( PDF ) Antagonistas adenosinérgicos revertem prejuízos cognitivos em modelo animal do transtorno de déficit de atenção

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Vanessa Aranega Pires

Antagonistas adenosinérgicos revertem prejuízos cognitivos

em modelo animal do transtorno de déficit de atenção

Florianópolis – SC

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

Antagonistas adenosinérgicos revertem prejuízos cognitivos

em modelo animal do transtorno de déficit de atenção

Vanessa Aranega Pires

Florianópolis – SC

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

Vanessa Aranega Pires

Antagonistas adenosinérgicos revertem prejuízos cognitivos em modelo animal

do transtorno de déficit de atenção

Florianópolis – SC

2008

Dissertação apresentada ao Curso

de Pós-Graduação em Farmacologia

do Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Santa

Catarina como requisito parcial à

obtenção de título de mestre em

Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Naoto

Takahashi

Aos meus pais, Lourdes e José Wilson, por todo o amor,

carinho, incentivo e dedicação; e em especial

à minha avó Terezinha pela realização

deste sonho, amo muito vocês !

“ São futeis e cheias de erros

as ciências que não nasceram da

experimentação, mãe de todo

conhecimento.”

Leonardo da Vinci

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Lourdes e Wilson, seres humanos admiráveis, que exalam bondade e sempre

abriram mão dos próprios sonhos para realização dos meus. Pessoas que tento seguir, mas que

não consigo chegar aos pés. Meu porto seguro, conselheiros e maiores incentivadores;

Aos meus avôs paternos Terezinha e José, e também aos maternos Nair e Gines, por não terem

poupado amor e dedicação durante grande parte da minha criação, eles infelizmente já se foram,

mas certamente estão felizes por mais esta etapa vencida;

A minha irmã Izadora, que nasceu para completar a minha vida e me mostrar o quanto o mundo

pode ser diferente, ela que sempre vibra com as minhas vitórias e apesar de crescida será sempre

a minha pequena;

Ao Professor Dr. Reinaldo Naoto Takahashi, pelos 4 anos de convívio e orientação, por ter me

aceitado em seu laboratório como aluna de iniciação cientifica e ter me incentivado a continuar e

hoje estar aqui;

Aos meus padrinhos Fátima e Martin, que sempre foram meus segundos pais e dividiram comigo

cada etapa da minha vida, seres iluminados os quais sempre terei respeito e admiração e também

a minha prima e hoje afilhada Taciana;

A D. Ilze e Sr. Lídio, os pais que me acolheram quando eu ainda uma menina cheguei a

Florianópolis, e com carinho e amor me incentivaram a continuar e a aprender a crescer com os

meus próprios erros;

A Ana Luisa e a Lisiane, com quem divido minhas alegrias e tristezas todos os dias ao chegar em

casa, amigas que amenizam a saudade que sinto de casa e são minha família em Florianópolis;

As velhas e eternas amigas, Bárbara, Débora, Luana, Maísa, Marina, Taisinha, Thalita e Thânea,

as quais morro de saudades, mas que sempre estão presentes em meus pensamentos e me

recebem de braços abertos a cada reencontro, apesar de estarmos tão longe e muito gratificante

perceber que a nossa amizade continua a mesma;

A minha irmã do coração Luana, a irmã que a vida me permitiu escolher, a irmã que mesmo a

quilômetros de distância dividiu comigo cada momento vivido nestes 6 anos longe de casa e que

muitas vezes foi a minha maior conselheira, mesmo que pelo telefone ou pela internet;

As minhas grandes amigas da faculdade, Ana Elisa, Caroline, Denise, Gabriela, Júlia e Stela,

Suelen que dividiram comigo os melhores anos da minha vida, as amigas que ganhei como

presente de formatura, algumas já tomaram seu caminho, outras ainda estão próximas

de mim, mas todas estão guardadas com muito carinho dentro da minha memória e do meu

coração;

As amigas que surgiram logo após o termino da faculdade, no período em que me senti mais

sozinha, já que a “turma” da faculdade não existia mais, as amigas que são tão recentes, mas

parecem que conheço desde que nasci, amigas pra todas as horas, amigas que sempre serão

amigas, as minhas amoras Aline, Betina, Cristiane, Franciane, Lisiane, Márcia e Nicolle;

Aos meus amigos que não se enquadram a nenhuma das outras coleções de amigos, mas que

possuem uma participação não menos especial na minha vida, pessoas que pra sempre vou amar,

Ana Paula, Daniela, Emerson, Fernanda, Flavinha, Gustavo, Moises e Roberto;

Ao professor Dr. Rui Daniel Prediger, por me apoiar e também orientar durante os obstáculos

encontrados no percurso;

Aos demais professores do Curso de Pós Graduação em Farmacologia, que sempre me guiaram

com entusiasmo e competência;

Aos colegas e ex-colegas do laboratório Aderbal, Daniel Rial, Fabrício Assini, Fabrício

Pamplona, Leandro, Luciano, Pablo, Rafael e em especial a Cristiane e Meigy pela amizade

durante estes anos de convívio;

Aos amigos e colegas da “Fármaco”, pelas conversas e risadas nos corredores, pelos apoio

sempre que precisei, pelos congressos, encontros fora da farmacologia e pela agradável

companhia;

A minha amiga Meigy, pelas infinitas ajudas durante todo o mestrado, por estar sempre pronta

para ajudar independente do dia ou da hora e também pela agradável companhia;

Aos colaboradores Claúdia, Daniel, Pablo, Pamplona e Rui pelas discussões que ajudaram a

realizar este trabalho;

Aos demais e funcionários do Curso de Pós Graduação em Farmacologia, por terem de alguma

forma contribuído para a realização deste trabalho;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro;

Acima de tudo e de todos agradeço a Deus, que em sua onipresença regeu minha vida, dando-me

amparo e equilíbrio nos momentos em que mais precisei. Minha eterna gratidão.

Aos colaboradores Claúdia, Daniel, Pablo, Pamplona e Rui pelas discussões que ajudaram a

realizar este trabalho;

Aos demais e funcionários do Curso de Pós Graduação em Farmacologia, por terem de alguma

forma contribuído para a realização deste trabalho;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro;

Acima de tudo e de todos agradeço a Deus, que em sua onipresença regeu minha vida, dando-me

amparo e equilíbrio nos momentos em que mais precisei. Minha eterna gratidão.

ÌNDICE

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... I

LISTA DE TABELAS .................................................................................................. IV

LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... V

RESUMO ...................................................................................................................... VI

ABSTRACT ................................................................................................................ VII

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 17

3. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 19

3.1. Animais .................................................................................................................. 19

3.2. Drogas .................................................................................................................... 20

3.3. Procedimentos experimentais ................................................................................ 21

3.3.1. Reconhecimento de objetos ................................................................................ 21

3.3.2. Locomoção .......................................................................................................... 26

3.3.3. Peso Corporal ...................................................................................................... 26

3.3.4. Pressão arterial .................................................................................................... 26

3.3.5. Reação de Imuno-histoquímica .......................................................................... 27

3.4. Análise estatística .................................................................................................. 30

4. RESULTADOS ........................................................................................................ 32

4.1. Comparação entre as linhagens WIS e SHR no teste do reconhecimento de objetos32

XIII

4.2. Efeitos da administração aguda de metilfenidato ou de cafeína na performance de ratos

machos WIS e SHR no teste de reconhecimento de objetos ........................................ 36

4.3. Efeitos da administração aguda de metilfenidato ou de cafeína na performance de ratos

fêmeas WIS e SHR no teste de reconhecimento de objetos ......................................... 39

4.4. Efeitos 24 horas após a administração aguda de metilfenidato ou de cafeína no teste de

reconhecimento de objetos em ratos fêmeas WIS e SHR ............................................. 43

4.5. Efeitos da administração aguda de antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos A1

e A2A no teste de reconhecimento de objetos em ratos fêmeas WIS e SHR. .............. 46

4.6. Efeitos da administração aguda de metilfenidato, cafeína e de antagonistas seletivos para

receptores adenosinérgicos A1 e A2A na pressão arterial de ratos fêmeas WIS e SHR49

4.7. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, durante a idade adulta, no teste

de reconhecimento de objetos, em ratos fêmeas WIS e SHR ....................................... 53

4.8. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, no teste de reconhecimento de

objetos, durante a adolescência, de ratos fêmeas WIS e SHR ...................................... 56

4.9. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, durante a idade adulta ou

durante a adolescência, na pressão arterial de ratos fêmeas WIS e SHR ..................... 60

4.10. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, durante a idade adulta ou

durante a adolescência, sob o peso corporal de ratos fêmeas WIS e SHR ................... 63

XIV

4.11. Análise imuno-histoquímica para expressão de receptores de adenosina A1 e A2A em

cérebros de ratos fêmeas adultos das linhagens WIS e SHR ........................................ 66

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 69

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 79

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Representação esquemática do mecanismo de ação do metilfenidato........5

Figura 2 - Representação esquemática de receptores adenosinérgicos........................ 10

Figura 3 – Representação esquemática da expressão de receptores adenosinérgico... 11

Figura 4 - Vista lateral dos três objetos utilizados no modelo de reconhecimento de objeto.

...................................................................................................................................... 22

Figura 5 – Representação da fase de habituação (campo aberto) ................................ 23

Figura 6 – Representação da fase de apresentação aos objetos ................................. ..24

Figura 7 – Representação da fase de reconhecimento dos objetos ....................... .......25

Figura 8 – Comparação entre ratos machos WIS e SHR no teste de reconhecimento de

objetos.......................................................................................................................................... 33

Figura 9 – Comparação entre ratos fêmeas WIS e SHR no teste de reconhecimento de

objetos.......................................................................................................................... 35

Figura 10 – Efeitos da administração de metilfenidato e de cafeína, no tempo de investigação (A)

e no índice de reconhecimento (B) em ratos machos WIS e SHR, no teste de reconhecimento do

objeto..............................................................................................................................37

Figura 11 – Efeitos da administração de metilfenidato e de cafeína, no tempo de investigação (A)

e no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas WIS e SHR, no teste de reconhecimento do

objeto. ........................................................................................................................... 40

Figura 12 – Efeitos da administração de metilfenidato e de cafeína, no tempo de investigação (A)

e no índice de reconhecimento, realizado 24 horas após a fase de apresentação aos objetos (B),

em ratos fêmeas WIS e SHR, no teste de reconhecimento do objeto. ........... ..............45

Figura 13 – Efeitos da administração de antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos

A1 - DPCPX e A2A – ZM241385, no tempo de investigação (A) e no índice de reconhecimento

(B) em ratos fêmeas WIS e SHR, no teste de reconhecimento do

objeto................................................................................................................................47

Figura 14 – Efeitos da administração de metilfenidato e de cafeína, sob a pressão arterial, em

ratos fêmeas WIS e SHR..................................................................................................50

Figura 15 – Efeitos da administração de antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos

A1 - DPCPX e A2A – ZM241385 sob a pressão arterial, em ratos fêmeas WIS e SHR.51

Figura 16 – Efeitos da administração repetida, de metilfenidato e de cafeína, durante a idade

adulta no tempo de investigação (A) e no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas WIS e

SHR, no teste de reconhecimento do objeto. ................................................................ 54

Figura 17 – Efeitos da administração repetida, durante a idade adulta, de metilfenidato e de

cafeína na atividade locomotora de ratos WIS e SHR fêmeas durante a fase de apresentação dos

objetos, no teste do reconhecimento de objetos........................................................... 55

Figura 18 – Efeitos da administração repetida, de metilfenidato e de cafeína, durante a

adolescência, no tempo de investigação (A) e no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas

adultos WIS e SHR, no teste de reconhecimento do objeto. ........................................ 58

Figura 19 – Efeitos da administração repetida, durante a adolecência, de metilfenidato e de

cafeína na atividade locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR durante a fase de apresentação dos

objetos, no teste do reconhecimento de objetos. ........................................................... 59

Figura 20 – Efeitos da administração repetida, durante a idade adulta, de metilfenidato e de

cafeína, sob a pressão arterial em ratos fêmeas adultos WIS e SHR............................61

III

Figura 21 – Efeitos da administração repetida, durante a adolescência, de metilfenidato e de

cafeína, sob a pressão arterial em ratos fêmeas adultos WIS e SHR............................62

Figura 22 – Efeitos da administração repetida, durante a adolescência (A), ou durante a idade

adulta (B) de metilfenidato e de cafeína, sob o ganho de peso corporal em ratos fêmeas adultos

WIS e SHR....................................................................................................................65

Figura 23 – Figura da expressão de receptores de adenosina A1, através de análises de imuno-

histoquímica, no hipocampo e no córtex parietal de ratos WIS e SHR. .................... ...67

Figura 24 – Figura da expressão de receptores de adenosina A2A, através de análises de imuno-

histoquímica, no hipocampo, córtex parietal e no estriado de ratos WIS e

SHR................................................................................................................................68

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Efeitos da administração (i.p.) de veiculo, metilfenidato ou cafeína, 30 min antes da

fase de apresentação aos objetos, na atividade locomotora de ratos machos WIS e SHR

.......................................................................................................................................38

Tabela 2 – Efeitos da administração (i.p.) de veiculo, metilfenidato ou cafeína, 30 min antes da

fase de apresentação aos objetos, na atividade locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR............42

Tabela 3 – Efeitos da administração (i.p.) de veiculo ou de antagonistas seletivos para receptores

adenosinérgicos A1 - DPCPX e A2A – ZM241385, 30 min antes da fase de apresentação aos

objetos, na atividade locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR............................................49

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA análise de variância

CA campo aberto

CAF cafeína

DA dopamina

DMSO dimetilsulfoxido

i.p. intraperitoneal

MAO monoamino-oxidase

MFD metilfenidato

MIX DPCPX (3 mg/kg) e ZM241385 (0,5 mg/kg)

PN pós-natal

SHR ratos espontaneamente hipertensos

SNC sistema nervoso central

TDAH transtorno do déficit de atenção e hiperatividade

WIS wistar

WKY wistar Kyoto

V solução veículo

RESUMO

O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos psiquiátricos

mais comuns em crianças e adolescentes, afetando cerca de 2 a 12% das crianças em idade

escolar. A linhagem de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) tem sido utilizada como

principal modelo animal para o estudo deste transtorno, já que estes animais apresentam

características comportamentais (hiperatividade, impulsividade e prejuízo atencional) e

neuroquímicas semelhantes às observadas neste transtorno em humanos. Trabalhos recentes

demonstraram que a administração de cafeína, um antagonista adenosinérgico não seletivo,

reverteu os prejuízos apresentados pelos ratos SHR nas tarefas de aprendizado espacial e de

memória social. Sendo assim o objetivo do presente estudo foi caracterizar o prejuízo

apresentado por ratos SHR machos e fêmeas na tarefa de reconhecimento de objetos quando

comparados aos ratos Wistar (WIS). Investigamos ainda o efeito agudo do metilfenidato, cafeína

e de antagonistas seletivos de receptores adenosinérgicos na idade adulta e também o efeito da

administração repetida de metilfenidato e cafeína na idade adulta ou durante a adolescência. Os

resultados demonstraram que os ratos WIS discriminam todos os objetos apresentados, enquanto

que os ratos SHR discriminam apenas os objetos com grandes diferenças estruturais. Foi também

observado que o tratamento intraperitoneal com metilfenidato (2 mg/kg), cafeína (1-10 mg/kg),

antagonistas adenosinérgicos seletivos para receptores A1 - DPCPX (5 mg/kg), antagonistas

adenosinérgicos seletivos para receptores A2A - ZM241385 (1 mg/kg) e também a associação de

doses não efetivas de DPCPX (3 mg/kg) + ZM241385 (0,5 mg/kg) na idade adulta reverteram o

prejuízo apresentado pelos ratos SHR na tarefa de reconhecimentos de objetos, sem alterar a

atividade locomotora ou a hipertensão apresentada por esses animais. Além disso, o tratamento

repetido de metilfenidato (2 mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg) durante a idade adulta ou durante a

adolescência reverteram de forma persistente o prejuízo apresentado nesta tarefa pelos ratos SHR,

no entanto a administração de ambas as drogas durante a adolescência causou prejuízo na

capacidade discriminatória dos ratos WIS quando testados na idade adulta. Surpreendentemente

não ocorreram diferenças entre as linhagens, na expressão de receptores adenosinérgicos do

subtipo A1 e A2A avaliada através da técnica de imuno-histoquímica. Estes resultados sugerem

que o desempenho dos ratos SHR na tarefa de reconhecimento de objetos parece estar

relacionado com prejuízos no aprendizado discriminatório, aos déficits atencionais e não com a

capacidade de armazenar informações. O presente estudo demonstra também que os antagonistas

seletivos e não seletivos de receptores adenosinérgicos revertem o prejuízo apresentado pelos

ratos SHR, sendo que os efeitos da administração repetida destas drogas podem persistir mesmo

após o termino do tratamento, sugerindo assim o potencial destas drogas para o tratamento dos

prejuízos cognitivos associados ao TDAH.

