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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA – UFSC
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – CCB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ANÁLISE DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO EXTRATO
ETANÓLICO OBTIDO DA Melissa officinalis L.
GISELLE GUGINSKI
Florianópolis/SC
2007
Dissertação apresenta
da ao Programa de Pós
-
graduação em Farmacologia do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Santa
Catarina, como requisito à obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos
Santos
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GUGINSKI, G
iselle
.
Análise das propriedades farmacológicas do extrato
etanólico de Melissa officinalis L. Florianópolis, 2007. 110 p. Dissertação
(Mestrado em Farmacologia) - Curso de Pós-Graduação em Farmacologia,
Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientador: Professor Doutor Adair Roberto Soares dos Santos
Defesa: 28/09/2007
O presente estudo analisou a possível ação antinociceptiva do extrato
etanólico (EE) obtido da Melissa officinalis em modelos de nocicepção química,
mecânica e térmica em camundongos e ratos. O EE administrado pela via oral
(v.o.), 1 h antes do teste, inibiu significativamente as contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético, bem como as duas fases do teste da formalina e a
nocicepção mediada por glutamato. Além disso, o ácido rosmarínico (0.3-3
mg/kg, v.o.), presente em grandes quantidades no EE, administrado 60 min antes
do teste, também reduziu de forma dependente da dose a nocicepção induzida
pelo glutamato. O EE ainda mostrou-se eficaz em reverter a nocicepção causada
pela constrição parcial do nervo ciático em camundongos por até 12 horas e
parece não induzir tolerância e nem ter efeito cumulativo com o tratamento
prolongado. Além disso, o EE foi capaz de reverter a hiperalgesia térmica e
mecânica induzida pela injeção intraplantar de BK, PGE
2
e PMA. Igualmente, o EE
foi capaz de prevenir os efeitos deletérios da colite induzida por injeção retal de
ácido acético. O EE facilitou a aquisição e a retenção da memória de longa e
curta duração, quando analisado no modelo da esquiva inibitória em ratos,
facilitação esta revertida pelo pré-tratamento dos animais via i.p. com MK-801,
L-NAME, mecamilanima e atropina. A antinocicepção ou facilitação da memória
causada pelo EE não está associada a efeitos inespecíficos, como relaxamento
muscular ou sedação. Em conjunto, estes resultados sugerem que o EE de Melissa
officinalis apresenta importante atividade antinociceptiva em vários modelos
experimentais de nocicepção e inflamação em camundongos e ratos, além de
atividade facilitadora da memória em ratos no modelo da esquiva inibitória. O
seu mecanismo de ação antinociceptiva e facilitadora da memória não estão
completamente esclarecidos, mas o presente estudo mostrou que esta ação é
dependente, pelo menos em parte, de uma interação com os sistemas
glutamatérgico, colinérgico e com a via L-arginina-óxido nítrico.
Palavras – chave: Melissa officinalis, nocicepção, memória
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ii
De tudo ficaram três coisas…
A certeza de que estamos começando…
A certeza de que é preciso continuar…
A certeza de que podemos ser interrompidos
antes de terminar…
Façamos da interrupção um caminho novo…
Da queda, um passo de dança…
Do medo, uma escada…
Do sonho, uma ponte…
Da procura, um encontro! “
(Fernando Sabino)
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Evaldo e Marilda, que sempre me apoiaram, cada um a
sua forma, e que foram determinantes e indispensáveis para que eu
conseguisse galgar mais este degrau. Muito Obrigada!
Ao meu namorado, Rafael, que mesmo a distância sempre me apoiou,
compreendeu e ajudou! Muito obrigada meu amor!
A todos os demais familiares que de alguma forma contribuíram para
minha formação, interesse pela pesquisa e que sempre torceram pelo meu
sucesso.
Às minhas amigas distantes, porém sempre muito presentes de alguma
forma, Marina e Denise, quase nem nos vemos mais, mas passe o tempo que
passar vocês sempre serão muito especiais pra mim! Amo vocês!
Ao pessoal do Laboratório, nunca houve, há, nem haverá no mundo
pessoas mais legais que vocês!
Ao Ney, que me auxiliou sempre, desde o inicio, até antes do início, me
ajudando a estudar para a prova de seleção! Muito obrigada!
À Ana, o Rodrigo, a Dani e a Morgana pelas valiosas correções das
versões preliminares.
À Fabi, a Flávia, a Vanessa, a Liana e a Ana! Alguns dos melhores
momentos dos meus últimos anos, passei ao lado de vocês. Obrigada pelo
companheirismo!
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À Morgana, pela amizade! Jamais pensei que tanta coragem,
capacidade, doçura e amizade coubessem dentro de alguém tão
pequenininha!
Ao Fábio “Gaúcho”, pela amizade e pelo auxilio na realização de
algumas técnicas.
À Débora, porque nela descobri uma irmã mais nova e semelhanças que
vão além da aparência física, te adoro... Mas toma juízo menina!
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, em
especial, Diana, Nivaldo, Seu Carlos e Dona Vilma, que colaboraram
imensamente para a realização deste trabalho.
Aos professores da Pós-graduação em Farmacologia e aos da Pós-
graduação em Neurociências, pelos conhecimentos transmitidos.
Ao Centroflora e à Doutora Elizabeth Teràn (in memorian) pelo
fornecimento do material vegetal.
A CAPES, CNPq, PRONEX, FAPESC e UFSC pelo suporte financeiro.
“...Desejo a vocês, folhas da minha árvore. Paz, Amor, Saúde,
Sucesso, Tranqüilidade e Prosperidade.Hoje e sempre...
Simplesmente porque cada pessoa que passa em nossas vidas é única.
Sempre deixa um pouco de si e leva um pouco de nós.
Há os que levaram muito, mas não há os que não deixaram nada.
Esta é a maior responsabilidade de nossas vidas
E a prova evidente de que duas almas não se encontram por acaso!”
(Antoine de Saint-Exupéry)
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SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................ i
LISTA DE FIGURAS............................................................................................ iv
LISTA DE TABELAS............................................................................................ viii
RESUMO.............................................................................................................. ix
ABSTRACT..........................................................................................................
xi
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1
1.1. Produtos naturais.......................................................................................... 1
1.2. Melissa officinalis L. subsp. officinalis....................................................... 4
1.3. Dor.................................................................................................................
7
1.3.1. Dor inflamatória........................................................................................ 16
1.3.2. Dor neuropática........................................................................................ 17
1.4. Memória........................................................................................................ 19
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 29
2.1. Objetivo geral.............................................................................................. 29
2.2. Objetivos específicos................................................................................... 29
3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................
31
3.1. Animais......................................................................................................... 31
3.2. Material botânico......................................................................................... 31
3.3. Drogas........................................................................................................... 32
3.4. Nocicepção induzida pelo ácido acético...................................................... 33
3.5. Nocicepção induzida pelo glutamato........................................................... 34
3.6. Nocicepção induzida pela formalina............................................................ 34
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3.7. Neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático.....................
35
3.8. Hiperalgesia induzida por mediadores inflamatórios................................... 36
3.9. Indução de colite por injeção intra-retal de ácido acético..........................
37
3.10. Avaliação da atividade locomotora: Teste do campo aberto (open-field).
38
3.11. Análise dos possíveis mecanismos de ação antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis ................................................................................................
38
3.11.1. Envolvimento do sistema glutamatérgico, da substância P e das
citocinas pró inflamatórias ..................................................................................
39
3.11.2. Envolvimento do sistema opióide............................................................ 40
3.11.3. Envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico..........................................
41
3.11.4. Envolvimento do sistema colinérgico.......................................................
41
3.12. Efeito do ácido rosmarínico no modelo do glutamato ...............................
42
3.13. Esquiva inibitória.........................................................................................
42
3.14. Análise dos possíveis mecanismos de ação do EE de Melissa officinalis
na faciliatação da memória..................................................................................
43
3.14.1. Envolvimento do sistema glutamatérgico................................................
43
3.14.2. Envolvimento do sistema colinérgico.......................................................
44
3.14.3. Envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico.......................................... 44
3.15. Análise estatística....................................................................................... 45
4. RESULTADOS....................................................................................................
46
4.1. Nocicepção induzida pelo ácido acético...................................................... 46
4.2. Nocicepção induzida pelo glutamato............................................................
47
4.3. Nocicepção induzida pela formalina.............................................................
47
4.4. Neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático.....................
49
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4.5. Hiperalgesia induzida por agentes flogísticos...............................................
51
4.6. Indução de colite por injeção intra-retal de ácido acético..........................
53
4.7. Avaliação da atividade locomotora: Teste do campo aberto (open-field).. 55
4.8. Análise dos possíveis mecanismos de ação antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis ................................................................................................
56
4.8.1. Envolvimento do sistema glutamatérgico, da substância P e das
citocinas pró inflamatórias ..................................................................................
56
4.8.2. Envolvimento do sistema opióide.............................................................. 58
4.8.3. Envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico............................................
59
4.8.4. Envolvimento do sistema colínergico........................................................
60
4.9. Efeito do ácido rosmarínico no modelo do glutamato..................................
61
4.10. Esquiva inibitória.........................................................................................
62
4.11. Análise dos possíveis mecanismos de ação do EE de Melissa officinalis
na facilitação da memória..................................................................................
63
4.11.1. Envolvimento do sistema glutamatérgico................................................
63
4.11.2. Envolvimento do sistema colinérgico.......................................................
64
4.11.3. Envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico.......................................... 66
5. DISCUSSÃO....................................................................................................... 67
6. CONCLUSÃO..................................................................................................... 83
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................
85
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i
LISTA DE ABREVIATURAS
α
2
β
3
Receptor nicotínico tipo α
2
β
3,
predominantemente neural
L
Microlitro
m
Micrômetro
mol
Micromol
AMP Monofosfato de adenosina
AMPA
Ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico
AMPc Monofosfato cíclico de 3’5’ -adenosina
ATP Trifosfato de adenosina
B
2
Receptor de Bradicinina tipo 2
BK Bradicinina
Ca
2+
Íon cálcio
Cainato Ácido caínico
CaMKII Cálcio calmodulina quinase II
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
CREB Proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc
DAG Diacilglicerol
DI
50
Dose que inibe a resposta em 50%
E.P.M. Erro padrão da média
EE Extrato etanólico
eNOS Sintase de óxido nítrico endotelial
EP Receptor de Postaglandina E
2
ERK Proteína quinase reguladora de sinal extracelular
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ii
GABA
Ácido -amino butírico
GABA
B
Receptor de Ácido γ-amino butírico tipo B
GC Guanilato ciclase
GMP
c
Monofosfato cíclico de 3’5’ – guanosina
i.p. Intraperitoneal
IP
3
Trifosfato de inositol
i.pl. Intraplantar
i.t. Intratecal
IASP Associação Internacional para o Estudo da Dor
iNOS Sintase de óxido nítrico induzida
K
+
Íon potássio
L-NOARG N
ω
-nitro-L-arginina
L-NAME Nitro-L-arginina–metil-éster
LTM Memória de longa duração
LTP Potencial de longa duração
M
1
Receptor colinérgico muscarínico do tipo 1 ou neural
mA Mili Ampere
MAPK Proteína quinase ativada por mitógenos
Mg
+2
Íon magnésio
mg/kg Miligramas por quilograma
mGluR Receptor glutamatérgico metabotrópico
MK-801 Maleato de dizocilpina
Na
+
Íon sódio
NaCl Cloreto de sódio
NAL Cloridrato de naloxona
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iii
NMDA Ácido N-metil-D-aspártico
nmol Nanomol
nNOS Sintase de óxido nítrico neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Sintase de óxido nítrico
PC -12 Linhagem de células derivas de feocromocitoma
PGE
2
Prostaglandina E
2
PMA forbol 12- miristato 13-acetato
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
pmol Picomol
RNA
m
Ácido ribonucleico mensageiro
RYR Receptor de Rianodina
s.c. Subcutânea
SP Substância P
STM Memória de curta duração
trans-ACPD Ácido (±)-1-aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
UnB Universidade de Brasília
v.o. Via oral
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iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Folhas (A) e flores (B) da Melissa officinalis...................................... 5
Figura 2: Diferentes tipos de neurônios sensoriais primários, responsáveis
pela condução do sinal nociceptivo da periferia ao SNC....................................
11
Figura 3: Formação da memória de longa duração............................................ 22
Figura 4: A fase precoce do LTP independe de síntese de proteínas................ 25
Figura 5: Todas as fases do LTP se comunicam através da via da Quinase
regulada por sinal extracelular(ERK)..................................................................
26
Figura 6: Avaliação do efeito antinociceptivo (3-1000 mg/kg, v.o.) do EE de
Melissa officinalis na nocicepção induzida por ácido acético 0,6% (450 µl,
i.p.) em camundongos.........................................................................................
46
Figura 7: Avaliação do efeito antinociceptivo do EE de Melissa officinalis
(10-1000 mg/kg, v.o) na nocicepção induzida por glutamato tamponado (20
mol/pata) em camundongos.............................................................................
47
Figura 8: Efeito antinociceptivo do EE de Melissa officinalis (30-1000 mg/kg)
administrado pela via oral em relação à primeira (A) e segunda (B) fase da
nocicepção induzida pela formalina (2,5%) em camundongos............................
48
Figura 9: Decurso temporal do efeito do EE de Melissa officinalis (100
mg/kg, v.o.) na neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático
em camundongos.................................................................................................
49
Figura 10: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) 2 (A) e 10 (B)
horas após o tratamento diário, na neuropatia induzida pela constrição
parcial do nervo ciático em camundongos..........................................................
50
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v
Figura 11: Efeito do EE de Melissa officinalis (10 - 300 mg/kg, v.o.) na
hiperalgesia mecânica (A) e térmica (B) induzida pela injeção intraplantar
de bradicinina (BK, 3 nmol/pata) em ratos........................................................
51
Figura 12: Efeito do EE de Melissa officinalis (3 - 300 mg/kg, v.o.) na
hiperalgesia mecânica (A) e térmica (B) induzida pela injeção intraplantar
de Prostaglandina E
2
(PGE
2
, 10 nmol/pata) em ratos.........................................
52
Figura 13: Efeito do EE de Melissa officinalis (10 – 300 mg/kg, v.o.) na
hiperalgesia mecânica (A) e térmica (B) induzida pela injeção intraplantar
de PMA (0,1 nmol/pata) em ratos.......................................................................
52
Figura 14: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) na
prevenção de lesão no cólon de animais que receberam ácido acético (5%,
150 µl) por via retal.............................................................................................
53
Figura 15: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) e da
Dexametasona (2 mg/kg, v.o.) no peso do baço (A) e do cólon (B) de animais
que receberam ácido acético (5%, 150 µl) por via retal.....................................
54
Figura 16: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) sobre a
atividade locomotora de camundongos avaliados no modelo do campo aberto
55
Figura 17: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 1000 mg/kg, v.o.) sobre a
atividade locomotora de ratos avaliados no modelo do campo aberto..............
56
Figura 18: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na
nocicepção induzida por aminoácidos excitatórios e SP em camundongos........
57
Figura 19: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na
nocicepção induzida por citocinas pró-inflamatórias em camundongos............
58
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vi
Figura 20: Efeito do pré-tratamento dos animais com naloxona (1 mg/kg,
i.p.) sobre a atividade antinociceptiva do EE de Melissa officinalis (100
mg/kg, v.o.) e morfina (2,5 mg/kg, s.c.), no modelo de nocicepção induzida
pelo glutamato em camundongos........................................................................
59
Figura 21: Efeito do pré-tratamento dos animais com L-arginina (40 mg/kg
i.p.) ou D-arginina (40 mg/kg i.p.) sobre a atividade antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) e L-NOARG (25 mg/kg, i.p.), no modelo
de nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos.................................
60
Figura 22: Efeito do pré-tratamento dos animais com mecamilamina (2
mg/kg, i.p., A) ou atropina (1 mg/kg, i.p., B) sobre a atividade
antinociceptiva da nicotina (1 mg/kg, i.p., A) e da pilocarpina (3 mg/kg, i.p.
B), bem como do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.), no modelo de
nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos......................................
61
Figura 23: Avaliação do efeito do ácido rosmarínico (0,3 - 3 mg/kg, v.o) na
nocicepção induzida por glutamato (20 mol/pata) em camundongos.........
62
Figura 24. Efeito do EE de Melissa officinalis (30 - 1000 mg/kg, v.o.) sobre a
aquisição (A e B) e retenção (C e D) da memória de curta (STM, A e C) e de
longa duração (LTM, B e D), no modelo de esquiva inibitória em ratas.............
63
Figura 25: Efeito do MK 801 (0,01mg/kg, i.p.) sobre o efeito do EE de
Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na a memória de curta (STM, A) e de
longa duração (LTM, B), no modelo de esquiva inibitória em ratas...................
64
Figura 26: Efeito da atropina (1 mg/kg, i.p.) sobre o efeito do EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) na memória de curta (STM, A) e de longa
duração (LTM, B), no modelo de esquiva inibitória em ratas.............................
65
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vii
Figura 27: Efeito da mecamilamina (5 mg/kg, i.p.) sobre o efeito do EE de
Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na memória de curta (STM, A) e de
longa duração (LTM, B), no modelo de esquiva inibitória em ratas...................
65
Figura 28: Efeito do L-NAME (2 mg/kg, i.p.) sobre o efeito do EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) na memória de curta (STM, A) e de longa
duração (LTM, B), no modelo de esquiva inibitória em ratas.............................
66
Figura 29: Esquema dos prováveis mecanismos de ação envolvidos na
atividade antinociceptiva do EE de Melissa officinalis......................................
80
Figura 30: Esquema dos prováveis mecanismos de ação envolvidos na
atividade facilitatória da memória do EE de Melissa officinalis.......................
