Download PDF
ads:
FLAVIA AXELBAND
A ANGIOTENSINA-(3-4) ANTAGONIZA OS EFEITOS DA
ANGIOTENSINA II NA Ca
2+
-ATPase DE MEMBRANA
PLASMÁTICA RENAL VIA RECEPTORES AT
2
E DISSOCIAÇÃO
DE HETERODÍMEROS AT
1
/AT
2
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU
DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Esta tese foi desenvolvida entre março de 2006 e março de 2008 sob a
orientação do Prof. Adalberto Vieyra no Laboratório de Físico-Química Biológica
Aída Hassón-Voloch do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. O trabalho foi
financiado com auxílios concedidos pelas seguintes agências de fomento: Fundação
Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(Programa Cientistas do Nosso Estado, FAPERJ), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Programa de Apoio aos Núcleos
de Excelência (PRONEX) e Coordenação de Desenvolvimento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES).
ads:
FICHA CATALOGRÁFICA
Axelband, Flavia
Angiotensina-(3-4) antagoniza os efeitos de Angiotensina II na
Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática renal via receptores
AT
2
e dissociação de heterodímeros AT
1
/AT
2
.
Rio de Janeiro, 2008.
177 páginas
Dissertação (Mestrado em Biofísica) −
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, 2008.
Orientador: Adalberto Vieyra
1. Angiotensina-(3-4); 2. Angiotensina II; 3. Rim; 4. Ca
2+
-
ATPase; 5. membrana basolateral; 6. receptores de
angiotensina − Teses
I. Vieyra, Adalberto (Orientador).
II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho
III. Angiotensina-(3-4) antagoniza os efeitos de Angiotensina II
na Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática renal via receptores
AT
2
e dissociação de heterodímeros AT
1
/AT
2
.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente aos meus pais, Jenny e David, por sempre terem
colocado a minha educação em primeiro lugar e me mostrado que com muita força de
vontade é possível se conquistar todos os objetivos. Devo muito a vocês pelo carinho,
amor, apoio emocional e financeiro, compreensão e respeito que têm por mim. Obrigada
por acreditarem e investirem na sua filhinha.
Agradeço ao meu orientador, Adalberto Vieyra, pela ajuda com o seu vasto
conhecimento, que certamente contribui para o meu crescimento intelectual. Desculpe
pelos momentos de teimosia e ansiedade e muito obrigada pela paciência e confiança.
Agradeço à Lucienne Lara da Silva Morcillo: professora, amiga, mãe, anjo da
guarda. Sem os seus ensinamentos, dedicação e apoio eu não seria metade do que sou
como cientista. Só ela sabe o que é tentar me manter calma e confiante para seguir em
frente.
Agradeço ao professor Marcelo Einicker pela amizade e ajuda de sempre e
principalmente por ter me resgatado para o Instituto de Biofísica, em um momento em
que eu só tinha a certeza de que queria trabalhar com pesquisa científica.
Agradeço à professora Jennifer Lowe pelos momentos sérios, como professora e
ótima conselheira, e pelos momentos tranqüilos, como amiga. Obrigada pela ajuda e
força (inesquecíveis no período em que eu estava na UNIFESP).
Agradeço às minhas alunas de iniciação científica, carinhosamente apelidadas de
angiotensininhas:
Obrigada Isabelinha Raposo (minha primeira aluna) pela amizade, excelente trabalho e
pelos ensinamentos quando entrei no laboratório;
Obrigada Fernandinha Ferrão pelo companheirismo durante todo o meu mestrado e
pelos lindos resultados que você me ajudou a obter, pela competência e pelo doce de
pessoa que você é. Fico muito feliz em vê-la hoje no mestrado, dando continuidade ao
trabalho com angiotensina;
Obrigada Ju Dias, minha caçulinha, pela dedicação e ajuda com os experimentos,
principalmente nesta etapa final.
Agradeço ao professor Luiz Juliano por ter me recebido tão bem em seu
laboratório na UNIFESP.
Agradeço à professora Adriana Carmona e sua aluna Nilana, também da
UNIFESP, por todo o carinho e pela ajuda imprescindível com os experimentos da
atividade das peptidases, pelas dicas e sugestões em um período conturbado de tentativa
de descobrimento dos metabólitos de Ang II.
Agradeço ao professor Antônio Miranda (UNIFESP) pela ajuda na análise no
HPLC/MS.
Agradeço ao professor Robson R. Bernardo por ter me ensinado a usar o HPLC.
Sua ajuda foi fundamental para a análise dos metabólitos e suas identificações, assim
como para descobrir as peptidases envolvidas nas suas formações.
Agradeço à professora Valéria F. de Magalhães pela ajuda com o HPLC nos
momentos mais cruciais.
Agradeço à professora Doris Rosenthal pelo carinho e revisão da tese.
Agradeço ao professor Celso Caruso Neves por ter me apresentado ao mundo
científico, por ter me dado base, conhecimento e força para seguir em frente como
pesquisadora e por ter sempre acreditado na minha capacidade.
Agradeço aos meus avós, Rachel e Jayme, pelo amor e apoio de sempre
(principalmente quando os meus pais estiveram no exterior).
Agradeço ao meu irmão, Andre, pelo companheirismo e momentos de
descontração.
Agradeço ao meu namorado, Paulo, pela paciência, amor e compreensão nesta
minha fase conturbada de dedicação quase que exclusiva à tese.
RESUMO
Foi observado pelo nosso laboratório que a angiotensina II (Ang II) em concentrações
picomolares inibe a atividade da Ca
2+
-ATPase (PMCA) de membrana basolateral (MBL) de
túbulos proximais de rim de ovelha através da ativação de um receptor sensível aos antagonistas
de receptores AT
1
e AT
2
, enquanto concentrações superiores a 10
-10
M revertem paulatinamente
esse efeito (Assunção-Miranda et al., 2005). Foram detectados por HPLC dois peptídeos,
denominados M
1
e M
2
, com tempos de retenção de 10,2 min e 11,9 min, respectivamente,
formados após a incubação das MBLs com concentrações micromolares de Ang II. Os objetivos
deste estudo foram identificar estes metabólitos de angiotensina, as peptidases envolvidas nas
suas formações e verificar se o receptor com o qual a Ang II interage para inibir a PMCA é um
heterodímero AT
1
/AT
2
. Foi verificado que o efeito contra-regulatório de M
1
e M
2
é abolido na
presença de antagonista de receptor AT
2
. Embora Ang-(1-7), Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e
Ang-(1-4) revertam a inibição da PMCA promovida por Ang II, esta via não envolve a ativação
de receptores AT
2
. Além disso, a análise por HPLC confirmou que nenhum destes cinco
peptídeos eram os metabólitos desconhecidos, mas que a proteólise destes leva à formação de M
1
e M
2
, identificados como tirosina e Ang-(3-4). Conforme esperado, Ang-(3-4) mimetiza o efeito
de M
1
e M
2
, contra-regulando o efeito inibitório de Ang II sobre a PMCA através da interação
com o receptor AT
2
. A principal via de proteólise de Ang II que leva a formação de tirosina e
Ang-(3-4) na MBL teve com intermediários Ang-(1-7) → Ang-(1-5) → Ang-(1-4) → Ang-(3-4)
e as peptidases envolvidas nestas etapas foram: carboxipeptidase P (CPP), responsável por
catalisar a proteólise de Ang II em Ang-(1-7); enzima conversora de angiotensina (ECA), que
converte Ang-(1-7) em Ang-(1-5) e a neprilisina (NEP) que pode catalisar a formação de Ang-(3-
4) a partir de Ang-(1-4) ou Ang-(1-5) ou converter Ang II diretamente em Ang-(1-4). Através da
técnica de imunopreciptação, foi demonstrado que, em condições basais, heterodímeros AT
1
/AT
2
,
associados ao efeito inibitório de Ang II sobre a PMCA estão presentes na MBL, porém,
concentrações elevadas de Ang II promovem a dissociação destes dímeros.
Assim, o aumento da concentração de Ang II favorece a formação de Ang-(3-4) que
reverte o efeito inibitório do octapeptídeo sobre a PMCA através da dissociação do heterodímero
AT
1
/AT
2
e, possivelmente, também através da modulação da atividade da PMCA via receptores
AT
2
. Portanto, o efeito final de Ang II sobre o transporte acoplado de Ca
2+
seria o resultado da
interação entre os diferentes receptores de Ang II e do balanço entre os níveis de Ang II e seus
derivados.
ABSTRACT
It was found by our laboratory that picomolar concentrations of angiotensin II (Ang II)
inhibit the basolateral membrane (BLM) Ca
2+
-ATPase (PMCA) activity in sheep renal proximal
tubules through an AT
1
and AT
2
antagonist-sensitive receptor, whereas high concentrations
(above 10
-10
M) revert this effect (Assunção-Miranda et al., 2005). After incubation of BLMs
with Ang II in micromolar concentrations, two peptides, called M
1
and M
2
, with 10,2 min and
11,9 min retention times in HPLC, respectively, were formed. The objectives of this study were
identify these angiotensin metabolites, the peptidases involved in their formation and investigate
if the receptor that Ang II interacts for inhibit the PMCA is an AT
1
/AT
2
heterodimer. It was
observed that the M
1
e M
2
contra-regulatory effect is abolished if the AT
2
receptor antagonist is
present. Although Ang-(1-7), Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) revert the PMCA
inhibition promoted by Ang II, their effect does not involve activation of the AT
2
receptor.
Furthermore, HPLC analysis confirmed that none of these five peptides were the unknown
metabolites, but their proteolysis leads to M
1
and M
2
formation, which were identified as tyrosin
and Ang-(3-4). Like expected, Ang-(3-4) mimics the M
1
and M
2
effect, being able to cancel the
inhibitory effect of Ang II on PMCA by interacting with the AT
2
receptor. The main Ang II
proteolysis pathway that leads to tyrosin and Ang-(3-4) formation in BLM had Ang-(1-7) →
Ang-(1-5) → Ang-(1-4) → Ang-(3-4) as intermediates and the peptidases involved in the
sequential conversion were: P carboxipeptidase (PCP), responsible for the convertion of Ang II to
Ang-(1-7); angiotensin converting enzyme (ACE), that converts Ang-(1-7) in Ang-(1-5) and
neprilysin (NEP) that can convert Ang-(1-5) or Ang-(1-4) in Ang-(3-4) and Ang II in Ang-(1-4).
It was demonstrated by immunoprecipitation that AT
1
/AT
2
heterodimers are associated with the
Ang II inhibitory effect on PMCA whereas high concentrations of Ang II promote dimer
dissociation.
In conclusion, Ang II concentrations that favor Ang-(3-4) formation, promote dissociation
of the AT
1
/AT
2
heterodimer and simultaneous recover of the PMCA activity, possibly by
activation of AT
2
receptors. Thus the final effect of Ang II on active Ca
2+
transport would be the
result of the interaction between different angiotensin receptors and the products of its
proteolysis.
ABREVIATURAS
Ang I : Angiotensina I
Ang-(1-4) : Angiotensina-(1-4)
Ang-(1-5) : Angiotensina-(1-5)
Ang-(1-7) : Angiotensina-(1-7)
Ang-(1-9) : Angiotensina-(1-9)
Ang II : Angiotensina II
Ang-(2-7) : Angiotensina-(2-7)
Ang III : Angiotensina-(2-8)
Ang-(3-4) : Angiotensina-(3-4)
Ang-(3-7) : Angiotensina-(3-7)
Ang IV : Angiotensina-(3-8)
BK : Bradicinina
CPP : Carboxipeptidase P
DAG : Diacilglicerol
ECA : Enzima conversora de angiotensina
ECaC : Canal de cálcio de epitélio
EGF : Fator de crescimento epidermal
GPCR : Receptores acoplados a proteína G
HPLC : Cromatografia líquida de alta resolução
IP
3
: Inositol trifosfato
MAPK : Proteínas cinases ativadoras de mitose
MBL : Membrana basolateral
NEP : Neprilisina
NO : Óxido nítrico
NOS : Óxido nítrico sintase
PD123319 :S-(+)-1-([4-(Dimethylamino)-3-methylphenyl]methyl)-5-
. (diphenylacetyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-imidazo(4,5-c)pyridine-6-
. ácido carboxílico
Pi :Fosfato inorgânico
PIP
2
: Fosfoinositídeo bifosfato
PKA : Proteína cinase A (dependente de AMPc)
PKC : Proteína cinase C
PKG : Proteína cinase G
PLC : Fosfolipase C
PLA
2
: Fosfolipase A
2
PLD : Fosfolipase D
PMCA : Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática
PMSF : Fluoreto de fenil-metil-sulfonila
PO : Proliloligopeptidase
PRCP : Prolilcarboxipeptidase
(P)RR : Receptor (pró) renina
SERCA : Ca
2+
-ATPase de retículo sarcoplasmático
SHR : Ratos espontaneamente hipertensos
SRA : Sistema renina-angiotensina
TO : Thimet-oligopeptidase
ÍNDICE
I. Introdução 1
I.1. Hormônios: visão clássica x visão atual 1
I.2. O sistema renina angiotensina, SRA 5
I.3. SRA intrarenal 15
I.4. SRA intrácrino 16
I.5. Receptores e vias desencadeadas por Ang II e seus metabólitos resultantes de
proteólise limitada 18
I.6. Os rins e a homeostasia do meio interno 33
I.7. O íon Ca
2+
e a Ca
2+
-ATPase 45
II. Objetivos 59
II.1. Objetivo geral 59
II.1. Objetivos específicos
III.Materiais e Métodos 61
III.1. Reagentes e soluções 61
III.2. Obtenção de homogenato total e purificação MBLs de túbulos proximais de rins
de ovelha 62
III.3. Identificação dos metabólitos por cromatografia líquida de alta performance
(HPLC) 64
III.4. Dosagem da atividade da PMCA de túbulos proximais renais 65
III.5. Determinação da atividade específica de ECA, ECA2, aminopeptidases e NEP
através da hidrólise dos peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência 67
III.6. Análise da proteólise de Ang-(1-7) e BK por ECA através da cromatografia
líquida de alta performance acoplada a espectrometria de massas (HPLC/MS) 68
III.7. Imunoprecipitação e Western blotting para detecção de heterodímero AT
1
/ AT
2
69
IV. Resultados e Discussão 71
IV.1. Modulação da PMCA por Ang II 71
IV.2. Há receptores envolvidos no efeito contra-regulador dos metabólitos sobre a
atividade da PMCA? 74
IV.3. Efeito dos metabólitos de Ang II sobre a PMCA 79
IV.4.Efeito dos metabólitos de Ang II sobre a PMCA na presença de antagonista de
receptor AT
2
87
IV.5. Identificação dos metabólitos de Ang II envolvidos na reversão da inibição da
PMCA promovida por Ang II 91
IV.6. Efeitos de Ang-(3-4) sobre a PMCA na ausência e presença de Ang II 10
-10
M:
envolvimento de receptores AT
2
104
IV.7. Enzimas envolvidas na metabolização de Ang II 105
IV.8. Ensaio da atividade de diferentes peptidases em MBLs de túbulos proximais
renais 117
IV.9.
Efeito de BK na metabolização de Ang II e Ang-(1-7) 122
IV.10. Investigação da formação de heterodímeros AT /AT na presença de Ang II 10
M e Ang II 10 M 132
1 2
-10
-6
V. Conclusões 143
VI. Referências Bibliográficas 144
1
I. Introdução
I.1. Hormônios: visão clássica x visão atual
Há aproximadamente 100 anos atrás, Ernest H. Starling
1
foi o primeiro cientista a
introduzir o termo hormônio aos nossos dicionários. Esta palavra é proveniente do verbo grego
“hormao”, com significado “eu estimulo”. Tal fato ocorreu em 1905, quando Starling comunicou
a descoberta da secretina no “Croonian Lecture” do Royal College of Physicians (Figura 1).
Neste momento, as secreções internas envolvidas na homeostasia do meio interno, mencionadas
primeiramente por Claude Bernard em 1855, passaram a ser denominadas hormônios
(Henderson, 2005).
Em conseqüência disto, a definição clássica de hormônio, aceita até bem pouco tempo
atrás, era de um grupo heterogêneo de substâncias químicas, sinalizadoras, produzidas em uma
glândula especializada (glândulas endócrinas), liberada na corrente sanguínea e cujos efeitos
fisiológicos ocorriam a longa distância do local de origem, após interação com um receptor na
célula-alvo, com o intuito de re-estabelecer a estabilidade do meio interno, ou seja, a homeostasia
do organismo. Duas propriedades eram atribuídas aos hormônios: alto poder de difusão e
capacidade de atuar em quantidades mínimas.
O conceito da produção apenas em glândulas especializadas foi ultrapassado, visto que
hoje em dia se sabe que estas moléculas sinalizadoras também são produzidas em células de
tecidos não glandulares (adipócitos, miócitos, células renais, entre outros) e o sinal para liberação
1. Ernest Starling (1866-1927) – cientista inglês reconhecido pela descrição das famosas forças de Starling, definidas
pelo balanço entre as pressões hidrostática e oncótica transcapilares, que culminam na determinação da pressão de
ultrafiltração glomerular.
2
Figura 1. O início da carta de Starling publicada no “Croonian Lecture” do Royal College of
Physicians, em 1905, e a frase importante contendo a palavra “hormônios” que aparece na
segunda página da carta (Retirado de Henderson, 2005).
3
dos mesmos não ocorre apenas por fatores endógenos ficando, também, a cargo de estímulos
exógenos como luz e ferormônios. O mesmo ocorre em relação à premissa da ligação do
hormônio a apenas um tipo de receptor, em uma única célula-alvo, uma vez que já se sabe que
um mesmo hormônio normalmente interage com mais de um tipo de receptor, presente nas mais
variadas células (Bouillon, 2003).
Além disso, atualmente, foi desmistificado o paradigma de que as ações dos hormônios
ocorrem apenas a longa distância da célula que o liberou. Desta forma, são hoje aceitas as ações
pelas vias:
1) parácrina - cuja interação ocorre com receptores em células adjacentes (Alberts et al.,
2004);
2) autócrina - cuja interação ocorre com receptores presentes na superfície da própria
célula que a secretou (Alberts et al., 2004);
3) intrácrina - a mais recentemente descrita, baseada na ação intracelular de uma
proteína/peptídeo de sinalização extracelular após a sua internalização pela sua célula-alvo ou
retenção na célula que a sintetizou (Figura 2) (Re & Cook, 2006). Foi enumerada uma série de
quesitos que compõem a hipótese intrácrina (Tabela 1) (Re & Cook, 2006). Para formular esta
hipótese, primeiramente, foi assumido que a proteína/peptídeo deve ser ligada (o) a uma organela
celular que não esteja associada às vias secretórias ou de degradação e ter capacidade de ser
encontrada no espaço extracelular, desencadeando um efeito biológico quando exposta à célula-
alvo (Re, 2003).
Neste contexto, o clássico sistema renina angiotensina (SRA), descrito há mais de um
século, se torna um exemplo perfeito da visão atual que se tem de sistema hormonal, uma vez que
se encontra constantemente em mudanças graças a novas descobertas, rompendo os cânones da
endocrinologia e acompanhando os novos conceitos. A produção de anticorpos, que permitiu o
4
Figura 2. Efeitos intrácrinos podem ser gerados por: (1) translocação do hormônio (H) (ou
fragmentos hormônio/receptor) da superfície da célula à cromatina com ou sem a geração intra-
lisossomal de fragmentos do peptídeo, (2) a ligação do hormônio recém-sintetizado a receptores
intracelulares com a geração se segundos mensageiros, ou (3) a síntese citoplasmática do
hormônio seguido da ligação à cromatina (Retirado de Re & Cook, 2006).
Princípios propostos para ação intrácrina:
1. Apesar de todos serem peptídeos/proteínas sinalizadoras, substâncias intrácrinas são estruturalmente diversas;
2. Tanto as ações do peptídeo na sua célula de síntese como após internalização são consideradas intrácrinas.
3. Os produtos intrácrinos de um gene são frequentemente sintetizados em múltiplas isoformas, das quais algumas
são secretadas e outras ficam retidas para agir no espaço intracelular;
4. As isoformas intrácrinas são sintetizadas frequentemente de várias maneiras através de sítios de início de
transcrição alternativos, “splicing” alternativo, sítios de início de tradução e de início de ribossomo alternativos;
5. Intrácrinos são frequentemente associados fisicamente e funcionalmente com RNA, função ribossomal,
transcrição de DNA e nucléolo;
6. Intrárinos participam de alças de feedback positivo intracelulares;
7. A ação intrácrina (através de alças regulatórias) produz diferentes formas de diferenciação celular, respostas
hormonais alteradas e memórias de várias fontes (incluindo a memória neurológica);
8. Intrácrinos angiogênicos e anti-angiogênicos frequentemente estão associados com o nucléolo.
Tabela 1. Quesitos que compõem a hipótese intrácrina (Adaptado de Re & Cook, 2006).
5
uso de métodos sensíveis como radioimunoensaio e imunohistoquímica para a detecção e
quantificação de componentes do sistema; o uso de ferramentas farmacológicas, como
antagonistas de receptores e inibidores de enzimas do sistema e a introdução de técnicas
modernas em biologia molecular foram os responsáveis pela expansão do conceito do modo de
ação sistêmico tradicional (endócrino) do SRA para incluir efeitos em tecidos locais (parácrino),
nas suas células de síntese (autócrino) e, ainda, em eventos intracelulares (intrácrino) (Re, 1984;
Re & Rovigatti, 1988) – visto que a angiotensina II (Ang II) é capaz de se ligar ao núcleo e a
mitocôndrias (Re, 2003).
I.2. O sistema renina angiotensina, SRA
No final do século XIX, Tigerstedt & Bergman analisando o efeito de extratos renais na
pressão arterial descobriram a presença de um composto pressor, o qual denominaram renina
(revisto por Basso & Terragno, 2001). Baseadas nesta descoberta, inúmeras foram as tentativas
de se desenvolver um modelo experimental de hipertensão arterial pela manipulação da função
renal, que foi bem sucedida, pela primeira vez, em 1934, por Goldblatt e colaboradores. O
modelo desenvolvido consistia na constrição parcial da artéria renal, por um clips de prata
(Goldblatt, et al., 1934). Reproduzindo o modelo criado por Goldblatt, em 1943, o Dr. Braun
Menéndez (líder de um grupo da Argentina) isolou do sangue venoso renal de rim isquêmico de
cachorro uma substância pressora proveniente da renina, a qual nomeou hipertensina.
Simultaneamente, o Dr. Page (líder de um grupo dos EUA) descreveu uma substância similar
nomeada angiotonina (revisto por Basso & Terragno, 2001). Logo, foi demonstrado que a renina,
per si, não era um agente pressor, mas que, atuando sobre uma substância no plasma, poderia
ativar um fator pressor, a denominada angiotonina de Page ou hipertensina de Braun Menéndez.
6
Após a divulgação destes resultados na Conferência Regional da Universidade de Michigan sobre
os Mecanismos Básicos da Hipertensão Arterial foi sugerida a fusão da metade dos dois nomes,
dando origem a angiotensina II (Ang II) (Basso & Terragno, 2001).
A Ang II é um octapeptídeo constituído pela seqüência NH
2
-Asp
1
-Arg
2
-Val
3
-Tyr
4
-Ile
5
-
His
6
-Pro
7
-Phe
8
-COOH. Considerado o principal componente biologicamente ativo do SRA, este
hormônio é o mais potente regulador fisiológico do volume dos fluidos corporais, balanço
eletrolítico e pressão sangüínea em mamíferos. É liberada em situações em que há depleção do
volume extracelular e acarreta vasoconstrição periférica, aumento do volume extracelular e
débito cardíaco, dentre outros processos que, no estado fisiológico, restabelecem a pressão
arterial e a homeostasia dos compartimentos líquidos do organismo. Suas ações ocorrem através
de efeitos diretos nos vasos sanguíneos, na modulação do transporte de íons, síntese de proteínas,
crescimento e diferenciação celular, indução de genes promotores do crescimento, modulação da
síntese de espécies reativas de oxigênio, autacóides, prostanóides e citocinas (Ferrario &
Chappell, 2004). O vasto espectro de tecidos-alvos de Ang II inclui a adrenal, o rim, o cérebro, a
hipófise, o músculo liso vascular e o sistema nervoso simpático (de Gasparo et al., 2000).
A via clássica do SRA (Figura 3A) se inicia pela síntese e secreção de renina pelas células
justaglomerulares das arteríolas aferentes renais. A renina é sintetizada como uma proteína de
401 aminoácidos, a pré-pró-renina que, no retículo endoplasmático, é clivada em um peptídeo
sinal de 20 aminoácidos, a pró-renina (Peach, 1977; Griendling et al., 1993). Esta é empacotada
em grânulos, processada e maturada no aparelho de Golgi formando uma carboxipeptidase
glicosilada com massa molecular de aproximadamente 44 kDa. A renina é então liberada da
célula por exocitose (Griendling et al., 1993) quando ocorre diminuição do volume extracelular.
Três mecanismos são responsáveis pelo processo de síntese e liberação de renina: (1) a
diminuição da carga de sódio detectada pela mácula densa, cujas células possuem característica
7
epitelial, mas atuam como indicador do volume do fluido extracelular, transmitindo sinais
químicos para as células justaglomerulares (células granulares especializadas presentes na parede
da arteríola aferente); (2) a diminuição da pressão de perfusão para os rins promovida pela queda
do volume extracelular detectada por barorreceptores localizados na arteríola aferente; e (3) a
modulação da atividade dos nervos simpáticos, que inervam as arteríolas aferente e eferente, cujo
sinalizador é a noradrenalina que aumenta a secreção de renina através do receptor β1 (Dzau et
al., 1988; Opolski & Filipiak, 2000; DiBona, 2002). Os eventos comuns em todas as vias de
sinalização que estimulam a liberação de renina são o aumento de AMPc, produto da atividade da
adenilato ciclase, e diminuição da concentração intracelular de Ca
2+
nas células
justaglomerulares. Recentemente, foi relatado que o decréscimo de Ca
2+
intracelular ativa
isoformas de adenilato ciclase sensíveis a este íon, aumentando os níveis de AMPc e
conseqüentemente a secreção de renina (Ortiz-Capisano et al., 2007). Outro fator relevante da
regulação da liberação de renina é a própria Ang II. Este peptídeo promove o aumento de Ca
2+
nas células justaglomerulares exercendo, portanto, feedback negativo na liberação renal de renina
(Seldin & Giebisch, 1992).
Além de atuar na circulação clivando angiotensinogênio em angiotensina I (Ang I), a
renina também interage com receptores presentes na membrana de miócitos (Saris et al., 2006),
células mesangiais (Huang et al., 2006) e de músculo liso vascular (Burckle et al., 2006).
Atualmente, foram caracterizados dois receptores de renina e pró-renina (até o momento
considerada inativa, liberada constitutivamente da membrana celular e encontrada no plasma em
concentração dez vezes maior que a renina): o receptor manose 6-fosfato (M6P), que se liga a
qualquer proteína fosfomanosilada, descrito como receptor de internalização de renina e pró-
renina (“clearance receptor”) (Nguyen, 2007) e o receptor específico de (pró) renina, (P)RR,
8
também conhecido como RR/ATP6ap2
2
(L’Huillier et al., 2006). O (P)RR é uma proteína com
350 aminoácidos com um único domínio transmembrana que liga renina e pró-renina com a
mesma afinidade. A interação com este receptor aumenta a atividade catalítica da renina,
aumentando em 4 vezes a conversão de angiotensinogênio a Ang I e, inesperadamente, permite a
ativação completa da pró-renina sem a clivagem do pró-fragmento, fenômeno chamado ativação
não-proteolítica (Nguyen, 2007). Surpreendentemente, foi mostrado que a ativação do (P)RR
pode exercer um papel nocivo em ratos diabéticos deficientes em receptores de Ang II (Ichihara
et al., 2006a), ativar a fosforilação de MAPK (Saris, 2006) e a síntese de moléculas pró-fibróticas
(Huang et al., 2006) independentemente da geração de Ang II. Ainda mais interessante, a
utilização de um peptídeo que se liga ao (P)RR e inibe a sua ativação atenua a nefropatia
diabética (Ichihara et al., 2004) e a fibrose cardíaca (Ichihara et al., 2006b) e o dano renal
(Ichihara et al., 2006c) em ratos espontaneamente hipertensos que sofreram infarto, sugerindo
que a utilização de antagonistas de (P)RR seriam tão ou mais potentes que antagonistas de
receptores de Ang II ou bloqueadores das enzimas que a formam no tratamento destas patologias,
constituindo novos alvos terapêuticos.
No clássico SRA (Figura 3A), a renina secretada na circulação atua sobre o seu substrato
sintetizado no fígado, angiotensinogênio (uma globulina), clivando-o e formando o decapeptídeo
angiotensina I (Ang I) (revisto por Inagami, 1994). A Ang I, um intermediário da cascata sem
ação biológica descrita (Peach, 1977), é convertida em Ang II na circulação pulmonar pela
remoção dos resíduos His
9
-Leu
10
através da enzima conversora de angiotensina (ECA) (Skeggs et
al., 1956) (Figura 3A).
2. ATP6ap2 é uma proteína 2 acessória da H
+
-ATPase e o nome RR/ATP6ap2 foi dado, visto que uma forma
truncada de (P)RR foi inicialmente descrita como co-precipitando com uma H
+
-ATPase vacuolar.
9
and lungs
A.
and lungsand lungs
A.
Ang
Ang
II
Figura 3. SRA clássico (A) e atual (B). JG cells, células justaglomerulares; AP, aminopeptidase;
APA, aminopeptidase A; APN, aminopeptidase N; CP, carboxipeptidase; EP, endopeptidase;
ACE ou ECA, enzima conversora de angiotensina; ECA2, enzima conversora de angiotensina 2;
CPP, carboxipeptidase P; PRCP, prolilcarboxipeptidase; NEP, neprilisina; TO, thimet-
oligopeptidase; PO, prolil-oligopeptidase.
Angiotensinogênio
(NH
2
-NRVYIHPFHLVIHS-COOH)
Ang I
(NH
2
-NRVYIHPFHL-COOH)
renina renal
ECA pulmonar
II
(NH
(NH
2
2
-
-
NRVYIHPF
NRVYIHPF
-
-
COOH
COOH
)
)
renina tecidual
Tecido (fígado, coração, cérebro, rins)
[desAsp
1
] Ang I
(NH
2
-RVYIHPFHL-COOH)
Ang III
(NH
2
-RVYIHPF-COOH)
Ang IV
(NH
2
-VYIHPF-COOH)
Ang-(5-8)
(NH
2
-IHPF-COOH)
Ang-(5-7)
(NH
2
-IHP-COOH)
CP
APN
AP
CP
AP
ECA tecidual
APA
ECA2
CP
AP
Ang-(1-7)
(NH
2
-NRVYIHP-COOH)
Ang-(1-9)
(NH
2
-NRVYIHPFH-COOH)
Ang-(2-7)
(NH
2
-RVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-NRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-NRVY-COOH)
Ang-(3-7)
(NH
2
-VYIHP-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
NEP/TO/PO
ECAEP
EP
AP/ NEP
CP
CPP/PRCP/
ECA2
ECA
B.
Angiotensinogênio
(NH
2
-NRVYIHPFHLVIHS-COOH)
Ang I
(NH
2
-NRVYIHPFHL-COOH)
renina renal
ECA pulmonar
B.
Ang
Ang
II
II
(NH
(NH
2
2
-
-
NRVYIHPF
NRVYIHPF
-
-
COOH
COOH
)
)
renina tecidual
Tecido (fígado, coração, cérebro, rins)
[desAsp
1
] Ang I
(NH
2
-RVYIHPFHL-COOH)
Ang III
(NH
2
-RVYIHPF-COOH)
Ang IV
(NH
2
-VYIHPF-COOH)
Ang-(5-8)
(NH
2
-IHPF-COOH)
Ang-(5-7)
(NH
2
-IHP-COOH)
CP
APN
AP
CP
AP
ECA tecidual
APA
ECA2
CP
AP
Ang-(1-7)
(NH
2
-NRVYIHP-COOH)
Ang-(1-9)
(NH
2
-NRVYIHPFH-COOH)
Ang-(2-7)
(NH
2
-RVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-NRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-NRVY-COOH)
Ang-(3-7)
(NH
2
-VYIHP-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
NEP/TO/PO
ECAEP
EP
AP/ NEP
CP
CPP/PRCP/
ECA2
ECA
D
D
D
D
D
D
Angiotensinogênio
(NH
2
-NRVYIHPFHLVIHS-COOH)
Ang I
(NH
2
-NRVYIHPFHL-COOH)
renina renal
ECA pulmonar
Ang
Ang
II
II
(NH
(NH
2
2
-
-
NRVYIHPF
NRVYIHPF
-
-
COOH
COOH
)
)
renina tecidual
Tecido (fígado, coração, cérebro, rins)
[desAsp
1
] Ang I
(NH
2
-RVYIHPFHL-COOH)
Ang III
(NH
2
-RVYIHPF-COOH)
Ang IV
(NH
2
-VYIHPF-COOH)
Ang-(5-8)
(NH
2
-IHPF-COOH)
Ang-(5-7)
(NH
2
-IHP-COOH)
CP
APN
AP
CP
AP
ECA tecidual
APA
ECA2
CP
AP
Ang-(1-7)
(NH
2
-NRVYIHP-COOH)
Ang-(1-9)
(NH
2
-NRVYIHPFH-COOH)
Ang-(2-7)
(NH
2
-RVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-NRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-NRVY-COOH)
Ang-(3-7)
(NH
2
-VYIHP-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
NEP/TO/PO
ECAEP
EP
AP/ NEP
CP
CPP/PRCP/
ECA2
ECA
B.
Angiotensinogênio
(NH
2
-NRVYIHPFHLVIHS-COOH)
Ang I
(NH
2
-NRVYIHPFHL-COOH)
renina renal
ECA pulmonar
B.
Ang
Ang
II
II
(NH
(NH
2
2
-
-
NRVYIHPF
NRVYIHPF
-
-
COOH
COOH
)
)
renina tecidual
Tecido (fígado, coração, cérebro, rins)
[desAsp
1
] Ang I
(NH
2
-RVYIHPFHL-COOH)
Ang III
(NH
2
-RVYIHPF-COOH)
Ang IV
(NH
2
-VYIHPF-COOH)
Ang-(5-8)
(NH
2
-IHPF-COOH)
Ang-(5-7)
(NH
2
-IHP-COOH)
CP
APN
AP
CP
AP
ECA tecidual
APA
ECA2
CP
AP
Ang-(1-7)
(NH
2
-NRVYIHP-COOH)
Ang-(1-9)
(NH
2
-NRVYIHPFH-COOH)
Ang-(2-7)
(NH
2
-RVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-NRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-NRVY-COOH)
Ang-(3-7)
(NH
2
-VYIHP-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
NEP/TO/PO
ECAEP
EP
AP/ NEP
CP
CPP/PRCP/
ECA2
ECA
DD
DD
DD
DD
DD
DD
10
A ECA (EC 3.4.15.1) também é conhecida como cininase II por ter a capacidade de
hidrolizar bradicininas (BK) (Yang et al., 1970). Esta peptidase também converte angiotensina-
(1-9) [Ang-(1-9)] em angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] e esta última em angiotensina-(1-5) [Ang-
(1-5)] (Shaltout et al., 2006). Trata-se de uma dipeptidilcarboxipeptidase e zinco-metalopeptidase
que existe em duas isoformas: a ECA somática, que possui alta massa molecular (150 a 180
kDa), encontrada nas células endoteliais, epiteliais e neuroepiteliais, e a ECA testicular, de baixa
massa molecular (90 a 110 kDa) encontrada nas células germinativas (El-Dorry et al., 1982). A
primeira isoforma é composta por dois domínios homólogos (domínios amino e carboxi), cada
um contendo um sítio ativo, que diferem na cinética de hidrólise de vários substratos e na sua
suscetibilidade por ativação com Cl
-
e diferentes pHs. A segunda isoforma tem apenas um sítio
ativo que corresponde ao domínio carboxi da isoforma somática (Ehlers et al., 1989, revisto por
Blais et al., 2000). A ECA existe sob a forma ligada a membrana, como ectoenzima, situada na
superfície da célula podendo, assim, hidrolisar peptídeos circulantes, e na forma solúvel, sendo
que a maior parte encontra-se sob a primeira forma (Carey & Siragy, 2003a). Foram relatadas a
presença de diferentes isoformas de ECA de ocorrência natural, que retêm o seu domínio amino e
que foram isoladas da urina de pacientes normotensos (peso molecular de 65 kDa) e hipertensos
(massa molecular de 65 e 90 kDa), sugerindo que esta última possa ser um marcador de
hipertensão (Casarini et al., 2001).
Em células endoteliais, foi visto que a ECA além de atuar como enzima também pode
induzir uma via de sinalização após interagir com os seus inibidores ou com a BK. Esta via é
iniciada com a dimerização da enzima (Kohlstedt et al., 2006) e seguida pela fosforilação de seu
resíduo Ser
1270
mediado por caseína cinase-2 (CK-2), podendo afetar a expressão de uma série de
proteínas, bem como aumentar a sua própria expressão (Kohlstedt et al., 2004).
11
Vias independentes de renina e ECA também foram descritas, nas quais a tonina (uma
serina-protease de citosol) pode agir sobre angiotensinogênio e sintetizar diretamente Ang II
diretamente e a catepsina G (uma lisozima serina-protease) pode ativar a pró-renina, induzindo a
síntese de Ang I a partir do angiotensinogênio (Haulica et al., 2004), enquanto a quimase
(pertencente à família das catepsinas do miocárdio) (Urata et al., 1990) e elastase-2 (uma serina
protease descrita no perfusado do leito mesentérico) (Paula et al., 1998; Santos et al., 2003)
podem gerar Ang II a partir de Ang I. Recentemente foi descoberta a angiotensina 1-12 [Ang-(1-
12)] também proveniente do angiotensinogênio, mas formada independentemente da ação de
renina. Apesar deste precursor parecer não ter atividade biológica, o seu processamento pode
culminar na formação de outras angiotensinas biologicamente ativas (Nagata et al., 2006).
Em 2000 foi descoberto, independentemente por dois grupos, um homólogo humano da
ECA que foi denominado ECAH (Tipnis et al., 2000) ou ECA2 (Donoghue et al., 2000). Esta
enzima tem massa molecular de 85 a 120 kDa, é constituída de 805 aminoácidos e seu domínio
amino terminal (que contém o sítio ativo) compartilha 40% de homologia com o domínio amino
terminal da ECA (Warner et al., 2004; Guy et al., 2005). Assim como a ECA, a ECA2 tem a sua
atividade dependente de pH e ânion, é uma zinco-metalopeptidase e ectopeptidase que funciona
como uma carboxipeptidase, é insensível aos potentes inibidores de ECA, como lisinopril e
captopril, e hidrolisa Ang I a Ang-(1-9), Ang II à Ang-(1-7) e des-Arg-bradicinina a des-Phe-
Arg-bradicinina, não convertendo Ang I em Ang II. A descrição da sua localização primária
ocorreu no coração e rim (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000) dando indícios do seu
importante papel nas funções cardiovascular e renal. Atualmente já se sabe que menores níveis de
ECA2 parecem estar associados a patologias como disfunção cardíaca, hipertensão (Allred et al.,
2002; Crackower et al., 2002) e nefropatia diabética (Tikellis et al., 2003).
12
A Ang II é rapidamente degradada na circulação com uma meia-vida de 13 segundos (de
Gasparo et al., 2000), sendo metabolizada em diferentes ligações peptídicas por peptidases
denominadas angiotensinases (aminopeptidases, carboxipeptidases, endopeptidases, entre outras).
Assim, pela ação da aminopeptidase A (EC 3.4.11.7), a Ang II pode ser convertida a
angiotensina-(2-8) (Ang III), que pode ser depletada do seu último aminoácido N-terminal pela
aminopeptidase N (EC 3.4.11.2, CD 13) gerando a angiotensina-(3-8) (Ang IV) (Figura 3B).
De maneira similar à Ang II, a Ang III também é um fator vasoconstritor que, entretanto,
possui apenas 25% da potência pressora de Ang II (Kramkowski et al., 2006). É postulado que a
Ang III seja responsável pela regulação central da pressão sanguínea, além de participar da
patogênese de doenças renais por aumentar a expressão de genes envolvidos na fibrose
intersticial e glomerular (como fatores de crescimento e proteínas de matriz extracelular) (Ruiz-
Ortega et al., 1998; Kramkowski et al., 2006). Já a Ang IV é conhecida principalmente como um
agente vasodilatador e contrabalanceador das ações de Ang II apesar de também serem descritos
para este peptídeo efeitos similares a Ang II (Kramkowski et al., 2006) (mais detalhes serão
abordados na seção I. 5).
Através da ação de ECA2, prolilcarboxipeptidase (PRCP, EC 3.4.16.2) ou
carboxipeptidase P (CPP, EC 3.4.17.16), a Ang II também pode ser proteolisada em Ang-(1-7)
(Santos et al., 1994; Schmaier, 2003; Ferrario & Chappell, 2004; Kramkowski et al., 2006) que,
ainda, pode ser metabolizada pela ECA em Ang-(1-5) (como descrito anteriormente).
