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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Expressão da proteína ligadora de cálcio
S100A7 em carcinoma espinocelular de laringe
e sua correlação com a clínica: análise por
imuno-histoquímica
ROGÉRIO COSTA TIVERON
Ribeirão Preto
2008
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ROGÉRIO COSTA TIVERON
Expressão da proteína ligadora de cálcio
S100A7 em carcinoma espinocelular de laringe
e sua correlação com a clínica: análise por
imuno-histoquímica
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo, para a obtenção do título de
Doutor em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Morfofisiologia de
Estruturas Faciais.
Orientador: Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede
Ribeirão Preto
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Tiveron, Rogério Costa
Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7 em carcinoma
espinocelular de laringe e sua correlação com a clínica: análise
por imuno-histoquímica.
Ribeirão Preto, 2008.
144p.: il.; 30cm
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP – Programa: Oftalmologia, Otorrinolaringologia
e Cirurgia de Cabeça e Pescoço - Departamento de Oftalmologia,
Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço.
Orientador: Mamede, Rui Celso Martins
1. psoriasin1; 2. carcinoma espinocelular; 3. carcinoma de laringe; 4.
imuno-histoquímica; 5. marcadores tumorais; 6. S100 A7
FOLHA DE APROVAÇÃO
Rogério Costa Tiveron
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo, para a obtenção do título de
Doutorado em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Morfofisiologia de
Estruturas Faciais.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Dedicatória
Dedico aos meus pais (Nelma e Djalma), pelo exemplo de caráter,
dedicação e amor incondicional.
Aos meus irmãos, pela amizade e companheirismo.
À Luciana: minha inspiração.
Agradecimentos
A Deus, pelo milagre da vida e por me conceder mais esta realização,
que não seria alcançada sem o envolvimento de tantas pessoas. Por
isso quero compartilhá-la com todos.
Gostaria de enfatizar que este trabalho não seria possível sem a
colaboração dos pacientes, que em momento difícil de suas vidas se
dispuseram a contribuir, sem o que, esta tese não existiria.
Ao Prof. Dr. Rui Mamede, pela orientação neste trabalho e pela
amizade e confiança estabelecidos em anos de convivência na
residência médica e, posteriormente, na pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Marco Antônio Zago, co-orientador desta tese, minha
gratidão por disponibilizar o anticorpo usado no trabalho junto ao
Ludwig Institute for Cancer Research (NY) e, principalmente, por
propiciar que o Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço se
envolvesse em pesquisas genômicas por meio do Projeto Temático da
FAPESP: “Busca de marcadores de Agressividade em Tumores de
Cabeça e Pescoço”.
Agradeço ao Prof. Dr. Luciano Nedder e demais funcionários da
patologia pela realização do estudo histológico.
Sou grato também às secretárias Vilma, Lílian e Cecília
(Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de
Cabeça e Pescoço) e Márcia (Departamento de Cirurgia) por terem
sido sempre tão prestativas ao longo destes anos.
Ao David, colega de residência, grande amigo, parceiro e tutor deste
projeto. Muito obrigado por abrir caminho nos trabalhos genômicos
em câncer de cabeça e pescoço nesta instituição. Também aos
colegas de projeto, José Raphael Montoro e Daniel Hardy, pela
amizade, desde a residência médica.
Meu reconhecimento especial à Emmanuelle, minha grande amiga de
todas as horas, que nos momentos mais difíceis da redação deste
trabalho esteve a meu lado, noites a fio, ajudando-me na digitação
até sua conclusão.
Ao amigo João Batista Ribeiro, pelas oportunas dicas e por me fazer
confiar que seria possível concluir esta etapa em momentos que nem
mesmo eu acreditava.
Aos meus pais e à Luciana pelo incentivo, apoio constantes e
tolerância nos momentos mais difíceis, não tenho palavras para
agradecer.
A tantos outros que de várias formas me incentivaram a abraçar e
concluir este desafio, meu muito obrigado!
Epígrafe:
“Bom mesmo é ir à luta com determinação
Abraçar a vida e viver com paixão
Perder com classe e vencer com ousadia.
Porque o mundo pertence a quem se atreve
E a vida é muito para ser insignificante”.
Charles Spencer Chaplin Jr. (1889 – 1977).
LISTA DE ABREVIATURAS
Lista de Abreviaturas
APCN- Antígeno de Proliferação Celular Nuclear
BD- bem diferenciados
CECCP- Carcinomas Espinocelulares da cabeça e pescoço
CECL- Carcinoma Espinocelular de Laringe
CTAs- genes de antígenos tumorais específicos
EGFR- Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico
FCVE- fator de crescimento vascular endotelial
FHIT- Tríade frágil da histidina
H&E- hematoxilina e eosina
HCFMRP-USP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
HPV- papiloma vírus humano
MD- moderadamente diferenciados
MIB I- proteína Ki-67
PD- pouco diferenciados
PET-CT- Tomografia por Emissão de Positrons
TGFα- Transformador de Crescimento-α
α-FGF- Fator de Crescimento Fibroblástico
LISTA DE FIGURAS
Lista de Figuras
Figura 1: Distribuição dos tumores de laringe por sítios segundo o
estadiamento clínico (valores expressos em número de pacientes) ..... 77
Figura 2- Classificação histológica em diferentes sítios do tumor,
expressa em número de pacientes. BD: bem diferenciados, MD:
moderadamente diferenciados, PD: pouco diferenciados ................... 80
Figura 3- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após
reação de imuno-histoquímica com expressão do S100 A7. Escore 0+
no Carcinoma e 4+ em área de carcinoma in situ (setas) (Aumento
de 100x) ..................................................................................... 81
Figura 4- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após
reação de imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100
A7). Escore 1+ (Aumento de 100x). ............................................... 82
Figura 5- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após
reação de imuno-histoquímica com expressão da proteína S100 A7.
Escore 2+ (Aumento de 100x). ...................................................... 82
Figura 6- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após
reação de imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100
A7). Escore 3+ (Aumento de 100x). ............................................... 83
Figura 7- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após
reação de imuno-histoquímica com expressão do S100 A7. Escore 4+
(Aumento de 100x). ..................................................................... 83
Figura 8- Distribuição dos diferentes escores das reações de imuno-
histoquímica em relação aos diferentes sítios tumorais na laringe
(valores expressos em número de pacientes). ................................. 84
Figura 9- Distribuição do escore nos diferentes graus de
diferenciação. (valores expressos em número de pacientes). ............. 87
Figura 10- Curva de sobrevida para os diferentes escores ................ 93
Figura 11- Curva de sobrevida para escores agrupados (grupo de
ausência ou de baixa positividade – escores zero, 1+ e 2+; grupo de
alta positividade – escores 3+ e 4+)............................................... 95
LISTA DE TABELAS
Lista de Gráficos
Tabela 1- Seguimento clínico dos pacientes segundo o sítio do tumor
(valor expresso em número de pacientes). ...................................... 78
Tabela 2- Relação de óbitos e seus motivos de acordo com o sítio do
tumor. (valores expressos em número de pacientes).
............................. 79
Tabela 3- Distribuição dos tumores em etilistas e não etilistas quanto
ao grau de diferenciação (valores expressos em número de
pacientes) ................................................................................... 80
Tabela 4- Relação dos pacientes estudados com seus respectivos escores,
grau de diferenciação, sítio primário e estadiamento clínico. B.D. (bem
diferenciado), M.D. (moderadamente diferenciado), P.D. (pouco
diferenciado).
................................................................................ 85
Tabela 5- Análise do escore de acordo com os diferentes graus de
diferenciação.
. ............................................................................... 87
Tabela 6: Distribuição dos escores de acordo com os diferentes
estadiamentos para os tumores MD.
................................................... 88
Tabela 7- Análise do escore em relação ao sitio do tumor
....................... 89
Tabela 8- Análise do escore em relação ao estadiamento clínico ...............
89
Tabela 9- Distribuição do escore em pacientes etilistas e não etilistas
(valores expressos em número de pacientes).
....................................... 90
Tabela 10- Análise do escore em relação à presença de recidiva local.
....... 91
Tabela 11- Análise do escore em relação à recidiva regional.
................... 91
Tabela 12- Relação do escore com a presença de falhas do tratamento
(recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário).
............ 92
Tabela 13- Relação da sobrevida média (em meses) e os diferentes
escores..
...................................................................................... 94
Tabela 14- Relação da sobrevida média (em meses) em relação aos dois
grupos de escore (grupo 1 – escores 0,1+,2+ e grupo 2 – escores 3+ e
4+)..
........................................................................................... 95
RESUMO
Resumo
TIVERON, R.C. Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7
em carcinoma espinocelular de laringe e sua correlação com a
clínica: análise por imuno-histoquímica 144f. Tese (Doutorado
em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
O Câncer de Laringe, com 8.000 casos por ano, corresponde a 2%
dos do Brasil e é o segundo mais freqüente do sistema respiratório,
perdendo apenas para o de pulmão. O Carcinoma Espinocelular de
Laringe (CECL), responsável por 94% dos casos, se caracteriza por
ser heterogêneo, com evoluções indefinidas. Nos últimos anos, o
estudo das alterações celulares e moleculares tem buscado
marcadores capazes de identificar os tumores mais agressivos. As
proteínas ligadoras de Cálcio S100, com atuação em uma série de
processos celulares como progressão e diferenciação do ciclo celular,
têm sido estudadas em muitos tipos de cânceres, excetuando os de
laringe. Objetivos: Em CECL pretendeu-se identificar a expressão
imuno-histoquímica da proteína ligadora de cálcio S100 A7 e a sua
correlação com características clínicas e histopatológicas do tumor.
Casuística e Métodos: Avaliados 63 pacientes com diagnóstico
histopatológico de CECL, tratados cirurgicamente no período de 2001
a 2005. Seus respectivos espécimes foram submetidos a reações de
imuno-histoquímica com o anticorpo S100 A7 (Psoriasin) – liquid
mouse monoclonal antibody NCL-L-S100 A7 – Novocastra
Laboratories
®
. As reações foram classificadas quanto à extensão da
imunomarcação em: Zero; 1+: 5 – 25% das células neoplásicas
marcadas; 2+: 25 – 50%; 3+: 50 – 75%; 4+: > 75% (nível de
significância p ≤ 0,05). Resultados: A amostra de 63 pacientes, 58
homens e cinco mulheres, com idade variando de 27 a 78 anos
(média de 57,46) constituiu-se de 36 casos de tumores pertencentes
à supraglote, 24 à glote e apenas três à subglote, sendo 13 BD, 37
MD e 13 PD. A análise das falhas do tratamento revelou dez recidivas
locais, sete recidivas regionais, uma metástase e cinco 2º tumores
primários. Os escores foram correlacionados com diversas variáveis.
Observou-se tendência dos tumores glóticos a terem escores altos
(15 de 24 com escore 3+ e 4+) e os supraglóticos, escore baixo (20
em 26 abaixo de 3+). O grupo BD apresentou escores
significantemente superiores aos MD e aos PD; e o grupo MD superior
ao PD (p< 0,01*). No grupo MD notou-se predomínio de escores
altos nos estadios I e II (7 casos com escore 3+ e 4+ de 10) , ao
passo que nos estadios avançados (III e IV), a distribuição do escore
foi mais homogênea (13/27 escores 0 a 2+ e 14/27 escores 3+ e
4+). Com relação às falhas do tratamento, houve diferença
estatisticamente significante do grupo escore 0 (3/4 complicações:
Resumo
75%) com os demais escores (13/59: 22%) (p= 0,02*). Discussão:
O gene proteína ligadora de cálcio S100 A7 pertence à família S100 e
é amplamente expresso em epitélio de doenças que cursam com
hiperplasias da epiderme, como a psoríase. Recentemente, tem sido
relatada alta expressão em lesões neoplásicas (carcinoma ductal de
mama, carcinoma espinocelular de bexiga e carcinoma espinocelular
de cavidade oral). À semelhança desses estudos, observou-se alta
expressão em tumores BD, ao passo que em tumores indiferenciados
esse gene parece não atuar. À medida que a massa tumoral aumenta
os escores tendem a diminuir (isto foi observado nos tumores MD), o
que reforça a hipótese da sua ação se concentrar nas fases iniciais da
carcinogênese. Conclusões: O marcador Psoriasin 1 (S100A7) foi
expresso em 93,7% dos casos de CECL com maior positividade em
tumores mais diferenciados e com menor índice de falhas de
tratamento (estatisticamente significante). Há tendência dos tumores
glóticos terem maior escore na expressão (sem significância). O
escore obtido não representou impacto na sobrevida dos pacientes
estudados.
Palavras-chave: psoriasin; carcinoma espinocelular; carcinoma de
laringe; imuno-histoquímica; marcadores tumorais, S100A7.
SUMMARY
Summary
TIVERON, R.C. Expression of calcium binding protein S100A7 in
Larynx Squamous Cell Carcinomas and its correlation to the
clinic: immunohistochemical analysis. 144f. Thesis (Doctoral) –
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, 2008.
Larynx cancer, with 8,000 cases annually, is the second most
common respiratory cancer after lung cancer and it represents 2% of
all cases of cancer in Brazil. The Laryngeal Squamous Cell Carcinoma
(LSCC), responsible for 94% of all larynx cancer cases, has
heterogenic features and presents indefinite evolutions. In the last
years, the study of molecular and cellular alterations has focused in
detecting markers to identify more aggressive tumors. The S100
Calcium biding proteins are involved in a variety of cellular processes
such as cell-cycle progression and differentiation. They are actually
reported in many kinds of cancer, except larynx cancer. Objectives:
In LSCC it was intended to identify the imunohistochemistry
expression of calcium binding protein S100 A7 and its correlation with
clinic and histological features. Casuistic and Methods: 63 patients
with histological LSCC diagnostic, treated by surgery between 2001
and 2005, were evaluated. The respective samples were submmited
to imunohistochemical reactions with the S100 A7 antibody (NCL-L-
S100 A7 – Novocastra Laboratories
®
). The reactions were classified
by two independent pathologists according to their extension: Zero,
1+: 5 to 25% of neoplasic cells marked, 2+: 25 to 50%, 3+: 50 to
75% and 4+:>75% (significance level: p<0,05). Results: 63
patients, 58 men and 5 women aged from 27 to 78 years – average:
57.46 years – had a distribution of 36 supraglottic, 24 glottic and
only 3 subglottic tumors. 13 cases of LSCC were well differentiated,
37 moderately differentiated and 13 poorly differentiated. There was
17 obits, 12 caused by the disease (5 by the treatment and 7 by the
neoplasia) and 5 by other causes. Analyzing the treatment failures
there was 10 local recurrences, 7 regional recurrences, 1 distant
metastasis an 5 2
nd
primary tumors. The obtained scores were
correlated to the different variables. The study showed a tendency of
the glottic tumors to have high scores (15 in 24 scored 3+ and 4+)
and also the supraglottic have lower (20 in 26 < 3+). The moderately
differentiated group had significantly higher scores than the
moderately and poorly and the moderately had higher scores than
poorly (p<0,01*). In the moderately group it is possible to note a
higher score prevalence at I and II stages (7 cases in 10 scored 3+ or
4+), and on the other hand at advanced stages (III and IV) the score
distribution were similar (13/27 scored 0 to 2+ and 14/27 scored 3+
Summary
and 4+). The treatment failures were significant higher in zero score
group (3/4 complications: 75%) than in positive score group (13/59:
22%) (p= 0,02*). Discussion: The calcium binding protein S100 A7
is a gene from S100 family and is highly expressed hyperplasic
epidermal diseases, such as psoriasis. Recently it was reported in
same neoplasic diseases (such as breast ductal cancer, bladder
epidermoid carcinoma, skin tumors and oral epidermoid cancer).
Similarly to these studies it was observed high expression in well
differentiated tumors but in poorly differentiated it seems to loose its
function. When the tumor mass is growing the score levels seems to
reduce and this fact showed a tendency to its action concentrate in
beginning carcinogenic phases. Conclusions: The psoriasin S100 A7
was expressed in 93.7% of tha LSCC, with highest expression in the
more differentiated (statistically significant). There is a tendency to
glottic tumors to have higher scores (no significance). The obtained
score didn’t represent impact in the overall survival curves.
Key-words: psoriasin, larynx cancer, squamous cell carcinoma,
tumors markers, S100A7.
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO ....................................................................... 22
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................... 30
2.1. Incidência ............................................................................... 31
2.2. Fatores de Risco ...................................................................... 33
2.2.1. Tabaco e Álcool .............................................................. 33
2.2.2. Outros Fatores ............................................................... 34
2.3. Mortalidade, Sobrevida e Prognóstico ........................................ 36
2.4. Fatores Prognósticos ................................................................ 39
2.4.1. Idade ............................................................................ 39
2.4.2. Estado Geral do Paciente ................................................. 39
2.4.3. Estadiamento do Tumor .................................................. 40
2.4.3.1 Estadio T ............................................................ 40
2.4.3.2. Metástase Linfonodal .......................................... 41
2.4.4. Grau Histológico do Tumor .............................................. 42
2.4.5. Sítio Anatômico do Tumor ............................................... 43
2.4.6. Neoangiogênese ............................................................. 44
2.5. Avanços Genéticos .................................................................. 45
2.5.1. Marcadores Pré-neoplásicos ............................................. 45
2.5.2. TP53 ............................................................................. 46
2.5.3. CDKNZA ........................................................................ 49
2.5.4. Ciclina D1 ...................................................................... 50
2.5.5. Marcadores de Proliferação .............................................. 51
2.5.6. Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico ................... 52
2.5.7. CD 44 ........................................................................... 53
2.5.8. Bcl-2 ............................................................................ 54
2.5.9. Ploidia .......................................................................... 55
2.5.10. Região cromossômica 3p14 ........................................... 56
2.5.11. Cromossomo 8 ............................................................. 56
2.6. Proteína ligadora de cálcio S100 A7, psoriasin 1 .......................... 58
2.6.1. O S100A7 e o Câncer de Mama ....................................... 60
3. HIPÓTESE ............................................................................. 63
4. OBJETIVOS ........................................................................... 65
5. CASUÍSTICA E MÉTODOS ...................................................... 67
5.1. Casuística ............................................................................... 68
5.1.1. Critérios de Inclusão ....................................................... 70
5.1.2. Critérios de Exclusão ...................................................... 71
5.2. Método ................................................................................... 71
5.2.1. Estudo Histopatológico ..................................................... 71
5.2.2. Análise Estatística ........................................................... 74
6. RESULTADOS ........................................................................ 75
6.1. Características da amostra........................................................ 76
6.2. Evolução ................................................................................ 77
6.3. Avaliação do Escore ................................................................. 84
6.4. Comparação das curvas de sobrevida entre os diferentes escores
(considerando os escores 0,1,2,3 e 4) ........................................ 92
6.5. Comparação das curvas de sobrevida entre grupos de escores ...... 94
7. DISCUSSÃO .......................................................................... 96
7.1. O gene S100 A7 ...................................................................... 97
7.2. Expressão da proteína S100 A7 .............................................. 101
7.3. Falhas do tratamento ............................................................ 103
7.4. Função do Gene .................................................................... 108
8. CONCLUSÕES ...................................................................... 110
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 112
10. ANEXOS ............................................................................ 136
ANEXO DE PUBLICAÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Introdução
23
O Câncer de Laringe é o segundo mais comum do sistema
respiratório, perdendo apenas para o de pulmão (CATTARUZZA;
MAISONNEUVE; BOYLE, 1996). Compreende cerca de 2% dos casos
de câncer do Brasil, o que corresponde a 8.000 por ano, sendo
responsável por 3,8% nos homens e 0,6% nas mulheres das mortes
por câncer, num total de 3.000 mortes por ano (MINISTÉRIO DA
SAÚDE - INCA, 2002 e 2003). Seu pico de incidência nos dois sexos
se dá nas sexta e sétima décadas de vida, embora alguns casos
tenham sido relatados na infância (BENHAMOU et al., 1992, VAN
CAUWENBERGE; DHOGE; INGELS, 1994; OHLMS; McGRILL; HEAL,
1994).
Existe marcante diferença na ocorrência do câncer de laringe
entre sexos, sendo ele mais comum nos homens (YANG et al., 1989),
com proporção homem/mulher, quanto à incidência, de 7/1, muito
maior que em outras partes da cabeça e pescoço (BOSCH et al.,
2004).
Com relação ao tipo histológico, o mais comum é o
carcinoma espinocelular (ou carcinoma de células escamosas), em
seus vários graus de diferenciação. O carcinoma espinocelular
corresponde à cerca de 96% dos casos de câncer da laringe (SHAH;
Introdução
24
KERNELL; HOFFMAN, 1997), o restante dos casos é representado
pelo carcinoma verrucoso (que corresponde à uma variação
histológica do carcinoma espinocelular), carcinoma epidermóide tipo
sarcomatóide (outra variação do carcinoma epidermóide),
adenocarcinoma, neoplasias de glândulas salivares (adenoma
pleomórfico, tumor mucoepidermóide, carcinoma adenóide-cístico,
tumor de células acinosas), tumores neuroendócrinos (paraganglioma
e tumores carcinóides), carcinoma anaplásico de pequenas células e
outras neoplasias mais raras como: melanoma, rabdomiossarcoma,
sarcoma de kaposi, histiocitoma, condrossarcoma, osteossarcoma,
lipossarcoma, linfoma e tumores metastáticos (NORONHA; DIAS,
1997).
O tabagismo é o maior fator de risco para o carcinoma
espinocelular de laringe (CECL) (CUMMINGS et al, 1998). As sub-
regiões da laringe devem ser distintas no que diz respeito à etiologia.
O tabaco predomina no risco do câncer da glote, ao passo que a
associação alcoolismo e tabagismo é mais proeminente nos casos da
supraglote (WORLD CÂNCER RESEARCH FUND AND AMERICAN
INSTITUTE FOR CÂNCER, 1997). A relação do asbesto com o câncer
de laringe é controversa, apesar de sua pronunciada relação com o
câncer de pulmão (SMITH; HANDLEY; WOOD, 1990). Algumas
estatísticas também revelam aumento na incidência do CECL em
Introdução
25
indivíduos expostos a substâncias irritantes (níquel, gás mostarda
nitrogenada, pó de óxido de ferro, vapores de ácido, etc.) (BARKLEY
et al., 1972; MERLETTI et al., 1984).