81
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ix
RESUMO
O presente estudo analisou a possível ação antinociceptiva do extrato
etanólico (EE) obtido da Melissa officinalis em modelos de nocicepção
química, mecânica e térmica em camundongos e ratos. O EE (3-1000 mg/kg)
administrado pela via oral (v.o.), 1 h antes do teste, inibiu significativamente
as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, com DI
50
de 241,92
mg/kg e inibição de 52+5%. Da mesma forma, o EE (30-1000 mg/kg, v.o.)
inibiu significativamente a nocicepção de origem neurogênica (337%) e
inflamatória (485%) induzida pela formalina. O EE (30-1000 mg/kg, v.o.)
também inibiu a nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato,
com DI
50
de 198,54 mg/kg e inibição de 62+5%. Além disso, o ácido rosmarínico
(0.3-3 mg/kg, v.o.), presente em grandes quantidades no EEMO, administrado
60 min antes do teste, também reduziu de forma dependente da dose a
nocicepção induzida pelo glutamato, com DI
50
de 2.64 mg/kg e inibição de
64+3%. O EE (100 mg/kg, v.o.) causou marcante inibição da resposta
nociceptiva induzida pela injeção intratecal (i.t.) de NMDA, AMPA, Cainato,
IL-1 e TNF- (com inibições de 685, 667, 852, 499 e 624%,
respectivamente), sem afetar a nocicepção induzida por trans-ACPD e SP. Na
neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático, o EE (100 mg/kg)
reduziu significativamente a alodínia mecânica, avaliada através de
filamentos de Von Frey, com inibição de 8511%. Este efeito foi mantido por
até 12 horas, e parece não induzir tolerância e nem ter efeito cumulativo com
o tratamento prolongado (15 dias). Além disso, o EE (3-300 mg/kg) foi capaz
de reverter a hiperalgesia térmica (com inibições de 83+2, 83+2 e 54+12%) e
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x
mecânica (com inibições de 59+10, 100 e 100%) induzida pela injeção
intraplantar de BK, PGE
2
e PMA, respectivamente. Igualmente, o EE (30-300
mg/kg) foi capaz de prevenir os efeitos deletérios da colite induzida por
injeção retal de ácido acético com inibição de 65+8% da inflamação e de
48+8% do peso do cólon, sem afetar, no entanto, o peso do baço. A
antinocicepção causado pelo EE (100 mg/kg, v.o.) na nocicepção causada pelo
glutamato foi significativamente atenuada pela injeção intraperitoneal (i.p.)
de L-arginina (40 mg/kg), atropina (1 mg/kg) ou mecamilamina (2 mg/kg),
mas não pela naloxona (1 mg/kg, i.p.). Além disso, o EE facilitou a aquisição e
a retenção da memória de longa e curta duração, quando analisado no modelo
da esquiva inibitória em ratos, facilitação esta revertida pelo pré-tratamento
dos animais via i.p. com MK-801 (0,01 mg/kg), L-NAME (2 mg/kg),
mecamilanima (5 mg/kg) e atropina (1 mg/kg). A antinocicepção ou
facilitação da memória causada pelo EE não está associada a efeitos
inespecíficos, como relaxamento muscular ou sedação. Em conjunto, estes
resultados sugerem que o EE de Melissa officinalis apresenta importante
atividade antinociceptiva em vários modelos experimentais de nocicepção e
inflamação em camundongos e ratos, além de atividade facilitadora da
memória em ratos no modelo da esquiva inibitória. O seu mecanismo de ação
antinociceptiva e facilitadora da memória não está completamente
esclarecido, mas o presente estudo mostrou que esta ação é dependente, pelo
menos em parte, de uma interação com os sistemas glutamatérgico,
colinérgico e com a via L-arginina-óxido nítrico.
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xi
ABSTRACT
The present study investigated the possible antinociceptive actions of
the ethanolic extract (EE) obtained from Melissa officinalis in chemical,
mechanical and thermal behavioural models of pain in mice and rats. The EE
(3-1000 mg/kg), given orally (p.o.), 1 h prior to testing, produced dose-
dependent inhibition of acetic acid-induced visceral pain, with ID
50
of 241.92
mg/kg and inhibition of 52+5%. Moreover, the EE (30-1000 mg/kg, p.o.) also
caused significant inhibition of both neurogenic (337%) and inflammatory
(485%) pain of formalin-induced licking. In addition, the EE (30-1000 mg/kg,
p.o.) caused significant and dose-dependent inhibition of glutamate-induced
pain, with ID
50
of 198.54 mg/kg and inhibition of 62+5%. Furthermore, the
rosmarinic acid (0.3–3 mg/kg), given p.o., 1 h prior to testing, also produced
dose-related inhibition of glutamate-induced pain, with a mean ID
50
value of
2.64 mg/kg and inhibition of 64+3%. The EE (100 mg/kg, p.o., 1h prior to
testing) caused marked inhibition of the nociceptive response induced by
intrathecal (i.t.) administration of NMDA, AMPA, kainate, IL-1 and TNF- (by
685, 667, 852, 499 e 624%, respectively), without affecting nociceptive
responses induced by trans-ACPD and substance P. The EE (100 mg/kg, p.o.)
also reduced the mechanical allodynia, evaluated by von Frey monofilament
fibers, induced by partial sciatic nerve injury neuropathy during 10 h, with
inhibition of 8511%. In addition, the EE (3–300 mg/kg, p.o.) inhibited both
mechanical (by 59+10, 100 and 100%) and thermal (by 83+2, 83+2 and 54+12%)
hyperalgesia induced by BK, PGE
2
and PMA in the rat paw, respectively.
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xii
Moreover, the EE (30-300 mg/kg) inhibited both inflammation (65+8%) and the
weight of the colon (488%) induced by the rectal injection of acetic acid,
without affecting, however, the weight of spleen. The antinociception caused
by EE (100 mg/kg, p.o.) at glutamate test was significantly attenuated by i.p.
treatment of mice with L-arginine (40 mg/kg, i.p.), atropine (1 mg/kg, i.p.)
or mecamylamine (2 mg/kg, i.p.). In contrast, EE (100 mg/kg, p.o.)
antinociception was not affected by naloxone (1 mg/kg, i.p.).
Additionally, the EE improved memory processes in rats submitted to
the inhibitory avoidance task. Although this response was blocked by i.p.
treatment of rats with MK-801 (0.01 mg/kg), L-NAME (2 mg/kg),
mecamylamine (5 mg/kg) and atropine (1 mg/kg). Furthermore, the
antinociception and the improvement of the memory caused by EE were not
associated with non-specific effects such as muscle relaxation or sedation.
Together, these results provide experimental evidences indicating that EE of
Melissa officinalis produces dose-related antinociception and anti-
inflammatory in several experimental models of nociception in mice and rats,
as well as it was capable to improve the memory in inhibitory avoidance task.
The mechanisms by which EE produced both effects still remains unclear, but
at least in part, this effect seems to be modulation of the L-arginine-nitric
oxide pathway, as well as glutamatergic and cholinergic systems.
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1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Produtos naturais
As primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo homem
remontam as sagradas escrituras e ao papiro de Ebers (1700 a.C.), em
homenagem à quem o descobriu e publicou, Georg Ebers. Enumera mais ou
menos 100 doenças e descreve uma grande variedade de fármacos de
natureza animal, vegetal e mineral (OUBRÉ et al., 1997; VANE & BOTTING,
1998; YUNES, PEDROSA & CECHINEL FILHO, 2001; LOMBARDINO & LOWE III,
2004).
Durante o período anterior à Era Cristã que ficou conhecido como
civilização grega, vários filósofos podem ser destacados por suas obras sobre
história natural. Dentre esses, sobressaem-se Hipócrates, considerado o pai da
medicina moderna, que se caracterizou por tomar a natureza como guia na
escolha dos remédios (Natura medicatrix) e Teofrasto (372 a.C.), discípulo de
Aristóteles, que escreveu vários livros sobre a história das plantas. Hipócrates
foi quem primeiro registrou a utilização da espécie botânica Papaver
somniferum, planta cujo princípio ativo é a morfina (documentos sumerianos
de 5000 a.C. referem-se à papoula (P. somniferum)) (LOMBARDINO & LOWE III,
2004).
Em 1928, Friedrich Wohler revolucionou a ciência demonstrando que
era possível obter matéria orgânica através de compostos inorgânicos (síntese
da uréia). Esse grande passo na história da ciência não só possibilitou corrigir
conhecimentos da época, os quais relatavam que a matéria orgânica só
poderia ser obtida de animais e vegetais, como também foi um grande
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2
impulso na ciência farmacêutica moderna. Tal descoberta possibilitou a
produção de produtos sintéticos através de novas técnicas que viabilizaram a
alteração da estrutura química de compostos, tendo como matéria prima
substâncias de origem animal ou vegetal. A partir de então o conhecimento
popular foi de extrema importância para que vários medicamentos
industrializados chegassem ao mercado farmacêutico e alguns destes são
utilizados atualmente em larga escala em todo o mundo. Um bom exemplo é o
ácido acetil-salicílico (AAS), que surgiu a partir de um princípio ativo extraído
da casca do salgueiro (Salix alba), utilizada popularmente para combater a
febre e o reumatismo (KAUFFMAN & CHOOLJIAN, 2000; LOMBARDINO & LOWE
III, 2004; KNOX, 2002).
Dessa forma, o uso de plantas, tornou-se importante na área das
ciências farmacêuticas buscando o crescimento e aperfeiçoamento de
métodos e recursos humanos especializados na busca de novas drogas
eficientes. Atualmente, mais de 50% dos medicamentos utilizados são de
origem sintética e cerca de 25% são obtidos de espécies vegetais isolados
diretamente ou produzidos por síntese a partir de um precursor vegetal. Até a
década de 70 as grandes indústrias farmacêuticas não tinham qualquer
projeto de pesquisa na área de produtos naturais. Atualmente pelo menos
metade das 250 maiores companhias farmacêuticas do mundo financiam
programas de pesquisa na área de produtos naturais (YUNES & CALIXTO, 2001;
PINTO, 2002).
Com relação aos produtos naturais, o Brasil é o país com maior número
de espécies de plantas do mundo. Dos diversos ecossistemas brasileiros
(pantanal, floresta amazônica, caatinga, cerrado, mata atlântica, mata de
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3
restinga, manguezal e pampa) estima-se que o país possua aproximadamente
25% dentre as 350 mil presentes no mundo, fornecendo um potencial imenso
para a pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos (SIMÕES et al.,
2000; YUNES &CALIXTO, 2001; PINTO, 2002).
As duas principais vias para identificação de produtos naturais visando
a formulação de novos medicamentos são: o conhecimento de práticas
tradicionais, ou etnofarmacologia e, a triagem aleatória de plantas (SIMÕES
et al., 2000; PINTO, 2002). A abordagem ao estudo de produtos naturais a
partir de seu emprego por tribos indígenas, populações rurais tradicionais,
caboclos e os descendentes de origem africana fornecem informações muito
úteis para a elaboração de estudos farmacológicos, fitoquímicos e
agronômicos, propiciando uma grande economia de tempo e dinheiro. Essa
abordagem etnofarmacológica permite planejar a pesquisa de novos
fármacos a partir de um conhecimento empírico existente. No entanto, para
o desenvolvimento de um novo produto farmacêutico é necessária a
integração de diversas áreas do conhecimento, entre elas podemos citar a
fitoquímica, a botânica, a farmacologia, a agronomia, entre outras (SIMÕES
et al., 2000; YUNES &CALIXTO, 2001).
Nos últimos anos, têm aumentado exponencialmente o interesse por
terapias alternativas e o uso de produtos naturais derivados de plantas pela
população. Isto se justifica porque grande parte da população acredita que os
fitoterápicos apresentam menor número de efeitos colaterais do que os
medicamentos sintéticos, o que nem sempre é verdade do ponto de vista
científico, e por se mostrarem aparentemente eficazes em casos nos quais a
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4
medicina tradicional ainda não alcançou o resultado esperado (CALIXTO,
2000).
Para os países em desenvolvimento, a produção e utilização de
fitoterápicos padronizados com seus benefícios comprovados e de alta
qualidade, podem facilitar o acesso da população a medicamentos seguros,
facilitando o crescimento da fitomedicina nacional e desta forma,
apresentando impacto na economia local (ELIZABETSKY & COSTA-CAMPOS,
1996).
1.2. Melissa officinalis L. subsp. officinalis
O nome latino “Melissa”, que significa bálsamo, tem raízes na palavra
grega “meliteia”, de “meli, melitus”, ou seja, que vem do mel, e se refere à
grande atração que esta planta exerce sobre as abelhas. O termo “officinalis”
foi usado pela primeira vez na época de Linnaeus, e foi mencionado
inicialmente pela farmacopéia francesa em 1733. “Officine” do francês
significa “apotecário, laboratório” (HERODEZ et al., 2003). No Brasil existem
inúmeros nomes populares referentes à Melissa officinalis, tais como cidreira,
melissa e bálsamo, este último derivado do nome popular na língua inglesa
“lemon balm”. Trata-se de um arbusto perene, pertencente à família
Laminaceae, de aproximadamente um metro de altura (Figura 1), que tem
origem na região do Mediterrâneo, leste da Ásia, sudeste da Sibéria e Norte da
África, mas que se difundiu por todo o mundo, com boa adaptação. Sabe-se
também que existem duas subespécies, a officinalis, que tem um cheiro
característico de limão, e a subespécie altíssima, que apresenta um odor
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5
fétido característico (CARNAT et al., 1998; HERODEZ et al.,2003; DASTMALCHI
et al., 2007).
(A) (B)
Figura 1: Folhas (A) e flores (B) da Melissa officinalis.
Autoridades médicas das civilizações grega e romana já prescreviam o
uso tópico de Melissa officinalis para o tratamento de feridas
(ALLAHVERDIYEV et al., 2004). Entretanto, o primeiro relato escrito do uso
medicinal desta planta remonta de aproximadamente 80 a.C. do livro Matéria
Médica. Durante a Idade Média a utilização da Melissa officinalis ganhou
força. Paracelsus (1493 – 1541) escreveu certa vez que esta planta poderia
revivificar completamente um homem e curar todas as desordens do sistema
nervoso. No século XV são também descritos os primeiros relatos do uso da
Melissa officinalis como facilitador da memória (KENNEDY et al., 2003).
Esta planta é conhecida por seus múltiplos usos populares, entre as
afecções tratadas têm-se: dores de cabeça, enxaqueca, dores de dente, dores
de ouvido, flatulência, indigestão, cólica, náuseas, nervosismo, anemia,
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6
vertigens, síncope, asma, bronquite, amenorréia, insuficiência cardíaca,
hipertensão arterial, arritmias, insônia, epilepsia, depressão, psicose,
histeria, desordens estomacais, úlceras, feridas, reumatismos e torcicolos
(CARNAT et al., 1998; HERODEZ et al., 2003; SALAH & JÄGER, 2005;
DASTMALCHI et al., 2007).
Os efeitos cientificamente comprovados são: antioxidante (CARNAT et
al., 1998; RIBEIRO, BERNARDO GIL & ESQUÍVEL, 2001), sedativo (KENNEDY et
al., 2003; MÜLLER & KLEMENT, 2006), antiinflamatório intestinal,
hepatoprotetor, digestivo (SIMMEN et al., 2006; SCHEMANN et al., 2006),
antibacteriano, antifúngico, antiviral (especialmente contra o Herpes
simplex), anti-histamínico (CARNAT et al., 1998; SANDRAEI et al., 2003;
ALLAHVERDIYEV et al., 2004), redutor da motilidade gastrointestinal, redutor
do colesterol (BOLKENT et al., 2005), redutor do estresse e da agitação
(SANTOS-NETO et al., 2006) e eficácia no controle da demência em casos
leves a moderados de Alzheimer (AKLHODZADEH et al., 2003; FERREIRA et al.,
2006).
Entre os inúmeros compostos que foram isolados a partir do extrato de
Melissa officinalis, os mais importantes são os compostos polifenólicos (ácido
rosmarínico e ácido cafeico), óleos essenciais (citral), aldeídos
monoterpenóides, sesquiterpenos, flavonóides (luteolina) e taninos (CARNAT
et al., 1998; HEITZ et al., 2000; KENNEDY et al., 2003; ZIAKOVÁ et al., 2003;
GAZOLA et al., 2004; BOLKENT et al., 2005; SALAH & JÄGER, 2005;
DASTMALCHI et al., 2007).
O ácido rosmarínico é o composto majoritário presente no extrato
etanólico de Melissa officinalis, estima-se que esteja presente em uma
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7
concentração de 2–5 % (CARNAT et al., 1998). Dessa substância já se têm
conhecimento da atividade antiviral e antioxidante. Recente estudo de Iuvone
e colaboradores (2006) demonstrou que o ácido rosmarínico é também capaz
de proteger células PC12 da neurotoxidade promovida pelo peptídeo β-
amilóide, em estudos in vitro. No entanto, foi verificado que o ácido
rosmarínico, nas doses de 1, 2, 4 e 8 mg/kg não exerce qualquer efeito sobre
a memória de ratos no modelo da esquiva inibitória (PEREIRA et al., 2005).
Sabe-se que, ao menos parte das ações da planta ocorre devido às suas
já comprovadas atividades sobre o sistema colinérgico. Dados obtidos por
Perry e colaboradores (1996), Wake e colaboradores (2000) e depois
confirmados por Kennedy e colaboradores (2003) deixam claro que o extrato
tem forte ação ativadora sobre os receptores nicotínicos e muscarínicos do
SNC, além de uma fraca atividade inibitória sobre a acetilcolinesterase.
Em conjunto esses resultados sugerem que o extrato etanólico de
Melissa officinalis pode exercer efeitos sobre a nocicepção - visto o grande
envolvimento do sistema colinérgico com a atividade do extrato - e sobre a
memória, uma vez que o sistema colinérgico está presente na formação de
memória.
1.3. Dor
O corpo humano possui inúmeros mecanismos de controle da
homeostasia, entre eles a dor, que exerce uma função importante, pois seu
papel fisiológico é alertar acerca de possíveis ameaças ao bem estar e a
integridade do organismo, e reter nossa atenção até que a causa de sua
ativação tenha sido identificada e afastada (CHAPMAN & GAVRIN, 1999; WALL,
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8
1999). Desta forma, a dor é um sinal vital clinicamente importante para a
detecção e avaliação de inúmeras doenças, bem como para induzir um
comportamento de precaução e, consequentemente, limitação de danos
(MILLAN, 1999; WOLF, 2000; ALMEIDA et al., 2004). Segundo a Associação
Internacional para o Estudo da Dor, podemos definí-la como “uma experiência
emocional e sensorial desagradável associada à lesão tecidual real ou
potencial ou descrita em termos de tal lesão” (LOESER & MELZACK, 1999). No
entanto, assim como a beleza não é somente inerente a sua imagem visual,
mas depende grandemente de seu observador, também a dor é uma
experiência complexa que não envolve somente a transdução de estímulos
nocivos advindos do ambiente, mas principalmente seu processamento
cognitivo e emocional, realizado pelo Sistema Nervoso Central (SNC) (JULIUS
& BASBAUM, 2001). A partir desta definição, pode-se citar um componente
fisiológico e outro psicológico ou emocional, e a junção de ambos é o que os
humanos entendem por dor. Sendo assim, em animais avalia-se a dor de forma
indireta. Uma vez que não há aparatos que permitam mensurar algum
componente emocional, avalia-se somente o componente fisiológico, ao qual
denomina-se nocicepção (TJØLSEN & HOLE, 1997). A função de alerta da dor
reflete a ativação fásica de sensores denominados nociceptores, os quais são
sensibilizados quando o estímulo é potencialmente perigoso, ou seja,
excedem uma determinada faixa considerada fisiológica (estímulo inócuo)
(BURGESS & PER, 1967; MILLAN, 1999).
Aproximadamente um século atrás, Sherrington propôs a existência do
nociceptor, um neurônio sensorial primário que é ativado por estímulos
capazes de gerar dano tecidual. De acordo com esse modelo, os nociceptores
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têm limiares característicos que os distinguem de outras fibras nervosas
sensoriais. Eles estão amplamente distribuídos na pele, vasos, músculos,
articulações e vísceras e são sensíveis a estímulos térmicos, mecânicos e
químicos (Fig. 2). Existem ainda os nociceptores silenciosos (“silent” ou
“sleeping”), que compreendem uma pequena proporção das fibras aferentes,
que normalmente não são responsivos a estímulos. Entretanto, quando
influenciados por mediadores inflamatórios, ou após a administração de
agentes flogísticos, apresentam atividade espontânea ou tornam-se
sensibilizados e respondem a estímulos sensoriais (JULIUS & BASBAUM, 2001).