VII

ABSTRACT

Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most common childhood

psychiatric disorders, affecting between 2 and 12% of primary-school children. The

spontaneously hypertensive rat (SHR) is considered a genetic model for the study of this disorder

since it displays behavioral and neurochemical characteristics of ADHD. Recent studies

demonstrated that administration of the non selective adenosine receptor antagonist caffeine

improved memory impairments in SHR rats. Therefore the objective of this study was to

investigate whether adult male and female SHR exhibit altered short-term object recognition

abilities compared to Wistar rats (WIS). The acute effects of methylphenidate, caffeine, or

selective adenosine receptor antagonists in the performance of adults WIS and SHR rats in the

object recognition task and the effects of repeated administration of methylphenidate and caffeine

in adult age and adolescence were also evaluated. The results show that WIS rats displayed

discrimination ability for all the objects employed while, SHR only discriminated “distinct” pairs

of objects, they were not able to discriminate pairs of objects with subtle structural differences. In

addition, the acute intraperitoneal (i.p.) injection of methylphenidate (2 mg/kg), caffeine (1–10

mg/kg), the selective adenosine A

receptor antagonist DPCPX (5 mg/kg), the selective

adenosine A

receptor antagonist ZM241385 (1.0 mg/kg) or association with low doses with

DPCPX (3 m/kg) and ZM242385 (0,5 mg/kg), reversed the impairment of object recognition in

SHR, without altering the locomotion or hypertensive state. The repeated treatment with

methylphenidate (2 mg/kg) and caffeine (3 mg/kg) in the adult age or in adolescence improved

the object recognition deficits in the SHR rats. However, in WIS rats these treatments during

adolescence impaired the recognition task. Interestingly, no major differences in the

immunoreactivity of adenosine A

and A

receptors were observed in brain areas of WIS and

SHR rats. These findings suggest that the previously described inability of SHR in cognitive

paradigm may not be associated with their capacity to store information for short-term periods

but rather may reflect discriminative learning impairments associated with attentional deficits.

The present work also shows that selective and non selective adenosine receptors antagonists

improved the cognitive impairment in SHR rats. Moreover, the effects of repeated administration

of these drugs were persistent after the end of treatment, suggesting the potential of adenosinergic

drugs for the treatment of cognitive impairment associated to ADHD.

1. INTRODUÇÃO

1.1. TRANSTORNO DO DÉFICIT DE ATENÇÃO E HIPERATIVIDADE (TDAH)

O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos

psiquiátricos mais comuns em crianças e adolescentes, afetando cerca de 2 a 12% das crianças

mundiais em idade escolar (Sagvolden et al., 2005). Este transtorno costuma manifestar-se em

idade inferior a 7 anos, e cerca de 20 a 30% dos indivíduos que apresentaram TDAH na infância

ou adolescência continuam com a patologia na idade adulta (Muglia et al., 2000). No entanto, o

mais comum é que os sintomas de hiperatividade desapareçam com o tempo, permanecendo

apenas os sintomas relacionados ao déficit de atenção (Swanson et al., 1998). Essa desordem em

crianças é mais comum em meninos do que em meninas, porém quando analisados o gênero dos

pacientes que apresentaram os sintomas durante a infância ou adolescência e continuam

apresentando na idade adulta o número de mulheres é maior do que o de homens (Biederman et

al., 1994; Muglia et al., 2000).

O primeiro relato não científico utilizado para ilustrar o TDAH é o poema de 1865

“Felipe o inquieto” do médico alemão Heinrich Hoffman. Já as primeiras referências aos

transtornos hipercinéticos na literatura médica aparecem na metade do século XIX. Entretanto,

somente no início do século XX começou-se a descrever o quadro clínico de uma maneira mais

sistemática (Petry, 1999).

Apesar do grande número de estudos já realizados, as causas precisas do TDAH ainda não

são conhecidas. Entretanto, a influência de fatores genéticos e ambientais no seu

desenvolvimento é amplamente aceita na literatura (Tannock, 1998; Thapar et al., 1999). A

procura pela associação entre TDAH e complicações na gestação ou no parto tem resultado em

conclusões divergentes, mas tende a suportar a idéia de que tais complicações (toxemia,

eclampsia, pós-maturidade fetal, duração do parto, estresse fetal, baixo peso ao nascer,

hemorragia pré-parto, má saúde materna) predisponham ao transtorno (Faraone e Bierderman,

1998). Recentemente, Mick et al. (2002) documentaram uma associação significativa entre

exposição a fumo e álcool durante a gravidez e a presença de TDAH nos filhos, a qual se

manteve mesmo após controle para psicopatologia familiar (incluindo TDAH), adversidades

sociais e comorbidade com transtorno de conduta. Outros fatores, como danos cerebrais

perinatais no lobo frontal, podem afetar processos de atenção, motivação e planejamento,

relacionando-se indiretamente com a doença (Levy et al., 1998). É importante ressaltar que a

maioria dos estudos sobre possíveis agentes ambientais apenas evidenciaram uma associação

desses fatores com o TDAH, não sendo possível estabelecer uma relação clara de causa e efeito

entre eles (Faraone e Biederman, 1998).

Apesar dos critérios de diagnóstico ainda não estarem completamente definidos, pode-se

considerar que a sintomatologia primária do TDAH se caracteriza por hiperatividade,

impulsividade e déficit de atenção (Taylor, 1998; Himelstein et al., 2000). Os prejuízos

atencionais costumam ser bastante importantes e incluem distração exagerada e dificuldade em

manter a atenção focada em um determinado assunto ou objeto, o que costumeiramente traz

consigo dificuldades de aprendizado e problemas escolares (Sagvolden, 2000; Davids et al.,

2003). Os indivíduos freqüentemente apresentam outros problemas cognitivos, como dificuldade

em planejar tarefas, demora em realizar tarefas intelectuais simples, impetuosidade e

esquecimentos freqüentes. Além disso, o TDAH é considerado um dos grandes fatores de risco

para a delinqüência juvenil, abuso de drogas e distúrbios de personalidade, sendo bastante

comum a comorbidade com depressão e ansiedade (Taylor et al., 1998).

Existem três subtipos de diagnósticos para o TDAH: o TDAH onde os indivíduos são

predominantemente desatentos, distraídos e desorganizados que ocorre mais em meninas do que

em meninos; o TDAH predominantemente hiperativo e impulsivo que ocorre mais em meninos

do que em meninas; e o subtipo combinado onde os indivíduos apresentam dificuldades

atencionais e prejuízos cognitivos e ainda apresentam sintomas de hiperatividade e impulsividade

(Taylor et al., 1998).

Pouco se sabe sobre a origem neurobiológica deste transtorno psiquiátrico e, até o

momento, a hipótese mais provável é de que alterações cerebrais no sistema monoaminérgico

estejam envolvidas. Evidências clínicas, por exemplo, demonstram que inibidores da recaptação

de catecolaminas, como d-anfetamina ou metilfenidato (Ritalina), ou inibidores seletivos da

recaptação de noradrenalina, como os antidepressivos tricíclicos, provocam uma melhora

substancial na qualidade de vida dos portadores de TDAH (Biederman e Spencer, 1999; Seeman

e Madras, 1998). Por outro lado, a serotonina não parece ter grande relevância na etiologia do

TDAH, visto que o tratamento com inibidores seletivos da recaptação de serotonina promove

apenas benefícios limitados nos pacientes com TDAH (Barrickman et al., 1991). Mais

especificamente, considera-se que uma hipofunção do sistema dopaminérgico em áreas corticais,

límbicas e motoras do cérebro seja a principal responsável pelas alterações comportamentais

observadas nos pacientes com TDAH (Sagvolden e Sergeant, 1998). De fato, faz bastante sentido

que a dopamina esteja envolvida em uma patologia que congrega sintomas motores e cognitivos,

visto que duas das principais vias dopaminérgicas no sistema nervoso central (SNC) estão

envolvidas diretamente nestes processos (as vias nigro-estriatal e mesolímbica-cortical,

respectivamente) (Sagvolden e Sergeant, 1998). Além disso, sugere-se que uma atividade

aumentada dos transportadores de dopamina (Krause et al., 2003) ou da monoamino-oxidase

(MAO), a enzima responsável pela metabolização da dopamina (Stoff et al., 1989), poderiam

contribuir para a hipofunção do sistema dopaminérgico apresentada pelos portadores de TDAH.

Como conseqüência provável do hipofuncionamento deste sistema, crianças com sintomas de

hiperatividade relacionados ao TDAH apresentam também uma concentração aumentada de

receptores dopaminérgicos D

no cérebro em relação aos indivíduos sadios de mesma faixa etária

(Jucaite et al., 2005).

O metilfenidato, comercialmente conhecido como Ritalina ®, é um estimulante utilizado

como principal tratamento para o TDAH em crianças e adolescentes (Goldman et al., 1998).

Quando utilizado nas doses recomendadas, essa droga possui um elevado índice de segurança, no

entanto pouco se sabe sobre a conseqüência do uso crônico desta substância durante a infância e

adolescência, idades nas quais está ocorrendo um intenso desenvolvimento e inúmeras

modificações neuronais. No entanto, resultados recentes obtidos em roedores demonstraram

evidências comportamentais que sugerem prejuízos em funções cerebrais induzidos pelo uso

repetido de metilfenidato, e ainda, que essas modificações persistiram por um longo período após

o termino do tratamento e após a droga ter sido completamente excretada do organismo (ver

LeBlanc-Duchin e Taukulis, 2007).

O metilfenidato é um estimulante e seu mecanismo de ação é similar à observada na

cocaína e em anfetaminas (Volkow et al., 1995; Solanto, 2000). A conseqüência da exposição a

esses estimulantes é o aumento dos níveis sinápticos de dopamina e de noradrenalina em varias

regiões do cérebro como hipocampo e córtex pré-frontal (Kuczenski e Segal, 2001). Esse

medicamento possui como principal mecanismo de ação a inibição de transportadores de

dopamina (DAT) aumentando assim os níveis de dopamina extracelular, modificações ainda

podem ser observadas nos receptores dopaminérgicos do subtipo D

e também na

neurotransmissão dopaminérgica (Gatley et al., 1996; Kuczenski e Segal, 1997; Volkow et al.,

1998, 1999, 2001; Russell et al., 1998). Adicionalmente o metilfenidato pode afetar os sistemas

noradrenérgicos e serotoninérgicos através do bloqueio dos transportadores de noradrenalina e

serotonina, no entanto a afinidade por esses transportadores é menor do que pelos transportados

de dopamina (Gatley et al., 1996; Kuczenski e Segal, 1997).

Figura 1 – Representação esquemática do mecanismo de ação do metilfenidato (elaborada por

Rial, 2008).

A administração crônica de cocaína ou anfetaminas em animais de laboratório, durante o

inicio da fase de desenvolvimento ou durante a idade adulta, resultaram em modificações

funcionais no SNC que trouxeram como conseqüência déficits cognitivos e modificações

comportamentais (ver Robinson e Kolb, 2004). Devido às semelhanças neurofisiológicas entre

esses estimulantes e o metilfenidato, imagina-se que o tratamento crônico com essa droga possa

afetar vários processos críticos para o aprendizado e processos envolvidos na memória de

trabalho. A memória de trabalho está relacionada à integridade funcional do córtex pré-frontal, o

qual depende dos níveis sinápticos de dopamina e noradrenalina (Arnsten e Li, 2005). Evidências

sugerem que o metilfenidato ajuda na manutenção desses níveis e restaura funções cognitivas de

indivíduos que apresentam diminuição nos níveis sinápticos de catecolaminas (Arnsten e Li,

2005). No entanto, em indivíduos que apresentam níveis normais de catecolaminas, o uso

prolongado de metilfenidato pode induzir perturbações que irão causar adaptações neuronais

podendo prejudicar a eficiência das funções cognitivas. Heyser, Pelletier e Febres (2004)

encontraram prejuízos na memória de reconhecimento em animais jovens que foram tratados com

metilfenidato 5 mg/kg (i.p.) duas vezes ao dia durante 7 dias.

O número de prescrições desse medicamento aumentou drasticamente na ultima década

(Olfson et al., 2002), isso tem ocorrido devido a um diagnóstico equivocado, já que comumente

crianças que são um pouco mais agitadas são repreendidas e diagnosticadas como portadoras do

TDAH. Sendo assim, se torna claro a necessidade de pesquisas clinicas para determinar

precisamente a severidade dos sintomas que justifiquem o uso de estimulante como tratamento

para esse transtorno, já que esse diagnóstico é realizado cada vez mais cedo, colocando em risco

o desenvolvimento cerebral de crianças que estão iniciando esse tratamento antes mesmo dos 2

anos de idade (Zito et al., 2000).

1.2. RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR)

Diversas tentativas têm sido realizadas na expectativa de se desenvolver um modelo

animal que represente fielmente as particularidades do TDAH. Isto é, que mimetize as

características comportamentais, apresente um perfil similar de resposta aos tratamentos

farmacológicos vigentes e apresente características neurobiológicas semelhantes aos portadores

deste transtorno. Até o momento, alguns modelos animais foram propostos: ratos selecionados

para hiperlocomoção a partir de uma população heterogênea (Puumala et al., 1996), ratos

expostos a toxinas ambientais (Silbergeld e Goldberg, 1974; Holene et al, 1998), ratos com lesões

neurológicas induzidas por toxinas dopaminérgicas (Shaywitz et al., 1976) e pelo menos três

modelos genéticos: Ratos Espontaneamente Hipertensos - SHR (Sagvolden, 2000), ratos Naple

com alta e baixa excitabilidade (Sadile et al., 1996) e camundongos deletados geneticamente para

o transportador de dopamina (Giros et al., 1996). Cada um destes modelos animais apresenta suas

vantagens e desvantagens e, de certa forma, cada um deles é capaz de mimetizar uma ou outra

característica do TDAH. No entanto, os ratos da linhagem isogênica SHR têm sido considerados,

até o momento, o modelo animal mais completo, e por isso o mais utilizado, no estudo do TDAH

(Davids et al., 2003).

A linhagem de ratos SHR foi desenvolvida a partir da seleção de ratos Wistar-Kyoto com

fenótipo de hipertensão e, surpreendentemente, os animais apresentavam também índices

aumentados de atividade locomotora (Moser et al., 1988). Então, Okamoto e Aoki (1963)

utilizando-se da técnica de cruzamentos parentais, criaram a linhagem isogênica SHR, que além

de hiperlocomoção, apresentou dificuldades de aquisição em tarefas de memória e respostas

excessivas em tarefas de condicionamento operante, refletindo aspectos fundamentais do TDAH,

como o déficit de aprendizado, a hiperatividade e a impulsividade, respectivamente (Sagvolden e

Sergeant, 1998; Sagvolden, 2000; Russell, 2002). Estes animais apresentam também

características neurobiológicas semelhantes ao esperado para os pacientes de TDAH, como uma

hipofunção do sistema dopaminérgico, resultante de uma baixa liberação de dopamina (Russel et

al., 1995) aliada a uma atividade aumentada da MAO, o que diminuiria a disponibilidade deste

neurotransmissor na fenda sináptica (Boix et al., 1998).

Foram também encontrados níveis aumentados de adenosina nos cérebros de ratos SHR,

juntamente a uma baixa atividade da enzima adenosina deaminase, responsável pela

metabolização de adenosina, sugerindo uma possível disfunção do sistema adenosinérgico que

poderia contribuir para a disfunção primária observada no sistema dopaminérgico (Davies et al.,

1987). Existem também várias evidências que suportam o papel modulatório da adenosina em

processos de aprendizado e memória, podendo ser esse desequilibro no sistema adenosinérgico o

responsável pelos déficits apresentados por esses animais.

Outra importante característica dos ratos SHR é que esses animais apresentam uma

relativa diminuição na atividade locomotora e uma melhora nos déficits de aprendizado em

resposta ao tratamento com metilfenidato, o que valida farmacologicamente este modelo animal

(Ueno et al., 2002; Fox et al., 2002, Adriani et al., 2004). Como conseqüência, eles têm sido

intensamente estudados com o objetivo de se investigar os processos de aprendizado e memória

dos portadores de TDAH, visando à possibilidade de desenvolvimento de novas terapias

farmacológicas.