Recentemente, foi visto que Ang II e Ang-(1-7) podem ser hidrolisadas a angiotensina-(1-4)
[(Ang-(1-4)] via neprilisina (NEP, EC 3.4.24.11) e que tanto Ang-(1-4) como Ang-(1-5) podem
ser convertidos em angiotensina-(3-4) [(Ang-(3-4)] via NEP (Shaltout et al., 2007) (Figura 3B).
A aminopeptidase A libera resíduos acídicos da porção N-terminal dos peptídeos,
enquanto a aminopeptidase N libera aminoácidos neutros e básicos. Já a CPP, libera o último
13
aminoácido C-terminal apenas de peptídeos que apresentam Pro ou Ala na penúltima posição
(Mentlein & Roos, 1996) e a NEP cliva preferencialmente ligações peptídicas na região N-
terminal em aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos (revisto por Blais et al., 2000) (Figura 4).
Contudo, estudos in vitro demonstram que a NEP apresenta melhor atividade de carboxipeptidase
do que de endopeptidase em situações em que ambas são possíveis (Malfroy & Schwartz, 1982;
Malfroy & Schwartz, 1985; Quay et al., 1994).
Em relação a Ang I, além de ser convertida a Ang II pela ECA, esta pode sofrer a ação de
endopeptidases que podem retirar o seu resíduo Asp
1
, formando a Des-Asp
1
-Ang I, que também
pode ser clivada pela ECA em Ang III (Ardaillou, 1997) (Figura 3B). Além disso, através da ação
de endopeptidases, como a NEP, prolil-oligopeptidase (EC 3.4.21.26) ou thimetoligopeptidase
(EC 3.4.24.15), a Ang I pode formar Ang-(1-7) ou, sofrendo a ação de ECA2, pode gerar Ang-(1-
9) (como descrito anteriormente) (Ferrario & Chappell, 2004). Muitos destes peptídeos derivados
da proteólise limitada de Ang II, antes descritos apenas como produtos de degradação, possuem
ação biológica (Haulica et al., 2004; Kramkowski et al., 2006), que ocorre, em grande parte,
através da interação com os seus próprios receptores (será visto mais adiante), tornando-os,
portanto, tão importantes quanto a Ang II (Ardaillou, 1997; Handa et al., 1998; de Gasparo et al.,
2000; Santos et al., 2003a) (Figura 3B).
Assim, o SRA clássico que contava com uma restrita cascata, na qual participavam apenas
o angiotensinogênio hepático, a ECA pulmonar e um único peptídeo biologicamente ativo, a Ang
II, foi ampliado para um sistema mais complexo, o SRA atual. Este novo sistema é baseado não
só na atividade biológica de Ang II e no simples SRA sistêmico como também na atividade
biológica de metabólitos provenientes da proteólise limitada de Ang II e na existência de SRA
teciduais e intrácrinos. Além disso, novas enzimas e vias de produção de angiotensina foram
descritas e compõem o SRA atual.
14
Figura 4. As setas indicam os sítios de clivagem de Ang II por peptidases de células de músculo
liso A7r5 e por peptidases purificadas da superfície da célula. AP, aminopeptidase indicada como
P, A ou N. CP, carboxipeptidase indicada como M, N, B ou P. Endopeptidases especificadas
pelos números de nomenclatura da Comissão de Enzimas (EC) da International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) (Retirado de Mentelein & Roots, 1996).
15
I.3. SRA intra-renal
Como mencionado anteriormente, nas últimas duas décadas constatou-se que Ang II não é
um hormônio formado apenas de forma sistêmica mas também é sintetizado localmente em uma
série de tecidos como rins, cérebro, pâncreas, trato reprodutor, coração, tecidos linfático e
adiposo e, ainda, na vasculatura (Carey & Siragy, 2003a; Haller et al., 2006; Paul et al., 2006). O
SRA local ou tissular é caracterizado pela presença de toda a maquinaria molecular necessária
para a biossíntese de Ang II, como angiotensinogênio e as diferentes enzimas conversoras e
angiotensinases específicas para cada tecido (Carey & Siragy, 2003a), e ligação das
angiotensinas com receptores específicos (Kumar et al., 2007).
Nos rins, há expressão de angiotensinogênio (observado em maior concentração nas
células do túbulo proximal), renina e ECA, que levam a formação de Ang II intra-renal (Carey &
Siragy, 2003a). A concentração de Ang II chega a ser aproximadamente 100-1000 vezes maior
no interstício renal (Nishiyama et al., 2002) e no fluido do túbulo proximal (Braam et al., 1993)
em relação ao plasma. Tal fato ocorre por um equilíbrio não específico entre as concentrações de
Ang II plasmática e do fluido extracelular intra-renal, que é devido ao acúmulo pelos rins de Ang
II proveniente da circulação (Navar et al., 2002) e pelo fato da própria Ang II auto-amplificar a
ativação do SRA intra-renal, uma vez que estimula a expressão do RNAm de angiotensinogênio e
a sua biossíntese (Ingelfinger et al., 1999; Kobari et al., 2001). A Ang II formada pode então agir
sobre os seus receptores e desencadear os seus efeitos, ou ser hidrolisada a fragmentos menores
biologicamente ativos, que podem ter efeitos similares ou opostos à mesma (serão abordados
mais detalhadamente adiante).
Neste contexto, foi visto que uma superexpressão renal de angiotensinogênio leva a uma
grande formação intra-renal de Ang II capaz de causar um aumento na pressão sanguínea
16
sistêmica na ausência de alterações nos níveis de Ang II circulante (Davisson et al., 1999). Este
fato sugere que o SRA intra-renal opera ao longo de todo o néfron e contribui para a regulação da
pressão arterial a longo prazo. Além disso, o SRA intra-renal é importante por ser um potente
regulador fisiológico da própria função renal, visto que a interrupção deste sistema local causa
um aumento significativo no fluxo plasmático renal, na taxa de filtração glomerular e na excreção
de sódio e água (Siragy et al., 1990) e em condições de depleção de sódio, a reabsorção deste íon
pelos túbulos renais é mais sensível aos níveis intrarenais de Ang II (Siragy et al., 1987).
Contudo, apesar de ser essencial para a função normal do rim, uma superatividade do SRA
intra-renal ou uma superexpressão dos seus componentes pode levar a modificações da condição
fisiológica, visto que a alteração da hemodinâmica renal e da sua função de transporte, contribui
para o desenvolvimento e manutenção da hipertensão (Navar et al., 2002), sepse e falência renal
aguda (Almeida et al., 2006), falência renal crônica (Graciano et al., 2004), nefropatia diabética
(Carey & Siragy, 2003b) e doença do rim policístico (Loghman-Adham et al., 2004).
I.4. SRA intrácrino
Similar à classificação de SRA em sistêmico ou local, que é definido pela síntese de Ang II
circulatória (SRA clássico) ou tecidual, existe o SRA intracelular, também denominado
intrácrino, que é caracterizado pela presença dos seus componentes dentro da célula e pela síntese
de Ang II em um sítio intracelular. A co-localização de componentes precursores e de enzimas do
SRA na mesma célula, como células renais corticais de rato (Hunt et al., 1992), cromafins
adrenais medulares (Wang et al., 2002) e glandulares pituitárias e até no mesmo grânulo
secretório (Vila-Porcile et al., 1998), além da co-localização do domínio N da ECA com Ang II
no citoplasma e núcleo de células mesangiais renais de ratos Wistar e espontaneamente
17
hipertensos (Camargo de Andrade et al., 2006) sugerem fortemente que Ang II é capaz de ser
sintetizada no meio intracelular. Além disso, estudos em miócitos ventriculares de rato neonatal
(Singh et al., 2007) e células mesangiais renais de rato (Vidotti et al., 2004), mostraram que altas
concentrações de glicose estimulam a síntese intracelular de Ang II, que se localiza
predominantemente no núcleo, corroborando os resultados que demonstram níveis aumentados de
Ang II intracelular em rins de ratos diabéticos (Carey & Siragy, 2003b; Singh et al., 2005).
Embora sem compreensão do seu significado fisiológico, os sítios de ligação intracelulares de
Ang II têm sido mostrados há mais de duas décadas em cromatina de hepatócitos e timócitos (Re
et al., 1984), e no núcleo de hepatócitos e células renais (Booz et al., 1992; Pendergrass et al.,
2006) sendo que no núcleo parece ser um receptor “AT
1
-like” (Lee et al., 2003; Cook et al.,
2004; Cook et al., 2006).
Os mecanismos de respostas desencadeadas pela Ang II intracelular são demonstrados pela
microinjeção de Ang II dentro das células (Haller et al., 1996), transfecção de células com
plasmídeo que expressa angiotensinogênio (Cook et al., 2001) ou Ang II não secretável (Baker et
al., 2006) ou Ang II que é expressa sob controle de determinado promotor (Baker et al., 2004).
Estas respostas podem ser citosólicas, como modificações nas concentrações intracelulares de
Ca
2+
(Haller et al., 1996), ou nucleares, como alterações na expressão de genes, como o aumento
da transcrição do gene do PDGF em células de hepatoma de ratos (Cook et al., 2001) e c-jun
3
,
fator de crescimento “insulina-like 1” e “transforming growth factor-b” em ventrículos cardíacos,
sem que haja alterações nos níveis circulantes de Ang II e na pressão sanguínea (Baker et al.,
2004).
3. c-jun – é uma proteína que forma homodímeros e heterodímeros com Fos e outras proteínas relacionadas a jun.
Juntas estas compõem o fator de transcrição AP-1 que se liga a elementos de resposta a TPA (TREs), mediando a
regulação transcricional em resposta a uma variedade de estímulos.
18
O SRA intracelular provavelmente não representa uma entidade independente, mas uma
extensão ou forma alternativa do SRA local, que pode se manifestar apenas sob certas condições
fisiopatológicas, como hiperglicemia. Contudo, mais estudos precisam ser realizados para a
compreensão da função do SRA intrácrino na fisio(pato)logia.
I.5. Receptores e vias desencadeadas por Ang II e seus metabólitos resultantes de proteólise
limitada
Da mesma forma como ocorre para todos os hormônios, a Ang II e seus derivados
desencadeiam seus efeitos biológicos agindo em receptores localizados nas células alvo. Até
meados do século XX, se acreditava que os efeitos de Ang II eram resultado da ligação do
peptídeo em apenas um único tipo de receptor. Contudo, a comparação de Ang II com um grande
número de agonistas e antagonistas sintéticos, formados pela substituição de vários aminoácidos
de Ang II, indicaram marcadas dissimilaridades entre análogos em cada órgão alvo sugerindo
diferenças na estrutura de sítios receptores (Khosla et al., 1974; Paminopeptidase Adimitriou &
Worcel, 1974; Peach & Levens, 1980). Com a disponibilidade de ferramentas farmacológicas
tornou-se possível a demonstração, em vários tecidos, da existência de pelo menos dois tipos de
receptor, uma vez que foram demonstradas diferentes afinidades por antagonistas não-peptídicos,
como losartan e PD123319 (Chiu et al., 1989; Whitebread et al., 1989; Speth & Kim, 1990),
resultando na subdivisão dos receptores em sensíveis a losartan, mais tarde nomeados de
receptores AT
1
, e naqueles sem afinidade pelo losartan, nomeados de receptores AT
2
. Ambos os
receptores já se encontram clonados e seqüenciados, apresentando apenas 34% de homologia (de
Gasparo et al., 2000) (Figura 5).
19
O receptor humano AT
1
pertence à superfamília dos receptores acoplados a proteína G
(GPCR) que contém sete domínios transmembrana, é composto de 359 aminoácidos, tem 41 kDa
e sua seqüência de aminoácidos é 95% idêntica à dos receptores AT
1
de ratos e bovinos (Bergsma
et al., 1992; Curnow et al., 1992; Furuta et al., 1992). O receptor AT
1
é derivado do gene AGTR1
que contém 5 exons e está localizado no cromossomo 3 na banda q22 (Curnow et al., 1992;
Davies et al., 1994). Em ratos e camundongos, o AT
1
é encontrado em dois subtipos,
denominados AT
1A
e AT
1B
(Guo & Inagami, 1994). O receptor AT
1
é responsável pelas principais
ações de Ang II nas células cardiovasculares, renais, endócrinas, hepáticas e outras. Estas ações
incluem, como mencionado acima, a regulação da pressão arterial, balanço eletrolítico, sede,
secreção de aldosterona, transporte de íons, vasoconstrição periférica, crescimento e proliferação
de células (de Gasparo et al., 2000).
Os aminoácidos do receptor AT
1
que são essenciais para a sua interação com Ang II
incluem quatro resíduos de cisteína, que formam duas pontes de dissulfeto externas, e muitos
outros resíduos localizados nas regiões do receptor expostas à superfície. Contudo, hélices
transmembrana também participam na ligação de Ang II através de aminoácidos como a Lys
199
,
Lys
102
, Ser
105
e His
256
(Yamano et al., 1995; Groblewski et al., 1995; Noda et al., 1995). O
receptor AT
1
contém sítios consenso na sua região citoplasmática para a fosforilação por
serina/treonina cinases, tais como proteína cinase C (PKC) e cinases que fosforilam GPCR (de
Gasparo et al., 2000). Além disso, ainda existem sítios de ligação específicos para os antagonistas
não-peptídicos, como losartan, distintos daqueles envolvidos na ligação de Ang II. Todavia,
ambos os ligantes parecem interagir com resíduos intramembranares comuns localizados entre as
hélices III, V, VI e VII do receptor AT
1
(de Gasparo et al., 2000).
20
Figura 5.
Seqüência de aminoácidos e estrutura do receptor AT de angiotensina de rato
1
. Cys
18
-
Cys
274
e Cys
101
-Cys
180
formam pontes dissulfeto. As linhas pontilhadas indicam interações
específicas entre Ang II e o receptor AT
1
. Os círculos em negrito indicam resíduos homólogos ao
receptor AT
2
(Miura et al., 2003).
21
A ativação completa do receptor AT
1
, induzida por agonistas, parece estar relacionada à
interação entre o resíduo Tyr
4
da Ang II e o resíduo Asn
111
, no terceiro domínio transmembrana
do receptor (Noda et al., 1996), e entre o resíduo Phe
8
da Ang II e o resíduo His
256
, no sexto
domínio transmembrana (Noda et al., 1995): de fato, a troca das posições 4 e 8 entre Tyr
4
e Phe
8
da Ang II levou à síntese do seu primeiro antagonista (Marshall et al., 1970). Enquanto a
atividade biológica de Ang II é altamente dependente da aromaticidade dos resíduos Phe
8
e Tyr
4
(e também de Arg
2
, da aromaticidade do resíduo His
6
e do terminal carboxi carregado), os
resíduos da região N-terminal são importantes para a ligação em AT
1
e a duração da ação de Ang
II e de seus agonistas. Assim, Ang III formada pela deleção de Asp
1
, é hipertensora, embora não
tão potente quanto o octapeptídeo nativo (apresenta apenas 25% da potência pressora de Ang II)
(Kramkowski et al., 2006). Já a Ang IV, formada pela deleção de Asp
1
e Arg
2
, apesar de manter
eficácia biológica, é um agonista fraco, devido à sua baixa afinidade de ligação para o receptor
AT
1
. A Ang-(1-7), que não possui o resíduo Phe
8
, até interage com o receptor AT
1
, porém parece
ter fraca atividade de agonista (de Gasparo et al., 2000).
Quando Ang II se liga ao receptor AT
1
, induz uma mudança conformacional no mesmo,
promovendo a ativação de uma proteína G específica, que já se encontra acoplada ao receptor, no
caso de AT
1
é uma G
q
ou G
i
que, em seguida, desencadeia uma via de transdução de sinal através
de sistemas efetores da membrana plasmática. Estes incluem enzimas como fosfolipase C (PLC)
(Rangel et al., 2002), fosfolipase D (PLD), fosfolipase A
2
(PLA
2
), canais de íons (como os canais
de cálcio voltagem dependente do tipo L e T) e cascatas que se estendem ao núcleo (MAPK,
JAK, STAT) e diferem-se dependendo da proteína G envolvida no processo (de Gasparo et al.,
2000). Há evidências de que a seqüência de aminoácidos do quarto segmento transmembrana do
receptor é o fator determinante para o reconhecimento e a seleção de proteínas G estruturalmente
diferentes (Feng & Karnik, 1999).
22
Os receptores AT
1
estimulados por Ang II são intensamente fosforilados nos seus resíduos
de serina no bolso estrutural central da porção carboxi-terminal. Esta modificação recruta
proteínas chamadas β-arrestinas para o receptor AT
1
ativado, levando a uma rápida endocitose
destes receptores, por vesículas revestidas por clatrina, que uma vez internalizados podem ser
entregues aos lisossomos e degradados ou serem desfosforilados e reciclados para a superfície da
célula (Thomas & Mendelsohn, 2003).
No rim humano, os receptores AT
1
são expressos nas células de músculo liso vascular das
arteríolas aferentes e eferentes, nas células mesangiais, no epitélio tubular (nas membranas apical
e basolateral), nos podócitos glomerulares e nas células intersticiais da medula. A densidade deste
receptor parece ser muito maior na medula do que no córtex renal demonstrando o papel do SRA
na regulação do fluxo sanguíneo medular renal, sendo portanto, um importante modulador da
geração do interstício medular concentrado (Haller et al., 2006).
As ações gerais de Ang II no rim, mediadas pelo receptor AT
1
, resultam no aumento da
reabsorção tubular de Na
+
e água e na vasocontrição periférica, proporcionando dessa forma a
recuperação da diminuição do volume extracelular, assim como a regularização da pressão
arterial. No que diz respeito à reabsorção de Na
+
, a Ang II, geralmente em baixas doses, estimula
os transportadores ativos primários de Na
+
, a (Na
+
+K
+
)ATPase (Féraille & Doucet, 2001) e a
Na
+
-ATPase (Rangel et al., 1999), o co-transportador Na
+
/HCO3
-
e o trocador Na
+
/H
+
do túbulo
proximal e o canal de sódio e trocador Na
+
/H
+
no túbulo distal (Féraille & Doucet, 2001; Carey &
Siragy, 2003a). Adicionalmente, a Ang II reduz o fluxo sanguíneo medular, resultando no
aumento da reabsorção de Na
+
na alça de Henle (Carey & Siragy, 2003a). Este octapeptídeo
também aumenta a reabsorção de sódio indiretamente pela estimulação da produção e secreção de
aldosterona, um mecanismo desencadeado também pela ativação de receptores AT
1
que leva à
23
abertura de canais de Ca
2+
, permitindo o influxo deste íon para as células da supra-renal e a
liberação deste hormônio (Dinh et al., 2001). A aldosterona, por sua vez, age nos segmentos
distais do rim aumentando a condutância de canais de Na
+
e K
+
e a síntese da (Na
+
+K
+
)ATPase,
dos canais de Na
+
e das enzimas mitocondriais que aumentam a produção de ATP (Marsden,
1990; Boldyreff & Wehling, 2003).
Estudos demonstram que a aldosterona diminui a expressão de ECA2 (Keidar et al 2005;
Tallant et al., 2005) e aumenta a expressão de ECA, do receptor AT
1
e da Ang II intra-renal
(Schiffrin, 2006) que, por sua vez, pode induzir a expressão de receptor B
2
de BK – que
compartilha algumas vias de sinalização comuns com a Ang II, amplificando-as (Tan et al., 2003)
– e diminuir a expressão de ECA2 através da ativação do receptor AT
1
(Gallagher et al., 2005),
sugerindo uma forma de feedback positivo e potencialização dos efeitos da própria Ang II via
receptor AT
1
.
Além disso, a Ang II inibe a secreção de renina da mácula densa (Dinh et al., 2001); faz
vasoconstrição nas arteríolas aferente e eferente, além de contração das células mesangiais
glomerulares e vasoconstrição renal. Estas ações vasoconstritoras reduzem o fluxo sanguíneo
renal, a taxa de filtração glomerular e, portanto, também diminuem a carga de Na
+
filtrada.
Assim, estes processos, associados ao aumento da reabsorção tubular de Na
+
, diminuem a
excreção renal deste íon (Carey et al., 2000). Contudo, por ser responsável pelas principais ações
de Ang II, uma maior responsividade ou sensibilidade do receptor AT
1
pode acarretar
modificações das condições fisiológicas, semelhante às descritas quando o SRA intra-renal está
superativado.
O desenvolvimento e a manutenção da hipertensão em modelos animais de hipertensão
genética e experimental, como SHR e ratos Wistar-Kyoto e Dahl, respectivamente, também
podem ser atribuídos à super atividade do SRA cerebral (Wright et al., 1990; Kotlo et al., 2007;
24
Tsujimoto et al., 2007). Os efeitos cerebrais de Ang II são atribuídos a sua conversão a Ang III,
considerada, portanto, a forma central ativa de Ang II. Esta afirmativa só foi possível graças ao
desenvolvimento de inibidores específicos de aminopeptidase A, que hidroliza Ang II a Ang III, e
de aminopeptidase N, que hidroliza Ang III a Ang IV. Dessa forma, foi demonstrado que a
liberação de ADH (hormônio antidiurético) e a elevação da pressão sanguínea são reduzidos tanto
na presença de inibidores de aminopeptidase A quanto de losartan, dependendo então também da
ativação do receptor AT
1
por Ang III (de Gasparo et al., 2000), como quando há infusão
intracerebroventricular de aminopeptidase N. Ao passo que a infusão de aminopeptidase A pela
mesma via tem efeito contrário, elevando a pressão sanguínea (Wright et al., 1990).
As funções fisiológicas de Ang II mais bem descritas são aquelas mediadas pelo receptor
AT
1
acoplado a proteína G
q
, na qual há ativação de PLC, que hidrolisa o fosfoinositídeo bifosfato
(PIP
2
) em inositol trifosfato (IP
3
) e diacilglicerol (DAG), culminando na ativação de PKC e no
aumento dos níveis de Ca
2+
intracelular (de Gasparo et al., 2000; Dinh et al., 2001). Tal
afirmativa pode ser observada pela ativação da Na
+
-ATPase de membrana basolateral de túbulo
proximal por Ang II através desta via (Rangel et al., 2002), sugerindo um envolvimento de Ca
2+
caso fosse utilizado o modelo de célula inteira. Neste contexto, dados prévios do nosso
laboratório demonstraram que a Ang II em concentrações picomolares inibe a Ca
2+
-ATPase de
membrana plasmática (PMCA) de túbulo proximal, o que também eleva as concentrações
intracelulares de Ca
2+
. Este efeito é resultante da interação de Ang II com um receptor que é
sensível tanto a losartan quanto a PD123319 (Assunção-Miranda et al., 2005), sugerindo o
envolvimento de heterodímeros de receptor AT
1
/AT
2
neste sistema ou um novo tipo de receptor.
Entretanto, aumentos progressivos da concentração de Ang II, até aquelas encontradas no
interstício renal (acima de 100 nM), levam à recuperação completa da atividade da PMCA
(Assunção Miranda, 2004).
25
O receptor humano AT
2
possui uma estrutura molecular que se assemelha à da superfamília
de receptores acoplados a proteína G (GPCR), é composto de 363 aminoácidos e cinco sítios
potenciais de glicosilação na porção N-terminal extracelular, responsáveis pelas disparidades de
peso molecular encontradas (varia de 60 a 140 kDa). Sua seqüência de aminoácidos é apenas
72% idêntica à dos receptores AT
2
de ratos sendo esta diferença atribuída às cadeias de
carboidratos inseridas na região N-terminal (de Gasparo et al., 2000). O gene para o receptor AT
2
reside no cromossomo X e contêm três exons com a região codificadora presente inteiramente no
terceiro exon (Ichiki & Inagami, 1995).
A homologia entre os receptores AT
1
e AT
2
reside principalmente nos domínios
hidrofóbicos, que formam as sete hélices transmembrana. Os resíduos destes domínios
considerados essenciais para a ligação de Ang II a AT
1
parecem ser preservados no receptor AT
2
.
Estes incluem Lys
118
(Lys
102
do AT
1
), Arg
183
(Arg
167
do AT
1
) e a Lys
216
(Lys
199
do AT
1
) entre
outros. Em adição, existe um sítio potencial de fosforilação por PKC, três seqüências consenso
para a fosforilação por PKC e um sítio de fosforilação por proteína cinase dependente de AMPc
(PKA) na porção C-terminal citoplasmática do receptor (Griendling et al., 1996).
Os mecanismos de transdução de sinal desencadeados pelo receptor AT
2
ainda não foram
bem definidos, mas parecem envolver vias dependentes de proteína G
i
, já que a estimulação do
receptor ativa fosfotirosina-fosfatases, resultando na inativação de MAPKs (Dinh et al., 2001;
Carey, 2005a), ativa PLA
2
(Haithcock et al., 1999), estimula a produção de ceramida (Berry et
al., 2001) e inibe a Na
+
-ATPase através de uma proteína G
i/0
(Lara et al., 2006).
O receptor AT
2
é altamente expresso nos tecidos mesenquimais fetais, mas sua expressão
diminui rapidamente após o nascimento, exceto no cérebro, miométrio uterino e zona
glomerulosa da adrenal e medula, em que não há regressão substancial. Contudo, apesar da
redução do RNAm do receptor AT
2
, este ainda é claramente detectável por Western blot em rim,
26
coração e vasculatura de adultos (Carey & Siragy, 2000). A expressão deste receptor encontra-se
aumentada na falência cardíaca, infarto do miocárdio, injúria vascular e em situações em que há
restrição alimentar de sódio, e é diminuída por Ang II e fatores de crescimento como o fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de crescimento epidermal (EGF) (Carey &
Siragy, 2000; Carey & Siragy, 2003a).
No rim de adultos, o receptor AT
2
é expresso em células epiteliais glomerulares, túbulos
corticais (preferencialmente na membrana basolateral) e células intersticiais (Ozono et al., 1997;
Féraille & Doucet, 2001), porém em quantidades menores comparada com a dos receptores AT
1
(Zhuo et al., 1992). Este fato demonstra a dificuldade que se tinha, no passado, em elucidar as
ações relacionadas ao receptor AT
2
e explica o porquê, antes de 1995, data a partir da qual
começaram-se os estudos com ratos que não expressavam este receptor, virtualmente todas as
ações renais de Ang II eram atribuídas à ativação do receptor AT
1
(Douglas, 1996).
Em geral, os efeitos desencadeados pelo receptor AT
2
são opostos às ações mediadas
pelo receptor AT
1
. Este princípio se aplica não só ao rim, como também a efeitos neuronais
(Gelband et al., 1997), no trato gastrointestinal (Jin et al., 1998), no coração (Liu et al., 1997;
Murasawa et al., 1998) e no músculo liso vascular (Hannan et al., 2003, Bergaya et al., 2004). No
rim, enquanto o receptor AT
1
promove vasoconstrição e retenção de Na
+
, o receptor AT
2
promove vasodilatação e natriurese. A vasodilatação depende da produção de BK, NO e GMPc
(Gohlke et al., 1998; Tsutsumi et al., 1999), sendo que a liberação de NO pode ocorrer de duas
maneiras: diretamente, através da ativação do receptor AT
2
ou, indiretamente, pela ativação de
receptor B
2
de BK, cuja liberação ocorre pela ativação do receptor AT
2
(Abadir et al., 2003). A
hipotensão provocada pelo uso de losartan ou valsartan, é completamente bloqueada quando se
adiciona antagonista do receptor AT
2
ou do receptor B
2
, ou um inibidor da NO sintase (NOS), o
que demonstra que o receptor AT
2
parece mediar, pelo menos em parte, alguns dos efeitos
27
benéficos dos antagonistas do receptor AT
1
(Siragy & Carey, 1999; Siragy et al, 2000). Neste
sentido, vários estudos têm demonstrado ações vasodilatadoras e hipotensivas mantidas com a
administração contínua de agonistas de receptor AT
2
, demonstrando a sua não dessensibilização
por um estímulo prolongado (ao contrário do que ocorre com o receptor AT
1
), indicando assim
que a sua ativação seria um adjunto apropriado e benéfico ao bloqueio do receptor AT
1
(Carey,
2005b). É interessante ressaltar, ainda, que foram identificados heterodímeros de AT
2
/B
2
que,
quando ativados, levam à produção de NO e GMPc, que se torna máxima quando se utiliza um
agonista parcial de AT
2
juntamente com um antagonista de B
2
(Abadir et al., 2006).
O efeito natriurético pode ser observado quando Ang II, em altas doses, interage com
receptores AT
2
, inibindo, por exemplo, a reabsorção de NaHCO
3
-
nas células de túbulo proximal
de camundongos (Haithcock et al., 1999). Adicionalmente, foi relatado que a ativação de
receptores AT
2
inibe a (Na
+
+K
+
)ATPase de túbulo proximal renal de ratos Sprague-Dawley
(Hakan & Hussain, 2006a), ocorrendo o mesmo em ratos obesos – situação em que há
superexpressão de receptores AT
2
(Hakan & Hussain, 2006b). Recentemente, foi visto, em ratos
que sofreram nefrectomia unilateral, que o bloqueio do receptor AT
1
leva à natriurese pela
ativação de receptores AT
2
via Ang III, mas não via Ang II, sugerindo que o efeito natriurético
estaria atrelado à conversão de Ang II a Ang III (Padia et al., 2006). Além disso, o receptor AT
1
estimula a fosforilação de proteínas e o receptor AT
2
estimula a defosforilação das mesmas,
resultando na inativação de MAPKs estimuladas pelo receptor AT
1
(Dinh et al., 2001; Carey,
2005a), o que contrabalanceia os efeitos de proliferação e crescimento, proporcionados por AT
1
por meio destas cinases e, eventualmente, sobre a natriurese.
Todavia, nem todas as ações mediadas pelo receptor AT
2
são opostas às desencadeadas
pelo receptor AT
1
. Como já mencionado, tanto AT
1
como AT
2
estão envolvidos na reversão da
inibição da atividade da PMCA em MBL de túbulo proximal renal (Assunção-Miranda et al.,
28
2005). Além disso, ambos os receptores agem sinergicamente no aumento da liberação de Ca
2+
citosólico promovido por Ang II em célula epitelial glomerular (Sharma et al., 2001) e parecem
ter o mesmo papel na liberação de noradrenalina na glândula adrenal (Jezova et al., 2003) e em
coração humano (El Muayed et al., 2004). Recentemente, também foi descoberto que o
mecanismo de feedback negativo da excreção, biossíntese e secreção de renina pelas células
justaglomerulares, mediado pelo receptor AT
1
(Johns et al., 1990), é beneficiado pela inibição do
processamento de renina provocada pela ativação do receptor AT
2
(Ichihara et al., 2003) por uma
via dependente de NO e GMPc (Siragy et al., 2007) .
Até meados de 1990, a idéia de que GPCRs poderiam funcionar como dímeros ou
oligômeros não era aceita. Contudo, estudos como o de Monnot e colaboradores, em 1996,
reabriram a questão de dimerização de GPCRs (Bouvier, 2001). Neste estudo foi observado que
dois mutantes pontuais do receptor AT
1
eram incapazes de se ligar a agonistas de receptor AT
1
,
mas que a co-expressão destes mutantes defeituosos permitia a restauração da ligação, devido à
trans-complementação da proteína (Monnot et al., 1996). Assim, as trans-complementações
foram interpretadas como interações intermoleculares entre receptores inativos como forma de
restaurar tanto a ligação ao ligante como domínios de sinalização em um complexo dimérico
(Bouvier, 2001). Atualmente, foi mostrado que os receptores AT
1
e AT
2
podem formar
heterodímeros e que a ligação do receptor AT
2
parece antagonizar as vias de sinalização e
funções do receptor AT
1
independentemente da ativação da proteína G do receptor AT
2
(AbdAlla
et al., 2001a). O receptor AT
1
também pode formar heterodímero com o receptor B
2
de BK,
aumentando a eficácia e potência de Ang II pelo aumento da ativação de G
q
e G
i
, além de alterar
a via endocítica de ambos (AbdAlla et al., 2000). Em mulheres com pré-eclâmpsia, foi detectado
um aumento de heterodímeros de AT
1
/B
2
, mostrando a importância deste mecanismo para o
aumento da responsividade à Ang II na pré-eclâmpsia (AbdAlla et al., 2001b).
29
Parte dos efeitos fisiológicos da Ang III, Ang IV e Ang-(1-7) também é mediada por AT
2
.
Ang III e Ang II possuem a mesma afinidade pelo receptor AT
2
(Rowe & Dixon, B., 2000),
enquanto as Ang IV e Ang-(1-7) – que têm seus próprios receptores (Ardaillou, 1999) – possuem
menor afinidade tanto por AT
1
como por AT
2
. A presença de sítios de ligação específicos para
Ang-(1-7) em células endoteliais de bovinos e fragmentos de rim e estudos usando antagonistas
seletivos para Ang-(1-7), como o A779 e o D-pro
7
-Ang-(1-7), sugeriram a existência de um
receptor distinto dos receptores clássicos de Ang II, o receptor MAS ou AT
1-7
(Santos et al.,
2003a; Silva et al., 2006). Este receptor não se liga a Ang II, é insensível a losartan e PD123319,
e é sensível a A-779 e D-pro
7
-Ang-(1-7) (Santos et al., 2003a; Santos et al., 2003b).
Recentemente, foi evidenciada a existência de um novo subtipo de receptor AT
1-7
, sensível ao D-
pro
7
-Ang-(1-7), mas insensível a A-779, losartan e PD123319 (Silva et al., 2006).
Grande parte das ações de Ang-(1-7) que se opõem às de Ang II são atribuídas a interação
do heptapeptídeo com o seu receptor específico. Neste contexto, foi visto que a ligação deste com
AT
1-7
reduz a atividade da MAPK, inibindo o crescimento de cardiomiócitos (Tallant et al.,
2005), reverte a fibrose cardíaca em modelos de rato “DOCA-salt” (McCollum et al., 2006;
Grobe et al., 2006), abole a hipertrofia cardíaca e fibrose intersticial na hipertrofia cardíaca
dependente de Ang II (Grobe et al., 2007), causa vasodilatação através da estimulação local da
produção de NO e prostaciclinas, amplificando a atividade vasodilatadora de BK (Ferrario &
Chappell, 2004) e, também, por ativar uma via dependente do endotélio em que a produção de
NO é mediada por Akt/fosfatidilinositol 3-cinase (PI-3K) (Sampaio et al., 2007).
A Ang-(1-7) também pode ser considerada um antagonista fisiológico de Ang II, em nível
renal, produzindo natriurese e diurese (Chappel et al., 1998). Contudo, sua influência sobre este
sistema é complexa e dependente da economia de Na
+
corporal e balanço de água, atividade do
nervo renal e ativação do SRA (Santos et al., 2000). Um estudo interessante em SHR tratados
30
com omapatrilat (inibidor de ECA e NEP) relatou a produção de diurese hiposmótica crônica e
pronunciada associada à excreção urinária aumentada de Ang-(1-7) nestes animais (Ferrario et
al., 2002), sugerindo uma ação importante de Ang-(1-7) na modulação da função da vasopressina
nos túbulos renais. Esta hipótese foi mais tarde confirmada através da demonstração da
modulação do sistema da vasopressina por um mecanismo dependente da ativação de adenilato
ciclase mediado pela interação de Ang-(1-7) com o receptor AT
1-7
(Magaldi et al., 2003). Além
dos efeitos diuréticos e natriuréticos, foi observado, em cultura primária de células epiteliais de
túbulo proximal renal, que a Ang-(1-7), através da sua ligação com o receptor MAS, inibe a
fosforilação de três MAPKs (p38, ERK1/ERK2 e c-Jun) estimulada por Ang II (Su et al., 2006).
Apesar da existência do receptor específico de Ang-(1-7), diversos efeitos deste peptídeo
também são atribuídos a sua capacidade de se ligar a outros receptores como AT
1
, AT
2
(Santos et
al., 2000) e AT
4
(Handa et al., 1999), o que explica, pelo menos em parte, a existência de efeitos
bifásicos deste peptídeo. Neste contexto, foi observado que Ang-(1-7) em baixas concentrações
(cerca de 1 pM) exerce efeitos anti-natriuréticos, de forma similar à Ang II, via receptor AT
1
ou
um receptor “AT
1
-like” sensível a losartan (uma vez que Ang-(1-7) parece ter baixa afinidade
pelo receptor AT
1
) através da ativação da Na
+
-ATPase (Caruso-Neves et al., 2000) e do
transporte de NaHCO
3
-
no túbulo proximal (Garcia & Garvin, 1994), enquanto em concentrações
maiores (cerca de 10 nM) inibe a atividade Na
+
-ATPásica (Caruso-Neves et al., 2000) e a
reabsorção de NaHCO
3
-
e água (Garcia & Garvin, 1994). No caso da Na
+
-ATPase, o efeito
inibitório é pronunciado com a utilização de losartan, que desmascara a interação de Ang-(1-7)
com o receptor AT
2
desencadeando a via G
i/0
/ GMPc/ PKG (Lara et al., 2006). Porém, na
presença de Ang II, a Ang-(1-7) atua através do receptor AT
1-7
, revertendo o efeito estimulatório
de Ang II sobre a Na
+
-ATPase (Lara et al., 2002).
31
Em 1996, Handa e colaboradores observaram que a Ang-(1-7) e a Ang-(3-7) inibiam a
atividade da (Na
+
+K
+
)ATPase de túbulo proximal renal (Handa et al., 1996) e que a ativação de
AT
4
reduzia o transporte de Na
+
dependente de energia neste mesmo segmento (refletindo a
redução da atividade da (Na
+
+K
+
)ATPase) (Handa et al., 1998). Posteriormente, o mesmo grupo
relatou a interação de Ang-(3-7) com o receptor AT
4
, sugerindo que a Ang-(1-7) poderia inibir a
(Na
+
+K
+
)ATPase de túbulo proximal renal através da interação do seu metabólito, Ang-(3-7),
com o receptor AT
4
(Handa, 1999).
O receptor AT
4
é uma zinco-metalopeptidase composta de 1025 aminoácidos, que
apresenta massa molecular em torno de 165 kDa (Thomas & Mendelsohn, 2003). Possui alta
especificidade e afinidade para Ang IV e é antagonizado pelo divalinal-Ang IV. Porém, outros
peptídeos como o LVV-hemorfina-7 são capazes de se ligar e ativar este receptor, o que de fato
não é surpreendente, dado que o requerimento mínimo para um ligante interagir com AT
4
parece
ser Val-Tyr-Ile-R
1
-R
2
, apesar da atividade agonística parecer necessitar da adição de fenilalanina
na porção carboxi-terminal (Val-Tyr-Ile-R
1
-R
2
-Phe) (de Gasparo et al., 2000). A purificação e
sequenciamento de AT
4
(IRAP, EC 3.4.11.3) demonstrou que este receptor é uma
aminopeptidase regulada por insulina, originalmente identificada em vesículas contendo GLUT-
4, que são translocadas para a superfície da célula, e se fundem com a membrana plasmática, na
presença de insulina. A presença de sítios consenso para a fosforilação por PKA e PKC, sugerem
que sinalizações intracelulares que ativem estas cinases possam fosforilar e regular a expressão,
processamento e função de AT
4
na superfície da célula (Thomas & Mendelsohn, 2003).
O receptor AT
4
é encontrado em cérebro, aorta, coração, pulmões, útero, cólon, próstata,
adrenal, rim (nas estruturas tubulares e nos glomérulos superficiais e medianos), músculo liso
vascular e células endoteliais de diversas espécies (Thomas & Mendelsohn, 2003).
32
A ligação de Ang IV ao receptor IRAP/AT4 inibe a sua atividade catalítica, sugerindo que
um de seus mecanismos de ação seja a redução da clivagem de neuropeptídeos, prolongando os
seus efeitos e facilitando processos de memória e aprendizado e talvez também possa modular os
níveis de peptídeos envolvidos na regulação do tráfego de GLUT-4 (Albiston et al., 2001). Além
disto, da mesma forma que os receptores AT
2
, a ativação de AT
4
por Ang IV também pode
antagonizar os efeitos desencadeados pelos receptores AT
1
, inibindo a hipertrofia cardíaca,
reduzindo a atividade (Na
+
+K
+
)ATPasica no túbulo proximal (Handa et al., 1998; de Gasparo et
al., 2000) e elevando o fluxo sanguíneo cerebral e cortical renal através da liberação de NO de
células endoteliais vasculares (de Gasparo et al., 2000). Adicionalmente, foi visto que Ang IV é
capaz de inibir a contração de células mesangiais induzida pela Ang II sugerindo que, via
receptor AT
4
, a Ang IV possa modular parâmetros da função glomerular, como a permeabilidade
e a filtração (Ardaillou & Chansel, 1997). Da mesma maneira que a Ang-(1-7), a Ang IV também
pode interagir com outros receptores além do seu específico, provocando respostas opostas
àquelas desencadeadas com a sua ligação em AT
4
. Assim, foi observado que a sua interação com
o receptor AT
1
leva à redução do fluxo sanguíneo renal e mesentérico, e redução da condutância
vascular (de Gasparo et al., 2000).
Em suma, além de Ang II gerar respostas opostas via seus receptores clássicos, AT
1
e AT
2
,
alguns de seus metabólitos, atuando em receptores AT
1
, AT
2
ou em seus receptores específicos,
também tem a capacidade de desencadear diversas ações biológicas que podem ser similares ou,
principalmente, opostas às de Ang II, constituindo um mecanismo complexo próprio de
contrabalanço e autoregulação do SRA.