A sensibilização dos nociceptores ocorrida, por exemplo, em casos de
mudança de temperatura (estímulo nocivo térmico), diferença osmótica ou
distensão do tecido (estímulo nocivo mecânico), resulta na liberação local de
mediadores químicos tais como bradicinina, prótons, serotonina, histamina,
metabólitos do ácido araquidônico, ATP, adenosina, citocinas, aminoácidos
excitatórios, SP, NO, opióides e acetilcolina, entre outros (JULIUS &
BASBAUM, 2001; GRIFFIS et al., 2006). Estes mediadores interagem com
receptores específicos, levando a uma propagação do sinal nociceptivo graças
a um aumento na permeabilidade da membrana neuronal à cátions e
conseqüente geração do potencial de ação (CARLTON & COGGESHALL, 1998;
PASERO et al., 1999; RAJA et al., 1999;). É importante ressaltar que estes
mediadores podem ser liberados não somente pelos neurônios sensoriais, mas
também por fibras simpáticas e por células não neuronais como plaquetas,
células endoteliais, fibroblastos, células de Schwann e células inflamatórias
(BESSON, 1997).
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10
A estimulação dos nociceptores periféricos faz com que a informação
nociceptiva seja levada por meio das fibras aferentes até o SNC. Os longos
axônios das fibras nociceptivas, que se localizam em nervos periféricos,
estendem-se de seus corpos celulares, reunidos no gânglio da raiz dorsal. Após
emergir de seu corpo celular, o axônio aferente primário bifurca-se para
enviar prolongamentos concomitantemente à medula espinhal e aos tecidos
corporais (MILLAN, 1999). As fibras aferentes primárias são classificadas de
acordo com critérios funcionais e anatômicos, entre eles velocidade de
condução, diâmetro e grau de mielinização (Fig. 2). Os neurônios mais
mielinizados, de maior diâmetro e que apresentam maior velocidade de
condução são as fibras Aβ. Essas fibras respondem ao leve toque ou
movimento e são importantes para informar a posição do corpo no espaço
(propriocepção), elas são encontradas basicamente nos nervos que inervam a
pele e em condições fisiológicas não contribuem para a sensação dolorosa.
Entretanto, a estimulação desse tipo de fibra pode aliviar a sensação
dolorosa, como ocorre quando ativadas por fricção da pele após alguma lesão.
No entanto, ainda existem dois outros tipos de aferentes primários
responsáveis pela transmissão da nocicepção da periferia à medula espinhal.
As fibras de pequeno e médio diâmetro originam a maioria dos nociceptores e
incluem fibras C não mielinizadas e fibras pouco mielinizadas Aδ. Estas fibras
são responsáveis por transmitir o estímulo nociceptivo (PLEUVRY, 1996;
SHELLEY & CROSS, 1994; MILLAN, 1999; JULIUS & BASBAUM, 2001).
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Tipo de fibra
Aα e Aβ
Aδ (I e II)
C
Mielinização
Diâmetro
Velocidade de
condução
Tipo de sinal
Temperatura
Muita Pouca Ausente
10µm
2 - 6µm
0.4 – 1.2µm
30 – 100m/s 1.2 – 30m/s
0.5 – 2m/s
Propriocepção
Toque leve
Nocicepção
(térmica, mecânica e
química)
Nocicepção
(térmica, mecânica e
química)
Não reconhece
Tipo I > 53ºC
Tipo II > 43ºC
> 43ºC
Figura 2: Diferentes tipos de neurônios sensoriais primários, responsáveis pela condução do
sinal nociceptivo da periferia ao SNC. Adaptado a partir de Julius & Basbaum, 2001.
Todas as fibras nociceptivas sensoriais primárias fazem conexões
sinápticas com neurônios secundários na substância cinzenta do corno dorsal
da medula espinhal. Os neurônios do corno dorsal, por sua vez, projetam seus
axônios e transmitem a informação nociceptiva para os centros encefálicos
superiores, que através de neurônios terciários enviam informação ao córtex
cerebral, onde ocorre o processamento que resulta em consciência da dor
(FÜRST, 1999; MILLAN, 1999; ALMEIDA et al., 2004). Os principais tratos que
carream a informação nociceptiva da medula para o encéfalo são o
espinotalâmico, espinorreticular, espinomesencefálico e espinohipotalâmico
(CRAIG & DOSTROVSKY, 2000).
Nesse sentido, o organismo também possui mecanismos intrínsecos de
controle da dor, pois após a estimulação dos diferentes núcleos do tálamo, os
sinais são transmitidos para diversas áreas do córtex sensorial somático,
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substância cinzenta periaquedutal, hipotálamo, amígdala e cerebelo. Um
circuito modulador endógeno descendente conectando a substância cinzenta
periaquedutal e o corno dorsal da medula é responsável pela ativação de
conexões que promovem facilitação ou inibição da nocicepção. Entretanto,
esse sistema não age simplesmente facilitando ou inibindo, uma vez que cada
lesão induz um tipo diferente de resposta devido à plasticidade do sistema,
exercendo este controle principalmente nas dores crônicas. Os sistemas de
neurotransmissão mais estudados nesta conexão são: glutamatérgico,
GABAérgico, neuropeptidérgico, serotoninérgico, opioidérgico e adrenérgico ,
entre outros (MILLAN, 2002; REN & DUBNER, 2002; VANEGAS & SCHAIBLE,
2004).
Sabe-se que os aminoácidos excitatórios, principalmente o glutamato,
que é encontrado nas fibras C, apresentam um papel fundamental na
transmissão da informação nociceptiva da medula espinhal até os centros
superiores (MILLAN, 1999; BLEAKMAN et al., 2006). O glutamato exerce suas
ações através de dois grupos distintos de receptores, um formado por
receptores acoplados a canais iônicos, chamados ionotrópicos e outro formado
por receptores acoplados à proteína G, denominados metabotrópicos. Os
receptores ionotrópicos glutamatérgicos compreendem os receptores N-metil-
D-aspartato (NMDA), cainato e α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
isoxazoleproprionato (AMPA), que são canais iônicos permeáveis ao cálcio,
sódio e potássio (DICKESON, 1997). Dados demonstram que os receptores
NMDA são formados por diferentes subunidades e estão amplamente
distribuídos no SNC (MARVIZON et al., 2002; BLEAKMAN et al., 2006). Os
receptores do tipo cainato, assim como os NMDA, encontram-se amplamente
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distribuídos no SNC, incluindo corno dorsal da medula, principalmente nas
fibras de pequeno e médio calibre, podendo modular a liberação de GABA em
neurônios inibitórios (PALECEK et al., 2004; BLEAKMAN et al., 2006). Já o
receptor AMPA é o primeiro a ser ativado em qualquer fenda sináptica frente
à liberação de glutamato, decorrendo dele a ativação de outros receptores,
como, por exemplo, o NMDA, que só se torna ativo após a ativação de AMPA,
que promove a remoção do íon magnésio que obstrui seu poro (MILLAN, 2001).
Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (
m
GluR) dividem-se em oito
subtipos classificados em três subgrupos de acordo com sua homologia e
mecanismo de transdução de sinal: o grupo I (
m
GluR 1 e 5) promove ativação
da via da fosfolipase C, o grupo II (
m
GluR 2 e 3) e o grupo III (
m
GluR 4, 6, 7 e 8)
estão acoplados negativamente à adenilato ciclase (OZAWA et al., 1998;
GURPREET & STEPHEN, 2006).
Outro mediador nociceptivo é o óxido nítrico (NO), um importante
mensageiro biológico que é sintetizado a partir da L-arginina pela sintase do
óxido nítrico (NOS). Existem três isoformas de NOS: neuronal (nNOS),
endotelial (eNOS) e induzível (iNOS), sendo as duas primeiras constitutivas e a
terceira induzível por diversas formas de estímulos (principalmente
inflamatórios) e capaz de produzir quantidades maiores de NO quando
comparada às demais isoformas. Contrariamente às NOS constitutivas, a iNOS
não depende do influxo intracelular de cálcio. O NO exerce seus efeitos
intracelulares por ativar a guanilato ciclase solúvel, que por sua vez
converterá GTP em GMPc, e este como segundo mensageiro poderá ativar
PKG, canais iônicos e fosfodiesterases. Ozek e colaboradores (2003) relatam
que o NO é produzido pós-sinapticapmente à ativação de aminoácidos
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14
excitatórios, e que inibidores da NOS são capazes de inibir indiretamente
receptores NMDA. Além disso, tem-se relatado regulação recíproca entre NO
e glutamato, uma vez que a nNOS é estimulada pela ativação de receptores
NMDA que permitem o influxo de cálcio (MOORE et al., 1991; GARTHWAITE &
BOULTON, 1995).
Outro sistema envolvido na inibição da nocicepção é o opióide, ele age
por duas vias principais, central e periférica. Na via central os agonistas
opióides, endógenos ou não, atuam sobre a substância cinzenta
periaquedutal, bulbo rostroventromedial e corno dorsal da medula espinhal,
ativando a via de controle descendente da dor, em parte, por ativar os canais
de potássio e inibir canais de cálcio dependentes de voltagem (MILLAN, 1999).
Perifericamente, tem se proposto que agonistas µ – opióides inibem a ativação
da adenilato ciclase em neurônios aferentes primários, enquanto agonistas de
receptores δ e κ opióides inibem a secreção de substâncias pró-inflamatórias
por neurônios simpáticos (KIM et al., 2006).
Pode-se citar ainda outro sistema, o sistema colinérgico, visto que está
bem estabelecido que agonistas colinérgicos e inibidores da
acetilcolinesterase, os chamados colinomiméticos, são eficazes em causar
antinocicepção em diversos modelos animais, o que sugere potencial
terapêutico para esses fármacos. Essas substâncias agiriam sobre receptores
nicotínicos (canais iônicos) e muscarínicos (acoplados a proteína G), os quais
podem exercer ação central por ativar a substância cinzenta periaquedutal, e
assim ativar a via de controle descendente da dor. Tanto na periferia, quanto
no SNC sabe-se também que agonistas colinérgicos são capazes de estimular a
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secreção de GABA, e desta forma promover antinocicepção (JONES & DUNLOP,
2007).
Dentre os transtornos que comumente acometem pacientes que
apresentam dor associada a quadros de hipersensibilidade (hipernocicepção)
estão a hiperalgesia (resposta nociceptiva aumentada à estímulos nocivos) e a
alodínia (resposta nociceptiva à estímulos inócuos) (MILLAN, 1999). As quais
podem ser causadas por anormalidades nestes sistemas de neurotrasmissores
acima citados.
Em termos de duração, a sensação dolorosa pode ser transitória, aguda
ou crônica. Quando transitória, a ativação de nociceptores é feita na ausência
de qualquer dano tecidual. Em contrapartida, na dor aguda geralmente ocorre
lesão e ativação de nociceptores no sítio lesionado. Por sua vez, a dor
crônica, na maioria das vezes, é gerada por lesão ou doença, podendo ser
perpetuada por fatores que não os causadores (LOESER & MELZACK, 1999;
WOOLF & MANNION, 1999; ZIMERMANN, 2001; MENDELL & SAHENK, 2003).
Quanto à sua origem, a dor pode ser classificada em: nociceptiva,
neurogênica, neuropática, psicogênica e inflamatória. A dor nociceptiva deve-
se à estimulação excessiva dos nociceptores localizados na pele, vísceras e
outros tecidos. A dor neurogênica reflete dano de tecido neuronal na periferia
ou no SNC. Quando há disfunção ou dano de um nervo ou grupo de nervos,
resultando em quadro álgico, denomina-se dor neuropática. No entanto,
quando a dor não é proveniente de fonte somática identificável e pode
refletir fatores psicológicos, diz-se dor psicogênica (MILLAN, 1999). Por fim,
na dor inflamatória, ocorre significativo dano tecidual, com dor geralmente
mais persistente e acompanhada de inflamação. Nestas circunstâncias,
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16
geralmente ocorre quadro de hipersensibilidade causado pela ativação e
sensibilização dos nociceptores periféricos por mediadores químicos,
produzidos pela lesão tecidual e pela inflamação (DRAY, 1997).
1.3.1. Dor inflamatória
Quando ocorre lesão tecidual em nosso organismo, são acionados
mecanismos de controle com o propósito de limitar os danos e auxiliar a
regeneração. Estes mecanismos fazem parte da resposta inflamatória,
caracterizada por quatro sinais cardinais: dor, rubor, calor, edema e, em
alguns casos, culminando com perda de função (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006).
A inflamação envolve a participação de diversos sistemas, mediadores e
células especializadas. Entre os principais sistemas estão o sistema do
complemento, de coagulação e o sistema cinina-calicreína. Dentre as células
envolvidas podem ser citadas as células do sistema imune, como linfócitos e
mastócitos, e principalmente os macrófagos, que estão envolvidos na
liberação de uma gama de mediadores e radicais livres que contribuirão para
o processo inflamatório (HAVSTEEN, 2002). Entre estes mediadores liberados
pelos macrófagos merecem destaque as citocinas, que entre outras ações
induzem a liberação de enzimas envolvidas no processo inflamatório, tais
como as COXs (SCHMID-SCHÖBEIN, 2006).
A formação de prostanóides pelas COXs é um dos responsáveis pela
sensação de dor (MASFERRER et al., 1994). Além das prostaglandinas, outros
mediadores inflamatórios contribuem para a transmissão da nocicepção, bem
como para a inflamação e o processo de recuperação. Dentre eles pode-se
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17
citar: histamina, serotonina, cininas, citocinas, neuropeptídeos, aminoácidos
excitatórios, prótons, neurotrofinas, ATP, NO e opióides, entre outros;
oriundos do sangue, de células do tecido lesado, células adjacentes ou de
células inflamatórias (JULIUS & BASBAUM, 2001; GRIFFIS et al., 2006).
No entanto, em alguns casos, o processo inflamatório deixa de ser uma
defesa benéfica e passa a ser um processo patológico. Isso decorre de
alterações fisiológicas que começam pela lesão inicial, mas que resultam em
eventos que perpetuam o quadro inflamatório, quando o estímulo é
persistente. Nestas condições, a inflamação perde sua característica de
proteção e torna-se doença. A grande preocupação na busca dos mecanismos
que envolvem a inflamação é devido ao seu envolvimento em doenças
crônicas, incluindo câncer, diabetes, doenças neurodegenerativas,
cardiovasculares e reumatológicas (GARCIA , 2005).
1.3.2. Dor neuropática
Diferentemente da dor aguda, a dor neuropática não tem função
biológica protetora. Mais que um sintoma, a dor neuropática é a própria
doença, pois a sensação de dor é incapacitante e interminável, podendo durar
inclusive por décadas após a lesão inicial. Pode ser iniciada por múltiplos
fatores, tais como: dieta inadequada (excesso ou falta de vitamina B
12
, por
exemplo), diabetes mellitus (tipo I ou tipo II), inflamações crônicas, quadros
infecciosos (como na neuralgia pós herpética), amputações, compressões
nervosas, alterações no sistema nervoso autônomo, entre outras. Desta forma,
a dor neuropática foi definida pela Associação Internacional para o Estudo da
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18
Dor como “dor iniciada ou causada por lesão primária ou disfunção do sistema
nervoso” (ZIMMERMANN, 2001; MENDELL & SAHENK, 2003).
Os principais sintomas clínicos são: hiperalgesia, alodínia e
paradoxalmente falta de sensibilidade na área afetada. Devido,
principalmente, às alterações ocorridas na medula espinhal (CODERRE et al.,
1993; JI & WOOLF, 2001).
Os mecanismos exatos da instalação do quadro de dor neuropática
ainda não são inteiramente compreendidos. Contudo, sugere-se que o
desenvolvimento da dor crônica após lesão do nervo ocorra através de
alterações na medula espinhal, como excitabilidade aumentada, inibição
diminuída, reestruturação organizacional das células e eventualmente,
mudança no fenótipo. Essas mudanças ocorrem principalmente devido a uma
estimulação excessiva dos nociceptores, uma vez que eles estão com um
limiar de ativação mais baixo (MacFARLANE et al., 1997; COUTAUX et al.,
2005).
A excitabilidade aumentada ocorre em função de despolarizações
repetitivas das fibras não mielinizadas do tipo C, o que resulta de prolongada
descarga no corno dorsal da medula espinhal. Esse fenômeno é conhecido
como “Wind up” (DAVIES & LODGE, 1987; HERRERO et al., 2000) e significa
um aumento progressivo no número de potenciais de ação por um estímulo
que ocorre em neurônios do corno dorsal. Esses episódios repetitivos de “wind
up” podem levar a potenciação a longo prazo (long term potentiation, LTP), a
qual envolve um aumento prolongado na transmissão sináptica (POCKETT,
1995). Esses fenômenos irão induzir inúmeras alterações em receptores
(principalmente os de glutamato e taquicininas) e segundos mensageiros
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19
celulares (cuja principal envolvida é a PKC) (OTSUKA & YOSHIOKA, 1993;
HERRERO et al., 2000).
Quanto à diminuição da neurotransmissão inibitória como mecanismo
etiológico da dor neuropática, sabe-se que está associada principalmente, a
anormalidades na neurotransmissão GABAérgica e a redução da eficácia dos
opióides endógenos (ZHANG et al., 1998; WOOLF, 2004).
Além dos mecanismos acima descritos, outros que merecem ser citados
são: inibição de transcrição e liberação de citocinas, sintase do óxido nítrico e
enzimas envolvidas na síntese das prostaglandinas, além da expansão das
fibras Aβ, que invadem a lâmina II do corno dorsal da medula, tornando essas
fibras pró-nociceptivas (RAMER et al., 1999; XIAO et al., 2002).
O manejo clínico da dor neuropática é complexo, uma vez que ela se
mostra refratária à maioria dos medicamentos analgésicos em uso. A terapia
utilizada atualmente consta de antidepressivos tricíclicos, inibidores da
recaptação da serotonina, anticonvulsivantes e capsaicina de uso tópico,
entre outros (SAWYMOK, 2003; UEDA, 2006). Desta maneira, fazem-se
necessárias pesquisas para desenvolvimento de novos fármacos para o
tratamento desta condição patológica.
1.4. Memória
Memória é a capacidade de reter, recuperar, armazenar e evocar
informações disponíveis no sistema nervoso central, desta forma podemos
dizer que é a retenção da informação aprendida (KANDELL, SCHWARTZ &
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20
JESSELL, 2000; BEAR, CONNORS & PARADISO, 2002). A palavra memória deriva
do latim e significa período alcançado pela lembrança.
Na Grécia antiga (século VIII a.C.) Hesíodo declarou que a memória era
a fonte de todas as artes, a Musa das Musas. Mais à frente, já no século IV a.C.