O déficit de aprendizado apresentado pelos ratos SHR foi demonstrado em diversas

tarefas, tais como a esquiva ativa de duas vias (Sutterer et al., 1980), o modelo de

reconhecimento social (Prediger et al., 2005a), o labirinto radial (Wyss et al., 1992; Mori et al.,

1995; Nakamura-Palacios et al., 1996) e o labirinto aquático de Morris (Gattu et al., 1997; Wyss

et al., 2000; Terry et al., 2000; De Bruin et al., 2003, Prediger et al., 2005b). Outros estudos têm

demonstrado que esses prejuízos cognitivos apresentados pelos ratos SHR podem estar

relacionados com a falta de atenção apresentada por esses animais causando assim uma

dificuldade de aprendizado (De Bruin et al., 2003; Ferguson e Cada, 2004). No entanto, outros

estudos têm criticado o uso de ratos SHR para o estudo do TDAH, já que esses animais não

demonstraram apresentar prejuízos cognitivos em algumas das tarefas avaliadas e apresentaram

hiperlocomoção, quando comparados a outras linhagens, em apenas algumas idades especificas.

Foi possível também observar que os ratos SHR não responderam ao tratamento com

metilfenidato, que é a droga mais utilizada para o tratamento do TDAH (van den Bergh et al.,

2006; Alsop, 2007; Bizot et al., 2007).

1.3. SISTEMA ADENOSINERGICO

A adenosina é um neuromodulador, presente em grande quantidade no SNC, que

desenvolve um importante papel na regulação da transmissão sináptica e na excitabilidade

neuronal (Cunha, 2001). A relevância dos receptores de adenosina foi inicialmente reconhecida

através da cafeína, que atua antagonizando de forma não seletiva receptores adenosinérgicos A

(Synder et al., 1981). Até o presente momento, quatro diferentes subtipos de receptores para

adenosina (A

, A

e A

) foram clonados e identificados em humanos e roedores, sendo que

todos os subtipos são receptores acoplados à proteína G. As ações fisiológicas da adenosina no

SNC parecem ser mediadas, principalmente, pelos subtipos A

e A

, que possuem elevada

afinidade pela adenosina, além de serem altamente expressos em diversas áreas cerebrais. Os

receptores A

e A

estão acoplados a proteínas G “inibitórias” (Gi ou Go) e os receptores A

estão acoplados a proteínas G estimulatória (Gs) (Fredholm et al., 2001; Linden, 2001).

Figura 2 - Representação esquemática de receptores adenosinérgicos (elaborado por Rial, 2008).

O receptor adenosinérgico do subtipo A

é o mais abundante no SNC, principalmente na

região do neocórtex, cerebelo, hipocampo e corno dorsal da coluna vertebral. Já os receptores

são altamente expressos em neurônios pálido-estriatais e no bulbo olfatório, uma leve

expressão desses receptores também é encontrada em outras regiões cerebrais como, por

exemplo, o hipocampo (Fredholm et al., 2001; Ribeiro et al., 2003).

Figura 3 – Representação esquemática da expressão de receptores adenosinérgico, (adaptado de

Ribeiro et al., 2003).

Várias evidências suportam o papel modulatório da adenosina em processos de

aprendizado e memória, inclusive mecanismos celulares básicos envolvidos na formação da

memória, como a potencialização de longa duração (LTP) (de Mendonça e Ribeiro, 1994) e

depressão de longa duração (LTD) (de Mendonça et al., 1997). De fato, diversos estudos

demonstram o envolvimento do sistema adenosinérgico na atenção, bem como nos processos de

aprendizado e memória tanto em humanos quanto em animais (Kenemans e Verbaten, 1998), mas

poucos estudos têm relacionado as propriedades farmacológicas de drogas que atuam neste

sistema com o TDAH (Bizarro et al., 2004). Grande parte dos efeitos da cafeína no SNC são

decorrentes da sua interação com os receptores de adenosina presentes no cérebro, atuando como

Estriado

Amigdala

Bulbo olfatório

Substância negra

Neocortex

Hipocampo

Tálamo

Cerebelo

Medula espinhal

Núcleo do

trato

solitário

Estriado

Amigdala

Bulbo olfatório

Substância negra

Neocortex

Hipocampo

Tálamo

Cerebelo

Medula espinhal

Núcleo do

trato

solitário

Estriado

Amigdala

Bulbo olfatório

Substância negra

Neocortex

Hipocampo

Tálamo

Cerebelo

Medula espinhal

Núcleo do

trato

solitário

Estriado

Amigdala

Bulbo olfatório

Substância negra

Neocortex

Hipocampo

Tálamo

Cerebelo

Medula espinhal

Núcleo do

trato

solitário

Estriado

Amigdala

Bulbo olfatório

Substância negra

Neocortex

Hipocampo

Tálamo

Cerebelo

Medula espinhal

Núcleo do

trato

solitário

um antagonista não-seletivo destes receptores. A utilização de agonistas de receptores

adenosinérgicos A1 (Zarrindast e Shafaghi, 1994), ou possivelmente de ambos os subtipos A1

e/ou A2A (Prediger e Takahashi, 2005c), está diretamente relacionada a prejuízos cognitivos,

enquanto o antagonismo dos receptores A2A (Prediger et al., 2005a) ou de ambos os receptores

A1 e/ou A2A (Prediger e Takahashi, 2005c) é capaz de reverter o desempenho de animais

submetidos a tarefas de aprendizado e memória.

Evidências sugerem que a maioria dos efeitos psicofarmacológicos da cafeína sejam

mimetizados somente pelos antagonistas dos receptores A2A e não pelos antagonistas do subtipo

A1, embora a cafeína seja um antagonista não seletivo de receptores adenosinérgicos

(Svenningsson et al., 1997; Huang et al., 2005). Estima-se que os efeitos de antagonistas

adenosinérgicos estejam intimamente relacionados com a ativação de receptores dopaminérgicos,

sugerindo inclusive que a integridade do sistema dopaminérgico seja imprescindível para que a

cafeína exerça seus efeitos estimulatórios (Ferré et al., 1992). De fato, há uma grande co-

localização entre os receptores adenosinérgicos e dopaminérgicos no SNC, sendo possível a

formação de heterodímeros entre os receptores A1/D1 e A2A/D2, levando a alterações alostéricas

que afetam a afinidade e o acoplamento à proteína G, modulando a eficácia de ativação de ambos

os receptores (Fuxe et al., 1998), interferindo assim em processos de aprendizado e de formação

de memória (Franco et al., 2000; Hillion et al., 2002; Franco et al., 2007). Por este motivo,

aparentemente, os agonistas dos receptores de adenosina produzem efeitos comportamentais

similares aos dos antagonistas da dopamina, enquanto que os efeitos dos antagonistas da

adenosina assemelham-se àqueles induzidos por agonistas dopaminérgicos (Fuxe et al, 1998).

Além dos efeitos cognitivos, há evidências de que o tratamento repetido com drogas

psicoestimulantes, como a cafeína, poderia diminuir a atividade locomotora exagerada

apresentada pelos ratos SHR, possivelmente também envolvendo uma interação com o sistema

dopaminérgico (Wultz et al., 1990). Portanto, levando-se em consideração as evidências acima

expostas, parece bastante factível que a manipulação do sistema adenosinérgico possa resultar em

uma intervenção farmacológica no TDAH para ambas as características de déficit de atenção e de

hiperatividade observadas neste distúrbio comportamental.

A cafeína pertence ao grupo dos compostos químicos chamados de metilxantinas, ela é a

substância psicoativa mundialmente mais consumida, seu grande consumo ocorre principalmente

pelo fato de que ela é um constituinte químico importante de várias bebidas alimentícias ou

estimulantes não alcoólicos e está presente em vários alimentos utilizados diariamente na

alimentação mundial, como no café, chás, chocolates e em refrigerantes a base de guaraná ou

cola, seja como preparações caseiras ou produtos industrializados, com grande importância

econômica e cultural. A cafeína é obtida de fontes vegetais, principalmente do café.

Bebidas contendo metilxantinas são consumidas desde tempos remotos, datando

provavelmente da era paleolítica. A mais antiga delas parece ser o chá-da-índia, cuja primeira

menção documentada de uso é atribuída ao imperador chinês Shen Nung, em 2737 a.C. O

primeiro relato escrito do uso do café data do século X, utilizado como bebida quente na Arábia,

por volta de 1000 d.C. Porém, este vegetal é cultivado na Etiópia desde 575 d.C., onde foi

inicialmente utilizado triturado com gordura, como alimento e a partir da fermentação dos frutos,

como vinho. O cacau também tem uma longa história. Uma bebida doce, considerada um

presente dos deuses e obtida a partir da fermentação, denominada chocolate, foi oferecida pelo

imperador asteca Montezuma aos conquistadores espanhóis em 1519. Esta bebida foi introduzida

na Europa, onde se popularizou e, em 1876, passou a ser produzida com leite, na Suíça, de onde

se originaram as mais variadas formas, consumidas e apreciadas mundialmente (Roberts e

Barone, 1983; Stefanovich, 1989).

A farmacocinética da cafeína depende de vários fatores como idade, peso, tabagismo,

regime alimentar, insuficiência hepática e outras condições patológicas. A cafeína é absorvida

facilmente por via oral, sendo que 99 % da absorção ocorre no trato gastrintestinal e os picos

plasmáticos são obtidos em 15 a 45 minutos. Ela possui metabolização hepática sendo que o

principal metabólito da cafeína no homem é a parametilxantina (70%), a excreção é urinária e o

tempo de meia-vida da cafeína está entre 5 e 6 horas (Borstel, 1983; Sawynok, 1995).

A cafeína possui vários alvos farmacológicos, como a inibição da fosfodiesterase e o

bloqueio de receptores GABA

(Fredholm et al., 1999), no entanto seu principal alvo é o

antagonismo da ação da adenosina, um neuromodulador presente em grande quantidade no SNC,

que ocorre através do impedimento da ligação de adenosina em seus receptores metabotrópicos

e A

de forma não seletiva (Snyder et al., 1981).

Esta substância é conhecida pela sua capacidade de melhorar a atenção e a memória

(Fredholm et al., 1999), efeitos esses que estão sendo estudados e demonstrados em diferentes

laboratórios. Estudos pré-clinicos em roedores demonstram o potencial da cafeína na melhora de

prejuízos cognitivos relacionados a dificuldades de aprendizado e déficits de memória (Takahashi

et al., 2008), como os recentemente executados em nosso laboratório onde a cafeína foi capaz de

reverter o prejuízo na performance de ratos SHR em tarefas de memória espacial no labirinto

aquático de Morris e na tarefa de memória social (Prediger et al., 2005a, b). Já em humanos,

estudos sobre possíveis efeitos do consumo de cafeína, em processos cognitivos, ainda são

contraditórios já que não se demonstram claras evidências da melhora dos indivíduos quando

submetidos a testes cognitivos (Hameleers et al., 2000; Smit e Rogers, 2000; Rogers et al., 2003;

van Boxtel et al., 2003; Haskell et al., 2005).

1.4. RECONHECIMENTO DO OBJETO

A tarefa de reconhecimento do objeto, originalmente proposto por Ennaceur e Delacour

(1988), é uma ferramenta experimental de bastante utilidade. O protocolo fundamental deste

modelo é bastante simples e utiliza basicamente um campo aberto e pelo menos dois modelos

diferentes de objetos, que serão apresentados aos animais. Primeiramente os animais precisam ser

habituados ao campo aberto, de modo a se familiarizarem ao aparelho, o que aguça a curiosidade

dos animais pelos objetos que posteriormente serão adicionados ao ambiente (Besheer e Bevins,

2000). Após esta etapa, dois objetos idênticos são adicionados ao campo aberto e se observa o

tempo que o animal permanece investigando cada um dos objetos (fase de apresentação dos

objetos). Depois de um intervalo de tempo variável (dependendo da intenção em se avaliar

memória de curta ou longa duração), substitui-se um dos objetos e avalia-se novamente o tempo

que o animal permanece investigando cada um dos objetos (fase de reconhecimento dos objetos).

Nesta etapa, a tendência natural é que o animal reconheça o objeto exposto na primeira etapa e

investigue o objeto novo por um maior período de tempo em relação ao objeto familiar. A

popularidade desde modelo tem aumentado já que o animal não precisa ser exposto a estímulos

aversivos, restrição de água ou de alimentos, o procedimento não necessita de varias sessões de

treino e ainda pode ser facilmente replicado em diversos laboratórios tanto para ratos como para

camundongos (Bevins e Besheer, 2006). Embora de simples execução, este modelo experimental

envolve aspectos de locomoção, atenção, aprendizado e memória, que podem torná-lo um modelo

bastante útil para avaliação de drogas com potencial para o tratamento do TDAH.

Além da possibilidade de se avaliar possíveis efeitos de drogas sobre o comportamento

exploratório durante as sessões de habituação, pode-se observar efeitos de drogas sobre a

aquisição de informações durante a fase de apresentação dos objetos e sobre a capacidade visual

discriminatória durante a fase de reconhecimento dos mesmos. Ambas as tarefas são processos

mnemônicos nos quais a atenção possui uma importância fundamental (Norman e Eacott, 2004).

No desenvolvimento do presente estudo, utilizaremos uma versão modificada do modelo

de reconhecimento do objeto, sugerida recentemente por Norman e Eacott (2004), que intensifica

a dificuldade da tarefa e aumenta ainda mais a sua utilidade como modelo de atenção. A principal

diferença da modificação proposta por estes autores é que na fase de reconhecimento dos objetos,

ao invés de se utilizar apenas uma opção de objeto novo, os animais são expostos a objetos com

diferentes níveis de complexidade estrutural, comparados ao objeto familiar. Desta forma, uma

maior capacidade discriminatória é requerida aos animais, havendo necessidade de maior atenção

na fase de reconhecimento dos objetos para que o animal perceba as diferenças sutis entre o

objeto familiar e o novo. Sendo assim será possível avaliar a capacidade discriminatória das

linhagens utilizadas e investigar a participação do sistema adenosinérgico nos resultados

encontrados, com a expectativa de caracterizar a participação do mesmo como um possível alvo

farmacológico para o tratamento dos prejuízos cognitivos característicos do TDAH.

2. OBJETIVOS

Considerando os fatos relatados na introdução, o objetivo do presente estudo foi comparar

a performance dos ratos WIS e SHR na tarefa de reconhecimento de objetos, e investigar a

participação do sistema adenosinérgico nos prejuízos cognitivos encontrados na linhagem SHR.

Para tanto, as seguintes etapas serão realizadas:

• Caracterizar o prejuízo atencional dos ratos SHR em comparação ao desempenho dos

ratos WIS na versão modificada do modelo de reconhecimento do objeto;

• Investigar o envolvimento do sistema adenosinérgico no prejuízo cognitivo apresentado

pelos ratos SHR através da administração de cafeína;

• Comparar os efeitos do tratamento com cafeína ao metilfenidato, principal terapia

farmacológica utilizada para o TDAH;

• Identificar em qual subtipo de receptores adenosinérgicos ocorre a ação da cafeína,

através da administração de antagonistas seletivos para receptores A

ou A

2A ;

• Investigar o efeito do tratamento agudo com cafeína, metilfenidato e antagonistas

seletivos de receptores adenosinérgicos sobre a pressão arterial, a fim de descartar o

papel da pressão arterial nos resultados encontrados;

• Avaliar os efeitos do tratamento repetido com cafeína ou metilfenidato em ratos WIS e

SHR adultos na tarefa de reconhecimento de objetos, locomoção, pressão arterial e ganho

de peso corporal;

• Avaliar a persistência do efeito do tratamento repetido com cafeína ou metilfenidato em

ratos WIS e SHR durante a adolescência na tarefa de reconhecimento de objetos,

locomoção, pressão arterial e ganho de peso corporal na idade adulta;

• Investigar possíveis diferenças na expressão de receptores adenosinérgicos A1 e A2A no

córtex parietal e hipocampo entre as linhagens WIS e SHR através da técnica de imuno-

histoquímica.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Ratos machos e fêmeas, adolescentes e adultos, das linhagens SHR e Wistar foram

utilizados para os procedimentos experimentais. A adolescência foi definida entre período pós-

natal (PN) 20 e 34 dias, idade correspondete a pré-adolescencia em humanos (Andersen et al.,

2001), já a idade adulta foi definida pelo período entre PN 75 e PN 90.