33
I.6. Os rins e a homeostasia do meio interno
Os rins possuem funções endócrinas e homeostáticas essenciais para o funcionamento do
organismo, além de terem um papel fundamental na excreção de produtos do metabolismo e
substâncias estranhas. Embora este órgão não seja uma glândula endócrina, as células
justaglomerulares renais são responsáveis pela síntese e liberação de renina, que não só leva à
formação de Ang II circulante como também a formação de Ang II intra-renal que, como já
mencionado, é essencial para a regulação da pressão arterial (Davisson et al., 1999) e da própria
função renal (Siragy et al., 1990). A eritropoietina e o calcitriol (1,25-(OH)2vitD3) são exemplos
de outros hormônios também sintetizados e secretados pelos rins. Os rins também são os
principais órgãos responsáveis pela homeostasia do meio interno através da regulação e
manutenção da composição, da osmolaridade, do pH e do volume dos compartimentos dos
líquidos corporais dentro de um limite bastante estreito, eliminando assim o efeito de grandes
variações promovidas pela absorção de alimentos, água e fatores ambientais (Berne & Levi,
2000).
O meio interno do organismo humano é constituído de dois compartimentos líquidos
corporais: o meio intracelular – delimitado pela membrana plasmática das células – e o meio
extracelular – que consta de interstício, meio transcelular e plasmático. Estes compartimentos
apresentam diferenças em seus volumes e suas composições, as quais ocorrem devido aos
mecanismos de transporte iônico presentes nas membranas celulares, que leva então a
distribuição assimétrica de determinados íons. Esta assimetria, contudo, não altera o equilíbrio
osmótico e ainda garante as peculiaridades necessárias para que as células realizem as suas
funções (Figura 6).
34
MEIO
INTRACELULAR
MEIO
INTERSTICIAL
MEIO
PLASMÁTICO
MEIO
TRANSCELULAR
MEIO INTRACELULAR
(mEq/L H
2
O)
14 Na
+
140 K
+
1e
-4
Ca
2+
20 Mg
2+
4 Cl
-
10 HCO
3
–
0.1 PO
4
3-
1 SO
4
2-
MEIO EXTRACELULAR
transcelular + intersticial + plasmático
(mEq/L H
2
O)
142 Na
+
4,2 K
+
1,3 Ca
2+
0.8 Mg
2+
108 Cl
-
24 HCO
3
–
2 PO
4
3-
0,5 SO
4
2-
MEIO
INTRACELULAR
MEIO
INTERSTICIAL
MEIO
PLASMÁTICO
MEIO
TRANSCELULAR
MEIO INTRACELULAR
(mEq/L H
2
O)
14 Na
+
140 K
+
1e
-4
Ca
2+
20 Mg
2+
4 Cl
-
10 HCO
3
–
0.1 PO
4
3-
1 SO
4
2-
MEIO EXTRACELULAR
transcelular + intersticial + plasmático
(mEq/L H
2
O)
142 Na
+
4,2 K
+
1,3 Ca
2+
0.8 Mg
2+
108 Cl
-
24 HCO
3
–
2 PO
4
3-
0,5 SO
4
2-
MEIO
INTRACELULAR
MEIO
INTERSTICIAL
MEIO
PLASMÁTICO
MEIO
TRANSCELULAR
MEIO
INTRACELULAR
MEIO
INTERSTICIAL
MEIO
PLASMÁTICO
MEIO
TRANSCELULAR
MEIO INTRACELULAR
(mEq/L H
2
O)
14 Na
+
140 K
+
1e
-4
Ca
2+
20 Mg
2+
4 Cl
-
10 HCO
3
–
0.1 PO
4
3-
1 SO
4
2-
MEIO EXTRACELULAR
transcelular + intersticial + plasmático
(mEq/L H
2
O)
142 Na
+
4,2 K
+
1,3 Ca
2+
0.8 Mg
2+
108 Cl
-
24 HCO
3
–
2 PO
4
3-
0,5 SO
4
2-
Figura 6. Composição do meio extra e intracelular
35
Neste sentido, o K
+
aparece como o principal cátion intracelular, enquanto o Na
+
é o
principal cátion presente no meio extracelular. A diferença de concentração destes íons entre os
meios intra e extracelular ocorre devido à alta permeabilidade da membrana ao K
+
e à baixa
permeabilidade ao Na
+
, em função da grande camada de solvatação que este último apresenta.
Por causa disto, a bicamada lipídica da membrana plasmática torna-se praticamente impermeável
para a difusão simples do Na
+
. Esta condição ainda é reforçada graças à atividade da
(Na
+
+K
+
)ATPase presente na membrana celular, que transfere de forma altamente eficiente íons
Na
+
para o meio extracelular às custas da hidrólise de ATP (Mello-Aires et al., 1999; Férraile &
Doucet, 2001).
Assim, a abundância de Na
+
no meio extracelular faz deste íon o principal componente
osmótico dos líquidos extracelulares e, portanto, determinante do seu volume. Dessa forma,
também são mantidas baixas concentrações intracelulares de Na
+
, evitando o rompimento das
células. Como a regulação da pressão arterial está intimamente associada ao volume extracelular,
os rins, principais rotas pelas quais o Na
+
é eliminado do organismo, são os órgãos centrais na
estabilidade a longo prazo da pressão arterial (revisto por Mullins et al., 2006). O fato dos rins
serem altamente vascularizados, recebendo cerca de 20% do débito cardíaco, sugere um efeito
ainda maior destes na pressão arterial ou, no mínimo, que estes órgãos possam ser profundamente
lesados quando se instalam quadros hipertensivos (lembrando que a pressão arterial é o produto
do débito cardíaco pela resistência vascular periférica) (Davies et al., 2001). O Na
+
também dirige
o transporte da maioria dos nutrientes para as células animais (através de co-transportadores de
Na
+
com aminoácidos ou glicose) e tem um papel fundamental na regulação do pH citosólico
(através da sua permuta por H
+
), dos impulsos nervosos e das contrações musculares (como
resultado do seu influxo através de canais).
36
O Ca
2+
, na sua forma livre, é um íon encontrado em baixas concentrações tanto no meio
intracelular (em torno de 100-200 nM) como no meio extracelular (cerca de 1 mM) chegando a
ser, portanto, três a quatro ordens de grandeza maior no meio extracelular do que no citosol
(Berridge et al., 2003). Suas baixas concentrações dentro da célula e seu rápido aumento
transitório neste compartimento em resposta a determinados estímulos levaram ao
reconhecimento de que este elemento é um segundo mensageiro essencial que acompanha as
células durante a sua vida, desde a sua origem na fertilização, até a sua morte por apoptose
(Carafoli, 2002). Dessa forma, além de ser um componente essencial de ossos e dentes, o Ca
2+
,
como segundo mensageiro, atua no acoplamento hormônio-resposta, participando de vários
processos celulares, como proliferação, diferenciação, movimentação e apoptose celular
(Nowycky & Thomas, 2002), e no acoplamento entre estímulo elétrico e resposta, participando
dos processos de contração muscular e liberação de neurotransmissores (Berne e Levi, 2000). O
papel do Ca
2+
e dos sistemas celulares que o processam será retomado mais adiante.
O balanço apropriado de água e íons em mamíferos é resultado do equilíbrio entre a
ingestão e excreção dos mesmos, sendo este último mecanismo quase exclusivamente dependente
da função renal
4
. Logo, os níveis destes elementos são mantidos dentro de um limite bastante
estreito de variação através dos processos de filtração e de reabsorção e secreção renais (Berne &
Levi, 2000). Estes últimos processos ocorrem por meio de transportadores específicos,
distribuídos de forma heterogênea nos diferentes segmentos dos rins, que transportam uma
grande variedade de substratos e são controlados finamente por hormônios e outros fatores.
Como exemplos de hormônios natriuréticos/diuréticos e antinatriuréticos/antidiuréticos, ou seja,
hormônios envolvidos na homeostasia de Na
+
e água podemos citar Ang II, aldosterona, fator
4. O termo “excreção” não inclui a eliminação de água pela respiração e através da perspiração que, em um adulto
humano equivalem em conjunto à eliminação pela urina.
37
atrial natriurético (FAN), ADH, dopamina, insulina, adrenalina, noradrenalina, entre outros
(Féraille & Doucet, 2001); e como exemplo de hormônios calciotrópicos clássicos temos PTH,
vitamina D
3
e calcitonina (Hoenderop et al., 2000; Negri, 2006).
A unidade funcional dos rins é o néfron. Todo rim humano contém aproximadamente 1,2
milhão de néfrons, os quais consistem do corpúsculo renal (formado pelos capilares glomerulares
e cápsula de Bowman), responsável pela filtração do plasma, e de uma estrutura tubular,
responsável pelos processos de reabsorção e secreção de água e eletrólitos (Berne & Levi, 2000)
(Figura 7). As células dos túbulos renais são constituídas de uma camada contínua de células
epiteliais, cuja função fundamental é separar diferentes compartimentos do organismo e regular a
troca de substâncias entre eles (Figura 7). As junções aderentes (“tight junctions”), domínios de
membrana especializados que mantêm estas células unidas lateralmente, são as responsáveis pela
característica polarização das células epiteliais, dividindo a membrana plasmática em porção
apical (que fica em contato com o lúmem do túbulo) e basolateral (que fica em contato com o
interstício). Estas junções evitam a difusão lateral de constituintes da membrana, mantendo as
diferenças na estrutura e na composição de transportadores e redes regulatórias entre a membrana
apical (AP) e a basolateral (MBL) (Gonzalez-Mariscal et al., 2003). Além disso, estas junções,
formam uma barreira seletiva para a passagem de íons e pequenas moléculas através do espaço
intercelular (Anderson et al., 2001), rota que é denominada via paracelular.
A parte tubular dos néfrons é constituída do túbulo proximal, alça de Henle (subdividida
em ramos descendente fino e ascendentes fino e espesso), túbulo distal e ductos coletores (Berne
e Levi, 2000) (Figura 7). Esta subdivisão dos túbulos é baseada na diferença da estrutura celular e
na presença de diferentes transportadores nas membranas apical e basolateral destas células. Com
isso, cada segmento possui uma característica estrutural e funções específicas de transporte de
solutos e água (Féraille & Doucet, 2001).
38
membrana apical (MA)
membrana basolateral (MBL)
membrana apical (MA)
membrana basolateral (MBL)
Figura 7. Estrutura do néfron e células epiteliais de alguns segmentos. Existem dois tipos de
néfrons, os quais diferenciam-se pela proporção entre seus segmentos tubulares. Nos néfrons
corticais, a alça de Henle é curta e nos néfrons justamedulares, a alça de Henle atinge a medula
interna. Na estrutura do néfron, A, B e C demarcam o túbulo proximal, o ramo fino descendente
da alça de Henle e o túbulo distal, cujas células, com diferenças estruturais, são representadas
esquematicamente logo abaixo. Repare que em A, a célula do túbulo proximal apresenta a
membrana luminal com uma borda em escova bastante definida e próximo a membrana
basolateral (que possui muitas ATPases), grande quantidade de mitocôndrias. Estas
características garantem ao túbulo proximal a enorme capacidade de reabsorção. A célula B
possui poucas mitocôndrias e microvilosidades, já a C possui muitas mitocôndrias (Retirado de
Davies et al., 2001).
39
Existe uma região de contato do túbulo distal com a arteríola aferente. Nesta região, as
células do epitélio distal sofrem uma modificação formando a mácula densa. As células da parede
da arter
encontra na região mais profunda do córtex
e mais
íola aferente presente nesta região de interseção também são modificadas, apresentando o
citoplasma rico em grânulos de renina e dando origem as chamadas células justaglomerulares
(Seldin & Geibisch, 1992). Este conjunto forma então o aparelho justaglomerular, responsável
pela liberação de renina a partir de sinais gerados na mácula densa e nos barorreceptores
presentes nas arteríolas aferente e eferente, bem como resultado da ativação simpática local e
sistêmica (como descrito anteriormente) (Figura 8).
O túbulo proximal, modelo experimental utilizado na tese, possui uma porção convoluta,
localizada próxima ao glomérulo, e outra reta, que se
externa da medula (Figura 7). Esse segmento tubular é revestido por um epitélio cúbico
simples e suas MA e MBL apresentam grandes diferenças em suas morfologias. A MA apresenta
numerosas microvilosidades em forma de dedo de luva, cujo aspecto dá origem à expressão
“borda-em-escova”, o que aumenta muito a área de reabsorção. A MBL é mais alargada, possui
um grande número de prolongamentos laterais e é altamente invaginada (Figura 7). Nestas
invaginações há muitas mitocôndrias próximas a MBL (Mello-Aires et al., 1999; Féraille &
Doucet, 2001), dando indícios claros da presença de transportadores ativos nesta região. Apesar
das diferenças, ambas, as microvilosidades apicais como as invaginações basolaterais aumentam
consideravelmente a área de membrana disponível para transporte. Além disso, a pouca
densidade de cristas nas junções aderentes resulta em uma fraca adesão entre as células
adjacentes, formando um epitélio frouxo, o que leva a uma via paracelular de elevada
permeabilidade.
40
igura 8. Representação esquemática do aparelho justaglomerular. Três mecanismos acarretam
a liberação de renina pelas células justaglomerulares: (1) ativação do sistema simpático em
ecorrência da diminuição do volume extracelular; (2) diminuição da pressão de perfusão da
rteríola aferente e (3) diminuição da carga de NaCl no túbulo distal (adaptado de
ww.med.mun.ca/anatomyts/renal/akid3.htm
F
n
d
a
w e www2j.biglobe.ne.jp/~fkamiya/HB/C09
57.html).
.
41
Dessa forma, em condições euvolêmicas, o túbulo proximal reabsorve cerca de 70% a
0% do Na
+
, K
+
, Ca
2+
, Cl
-
, HCO
3
-
, HPO
4
-
e água do filtrado glomerular e virtualmente a
talidade de glicose e aminoácidos filtrados (Féraille & Doucet, 2001; Hoenderop, et al., 2005)
ide Figura 9 para as percentagens de reabsorção de Na
+
e Ca
2+
). A reabsorção destes solutos
nsporte de Ca
2+
se dá pela via paracelular por meio de arraste pelo solvente (“solvent drag”) e
beneficiado pela diferença de potencial lúmen-positivo nos segmentos finais do túbulo proximal
gerada pela difusão transcelular de solutos como o Cl
-
(Mello-Aires, 1999). O 1/3 restante do
transpo e Ca
2+
ocorre pela via transcelular, com participação da Ca
2+
-ATPase presente apenas
na membrana basolateral das células do túbulo proximal (Vieyra, 1996) (Figura 10). Esta enzima
juntam
8
to
(v
pode ocorrer tanto passivamente pela via paracelular (pelo espaço intercelular), como ativamente
por via transcelular: pela célula através de diferentes transportadores localizados na MA e MBL
em muitos casos acoplando o transporte de Na
+
com o de outras espécies, iônicas e não iônicas
(Figura 10). A exemplo, enquanto 2/3 do transporte de Na
+
ocorre pela via transcelular, 2/3 do
tra
rte d
ente com as proteínas citoplasmáticas ligadoras de Ca
2+
e com os sistemas de sequestro
deste íon para estoques intracelulares (serão abordados mais adiante) (Carafoli & Brini, 2000)
mantêm baixas as concentrações citosólicas de Ca
2+
livre favorecendo, assim, a sua entrada na
célula através de canais de Ca
2+
presentes na MA (Bronner et al., 1989; Friedman, 2000). A
presença do trocador Na
+
/Ca
2+
(NCX) na MBL de túbulos proximais, participando da extrusão do
Ca
2+
conjuntamente com a Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática (PMCA), ainda é controversa.
Sua localização nesta porção do néfron foi demonstrada bioquimicamente (Friedman et al.,
1981), mas a imunocitoquímica demonstrou uma expressão muito pequena deste trocador
(Seldin, 1999).
O transporte transcelular de Na
+
ao longo de todo o néfron, inclusive no túbulo proximal,
é dependente da força motriz gerada pela atividade da (Na
+
+K
+
)-ATPase e da Na
+
-ATPase
42
Figura 9. Percentagens da reabsorção de Na
+
e Ca
2+
ao longo do néfron em condições
euvolêmicas.
A. B.A. B.
43
tr
al. Estes transportadores encontram-se assimetricamente distribuídos nas
membranas apical (MA) e basolateral (MBL). Na MA, ocorre a predominância do transporte
passivo e ativo secundário, já a MBL é rica em transportadores que utilizam o ATP como fonte
de energia para a realização do transporte. Note que a reabsorção de Ca
2+
no túbulo proximal
ocorre pelas vias paracelular e transcelular. Nesta última, a reabsorção é dependente da Ca
2+
-
ATPase de membrana plasmática (PMCA, em vermelho). Esta enzima gera um gradiente
eletroquímico intracelular de Ca
2+
que favorece a sua entrada luminal através de um canal de
Ca
2+
(azul escuro). As ATPases de Na
+
também estão presentes na MBL (Adaptado de Davies et
al., 2001).
Figura 10. Vias de reabsorção de solutos (setas azuis) e ansportadores presentes nas células do
túbulo proxim
Na
+
Na
+
Ca
2+
H
+
Na
+
Glicose; aa;
ânions orgânicos
Ca
2+
eCl
-
3 Na
+
Ca
2+
Na
+
2 K
+
Interstício
MA
MBL
Transportadores ativos
primários
Na
+
Cl
-
Na
+
Na
+
Ca
2+
H
+
Na
+
Glicose; aa;
ânions orgânicos
Ca
2+
eCl
-
3 Na
+
Ca
2+
Na
+
2 K
+
Interstício
MA
MBL
Transportadores ativos
primários
Na
+
Cl
-
Na
+
Na
+
Ca
2+
H
+
Na
+
Glicose; aa;
ânions orgânicos
Ca
2+
eCl
-
3 Na
+
Ca
2+
Na
+
2 K
+
Interstício
MA
MBL
Transportadores ativos
primários
Na
+
Cl
-
Na
+
Na
+
Ca
2+
H
+
Na
+
Glicose; aa;
ânions orgânicos
Ca
2+
eCl
-
Interstício
3 Na
+
Ca
2+
Na
+
2 K
+
Transportadores ativos
primários
Na
+
Cl
-
MA
MBL
44
(denominadas bombas de Na
+
) também presentes exclusivamente na MBL (Féraille & Doucet,
2001; Caruso-Neves, 2002) (Figura 10). Estes transportadores acoplam fluxos de Na
+
contra seu
gradiente de potencial eletroquímico e hidrólise de ATP, e são responsáveis pela extrusão de Na
+
através da MBL, mantendo baixos seus níveis intracelulares e criando, dessa forma, o gradiente
eletroquímico favorável à entrada deste íon através da MA. As bombas de Na
+
não só garantem a
reabsorção de Na
+
, como também viabilizam o transporte ativo secundário e a reabsorção de uma
grande variedade de substâncias, como glicose, aminoácidos, HCO
3
-
, HPO
4
-
, Cl
-
e ânions
orgânicos, que são co-transportados com o Na
+
através da MA das células do túbulo proximal
(Féraille & Doucet, 2001) (Figura 10).
Dado o fato da MA e MBL das células do túbulo proximal serem livremente permeáveis à
água devido à expressão de aquoporina-1 (canais de água), a reabsorção de água é passivamente
direcionada da luz tubular para os capilares peritubulares pelo balanço osmótico dos fluxos dos
solutos (Nejsum, 2005), preservando a osmolaridade e o volume dos compartimentos.
Portanto, o segmento proximal é o responsável pela reabsorção em massa de solutos e
da liberação de Ang II, aumenta a reabsorção de Na
+
e água ao longo de todos os
gmentos do néfron, aumentando ainda mais a caminopeptidase Acidade reabsortiva do túbulo
al para Na
+
e água. Como muitos dos efeitos de Ang II e seus derivados dependem de
água, cabendo aos segmentos distais o ajuste fino da composição e do volume extracelular. Sendo
o Na
+
o principal responsável pela magnitude do volume extracelular, hormônios e autacóides
que regulam a atividade das bombas de Na
+
neste segmento alteram toda a dinâmica de
reabsorção de sais, nutrientes e, conseqüentemente, de água, levando a grandes alterações no
meio extracelular (Rangel et al., 1999; Caruso-Neves et al., 2000; Féraille & Doucet, 2001;
Rangel et al., 2002; Lara. et al., 2002; Lara et al., 2006). Portanto, quando há contração do
volume extracelular é acionado o poderoso SRA (dentre outros fatores endócrinos e neuronais)
que, através
se
proxim
45
alterações nas concentrações intracelulares de Ca
2+
(como visto anteriormente) é de extremo
interesse introduzir quais os transportadores e proteínas que estão envolvidos neste processo e de
que forma as suas atividades são moduladas.
I.7. O íon Ca e a Ca -ATPase
Até 1883, o Ca era considerado exclusivamente um elemento estrutural presente em
dentes e ossos. Contudo, uma nova visão da função deste cátion foi prenunciada quando Ringer
demonstrou que o Ca era necessário
2+ 2+
2+
2+
para a contratilidade cardíaca (Ringer, 1883 cf). Tal
observ
2+ 2+
5 2+
02).
2+
2+
2+
2+
ação não recebeu a devida importância na época, sendo apenas em 1950 que o papel do
Ca como sinalizador começou a ganhar vida atingindo hoje uma fase explosiva. Hoje, O Ca é
reconhecido como um segundo mensageiro essencial que acompanha a célula por todo o seu
ciclo. Sabiamente, Otto Loewy já dizia: “Se há Ca , há vida” (revisto por Carafoli, 20
A maior parte do íon Ca , 99%, é armazenada em ossos enquanto apenas cerca de 1% e
0,1% são encontrados no meio extracelular e intracelular, respectivamente (Berne & Levi, 2000).
No plasma, aproximadamente 50% do Ca está sob a forma ionizada, cerca de 45% está ligado
às proteínas plasmáticas e 5% está complexado a outros ânions. Como o Ca ligado a proteínas
não é filtrado, 55% de Ca está disponível para a filtração, dentre os quais cerca de 99% são
reabsorvidos pelos túbulos renais em condições normais (Mello-Aires, 1999; Assunção-Miranda
et al., 2005) (Figura 9).
5. Otto Loewi (1873-1961) – cientista alemão que dividiu o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1936 com o
fisiologista Henry Hallett Dale pela descoberta da acetilcolina (“Vagusstoff”). Também realizou importantes estudos
na área de metabolismo de carboidratos e proteínas e sobre a função renal.
46
Conforme já mencionado, a maior parte da reabsorção de Ca
2+
ocorre no túbulo proximal
através da via paracelular. Os ramos finos da alça de Henle, tanto descendente como ascendente,
são impermeáveis, ou pouco permeáveis, ao Ca
2+
, ficando a cargo do ramo grosso ascendente a
reabsorção de 20% deste íon que acontece na alça (Figura 9). Assim como ocorre no túbulo
l membrana lúmen-positivo criado pela secreção de K
+
e sua
ciclagem via o transportador tríplice eletroneutro 2Cl
-
:1Na
+
:1K
+
, direciona o transporte passivo
Ca
2
e
,
ão do
tipo “ti
i
tor cortical é negligenciável (aproximadamente 5%) e que a excreção
urinária de Ca
2+
alcance ou supere de 1 a 3% da carga filtrada. Contudo, apesar de não ter as
2+
e células do ducto coletor, induzido por ADH (Star et al., 1988; Van Baal et al., 1996), e que
proximal, o e evado potencial de
re
de
+
(e do Mg
2+
) p los espaços intercelulares (Mello-Aires et al., 1999). Este transporte
paracelular de Ca
2+
é facilitado pela proteína paracelina-1 expressa nas junções aderentes deste
ramo (Hoenderop et al. 2005). Todavia, alguns resultados demonstram transporte ativo de Ca
2+
no ramo grosso ascendente cortical (Imai, 1978; Friedman, 1988).
No túbulo distal ocorre a reabsorção de cerca de 10 a 15% do Ca
2+
filtrado (Figura 9).
Esta menor reabsorção percentual não depende apenas da pequena fração remanescente de Ca
2+
no fluido tubular como também resulta do fato de que as junções aderentes deste segmento s
ght” e relativamente impermeáveis ao Ca
2+
. A presença de canais de Ca
2+
do tipo TRPV5
(também conhecido como ECaC), TRPV6 (também conhecido como ECaC2), calbindinas, NCX
e PMCA (Hoenderop et al., 2000; Loffing et al., 2001) demonstram que o transporte de Ca
2+
neste segmento ocorre preferencialmente pela via transcelular (Hoenderop et al., 2005).
As proteínas envolv das no transporte transcelular de Ca
2+
desaparecem abruptamente na
transição do túbulo distal para o ducto coletor cortical corroborando a noção de que este
transporte no ducto cole
proteínas que suportam o transporte transcelular de Ca , o TRPV6 é expresso na porção medular
do ducto coletor (Nijenhuis et al., 2003). Sabendo-se que há um influxo de Ca
2+
através da MA
d
47
elevaçõ
, o trocador NCX presente,
geralm
e et al.,
2003).
es nos níveis de Ca
2+
intracelular inibem a reabsorção de Na
+
no ducto coletor (Frindt et
al., 1990) pode-se sugerir que o transporte de Ca
2+
pelo TRPV6 seja mais parte de uma cascata de
sinalização hormonal do que um mecanismo importante de reabsorção (Hoenderop et al., 2005).
Para que o Ca
2+
possa atuar como sinalizador intracelular, a concentração intracelular de
Ca
2+
deve ser mantida baixa. Tal fato ocorre devido a baixa permeabilidade da membrana
plasmática ao Ca
2+
, pela atividade de transportadores de extrusão de Ca
2+
para o meio
extracelular ou compartimentos intracelulares, e pela presença de proteínas citossólicas quelantes
de Ca
2+
. Como extrusores de Ca
2+
para compartimentos intracelulares temos a Ca
2+
-ATPase
presente no retículo endo-sarcoplasmático (SERCA), a Ca
2+
-ATPase presente na membrana
plasmática (PMCA) de todas as células do nosso organismo
ente, em células excitáveis e o uniporter de Ca
2+
mitocondrial, proteínas que apresentam
diferenças na sua cinética de transporte. A PMCA e a SERCA (em tecidos não musculares)
apresentam baixa taxa de transporte (baixa capacidade), mas alta afinidade para Ca
2+
, o que
significa que podem responder a modestas elevações nos níveis de Ca
2+
e manter os níveis basais
do íon no citosol. O NCX e o uniporter mitocondrial possuem taxa de transporte muito maior,
porém afinidade muito menor para Ca
2+
, podendo delimitar o transiente de Ca
2+
para uma
variação dinâmica espacial e temporal mais larga (Zylinska &, Soszynski, 2001; Berridg
Dentre as proteínas citosólicas quelantes de Ca
2+
podemos citar aquelas móveis e
difusíveis no citosol como a calbindina D
28
, a calretinina e a parvalbumina, assim como aquelas
que, além de quelantes, são efetoras, ou seja, são moduladas por Ca
2+
e decodificam os seus
sinais, como a calmodulina (Berridge et al., 2003) (Figura 11).
48
concentração intracelular de Ca aumenta por meio do influxo deste íon advindo do meio
2+
s intracelulares, via Ca
2+
-
ATPase de retículo sarco-endoplasmático (SERCA), ou é removido da célula através do trocador
Na
+
/Ca
+
(NCX) e da Ca
2+
-ATPase de membrana plasmática (PMCA) (Retirado de Syntichak &
Tavernarakis, 2003).
Figura 11. Homeostasia intracelular do íon Ca
2+
. A concentração intracelular do íon Ca
2+
é
precisamente regulada de forma que a sua concentração na forma livre seja 100 nM, enquanto no
meio extracelular é aproximadamente 1 mM. Após a ativação de um sinal externo, a
2+
externo por meio de canais iônicos (canais operados por voltagem, ligante ou concentração) ou
por meio da liberação de Ca
2+
dos estoques intracelulares (retículo endoplasmático e
mitocôndrias). Ao término do sinal, o Ca retorna aos seus estoque
49
O íon Ca
2+
intracelular opera sob uma larga variação temporal (picos) e espacial (ondas)
2+
er
Logo, distúrbios que alterem a permeabilidade da membrana plasmática, os fluxos de Ca
2+
ove uma inibição do trocador Na
+
/H
+
presente na MA, prejudicando o
ansporte transcelular de Na
+
(Sogabe et al., 1996). Como este trocador é o principal responsável
para regular os mais diferentes processos. Assim, picos localizados rápidos e altos de Ca
regulam respostas rápidas de microssegundos, como a exocitose de neurotransmissores, enquanto
respostas mais lentas que ocorrem de minutos a horas, como transcrição de um gene e
proliferação celular, são controladas por ondas de Ca
2+
transientes e repetitivas, que parecem ser
resultado da liberação de Ca
2+
induzida por Ca
2+
(Figura 12). De qualquer maneira, ambas as
respostas são desencadeadas por oscilações de Ca
2+
, uma forma elegante e eficiente de se
transmitir sinais, evitando elevações sustentadas de Ca
2+
, que seriam deletérias para a célula
(Berridge et al., 2003). As células utilizam mecanismos moleculares sofisticados para respond
às diferentes oscilações de Ca
2+
, incluindo a habilidade de interpretar alterações na freqüência.
Dentre eles podemos citar a Ca
2+
-calmodulina cinase II (CAMKII) (De Koninck et al., 1998;
Valverde et al., 2005) e a PKC (Oancea & Meyer, 1998), proteínas cinases que sofrem uma
mudança conformacional após a ligação com o Ca
2+
, passando adiante o sinal transmitido por
este íon.
entre o citoplasma e o meio extracelular e os fluxos de Ca
2+
entre o citoplasma e a luz de seus
sistemas de seqüestro podem levar a patologias, como a doença autossômica dominante do rim
policístico (Berridge et al., 2003) e hipertensão. Em modelos de hipertensão (ratos SHR), foi
demonstrado que a dinâmica da regulação do Ca
2+
encontra-se alterada em relação aos ratos
normotensos Wistar-Kyoto, tanto na musculatura vascular (Monteith et al., 1997; Manso et al.,
1999) como em túbulos proximais renais (Drüeke et al., 1990; Jacobs et al., 1990).
Neste sentido, foi verificado, em túbulos proximais de rim de coelho, que o aumento de
Ca
2+
intracelular prom
tr
50
Figura 12. O íon Ca
2+
está envolvido nos mais variados processos, desde a exocitose de
neurotransmissores até eventos de proliferação celular. Assim, picos rápidos e altos de Ca
2+
regulam
ondas de Ca transientes e repetitivas.
respostas rápidas (μs a s), enquanto respostas mais lentas (min a h) são controladas por
2+
51
pela reabsorção apical de Na neste segmento, se não houver comp
o grosso ascendente da alça de Henle, provavelmente o volum
entos líquidos extracelulares ficarão comprometidos. Além
+
, (Na
+
+K
+
)-ATPase e Na
+
-ATPase, são m
defosforilações decorrentes da atividade de cinases e fosfatases, respectivam
et al., 2002; Rangel et al., 2002).
o descrito anteriormente, muitos dos efeitos de Ang II sobre o transporte de Na
água no túbulo proximal ocorrem pelo aumento dos níveis de Ca
2+
podem ocorrer pelo aumento de influxo apical de Ca
2+
(Charbonneau et al
mobilização do retículo endoplasmático (de Gasparo et al., 2000; Dinh et al
inibição da PMCA (Assunção-Miranda et al., 2005).
Nas células do túbulo proximal, a PMCA participa de um
l de Ca
2+
, porém é essencial no ajuste fino das concentrações in
et al., 1991; Strehler et al., 2007). Assim, esta bomba aparece com
excelente alvo de hormônios e autacóides que modulam o transporte de Na
+
de Ca
2+
como segundo mensageiro, exercendo um papel im
ostase corporal global de Ca
2+
como também se constituindo num participante
essencial na sinalização intracelular de Ca
2+
(Strehler et al., 2007).
+
ensação da reabsorção deste
íon no ram e e a composição dos
compartim disso, os transportadores
renais de Na odulados por fosforilações e
ente, dependentes de
Ca
2+
(Ibarra
Com
+
e
intracelular. Tais efeitos
., 2001), pela sua
., 2001) e pela
a pequena parcela do transporte
transepitelia tracelulares deste íon
(Coelho-Sampaio o um
e água através de
vias que dependem portante não só na
home dinâmico e
sta bomba é encontrada em cavéolas (Anderson et al., 1998) e, em células de túbulo
omo uma plataforma de sinalização. No caso, é descrito que além da PMCA, alguns dos
elementos envolvidos na sinalização do Ca
2+
, como receptores IP3, calmodulina e óxido nítrico
E
proximal renal, exclusivamente nestes microdomínios de membrana (Tortelote et al., 2004).
Cavéolas são invaginações da superfície da membrana plasmática, em forma de ômega invertido,
que compartimentalizam toda a maquinaria necessária para determinado evento, funcionando
c
52
sintase (NOS) são encontrados em cavéolas (Anderson et al., 1998). Dessa forma, a localização
específica de PMCA parece estar primariamente relacionada com o envolvimento do Ca
2+
na
sinalização intracelular nos mecanismos de transdução e adaptação. Corroborando isto, tem sido
identificado um número crescente de proteínas específicas que interagem com a PMCA e que
possuem funções sinalizadoras e regulatórias (Strehler et al., 2007) (Figura 13).
A PMCA tem uma massa molecular de aproximadamente 141 kDa (Gmaj et al., 1983) e
opera c
gradientes eletroquímicos (Guerini, 1998).
A supe
i, 2000). Na conformação E
1
,
a enzim
omo um trocador eletrogênico Ca
2+
/H
+
na estequiometria de 1:1 (Vieyra et al., 1986;
Salvador et al., 1998). Pertence a subfamília do tipo II B da superfamília das P-ATPases, cujos
membros são capazes de formar um intermediário fosforilado durante o seu ciclo catalítico
utilizando o a fosforila γ terminal do ATP, o que lhes fornece a energia necessária para
transportar íons através das membranas contra os seus
rfamília das ATPases do tipo P inclui uma variedade de enzimas que participam da
regulação da concentração intracelular de íons, incluindo a SERCA, a (Na
+
+K
+
)-ATPase, a Na
+
-
ATPase e as H
+
-ATPases (Axelsen & Palmgren, 1998; Caruso-Neves et al., 2002).
O ciclo de reação da Ca
2+
-ATPase envolve a formação e degradação seqüencial de
intermediários fosforilados (aspartilfosfato). A enzima, que pode existir em dois estados
diferentes (E1 e E2) com diferentes afinidades para o Ca
2+
, passa por uma mudança
conformacional durante o transporte deste íon (Zylinska & Soszynsk
a liga Ca
2+
com alta afinidade em resposta ao aumento intracelular das concentrações
deste íon. Com o Ca
2+
ligado, a enzima sofre modificações conformacionais que favorecem a
ligação, também com alta afinidade, do ATP complexado ao Mg
2+
, catalisando em seguida a
quebra de sua ligação β, γ (Pickart & Jencks, 1984; Jencks, 1989; Jencks 1995). Nesta etapa,
ocorre a transferência da fosforila γ-terminal para um resíduo de ácido aspártico no sítio catalítico
53
Figura 13. Ilustração da PMCA com proteínas associadas (Retirado de Strehler et al., 2007).
54
da enzima (Shull & Greeb, 1988). Com isso é formado o complexo denominado Ca
2+
E
1
~P,
aracterístico das P-ATPases. No passo seguinte, a enzima sofre nova mudança em sua
2+
lar.
ofílico da água,
a seja
através de uma
odelo baseado
ificam
ocorrem na
ca de
ariantes, o domínio de ligação de calmodulina, os domínios fosforilados por proteínas cinases e
o splicing alternativo (Figura 15). Assim, a diversidade das isoformas está relacionada com suas
ropriedades peculiares de regulação (Carafoli et al., 1992). Tal fato é relevante para revelar
iferenças significativas nas suas capacidades de responder a um aumento repentino de Ca
2+
e
ara decodificar a freqüência de picos de Ca
2+
repetitivos. Como exemplo temos que as PMCAs
e 3 (mais expressas em tecidos excitáveis) são bombas mais rápidas que a PMCA 4
eoricamente presente em todas as células) (Streheler et al., 2007). Estas diferentes isoformas e
as variáveis também apresentam padrões de expressão específicos em cada tipo de célula e
tecido, que são regulados durante o desenvolvimento (Garcia et al., 1997; Zacharias & Kappen,
c
conformação, transitando para uma fosfoenzima de baixa energia com baixa afinidade para Ca
(Ca
2+
E
2
-P). Esta transição permite o transporte e a liberação do Ca
2+
para o meio extracelu
Após a liberação do Ca
2+
, a fosfoenzima se torna suscetível ao ataque nucle
ocorrendo assim sua defosforilação para o estágio E
2
livre. Isso permite que a enzim
regenerada para realizar um novo ciclo transitando da forma E
2
para a forma E
1
mudança conformacional acelerada pelo ATP, completando assim o seu ciclo (m
no ciclo de catálise geralmente aceito para a SERCA; de Méis & Carvalho, 1976) (Figura 14).
Em mamíferos, quatro genes distintos para PMCA foram encontrados. Estes cod
para as isoformas 1 a 4 de PMCA e todos os produtos destes genes podem sofrer “splicing”
alternativo aumentando a diversidade das diferentes isoformas. Os “splicings”
primeira alça intracelular (sítio A) e na cauda C-terminal (sítio C) levando à geração de cer
20 variantes da PMCA (Strehler & Zacharias, 2001). Nas diferentes isoformas de PMCA e suas
v
aqueles responsivos aos fosfolipídeos acídicos não são conservados, sendo portanto submetidos
a
p
d
p
2
(t
su
55
na face citosólica da estrutura protéica em troca do H
+
remanescente da água participante de um
transporte do Ca para o meio extracelular (5). Esta mudança permite o acesso de uma molécula
Figura 14. Esquema representativo das etapas do ciclo catalítico da PMCA. A ligação do íon Ca
2+
evento de hidrólise em um ciclo prévio (1) permite a ancoragem de uma molécula de ATP (2),
que doa sua fosforila γ-terminal a um resíduo de ácido aspártico presente na grande alça
citosólica que compõe o centro ativo para formar o intermediário CaE
1
~P (3). A enzima
fosforilada sofre uma mudança conformacional (transição para CaE
2
-P) (4) que resulta no
2+
de água ao centro ativo (6) e a hidrólise da ligação acil-fosfato, liberando Pi da PMCA (7), que
conseqüentemente volta ao estado conformacional inicial, com o sítio de ligação de Ca
2+
voltado
para o citosol (8), possibilitando a retomada do ciclo de catálise (Modificado de Carafoli & Brini,
2000).
H
2
O
Pi
Ca
2+
ex
HE
2
Ca
2+
cit
Ca
•
E
1
ATP
CaE
1
•
ATP
ADP
CaE
1
CaE
2
-P
E
2
-P
HE
2
HE
1
H
+
8
7
1 2 3
4
6 5
•
Pi
~P
H
2
O
Pi
Ca
2+
ex
HE
2
Ca
2+
cit
Ca
•
E
1
ATP
CaE
1
•
ATP
ADP
CaE
1
CaE
2
-P
E
2
-P
HE
2
HE
1
H
+
8
7
1 2 3
4
6 5
•
Pi
~P
56
Figura 15. Esquema da PMCA. Os dez domínios transmembranas estão representados nas regiões
numeradas. O primeiro principal domínio, localizado entre os segmentos transmembrana 2 e 3,
apresenta sítios de interação com fosfolipídeos acídicos (PL). O segundo principal domínio,
localizado entre os segmentos transmembrana 4 e 5, contêm o sítio de fosforilação do ácido
aspártico (P) e o sítio de ligação de ATP (ATP). O terceiro principal domínio é encontrado na
porção C-terminal e apresenta uma região auto-inibitória de ligação a calmodulina (Calmodulin).
(Retirado de Strehler et al., 2007).
57
1999), reforçando a idéia de haver propriedades regulatórias distintas entre elas. As PMCAs 1 e 4
são expressas em praticamente todos os tecidos, enquanto as PMCA 2 e 3 parecem estar
confinadas a tecidos especializados como cérebro e coração (Stauffer et al., 1995; Filoteo et al.,
1997). Neste sentido, foi demonstrado que o cérebro contém aproximadamente 10 vezes mais
a
nios
nte
ndo um domínio auto-inibitório com alta afinidade à
calmodulina, sítios de ligação a fosfolipídeos e sequências que são potentes alvos para a
fosforilação por PKA e PKC (Zylinska & Soszynski, 2000; Brodin et al., 1992; Carafoli et al.,
1992) (Figura 15).
PMCA que as células não excitáveis (Guerini, 1998), porém, enquanto as quantidades de PMCA
1 e 4 de astrócitos são comparáveis àquelas encontradas em neurônios, a quantidade de PMCA 2
de astrócitos é menor (Fresu et al., 1999). Assim, cada região de um tecido pode utilizar um
combinação única de isoformas para manter o controle intracelular de Ca
2+
.