Sócrates compara a formação da memória à impressões em blocos de cera, e
seu discípulo, Aristóteles, ressalta a importância da memória e sua relação
com os processos de aprendizado. O primeiro a tentar localizar a memória no
cérebro foi Galeno (200 d.C.), que postulou que o quarto ventrículo era
associado ao ato de recordar enquanto o terceiro ventrículo estava
relacionado ao aprendizado. Descartes, no século XVI ainda defendia a
localização de sítios específicos que continham a memória (ZIGMOND et al.,
1999; KANDELL, SCHWARTZ & JESSELL, 2000).
Em 1894, Santiago Ramón y Cajal postulou em um de seus livros que a
memória deveria ser formada pelo reforço de conexões entre os neurônios já
existentes, que aumentavam a efetividade de sua comunicação, uma vez que
percebeu que o número de neurônios de um cérebro adulto não variava com o
tempo (KANDELL, SCHWARTZ & JESSELL, 2000).
Na década de 1940 um discípulo de Charles Sherrington, chamado
Wilder Penfield, conseguiu através de estimulação elétrica em pacientes
submetidos à neurocirurgia para tratamento de epilepsia, identificar regiões
que quando estimuladas davam origem ao que ele chamou de resposta
experiencial, onde o paciente descrevia uma lembrança correspondente a
uma experiência vivida (SANTI & GRODZINSKI, 2007).
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21
Em 1949, Donald Hebb dividiu a memória em memória de curta duração
e de longa duração, sendo uma dependente de circuitos reverberativos e
outra de mudanças estruturais (COOPER, 2005).
Hoje se sabe que são inúmeras estruturas cerebrais relacionadas à
memória, e não há um lócus único envolvido na aquisição, armazenamento e
evocação das diversas informações adquiridas por aprendizagem, tais como:
hipocampo, amígdala, córtex entorrinal, giro parahipocampal, fórnix, corpos
mamilares, giro do cíngulo, entre outros (KANDELL, SCHWARTZ & JESSELL,
2000; BEAR, CONNORS & PARADISO, 2002).
De maneira simplificada, a memória pode ser classificada em
Declarativa e não Declarativa. A memória declarativa está relacionada à
lembrança de fatos e eventos e à habilidade de verbalizá-los; está
anatomicamente relacionada ao lobo temporal medial e ao diencéfalo. Já a
memória não declarativa está relacionada a respostas emocionais e memórias
de procedimentos e relaciona-se ao núcleo estriado, ao cerebelo e à amígdala
(KANDELL, SCHWARTZ & JESSELL, 2000; BEAR, CONNORS & PARADISO, 2002).
A memória declarativa pode ser classificada em:
Memória imediata ou de trabalho: dura no máximo alguns segundos e é
usada para fatos que são esquecidos completamente, é resultante de
um influxo de íons potássio. Um exemplo é a capacidade de repetir
imediatamente um número de telefone que é dito e esquecer logo em
seguida. A qual é dependente do córtex pré-frontal.
Memória de curto prazo: tem duração de até algumas horas. Neste
caso, há mudanças estruturais em proteínas pré-existentes. Um
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22
exemplo deste tipo de memória é a capacidade de se recordar do
cardápio do almoço do dia anterior.
Memória de longo prazo: dura de meses a anos e para sua formação
exige a síntese de novas proteínas e translocações nas já existentes.
Um exemplo é o aprendizado de uma nova língua.
A formação da memória de longo prazo pode passar ou não pelo estágio
de memória de curto prazo, como é o caso de memórias da infância. Por outro
lado, não necessariamente toda memória de curto prazo irá tornar-se uma
memória de longo prazo, por exemplo, é fácil lembrar qual o cardápio do
jantar do dia anterior, mas dificilmente alguém lembrará do cardápio do
jantar de uma semana atrás (Figura 3). À conversão de uma informação em
memória de longa duração dá-se o nome de consolidação (BEAR, CONNORS &
PARADISO, 2002; IZQUIERDO et al., 2002; CAMMAROTA et al., 2004b).
(A) Informação sensorial
(B) Informação sensorial
Memória de
Curta duração
Memória de
Curta duração
Memória de
Longa duração
Memória de
Longa duração
Consolidação
Consolidação
Tempo
Figura 3: A informação sensorial pode ser armazenada temporariamente como memória de
curta duração, mas a armazenagem permanente depende de consolidação. (A) A informação
pode ser consolidada a partir da memória de curta duração. (B) Alternativamente, o
processamento da informação necessária para a consolidação pode ocorrer separadamente da
memória de curto prazo. Adaptado de BEAR, CONNORS & PARADISO, 2002.
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23
Pouco se sabia, no entanto, sobre os mecanismos moleculares
envolvidos na memória até que Eric Kandell, em 1965, publicou seus estudos
com a Aplysia californica e os mecanismos de potenciação pós-sináptica. No
entanto, a descoberta do que viria a ser colocado como o principal mecanismo
molecular da memória é conferida a Terge Lømo, que em 1966 publicou um
estudo mostrando a potenciação pós-sináptica, chamada por ele de
potenciação a longo prazo (LTP), em hipocampos de mamíferos (coelhos)
(BEAR, CONNORS & PARADISO, 2002; LØMO, 2003).
O LTP é um aumento da força de sinapses químicas que pode durar de
minutos até anos, sendo simplesmente o resultado de uma série de pequenos
estímulos elétricos de alta freqüência. Sua ocorrência contribui para a
plasticidade sináptica, provendo bases para um sistema nervoso altamente
adaptável, fundamental para o aprendizado e a memória (JI et al., 2003;
HAWKINS, KANDELL & BAILEY, 2006; WANG, HU & TSIEN, 2006).
As quatro propriedades fundamentais do LTP são: indução rápida,
especificidade, associabilidade e cooperatividade. Sua indução é rápida, pois
pode ser iniciado por um ou mais breves estímulos tetanizantes em uma célula
pré-sináptica. Especifica porque uma vez induzido em uma sinapse o LTP não
é arbitrariamente conduzido a outras sinapses adjacentes. A associabilidade
refere-se à observação de que a estimulação fraca de uma única via é
insuficiente para gerar LTP, no entanto, a estimulação simultânea e forte de
outra via pode gerar LTP em ambas. E por fim a cooperatividade que refere-se
à capacidade dos neurônios pós-sinápticos de gerarem LTP frente à
estimulação fraca, sem efeito per se, de inúmeras vias que convergem para
ele (WANG, HU & TSIEN, 2006).
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24
O mecanismo se dá principalmente pela via glutamatérgica. Uma vez
que o estímulo tetanizante faz com que o glutamato seja liberado na fenda
sináptica, ativando primeiramente os receptores AMPA. A despolarização dos
receptores AMPA expulsa o Mg
+2
do poro do canal NMDA, este por sua vez
permite a entrada de grandes quantidades de Ca
+2
, o aumento da
concentração intracelular de Ca
+2
ativará inúmeras quinases (além da NOS). A
ativação dessas quinases levará a fosforilação de alguns receptores AMPA
citoplasmáticos que se externalizam, aumentando ainda mais a resposta ao
glutamato liberado na fenda (HAWKINS, KANDELL & BAILEY, 2006; WANG, HU
& TSIEN, 2006).
Para fins didáticos os mecanismos que envolvem os LTP podem ser
divididos em LTP precoce e LTP tardio (SWEATT, 1999), ou ainda, segundo
uma minoria, em LTP-1, LTP-2 e LTP-3 (RAYMOND, 2007).
Segundo Sweatt (1999) a fase precoce é dependente de NMDA e
independente de síntese protéica (Figura 4), porém marcada por grande
atividade de proteínas quinases, como proteína quinase C (PKC), proteína
quinase ativada por mitógenos (MAPK), proteína quinase dependente de
cálcio/calmodulina II (CaMKII) e proteína quinase A (PKA). Essas quinases
devem fosforilar proteínas já existentes na célula, alterando o seu estado
funcional.
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25
Ativação de
Receptores NMDA
Aumento da
[Ca
+2
]
i
Ativação da
CaMKII
Fosforilação do
Receptor AMPA
Inserção do
Receptor AMPA
Aumento da
Condutância AMPA
Figura 4: A fase precoce do LTP independe de síntese de proteínas. Adaptado de LYNCH,
2004. Abreviaturas: [Ca
+2
]
i
– concentração intracelular de íons cálcio; CaMKII – cálcio-
calmodulina quinase II.
A diferenciação para a fase tardia se dá pela presença de síntese
protéica, com participação preponderante da proteína quinase regulada por
sinal extracelular (ERK) (LYNCH, 2004; WANG, HU & TSIEN, 2006).
O LTP-1 é equivalente à fase precoce, sem síntese de proteínas,
desenvolvendo seu efeito somente através da translocação das proteínas
existentes. O LTP-2 é uma fase intermediária da fase tardia que requer
síntese protéica, mas é independente de transcrição gênica. E finalmente, o
LTP-3 representa o componente mais duradouro da fase tardia e é marcado
por transcrição gênica (RAYMOND, 2007).
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26
mGluRNMDAR AMPAR
PI-3K PKA PKC CaMKII
ERK
Proteínas
sinalizadoras
Proteínas do
citoesqueleto
Proteínas
nucleares
Transcrição gênica
Síntese protéica
Mudanças morfológicas
Figura 5: Todas as fases do LTP se comunicam através da via da Quinase regulada por sinal
extracelular(ERK). Adaptado de LYNCH, 2004. Abreviaturas: NMDAR – repceptor NMDA; AMPAR
– receptor AMPA; mGluR – receptor glutamatérgico metabotrópico; PI-3K – Fosfolipase- 3-
quinase; PKA – Proteína quinase A; PKC – proteína quinase C; CaMKII – Cálcio-calmodulina
quinase II.
Este sistema bastante complexo pode ser modulado por um grande
número de enzimas e receptores, alguns dos mais importantes estão citados
na Tabela 1:
Tabela 1: Principais vias envolvidas na modulação do LTP.
Modulador Alvo
NOS (Sintase do óxido nítrico) Guanilyl ciclase, PKG, NMDAR, Ryr
mGluR Amplificação de PKC, MAPK
Receptores colinérgicos Amplificação da CaMKII, [Ca
+2
]
i
Adaptada a partir de dados obtidos de BORTOLOTTO et al., 2005; EDWARDS & RICKARD, 2006;
ODDO & LA FERLA, 2006; KIM et al., 2007.
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27
É sabido que a acetilcolina é um neurotransmissor central envolvido em
muitas funções cognitivas, inclusive o aprendizado e a memória. Neurônios
colinérgicos frequentemente inervam os terminais pré-sinápticos que
modulam a atividade de vários sistemas no encéfalo. No hipocampo, por
exemplo, liberação pré-sináptica de acetilcolina pode regular a atividade de
neurônios glutamatérgicos e GABAérgicos. Conseqüentemente, perturbações
do sistema colinérgico podem levar à disfunções em outros sistemas de
neurotransmissores e nas funções por eles desempenhadas (GOLD, 2003;
MIRANDA et al., 2003).
Já é bem estabelecido que o NO tem um papel importante para a
consolidação da memória. No entanto, até pouco tempo pensava-se que sua
ação dava-se exclusivamente pela amplificação da guanilato ciclase no
neurônio pré-sináptico, vital para a manutenção da potenciação à longo
prazo. Porém alguns pesquisadores têm demonstrado que a ação do NO sobre
os receptores de Rianodina e outros canais iônicos também tem fundamental
importância sobre a memória (EDWARDS & RICKARD, 2007).
Sabe-se também que inúmeros fármacos analgésicos têm efeitos
deletérios sobre a memória uma vez que antagonizam sistemas que estão
envolvidos nos dois quadros, tais como os sistemas glutamatérgico e
colinérgico, além de bloqueadores da via da L-arginina-Óxido Nítrico
(BORTOLOTTO et al., 2005; ODDO & LA FERLA, 2006; EDWARDS & RICKART,
2007). Desta forma, a pesquisa de novos agentes analgésicos que não afetem
a memória torna-se imperativa, uma vez que muitos pacientes que fazem uso
crônico de medicação analgésica são idosos e por isso tornam-se mais
propensos a diversos tipos de demências, entre elas o Alzheimer.
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28
A Doença de Alzheimer é uma demência que afeta grande parte da
população acima de 85 anos, cujos principais sinais são emaranhados
neurofibrilares e placas de deposição de pepetídeo β- amilóide no sistema
nervoso central além de intensa perda neuronal, principalmente de neurônios
colinérgicos. Como resultado os principais sintomas são perda da memória
recente e agitação psicomotora. O tratamento atualmente é feito à base de
inibidores da acetilcolinesterase e da memantina (antagonista NMDA), porém,
é pouco efetivo e apresenta muitos efeitos colaterais (BEERI et al., 2005;
ODDO & LA FERLA, 2006).
O EE de Melissa officinalis mostra-se um potencial fitoterápico para o
tratamento para pessoas que apresentam Alzheimer, tendo em vista que
inúmeros estudos demonstram sua ação sobre neurônios colinérgicos. Esta
ação pode ter um efeito facilitador sobre a memória, além de seu já
conhecido efeito sedativo que pode beneficiar os pacientes portadores desta
doença por diminuir a agitação psicomotora. Além disso, seu provável efeito
analgésico beneficiaria esta população que como já dito anteriormente, são
pessoas que fazem grande uso deste tipo de medicação.
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar a ação antinociceptiva, antiinflamatória e facilitadora da
memória do extrato etanólico (EE) obtido de Melissa officinalis em modelos
animais que utilizam estímulos químicos, térmico e mecânico em
camundongos e ratos, assim como avaliar os possíveis mecanismos de ação
envolvidos nestas atividades. Uma vez que seria de grande valia um fármaco
que facilite a memória e tenha ação antinociceptiva, uma vez que a maioria
dos analgésicos em uso tem efeito inibitório sobre a memória, uma vez que,
quase sempre, antagonizam o sistema glutamatérgico, em especial receptores
NMDA.
2.2. Objetivos Específicos
1. Avaliar a ação antinociceptiva do EE de Melissa officinalis em modelos
químicos de nocicepção induzida pelo glutamato, formalina e ácido acético
em camundongos;
2. Analisar o possível efeito do EE de Melissa officinalis sobre a hiperalgesia
térmica e mecânica, em ratos, nos modelos descritos por Hargreaves e
Randall e Sellito, respectivamente;
3. Avaliar o efeito do EE de Melissa officinalis sobre alodínia mecânica no
modelo de neuropatia induzida pela ligadura parcial do nervo ciático em
camundongos;
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30
4. Avaliar o efeito antinflamatório do EE de Melissa officinalis sobre o modelo
de colite induzida por ácido acético;
5. Avaliar o efeito antinociceptivo do ácido rosmarínico, presente em grande
quantidade no EE de Melissa officinalis, sobre o modelo de nocicepção
induzida pelo glutamato;
6. Investigar a influência dos sistemas: glutamatérgico, opióide, colinérgico e
a via L-arginina-óxido nítrico na ação antinociceptiva do EE de Melissa
officinalis no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato em
camundongos;
7. Investigar a ação antinociceptiva do EE de Melissa officialis sobre a
nocicepção induzida por injeção i.t. TNF-α e IL-1β;
8. Analisar o efeito do EE de Melissa officinalis sobre a memória em ratos, no
modelo de esquiva inibitória.
9. Investigar a influência dos sistemas: glutamatérgico, colinérgico e da via L-
arginina-óxido nítrico na ação facilitadora da memória do EE de Melissa
officinalis no modelo de esquiva inibitória.
10. Verificar o efeito do EE de Melissa officinalis sobre o desempenho e
atividade locomotora de camundongos e ratos no teste do campo aberto.
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31
3. MATERIAS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados nos experimentos camundongos do tipo Swiss de
ambos os sexos, pesando entre 25-35g e ratos Wistar de ambos os sexos
pesando entre 250–300 g. Os animais foram aclimatizados, sob o ciclo claro e
escuro (12 h claro/12 h escuro, claro as 7:00 h), com temperatura controlada
(22 ± 2ºC) e livre acesso à água e comida. Os camundongos (machos e fêmeas)
foram homogeneamente distribuídos entre os grupos. Todos os animais
utilizados foram aclimatizados no laboratório pelo menos uma hora antes dos
testes, realizados na fase clara do ciclo. Os experimentos foram realizados
após a aprovação do protocolo (n: 23080.0011700/2005-03/UFSC) pela
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa
Catarina (UFSC), seguindo as normas éticas para o cuidado dos animais de
laboratório e investigação científica da dor em animais (ZIMMERMANN, 1983).
O número de animais e a intensidade dos estímulos utilizados foram os
mínimos necessários para demonstrar de forma consistente o efeito dos
tratamentos.
3.2. Material botânico
As folhas de Melissa officinalis foram cedidas pela Centroflora
(Ourinhos, Brasil). O extrato etanólico foi preparado por maceração, usando
etanol 95%. As folhas secas de Melissa officinalis foram separadas dos talos e
deixadas para secar livremente ao sol. Após, as folhas foram cortadas em
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32
pequenos pedaços e colocadas em um recipiente juntamente
com etanol (95%) na quantidade suficiente para cobrir as folhas, a mistura foi
tampada e mantida por 7 dias. Decorrido o período de maceração o extrato
foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório até a secura, onde obteve-
se o extrato etanólico que foi armazenado no refrigerador (4ºC).
3.3. Drogas
As seguintes substâncias foram utilizadas: formalina e cloridrato de
morfina (Merck, Darmstadt, Alemanha); capsaicina, ácido glutâmico,
cloridrato de naloxona, N
ω
-nitro-L-arginina (L-NOARG), Interleucina-1β (IL-
1β), Fator de necrose tumoral α (TNF-α), cloridrato de L-arginina, cloridrato
de D-arginina, Prostaglandina E
2
(PGE
2
), Bradicinina, Sulfato de atropina,
Cloridrato de Pilocarpina, (5S,10R)-(+)-5-Metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]
(MK-801), ácido rosmarínico (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA); ácido
(±)-1-aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico (trans-ACPD), ácido -amino-
3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionico (AMPA), ácido N-metil-D-aspártico
(NMDA), ácido caínico (cainato), (PMA) forbol 12-miristato 13-acetato,
Hidrocloreto de nicotina, Cloridrato de Mecaminalamina (Tocris Cookson Inc.,
Ellisville, USA). O extrato etanólico foi obtido das folhas da Melissa officinalis
no Departamento de Farmacologia da Universidade de Brasília (UnB), como
descrito acima. As drogas foram dissolvidas em solução 0,9% de NaCl, com
exceção da capsaicina, que foi dissolvida em 5% etanol, 10% tween 80 e 85%
de salina e do EE de Melissa officinalis que foi dissolvido em 10% de tween 80
e 90% de salina. No entanto, a concentração final de etanol não excedeu 5%,
não causando assim quaisquer efeitos “per se”.
