CASP7 Exonic -1.3 Caspase 7 5/6 no

BE816027

TFDP2 Exonic -1.3 Transcription factor DP2 5/6 no

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For Peer Review

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BF365294 TACC1 Intronic -1.3 Transforming, acidic coiled-coil containing

protein 1

6/6 yes

BF751539

FOXK2 Exonic -1.2 Forkhead box K2 5/6 no

BE153247

MBD2 Exonic -1.2 Methyl CpG binding domain protein 2 5/6 no

BF990000

ENPP1 Exonic -1.2 Ectonucleotide

pyrophosphatase/phosphodiesterase 1

5/6 no

BE720500

S100A2 Exonic -1.1 S100 calcium binding protein A2 5/6 no

BF946916

CHEK1 Exonic -1.0 Cell cycle checkpoint kinase 5/6 no

BF856925

WDR23 Exonic -1.0 WD repeat domain 23 5/6 no

AW361064

PICALM Exonic -1.0 Phosphatidylinositol binding clathrin

assembly protein

5/6 no

AW859979

FLJ39067 Exonic -1.0 CDNA FLJ39067 fis, clone NT2RP7014910 5/6 no

BQ366120 PRCC Exonic -1.0 Renal cell carcinoma, papillary 1 5/6 no

BE697269

SH3PX3 Exonic -0.9 Hypothetical protein MGC32065 5/6 no

BF922401

EPB41 Exonic -0.9 Erythrocyte membrane protein band 4.1 5/6 no

AW939421

MAP2K3 Exonic -0.9 Mitogen-activated protein kinase kinase 3 4/6 no

BQ314686 MSH3 Exonic -0.9 MutS homolog 3 5/6 no

BF946928

DEPDC5 Exonic -0.9 DEP domain containing 5 5/6 no

BG010306 HDAC5 Intronic -0.9 Histone deacetylase 5 5/6 no

BF994346

NDC80 Exonic -0.8 Kinetochore complex component (S.

cerevisiae)

4/6 no

BF360792

RAB25 Intronic -0.8 Ras associated protein RAB25 4/6 no

BF082556

Intergenic -0.7 4/6 no

BQ338721

MCM2 Exonic -0.6 Minichromosome maintenance protein 2 3/6 no

BF092089

TCF3 Exonic -0.6 Transcription factor 3 4/6 no

BE163794

ZBED4 Exonic -0.5 Zinc finger BED domain containing 4 3/6 no

AW748714

ZNF447 Exonic -0.4 Hypothetical protein FLJ12895 5/6 no

BE697330

SAT2 Exonic -0.4 Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 2 4/6 no

AW837043

IL11RA Exonic -0.4 Interleukin 11 receptor alpha 4/6 no

BF087474

GAA Exonic 0.1 Lysosomal alpha glucosidase 3/6 no

AW852125

AK055564 Exonic 0.1 AK055565 3/6 no

BE935243

MDM2 Exonic 0.1 Transformed 3T3 cell double minute 2 2/6 no

AW796066

TP53I3 Exonic 0.1 p53 induced gene 3 2/6 no

BG005977

MLLT7 Exonic 0.1 Myeloid/lymphoid, translocated to 7 3/6 no

BE070310

SDC2 Exonic 0.1 Syndecan 2 2/6 no

BF810617

ADORA2A Exonic 0.1 Adenosine A2 receptor 2/6 no

BF871631

FOXK1 Exonic 0.1 Forkhead box K1 3/6 no

BF957566

TMF1 Exonic 0.1 TATA element modulatory factor 1 2/6 no

BF949348

TCF2 Exonic 0.3 Transcription factor 2 2/6 no

BE837647

POFUT2 Exonic 0.3 Protein O-fucosyltransferase 2 5/6 no

BF987726

H2AFY Intronic 0.3 H2A histone family member Y 5/6 no

BE702107

MAP4 Exonic 0.6 Microtubule associated protein 4 5/6 no

AW880614

RBMX Exonic 0.7 RNA binding motif protein, X-linked 5/6 no

BF997724

PAPPA/AY623011 Exonic 0.7 Pregnancy associated plasma protein A /

DIPLA1-antisense mRNA

5/6 no

BF328211

AK091566 Exonic 1.1 AK091566 5/6 no

AW901127

ARNTL Exonic 1.1 Aryl hydrocarbon receptor nuclear

translocator-like

5/6 no

AW377370

POLL Exonic 1.1 DNA polymerase lambda 5/6 no

AW383947

CD68 Exonic 1.7 CD68 antigen 6/6 no

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John Wiley & Sons

Molecular Carcinogenesis

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