A arquitetura geral das PMCAs mostra que a bomba apresenta dez domí
transmembrana sendo que a maior parte da massa da molécula está no citoplasma. No lado
extracelular, os domínios estão conectados por alças muito curtas, enquanto no lado intracelular
encontramos, nas alças mais protuberantes, os três principais domínios (Carafoli et al., 1992). O
primeiro, localizado entre os segmentos transmembrana 2 e 3, acoplaria a hidrólise do ATP à
translocação de Ca
2+
(Carafoli et al., 1992) - devido à presença de uma seqüência altame
conservada à qual se atribui atividade fosfatásica e, portanto, participação nas etaminopeptidase
As 6 e 7 representadas na Figura 14 - e possui sítios de interação com fosfolipídeos acídicos
(Brodin et al., 1992). O segundo e maior, localizado entre os segmentos transmembrana 4 e 5,
contém o sítio de fosforilação do ácido aspártico e o sítio catalítico (de ligação de ATP) em
seqüências altamente conservadas. O terceiro, encontrado na porção C-terminal, é uma região
regulatória multifuncional, conte
58
O complexo Ca
2+
-calmodulina é o “protótipo” de todas as proteínas que interagem com a
PMCA, tendo sido identificado como o principal regulador da bomba há quase 30 anos (Jarrett &
Penniston, 1978). Na ausência de Ca
2+
-calmodulina, a bomba encontra-se auto-inibida por
mecanismos que envolvem a ligação de sua cauda C-terminal com uma região localizada logo
após o primeiro segmento transmembrana e com a grande alça citosólica que corresponde ao
centro ativo. A ativação requer a interação de Ca
2+
-calmodulina com a cauda C-terminal, levando
a uma mudança conformacional da PMCA que libera o seu sítio catalítico, aumentando a
afinidade aminopeptidase Arente para Ca
2+
e elevando a sua Vmax (Carridge et al., 1999). A
liberaç
ão da auto-inibição também pode ser facilitada por outros meios, incluindo a interação da
PMCA com fosfolipídeos acídicos, fosforilação de resíduos de serina e treonina específicos na
cauda C-terminal, mediados por PKA e PKC, e de resíduos tirosina específicos, mediada por
tirosina cinases, clivagem proteolítica parcial da cauda C-terminal por calpaínas e caspases ou
dimerização via a cauda C-terminal (Carafoli, 1994; Penniston & Enyedi, 1998).
Foi demonstrado que a PKA ativa a PMCA por uma via dependente de CaM-kinase II
(Valverde et al., 2005) e que a PKC pode ativar ou inibir a PMCA dependendo da isoforma
presente (Zylinska & Soszynski, 2000; Streheler et al., 2007) indicando que a variabilidade da
resposta a cinases depende da localização de resíduos de serina e treonina em domínios não
homólogos, na seqüência primária de diferentes variantes da PMCA. Neste sentido, dados prévios
do nosso laboratório demonstraram que a Ang II inibe a PMCA de túbulo proximal renal via
PKC, enquanto concentrações crescentes de Ang II revertem este efeito inibitório possivelmente
pela ação de metabólitos derivados da proteólise limitada de Ang II (Assunção-Miranda, 2004;
Assunção-Miranda et al., 2005).
59
II. Obj
túbulos
etivos
II. 1. Objetivo geral
O objetivo da presente tese visa esclarecer se a fase de reversão da inibição da atividade
da PMCA promovida pela Ang II é decorrente da produção de metabólitos ativos, cuja ação
contra-regularia os efeitos desencadeados pelo octapeptídeo Ang II em concentrações
fisiológicas.
II. 2. Objetivos específicos
Os objetivos específicos desta tese são:
1) Verificar se os metabólitos de Ang II modulam a atividade da PMCA de MBL de
proximais renais através da ativação de receptor(es) de angiotensina e qual(is) seria(m)
estes receptores;
2) Estudar o efeitos dos metabólitos de Ang II sobre a atividade da PMCA presente em
MBL de túbulos proximais renais;
3) Identificar quais são os peptídeos derivados da proteólise limitada de Ang II que
promovem a reversão do efeito inibitório de Ang II sobre a PMCA de MBL de túbulos proximais
renais;
4) Identificar a presença de peptidases que estariam envolvidas na proteólise limitada de
Ang II na MBL;
60
5) Investigar se o receptor sensível a losartan e PD123319, associado à inibição da PMCA
or Ang II (Assunção-Miranda et al., 2005), é um heterodímero formado pelos receptores AT
1
e
p
AT
2
.
61
III. Materiais e Métodos
III.1. Reagente e soluções
O ATP (sal de Na
+
), Bis-Tris Propano, ouabaína, EGTA, EDTA, PMSF, inibidor de
tripsina II, bestatina, PD123319, CGP 42112A, Ang II, Ang(1-7) foram obtidos da Sigma
Chemical Co. (Saint Louis, MO). Os peptídeos Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5), Ang-(1-4) e
Ang-(3-4) do EZBiolab (Westfield, USA). O Percoll foi adquirido da Amershan Pharmacia
(Uppsala, Suécia), o losartan da Merck Sharp & Dohme (São Paulo, Brasil), o captopril da
Medley (Rio de Janeiro, Brasil), o DX600 da Phoenix Pharmaceutical (Belmont, CA, USA) a
sacarose e o Me
2
SO da Merck (Darmstadt, Alemanha), os anticorpos primários policlonais anti-
AT
1
e anti-AT
2
do Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), o kit ECL e o anticorpo
secundário policlonal anti-rabbit da GE Healthcare Life Sciences do Brasil (São Paulo, Brasil). A
acetonitrila e o TFA eram provenientes da TEDIA (Farfield, Estados Unidos). Os outros
reagentes químicos utilizados são os de mais alta pureza disponíveis no mercado. As soluções
foram preparadas com água deionizada pelo sistema de resinas Nanopure II (Sybron Barnstead,
Newton, MA). O tampão Bis-Tris Propano foi neutralizado com HCl até o pH desejado e o pH da
solução ácida de Hepes foi ajustado neutralizando a solução com Tris base (tampão Hepes-Tris,
sendo que a concentração indicada do tampão refere-se à concentração do ácido). O
32
Pi foi
obtido do Instituto de Pesquisa Energética e Nuclear (São Paulo, Brasil) e o [γ-
32
P]ATP foi
preparado conforme descrito por Maia et al. (1993).
62
III.2. Obtenção de homogeneizado total e purificação de membranas basolaterais (MBL) de
túbulos proximais de rins de ovelha
As frações purificadas de MBL de túbulos proximais renais foram obtidas através da
técnica de centrifugação diferencial descrita originalmente por Scalera et al. (1980), com algumas
modificações adicionadas por Sacktor et al. (1981) e especialmente por Boumendil-Podevin e
Podevin (1983). Os rins de ovelha, retirados imediatamente após a morte das mesmas, foram
provenientes de matadouros regulamentados e a saúde das ovelhas foi assegurada por um
controle veterinário. Em cada preparação foram utilizados 5-6 pares de rins, que eram
transportados do matadouro até o laboratório imersos em solução I - sacarose 250 mM, Hepes-
Tris 10 mM (pH 7,6), EDTA 2 mM, PMSF 1 mM e inibidor de tripsina (type II-S Soybean) 0,15
mg/ml - e conservados no gelo para minimizar os efeitos de proteólise. Ainda banhados por esta
solução, os rins eram dissecados para retirar apenas a porção mais externa do córtex (córtex-
corticis), composta principalmente de túbulos proximais (> 95% da população celular)
(Whittembury & Provérbio, 1970). Os cortes eram pesados (sem a solução), adicionando-se
depois o volume equivalente a 3 vezes a massa dos cortes (1 g de tecido para 3 ml de solução I).
As fatias dissecadas eram então picadas e homogeneizadas usando um homogeneizador do tipo
Potter–Elvejhem e pistilo de teflon por 30 vezes a 2.000 rpm. Este homogeneizado total era
centrifugado por 10 min a 1.500 × g em centrífuga refrigerada, modelo Sorvall (rotor GSA). O
sobrenadante desta primeira etapa era guardado e o pellet era ressuspendido em solução I e
novamente homogeneizado para uma segunda centrifugação nas mesmas condições. Os
sobrenadantes das duas centrifugações eram unidos e centrifugados por 30 min a 48.000 × g em
ultracentrífuga Hitachi (rotor 45 Ti). O sobrenadante era descartado e a porção mais externa do
63
pellet (fração microssomal) era ressuspendida em 6 ml de solução II (sacarose 250 mM, Hepes-
Tris 10 mM (pH 7,6), PMSF 1 mM e inibidor de tripsina type II-S Soybean 0,15 mg/ml) por
tubo, adicionando Percoll
®
na concentração final de 12% (v/v). Esta suspensão era então
homogeneizada por 5 vezes a 2.000 rpm no mesmo homogeneizador mecânico, seguindo-se de
uma centrifugação a 40.000 × g por 66 minutos. Dos 26 ml contidos em cada tubo, os primeiros
7,8 ml (do topo até a base do gradiente) eram retirados e descartados, sendo então coletados e
reservados os 4,3 ml seguintes. As frações do gradiente eram reunidas e homogeneizadas, e
posteriormente centrifugadas por 60 min a 200.000 × g também em uma ultracentrífuga Hitachi
(rotor 90 Ti) para retirar o Percoll
®
da preparação. Após a centrifugação, o Percoll
®
ficou aderido
ao fundo do tubo, sendo assim possível retirar o sedimento de membranas, fracamente aderido,
por aspiração. O sedimento final era ressuspendido em sacarose 250 mM em volume suficiente
para obtenção de uma concentração final de proteína de 20-25 mg/ml e em seguida estocado em
N
2
líquido, onde a atividade da PMCA é preservada por, pelo menos, três meses.
A concentração de proteína na MBL e homogeneizado era dosado segundo o método de
Lowry et al. (1951), com algumas modificações, utilizando albumina bovina 0,1 % (p/v) como
padrão. A atividade da (Na
+
+K
+
)ATPase foi dosada rotineiramente, pois esta enzima, polarizada
na região basolateral das células do túbulo proximal, é o marcador destas membranas (Scalera et
al., 1980; Gmaj et al., 1982; Tsukamoto et al., 1988). Com este método obtém-se um significativo
enriquecimento da atividade (Na
+
+K
+
)ATPásica de aproximadamente 5-8 vezes em relação ao
homogeneizado total, dependendo da preparação. A contaminação residual com outras
membranas subcelulares é mínima. Seis preparações selecionadas de forma randômica para testar
os níveis de contaminação mostraram que a atividade das enzimas succinato-desidrogenase
(marcador de contaminação mitocondrial), fosfatase ácida (marcador para membranas
64
lisossomais) e glicose-6-fosfatase (marcador para retículo endoplasmático) diminuíram entre uma
e duas ordens de magnitude nas preparações enriquecidas em membrana basolateral em
comparação com o homogeneizado total (Coka-Guevara et al., 1999).
III.3. Identificação dos metabólitos por cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
A proteólise limitada de Ang II na presença de fração de MBL de túbulos proximais foi
investigada como descrito a seguir. A Ang II ou seus derivados - Ang-(1-7), Ang-(2-7), Ang-(3-
7), Ang-(1-5), Ang-(1-4) ou Ang-(3-4) - na concentração de 30 μM eram incubados com as
membranas (1 mg/ml) por 30 min a 37 ºC e a reação era interrompida com a adição de tampão
acetato de sódio-ácido acético 5 mM (pH 4,6). Nos ensaios de verificação das peptidases
envolvidas na proteólise das angiotensinas ou naqueles em que foi analisada a interferência de
BK na proteólise de Ang II ou Ang-(1-7), a MBL (1 mg/ml) era pré-incubada por 20 min a 37 ºC
com 150 μM de captopril (inibidor de ECA), 1 μM de DX600 (inibidor de ECA2), 2 mM de
orto-fenantrolina (inibidor não específico de metalopeptidases), 1 μM de bestatina (inibidor não
específico de aminopeptidases), 100 nM de tiorfan (inibidor de NEP) ou 10
-8
M de BK e
posteriormente era adicionado 30 μM de Ang II ou Ang-(1-7) que permaneciam no banho-maria
com a MBL pré-incubada por mais 30 min. O controle contendo Ang II intacta era obtido
adicionando-se o tampão à MBL antes do peptídeo e o branco era obtido colocando-se apenas a
MBL e o tampão acetato de sódio-ácido acético 5 mM (após 30 min). Após o término da
incubação, as amostras eram centrifugadas a 56.000 × g por 30 min a 4 ºC em centrífuga Hitachi
CS100, rotor RP100AT4, os sobrenadantes eram coletados (450 μl) em tubos tipo eppendorf,
concentrados em “speed vac” e, por fim, eram estocados no freezer a -20 ºC. No momento de
65
análise no HPLC, as amostras eram ressuspendidas em 100 μl (volume de injeção) de solvente A
(composição abaixo) e injetadas em um “loop” de 50 μl. Os padrões de Ang II e os seus
derivados (acima citados) também foram diluídos em 100 μl de solvente de forma que suas
concentrações finais fossem 10
-4
M.
As análises foram realizadas em um HPLC Shimadzu (Tokio, Japão) modelo LC10AS,
utilizando uma coluna C-18 de fase reversa (coluna Rexcrom, 25 cm × 4,6 mm, Regis
Technologies Inc.). As corridas cromatográficas foram realizadas sob gradiente, a um fluxo de
0,7 ml/min e detecção a 214 nm. Dois solventes foram utilizados durante as análises, solvente A
(água deionizada, 0,1% de TFA) e solvente B (90% de acetonitrila e 0,1% de TFA). Os solventes
eram preparados no dia anterior à análise e guardados sob refrigeração a 4
o
C, filtrados com
aparelho de filtragem a vácuo com filtro de nitrocelulose de 0,47 μM, e no dia da análise eram
degaseificados utilizando um sonicador por 30 min. A coluna era equilibrada durante 1 h com 5%
da solução B e o restante de A. O gradiente se estabelecia da seguinte maneira: para 0-3 min, 5%
de B e 95% de A; para 3-20 min de 5% a 100% de B; para 20-24 min de 100% a 5% de B e aos
25 min o fim da corrida.
III.4. Dosagem da atividade da PMCA de túbulos proximais renais
A atividade da PMCA foi mensurada pela quantificação do fosfato inorgânico (P
i
)
resultante da hidrólise do ATP utilizando ATP radioativo através do método descrito por
Grubmeyer & Penefsky (1981). A atividade foi calculada pela diferença entre as determinações
na presença e ausência de Ca
2+
(EGTA 2 mM). O meio de reação continha: Bis-Tris-propano 50
mM (pH 9,0), ATP 5 mM, MgCl
2
5 mM, NaN
3
10 mM, KCl 120 mM, EGTA 0,2 mM, Ca
2+
66
suficiente para a obtenção de 20 μM de Ca
2+
livre e 0,2 mg/ml de proteína. A reação foi iniciada
pela adição de [γ-
32
P]ATP (~2,0 Χ 10
6
cpm/μmol de ATP) a 37
o
C e interrompida após 20 min
com a adição de carvão ativado em HCl 0,1 N para a adsorção de ADP e do ATP não hidrolisado.
O
32
Pi liberado foi medido empregando um contador de cintilação líquida. Antes da reação as
membranas eram suspensas em sacarose 250 mM e previamente incubadas por 10 min a 37
o
C na
presença de 0,1 mM de ouabaína (a fim de garantir a inibição da (Na
+
-K
+
)ATPase e minimizar a
hidrólise independente de Ca
2+
). Entretanto, nos ensaios em que foi estudado a reversão do efeito
de Ang II pelos peptídeos derivados da sua proteólise, a MBL foi pré-incubada com Ang II 10
–10
M e ouabaína 0,1 mM por 30 min a 37
o
C. Em seguida, a proteína pré-incubada era adicionada ao
meio de reação já contendo os respectivos peptídeos, os antagonistas (10
-7
M de losartan ou
PD123319 ) ou agonista parcial dos receptores de Ang II (10
-10
M de CGP 42112A) e enfim, a
reação era disparada com [γ-
32
P]ATP.
A concentração de Ca
2+
livre foi calculada empregando um programa de computador
(MCALC), que se baseia num método interativo (Inesi et al., 1980), modificado por Sorenson et
al. (1986) a partir do original desenvolvido por Fabiato & Fabiato (1979). Este programa
considera as diferentes espécies envolvidas no equilíbrio entre EGTA, Ca
2+
, Mg
2+
, as diferentes
formas iônicas do ATP, K
+
e H
+
e a influência da força iônica nas constantes de associação entre
Ca
2+
e EGTA. Com as informações das concentrações de cada um destes compostos, calcula-se a
concentração de Ca
2+
a ser adicionada ao meio contendo 0,2 mM EGTA para a obtenção da
concentração de Ca
2+
livre desejada.
Os experimentos de dosagem da atividade da PMCA na presença dos metabólitos e Ang II
foram realizados utilizando o mesmo protocolo de preparação destes para ensaio em HPLC,
porém as amostras foram ressuspendidas em HCl 10 mM ao invés de solvente A.
67
Os resultados apresentados correspondem à média de pelo menos seis experimentos
realizados em triplicata. As diferenças entre os dados − quando indicados − foram analisados por
ANOVA.
III.5. Determinação da atividade específica de ECA, ECA2, aminopeptidases e NEP através
da hidrólise dos peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência
A atividade de ECA, ECA2, aminopeptidases e NEP foi realizada no Departamento de
Biofísica da UNIFESP através da hidrólise de substratos fluorogênicos específicos na presença
ou ausência dos inibidores das enzimas (lisinopril, DX600, bestatina e tiorfan nas concentrações
indicadas na Figura 42). A hidrólise dos substratos fluorogênicos contendo o grupo fluorogênico
MCA ou Abz (ácido orto-amino benzóico) e o grupo supressor de fluorescência Dnp
(dinitrofenil) ou EDDnp (2,4 dintrofenil-etilenodiamino) como supressor de fluorescência, foi
monitorada direto em cubeta de quartzo pelo aumento de fluorescência detectado em
espectrofluorímetro Hitachi F-2000. A fenda de excitação do aparelho foi ajustada para λ
ex
380
nm e emissão λ
em
460 nm para os substratos contendo o grupo MCA como sonda fluorescente e
para λ
ex
320 nm e emissão λ
em
420 nm para os substratos contendo o Abz como grupo
fluorogênico. A cubeta foi mantida em compartimento termostatizado (37
o
C). O aumento da
fluorescência com o tempo, devido a hidrólise dos substratos foi continuamente monitorado. As
concentrações dos substratos contendo EDDnp ou Dnp foram determinadas pela medida
fotométrica a 365 nm, usando um coeficiente de extinção molar igual a do Dnp, 17300 M
-1
cm
-1
.
Os ensaios para a dosagem de ECA foram feitos usando Abz-FRK(Dnp)P-OH como
substrato como descrito por Araújo et al., (2000). Os ensaios eram feitos em tampão Tris 100
68
mM, contendo 50 mM de NaCl e 10 µM de ZnCl pH 7,0. Nas dosagens da NEP foi usado como
substrato Abz-rGL-EDDnp e os ensaios eram feitos em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,0
conforme descrito por Barros et al. (2007). Nas dosagens de ECA2 e aminopeptidases foram
usados os substratos Abz-APK(Dnp)-OH e F-MCA, respectivamente, e os ensaios fora feitos em
tampão Tris 100 mM pH 7,0.
III.6. Análise da proteólise de Ang-(1-7) e BK por ECA através da cromatografia líquida de
alta performance acoplada a espectrometria de massas (LC/MS)
A proteólise preferencial de BK ou Ang-(1-7) por ECA também foi realizada no
Departamento de Biofísica da UNIFESP em ensaios contendo 80 µM de ECA purificada de
pulmão, tampão contendo Tris 100 mM, 50 mM de NaCl e 10 µM de ZnCl
2
pH 7,0 e adição
simultanânea de Ang-(1-7) e BK (ambos 20 µM), que foram incubadas por 2 hs a 37
o
C. O meio
resultante foi identificado no LC/MS Waters constituído por um módulo de separação Alliance
modelo 2690, detector do tipo “photodiode array” modelo 996, injetor automático com
capacidade de 120 amostras e um detector de massas da Micromass, Altrincham, UK, modelo
ZMD. O sistema é controlado por uma Workstation Compaq modelo AP200. As condições
experimentais utilizadas foram: coluna C-18 de fase reversa (Waters Nova-Park 2,1 × 150 mm);
solvente A (água deionizada e 0,1% TFA) e solvente B (60% acetonitrila e 0,1% TFA) sob um
gradiente que variava a concentração de B de 5 a 95% em um intervalo de tempo de 30 min a um
fluxo de 0,4 ml/min (de baixa intensidade para permitir a passagem direta das amostras do HPLC
para o espectrômetro de massas); a detecção foi realizada entre os comprimentos de onda
possíveis entre 190 e 300 nm; o intervalo de massa detectava massas de 500-3930 Da através da
69
injeção por modo de “eletctrospray” positivo; a temperatura da fonte era de 150
o
C e a de
evaporação 400
o
C; a voltagem do cone, a energia do capilar, do extrator e do multiplicador
foram de 36 V, 4 kV, 5 kV e 700 V, respectivamente e as resoluções de baixo e alta massa
molecular eram de 15,6 e 8,7, respectivamente.
III.7. Imunoprecipitação e Western blotting para detecção de heterodímero AT
1
/ AT
2
As MBLs de túbulo proximal (1 mg/ml) foram inicialmente incubadas com Ang II 10
-10
M
ou Ang II 10
-6
M por 30 min a 37 ºC. Em seguida, eram solubilizadas em CHAPS 0,01% (p/v)
por 30 min à temperatura ambiente. O anticorpo anti-AT
2
(diluição 1:200) foi pré-incubado, por
20 min sob leve agitação, com a proteína A-agarose (centrifugada 3 vezes a 3300 × g por 1 min
havendo lavagens com solução salina tamponada com Tris, TBS, entre as centrifugações) na
proporção 1:1. Posteriormente, a mistura anticorpo-proteína A-agarose foi ressuspendida em
BSA 1 mg/ml CHAPS 0,01% (p/v) e então adicionada às MBLs, mantida sob leve agitação a 4 ºC
overnight. O “pré-coating” de proteína A-agarose, anticorpo e solução contendo BSA e CHAPS
evita que a primeira se ligue a outras proteínas de membrana além do anticorpo primário. O
sobrenadante era separado do imunoprecipitado por uma centrifugação a 1000 × g por 4 min a 4
ºC. Após três centrifugações (as duas primeiras a 16100 × g por 10 min a 4 ºC e a última
seguindo as mesmas condições, porém apenas por 4 min, com lavagens em TBS intercalando as
centrifugações), o imunoprecipitado era ressuspendido em tampão de amostra contendo β-
mercaptoetanol e azul de bromofenol, aquecido a 100 ºC por 4 min – a fim de desligá-lo do
anticorpo-proteína A – e submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida (10%) com SDS,
assim como o sobrenadante. Ambos, então, foram transferidos para uma membrana de
70
nitrocelulose e incubados com anticorpo anti-AT
2
por 1 h a temperatura ambiente. A membrana
era lavada 5 vezes por 3 min em TBS e em seguida incubada com o anticorpo secundário por 1 h.
O resultado foi visualizado usando-se o kit ECL
®
após a lavagem em TBS (5 vezes por 3 min). A
banda de ambos os receptores (AT
1
e AT
2
) é detectada em 45 KDa. Para verificar a formação de
heterodímero dos receptores AT
1
/AT
2
, a mesma membrana foi submetida a tratamento com
glicina 0,2 M (pH 2,2) por 30 min e posteriormente incubada com anticorpo anti-AT
1
por 1 h
(ambos em temperatura ambiente), seguida do anticorpo secundário (após lavagem) repetindo-se
o procedimento anterior. A diluição dos anticorpos primários anti-AT
1
e anti-AT
2
foi 1:500 em
leite 5% (p/v) em TBS e a do anticorpo secundário anti-rabbit foi 1:2500 também em leite 5%
(p/v) em TBS.
71
IV. Resultados e Discussão
IV.1. Modulação da PMCA por Ang II
Conforme mencionado na Introdução, a Ang II é um hormônio chave na regulação do
volume extracelular e da pressão arterial, promovendo muitos dos seus efeitos fisiológicos
através da modulação das concentrações intracelulares de Ca
2+
, que por sua vez são finamente
reguladas pela PMCA. Embora tenha sido mostrado que Ang II aumenta os níveis do RNAm de
PMCA1 e SERCA2 em células de músculo liso de aorta, tanto em ratos normotensos Wistar-
Kyoto como em SHR (Monteith et al., 1997), pouco se sabe sobre a regulação da atividade da
PMCA por Ang II e seus metabólitos. Neste contexto, resultados prévios do nosso laboratório
demonstraram que a Ang II em baixas concentrações, 10
-10
M, inibe a atividade da PMCA de
MBL de túbulo proximal renal, enquanto altas concentrações, 10
-6
M, retornam a atividade da
PMCA ao nível controle, um efeito atribuído a metabolização de Ang II (Assunção-Miranda,
2004; Assunção-Miranda et al., 2005), o que de fato é bem provável já que, como vimos, o tecido
renal (inclusive a MBL) apresenta angiotensinases (Tikellis et al., 2003; Shaltout et al., 2007) e
muitos dos peptídeos derivados da metabolização de Ang II têm sido descritos como contra-
regulatórios dos seus efeitos (Haulica et al., 2004; Kramkowski et al., 2006).
Para confirmar a hipótese de que peptídeos derivados da proteólise de Ang II – quando
esta se encontra em altas concentrações – seriam os responsáveis pela reversão da inibição da
PMCA por Ang II na faixa das concentrações encontradas no plasma de mamíferos (Nishiyama
et al., 2002) preparações de MBL foram inicialmente incubadas com Ang II 30 µM por 30 min a
37
o
C e separadas do sobrenadante por meio de centrifugação após este período. O objetivo deste
72
experimento foi confirmar o aparecimento, no sobrenadante, de peptídeos provenientes de Ang II,
como resultado de sua exposição as MBLs. Verificou-se que o pico padrão de Ang II (tempo de
retenção, t
r
, de aproximadamente 15 min) (Figura 16A) tornou-se indetectável, enquanto
apareceram dois novos picos denominados M
1
(t
r
de 10,2 min) e M
2
(t
r
de 11,9 min) (Figura
16B). Dessa forma, estes dados confirmam a existência de um processo de proteólise de Ang II
que culmina, com a formação de dois produtos, cujo aparecimento coincidiu e foi associado com
a progressiva recuperação da atividade da PMCA (Assunção-Miranda, 2004).
Tendo visto assim que Ang II é metabolizada quando exposta a uma preparação de MBL,
os estudos seguintes se propuseram a investigar a possível atividade biológica dos produtos
formados sobre a PMCA. O mesmo processo de incubação foi repetido e o sobrenadante obtido
após separação da MBL foi seco e ressuspenso conforme descrito em Materiais e Métodos. Este
extrato foi então adicionado a um ensaio de atividade da PMCA e seu efeito comparado com o de
Ang II 10
-10
M. Observou-se que na presença dos produtos de proteólise de Ang II a atividade da
PMCA (10,35 ± 0,88 nmol Pi × mg
-1
× min
-1
) foi semelhante (p > 0,05) à do controle sem adições
(11,62 ± 1,14), enquanto que na presença de Ang II 10
-10
M foi confirmada a inibição de 40-50%
(6,65 ± 0,99) previamente descrita (Assunção-Miranda, 2004; Assunção-Miranda et al., 2005)
(Figura 16C). Portanto, a MBL de túbulos proximais renais, quando em contato com altas
concentrações de Ang II, é capaz de promover a formação de metabólitos (M
1
e M
2
) em cuja
presença a PMCA preserva a sua atividade basal. Este experimento não responde ainda à seguinte
pergunta: a recuperação da atividade da PMCA decorre do desaparecimento progressivo de Ang
II que a inibe ou é resultado de efeitos promovidos pelos metabólitos?
73
Figura 16. Ang II em altas concentrações é metabolizada a M
1
(tempo de retenção, t
r
, de 10,2
min) e M
2
(t
r
de 11,9 min), que não têm efeito sobre a atividade da PMCA. Cromatogramas
obtidos por HPLC (A) do padrão de Ang II e (B) do sobrenadante obtido após a incubação das
MBLs de túbulos proximais renais com Ang II 30 µM por 30 min a 37
o
C. (C) Atividade da
PMCA, determinada como descrito em Materiais e Métodos na presença de Ang II 10
-10
M ou
dos metabólitos M
1
e M
2
recuperados do sobrenadante obtido após incubação das MBLs com
Ang II 30 µM.
*
0
3
6
9
12
Ang II,
10
-10
M
M
1
+ M
2
+
+
-
-
-
-
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
Ang II
A
C
B
M
1
t
r
=10,2 min
M
2
t
r
=11,9 min
Ang II
0
3
6
9
12
Ang II,
10
-10
M
M
1
+ M
2
+
+
-
-
-
-
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
Ang II
A
C
B
M
1
t
r
=10,2 min
M
2
t
r
=11,9 min
Ang II
M
1
t
r
=10,2 min
M
2
t
r
=11,9 min
Ang IIAng II
74
IV.2. Há receptores envolvidos no efeito contra-regulador dos metabólitos sobre a atividade
da PMCA?
A reversão do efeito inibitório de Ang II na atividade da PMCA poderia ocorrer por três
caminhos: (1) pela simples degradação do octapeptídeo em metabólitos inativos, (2) pela ação
dos metabólitos de angiotensina em receptores específicos, ou (3) pela dessensibilização de
receptores de angiotensina causada devido a exposição a altas concentrações de Ang II. Sabendo-
se que Ang II e seus derivados (como a Ang-(1-7)) desencadeiam seus efeitos biológicos agindo
em receptores localizados nas células epiteliais do túbulo proximal – encontrados tanto na MA
como na MBL (Mujais, et al., 1986; Féraille & Doucet, 2001; Handa, et al., 2001) –, os próximos
experimentos foram realizados buscando verificar se os metabólitos são realmente
biologicamente ativos e se há receptores de Ang II ativados por estes num processo que resulta na
reversão da inibição da PMCA. Para tanto, a atividade desta enzima foi medida na presença dos
antagonistas dos receptores AT
1
(losartan) ou AT
2
(PD123319), ambos na concentração de 10
-7
M, e na presença dos metabólitos M
1
e M
2
, provenientes do sobrenadante seco gerado pela
incubação da MBL com Ang II 30 µM por 30 min a 37
o
C. Na presença de losartan, não houve
alteração no efeito dos metabólitos sobre a atividade da PMCA (Figura 17), um resultado que
oferece quatro possibilidades: (1) os metabólitos são de fato inativos, (2) os metabólitos são
inativos e o losartan bloqueia a inibição provocada por Ang II residual presente no extrato (não
detectável no HPLC), (3) os metabólitos são ativos, mas não há envolvimento de receptores AT
1
no antagonismo destes sobre o efeito de Ang II residual e (4) um eventual efeito biológico de M
1
e M
2
poderia ser mediado por receptores AT
2
.
75
Figura 17. Atividade da PMCA de MBL de túbulos proximais renais na presença dos metabólitos
de Ang II (M
1
+ M
2
) e do antagonista do receptor AT
1
, losartan. A atividade da PMCA foi
medida conforme descrito em Materiais e Métodos na presença dos metabólitos provenientes da
incubação da MBL com Ang II 30 µM por 30 min a 37
o
C (M
1
+ M
2
) e losartan nas combinações
indicadas na abcissa. Os resultados são expressos como média ± erro padrão (n = 7). Não se
observou diferença entre os tratamentos (NS).
Losartan,
10
-7
M
++--
M
1
+ M
2
-++-
*
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
0
3
6
9
12
15
NS
76
Os experimentos da Figura 18 apontam para a quarta possibilidade mencionada no
parágrafo anterior. Na presença de PD123319, o extrato contendo M
1
e M
2
inibiu a atividade da
PMCA para níveis idênticos aos obtidos com Ang II sozinha (Figura 16C): 6,16 ± 1,02 vs 11,62 ±
1,14 nmol Pi × mg
-1
× min
-1
do controle. Estes dados mostram que o bloqueio dos receptores AT
2
impede a ativação de uma via que, tendo M
1
e M
2
como agonistas, se contrapõe àquela inibitória
da PMCA via PLC→DAG→PKC (Assunção-Miranda et al., 2005). Assim, na presença de
PD123319 continuaria sendo evidenciada apenas a inibição provocada por Ang II residual, uma
conclusão reforçada pelos experimentos mostrados na Figura 19, na qual se observa que o
agonista parcial do receptor AT
2
, CGP42112A, reverte o efeito inibitório de Ang II 10
-10
M,
retornando a atividade da PMCA para os níveis controle. Este dado mimetiza a situação
encontrada quando há concentrações micromolares de Ang II (quarta coluna da Figura 19), que
leva a formação de quantidades significativas dos peptídeos M
1
e M
2
(Figura 16 A,B). Os
resultados das Figuras 16-19 permitem concluir, portanto, que ao passo que Ang II inibe a
atividade da PMCA, os metabólitos resultantes de sua proteólise revertem este efeito através da
interação com o receptor AT
2
. Extrapolando para modelos in vivo isto significa que Ang II em
baixas concentrações levaria a um aumento dos níveis intracelulares de Ca
2+
em túbulos
proximais renais através da inibição da PMCA, enquanto os metabólitos formados no interstício
peritubular vizinho levariam à extrusão de Ca
2+
da célula pelo retorno da atividade da PMCA aos
níveis basais. Desta forma, os metabólitos de Ang II ao modular os níveis intracelulares de Ca
2+
permitiriam ajustar a reabsorção de Na
+
(e água) pelo túbulo proximal em condições que cursam
com altos níveis de Ang II circulantes. Du et al. (2003) observaram um efeito bifásico de Ang II
na reabsorção de fluido em túbulos isolados, com estimulação em baixas concentrações e retorno
aos níveis basais com altas concentrações, um efeito dependente de PKC e Ca
2+
que pode estar
77
Figura 18. Atividade da PMCA de MBL de túbulos proximais renais na presença dos metabólitos
de Ang II (M
1
+ M
2
) e do antagonista do receptor AT
2
, PD123319. A atividade da PMCA foi
medida na presença dos metabólitos provenientes da incubação da MBL com Ang II 30 µM por
30 min a 37
o
C (M
1
+ M
2
) e o PD123319 nas combinações indicadas na abcissa. Os resultados
são expressos como média ± erro padrão (n = 10; *p < 0,05 em relação aos demais tratamentos).
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
0
3
6
9
12
*
M
1
+ M
2
PD123319,
10
-7
M
-- ++
--++
78
Figura 19. O agonista parcial do receptor AT
2
, CGP42112A, reverte o efeito inibitório de Ang II
10
-10
M sobre a PMCA de MBL de túbulo proximal renal. A atividade da PMCA foi medida na
presença de Ang II 10
-10
M, Ang II 10
-6
M e CGP42112A 10
-10
M nas combinações indicadas na
abcissa. Os resultados são expressos como média ± erro padrão (n = 6; * p < 0,05 em relação as
demais tratamentos).
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
-
--
--
+
*
Ang II
10
-10
M
Ang II
10
-6
M
CGP42112A
10
-10
M
-
+
+
++
--
-+
-
-
+
79
associado a efeitos de Ang II (e seus metabólitos) na PMCA. Este efeito contra-regulatório dos
metabólitos de Ang II, promovido pela interação destes com AT
2
, se insere na visão geral que
aponta para estes receptores como mediadores de efeitos que antagonizam os efeitos biológicos
resultantes da ligação de Ang II em receptores AT
1
e também naquela que considera a
possibilidade de AT
2
ser o receptor envolvido nos efeitos biológicos de peptídeos derivados de
angiotensina, como a Ang-(1-7) (Santos et al., 2000; Lara et al., 2006; Padia et al., 2006).
IV.3. Efeito dos metabólitos de Ang II sobre a PMCA
Os resultados obtidos até o momento demonstraram que os metabólitos de Ang II são
biologicamente ativos, uma vez que modulam a atividade da PMCA na presença de Ang II
através da ativação de receptores, mas não oferecem informações sobre a sua estrutura. São
eles alguns dos peptídeos das vias de proteólise de angiotensinas esquematizadas na Figura
3B? Teriam também outros intermediários e produtos desta via a capacidade de modular a
PMCA? Com base nestas duas questões foi estudada inicialmente a influência de diferentes
componentes da família de peptídeos derivados de angiotensinas, antes de abordar a sua
caracterização estrutural, já que a premissa era de que, em função de seu provável pequeno
tamanho, haveria dificuldade para uma acurada definição de seqüência através da
espectrometria de massa. O ensaio de peptídeos obtidos por síntese química poderia assim
direcionar a investigação da estrutura a partir do seu efeito sobre a PMCA e da caracterização
do seu perfil de eluição no HPLC. Ao mesmo tempo, também poderiam ser obtidas
informações acerca de quais seriam os intermediários (biologicamente ativos ou não), na(s)
via(s) que, a partir de Ang II culminam em M
1
e M
2
.
80
Em um estudo de cinética de formação dos metabólitos, M
1
e M
2
, realizado em nosso
laboratório foi demonstrado que a incubação das MBLs de túbulos proximais renais com Ang
II leva à formação transitória de Ang-(1-7) (Assunção- Miranda, 2004), sugerindo que os
produtos finais passam pela proteólise limitada de Ang-(1-7). Analisando a Figura 20,
observa-se que Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5), Ang-(1-4) e Ang-(3-4) seriam possíveis
candidatos a metabólitos através de posteriores etapas paralelas ou seqüências de proteólise
limitada que se iniciam em Ang-(1-7). Com a finalidade de testar inicialmente se estes
peptídeos apresentam efeito biológico no transporte transepitelial no túbulo proximal através
da alteração das concentrações intracelulares de Ca
2+
– sendo, portanto, funcionalmente
associadas a M
1
e M
2
– foram investigadas suas influências na atividade da PMCA. Apesar
de ter sido relatado que Ang-(1-7) em concentrações de aproximadamente 10 nM modula a
atividade de transportadores de Na
+
(NaHCO
3
-
e Na
+
-ATPase) (Garcia & Garvin, 1994; Lara
et al., 2006) – efeitos que poderiam ter a participação do Ca
2+
citosólico –, não se verificou
nenhum efeito deste heptapeptídeo, per se (em concentrações que variaram de 10
-16
a 10
-6
M), sobre a atividade da PMCA (Figura 21). Resultados semelhantes foram obtidos para
Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) que não alteraram a atividade da PMCA
(Figura 22A, B, C e D, respectivamente). Por razões que emergirão ao longo do texto, o
produto final da cascata mostrada na Figura 20, será ensaiado posteriormente.
Ações de Ang-(1-7) se contrapondo aos efeitos de Ang II quando a mesma está
presente já foram descritas no túbulo proximal. Dois exemplos são a reversão do efeito
estimulatório de Ang II sobre a atividade Na
+
-ATPásica presente em MBL de túbulos
proximais renais (Lara et al., 2002) e a inibição da fosforilação de MAPKs estimulada por
Ang II em células de túbulo proximal (Su et al., 2006). Com base nestas observações e nos
resultados das Figuras 16-19, o ensaio seguinte buscou investigar o efeito de Ang-(1-7) sobre
81
Figura 20. Possíveis peptídeos derivados de Ang-(1-7) por proteólise limitada mediada por
diferentes classes de peptidases. A figura mostra potenciais candidatos aos metabólitos finais
de Ang II (M
1
e M
2
) e os possíveis intermediários em uma seqüência de etapas de proteólise
limitada. Para detalhes destas vais ver seção IV.7. ECA, enzima conversora de angiotensina;
AP, aminopeptidase; CP, carboxipeptidase; EP, endopeptidase; NEP, neprilisina.
Ang-(1-7)
(NH
2
-DRVYIHP-COOH)
AP
Ang-(2-7)
(NH
2
-RVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-DRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-DRVY-COOH)
Ang-(3-7)
(NH
2
-VYIHP-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
ECAAP
EP AP/ NEP
CP
Ang-(1-7)
(NH
2
-DRVYIHP-COOH)
AP
Ang-(2-7)
(NH
2
-RVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-DRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-DRVY-COOH)
Ang-(3-7)
(NH
2
-VYIHP-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
ECAAP
EP AP/ NEP
CP
82
Figura 21. Ang-(1-7) per se não modula a atividade da PMCA de MBL de túbulos proximais
renais. A atividade da PMCA foi medida na ausência e presença de concentrações crescentes do
peptídeo (10
-16
a 10
-6
M). Os resultados são expressos como média ± erro padrão (n = 11).
- log[(Ang-(1-7)], M
16 14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
25
Controle
Ang-(1-7)
83
Figura 22. (A) Ang-(2-7), (B) Ang-(3-7), (C) Ang-(1-5) e (D) Ang-(1-4) per se não modulam a
atividade da PMCA de MBL de túbulos proximais renais. A atividade da PMCA foi medida na
presença de concentrações crescentes dos diferentes peptídeos (10
-16
a 10
-6
M). Os resultados são
expressos como média ± erro padrão (n = 15; n = 12; n = 12; n = 15, respectivamente) sem
diferença entre os valores da atividade da PMCA em diferentes concentrações de cada peptídeo.