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33
3.4. Nocicepção induzida pelo ácido acético
Primeiramente verificou-se o efeito do EE de Melissa officinalis no teste
de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Este teste é descrito
como um modelo típico de nocicepção inflamatória visceral e permite avaliar a
atividade antinociceptiva de substâncias que atuam tanto em nível central
quanto periférico (KOSTER et al., 1959; VINEGAR et al., 1979; TJLSEN &
HOLE, 1997). A resposta nociceptiva foi induzida pela injeção intraperitoneal de
450 µl de ácido acético (0,6%). As contorções abdominais consistem na
contração da musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das
patas posteriores, de acordo com o método descrito anteriormente (KOSTER et
al., 1959; SANTOS et al., 1999). Grupos de animais foram pré–tratados, pela via
oral (v.o.), com EE de Melissa officinalis (10–1000 mg/kg) 60 min antes da
realização dos experimentos; os grupos controles foram tratados com veículo
(10 ml/kg). Após a injeção do ácido acético os camundongos foram colocados
individualmente em funis de vidro e o número de contorções abdominais foi
cumulativamente quantificado durante um período de 20 min. A atividade
antinociceptiva foi determinada pela inibição do número das contorções
abdominais observadas nos animais pré-tratados sistemicamente com EE de
Melissa officinalis.
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34
3.5. Nocicepção induzida pelo glutamato
O sistema glutamatérgico é um dos mais importantes sistemas
envolvidos na modulação da nocicepção e da antinocicepção, tanto em nível
periférico quanto central (FUNDYTUS, 2001; RIEDEL & NEECK, 2001). Os
animais utilizados foram individualmente ambientados em funis de vidro. Um
volume de 20 µL de glutamato tamponado (20 µmol/pata) foi injetado
intraplantarmente (i.pl.) na superfície ventral da pata direita do animal, que
foi observado por 15 min logo após a injeção. O tempo que os animais
permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada foi cronometrado e
considerado como indicativo de nocicepção. Os animais foram tratados com o
EE de Melissa officinalis (10 – 1000 mg/kg) ou veículo (10 mL/kg) pela via oral
(v.o.) 1 h antes da injeção de glutamato.
3.6. Nocicepção induzida pela formalina
O modelo de nocicepção induzida pela formalina permite avaliar dois
tipos distintos de nocicepção: a de origem neurogênica (estimulação direta
das fibras nociceptivas) e a de origem inflamatória (caracterizada pela
liberação de mediadores inflamatórios) (HUNSKAAR & HOLE, 1987, TJØLSEN et
al., 1992). A metodologia utilizada foi essencialmente a mesma descrita por
Santos e Calixto (1997). Os animais utilizados foram individualmente
ambientados em funis de vidro. Um volume de 20 µL de solução de formalina
2,5% (0,92% formaldeído) foi injetado intraplantarmente (i.pl.) na superfície
ventral da pata direita do animal, sendo individualmente observado o tempo
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35
que os animais permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada de 0-5
min (fase neurogênica) e de 15-30 min (fase inflamatória) após a injeção da
formalina. Os animais receberam o EE de Melissa officinalis (30-1000 mg/kg,
v.o.) ou veículo (10 mL/kg, v.o.) 1 h antes da administração da formalina.
3.7. Neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático
O possível efeito do EE de Melissa officinalis sobre a dor neuropática
foi avaliado no modelo de neuropatia induzida pela constrição parcial do
nervo ciático em camundongos. Os animais foram previamente anestesiados
com hidrato de cloral (7%, i.p.) e após a verificação de que se obteve o efeito
anestésico, foi realizada incisão no membro inferior direito para a exposição
do nervo ciático. O nervo em questão foi dissecado das veias e dos tecidos
aderentes de acordo com o método descrito para ratos (SELTZER et al., 1990)
e adaptado para camundongos (MALMBERG & BASBAUM, 1998). Após o
procedimento descrito, aproximadamente 1/2 a 2/3 do nervo ciático foi
amarrado com o auxilio do fio de sutura (Ethicon, Cardiovascular, 7.0 Prolone)
sendo também utilizado para suturar a fáscia; já a epiderme foi suturada com
o fio 4.0 (Ethicon, Cardiovascular, Ethibond).
A dor neuropática foi avaliada do 7 ao 20 dia após a ligadura do nervo
ciático com o filamento de Von Frey (0,6 g). O método consiste na aplicação
do filamento sob a região plantar da pata que sofreu a constrição. A resposta
nociceptiva foi expressa como a porcentagem de retirada da pata a 10
estímulos induzidos pelo filamento de Von Frey, com intervalos de 1 min entre
cada aplicação. No 7 dia os animais foram avaliados 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h
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36
após a administração do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.), e nos dias
subseqüentes a avaliação foi realizada apenas 2, 10 e 24 h após o tratamento,
sendo que entre o 15 e 17 dias todos os grupos receberam apenas veículo.
Dois grupos de animais: um operado e outro que foi submetido ao
procedimento cirúrgico, porém sem sofrer a constrição (grupo falso operado
ou sham), receberam apenas veículo (10 mL/kg, v.o.) e foram utilizados como
parâmetro de comparação ao grupo operado e tratado com o EE de Melissa
officinalis.
3.8. Hiperalgesia induzida por mediadores inflamatórios.
O possível efeito anti-hiperalgésico do EE foi avaliado usando o
procedimento previamente descrito (RANDALL e SELITTO, 1957; HARGREAVES,
1998; OTUKI et al., 2005). Os animais foram pré-tratados com EE de Melissa
officinalis (3 – 300 mg/kg, v.o.), 60 min antes da injeção na pata direita de
0,1 ml de PGE
2
(10 nmol/pata), PMA (0,1 nmol/pata) ou BK (3 nmol/pata),
somente veículo (10 ml/kg). A hiperalgesia foi avaliada 30 min após a
administração dos agentes irritantes. Os animais tratados com BK foram pré-
tratados subcutaneamente (s.c.) com um inibidor da enzima conversora de
angiotensina, o captropil (5 mg/kg), uma hora antes do experimento, para
prevenir a sua degradação (MENDES et al., 2000).
A resposta hiperalgésica induzida pelos agentes flogísticos foi avaliada
pela aplicação crescente de pressão ou temperatura na superfície plantar da
pata direita dos animais, conforme o método previamente descrito (RANDALL
& SELITTO 1957; HARGREAVES et al., 1998). A hiperalgesia mecânica foi
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37
avaliada no aparelho de Randall e Selitto (Ugo Basile, Milan, Itália) no qual a
pressão pode variar de 0 a 750 g. A resposta hiperalgésica foi analisada em
função da capacidade do rato em suportar a pressão exercida pelo aparelho
em sua pata. Já para a análise da hiperalgesia térmica, os animais foram
ambientados no aparelho de Hargreaves (Ugo Basile, Milan, Itália), por
aproximadamente 10 mim antes dos experimentos. Foi avaliado o tempo que
o animal permaneceu com a pata sobre uma fonte de calor radiante (radiação
infravermelha). O tempo máximo estabelecido foi de 30 segundos para evitar
assim, danos teciduais.
3.9. Indução de Colite por injeção intra-retal de ácido acético
Um possível efeito êntero protetor do EE de Melissa officinalis foi
avaliado pelo modelo da colite induzida pela injeção intra-retal de ácido
acético descrito por Popov e colaboradores (2006). Os animais foram pré-
tratados com EE de Melissa officinalis (30,100 e 300 mg/kg, v.o.), veículo (10
ml/kg, v.o.) ou dexametasona (2 mg/kg, v.o.) durante 4 dias. Uma hora após
o último tratamento os animais, que permaneceram por 24h sem água e
ração, porém com uma solução de glicose 5% ad libitum, foram tratados por
via retal com ácido acético 5% (100 µl). No dia seguinte os animais foram
sacrificados e foi avaliada a característica geral do baço e do cólon. Além de
atribuído um escore macroscópico para as eventuais alterações sugestivas de
inflamação para o cólon: 0 – normal, 1 – leve eritema, 2 - eritema e edema e 3
– eritema, edema e ulcerações.
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3.10. Avaliação da atividade locomotora: Teste do Campo Aberto (open-
field)
O teste do campo aberto foi usado para excluir a possibilidade de que
as ações do EE de Melissa officinalis sobre a memória e a nocicepção
poderiam estar relacionadas com efeitos inespecíficos, tanto em nível central
quanto periférico, sobre a atividade locomotora dos animais. O
comportamento dos animais foi verificado conforme descrito previamente
(RODRIGUES et al., 1996). O aparato consiste em uma caixa de madeira
medindo 40 x 60 x 50 cm. O assoalho da arena é divido em 12 quadrados
iguais, e o número de cruzamentos com todas as patas (crossing), foi contado
cumulativamente durante 6 min. Os animais foram tratados com EE de Melissa
officinalis (30 -300 mg/kg, v.o.) ou veículo (10 ml/kg, v.o.) 60 min antes da
realização do experimento.
3.11. Análise dos possíveis mecanismos de ação antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis
A fim de avaliar alguns dos possíveis mecanismos de ação pelo qual o EE
de Melissa officinalis exerce seu efeito antinociceptivo na nocicepção
induzida pelo glutamato, os animais foram tratados com diferentes drogas. As
doses das drogas utilizadas foram selecionadas com base em dados da
literatura (SANTOS et al., 1999, 2005; KASTER et al., 2005; GADOTTI et al.,
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39
2006; MEOTTI et al., 2006; PIETROVSKI et al., 2006; KIM et al., 2007; SEOANE
et al., 2007) e dados obtidos previamente em nosso laboratório.
3.11.1. Envolvimento do sistema glutamatérgico, da substância P e das
citocinas pró-inflamatórias
Com o intuito de evidenciar se a atividade antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) depende da estimulação do sistema
nervoso central, aminoácidos excitatórios, substância P (SP) e citocinas pró-
inflamatórias foram administrados intratecalmente. O procedimento utilizado
foi similar ao descrito previamente por SCHEIDT et al. (2002) e GADOTTI et al.
(2006). Os animais receberam uma injeção intratecal de 5 µL dos aminoácidos
excitatórios, substância P ou citocinas pró-inflamatórias. As administrações
foram realizadas com o animal acordado, utilizando o método descrito por
HYLDEN e WILCOX (1980). Os animais foram contidos manualmente, e uma
agulha adaptada a uma microseringa de 25 µL (Hamilton) foi inserida entre as
vértebras L5-L6 dentro do espaço subdural. As injeções foram administradas
durante o período de 5 segundos, e a resposta nociceptiva foi avaliada após a
administração de AMPA (agonista seletivo de receptores ionotrópicos
glutamatérgicos do subtipo AMPA, 135 pmol/sítio), NMDA (agonista seletivo de
receptores ionotrópicos glutamatérgicos do subtipo NMDA, 450 pmol/sítio),
Cainato (agonista seletivo de receptores ionotrópicos glutamatérgicos do
subtipo Cainato, 110 pmol/sítio), trans-ACPD (agonista de receptores
glutamatérgicos metabotrópicos do grupo I e II, 50 nmol/sítio), SP (agonista
preferencial de receptores NK
1
, 100 pmol/sítio), IL-1β (citocina pró-
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40
inflamatória, agonista do receptor IL-1R tipos I e II, 1 pg/sítio) e TNF-α
(citocina pró-inflamatória, agonista do receptor TNF-R tipos I e II, 0,1
pg/sítio). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo as patas
posteriores, abdômen ou cauda foi cronometrado e registrado como indicativo
de nocicepção. Neste modelo, uma mordida é definida como um simples
movimento da cabeça em direção ao abdômen ou membros posteriores,
resultando no contato do focinho do animal com o órgão alvo. O
comportamento nociceptivo foi avaliado imediatamente após a injeção e
observado de acordo com o tempo padronizado para cada agonista: AMPA: 1
min; NMDA: 5 min; Cainato: 4 min; trans-ACPD: 15 min; SP: 6 min; IL-1β: 15
min; TNF –α: 15 min (URCA & RAIGORODSKY, 1988; BOXALL et al., 1998;
SCHEIDT et al., 2002).
3.11.2. Envolvimento do sistema opióide
A fim de avaliar a possível participação do sistema opióide no efeito
antinociceptivo do EE de Melissa officinalis, os camundongos foram pré-
tratados com naloxona (antagonista não seletivo de receptores opióides, 1
mg/kg, i.p.) ou veículo (10 mL/kg, i.p.) e após 20 min os animais receberam
EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.), morfina (agonista não seletivo de
receptores opióides, 2,5 mg/kg, s.c.) ou veículo (10 mL/kg, v.o.). A resposta
nociceptiva ao glutamato (i.pl.) foi avaliada 60, 30 e 60 min após a
administração do EE de Melissa officinalis, morfina ou veículo,
respectivamente.
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41
3.11.3. Envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico
Com o objetivo de evidenciar a participação da via do óxido nítrico na
ação antinociceptiva do EE de Melissa officinalis, os animais foram pré-
tratados com L-arginina (precursor da síntese do óxido nítrico, 40 mg/kg,
i.p.), D-arginina (isômero inativo da L-arginina, 40 mg/kg, i.p.) ou veículo (10
mL/kg, i.p.), 20 min antes da administração do EE de Melissa officinalis (100
mg/kg, v.o.), L-NOARG (inibidor da síntese do óxido nítrico, 25 mg/kg, i.p.)
ou veículo (10 mL/kg, v.o.). O efeito nociceptivo do glutamato (i.pl.) foi
registrado 60, 30 e 60 min após a administração do EE de Melissa officinalis,
L-NOARG ou veículo, respectivamente.
3.11.4. Envolvimento do sistema colinérgico
Para verificar a interação do efeito antinociceptivo do EE de Melissa
officinalis sobre o sistema colinérgico, os animais foram pré tratados com
atropina (antagonista muscarínico não seletivo, 1 mg/kg; i.p.), mecamilamina
(antagonista nicotínico α
2
β
3
seletivo, 2 mg/kg; i.p.) ou veículo (0,9%; 10
ml/kg; i.p.) 30 minutos antes da administração do EE de Melissa officinalis
(100 mg/kg, v.o.), pilocarpina (agonista muscarínico não seletivo, 3 mg/kg;
i.p), nicotina (agonista nicotínico não seletivo, 1 mg/kg, i.p.) ou veículo (10
ml/kg, v.o.). A resposta nociceptiva ao glutamato (i.pl.) foi avaliada 60 min
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42
após a administração do EE de Melissa officinalis ou veículo, e 30 min após a
administração de pilocarpina ou nicotina.
3.12. Efeito do ácido rosmarínico no modelo do glutamato
Conforme diversos dados da literatura, um dos componentes mais
expressivos no EE de Melissa officinalis é um ácido polifenólico, o ácido
rosmarínico. Ele se faz presente em concentrações entre 2 e 5% no EE de
Melissa officinalis. Diante disso, foi avaliado o possível efeito do ácido
rosmarínico no modelo de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de
glutamato. Os animais foram tratados com ácido rosmarínico (0,3 – 3 mg/kg)
ou veículo (10 mL/kg) pela via oral (v.o.) 1 h antes da injeção de glutamato.
3.13. Esquiva inibitória
Com o intuito de investigar a possível ação do EE de Melissa officinalis
no processo de formação de memória, o modelo da esquiva inibitória foi
realizado em ratas. Este modelo permite avaliar processos de aprendizagem e
memória, tarefas essas que dependem de ativação hipocampal e estão
extremamente envolvidas com o sistema glutamatérgico (BERNABEU et al.,
1997; BEVILAQUA et al., 2003; CAMMAROTA et al., 2004). O aparelho de
esquiva inibitória consiste em uma caixa de vidro e plástico medindo 50 x 25 x
25 cm com uma plataforma de 5 cm de altura, 8 cm de largura e 25 cm
comprimento, e no canto esquerdo apresenta uma série de barras de bronze
que constituem o assoalho da caixa. Durante o treino os animais (ratas) foram
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43
cuidadosamente colocados na plataforma em frente ao canto esquerdo da
caixa de treino. Assim que o animal descia da plataforma e colocava as quatro
patas na grade ele recebia um choque de 0.4 mA por 1 s nas patas, sendo
imediatamente retirado da caixa de treino. Os animais foram tratados com EE
de Melissa officinalis (30 - 1000 mg/kg, v.o.) ou veículo (10 mL/kg, v.o.) logo
após o treino (retenção de memória) ou 1 h antes do treino (aquisição de
memória). A memória de curta e longa duração foi avaliada no modelo da
esquiva inibitória 1,5 e 24 h depois do treino, respectivamente. No teste, os
animais treinados foram colocados de costas na plataforma, e o tempo
(latência) que eles levaram para descer com as quatro patas da plataforma foi
utilizado como indicativo de retenção de memória. O intervalo de 180 s foi
padronizado como o tempo máximo de espera (latência) para a descida do
animal da plataforma durante as avaliações.
3.14. Análise dos possíveis mecanismos de ação do EE de Melissa
officinalis na facilitação da memória
A fim de avaliar alguns dos possíveis mecanismos de ação pelo qual o EE
de Melissa officinalis exerce seu efeito facilitador na memória no modelo da
esquiva inibitória, os animais foram tratados com diferentes drogas. As doses
das drogas utilizadas foram selecionadas com base em dados da literatura
(NETTO et al., 1990; ROESLER et al., 1999; BARROS et al., 2005; KAHVECI et
al., 2006) e dados obtidos previamente em nosso laboratório.
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44
3.14.1. Envolvimento do Sistema Glutamatérgico
A fim de avaliar a participação do sistema glutamatérgico na atividade
do EE de Melissa officinalis sobre a memória no modelo da esquiva inibitória,
os animais foram pré-tratados com MK-801 (antagonista NMDA não
competitivo; 0,01 mg/kg, i.p.) ou veículo (10 ml/kg, i.p.) e após 30 min
receberam EE de Melissa officinalis (100 mg/kg; v.o.) ou veículo (10 ml/kg;
v.o.). Decorridos 60 min do tratamento com o EE de Melissa officinalis os
animais foram submetidos ao teste da esquiva inibitória, conforme descrito
anteriormente.
3.14.2. Envolvimento do Sistema colinérgico
Com o objetivo de avaliar a participação do sistema colinérgico na
facilitação do aprendizado e da memória promovida pelo EE de Melissa
officinalis no modelo da esquiva inibitória, os animais foram pré-tratados com
atropina (antagonista muscarínico não seletivo; 1 mg/kg, i.p.), mecamilamina
(antagonista nicotínico α3β4 seletivo, 5 mg/kg, i.p.) ou veículo (10 ml/kg,
i.p.) e após 30 min receberam EE de Melissa officinalis (100 mg/kg; v.o.) ou
veículo (10 ml/kg; v.o.). Decorridos 60 min do tratamento com o EE de
Melissa officinalis os animais foram submetidos ao teste da esquiva inibitória,
conforme descrito anteriormente.
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45
3.14.3. Envolvimento da via L-arginina- Óxido nítrico
Objetivando avaliar o envolvimento da via L-arginina-Óxido nítrico na
facilitação do aprendizado e da memória promovida pelo EE de Melissa
officinalis, no modelo da esquiva inibitória, os animais foram pré-tratados
com L-NAME (inibidor da síntese de óxido nítrico; 2 mg/kg, i.p.) ou veículo (10
ml/kg, i.p.) e 30 minutos após receberam EE de Melissa officinalis (100
mg/kg; v.o.) ou veículo (10 ml/kg; v.o.). Decorridos 60 min do tratamento
com o EE de Melissa officinalis os animais foram submetidos ao teste da
esquiva inibitória, conforme descrito anteriormente.