Apesar dos inúmeros avanços no diagnóstico, bem como no
tratamento do câncer de cabeça e pescoço, a sobrevida aumentou
pouco mais de 10% nos últimos 30 anos (JERNAL et al., 2002; CHEN;
SANKARANARAYANAN; SHEN, 1998). Esse aumento está entre os
mais baixos obtidos para os carcinomas de todo o corpo, mantendo
os índices de cura num platô desde 1975 (LANDIS et al., 1999).
É marcante a heterogeneidade de fatores envolvidos na
evolução do carcinoma epidermóide. Muitas características clínicas e
histopatológicas já foram extensamente estudadas e são
consideradas úteis como fatores prognósticos, sendo usadas na
indicação terapêutica dessa neoplasia. Dentre elas, o estadiamento
da lesão (TNM), o sítio anatômico da lesão, grau de diferenciação
tumoral e influência de fatores etiológicos (cigarro, álcool e HPV).
A classificação e estadiamento da neoplasia, segundo o
sistema TNM de classificação de tumores malignos (SOLBIN;
WITTEKIND, 2004) (Anexo 1), representa impacto importante na
sobrevida dos pacientes com CECL. O estadio T dá mais informação
de prognóstico no que diz respeito à recorrência no sítio primário. Em
termos de sobrevida, os fatores prognósticos mais importantes são a
Introdução
26
presença de metástases linfonodais (estadio N) e a detecção de
extravasamento capsular (PINSOLLE; PINSOLLE; MAYOUFRE, 1997).
Com relação à diferenciação histológica, sabe-se que
tumores bem diferenciados (com predomínio de células diferenciadas)
tendem a uma evolução mais favorável que os pouco diferenciados.
Uma divisão cirúrgica da laringe em supraglote, glote e
subglote tem correlação embriológica e anatômica e valor em prever
padrões de invasão e comportamento tumoral. A região glótica tem
uma drenagem linfática pobre, levando à baixa capacidade de
disseminação do tumor para os linfonodos cervicais, e em geral, é
sede de carcinomas espinocelulares bem diferenciados. Esses fatores,
associados à precocidade de seus sintomas, fazem com que o
prognóstico do tratamento dos tumores da glote tenha melhor
perspectiva (NORONHA; DIAS, 1997). A supraglote, pelo contrário,
com sua rica rede linfática, tem grande poder de disseminação
tumoral para os linfonodos cervicais. Devido ainda ao fato de sua
origem embrionária ser o primórdio bucofaríngeo (3º ou 4º arco), que
não é dividido pela linha média, essa disseminação pode ser bilateral.
A sintomatologia dos tumores dessa região é escassa e, geralmente,
os tumores manifestam sinais e sintomas em um estágio mais
avançado. Esses dados concorrem para o fato de que tumores da
supraglote apresentem pior prognóstico (CUMMINGS et al., 1998)
Introdução
27
Esses aspectos, porém, não são suficientes em todos os casos
observados e, com isso, não é raro observar tumores com
características clínicas e histopatológicas favoráveis apresentarem
evoluções agressivas e, ao contrário, tumores com aspectos de mau
prognóstico apresentar evolução mais branda.
Nos últimos anos, o estudo das alterações celulares e
moleculares tem se desenvolvido no sentido de detectar marcadores
moleculares. A análise da expressão dos marcadores tumorais auxilia
na localização de tumores primários ocultos e a presença de
neoplasia nas margens cirúrgicas, mas principalmente, auxilia na
identificação de indivíduos mais suscetíveis a desenvolverem o CECL,
bem como aqueles portadores de neoplasia de maior agressividade e
com maior propensão para metástases locorregionais e à distância e
com isso orientar o melhor tratamento.
As bases genéticas do câncer de cabeça e pescoço são
complexas. Entretanto, após cuidadosos estudos cromossômicos e
genéticos, tem havido melhor compreensão dos eventos moleculares
envolvidos na sua origem e progressão (SHIN; LIPPMAN; HONG,
1999). Diferenças no padrão cromossômico e na progressão
carcinogênica entre os CECL e outros carcinomas espinocelulares da
cabeça e pescoço (CECCP) têm sido demonstradas por estudos
genômicos comparativos (HUANG et al., 2002),
em particular o TP53,
Introdução
28
que é normalmente expresso nos CECL mais freqüentemente que nos
outros CECCP (BOSCH et al., 2004). Outros marcadores moleculares
e alterações cromossômicas diversas têm sido descritos
recentemente nos CECL, dentre eles, o CDK2NA (conhecido também
como p16), a ciclina D1, os marcadores de proliferação, o receptor do
fator de crescimento epidérmico, o Bcl-2, o gene da tríade frágil da
histidina, as alterações do cromossomo 8.
Figueiredo et al. (2006), em análise da expressão de RNAm
dos genes codificantes de antígenos tumorais (CT Antigens) – MAGE -
1,4,10,12,BAGE, GAGE, LAGE, NYESO1 e PRAME – observaram a
expressão desses genes, em proporções variáveis (de 6,1 a 48%),
em CECCP. Concluíram ainda, que no caso de tumores avançados,
pelo menos um desses antígenos encontra-se expresso em 66,6%
dos casos.
A família de genes S100 compreende, pelo menos, 13
membros localizados na região cromossômica 1q21. As proteínas
ligadoras de cálcio S100 se localizam no citoplasma e/ou no núcleo de
uma variedade de células (SMITH; SHAW, 1998) e estão envolvidas
em uma série de processos celulares, como a progressão e a
diferenciação do ciclo celular (ZIMMER et al. 1995). Recentemente,
tem se observado o envolvimento de algumas proteínas da família
S100 com muitos tipos de câncer (OHUCHIDA et al., 2005;
Introdução
29
ARUMUGAM; RAMACHANDRAN; LOGSDON, 2006; JASSEM et al.,
2006).
A proteína ligadora de cálcio S100 A7, também conhecida
por psoriasin 1 ou S100 A7 é um novo gene, localizado na região
cromossômica 1q21 e compartilha os domínios dos ligantes de cálcio
que define a família de genes S100 (WATSON; LEYGUE; MURPHY,
1998). Ele codifica pequenas proteínas citoplasmáticas ligantes do
cálcio (SCHAFER; HEIZMAN, 1996), responsáveis pelo crescimento
celular, diferenciação e determinação do formato celular (WATSON;
LEYGUE; MURPHY, 1998).
Evidências recentes afirmam seu papel na patogênese de
inflamações de pele como fator quimiotático para células
hematopoéticas, bem como papel em estágios precoces da
progressão do tumor de mama em associação com o surgimento do
fenótipo invasivo (WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).
Ainda não se encontra na literatura relação das proteínas
S100 com o CECL, em especial o psoriasin 1 (S100 A7) (LIANG et al.,
2007).
Por tudo isso, acredita que o estudo do gene S100 poderá
fornecer informações sobre os CECL indicando aqueles que terão
evolução mais agressiva para que, através de terapêutica apropriada,
possam ser controlados.
2. REVISÃO DE LITERATURA
Revisão de Literatura
31
2.1. Incidência
A incidência do câncer de laringe é muito baixa, com notáveis
exceções (LEVI et al., 1993; MUIR et al., 1998), como em várias
áreas da Europa central (Espanha, França, Itália, Portugal), sul do
Brasil, Uruguai, Índia e partes do sudeste Asiático (PARKIN et al.,
1992; PINHEIRO et al., 2003).
Corresponde à décima primeira neoplasia mais freqüente. É
mais comum nos homens e em negros em áreas urbanas. A relação
mundial homem/mulher, em torno de 7/1, é a maior que em
qualquer outra neoplasia, o que demonstra a sua raridade nas
mulheres (PARKIN; PISANI; FERLAY, 1999). Entretanto, essa relação
tem decrescido com o tempo em muitos países (Bélgica e Estados
Unidos), à custa do aumento de incidência nas mulheres. Uma
relação similar (em torno de 6:1) foi encontrada na região
metropolitana de São Paulo de 1999 a 2001 (SARTOR, 2003). No
Brasil, as taxas de incidência para os homens são em torno de 7 a 15
casos/100.000 habitantes e nas mulheres entre 1,5 a 1,8
casos/100.000 habitantes (WUNSCH, 2004).
Das dez regiões mundiais de maior freqüência do câncer da
laringe nos homens, cinco delas estão localizadas na Espanha (País
Revisão de Literatura
32
Basco, Navarra, Zaragoza, Granada e Murcia). Altas taxas de
incidência também são encontradas na Itália, na Polônia e no Brasil.
Nas mulheres, a incidência é notadamente mais alta na população
negra dos Estados Unidos, sendo a maior taxa de incidência nas
negras de Nova Orleans (3,8 casos/100.000 habitantes)
(RAFFERERTY; FENTON; JONES, 2001).
A incidência do câncer de laringe cresce com a idade, sendo
grande parte deles diagnosticados em indivíduos acima de 65 anos
(45% dos casos), tendo o pico de incidência nas 6ª e 7ª décadas de
vida (FERLAY et al., 2001).
Variações na distribuição dos tumores nos diferentes sítios da
laringe são observadas. Tumores glóticos estão mais presentes nas
populações Anglo-saxônicas; na França, na Índia e, na população
negra dos Estados Unidos, o número de tumores de glote e de
supraglote é aproximadamente igual (RAFFERERTY; FENTON; JONES,
2001), enquanto que no sul da Europa, os tumores de supraglote são
mais freqüentes (EUROPEAN NETWORK OF CÂNCER REGISTRIES,
1997). No Brasil, os tumores de glote são os mais freqüentes (65%
dos casos), seguidos pelos de supraglote (30 a 35% dos casos) e de
subglote (5% dos casos) (NORONHA; DIAS, 1997).
Revisão de Literatura
33
2.2. Fatores de Risco
O câncer de laringe é uma doença multifatorial influenciada pelo
ambiente e pelo estilo de vida. A forte relação do tabaco com o
câncer de laringe já foi demonstrada em uma grande variedade de
estudos epidemiológicos, onde se observa seu efeito, independente
do consumo do álcool (INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON
CANCER, 1986, 1988). O consumo excessivo de bebidas alcoólicas e
a exposição ocupacional a algumas substâncias químicas (asbestos,
gás mostarda e ácido sulfúrico) também são fatores de risco. Além
desses, baixo nível sócio econômico, infecção pelo papiloma vírus
humano (HPV) e refluxo gastroesofágico têm sido sugeridos como co-
fatores do câncer de laringe por alguns estudos epidemiológicos.
2.2.1. Tabaco e Álcool
O câncer de laringe é causado, principalmente, pelo tabagismo
e o consumo de bebidas alcoólicas, independentemente do tipo de
bebida (LICITRA et al., 2003). O consumo crônico de cigarro e de
bebidas alcoólicas, isolados ou não, aumenta o risco de câncer de
laringe em uma relação dose dependente (WUNSCH, 2004).
O risco relativo é maior para o tabagismo que para o alcoolismo
(WUNSCH, 2004). Tuyns et al. (1988) avaliaram o resultado do
tabagismo e do alcoolismo em um estudo multicêntrico de caso
Revisão de Literatura
34
controle, comparando 1.147 casos de homens com diagnóstico de
câncer de laringe e de hipofaringe com 3.957 homens sem neoplasia
(caso controle). O risco associado ao tabagismo foi de 10 para todos
os sítios da laringe e da hipofaringe. Por outro lado, o risco associado
ao consumo de álcool variou de acordo com o sítio da neoplasia,
sendo maior na hipofaringe e na supraglote (OR: 4,3) e, menor na
glote (OR: 2,1) para a mesma dose. Os autores também concluíram
que a associação de tabagismo com etilismo tem um efeito
multiplicativo. Para Wunsch (2004), as diferentes regiões anatômicas
da laringe devem ser consideradas separadamente, com relação aos
fatores de risco. Assim, segundo eles, o tabaco domina o risco nos
tumores da glote, ao passo que o álcool, nos tumores da supraglote.
De acordo com estudo caso-controle no sudeste da Europa,
mais de 90% da presente incidência de CECL poderia ser prevenida
abolindo o tabagismo e o consumo de bebidas alcoólicas. Maior parte
do risco é atribuída ao tabagismo, mas a redução do consumo de
bebidas alcoólicas, isoladamente, poderia, ainda, prevenir 25% dos
casos (TUYNS et al. 1998). O cigarro e o álcool parecem ter ação
sinérgica. (LICITRA et al., 2003).
2.2.2. Outros Fatores
Desde os anos 70, a exposição a asbestos tem sido referida
Revisão de Literatura
35
como fator de risco para o câncer de laringe (STELL; Mc GILL , 1973;
NEWHOUSE; BERRY, 1973). Em um estudo caso controle, Shettigara
e Morgan (1975) descobriram que o asbesto estava fortemente
associado ao câncer de laringe, tanto quanto o cigarro e o álcool.
Desde então, outros estudos têm mostrado a incidência elevada em
trabalhadores expostos a asbestos. (BURCH et al., 1981; BERRINO et
al., 2003).
Em 1992, baseados no resultado de uma variedade de estudos
a IARC (International Association on Research on Cancer) concluiu
que há suficientes evidências para classificar o ácido sulfúrico e
outros ácidos inorgânicos como carcinógenos humanos incluindo o
risco para surgimento de câncer laríngeo, pulmonar e nasosinusal.
(IARC, 1992). Estudos também demonstram risco elevado em
trabalhadores da construção (devido à exposição ao cimento)
(BOFFETA et al., 2003), bem como indivíduos expostos à madeira
(madeireiras e marcenarias) (WYNDER; COVEY; MABUCHI, 1976;
POLLÁN; LÓPEZ-ABENTE, 1995; BERRINO et al., 2003).
Estudos caso controle no Uruguai demonstraram que dieta rica
em carne salgada e gordura de origem animal estão relacionadas com
o câncer de laringe (De STEFANI et al., 1995; OREGGIA et al., 2001).
Entretanto, evidências de vários estudos epidemiológicos sugerem
que uma dieta rica em frutas e vegetais parece ter efeito protetor.
Revisão de Literatura
36
Vitaminas como carotenóides, retinol e vitamina C devem produzir
decréscimo no risco de desenvolver o câncer de laringe. (ESTÈVE et
al., 1966; BOSETTI et al., 2002).
Tem se postulado também a relação entre a infecção pelo
papilomavírus humano (HPV) (Tipos 16, 18 e 33) e o câncer da
laringe (SUGAR; VERECZKEY; TÓTH, 1996). A positividade do HPV é
muito maior no câncer de cavidade oral e de faringe (HERRERO,
2003), enquanto no de laringe é evidente apenas em um grupo
restrito de pacientes (TORRENT; OJEDA, 2007).
O refluxo gastroesofágico tem chamado a atenção como um
possível fator etiológico, devido à sua alta prevalência em pacientes
com CECL. A associação do refluxo gastroesofágico com o câncer da
laringe foi sugerida, primeiramente, por Olson, em 1983, ao
identificá-lo em uma série de pacientes com refluxo gastroesofágico.
Desde então, sua alta prevalência em pacientes com CECL tem sido
amplamente relatada (KOUFMAN, 1991; QADEER; COLABIANCHI;
VAEZI, 2005). Entretanto, são encontrados resultados conflitantes a
respeito da comprovação do refluxo como fator de risco para câncer
de laringe, uma vez que sua prevalência é alta na população.
2.3. Mortalidade, Sobrevida e Prognóstico
Com relação à mortalidade, estima-se que ocorre 90.000
Revisão de Literatura
37
mortes ao ano devido ao câncer de laringe nos homens e cerca de
12.000 nas mulheres (FERLAY et al., 2001). A mortalidade, devido a
esse tipo de câncer, é particularmente alta em homens do leste e
sudeste asiático (taxas de 6,5 a 7,5/100.000), seguidos pela América
do Sul (sul de Brasil, Uruguai e Argentina). Ela é muito rara nas
mulheres (0,4% de todas as mortes por câncer no mundo) (PISANI et
al., 1999). No Brasil, as taxas de mortalidade mais altas para homens
(6,2 casos/100.000) e para mulheres (0,2 casos/100.000) são
encontradas em São Paulo e as mais baixas no estado do Maranhão
para os homens (0,6/100.000) e no Acre e no Amapá para as
mulheres (menor que 0.01/100.000) (INCA - INSTITUTO NACIONAL
DO CÂNCER, 2002).
Variações na incidência e na mortalidade do câncer de laringe
estão associadas à tendência de outros tipos de câncer relacionados
com tabagismo e etilismo. Tendência ascendente é observada na
Europa central, Leste Europeu e na maioria dos países em
desenvolvimento, ao passo que na América do Norte e no oeste da
Europa se observa estabilização nessas taxas ou mesmo tendência
para declínio (COLEMAN et al., 1993). Incidências crescentes nas
mulheres são reportadas no Canadá, na Itália, na Dinamarca, noa
Estados Unidos e na Austrália (LICITRA et al. 2003). Na América
Latina, diferentes tendências são encontradas, a saber: em Cuba (em
Revisão de Literatura
38
crescimento), em Porto Rico (estável) e em Cali, na Colômbia
(declínio). Na cidade de São Paulo ocorre declínio nos homens e
estabilidade nas mulheres (MIRRA; FRANCO, 1985; MIRRA;
LATORRE; VENEZIANO, 2004).
Com relação à mortalidade, encontra-se crescimento na Costa
Rica, no Uruguai e declínio no Chile e na Venezuela (COLEMAN et al.,
1993). No Brasil, as taxas de mortalidade para os homens foram de
2,5/100.000 em 1979 para 3,0/100.000 em 1999 e para as mulheres
se manteve estável (em torno de 0,4/100.000), ao longo desse
período (INCA, 2002). Em São Paulo, as taxas de mortalidade se
mantiveram estáveis de 1969 a 1998 para homens e mulheres, com
taxas menores que 1/100.000 para as mulheres e de 6 a 8/100.000
para os homens (MIRRA; LATORRE; VENEZIANO, 2004).
De acordo com os dados de países em desenvolvimento, o
prognóstico para todos os pacientes com câncer de laringe
permanece inalterado desde os anos 70 (AUSTIN; REYNOLDS, 1997).
Por outro lado, na Europa, houve um aumento significativo no
prognóstico de 1978 a 1989, pois a sobrevida em cinco anos subiu de
58% para 63% (BERRINO et al., 1995; BERRINO; CAPOCACCIA;
ESTEVE, 1999). Idade avançada, doença regional ou metastática e
tumores da supraglote estão associados à pior sobrevida (PICCIRILLO
et al, 1994; AUSTIN; REYNOLDS, 1997; SASAKI; JASSIN, 2001). Os
Revisão de Literatura
39
tumores da glote têm sobrevida mais favorável que os da supraglote
ou da subglote, que têm sobrevida pobre, semelhante aos da faringe
(PERA; MORENO; GALINDO, 1986; STELL, 1990). Dentre as principais
causas, destaca-se a precocidade de sintomas e baixo grau de
metastatização regional e a distância nos tumores glóticos.
2.4. Fatores Prognósticos
2.4.1. Idade
A idade como fator prognóstico é controversa. A opinião de
consenso é que pacientes de idade avançada têm sobrevida menor,
mas é necessária a correlação com outros fatores prognósticos
(JANOT; KLIJANIENKO; RUSSO, 1996; JONES et al., 1998).
2.4.2. Estado Geral do Paciente
Singh et al. (1998) demonstraram que a comorbidade medida
pelo Índice de Comorbidade de Kaplan Feinstein, analisada como
fator independente, tem um efeito negativo na sobrevida específica
do tumor e na taxa loco regional de recorrência. Usando análise
multivariada, Magnanno et al. (1995) demonstraram que pacientes
com doença em vias aéreas baixas ou hepáticas têm maior chance de
recorrência locorregional. Entretanto, Jones et al. (1998), estudando
3442 pacientes, não comprovaram que o estado geral do paciente
Revisão de Literatura
40
possa ser um fator prognóstico independente.
O estado imune do paciente é considerado um fator prognóstico
importante, porém o seu mecanismo ainda é incerto. O número
absoluto de células T (KATZ, 1983), o grau de infiltração linfocitária
(WOLF et al., 1986) e a presença de eosinofilia tecidual
(GOLDSMITH; CRESSON; ASKIN, 1987; THOMPSON; BRADLEY;
GRIFFIN, 1994) estão associados a prognóstico favorável. Em
contraste, outros trabalhos não conseguiram comprovar tal relação
(ESTEBAN et al., 1996). O estado nutricional afeta marcantemente a
função imune do paciente e indivíduos com balanço nitrogenado
negativo apresentam pior resposta ao tratamento (BROOKES;
CLIFFORD, 1981; LOPEZ et al., 1994).
2.4.3. Estadiamento do Tumor
O estadiamento dos tumores de laringe, definido pela
classificação de tumores malignos TNM, UICC (SOLBIN; WITEKIND,
2004), constitui um fator prognóstico independente para recorrência
locorregional e/ou sobrevida específica do tumor (CEREZO et al.,
1992; MAGNANNO et al., 1995).
2.4.3.1 Estadio T
O estadio T dá mais informação de prognóstico no que diz
Revisão de Literatura
41
respeito à recorrência no sítio primário que recorrência em linfonodos
(CEREZO et al., 1992) e tem um peso menor na sobrevida em relação
ao estadio N. A mobilidade de pregas vocais (que influencia o
estadiamento T) é considerada um fator prognóstico independente no
controle regional (PRADIER et al., 1996; SAKATA et al., 1994).