-log[Ang-(2-7)], M
14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
controle
Ang-(2-7)
-log [(Ang-(3-7)], M
14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
controle
Ang-(3-7)
B
A
16 14 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
-log[Ang-(1-5)], M
Controle
Ang-(1-5)
C
D
16 14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
-log[Ang-(1-4)], M
Controle
Ang-(1-4)
-log[Ang-(2-7)], M
14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
controle
Ang-(2-7)
-log [(Ang-(3-7)], M
14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
controle
Ang-(3-7)
B
A
16 14 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
-log[Ang-(1-5)], M
Controle
Ang-(1-5)
C
D
16 14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
-log[Ang-(1-4)], M
Controle
Ang-(1-4)
D
84
a PMCA na presença de Ang II. A Figura 23 mostra que o heptapeptídeo reverteu a inibição
promovida por Ang II, mostrando que o intermediário da via que conduz de Ang II para M
1
e
M
2
exerce o mesmo efeito antagonista da inibição da PMCA, apoiando a idéia de que
intermediários e produtos de proteólise convergem para modular a concentração de Ca
2+
citosólico – e, portanto, o transporte de fluido – quando se eleva a concentração plasmática
de Ang II. Em relação aos peptídeos derivados da metabolização de Ang-(1-7) (Figura 20)
também foi observado que todos são capazes de reverter o efeito inibitório de Ang II 10
-10
M
sobre a PMCA (a atividade da PMCA em nmol Pi × mg
-1
× min
-1
foi de 11,44 ± 1,84 no
controle vs 6,22 ± 0,66 na presença de Ang II 10
-10
M e 9,57 ± 1,03; 13,61 ± 1,80; 14,18 ±
1,37; 12,07 ± 1,94 na presença de Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-4) e Ang-(1-5),
respectivamente) (Figura 24). Este resultado indica que o efeito biológico destes peptídeos
sobre a PMCA é semelhante ao do seu precursor Ang-(1-7), reforçando os indícios de que
alguns destes poderiam de fato ser um dos metabólitos de Ang II, M
1
e M
2
e, mais uma vez,
evidencia o que parece ser uma regra geral: peptídeos derivados de Ang II antagonizam os
efeitos desta no fluxo ativo de Ca
2+
através do epitélio tubular proximal. Nota-se que a
concentração de Ang-(2-7) e Ang-(3-7) usada neste último experimento foi 10
-8
M, enquanto
a de Ang-(1-5) e Ang-(1-4) foi 10
-14
M. Embora a concentração de 10
-14
M pareça ser mais
fisiológica, a escolha aleatória da concentração de 10
-8
M para os ensaios com Ang-(2-7) e
Ang-(3-7) foi decidida para abranger uma concentração alta dentre as ensaiadas nos
experimentos da Figura 22.
85
Figura 23. Ang-(1-7) reverte o efeito inibitório de Ang II sobre a atividade da PMCA de MBL de
túbulo proximal renal. A atividade da PMCA foi medida conforme descrito em Materiais e
Métodos. Onde indicados, foram adicionados Ang II 10
-10
M e Ang-(1-7) 10
-14
M. O resultado é
expresso como média ± erro padrão (n = 6).
Atividada PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang II,
10
-10
M
-+
-
Ang-(1-7),
10
-14
M
-
+
+
*
86
Figura 24. Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-4) e Ang-(1-5) revertem o efeito inibitório de Ang II
sobre a atividade da PMCA de MBL de túbulos proximais renais. A atividade da PMCA foi
medida na ausência ou presença de Ang II 10
-10
M e dos peptídeos Ang-(2-7) e Ang-(3-7) na
concentração de 10
-8
M e Ang-(1-4) e Ang-(1-5) na concentração de 10
-14
M, como indicado na
abcissa. Os resultados são expressos como média ± erro padrão (n = 7; n = 6; n = 12; n = 6; *p <
0,05 em relação aos demais tratamentos).
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang II, 10
-10
M
A
n
g
-
(
2
-
7
)
1
0
-
8
M
A
n
g
-
(
1
-
5
)
1
0
-
1
4
M
A
n
g
-
(
1
-
4
)
1
0
-
1
4
M
A
n
g
-
(
3
-
7
)
1
0
-
8
M
87
IV.4. Efeito dos metabólitos de Ang II sobre a PMCA na presença de antagonista de
receptor AT
2
A partir dos resultados apresentados nas Figuras 23 e 24 foi concluído que Ang-(1-7),
Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) participam de uma grande família de derivados de
Ang II com uma propriedade comum a M
1
e M
2
: antagonizar os efeitos de Ang II sobre a PMCA.
Será que este efeito é promovido através da sua interação inicial com receptores AT
2
? Sabendo-
se que Ang-(1-7) é capaz de interagir com o receptor AT
2
para desencadear alguns de seus
efeitos, inibindo a atividade de uma ATPase (Na
+
-ATPase) através da interação com estes
receptores (Lara et al., 2006), foi assim investigado o envolvimento do mesmo no efeito contra-
regulatório de Ang-(1-7) sobre a inibição da PMCA promovida por Ang II. Conforme
demonstrado na Figura 25, o efeito contra-regulatório de Ang-(1-7) não foi abolido na presença
de PD123319, excluindo a participação de AT
2
neste processo. Talvez o receptor AT
1-7
seja o
responsável pelo efeito de Ang-(1-7) neste sistema, porém tal hipótese não foi testada. Os
ensaios de Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) na presença de PD123319 tiveram o
intuito de investigar se os seus efeitos sobre a PMCA na presença de Ang II seriam mediados ou
não pela ligação a receptores AT
2
como também buscaram restringir as opções de candidatos a
M
1
e M
2
, uma vez que M
1
e M
2
não são capazes de reverter o efeito inibitório de Ang II na
presença de antagonista do receptor AT
2
(Figura 18). A Figura 26 mostra os resultados obtidos
adicionando PD123319 e cada um destes peptídeos de síntese em ensaios de atividade da PMCA
de MBLs incubadas na presença de Ang II 10
-10
M. Apesar de serem capazes de reverter a
inibição promovida por Ang II, o efeito destes peptídeos não é cancelado pelo antagonista
PD123319, evidenciando assim que estes não atuam via receptores AT
2
e, ainda, permitindo
descartar a possibilidade de quaisquer um deles ser M
1
ou M
2
. Por outro lado, este resultado
88
Figura 25. O receptor AT
2
não está envolvido no efeito contra-regulatório de Ang-(1-7) sobre a
inibição da PMCA promovida por Ang II. A atividade da PMCA foi medida conforme descrito
em Materiais e Métodos. Onde indicado, foram adicionados Ang II 10
-10
M, PD123319 10
-7
M e
Ang-(1-7). Os resultados são expressos como média ± erro padrão (n = 5).
Atividada PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang II,
10
-10
M
-
-
+
Ang-(1-7),
10
-14
M
-
+
+
*
PD123319,
10
-7
M
-
-
-+
+
+
89
Figura 26. O receptor AT
2
não está envolvido no efeito contra-regulatório de Ang-(2-7), Ang-(3-
7), Ang-(1-4) e Ang-(1-5) sobre a inibição da PMCA por Ang II. A atividade da PMCA foi
medida na presença de Ang II 10
-10
M, PD123319 10
-7
M, Ang-(2-7) (A); Ang-(3-7) (B); Ang-(1-
4) (C); Ang-(1-5) (D) nas combinações indicadas nas abcissas dos respectivos quadros. Os
resultados são expressos como média ± erro padrão (n=8; n=6; n=12; n=6, respectivamente; *p <
0,05 em relação ao respectivo controle sem adições).
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(2-7),
10
-8
M
PD123319,
10
-7
M
-+
--
-++
+--
Ang II,
10
-10
M
--+++
*
*
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(1-4),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
+
-
+
++
+-
-
-
-
-
-
-
PD123319,
10
-7
M
+
+
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(1-5),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
- +
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+-
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(3-7),
10
-8
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
-+
-
-
-
---
-
+
+
+
+
+
+
*
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(2-7),
10
-8
M
PD123319,
10
-7
M
-+
--
-++
+--
Ang II,
10
-10
M
--+++
*
*
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(1-4),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
+
-
+
++
+-
-
-
-
-
-
-
PD123319,
10
-7
M
+
+
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(1-5),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
- +
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+-
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(3-7),
10
-8
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
-+
-
-
-
---
-
+
+
+
+
+
+
*
A
D
C
B
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(2-7),
10
-8
M
PD123319,
10
-7
M
-+
--
-++
+--
Ang II,
10
-10
M
--+++
*
*
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(1-4),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
+
-
+
++
+-
-
-
-
-
-
-
PD123319,
10
-7
M
+
+
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(1-5),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
- +
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+-
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(3-7),
10
-8
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
-+
-
-
-
---
-
+
+
+
+
+
+
*
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(2-7),
10
-8
M
PD123319,
10
-7
M
-+
--
-++
+--
Ang II,
10
-10
M
--+++
*
*
Atividade da PMCA
(nmolPi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
Ang-(1-4),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
+
-
+
++
+-
-
-
-
-
-
-
PD123319,
10
-7
M
+
+
*
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(1-5),
10
-14
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
- +
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+-
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
Ang-(3-7),
10
-8
M
Ang II,
10
-10
M
PD123319,
10
-7
M
-+
-
-
-
---
-
+
+
+
+
+
+
*
A
D
C
B
90
anuncia o envolvimento de outros receptores de angiotensina, que não AT
1
e AT
2
, na reversão
por estes peptídeos, da inibição exercida pela Ang II sobre a PMCA. Estes receptores poderiam
ser AT
1-7
ou AT
4
ou ainda receptores órfãos (Wise et al., 2004). Estes últimos fazem parte de um
grupo de receptores cujos ligantes endógenos ou função ainda não foram estabelecidos.
Atualmente se sabe que 720 genes pertencem à superfamília de GPCRs, dos quais metade
parecem codificar receptores sensoriais. Da outra metade restante, apenas 210 possuem seus
ligantes endógenos identificados, permanecendo 150 no grupo dos chamados “receptores órfãos”
(Wise et al., 2004), ou seja, aqueles sem ligantes (específicos ou não) encontrados até o
momento.
Algumas observações permitem, postular que, Ang-(3-7) poderia antagonizar os efeitos de
Ang II através da interação com receptores AT
4
. Foi demonstrado por Handa (1999) que Ang-(1-
7) e Ang-(3-7) inibem a atividade da (Na
+
+K
+
)ATPase de túbulos proximais renais, um efeito
semelhante ao encontrado após a ativação dos receptores sensíveis a divalinal-Ang IV por Ang
IV (Handa et al., 1998) e oposto aquele mediado por Ang II (em baixas concentrações) sobre esta
enzima (Féraille & Doucet, 2001). Como Ang-(3-7), mas não Ang-(1-7), interage com o receptor
AT
4
, foi sugerido que a inibição promovida por Ang-(1-7) sobre a (Na
+
+K
+
)ATPase ocorreria
através da ligação do seu metabólito Ang-(3-7) no receptor AT
4
(Handa, 1999). Este parece ser o
caso de Ang-(3-7) na PMCA inibida por Ang II (Figura 26B). A adição de PD123319 cancela a
inibição exercida pela Ang II 10
-10
M (Assunção-Miranda et al., 2005) e a ativação simultânea de
receptores AT
4
por Ang-(3-7) seria responsável pela hiperativação da PMCA (Figura 26B, quarta
coluna). Além disso, apesar de Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) não serem M
1
e M
2
,
estes peptídeos apresentam efeito semelhante aos metabólitos, nos levando a postular que estas
angiotensinas apesar de agirem por um receptor que não é o AT
2
poderiam estar sendo
91
metabolizadas a um mesmo produto que seria, então, responsável pela reversão da inibição da
PMCA através da ativação de receptores AT
2
(Figura 18).
IV.5. Identificação dos metabólitos de Ang II envolvidos na reversão da inibição da PMCA
promovida por Ang II
A caracterização do efeito de Ang-(1-7), Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) na
PMCA (Figuras 23-26) permitiu identificá-los como pertencentes a uma grande família de
peptídeos derivados de Ang II, capazes de reverter a inibição do transporte ativo de Ca
2+
através
do epitélio tubular proximal exercido por concentrações muito baixas de Ang II. A relevância
fisiológica desta observação reforça a idéia de que através de diferentes tipos de receptores e de
diferentes vias (ainda não elucidadas; Figuras 25,26), produtos da proteólise limitada e
progressiva de Ang II – que tem como intermediário Ang-(1-7) – seriam capazes de modular
finamente a concentração citosólica de Ca
2+
em túbulos proximais nas variadas circunstâncias
fisiológicas e patológicas que cursam com alterações do VEC e da pressão arterial e, portanto,
com concentrações plasmáticas muito variáveis de Ang II. Esta regulação fina do Ca
2+
citosólico
e das vias de sinalização que o tem como segundo mensageiro permitiria adequados fluxos de
água e de diferentes eletrólitos a despeito de grandes flutuações sistêmicas e locais de Ang II.
A abordagem de estudo dos efeitos biológicos dos peptídeos derivados de Ang II e,
especialmente, a ausência de interação com receptores AT
2
(Figuras 25,26) nas suas influências
sobre a PMCA inibida por Ang II permitiram concluir que Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e
Ang-(1-4) não são os produtos finais M
1
e M
2
formados quando Ang II em altas concentrações é
incubada com preparações de MBL. Esta conclusão é reforçada quando os quatro peptídeos de
síntese (10
-4
M) são analisados através de HPLC. O t
r
dos peptídeos foi de 13,3 min para Ang-(2-
92
7); 13,1 min para Ang-(3-7); 10,9 min para Ang-(1-4) e 12,3 para Ang-(1-5) com o padrão de
Ang-(1-7) exibindo o mesmo t
r
de 13,1 min observado por Assunção-Miranda (2004) (Figura 27).
Como os t
r
de Ang-(1-4) e Ang-(1-5) são muito próximos aos de M
1
e M
2
(t
r
= 10,2 min e 11,9
min, respectivamente), os metabólitos já secos obtidos pela pré-incubação das MBLs com 30 µM
de Ang II a 37 ºC por 30 min foram injetados no HPLC juntamente com 10
-4
M de Ang-(1-4) e
Ang-(1-5) (Figura 28) para verificar se estes peptídeos co-eluíam com M
1
e M
2
. Como os picos
de M
1
e M
2
não se sobrepuseram aos de Ang-(1-4) e Ang-(1-5) descartou-se a possibilidade de
qualquer um destes peptídeos ser M
1
e M
2
como previsto a partir da comparação dos resultados
da atividade biológica das Figuras 18 e 26. Entretanto M
1
e M
2
poderiam ainda ser metabólitos
dos peptídeos acima citados, como mostrado na Figura 20. Para avaliar esta hipótese e assim
caracterizar as vias de proteólise, as MBLs de túbulo proximal renal foram incubadas por 30 min
a 37
o
C com 30 µM de cada um destes cinco peptídeos separadamente e após passar pelo mesmo
procedimento de obtenção de M
1
e M
2
, o sobrenadante seco foi injetado no HPLC. No
cromatograma de metabolização de Ang-(1-7) foi detectado M
1
e M
2
de forma semelhante à
proteólise de Ang II, porém também se detectou um pico residual de Ang-(1-7) (Figura 29), um
resultado que reforça a visão de uma via de proteólise de Ang II que apresenta Ang-(1-7) como
intermediário e que tem M
1
e M
2
como produtos finais.
Apesar da metabolização de Ang-(1-7) gerar M
1
e M
2
, os produtos das vias em paralelo,
ou seja, Ang-(2-7) e Ang-(3-7) e, Ang-(1-5) e Ang-(1-4) (Figura 20), parecem ser totalmente
metabolizados e geram somente um mesmo peptídeo, cujo t
r
coincide com aquele de M
1
(t
r
= 10,2
min) (Figura 30). Esta observação permite concluir que os metabólitos (ou pelo menos M
1
) são
derivados de todos os peptídeos caracterizados nas Figuras 24 e 26, reforçando a hipótese de que
as seqüências de proteólise mostradas na Figura 20 representariam as vias que, a partir de Ang II
93
Figura 27. Cromatogramas obtidos por HPLC dos peptídeos de síntese dos derivados de Ang II.
(A) Padrão de Ang-(1-7) – tempo de retenção de aproximadamente (t
r
) 13,1 min; (B) Padrão de
Ang-(2-7) – t
r
de aproximadamente 13,3 min; (C) Padrão de Ang-(3-7) – t
r
de aproximadamente
13,1 min; (D) Padrão de Ang-(1-5) – t
r
de aproximadamente 12,3 min; (E) Padrão de Ang-(1-4) –
t
r
de aproximadamente 10,9 min.
Ang-(1-7)
t
r
=13,1 min
A
Ang-(1-4)
t
r
=10,9 min
E
Ang-(1-5)
t
r
=12,3 min
D
Ang-(3-7)
t
r
=13,1 min
C
Ang-(2-7)
t
r
=13,3 min
B
Ang-(1-7)
t
r
=13,1 min
A
Ang-(1-4)
t
r
=10,9 min
E
Ang-(1-5)
t
r
=12,3 min
D
Ang-(3-7)
t
r
=13,1 min
C
Ang-(2-7)
t
r
=13,3 min
B
94
Figura 28. Não há sobreposição do pico de M
1
e M
2
com os de Ang-(1-4) e Ang-(1-5).
Cromatograma dos metabólitos obtidos pela pré-incubação de MBL de túbulo proximal renal
com 30 µM de Ang II a 37 ºC por 30 min injetados no HPLC juntamente com 10
-4
M de Ang-(1-
4) e Ang-(1-5).
Ang-(1-4)
t
r
= 10,9 min
M
1
t
r
= 10,2 min
M
2
t
r
= 11,9 min
Ang-(1-5)
t
r
= 12,3 min
Ang-(1-4)
t
r
= 10,9 min
M
1
t
r
= 10,2 min
M
2
t
r
= 11,9 min
Ang-(1-5)
t
r
= 12,3 min
95
Figura 29. Ang-(1-7) é precursor de M
1
e M
2
. (A) Padrão de Ang-(1-7) – t
r
de 13,1 min. (B)
metabolização de Ang-(1-7) a M
1
e M
2
formados após a incubação das MBLs de túbulo proximal
renal com Ang-(1-7) por 30 min a 37
o
C.
Ang-(1-7)
M
1
M
2
B
Ang-(1-7)
t
r
=13,1 min
A
Ang-(1-7)
M
1
M
2
B
Ang-(1-7)
M
1
M
2
M
1
M
1
M
2
M
2
B
Ang-(1-7)
t
r
=13,1 min
A
Ang-(1-7)
t
r
=13,1 min
A
96
Figura 30. A metabolização de (A) Ang-(2-7), (B) Ang-(3-7), (C) Ang-(1-4) e (D) Ang-(1-5) leva
a formação de um mesmo pico, cujo t
r
é semelhante ao de M
1
. Os insets demonstram os
cromatogramas dos respectivos peptídeos padrão a partir do qual o metabólito foi formado. Os
metabólitos foram gerados após a incubação da MBL de túbulos proximais renais com os
respectivos peptídeos por 30 min a 37
o
C.
M
1
M
1
M
1
M
1
Ang-(2-7)
t
r
=13,3 min
Ang-(1-4)
t
r
=10,9 min
Ang-(1-5)
t
r
=12,3 min
Ang-(3-7)
t
r
=13,1 min
A
D
C
B
M
1
M
1
M
1
M
1
Ang-(2-7)
t
r
=13,3 min
Ang-(1-4)
t
r
=10,9 min
Ang-(1-5)
t
r
=12,3 min
Ang-(3-7)
t
r
=13,1 min
M
1
M
1
M
1
M
1
M
1
M
1
M
1
M
1
Ang-(2-7)
t
r
=13,3 min
Ang-(1-4)
t
r
=10,9 min
Ang-(1-4)
t
r
=10,9 min
Ang-(1-5)
t
r
=12,3 min
Ang-(1-5)
t
r
=12,3 min
Ang-(3-7)
t
r
=13,1 min
Ang-(3-7)
t
r
=13,1 min
A
D
C
B
97
e passando por Ang-(1-7) culminam em M
1
e M
2
. Como a proteólise sucessiva teve uma ou duas
etapas a menos quando ensaiada a partir destes peptídeos intermediários, M
2
pode ter sido
também metabolizado a M
1
no tempo padrão de 30 min, sobretudo se a eficiência catalítica
kcat/km de alguma das etapas finais da cascata proteolítica for muito alta. Como mostrado pouco
mais adiante, esta hipótese mostrou-se correta.
Analisando a confluência das vias paralelas mostradas na Figura 20, bem como os
aminoácidos dos peptídeos destas vias, constata-se que estes convergem em Ang-(3-4), composta
apenas de valina e tirosina nas posições 3 e 4, respectivamente (Figura 31). Portanto, resta
investigar se Ang-(3-4) é realmente um dos metabólitos M
1
ou M
2
, se tem efeito sobre a atividade
da PMCA e se interage com o receptor AT
2
para atuar sobre esta bomba como o extrato ensaiado
na Figura 18. Assim, o passo seguinte foi verificar se o peptídeo padrão de Ang-(3-4) apresentava
tempo de retenção semelhante ao de M
1
ou ao de M
2
. O t
r
de Ang-(3-4) não coincidiu com aquele
de M
1
, mas foi idêntico ao de M
2
(t
r
=11,9’) (Figura 32A,B). A sobreposição do pico de M
2
com o
pico de Ang-(3-4) detectado no cromatograma após a injeção dos metabólitos já secos (obtidos
pela pré-incubação da MBL com 30 µM de Ang II a 37 ºC por 30 min) juntamente com 10
-4
M de
Ang-(3-4) confirmou a identidade de M
2
como sendo Ang-(3-4) (Figura 32C). Esta observação
confirma a hipótese esquematizada na seqüência de proteólise da Figura 20 de que Ang-(3-4)
seria o menor produto biológico derivado de Ang II. Allred et al. (2000) descreveram a formação
de um dipeptídeo Val
3
-Tyr
4
resultante da proteólise de Ang-(1-7) e, mais recentemente, Shaltout
et al. (2007) também descreveram Ang-(1-7), Ang-(1-5), Ang-(1-4) e Ang-(3-4) como
metabólitos de Ang II quando a mesma é incubada em fração de membranas de túbulo proximal
de rim de ovelha. O aparecimento destes produtos na urina também revela a existência de um
metabolismo normal em túbulos inteiros, mas nenhum destes dois trabalhos aponta para o
98
Figura 31. Os peptídeos formados a partir da proteólise limitada de Ang II esquematizada na
Figura 20 apresentam como motivo estrutural comum o dipeptídeo Val
3
-Tyr
4
.
DRVYIHP
RVYIHP
VYIHP
DRVYI
DRVY
VY
Ang-(1-7)
Ang-(2-7)
Ang-(3-7)
Ang-(1-5)
Ang-(1-4)
Ang-(3-4)
RVYIHP
VYIHP
VY
Ang-(1-7)
Ang-(2-7)
Ang-(3-7)
Ang-(1-5)
Ang-(1-4)
Ang-(3-4)
DRVYIHP
RVYIHP
VYIHP
DRVYI
DRVY
VY
Ang-(1-7)
Ang-(2-7)
Ang-(3-7)
Ang-(1-5)
Ang-(1-4)
Ang-(3-4)
RVYIHP
VYIHP
VY
Ang-(1-7)
Ang-(2-7)
Ang-(3-7)
Ang-(1-5)
Ang-(1-4)
Ang-(3-4)
99
Figura 32. Comparação dos perfis de eluição de M
1
, M
2
e Ang-(3-4). (A) Cromatograma obtido
por HPLC do peptídeo de síntese de Ang-(3-4). O t
r
foi de 11,9 min idêntico ao t
r
de M
2
. (B)
Comparação do cromatograma A (rosa) com o cromatograma em que Ang II é metabolizada a M
1
e M
2
(preto). (C) Ang-(3-4) co-eluiu com M
2
, conforme demonstrado na sobreposição dos picos.
Ang-(3-4)
t
r
=11,9’= M
2
Ang-(3-4)
t
r
= 11,9 min
Ang-(3-4)
t
r
= 11,9 min=M
2
A
B
C
M
1
Ang-(3-4) + M
2
t
r
= 11,9 min
Ang-(3-4)
t
r
=11,9’= M
2
Ang-(3-4)
t
r
= 11,9 min
Ang-(3-4)
t
r
= 11,9 min=M
2
A
B
C
M
1
M
1
Ang-(3-4) + M
2
t
r
= 11,9 min
100
significado fisiológico destes peptídeos em processos renais de transporte.
A que estrutura corresponderia M
1
? A primeira hipótese foi a de que seria simplesmente
uma valina e/ou tirosina, já que Ang-(3-4) é um dipeptídeo composto pelos mesmos. Para testa-
la, as MBLs foram incubadas com 30 µM de Ang-(3-4) por 30 min a 37
o
C e o sobrenadante
resultante foi secado e analisado por HPLC. A Ang-(3-4) desapareceu dando origem a um pico
com o mesmo tempo de retenção de M
1
(t
r
= 10,2 min) (Figura 33), da mesma maneira que
ocorreu com Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) (Figura 30). Este fato reforça a
hipótese de que M
1
poderia ser apenas tirosina e/ou valina. A análise por HPLC de uma solução
de tirosina 33 µM revelou então que este aminoácido apresentava o mesmo tempo de retenção de
M
1
(t
r
= 10,2 min), levando a conclusão de que M
1
é a tirosina (Figura 34).
Analisando em conjunto as Figuras 16C, 29, 30, 32 e 33 pode ser concluído que: (a)
diferenças na eficiência catalítica das enzimas envolvidas nas vias representadas na Figura 20
poderiam explicar a não visualização de intermediários a partir de Ang-(1-7), (b) após a
confluência em Ang-(3-4) – um dipeptídeo ainda com atividade biológica – ocorre ainda a
proteólise deste que culmina com a sua clivagem em dois aminoácidos. Seria, no entanto, o
desaparecimento de M
2
(Ang-(3-4)) uma questão de tempo? Para responder a esta pergunta, as
MBLs foram incubadas com Ang II 30 µM por 2 hs (ao invés de 30 min) a 37
o
C e o
sobrenadante seco foi analisado por HPLC. A Figura 35 mostra que o estado final de proteólise
de Ang II conserva Ang-(3-4) (M
2
) independente do tempo de exposição da Ang II à MBL. A
persistência após 30 min ou 2 hs de um pico idêntico com t
r
de 11,9 min não pode ser atribuído a
uma velocidade intrínsica muito lenta da transição M
2
→M
1
, uma vez que Ang-(3-4) transita
completamente para M
1
em 30 min (Figura 33).
Talvez a manutenção de níveis residuais de Ang II ou Ang-(1-7) no ensaio da Figura 35,
101
Figura 33. Cromatograma obtido por HPLC após a incubação das MBLs com Ang-(3-4). O
tempo de retenção do pico formado foi de 10,2 min, semelhante ao tempo de retenção de M
1
,
acompanhado do desaparecimento de Ang-(3-4).
M
1
t
r
= 10,2 min
M
1
t
r
= 10,2 min
102
Figura 34. Cromatogramas obtidos por HPLC do padrão de tirosina e produtos da proteólise de
Ang II. (A) O t
r
do padrão de tirosina foi de 10,2 min, idêntico ao t
r
de M
1
; (B) Superposição do
cromatograma A (preto) com o cromatograma em que Ang II é metabolizada a M
1
e M
2
após a
incubação por 30 min a 37
o
C na presença de MBLs (rosa).
tirosina
t
r
= 10,2 min
A
tirosina
t
r
= 10,2 min=M
1
B
M
2
tirosina
t
r
= 10,2 min
A
tirosina
t
r
= 10,2 min=M
1
B
tirosina
t
r
= 10,2 min=M
1
B
M
2
M
2
103
Figura 35. Proteólise de Ang II em tempos prolongados. Os cromatogramas dos produtos da
metabolização de Ang II quando incubada com a MBL a 37
o
C por 30 min (A) ou por 2 hs (B)
são semelhantes.
A
M
1
M
2
A
M
1
M
1
M
2
M
2
M
1
M
2
B
Tyr
Ang-(3-4)
Tyr
Ang-(3-4)
A
M
1
M
2
A
M
1
M
1
M
2
M
2
M
1
M
2
B
M
1
M
2
B
Tyr
Ang-(3-4)
Tyr
Ang-(3-4)
Tyr
Ang-(3-4)
Tyr
Ang-(3-4)
104
não detectáveis no HPLC com o método empregado, inibam a clivagem de Ang-(3-4) e
estabilizem a sua presença como um dos produtos finais da proteólise seqüencial de Ang II. Se
este processo também ocorrer in vivo, o mesmo constituiria um mecanismo que, contribuindo
para preservar Ang-(3-4) (M
2
), seria um “salva-guarda” contra os níveis anormalmente altos de
Ca
2+
intracelular ou contra o prolongamento deste efeito pela inibição exacerbada da PMCA por
Ang II. Como a intensidade e a duração das ondas e dos picos intracelulares de Ca
2+
, bem como
as vias de sinalização disparadas pelo íon, dependem do fino controle dos processos que
governam a sua entrada (através de receptores de IP
3
) e sua saída via PMCA (Tortelote et al.,
2004; Strehler et al., 2007), talvez os níveis relativos de Ang II e Ang-(3-4) no interstício tubular
vizinho a MBL sejam mais importantes que as concentrações absoutas de Ang II na modulação
de processos que têm o Ca
2+
como segundo mensageiro. Nesta perspectiva, as vias que conduzem
a Ang-(3-4) teriam o mesmo significado que aquelas que conduzem a Ang-(1-7) e Ang IV
(Haulica et al., 2004; Kramkowski et al., 2006) na compensação redundante – e, portanto, mais
eficiente – de efeitos biológicos de Ang II. Todavia, muito embora a Figura 32 mostre que a Ang-
(3-4) de síntese e o M
2
resultante da proteólise co-eluam com o mesmo t
r
, aceito em moléculas
desta natureza (Allred et al., 2000), falta ainda confirmar o efeito contra-regulatório de Ang-(3-4)
sobre a inibição da PMCA promovida por Ang II e o eventual envolvimento de receptores AT
2
.
Isto será abordado no próximo ponto.
IV.6. Efeitos de Ang-(3-4) sobre a PMCA na ausência e presença de Ang II 10
-10
M:
envolvimento de receptores AT
2
Primeiramente, foi verificado se a Ang-(3-4), per se, modulava a atividade da PMCA de
MBL de túbulo proximal renal. Para isso, foi feita uma curva dose-resposta adicionando-se
105
Ang-(3-4) em concentrações crescentes (10
-16
a 10
-6
M) a preparação de MBL, observando-se
num ensaio de atividade da PMCA, que não houve alteração alguma na atividade da bomba de
Ca
2+
(Figura 36), um efeito semelhante ao encontrado com os outros peptídeos de síntese
derivados de Ang II (Figura 22). Contudo, quando as MBLs foram previamente incubadas com
Ang II 10
-10
M, Ang-(3-4) 10
-14
M reverteu o efeito inibitório de Ang II sendo este efeito
suprimido na presença de PD123319 10
-7
M (a atividade da PMCA foi de 13,98 ± 1,60 nmol Pi ×
mg
-1
× min
-1
no controle versus 8,37 ± 1,78 na presença de Ang II e 16,87 ± 1,00 e 8,59 ± 1,05 na
presença de Ang-(3-4) e Ang-(3-4) e PD123319, respectivamente) (Figura 37). Este resultado
comprova, portanto, que a Ang-(3-4) mimetiza os efeitos promovidos pelos metabólitos (M
1
e
M
2
) (Figura 18). Assim, podemos confirmar que a Ang-(3-4) (cujos efeitos foram hipotetizados,
mas não mostrados na seção anterior) é um peptídeo biologicamente ativo que contrabalança
numa concentração extremamente baixa (10
-14
M) o efeito inibitório de Ang II sobre a PMCA
através de uma via dependente de receptor AT
2
. É importante mencionar que é a primeira vez que
é atribuída e demonstrada atividade biológica para o peptídeo Ang-(3-4) e que a baixa
concentração em que reverte o efeito (10 fM) lhe confere um importante significado fisiológico.
Como mencionado anteriormente, os resíduos Tyr
4
e Phe
8
da Ang II são essenciais para a
ativação completa do receptor AT
1
(Noda et al., 1995; Noda et al., 1996) sendo que talvez apenas
a presença do resíduo Tyr
4
de Ang-(3-4) seja fundamental para a ativação do receptor AT
2
com
altíssima afinidade.
IV.7. Enzimas envolvidas na metabolização de Ang II
Sabendo-se que Ang II é metabolizada a Ang-(3-4) tendo como intermediário Ang-(1-7) e
106
Figura 36. Ang-(3-4), per se, não modula a atividade da PMCA. Foram adicionadas as diferentes
concentrações de Ang-(3-4) (10
-16
a 10
-6
M) mostradas na abcissa. Os resultados são expressos
como média ± erro padrão (n=11).
- log[(Ang-(3-4)], M
16 14 12 10 8 6
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
25
Controle
Ang-(3-4)
107
Figura 37. Ang-(3-4) não reverte o efeito inibitório de Ang II sobre a atividade da PMCA de
MBL de túbulo proximal renal na presença de antagonista de receptor AT
2
. A atividade da
PMCA foi ensaiada na presença de Ang II 10
-10
M, Ang-(3-4) 10
-14
M e PD123319 10
-7
M nas
combinações indicadas na abcissa. Os resultados são expressos como média ± erro padrão (n = 6;
* p < 0,05).
Atividade da PMCA
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
5
10
15
20
*
*
-
PD123319,
10
-7
M
--+
Ang II,
10
-10
M
-+
Ang-(3-4),
10
-14
M
-+-
++
+
108
que o túbulo proximal renal apresenta uma série de enzimas responsáveis pela proteólise de Ang
II, como ECA, NEP e ECA2 (Shaltout et al., 2007), o próximo passo foi investigar as peptidases
envolvidas na proteólise limitada e progressiva de Ang II esquematizada na Figura 20 e
demonstrar se a presença ou ausência das enzimas indicadas nesta Figura contribuiria para
reforçar o papel de Ang-(2-7), Ang-(3-7), Ang-(1-5) e Ang-(1-4) na via que conduz a Ang-(3-4),
uma vez que – possivelmente pela alta eficiência catalítica das peptidases que o transformam –
estes peptídeos não foram individualizados como intermediários da via que leva de Ang II a Ang-
(3-4) (passando por Ang-(1-7)), apesar da aparente lógica e possível seqüência proposta.
Inicialmente, a fim de investigar quais seriam as peptidases que levam à formação de Ang-(1-7) a
partir de Ang II, na primeira etapa da via que culmina em Ang-(3-4), as MBLs foram pré-
incubadas por 20 min a 37
o
C com 1 µM de inibidor específico de ECA2 (DX600) ou 2 mM de
inibidor de CPP (orto-fenantrolina) adicionando em seguida Ang II 30 µM e incubando-a por 30
min. Posteriormente, o sobrenadante seco obtido após a separação das MBLs foi injetado no
HPLC. Verificou-se que quando a MBL foi pré-incubada com inibidor de ECA2 (Figura 38A)
não houve mudança no perfil de proteólise permanecendo a formação dos metabólitos M
1
e M
2
,
indicando assim que a formação de Ang-(1-7) na MBL não ocorre de forma dependente de
ECA2. Em contrapartida, a pré-incubação das MBLs com orto-fenantrolina impediu a
degradação de Ang II sem o aparecimento de nenhum intermediário, revelando que a CPP parece
ser a principal enzima responsável pela conversão de Ang II a Ang-(1-7) em túbulos proximais
renais (Figura 38B). Entretanto não se pode excluir o envolvimento de uma PRCP, uma vez que
esta enzima também atua na proteólise de Ang II a Ang-(1-7) e orto-fenantrolina não é capaz de
inibí- la (Schmaier et al., 2003).
A forte evidência apresentada na Figura 38A de que a ECA2 não participa da etapa de
109
Figura 38. Cromatogramas obtidos por HPLC após a adição de Ang II a MBLs de túbulos
proximais renal pré-incubadas com (A) 1 µM de DX600 (inibidor de ECA2) e (B) com 2 mM de
orto-fenantrolina (inibidor de CPP). Em (A) não houve alteração na metabolização de Ang II,
enquanto em (B) não houve proteólise de Ang II.
B
Ang II
t
r
= 15,1 min
Tyr
Ang-(3-4)
A
B
Ang II
t
r
= 15,1 min
B
Ang II
t
r
= 15,1 min
Tyr
Ang-(3-4)
A
110
conversão de Ang II em Ang-(1-7) em MBLs de túbulos proximais renais, sugere fortemente de
que esta enzima não estaria presente nestas membranas (ver adiante Figura 44), um exemplo de
exclusão seletiva de uma potente peptidase na superfície das células voltadas para o interstício,
que poderia garantir a Ang II um destino metabólico preferencial numa via destinada a modular
fluxos e sinais de Ca
2+
. Em contraste, no sistema cardiovascular a conversão de Ang II por
ECA2 é considerada a principal via catalítica para a formação de Ang-(1-7), uma vez que ocorre
com uma eficiência 500 vezes maior que a de Ang I a Ang-(1-9) (Odya et al., 1978; Vickers et
al., 2002).
Pode ser especulado que a via que metaboliza Ang II em túbulos proximais sem o
envolvimento de ECA2 e que tem como produto final Ang-(3-4) participaria da regulação de
fluxos iônicos através da modulação do Ca
2+
citosólico (PMCA) e, conseqüentemente do VEC.
No aparelho cardiovascular (vasos e coração), a metabolização de Ang II à Ang-(1-7) não estaria
tão eficientemente acoplado a outra seqüência proteolítica que culmina em Ang-(3-4). Dessa
forma, o contrabalanço dos efeitos de Ang II decorreria principalmente da atividade da ECA2 e
da geração de Ang-(1-7). Ratos que não expressam ECA2, por exemplo, apresentam hipertensão
arterial e níveis de Ang II renal aumentados (talvez por diminuição de sua conversão intracelular
ou intravascular a Ang-(1-7)) (Gurley et al., 2006). Em um outro exemplo, a transferência do
gene de ECA2 para o coração de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) – cujos níveis de
ECA2 estão constitutivamente reduzidos – exerce um efeito protetor do estabelecimento de
hipertensão arterial e fibrose cardíaca (Díez-Freire et al., 2006). Estes exemplos apóiam,
portanto, a noção de que se ECA2 e Ang-(1-7) desempenham um papel chave no contrabalanço
dos efeitos sistêmicos (vasculares) de Ang II, outras peptidases – e diferentes peptídeos, como
Ang-(3-4) e os outros apresentados na Figura 20 – participariam do contrabalanço dos efeitos de
Ang II nos processos de transporte renal, cujas vias de sinalização acopladas têm o Ca
2+
como
111
segundo mensageiro, conferindo, assim, maior versatilidade ao sistema e amplificando os pontos
para a sua possível regulação.
Dando continuidade aos experimentos de investigação das enzimas que estariam
envolvidas na conversão de Ang II nos peptídeos indicados na Figura 20 via Ang-(1-7), foi
analisada a participação da ECA, visto que em túbulos proximais renais de ratos diabéticos, a
expressão de ECA2 e ECA apresenta perfis opostos e isto se reflete nos níveis de Ang-(1-7)
(Tikellis et al., 2003; Benter et al., 2007). As MBLs foram então pré-incubadas com 150 µM de
inibidor de ECA (captopril) e posteriormente foi adicionado Ang II ou Ang-(1-7) 30 µM. A
adição de Ang II à MBL na presença deste inibidor revelou um cromatograma com alteração
significativa dos produtos finais formados (Figura 39A). À diminuição marcante de M
1
soma-se
o destaque adquirido por um pico cujo t
r
é de aproximadamente 9 min e cujo aparecimento
errático foi verificado algumas vezes (ver, por exemplo, Figura 29). Estas observações abrem
algumas possibilidades. A primeira seria a de que a proteólise limitada de Ang II ocorreria –
quando a conversão de Ang-(1-7) em Ang-(1-5) (Shaltout et al., 2007) está inibida pelo captopril
– como resultado da catálise pelas enzimas do ramal da esquerda esquematizado na Figura 20
(via Ang-(2-7) → Ang-(3-7)), para culminar em Ang-(3-4). A diminuição de M
1
poderia ser
atribuída a uma velocidade geral de proteólise mais lenta por este ramal, que não permitiria o
aparecimento de tirosina em quantidades significativas em 30 min. Esta hipótese não foi
explorada.
Todavia, os experimentos mostrados na Figura 39B não suportam esta primeira
alternativa. Quando as MBLs são pré-incubadas com captopril e se adiciona Ang-(1-7), esta
permanece intacta ao longo de todo o experimento sem o aparecimento de M
1
e/ou M
2
como
visto anteriormente na Figura 29B. Isto mostra, por um lado, que a conversão de Ang-(1-7) a
112
Figura 39. Cromatogramas obtidos após a adição de (A) Ang II ou (B) Ang-(1-7) a MBLs pré-
incubadas com 150 µM de captopril (inibidor de ECA). Como o captopril tem um t
r
igual ao de
Ang-(1-7) (13,1 min; traçados em rosa nas duas figuras inseridas e picos do captopril ressaltados
com “x” vermelho), o pico de Ang-(1-7) em “B” (painel principal) foi corrigido utilizando um
branco de captopril incubados com as MBLs por 20 min (traçados em rosa). M
x
: pico não
identificado em “A”, com t
r
≅ 9 min.