3.15. Análise estatística
Os resultados foram avaliados estatisticamente através da análise de
variância (ANOVA), de uma via ou de medidas repetidas, dependendo do
experimento, seguido pelo teste de Newman-Keuls ou teste “t” não pareado
de Student, quando apropriado e expressos como a média + E.P.M. O valor de
P<0,05 foi considerado como indicativo de significância. Os valores da DI
50
(dose do EE ou do ácido rosmarínico que reduziu 50% a resposta nociceptiva
em relação ao grupo controle [veículo]) estão apresentados como média
geométrica acompanhada pelo seu respectivo intervalo de confiança (95%). Os
valores de DI
50
foram obtidos através do método de regressão linear utilizando
o software “Graph Pad Instat®” (GraphPad software, San Diego, CA). Os
resultados do experimento da esquiva inibitória foram apresentados em
medianas acompanhadas dos intervalos interquartis. A diferença entre os
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47
4. RESULTADOS
4.1. Nocicepção induzida pelo ácido acético
Os resultados apresentados na figura 6 mostram que o EE de Melissa
officinalis, administrado por v.o., inibiu de forma significativa e depedente da
dose, do número das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos, com valores de DI
50
(e seus respectivos limites de confiança de
95%) de 241,92 (203,92 -289,37) mg/kg e inibição de 52±5% na dose de 1000
mg/kg.
C 10 30 100 300 1000
0
10
20
30
40
50
**
***
***
***
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
Ácido acético 0,6% ( 450l/ i.p.)
Número de contorções
Figura 6: Avaliação do efeito antinociceptivo (10-1000 mg/kg, v.o.) do EE de Melissa
officinalis na nocicepção induzida por ácido acético 0,6% (450 µl, i.p.) em camundongos.
Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os
símbolos indicam o nível de significância: **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo controle
(C) (pelo teste de Newman-Keuls).
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48
4.2. Nocicepção induzida pelo glutamato
O tratamento dos animais com o EE de Melissa officinalis (10-1000
mg/kg, v.o.) inibiu de forma significativa e dependente da dose a nocicepção
induzida pela injeção i.pl. de 20 mol/pata de glutamato tamponado, com
uma DI
50
de 198,54 (146,37-261,21) mg/kg e inibição de 62+5% na maior dose
testada (Fig. 7).
C 10 30 100 300 1000
0
50
100
150
200
250
**
***
***
***
***
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
Glutamato 20mol ( 20l/ pata)
Tempo de reação (s)
Figura 7: Avaliação do efeito antinociceptivo do EE de Melissa officinalis (10-1000 mg/kg,
v.o) na nocicepção induzida por glutamato (20 mol/pata) em camundongos. Cada grupo
representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos
indicam o nível de significância: **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo controle (C) (pelo
teste de Newman-Keuls).
4.3. Nocicepção induzida pela formalina
Os resultados apresentados na figura 8 demonstram que o EE de Melissa
officinalis (30-1000 mg/kg, v.o.) inibiu de maneira significativa tanto a fase
neurogênica (0-5 min, A) quanto a fase inflamatória (15-30 min, B) da
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49
nocicepção induzida pela formalina (2,5%). As inibições causadas pela dose de
100 mg/kg foram de 33+7 e 48+5%, respectivamente.
C 30 100 300 1000
0
20
40
60
80
100
Formalina 2,5% ( 20l/ pata)
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
*
*
*
*
Tempo de reação (s)
(A)
C 30 100 300 1000
0
100
200
300
400
500
Formalina 2,5% ( 20l/ pata)
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
*
**
*
*
(B)
Tempo de reação (s)
Figura 8: Efeito antinociceptivo do EE de Melissa officinalis (30-1000 mg/kg) administrado
pela via oral em relação à primeira (A) e segunda (B) fase da nocicepção induzida pela
formalina (2,5%) em camundongos. As barras representam a média de 6 a 8 animais e as
linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos indicam o nível de significância: *p<0,05 e
**p<0,01 comparados ao grupo controle (C) (pelo teste de Newman-Keuls).
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50
4.4. Neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático
O tratamento agudo com EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.)
reverteu completamente a alodínia mecânica avaliada através do filamento
de Von Frey na pata dos animais operados, sendo que seu efeito ocorreu a
partir da primeira hora (inibição de 100%) após a sua administração e
permaneceu de forma significante por até 12 horas (Fig. 9).
basal 1 2 4 6 8 10 12 24
0
25
50
75
100
***
***
**
***
***
***
**
###
###
###
###
###
###
##
##
Tempo (h)
Limiar de retirada (%)
Figura 9: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na neuropatia induzida pela
constrição parcial do nervo ciático em camundongos. () representa o grupo falso-operado
(Sham) que recebeu veículo (10 ml/kg, v.o); () representa o grupo operado que recebeu
veículo (10 ml/kg, v.o); () simboliza o grupo operado que recebeu o EE. O grupo
identificado como Basal representa o limiar dos animais antes de serem submetidos à cirurgia.
Cada grupo representa a média de 6 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos
indicam o nível de significância: **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo operado + veículo
e ## p<0,01 e ### p<0,001 comparado ao grupo falso-operado(pelo teste ANOVA de 2 vias).
Quando administrado diariamente, o EE de Melissa officinalis (100
mg/kg, v.o.), demonstrou ser efetivo em reduzir completamente a alodínia
mecânica avaliada 2 h (Fig. 10) e também em 10 h (Fig. 10B) após a sua
administração. Além disso, a interrupção do tratamento com o EE do 8
o
ao 10
o
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51
dia após o início do tratamento não alterou a sua eficácia nos dias
subseqüentes.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
20
40
60
80
100
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
###
###
###
######
###
###
###
###
###
###
Dias
Limiar de retirada(%)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
20
40
60
80
100
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
Dias
Limiar de retirada(%)
###
###
###
###
###
###
###
###
###
###
(A)
(B)
Figura 10: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) 2 (A) e 10 (B) horas após o
tratamento diário, na neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático em
camundongos. (▲) representa o grupo operado que recebeu veículo (10 ml/kg, v.o); ()
representa o grupo falso-operado que recebeu veículo (10ml/kg, v.o.); () representa o
grupo operado que foi submetido ao tratamento com o EE. Cada grupo representa a média de
6 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos indicam o nível de significância:
***p<0,001 comparado ao grupo operado + veículo e ### p<0,001 comparado ao grupo falso
operado (pelo teste ANOVA de 2 vias).
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52
4.5. Hiperalgesia induzida por agentes flogísticos
Nos modelos de hiperalgesia mecânica e térmica, descritos por Randall-
Selitto e por Hargreaves, respectivamente, o EE de Melissa officinalis (3-300
mg/kg, v.o.) reverteu a hiperalgesia mecânica e térmica induzida pela injeção
i.pl. de BK (3 nmol/pata) (Figura 11), com inibições de 59±10 e 83±2% e DI
50
de 94,73 (85,25–104,20) e 27,09 (26,54–27,63) mg/kg, respectivamente; bem
como a resposta causada pela Prostaglandina E
2
(10 nmol/pata) (Figura 12)
com inibições de 100 e 83±2% e DI
50
de 32,04 (29,15–34,93) e 19,40 (16,68-
22,12) mg/kg, respectivamente.
C 0 10 30 100 300
0
100
200
300
400
500
600
M. officinalis (mg/kg v.o.)
***
***
***
Bradicinina (3 nmol/pata)
Captopril (5 mg/kg, s.c.)
***
Carga tolerada (g)
C 0 10 30 100 300
0
5
10
15
20
M. officinalis (mg/kg v.o.)
**
***
Bradicinina (3 nmol/pata)
Captopril (5 mg/kg, s.c.)
***
Latência (s)
(A)
(B)
Figura 11: Efeito do EE de Melissa officinalis (10 - 300 mg/kg, v.o.) na hiperalgesia mecânica
(A) e térmica (B) induzida pela injeção intraplantar de bradicinina (BK, 3 nmol/pata) em
ratos. Os resultados são expressos como a média ± E.P.M. Cada grupo representa a média de
6-10 animais. **p < 0,01 e ***p<0,001 diferem significativamente do grupo tratado somente
com BK (pelo teste de Newman-Keuls).
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53
C 0 3 10 30 100 300
0
100
200
300
400
500
M. officinalis (mg/kg v.o.)
***
***
***
**
Prostaglandina E
2
(10 nmol/pata)
***
Carga tolerada (g)
C 0 3 10 30 100
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Prostaglandina E
2
(10 nmol/pata)
M. officinalis (mg/kg v.o.)
***
***
***
**
Latência (s)
(A) (B)
Figura 12: Efeito do EE de Melissa officinalis (3 - 300 mg/kg, v.o.) na hiperalgesia mecânica
(A) e térmica (B) induzida pela injeção intraplantar de Prostaglandina E
2
(PGE
2
, 10nmol/pata)
em ratos. Os resultados são expressos como a média ± E.P.M. Cada grupo representa a média
e 6-10 animais. **p < 0,01 e ***p<0,001 diferem significativamente do grupo tratado somente
com PGE
2
(pelo teste de Newman-Keuls).
Além disso, o tratamento dos animais com o EE de Melissa officinalis
também foi capaz de reverter de forma significativa a hiperalgesia térmica e
mecânica induzida pelo PMA (0,1 nmol/pata) (Figura 13), com inibições de 100
e 54+12% e DI
50
de 29,07 (27,30–30,86) e 288,91 (254,24– 323,58) mg/kg.
C 0 10 30 100 300
0
100
200
300
400
500
600
M. officinalis (mg/kg v.o.)
******
PMA (0,1 nmol/pata)
***
***
Carga tolerada (g)
C 0 10 30 100 300
0
5
10
15
20
M. officinalis (mg/kg v.o.)
*
PMA (10 nmol/pata)
***
Latência (s)
(A)
(B)
Figura 13: Efeito do EE de Melissa officinalis (10 – 300 mg/kg, v.o.) na hiperalgesia mecânica
(A) e térmica (B) induzida pela injeção intraplantar de PMA (0,1nmol/pata) em ratos. Os
resultados são expressos como a média ± E.P.M. Cada grupo representa a média de 6-10
animais. *p<0,05; **p < 0,01 e ***p<0,001 diferem significativamente do grupo tratado
somente com PMA (pelo teste de Newman-Keuls).
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54
4.6. Indução de Colite por injeção intra-retal de ácido acético
O tratamento com EE de Melissa officinalis foi capaz de prevenir os
sinais da agressão intra colo retal causada pela administração intra-retal de
ácido acético (5%, 150 µl), segundo um escore, com inibição de 65+8% e DI
50
de 230,76 (193,84–267,68) mg/kg. Como controle positivo foi utilizado a
Dexametasona (2 mg/kg, v.o.), que apresentou inibição de 57+8% para o
mesmo parâmetro.
sal/sal sal/acid dexa 30 100 300
0
1
2
3
***
M. Officinalis (mg/kg, v.o.)
***
***
***
***
Escore
Figura 14: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) na prevenção de lesão no
cólon de animais que receberam ácido acético (5%, 150µl) por via retal. Os resultados são
expressos como a média ± E.P.M. Cada grupo representa a média de 6-10 animais. ***p<0,001
difere significativamente do grupo controle (sal/acid) (pelo teste de Newman-Keuls).
Além do parâmetro acima analisado, foram avaliados o peso do cólon e
do baço dos animais. O EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) não
reduziu o peso do baço, como aconteceu com seu fármaco de referência a
dexametasona (2 mg/kg, v.o.) que diminuiu em 48+8% o peso do órgão (Fig.
15A). No entanto, as mesmas doses do extrato foram eficazes em reduzir de
forma significativa o peso do cólon, com inibição de 364% na dose de 300
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55
mg/kg, além disso, o efeito do extrato foi significativamente maior que o
obtido com a dexametasona (143%).
sal/sal sal/acid dexa 30 100 300
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
***
M. Officinalis (mg/kg, v.o.)
Peso (g)
sal/sal sal/acid dexa 30 100 300
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
***
M. Officinalis (mg/kg, v.o.)
*** ***
**
**
***
Peso (g)
(A)
(B)
Figura 15: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) e da Dexametasona
(2mg/kg, v.o.) no peso do baço (A) e do cólon (B) de animais que receberam ácido acético
(5%, 150 µl) por via retal. Os resultados são expressos como a média ± E.P.M. Cada grupo
representa a média de 6-10 animais. **p<0,01 e ***p<0,001 difere significativamente do grupo
controle (sal/acid) (pelo teste de Newman-Keuls).
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56
4.7. Avaliação da atividade locomotora: Teste do Campo Aberto (open-
field)
O tratamento dos animais com EE de Melissa officinalis (30 - 1000
mg/kg, v.o.), doses nas quais apresentaram significativo efeito
antinociceptivo, não foram capazes de causar mudança significativa sobre a
atividade locomotora de camundongos (Figura 16) e ratos (Figura 17) quando
avaliados no teste do campo-aberto.
C 30 100 300
0
50
100
150
M. officinalis (mg/kg v.o.)
Número de cruzamentos
Figura 16: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 300 mg/kg, v.o.) sobre a atividade
locomotora de camundongos avaliados no modelo do campo aberto. Os resultados são
expressos como a média ± E.P.M. Cada grupo representa a média de 6-10 animais (pelo teste
de Newman-Keuls).
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57
C 30 100 300 1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
Número de cruzamentos
Figura 17: Efeito do EE de Melissa officinalis (30 – 1000 mg/kg, v.o.) sobre a atividade
locomotora de ratos avaliados no modelo do campo aberto. Os resultados são expressos como
a média ± E.P.M. Cada grupo representa a média de 6-10 animais (pelo teste de Newman-
Keuls).
4.8. Análise dos possíveis mecanismos de ação antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis
4.8.1. Envolvimento do sistema glutamatérgico, da substância P e das
citocinas pró-inflamatórias
O tratamento dos animais com o EE de Melissa officinalis (100 mg/kg),
administrado pela via oral 1 h antes do teste, reduziu significativamente a
resposta nociceptiva induzida pela administração intratecal de NMDA, AMPA e
cainato, com inibições de 685, 667 e 852%, respectivamente, porém não
foi capaz de inibir a nocicepção induzida por trans-ACPD e SP (Fig. 18).
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58
0
100
200
300
400
***
***
***
Melissa officinalis
Salina
NMDA
AMPA
450pmol
135pmol
Cainato
trans ACPD
SP
110pmol 50nmol
0,1nmol
Tempo de reação (s)
Figura 18: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na nocicepção induzida por
aminoácidos excitatórios e SP em camundongos. Os agonistas: Trans-ACPD (50 nmol/sítio),
NMDA (450 nmol/sítio), AMPA (135 pmol/sítio), Cainato (110 pmol/sítio) e SP (0,1 nmol/sítio)
foram injetados pela via intratecal, 1 h após a administração do EE de Melissa officinalis. As
barras indicam uma media 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos
denotam o nível de significância: ***p<0,001 comparado ao grupo veículo (barras brancas)
(pelo teste “t” não pareado).
De forma similar, o tratamento dos animais com o EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg), administrado pela via oral 1 h antes do teste, reduziu
significativamente a resposta nociceptiva induzida pela administração
intratecal de IL-1β e TNF-α, com inibições de 499 e 624%, respectivamente
(Fig. 19).
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59
0
50
100
150
200
250
-
***
**
Salina
IL 1
TNF
Melissa officinalis
+
+ +
+
+ +
+
+
-
- -
-
-
--
-
Tempo de reação (s)
Figura 19: Efeito do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na nocicepção induzida por
citocinas pró-inflamatórias em camundongos. As citocinas: IL-1β (1 pg/sítio) e TNF-α (0,1
pg/sítio) foram injetadas pela via intratecal, 1 h após a administração do EE de Melissa
officinalis. As barras indicam uma media 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M.
Os símbolos denotam o nível de significância: **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo
veículo (barras brancas) (pelo teste “t” não pareado).
4.8.2. Envolvimento do sistema opióide
Os resultados apresentados na Fig. 20 demonstram que o pré-
tratamento com naloxona (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo de
receptores opióides), administrado 20 min antes do EE, morfina ou veículo,
reverteu completamente o efeito antinociceptivo causado pela morfina (2,5
mg/kg, s.c.), mas não o efeito antinociceptivo do EE de Melissa officinalis
quando analisado no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato (i.pl.).
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60
0
50
100
150
200
***
***
Veículo
Naloxona
Morfina
Melissa officinalis
##
***
-
+
+
+
+
+
+
+
+
- - - - -
-
-
-
-
-
-
- -
- -
Tempo de reação (s)
Figura 20: Efeito do pré-tratamento dos animais com naloxona (1 mg/kg, i.p.) sobre a
atividade antinociceptiva do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) e morfina (2,5 mg/kg,
s.c.), no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos. As barras
representam a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos
indicam o nível de significância: ***p<0,001 em relação ao grupo veículo e ##p<0,01
comparado ao grupo veículo+morfina (pelo teste Student de Newman-Keuls).
4.8.3. Envolvimento da via L-arginina-óxido nítrico
O pré-tratamento dos animais com o precursor do óxido nítrico, L-
arginina (40 mg/kg, i.p.), administrado 20 min antes do tratamento, mas não
a D-arginina (40 mg/kg, i.p., isômero inativo da L-arginina), preveniu
completamente a antinocicepção causada tanto pela L-NOARG (25 mg/kg,
i.p., inibidor da sintase de óxido nítrico) quanto pelo EE de Melissa officinalis
(100 mg/kg, v.o.) no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato (Fig. 21).
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61
0
50
100
150
Veículo
L arginina
Melissa officinalis
D arginina
L NOARG
-
**
*****
**
###
##
+
+
+
+
+
+
+ + +
+
+
+
+ + +
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Tempo de reação (s)
Figura 21: Efeito do tratamento prévio dos animais com L-arginina (40 mg/kg i.p.) ou D-
arginina (40 mg/kg i.p.) sobre a atividade antinociceptiva do EE de Melissa officinalis (100
mg/kg, v.o.) e L-NOARG (25 mg/kg, i.p.), no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato
em camundongos. As barras representam a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais
indicam o E.P.M. Os símbolos indicam o nível de significância: **p<0,01 e ***p<0,001 em
relação aos grupos veículo, L-arginina e D-arginina; e ##p<0,01 e ###p<0,001 comparado ao
grupo veículo + L-NOARG ou veículo + EE de Melissa officinalis (pelo teste Student de
Newman-Keuls).
4.8.4. Envolvimento do sistema colinérgico
A figura 22 demonstra que o pré-tratamento dos animais com os
antagonistas colinérgicos mecamilamina (2 mg/kg, i.p.) e atropina (1 mg/kg,
i.p.), administrados 30 minutos antes do tratamento, preveniu
completamente a antinocicepção causada pelos agonistas colinérgicos nicotina
(1 mg/kg, i.p.) e pilocarpina (3 mg/kg, i.p.), bem como pelo EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) no modelo de nocicepção induzida pelo
glutamato.