2.4.3.2. Metástase Linfonodal
É consenso que, em termos de sobrevida, os fatores
prognósticos de maior impacto são a presença de metástase
linfonodal e a detecção de extravasamento capsular, sendo mais
importantes que outros, como: número de linfonodos, estadio N,
localização do linfonodo no pescoço ou fixação do linfonodo. (ALVI;
JOHNSON, 1996; BARZAN; TALAMINI, 1996; NICOLAI et al., 1997;
De CARVALHO, 1998; JONES et al., 1998). O status clínico (ao
contrário do patológico) dos nódulos cervicais também é um
marcador independente de prognóstico para sobrevida e recorrência
locorregional (ZATTERSTROM et al., 1991; CEREZO et al., 1992;
KOWALSKI et al., 1996). Entretanto, devem-se ressaltar as
discrepâncias entre a avaliação clínica e a patológica dos linfonodos,
isto é, 40% dos casos de pescoço N0 são falso negativos e 50% dos
casos de pescoço, clinicamente positivos para nódulos cervicais, são
falso positivos (ALI; TIWARI; SNOW 1985; MADSEN et al. 1991).
Revisão de Literatura
42
Melhorias nas tecnologias de imagem, como por exemplo, o PET-CT
(Tomografia por Emissão de Positrons), devem aumentar a
sensibilidade e a especificidade na avaliação de doença linfonodal e
dar mais informações prognósticas antes de iniciar o tratamento
(WONG et al. 1997).
2.4.4. Grau Histológico do Tumor
Os CECL são classificados de acordo com a diferenciação celular
de seus elementos celulares. Essa classificação é expressa com base
na porcentagem de células diferenciadas em relação ao total de
elementos celulares. Com isso, os tumores são classificados em
tumores bem diferenciados (BD), moderadamente diferenciados (MD)
e pouco diferenciados (PD). Os tumores BD consistem naqueles que
possuem de 100 a 75% de células diferenciadas; os MD são aqueles
que possuem de 75 a 50% e os PD possuem menos que 50% de
células diferenciadas em relação à população celular total do tumor
(BACCHI; ALMEIDA; FRANCO, 1999).
O grau de diferenciação histológica do tumor tem demonstrado
conter informação prognóstica independente em termos de sobrevida
(De CARVALHO, 1998; WIERNICK et al. 1991). Alguns autores,
entretanto, defendem a tese de que uma graduação histológica
composta, baseada em vários fatores como polimorfismo nuclear,
Revisão de Literatura
43
taxa de mitose, estrutura histológica, modo de invasão, invasão
vascular e resposta celular do indivíduo poderia oferecer informações
mais úteis da sobrevida (JAKOBSON, 1976; BRYNE; JENSSEN;
BAYSEN. 1995).
2.4.5. Sítio Anatômico do Tumor
É consenso que para um mesmo estadio T, tumores de
orofaringe e hipofaringe têm pior prognóstico que os de laringe e
tumores de supraglote têm pior prognóstico que os da região glótica
(MAGNANO et al., 1997; WEBER; JONHSON; MEYERS, 1993;
BATAINI, 1993). Entretanto, não há nenhuma evidência que confirme
que tumores desses diferentes sítios têm diferenças biológicas,
exceto nos tumores da supraglote, que em comparação com os
tumores da glote, tendem a ser menos diferenciados (STELL, 1990).
Tumores da glote têm melhor prognóstico que tumores da supraglote
ou da subglote devido a uma série de fatores, dentre eles, o seu
menor potencial de metastatização e o melhor grau de diferenciação.
Para os tumores da glote, aqueles que atingem a comissura anterior
carregam pior prognóstico em termo de controle local e sobrevida
(SCHVERO et al. 1994; RUCCI; GAMMAROTA; GALLO, 1996).
Revisão de Literatura
44
2.4.6. Neoangiogênese
A angiogênese ocorre em resposta a um balanço entre fatores
regulatórios positivos e negativos que se interagem de uma forma
complexa e pouco conhecida (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD,
2000). O fator de crescimento vascular endotelial (EGFR) é,
provavelmente, a citocina mais importante na angiogênese devido a
uma série de razões: funções pró-angiogênicas múltiplas, receptores
específicos para célula endotelial e também porque, tanto o
crescimento do tumor quanto a angiogênese são bloqueados quando
a sua ação é inibida (FOLKMAN, 1990). A indução da angiogênese é
um fator crítico no desenvolvimento tumoral, crescimento, invasão e
metástase (FOLKMAN, 1990). Existe correlação bem estabelecida
entre a angiogênese, medida pela densidade dos microvasos e pela
agressividade tumoral em muitos tumores sólidos (POTGENS et al.,
1995), mas a evidência desse fato nos CECCP é controversa, pois
alguns estudos comprovam tal associação (GASPARINI et al., 1993;
KILIJANIENKO et al., 1995; SHPITIZER et al., 1996; MURRAY et al.,
1997; EISMA; SPIRO; KREUTZER, 1999) e outros reportam a
ausência de associação com variáveis clínicas importantes (CARRAU
et al., 1995; DRAY; HARDIN; SOFFERMAN, 1995; MORYAMA et al.,
1997; HEDGE et al., 1998).
Revisão de Literatura
45
2.5. Avanços Genéticos
Atualmente, os únicos fatores prognósticos rotineiramente
considerados no momento da decisão do tratamento são o tamanho
da lesão, a localização do tumor e a presença de metástases
linfonodais e/ou à distância.
Com a rápida expansão de informações a respeito dos avanços
na medicina molecular e imuno-histoquímica, uma quantidade
crescente de fatores está sendo responsabilizada por prover
informações prognósticas para o CECCP. O carcinoma espinocelular
do trato aerodigestivo, no qual os tumores da laringe representam o
seu maior grupo, é caracterizado por uma marcante heterogeneidade
em seu comportamento biológico. Em comparação com tumores
sólidos de comportamento biológico mais simples, como o carcinoma
de cólon, de pulmão e de mama, poucos trabalhos foram feitos para
esclarecer a importância das novas moléculas, no que diz respeito à
significância no prognóstico. Além do que, a maioria desses estudos
foi feita em pequenos grupos de tumores, tornando difícil a avaliação
do seu valor no prognóstico.
2.5.1. Marcadores Pré-neoplásicos
São moléculas expressas antes do surgimento tumoral. Uhlman
et al. (1996) compararam a expressão dos marcadores TP 53, EGFR e
Revisão de Literatura
46
a ciclina D1 em pacientes com displasia em mucosa laríngea, que
subseqüentemente, desenvolveram o carcinoma in situ ou carcinoma
invasivo de laringe, durante, pelo menos, quatro anos. Esse estudo
revelou a expressão do TP 53 em dois terços ou mais do epitélio e
forte expressão da ciclina D1; todas elas fortemente relacionadas
com a progressão da displasia para neoplasia invasiva e demonstrou
que a imuno-histoquímica pode ser útil para identificar indivíduos de
risco para desenvolver tumor invasivo.
2.5.2. TP 53
A p53 é uma proteína supressora tumoral, cuja função é
promover a morte de células anormais, por apoptose. A mutação no
gene TP 53, presente em mais de 50% dos tumores humanos, faz
esse gene atuar na carcinogênese. Imagina-se que a mutação do
gene TP 53 produz uma proteína inativa, porém mais estável
metabolicamente. A expressão oncogênica da proteína supressora
tumoral p53 pode ser detectada por imuno-histoquímica (GREENMAN;
HOMMER; STAFFORD, 2000).
As mutações do gene TP 53 e sua incidência aumentam com a
progressão da doença (BOYLE et al., 1993). Mudanças simples na
base do TP 53 são as mutações mais comuns. Brennan et al. (1995)
demonstraram que a análise das mutações individuais da proteína
Revisão de Literatura
47
pode ser um método de alta sensibilidade para o acompanhamento
do crescimento tumoral em mucosa histologicamente normal. Em seu
estudo, foram analisados 25 pacientes com tumores de cabeça e
pescoço (20 da região da laringe e faringe) e em 13 foi detectada,
pela técnica de RT-PCR, a presença de margens positivas, e desses
observaram-se cinco casos de recorrência local. Dos 12 pacientes
restantes, cujo estudo molecular revelou negatividade das margens,
não houve recidiva. No mesmo estudo, 21% dos linfonodos,
histologicamente negativos, revelaram células anormais além de
expressão anormal do TP 53 e quatro de cada cinco pacientes
deveriam ter seu estadiamento aumentado se fosse levado em conta
os resultados dessa análise molecular.
Estudos posteriores do gene TP 53 indicam que diferentes tipos
de mutação na molécula promovem diferentes efeitos biológicos e
diferente comportamento biológico do tumor (ERBER et al., 1998).
Rowley et al (1998), demonstraram que a expressão anormal do TP
53 pode ser responsável por diferentes taxas de sobrevida para os
tumores de laringe (em torno de 60% em 5 anos) e faringe (menor
que 30% em 5 anos). Para explicar essa diferença, os autores
sugerem que diferentes mutações acontecem nesses dois sítios
distintos e são responsáveis por diferenças no comportamento
biológico e nas taxas de sobrevida. As mutações de regiões de
Revisão de Literatura
48
contato, presentes em 36% dos CECCP estão associadas ao aumento
no estadiamento do tumor e na incidência de metástases em
linfonodos, diminuição da sobrevida livre da doença e piora da
sobrevida. (ERBER et al., 1998).
Shin et al. (1996) demonstraram que pacientes com alta
expressão da p53 tiveram pior sobrevida. Nesse estudo foi usada
uma definição muito rígida da expressão do gene TP 53, sendo
considerada positiva qualquer mínima alteração da proteína
supressora tumoral p53 acima do nível basal. Usando esse critério, foi
comprovado que tumores com alta expressão de p53 estão
associados com significante pior prognóstico. Em estudo de revisão,
Oh e Mao (1997) concluíram que tumores com alta expressão da p53
tendem a ser mais agressivos, mas a maioria dos estudos não
conseguiu comprovar correlação estatisticamente significante com a
progressão da doença.
Um estudo muito importante envolvendo o gene TP 53 está
sendo realizado por Clayman et al. (1998), em que foi usado como
vetor o Adenovírus para introduzir cópias normais e funcionantes em
pacientes com CECCP. A razão para tal experimento é que levando
gene TP 53 não mutante ao tumor haveria regeneração da função da
proteína supressora tumoral p53 o que induziria à apoptose da célula
tumoral. Vetores de Adenovírus são os sistemas de vetores mais
Revisão de Literatura
49
usados por poderem “infectar” um largo espectro de células em
repouso e em fase de divisão celular. A fase I/II do estudo já
demonstrou ausência de toxicidade ou limite da dose.
A medida da expressão anormal da p53, como um marcador
prognóstico, tem sido estudada por muitos grupos, com conclusões
conflitantes, provavelmente devido a avaliações subjetivas dos
protocolos de imuno-histoquímica, no que diz respeito à interpretação
da expressão anormal. Além disso, apesar da análise molecular da
p53 ter se mostrado um método de grande importância, esse estudo
requer profissionais altamente treinados associado a um investimento
significante de tempo e dinheiro. É, pois, necessária uma automação
do processo para que ele possa se tornar um método clínico de
rotina.
2.5.3. CDKN2A
O CDKN2A, também conhecido como p16 consiste em outro
gene de supressão tumoral envolvido no controle do ciclo celular
(GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000). Está localizado na região
cromossômica 9p21, região freqüentemente inativada pela deleção
homozigótica. Estudos realizados por análise imuno-histoquímica
demonstram que a perda do produto do gene CDKN2A pode ser
detectada em aproximadamente 83% dos casos de CECCP (OH; MAO,
Revisão de Literatura
50
1997). Estudo retrospectivo em lesões pré-cancerosas demonstrou
que a expressão acentuada da p53 associada à perda ou redução da
expressão da p16 está correlacionada com a progressão para doença
maligna. (GALLO; SANTUCCI; FRANCHI, 1997). Uma combinação de
mutações no CDKN2A e TP 53 foi descrita por possuir valor
prognóstico em predizer a progressão de lesões pré-cancerosas para
tumor invasivo de laringe (GALLO; SANTUCCI; FRANCHI, 1997).
2.5.4. Ciclina D1
A ciclina D1 é uma das muitas moléculas envolvidas no controle
do ciclo celular, agindo especificamente como reguladora da transição
da fase G1 para a S (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000). A
amplificação da região cromossômica 11q13, onde o gene ciclina D1
(também conhecido por CCND1) está localizado está fortemente
correlacionada com o aumento da expressão de sua proteína em
vários estudos de CECCP (SYDRANSKY, 1995).
Kyomoto et al. (1997) compararam o valor prognóstico da
expressão e da amplificação do gene ciclina D1. A sobrevida em cinco
anos dos pacientes, com a amplificação do gene aumentada (22%)
ou com aumento da expressão da sua proteína (53%) foi
significativamente mais baixa que daqueles que não apresentavam tal
alteração genética. Entretanto, usando análise multivariada, apenas
Revisão de Literatura
51
os casos de amplificação do gene ciclina D1 obtiveram valor
prognóstico independente (p = 0,0018).
A associação da amplificação do gene da ciclina com a infecção
pelo HPV também já foi relatada (CATTANI et al., 1998). O DNA do
HPV foi encontrado em 29% dos tumores e o gene amplificado da
ciclina D1 foi encontrado em 20% dos casos e estava
significativamente associado com a infecção pelo papilomavirus
humano (HPV), sugerindo a hipótese de que a amplificação do gene
ciclina D1 seja provocada, pelo menos em parte, pelas instabilidades
genômicas causadas pelas oncoproteínas virais E6 e E7.
Anormalidades na região 11q13 têm sido observadas nos
CECCP e sua presença é um indicador de baixo prognóstico
(AKERVALL et al., 1995).
2.5.5. Marcadores de Proliferação
A proliferação celular tem se mostrado aumentada em quase
todos os tumores e é usualmente medida pela proteína Ki-67, um
antígeno nuclear presente apenas nas fases G1, S e G2 do ciclo
celular. Esse antígeno é hoje conhecido com MIB I, o mesmo nome
que a maioria dos anticorpos usados contra essa proteína. Grande
parte dos estudos com os CECL afirma que a Ki-67 não tem valor
prognóstico (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000).
Revisão de Literatura
52
Entretanto, Franchi et al. (1996) relataram que o aumento nos
níveis de MIB I estava significativamente associado a metástases
linfonodais ocultas. Esse estudo identificou, ainda, dois outros
fatores: antígeno de proliferação celular nuclear (APCN) e E-caderina
que estavam significativamente associados a esses casos de nódulos
falso negativos. O APCN, detectável apenas na fase S do ciclo celular
estava com sua expressão aumentada nos linfonodos com metástases
ocultas. A perda da E-caderina, molécula de adesão celular, também
foi observada. Esse estudo novamente sugere que uma combinação
de marcadores é capaz de fornecer informações úteis na detecção de
metástases ocultas.
2.5.6. Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico
Um aumento da expressão do receptor do fator de crescimento
epidérmico (EGFR) tem sido relatado em quase todos os casos de
CECCP e as alterações na sua expressão são encontradas nas fases
iniciais da carcinogênese (UHLMAN et al., 1996).
O EGFR é uma glicoproteína de superfície celular que se liga a
uma variedade de moléculas homólogas incluindo o fator de
crescimento epidérmico, transformador de crescimento-α (TGFα) e
fator de crescimento fibroblástico (α-FGF).
Grandis et al, (1998) demonstraram que a expressão do
Revisão de Literatura
53
receptor do fator de crescimento epidérmico e do TGFα em 91
pacientes com CECCP estavam associados com a diminuição da
sobrevida livre da doença.
Outra análise do receptor do fator de crescimento epidérmico
foi realizada por Maurizi et al. (1996) em 140 carcinomas
espinocelulares primários de laringe. A taxa de sobrevida em cinco
anos foi de 81% e 25% para os casos EGFR negativos e positivos,
respectivamente. A acurácia em sua quantificação parece prover
informações prognósticas importantes.
2.5.7. CD 44
A CD44 é uma molécula expressa na superfície celular,
encontrada em muitas células de origem hematopoéticas, endoteliais
e mesoteliais (BARCLAY et al., 1998). Dentre as várias funções do
CD44, molécula encontrada em várias isoformas, uma é fazer
interações célula-célula e célula-substrato. O epitélio laríngeo normal
expressa grandes quantidades de CD44H, uma forma da molécula
que se liga muito bem à matriz glicana extracelular e CD44v6, uma
forma variante com menor capacidade de ligação (SPADDFORD et al.,
1996).
Spafford et al. (1996) demonstraram que para pacientes com
CECL - Estadio IV, a diminuição na expressão de CD44H está
Revisão de Literatura
54
relacionada com a alta taxa de metástase e baixa sobrevida. Baixa
expressão do CD44v6 também se correlaciona com baixa sobrevida.
Acredita-se que uma redução da expressão do CD44 evita a
sinalização intercelular através de seus receptores ou reduz a adesão
à matriz extracelular favorecendo a formação de massas tumorais e
aumentando o potencial de metástases (SPADDFORD et al., 1996).
2.5.8. Bcl-2
A família de genes Bcl-2 é essencial para a sobrevivência das
células por inibir a ação de adaptadores necessários para a ativação
do sistema de Caspase (série de enzimas mediadoras da apoptose)
(ADAMS; CORY, 1998) . São moléculas, portanto, anti-apoptóticas.
Nas células dos mamíferos existem pelo menos 15 membros da
família Bcl-2 interagindo entre si e com outras classes de moléculas
(ADAMS; CORY, 1998). Uma produção aberrante ou uma mutação
pode contribuir para a carcinogênese. O papel da Bcl-2 foi descrito
primeiramente no linfoma folicular (SITE SOURCE).
Com relação aos CECCP, dois estudos foram relatados, porém
com conclusões completamente distintas. Friedman et al. (1997)
analisaram 33 pacientes com diagnóstico de carcinoma espinocelular
de cavidade oral, faringe e laringe, todos T1 – T2 e N0 demonstrando
associação estatisticamente significante entre aumento da expressão
Revisão de Literatura
55
do Bcl-2 e mau prognóstico. Jin et al. (1998) analisaram 83 casos de
CECL e não encontraram relação entre a expressão do Bcl-2 e o
seguimento. As razões prováveis para esse conflito não são muito
claras, mas no primeiro estudo foram analisadas amostras de vários
sítios e o número de amostras foi pequeno.
2.5.9. Ploidia
A ploidia do DNA, material genético contido no núcleo celular, é
o mais estudado de todos os marcadores de câncer em humanos,
visto que células tumorais se apresentam com instabilidades
genômicas resultando em variação do estado normal diplóide. Em
tecidos normais, a maioria das células está na fase de repouso (fase
G0) e na fase diplóide (2N). Após o comprometimento com a divisão
celular e o recrutamento no ciclo celular, as células alcançam as fases
G1, S e G2, se preparando para realizar a mitose. (GREENMAN;
HOMMER; STAFFORD, 2000). Tumores contendo maior pico de
células com menos que o conteúdo diplóide (2N) de DNA são
chamados de hipoplóide ou euplóide; se o conteúdo for 2N são
chamados de diplóide, se 4N tetraplóide e finalmente aneuplóide para
qualquer outro valor.
Uma revisão no valor da medida do DNA dos CECCP concluiu
que existe associação de pior prognóstico e tumores não-diplóides
Revisão de Literatura
56
(MILROY et al., 1997). No entanto, Janot et al. (1996), ao contrário,
em estudo com 108 pacientes (84 casos de câncer de laringe e os
demais de faringe) não encontraram significância estatística
associando a ploidia do DNA com recorrência locorregional ou
sobrevida em dois anos. Ambos os estudos são concordantes na tese
de que a proporção de células na fase S não tem valor prognóstico.
Um dos problemas da avaliação do DNA como indicador de
prognóstico é o alto nível de heterogeneidade intratumoral,
observada em muitos tumores.
2.5.10. Região cromossômica 3p14
O gene supressor do tumor FHIT (gene da tríade frágil da
histidina) tem sido identificado como um gene freqüentemente
perdido nos CECCP. Ele se encontra na região 3p14.2, que demonstra
alta freqüência de heterozigosidade (VIRGILIO et al., 1996).
Aproximadamente 80% dos CECCP possuem anormalidade em, pelo
menos, um alelo do FHIT, e esse é um evento precoce na
carcinogênese (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000).
2.5.11. Cromossomo 8
Conforme já visto, células normais diplóides processam duas
cópias de cada gene. Freqüentemente, em conseqüência das
Revisão de Literatura
57
instabilidades genéticas dos tumores, regiões cromossômicas variam
em tamanho, desde um simples alelo até uma pequena região,
causando uma pequena perda de genes. Isso é chamado de perda da
heterozigosidade.
Scholnick et al. (1996) identificaram três regiões marcadas:
D8S264 (8P23), D8S552 (8p23-22) e D8S133 (8p21) que contêm
genes supressores tumorais dos CECCP. A investigação dessas
regiões como marcadores tumorais demonstrou apenas o D8S264 de
relevância para o seguimento.
O oncogene MYC (também conhecido por c-myc) localizado na
região cromossômica 8q24 tem sua expressão elevada em muitos
tumores, inclusive nos de cabeça e pescoço. Ele codifica um fator de
ativação de grande número de genes promotores do crescimento. O
nível da amplificação do MYC parece não ter relação com o
seguimento em longo prazo, mas está associado à baixa resposta ao
tratamento (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000).
Riva et al. (1995) demonstraram que o MYC estava expresso
em 89% dos tumores e baixos níveis de amplificação desses genes
estavam associados à ausência de resposta ao tratamento neo-
adjuvante com a quimioterapia.
Revisão de Literatura
58
2.6. Proteína ligadora de cálcio S 100A7 (psoriasin 1)
O gene proteína ligadora de cálcio S100 A7 (também conhecido
por psoriasin 1 ou simplesmente S100 A7) é um membro da família
de genes S100, identificado por Madsen et al., em 1991, por codificar
uma proteína de 11,4 KDa, presente em células escamosas epiteliais
da epiderme e isoladas de pele contendo psoríase.
Esse gene é mapeado na região cromossômica 1q21-2q22, que
contem pelo menos 12 genes da família S100 e vários outros genes
da diferenciação epidérmica (SCHAFER et al., 1995; BOGLUM et al.,
1995). Compartilha proximidade cromossômica com outros membros
da família S100, o que justifica sua classificação de S100 A7. Os
genes S100 codificam pequenas proteínas citoplasmáticas com função
de proteínas ligadoras de cálcio (SCHAFER; HEIZMANN, 1996).