M
x
Ang-(3-4)
x
Captopril
t
r
=13,1
min
Ang III
t
r
= 15,6 min
Tyr
M
1
M
2
x
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
Captopril
+
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1
min
M
x
Ang-(3-4)
x
Captopril
t
r
=13,1
min
Ang III
t
r
= 15,6 min
Tyr
M
x
Ang-(3-4)
x
Captopril
t
r
=13,1
min
Ang III
t
r
= 15,6 min
Tyr
M
1
M
2
x
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
Captopril
+
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1
min
M
1
M
1
M
2
M
2
x
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
Captopril
+
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1
min
113
Ang-(1-5) catalisada pela ECA é uma etapa crítica e obrigatória no ramal que conduziria a Ang-
(3-4) via Ang-(1-4). Adicionalmente, permite descartar uma contribuição pelo menos
significativa do ramal da esquerda na seqüência apresentada na Figura 20, uma vez que o
captopril não inibe inespecificamente – até onde chega o nosso conhecimento – endopeptidases e
aminopeptidases como aquelas potencialmente envolvidas nas transformações de Ang-(2-7) e
Ang-(3-7). Por outro lado, os experimentos das Figuras 39
A,B abrem uma segunda possibilidade
para explicar o aparecimento dos produtos de proteólise a partir de Ang II na presença de
captopril (Figura 39A). Como a transição Ang-(1-7) → Ang-(1-5) está bloqueada e o ramal da
esquerda representado na Figura 20 não contribui para a formação de Ang-(3-4), resulta a
evidência de que a Ang II foi desviada para uma via alternativa de processamento que poderia
envolver a seqüência Ang II → Ang III → Ang IV → Ang-(3-7) → Ang-(3-4) (Figura 3B).
Aminopeptidases A e N foram implicadas nos efeitos biológicos de Ang IV quando esta resulta
do processamento de Ang II (Braszco et al., 2006) o que mostra a relevância fisiológica de uma
via que passa por Ang IV. O aparecimento de um pico remanescente com um t
r
igual ao de Ang
III (15,6 min) (Figura 39A) indicaria por fim, que quando Ang II é desviada da via preferencial
que passa por Ang-(1-7) para a via alternativa catalisada inicialmente por aminopeptidase A e
aminopeptidase N, o passo limitante da sequência de proteólise a partir de Ang II seria a
conversão Ang III → Ang IV. Assim, com este conjunto de resultados, mais uma vez evidencia-
se uma via redundante de produção de Ang-(3-4), um peptídeo capaz de contrapor os efeitos de
Ang II (ao menos sobre a PMCA) e reforça-se a idéia de que no SRA existiriam sempre “válvulas
de escape” para evitar efeitos excessivos de Ang II. Neste sentindo, retornando a Figura 38B,
poderia ser questionado porque não houve formação dos metabólitos via Ang III e Ang IV a
partir de Ang II na presença de orto-fenantrolina, já que este inibidor teria bloqueado apenas a
114
conversão de Ang II a Ang-(1-7) catalisada pela CPP. Todavia, a orto-fenantrolina é um inibidor
não específico de metalopeptidases e mesmo que haja a conversão Ang II → Ang III → Ang IV,
esta seqüência não prosseguiria até a formação de Ang-(3-4), visto que são necessárias
carboxipeptidases para removerem a porção carboxi destes peptídeos (Figura 3B).
Como já experimentado e descrito acima, nos ensaios em que se adicionou Ang-(1-7) às
MBLs pré-incubadas com captopril contatou-se a abolição da formação de qualquer metabólito
(Figura 39B). Portanto, no caso em que se tem inicialmente Ang-(1-7) como substrato, há apenas
um único caminho a ser seguido sendo necessária a conversão específica de Ang-(1-7) a Ang-(1-
5) catalisada pela ECA para completar a sequência Ang-(1-7) → Ang-(1-5) → Ang-(1-4) →
Ang-(3-4) e tirosina. Como a NEP parece ser responsável pela transformação de Ang-(1-4) em
Ang-(3-4) “in vitro” (Shaltout et al., 2007), os experimentos das Figuras 40 e 41 foram
delineados na tentativa de discernir se a NEP ou uma aminopeptidase estariam envolvidas na
etapa final do ramal da direita representado na Figura 20 em MBLs de túbulos proximais renais.
Em fibroblastos de tecido cardíaco, uma alta atividade de arginino-aminopeptidase é a
responsável pela rápida conversão de Ang-(1-4) em Ang-(3-4) (Petrov et al., 2004). Quando as
MBLs foram pré-tratadas com bestatina, um inibidor de amplo espectro de aminopeptidase e
incubadas na presença de Ang-(1-7) para alimentar somente a seqüência da direita mostrada na
Figura 20, a formação de M
1
e M
2
permaneceu inalterada (Figura 40), permitindo assim descartar
a participação de uma arginino-aminopeptidase na proteólise limitada do intermediário Ang-(1-
4).
O envolvimento da NEP na formação de Ang-(3-4) confirma-se com o experimento da
Figura 41. Quando as MBLs são pré-incubadas com tiorfan (um inibidor específico de NEP) e se
ensaia a proteólise de Ang II, observa-se o aparecimento de picos menores de M
1
e M
2
com
115
Figura 40. Cromatograma obtido após a adição de Ang-(1-7) a MBLs de túbulos proximais renais
pré-incubadas por 20 min com 1 µM de bestatina (inibidor de amplo espectro de
aminopeptidases). O tempo de reação após a adição de Ang-(1-7) foi de 30 min.
Tyr
Ang-(3-4)
Tyr
Ang-(3-4)
116
Figura 41. Cromatograma obtido após a adição de Ang II a MBLs de túbulos proximais renais
pré-incubadas por 20 min com 100 nM de tiorfan (inibidor de NEP). O tempo de reação após a
adição de Ang II foi de 30 min.
Ang II
t
r
= 15,1 min
Tyr
Ang-(3-4)
Ang II
t
r
= 15,1 min
Tyr
Tyr
Ang-(3-4)
117
persistência de uma parcela significativa de Ang II, um resultado compatível com uma proteólise
mais lenta desta por uma via parcialmente inibida.
Embora os resultados obtidos com tiorfan, que mostram persistência residual significativa
de Ang II, possam ser explicados por inibição parcial de uma NEP envolvida na transição Ang-
(1-4) → Ang-(3-4), tal fato não afasta possibilidades de outras vias catalisadas por NEP. Shaltout
et al. (2007) mostraram também que NEP pode catalisar diretamente a conversão de Ang II a
Ang-(1-4) bem como as de Ang-(1-5) e Ang-(1-4) para Ang-(3-4) (já discutida). A inibição
parcial destas vias alternativas (Figura 42), junto a um concomitante desvio de Ang II para a via
alternativa que tem Ang III e Ang IV como intermediários poderia explicar a proteólise
incompleta observada na Figura 41. Mas embora estes processos mediados pela NEP possam
existir, o experimento da Figura 38B confirmaria o papel central da proteólise de Ang II para
Ang-(1-7) catalisada por CPP ou PRCP na seqüência que culmina no peptídeo Ang-(3-4)
modulador dos efeitos de Ang II na PMCA de túbulos renais.
IV.8. Ensaio da atividade de diferentes peptidases em MBLs de túbulos proximais renais
Os experimentos mostrados nas diferentes Figuras da seção anterior, embora deixando
algumas alternativas em aberto, mostraram um papel central da conversão inicial de Ang II a
Ang-(1-7) catalisado por uma CPP ou por uma PRCP, uma vez que a inibição de ECA2 não
parece influenciar a formação de Ang-(3-4). Os experimentos da Figura 43 tiveram como
objetivo correlacionar a presença de atividades peptidásicas de algumas enzimas com o papel que
118
Figura 42. Possível via preferencial de proteólise limitada de Ang II com Ang-(1-7) como
intermediário e as peptidases envolvidas (modificação da Figura 20). CPP, carboxipeptidase P;
PRCP, prolilcarboxipeptidase; ECA, enzima conversora de angiotensina; NEP, neprilisina. (A)
Via em que a NEP proteolisa Ang-(1-4) a Ang-(3-4) com um passo intermediário anterior em que
uma CP cliva Ang-(1-5) a Ang-(1-4). Ver também Figura 3B para a via alternativa Ang II → Ang
III → Ang IV.
Ang-(1-7)
(NH
2
-NRVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-NRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-NRVY-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
ECA
CPP/ PRCP
Ang II
(NH
2
-NRVYIHPF-COOH)
tirosina
CP
NEP/ ?
NEP/ ?
NEP/ ?
Ang-(1-7)
(NH
2
-NRVYIHP-COOH)
Ang-(1-5)
(NH
2
-NRVYI-COOH)
Ang-(1-4)
(NH
2
-NRVY-COOH)
Ang-(3-4)
(NH
2
-VY-COOH)
ECA
CPP/ PRCP
Ang II
(NH
2
-NRVYIHPF-COOH)
tirosina
CP
NEP/ ?
NEP/ ?
NEP/ ?
119
poderiam desempenhar nas cascatas de proteólise esquematizadas nas Figuras 20 e 42. A análise
do curso temporal da hidrólise dos respectivos substratos fluorescentes Abz-FRK-(Dnp)P, Abz-
APK-Dnp, Abz-rGL-EDDnp e F-MCA por ECA, ECA2, NEP e aminopeptidase na presença dos
correspondentes inibidores específicos, mostra (Figura 43) que as MBLs apresentam atividades
ECA > NEP > AP, sem sinais de atividade de ECA2 (Figura 44). É importante ressaltar que estes
resultados são qualitativos, sobretudo quando se pretende extrapolá-los para a proteólise de
angiotensinas, visto que os substratos fluorescentes apresentam afinidades diferentes pelas
peptidases de diferente origem e, desta forma, as enzimas de MBL poderiam estar com diferentes
graus de saturação nos experimentos da Figura 43, além das afinidades por substratos artificiais
serem potencialmente distintas daquelas por diversas angiotensinas.
Todavia, apesar desta restrição, os ensaios com aminopeptidases permitem acrescentar
algumas conclusões àquelas apresentadas na seção anterior. A mais elevada atividade da ECA
reforça a idéia do papel central de Ang-(1-7) como intermediário na seqüência de proteólise e de
uma via preferencial representada pelo ramo da direita da Figura 20 (ver também Figura 42), ao
permitir uma eficiência maior de passo Ang-(1-7) → Ang-(1-5). A menor atividade da NEP em
MBLs, sugere que a conversão direta de Ang II em Ang-(1-4) sem passar por Ang-(1-7) (Figura
42) constituiria uma via colateral de menor significado fisiológico mas permanecendo uma
“alternativa para a redundância” na produção de Ang-(3-4). A ausência de atividade detectável de
ECA2 em MBLs corrobora os resultados da Figura 38A, que mostra a conversão completa de
Ang II em M
1
e M
2
mesmo na presença de uma alta concentração de DX600, descartando dessa
forma qualquer papel de ECA2 na seqüência de proteólise até Ang-(3-4). Esta enzima parece ter
uma localização preferencial, se não exclusiva, na borda em escova da MA, participando da
proteólise de Ang II presente no fluido luminal e contribuindo para a reabsorção de fragmentos
120
Figura 43. Curso temporal da atividade de peptidases de MBLs de túbulos proximais renais
envolvidas na proteólise limitada de angiotensinas. As atividades de ECA (A), NEP (B) e
aminopeptidase (C) foram ensaiadas na presença de seus respectivos substratos fluorescentes
(Abz-FRK-DnpP, Abz-rGL-EDDnp, F-MCA, Abz-APK(Dnp)-OH, Abz-APK(Dnp)-OH) na
ausência (círculos vazios) ou na presença dos seus respectivos inibidores: lisinopril 2 µM, tiorfan
100 nM e bestatina 10 µM (círculos cheios). Não houve atividade detectável de ECA2. As
ordenadas expressam unidades arbitrárias de florescência (UAF) por µg de proteína de MBL. As
reações foram iniciadas pela adição dos respectivos substratos. Ver Materiais e Métodos.
Time (s)
02040
UAF (ECA Abz-FRK-Dnp P)
2000
4000
6000
8000
ECA (UAF)
ECA +
Lisinopril 2
uM (UAF)
UAF em 1 ug de ptn
Time (s)
02040
UAF (NEP Abz- rGL-EDDnp)
1000
2000
NEP
NEP +
Thiorphan
100 nM
Time (s)
02040
UAF (Aminopeptidase F-MCA)
1000
1200
1400
Aminopeptid
ase
Amino+
Bestatina 10
uM
121
Figura 44. Comparação das atividade de ECA (enzima conversora de angiotensina); ECA2
(enzima conversora de angiotensina 2); NEP (neprilisina) e aminopeptidase em MBL de túbulo
proximal renal. Os valores de cada atividade correspondem àqueles obtidos com os substratos de
síntese e, portanto, suas diferenças não espelham as atividades relativas das enzimas no seu meio
ambiente natural com os seus substratos fisiológicos com Kms e Kcats diferentes aos dos
substratos sintéticos (ver texto). Estes têm, portanto, o significado de uma avaliação qualitativa.
ECA ECA2 NEP Aminopeptidase
Atividade Específica
(
µ
mol substrato
x min
-1
x
µ
g proteína
-1
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
122
peptídicos (Rice et al., 2004). Finalmente, a inibição completa da NEP, por uma concentração de
tiorfan igual à utilizada no experimento da Figura 41, contribui para sustentar a hipótese de que
uma via mais lenta que, passa por Ang III e Ang IV poderia contribuir para a formação de Ang-
(3-4) sem qualquer intervenção de NEP (Figura 3B).
IV.9. Efeito de BK na metabolização de Ang II e Ang-(1-7)
Os experimentos mostrados na Figura 35, nos quais a proteólise da Ang-(3-4) não
progride até a sua consumação final quando o substrato inicial é Ang II, foram interpretados
como resultado de inibição promovida pela Ang II residual – não detectável no HPLC – na
peptidase responsável pela clivagem da ligação Val-Tyr. Estes resultados levaram a postular que
peptídeos de atividades opostas poderiam inibir mutuamente a sua proteólise total, preservando a
continuidade de antagonismos e constituindo-se num mecanismo que permitiria, por exemplo,
atenuar através de Ang-(3-4), a inibição da PMCA por baixas concentrações de Ang II. Quase
uma década atrás, Allred et al. (2000) observaram que a Ang II poderia exercer um efeito
protetor de Ang-(1-7) inibindo a sua metabolização a Ang-(1-4) (ver Figura 20), porém não foi
atribuído qualquer significado fisiológico a este processo de inibição de proteólise.
Estas observações nos levaram a formular a hipótese de que, em nível da MBL de túbulos
renais, outros peptídeos vasoativos não relacionados a Ang II poderiam modular a sua proteólise
se a preservação de níveis altos de Ang II fosse fisiologicamente necessária em condições em
que, simultaneamente ocorressem níveis altos de, por exemplo, um peptídeo hipotensor. Sendo o
epitélio tubular renal uma fonte de cininogênio de baixa massa molecular (El-Dahr, 1997), a
grande candidata foi a bradicinina (BK).
123
A BK (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) é o principal componente biologicamente
ativo do sistema calicreína-cinina (SKK) (Rocha e Silva et al., 1949). Este sistema está envolvido
em vários processos regulatórios do organismo, como hipertensão, coagulação e inflamação
(Moreau et al., 2005). Da mesma forma que no caso do SRA, existem dois tipos de SKK: o SKK
plasmático (circulante) e o SKK tecidual, encontrado em uma série de órgãos, inclusive nos rins,
como mencionado acima. Este sistema renal apresenta todos os componentes do SKK (calicreína
tecidual, cininogênio, ECA e receptores de cininas) e tem um papel importante na regulação da
função renal (El-Dahr, 1997), uma vez que é conhecido o papel da BK como vasodilatadora da
microvasculatura renal (El-Dahr, 1997; Moreau et al., 2005) e reguladora dos processos de
natriurese e diurese (Caruso-Neves et al., 1999; Hébert et al., 2005). Para desempenhar as suas
ações cardiovascular e renal, esta cinina interage principalmente com o seu receptor B
2
ativando
vias que levam à liberação de NO e GMPc (Abadir et al., 2006) – mediadores hipotensores – e à
inibição do transporte de Na
+
em MBL do túbulo proximal (Caruso-Neves et al., 1999; Caruso-
Neves et al., 2003), efeitos opostos aqueles desencadeados por Ang II. Portanto, o SKK é
conhecido como um contra-balanceador fisiológico do SRA. Neste sentido, cada vez mais têm
sido demonstradas interações e “cross-talk” em vários níveis entre o SKK e o SRA. A Figura 45
resume todas as interações descritas até o momento.
Para testar a hipótese de que BK poderia influenciar a proteólise de Ang II (e de outros
peptídeos derivados), a preparação de MBL foi pré-incubada com BK 10
-8
M por 20 min a 37
o
C.
Após a adição de Ang II ou Ang-(1-7) 30 µM e incubação por mais 30 min à mesma temperatura,
a reação foi parada com tampão acetato, como descrito anteriormente, para obter o extrato seco a
ser analisado por HPLC. Os cromatogramas mostram (Figura 46) que as metabolizações, tanto a
de Ang II quanto a de Ang-(1-7), foram completamente abolidas, já que os picos correspondentes
124
Figura 45. Interações do sistema calicreína-cinina (SKK) com o sistema renina-angiotensina
(SRA). HK, cininogênio de alta massa molecular; PK, pré-calicreína; PRCP,
prolilcarboxipeptidase; HKa, cininogênio de alta massa molecular livre de bradicinina (BK);
ACE, enzima conversora de angiotensina; ACE2, enzima conversora de angiotensina 2; PGI
2
,
prostaciclina. Adaptado de Schmaier (2003).
Des-Arg-BK
ACE2
Des-Phe-Arg-BK
SKK
SRA
Angiotensin-(1-5)
ACE
Des-Arg-BK
ACE2
Des-Phe-Arg-BK
SKK
SRA
Angiotensin-(1-5)
ACE
125
Figura 46. Cromatograma obtido por HPLC após a pré-incubação de MBL com BK 10
-8
M. (A)
Ang II 30 µM foi adicionada após a pré-incubação. (B) Ang-(1-7) 30 µM foi adicionada após a
pré-incubação.
Ang II
t
r
=15,06’
Ang II
t
r
= 15,1 min
Ang-(1-7)
t
r
=13,55’
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
A
B
Ang II
t
r
=15,06’
Ang II
t
r
= 15,1 min
Ang-(1-7)
t
r
=13,55’
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
Ang II
t
r
=15,06’
Ang II
t
r
= 15,1 min
Ang-(1-7)
t
r
=13,55’
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
Ang-(1-7)
t
r
=13,55’
Ang-(1-7)
t
r
= 13,1 min
A
B
126
aos t
r
de Ang II e Ang-(1-7) (t
r
= 15,1 min e 13,1 min, respectivamente) permaneceram intactos
(Figura 46A e B, respectivamente). Portanto na presença de BK não seria necessária a presença
de outro peptídeo, como Ang-(3-4), formado a partir de Ang II, para contra-regular os efeitos
desta última. Se a inibição da proteólise de Ang II por BK parece ser compreensível do ponto de
vista fisiológico como uma forma de preservação dos efeitos de Ang II (no caso dos túbulos
renais estimulando a reabsorção de Na
+
), na presença de altas concentrações locais de BK, parece
mais difícil entender quais seriam o significado, o resultado e os mecanismos subjacentes da
inibição da proteólise de Ang-(1-7). Postulamos que em concentrações relativamente altas de
Ang-(1-7) em relação a Ang II, a primeira poderia atuar como agonista parcial dos efeitos da
segunda, através da ligação a receptores AT
1
. A BK poderia, assim, contrabalancear os efeitos de
Ang-(1-7) – nestas circunstâncias semelhantes aos de Ang II – sem requerer a presença de Ang-
(3-4) para isto. Dando suporte a esta idéia foi observado, em túbulos proximais renais, que na
ausência de Ang II, a Ang-(1-7) mimetiza os efeitos da primeira estimulando a Na
+
-ATPase
insensível a ouabaína, via um receptor sensível a losartan (Caruso-Neves et al., 2000, 2003).
Embora a BK possa antagonizar o efeito de Ang-(1-7), por exemplo, em relação a
atividade Na
+
-ATPásica, têm sido também mostrados efeitos sinérgicos resultantes da interação
entre BK e Ang-(1-7): potencialização de BK por Ang-(1-7) e mediação da atividade vascular de
Ang-(1-7) por BK (Santos et al., 2001 e referências ali incluídas). O primeiro tipo de interação
foi observado em estudos em ratos normotensos ou hipertensos, onde foi visto que a Ang-(1-7)
potencializa o efeito hipotensor da BK (Paula et al., 1995). Também foi relatado que a Ang-(1-7)
potencializa o efeito vasodilatador de BK em vasos de mesentério de rato (Fernandes et al.,
2001), artérias coronárias de cachorro (Brosnihan et al., 1996) e coração isolado de rato (Almeida
et al., 2000). Como a Ang-(1-7) pode agir também como inibidor da ECA e não apenas como
substrato – ligando-se ao seu domínio C onde é fracamente hidrolisada (Deddish et al., 1998) –
127
atuaria como inibidor da proteólise de BK disponibilizando-a em maior quantidade para os
receptores B
2
. O aumento de NO resultante desta interação e a conseguinte vasodilatação (Li et
al., 1997) explicariam o sinergismo entre Ang-(1-7) e BK no sistema circulatório acima descrito.
O segundo tipo de interação, em que BK medeia os efeitos de Ang-(1-7), foi evidenciado
por dois conjuntos de experimentos diferentes. No primeiro, a utilização de antagonistas de B
2
suprimiu os efeitos vasculares de Ang-(1-7) (Santos et al., 2001); no segundo, Ang-(1-7) ligando-
se a receptores AT
2
estimulou a liberação de cininas (Tsutsumi et al., 1999). Da mesma forma, as
cininas poderiam estar mediando os efeitos promovidos pela ativação do receptor AT
2
por Ang-
(3-4) (Figura 37); e, por inibição da via que converte Ang II em Ang-(1-7), a BK bloquearia a
proteólise de Ang II a Ang-(3-4) (Figura 46), como um mecanismo destinado a evitar a
redundante formação de cininas que ocorreria via a ativação de receptores AT
2
por Ang-(3-4).
Outros mecanismos poderiam ainda modular as interações do SRA com BK em
membranas ricas em receptores B
2
(Líbano-Soares et al., 2008) e ECA (Figura 44), como é o
caso das MBLs empregadas neste estudo e, conseqüentemente modificar os efeitos em alvos
como a PMCA e outros transportadores que respondem a hormônios e autacóides. Foi relatado a
BK induz a formação de complexos entre os receptores B
2
e a ECA, que são estabilizados na
presença de inibidores da ECA (tanto endógenos, como Ang-(1-7) e Ang-(1-9), tanto exógenos,
como inibidores sintéticos da ECA). Estes complexos bloqueiam a dessensibilização de B
2
(Schmaier et al., 2003; Chen et al., 2005, 2006) como também são capazes de causar a
ressensitização de receptores B
2
endocitados, disponibilizando um maior número destes para a
BK se ligar e desencadear os seus efeitos. Desta maneira, a presença de complexos ECA/B
2
na
MBL (estabilizados na presença de BK ou Ang-(1-7)) poderia ser uma forma mais eficiente de
BK mediar os efeitos contra-regulatórios de Ang-(1-7) (ou Ang-(3-4)) nos fluxos ativos de Ca
2+
em situações em que Ang II estivesse presente (Figura 23, 37).
128
Qual seria o mecanismo envolvido na potente supressão da metabolização das
angiotensinas por BK numa concentração 3000 vezes menor, ou seja, com um Ki extremamente
baixo? (note-se que a concentração de BK é 10
-8
M muito menor que a de Ang II ou Ang-(1-7)
que foi de 30 µM; Figura 46). A Figura 45 mostra que a PRCP e ECA são enzimas
compartilhadas pelo SKK e SRA, que por sua vez também estão envolvidas nas vias de proteólise
de Ang II em MBL de túbulos proximais renais (Figura 42). Este compartilhamento permite
postular que BK poderia interferir na proteólise de Ang II e Ang-(1-7) catalisada por estas
enzimas. Como a PRCP é iniciadora da cascata das cininas (Figura 45), a adição de BK (o
principal produto biológico da via) poderia inibir esta peptidase e, desta forma, impedir a
proteólise de Ang II e a formação dos produtos Ang-(3-4) e tirosina (Figura 46A). Como o Km
da PRCP renal para Ang II é 2 mM (Odya et al., 1978), ou seja, 100 vezes maior que a
concentração usada nos experimentos da Figura 46, um Ki muito baixo para BK poderia explicar
a inibição completa da proteólise de Ang II. Pode-se postular ainda que, em condições
fisiológicas, a PRCP participaria do controle das concentrações locais de Ang II (e de seus
produtos) numa faixa de saturação extremamente baixa e, portanto, altamente sensível a
flutuações de BK numa faixa submicromolar em torno do seu Ki.
Em relação à ECA, duas observações aparentemente contraditórias podem contribuir para
explicar o bloqueio da proteólise de Ang-(1-7) na presença de BK (Figura 46B). Já no advento da
era de utilização de diferentes peptídeos para inibir a ECA, com fins terapêuticos, foi observado
que a BK era capaz de inibir a proteólise de Ang I com um Ki muito baixo, 1,5 × 10
-7
M, na
presença de altas concentrações de Ang I (Cheung et al., 1980). Quando ensaiadas
separadamente, observou-se que a afinidade por BK na reação de formação de BK-(1-5) é
aproximadamente 90 vezes maior que para Ang I na conversão a Ang II (Kms respectivos de 0,18
129
e 16 µM; Blais et al., 2000). A semelhança dos valores de Ki e Km da ECA para BK mostra que
a enzima contribui para controlar respostas pressóricas, por exemplo, inibindo a proteólise de BK
ou de Ang I, dependendo das concentrações desta última. Se a diferença de afinidades da ECA
por BK e Ang I for semelhante em relação a Ang-(1-7), poderia explicar também a supressão de
proteólise desta última (Figura 46B). Para testar esta hipótese sem necessidade de avaliar
quantitativamente o Km da ECA para Ang-(1-7), foi realizado um experimento de proteólise
simultânea de BK e Ang-(1-7) em “ciclo único”
6
, utilizando um excesso de enzima em relação
aos dois substratos. Uma preparação de ECA purificada de pulmão de coelho (80 µM) foi
incubada a 37
o
C na presença de BK e Ang-(1-7) (20 µM) cada. Após 2 h, o meio foi injetado no
“loop” de um aparelho de HPLC acoplado a um espectrômetro de massas (LC/MS). Observou-se
inicialmente o aparecimento de dois picos no cromatograma, com t
r
de aproximadamente 11,1 e
12,2 min (Figura 47A). O “scan” de massa, que revela a abundância do pico por tempo, detectou
– como esperado – os mesmos picos com t
r
de 11,2 e 12,3 min (Figura 47B) que, resolvidos por
espectrometria de massa revelaram a presença de BK-(1-5) e Ang-(1-7) no primeiro (relação
massa/carga, m/z, 574 e 900; Figura 48A) e de Ang-(1-5) no segundo (relação m/z 666; Figura
48B). Levando-se em consideração que a escala das ordenadas no painel A é quase 7 vezes maior
que no painel B, pode ser concluído que a concentração de Ang-(1-7) remanescente é maior que a
do seu produto de proteólise Ang-(1-5), enquanto que toda a BK transformou-se no seu produto
BK-(1-5). O inset da Figura 48A, mostra as quantidades relativas dos produtos (BK-(1-5) e Ang-
(1-5)) formados a partir de seus substratos (BK e Ang-(1-7)). Este resultado comprova a maior
eficiência da ECA como cininase do que angiotensinase, apoiando a idéia de que a metabolização
6. Como a concentração da enzima é maior que a do substrato , a probabilidade de uma molécula de ECA encontrar
uma molécula de BK ou Ang-(1-7) mais de uma vez é extremamente pequena.
130
Figura 47. Cromatograma obtido por HPLC (A) e “scan” de massa (B), obtidos após a incubação
de ECA pulmonar 80 µM com BK e Ang-(1-7) (ambas na concentração de 20 µM) (a intensidade
no “scan” de massa para as áreas dos picos foi de 65,88 % para o t
r
de 11,2 min e 6,88 % para o t
r
de 12,3 min)
A
B
A
B
131
Figura 48. Espectrometria de massa realizado de maneira acoplada ao experimento mostrado na
Figura 46B. O pico eluído com t
r
de 11,2 min corresponde a BK-(1-5) e Ang-(1-7), enquanto
aquele eluído com t
r
de 12,3 min corresponde a Ang-(1-5). Nota-se que a BK foi totalmente
degradada a BK-(1-5). Nota-se que a relação de escalas na ordenada é de 1,1 x 108/ 1,62 x 107
(A/B). Inset no painel A: quantidades finais de BK-(1-5) e Ang-(1-5) no ensaio (as intensidades
dos picos foram de 68%, 32% e 6,88% para BK-(1-5), Ang-(1-7) e Ang-(1-5) respectivamente).
B
A
Ang-(1-7)
Ang-(1-5)
BK-(1-5)
BK-(1-5) ou Ang-(1-5)
(% de BK ou Ang-(1-7) iniciais)
0
20
40
60
80
BK-(1-5)
Ang-(1-5)
B
A
Ang-(1-7)
Ang-(1-5)
BK-(1-5)
BK-(1-5) ou Ang-(1-5)
(% de BK ou Ang-(1-7) iniciais)
0
20
40
60
80
BK-(1-5)
Ang-(1-5)
B
A
Ang-(1-7)
Ang-(1-5)
BK-(1-5)
BK-(1-5) ou Ang-(1-5)
(% de BK ou Ang-(1-7) iniciais)
0
20
40
60
80
BK-(1-5)
Ang-(1-5)
132
de Ang-(1-7) é suprimida devido à preferência da ECA por BK. Do ponto de vista fisiológico,
este resultado dá sustentação, mais uma vez, à hipótese de que a presença de um peptídeo de
outra cascata que antagoniza os efeitos de Ang II, como a BK, modula negativamente a formação
de um derivado que, potencialmente, tem os mesmos efeitos. No caso da PMCA, os efeitos
antagonistas de BK sobre a inibição por Ang II restam a ser explorados.
IV.10. Investigação da formação de heterodímeros AT
1
/AT
2
na presença de Ang II 10
-10
M e
Ang II 10
-6
M
Além do SRA e SKK estarem interconectados por uma série de enzimas como mostrado
previamente (Figura 45), o antagonismo funcional entre as suas ações também ocorre em nível de
receptor, uma vez que já foram mostradas dimerizações entre os receptores AT
2
e B
2
e entre AT
1
e B
2
. No primeiro caso, a heterodimerização AT
2
/B
2
foi máxima na presença de um agonista
parcial de AT
2
(CGP 42112A) juntamente com um antagonista de B
2
(icatibant), condição na qual
foi induzida maior formação do NO e GMPc em células de feocromocitoma em comparação ao
controle (Abadir et al., 2006). No segundo caso, a heterodimerização AT
1
/B
2
levou ao aumento
da eficácia e potência de Ang II para formar IP
3
e aumentar a concentração do Ca
2+
citosólico em
células de músculo liso, como resultado de uma maior ativação de G
q
e G
i
, além de ter inibido a
via endocítica de ambos (AbdAlla et al., 2000). Portanto, como a BK, através de ativação de B
2
,
compartilha cascatas de sinalização comuns com a Ang II (como aumento intracelular de Ca
2+
,
estimulação de MAPKs e da expressão de proteínas de matriz extracelular) e esta última induz a
expressão de receptor B
2
(Tan et al., 2003), o aumento da expressão de B
2
estimulado por Ang II
pode amplificar os sinais desta última tanto pela ativação de B
2
por BK como por aumentar a
formação do heterodímero AT
1
/B
2
. A heterodimerização entre os receptores de angiotensina
133
também já foi relatada pelo grupo do AbdAlla, que descreveu uma heterodimerização entre AT
2
e
AT
1
, no qual o primeiro receptor inibiu a via de sinalização desencadeada pelo segundo (AbdAlla
et al., 2001).
Uma vez que a inibição da PMCA promovida por Ang II é revertida tanto na presença de
losartan quanto de PD123319 (Assunção-Miranda, 2004; Assunção-Miranda et al., 2005), foi
formulada a hipótese de que o receptor envolvido seria um heterodímero AT
1
/AT
2
. Como a
inibição da PMCA por Ang II (máxima em 10
-10
-10
-9
M) é progressivamente revertida a medida
que se aumenta a sua concentração (até 10
-6
M), postulamos, no presente trabalho, a hipótese
complementar do “receptor em dois estados”, um modelo que assume a existência de monômeros
(de AT
1
e AT
2
) em equilíbrio dinâmico com heterodímeros AT
1
/AT
2
(acoplados à rede de
sinalização que os vincula à PMCA) que poderiam se dissociar na presença de altas
concentrações de Ang II. Como a Ang II – inicialmente alta – desaparece progressivamente para
gerar Ang-(3-4) (Figura 31) e esta é capaz de reverter a inibição da PMCA por Ang II num
processo sensível a PD123319, poder-se-ia postular que este produto final da proteólise catalisada
por enzimas residentes na MBL exerceria seu efeito via receptores AT
2
dissociados do
heterodímero AT
1
/AT
2
ou em monômeros de AT
2
pré-existentes em equilíbrio com
heterodímeros.
Para investigar a possibilidade de que a heterodimerização AT
1
/AT
2
em células renais é
dependente da concentração de Ang II, a preparação de MBL foi incubada com Ang II em baixas
e altas concentrações (10
-10
M e 10
-6
M, respectivamente) por 30 min a 37
o
C e posteriormente foi
realizada imunoprecipitação empregando-se o anticorpo anti-AT
2
. Em seguida foi realizado o
ensaio de Western blotting utilizando-se o anticorpo contra o receptor AT
1
. A Figura 49A,B
mostra que o receptor AT
1
é detectado no imunoprecipitado obtido com o anticorpo específico
anti-AT
2
tanto no controle como na presença de Ang II 10
-10
M. Como não há reação cruzada
134
Figura 49. Ang II modula a formação de heterodímeros entre os receptores AT
1
e AT
2
em MBLs
de túbulos proximais renais. Conforme indicado na abscissa, a membrana foi incubada na
ausência de Ang II (controle) e na presença de Ang II 10
-10
M e 10
-6
M. A. O receptor AT
2
foi
inicialmente imunoprecipitado e em seguida foi realizado o ensaio de Western blotting para a
detecção do receptor AT
1
. Os anticorpos não fazem reação cruzada. B. Análise densitométrica do
Western blotting para a detecção do receptor AT
1
. As barras pretas correspondem aos
imunoprecipitados (IP) e as barras brancas aos sobrenadantes (S). *: em relação ao controle e **:
em relação a Ang II 10
-10
M: diferença estatisticamente significativa (p< 0,01; n = 3).C. Após a
imunoprecipitação do receptor AT
2,
foi realizado o ensaio de Western blotting para a detecção do
mesmo. D. Análise densitométrica do Western blotting para a detecção do receptor AT
2
. As
barras pretas correspondem aos imunoprecipitados e as barras brancas aos sobrenadantes.
Os
ensaios de Western Blotting e imunoprecipitação realizados estão descritos em “Materiais e
Métodos”. .* : diferença estatisticamente significativa (p < 0,05; n = 3).
45kDa
45kDa
45kDa
45kDa
135
com os anticorpos empregados, este resultado mostra que o receptor AT
2
forma um heterodímero
estável com o receptor AT
1
na MBL nativa, que pode, assim, ser imunoprecipitado com o
anticorpo anti-AT
2
. Esta seria a estrutura funcional capaz de interagir com concentrações
fisiológicas (picomolares) de Ang II, modulando a PMCA (Figura 16) e, eventualmente, outros
processos de transporte transepitelial (Rangel et al., 1999; Féraille & Doucet, 2001). Na presença
de Ang II 10
-6
M, o imunoprecipitado obtido com o anticorpo anti-AT
2
não mais revela a
presença do receptor AT
1
, indicando que houve dissociação do dímero na membrana.
Os experimentos da Figura 49C,D mostram que o receptor AT
2
é detectado nas três
condições em quantidades semelhantes após a imunoprecipitação com seu anticorpo específico.
Esta observação permite descartar qualquer possibilidade de reação cruzada entre os anticorpos
utilizados, uma vez que se este fosse o caso uma banda teria sido necessariamente observada na
Figura 49A,B (última coluna à direita). Adicionamente, a Figura 49C,D serve como controle de
uma adequada imunoprecipitação proporcionada pelo anticorpo anti-AT
2
em todas as condições
experimentais da Figura 48A,B. Se não há detecção do receptor AT
1
no imunoprecipitado obtido
com o anticorpo anti-AT
2
na presença de Ang II 10
-6
M, porque o mesmo não aparece no
sobrenadante? (seta na Figura 49A) A resposta emerge na Figura 50. Quando os sobrenadantes
obtidos após a imunoprecipitação com o anticorpo anti receptor AT
2
são re-imunoprecipitados
empregando anticorpo anti receptor AT
1
observa-se: a) que uma parcela significativa deste último
não co-imunoprecipitou com o receptor AT
2
; b) que esta parcela é maior na presença de Ang II
10
-6
M. Estas observações, em conjunto, permitem concluir: 1) que o mais abundante receptor
AT
1
(Zhuo et al., 1992) existe na MBL na forma monomérica e constituindo também uma
população de heterodímeros com o menos abundante receptor AT
2
; 2) que o equilíbrio entre
monômeros e heterodímeros seria modulado pela ligação preferencial de Ang-(3-4) ao
componente AT
2
do heterodímero. Assim, a Ang-(3-4), formada pela proteólise limitada de
136
Figura 50. Presença de AT
1
no sobrenadante proveniente da Figura 48AB. A. O receptor AT
1
do
sobrenadante foi imunoprecipitado utilizando anticorpo específico anti-AT
1
e em seguida foi
realizado o ensaio de Western blotting para a detecção do receptor AT
1
. B. Análise
densitométrica do Western blotting para a detecção do receptor AT
1
. As barras (* p < 0,05; n = 2
em relação aos demais tratamentos).
Quantificação do monômero de AT
1
(IP:AT
1
e WB:AT
1
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
sobrenadante
Ang II 10
-6
M
--+
Ang II 10
-10
M
--+
45kDa
IP:AT1
WB:AT1
A.
B.
Quantificação do monômero de AT
1
(IP:AT
1
e WB:AT
1
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
sobrenadante
Ang II 10
-6
M
--+
Ang II 10
-10
M
--+
Quantificação do monômero de AT
1
(IP:AT
1
e WB:AT
1
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
sobrenadante
Ang II 10
-6
M
--+
Ang II 10
-10
M
--+
45kDa
IP:AT1
WB:AT1
A.
B.
137
Ang II quando esta se encontra elevada, deslocaria o equilíbrio AT
1
+ AT
2
' AT
1
/AT
2
no
sentido da dissociação. Em concentrações baixas de Ang II, a ligação preferencial ao componente
AT
1
do dímero ativaria a cascata de sinalização que leva à inibição da PMCA (Figura 16). A
ligação de Ang-(3-4) ao receptor AT
2
, após a dissociação do dímero, ativaria uma via capaz de
restaurar a atividade da PMCA. Estas interações completando aquelas descritas previamente
(Assunção- Miranda et al., 2005) encontram-se esquematizadas na Figura 51 e descritas a seguir.