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62
0
100
200
300
400
***
**
Veículo
Mecamilamina
Nicotina
Melissa officinalis
###
+
+
+ +
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
- -
-
##
+ +
Tem po de reação (s)
0
100
200
300
400
***
***
Veículo
Atropina
Pilocarpina
Melissa officinalis
###
###
+
+
+ +
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
--
-
+ +
Tem po de reação (s)
(A)
(B)
Figura 22: Efeito do pré-tratamento dos animais com mecamilamina (2 mg/kg, i.p., A) ou
atropina (1 mg/kg, i.p., B) sobre a atividade antinociceptiva da nicotina (1 mg/kg, i.p., A) e
da pilocarpina (3 mg/kg, i.p. B), bem como do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.), no
modelo de nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos. As barras representam a
média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os símbolos indicam o nível de
significância: **p<0,01 e ***p<0,001 em relação aos grupos veículo ou antagonista e
###p<0,001 comparado ao grupo veículo + agonista ou veículo + EE de Melissa officinalis (pelo
teste Student de Newman-Keuls).
4.9. Efeito do ácido rosmarínico no modelo de nocicepção induzida pelo
glutamato
O tratamento sistêmico dos animais com o ácido rosmarínico (0,3 - 3
mg/kg, v.o.) inibiu de forma significativa e dependente da dose a nocicepção
induzida pela injeção i.pl. de 20 mol/pata de glutamato tamponado, com
uma DI
50
de 2,64 (2,50 - 2,78) mg/kg e inibição de 64+3% na maior dose
testada (Fig. 23). É importante mencionar que a DI
50
do ácido rosmarínico foi
cerca de 74 vezes menor que a DI
50
do EE para o modelo de nocicepção do
glutamato.
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63
C 0,3 1 3
0
100
200
300
Ácido rosmarínico (mg/kg, v.o.)
**
***
Tempo de reação (s)
Figura 23: Avaliação do efeito antinociceptivo dependente da dose (0,3 - 3 mg/kg, v.o) de
ácido rosmarínico na nocicepção induzida por glutamato tamponado (20 mol/pata) em
camundongos. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o
E.P.M. Os símbolos indicam o nível de significância: **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo
controle (C) (pelo teste Student de Newman-Keuls).
4.10. Esquiva inibitória
Os dados apresentados na figura 24 mostram que o EE de Melissa
officinalis, aumentou de forma significativa a latência dos animais à aquisição
(Fig. 24 A e B) e à retenção (Fig. 24 C e D) da memória de curta (STM, 1,5 h) e
longa duração (LTM, 24 h) no modelo de esquiva inibitória em ratas. A
administração do EE foi realizada pela via oral 1 hora antes (para avaliar a
aquisição) ou logo após (para avaliar a retenção) o treino no aparelho de
esquiva inibitória.
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64
C 30 100 300 1000
0
50
100
150
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
**
**
*
Latência (s)
C 30 100 300 1000
0
50
100
150
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
Latência (s)
***
**
**
C 30 100 300 1000
0
25
50
75
100
125
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
Latência (s)
***
***
**
C 30 100 300 1000
0
25
50
75
100
125
Melissa officinalis (mg/kg v.o.)
Latência (s)
***
**
**
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 24. Efeito do EE de Melissa officinalis (30 - 1000 mg/kg, v.o.) sobre a aquisição (A e B)
e retenção (C e D) da memória de curta (STM, A e C) e de longa duração (LTM, B e D), no
modelo de esquiva inibitória em ratas. As barras indicam a mediana de 9 a 12 animais e as
linhas verticais denotam seu intervalo interquatil, *p<0,05; **p<0,01 e *** p<0,001 (pelo teste
de Mann Whitney seguido de Kruskall Wallis).
4.11. Análise dos possíveis mecanismos de ação do EE de Melissa
officinalis na facilitação da aquisição da memória
4.11.1. Envolvimento do Sistema Glutamatérgico
O pré-tratamento com MK-801 (0,01 mg/kg, i.p.) foi capaz de reverter
o efeito facilitador da memória do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.)
no modelo da esquiva inibitória, conforme mostra a figura 25.
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65
0
25
50
75
100
125
Veículo
Melissa officinalis
MK 801
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
**
**
Latência (s)
0
50
100
150
200
Veículo
Melissa officinalis
MK 801
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
**
**
Latência (s)
(A)
(B)
Figura 25: Efeito da administração MK 801 (0,01mg/kg, i.p.) sobre ação do EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) na aquisição da memória de curta (STM, A) e de longa duração
(LTM, B), no modelo de esquiva inibitória em ratas. As barras indicam a mediana de 9 a 12
animais e as linhas verticais denotam seu intervalo interquatil, ** p<0,01 comparado ao grupo
veículo e ##p<0,01 na comparação entre o grupo tratado com EE de Melissa officinalis e o
grupo EE + MK 801 (pelo teste de Mann Whitney seguido de Kruskall Wallis).
4.11.2. Envolvimento do Sistema colinérgico
Como demonstra a figura 26, o pré-tratamento dos animais com
atropina (1 mg/kg, i.p.) inibiu o efeito facilitador da memória do EE de
Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) no modelo da esquiva inibitória, tanto na
memória de curta duração, como na memória de longa duração.
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66
0
50
100
150
Veículo
Melissa officinalis
Atropina
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
**
**
Latência (s)
0
50
100
150
Veículo
Melissa officinalis
Atropina
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
** **
Latência (s)
(A)
(B)
Figura 26: Efeito da administração de atropina (1 mg/kg, i.p.) sobre a ação do EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) na aquisição da memória de curta (STM, A) e de longa duração
(LTM, B), no modelo de esquiva inibitória em ratas. As barras indicam a mediana de 9 a 12
animais e as linhas verticais denotam seu intervalo interquatil, **p<0,01 comparado ao grupo
veículo e ## p>0,01 na comparação entre o grupo EE de Melissa officinalis e o grupo atropina
+ EE (pelo teste de Mann Whitney seguido de Kruskall Wallis).
A figura 27 demonstra que o pré-tratamento com mecamilamina (5
mg/kg, i.p.) foi efetivo em inibir a resposta facilitátoria do EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) frente ao modelo da esquiva inibitória tanto na
memória de curta, como na de longa duração.
0
50
100
150
200
Veículo
Melissa officinalis
Mecamilamina
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
**
**
Latência (s)
0
50
100
150
200
Veículo
Melissa officinalis
Mecamilamina
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
**
*
Latência (s)
(B)
(A)
Figura 27: Efeito da administração mecamilamina (5 mg/kg, i.p.) sobre a ação do EE de
Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) na memória de curta (STM, A) e de longa duração (LTM,
B), no modelo de esquiva inibitória em ratas. As barras indicam a mediana de 9 a 12 animais e
as linhas verticais denotam seu intervalo interquatil, *p< 0,05 e **p<0,01 quando comparados
ao grupo veículo e ##p<0,01 a comparação entre o grupo tratado somente com EE e o grupo
EE + mecamilamina (pelos testes de Mann Whitney seguido de Kruskall Wallis).
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67
4.11.3. Envolvimento da via L-arginina- Óxido nítrico
A administração de L-NAME (2 mg/kg, i.p.) reverteu o efeito facilitador
da memória do EE de Melissa officinalis (100 mg/kg, v.o.) no modelo da
Esquiva Inibitória em ratas, na memória de curta e na memória de longa
duração.
0
50
100
150
200
Veículo
Melissa officinalis
L NAME
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
###
***
*
**
Latência (s)
0
25
50
75
100
125
Veículo
Melissa officinalis
L NAME
+
+
+ +
+
-
-
-
-
-
-
-
##
**
**
**
Latência (s)
(A) (B)
Figura 28: Efeito da administração L-NAME (2 mg/kg, i.p.) sobre a ação do EE de Melissa
officinalis (100 mg/kg, v.o.) na memória de curta (STM, A) e de longa duração (LTM, B), no
modelo de esquiva inibitória em ratas. As barras indicam a mediana de 9 a 12 animais e as
linhas verticais denotam seu intervalo interquatil, *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 comparado
ao grupo veículo e ##p<0,01 e ###p<0,001 quando comparados o grupo tratado somente com
EE de Melissa officinalis e o grupo EE + L-NAME (pelos testes de Mann Whitney seguido de
Kruskall Wallis).
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68
5. DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou que o extrato etanólico (EE) de Melissa
officinalis apresenta atividade antinociceptiva nos diferentes modelos de
nocicepção térmica, química e mecânica, quando administrado pela via oral.
Optou-se por começar a investigação de uma possível atividade
antinociceptiva do referido extrato por um modelo de dor visceral, tal como o
modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos. Assim, comprovou-se que a administração sistêmica pela via
oral do EE de Melissa officinalis inibiu as contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético em camundongos, de forma dependente da dose. Este
modelo é descrito como um modelo típico de nocicepção inflamatória
visceral, sendo amplamente utilizado como ferramenta para detecção e
avaliação de novos agentes com propriedades analgésicas e antiinflamatórias
(COLLIER et al., 1968; DUARTE et al., 1988; REICHERT et al., 2001). Os
prótons oriundos da dissociação do ácido acético podem ativar diretamente
canais de cátions não seletivos localizados nas vias aferentes primárias
(JULIUS & BASBAUM, 2001). Além disso, a injeção de ácido acético na
cavidade peritoneal de camundongos promove a liberação de diversos
mediadores inflamatórios como PG, BK, SP, TNF-α, IL-1β e IL-8, entre outros
(COLLIER et al., 1968; VINEGAR et al., 1979; RIBEIRO et al., 2000; IKEDA et
al., 2001). Estes mediadores estimulam neurônios aferentes primários
aumentando a liberação de aspartato e glutamato no fluído cerebroespinhal
(FENG et al., 2003; ZHU et al., 2004). Em função disto, este modelo
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69
apresenta uma boa sensibilidade, embora pouca especificidade. Uma vez que
a nocicepção induzida pelo ácido acético pode ser prevenida por agentes
antiinflamatórios, analgésicos, relaxantes musculares e sedativos (REICHERT
et al., 2001; FENG et al., 2003).
Para descartar qualquer efeito inespecífico, tais como diminuição da
deambulação do animal ou sedação, que pudesse interferir nos resultados dos
experimentos com o EE de Melissa officinalis foi realizado o teste do campo
aberto, em ratos e camundongos. Assim, pode-se observar que nenhuma
alteração significativa foi encontrada, quando o EE foi administrado nos
animais, nas doses que se mostraram efetivas no modelo do ácido acético.
Demonstrando que a atividade nociceptiva nos modelos de nocicepção é
específica e não devido a efeitos sobre a musculatura esquelética do animal
ou seu estado de consciência.
Este trabalho demonstrou que o EE de Melissa officinalis, quando
administrado pela v.o. foi efetivo em inibir ambas as fases, neurogênica e
inflamatória, da nocicepção induzida pela injeção i.pl. de formalina. A fase
neurogênica decorre da ativação direta dos terminais nervosos nociceptivos,
enquanto que a fase inflamatória é mediada por uma combinação de
mecanismos periféricos e de sensibilização central na medula espinhal
(HUNSKAAR & HOLE, 1987; TJØLSEN et al., 1992). Por outro lado, estudos
demonstram que várias classes de fármacos tais como antagonistas NMDA,
inibidores da NOS e AINES, são capazes de inibir a nocicepção induzida pela
formalina (TJØLSEN et al., 1992, MOORE et al., 1993; MALMBERG & YAKSH,
1995; CHAPLAN et al., 1997; SANTOS et al., 1998; SAWAMURA et al., 1999).
Desta forma, a administração intraplantar de formalina constitui um
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70
excelente modelo para a investigação de substâncias potencialmente
antinociceptivas. No entanto, este modelo não permite concluir o mecanismo
pelo qual o EE de Melissa officinalis causa antinocicepção.
Os resultados apresentados no presente estudo evidenciam que a
administração de EE de Melissa officinalis pela via oral produziu uma inibição
significativa da resposta nociceptiva induzida por injeção intraplantar de
glutamato em camundongos. A resposta nociceptiva induzida pelo glutamato
parece envolver sítios periféricos, espinhais e supra-espinhais, tendo ação
mediada amplamente por receptores NMDA e não NMDA, assim como pela
liberação de óxido nítrico ou por algumas vias de transmissão moduladas por
nitro derivados (BEIRITH et al., 2002, 2003; ROSA et al., 2005). Vários estudos
têm demonstrado que os receptores de aminoácidos excitatórios estão
envolvidos na transmissão aferente primária nociceptiva, tanto no
desenvolvimento quanto na manutenção da resposta dolorosa (AANONSEN &
WILCOX, 1987, 1990; COGGESHAL & CARLTON, 1997; FERREIRA et al., 1999).
Desta forma, a supressão da nocicepção induzida pelo glutamato em função
do tratamento dos animais com o EE de Melissa officinalis pode estar
associada a sua interação com o sistema glutamatérgico ou com a inibição da
produção de óxido nítrico (FERREIRA et al., 1999; BEIRITH et al., 2003).
Assim, o modelo da nocicepção induzida pela administração
intraplantar de glutamato foi escolhido para a realização dos experimentos
posteriores, com o intuito de elucidar os possíveis mecanismos de ação
através dos quais o EE de Melissa officinalis estaria atuando para produzir seu
efeito antinociceptivo. Dentre os sistemas envolvidos na ativação e inibição
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71
das vias nociceptivas foram investigados os sistemas glutamatérgico, opióide,
colinérgico e a via da L-arginina – óxido nítrico.
Os receptores glutamatérgicos são amplamente distribuídos no SNC e
são divididos em: ionótrópicos (acoplados à canais iônicos) e metabotrópicos
(acoplados à proteína G (mGluR)). Estudos recentes utilizaram agonistas e
antagonistas seletivos de receptores glutamatérgicos para investigar o papel
de cada grupo de receptores na nocicepção aguda e crônica. Os resultados
levaram à conclusão de que todos os subtipos de receptores ionotrópicos
NMDA, AMPA e Cainato e receptores metabotrópicos (Grupos I, II e III)
possuem papel relevante na estabilização ou manutenção destes estados
dolorosos (NEUGEBAUER, 2001; CARLTON, 2001; SCHEIDT et al., 2002; VARNEY
& GEREAU, 2002; SAWYNOK, 2003). Os resultados encontrados sugerem que a
antinocicepção produzida pelo EE de Melissa officinalis envolve o sistema
glutamatérgico. Tal sugestão deriva do fato de que o extrato foi capaz de
reduzir a resposta nociceptiva induzida pela injeção intratecal de NMDA,
AMPA e Cainato; agonistas seletivos de receptores ionotrópicos
glutamatérgicos do tipo NMDA, AMPA e Cainato, respectivamente. No entanto,
foi inefetivo frente ao agonista seletivo para receptores glutamatérgicos
metabotrópicos do grupo I e II, trans-ACPD, e também frente a administração
intratecal de SP.
Os dados do presente estudo também demostraram que a administração
v.o. de EE de Melissa officinalis inibiu a nocicepção induzida por injeção
intratecal de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α. Já está bem
estabelecido que a ligação da IL-1β ao seu receptor IL-1RI ativa PKC
independentemente do cálcio (OBREA et al., 2002). Em contrapartida,
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72
Schafers e colaboradores (2003) descrevem que a nocicepção induzida pelo
TNF-α envolve a fosforilação de quinases ativadas por mitógenos. Alguns
autores demonstraram que flavonoides como a luteolina e quercitina,
presentes no EE de Melissa officinalis, podem inibir a fosforilação das
quinases ativadas por mitógenos, via inibição de PKC (CARNAT et al., 1998;
HEITZ et al., 2000; WADSWORTH et al., 2001; XAGORARI et al., 2001). Sabe-se
que flavonóides podem inibir PI-3 (Fosfoinositidio 3-quinase), e
consequentemente ativação da proteína quinase C (GAMET-PAYRASTRE et al.,
1999). No entanto, flavonoides também são capazes de inibir a PKC
diretamente (AGULLO et al., 1997), condições estas que demonstram uma
possível atividade inibitória do EE de Melissa officinalis sobre a proteína
quinase C por uma ação dos flavonóides nele presentes.
Acredita-se que os opióides produzam analgesia primariamente por sua
ação no SNC (PASTERNAK, 1988; JAFFE & MARTIN, 1990). No entanto, é
provável que o sistema opióide não esteja envolvido na ação antinociceptiva
do EE de Melissa officinalis, uma vez que a naloxona, antagonista não seletivo
dos receptores opióides, inibiu o efeito antinociceptivo da morfina, contudo
não foi capaz de inibir a antinocicepção causada pelo EE de Melissa
officinalis.
O presente estudo confirmou que a via L-arginina – óxido nítrico está
envolvida na ação antinociceptiva do EE de Melissa officinalis. Esta conclusão
deriva do fato de que o pré-tratamento dos animais com o substrato para a
NOS, a L-arginina, numa dose em que não produziu nenhum efeito “per se”
no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato, reverteu
significantemente a atividade antinociceptiva causada pelo inibidor da sintase
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73
do NO, L-NOARG, assim como a antinocicepção causada pelo EE. Ao contrário,
o pré-tratamento dos animais com o isômero inativo da L-arginina, a D-
arginina, não reverteu o efeito da L-NOARG e do EE no modelo do glutamato.
Por isso, o EE de Melissa officinalis deve exercer seu efeito antinociceptivo
por atuar, pelo menos em parte, inibindo a sintase do óxido nítrico (HORVÁTH
et al., 1999; FAIRBANKS et al., 2000; ARICIOGLU-KARTAL et al., 2003; HOU et
al., 2003; KARADAG et al., 2003, ÖNAL et al., 2003).
Este trabalho demonstrou que o EE de Melissa officinalis exerce seu
efeito antinociceptivo, pelo menos em parte, pela via colinérgica, tanto por
receptores nicotínicos como por receptores muscarínicos, visto que tanto a
mecamilamina (antagonista nicotínico α
2
β
3
seletivo), quanto a atropina
(antagonista muscarínico não seletivo) foram capazes de reverter a
antinocicepção causada pelo EE de Melissa officinalis e pelos seus respectivos
agonistas não seletivos, nicotina e pilocarpina. Corroborando com estes
dados, o estudo de Kennedy e colaboradores que demonstrou, através de um
estudo de “binding” em tecido do SNC (lobo occiptal) de humanos, que o EE
de Melissa officinalis foi capaz de deslocar a nicotina e a escopolamina de
receptores nicotínicos e muscarínicos, respectivamente. A acetilcolina exerce
seus efeitos através de receptores nicotínicos (acoplados a canais iônicos) e
muscarínicos (ligados à Proteína G) em múltiplos processos fisiológicos. No
entanto, está bem estabelecido que os agonistas colinérgicos e também os
acetilcolinesterásicos exercem efeitos antinociceptivos por diferentes vias de
sinalização, como modulação das vias serotoninérgica e adrenérgica
descendentes e aumento da secreção de neurotransmissores inibitórios como
GABA e glicina (JONES & DUNLOP, 2007). Os efeitos modulatórios sobre o
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74
sistema GABAérgico ocorrem principalmente via receptores GABA
B
, que
aumentam a condutância ao potássio e diminuem a condutância ao cálcio nos
nociceptores (LI et al., 2002).
Uma vez esclarecido que o EE de Melissa officinalis apresenta efeito
em modelos de dor aguda surgiu a dúvida se apresentaria também o mesmo
efeito na dor crônica. Desta forma, o extrato mencionado foi testado em
animais submetidos à ligadura parcial do nervo ciático, tendo em vista que
este modelo envolve tanto os mediadores químicos que participam da
nocicepção neurogênica quanto da inflamatória. Realmente, os resultados
obtidos neste modelo demonstram que o EE de Melissa officinalis inibiu
significativamente a alodínia mecânica por até 12 horas após a sua
administração. Além disso, os resultados comprovam que o EE administrado
uma vez ao dia, durante 7 dias, reduziu siginificativamente a alodínia
mecânica induzida pela constrição parcial do nervo ciático. Este efeito foi
evidente até o 7º dia de tratamento (inibição de 100%). Contudo, quando o
tratamento foi suspenso por 3 dias, a alodínia mecânica foi restabelecida. No
11º dia, o tratamento dos animais com o EE foi reiniciado e observou-se que o
mesmo foi capaz de reduzir a alodínia mecânica semelhante ao tratamento
agudo, indicando que o EE parece não apresentar efeito cumulativo, nem
induzir tolerância. Sabe-se que as sensações de dor estão normalmente
relacionadas à ativação de neurônios aferentes primários não mielinizados
(fibras C) ou pouco mielinizados (fibras Aδ), que são normalmente silenciosos
na ausência de estimulação, e respondem melhor aos estímulos
potencialmente nocivos. Entretanto, após a lesão no nervo periférico, estes
neurônios tornam-se anormalmente sensíveis e desenvolvem atividade
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75
espontânea patológica (BARON, 2006). A atividade espontânea ectópica
seguida pela lesão do nervo é produzida pelo aumento do número de canais de
sódio e cálcio dependentes de voltagem (LUO et al., 2001; HAINS et al.,
2004), estes últimos facilitando a liberação de glutamato e SP. Além disso,
sabe-se que há um aumento da produção de óxido nítrico (GARRY et al., 2000)
sugerindo, desta forma, uma possível relação do efeito antinociceptivo do EE
de Melissa officinalis com o sistema glutamatérgico e com a via L-arginina-
óxido nítrico.
Já foi confirmado que pacientes que apresentam dor também são
acometidos por quados de hipersensibilidade (hipernocicepção), tais quais a
hiperalgesia e a alodínia (MILLAN, 1999). A hiperalgesia é um estado
caracterizado pela diminuição do limiar nociceptivo e está associada à
resposta nociceptiva em vários modelos de nocicepção (térmica, química e
mecânica), tem origem no aumento da secreção de mediadores inflamatórios,
e estes tornam as fibras sensoriais nociceptivas mais sensíveis (JULIUS &
BASBAUM, 2001).
Neste estudo investigou-se também o efeito do EE de Melissa officinalis
na hiperalgesia causada por BK, PGE
2
e PMA. Dados na literatura demonstram
que vários mediadores pró-inflamatórios causam hipernocicepção por sua ação
sobre proteínas quinases, especialmente PKA, PKC e quinases ativadas por
mitógenos (SCHOLZ & WOOLF, 2002). Sabe-se, por exemplo, que em
nociceptores a bradicinina se liga a receptores B
2
, ativando diretamente a PKC
e indiretamente a PKA (FERREIRA et al., 2004, 2005). Conhece-se também que
a Prostaglandina E
2
atua por modular a corrente em canais iônicos e ativando
diretamente a PKA (PORTANOVA et al., 1996; KHASAR et al., 1999; TREBINO
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76
et al., 2003). O PMA por sua vez exerce seus efeitos diretamente sobre a PKC,
e desta forma modulando a liberação de diversos outros mediadores pró-
inflamatórios (SZALLASI & BLUMBERG, 1993; FERREIRA et al., 2005; TSUCHIYA
et al., 2005). Neste contexto, os resultados sugerem que o EE de Melissa
officinalis inibe a hiperalgesia induzida por diferentes agentes flogísticos por
inibir PKA e PKC. Contudo, são necessários estudos adicionais para confirmar
esta hipótese.
Uma vez confirmada essa atividade do EE de Melissa officinalis sobre
mediadores inflamatórios e tendo em vista sua utilização em medicamentos
para afecções inflamatórias do trato digestivo, decidiu-se constatar a
atividade do EE sobre um modelo inflamatório do sistema gastrointestinal
utilizando-se do modelo de colite induzida pelo ácido acético (SADREI et al.,
2003; SIMMEN et al., 2006; SCHEMMAN et al., 2007). Conforme o esperado, o
EE mostrou efeitos positivos também neste modelo, mostrando-se capaz de
reduzir os danos e o peso do cólon quando comparado ao controle. O
mecanismo de ação não está bem estabelecido, especula-se, no entanto, que
não seja uma ação semelhante à dexametasona, uma vez que o EE não produz
efeitos de diminuição do peso do baço dos animais, característico de
antiinflamatórios esteroidais que atuam por inibir a resposta imune (COE &
LUBACH, 2005).
No entanto, parte dos fármacos que promovem o alívio da dor pode
contrometer processo de memória, uma vez que interagem com o sistema
glutamatérgico, em especial com o receptor NMDA, que também está
envolvido na formação de novas memórias.
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77
Trabalhos demonstraram que o EE de Melissa officinalis seria um
potencial agente no tratamento de demências tais como o Alzheirmer, por
suas propriedades antioxidantes, sedativas e sua ação colinérgica já
comprovada (AKHONDZADEH et al., 2003; KENNEDY et al., 2002, 2003;
DASTMALCHI et al., 2007). Tendo em vista os dados supracitados, o EE de
Melissa officinalis foi testado no modelo da esquiva inibitória para avaliação
de uma suposta atividade facilitatória na memória. Este estudo mostrou que o
EE de Melissa officinalis, quando administrada uma hora antes do treino por
via oral, é capaz de facilitar tanto a aquisição quanto a retenção da memória,
quando administrada logo após o treino também por via oral. Este efeito
facilitatório pode ser observado tanto na memória de curta duração quanto na
memória de longa duração. É importante mencionar ainda que este efeito é
dissociado de qualquer efeito sedativo ou relaxante inespecífico, como foi
comprovado pelo teste de campo aberto realizado nos animais.
Além disso, o EE de Melissa officinalis demonstrou atuar sobre o
sistema glutamatérgico e colinérgico, além de sobre a via L-arginina- óxido
nítrico, que além de atuarem como vias modulatórias da nocicepção atuam
também como vias modulatórias da memória (CAMMAROTA et al., 2005).
É conhecido que a injeção sistêmica do antagonista do receptor NMDA,
MK-801, reduz o comportamento nociceptivo induzido por aminoácidos
excitatórios injetados intratecalmente (GADOTTI et al., 2006). No entanto,
também é conhecido que o MK-801 leva a prejuízos na memória (ROESLER et
al., 1999). Desta forma, quando os animais pré-tratados com MK-801 foram
tratados com EE de Melissa officinalis e submetidos à esquiva inibitória
observou-se uma reversão total do efeito facilitador do EE. O que leva a crer
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78
que os efeitos facilitatórios sobre a memória do EE de Melissa officinalis,
devem-se, ao menos em parte, à interação com o sistema glutamatérgico.
Uma vez que o referido sistema tem grande participação nos mecanismos de
formação de LTP, pois o estímulo inicial se dá através dos receptores AMPA,
que quando despolarizados provêem o desbloqueio dos canais NMDA. Estes
últimos quando abertos geram uma maciça entrada de íons cálcio os quais
ativam inúmeras proteínas quinases, que fosforilam receptores AMPA
internalizados fazendo com que eles se externalizem. Além disso, o aumento
da concentração intracelular de íons cálcio ativa a sintase do óxido nítrico,
que clivará L-arginina em citrulina e NO. O NO rapidamente se difunde para a
célula pré-sináptica reforçando ainda mais a sinapse e fazendo com que
ocorra uma maior liberação de glutamato na fenda (JI et al., 2003; WANG, HU
& TSIEN, 2006).
Outro mecanismo bastante envolvido com a formação e manutenção de
memórias é a via L-arginina óxido nítrico. Estudos demonstram que os
inibidores da sintase do óxido nítrico, como o L-NAME, têm efeito deletério
sobre a memória (EDWARDS & RICKARD, 2006; KHAVANDGAR et al., 2003).
Este estudo demonstrou que, ao menos em parte, os efeitos facilitatórios da
memória do EE de Melissa officinalis acontecem com a participação da via L-
arginina-óxido nítrico. Isso pode ser sugerido porque o pré-tratamento com L-
NAME preveniu os efeitos facilitatórios da memória exercidos pelo referido
extrato.
Além disso, demonstrou-se também, que ao menos em parte, o efeito
do EE de Melissa officinalis sobre a memória é devido ao sistema colinérgico,
tanto via receptores nicotínicos quanto muscarínicos, uma vez que os pré-
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79
tratamentos com mecaminalina (antagonista nicotínico α
2
β
3
) e atropina
(antagonista muscarínico não específico) foram capazes de reverter o efeito
do extrato. Efeito este devido provavelmente a modulação da atividade
glutamatérgica e da via L-arginina-óxido nítrico (GOLD, 2003; MIRANDA et al.,
2003).
Assim, vê-se que o EE de Melissa officinalis é capaz de exercer ações
antinociceptivas e facilitatórias da memória, no entanto, parece que essas
ações são dissociadas entre si. Uma vez que dados presentes na literatura
demonstram que normalmente há uma relação inversamente proporcional
entre as atividades antinociceptivas e facilitatorias da memória.
Especialmente quando há envolvimento do sistema glutamatérgico na
modulação da dor por alguma droga espera-se que esta leve a prejuízos na
memória. Uma vez que a formação e evocação de memórias dependem de
intensa ativação do sistema glutamatérgico e da via L-arginina-óxido nítrico e
a antinocicepçao requer uma inativação dos mesmos sistemas (HEALE &
HARLEY, 1990; CASTELLANO et al., 2001; GOULD et al., 2002; HLINAK &
KREJRI, 2002; BAST et al., 2003).
Desta forma, os dados obtidos neste estudo são importantes, pois
demonstram não só a atividade antinociceptiva do EE de Melissa officinalis via
antagonismo do sistema glutamatérgico, como também evidencia que a
atividade facilitatória da memória se dá por ativação do sistema
glutamatérgico. Uma hipótese que pode explicar este fato intrigante seria a
participação de compostos diferentes para cada tarefa. Presume-se que o
ácido rosmarínico, presente em grandes quantidades no extrato, pode ser um
dos responsáveis pela atividade antinocieptiva. Especula-se que as substâncias
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80
encontradas no EE de Melissa officinalis que beneficiam a memória sejam os
monoterpenos, como o citral, por sua ação inibitória sobre a
acetilcolinesterase (SALAH & JÄGER, 2005).
Em síntese, pode-se observar nas figuras 29 e 30 que a administração
sistêmica (v.o.) do EE de Melissa officinalis (1) produziu inibição da
nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos; (2) causou inibição
significativa da nocicepção neurogênica e inflamatória induzida pela formalina
e das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos;
(3) foi eficaz em inibir a alodínia resultante de constrição parcial do nervo
ciático em camundongos; (4) reverteu a hiperalgesia térmica e mecânica
causada por BK, PGE
2
e PMA em ratos; (5) preveniu danos no cólon de
camundongos no modelo de colite induzida por ácido acético; (6) é capaz de
prevenir o efeito pró-nociceptivo da administração intratecal de IL-1β e TNF-
α; (7) inibiu a resposta nociceptiva causada por NMDA, AMPA e Cainato, mas
não pelo trans-ACPD e pela SP; (8) não causou nenhuma alteração motora
significativa no teste do campo aberto; (9) teve a antinocicepção no modelo
do glutamato revertida pelo pré-tratamento com L-NOARG, mecamilamina e
atropina, mas não pela naloxona; (10) exerceu efeito facilitatório sobre a
memória de ratos no modelo da esquiva inibitória (Figura 30); (11) teve os
efeitos facilitatórios sobre a memória revertidos pelo pré-tratamento com MK-
801, L-NAME, mecamilamina e atropina.
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81
Melissa
officinalis
NOS
L- arginina
NO
GC
GTPGMPc
NMDAR
NMDAR
GG G
Núcleo
IL-1R
TNF-R
Transcrição
gênica via
ERK
B
2
PLC
PKC
IP
3
DAG
-
-
PKA
cAMP
EP M
1
α
2
β
3
α
2
β
3
+
+
-
[Ca
+2
]
-
-
-
+
[Na
+
]
[K
+
]
-
PKC
MAPK
G
M
1
Glutamato
+
GABA e
glicina
G
GABA
B
-
-
+
[K
+
]
[Ca
+2
]
Fibra nociceptiva aferente
Interneurônio
Figura 29: Prováveis mecanismos de ação envolvidos na atividade antinociceptiva do EE de
Melissa officinalis.O EE de Melissa officinalis parece exercer sua atividade antinociceptiva
por interagir com os sistemas: glutamatérgico (através dos receptores NMDA, AMPA e Cainato)
e colinérgico (através de receptores nicotínicos e muscarínicos), além da via L-arginina-óxido
nítrico.GABA
B
- receptor GABAérgico do tipo B, EP – receptor de PGE
2
, B
2
– receptor de
bradicinina, M1 – receptor muscarínico tipo 1 ou neural, α
2
β
3
– receptor nicotínico
predominantemente neuronal,TNF-R – receptor de TNF-α; IL-1R – receptore de IL-1β, PKA –
proteína quinase A, PKC – proteína quinase C, MAPK – quinase ativada por mitógenos,
c
AMP –
Monofosfato de adenosina cíclico, NOS – sintase de óxido nítrico, NO – óxido nítrico, GC –
guanilato ciclase, GMP
C
– Monofosfato cíclico de 3’5’ - guanosina, GTP – guanosina-5’-
trifosfato, [Ca
2+
] – concentração de cálcio, IP
3
– inositol
1,4,5- trisfosfato, DAG – diacilglicerol,
NMDAR – receptor glutamatérgico tipo NMDA, AMPAR – receptor glutamatérgico tipo AMPA (+)
ativação, (-) inibição.
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82
Melissa
officinalis
NOS
L- arginina
NO
GC
GTP
GMPc
NMDAR
Núcleo
Transcrição
gênica via
ERK
PKC
PKA
α
2
β
3
[Ca
+2
]
+
+
+
G
M
1
Glutamato
[Ca
+2
]
Neurônio hipocampal
CaMKII
Mg
+2
+
+
AMPAR
NMDARAMPAR
+
RE
RYR
[Ca
+2
]
Interneurônio
AMPAR
Figura 30: Prováveis mecanismos de ação envolvidos na atividade facilitatória da memória do
EE de Melissa officinalis. O qual parece exercer sua atividade por interagir com os sistemas
:glutamatérgico (através dos receptores NMDA e AMPA) e colinérgico (através de receptores
nicotínicos e muscarínicos), além da via L-arginina-óxido nítrico. M1 – receptor muscarínico
tipo 1 ou neural, α
2
β
3
– receptor nicotínico predominantemente neuronal, PKA – proteína
quinase A, PKC – proteína quinase C, CaMKII – Cálcio/calmodulina quinase II, NOS – sintase de
óxido nítrico, NO – óxido nítrico, GC – guanilato ciclase, GMP
C
– Monofosfato cíclico de 3’5’ -
guanosina, GTP – guanosina-5’-trifosfato, RE – retículo endosarcoplasmático, RYR – receptor
de rianodina, [Ca
2+
]
– concentração de cálcio, NMDAR – receptor glutamatérgico tipo NMDA,
AMPAR – receptor glutamatérgico tipo AMPA, Mg
+2
– íon magnésio, (+) ativação, (-) inibição.
Em um estudo de 1998, Carnat e colegas demonstraram que um dos
compostos mais abundantes nas folhas de Melissa officinalis é o ácido
rosmarínico, e estima-se que o EE de Melissa officinalis contenha 2 a 5% desta
substância. Ainda este mesmo estudo estimou que em uma xícara de chá feito
de folhas secas de Melissa officinalis encontram-se 60 a 180 mg de ácido
rosmarínico. Suas principais atividades são: adstringente, antioxidante,
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83
antiinflamatório, antimutagênico, antibacteriano e antiviral (PETERSEN &
SIMMOND, 2003). Sabe-se que o ácido rosmarínco é capaz de proteger contra a
perda de memória induzida por peptídeo β-amilóide em camundongos (ALKAM
et al., 2007). No entanto, estudos recentes indicam que o ácido rosmarínico
não tem qualquer efeito sobre a memória no modelo da esquiva inibitória em
ratos (PEREIRA et al., 2005). O que leva a crer que a ação do ácido
rosmarínico seja diretamente sobre o peptídeo e não sobre a formação da
memória em si.
Diante do acima descrito, optou-se por verificar também, de forma
sucinta a atividade antinociceptiva no ácido rosmarínico, submetendo-o ao
modelo de nocicepção induzida pelo glutamato, onde foi verificado que ele
exerce, na maior dose utilizada, uma inibição de aproximadamente 65%,
inibição esta muito semelhante à produzida pela maior dose do EE de Melissa
officinalis. Além disso, é importante mencionar que, se tratando de DI
50
, o
ácido rosmarínico foi cerca de setenta e quatro vezes mais potente que o EE
de Melissa officinalis. Desta forma, pode-se supor que ao menos em parte o
efeito antinociceptivo do EE de Melissa officinalis é devido ao ácido
rosmarínico.
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84
6. CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho, conclui-se que:
O EE da Melissa officinalis apresenta efeito antinociceptivo nos
modelos de nocicepção química induzida pelo ácido acético, glutamato
e formalina em camundongos;
O EE da Melissa officinalis é eficaz em inibir a alodínia mecânica no
modelo de neuropatia induzida pela constrição parcial do nervo ciático
em camundongos;
A hiperalgesia térmica e mecânica, geradas por agentes flogísticos tais
como BK, PGE
2
e PMA é inibida pelo EE de Melissa officinalis, em ratos;
O pré-tratamento com EE de Melissa officinalis previne os danos no
cólon no modelo de colite induzida por ácido acético em camundongos,
e essa ação parece não ser imune dependente;
O EE de Melissa officinalis é capaz de inibir o efeito pró-nociceptivo
das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α administradas pela via
intratecal em camundongos;
Os sistemas glutamatérgico, colinérgico e a via do óxido nítrico
parecem estar envolvidos na ação antinociceptiva do EE da Melissa
officinalis;
O EE da Melissa officinalis não causa déficit na performance motora
avaliada no teste do campo aberto em camundongos e em ratos;
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85
O Ácido Rosmarínico, substância encontrada em grande quantidade no
EE de Melissa officinalis, é capaz de inibir a nocicepção induzida pela
injeção de glutamato;
O EE da Melissa officinalis, exerce efeito facilitatório sobre a aquisição
e retenção da memória de curta e longa duração em ratas, no modelo
de esquiva inibitória;
O efeito do EE de Melissa officinalis se dá, pelo menos em parte, pelos
sistemas glutamatérgico, colinérgico e também pela via da L-arginina-
óxido nítrico;
Estes dados fornecem, pelo menos em parte, a fundamentação
científica para a utilização etnofarmacológica do extrato de Melissa
officinalis;
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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