Sua expressão é restrita aos queratinócitos e células epiteliais,
diferentemente do padrão dos genes S100 A8, A9 e A12 que são
também expressos em células hematopoéticas da linhagem mielóide
(WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).
Apesar de ainda não ter sido seqüenciado, acredita-se que
possui a mesma organização estrutural dos genes S100 adjacentes
(HITOMI et al, 1996).
Uma variedade de funções tem sido atribuída a esses genes,
no que diz respeito ao crescimento e diferenciação celular e
Revisão de Literatura
59
determinação do formato celular (WATSON; LEYGUE; MURPHY,
1998). É conhecido como uma proteína citoplasmática e secretada
que se encontra aumentada nos queratinócitos em resposta ao cálcio
e ao ácido retinóico e também durante etapas anormais da
diferenciação em culturas (HOFFAMN et al., 1994).
Como a função normal dessa proteína ainda é incerta, usa-se
inferir sua função pela dos genes de sua família. Acredita-se que as
proteínas da família S100 influenciam na transdução do sinal mediado
pelo cálcio e em eventos celulares através de interações diretas com
proteínas alvo. Os alvos relacionados às proteínas S100 incluem
filamentos intermediários (no caso do S100 A8) e anexina (no caso
do S100 A10), responsáveis pela modulação da arquitetura e do
formato (citoesqueleto) celular e pela transdução do sinal
intracelular. As proteínas S100 A8 e A9 também têm funções
intracelulares (reguladora do cálcio e/ou inibidora da atividade da
caseína quinase) e várias funções extracelulares complexas (fator de
inibição de migração e fator quimiotático para monócitos e
granulócitos em diferentes circunstâncias) (HESIAN; EDGEWORTH;
HOGG, 1993).
No caso do S100 A7, a sua associação com a hiperplasia
psoriasiforme da pele sugere um papel na diferenciação dos
queratinócitos, entretanto o psoriasin 1 também tem ação
Revisão de Literatura
60
quimiotática (JINQUAN et al., 1996) estimulando a infiltração de
neutrófilos e linfócitos T CD4+ na pele, o que caracteriza a psoríase.
(WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).
A associação do S100 A7 com a psoríase e seus altos níveis de
expressão na hiperplasia psoriasiforme epidérmica já foram bastante
relatados. Entretanto, esse gene também é expresso sob condições
de diferenciação epitelial anormal e é secretado por queratinócitos no
carcinoma de bexiga (CELIS et al., 1996). Mais recentemente, o
psoriasin 1, bem como as proteínas S100 A8 e S100 A9, foram
encontrados em outros epitélios anormais, incluindo o epitélio
neoplásico ductal de mama e o epitélio brônquico de indivíduos com
fibrose cística (WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).
2.6.1. O S100 A7 e o Câncer de Mama
A ruptura nas etapas sinalizadas pelo cálcio tem sido associada
com o mecanismo central na gênese tumoral e no processo de
invasão e de metástase (KOHN; LIOTTA, 1995). Um componente
importante da sinalização intracelular do cálcio é a família de genes
S100 que são freqüentemente expressos em algumas linhagens de
câncer de mama e em alguns tecidos (SCHAFER; HEIZMANN, 1996),
mas sempre com diferentes padrões de regulação, o que demonstra
que o tipo celular e o estágio específico da regulação da expressão é
Revisão de Literatura
61
característica da família S100.
Moog-Lutz, et al. (1995) demonstraram, pela primeira vez, a
expressão do S100 A7 em metástase de tumor de mama. Estudos
posteriores da expressão do RNAm do psoriasin 1 em diferentes
estágios da tumorigênese demonstraram ser baixa ou indetectável a
sua expressão em tecidos normais ou em lesões ductais hiperplásicas
proliferativas, porém era sempre altamente expressa no carcinoma
ductal in situ e baixa ou indetectável em carcinoma invasivo (LEYGUE
et al., 1996). Esse padrão sugere que a expressão da proteína
ligadora de cálcio S100 A7 está associada com alterações na
diferenciação do epitélio glandular dos carcinomas ductais in situ e
devem ter um papel na progressão tumoral precoce. Outro fator
adicional para o envolvimento na progressão do carcinoma ductal é a
sua localização em uma região do cromossomo 1, que,
freqüentemente (> 50% dos casos) apresenta perda da
heterozigosidade nos tumores invasivos. (MUNN; WALKER; VARLEY,
1995).
O S100 A7 tem efeito importante no desenvolvimento do
fenótipo invasivo, que pode ser tanto um efeito indireto nas células
da resposta imune do hospedeiro ou mesmo uma influência mais
direta na motilidade epitelial. (WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).
Enquanto nenhum efeito quimiotático nas células epteliais tem
Revisão de Literatura
62
sido demonstrado, até agora, fica claro que as proteínas S100 A8 e
A9 e suas formas heterodiméricas podem exercer efeitos
quimiotáticos inibitórios ou estimulatórios em diferentes tipos
celulares sob diferentes condições (HESIAN; EDGEWORTH; HOGG,
1993) É sabido também que outras proteínas derivadas do eptélio
podem ser quimiotáticas para macrófagos e queratinócitos (WANG et
al., 1996).
Portanto, o psoriasin 1 pode exercer função inibitória na
migração epitelial dos tumores ductais in situ, cuja perda poderia
contribuir para a invasão tumoral (WATSON; LEYGUE; MURPHY,
1998).
3. HIPÓTESE
Hipótese
64
Considerando que a proteína ligadora de cálcio S100 A7
(psoriasin 1) é expressa no epitélio estratificado escamoso e possui
alta expressão no carcinoma ductal da mama e no carcinoma
espinocelular de pele, de bexiga e de boca, levanta-se a hipótese de
que tal proteína encontra-se altamente expressa em carcinoma
espinocelular de laringe e a sua expressão se correlaciona com
características histopatológicas e com aspectos clínicos da neoplasia.
4. OBJETIVOS
Objetivos
66
O presente estudo em carcinoma espinocelular de laringe visa:
a. identificar a expressão imuno-histoquímica da proteína
S100 A7 (psoriasin 1);
b. identificar a correlação entre a expressão dessa proteína
com variáveis clínicas e características histopatológicas
do tumor;
c. comparar as curvas de sobrevida global entre pacientes
cujos tumores expressam a proteína psoriasin 1 e
aqueles que não a expressam.
5. CASUÍSTICA E MÉTODOS
Casuística e Métodos
68
5.1. Casuística
Foram avaliados 63 casos de pacientes com diagnóstico
histopatológico de CECL tratados cirurgicamente no serviço de
cirurgia de cabeça e pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-
USP), no período compreendido entre janeiro de 2001 a dezembro de
2005. Foi obtido consentimento prévio dos mesmos mediante
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).
Este estudo obteve aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
HCFMRP-USP (Anexo 3).
Todos os pacientes foram examinados e operados, conforme os
protocolos de tratamento vigentes, sem alterá-los, para a realização
deste estudo. O tratamento para o tumor primário utilizado no
serviço foi laringectomias parciais verticais (fronto-lateral, fronto-
anterior ou hemilaringectomia) para os tumores T1 e T2 glóticos. Os
T3 e T4 foram tratados por laringectomia total. Os pacientes com
tumores T1 e T2 de supraglote foram submetidos a laringectomias
parciais horizontais (supraglóticas). Todos os casos de tumores de
subglote foram tratados por laringectomia total.
Casuística e Métodos
69
O tratamento cervical eletivo, ou seja, com pescoço N0, foi indicado
em tumores de supraglote e subglote e também para os T4 de glote,
tendo sido realizado o esvaziamento cervical lateral bilateral (cadeias
cervicais II, III e IV). O tratamento cervical terapêutico (indicado nos
casos N+) era realizado sempre que necessário, sendo ele o
esvaziamento cervical radical (ou suas variantes).
A radioterapia pós-operatória foi realizada nos casos de
margens cirúrgicas acometidas com neoplasia, nos casos de
confirmação histológica de acometimento linfonodal (pN+) em mais
de um linfonodo ou nos casos T4 para qualquer sítio.
Os espécimes colhidos foram encaminhados em formalina
tamponada para exame anatomopatológico de rotina. Alguns casos
foram submetidos a exames per-operatórios, principalmente para se
detectar a presença de metástases. Os blocos utilizados no exame
per-operatório não foram utilizados para a realização das reações
imuno-histoquímicas.
Os dados clínicos, sócio-demográficos, anatomopatológicos e de
acompanhamento dos pacientes estudados foram armazenados no
banco de dados pertencente ao projeto Genoma Clínico (GENCAPO)
financiado pela FAPESP e Ludwig Institute for Cancer Research (NY) -
http://www.compbio.ludwig.org.br/clinicalgenomics/.
Casuística e Métodos
70
Todos os casos foram revistos em conjunto por dois
patologistas com experiência na área. Os casos foram analisados de
forma sistemática e minuciosa, sendo que alguns casos foram
reclassificados de acordo com as diretrizes do Manual de
Padronização de Laudos Anátomopatológicos (BACCHI; ALMEIDA;
FRANCO, 1999). A seguir, foram escolhidos os blocos
correspondentes às áreas mais representativas da neoplasia para a
realização das reações imuno-histoquímicas. Para cada caso, foi
escolhido pelo menos 1 bloco representativo do fronte de invasão
tumoral. O anticorpo utilizado foi o S100 A7 (Psoriasin) – liquid
mouse monoclonal antibody NCL-L-S100 A7 – Novocastra
Laboratories
®
(Anexo 4).
O Anexo 5 relaciona todos os pacientes estudados com suas
respectivas características hitológicas e clínicas, bem como o
seguimento clínico.
5.1.1. Critérios de Inclusão
Os critérios de inclusão foram:
o Diagnóstico histopatológico de CECL obtido por biópsia
incisional (saca-bocado) e confirmado por exame
anatomopatológico;
o Ausência de tratamento prévio para a neoplasia;
Casuística e Métodos
71
o Indicação da cirurgia como tratamento;
o Aceite do paciente para participar do estudo (através de
assinatura do Termo de Consentimento – Anexo 2);
o Amostra tecidual representativa para a realização do estudo
imuno-histoquímico.
5.1.2. Critérios de Exclusão
Foram excluídos deste estudo cinco pacientes decorrentes de:
o Ausência de precisão quanto ao local do tumor;
o Perda do seguimento clínico;
o Dados clínicos indisponíveis ou incompletos (data da
cirurgia, estadiamento clínico e patológico dos tumores,
radioterapia pós-operatória, recidiva local, recidiva regional,
metástase à distância, segundo tumor primário e óbito).
o Amostra tecidual não representativa e/ou insuficiente para a
realização das reações de imuno-histoquímicas.
5.2. Método
5.2.1. Estudo Histopatológico
As peças cirúrgicas foram fixadas em formalina tamponada a
10% por um período não superior a 48 horas, clivadas e obtidas
áreas representativas da neoplasia. Os fragmentos escolhidos foram
Casuística e Métodos
72
processados a fim de serem emblocados em parafina para obtenção
dos cortes histológicos de 4µm de espessura, que foram corados com
hematoxilina e eosina (H&E).
Para cada caso foi selecionado um bloco representativo para a
realização das reações imuno-histoquímicas, sendo obtidos cortes
seriados de 4µm em lâminas com solução adesiva de 3-amino-
propyltriethoxy-silano (Sigma Chemical Co.
®
, St. Louis, MO/USA).
O anticorpo utilizado para a reação imuno-histoquímica foi o
S100 A7 (Psoriasin) – liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100
A7 – Novocastra Laboratories
®
, UK (Anexo 4).
Para evitar reação endógena, devido à presença de biotina e
avidina, foram utilizados polímero dextran e sistema de amplificação
enzimática NovoLink (Novocastra Laboratories
®
, UK).
Os cortes teciduais de 4µm foram submetidos à recuperação
antigênica pelo calor por 3 minutos em steammer, com solução de
ácido cítrico 10 mM/pH 6.0. O bloqueio da peroxidase endógena foi
realizado com solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 6%. A
incubação com o anticorpo primário foi feita a 37ºC em câmara
úmida a 4ºC por 12 horas (overnight). A incubação com anticorpo
secundário, diluído em PBS, foi realizada por 30 minutos a 37°C.
Após lavagens em PBS, os cortes foram incubados por 30 minutos a
37
o
C com o sistema amplificador Novolink. Por fim, os cortes
Casuística e Métodos
73
histológicos foram lavados em água corrente por 10 minutos,
contracorados com hematoxilina de Harris por 10 segundos,
novamente lavados em água corrente, desidratados em etanol e
diafanizados em xilol. A montagem das lâminas foi realizada em
resina Permount (Fisher Scientific
®
, Fair Lawn, NJ/USA, cód. S15-
100).
Para cada bateria de reação foram utilizados controles positivos
(pele normal) e negativos. Os controles negativos foram
estabelecidos através da omissão do anticorpo primário, que foi
substituído por tampão PBS (“blank”).
O estudo das reações foi feito em microscópio de múltipla
observação por dois patologistas, simultaneamente, com
desconhecimento da identidade dos casos e a classificação foi
definida mediante consenso. Das amostras escolhidas, inicialmente
fez-se avaliação da extensão da imunomarcação usando objetiva
panorâmica (aumento final de 40x). Para se confirmar o padrão da
expressão, aumentos maiores foram utilizados (100x, 200x e 400x).
As reações foram, então, classificadas subjetivamente quanto à
extensão da imunomarcação em:
• Zero: até 5% das células neoplásicas marcadas;
• 1+: 5 – 25% das células neoplásicas marcadas;
• 2+: 25 – 50% das células neoplásicas marcadas;
Casuística e Métodos
74
• 3+: 50 – 75% das células neoplásicas marcadas;
• 4+: > 75% das células neoplásicas marcadas.
Para fins de análise estatística, não foram consideradas as
intensidades das reações, e sim, apenas a sua positividade.
5.2.2. Análise Estatística
Após Classificação das Reações, os diferentes escores obtidos
foram comparados com os dados clínicos, histopatológicos e de
acompanhamento dos pacientes.
Para análise estatística utilizamos a metodologia não-
paramétrica, pois a variável escore não apresentou distribuição
normal. Adotamos como nível de significância p ≤ 0,05.
A variável escore foi trabalhada como uma variável numérica, ou
seja, 0+ = 0; 1+ = 1; 2+ = 2; 3+ = 3 e 4+ = 4.
6. RESULTADOS
Resultados
76
6.1. Características da amostra
Foram incluídos neste estudo 63 casos de pacientes com
diagnóstico de CECL tratados cirurgicamente pelo serviço de cirurgia
de cabeça e pescoço do HCFMRP-USP, no período de fevereiro de
2001 a dezembro de 2005.
Desse total, 58 eram homens e cinco mulheres, com idade
variando, nos homens, de 27 a 78 anos (média de 57,46 anos) e 47 a
59 anos nas mulheres.
O tumor primário, na grande maioria, se localizava na
supraglote (36 casos) e na glote (24 casos) com incidência de 57% e
38%, respectivamente. Somente três casos (4,7%) se originavam da
subglote. Com relação ao estadiamento clínico, obtiveram-se oito
casos no estadio I, oito no estadio II, 22 no estadio III e 25 casos no
estadio IV, sendo que três eram IVb. A Figura 1, na seqüência,
demonstra o estadiamento dos tumores de acordo com o sítio
acometido. Entre os tumores glóticos, houve distribuição por todos os
grupos, sendo que oito foram classificados como estadio I; entre os
de supraglote, 15 eram estadio III e 14 eram estadio IV.
Resultados
77
0
8
0
6
2
0
15
6
1
14
7
1
1 1 1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
I II III Iva Ivb
supraglote
glote
subglote
Figura 1. Distribuição dos tumores de laringe por sítios segundo o
estadiamento clínico (valores expressos em número de pacientes).
Em relação ao tabagismo, apenas dois dos 63 casos não eram
fumantes; 52 eram etilistas e apenas 11 não consumiam bebidas
alcoólicas.
6.2. Evolução
Os pacientes foram acompanhados desde o dia da cirurgia
(estipulado como início do seguimento) até dezembro de 2007, sendo
que o tempo de seguimento variou de 1 mês a 82 meses (média de
45,4 meses. Durante esse período, constatou-se que ocorreram dez
casos de recidiva local, sete de recidiva regional, um de metástase à
Resultados
78
distância e em cinco casos houve o aparecimento de segundo tumor
primário (Tabela 1).
Tabela 1- Seguimento clínico dos pacientes segundo o sítio do tumor (valor
expresso em número de pacientes).
Recidiva
local
Recidiva
regional
Metástase
à distância
Segundo
tumor
primário
Supraglote
5
3
1
3
Glote
5
4
0
2
Subglote
0
0
0
0
Total
1
0
7
1
5
Dos 63 pacientes estudados, 17 (27%) foram a óbito, sendo
que 12 (19%) pela neoplasia e cinco (8%) faleceram por outras
causas não relacionadas à neoplasia. A Tabela 2 relaciona óbitos e
suas causas ao sítio do tumor.
Resultados
79
Tabela 2- Relação de óbitos e seus motivos de acordo com o sítio do
tumor. (valores expressos em número de pacientes).
Sito da lesão Óbitos
decorrentes
do tratamento
Óbitos por
recidiva local/
regional
Óbitos por metástase
à distância
Total de
Óbitos
Supraglote
3
4
1
8
Glote
1
2
0
3
Subglote
1
0
0
1
Total
5
6
1
12
Todos os tumores foram classificados histologicamente por grau
de diferenciação, obtendo-se 13 (20,6%) BD, 37 (58,7%) MD e 13
(20,6%) PD. Na Figura 2 encontra-se a classificação histológica pelos
diferentes sítios. A maioria dos tumores glóticos (91,7%) era MD
(16/24=66,7%) e BD (6/24=25%) e somente dois eram PD. Os
tumores supraglóticos apresentavam distribuição mais uniforme
quanto à diferenciação, pois sete (19,4%) eram BD, 19 (52,7%) MD
e 10 (27,8%) PD. Entre os da subglote, dois eram MD e um PD.
Resultados
80
7
6
0
19
16
2
10
2
1
0
5
10
15
20
BD MD PD
Supraglote
Glote
Subglote
Figura 2- Classificação histológica em diferentes sítios do tumor, expressa
em número de pacientes. BD: bem diferenciados, MD: moderadamente
diferenciados, PD: pouco diferenciados.
Analisando separadamente as populações de etilistas e não
etilistas (Tabela 3), observa-se uma distribuição muito semelhante
dos tumores quanto ao grau de diferenciação nos etilistas e nos não
etilistas.
Tabela 3- Distribuição dos tumores em etilistas e não etilistas quanto ao
grau de diferenciação (valores expressos em número de pacientes).
Grau de Diferenciação Não Etilistas (total: 11)
Etilistas (total 52)
PD 3 10
MD 7 30
BD 1 12
Resultados
81
Os 63 espécimes tumorais foram submetidos à imuno-
histoquímica para detecção da expressão da proteína ligadora de
cálcio (psoriasin 1). As reações foram classificadas de acordo com a
extensão da imunomarcação em escores, segundo a classificação
estabelecida na metodologia. Obtiveram-se quatro casos com escore
0 (6,3%), 10 casos com escore 1+(15,9%), 15 casos 2+ (23,8%), 10
casos 3+ (15,9%) e 24 casos 4+ (38,1%). As Figuras 3, 4, 5, 6 e 7
demonstram os diferentes resultados de Imunomarcação de 1+ a 4+.
Figura 3- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de
imuno-histoquímica com expressão negativa da S100 A7 (psoriasin 1).
Escore 0+ no Carcinoma e positiva 4+ em área de Carcinoma in situ (setas)
(Aumento de 100x).
Resultados
82
Figura 4- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de
imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100 A7). Escore 1+
(Aumento de 100x).
Figura 5- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de
imuno-histoquímica com expressão da proteína S100 A7. Escore 2+
(Aumento de 100x).
Resultados
83
Figura 6- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de
imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100 A7). Escore 3+
(Aumento de 100x).
Figura 7- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de
imuno-histoquímica com expressão do S100 A7. Escore 4+ (Aumento de
100x).
Resultados
84
2
2
0
8
2
0
10
5
0
4 4
2
12 11
1
0
2
4
6
8
10
12
Zero 1+ 2+ 3+ 4+
Supraglote
Glote
Subglote
6.3. Avaliação do Escore
Os escores obtidos foram correlacionados com as variáveis
clínicas, sócio-demográficas e histopatológicas dos tumores.
A Figura 8 ilustra a distribuição dos escores de acordo com os
diferentes sítios primários.
Figura 8- Distribuição dos diferentes escores das reações de imuno-
histoquímica em relação aos diferentes sítios tumorais na laringe (valores
expressos em número de pacientes).
Houve distribuição muito semelhante dos escores pelos vários
sítios anatômicos, com exceção da subglote, devido ao número
escasso de casos. Há tendência maior dos glóticos serem classificados
com 3 e 4 + (15 de 24), enquanto os supraglóticos em se manter
com baixo escore (20 em 36).
Resultados
85
Segue abaixo a relação de todos os pacientes analisados e os
dados correspondentes ao grau de diferenciação tumoral, sítio do
tumor e estadiamento clínico (Tabela 4).
Tabela 4- Relação dos pacientes estudados com seus respectivos escores,
grau de diferenciação, sítio primário e estadiamento clínico. B.D. (bem
diferenciado), M.D. (moderadamente diferenciado), P.D. (pouco
diferenciado).