Os receptores AT
1
e AT
2
participando do equilíbrio dinâmico AT
1
+ AT
2
' AT
1
/AT
2
estão representados na forma dimérica à esquerda na Figura 51. A dimerização permitiria a
ligação de Ang II com alta afinidade no componente AT
1
, mas não no componente AT
2
, talvez
por impedimento estérico resultante de modificações no seu domínio de ligação quando se forma
o dímero. Este dímero seria aquele estrutural e funcionalmente acoplado ao heterotrímero de
proteína G (via AT
1
) para culminar na ativação seqüencial da PLC e da PKC que, por último,
leva à inibição da PMCA. Na presença de concentrações crescentes de Ang-(3-4) resultantes do
aumento da oferta de Ang II às enzimas proteolíticas vizinhas (Figuras 38-41), o pequeno
dipeptídeo passaria a ligar no componente AT
2
do dímero superando a dificuldade estérica
existente para Ang II em função do seu tamanho. Como o conjunto dos produtos que resultam da
proteólise de Ang II (incluindo a Ang-(3-4) e a Ang-(3-4) sintética) não estimulam per se a
PMCA (Figuras 16-18, 36), pode ser postulado que a recuperação de sua atividade quando Ang-
(3-4) é formada, resulta: (a) do deslocamento do equilíbrio AT
1
+ AT
2
' AT
1
/AT
2
no sentido dos
monômeros; (b) da interrupção do sinal gerado a partir da ligação de Ang II ao componente AT
1
do heterodímero. Esta interrupção poderia resultar de: (1) deslocamento da Ang II do receptor
AT
1
; (2) inibição em algum ponto da via PLC→PKC por algum produto da via ativada após a
ligação de Ang-(3-4) a AT
2
; ou (3) um efeito direto na PMCA “silenciando” a fosforilação
138
Figura 51. Efeito contra-regulatório de Ang-(3-4) sobre a inibição da atividade da PMCA de
MBL de túbulos proximais renais promovido por Ang II. Ang II, em baixas concentrações, inibe
a PMCA através da via PLC/DAG/PKC (Assunção-Miranda et al., 2005) decorrente da ativação
de heterodímeros de receptores AT
1
/AT
2
. Enquanto, Ang-(3-4) formada pela proteólise limitada
de Ang II (em situações que cursam com altas concentrações deste peptídeo) reverte o efeito
desencadeado por Ang II sobre a PMCA através de uma via que envolve a ativação de receptores
AT
2
. Como resultado final, a atividade da PMCA é recuperada a níveis controle. A proteólise
limitada de Ang II neste modelo tem como principais intermediários Ang-(1-7) (formada a partir
da ação da CPP e/ou PRCP sobre Ang II), Ang-(1-5) (formada a partir da ação da ECA sobre
Ang-(1-7)), possivelmente Ang-(1-4) (formada a partir da ação de uma CP sobre Ang-(1-5)) e
Ang-(3-4) (provavelmente formada a partir da ação de NEP sobre Ang-(1-4)). In, intracelular;
Out, extracelular; CPP, carboxipeptidase P; PRCP, prolilcarboxipeptidase; ECA, enzima
conversora de angiotensina; NEP, neprilisina.
Ang-(1-7)
CPP
ou
PRCP
Ca
Ca
2+
2+
ATP
ATP
ADP+Pi
ADP+Pi
-
Ang II
Losartan
e
PD123319
-
?
PLC/DAG/PKC
+
PD123319
A
T
2
Ang-(1-4)
CP ?
ECA
Ang-(1-5)
Ang-(3-4)
NEP?
AT
2
AT
1
AT
1
-
-
In
Out
Ang-(1-7)
CPP
ou
PRCP
Ang-(1-7)
CPP
ou
PRCP
Ca
Ca
2+
2+
ATP
ATP
ADP+Pi
ADP+Pi
-
Ang II
Losartan
e
PD123319
-
?
-
?
PLC/DAG/PKC
++
PD123319
A
T
2
A
T
2
Ang-(1-4)
CP ?
Ang-(1-4)
CP ?
ECA
Ang-(1-5)
ECA
Ang-(1-5)
Ang-(3-4)
NEP?
Ang-(3-4)Ang-(3-4)
NEP?
AT
2
AT
1
AT
1
AT
1
-
-
In
Out
139
inibitória promovida por PKC. A interação direta com a PMCA poderia ocorrer via PKG ou
PKA, que poderiam catalisar uma fosforilação compensatória na bomba de Ca
2+
, como etapa
final da via de sinalização disparada pela ligação de Ang-(3-4) a AT
2
. Dão suporte a esta visão os
seguintes dados: Lara et al. (2006) observaram inibição da Na
+
-ATPase de MBL de células de
túbulos proximais renais por Ang-(1-7) quando os receptores AT
1
estão bloqueados por losartan,
um efeito que envolve receptor AT
2
e PKG. Estes resultados indicam que a ligação de Ang-(1-7)
(ou eventualmente de Ang-(3-4) resultante de sua proteólise, Figura 29B) a receptores AT
2
é
capaz de modular um transportador ativo de Na
+
nas células renais proximais, um efeito que
poderia ser exercido também sobre a PMCA. Por outro lado, a mediação por PKA, por exemplo,
pode ser postulada a partir da observação de que a ativação de receptores AT
2
promove a
liberação da ceramida (Berry et al., 2001), um esfingolipídeo que reverte – via estimulação de
PKA – a inibição que esta mesma exerce – via PKC – na PMCA (Cabral et al., 2007). Este amplo
leque de possibilidades mostra que as vias e os mecanismos pelos quais a ligação de Ang-(3-4) a
AT
2
reverte a inibição causada pela ativação do receptor AT
1
do heterodímero por concentrações
fisiológicas de Ang II, permanecem ainda por ser elucidados.
Ainda há outra questão que deve ser abordada. Porque se há formação dos dímeros na
ausência de Ang II ou na presença de Ang II 10
-10
M, a imunodetecção da Figura 48 mostra
apenas monômeros de aproximadamente 45 kDa, enquanto alguns outros trabalhos mostram
estruturas de aproximadamente 90 kDa? (ver por exemplo AbdAlla et al., 2001) Além da
estabilização artificialmente provocada por “crosslinkers” como o tartarato de succinimidila, uma
ferramenta que garante a presença de dímeros superexpressos em sistemas heterólogos (como as
células de feocromocitoma) são as ligações de diferentes natureza (e força) que podem existir
entre as diferentes classes de receptores. Pontes di-sulfeto na região N-terminal contribuem para
formar dímeros de receptores glutamatérgicos (Romano et al., 1996), enquanto tranças entre as
140
respectivas cadeias polipeptídicas da região C-terminal de monômeros de receptores
metabotrópicos asseguram a estabilidade dos dímeros assim formados (White et al., 1998;
Margeta-Mitrovic et al., 2000). No caso de receptores β
2
adrenérgicos, dopaminérgicos,
muscarínicos e de Ang II, interações hidrofóbicas entre segmentos transmembrana são as que
permitiriam a formação de heterodímeros (Lemmon & Engelman, 1994; Bouvier, 2001).
Provavelmente, resíduos específicos de AT
1
e de AT
2
seriam essenciais para a formação de
interações hidrofóbicas entre estes receptores. Evidentemente, o dímero de AT
1
/AT
2
estabilizado
por estas interações pode resistir ao suave tratamento com CHAPS 0,01%, mas não ao de SDS
10% do tampão de amostra empregado na eletroforese antes da imunodetecção (Figura 48; ver
também Materiais e Métodos).
Há diversidade ou, pelo contrário, um padrão relativamente repetitivo e conservado de
resposta como resultado da formação de heterodímeros GPCRs? AbdAlla et al. (2001) mostraram
que em heterodímeros AT
1
/AT
2
, expressos em diferentes tipos celulares (fibroblastos, células de
miométrio, células imortalizadas de feocromocitoma de ratos), a presença de AT
2
inibe a via
desencadeada pela ligação de Ang II em AT
1
, ou seja, que AT
2
funcionaria como antagonista do
receptor AT
1
. Esta variante, em termos de mecanismo, da visão correntemente aceita de que os
dois principais tipos de receptor estão associados a vias que geram respostas opostas, não parece
corresponder, portanto, ao observado na MBL de túbulos proximais, já que o bloqueio de AT
2
reverte o efeito de Ang II (Assunção-Miranda, 2004; Assunção-Miranda et al., 2005). Estes
dados mostram claramente a existência de conseqüências diferentes resultantes da dimerização,
que poderiam ser específicas em tecidos/órgãos diferentes. Independentemente do efeito, todavia,
a dimerização parece ser um pré-requisito para a ativação de diversas vias de sinalização
acoplada a diferentes classes de receptores, como no caso de receptores β
2
-adrenérgicos
141
acoplados a adenilato ciclase (Hebert et al., 1996), uma observação que apóia a idéia do “modelo
do receptor em dois estados” no qual o monômero e o dímero representariam a conformação
inativa e ativa, respectivamente. Mais ainda, há evidências de que a dimerização de receptores
per se poderia ativar cascatas de sinalização independentemente da ligação de agonista (Bond &
Bouvier, 1998; Bouvier 2001; Kroeger et al., 2001) ou, inclusive na presença de antagonistas. Por
exemplo, antagonistas dos receptores do hormônio estimulante de melanócitos tornam-se
agonistas de receptores covalentemente dimerizados (Carrithers & Lerner, 1996), uma clara
evidência de que a dimerização deste GPCR pode ser suficiente para ativar uma cascata de
sinalização via proteína G.
Todavia, a dimerização não só está envolvida em processos como a ativação de receptores
e transdução de sinal, como também parece participar na maturação, no transporte e até na
dessensibilização de receptores. O envolvimento de dímeros nos dois primeiros processos emerge
da observação de que a dimerização de duas isoformas diferentes do receptor GABA
B
(chamados
GBR1 e GBR2) é o pré-requisito para a formação deste receptor funcional na superfície da
célula. Sem a dimerização, o GBR1 fica retido intracelularmente como uma glicoproteína
imatura, enquanto o GBR2 expresso na superfície da célula é incapaz de se ligar ao GABA ou
promover sinalização intracelular, uma evidência de que o GBR2 serviria como uma chaperona
molecular essencial para o transporte de GBR1 para a superfície da célula, onde ambos
constituirão assim um receptor GABA metabotrópico funcional (Bouvier, 2001). Quanto ao
envolvimento da dimerização na dessensibilização de receptores, foi demonstrado que a inibição
da dimerização do receptor δ-opióide impede a endocitose induzida por receptor (Cvejic & Devi,
1997). Portanto, não pode ser descartado que concentrações altas de Ang II, além de promoverem
dissociação (Figuras 49 e 51), ativem o processo de endocitose de heterodímeros ou apenas do
142
receptor AT
1
presente no dímero. Dados recentes do nosso laboratório (da Silva et al., 2007)
mostram que há um acentuado decréscimo na quantidade de receptores AT
1
e AT
2
na MBL de
células de túbulos proximais de ratos submetidos a desnutrição crônica, uma condição em que o
SRA encontra-se estimulado.
Com base no conjunto de observações discutidas acima, incluindo as apresentadas nesta
dissertação, pode ser concluído que o “modelo de receptor em dois estados” monomérico e
di(oligo)mérico contribui para entender os processos de ativação de receptores. Processos que
podem ter influência tanto positiva quanto negativa em diferentes vias e funções e que, em alguns
casos – como o dos heterodímeros AT
1
/AT
2
– podem ser específicas de células ou tecidos.
Muitas questões, no entanto, precisam ainda ser abordadas e respondidas antes que se possa
apreciar completamente a sua real contribuição para a fisiologia de órgãos e sistemas. O que de
fato pode ser afirmado hoje em dia é que a dimerização parece ser tão importante para determinar
a atividade de GPCRs quanto a interação com as proteínas que transmitem sinais através de
diferentes redes. E, por isso, talvez a dimerização (e oligomerização) represente mais a regra do
que a exceção no funcionamento acoplado desta importante classe de receptores.
143
V. Conclusões
- Com uma capacidade de reverter – na faixa fentomolar – a inibição da PMCA de
MBL de túbulo proximal renal provocada por Ang II, a Ang-(3-4), produto final da proteólise
da primeira, revela-se como um dos mais potentes modulares dos fluxos ativos da Ca
2+
através
do epitélio tubular renal. Outros peptídeos intermediários resultantes da proteólise seqüencial
de Ang II mostraram-se igualmente eficazes.
- Os receptores do tipo AT
2
medeiam a resposta da Ang-(3-4) enquanto outros
receptores – provavelmente AT
1-7
– seriam ativados pelos peptídeos intermediários Ang-(1-7),
Ang-(1-5) e Ang-(1-4) conferindo redundância e plasticidade à resposta que antagoniza os
efeitos de Ang II.
- As concentrações relativas de Ang II e Ang-(3-4) – e provavelmente dos outros
peptídeos intermediários – modulariam a intensidade de eventos intracelulares de sinais
opostos, através de sua influência no equilíbrio dinâmico entre monômeros e heterodímeros
de receptores AT
1
e AT
2
(e AT
1-7
?) na MBL de túbulos renais.
- A presença, na MBL, de peptidases que catalisam a transformação de Ang II em
peptídeos de ação oposta evidencia a existência de um complexo enzimático multifuncional,
espacialmente associado a receptores de angiotensina e a moléculas de PMCA, capaz de
modular finamente as concentrações relativas de peptídeos que modulam os fluxos ativos de
Ca
2+
de maneira oposta.
- As flutuações de Ca
2+
intracelular, resultantes de variações locais de angiotensinas
que influenciam a maquinaria responsável pelo ajuste fino do Ca
2+
citsólico (a PMCA),
modulam os fluxos transepiteliais de Na
+
e H
2
O em resposta a variações do VEC e da pressão
arterial em situações que cursam com elevados níveis circulantes de Ang II.
144
VI. Referências Bibliográficas
Abadir, P.M., Carey, R.M., Siragy, H.M. (2003) Angiotensin AT
2
receptors directly stimulate
renal nitric oxide in bradykinin B
2
-receptor-null mice. Hypertension 42: 600-604.
AbdAlla, S., Lother, H., Abdel-tawab, A.M., Quitterer, U. (2001a) The angiotensin AT
2
receptor
is an AT
1
receptor antagonist. J. Biol. Chem. 276: 39721-39726.
AbdAlla, S., Lother, H., El Massiery, A., Quitterer, U. (2001b) Increased AT
1
receptor
heterodimers in preeclampsia mediate enhanced angiotensin II responsiveness. Nat. Med. 7:
1003-1009.
AbdAlla, S., Lother, H., Quitterer, U. (2000) AT
1
receptor heterodimers show enhanced G-
protein activation and altered receptor sequestration. Nature. 407: 94-98.
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Water, P. (2004) Biologia Molecular da
Célula (4
a
edição) Ed. Artmed, São Paulo, Brasil, Capítulo 15.
Allred, A.J., Diz, D.I., Ferrario, C.M., Chappell, M.C. (2000) Pathways for angiotensin-(1-7)
metabolism in pulmonary and renal tissues. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279: F841-850.
Allred, A.J., Donoghue, M., Acton, S., Coffman, T.M. (2002) Regulation of blood pressure by
the angiotensin converting enzyme homologue ACE2. Am. J. Nephrol. 13: 52A.
Almeida, A.P., Fábregas, B.C., Madureira, M.M., Santos, R.J.S., Campagnole-Santos, M.J,
Santos, R.A.S. (2000) Angiotensin-(1-7) potentiates the coronary vasodilatory effect of
bradykinin in the isolated rat heart. Braz. J. Mol. Biol. Med. 33: 709-713.
Almeida, W.S., Maciel, T.T., Di Marco, G.S., Casarini, D.E., Campos, A.H., Schor, N. (2006)
Escherichia coli lipopolysaccharide inhibits renin activity in human mesangial cells. Kidney
Int. 69: 974-980.
145
Anderson, J.M. (2001) Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport.
News Physiol. Sci. 16: 126-130.
Anderson, R.G.W. (1998) The caveolae membrane system. Annu.. Rev. Biochem. 67: 199-225.
Angiotensin II (type 1) receptor locus: CA repeat polymorphism and genetic mapping.
Araujo, M.C., Melo, R.L., Cesari, M.H., Juliano, M.A., Juliano, L., Carmona, A.K. (2000)
Peptidase specificity characterization of C- and N-terminal catalytic sites of angiotensin I-
converting enzyme. Biochem. 39: 8519-8525.
Ardaillou, R. (1997) Active fragments of angiotensin II: enzymatic pathways of synthesis and
biological effects. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 6: 28-34.
Ardaillou, R. (1999) Angiotensin II receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 11: S30-39.
Ardaillou, R., Chansel, D. (1997) Angiotensin IV, a new component of the renin angiotensin
system with renal effects. Bull. Acad. Natl. Med., 180: 475-488.
Assunção-Miranda, I. (2004) Modulação do transporte ativo de cálcio em túbulos proximais
renais por Angiotensina II: envolvimento dos receptores AT
1
E AT
2
e dos produtos de
proteólise limitada do hormônio. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Biofísica. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ.
Assunção-Miranda, I., Guilherme, A.L., Reis-Silva, C., Costa-Sarmento, G., Oliveira, M.M.,
Vieyra, A. (2005) Protein kinase C-mediated inhibition of renal Ca
2+
ATPase by
physiological concentrations of angiotensin II is reversed by AT
1
- and AT
2
-receptor
antagonists. Regul. Pept. 127: 151-157.
Axelsen, K.B., Palmgren, M.G. (1998) Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase
superfamily. J. Mol. Evol. 46: 84-101.
146
Baker, K.M., Chernin, M.I., Schreiber, T., Sanghi, S., Haiderzaidi, S., Booz, G.M., Dostal, D.E.,
Kumar, R. (2004) Evidence of a novel intracrine mechanism in angiotensin II-induced cardiac
hypertrophy. Regul. Pept. 120: 5-13.
Baker, K.M., Kumar, R. (2006) Intracellular angiotensin II induces cell proliferation independent
of AT
1
receptor. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291: C995-1001.
Barros, N.M., Campos, M., Bersanetti, P.A., Oliveira, V., Juliano, M.A., Boileau, G., Juliano, L.,
Carmona, A.K. (2007) Neprilysin carboxydipeptidase specificity studies and improvement in
its detection with fluorescence energy transfer peptides. Biol. Chem. 388: 447-455.
Basso, N., Terragno, N.A. (2001) History about the discovery of the renin-angiotensin system.
Hypertension 38: 1246-1249.
Benter, I.F., Yousif, M.H., Dhaunsi, G.S., Kaur, J., Chappell, M.C., Diz, D.I. (2007)
Angiotensin-(1-7) Prevents Activation of NADPH Oxidase and Renal Vascular Dysfunction
in Diabetic Hypertensive Rats. Am. J. Nephrol. 28: 25-33.
Benzing, T., Fleming, I., Blaukat, A., Müller-Esterl, W., Busse, R. (1999) The ACE inhibitor
ramiprilat prevents the sequestration of the B
2
kinin receptor within the plasma membrane of
native endothelial cells. Circulation. 99: 2034-2040.
Bergaya, S., Hilgers, R.H., Meneton, P., Dong, Y., Bloch-Faure, M., Inagami, T., Alhenc-Gelas,
F., Levy, B.I., Boulanger, C.M. (2004) Flow-dependent dilation mediated by endogenous
kinins requires angiotensin AT
2
receptors. Circ Res. 94: 1623-1629.
Bergsma, D.J., Ellis, C., Kumar, C., Nuthulaganti, P., Kerstein, H., Elshourbagy, N., Griffin, E.,
Stadel, J.M., Aiyar, N. (1992) Cloning and characterization of a human angiotensin II type 1
receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 183: 989-995.
Berne, R.M., Levy, M.N. (2000) Fisiologia (4
a
edição) Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro,
Brasil, pp. 634-699.
147
Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. (2003) Calcium signalling: dynamics, homeostasis
and remodeling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 517-29.
Berry, C., Touyz, R., Dominiczak, A.F., Webb, R.C., Johns, D.G. (2001) Angiotensin receptors:
signaling, vascular pathophysiology and interactions with ceramide. Am. J. Physiol. 281:
H2332-2365.
Blais, C.Jr., Marceau, F., Rouleau, J.L., Adam, A. (2000) The kallikrein-kininogen-kinin system:
lessons from the quantification of endogenous kinins. Peptides 21:1903-1940.
Boldyreff, B., Wehling, M. (2003) Rapid aldosterone actions: from the membrane to signaling
cascades to gene transcription and physiological effects. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 85:
375-381.
Booz, G.W., Conrad, K.M., Hess, A.L., Singer, H.A., Baker, K.M. (1992) Angiotensin-II-binding
sites on hepatocyte nuclei. Endocrin. 130: 3641-3649.
Boumendil-Podevin, E.F., Podevin, R.A. (1987) Effects of ATP on Na+ transport and membrane
potential in inside-out renal basolateral vesicles. Biochim. Biophys. Acta 728: 39-49.
Bouvier, M. (2001) Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors. Nat. Rev.
Neurosci. 2: 274-286.
Braam, B., Mitchell, K.D., Fox, J., Navar, L.G. (1993) Proximal tubular secretion of angiotensin
II in rats. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 264: F891-898.
Braszko, J.J., Walesiuk, A., Wielgat, P. (2006) Cognitive effects attributed to angiotensin II may
result from its conversion to angiotensin IV. J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 7: 168-
174.
Brodin, P., Falchetto, R., Vorherr, T., Carafoli, E. (1992) Identification of two domains which
mediate the binding of activating phospholipids to the plasma-membrane Ca
2+
pump. Eur. J.
Biochem. 204: 939-946.
148
Bronner, F., Bosco, J.J., Stein, W.D. (1989) Acute plasma calcium regulation in rats: effect of
vitamin D deficiency. Bone Miner. 6: 141-153.
Brosnihan, K.B., Li, P., Ferrario, C.M. (1996) Angiotensin-(1-7) dilates canine coronary arteries
through kinins and nitric oxide. Hypertension 27: 523-528.
Burckle, C.A., Danser, A.H.J., Müller, D.N., Garrelds, I.M., Gasc, J.M., Popova, E., Plehm, R.,
Peters, J., Bader, M., Nguyen, G. (2006) Elevated blood pressure and heart rate in human
renin receptor transgenic rats. Hypertension 47: 552-556.
Cabral, L.M., Wengert, M., da Ressurreição, A.A., Feres-Elias, P.H., Almeida, F.G., Vieyra, A.,
Caruso-Neves, C., Einicker-Lamas, M. (2007) Ceramide is a potent activator of plasma
membrane Ca
2+
-ATPase from kidney-promixal tubule cells with protein kinase A as an
intermediate. J. Biol. Chem. 282: 24599-606.
Camargo de Andrade, M.C, Di Marco, G.S., de Paulo Castro Teixeira, V., Mortara, R.A.,
Sabatini, R.A., Pesquero, J.B., Boim, M.A., Carmona, A.K., Schor, N., Casarini, D.E. (2006)
Expression and localization of N-domain ANG I-converting enzymes in mesangial cells in
culture from spontaneously hypertensive rats. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290: F364-375.
Carafoli, E. (1994) Biogenesis: plasma membrane calcium ATPase: 15 years of work on the
purified enzyme. FASEB J. 8: 993-1002.
Carafoli, E. (2002) Calcium signaling: a tale for all seasons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1115-
1122.
Carafoli, E., Brini, M. (2000) Calcium pumps: structural basis for and mechanism of calcium
transmembrane transport. Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 152-161.
Carafoli, E., Kessler, F., Falchetto, R., Heim, R., Quadroni, M., Krebs, J., Strehler, E.E., Vorherr
T. (1992) The molecular basis of the modulation of the plasma membrane calcium pump by
calmodulin. Ann. NY Acad. Sci. 671: 58-68.
149
Carey, R.M. (2005a) Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the
AT
2
receptor comes of age. Hypertension 45: 840-844.
Carey, R.M. (2005b) Update on the role of the AT
2
receptor. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 14:
67-71.
Carey, R.M., Siragy, H.M. (2003a) Newly Recognized Components of the Renin-Angiotensin
System: Potential Roles in Cardiovascular and Renal Regulation. Endocrine Rev. 24: 261-
271.
Carey, R.M., Siragy, H.M. (2003b) The intrarenal renin-angiotensin system and diabetic
nephropathy. Trends Endocrinol. Metab. 14: 274-281.
Carey, R.M., Wang, Z.Q., Siragy, H.M. (2000) Role of the Angiotensin Type 2 Receptor in the
Regulation of Blood Pressure and Renal Function. Hypertension 35: 155-163.
Caride, A.J., Elwess, N.L., Verma, A.K., Filoteo, A.G., Enyedi, A., Bajzer, Z., Penniston, J.T.
(1999) The rate of activation by calmodulin of isoform 4 of the plasma membrane Ca
2+
pump
is slow and is changed by alternative splicing. J. Biol. Chem. 274: 35227-35232.
Caruso-Neves, C., Coelho-Souza, S.A., Vives, D., Goes, G., Lara, L.S., Lopes, A.G. (2002)
Modulation of ouabain-insensitive Na
+
-ATPase activity in the renal proximal tubule by Mg
2+
,
MgATP and furosemide. Int. J. Biochem. Cell Biol. 34: 1586-1593.
Caruso-Neves, C., Lara, L.S., Rangel, L.B., Grossi, A.L., Lopes, A.G. (2000) Angiotensin-(1-7)
modulates the ouabain-insensitive Na+-ATPase activity from basolateral membrane of the
proximal tubule. Biochim Biophys Acta. 1467: 189-97.
Caruso-Neves, C., Provenzano, K., Luz, F.F., Santos, F.M., Fernandes, M.S., Leão-Ferreira, L.R.,
Lopes, A.G. (2003) Bradykinin counteracts the stimulatory effect of angiotensin-(1-7) on the
proximal tubule Na
+
-ATPase activity through B
2
receptor. Regul. Pept. 110: 207-212.
150
Caruso-Neves, C., Rangel, L.B., Lara, L.S., Lopes, A.G. (2001) Regulation of the renal proximal
tubule second sodium pump by angiotensins. Braz. J. Biol. Res. 34: 1079-1084.
Caruso-Neves, C., Siqueira, A.S., A-Cohen, G., Lopes, A.G. (1999) Bradykinin modulates the
ouabain-insensitive Na
+
-ATPase activity from basolateral membrane of the proximal tubule.
Biochim. Biophys. Acta 1431: 483-91.
Casarini, D.E., Plavinik, F.L., Zanella, M.T., Marson, O., Krieger, J.E., Hirata, I.Y., Stella, R.C.
(2001) Angiotensin converting enzymes from human urine of mild hypertensive untreated
patients resemble the N-terminal fragment of human angiotensin I-converting enzyme. Int. J.
Biochem. Cell Biol. 33: 75-85.
Chappell, M.C., Diz, D.I., Yunis, C., Ferrario, C.M. (1998) Differential actions of angiotensin-(1-
7) in the kidney. Kidney Int. Suppl. 54: 53–56.
Charbonneau, A., Leclerc, M., Brunette, M.G. (2001) Effect of angiotensin II on calcium
reabsorption by the luminal membranes of the nephron. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.
280: E928-36.
Chen, Z., Deddish, P.A., Minshall, R.D., Becker, R.P., Erdos, E.G., Tan, F. (2006) Human ACE
and bradykinin B
2
receptors form a complex at the plasma membrane. FASEB J. 20: 2261-
2270.
Chen, Z., Tan, F., Erdos, E.G., Deddish, P.A. (2005) Hydrolysis of Angiotensin peptides by
human angiotensin I-converting enzyme and the resensitization of B
2
kinin receptors.
Hypertension 46: 1368-1373.
Chiu, A.T., Herblin, W.F., Ardecky, R.J., McCall, D.E., Carini, D.J., Duncia, J.V., Pease, L.J.,
Wexler, R.R., Wong, P., Johnson, A.L., Timmermans, P. (1989) Identification of angiotensin
II receptor subtypes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 196-203.
151
Coelho-Sampaio, T., Teixeira-Ferreira, A., Vieyra, A. (1991) Novel effects of calmodulin and
calmodulin antagonists on the plasma membrane (Ca
2+
+Mg
2+
)-ATPase from rabbit kidney
proximal tubules. J Biol Chem. 266:10249-10253.
Coka-Guevara, S., Markus, R.P., Caruso-Neves, C., Lopes, A.G., Vieyra, A. (1999) Adenosine
inhibits the renal plasma-membrane (Ca
2+
+Mg
2+
)ATPase through a pathways sensitive to
colera toxin and sphingosine. Eur. J. Chem. 264: 3274-3285.
Cook, J.L., Mills, S.J., Naquin, R., Alam, J., Re, R.N. (2006) Nuclear accumulation of the AT1
receptor in a rat vascular smooth muscle cell line: effects upon signal transduction and
cellular proliferation. J. Mol. Cell. Cardiol. 40: 696-707.
Cook, J.L., Re, R., Alam, J., Hart, M., Zhang, Z. (2004) Intracellular angiotensin II fusion protein
alters AT
1
receptor fusion protein distribution and activates CREB. J. Mol. Cell. Cardiol. 36:
75-90.
Cook, J.L., Zhang, Z., Re, R.N. (2001) In vitro evidence for an intracellular site of angiotensin
action. Circ. Res. 89: 1138-1146.
Crackower, M.A., Sarao, R., Oudit, G.Y., Yagil, C., Kozieradzki, I., Scanga, S.E., Oliveira-dos-
Santos, A.J., da Costa, J., Zhang, L., Pei, Y., Scholey, J., Ferrario, C.M., Manoukian, A.S.,
Chappell, M.C., Backx, P.H, Yagil, Y., Penninger, J.M. (2002) Angiotensin-converting
enzyme 2 is an essential regulator of heart function. Nature 417: 822-828.
Curnow, K.M., Pascoe, L., White, P.C. (1992) Genetic analysis of the human type-1 angiotensin
II receptor. Mol. Endocrinol. 6: 1113–1118.
Davies et The renal system l (2001) Human Physiology. Cap. 8, Churchill Liv.
Davies, E., Bonnardeaux, A., Lathrop, G.M., Corvol, P., Clauser, E., Soubrier, F. (1994)
Angiotensin II (type I) receptor locus: CA repeat polymorphism and genetic mapping. Hum.
Mol. Genet. 3: 83-84.
152
Davisson, R.L., Ding, Y., Stec, D.E., Catterall, J.F., Sigmund, C.D. (1999) Novel mechanism of
hypertension revealed by cell-specific targeting of human angiotensinogen in transgenic mice.
Physiol. Genomics.1: 3-9.
de Gasparo, M., Catt, K.J., Inagami, T., Wright, J.W., Unger, T. (2000) International union of
pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacol. Rev. 52: 415-472.
De Koninck, P., Shulman, H. (1998) Sensitivity of CaM kinase II to the frequency of Ca
2+
oscillations. Science 279: 227-230.
de Meis, L., Carvalho, M.G. (1976) On the sidedness of membrane phosphorylation by Pi and
ATP synthesis during reversal of the Ca
2+
pump of sarcoplasmic reticulum vesicles. J. Biol.
Chem. 251: 1413-1417.
Deddish, P.A., Marcic, B., Jackman, H.L., Wang, H.Z., Skidgel, R.A., Erdos, E.G. (1998) N-
domain-specific substrate and C-domain inhibitors of angiotensin-converting enzyme
angiotensin-(1–7) and Keto-ACE. Hypertension 31: 912-917.
Dibona, G.F. (2002) Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr. Opin.
Nephrol. Hypertens. 11: 179-200.
Díez-Freire, C., Vázquez, J., Correa de Adjounian, M.F., Ferrari, M.F., Yuan, L., Silver, X.,
Torres, R., Raizada, M.K. (2006) ACE2 gene transfer attenuates hypertension-linked
pathophysiological changes in the SHR. Physiol. Genomics. 27: 12-19.
Dinh, D.T., Frauman, A.G., Johnston, C.I., Fabiani, M.E. (2001) Angiotensin receptors:
distribution, signalling and function. Clin. Sci. (Lond). 100: 481-492.
Donoghue, M., Hsieh, F., Baronas E., Godbout K., Gosselin M., Stagliano, N., Donovan, M.,
Woolf, B., Robison, K., Jeyaseelan, R., Breitbart, R.E., Acton, S. (2000) A novel angiotensin-
converting enzyme-related carboxypeptidase (ACE2) converts angiotensin I to angiotensin 1-
9. Circ. Res. 87: E1-9.
153
Douglas, J.G. (1996) The curtain rises on the renin-angiotensin system: AT
2
receptors are in the
spotlight. J. Clin. Invest. 97: 1787.
Drüeke, T., Hennessen, U., Nabarra, B., Ben Nasr, L., Lucas, P.A., Dang, P., Thomasset, M.,
Lacour, B., Coudrier, E., McCarron, D.A. (1990) Ultrastructural and functional abnormalities
of intestinal and renal epithelium in the SHR. Kidney Int. 37: 1438-1448.
Du
, Z., Ferguson, W., Wang, T. (2003) Role of PKC and calcium in modulation of effects of
angiotensin II on sodium transport in proximal tubule.
Am. J. Ren. Physiol
.
284: F688-692.
Dzau, V.J., Bernstein, K., Celermajer, D., Cohen, J., Dahlof, B., Deanfield, J., Diez, J., Drexler,
H., Ferrari, R., Gilst, V.W., Hansson, L., Hornig, B., Husain, A., Johnston, C., Lazar, H.,
Lonn, E., Luscher, T., Mancini, J., Mimran, A., Pepine, C., Rabelink, T., Remme, W.,
Ruilope, L., Ruzicka, M., Schunkert, H., Swedberg, K., Unger, T., Vaughan, D., Weber, M.
(2001) The Relevance of Tissue Angiotensin-Converting Enzyme: Manifestations in
Mechanistic and Endpoint Data. Am. J. Cardiol. 88: 1L-20L.
Dzau, V.J., Burt, D.W., Pratt, R.E. (1988) Molecular biology of the rennin angiotensin system.
Am. J. Physiol. 255: F563-573.
Ehlers, M.R., Fox, E.A., Strydom, D.J., Riordan, J.F. (1989) Molecular cloning of human
testicular angiotensin-converting enzyme: the testis isozyme is identical to the C-terminal half
of endothelial angiotensin-converting enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7741-7745.
El-Dorry, H.A., Bull, H.G., Iwata, K., Thornberry, N.A., Cordes, E.H., Soffer, R.L. (1982)
Molecular and catalytic properties of rabbit testicular dipeptidyl carboxypeptidase. J. Biol.
Chem. 257: 14128-14133.
154
Fabiato, A., Fabiato, F. (1979) Calculator programs for computing the composition of the
solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned muscle
cells. J. Physiol. (Paris) 75: 463-505.
Feng, Y.H., Karnik, S.S. (1999) Role of transmembrane helix IV in G-protein specificity of the
angiotensin II type 1 receptor. J. Biol. Chem. 274: 35546-35552.
Féraille, E., Doucet, A. (2001) Sodium-potassium-adenosinetriphosphatase-dependent sodium
transport in the kidney: hormonal control. Physiol. Rev. 81: 345-418.
Fernandes, L., Fortes, Z.B., Nigro, D., Tostes, R.C., Santos, R.A., Catelli De Carvalho, M.H.
(2001) Potentiation of bradykinin by angiotensin-(1-7) on arterioles of spontaneously
hypertensive rats studied in vivo. Hypertension 37: 703-709.
Ferrario, C.M., Chappell, M.C. (2004) Novel angiotensin peptides. Cell. Mol. Life Sci. 61: 2720-
2727.
Ferrario, C.M., Smith, R.D., Brosnihan, B., Chappell, M.C., Campese, V.M., Vesterqvist, O.,
Liao, W.C., Ruddy, M.C., Grim, C.E. (2002) Effects of omapatrilat on the renin-angiotensin
system in salt-sensitive hypertension. Am. J. Hypertens. 15: 557-564.
Ferreira, A.J., Santos, R.A. (2005) Cardiovascular actions of angiotensin-(1-7). Braz. J. Med.
Biol. Res. 38: 499-507.
Filoteo, A.G., Elwess, N.L., Enyedi, A., Caride, A., Aung, H.H., Penniston, J.T. (1997) Plasma
membrane Ca
2+
pump in rat brain. J. Biol. Chem. 272: 23741-23747.
Fresu, L., Dehpour, A., Genazzani, A., Carafoli, E., Guerini, D. (1999) Plasma membrane
calcium ATPase isoforms in astrocytes. Glia 28: 150-155.
Friedman, P.A. (1988) Basal and hormone-activated calcium absorption in mouse renal thick
ascending limbs. Am. J. Physiol. Renal Fluid Electrolyte Physiol. 254: F62-70.
Friedman, P.A. (2000) Mechanisms of renal calcium transport. Exp. Nephrol. 8: 343-350.
155
Friedman, P.A., Figueiredo, J.F., Maack, T., Windhager, E.E. (1981) Sodium-calcium
interactions in the renal proximal convoluted tubule of the rabbit. Am. J. Physiol. 240: F558-
568.
Frindt, G., Windhager, E.E. (1990) Ca2+-dependent inhibition of sodium transport in rabbit
cortical collecting tubules. Am. J. Physiol. Renal Fluid Electrolyte Physiol. 258: F568-F582.
Furuta. H., Guo, D.F., Inagami, T. (1992) Molecular cloning and sequencing of the gene
encoding human angiotensin II type 1 receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 8-13.
Gallagher, P.E., Chappell, M.C., Ferrario, C.M., Tallant, E.A. (2005) Distinct roles for
angiotensin II and angiotensin-(1-7) in the regulation of angiotensin converting enzyme 2 in
rat astrocytes. Am. .J Physiol. Cel.l Physiol. 290: C240-246.
Garcia, M.L., Murray, K.D., Garcia, V.B., Strehler, E.E., Isackson, P.J. (1997) Seizure-induced
alterations of plasma membrane calcium ATPase isoforms 1, 2, and 3 mRNA and protein in
rat hippocampus. Brain Res.Mol. Brain Res. 45: 230-238.
Garcia, N.H., Garvin, J.L. (1994) Angiotensin 1-7 has a biphasic effect on fluid absorption in the
proximal straight tubule. J. Am. Soc. Nephrol. 5: 1133-1138.
Gelband, C.H., Zhu, M., Lu, D., Reagan, L.P., Fluharty, S.J., Posner, P., Raizada, M.K.,
Sumners, C. (1997) Functional interaction between neuronal AT
1
and AT
2
receptors.
Endocrin. 38: 2195-2198.
Gmaj, P., Murer, H., Carafoli, E. (1982) Localization and properties of a high affinity
(Ca
2+
+Mg
2+
)ATPase in isolated kidney cortex plasma membranes. FEBS. Lett. 144: 226-230.
Gmaj, P., Zurini, M., Murer, H., Carafoli E. (1983) A high-affinity, calmodulin-dependent Ca
2+
pump in the basal-lateral plasma membranes of kidney cortex. Eur. J. Biochem. 136: 71-76.
156
Goldblatt, H., Lynch, J., Hanzal, R.F., Summerville, W.W. (1934) Studies on experimental
hypertension: the production of persistent elevation of systolic blood pressure by means of
renal ischemia. J. Exp. Med. 59: 347-379.
Gonzalez-Mariscal, L., Betanzos, A., Nava, P., Jaramillo, B.E. (2003) Tight junction proteins.
Prog. Biophys. Mol. Biol. 81: 1-44.
Graciano, M.L., de Cassia Cavaglieri, R., Dellê, H., Dominguez, W.V., Casarini, D.E.,
Malheiros, D.M., Noronha, I.L. (2004) Intrarenal
emode-angiotensin system is upregulated
in experimental model of progressive renal disease induced by chronic inhibition of nitric
oxide synthesis. J. Am. Soc. Nephrol. 15: 1805-1815.
Griendling, K.K., Lassegue, B., Alexander, R.W. (1996) Angiotensin receptors and their
therapeutic implications. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 281-306.
Griendling, K.K., Murphy, T.J., Alexander, R.W. (1993) Molecular biology of the renin-
angiotensin system. Circulation 87: 1816-1828.
Grobe, J.L., Mecca, A.P., Lingis, M., Shenoy, V., Bolton, T.A., Machado, J.M., Speth, R.C.,
Raizada, M.K., Katovich, M.J. (2007) Prevention of angiotensin II-induced cardiac
remodeling by angiotensin-(1-7). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292: H736-742.
Grobe, J.L., Mecca, A.P., Mao, H., Katovitch, M.J. (2006) Chronic angiotensin-(1-7) prevents
cardiac fibrosis in DOCA-salt model of hypertension. Am. J. Physio.l Heart Circ. Physiol.
290: H2417-2423.
Groblewski, T., Maigret, B., Nouet, S., Larguier, R., Lombard, C., Bonnafous, J.C., Marie, J.
(1995) Amino acids of the third transmembrane domain of the AT
1
A angiotensin II receptor
are involved in the differential recognition of peptide and nonpeptide ligands. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 209: 153-160.
157
Grubmeyer, C., Penefsky, H.S. (1981) The presence of two hydrolytic sites on beef heart
mitochondrial adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem. 256: 3718-3727.
Guerini, D. (1998) The significance of the isoforms of plasma membrane calcium ATPase. Cell
Tissue Res. 292: 191-197.
Guo, D.F., Inagami, T. (1994) The genomic organization of the rat angiotensin II receptor AT
1
B.
Biochim. Biophys. Acta. 1218: 91-94.
Gurley, S.B., Allred, A., Le, T.H., Griffiths, R., Mao, L., Philip, N., Haystead, T.A., Donoghue,
M., Breitbart, R.E., Acton, S.L., Rockman, H.A., Coffman, T.M. (2006) Altered blood
pressure responses and normal cardiac phenotype in ACE2-null mice. J. Clin. Invest. 116:
2218-2225.
Guy, J.L., Lambert, D.W., Warner, F.J., Hooper, N.M., Turner, A.J. (2005) Membrane-associated
zinc peptidase families: comparing ACE and ACE2. Biochim. Et Biophys. Acta 1751: 2-8.
Guyton, A.C., Hall, J.E. (2002) Tratado de Fisiologia Médica (10
a
ed.). Guanabara Koogan S.A.,
Rio de Janeiro, Brasil, pp 250-326.
Haithcock, D., Jiao, H., Cui, X.L., Hopfer, U., Douglas, J.G. (1999) Renal proximal tubular AT
2
receptor: signaling and transport. J. Am. Soc. Nephrol. 11: S69-74.
Hakam, A.C., Hussain, T. (2006a) Angiotensin II AT
2
receptors inhibit proximal tubular Na
+
-K
+
-
ATPase activity via a NO/cGMP-dependent pathway. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290:
F1430-1436.