A colônia de ratos SHR utilizada neste estudo é originária da Universidade de Harvard

(Boston, MA) sendo obtida a partir da UNESP (Botucatu, SP, Brasil) em 1999. A partir daí, os

ratos SHR foram mantidos no laboratório de Genética do Comportamento da UFSC

(Florianópolis, SC, Brasil) sob um sistema de acasalamento irmão/irmã como recomendado para

todas as linhagens consangüíneas (ILAR, 1992). A linhagem SHR foi considerada como

isogênica uma vez que os animais apresentaram uma alta homologia de DNA entre seus

indivíduos (Ramos et al., 1997). Para realização deste estudo as colônias de ratos SHR foram

criadas e mantidas em nosso laboratório.

Embora a linhagem Wistar Kyoto possua um background genético semelhante aos do

SHR, o que faz dela a melhor linhagem para comparações que visam buscar explicações sobre

fenômenos dos ratos SHR, especialmente em estudos de hipertensão, traço para o qual a

linhagem SHR foi desenvolvida a partir da WKY (Okamoto e Aoki, 1963), não a utilizamos

como linhagem controle, já que nosso estudo investiga a participação do sistema adenosinérgico

nos prejuízos cognitivos dos ratos SHR, e alguns estudos demonstram que a linhagem WKY

também possui prejuízos em relação às linhagens heterogênicas mais comuns (Grauer e Kapon,

1993; De Bruin et al., 2003; Clements e Wainwright, 2006). Por esse motivo, e após validação

das habilidades cognitivas da linhagem WIS em vários modelos experimentais utilizados

anteriormente em nosso laboratório, resolvemos utilizar a linhagem de ratos WIS como controle,

refletindo uma população geneticamente heterogênica.

Sendo assim a colônia de ratos Wistar é originária da EPM/UNIFESP (São Paulo, SP,

Brasil), sendo criadas e mantida no biotério central da UFSC (Florianópolis, SC, Brasil) desde

1991. Para a realização deste estudo as colônias de ratos Wistar, considerados uma população

heterogênea, foram obtidas do biotério central da UFSC.

Os animais foram desmamados e separados por sexo com quatro semanas de idade, é após

isso, foram agrupados em cinco ou seis em gaiolas plásticas (42 x 34 x 17 cm), e mantidos em

ambiente com temperatura controlada (23 ± 1 °C) e ciclo claro-escuro de 12 horas (fase clara

7:00-19:00). Alimento e água foram disponibilizados ad libitum. O estágio do ciclo estral das

fêmeas WIS e SHR não foi analisado nos experimentos realizados, já que se pretendeu avaliar o

comportamento de uma população heterogênea. Todos os procedimentos experimentais foram

realizados entre as 09:00 e 17:00 horas e ocorreram de acordo com as normas de conduta com

animais experimentais do Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Federal de

Santa Catarina (CEUA-UFSC).

3.2. Drogas

As drogas utilizadas foram metilfenidato (Ritalin ®, Norvartis, Brasil) na dose de 2 mg/kg

e o antagonista de receptores adenosinérgico não seletivo cafeína (Sigma., USA) nas doses de 1,

3 e 10 mg/kg que foram dissolvidas em 0,9 % de NaCl (salina). Também foram utilizados os

antagonistas adenosinérgicos seletivos para receptores A1 ciclopentil-1,3-dipropilxantina

(DPCPX) nas doses de 1, 3 e 5 mg/kg e o antagonista adenosinérgico seletivo para receptores

A2A 4-(2-[7-amino-2-{2-furil}{1,2,4}triazolo-{2,3-a}{1,3,5} triazin-5-il-amino]etil)fenol

(ZM241385) nas doses de 0,5 e 1 mg/kg (Tocris Cookson, USA) que foram dissolvidos em salina

com 10 % de dimetilsulfoxido (DMSO). A solução controle consistiu do veículo utilizado para

dissolver as drogas. Todas as doses foram selecionadas a partir de experimentos pilotos ou de

estudos prévios (Prediger et al., 2005a,b, Andersen et al., 2001).

As drogas foram administradas intraperitonealmente (i.p.) no volume de 1ml/kg de peso

corporal para os animais tratados na idade adulta e no volume de 5 ml/kg de peso corporal para

os animais tratados na adolescência. A administração ocorreu trinta minutos antes da fase de

apresentação aos objetos, no tratamento agudo e uma vez ao dia, durante 14 dias no tratamento

repetido. O tratamento teve inicio no 20° dia PN para os animais tratados na adolescência.

3.3. Procedimentos experimentais

3.3.1. Reconhecimento de objetos

Campo aberto

O campo aberto (CA) para ratos consiste em uma arena feita de madeira com 100x100

cm de base, pintada de branca e dividida por linhas pretas formando 25 quadrados de 20x20 cm.

A base é cercada por paredes brancas de madeira com 40cm de altura. A luminosidade do

ambiente foi mantida em cerca de 10 Lux. Após o final de sessão de análise comportamental o

campo aberto foi limpo com álcool 10 % e papel toalha.

Objetos

Três cubos, um "T" e uma pirâmide (“P”) feitos de blocos plásticos desmontáveis,

medindo 10 X 10 cm, foram utilizados na tarefa de reconhecimento do objeto (ver Figura 1). A

fim de se verificar a influência do nível de ambigüidade entre os objetos na capacidade de

reconhecimentos dos mesmos, graus crescente de complexidade estrutural foram utilizados no

presente estudo. Os objetos A1, A2 e A3 foram representados pelos cubos e os objetos B

representados por um dos outros dois objetos disponíveis (pirâmide ou “T”).

Figura 4 - Vista lateral dos três objetos que foram utilizados no modelo de reconhecimento do

objeto.

Teste do reconhecimento do objeto

O teste do reconhecimento do objeto foi adaptado de um procedimento experimental

previamente descrito (Norman e Eacott, 2004; Abe et al, 2004) e consistiu de três fases:

Fase de habituação (Dias 1 e 2): Em dois dias consecutivos, os animais foram expostos ao

campo aberto e o exploraram livremente por 10 min. Essa fase é realizada com o objetivo de

familiarização dos animais no aparelho, para que no dia do teste a exploração de um ambiente

novo não interfira na investigação dos objetos. Depois deste período os animais foram colocados

novamente em suas respectivas gaiolas e retornaram ao biotério.

Figura 5 – Representação da fase de habituação (campo aberto).

Fase de apresentação dos objetos (Dia 3): Nesta fase os animais foram apresentados por 3 min

a dois objetos idênticos (nomeados de A1 e A2) colocados em duas extremidades opostas do

campo aberto. Cada objeto foi posicionado a cerca de 20 cm das paredes do aparelho e a 60 cm

do outro objeto. Após a fase de apresentação dos objetos, os animais foram retirados do campo

aberto e mantidos em suas respectivas gaiolas.

Figura 6 – Representação da fase de apresentação aos objetos

Fase de reconhecimento dos objetos (Dias 3): Trinta minutos após a fase de apresentação dos

objetos os animais foram re-expostos ao campo aberto por 3 min para avaliação de memória de

curta duração. Nesta fase, um objeto idêntico aos anteriores (nomeado de A3) e um objeto novo

(nomeado de B) foram colocados nas posições antes ocupadas pelos objetos A1 e A2. O

posicionamento dos objetos foi balanceado entre as sessões. O tempo de investigação (s),

definido como o tempo em que o animal permanece com o focinho posicionado em direção ao

objeto a uma distância igual ou inferior a 2 cm ou tocando o objeto, foi registrado e utilizado

como índice de memória (Norman e Eacott, 2004; Abe et al., 2004). Além do tempo de

investigação, a razão de discriminação foi utilizada como índice da capacidade de

reconhecimento dos objetos diferentes (A e B) e foi calculada dividindo-se a diferença do tempo

de exploração entre o objeto novo e o conhecido pelo tempo total de exploração na fase de

reconhecimento dos objetos (B - A3)/(B+A3).

Figura 7 – Representação da fase de reconhecimento dos objetos

3.3.2. Locomoção

Durante a fase de apresentação aos objetos e/ou durante a fase de discriminação dos

mesmos foi analisado a atividade locomotora dos animais. Este procedimento foi realizado para

avaliar tanto a diferença na atividade locomotora relacionada às diferentes linhagens utilizadas

(WIS e SHR) quanto para avaliar o efeito das drogas utilizadas na locomoção desses animais. A

locomoção foi analisada por 3 min onde o número de cruzamentos horizontais totais dos animais

no campo aberto foram registrados através de contadores manuais. O cruzamento foi considerado

quando os animais cruzavam a linha com as quatro patas.

3.3.3. Peso Corporal

O peso corporal dos animais WIS e SHR foi medido de dois em dois dias durante o

tratamento repetido (14 dias) com solução veiculo, cafeína ou metilfenidato, tanto durante a

adolescência quanto na idade adulta. Esse procedimento foi realizado para verificar o efeito das

drogas utilizadas na ingestão de alimentos e na manutenção do peso corporal.

3.3.4. Pressão arterial

A pressão arterial (mmHg) de ratos fêmeas adultos WIS e SHR foi medida após o

tratamento agudo com: solução veiculo (salina ou salina com DMSO 10 %), metilfenidato

(2mg/kg), cafeína (1, 3 ou 10 mg/kg), DPCPX (1, 3 ou 5 mg/kg), ZM241385 (0,5 ou 1 mg/kg) ou

MIX (3 mg/kg de DPCPX e 0,5 mg/kg de ZM241385) e também após o tratamento repetido com

veiculo, metilfenidato (2mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg) durante a adolescência ou durante a idade

adulta. Para realização desta medida os animais foram anestesiados com uma mistura contendo

cetamina (90 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg), injetada pela via intramuscular. Uma vez

anestesiados, os animais foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica

aquecida (temperatura entre 35 e 36º C). Para prevenir a formação de coágulos e a obstrução das

cânulas os animais receberam uma injeção intraperitoneal de heparina (300 UI) 10 minutos antes

da anestesia. Para facilitar a respiração espontânea, todos os animais foram submetidos a

traqueostomia. Na seqüência, a artéria carótida esquerda foi localizada e, de forma cuidadosa e

rápida, separada do nervo vago e tecidos adjacentes. O fluxo sanguíneo da artéria carótida foi

interrompido na extremidade distal através da ligadura com fio de sutura, enquanto o fluxo da

extremidade proximal foi temporariamente suprimido por compressão com uma pinça curva. Um

pequeno corte foi realizado na região medial da porção da artéria carótida clampeada, servindo

como via de inserção de um catéter de polietileno (Angiocath



, número 19), devidamente

heparinizado, o qual foi firmemente amarrado na artéria e conectado ao transdutor de pressão

(Mikro-Tip®, Millar Instruments, Inc., Houston, Texas, USA) acoplado a um sistema de

aquisição Powerlab 8/30 (AD Instruments Pty Ltd., Castle Hill, Australia). Após um período de

estabilização de 30 minutos os valores de pressão arterial média (PAM), sistólica e diastólica (em

mmHg) e da freqüência cardíaca (em batimentos por minuto, bpm) foram registrados. Ao término

dos experimentos, todos os animais foram sacrificados através da administração intravenosa de

altas doses de xilocaína.

3.3.5. Reação de Imuno-histoquímica

Após o termino dos testes comportamentais, ratos adultos WIS e SHR foram perfundidos

transcardicamente com solução PBS contendo 4% de paraformaldeido (w/v). Os cérebros foram

cuidadosamente removidos e mantidos na mesma solução de paraformaldeido por 24 horas, após

esse tempo os cérebros foram mantidos em álcool 70% até o momento da confecção dos blocos

de parafina.

A expressão dos receptores de adenosina A1 e A2A foram detectados em cortes

histológicos confeccionados a partir dos blocos de parafina contendo amostras dos cérebros dos

ratos WIS e SHR utilizados no estudo. Os cortes teciduais de espessura de 3 µm foram montados

sobre lâminas preparadas com solução de ATPS a 5% (3-aminopropyltriethoxysilene; SIGMA

CHEMICAL CO, St. Louis, MO, USA) em acetona PA, sendo mantidas em estufa a uma

temperatura de 50°C durante 1h para fixação dos cortes nas lâminas.

Após fixação, os cortes foram desparafinados em xilol e hidratados por passagens

sucessivas em etanol de concentrações decrescentes (etanol absoluto, etanol 90%, etanol 80% e

finalmente etanol 70%). O bloqueio da peroxidase endógena dos tecidos foi realizado com o

objetivo de eliminar o desenvolvimento de reações inespecíficas falso-positivas. Para tanto, as

lâminas foram imersas em uma solução de peróxido de hidrogênio a 1,5% e metanol absoluto

(V/V), em uma passagem de 20 min, com posterior lavagem através de duas passagens em água

destilada.

Previamente à incubação com o anticorpo primário, as lâminas foram submetidas ao

tratamento para reativação antigênica, com a finalidade de recuperar os sítios antigênicos

mascarados pela fixação e inclusão do tecido em formol e parafina. Para este fim, foi preparada

uma solução composta por 180 mL de ácido cítrico 0,1M (MERCK, São Paulo/SP, Brasil) e 820

mL de citrato de sódio 0,1M (MERCK, São Paulo/SP, Brasil) pH 6,0. Após preparo da solução,

as lâminas foram imersas nesta solução de reativação antigênica diluída 1:10 em água destilada, e

mantidas em banho-maria ajustado para 95-98°C, durante 45 min.

Logo após, ainda como parte do processo de reativação antigênica através do calor, as

lâminas foram retiradas do banho-maria, mantidas durante 20 min à temperatura ambiente, e

posteriormente lavadas em água destilada. Após a lavagem das lâminas, estas foram submersas

em tampão salina fosfato (PBS, composição: NaCl 137 mM, KCl 2 mM e tampão fosfato 10 mM,

pH 7,2-7,4) (SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO, USA).

O anticorpo monoclonal primário anti-A1 (Sigma®, Saint Louis, USA) foi diluído a 1:100

já o anticorpo monoclonal primário anti-A2A ( Santa Cruz Biotechnology) foi diluído a 1:200,

em uma solução comercial apropriada à diluição de anticorpos (Dako Cytomation®, Carpinteria,

CA, USA), composta por TRIS-NaCl (Tris Base 13,9g, Tris-HCl 60,6g, NaCl 87,66g, pH 7,6) e

um reagente comercial bloqueador de reação inespecífica.

Após esta etapa, a solução contendo os anticorpos foi adicionada sobre os cortes teciduais

e as lâminas foram mantidas em câmara úmida, de 2-8°C durante 12h. A seguir, estas foram

lavadas com tampão PBS, por 2 vezes, por 5 min cada, à temperatura ambiente. Após lavagem as

lâminas foram incubadas com anticorpo secundário Envision plus (Dako Cytomation®,

Carpinteria, CA, USA) conjugado com um polímero de peroxidase (EN VISION PLUS, Dako

Cytomation, Carpinteria, CA, USA) pronto para uso em câmara úmida durante 1h à temperatura

ambiente.

Posteriormente, foram realizadas duas lavagens utilizando-se PBS por 5 min, à temperatura

ambiente. As amostras foram submetidas a uma revelação colorimétrica com uma solução

cromógena contendo 0,03% de 3,3´-diaminobenzidina (3,3’,4,4´-

tetraaminobiphenyltetrahydrochloride) (DAB), diluído em tampão imidazol pH 7,2 e peróxido de

hidrogênio a 0,3%. Após a revelação, foram realizadas a contra coloração das lâminas com

solução de Hematoxilina de Harris, desidratação através de passagem das lâminas em

concentrações crescentes de etanol (etanol 70%, etanol 80%, 90% e etanol absoluto),

diafanização em xilol e montagem em ENTELLAN® (MERCK, São Paulo/SP, Brasil).

O resultado positivo foi revelado pelo aparecimento de coloração castanha no local da

marcação pelos anticorpos. A leitura das lâminas e digitalização das imagens de todas as sub-

regiões hipocampais (CA1, CA2, CA3 e giro denteado), córtex e estriado foram realizadas em

microscópio óptico comum (NIKON, 80i) acoplado a câmera digital (Digital Sight Câmera, DS-

5M-L1; Nikon, Nova Iorque, USA). Para quantificação da expressão dos receptores

adenosinergicos nas diferentes regiões as imagens obtidas em aumento de 20X foram analisadas

através de um software de análise de imagens (CHPTool Cyclops, Brasil).

A quantificação dos receptores foi expressa por porcentagem de área marcada em relação a área

total analisada.

3.4. Análise estatística

Todos os valores foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.), sendo

que n é igual ao número de ratos utilizados em cada grupo experimental. A análise estatística foi

realizada utilizando análise de variância (ANOVA) de duas vias, com o fator linhagem, objeto e

tratamento como variáveis independentes ou através da (ANOVA) de três vias, sendo o fator

linhagem, tratamento e repetição as variáveis independentes. O teste post-hoc de Duncan foi

utilizado para comparações adicionais, em decorrência de valores significantes de P <

0.05 para a

ANOVA. O teste “t” de Student foi também utilizado para comparações diretas. O nível de

significância para todos os testes foi de p<0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas

utilizando o pacote estatístico Statistica® 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).

Resultados Tratamento Agudo

4. RESULTADOS

4.1. Comparação entre as linhagens WIS e SHR no teste do reconhecimento de objetos

Inicialmente, para avaliar a desempenho dos ratos WIS e SHR machos e fêmeas no teste

de reconhecimento de objetos, grupos independentes de ambas as linhagens foram designados

para um dos dois grupos experimentais, nomeados de acordo com o par de objetos utilizados:

cubo X “T” ou cubo X pirâmide.

Os resultados do desempenho dos ratos WIS e SHR machos no tempo de investigação,

durante a etapa de apresentação aos objetos e do índice de reconhecimento, durante a fase de

reconhecimento estão ilustrados nas figuras 8A e 8B. Ao analisar o tempo de investigação dos

objetos, a análise de variância realizada através da ANOVA de duas vias (fator linhagem X

objeto) não revelou efeito significante para os fatores linhagem [F(1,30)=0.83, P=0.37], objetos

[F(1,30)=0.36, P=0.55] e para a interação entre esses fatores [F(1,30)=1.40, P=0.25]. Quando

avaliado o índice de reconhecimento, não foi encontrado efeito significante para os fatores

linhagem [F(1,30)=1.46, P=0.24] e objeto [F(1,30)=2.44, P=0.13

], já para a interação entre os

dois fatores a ANOVA revelou efeito significante

[F(1,30)=4.33, P<0.05]. Subseqüente teste

de Duncan indicou que os ratos SHR apresentam prejuízo no índice de reconhecimento quando

expostos ao objeto “T” durante a fase de reconhecimento dos objetos, comparado ao índice de

reconhecimento dos ratos WIS expostos ao mesmo objeto e também quando comparado ao grupo

exposto ao objeto “P” da mesma linhagem na mesma fase (p<0.05). Já os ratos WIS foram

capazes de discriminar ambos os objetos investigando assim por mais tempo o novo objeto (“T”

ou pirâmide).

Cubo X Pirâmide

Cubo X T

Tempo de investigação(s)

WIS

SHR

Machos - adultos

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

Índice de discriminação

Figura 8 – Comparação entre ratos machos WIS e SHR adultos no teste de reconhecimento de

objetos. Após a fase de habituação no campo aberto, os animais foram expostos a 2 cubos

idênticos (A1 e A2) na fase de apresentação aos objetos e 30 min depois eles foram expostos a

outro cubo igual aos anteriores (A3) e a um objeto não familiar (B) na fase de reconhecimento

dos objetos. Os objetos B utilizados foram a pirâmide (P) e o objeto na forma de “T”. (A) O

tempo de investigação (s) foi calculado através da soma do tempo de investigação dos objetos A1

e A2 durante a fase de apresentação aos objetos. (B) Já o índice de discriminação foi calculado

pelo tempo que os animais investigaram (B-A3)/(B+A3). Os valores foram expressos como

média ± erro padrão da média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo “T” WIS. *p<0.05

quando comparado ao grupo “T” SHR (teste de Duncan). (n = 8-9).

Após verificação do desempenho de ratos machos das linhagens WIS e SHR no modelo

apresentado, analisamos a performance de ratos fêmeas, das mesmas linhagens, para verificar se

existe diferenças entre sexo (figuras 9Ae 9B). Ao analisar o tempo de investigação dos objetos, a

análise de variância realizada através da ANOVA de duas vias (fator linhagem X objeto) não

revelou efeito significante para os fatores linhagem [F(1,22)=0.01, P=0.92], objeto

[F(1,22)=0.92, P=0.35] ou para a interação entre os fatores linhagem e objeto [F(1,22)=0.71,

P=0.41]. Quando avaliado o índice de reconhecimento, a ANOVA de duas vias revelou efeito

significante para os fatores linhagem [F(1,22)=5.50, P<0.05], objeto [F(1,22)=10.0, P<0.01

] e

para a interação entre os dois fatores

[F(1,22)=5.50, P<0.05]. Subseqüente teste de Duncan

indicou que os ratos SHR apresentam prejuízo no índice de reconhecimento quando expostos ao

objeto “T” durante a fase de reconhecimento dos objetos quando comparado ao índice de

reconhecimento dos ratos WIS e também quando comparado ao grupo exposto ao objeto “P” da

mesma linhagem na mesma fase (p<0.05). Já os ratos WIS foram capazes de discriminar ambos

os objetos investigando assim por mais tempo o novo objeto (“T” ou pirâmide).

Após caracterizar o prejuízo dos ratos SHR, na habilidade de discriminar o objeto “T”, em

todos os próximos experimentos realizados o cubo foi utilizado como objeto familiar e o “T”

como novo objeto.

Fêmeas - adultas

Cubo x T

Cubo x Pirâmide

WIS SHR

Tempo de investigação (s)

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50

Índice de discriminação

Figura 9 – Comparação entre ratos fêmeas WIS e SHR adultos no teste de reconhecimento de

objetos. Após a fase de habituação no campo aberto, os animais foram expostos a 2 cubos

idênticos (A1 e A2) na fase de apresentação aos objetos e 30 min depois eles foram expostos a

outro cubo igual aos anteriores (A3) e a um objeto não familiar (B) na fase de reconhecimento

dos objetos. Os objetos B utilizados foram a pirâmide e o objeto na forma de “T”. (A) O tempo

de investigação (s) foi calculado através da soma do tempo de investigação dos objetos A1 e A2

durante a fase de apresentação aos objetos. (B) Já o índice de discriminação foi calculado pelo

tempo que os animais investigaram (B-A3)/(B+A3). Os valores foram expressos como média ±

erro padrão da média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo “T”WIS. *p<0.05 quando

comparado ao grupo “T” SHR (teste de Duncan). (n = 6-7).

4.2. Efeitos da administração aguda de metilfenidato ou cafeína na performance de ratos

machos WIS e SHR no teste de reconhecimento de objetos

Os efeitos da administração aguda (i.p.) de metilfenidato ou cafeína, injetados 30 min

antes da fase de apresentação aos objetos, no tempo de investigação e no índice de

reconhecimento, de ratos machos adultos WIS e SHR no teste de reconhecimento de objetos

encontram-se nas Figuras 10A e 10B, respectivamente. No tempo de investigação a ANOVA de

duas vias (linhagem x tratamento) não revelou efeito significativo para o fator linhagem

[F(1,77)=1.22, P=0.27], tratamento [F(4,77)=2.46, P=0.06] ou para interação entre os fatores

linhagem e tratamento [F(4,77)=0.85, P=0.49]. Já quando analisado o índice de reconhecimento a

ANOVA de duas vias revelou efeito significante entre as linhagens [F(1,77)=8.54, P<

0.05], mas

não entre os tratamentos [F(4,77)=0,88, P=0.48], no entanto significante efeito foi encontrado ao

analisar a interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(4,77)=2.91, P<

0.05]. Confirmando

esses resultados, subseqüente teste de Duncan indicou que o grupo controle dos ratos SHR

apresentam prejuízo no índice de reconhecimento quando comparados ao grupo controle dos

ratos WIS (P<

0.05). Entretanto a administração (i.p.), de metilfenidato na dose de 2 mg/kg ou de

cafeína na dose de 10 mg/kg, foram capazes de reverter o prejuízo na habilidade discriminatória

dos ratos SHR, sem apresentar qualquer tipo de efeito nos ratos WIS.

3 10

cafeína

1 3

cafeína

mg/kg, i.p

MFD

WIS

SHR

Tempo de investigação (s)

Machos - adultos

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1 3

cafeína

mg/kg, i.p

MFD

1 3

cafeína

V MFD

Índice de discriminação

Figura 10 – Efeitos da administração de veiculo (V), metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína

(CAF) 1, 3 e 10 mg/kg, 30 min antes da fase de apresentação aos objetos, no tempo de

investigação (A) e no índice de reconhecimento (B) em ratos machos WIS e SHR adultos, no

teste de reconhecimento do objeto. O tempo de investigação (s) foi calculado através da soma do

tempo de investigação dos objetos A1 e A2 durante a fase de apresentação aos objetos. Já o

índice de discriminação foi calculado pelo tempo que os animais investigaram (B-A3)/(B+A3)

durante a fase de discriminação. Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média

(E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo V WIS. *p<0.05 quando comparado ao grupo V

SHR (teste de Duncan). (n = 8-10).

A tabela 1 ilustra o efeito do tratamento com metilfenidato ou cafeína na atividade

locomotora de ratos machos das linhagens WIS e SHR, a medida foi realizada durante a fase de

apresentação e de discriminação dos objetos na execução do teste de reconhecimento de objetos.

Durante a fase de apresentação aos objetos, através da ANOVA de duas vias (linhagem X

tratamento) nenhum efeito significante foi encontrado para o fator linhagem [F(1,77)=2.44,

P=0.12], tratamento [F(4,77)=1.84, P=0.13] ou para a interação entre os fatores linhagem e

tratamento [F(4,77)=1.13, P=0.35]. O mesmo ocorreu durante a fase de reconhecimento dos

objetos, onde não foi encontrado efeito significante para o fator linhagem [F(1,77)=1.82,

P=0.18], tratamento [F(4,77)=0.97, P=0.43] e para a interação entre os fatores linhagem e

tratamento [F(4,77)=0.76, P=0.55] no total de cruzamentos dos animais durante os 3 min de

teste.

Tabela 1 – Efeitos da administração (i.p.) de veiculo (V), metilfenidato (MFD) (2 mg/kg) ou

cafeína (CAF) (1, 3 ou 10 mg/kg), 30 min antes da fase de apresentação aos objetos, na atividade

locomotora de ratos machos WIS e SHR durante a fase de apresentação e de discriminação de

objetos, no teste do reconhecimento de objetos. (n = 8-10).

Tratamento

(mg/kg, i.p.)

V MFD

CAF

Fase Linhagem

Nº de cruzamentos

Apresentação

aos objetos

WIS

85.25±5.02

85.37±3.82

100,1±5.37

82.87±4.96

94.20±5.83

SHR

100,1±6.20

84.37±4.89

94.11±5.46

95.22±6.88

103.6±8.64

Reconhecimento

dos objetos

WIS

69.75±8.66

81.37±2.28

82.78±4.69

69.62±7.23

84.20±5.77

SHR

86.77±7.01

80.50±6.43

79.66±5.46

79.44±5.75

89.33±9.33

4.3. Efeitos da administração aguda de metilfenidato ou cafeína na performance de ratos

fêmeas WIS e SHR no teste de reconhecimento de objetos

Já que ratos fêmeas da linhagem SHR, assim como os ratos machos da mesma linhagem,

demonstraram prejuízos no testes de reconhecimento dos objetos, avaliamos o efeito do

tratamento com metilfenidato ou cafeína nas mesmas doses utilizadas para avaliar se a resposta

ao tratamento em fêmeas e semelhante a encontrada em machos.

Sendo assim os efeitos da administração aguda (i.p.) de metilfenidato ou cafeína,

injetados 30 min antes da fase de apresentação aos objetos, no tempo de investigação e no índice

de reconhecimento, de ratos fêmeas adultos WIS e SHR no teste de reconhecimento de objetos

encontram-se nas Figuras 11A e 11B. No tempo de investigação a ANOVA de duas vias

(linhagem x tratamento) não revelou efeito significativo para o fator linhagem [F(1,71)=1.73,

P=0.19], tratamento [F(4,71)=1.48, P=0.21] ou para interação entre os fatores linhagem e

tratamento [F(4,71)=0.29, P=0.88]. Porém quando analisado o índice de reconhecimento a

ANOVA de duas vias também não revelou efeito significante entre as linhagens [F(1,71)=0.82,

P=0.77] e tratamentos [F(4,71)=1,03, P=0.39], no entanto, um significante efeito foi encontrado

na interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(4,71)=2.57, P<

0.05]. Confirmando esses

resultados, subseqüente teste de Duncan indicou que o grupo controle dos ratos SHR apresentam

prejuízo no índice de reconhecimento quando comparados ao grupo controle dos ratos WIS

(P<

0.05). Foi também observado que a administração (i.p.), de metilfenidato na dose de 2 mg/kg

ou de cafeína nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, foram capazes de reverter o prejuízo na habilidade

discriminatória dos ratos SHR, sem apresentar qualquer tipo de efeito nos ratos WIS.

3 10

cafeína

1 3

cafeína

mg/kg, i.p

MFD

WIS

SHR

Tempo de investigação (s)

Fêmeas - adultas

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1 3

cafeína

mg/kg, i.p

MFD

1 3

cafeína

V MFD

Índice de discriminação

Figura 11 – Efeitos da administração de veiculo (V), metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína

(CAF) 1, 3 e 10 mg/kg, 30 min antes da fase de apresentação aos objetos, no tempo de

investigação (A) e no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas WIS e SHR adultos, no

teste de reconhecimento do objeto. O tempo de investigação (s) foi calculado através da soma do

tempo de investigação dos objetos A1 e A2 durante a fase de apresentação aos objetos. Já o

índice de discriminação foi calculado pelo tempo que os animais investigaram (B-A3)/(B+A3)

durante a fase de reconhecimento. Os valores foram expressos como média ± erro padrão da

média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo V WIS. *p<0.05 quando comparado ao

grupo V SHR (teste de Duncan). (n = 8-9).

A tabela 2 representa o efeito do tratamento com metilfenidato ou cafeína na atividade

locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR, a medida foi realizada durante a fase de apresentação e

de discriminação dos objetos na execução do teste de reconhecimento de objetos. Durante a fase

de apresentação aos objetos, a ANOVA de duas vias (linhagem X tratamento) demonstrou que

nenhum efeito significante foi encontrado para o fator linhagem [F(1,71)=0.82, P=0.37],

tratamento [F(4,71)=0.72, P=0.58] ou para a interação entre os fatores linhagem e tratamento

[F(4,71)=1.61, P=0.18] no total de cruzamentos dos animais durante os 3 min de teste. Já durante

a fase de reconhecimento dos objetos, a ANOVA de duas vias (linhagem X tratamento) revelou

efeito significante para o fator linhagem [F(1,71)=4.55, P<

0.05] na atividade locomotora dos

animais, porém não foi encontrado efeito significante para o fator tratamento [F(4,71)=0.68,

P=0.61] ou na interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(4,71)=1.54, P=0.20]. Analises

subseqüentes através do teste de Duncan não indicaram diferença significativa na atividade

locomotora entre os grupos controles das duas linhagens utilizadas.

Tabela 2 – Efeitos da administração (i.p.) de veiculo (V), metilfenidato (MFD) (2 mg/kg) ou

cafeína (CAF) (1, 3 ou 10 mg/kg), 30 min antes da fase de apresentação aos objetos, na atividade

locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR durante a fase de apresentação e de discriminação de

objetos, no teste do reconhecimento de objetos. (n = 8-9).

Tratamento

(mg/kg, i.p.)

V MFD

CAF

Fase Linhagem

Nº de cruzamentos

Apresentação

aos objetos

WIS

80.25±5.41

90.78±7.45

89.75±4.43

100.37±10.8

101.00±5.6

SHR

96.75±4.68

105.22±6.6

94.28±5.38

91.75±6.15 93,25±6.99

Reconhecimento

dos objetos

WIS

69.75±8.09

68.00±5.00

73.25±8.20

81.87±10.23

82.62±4.98

SHR

80.0±5.45

97.44±5.53

78.41±6.79

83.12±7.09 83.62±7.12

Após verificar que ratos SHR machos e fêmeas apresentam prejuízo na tarefa de

reconhecimento de objetos quando estes possuem características muito semelhantes e ainda após

avaliar a melhora no desempenho de ambos os gêneros após tratamento com metilfenidato ou

cafeína, optamos por utilizar o gênero fêmea para prosseguir nossas investigações, já que estamos

utilizando animais adultos e o TDAH na idade adulta é mais comum em mulheres e ainda porque

ratos fêmeas da linhagem SHR demonstraram ser mais sensíveis ao tratamento com cafeína.

4.4. Efeitos 24 horas após a administração aguda de metilfenidato ou cafeína no teste de

reconhecimento de objetos em ratos fêmeas WIS e SHR

Para avaliar se o efeito do metilfenidato e da cafeína estavam realmente ocorrendo durante

a fase de apresentação aos objetos, no momento em que os animais necessitam adquirir as

informações, ou se esse efeito estaria ocorrendo apenas durante a evocação das informações

aprendidas que ocorre na fase de reconhecimento dos objetos. Além disso, para avaliar se os

animais necessitam estar sobre o efeito das drogas para que possam apresentar a melhora no

desempenho, um novo grupo de animais foi avaliado.

Para responder essas questões, foram selecionadas as doses de 2 mg/kg de metilfenidato e

a dose de 3 mg/kg de cafeína, já que essas doses apresentaram efeito em outros grupos avaliados.

Os animais receberam uma administração aguda (i.p.) de veiculo, cafeína ou metilfenidato,

injetados 30 min antes da fase de apresentação aos objetos. Já a fase de reconhecimento dos

objetos, que antes era realizada 30 min após a fase de apresentação, foi realizada 24 horas após

esta fase.

Os resultados encontrados estão representados nas figuras 12A e 12B. Como pode ser

observado no tempo de investigação a ANOVA de duas vias (linhagem x tratamento) não revelou

efeito significativo para o fator linhagem [F(1,41)=0.38, P=0.85], tratamento [F(2,41)=1.87,

P=0.17] ou para interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(2,41)=0.32, P=0.72]. Já

quando analisado o índice de reconhecimento a ANOVA de duas vias também não revelou efeito

significante entre as linhagens [F(1,41)=2.06, P=0.16] e tratamentos [F(2,41)=2,54, P=0.91]. No

entanto, um significante efeito foi encontrado na interação entre os fatores linhagem e tratamento

[F(2,41)=10.27, P<

0.001]. Confirmando esses resultados, análises post-hoc indicaram que o

grupo controle dos ratos SHR apresentam prejuízo no índice de reconhecimento quando

comparados ao grupo controle dos ratos WIS (P<0.05). E ainda, a administração (i.p.), de

metilfenidato na dose de 2 mg/kg ou de cafeína na dose de 3 mg/kg, foram capazes de reverter o

prejuízo na habilidade discriminatória dos ratos SHR, sem apresentar qualquer tipo de efeito nos

ratos WIS, mesmo quando testados 24 horas após a administração.

mg/kg, i.p

MFD

WIS

SHR

CAF

Tempo de investigação (s)

Fêmeas - adultas

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

mg/kg, i.p

MFD

CAF

Índice de reconhecimento

Figura 12 – Efeitos da administração de V, MFD 2 mg/kg e de cafeína CAF 3 mg/kg, 30 min

antes da fase de apresentação aos objetos, no tempo de investigação (A) e no índice de

reconhecimento, realizado 24 horas após a fase de apresentação aos objetos (B), em ratos fêmeas

WIS e SHR adultos, no teste de reconhecimento do objeto. O tempo de investigação (s) foi

calculado através da soma do tempo de investigação dos objetos A1 e A2 durante a fase de

apresentação aos objetos. Já o índice de discriminação foi calculado pelo tempo que os animais

investigaram (B-A3)/(B+A3) durante a fase de reconhecimento. Os valores foram expressos

como média ± erro padrão da média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo V WIS.

*p<0.05 quando comparado ao grupo V SHR (teste de Duncan). (n = 7-8).

4.5. Efeitos da administração aguda de antagonistas seletivos para receptores

adenosinérgicos A1 e A2A no teste de reconhecimento de objetos em ratos fêmeas WIS e

SHR.

Nas figuras 13A e 13B encontram-se os resultados da administração aguda (i.p.) dos

antagonistas seletivos para receptores de adenosina A1 (DPCPX) nas doses de 1, 3 e 5 mg/kg e

A2A (ZM241385) nas doses de 0,5 e 1 mg/kg e também o efeito da associação das doses de 3

mg/kg de DPCPX e de 0,5 mg/kg de ZM241385 (MIX), injetados 30 min antes da fase de

apresentação aos objetos, no tempo de investigação e no índice de reconhecimento, de ratos

fêmeas adultos WIS e SHR. No tempo de investigação a ANOVA de duas vias (linhagem x

tratamento) revelou efeito significante para o fator linhagem [F(1,102)=5.13, P<

0.05], mas não

para o fator tratamento [F(6,102)=2.11, P=0.06] ou para a interação entre os fatores linhagem e

tratamento [F(6, 102)=0.66, P=0.68]. Já quando analisado o índice de reconhecimento a ANOVA

de duas vias (linhagem e tratamento) revelou efeito significante para o fator linhagem

[F(1,102)=4.29, P<

0.05], tratamento [F(6,102)=3.02, P<0.05] e para a interação entre os fatores

linhagem e tratamento [F(6,102)=4.15, p<

0.001]. Confirmando esses resultados, subseqüente

teste de Duncan indicou que o grupo controle dos ratos SHR apresentam prejuízo no índice de

reconhecimento quando comparados ao grupo controle dos ratos WIS e também que a

administração aguda de DPCPX na dose de 5 mg/kg, ZM241385 na dose de 1 mg/kg, e a

associação das doses de 3 mg/kg de DPCPX e 0,5 mg/kg de ZM241385 reverteram o prejuízo na

habilidade discriminatória dos ratos SHR (P<0.05), enquanto nenhum efeito foi encontrado para

os ratos WIS após administração das drogas.

Fêmeas - adultas

WIS

SHR

mg/kg, i.p

1 1

0.5

MIX

3 + 0,5

1 1

0.5

MIX

3 + 0,5

DPCPX DPCPX

Tempo de investigação (s)

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

mg/kg, i.p

DPCPX

1 1

0.5

Índice de discriminação

MIX

3 + 0,5

DPCPX

0.5

MIX

3 + 0,5

Figura 13 – Efeitos da administração de antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos

A1 - DPCPX (1, 3 e 5 mg/kg) e A2A – ZM241385 (0,5 e 1 mg/kg) e também da administração

combinada de DPCPX (3 mg/kg) e ZM (0,5 mg/kg) (MIX), 30 min antes da fase de apresentação

aos objetos, no tempo de investigação (A) e no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas

WIS e SHR, no teste de reconhecimento do objeto. O tempo de investigação (s) foi calculado

através da soma do tempo de investigação dos objetos A1 e A2 durante a fase de apresentação

aos objetos. Já o índice de discriminação foi calculado pelo tempo que os animais investigaram

(B-A3)/(B+A3) durante a fase de reconhecimento. Os valores foram expressos como média ±

erro padrão da média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo V WIS. *p<0.05 quando

comparado ao grupo V SHR (teste de Duncan). (n = 8-10).

A tabela 3 representa o efeito do tratamento agudo com os antagonistas seletivos na

atividade locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR, a medida foi realizada durante a fase de

apresentação e de discriminação dos objetos. Durante a fase de apresentação aos objetos, através

da ANOVA de duas vias (linhagem X tratamento) um significante efeito foi encontrado para o

fator linhagem [F(1,102)=11.4, P<

0.001] e para o fator tratamento [F(6,102)=2.4, P<0.05] no

total de cruzamentos dos animais durante os 3 min de teste. No entanto, a análise não revelou

efeito significante na interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(6,102)=1.27, P=0.28].

Comparações adicionais não revelaram diferenças significantes entre os grupos controles das

linhagens WIS e SHR ou em relação aos grupos tratados, quando comparados ao grupo controle

da mesma linhagem. Já durante a fase de reconhecimento dos objetos, a ANOVA de duas vias

(linhagem X tratamento) revelou efeito significante para o fator linhagem [F(1,102)=6.7,

0.01], mas não para o fator tratamento [F(6,102)=0.45, P=0.84] ou para a interação entre os

fatores linhagem e tratamento [F(6,102)=1.05, P=0.40]. Comparações post-hoc adicionais não

revelaram diferenças significantes entre os grupos controles das linhagens WIS e SHR

Tabela 3 – Efeitos da administração (i.p.) de V, antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos

A1 - DPCPX (1, 3 e 5 mg/kg), A2A – ZM241385 (0,5 e 1 mg/kg) e também da administração

combinada de DPCPX (3 mg/kg) e ZM (0,5 mg/kg) (MIX), 30 min antes da fase de apresentação aos

objetos, na atividade locomotora de ratos fêmeas WIS e SHR durante a fase de apresentação e de

discriminação de objetos, no teste do reconhecimento de objetos. (n = 8-10).

Tratamento

(mg/kg, i.p.)

V DPCPX

DPCPX

0.5

MIX

Fase Linh

Nº de cruzamentos

Apresentação

aos objetos

WIS

84.4±2.9

76.6±5.0

71.4±4.3

79.0±4.7

78.2±4.0

69.2±1.6

83.0±5.1

SHR

86.8±3.6

73.5±6.9

81.7±4.9

86.6±2.9

95.9±6.6

86.2±6.8

90.9±4.2

Reconhecimento

Dos objetos

WIS

72.3±3.8

72.7±4.1

61.7±4.8

70.5±6.4

73.2±6.9

62.1±5.2

70.0±3.6

SHR

81.2±6.8

73.9±9.5

74.2±8.1

79.7±4.3

68.4±5.7

85.9±9.2

79.9±4.3

4.6. Efeitos da administração aguda de metilfenidato, cafeína e de antagonistas seletivos

para receptores adenosinérgicos A1 e A2A na pressão arterial de ratos fêmeas WIS e SHR

Para avaliar se os déficits cognitivos apresentados pelos ratos SHR são diretamente

relacionados com a hipertensão desses animais ou se as duas patologias possuem mecanismos

distintos, a pressão sangüínea de ambas as linhagens após o tratamento agudo com metilfenidato,

cafeína ou com os antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos, foi avaliada. A figura

14 representa os resultados dos efeitos da administração (i.p.) aguda de veiculo, metilfenidato (2

mg/kg) e cafeína (1, 3 e 10 mg/kg) sob a pressão arterial (mmHg) de ratos fêmeas adultos WIS e

SHR. A ANOVA de duas vias (linhagem x tratamento) revelou significante efeito para o fator

linhagem [F(1,35)=77.20, P<

0.001], mas não foi encontrado efeito significante para o fator

tratamento [F(4,35)=1.94, P=0.12] ou para a interação entre os fatores linhagem e tratamento

[F(4,35)=0.44, P=0.78]. Comparações adicionais através do teste de Duncan, assim como já era

esperado, demonstraram que os animais SHR tratados com solução veiculo são hipertensivos em

relação aos animais WIS também tratados com solução veiculo (P<

0.001). No entanto a

administração de metilfenidato ou de cafeína, 30 min antes de mensurar a pressão arterial, nas

mesmas doses que foram capazes de reverter os prejuízos cognitivos dos ratos SHR no teste do

reconhecimento de objetos, não causaram alterações significantes nos valores da pressão arterial

tanto em ratos SHR quanto em ratos WIS.

120

150

WIS SHR

1 3

mg/kg, i.p

MFD

1 3

V MFD

cafeína cafeína

Pressão arterial (mmHg)

Figura 14 – Efeitos da administração (i.p.) V, MFD (2 mg/kg) ou CAF (1, 3 e 10 mg/kg), sob a

pressão arterial (média ±E.P.M., in mmHg), em ratos fêmeas WIS e SHR. # p<0,05 comparado

aos ratos WIS controle. (n = 4)

Já a figura 15 representa os resultados dos efeitos da administração (i.p.) aguda de veiculo ou

dos antagonistas seletivos para receptores adenosinérgicos A1 – DPCPX nas doses de 1, 3 e 5

mg/kg, A2A – ZM241385 nas doses de 0,5 e 1 mg/kg e também da associação das doses de 3

mg/kg de DPCPX e de 0,5 mg/kg de ZM241385 (MIX), sob a pressão arterial (mmHg) de ratos

fêmeas adultos WIS e SHR. A análise de variância realizada através da ANOVA de duas vias

(linhagem x tratamento) revelou significante efeito para o fator linhagem [F(1,41)=200.8,

0.001] e para o fator tratamento [F(6,41)=4.48, P<0.001]. Porém não foi encontrado efeito

significante para a interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(6,41)=1.9, P=0.09].

De acordo com os estudos anteriores, comparações adicionais através do teste de Duncan

demonstraram que os animais SHR tratados com veiculo são hipertensos em relação aos animais

WIS tratados com a mesma solução (P<

0.001). E demonstrou ainda que os grupos de animais

SHR tratados com as doses de 3 e 5 mg/kg de DPCPX e também com a associação de 3 mg/kg de

DPCPX e 0,5 mg/kg de ZM apresentaram diminuição da pressão arterial quando comparados ao

grupo controle dos ratos SHR. Já quando analisado o efeito dos tratamentos na linhagem WIS,

apenas a dose de 1 mg/kg de DPCPX diminuiu a pressão arterial desses animais quando

comparados ao grupo controle da mesma linhagem (p<

0,05).

120

150

WIS

SHR

mg/kg, i.p

1 1

0.5

MIX

3 + 0,5

DPCPX

1 1

0.5

MIX

3 + 0,5

DPCPX

Pressão arterial (mmHg)

Figura 15 – Efeitos da administração (i.p.) de solução veiculo ou dos antagonistas seletivos para

receptores adenosinérgicos A1 - DPCPX (1, 3 e 5 mg/kg) e A2A – ZM241385 (0,5 e 1 mg/kg) e

também da associação das doses de 3 mg/kg de DPCPX e de 0,5 mg/kg de ZM241385 (MIX),

sob a pressão arterial (média ±E.P.M., in mmHg), em ratos fêmeas WIS e SHR. # p<0,05

comparado aos ratos WIS controle. (n = 3 - 4).

Resultados Tratamento Repetido

4.7. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, durante a idade adulta, no

teste de reconhecimento de objetos, em ratos fêmeas WIS e SHR

Os efeitos do tratamento repetido durante 14 dias com veiculo, metilfenidato (2mg/kg) ou

cafeína (3 mg/kg), durante a idade adulta, em ratos fêmeas WIS e SHR, no tempo de

investigação e no índice de reconhecimento. A fase de habituação teve início 24h após o ultimo

dia de tratamento e os resultados encontram-se representados nas figuras 16A e 16B. No tempo

de investigação a ANOVA de duas vias (linhagem x tratamento) não revelou efeito significativo

para o fator linhagem [F(1,61)=2.14, P=0.15]. Quando analisado o fator tratamento, significante

efeito foi encontrado [F(2,61)=3.71, P<

0,05], no entanto o mesmo não ocorreu quando analisado

a interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(2,61)=1.49, P=0.23]. Comparações

adicionais não revelaram diferença significante entre os grupos tratados e o grupo controle da

respectiva linhagem. Ao analisar o índice de reconhecimento a ANOVA de duas vias também

não revelou efeito significante entre as linhagens [F(1,61)=0.70, P=0.40], no entanto revelou

efeito significante para o fator tratamento [F(2,61)=3.39, P<

0,05], e para a interação entre os

fatores linhagem e tratamento [F(2,61)=4.89, P<

0.05]. Confirmando esses resultados,

subseqüentes comparações post-hoc indicaram que o grupo controle dos ratos SHR apresentam

prejuízo no índice de reconhecimento quando comparados ao grupo controle dos ratos WIS

(P<

0.05). No entanto, a administração (i.p.) repetida, de metilfenidato na dose de 2 mg/kg ou de

cafeína na dose de 3 mg/kg, foi capaz de reverter o prejuízo na habilidade discriminatória dos

ratos SHR, sem apresentar qualquer tipo de efeito nos ratos WIS (Fig 16B).

mg/kg, i.p

MFD2

WIS

SHR

CAF3

Tempo de investigação (s)

Fêmeas - adultas

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

mg/kg, i.p

MFD2

CAF3

Índice de reconhecimento

Figura 16 – Efeitos da administração (i.p.) repetida (14 dias), de veiculo (V), metilfenidato

(MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg, durante a idade adulta no tempo de investigação (A)

e no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas WIS e SHR, no teste de reconhecimento do

objeto. O tempo de investigação (s) foi calculado através da soma do tempo de investigação dos

objetos A1 e A2 durante a fase de apresentação. Já o índice de discriminação foi calculado pelo

tempo que os animais investigaram (B-A3)/(B+A3) durante a fase de discriminação. Os valores

foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao

grupo V WIS. *p<0.05 quando comparado ao grupo V SHR (teste de Duncan). (n = 8 – 10).

A figura 17 sumariza o efeito do tratamento repetido com veiculo, metilfenidato ou

cafeína na atividade locomotora, durante a idade adulta, de ratos WIS e SHR fêmeas, a medida

foi realizada durante a fase de apresentação aos objetos durante a execução do teste. Através da

ANOVA de duas vias (linhagem X tratamento) nenhum efeito significante foi encontrado para o

fator linhagem [F(1,61)=2.84, P=0.09], tratamento [F(2,61)=1.52, P=0.23], ou para a interação

entre os fatores linhagens e tratamento [F(2,61)=1.38, P=0.26] no total de cruzamentos dos

animais durante os 3 min de testes.

100

125

mg/kg, i.p

MFD2

WIS

SHR

CAF3

Locomoção

Fêmeas - adultas

Figura 17 – Efeitos da administração (i.p.) repetida (14 dias) durante a idade adulta, de veiculo

(V), metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg na atividade locomotora de ratos

WIS e SHR fêmeas durante a fase de apresentação dos objetos, no teste do reconhecimento de

objetos. (n = 8 – 10).

4.8. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, no teste de

reconhecimento de objetos, durante a adolescência, de ratos fêmeas WIS e SHR

Os efeitos do tratamento repetido durante 14 dias com solução veiculo, metilfenidato

(2mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg), durante o início da adolescência (20º ao 34º dia PN) de ratos WIS

e SHR fêmeas, no tempo de investigação e no índice de reconhecimento realizados na idade

adulta (2 meses depois da ultima administração das drogas) encontram-se representados nas

figuras 18A e 18B, respectivamente. Esses experimentos foram realizados para avaliar a

persistência do efeito da administração repetida dessas drogas quando utilizadas como tratamento

durante a adolescência, que é um período crítico, onde várias modificações estão ocorrendo em

todo o SNC tanto humanos como de roedores.

No tempo de investigação a ANOVA de duas vias (linhagem x tratamento) revelou efeito

significativo para o fator linhagem [F(1,49)=5.59, P<0.05]. No entanto nenhum significante

efeito foi encontrado para o fator tratamento [F(2,49)=1.60, P<

0.20], já para a interação entre os

fatores linhagem e tratamento significante efeito foi encontrado [F(2,49)=3.36, P<0.05].

Comparações adicionais através do teste de Duncan revelou que os ratos WIS tratados com a

dose de 3 mg/kg de cafeína apresentaram aumento no tempo de investigação quando comparado

ao grupo de ratos WIS tratados com veiculo. Quando analisado o índice de reconhecimento a

ANOVA de duas vias também não revelou efeito significante entre as linhagens [F(1,49)=0.17,

P=0.68], ou entre os diferentes tratamentos [F(2,49)=0.05, P=0.95], já quando analisado a

interação entre os fatores linhagem e tratamento, efeito significante foi encontrado

[F(2,49)=11.68, P<

0.001]. Confirmando esses resultados, subseqüente teste de Duncan indicou

que o grupo controle dos ratos SHR apresentam prejuízo no índice de reconhecimento quando

comparados ao grupo controle dos ratos WIS (P<

0.05). Como pode ser observado, a

administração (i.p.) repetida de metilfenidato na dose de 2 mg/kg ou de cafeína na dose de 3

mg/kg durante a adolescência dos ratos SHR, foram capazes de reverterem o prejuízo na

habilidade discriminatória apresentado por esses animais. No entanto, surpreendentemente, as

mesmas doses de ambas as drogas que reverteram o prejuízo no índice de discriminação em ratos

SHR causaram prejuízo nesta mesma habilidade em ratos WIS, os quais apresentavam eficiente

capacidade de discriminação entre o objeto novo e o familiar nos experimentos realizados

anteriormente.

mg/kg, i.p

MFD2

WIS

SHR

CAF3

Tempo de investigação (s)

Fêmeas - adolescentes

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

mg/kg, i.p

MFD2

CAF3

Índice de reconhecimento

Figura 18 – Efeitos da administração (i.p.) repetida (14 dias), de veiculo (V), metilfenidato

(MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg, durante adolescência, no tempo de investigação (A) e

no índice de reconhecimento (B) em ratos fêmeas adultos WIS e SHR adultos, no teste de

reconhecimento do objeto. O tempo de investigação (s) foi calculado através da soma do tempo

de investigação dos objetos A1 e A2 durante a fase de apresentação aos objetos. Já o índice de

discriminação foi calculado pelo tempo que os animais investigaram (B-A3)/(B+A3) durante a

fase de discriminação. Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.),

p<0.05 quando comparado ao grupo V WIS. *p<0.05 quando comparado ao grupo V SHR (teste

de Duncan). (n = 10 – 12).

A figura 19 expressa o efeito do tratamento repetido durante a adolescência com veiculo,

metilfenidato ou cafeína na atividade locomotora, durante a idade adulta de ratos fêmeas WIS e

SHR. Através da ANOVA de duas vias (linhagem X tratamento) nenhum efeito significante foi

encontrado para o fator linhagem [F(1,49)=2.02, P=0.16], tratamento [F(2,49)=1.96, P=0.15], ou

para a interação entre os fatores linhagem e tratamento [F(2,49)=1.50, P=0.23] no total de

cruzamentos dos animais durante os 3 min de avaliação.

100

125

mg/kg, i.p

MFD2

CAF3

WIS

SHR

Fêmeas - adolescentes

Locomoção

Figura 19 – Efeitos da administração (i.p.) repetida (14 dias) durante a adolescência, de veiculo

(V), metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg na atividade locomotora de ratos

fêmeas WIS e SHR adultos, durante a fase de apresentação dos objetos, no teste do

reconhecimento de objetos. (n = 10 -12).

4.9. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, durante a idade adulta ou

durante a adolescência, na pressão arterial de ratos fêmeas WIS e SHR

Novamente para avaliar se os déficits cognitivos apresentados pelos ratos SHR estão

diretamente relacionados com a hipertensão desses animais, a pressão sanguínea foi avaliada. A

figura 20 ilustra os resultados dos efeitos da administração (i.p.) repetida de veiculo,

metilfenidato (2 mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg) durante a idade adulta, sob a pressão arterial

(mmHg) de ratos fêmeas adultos, das linhagens WIS e SHR. A ANOVA de duas vias (linhagem

x tratamento) revelou significante efeito para o fator linhagem [F(1,22)=39.7, P<

0.001] e

também para o fator tratamento [F(2,22)=5.52, P<

0.05], mas não para a interação entre os fatores

linhagem e tratamento [F(2,22)=1.56, P=0.23]. A análise post-hoc destes dados demonstraram

que os animais SHR tratados com veiculo são hipertensos em relação aos animais WIS tratados

com a mesma solução (P<

0.001). No entanto a administração repetida de metilfenidato, na

mesma dose que foi capaz de reverter os prejuízos cognitivos dos ratos SHR no teste do

reconhecimento de objetos, causou uma significante diminuição nos valores da pressão arterial

dos ratos SHR, sem causar qualquer tipo de alteração na pressão arterial dos ratos WIS.

100

125

mg/kg, i.p

MFD2

CAF3

WIS

SHR

Fêmeas - adultas

Pressão arterial (mmHg)

Figura 20 – Efeitos da administração (i.p.) repetida, durante a idade adulta, de veiculo (V),

metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg, sob a pressão arterial (média ±E.P.M.,

in mmHg), em ratos fêmeas WIS e SHR adultos. # p<0,05 comparado aos ratos WIS tratados

com V, * p<0,05 comparado aos ratos SHR tratados com veiculo (n = 3 – 4).

Já a figura 21 sumariza os resultados dos efeitos da administração (i.p.) repetida de veiculo,

metilfenidato (2 mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg), administrados durante a adolescência, sob a

pressão arterial (mmHg) de ratos fêmeas adultos, das linhagens WIS e SHR. A análise de

variância realizada através da ANOVA de duas vias (linhagem x tratamento) revelou significante

efeito para o fator linhagem [F(1,14)=37.15, P<

0.001]. Porém não revelou efeito significante

para o fator tratamento [F(2,14)=0.58, P=0.57] ou a interação entre os fatores linhagem e

tratamento [F(2,14)=0.24, P=0.79]. Reproduzindo dados anteriores, comparações adicionais

demonstraram que os animais SHR tratados com veiculo são hipertensos em relação aos animais

WIS também tratados com veiculo (P<

0.05). No entanto a administração repetida de

metilfenidato ou de cafeína, nas mesmas doses que foram capazes de reverter os prejuízos

cognitivos dos ratos SHR e de causar prejuízos nos ratos WIS no teste do reconhecimento de

objetos, não causou alterações significantes nos valores da pressão arterial tanto em ratos SHR

quanto em ratos WIS.

100

125

mg/kg, i.p

MFD2

CAF3

WIS

SHR

Pressão arterial (mmHg)

Fêmeas - adolescentes

Figura 21 – Efeitos da administração (i.p.) repetida, durante a adolescência, de veiculo, V,

metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg, sob a pressão arterial (média ±E.P.M.,

in mmHg), em ratos fêmeas WIS e SHR adultos. # p<0,05 comparado aos ratos WIS tratados

com veiculo (n = 3 – 4).

4.10. Efeitos do tratamento repetido com metilfenidato ou cafeína, durante a idade adulta

ou durante a adolescência, sob o peso corporal de ratos fêmeas WIS e SHR

As figuras 22A e 22B ilustram o peso corporal dos animais da linhagem WIS e SHR, que

foram medidos de dois em dois dias durante o tratamento repetido (14 dias) com veiculo,

metilfenidato ou cafeína tanto durante o tratamento na adolescência quanto durante o tratamento

na idade adulta. Esse procedimento foi realizado para verificar o efeito das drogas utilizadas na

ingestão de alimentos e na manutenção do peso corporal já que estudos demonstram a diminuição

da ingestão alimentar e uma conseqüente perda de peso corporal durante a administração

prolongada das drogas utilizadas tanto em humano como em roedores (Rapport e Moffitt, 2002;

Gray et al., 2007).

Na figura 22A pode ser observado que a administração repetida tanto de metilfenidato

quanto de cafeína, durante a idade adulta, não foi capaz de alterar o ganho de peso corporal de

ambas as linhagens durante os 14 dias de tratamento. Através da ANOVA de três vias (linhagem

X tratamento X repetição), a única diferença que pode ser observada é a já existente entre o

tamanho e conseqüentemente entre o peso corporal das linhagens WIS e SHR, que não sofreram

alterações [F(1,26)=28.77, P<

0.001]. Já que não houve diferenças significativas entre os outros

parâmetros analisados, além do fator repetição [F(6,156)=9.56, P<

0.001].

Resultados semelhantes foram encontrados com o tratamento realizado durante a

adolescência, como pode ser observado na figura 22B a administração repetida tanto de

metilfenidato quanto de cafeína, durante a adolescência, não foi capaz de alterar o ganho de peso

corporal de ambas as linhagens durante os 14 dias de tratamento. A única diferença que pode ser

observada, assim como ocorreu com o tratamento na idade adulta, é a já existente entre o

tamanho e conseqüentemente entre o peso corporal das linhagens WIS e SHR [F(1,42)=93.13,

P<0.001], que não sofreram alterações e também o fator repetição que também já era esperado

[F(6,252)=2065.2, P<

0.001].

150

175

200

225

250

275

WIS MFD

WIS V

WIS Caf

SHR V

SHR Caf

SHR MFD

1 3 5

11 13

Dias

Fêmeas - adultas

Peso Corporal (g)

100

150

WIS V

WIS CAF

WIS MFD

SHR V

SHR CAF

SHR MFD

1 2 5 7

11 13

Dias

Fêmeas - adolescentes

Peso corporal (g)

Figura 22 – Efeitos da administração (i.p.) repetida, durante a idade adulta (A) ou durante a

adolescência (B) de veiculo (V), metilfenidato (MFD) 2 mg/kg ou cafeína (CAF) 3 mg/kg, sob o

ganho de peso corporal (média ±E.P.M.), em ratos fêmeas adultos WIS e SHR.

4.11. Análise imuno-histoquímica para expressão de receptores de adenosina A1 e A2A em

cérebros de ratos fêmeas adultos das linhagens WIS e SHR

Para investigar se a expressão de receptores adenosinérgicos poderia estar envolvida com

o prejuízo cognitivo apresentado pelos ratos SHR foram realizadas análises de imuno-

histoquímica no hipocampo, nas sub-regiões CA1, CA2, CA3 e giro denteado (GD) e no córtex

parietal.

A figura 23 demonstra a expressão de receptores de adenosina A1 no hipocampo (sub-

regiões CA1, CA2, CA3 e GD) e no córtex parietal de ratos fêmeas adultos WIS e SHR ambos

tratados com veiculo. Como pode ser observado no gráfico abaixo da figura, não ocorreu

diferença significativa na quantificação de receptores de adenosina A1 em nenhuma das áreas

analisadas entre as linhagens WIS e SHR.

Figura 23 –

Figura representativa da expressão de receptores de adenosina A1, através de

análises de imuno-histoquímica, na região do hipocampo - 4X (A), sub-regiões hipocampais CA1

- 20X(B), CA2 - 20X(C), CA3 - 20X (D) e GD – 20X (E), no córtex parietal – 20X (F) de ratos

WIS e SHR.

Na figura 24 encontra-se demonstrado a expressão de receptores de adenosina A2A no

hipocampo, córtex parietal e estriado de ratos fêmeas adultos WIS e SHR também tratados com

veiculo. A análise de imuno-histoquímica não foi capaz de detectar a expressão de receptores de

adenosina A2A nas regiões hipocampais analisadas e no córtex parietal de ambas as linhagens.

No entanto, como pode ser observado na figura abaixo, uma pronunciada expressão desses

receptores foi encontrada na região estriatal de ambas as linhagens, que foi então utilizada como

controle positivo para a reação com o anticorpo para receptores de adenosina A2A.

Figura 24 – Figura representativa da expressão de receptores de adenosina A2A, através de

análises de imuno-histoquímica, no hipocampo – 4X (A e B), córtex parietal – 20X(C e D) e no

estriado – 40X (E e F) de ratos WIS e SHR.

5. DISCUSSÃO

Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que ratos SHR machos e

fêmeas apresentam um significante prejuízo na habilidade de reconhecimento de objetos, com

sutis diferenças estruturais, quando comparados com a linhagem de ratos WIS. Observamos

também que esse déficit apresentado pelos ratos SHR foi eficientemente revertidos pela

administração aguda de metilfenidato, cafeína, de antagonistas seletivos para receptores

adenosinérgicos do subtipo A

(DPCPX), A

(ZM241385) e também pela administração da

associação de DPCPX e ZM241385 em doses que sozinhas não foram efetivas. Verificamos

ainda que os diferentes tratamentos não alteraram a atividade locomotora e o estado hipertensivo

dos animais, sugerindo que a melhora no prejuízo cognitivo causado pela administração das

drogas utilizadas não está diretamente relacionada com esses fatores. Além disso, investigamos o

efeito da administração repetida de cafeína durante a idade adulta e durante a adolescência, e em

ambos os períodos a cafeína foi capaz de reverter, assim como o metilfenidato, os prejuízos

cognitivos apresentados por esses animais.

Vários estudos têm investigado a disfunção cognitiva dos ratos SHR em diferentes testes

comportamentais, já que esses animais apresentam os principais sintomas comportamentais

observados em pacientes que possuem o TDAH como hiperatividade, impulsividade e desatenção

(Sagvolden e Sergeant 1998; Sagvolden, 2000; Russel, 2002). Os prejuízos cognitivos

encontrados neste trabalho estão de acordo com estudos prévios que demonstraram menos

desempenho na performance dos ratos SHR quando comparados à linhagem utilizada como

controle (Hecht et al., 1978; Sutterer et al., 1980; Wyss et al., 1992; Mori et al., 1995;

Nakamura-Palacios et al., 1996; Gattu et al., 1997; Terry et al., 2000; Wyss et al., 2000; De

Bruin et al., 2003; Prediger et al., 2005a,b). No entanto é importante salientar que alguns autores

criticam o uso desta linhagem como modelo do TDAH, já que resultados comportamentais

indicaram que esses animais não apresentam sintomas consistentes equivalentes aos

diagnosticados no TDAH, como hiperatividade e prejuízos atencionais (van den Bergh et al.,

2006; Alsop, 2007), ou ainda estudos os quais indicam que os efeitos comportamentais após

tratamento com metilfenidato, a droga freqüentemente mais prescrita para o tratamento do

TDAH, não é especifica para a linhagem SHR (Bizot et al., 2007; Ferguson et al., 2007).

O modelo de reconhecimento de objetos utilizado neste trabalho é amplamente utilizado

como um teste de memória de trabalho, este modelo embora de simples execução é bastante útil

para investigar processos de atenção, aprendizado e ainda diferentes etapas da memória. Ele

utiliza como principal ferramenta a tendência natural que os roedores possuem de investigar

aquilo que é novo, e requer a habilidade de discriminação entre o objeto familiar e o não familiar.

Prediger et al. (2005a) demonstraram que os ratos SHR, os quais apresentam déficits de atenção

em paradigmas clássicos para a avaliação de processos atencionais, são capazes de discriminar

objetos com grandes diferenças estruturais. No entanto, no presente estudo, utilizamos uma

versão modificada do teste de reconhecimento de objetos, onde os animais foram submetidos a

objetos com diferentes níveis de complexidade estruturais, onde foi possível observar que ratos

machos e fêmeas adultos da linhagem SHR são capazes de discriminar objetos com claras

diferenças estruturais (ex: cubo X pirâmide), no entanto não possuem a mesma habilidade quando

os objetos são bem semelhantes (ex: cubo X “T”) quando comparados aos ratos WIS. Este déficit

na capacidade discriminatória não pode ser explicado pela diminuição do interesse dos animais

por novidades ou anedonia, já que durante a fase de apresentação aos objetos, onde os dois

objetos eram novos, os ratos SHR apresentaram tempo de investigação semelhante aos ratos WIS

e também não podem ser explicados por prejuízo na formação da memória, já que os animais

foram capazes de discriminar os objetos quando esses não eram tão semelhantes. As

modificações realizadas nesta versão nos permitiram então avaliar também processos atencionais,

já que os objetos são bastante semelhantes e a capacidade de manter a atenção sustentada é

imprescindível para que os animais possam discriminá-los, podendo ser que um prejuízo neste

processo seja o responsável pelo déficit na capacidade discriminatória apresentada pelos ratos

SHR.

Considerando a redução na performance dos ratos SHR em diferentes paradigmas de

avaliação de aprendizado e memória, eles têm sido considerados um modelo interessante para

investigação de substâncias com potencial terapêutico para transtornos de memória e atenção

(Meneses e Hong, 1998). Com o intuito de validar o uso da linhagem de ratos SHR no modelo

utilizado, assim como pode ser observado em nossos resultados, realizamos o tratamento com

metilfenidato em todas as etapas da pesquisa. Além da validação, o uso do metilfenidato teve

como objetivo a investigação de sua ação em ratos SHR, quando submetidos a testes cognitivos,

já que são poucos os trabalhos que abordam o uso desta droga em ratos SHR para avaliação

desses prejuízos. Como pode ser observada, a administração aguda de 2 mg/kg de metilfenidato

antes da etapa de apresentação aos objetos, ou a administração repetida da mesma dose tanto

durante as idades adultas, quanto na adolescência, foi capaz de reverter o prejuízo na capacidade

discriminatória apresentada por esses animais (Ueno et al., 2002; Fox et al., 2002; Adriani et al.,

2004). Neste trabalho não foi investigada qual é a persistência do efeito desta droga quando

administrada de forma repetida durante a idade adulta, no entanto, ao tentar simular o tratamento

que ocorre na clínica, administramos metilfenidato de forma repetida durante 14 dias no início da

adolescência e como pode ser observado os efeitos foram persistentes podendo ser detectados 2

meses após o termino do tratamento, tanto em ratos WIS como em ratos SHR.

O mecanismo exato responsável pelos déficits cognitivos apresentados pelos ratos SHR

ainda é desconhecido, no entanto a hipótese mais aceita é a existência de um distúrbio na

neurotransmissão dopaminérgica (Russel et al., 1998; Papa et al., 2002; Russel, 2002) assim

como observado no TDAH. Além disso, vários trabalhos têm demonstrado alterações funcionais

na neurotransmissão adenosinérgica em ratos SHR (Kamikawa et al., 1980; Davies et al., 1987,

Illes et al., 1989, Matias et al., 1993). O fato dos ratos SHR apresentarem redução na atividade da

enzima adenosina deaminase, que é responsável pela metabolização da adenosina em inosina,

causa um conseqüente aumento na atividade do sistema adenosinérgico, que pode ser

parcialmente responsável pela disfunção nos processos cognitivos, desde que evidências

suportam o efeito negativo de agonistas de receptores de adenosina no aprendizado e na memória

de roedores (Normile e Barraco, 1991; Zarrindast e Shafaghi, 1994; Ohno e Watanabe, 1996;

Homayoun et al., 2001; Takahashi et al., 2008). Takahashi et al., (2008) revisaram recentemente

estudos psicofarmacológicos pré-clinicos, os quais indicavam que a cafeína e antagonistas

seletivos para receptores de adenosina podem melhorar a memória de roedores assim como

proporcionar efeito protetor nas disfunções de memória apresentado em modelos animais da

doença de Alzheimer, Parkinson e TDAH.

No presente estudo, a administração aguda com cafeína na dose de 10 mg/kg em machos e

nas doses de 1, 3 ou 10 mg/kg em fêmeas, antes da fase de apresentação aos objetos, melhorou

significativamente o índice de reconhecimento apresentado pelos ratos SHR quando objetos com

diferenças estruturais sutis foram apresentados (cubo X T). A cafeína foi capaz de promover um

significante aumento no tempo de investigação do novo objeto na fase de discriminação sem

alterar o tempo de investigar do par de objetos iguais durante a fase de apresentação aos objetos.

Esses resultados não podem ser explicados pelo aumento na atividade locomotora, desde que não

foi observado alteração no número total de cruzamentos no campo aberto, durante a realização

das fases de apresentação e de reconhecimento dos objetos.

Assim como em estudos anteriores que demonstraram que a administração de cafeína

antes da sessão de treinamento é ineficaz, ou pode até mesmo prejudicar a retenção da memória

em roedores (Izquierdo et al., 1979; Angelucci et al., 1999, 2002; Prediger et al., 2005a, b), no

presente estudo a administração de cafeína, nas doses utilizadas, não causou nenhum tipo de

efeito quando administrado agudamente em ratos WIS ou quando administrado de forma repetida

(14 dias) durante a idade adulta. Por outro lado, quando administrados de forma repetida durante

a adolescência e testados na idade adulta a cafeína assim como o metilfenidato causaram um

prejuízo na habilidade discriminatória destes animais. Este efeito provavelmente ocorreu devido a

um desequilíbrio em processos de neurotransmissão, já que a fase onde ocorreu o tratamento é

uma fase onde várias modificações e processos de maturações neuronais estão ocorrendo e a

exposição prolongada a psicoestimulantes nesta fase podem causar modificações e adaptações

permanentes, resultando em disfunções no funcionamento cerebral durante a idade adulta

(Andersen, 2003; Stanwood e Levitt, 2004). Estudos demonstram que quando os níveis de

catecolaminas estão normais, a administração repetida de metilfenidato induz perturbações que

podem causar adaptações neuronais, podendo assim prejudicar o eficiente funcionamento

cognitivo. Heyser, Pelletier e Ferris (2004) encontraram prejuízos na memória de reconhecimento

de animais jovens que foram tratados (i.p.) com metilfenidato (5 mg/kg), duas vezes ao dia,

durante sete dias. Já outro estudo demonstrou que a administração de metilfenidato nas doses de

3 e 5 mg/kg durante 21 dias causou prejuízo na tarefa de reconhecimento de objetos quando

testados 14, 28 ou 42 dias após a ultima administração de metilfenidato (LeBlanc-Duchin e

Taukulis, 2007). Resultados semelhantes foram observados neste mesmo teste quando ratos

machos foram tratados cronicamente com d-anfetamina e testados 7 dias depois (Bisagno et al.,

2003).

Possivelmente, a explicação para esses resultados, é que a dificuldade apresentada pelos

ratos SHR na discriminação entre o objeto novo e o familiar ocorre devido a um prejuízo na

aquisição de informações durante a fase onde os objetos são apresentados a esses animais pela

primeira vez, que pode ser conseqüência da impulsividade ou da dificuldade de manter uma

atenção sustentada. Assim, a administração de cafeína, conhecida por melhorar a atenção (Nehlig

et al., 1992), teria permitido a melhora e a sustentação da atenção no momento da apresentação

aos objetos e, conseqüentemente, facilitado o reconhecimento do mesmo durante a fase de

reconhecimento. Este efeito ficou evidente quando administramos a cafeína antes da etapa de

apresentação aos objetos, e realizamos a fase de reconhecimento 24 horas após, esse experimento

nos permitiu verificar que o efeito da droga estava realmente ocorrendo na etapa de aquisição das

informações, pois na etapa de evocação os animais já não estavam sobre o efeito da droga.

Através destes mesmos resultados foi também possível excluir a existência de um efeito

dependente de estado, já que os ratos SHR demonstraram melhora na habilidade discriminatória

mesmo sem estar sob o efeito das drogas (Corodimas et al., 2000).

Observamos também que a capacidade da cafeína de melhorar o prejuízo na capacidade

de discriminação desses animais parece ser mediada tanto via receptores A

quanto via receptores

2A ,

já que resultados similares aos da cafeína foram obtidos com a administração aguda do

antagonista seletivos para receptores adenosinérgicos do subtipo A

– DPCPX e também pela

administração aguda do antagonista adenosinérgico seletivos para receptores do subtipo A

ZM24138, observamos ainda que doses desses mesmos antagonistas que eram ineficazes quando

administradas isoladamente, foram capazes de reverter o prejuízo dos ratos SHR quando

associadas.

Existe uma grande controvérsia a respeito da participação de receptores A1 e A2A em

processos de aprendizado e memória. Resultados anteriores obtidos em nosso laboratório

demonstraram que o ZM241385, assim como a cafeína, foram capazes de reverter o prejuízo

apresentado pelos SHR na tarefa de reconhecimento social, utilizado para avaliar memória de

trabalho, (Prediger et al., 2005a). Já quando avaliado o efeito da cafeína no teste de memória

espacial no labirinto aquático de Morris (Prediger et al., 2005b), assim como nos nossos

experimentos, tanto a administração de DPCPX quanto a administração de ZM241385 foram

capazes de reverter, assim como a cafeína, o prejuízo apresentado pelos ratos SHR (Takahashi et

al., 2008).

Apesar de não existir um consenso a respeito de qual seria o principal receptor envolvido,

evidências sugerem que o efeito da cafeína ocorre principalmente via receptores A

2A.

Higgins et

al., (2007) demonstraram recentemente que o efeito da cafeína no aumento do tempo de reação

durante a realização do teste de atenção “five-choice” é mediado pelo antagonismo de receptores

de adenosina do subtipo A

. Outro trabalho realizado por Gimenez-Llort et al., (2007), onde

foram utilizados ratos transgênicos que superexpressam receptores adenosinérgicos humanos do

subtipo A

2A,

demonstrou que esses animais apresentam déficits na memória de trabalho quando

avaliados no teste de reconhecimento de objetos. Juntos esses trabalhos reforçam nossa hipótese

de que um possível desequilíbrio no sistema adenosinérgico pode ser o responsável, pelo menos

em parte, pelo déficit atencional apresentado pelos ratos SHR, e que a reversão deste

desequilíbrio pela cafeína (através do bloqueio de receptores de adenosina) seja responsável pelo

efeito positivo no desempenho dos ratos SHR no teste de reconhecimento de objetos.

A memória de trabalho é um relevante processo cognitivo para aquisição de informações

importantes e idéias que são críticas para argumentação e para o julgamento humano. Castner et

al. (2004) através de sua revisão, demonstraram que a memória de trabalho depende da

integridade funcional do córtex pré-frontal, embora o hipocampo, córtex parietal inferior, núcleo

caudado e núcleo dorsomedial do tálamo são áreas cerebrais conhecidas por apresentarem papel

relevante no circuito neural. Baseado no estudo de Gimenez-llort et al. (2007), onde evidências

demonstraram que déficits na memória de trabalho em ratos podem ser conseqüência de uma

expressão aumentada de receptores de adenosina A

na região do córtex cerebral e do

hipocampo, foi avaliado no presente estudo a comparação da expressão de receptores de

adenosina A1 e A

na região cortical e hipocampal de ratos WIS e SHR através da técnica de

imuno-histoquímica. Entretanto, surpreendentemente não foram encontradas diferenças

significativas nos níveis de receptores de adenosina A

e A

entre as linhagens avaliadas.

Embora inéditos esses resultados estão de acordo com a já sabida escassez de receptores A

algumas áreas cerebrais no SNC de roedores, sendo encontrados principalmente no estriado,

núcleo acumbens e tubérculo olfatório (Fredholm et al., 1998; Rosin et al., 1998, 2003).

Outra possível especulação para os resultados encontrados no presente estudo é a

interação entre receptores de adenosina e de dopamina. Vários trabalhos demonstraram

evidências da existência de formação de complexos heterodímeros entre os receptores A

- D

entre os receptores A

– D

. A formação destes complexos pode causar modificações na

neurotransmissão da dopamina, influenciando tanto as condições fisiológicas quando patológicas

envolvidas. Estudos farmacológicos demonstraram que a neuromodulação adenosinérgica causa

profundo efeito na função neuronal da dopamina (Fuxe et al., 1998; Hillion et al., 2002; Canals et

al., 2003; Kamiya et al., 2003, Fuxe et al., 2007). Os efeitos comportamentais observados neste

estudo, através da administração de antagonistas adenosinérgicos, podem estar relacionados com

a existência desses complexos heterodímeros, desde que os efeitos encontrados com a

administração desses antagonistas foram bastante semelhantes aos encontrados com

metilfenidato, uma droga que tem como principal mecanismo de ação a inibição da recaptação de

dopamina causando assim um aumento na concentração da mesma na fenda sináptica.

Outro ponto que deve ser discutido é a possibilidade de algum tipo de relação entre os

déficits cognitivos e a hipertensão apresentados pelos SHR. A ativação de receptores de

adenosina demonstrou diminuir a pressão sanguínea, enquanto seu bloqueio demonstrou causar

hipertensão (Azevedo e Osswald, 1992; Biaggioni, 1992; Abdel-Rahman e Tao, 1996). No

entanto, nossos resultados indicaram que apesar das maiores doses de DPCPX terem causado

uma diminuição na pressão arterial dos ratos SHR, a reversão dos processos cognitivos

encontrados não parecem estar relacionados com a diminuição da pressão arterial, já que as doses

utilizadas de metilfenidato, cafeína e ZM241385, que foram capazes de melhorar a função

cognitiva dos ratos SHR, não foram capazes de alterar o estado hipertensivo desses animais.

Assim como em nossas evidências, estudos prévios que também demonstraram melhora no

aprendizado de ratos SHR, não encontraram nenhuma interferência nos valores da pressão arterial

desses animais (De Bruin et al., 2003; Prediger et al., 2005a, b), sugerindo assim que outros

fatores, mas não a hipertensão estão diretamente relacionados com os déficits cognitivos

apresentados.

Em conclusão, o presente estudo caracteriza pela primeira vez a presença de prejuízos

cognitivos, no teste de reconhecimento de objetos, em ratos SHR machos e fêmeas adultos,

possivelmente devido a dificuldade de manter a atenção sustentada durante o teste. Demonstram

ainda que o déficit apresentado por esses animais foram revertidos pela administração aguda de

metilfenidato e de cafeína, de maneira semelhante em ambos os sexos. Através da administração

de antagonistas adenosinérgicos seletivos, observamos que o efeito encontrado com a cafeína

pode estar relacionado tanto com o bloqueio de receptores A1 como A2A. Encontramos ainda

que a administração repetida de metilfenidato ou de cafeína possivelmente são responsáveis por

modificações persistentes em processos neuronais. È interessante ressaltar também que

possivelmente os prejuízos apresentados pelos ratos SHR não estão relacionados com a

hipertensão e que outros estudos são necessários para esclarecer se os resultados encontrados

estão relacionados com alterações na expressão de receptores de adenosina A

ou A

Certamente mais estudos são necessários também para avaliar o mecanismo pelo qual esses

efeitos estão sendo realizados, a durabilidade dos efeitos e a existência da interação entre o

sistema adenosinérgico e outros sistemas de neurotransmissores que podem estar também

envolvidos com o efeito da cafeína. E ainda deixar claro a importância da descoberta e

desenvolvimento de uma alternativa terapêutica para o tratamento do TDAH, já que o diagnóstico

desde distúrbio está sendo realizado cada vez mais cedo, sendo que muitas vezes é realizado de

forma errônea, colocando em risco o desenvolvimento e saúde mental de milhares de crianças e

adolescentes que são desde cedo submetidos ao uso crônico de psicoestimulantes.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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