Paciente: Escore
Grau de
diferenciação
Sítio do
Tumor
Estadiamento
Clínico
1 4+ B.D. Supraglote III
2 2+ M.D. Supraglote IVa
3 4+ M.D. Subglote IVa
4 4+ M.D. Supraglote III
5 4+ M.D. Glote IVa
6 4+ M.D. Glote IVa
7 1+ P.D Supraglote III
8 4+ M.D. Glote I
9 2+ M.D. Supraglote III
10 4+ M.D. Supraglote II
11 1+ P.D Supraglote II
12 2+ M.D. Supraglote IVa
13 3+ M.D. Glote IVa
14 3+ M.D. Supraglote II
15 Zero P.D Supraglote III
16 1+ P.D Supraglote II
17 Zero P.D Glote III
18 4+ M.D. Supraglote IVa
19 4+ M.D. Supraglote IVb
20 3+ M.D. Glote II
21 2+ M.D. Glote I
22 1+ M.D. Supraglote III
23 1+ P.D Supraglote II
24 4+ B.D. Supraglote III
25 2+ P.D Supraglote IVa
26 1+ P.D Supraglote IVa
27 3+ M.D. Glote I
28 4+ B.D. Glote I
29 3+ M.D. Subglote IVa
30 Zero P.D Supraglote III
31 2+ M.D. Supraglote III
32 1+ M.D. Supraglote IVa
33 4+ B.D. Glote I
34 1+ B.D. Supraglote IVa
35 2+ B.D. Supraglote IVa
36 2+ M.D. Supraglote III
continua
Resultados
86
Paciente:
Escore
Grau de
diferenciação
Sítio do
Tumor
Estadiamento
Clínico
37 2+ M.D. Glote I
38 2+ M.D. Glote III
39 3+ B.D. Subglote III
40 4+ B.D. Supraglote II
41 4+ B.D. Glote III
42 4+ M.D. Glote I
43 4+ B.D. Glote IVa
44 4+ B.D. Supraglote IVa
45 4+ B.D. Supraglote IVa
46 4+ B.D. Supraglote III
47 4+ M.D. Supraglote IVa
48 1+ P.D Glote IVa
49 2+ M.D. Glote III
50 2+ M.D. Glote IVa
51 4+ B.D. Glote I
52 3+ M.D. Glote III
53 3+ M.D. Supraglote III
54 Zero M.D. Glote IVb
55 4+ M.D. Supraglote IVa
56 3+ M.D. Supraglote III
57 4+ B.D. Glote II
58 2+ P.D Supraglote III
59 4+ M.D. Glote IVa
60 2+ M.D. Supraglote IVa
61 3+ M.D. Supraglote III
62 1+ M.D. Glote III
63 2+ M.D. Supraglote IVa
Na relação com o grau de diferenciação celular utilizou-se o
Teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados estão
representados na Tabela 5.
continua
ção
Resultados
87
3
1
1
7
3
0
3
12
1
0
9
0
0
12
11
0
2
4
6
8
10
12
0 1+ 2+ 3+ 4+
PD
MD
BD
Tabela 5- Análise do escore de acordo com os diferentes graus de
diferenciação (PD, MD, BD) através do método não paramétrico de Kruskal-
Wallis.
Grau de
Diferenciação
Número
de
pacientes
Mediana
Máximo
Mínimo
Média
Desvio
Padrão
PD
13
1,00
2,00
0,00
1,00
0,71
MD
37
3,00
4,00
0,00
2,76
1,09
BD
13
4,00
4,00
3,00
3,92
0,28
X² = 32,90, p < 0,001*
Houve diferença estatisticamente significativa para o escore
obtido nos diversos grupos. O grupo BD apresentou escores
significativamente superiores aos dos grupos MD e PD e o grupo MD
apresentou escores significativamente superiores aos dos grupos PD
(BD > MD > PD) (Figura 9).
Figura 9- Distribuição do escore nos diferentes graus de diferenciação.
(valores expressos em número de pacientes).
Resultados
88
Pela figura 9 observa-se que os tumores PD se postaram nas
faixas de escores inferiores, ou seja, nenhum apresentou-se com
escore 3 ou 4+.
Considerando somente os tumores MD, a análise do escore em
relação ao estadiamento está representada na Tabela 6, onde estão
agrupados os estadios I e II, os estadios III e IV e os escores 0, 1+ e
2+ e 3+ e 4+
Tabela 6: Distribuição dos escores de acordo com os diferentes
estadiamentos para os tumores MD. Teste utilizado: Teste exato de Fisher.
(Valores expressos em número de pacientes).
Estadiamento
Escore 0 / 1+ / 2+
Escore 3+ / 4+
I e II
3
7
III e IV (IVa e IVb)
13
14
P= 0,46
Foi realizado o Teste Exato de Fisher onde não se obteve
diferença estatisticamente significante, porém demonstra uma
tendência de distribuição mais homogênea do escore para estadios
mais avançados.
Usando o Teste não-paramétrico de Mann-Whitney e excluindo-
se o grupo com tumor localizado na subglote que tem n=3, construiu-
se a Tabela 7.
Resultados
89
Tabela 7- Análise do escore em relação ao sitio do tumor
excluindo-se o
grupo de tumor da subglote, utilizando o Teste não-paramétrico de Mann-
Whitney. N- número de pacientes.
Sítio N Mediana
Máximo Mínimo Média
D
esvio
padrão
Glote
24
3,00
4,00
0,00
2,83
1,34
Supra
36
2,00
4,00
0,00
2,44
1,32
Z = 1,18 / p = 0,24
Nessa comparação não foi encontrada diferença
estatisticamente significativa dos escores em relação ao sítio do
tumor. A análise do escore em relação ao estadiamento clínico está
representada na Tabela 8. Agruparam-se os tumores classificados
como IVb (n = 2) com os IVa e os denominou de IV. Foi utilizado
teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (ANOVA não-paramétrica).
Tabela 8- Análise do escore em relação ao estadiamento clínico utilizando
teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (ANOVA não-paramétrica). N-
número de pacientes.
Es
tadiamento
Clínico
N
Mediana
Máximo
Mínimo
Média
D.padrão
I
8
4,00
4,00
2,00
3,38
0,92
II
8
3,00
4,00
1,00
0,92
1,41
III
22
2,00
4,00
0,00
2,63
1,35
IV
25
3,00
4,00
0,00
1,41
1,31
X² = 4,35 p = 0,23
Resultados
90
Não houve diferença estatisticamente significante na presença
dos escores quanto ao estadiamento clínico.
Para a análise do escore por idade dos pacientes do grupo foi
utilizado o coeficiente de correlação não-paramétrico de Spearman:
r=0,13 p=0,30. O resultado encontrado foi uma correlação baixíssima
e não significativa.
Ao se analisar a distribuição dos diferentes escores nos etilistas
e não etilistas construiu-se a Tabela 9.
Tabela 9- Distribuição do escore em pacientes etilistas e não etilistas
(valores expressos em número de pacientes) utilizando o Teste não-
paramétrico de Mann-Whitney.
Mediana
Média
Desvio Padrão
Não Etilistas
3,00
2,
55
1,51
Etilistas
3,00
2,65
1,28
Z= 0,22 p= 0,83
Realizado o Teste não-paramétrico de Mann-Whitney, onde não
se obteve diferença estatisticamente significante dos escores nas
diferentes populações de etilistas e não etilistas.
A presença de recidiva local foi analisada pelo Teste não-
paramétrico de Mann-Whitney e está representado na Tabela 10.
Resultados
91
Tabela 10- Análise do escore em relação à presença de recidiva local.
Utilizado teste não-paramétrico de Mann-Whitney. N- número de pacientes.
Recidiva
Local
N
Mediana
Máximo
Mínimo
Média
D. padrão
Não
53
3,00
4,00
0,00
2,75
1,21
Sim
10
2,00
4,00
0,00
2,00
1,70
Z = 1,37 / p = 0,17
Não houve diferença significativa na análise acima entre os
grupos.
A relação da recidiva regional com os escores foi analisada pelo
Teste não-paramétrico de Mann-Whitney e está representado na
Tabela 11.
Tabela 11- Análise do escore em relação à recidiva regional. Utilizado teste
não-paramétrico de Mann-Whitney. N- número de pacientes.
Recidiva
Regional
N
Mediana
Máximo
Mínim
o
Média
D.Padrão
Não
56
3,00
4,00
0,00
2,73
1,21
Sim
7
2,00
4,00
0,00
1,86
1,86
Z = 1,30 / p = 0,22
Nessa relação não houve diferença significativa.
A relação de segundo tumor primário e óbitos com escore não
foram significantes.
Resultados
92
Considerando como falhas do tratamento a presença de
recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário, a
Tabela 12 correlaciona tais eventos com os diferentes escores.
Tabela 12- Relação do escore com a presença de falhas do tratamento
(recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário). Valores
expressos em número de pacientes.
Escore
Total de pacientes
Complicações Oncológicas
Zero
4
3
1+
10
2
2+
15
4
3+
10
2
4+
24
5
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os
escores e a presença de falhas do tratamento na comparação entre
escore 0 e 1+ (5/14 = 35,7%) X escores 2+ a 4+ (11/49 = 22,4%)
(Z= 0,94 / p+ 0,35). Porém, na comparação entre o escore zero
(3/4=75%) com os demais (13/59=22%) houve diferença
estatisticamente significativa (Z=2,37, p=0,02)
6.4. Comparação das curvas de sobrevida entre os diferentes
escores (considerando os escores 0, 1+, 2+, 3+, e 4+)
Foi aplicado o método de construção das curvas de Kaplan-
Meier e o teste do Log rank para a comparação das diferentes curvas.
Resultados
93
Não foi observada diferença estatisticamente significante entre as
sobrevidas e os escores obtidos (Figura 10 e Tabela 13).
Figura 10- Curva de sobrevida para os diferentes escores (zero, 1+, 2+,
3+, 4+).
A Tabela 13 abaixo relaciona a sobrevida média obtida para os
diferentes escores.
Função de Sobrevida
TEMPO (meses)
100
8060
40
20
0
Sobrevida acumulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
ESCORE
4
4-censurado
3
3-censurado
2
2-censurado
1
1-censurado
0
0-censurado
Resultados
94
Tabela 13- Relação da sobrevida média (em meses) e os diferentes
escores. N- número de pacientes. Teste utilizado: Log-Rank.
Es
core
N
Sobrevida média
Intervalo de confiança d
e 95%
0
4
57,75
(33,56
–
81,94)
1
+
10
65,62
(56,71
–
74,53)
2
+
15
57,65
(48,95
–
66,36)
3
+
10
58,26
(4367
–
72,84)
4
+
24
62,78
(49,42
–
76,15)
Teste Log Rank = 0,90 / p = 0,92
Não houve diferença significativa entre as sobrevidas nos diversos
escores obtidos.
6.5. Comparação das curvas de sobrevida entre grupos de
escores
Para a comparação das curvas de sobrevida entre os grupos de
escore consideraram-se dois grupos: um de ausência ou baixa
positividade – Grupo 1 (considerando os escores Zero, 1+,2+) e
outro de forte positividade – Grupo 2 (considerando os escores 3+ e
4+)
O método de construção das curvas foi de Kaplan-Meier com
teste do Log rank para a comparação das diferentes curvas e não se
observou diferença significante, conforme se verifica na Figura 11 e
na Tabela 14 abaixo.
Resultados
95
Figura 11- Curva de sobrevida para escores agrupados (grupo de ausência
ou de baixa positividade – escores zero, 1+ e 2+; grupo de alta positividade
– escores 3+ e 4+).
Tabela 14- Relação da sobrevida média (em meses) em relação aos dois
grupos de escore (grupo 1 – escores 0,1+,2+ e grupo 2 – escores 3+ e
4+). Teste utilizado: Log-Rank. N- número de pacientes.
Grupos de
escore
N
Sobrevida
m
édia
Intervalo de confiança de
95%
0+1+2
29
61,01
(54,3
6
–
67,66)
3+4
34
64,84
(54,01
–
75,68)
Teste Log Rank = 0,05 p = 0,83
Nessa comparação de sobrevida também não foi encontrada
diferença estatisticamente significante entre os grupos.
Função de Sobrevida
Tempo
(meses)
100806040200
Sobrevida acumulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
ESCORE
3+4
3+4 censurado
0, 1+, 2+
0, 1+, 2+ censurado
7. DISCUSSÃO
Discussão
97
7.1. O Gene S100 A7
Esforços têm sido aplicados no sentido de identificar a
expressão de novos marcadores tumorais relacionados com os
CECCP. Figueiredo et al. (2006) descreveram que genes de antígenos
tumorais específicos (CTAs) (MAGE-1, -4, -10, -12, BAGE, GAGE,
LAGE, NYESO-1 e PRAME) são expressos em proporções variáveis
(6,1 a 48,5%) em CECCP e essa expressão correlaciona-se com
tumores avançados. Além disso, concluíram que em 63,6% dos casos
ocorre expressão concomitante de dois ou mais genes,
principalmente nos tumores avançados e que há relação da expressão
de MAGE-4 no tumor primário com menor incidência de metástases
linfonodais. Esses autores não observaram associação da expressão
dos CTAs com grau de diferenciação, contradizendo Sarcevic et al.
(2003), que encontraram MAGE-4 em tumores de menor grau de
diferenciação. O padrão de co-expressão observado sugeriu a
Figueiredo et al. (2006) que o desenvolvimento de vacinas
polivalentes, contendo epitopos de vários antígenos codificados por
esses genes, deva ser o caminho para o desenvolvimento de vacinas
clinicamente úteis. O estudo do gene S100 A7 encontra-se em fase
bem precoce, porém sua expressão maior na urina do paciente
Discussão
98
portador de carcinoma espinocelular de bexiga sugere ser um
potencial marcador não invasivo para o seguimento de pacientes com
câncer (CELIS et al., 1996) e, segundo Skliris et al. (2007), esse gene,
por ser regulado pela atividade do receptor de estrógeno, poderia ser
um guia para terapia alvo.
O psoriasin 1 é uma pequena proteína fixadora do cálcio de
11,4 Kda pertencente à família de genes S100 amplamente expressa
em epitélio escamoso cuja exata função é incerta (MADSEN et al.,
1991; HOFMAN et al., 1994). A expressão do gene psoriasin 1 foi
descrita, previamente, em pele psoriática e em outras doenças que
cursam com hiperplasia de epiderme (CELIS et al., 1990; KROP et al.,
2005; ECKERT; LEE, 2006). Estudos por imuno-histoquímica
detectaram que o psoriasin 1 é produzido pelo queratinócito
circundante de ferida e está presente no seu exsudato (LEE; ECKERT,
2007). Segundo Eckert e Lee (2006), o psoriasin 1 (S100 A7) age
como substrato da transglutaminase no sinal da transdução e tem
também função antibacteriana na epiderme. Para Wolk et al. (2006),
além da ação antimicrobiana, o psoriasin 1 inibe a diferenciação
celular e aumenta a sua motilidade, favorecendo a invasão e a
metastatização.
Relatos de sua expressão aumentada em lesões neoplásicas
têm sido freqüentes. Dentre elas ressalta-se o carcinoma ductal de
Discussão
99
mama (LEYGUE et al., 1996; SKLIRIS et al, 2007; MANDAL et al,
2007; PETERSSON et al., 2007), carcinoma espinocelular de bexiga
(CELIS et al., 1996), em tumores de pele (MOUBAYET, et al. 2007) e
carcinoma espinocelular de cavidade oral (ZHOU et al, 2008;
FUKUZAWA et al, 2006).
Neste estudo detectou-se a expressão do marcador S100 A7
(psoriasin 1) em 93,7% dos casos de CECL, com expressão forte nos
tumores diferenciados e fraca nos PD. Isso é também concordante
com trabalho de Leygue et al. (1996), realizado com carcinoma
ductal de mama, onde a expressão do psoriasin 1 é fortemente
positiva no carcinoma in situ, enquanto no carcinoma invasivo essa
expressão é menor. Esses autores avaliaram a expressão do RNAm
do psoriasin 1 em biópsias de congelação de tecidos de mama
representadas por carcinoma in situ, carcinoma ductal invasivo e
tecidos normais e confirmaram altas expressões do psoriasin 1 no
carcinoma ductal in situ.
É sabido que tumores mais diferenciados tendem a ser menos
agressivos com melhor evolução e maior sobrevida, porém esse fato
não se confirmou em nosso estudo, pois não se detectou diferenças
na sobrevida dos diferentes grupos de pacientes estudados.
Watson; Leygue e Murphy (1998) relataram que a expressão do
S100 A7 foi amplamente detectada em tumores in situ, ao passo que
Discussão
100
nos tumores invasivos tal proteína foi expressa em apenas 18% dos
casos. Esse padrão sugere que a expressão do psoriasin 1 está
associada com alterações na diferenciação do epitélio e deve ter
papel na progressão tumoral precoce. Outro fator adicional para o
envolvimento na progressão do carcinoma ductal é a sua localização
em uma região do cromossomo 1 que freqüentemente (> 50% dos
casos) apresenta perda da heterozigosidade nos tumores invasivos.
(MUNN; WALKER; VARLEY, 1995).
Em estudo recente, Moubayet, et al. (2007) avaliaram a
expressão de RNAm do psoriasin 1 através da técnica de RT-PCR, em
biópsias de pele de pacientes com lesões pré-neoplásicas, carcinoma
espinocelular, carcinoma basocelular e controles normais.
Encontraram expressão aumentada em pacientes com lesões pré-
neoplásicas, no carcinoma basocelular e significantemente
aumentada no carcinoma espinocelular. Os autores concluíram que, à
semelhança do carcinoma ductal da mama e do carcinoma
espinocelular de bexiga, o aumento na expressão do psoriasin 1 deve
desempenhar um papel importante na progressão do câncer de pele.
Para Watson; Leygue e Murphy (1998), o S100 A7 tem efeito
importante no desenvolvimento do fenótipo invasivo, que pode ser
tanto um efeito indireto nas células da resposta imune do hospedeiro
ou mesmo uma influência direta que contribui para a invasão
Discussão
101
tumoral. Nessa amostra, pôde-se constatar que entre os tumores MD
a expressão tem tendência a diminuir na medida em que o
estadiamento do tumor aumenta (embora sem diferença
estatisticamente significante). A observação de que 75% dos tumores
com escore zero tiveram complicação oncológica mostra que na falta
do S100 A7 há favorecimento da invasão tumoral.
7.2. Expressão da proteína S100 A7
Houve distribuição dos escores pelos vários sítios anatômicos,
com exceção da subglote devido ao número escasso de casos. Há
tendência maior dos glóticos serem classificados com 3 e 4+
(15/24=62,5%), enquanto os supraglóticos em se manter com
escores menores na imunomarcação (20/36=55,5%) (embora sem
relevância estatística).
Pela figura 9 observou-se que os tumores PD se postaram nas
faixas de escores inferiores, ou seja, nenhum se apresentou com 3 ou
4+. Isso explica a maior tendência dos tumores glóticos terem escore
maior, pois seus tumores são em maior número de bem diferenciados
do que os da supraglote. Entretanto, não houve diferença
estatisticamente significante dos escores em relação ao sítio do
tumor. Outro aspecto que deve ser destacado é que todos os tumores
PD tiveram tendência a terem escores <3+, daí os da supraglote
Discussão
102
terem escores menores, pois lá residem mais tumores PD. Esse fato é
explicado pela provável função desse gene, ou seja, atua enquanto as
células são BD. Como citam também Moubayet et al. (2007) e Leygue
et al. (1996), nos tumores indiferenciados, esse gene parece não
atuar.
Analisando a distribuição dos 37 tumores MD, verifica-se que 19
(19/36=53,7%) estão localizados na supraglote, 16 (16/24=66,6%)
na glote e dois na subglote. A maioria desses tumores, ou seja,
56,7% (21/37) foi classificada com mais de 2+, porém ao analisar a
sua distribuição segundo o estadiamento clínico, verifica-se que
existe uma tendência dos classificados com estadios I ou II de obter
escore > que 3+ (7/10), enquanto que os com estadios III e IV, a
distribuição de escore se encontra mais uniforme (Tabela 6), porém
tal relação não se mostrou estatisticamente significante. Ou seja, na
medida em que a massa tumoral aumenta, os escores diminuem.
Assim, a ação do gene S100 A7 parece se concentrar nas fases
iniciais da carcinogênese.
Não se encontrou relação estatisticamente significante entre o
escore obtido e a idade dos pacientes. Rigopoulou et al. (1994)
detectaram fatores de suscetibilidade para o carcinoma papilífero de
tireóide que variavam conforme as populações investigadas
(espanhóis, americanos e alemães) e que essa suscetibilidade
Discussão
103
dependia de fatores genéticos e ambientais. Neste estudo não foi
possível essa análise porque somente dois pacientes não tinham o
hábito de fumar.
Apesar de o seguimento clínico ter sido menor do que a
literatura preconiza, a comparação das curvas de sobrevida entre os
escores obtidos (analisados individualmente ou agrupados) não
demonstrou diferença estatisticamente significante.
7.3. Falhas do tratamento
Nesta amostra, obtiveram-se 73% (46/63) de sobrevida e 17
(17/63=27%) óbitos, sendo o motivo desses óbitos: falhas do
tratamento em 12,7% (8/63); complicações decorrentes do
procedimento cirúrgico em 6,3% (4/63) e por outras causas em 7,9%
(5/63). Portanto, 70,5% (12/17) dos óbitos foram decorrentes do
tumor ou do seu tratamento.
Entre os 63 casos tratados, 25,4% (16/63) evoluíram com
algum tipo de falha do tratamento (foram dez recidivas locais, sete
recidivas cervicais, uma metástase e cinco 2º tumor primário,
totalizando 22 em 15 pacientes), sendo que sete continuam vivos.
Dentre essas falhas, a recidiva local ou regional (, simplesmente
recidiva) ocorreu em 12 casos, enquanto a metástase à distância e a
presença de segundo tumor primário (doravante, outras) em seis,
Discussão
104
sendo que um paciente teve recidiva local e 2º tumor primário ao
mesmo tempo e seis tiveram recidivas local e regional. Essas
complicações estavam igualmente distribuídas entre a glote (5
recidivas e 2 outras) e a supraglote (5 recidivas e 4 outras), sem que
os da subglote tenham apresentado esse tipo de complicação.
Considerando somente os 15 casos em que houve falhas do
tratamento, verifica-se que ocorreu em 29,1% (7/24) dos tumores
glóticos e em 22,2% (8/36) entre os da supraglote. Uma justificativa
para a maior agressividade observada entre os glóticos é que eles
não são aqueles tratados por radioterapia ou cirurgia endoscópica
(indicados em estágio precoce). Além disto, os tumores transglóticos
foram classificados nessa categoria na subdivisão dos sítios primários
da neoplasia (ou seja, como glóticos avançados). Dessa forma, é
provável que a amostra de tumores glóticos aqui estudados tenha
representação apenas da fração mais agressiva desses tumores.
Ainda neste estudo, verificou-se que a maioria (83,3%) dos
tumores supraglóticos foi classificada como estadios III e IV (30 em
36 casos), enquanto os glóticos se dividiram pelos vários
estadiamentos (10 estadios < III e 14 estadios >II), o que nos leva a
concluir que na supraglote os tumores eram de maior dimensão ou,
segundo a classificação TNM (SOLBIN; WITTEKIND, 2004), mais
Discussão
105
agressivos. Esse fato, porém, não se confirmou ao se observar a
evolução dos tumores aqui estudados.
Dikshit et al. (2005) relataram que o consumo de álcool e o
tabagismo, antes do diagnóstico do tumor, influenciaram a sobrevida
e o prognóstico dos pacientes e Zapater et al. (2000), em estudo de
tumores de supraglote, concluíram que o consumo de álcool
representa uma variável importante no prognóstico. No entanto, não
se observaram diferenças nas populações de etilistas e não etilistas
com relação aos diversos fatores estudados, o que demonstra que o
consumo de álcool, que tem um papel comprovado na etiologia do
câncer de laringe, não representou impacto na sobrevida dessa
população.
As falhas de tratamento ocorreram em 25% (2/8) dos
tumores classificados como estadios I, 12,5% (1/8) dos estadios II;
22,7% (5/22) dos estadios III e 28% (7/25) entre os estadios IV. As
falhas ocorridas com o estadio I foram entre os tumores glóticos ao
se tentar o tratamento com cirurgias parciais da laringe. É sabido que
os carcinomas supraglóticos são possuidores de comportamento
biológico diferente dos da laringe, sempre com maior agressividade,
devido à freqüente metastatização para linfonodos, segundo Noronha
e Dias (1997). Porém, acredita-se que outros mecanismos estejam
envolvidos nessa agressividade, como o fato de maior incidência de
Discussão
106
tumores em estadios III e IV, em relação à glote. Esse fato ocorre
porque os tumores da supraglote são diagnosticados mais
tardiamente, com volume maior de células neoplásicas. Por outro
lado, Greenman; Hommer e Stafford (2000) referem que a diferença
no prognóstico dos tumores para os diferentes sítios da laringe se
correlaciona apenas com o potencial de metastatização, que é maior
nos tumores da supraglote. Neste estudo, a maioria dos supraglóticos
foram estadio III e IV, porém essa agressividade não foi detectada.
Quanto ao escore obtido pelo grupo que desenvolveu falhas
no tratamento, 75% (¾) eram zero+, 20% (2/10) 1+; 26,6% (4/15)
2+; 20% (2/10) 3+ e 20,1% (5/24) 4+. Esses números nos levam a
concluir que essas falhas foram mais freqüentes nos pacientes com
escores da proteína S100 A7 zero (estatisticamente significante).
Destaque-se que a recidiva local é fruto do ato cirúrgico, quando
margens de segurança escassas são deixadas no leito operatório,
sendo, portanto, relacionada muito mais à indicação e à realização do
ato operatório do que à agressividade tumoral. O mesmo não ocorre
com a recidiva regional que, embora tenha relação com a indicação e
a realização do esvaziamento cervical, sua presença decorre da maior
agressividade tumoral. Outras complicações em que não há a
participação da indicação errada do tratamento são a metastatização
à distância e a presença de segundo tumor primário. Essas três
Discussão
107
complicações: recidiva regional, metástase e segundo tumor primário
estiveram presentes em 13 casos, sendo em 19,4% dos tumores de
supraglote (7/36) e em seis (6/24=25%) entre os da glote. Elas se
distribuíram por oito casos com escore menor que 3+ (8/29=27,6%)
e em cinco casos com escore maior que 2+ (5/34=14,7%). Pôde-se
comprovar a ocorrência de complicações estatisticamente
significantes nos casos em que o escore da expressão S100 A7 foi
zero+ e também uma tendência em estarem presentes em pacientes
com escore <3+ (embora, sem diferença estatisticamente
significante).
Dos tumores analisados, 20,6% eram BD, 58,7% eram MD e
20,6% eram PD. Na população de pacientes que evoluíram com
falhas do tratamento, a distribuição da diferenciação celular foi muito
semelhante, ou seja, 21,4% (3/14) de BD, 57,1% (8/14) de MD e
21,4% (3/14) de PD. Isso mostra que a diferenciação celular não
teve influência na presença dessas falhas. A distribuição da
diferenciação celular foi a mesma por região anatômica. Não existem
evidências de que os tumores desses diferentes sítios possuam
diferenças biológicas intrínsecas. Entretanto, segundo Stell (1990), os
tumores da supraglote tendem a ser mais indiferenciados que os
glóticos, o que não foi verificado neste estudo.
Discussão
108
7.4. Função do Gene
Segundo Zhou et al. (2008) e Eckert e Lee (2006), a proteína
fixadora de cálcio tem ação na transdução e na carcinogênese do
epitélio, porém sua função ainda não está bem determinada.
Para Petersson et al. (2007), o psoriasin 1 expresso
desenvolve um fenótipo de resistência à apoptose e para Wolk et al.
(2006), a falta de expressão inibe a diferenciação celular e aumenta
sua motilidade, facilitando a invasão. Dessa forma, o S100 A7 é
altamente expresso nos tumores diferenciados na fase pré-invasiva e
é pouco expresso nos menos diferenciados e em estágio invasivo do
tumor (MANDAL et al, 2007; ZHOU et al, 2008). Krop et al. (2005)
acreditam que o S100 A7 age promovendo a angiogênese e
destacando células que comandam a função antiinvasiva, explicando,
assim o porquê da alta expressão em tumores BD ou estrógenos
negativos.
Para Fukuzawa et al. (2006), a proteína ligadora de cálcio
S100 A7 tem ação na transcrição e que o segmento desse gene que
determina essa função no CEC de cavidade oral é o -1513 a 988. Para
Mandal et al. (2007), o S100 A7 modula a resposta imune
favorecendo o crescimento do câncer de mama, nas fases iniciais. No
entanto, Zhou et al. (2008) demonstraram que o psoriasin 1 age
inibindo ou sendo inibido pelo complexo beta catenin. Assim, segundo
Discussão
109
os autores, em situação em que a expressão do S100 A7 é alta,
ocorre diminuição do complexo beta catenin, e o tecido pré-
neoplásico se transforma em carcinoma espinocelular BD, porém com
pouca agressividade. O carcinoma espinocelular será PD e de alta
agressividade quando a expressão do complexo beta catenin for alta
a ponto de inibir a do psoriasin 1.
Parece que esse gene age nas fases iniciais da tumorigênese,
sendo importante na origem dos tumores diferenciados, porém à
medida que sofrem indiferenciação sua influência desaparece ou são
consumidos para que o processo ocorra. Esse deve ter sido a atuação
do gene psoriasin 1 envolvido nos tumores de laringe, ou seja,
participam na sua diferenciação, e à medida que a expressão diminui,
os tumores tornam-se mais agressivos. Este é o primeiro trabalho na
literatura a avaliar a expressão desse marcador em neoplasia de
laringe e novos estudos poderão detectar informações
complementares que possam tornar esse gene expresso em 93,7%
dos casos, um marcador da presença e da agressividade do CECCP.
8. CONCLUSÕES
Conclusões
111
Os dados deste estudo levam a concluir que em carcinoma
espinocelular de laringe:
a) O marcador S100 A7 (psoriasin1) foi expresso em 93,7%
dos casos;
b) Os pacientes com escore zero de imunomarcação para o
S100 A7 (psoriasin1) apresentaram falhas do tratamento
mais freqüentes;
c) A expressão do S100 A7 foi maior em tumores bem
diferenciados:
- com tendência dos MD a diminuírem sua expressão
à medida que o estadiamento aumenta (embora
sem diferença estatística).
d) O escore da expressão do S100 A7 (psoriasin1) não
representou impacto na sobrevida dos pacientes.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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EI-NAGGAR A.K., EMBERLEY E.D., WATSON P.H., MATSUZAWA S.I.,
REED J.C., MYERS J.N. Reciprocal negative regulation between
S100A7/psoriasin and beta-catenin signaling plays an important role
in tumor progression of squamous cell carcinoma of oral cavity.
Oncogene. 2008 Jan 28 [Epub ahead of print]
9. ANEXOS
Anexos
136
ANEXO 1
Estadiamento TNM (SOLBIN; WITEKIND, 2004)
Classificação T – Tumor Primário
Tx O tumor primário não pode ser avaliado
T0 Não há evidência de tumor primário
Tis Carcinoma in situ
Glote
• T1: Tumor limitado às cordas vocais, com mobilidade das cordas normal:
o T1a: Acometimento de uma corda;
o T1b: Tumor que envolve ambas as Cordas Vocais;
• T2: Tumor se estende à Supraglote e/ou subglote; e/ou com mobilidade
diminuída de corda vocal;
• T3: Tumor limitado à Laringe, com fixação de corda vocal e/ ou que invade
espaço paraglótico, e/ ou com erosão mínima da cartilagem tireóide (Ex. Córtex
Interno).
Supraglote
• T1: Tumor limitado a uma sub-localização anatômica da supraglote,com
mobilidade normal da corda vocal;
• T2: Tumor que invade a mucosa de mais de uma sub-localização anatômica
adjacente da supraglote (p.ex., a mucosa da base da língua, a valécula, a parede
medial do seio piriforme), sem fixação da laringe;
• T3: Tumor limitado á laringe com fixação da corda vocal e/ou invasão de
qualquer uma das seguintes estruturas: área pós-cricóide, tecidos pré-epiglóticos,
espaço para-glótico, e/ou com erosão mínima da cartilagem tireóide (p.ex.,
córtex interna).
Subglote
• T1: Tumor limitado á subglote;
• T2: Tumor que se estende à(s) corda(s) vocal(ais),com mobilidade normal ou
reduzida;
• T3: Tumor limitado à laringe, com fixação da corda vocal.
Para glote, supraglote e subglote:
• T4a: Tumor que invade toda a cartilagem tireóide e/ou estende-se aos tecidos
além da laringe, p.ex., traquéia, partes moles do pescoço, incluindo músculos
profundos/extrínsicos da língua (genioglosso, hioglosso, palatoglosso e
estiloglosso), alça muscular, tireóide e esôfago;
Anexos
137
• T4b: Tumor que invade o espaço pré-vertebral, estruturas mediastinais ou
adjacente à artéria carótida.
Classificação N - Linfonodos Regionais Cervicais:
• Nx: linfonodos regionais não podem ser avaliados
• N0: ausência de metástase em linfonodos regionais
• N1: metástase em um único linfonodo ipsilateral, até 3cm em sua maior
dimensão;
• N2: metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 até 6cm em
sua maior dimensão; ou em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles
com mais de 6cm em sua maior dimensão; ou em linfonodos bilaterais ou
contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão:
o N2a: metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3cm
até 6cm em sua maior dimensão;
o N2b: metástases em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles
com mais de 6cm em sua maior dimensão;
o N2c: metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles
com mais de 6cm em sua maior dimensão;
o N3: metástase em linfonodo com mais de 6cm em sua maior dimensão.
Classificação M: Metástase à Distância
• Mx: a presença de metástase à distância não pode ser avaliada;
• M0: ausência de metástase à distância;
• M1: metástase à distância
Estadiamento Clínico
Estádio 0 Tis N0 M0
Estádio I T1 N0 M0
Estádio II T2 N0 M0
Estádio III T1,T2 N1 M0 ;T3 N0,N1 M0
Estádio IVa T1,T2,T3 N2 M0 ;T4a N0,N1,N2 M0
Estádio IVb T4b Qualquer N M0 ;Qualquer T N3 M0
Estádio IVc Qualquer T Qualquer N M1
Anexos
138
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
“Marcadores Moleculares no Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço”
Eu ____________________________________________________, abaixo-assinado,
tendo sido devidamente esclarecido sobre todas as condições que tratam do Projeto de
pesquisa intitulado “Marcadores Moleculares no Carcinoma Espinocelular de Cabeça e
Pescoço”, especialmente no que diz respeito aos objetivos da pesquisa, aos
procedimentos que serei submetido, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos
e das condições que me foram assegurados, a seguir relacionados:
1. Após a cirurgia com a retirada do tumor, o mesmo (o tumor) fará parte de uma
pesquisa que tem como objetivo procurar alterações nas células dos tumores.
2. A cirurgia será realizada independentemente da sua participação na pesquisa, e a
pesquisa não influenciará de modo algum o tipo de tratamento.
Após a retirada do tumor nós retiraremos apenas 0,5 cm do tumor para estudar estas
alterações. Também serão coletados 5ml (1 colher de sopa) de sangue de sua veia
durante a cirurgia.
3. Não haverá riscos nem desconforto para você, pois retiraremos o pedaço do tumor
somente após a cirurgia e o sangue será coletado enquanto você estiver anestesiado.
4. Com esta pesquisa esperamos encontrar alterações que possam ajudar no diagnóstico
e tratamento dos tumores de cabeça e pescoço.
5. Não haverá despesas para você.
6. Você será acompanhado das maneiras normais no serviço de Cirurgia de Cabeça e
Pescoço do HCFMRP, independentemente da participação ou não na pesquisa.
7. A pesquisa não oferece danos a você e comprometemos que será mantido total sigilo
sobre sua identidade e que em qualquer momento poderá desistir que estes dados sejam
utilizados na presente pesquisa.
_______________________________
Paciente ou Responsável
Ribeirão Preto,....../....../..........
Anexos
139
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO
Motivo: Laringectomia Parcial
Estou ciente de que sou portador de câncer da laringe/faringe e fui informado
que a cirurgia é a forma de tratamento recomendada e, se houver necessidade,
posteriormente, a radioterapia.
Estou ciente que a cirurgia será na garganta e que serão retiradas partes da
laringe e, por isso, minha voz será prejudicada, porém poderei me comunicar com voz
rouca. Será confeccionado um orifício no pescoço chamado de traqueotomia para
respirar, nos primeiros dias da cirurgia. Este orifício será fechado assim que possível.
Recebi a orientação de que serei alimentado por sonda até a cicatrização da garganta,
depois disso, me alimentarei normalmente pela boca. Fui informado também que ficarei
internado cerca de uma semana e que terei enfermeira e fonoaudiólogos para orientar a
minha recuperação.
______________________________ ______________________________
Paciente Médico Orientador
____________________________
Testemunha
Ribeirão Preto, ....../....../.............
Anexos
140
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO
Motivo: Laringectomia Total
Estou ciente de que sou portador de câncer da laringe/faringe e fui informado
que a cirurgia é a forma de tratamento recomendada e, se houver necessidade,
posteriormente, a radioterapia.
Estou ciente que a cirurgia será na garganta e que será retirada a laringe e, por
isso, minha voz será prejudicada. Para respirar será confeccionado um orifício
permanente no pescoço, chamado de traqueotomia, cujo orifício será mantido por uma
cânula metálica. Perderei a voz, porém poderei voltar a me comunicar, aprendendo a
“falar” pelo esôfago, ou colocando uma prótese entre a traquéia e o esôfago. Recebi
orientação de que serei alimentado por sonda até a cicatrização da garganta, depois
disso, me alimentarei pela boca. Fui informado também que ficarei internado cerca de
uma semana e que serei orientado por fonoaudiólogos e enfermeiros.
______________________________ ______________________________
Paciente Médico Orientador
____________________________
Testemunha
Ribeirão Preto, ....../....../.............
Anexos
141
ANEXO 3
Anexos
142
ANEXO 4
Data Sheet
S100A7 (Psoriasin)
liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100-A7
Intended Use
FOR RESEARCH USE ONLY
.
Specificity Human S100A7 (Psoriasin).
Clone 3DC
Ig Class IgG2b
Antigen used Recombinant protein corresponding to the entire S100A7 molecule.
for immunisations
Hybridoma partner Mouse myeloma (p3-NS1-Ag4-1).
Preparation Liquid tissue culture supernatant containing 15mM sodium azide.
Volume as indicated on vial label.
Effective on frozen tissue Not evaluated.
Effective on paraffin wax Yes (using the high temperature antigen unmasking technique:
embedded tissue see overleaf).
Recommendations on use Immunohistochemistry:
Typical working dilution 1:50.
High temperature antigen unmasking technique.
60 minutes primary antibody incubation at 25
o
C.
Standard ABC technique.
Western Blotting:
Not recommended.
Positive Controls Immunohistochemistry - Skin.
Staining pattern Cytoplasmic and nuclear.
Storage and stability Store liquid antibody at 4
o
C. Under these conditions, there is no significant
loss in product performance up to the expiry date indicated on the vial
label. Prepare working dilutions on the day of use.
General Overview
Psoriasin (S100A7) is a 12kD calcium binding protein whose expression is largely, although not entirely,
confined to stratified squamous epithelium.
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Anexos
143
ANEXO 5
Relação de todos os pacientes estudados e seus respectivos dados clínocos,
histológicos e de seguimento
Paciente
Grau de
Diferenciação
Score
Sexo
Idade
Tab
Etil
sub-sitio
Classificação
TNM
1 BD 4+ M 58 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N1Mx
2 MD 2+ M 47 SIM SIM SUPRAGLOTE T1N2MX
3 MD 4+ M 50 SIM SIM SUBGLOTE T2N2BMX
4 MD 4+ M 43 SIM NÃO SUPRAGLOTE T3N0MX
5 MD 4+ F 59 SIM NÃO GLOTE T3N2AMX
6 MD 4+ M 52 SIM SIM GLOTE T4N1MX
7 PD 1+ M 50 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0MX
8 MD 4+ M 75 SIM SIM GLOTE T1N0MX
9 MD 2+ M 49 SIM SIM SUPRAGLOTE T3NOMX
10 MD 4+ F 56 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N0MX
11 PD 1+ M 62 NÃO NÃO SUPRAGLOTE T2N0MX
12 MD 2+ M 44 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N2cMx
13 MD 3+ M 73 SIM NÃO GLOTE T4N0MX
14 MD 3+ M 78 SIM NÃO SUPRAGLOTE T2N0MX
15 PD 0 M 27 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0M0
16 PD 1+ F 49 SIM NÃO SUPRAGLOTE T2N0M0
17 PD 0 M 34 SIM SIM GLOTE T3N1M0
18 MD 4+ M 65 SIM SIM SUPRAGLOTE T1N2M0
19 MD 4+ M 63 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N3M0
20 MD 3+ M 77 SIM SIM GLOTE T2N0MX
21 MD 2+ M 76 SIM SIM GLOTE T1N0Mx
22 MD 1+ F 55 SIM NÃO SUPRAGLOTE T3N0MX
23 PD 1+ M 62 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N0MX
24 BD 4+ M 57 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0MX
25 PD 2+ M 44 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2MX
26 PD 1+ M 52 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N2CMO
27 MD 3+ M 68 SIM SIM GLOTE T1aN0MX
28 BD 4+ M 67 SIM SIM GLOTE T1ANOMX
29 MD 3+ M 53 NÃO NÃO SUBGLOTE T4N2CM0
30 PD 0 M 70 SIM NÃO SUPRAGLOTE T3N0MX
31 MD 2+ M 58 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N1Mx
32 MD 1+ M 71 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2BM0
33 BD 4+ M 52 SIM SIM GLOTE T1N0MX
34 PD 1+ M 58 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N2AMX
35 PD 2+ F 47 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2BM0
36 MD 2+ M 63 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0MX
37 MD 2+ M 51 SIM SIM GLOTE T1AN0MX
38 MD 2+ M 75 SIM SIM GLOTE T3N0M0
39 BD 3+ M 56 SIM SIM SUBGLOTE T3NO0M0
40 BD 4+ M 52 SIM NÃO SUPRAGLOTE T2N0MX
41 BD 4+ M 49 SIM SIM GLOTE T3N0M0
42 MD 4+ M 62 SIM NÃO GLOTE T1BN0M0
43 BD 4+ M 50 SIM SIM GLOTE T4N0M0
44 BD 4+ M 60 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N2cM0
45 BD 4+ M 57 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N2cM0
46 BD 4+ M 64 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0M0
47 MD 4+ M 50 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2AM0
48 PD 1+ M 52 SIM SIM GLOTE T3N2BM0
49 MD 2+ M 53 SIM SIM GLOTE T3N0M0
50 MD 2+ M 52 SIM SIM GLOTE T4N0M0
51 BD 4+ M 61 SIM SIM GLOTE T1AN0MX
52 MD 3+ M 63 SIM SIM GLOTE T3N0M0
53 MD 3+ M 60 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N1M0
54 MD 0 M 48 SIM SIM GLOTE T4N3MX
55 MD 4+ M 70 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N0M0
56 MD 3+ M 57 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0M0
57 BD 4+ M 56 SIM SIM GLOTE T2N0M0
58 PD 2+ M 71 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N1M0
59 MD 4+ M 54 SIM SIM GLOTE T4N1M0
60 MD 2+ M 62 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N0MX
61 MD 3+ M 46 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N1M0
62 MD 1+ M 73 SIM SIM GLOTE T3N0M0
63 MD 2+ M 52 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N0MX
Anexos
144
Continuação:
Paciente
Estadio
clínico
data cir
RTX PO
Recidiva
loc.
Recidiva
reg.
Metástase
2a Lesão
Óbito
Data do óbito
1 III 1/2/2001 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
2 Iva 9/3/2001 SIM SIM NÃO NÃO
SIM
(estômago) SIM abril-03
3 Iva 16/030/01s SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
4 III 30/3/2001 SIM SIM NÃO NÃO NÃO SIM outubro-05
5 Iva 29/5/2001 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
6 Iva 15/3/2002 NÃO SIM SIM NÃO NÃO SIM julho-03
7 III 19/2/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
8 I 22/2/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
9 III 25/2/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
10 II 4/3/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
11 II 14/3/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
12 Iva 18/3/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM janeiro-06
13 Iva 5/4/2002 SIM NÃO NÃO NÃO SIM (pulmão) NÃO
14 II 17/5/2002 NÃO SIM SIM NÃO NÃO SIM dezembro-04
15 III 13/6/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
16 II 14/6/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
17 III 28/6/2002 SIM SIM SIM NÃO NÃO SIM setembro-03
18 Iva 21/7/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
19 Ivb 29/7/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
20 II 13/8/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
21 I 16/8/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. dezembro-03
22 III 20/8/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. março-05
23 II 17/9/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
24 III 16/9/2002 SIM NÃO NÃO
SIM (seio
Cavernoso) NÃO SIM abril-03
25 IVa 4/10/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM fevereiro-07
26 IVa 4/11/2002 SIM NÃO NÃO NÃO SIM (lábio ) NÃO
27 I 29/11/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
28 I 6/12/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
29 IVa 21/2/2003 Sim NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
30 III 7/3/2003 SIM SIM SIM NÃO NÃO NÃO
31 III 22/4/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
32 IVa 6/5/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
33 I 27/5/2003 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
34 IVa 30/5/2003 NÃO SIM NÃO NÃO NÃO SIM outubro-05
35 IVa 6/6/2003 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
36 III 16/6/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
37 I 11/7/2003 NÃO NÃO NÃO NÃO SIM (Lábio) SIM abril-06
38 III 10/2/2004 NÃO SIM SIM NÃO NÃO NÃO
39 III 27/2/2004 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO SIM julho-04
40 II 16/3/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
41 III 19/3/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. setembro-04
42 I 23/4/2004 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
43 IVa 4/5/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
44 IVa 7/5/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM outubro-04
45 IVa 25/5/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
46 III 8/10/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. novembro-04
47 IVa 13/8/2004 SIM NÃO SIM NÃO NÃO SIM o.c. junho-05
48 IVa 9/3/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
49 III 25/10/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
50 IVa 22/11/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
51 I 1/6/2005 NÃO SIM NÃO NÃO NÃO NÃO
52 III 1/6/2005 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
53 III 1/7/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
54 IVb 11/1/2006 SIM SIM SIM NÃO NÃO NÃO
55 IVa 6/10/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
56 III 1/11/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
57 II 18/2/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
58 III 5/4/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
59 IVa 19/4/2005 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
60 IVa 29/7/2005 SIM NÃO NÃO NÃO SIM (lingua) NÃO
61 III 11/10/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
62 III 4/11/2005 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
63 IVa 16/5/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO
ANEXO DE PUBLICAÇÃO
Anexo de Publicação
Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7 em carcinoma espinocelular de
laringe e sua correlação com a clínica: análise por imuno-histoquímica.
Rogério Costa Tiveron; Rui Celso Martins Mamede; David Livingstome A. Figueiredo;
Daniel Hardy de Melo; José Raphael M. C. Montoro
Anexo de Publicação
2
RESUMO
O Carcinoma Espinocelular de Laringe (CECL), responsável por 96% dos casos
de câncer de laringe, se caracteriza pelo comportamento heterogêneo, com evoluções
indefinidas. Estudos têm buscado marcadores para identificar tumores mais agressivos.
As proteínas ligadoras de Cálcio S100, com atuação em uma série de processos
celulares como progressão e diferenciação do ciclo celular, têm sido estudadas em
muitos tipos de cânceres, com exceção os de laringe. Objetivos: Identificar a expressão
imuno-histoquímica da proteína S100A7 em CECL e a correlação com variáveis
clínicas e histológicas do tumor, além de comparar as curvas de sobrevida global de
acordo com a expressão. Casuística e Métodos: 63 pacientes com CECL, tratados
cirurgicamente. Os dados clínicos foram coletados e arquivados e realizadas as reações
de imuno-histoquímica com o anticorpo S100A7 (Psoriasin) NCL-L-S100A7 –
(Novocastra Laboratories
®
). As reações foram classificadas quanto à extensão da
imunomarcação em: Zero; 1+: 5 – 25% das células neoplásicas marcadas; 2+: 25 –
50%; 3+: 50 – 75%; 4+: > 75% (nível de significância p ≤ 0,05). Resultados: A
amostra de 63 pacientes, 58 homens e cinco mulheres, com idade de 27 a 78 anos
(média de 57,46) constituiu de 36 casos de tumores pertencentes à supraglote, 24 à glote
e apenas três à subglote; 13 casos de CECL BD, 37 MD e 13 PD. Os escores foram
correlacionados com diversas variáveis. Observou-se uma tendência dos tumores
glóticos terem escores altos (15 de 24 com escore 3+ e 4+) e os supraglóticos baixos
escores (20 em 26 abaixo de 3+). O grupo BD apresentou escores significantemente
superiores aos MD e aos PD e o grupo MD superior ao PD (p< 0,01*). No grupo MD
notou-se predomínio de escores altos nos estadios I e II (7 casos com escore 3+ e 4+ de
10), ao passo que nos estadios avançados (III e IV), a distribuição do escore foi mais
homogênea (13/27 escores 0 a 2+ e 14/27 escores 3+ e 4+). Com relação às falhas do
tratamento houve diferença estatisticamente significante do grupo escore 0 (3/4
complicações: 75%) com os demais escores (13/59: 22%) (p= 0,02*). Discussão: O
Anexo de Publicação
3
S100A7 (psoriasin 1) é uma proteína liagadora de cálcio da família S100 amplamente
expresso em epitélio de doenças que cursam com hiperplasias da epiderme, como a
psoríase. Recentemente tem sido relatada alta expressão em lesões neoplásicas
(carcinoma ductal de mama, carcinoma espinocelular de bexiga e carcinoma
espinocelular de cavidade oral). À semelhança desses estudos, observou-se alta
expressão em tumores BD, ao passo que em tumores indiferenciados esse gene parece
não atuar. À medida que a massa tumoral aumenta os escores tendem a diminuir (isto
foi observado nos tumores MD), o que reforça a hipótese da sua ação se concentrar nas
fases iniciais da carcinogênese. Conclusões: A proteína S100A7 foi expressa em 93,7%
dos casos de CECL, com maior positividade em tumores mais diferenciados e com
menor índice de falhas de tratamento(estatisticamente significante). Há tendência dos
tumores glóticos terem maior escore na expressão (sem significância). O escore obtido
não representou impacto na sobrevida dos pacientes estudados.
Palavras-chave: psoriasin; carcinoma espinocelular; carcinoma de laringe; imuno-
histoquímica; marcadores tumorais, S100A7.
Anexo de Publicação
4
SUMMARY
The Laryngeal Squamous Cell Carcinoma (LSCC), represents around 96% of all larynx
cancer cases and has heterogenic features and presents indefinite evolutions. Studies of
molecular and cellular alterations have focused in detecting markers to identify more
aggressive tumors. The S100 calcium biding proteins are involved in a variety of
cellular processes such as cell-cycle progression and differentiation. They are actually
reported in many kinds of cancer, except larynx cancer. Objectives: Identify the
imunohistochemistry expression of S100A7 protein and its correlation with clinic and
histological features, besides comparing the survival curves of the different score
groups. Casuistic and Methods: 63 LSCC patients, treated by surgery have their
clinical data collected and filed and the imunohistochemical reactions with S100A7
(Psoriasin) NCL-L-S100A7 – (Novocastra Laboratories
®
). The reactions were classified
according to their extension: Zero, 1+: 5 to 25% of neoplasic cells marked, 2+: 25 to
50%, 3+: 50 to 75% and 4+: > 75% (significance level, p<0,05). Results: 63 patients,
58 men and 5 women aged from 27 to 78 years (average: 57.46 years) had a distribution
of 36 supraglottic, 24 glottic and only 3 subglottic tumors; 13 cases of LSCC were well
differentiated, 37 moderately differentiated and 13 poorly differentiated. There is a
tendency of the glottic tumors to have high scores (15 in 24 scored 3+ and 4+) and also
the supraglottic have lower (20 in 26 < 3+). The moderately differentiated group had
significantly higher scores than the moderately and poorly and the moderately had
higher scores than poorly (p<0,01*). In the moderately group it is possible to note a
higher score prevalence at I and II stages (7 cases in 10 scored 3+ or 4+), and on the
other hand at advanced stages (III and IV) the score distribution were similar (13/27
scored 0 to 2+ and 14/27 scored 3+ and 4+). The treatment failures were significant
Anexo de Publicação
5
higher in zero score group (3/4 complications: 75%) than in positive score group (13/59:
22%) (p= 0,02*). Discussion: Psoriasin1 is S100 calcium binding protein family highly
expressed in hyperplasic epidermal diseases, such as psoriasis. Recently it was reported
in same neoplasic diseases (such as breast ductal cancer, bladder epidermoid carcinoma,
skin tumors and oral epidermoid cancer). Similarly to these studies it was observed high
expression in well differentiated tumors but in poorly differentiated it seems to loose its
function. When the tumor mass is growing the score levels seems to reduce and this fact
showed a tendency to its action concentrate in beginning carcinogenic phases.
Conclusions: The S100A7 protein was expressed in 93.7% of the LSCC, with highest
expression in the more differentiated (statistically significant). There is a tendency to
glottic tumors to have higher scores (no significance). The obtained score didn’t
represent impact in the overall survival curves.
key-words: psoriasin, larynx cancer, squamous cell carcinoma, tumors markers,
S100A7.
Anexo de Publicação
6
INTRODUÇÃO
O Câncer de Laringe é o segundo mais comum câncer do sistema respiratório
perdendo apenas para o câncer de pulmão
1
. Compreende cerca de 2% dos casos de
câncer do Brasil, o que corresponde a 8.000 casos por ano
2
. O carcinoma espinocelular
corresponde à cerca de 94% de todos os tipos histológicos. Apesar dos inúmeros
avanços no diagnóstico bem como no tratamento do câncer de cabeça e pescoço, a
sobrevida aumentou pouco mais de 10% nos últimos 30 anos
3,4
. É marcante a
heterogeneidade de fatores envolvidos na evolução do carcinoma epidermóide. Muitas
características clínicas e histopatológicas já foram extensamente estudadas. Nos últimos
anos, o estudo das alterações celulares e moleculares tem se desenvolvido no sentido de
detectar marcadores para o reconhecimento de tumores primários ocultos, presença de
neoplasia nas margens cirúrgicas, e principalmente, auxiliar na identificação de
indivíduos mais suscetíveis a desenvolver a neoplasia, bem como aqueles casos de
maior agressividade. Não existem relatos na literatura sobre a avaliação da expressão da
proteína S100A7 em CECL.
OBJETIVOS
O presente estudo visa, em carcinoma espinocelular de laringe:
a) identificar a expressão imuno-histoquímica do da proteína ligadora de
cálcio S100A7;
b) identificar a correlação entre a expressão da proteína com variáveis
clínicas e histológicas do tumor;
c) comparar as curvas de sobrevida global dos diversos grupos de escore.
Anexo de Publicação
7
CASUÍSTICA E MÉTODO
Casuística
Foram avaliados 63 casos de pacientes com diagnóstico histopatológico de
CECL tratados cirurgicamente no serviço de cirurgia de cabeça e pescoço do Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(HCFMRP-USP), entre janeiro de 2001 a dezembro de 2005, com prévio consentimento
para participar, com assinatura de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Todos os pacientes foram examinados e operados, conforme os protocolos de
tratamento vigentes, sem qualquer alteração técnica. Os espécimes foram encaminhados
de maneira usual para o estudo anatomopatológico, sem interferência na rotina do
estudo histopatológico.
Os dados clínicos, sócio-demográficos, anatomopatológicos, e de
acompanhamento destes pacientes foram armazenados em um sistema de controle de
dados pertencente ao projeto Genoma (GENCAPO) financiado pela FAPESP e Ludwug
Institute for Cancer Research (NY) –
(http://www.compbio.ludwig.org.br/clinicalgenomics/).
As respectivas lâminas e blocos foram obtidos do departamento de patologia do
HCFMRP-USP. Todos os casos foram revistos por dois patologistas e foram realizadas
as reações de imuno-histoquímica para avaliar a expressão da proteína ligadora de
cálcio S100A7.
Critérios de Inclusão
Os critérios de inclusão foram:
Anexo de Publicação
8
o Diagnóstico histológico de CECL obtido por biópsia incisional (saca-bocado)
e confirmado por exame anatomopatológico;
o Ausência de tratamento prévio para a neoplasia;
o Cirurgia indicada como tratamento inicial
o Aceite do paciente de participar do estudo (através de assinatura do Termo
de Consentimento);
o Amostra tecidual representativa para o estudo imuno-histoquímico.
Critérios de Exclusão
Foram excluídos deste estudo cinco pacientes decorrentes de:
o Ausência de precisão quanto ao sítio primário do tumor;
o Perda do seguimento clínico;
o Dados clínicos indisponíveis ou incompletos (data da cirurgia, estadiamento
clínico e patológico dos tumores, radioterapia pós-operatória, recidiva local,
recidiva regional, metástase à distância, segundo tumor primário, óbito);
o Amostra tecidual não representativa e/ou insuficiente para as reações de
imuno-histoquímica.
Método
Estudo Histológico
As peças cirúrgicas foram fixadas em formalina tamponada a 10% por um
período não superior a 48 horas, clivadas e obtidas áreas representativas da neoplasia.
Os fragmentos escolhidos foram então processados a fim de serem emblocados em
parafina para obtenção dos cortes histológicos de 4 µm de espessura, que foram corados
Anexo de Publicação
9
com hematoxilina e eosina (H&E).
Para cada caso foi selecionado um bloco representativo para a realização das
reações imuno-histoquímicas, sendo obtidos cortes seriados de 4 µm em lâminas com
solução adesiva de 3-amino-propyltriethoxy-silano (Sigma Chemical Co.
®
, St. Louis,
MO/USA).
O anticorpo utilizado para a reação imuno-histoquímica foi o S100A7
(Psoriasin) – liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100A7 – Novocastra
Laboratories
®
, UK.
Para evitar reação endógena, devido à presença de biotina e avidina, foram
utilizados polímero dextran e sistema de amplificação enzimática NovoLink (Novocastra
Laboratories
®
, UK).
Os cortes teciduais de 4 µm foram submetidos à recuperação antigênica pelo
calor por 3 minutos em steammer, com solução de ácido cítrico 10 mM/pH 6.0. O
bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com solução aquosa de peróxido de
hidrogênio a 6%. A incubação com o anticorpo primário foi feita a 37ºC em câmara
úmida a 4ºC por 12 horas (overnight). A incubação com anticorpo secundário, diluído
em PBS, foi realizada por 30 minutos a 37°C. Após lavagens em PBS, os cortes foram
incubados por 30 minutos a 37
o
C com o sistema amplificador Novolink. Por fim, os
cortes histológicos foram lavados em água corrente por 10 minutos, contracorados com
hematoxilina de Harris por 10 segundos, novamente lavados em água corrente,
desidratados em etanol e diafanizados em xilol. A montagem das lâminas foi realizada
em resina Permount (Fisher Scientific
®
, Fair Lawn, NJ/USA, cód. S15-100).
Anexo de Publicação
10
Para cada bateria de reação foram utilizados controles positivos (pele normal) e
negativos. Os controles negativos foram estabelecidos através da omissão do anticorpo
primário, que foi substituído por tampão PBS (“blank”).
O estudo das reações foi feito em microscópio de múltipla observação por dois
patologistas simultaneamente, com desconhecimento da identidade dos casos e
definidas mediante consenso. Das amostras escolhidas, foi inicialmente avaliada, em
objetiva panorâmica (aumento final de 40x), a extensão da imunomarcação, sendo que
aumentos maiores foram utilizados a fim de se confirmar o padrão de expressão (100x,
200x e 400x).
As reações foram então classificadas subjetivamente quanto à extensão da
imunomarcação em:
• Zero: até 5% das células neoplásicas marcadas;
• 1+: 5 – 25% das células neoplásicas marcadas;
• 2+: 25 – 50% das células neoplásicas marcadas;
• 3+: 50 – 75% das células neoplásicas marcadas;
• 4+: > 75% das células neoplásicas marcadas.
Para fins de análise estatística, não foram consideradas as intensidades das
reações, e sim, apenas a sua positividade.
Análise Estatística
Após Classificação das Reações, os diferentes escores obtidos foram
comparados com os dados clínicos, histopatológicos e de acompanhamento dos
pacientes.
Anexo de Publicação
11
Para análise estatística utilizamou-se a metodologia não-paramétrica, pois a
variável escore não apresentou distribuição normal. Adotou-se como nível de
significância p ≤ 0,05.
A variável escore foi trabalhada como uma variável numérica, ou seja, 0+ = 0;
1+ = 1; 2+ = 2; 3+ = 3 e 4+ = 4.
RESULTADOS
Características da Amostra
Foram incluídos neste estudo 63 casos de pacientes com diagnóstico de CECL
tratados cirurgicamente pelo serviço de cirurgia de cabeça e pescoço do HCFMRP-USP,
no período de fevereiro de 2001 a dezembro de 2005. Do total de 63 pacientes, eram 58
homens e cinco mulheres com idade variando, nos homens, de 27 a 78 anos (média de
57,46 anos) e 47 a 59 anos nas mulheres. Quanto à localização do tumor primário, a
grande maioria se localizava na supraglote (36 casos) e na glote (24 casos) com
incidência de 57% e 38%, respectivamente. Somente três casos (4,7%) se originavam da
subglote. Obtiveram-se oito casos no estadio I, oito no estadio II, 22 no estadio III e 25
casos no estádio IV, sendo que três eram IVb. Entre os tumores glóticos, houve
distribuição por todos os grupos de escore, sendo que oito foram classificados como
estádio I; entre os de supraglote, 15 eram estadio III e 14, estadio IV.
Em relação ao tabagismo, apenas dois dos 63 casos não eram fumantes; 52 eram
etilistas e apenas 11 não consumiam bebidas alcoólicas.
Os pacientes foram acompanhados desde o dia da cirurgia (estipulado como
início do seguimento) até dezembro de 2007, sendo que o tempo de seguimento variou
de um mês a 82 meses (média de 45,4 meses). Durante o seguimento desses pacientes,
Anexo de Publicação
12
constatou-se que ocorreram dez casos de recidiva local, sete casos de recidiva regional,
um caso de metástase à distância e em cinco casos houve o aparecimento de segundo
tumor primário (Tabela 1).
Dos 63 pacientes estudados, 17 (27%) foram a óbito, sendo que 12 (19%) pela
neoplasia e cinco (8%) faleceram por outras causas não relacionadas à neoplasia. A
Tabela 2 relaciona óbitos e suas causas ao sítio do tumor.
Todos os tumores foram classificados histologicamente por grau de
diferenciação, obtendo-se 13 (20,6%) bem diferenciados, 37 (58,7%) moderadamente
diferenciados e 13 (20,6%) pouco diferenciados. No gráfico 1, encontra-se a
classificação histológica pelos diferentes sítios. A maioria dos tumores glóticos (91,7%)
era moderadamente diferenciada (16/24=66,7%), bem diferenciados (6/24=25%) e
somente dois eram pouco diferenciados. Os tumores supraglóticos apresentavam
distribuição mais uniforme quanto à diferenciação, pois sete (19,4%) eram bem
diferenciados, 19 (52,7%) moderadamente diferenciados e 10 (27,8%) eram pouco
diferenciados. Entre os de subglote, dois eram moderadamente e um era pouco
diferenciado.
Avaliação do escore
Os 63 espécimes tumorais foram submetidos à imuno-histoquímica para
detecção da expressão da proteína S100A7. As reações foram classificadas, de acordo
com a extensão da imunomarcação em escores segundo a classificação estabelecida na
metodologia. Obtiveram-se quatro casos com escore 0 (6,3%), 10 casos com escore
1+(15,9%), 15 casos 2+ (23,8%), 10 casos 3+ (15,9%) e 24 casos 4+ (38,1%). Os
Anexo de Publicação
13
escores obtidos foram relacionados com as variáveis clínicas dos pacientes e
histopatológicas dos tumores.
O gráfico 1 ilustra a distribuição dos escores de acordo com os diferentes sítios
primários. Houve distribuição muito semelhante dos escores pelos vários sítios
anatômicos, com exceção a subglote devido ao número escasso de casos. Há tendência
maior dos glóticos serem classificados com 3 e 4 + (15 de 24), enquanto os
supraglóticos em se manter com baixo escore (20 em 36).
Na comparação do escore com o grau de diferenciação celular utilizou-se o
Teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados estão representados na Tabela
3.
Há diferença estatisticamente significativa entre os diversos grupos. O grupo BD
apresenta escores significativamente superiores aos dos grupos MD e PD; o grupo MD
apresenta escores significativamente superiores aos dos grupos PD (BD > MD > PD).
Pelo Gráfico 2 observa-se que os tumores pouco diferenciados se postaram nas
faixas de escores inferiores, ou seja nenhum apresentou-se com escore 3 ou 4+.
Considerando somente os tumores moderadamente diferenciados, a análise do
escore em relação ao estadiamento está representada na Tabela 4, onde estão agrupados
os estadios I e II, os estadios III e IV e os escores 0, 1 e 2+ e 3 e 4+.
As relações dos escores com as variáveis sítio do tumor, estadiamento clínico,
idade, presença de recidiva regional e/ ou local, segundo tumor primário e óbitos não
foram significantes.
Anexo de Publicação
14
Comparação das curvas de sobrevida
Foi aplicado o método de construção das curvas de Kaplan-Meier e o teste do
Log rank para a comparação das diferentes curvas. Não se notou diferença
estatisticamente significante entre as sobrevidas e os escores obtidos tanto se analisando
os escores separadamente, quanto agrupados (Gráficos 3 e 4 e Tabelas 5 e 6) .
Para a comparação das curvas de sobrevida entre os grupos de escore
consideram-se dois grupos. Um de ausência ou baixa positividade – grupo 1
(considerando os escores Zero, 1+,2+) e outro de forte positividade – grupo 2
(considerando os escores 3+ e 4+).
Análise Estatística
Considerando como falhas do tratamento a presença de recidiva local ou
regional, metástases e segundo tumor primário, a Tabela 7 correlaciona tais
complicações com os diferentes escores.
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os escores e a presença
de complicações. Porem na comparação do escore zero (3/4=75%) com os demais
(13/59=22%) houve diferença estatisticamente significativa (Z=2,53, p=0,02)
DISCUSSÃO
Expressão do gene Psoriasin
Houve distribuição dos escores pelos vários sítios anatômicos, com exceção da
subglote devido ao número escasso de casos. Há tendência maior dos glóticos serem
classificados com 3 e 4+ (15/24=62,5%), enquanto os supraglóticos em se manter com
escores menores na imunomarcação (20/36=55,5%). Pelo gráfico 4 observa-se que os
Anexo de Publicação
15
tumores pouco diferenciados se postaram nas faixas de escores inferiores, ou seja
nenhum apresentou-se com 3 ou 4+. Isto explica a maior tendência dos tumores glóticos
terem escore maior, pois seus tumores são em maior número de bem diferenciados do
que os da supraglote. Entretanto, não houve diferença estatisticamente significante dos
escores em relação ao sítio do tumor. Outro aspecto que deve ser destacado é que todos
os tumores pouco diferenciados tiveram tendência a terem escores <3+, daí os de
supraglote terem escores menores, pois lá residem mais tumores pouco diferenciados.
Este fato é explicado pela provável função deste gene, ou seja, atua enquanto as células
são bem diferenciadas, nos tumores indiferenciados esse gene parece não ter função
5,6
,.
Analisando a distribuição dos 37 tumores moderadamente diferenciados,
verifica-se que 19 (19/36=53,7%) estão localizados na supraglote, 16 (16/24=66,6%) na
glote e dois na subglote. A maioria desses tumores, ou seja, 56,7% (21/37) foram
classificados com mais de 2+, porém, ao analisar a sua distribuição segundo o
estadiamento clínico, observa-se que existe uma tendência dos classificados com
estadios I ou II de obterem escore > que 3+ (7/10), enquanto que os com estadios III e
IV, a distribuição de escore se encontra mais uniforme (Tabela 8). Ou seja, na medida
em que a massa tumoral aumenta, os escores diminuem. Assim, a ação do gene
Psoriasin parece se concentrar nas fases iniciais da carcinogênese.
Não se encontrou relação estatisticamente significante entre o escore obtido e
a idade dos pacientes. Foram detectados fatores de suscetibilidade para o carcinoma
papilífero de tireóide que variava conforme as populações investigadas (espanhóis,
americanos e alemães) e que essa suscetibilidade dependia de fatores genéticos e
ambientais
7
. Neste estudo não foi possível essa análise porque somente dois pacientes
não tinham o hábito de fumar.
Anexo de Publicação
16
Apesar de o seguimento clínico ter sido menor do que a literatura preconiza, a
comparação das curvas de sobrevida entre os escores obtidos (analisados
individualmente ou agrupados) não demonstrou diferença estatisticamente significante.
Falhas do tratamento
Nesta amostra, obtiveram-se 73% (46/63) de sobrevida e 17 (17/63=27%)
óbitos, sendo que o motivo desses óbitos foi por falhas do tratamento em 12,7% (8/63);
complicações decorrentes do tratamento em 6,3% (4/63) e por outras causas em 7,9%
(5/63). Portanto, 70,5% (12/17) dos óbitos foram decorrentes do tumor ou do seu
tratamento.
Entre os 63 casos tratados, 22,2% (14/63) evoluíram com algum tipo de falha
do tratamento (foram 10 recidivas locais, 6 recidivas cervicais, 1 metástase e 5 segundo
tumor primário, totalizando 22 em 15 pacientes) sendo que sete continuam vivos.
Dentre as falhas de tratamento, a recidiva local ou regional (doravante simplesmente
recidiva) ocorreu em 10 casos, enquanto a metástase à distância e a presença de segundo
tumor primário (doravante outras) em seis, sendo que um paciente teve recidiva local e
2º tumor primário ao mesmo tempo e seis tiveram recidivas local e regional. Essas
complicações estavam igualmente distribuídas entre a glote (5 recidivas e 2 outras) e a
supraglote (5 recidivas e 4 outras), sem que os de subglote tenham apresentado este tipo
de complicação.
Verificou-se que a falha no tratamento ocorreu em 29,1% (7/24) dos tumores
glóticos e em 22,2% (8/36) entre os da supraglote. Uma justificativa para a maior
agressividade observada entre os glóticos é que eles não são aqueles tratados por
radioterapia ou cirurgia endoscópica (indicados em estágio precoce), além do fato dos
Anexo de Publicação
17
tumores transglóticos terem sido incluídos nesta categoria. Dessa forma, é provável que
a amostra de tumores glóticos aqui estudados tenha representação apenas da fração mais
agressiva destes tumores.
Ainda neste estudo, verifica-se que a maioria (83,3%) dos tumores
supraglóticos foi classificada como estadios III e IV (30 em 36 casos), enquanto os
glóticos se dividiram pelos vários estadiamentos (10 estadios < III e 14 estadios >II) o
que nos leva a concluir que na supraglote os tumores eram de maior dimensão ou,
segundo a classificação TNM, mais agressivos. Esse fato, porém, não se confirmou ao
se observar a evolução dos tumores aqui estudados.
Com relação ao consumo de bebidas alcoólicas, não se observaram diferenças
nas populações de etilistas e não etilistas com relação aos diversos fatores estudados, o
que demonstra que o consumo de álcool tem um papel comprovado na etiologia do
câncer de laringe, entretanto não representou impacto na sobrevida desta população. Por
outro lado, Dikshit et al., 2005
8
relataram que o consumo de álcool e o tabagismo antes
do diagnóstico do tumor influenciaram a sobrevida e o prognóstico dos pacientes e
Zapater et al., 2000
9
, em estudo de tumores de supraglote, concluíram que o consumo
de álcool representa uma variável importante de prognóstico, fato que não foi
comprovado neste estudo.
As falhas de tratamento ocorreram em 25% (2/8) dos tumores classificados
como estadios I, 12,5% (1/8) dos estadios II; 22,7% (5/22) dos estadios III e 28% (7/25)
entre os estadios IV. As falhas ocorridas com o estadio I foram entre os tumores
glóticos ao se tentar o tratamento com cirurgias parciais da laringe. É sabido que os
carcinomas supraglóticos são possuidores de comportamento biológico diferente dos da
laringe, sempre com maior agressividade, devido à freqüente metastatização para
Anexo de Publicação
18
linfonodos
10
. Porém, acredita-se que outros mecanismos estejam envolvidos nessa
agressividade, como o fato da incidência maior de tumores em estadios III e IV, em
relação à glote. Esse fato ocorre porque os tumores de supraglote são diagnosticados
mais tardiamente, com volume maior de células neoplásicas. Por outro lado, Greenman
(2000)
11
refere que a diferença no prognóstico dos tumores para os diferentes sítios da
laringe se correlaciona apenas com o potencial de metastatização que é maior nos
tumores de supraglote. Neste estudo, a maioria dos supraglóticos foi estadio III e IV,
porém essa agressividade não foi detectada.
Quanto ao escore obtido pelo grupo que desenvolveu complicações
oncológicas, 75% (¾) eram zero+, 20% (2/10) eram 1+; 26,6% (4/15) eram 2+; 20%
(2/10) eram 3+ e 20,1% (5/24) eram 4+. Esses números nos levam a concluir que as
complicações oncológicas foram mais freqüentes nos pacientes com escores do gene
Psoriasin zero (estatisticamente significante). Destaque-se que a recidiva local é fruto
do ato cirúrgico, quando margens de segurança escassas são deixadas no leito
operatório, sendo, portanto, relacionada muito mais á indicação e a realização do ato
operatório do que à agressividade tumoral. O mesmo não ocorre com a recidiva regional
que, embora tenha relação com a indicação e a realização do esvaziamento cervical, sua
presença decorre da maior agressividade tumoral. Outras complicações em que não há a
participação da indicação errada do tratamento são: a metastatização à distância e a
presença de segundo tumor primário. Estas três complicações: recidiva regional,
metástase e segundo tumor primário estiveram presentes em 13 casos, sendo em 19,4%
dos tumores de supraglote (7/36) e em 6 (6/24=25%) entre os de glote. Elas se
distribuíram por oito casos com escore menor que 3+ (8/29=27,6%) e em cinco casos
com escore maior que 2+ (5/34=14,7%). Pôde-se comprovar a ocorrência de
Anexo de Publicação
19
complicações estatisticamente significantes nos casos em que o escore do Psoriasin foi
zero+ e também uma tendência em estarem presentes em pacientes com escore <3+.
Dos tumores analisados, 20,6% eram bem diferenciados, 58,7% eram
moderadamente diferenciados e 20,6% eram pouco diferenciados. Na população de
pacientes que evoluíram com complicações oncológicas a distribuição da diferenciação
celular foi muito semelhante, ou seja: 21,4% (3/14) de bem diferenciados, 57,1% (8/14)
de moderadamente diferenciados e 21,4% (3/14) de pouco diferenciados. Isso mostra
que a diferenciação celular não teve influência na presença de complicações
oncológicas. A distribuição da diferenciação celular foi a mesma por região anatômica.
Não existem evidências de que os tumores desses diferentes sítios possuem diferenças
biológicas intrínsecas. Entretanto, segundo Stell (1990)
12
, os tumores da supraglote
tendem a ser mais indiferenciados que os glóticos, o que não foi verificado neste estudo.
O Gene Psoriasin 1
Esforços têm sido aplicados no sentido de identificar a expressão de novos
marcadores tumorais relacionados com os CECCP. Figueiredo et al. (2006)
13
descreveram que genes de antígenos tumorais específicos (CTAs) (MAGE-1, -4, -10, -
12, BAGE, GAGE, LAGE, NYESO-1 e PRAME) são expressos em proporções variáveis
(6,1 a 48,5%) em CECCP e essa expressão correlaciona-se com tumores avançados.
Além disso, concluíram que em 63,6% dos casos ocorre expressão concomitante de dois
ou mais genes, principalmente nos tumores avançados e que há relação da expressão de
MAGE-4 no tumor primário com menor incidência de metástases linfonodais. Esses
autores não observaram associação da expressão dos CTAs com grau de diferenciação,
contradizendo Sarcevic, 2003
14
que encontraram MAGE-4 em tumores de menor grau
Anexo de Publicação
20
de diferenciação. O padrão de co-expressão observado sugeriu a Figueiredo et al
(2006)
13
que o desenvolvimento de vacinas polivalentes, contendo epitopos de vários
antígenos codificados por esses genes, deva ser o caminho para o desenvolvimento de
vacinas clinicamente úteis. O estudo do gene S100A7 encontra-se em fase bem mais
precoce, porém sua expressão maior na urina do paciente sugere ser um potencial
marcador não invasivo para o seguimento de pacientes com câncer
15
e, segundo Skliris
et al, 2007
16
, esse gene, por ser regulado pela atividade do receptor de estrógeno,
poderia ser um guia para terapia alvo.
O S100A7 (psoriasin 1) é uma pequena proteína fixadora do Cálcio de 11,4 Kda
pertencente à família de genes S100 amplamente expressa em epitélio escamoso, cuja
exata função é incerta
17,18
. A expressão do gene S100A7 foi descrita previamente em
pele psoriática e em outras doenças que cursam com hiperplasia de epiderme
19,20,21
.
Estudos por imuno-histoquímica detectaram que o psoriasin 1 é produzido pelo
queratinócito circundante de ferida e está presente no seu exsudato
22
. Segundo Eckert e
Lee, 2006
19
, o psoriasin 1 age como substrato da transglutaminase; no sinal da
transdução e tem também função antibacteriana na epiderme. Para Wolk et al, 2006
23
,
além da ação antimicrobiana, o psoriasin 1 inibe a diferenciação celular e aumenta a sua
motilidade, favorecendo a invasão e a metastatização.
Relatos de sua expressão aumentada em lesões neoplásicas têm sido
freqüentes. Dentre elas ressalta-se o carcinoma ductal de mama
6,16,24,25,26
, carcinoma
espinocelular de bexiga
15
, em tumores de pele
5
e carcinoma espinocelular de cavidade
oral
27,28
.
Neste estudo detectou-se a expressão do marcador S100A7 (psoriasin 1 ou
preoteína ligadora de cálcio S100A7) em 93,7% dos casos de CECL, com expressão
Anexo de Publicação
21
forte nos tumores diferenciados e fraca nos pouco diferenciados. Isso é também
concordante com o trabalho de LEYGUE et al., 1996
6
realizado com carcinoma ductal
da mama, onde a expressão do psoriasin1 é fortemente positiva no carcinoma in situ,
enquanto no carcinoma invasivo essa expressão é menor. Esses autores avaliaram a
expressão do RNAm do S100A7 em biópsias de congelação de tecidos de mama
representadas por carcinoma in situ, carcinoma ductal invasivo e tecidos normais e
confirmou altas expressões do psoriasin no carcinoma ductal in situ. É sabido que
tumores mais diferenciados tendem a ser menos agressivos com melhor evolução e
maior sobrevida, porém esse fato não se confirmou em nosso estudo, pois não se
detectou diferenças na sobrevida dos diferentes grupos de pacientes estudados.
Watson; Leygue e Murphy, 1998
29
relatam que a expressão do S100A7 foi
amplamente detectada em tumores in situ, ao passo que nos tumores invasivos tal
proteína foi expressa em apenas 18% dos casos. Esse padrão sugere que a expressão do
psoriasin 1 está associada com alterações na diferenciação do epitélio e deve ter
importância na progressão tumoral precoce. Outro fator adicional para o envolvimento
na progressão do carcinoma ductal é a sua localização em uma região do cromossomo 1
que freqüentemente (> 50% dos casos) apresenta perda da heterozigosidade nos tumores
invasivos
30
.
Em estudo recente foi avaliada a expressão de RNAm do S100A7 através da
técnica de RT-PCR em biópsias de pele de pacientes com lesões pré-neoplásicas,
carcinoma espinocelular, carcinoma basocelular e controles normais. Encontraram
expressão aumentada em pacientes com lesões pré-neoplásicas, no carcinoma
basocelular e significantemente aumentada no carcinoma espinocelular. Os autores
concluíram que, à semelhança do carcinoma ductal da mama e do carcinoma
Anexo de Publicação
22
espinocelular de bexiga o aumento na expressão do psoriasin 1 deve desempenhar um
papel importante na progressão do câncer de pele
5
.
Para Watson; Leygue e Murphy, 1998
29
, o S100A7 tem efeito importante no
desenvolvimento do fenótipo invasivo, que pode ser tanto um efeito indireto nas células
da resposta imune do hospedeiro ou mesmo uma influência direta que contribuía para a
invasão tumoral. Nessa amostra, pôde-se constatar que entre os tumores moderadamente
diferenciados a expressão tem tendência a diminuir na medida em que o estadiamento
do tumor aumenta. A observação de que 75% dos tumores com escore zero tiveram
complicação oncológica mostra que na falta do S100A7 há favorecimento da invasão
tumoral.
Função do Gene
Segundo Zhou et al, 2008
27
e Eckert e Lee, 2006
19
a proteína fixadora de
cálcio tem ação na transdução e dessa forma na carcinogênese do epitélio, porém sua
função ainda não está bem determinada.
Para Petersson et al, 2007
24
, o Psoriasin expresso desenvolve um fenótipo de
resistência à apoptose e para Wolk et al, 2006
23
, a falta de expressão inibe a
diferenciação celular e aumenta sua motilidade, facilitando a invasão. Dessa forma, o
Psoriasin é altamente expresso nos tumores diferenciados, na fase pré-invasiva e é
pouco expresso nos menos diferenciados e em estágio invasivo do tumor
25,27
. Krop et
al., 2005
20
acreditam que o Psoriasin age promovendo a angiogênese e destacando
células que comandam a função antiinvasiva, explicando, assim, o porquê da alta
expressão em tumores bem diferenciados ou estrógenos negativos.
Anexo de Publicação
23
Para Fukuzawa et al, 2006
28
o Psoriasin tem ação na transcrição e que o
segmento desse gene que determina esta função no CEC de cavidade oral é o -1513 a
988. Para Mandal et al, 2007
25
o Psoriasin modula a resposta imune favorecendo o
crescimento do câncer de mama, nas fases iniciais. No entanto, Zhou et al, 2008
27
demonstram que o Psoriasin age inibindo ou sendo inibido pelo complexo beta catenin.
Assim, segundo os autores, em situação em que a expressão do Psoriasin é alta, ocorre
diminuição do complexo beta catenin, e o tecido pré-neoplásico se transforma em
carcinoma espinocelular bem diferenciado, mas com pouca agressividade. O carcinoma
espinocelular será pouco diferenciado e de alta agressividade quando a expressão do
complexo beta catenin for alta a ponto de inibir a do psoriasin 1.
A nosso ver, esse gene age nas fases iniciais da tumorigênese, sendo
importante na origem dos tumores diferenciados, mas à medida que sofrem
indiferenciação sua influência desaparece ou são consumidos para que o processo
ocorra. Esse deve ter sido o mecanismo do gene Psoriasin envolvido nos tumores de
laringe, ou seja, participam na sua diferenciação, e à medida que a expressão diminui,
os tumores tornam-se mais agressivos. Este é o primeiro trabalho na literatura a avaliar
a expressão desse marcador em neoplasia de laringe e novos estudos poderão detectar
informações complementares que possam tornar esse gene, expresso em 93,7% dos
casos, um marcador da presença e da agressividade do CECCP.
CONCLUSÕES
Os dados deste estudo levam a concluir com relação à expressão da proteína
ligadora de cálcio S100 A7 em carcinoma espinocelular de laringe:
a) Esteve presente em 93,7% dos casos;
Anexo de Publicação
24
b) As complicações oncológicas foram mais freqüentes nos pacientes com
escore zero
c) Apresenta maior positividade em tumores bem diferenciados:
- com tendência dos moderadamente diferenciados a diminuírem sua
expressão à medida que o estadiamento aumenta.
d). O escore de imunomarcação não representou impacto na sobrevida dos
pacientes estudados.
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Anexo de Publicação
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Anexo de Publicação
26
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Anexo de Publicação
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between S100A7/psoriasin and beta-catenin signaling plays an important role in
tumor progression of squamous cell carcinoma of oral cavity. Oncogene. 2008 Jan
28 [Epub ahead of print]
Anexo de Publicação
28
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Anexo de Publicação
29
LEGENDA DE FIGURAS
Figura 1- Distribuição dos diferentes escores das reações de Iimuno-histoquímica em
relação aos diferentes sítios tumorais na laringe (valores expressos em número de
pacientes)..
Figura 2- Distribuição do Escore em diferentes graus de diferenciação. Valores
expressos em número de pacientes..
Figura 3- Curva de sobrevida para os diferentes escores (considerando os escores 0, 1, 2,
3, e 4).
Figura 4- Curva de Sobrevida para escores agrupados.
Anexo de Publicação
30
2
2
0
8
2
0
10
5
0
4 4
2
12 11
1
0
2
4
6
8
10
12
Zero 1+ 2+ 3+ 4+
Supraglote
Glote
Subglote
Figura 1
Figura 2
3
1
1
7
3
0
3
12
1
0
9
0
0
12
11
0
2
4
6
8
10
12
0 1+ 2+ 3+ 4+
PD
MD
BD
Anexo de Publicação
31
Figura 3
Figura 4
Função de Sobrevida
TEMPO (meses)
100806040
20
0
Sobrevida acumulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
ESCORE
4
4-censurado
3
3-censurado
2
2-censurado
1
1-censurado
0
0-censurado
Função de Sobrevida
Tempo
(meses)
100806040200
Sobrevida acumulada
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
ESCORE
3+4
3+4 censurado
0, 1+, 2+
0, 1+, 2+ censurado
Anexo de Publicação
32
Tabela 1- Seguimento Clínico dos pacientes segundo o sítio do tumor (valor expresso em
número de pacientes).
Recidiva local Recidiva regional
Metástase à
distância
Segundo tumor
primário
Supraglote
5 3 1 3
Glote
5 4 0 2
Subglote
0 0 0 0
Total
10 7 1 5
Tabela 2- Relação de óbitos e as causas dos mesmos de acordo com o sítio do tumor. (valores
expressos em número de pacientes).
Sito da
lesão
Total de
óbitos
Óbitos por
recidiva
local/
regional
Óbitos por
segundo
tumor
primário
Óbitos por
metástase à
distância
Óbitos
decorrentes do
tratamento
Supraglote
8 4 0 1 3
Glote
3 2 0 0 1
Subglote
1 0 0 0 1
Total
12 6 0 1 5
Tabela 3- Análise do Escore de acordo com os diferentes graus de diferenciação.
Grau de
Diferenciação
N Mediana Máximo Mínimo Média
Desvio
Padrão
PD
13 1,00 2,00 0,00 1,00 0,71
MD
37 3,00 4,00 0,00 2,76 1,09
BD
13 4,00 4,00 3,00 3,92 0,28
X² = 32,90, p < 0,001*
Anexo de Publicação
33
Tabela 4: Distribuição dos escores de acordo com os diferentes estadiamentos para os tumores MD
Estadiamento Escore 0 / 1+ / 2+ Escore 3+ / 4+
I e II
3 7
III e IV (IVa e IVb)
13 14
Tabela 5- Relação da Sobrevida média (em meses) e os diferentes escores.
Escore N Sobrevida média Intervalo de confiança de 95%
0 4 57,75 (33,56 – 81,94)
1 10 65,62 (56,71 – 74,53)
2 15 57,65 (48,95 – 66,36)
3 10 58,26 (4367 – 72,84)
4 24 62,78 (49,42 – 76,15)
Teste Log Rank = 0,90 / p = 0,92
Tabela 6- Relação da Sobrevida média (em meses) em relação aos dois grupos de escore (grupo
1 – escores 0,1+,2+ e grupo 2 – escores 3+ e 4+).
Grupos de
escore
N Sobrevida média Intervalo de confiança de 95%
0+1+2 29 61,01 (54,36 – 67,66)
3+4 34 64,84 (54,01 – 75,68)
Teste Log Rank = 0,05 p = 0,83
Anexo de Publicação
34
Tabela 7- Relação do escore com a presença de complicações oncológicas (recidiva local ou
regional, metástases e segundo tumor primário).
Escore Total de pacientes Complicações
Zero
4 3
1+
10 2
2+
15 4
3+
10 2
4+
24 5
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