Hakam, A.C., Hussain, T. (2006b) Angiotensin II type 2 receptor agonist directly inhibits
proximal tubule sodium pump activity in obese but not in lean Zucker rats. Hypertension 47:
1117-1124.
Haller, H., Lindschau, C., Erdmann, B., Quass, P., Luft, F.C. (1996) Effects of intracellular
angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 79: 765-772.
158
Haller, H., Park, J.K., Lindschau, C., Meyer, M., Menne, J., Renin Academy (2006) Spotlight on
renin: intrarenal renin-angiotensin system-important player of the local milieu. J. Renin
Angiotensin Aldosterone Syst. 7: 122-125.
Handa, R.K. (1999) Angiotensin-(1-7) can interact with the rat proximal tubule AT
4
receptor
system. Am. J. Physiol. 277: F75-83.
Handa, R.K., Ferrario, C.M., Strandhoy, J.W. (1996) Renal actions of angiotensin-(1–7): in vivo
and in vitro studies. Am. J. Physiol. 270: F141-147.
Handa, R.K., Krebs, L.T., Harding, J.W., Handa, S.E. (1998) Angiotensin IV AT
4
-receptor
system in the rat kidney. Am. J. Physiol. 274: F290-299.
Hannan, R.E., Davis, E.A., Widdop, R.E. (2003) Functional role of angiotensin II AT
2
receptor in
modulation of AT
1
receptor-mediated contraction in rat uterine artery: involvement of
bradykinin and nitric oxide. Br. J. Pharmacol. 140: 987-995.
Haulică, I., Petrescu, G., Slătineanu, S.M., Bild, W., Mihaila, C.N., Ioniţă, T. (2004) New
bioactive angiotensins formation pathways and functional involvements. Rom. J. Intern. Med.
42: 27-40.
Hébert, R.L., Regoli, D., Xiong, H., Breyer, M.D., Plante, G.E. (2005) Bradykinin B
2
type
receptor activation regulates fluid and electrolyte transport in the rabbit kidney. Peptides 26:
1308-1316.
Hebert, T.E., Moffett, S., Morello, J.P., Loisel, T.P., Bichet, D.G., Barret, C., Bouvier, M. (1996)
A peptide derived from a beta2-adrenergic receptor transmembrane domain inhibits both
receptor dimerization and activation. J Biol Chem. 271: 16384-16392.
Hecker, M., Blaukat, A., Bara, A.T., Muller-Esterl, W., Busse R. (1997) ACE inhibitor
potentiation of bradykinin-induced venoconstriction. Br. J. Pharmacol. 121: 1475-1481.
159
Hecker, M., Porsti, I., Bara, A.T., Busse, R. (1994) Potentiation by ACE inhibitors of the dilator
response to bradykinin in the coronary microcirculation interaction at the receptor level. Br. J.
Pharmacol. 111: 238-244.
Henderson, J. (2005) Ernest Starling and ‘Hormones’: an historical commentary. J. Endocrinol.
184: 5-10.
Hoenderop, J.G., Hartog, A., Stuiver, M., Doucet, A., Willems, P.H., Bindels, R.J. (2000a)
Localization of the epithelial Ca
2+
channel in rabbit kidney and intestine. J. Am. Soc. Nephrol.
11: 1171-1178.
Hoenderop, J.G., Nilius, B., Bindels, R.J. (2005) Calcium absorption across epithelia. Physiol.
Rev. 85: 373-422.
Hoenderop, J.G., Willems, P.H., Bindels, R.J. (2000b) Toward a comprehensive molecular model
of active calcium reabsorption. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278: F352-360.
Huang, Y., Wongamorntham, S., Kasting, J., McQuillan, D., Owens, R.T., Yu, L., Noble, N.A.,
Border W. (2006) Renin increases mesangial cell transforming growth factor-beta1 and
matrix proteins through receptormediated, angiotensin II-independent mechanisms. Kidney
Int. 69: 105-113.
Hum. Mol. Genet. 3: 83–84.
Hunt, M.K., Ramos, S.P., Geary, K.M., Norling, L.L., Peach, M.J., Gomez, R.A., Carey, R.M.
(1992) Colocalization and release of angiotensin and renin in renal cortical cells. Am. J.
Physiol. 263: F363-373.
Ibarra, F.R., Cheng, S.X., Agrén, M., Svensson, L.B., Aizman, O., Aperia A. (2002) Intracellular
sodium modulates the state of protein kinase C phosphorylation of rat proximal tubule
Na
+
,K
+
-ATPase. Acta Physiol. Scand. 175: 165-71.
160
Ichihara, A, Hayashi, M., Hirota, N., Okada, H., Koura, Y., Tada, Y., Kaneshiro, Y.,
Tsuganezawa, H., Saruta, T. (2003) Angiotensin II type 2 receptor inhibits prorenin
processing in juxtaglomerular cells. Hypertens. Res. 26: 915-921.
Ichihara, A., Hayashi, M., Kaneshiro, Y., Suzuki, F., Nakagawa, T., Tada, Y., Koura, Y.,
Nishiyama, A., Okada, H., Uddin, M.N., Nabi, A.H., Ishida, Y., Inagami, T., Saruta, T.
(2004) Inhibition of diabetic nephropathy by a decoy peptide corresponding to the ‘handle’
region for nonproteolytic activation of prorenin. J. Clin. Invest. 114: 1128-1135.
Ichihara, A., Kaneshiro, Y., Takemitsu, T., Sakoda, M., Nakagawa, T., Nishiyama, A., Kawachi,
H., Shimizu, F., Inagami, T. (2006c) Contribution of nonprotelolytically activated prorenin in
glomeruli of hypertensive renal damage. J. Am. Soc. Nephro. 17: 2495-2503.
Ichihara, A., Kaneshiro, Y., Takemitsu, T., Takemitsu, T., Sakoda, M., Suzuki, F., Nakagawa, T.,
Nishiyama, A., Inagami, T., Hayashi, M. (2006b) Nonproteolytic activation of prorenin
contributes to development of cardiac fibrosis in genetic hypertension. Hypertension 47: 894–
900.
Ichihara, A., Suzuki, F., Nakagawa, T., Kaneshiro, Y., Takemitsu, T., Sakoda, M., Nabi, A.H.,
Nishiyama, A., Sugaya, T., Hayashi, M., Inagami, T. (2006a) Prorenin receptor blockade
inhibits development of glomerulosclerosis in diabetic angiotensin II type 1a
receptordeficient mice. J. Am. Soc. Nephrol. 17: 1950–1961.
Ichiki, T., Inagami, T., (1995) Expression, genomic organization and transcription of the mouse
angiotensin II type-2 receptor gene. Circ Res. 76: 693-700.
Imai, M. (1978) Calcium transport across the rabbit thick ascending limb of Henle’s loop
perfused in vitro. Pflugers Arch. 374: 255-263.
Inagami, T. (1994) The renin angiotensin System. Essays Biochem. 28: 147-164.
161
Inesi, G., Kurzmack, M., Coan, C., Lewis, D.E. (1980) Cooperative calcium binding and ATPase
activation in sarcoplasmic reticulum vesicles. J. Biol. Chem. 255: 3025-3031.
Ingelfinger, J.R., Jung, F., Diamont, D., Havervan, L., Lee, E., Brem, A., Tang, S.S. (1999) Rat
proximal tubule cell line transformed with origin-defective SV40DNA: autocrine ANG II
feedback. Am. J. Physiol. 276: F218-227.
Jacobs, W.R., Ferrari, C.M., Brazy, P.C., Mandel, L.J. (1990) Cytosolic free calcium regulation
in renal tubules from spontaneously hypertensive rats. Am. J. Physiol. 258: F175-182.
Jarrett,H.W., Penniston, J.T. (1978) Purification of the Ca
2+
-stimulated ATPase activator from
human erythrocytes: its membership in the class of Ca
2+
-binding modulator proteins. J. Biol.
Chem. 253: 4676-4682.
Jin, X.H., Wang, Z.Q., Siragy, H.M., Guerrant, R.L., Carey, R.M. (1998) Regulation of jejunal
sodium and water absorption by angiotensin subtype receptors. Am. J. Physiol. 275: R515-
523.
Johns, D.W., Peach, M.J., Gomez, R.A., Inagami, T., Carey, R.M. (1990) Angiotensin II
regulates renin gene expression. Am. J. Physiol. 259: F882-887.
Khosla, M.C., Smeby, R.R., Bumpus, F.M. (1974) Structure activity relationship in angiotensin II
analogs, in Handbook of Experimental Pharmacology, (Page IH and Bumpus RM eds)
XXXVII, pp 126-156, Springer-Verlag, New York.
Kobari, H., Harrison-Bernard, L.M., Navar, L.G. (2001) Enhancement of angiotensinogen
expression in angiotensin II-dependent hypertension. Hypertension 37: 1329-1335.
Kohlstedt, K., Brandes, R.P., Muller-Esterl, W., Busse, R., Fleming, I. (2004) Angiotensin-
converting enzyme is involved in outside-in signaling in endothelial cells. Circ. Res. 94: 60-
67.
162
Kohlstedt, K., Gershome, C., Friedrich, M., Muller-Esterl, W., Alhenc-Gelas, F., Busse, R.,
Fleming, I. (2006) Angiotensin-converting enzyme (ACE) dimerization is the initial step in
the ACE inhibitor-induced ACE signaling cascade in endothelial cells. Mol. Pharmacol. 69:
1725-1732.
Kotlo, K., Hughes, D.E., Herrera, V.L., Ruiz-Opazo, N., Costa, R.H., Robey, R.B., Danziger,
R.S. (2007) Functional polymorphism of the Anpep gene increases promoter activity in the
Dahl salt-resistant rat. Hypertension 49: 467-472.
Kramkowski, K., Mogielnicki, A., Buczko, W. (2006) The physiological significance of the
alternative pathways of angiotensin II production. J. Physiol. Pharmacol. 57: 529-39.
Kumar, R., Singh, V.P., Baker, K.M. (2007) The intracellular
emode-angiotensin system: a new
paradigm. Trends Endocrinol. Metab. 18: 208-214.
Lara, L.S., Bica, R.B., Sena, S.L., Correa, J.S., Marques-Fernandes, M.F., Lopes, A.G., Caruso-
Neves, C. (2002) Angiotensin-(1-7) reverts the stimulatory effect of angiotensin II on the
proximal tubule Na
+
-ATPase activity via a A779-sensitive receptor. Regul Pept. 103: 17-22.
Lara, L.S., Cavalcante, F., Axelband, F., De Souza, A.M., Lopes, A.G., Caruso-Neves, C. (2006)
Involvement of the G
i/o
/cGMP/PKG pathway in the AT
2
-mediated inhibition of outer cortex
proximal tubule Na
+
-ATPase by Ang-(1-7). Biochem. J. 395: 183-190.
Lee, D.K., Lança, A.J., Cheng, R., Nguyen, T., Ji, X.D., Gobeil, F. Jr., Chemtob, S., George,
S.R., O'Dowd, B.F. (2003) Agonist-independent nuclear localization of the apelin,
angiotensin AT
1
and bradykinin B
2
receptors. J. Biol. Chem. 279: 7901-7908.
Lemmon, M.A, Engelman, D.M. (1994) Specificity and promiscuity in membrane helix
interactions. FEBS Lett. 346: 170-20.
163
Li, N., Zimpelmann, J., Cheng, K., Wilkins, J.A., Burns, K.D. (2005) The role of angiotensin
converting enzyme 2 in the generation of angiotensin 1-7 by rat proximal tubules. Am. J.
Physiol. Renal Physiol. 288: F353-362.
Li, P., Chappell, M.C., Ferrario, C.M., Broshihan, K.B. (1997) Angiotensin-(1–7) augments
bradykinin-induced vasodilation by competing with ACE and relapsing nitric oxide.
Hypertension 29: 394-400.
Liu, Y.H, Yang, X.P., Sharov, V.G., Nass, O., Sabbah, H.N., Petersen, E., Carretero, O.A. (1997)
Effects of angiotensin converting enzyme inhibitors and angiotensin II type 1 receptor
antagonists in rats with heart failure. J. Clin. Invest. 99: 1926-1935.
Loffing, J., Loffing-Cueni, D., Valderrabano, V., Klausli, L., Hebert, S.C., Rossier, B.C.,
Hoenderop, J.G., Bindels, R.J., Kaissling, B. (2001) Distribution of transcellular calcium and
sodium transport pathways along mouse distal nephron. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281:
F1021-1027.
Loghman, A.M., Soto, C.E., Inagami, T., Cassis, L. (2004) The intrarenal renin-angiotensin
system in autosomal dominant polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287:
F775-788.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Far, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein measuremente with the
folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
Magaldi, A.J., César, K.R., De Araújo, M., Simões, E., Silva, A.C., Santos, R.A. (2003)
Angiotensin-(1–7) stimulates water transport in rat inner medullary collecting duct: evidence
for involvement of vasopressin V(2) receptors. Pflugers Arch. 447: 223-230.
Maia, J.C.C., Gomes, S.L., Juliani, M.H. In: Morel, C.M, editor. Genes of Antigenes of Parasites:
A Laboratory Manual. Rio de Janeiro: Fundacão Oswaldo Cruz; 1993. p. 146-157.
164
Maia, L.G., Ramos, M.C., Fernandes, L., de Carvalho, M.H., Campagnole-Santos, M.J., Souza
dos Santos, R.A. (2004) Angiotensin-(1-7) antagonist A-779 attenuates the potentiation of
bradykinin by captopril in rats. J. Cardiovasc. Pharmacol. 43: 685-691.
Malfroy, B., Schwartz, J.C. (1982) Properties of enkephalinase from rat kidney: comparison of
dipeptidyl-carboxypeptidase and endopeptidase activities. Biochem. Biophys. Res. Commun.
106: 276-285.
Malfroy, B., Schwartz, J.C. (1985) Comparison of dipeptidyl carboxypeptidase and
endopeptidase activities in the three enkephalin-hydrolysing metallopeptidases: ‘angiotensin-
converting enzyme’, thermolysin and ‘enkephalinase’. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130:
372-378.
Manso, A.M., Encabo, A., Ferrer, M., Balfagon, G., Salaices, M., Marin, J. (1999) Changes of
cardiac calcium homeostasis in spontaneously hypertensive rats. J. Auton. Pharmacol. 19:
123-130.
Margeta-Mitrovic, M., Jan, Y.N., Jan, L.Y. (2000) A trafficking checkpoint controls GABA(B)
receptor heterodimerization. Neuron 27: 97-106.
Marsden, P.A. (1990) Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. Nova
Iorque: Raven Press.
Marshall, G.R., Vine, W., Needlemann, P. (1970) A specific competitive inhibitor of angiotensin
II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67: 1624–1630.
McCollum, L.T., Gallagher, P.E., Ferrario, C.M., Tallant, E.A, (2006) Angiotensin-(1-7) reduces
COX-2 in cardiac fibroblasts. Hypertension 48: 79.
Mello-Aires, M. (1999) Fisiologia (2ª ed.). Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, Brasil. Seção
9, Fisiologia Renal. pp. 561-645.
165
Mentlein, R., Roos, T. (1996) Proteases involved in the metabolism of angiotensin II, bradykinin,
calcitonin gene-related peptide (CGRP), and neuropeptide Y by vascular smooth muscle cells.
Peptides 17: 709-720.
Monnot, C., Bihoreau, C., Conchon, S., Curnow, K.M., Corvol, P., Clauser, E. (1996) Polar
residues in the transmembrane domains of the type 1 angiotensin II receptor are required for
binding and coupling. Reconstitution of the binding site by co-expression of two deficient
mutants. J. Biol. Chem. 271: 1507-1513.
Monteith, G.R., Kable, E.P., Kuo, T.H., Roufogalis, B.D. (1997) Elevated plasma membrane and
sarcoplasmic reticulum Ca
2+
pump mRNA levels in cultured aortic smooth muscle cells from
spontaneously hypertensive rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230: 344-346.
Moreau, M.E., Garbacki, N., Molinaro, G., Brown, N.J., Marceau, F., Adam, A. (2005) The
kallikrein-kinin system: current and future pharmacological targets. J. Pharmacol. Sci. 99: 6-
38.
Mujais, S.K., Kauffman, S., Katz, A.I. (1986) Angiotensin II binding sites in individual segments
of the rat nephron. J. Clin. Invest. 77: 315-318.
Mullins, L.J., Bailey, M.A., Mullins, J.J. (2006) Hypertension, kidney, and transgenics: a fresh
perspective. Physiol. Rev. 86: 709-746.
Murasawa, S., Kizima, K., Maruyama, K., Inada, M. (1998) Cardiac-specific overexpression of
angiotensin II AT
2
receptor causes attenuated response to AT
1
receptor-mediated pressor and
chronotropic effects. J. Clin. Invest. 101: 527-535.
Nagata, S., Kato, J., Sasaki, K., Minamino, N., Eto, T., Kitamura, K. (2006) Isolation and
identification of proangiotensin-12, a possible component of the renin-angiotensin system.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 350: 1026-1031.
166
Navar, L.G., Harrison-Bernard, L.M., Nishiyama, A., Kobori, H. (2002) Regulation of intrarenal
angiotensin II in hypertension. Hypertension 39: 316-322.
Negri, A.L. (2006) Proximal tubule endocytic apparatus as the specific renal uptake mechanism
for vitamin D-binding protein/25-(OH)D3 complex. Nephrology (Carlton) 11: 510-515.
Nejsum, L.N. (2005) The renal plumbing system: aquaporin water channels. Cell. Mol. Life Sci.
62: 1692-1706.
Nguyen, G. (2007) The (pro)renin receptor: pathophysiological roles in cardiovascular and renal
pathology. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 16: 129-133.
Nijenhuis, T., Hoenderop, J.G., van der Kemp, A.W., Bindels, R.J. (2003) Localization and
regulation of the epithelial Ca2+ channel TRPV6 in the kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 14:
2731-2740.
Nishimura, H., Tsuji, H., Masuda, H., Nakagawa, K., Nakahara, Y., Kitamura, H., Kasahara, T.,
Sugano, T., Yoshizumi, M., Sawada, S., Nakagawa, M. (1997) Angiotensin II increases
plasminogen activator inhibitor-1 and tissue factor mRNA expression without changing that
of tissue type plasminogen activator or tissue factor pathway inhibitor in cultured rat aortic
endothelial cells. Thromb. Haemost. 77: 1189-1195.
Nishiyama, A., Seth, D.M., Navar, L.G. (2002) Renal interstitial fluid concentrations of
angiotensins I and II in anesthetized rats. Hypertension 39: 129-134.
Noda, K., Feng, Y.H., Liu, X.P., Saad, Y., Husain, A., Karnik, S.S. (1996) The active state of the
AT
1
angiotensin receptor is generated by angiotensin II induction. Biochemistry 35:16435-
16442.
Noda, K., Saad, Y., Karnik, S.S. (1995a) Interaction of Phe
8
of angiotensin II with Lys
199
and
His
256
of AT
1
receptor in agonist activation. J. Biol. Chem. 270: 28511-28514.
167
Nowycky, M.C., Thomas, A.P. (2002) Intracellular calcium signaling. J. Cell. Sci. 115: 3715-
3716.
Oancea, E., Meyer, T. (1998) Protein kinase C as a molecular machine for decoding calcium and
diacylglycerol signals. Cell 95: 307-318.
Odya, C.E., Marinkovic, D.V., Hammon, K.J., Stewart, T.A., Erdos, E.G. (1978) Purification and
properties of prolylcarboxypeptidase (Angiotensinase C) from human kidney. J. Biol. Chem.
253: 5927-5931.
Opolski, G., Filipiak, K.J. (2000) Drugs blocking renin-angiotensin-aldosteron system. Wroclaw,
Urban & Partner.
Ortiz-Capisano, M.C., Ortiz, P.A., Harding, P., Garvin, J.L., Beierwaltes, W.H. (2007) Decreased
intracellular calcium stimulates renin release via calcium-inhibitable adenylyl cyclase.
Hypertension 49: 162-169.
Ozono, R., Wang, Z.Q., Moore, A.F., Inagami, T., Siragy, H.M., Carey, R.M. (1997) Expression
of the subtype-2 angiotensin II (AT
2
) receptor protein in the rat kidney. Hypertension
30:1238-1246
Papadimitriou, A., Worcel, M. (1974) Dose-response curves for angiotensin II and synthetic
analogues in three types of smooth muscle: Existence of different forms of receptor sites for
angiotensin II. Br. J. Pharmacol. 50: 292-297.
Paul, M., Poyan Mehr, A., Kreutz, R. (2006) Physiology of local renin-angiotensin systems.
Physiol. Rev. 86: 747-803.
Paula, C.A., Sousa, M.V., Salgado, M.C., Oliveira, E.B. (1998) Purification and substrate
specificity of an angiotensin converting elastase-2 from the rat mesenteric arterial bed
perfusate. Biochim. Biophys. Acta. 1388: 227-238.
168
Paula, R.D., Lima, C.V., Khosla, M.C., Santos, R.A.S. (1995) Angiotensin-(1-7) potentiates the
hypotensive effect of bradykinin in conscious rats. Hypertension 26: 1154-1159.
Peach, M.J. (1977) Renin-angiotensin system: biochemistry and mechanisms of action. Physiol.
Rev. 57: 313-370.
Peach, M.J., Levens, R.N. (1980) Molecular approaches to the study of angiotensin receptors.
Adv. Exp. Med. Biol. 130: 171-191.
Pendergrass, K.D., Averill, D.B., Ferrario, C.M., Diz, D.I., Chappell, M.C. (2006) Differential
expression of nuclear AT1 receptors and angiotensin II within the kidney of the male
congenic mRen2. Lewis rat. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290: F1497-1506.
Penniston, J.T., Enyedi, A. (1998) Modulation of the plasma membrane Ca
2+
pump. J. Membr.
Biol. 165: 101-109.
Petrov, V.V., Fagard, R.H., Lijnen, P.J. (2004) Arginine-aminopeptidase in rat cardiac
fibroblastic cells participates in angiotensin peptide turnover. Cardiovasc. Res. 61: 724-35.
Quay,T., Slaughter, C., Davis, T.P., Merril, B.J., Hersh, L.B. (1994) Positional effects in the
neprilysin (neutral endopeptidase) reaction. Arch. Biochem. Biophys. 308: 133-136.
Rangel, L.B., Caruso-Neves, C., Lara, L.S., Brasil, F.L., Lopes, A.G. (1999) Angiotensin II
activates the ouabain-insensitive Na
+
-ATPase from renal proximal tubules through a G-
protein. Biochim. Biophys. Acta. 1416: 309-319.
Rangel, L.B., Caruso-Neves, C., Lara, L.S., Lopes, A.G. (2002) Angiotensin II stimulates renal
proximal tubule Na
+
-ATPase activity through the activation of protein kinase C. Biochim.
Biophys. Acta 1564: 310-316.
Re, R.N. (1984a) Cellular biology of the renin-angiotensin systems. Arch. Intern. Med. 144:
2037-2041.
169
Re, R.N. (2003) The intracrine hypothesis and intracellular peptide hormone action. Bioessays
25: 401-409.
Re, R.N., Cook, J.L. (2006) The intracrine hypothesis: an update. Regul. Pept. 133: 1-9.
Re, R.N., Rovigatti, U. (1988) New approaches to the study of the cellular biology of the
cardiovascular system. Circulation 77: I14-17.
Re, R.N., Vizard, D.L., Brown, J., Bryan, S.E. (1984b) Angiotensin II receptors in chromatin
fragments generated by micrococcal nuclease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 220-
227.
Rice, G.I., Thomas, D.A., Grant, P.J., Turner, A.J., Hooper, N.M. (2004) Evaluation of
angiotensin-converting enzyme (ACE), its homologue ACE2 and neprilysin in angiotensin
peptide metabolism. Biochem. J. 383: 45-51.
Ringer, S. (1883) A further Contribution regarding the influence of the different Constituents of
the Blood on the Contraction of the Heart. J. Physiol. 4: 29-42.
Rocha e Silva, M., Beraldo, W.T, Rosenfeld, G. (1949) Bradykinin, a hypotensive and smooth
muscle stimulating factor released from plasma globulin by snake venoms and by trypsin.
Am. J. Physiol. 156: 261-273.
Romano, C., Yang, W.L., O’Malley, K.L. (1996) Metabotropic glutamate receptor 5 is a
disulfide-linked dimer. J. Biol.Chem. 271: 28612–28616.
Rowe, B.P., Dixon, B. (
2000) Angiotensin III depressor action in the conscious rabbit is blocked
by losartan but not PD 123319. Hypertension 35: 130-134.
Ruiz-Ortega, M., Lorenzo, O., Egido, J. (1998) Angiotensin III up-regulates genes involved in
kidney damage in mesangial cells and renal interstitial fibroblasts. Kidney Int. Suppl. 68: S41-
45.
170
Sacktor, B., Rosemblom, I.L., Liang, .T., Cheng, L. (1981) Sodium gradient-and sodium plus
potassium gradient-dependent glutamete uptake in renal basolateral membranes vesicles. J.
Membr. Biol. 60: 63-61.
Salvador, J.M., Inesi, G., Rigaud, J.L., Mata, A.M. (1998) Ca
2+
transport by reconstituted
synaptosomal ATPase is associated with H
+
countertransport and net charge displacement. J.
Biol. Chem. 273: 18230-18234.
Samir, S., El-Dahr (1997) Ontogeny of the Intrarenal Kallikrein-Kinin System: Proposed Role in
Renal Development. Res. Microsc. Tech. 39: 222-232.
Sampaio, W.O., dos Santos, R.A., Faria-Silva, R., de Mata Machado, L.T., Schiffrin, E.L.,
Touyz, R.M. (2007) Angiotensin-(1-7) through receptor Mas mediates endothelial nitric oxide
synthase activation via Akt-dependent pathways. Hypertension 49: 185-192.
Santos, C.F., Caprio, M.A., Oliveira, E.B., Salgado, M.C., Schippers, D.N., Munzenmaier, D.H.,
Greene, A.S. (2003) Functional role, cellular source, and tissue distribution of rat elastase-2,
an angiotensin II-forming enzyme. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285: H775-783.
Santos, R.A., Campagnole-Santos, M.J. (1994) Central and peripheral actions of angiotensin-(1-
7). Br. J. Med. Biol. Res. 27: 1033-1047.
Santos, R.A., Campagnole-Santos, M.J., Andrade, S.P. (2000) Angiotensin-(1-7): an update.
Regul. Pept. 91: 45-62.
Santos, R.A., Haibara, A.S., Campagnole-Santos, M.J., Simões-e-Silva, A.C., Paula, R.D.,
Pinheiro, S.V.B., Leite, M.F., Lemos, V.S., Silva, D.M.R., Guerra, M.T., Khosla, M.C.
(2003b) Characterization of a new selective antagonist for Angiotensin-(1-7), D-pro7-
Angiotensin-(1-7). Hypertension 41: 737-743.
171
Santos, R.A., Passaglio, K.T., Pequero, J.B., Bader, M., Simões-e-Silva, A.C. (2001) Interactions
between Angiotensin-(1-7), Kinins, and Angiotensin II in Kidney and Blood Vessels.
Hypertension 38: 660-664
Santos, R.A., Simões-e-Silva, A.C., Maric, C., Silva, D.M.R., Machado, R.P., Buhr, I., Heringer-
Walther, S., Pinheiro, S.V.B., Lopes, M.T., Bader, M., Mendes, E.P., Lemos, V.S.,
Campagnole-Santos, M.J., Schultheiss, H.P., Speth, R., Walther, T. (2003a) Angiotensin-(1-
7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor MAS. Proc. Natl. Acad. Soc.
USA. 100: 8258-8263.
Saris, J.J., ‘t Hoen, P.A.C., Garrelds, I.M., Dekkers, D.H., den Dunnen, J.T, Lamers, J.M., Jan
Danser, A.H. (2006) Prorenin induces intracellular
emodelin in cardiomyocytes
independently of angiotensin II. Hypertension 48: 1-8.
Scalera, V., Storeli, C., Storeli-Joss, C., Haase., W., Murer, H. (1980) A simple and fast method
for isolation of basolateral plasma membranes from rat small-intestinal ephitelial cells.
Biochem. J. 186: 177-181.
Schmaier, A.H. (2003) The kallikrein-kinin and the renin-angiotensin systems have a
multilayered interaction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 285: R1-13.
Seldin, D.W. (1999) Renal handling of calcium. Nephron. 81: 2-7.
Seldin, D.W., Geibisch, G. (1992) The Kidney: Physiology and Pathophysiology, 2 ed. New
York: Raven Press.
Shaltout, H.A., Westwood, B.M., Averill, D.B., Ferrario, C.M., Figueroa, J.P., Diz, D.I., Rose,
J.C., Chappell, M.C. (2007) Angiotensin metabolism in renal proximal tubules, urine, and
serum of sheep: evidence for ACE2 – dependent processing of angiotensin II. Am. J. Physiol.
Renal Physiol. 292: F82-91.
172
Silva, D.M.R., Vianna, H.R., Cortes, S.F., Campagnole-Santos, M.J., Santos, R.A., Lemos, V.S.
(2006) Evidence for a new angiotensin-(1–7) receptor subtype in the aorta of Sprague–
Dawley rats. Peptides 28: 702-707.
Singh, R., Singh, A.K., Leehey, D.J. (2005) A novel mechanism for angiotensin II formation in
streptozotocin-diabetic rat glomeruli. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288: F1183-1190.
Singh, V.P., Le, B., Bhat, V.B., Baker, K.M., Kumar, R. (2007) High glucose induced regulation
of intracellular angiotensin II synthesis and nuclear redistribution in cardiac myocytes. Am. J.
Physiol. Heart Circ. Physiol. 293: H939-948.
Siragy, H.M., Carey, R.M. (1999) Protective role of the angiotensin AT
2
receptor in renal
vascular hypertension in conscious rats. Hypertension 33: 1237-1242.
Siragy, H.M., de Gasparo, M., Carey, R.M. (2000) Angiotensin type 2 receptor mediates
valsartan-induced hypotension in conscious rats. Hypertension 35: 1074-1077.
Siragy, H.M., Howell, N.L., Peach, M.J., Carey, R.M. (1990) Combined blockade of the
intrarenal renin-angiotensin system in the conscious dog. Am. J. Physiol. 27: F522-529.
Siragy, H.M., Inagami, T., Carey, R.M. (2007) NO and cGMP mediate angiotensin AT
2
receptor-
induced renal renin inhibition in young rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.
293: R1461-1467.
Siragy, H.M., Lamb, N.E., Woodson, J.F., Ragsdale, N.V., Rose, Jr. C.E., Peach, M.J., Carey,
R.M. (1987) Renal sensitivity to angiotensin II in the conscious dog. Endocrin. 120: 1272-
1278.
Skeggs, L.T. Jr., Kahn, J.R., Shumway, N.P. (1956) The preparation and function of the
hypertensin-converting enzyme. J. Exp. Med. 103:295-299.
173
Sogabe, K., Roeser, N.F., Davis, J.A., Nurko, S., Venkatachalam, M.A., Weinberg, J.M. (1996)
Calcium dependence of integrity of the actin cytoskeleton of proximal tubule cell microvilli.
Am. J. Physiol. 271: F292-303.
Sorenson, M.M., Coelho, H.S., Reuben, J.P. (1986) Caffeine inhibition of calcium accumulation
by the sarcoplasmic reticulum in mammalian skinned fibers. J. Membr. Biol. 90: 219-230.
Souza, Dos Santos, R.A., Passaglio, K.T., Pesquero, J.B., Bader, M., Simões E Silva, A.C. (2001)
Interactions between angiotensin-(1-7), kinins, and angiotensin II in kidney and blood
vessels. Hypertension 38: 660-664.
Speth, R.C., Kim, K.H. (1990) Discrimination of two angiotensin II receptor subtypes with a
selective agonist analogue of angiotensin II p-aminophenylalanine8 angiotensin II. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 169: 997-1006.
Star, R.A., Nonoguchi, H., Balaban, R., Knepper, M.A. (1988) Calcium and cyclic adenosine
monophosphate as second messengers for vasopressin in the rat inner medullary collecting
duct. J. Clin. Invest. 81: 1879-1888.
Stauffer, T.P., Guerini, D., Carafoli, E. (1995) Tissue distribution of the four gene products of the
plasma membrane Ca
2+
pump. J. Biol. Chem. 270: 12184-12190.
Strehler, E.E, Caride, A.J., Filoteo, A.G., Xiong, Y., Penniston, J.T., Enyedi, A. (2007) Plasma
membrane Ca
2+
ATPases as dynamic regulators of cellular calcium handling. Ann. NY Acad.
Sci. 1099: 226-236.
Strehler, E.E., Zacharias, D.A. (2001) Role of alternative splicing in generating isoform diversity
among plasma membrane calcium pumps. Physiol. Rev. 81: 21-50.
Su, Z., Zimpelmann, J., Burns, K.D. (2006) Angiotensin-(1-7) inhibits angiotensin II-stimulated
phosphorylation of MAP kinases in proximal tubular cells. Kidney Int. 69: 2212-2218.
174
Tallant, E.A., Ferrario, C.M., Gallagher, P.E. (2005) Angiotensin-(1-7) inhibits growth of cardiac
myocytes through activation of the MAS receptor. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289:
H1560-1566.
Tan, Y., Hutchison, F.N., Jaffa, A.A. (2004) Mechanisms of angiotensin II-induced expression of
B
2
kinin receptors. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286: H926-932.
Thomas, W.G., Mendelsohn, F.A. (2003) Angiotensin receptors: form and function and
distribution. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 35: 774-779.
Tikellis, C., Johnston, C.I., Forbes, J.M., Burns, W.C., Burrell, L.M., Risvanis, J., Cooper, M.E.
(2003) Characterization of renal angiotensin-converting enzyme 2 in diabetic nephropathy.
Hypertension 41: 392-397.
Tipnis, S.R., Hooper, N.M., Hyde, R., Karran, E., Christie, G., Turner, A.J. (2000) A human
homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression as a captopril
insensitive carboxypeptidase. J. Biol. Chem. 275: 33238-33243.
Tortelote, G.G., Valverde, R.H., Lemos, T., Guilherme, A., Einicker-Lamas, M., Vieyra, A.
(2004) The plasma membrane Ca
2+
pump from proximal kidney tubules is exclusively
localized and active in caveolae. FEBS Lett. 576: 31-35.
Tsujimoto, M., Goto, Y., Maruyama, M., Hattori, A. (2007) Biochemical and enzymatic
properties of the M1 family of aminopeptidases involved in the regulation of blood pressure.
Heart Fail Rev. Nov 13 [Epub ahead of print].
Tsukamoto, Y., Tamura, T., Marum, F. (1988) ATP driven Ca
2+
pump in the basolateral
membrane of rat kidney cortex catalyzes and eletroneutral Ca
2+
/H
+
antiporter. Biochim.
Biophys. Acta 945: 281-290.
Tsutsumi, Y., Matsubara, H., Masaki, H., Kurihara, H., Murasawa, S., Takai, S., Miyazaki, M.,
Nozawa, Y., Ozono, R., Nakagawa, K., Miwa, T., Kawada, N., Mori, Y., Shibaski, Y.,
175
Tanaka, Y., Fujiyama, S., Koyama, Y., Fujiyama, A., Takahashi, H., Iwasaka, T. (1999)
Angiotensin II type 2 receptor overexpression activates the vascular kinin system and causes
vasodilation. J. Clin. Invest. 104: 925-935.
Urata, H., Healy, B., Stewart, R.W., Bumpus, F.M., Husain, A. (1990) Angiotensin II-forming
pathways in normal and failing human hearts. Circ. Res. 66: 883-890.
Valverde, R.H., Tortelote, G.G., Lemos, T., Mintz, E., Vieyra, A. (2005) Ca
2+
/calmodulin-
dependent protein kinase II is an essential mediator in the coordinated regulation of
electrocyte Ca
2+
-ATPase by calmodulin and protein kinase A. J. Biol. Chem. 280: 30611-
30618.
Van Baal, J., Raber, G., de Slegte, J., Pieters, R., Bindels, R.J., Willems, P.H. (1996)
Vasopressin-stimulated Ca
2+
reabsorption in rabbit cortical collecting system: effects on
cAMP and cytosolic Ca
2+
. Pflugers Arch. 433: 109-115.
Vanhoof, G., Goossens, F., De Meester, I., Hendriks, D., Scharpé, S. (1995) Proline motifs in
peptides and their biological processing. FASEB J. 9: 736-744.
Vaughan, D.E., Lazos, S.A., Tong, K. (1995) Angiotensin II regulates the expression of
plasminogen activator inhibitor-1 in cultured endothelial cells. J. Clin. Invest. 96: 2515–2520.
Vickers, C., Hales, P., Kaushik, V., Dick, L., Gavin, J., Tang, J., Godbout, K., Parsons, T.,
Baronas, E., Hsieh, F., Acton, S., Patane, M., Nichols, A., Tummino, P. (2002) Hydrolysis of
biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase. J.
Biol. Chem. 277: 14838–14843.
Vidotti, D.B., Casarini, D.E., Cristovam, P.C., Leite, C.A., Schor, N., Boim, M.A. (2004) High
glucose concentration stimulates intracellular renin activity and angiotensin II generation in
rat mesangial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286: F1039-F1045.
176
Vieyra, A. (1996) Catalytic and structural modifications of sarcoplasmic reticulum and plasma
membrane (Ca
2+
+Mg
2+
)ATPases induced by organic solutes that accumulate in living
systems. Biosci. Rep. 16: 115-127.
Vieyra, A., Nachbin, L., de Dios-Abad, E., Goldfeld, M., Meyer-Fernandes, J.R., de Moraes L.
(1986) Comparison between calcium transport and adenosine triphosphatase activity in
membrane vesicles derived from rabbit kidney proximal tubules. J. Biol. Chem. 261: 4247-
4255.
Vila-Porcile, E., Corvol, P. (1998) Angiotensinogen, prorenin, and renin are co-localized in the
secretory granules of all glandular cells of the rat anterior pituitary: an immunoultrastructural
study. J. Histochem. Cytochem. 46: 301-311.
Wang, J.M, Slembrouck, D., Tan, J., Arckens, L., Leenen, F.H., Courtoy, P.J., De Potter, W.P.
(2002) Presence of cellular renin-angiotensin system in chromaffin cells of bovine adrenal
medulla. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283: H1811-1818.
Warner, F. J., Smith, A. I., Hooper, N. M., Turner, A. J. (2004) Angiotensin-converting enzyme-
2: a molecular and cellular perspective. Cell. Mol. Life Sci. 61: 2704–2713.
White, J.H., Wise, A., Main, M.J., Green, A., Fraser, N.J., Disney, G.H., Barnes, A.A., Emson,
P., Foord, S.M., Marshall, F.H. (1998) Heterodimerization is required for the formation of a
functional GABA(B) receptor. Nature. 396: 679-682.
Whitebread, S., Mele, M., Kamber, B., de Gasparo. M. (1989) Preliminary biochemical
characterization of two angiotensin II receptor subtypes. Biochem. Biophys. Res. Commun.
163: 284-291.
Whittembury, G. E., Proverbio, F. (1970) Two models of Na
+
extrusion in cells from guinea-pig
kidney cortex slices. Pflügers Arch. 316: 1-25.
177
Wise, A., Jupe, S.C., Rees, S. (2004) The identification of ligands at orphan G-protein coupled
receptors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44: 43-66.
Wright, J.W., Mizutani, S., Murray, C.E., Amir, H.Z., Harding, J.W. (1990) Aminopeptidase-
induced elevations and reductions in blood pressure in the spontaneously hypertensive rat. J.
Hypertens. 8: 969–974.
Yamano, Y., Ohyama, K., Kikyo, M., Sano, T., Nakagomi, Y., Inoue, Y., Nakamura, N.,
Morishima, I., Guo, D.F., Hamakubo, T., Inagami, T. (1995) Mutagenesis and the molecular
modeling of the rat angiotensin II receptor (AT
1
). J. Biol. Chem. 270: 14024-14030.
Yang, H.Y., Erdös, E.G., Levin, Y. (1970) A dipeptidyl carboxypeptidase that converts
angiotensin I and inactivates bradykinin. Biochim. Biophys. Acta. 214: 374-376.
Zacharias, D.A., Kappen, C. (1999) Developmental expression of the four plasma membrane
calcium ATPase (PMCA) genes in the mouse. Biochim. Biophys. Acta 1428: 397-405.
Zhuo, J., Song, K., Harris, P.J., Mendelsohn, F.A. (1992) In vitro autoradiography reveals
predominantly AT
1
angiotensin II receptors in the rat kidney. Renal Physiol. Biochem. 15:
231-239.
Zylińska L, Soszyński M. (2000) Plasma membrane Ca
2+
-ATPase in excitable and nonexcitable
cells. Acta Biochim. Pol. 47: 529-39.
Páginas de Internet consultadas:
Roger Bouillon. The Changing face of endocrinology. Karger Gazette. Número 66, abril 2003.
http://www.karger.com/gazette/pdf/gazett66.pdf
;
www.med.mun.ca/anatomyts/renal/akid3.htm;
www2j.biglobe.ne.jp/~fkamiya/HB/C09 57.html.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo