( PDF ) Estudo comparativo da farmacocinética vítrea e toxicidade retiniana entre o acetonido de triancinolona com e sem preservativo, em olhos de coelhos

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

ESTUDO COMPARATIVO DA FARMACOCINÉTICA VÍTREA E

TOXICIDADE RETINIANA ENTRE O ACETONIDO DE

TRIANCINOLONA COM E SEM PRESERVATIVO ÁLCOOL

BENZÍLICO, EM OLHOS DE COELHOS

RAFAEL CARDOSO OLIVEIRA

RIBEIRÃO PRETO

2008

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RAFAEL CARDOSO OLIVEIRA

ESTUDO COMPARATIVO DA FARMACOCINÉTICA VÍTREA E

TOXICIDADE RETINIANA ENTRE O ACETONIDO DE

TRIANCINOLONA COM E SEM PRESERVATIVO ÁLCOOL

BENZÍLICO, EM OLHOS DE COELHOS

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo para obtenção do Título de Doutor em

Ciências Médicas.

Área de Concentração: Mecanismos

Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e

Audio-Vestibular.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Jorge

RIBEIRÃO PRETO

2008

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,

POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E

PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Oliveira, Rafael Cardoso

Estudo comparativo da farmacocinética vítrea e toxicidade retiniana

entre o acetonido de triancinolona com e sem preservativo, em

olhos de coelhos. Ribeirão Preto, 2008.

74p.: il.; 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Mecanismos

Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-Vestibular.

Orientador: Jorge, Rodrigo

1. Triancinolona; 2 Preservativo Álcool Benzílico; 3.

Farmacocinética vítrea; 4. Retina.

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Alcides e Regina, principais referências em todos os “trabalhos”

de minha vida. Aos meus irmãos, Sílvia e Humberto, pela intensa união

familiar. Aos meus avós Antônio Severino (in memorian) e Nair, Domingos (in

memorian) e Amélia (in memorian), pelos exemplos de luta.

Aos “Meus Amores”: à minha esposa Lygia, que sempre esteve ao meu lado

em todos os momentos, verdadeira co-autora desta tese, já que participou

diretamente de todo o trabalho desde o início, e à minha filha Júlia, que, com

sua chegada, me fortaleceu ainda mais para enfrentar as adversidades e

prosseguir.

Aos mestres que tive na vida: ao Prof. Osvaldo M. Ohya, que me fez despertar

o interesse pela ciência ainda no colégio, em Apucarana-PR; ao meu tio, Dr.

João Severino de Araújo (in memorian), que além de grande médico

oftalmologista, sempre ensinou, a mim e aos meus primos, a importância da

união familiar; ao Prof. Dr. Rodrigo Jorge, que compartilha continuamente o

ensinamento com seus alunos, sem omissão de informações, transmitindo a

melhor forma de se praticar a medicina baseada em evidências, e visando o

melhor para o paciente. Com extrema dedicação tornou o Serviço de Retina da

FMRP-USP uma forte referência nacional, o que me faz orgulhar de ter

participado do seleto grupo de residentes, estagiários e pós-graduandos

orientados por ele; ao Dr. Harry W Flynn, que me acolheu de maneira

extremamente cordial em Miami e complementou minha formação em Retina e

Vítreo, no Bascom Palmer Eye Institute; ao meu pai, Dr. Alcides da Silva e

Oliveira, que, com sua experiência de 40 anos de medicina, me orientou a

persistir na busca dos objetivos, sempre com humildade, dignidade e

honestidade, sem prejudicar as pessoas.

À minha cidade natal, que me proporcionou uma formação pessoal de

qualidade. Além de poder ter freqüentado excelentes colégios (Mater Eclesiae

e Canadá), Apucarana me ofereceu agradáveis locais de lazer e prática de

esportes. Tudo isso resultou em histórias inesquecíveis e verdadeiras

amizades por toda a vida. Por isso minha eterna gratidão à ela, a “Cidade Alta”

do norte do Paraná.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por iluminar meus caminhos como médico, pai, filho, irmão,

esposo e amigo.

Ao Prof. Dr. Rodrigo Jorge, que não mediu esforços para a realização deste

trabalho. Um verdadeiro professor que sempre compartilha os conhecimentos e

idéias com seus alunos, além de um grande incentivador da pesquisa e do

estudo oftalmológico.

Ao Prof. Armando da Silva Cunha Júnior, pela dedicação e apoio a esta

pesquisa, somada à valiosa colaboração na obtenção dos principais resultados.

Ao Dr. Rubens Siqueira, que sempre incentivou a pesquisa em retina e que

participou diretamente desta obra.

Ao Prof. Antônio Haddad, à Maria Dolores Seabra Ferreira e Vani Alves

Correia, que proporcionaram excelentes condições para o estudo e obtenção

das imagens histológicas.

Ao Dr. Francisco Max Damico, que, com sua grande experiência nesta linha de

pesquisa, contribuiu diretamente para a obtenção dos resultados.

Ao Prof. Pedro Di Tarique Barreto Crispim, pela ajuda indispensável na análise

estatística dos dados do trabalho.

Aos Professores Alfredo Maia e Halin Atique, e a todos do Hospital Veterinário

– UNIRP, que tornaram possível o desenvolvimento de toda a parte cirúrgica

da pesquisa.

Aos técnicos em Cirurgia Experimental do HCFMRP: Hermes Murtha Oliveira,

José Carlos Vanni, Paulo Alves Júnior, Sebastião Assis Mazzetto, e Wagner

Andrade de Oliveira, que com muita dedicação proporcionaram cuidados

excepcionais para com os animais, evitando sofrimento ou perda dos mesmos

durante o estudo.

A todos do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de

Cabeça e Pescoço, do Ambulatório de Oftalmologia e do Centro Cirúrgico, em

especial à Cecília, Amélia, Rita, Rogério, Édson, Neuza, Maria Luiza, Elisabeth,

Lucélia, Vera, Maria Eduvirges, Maria Helena, Marlene, Flora, Luís Carlos,

Paulo César, Maribel, Neusa, Siane, Fátima, Madalena, Adriana, Auxiliadora,

Luciana e Alessandra, profissionais com quem convivi durante os anos de

residência e de pós-graduação, e por quem tenho um sentimento de gratidão e

amizade.

Aos meus amigos e colegas de residência e pós-graduação Doutores Marcus

Rudolph Malaguido, Marcelo Guimarães Brandão Rego e Mila Wiermann

Paques, que dividiram as tarefas para que pudéssemos, com amizade, superar

as dificuldades desta época de árduo estudo e trabalho.

A todos da família CEOF, em especial à Glória e aos doutores Erodício, Penati

e Waldemar, que deram o suporte necessário, principalmente durante minhas

ausências na clínica para a execução desta pesquisa.

À tia Claudia, Ricardo, Ricardinho, Vitor e Margarida, que me acolheram de

braços abertos em Ribeirão Preto, durante os anos de residência e pós-

graduação.

Aos meus queridos parentes e amigos de Apucarana-PR, Jandaia do Sul-PR,

Londrina-PR, Reserva-PR, Curitiba-PR, Guaratuba-PR, Ribeirão Preto-SP,

Araguari-MG, Piracaíba-MG, Brasília-DF e Porto Velho-RO, que sempre me

apoiaram em tudo, mesmo à distância.

Às Universidades que freqüentei: à UEL / Londrina-PR e à USP / Ribeirão

Preto-SP, apesar das dificuldades que atravessam as escolas e hospitais

públicos no Brasil, decorrentes do descaso de nossos políticos para com a

educação e saúde, proporcionaram a mim e aos meus colegas boas condições

para o aprendizado da medicina.

À CAPES, ao CNPq e à FAEPA, pelo auxílio financeiro para a realização desta

pesquisa.

“A base do sucesso está ligada ao bom entendimento dentro da Família.

O apoio que sempre recebi de minha Família proporcionou o meu

sucesso”.

Arthur Antunes Coimbra – Zico

LISTA DE ABREVIATURAS

__________________________________________

Lista de Abreviaturas

____________________________________________________________________________________

®- marca registrada

ARVO- Association for Research in Vision and Ophthalmology

AV- acuidade visual

CETEA- Comissão de Ética em Experimentação Animal

CMV- citomegalovírus

DMRI- degeneração macular relacionada com a idade

EPR- epitélio pigmentado da retina

ERG- eletrorretinograma

EUA - Estados Unidos da América

FDA- Food and Drug Administration

FMRP- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

g- grama

HSC- células tronco hematopoéticas

ICAM-1- molécula de adesão intercelular-1

ISCEV- International Society of Electrophysiology of Vision

Kg- quilograma

M- molar

mg- miligrama

mL- mililitro

mm- milímetro

mmHg- milímetro de mercúrio

NVC- neovascularização de coróide

ºC- graus Celsius

OCT- tomografia de coerência óptica

OVCR- oclusão de veia central da retina

Ph- potencial de hidrogênio

PO- pressão ocular

PVR- proliferação vitreorretiniana

SDF-1- fator derivado de células estromais-1

Lista de Abreviaturas

____________________________________________________________________________________

SIDA- síndroma da imunodeficiência adquirida

TACP- triancinolona com preservativo alcoólico

TASP- triancinolona sem preservativo alcoólico

UFMG- Universidade Federal de Minas Gerais

UNIRP- Universidade de Rio Preto

USP- Universidade de São Paulo

VEGF- fator de crescimento endotelial vascular

ZO-1- zonulae occludens-1

µg- micrograma

µm

- micrômetro quadrado

LISTA DE FIGURAS

__________________________________________

Lista de Figuras

_____________________________________________________________________________________

Figura 1- Técnica utilizada para injeção intravítrea em coelhos ........................... 37

Figura 2- Biotério do Hospital Veterinário Dr. Halim Atique, onde os animais

ficaram confinados após a injeção ........................................................................ 41

Figura 3- Técnica de realização do ERG ............................................................. 42

Figura 4- Dissecção do globo ocular e retirada do vítreo após enucleação ......... 44

Figura 5- Variabilidade da concentração em relação ao tempo para os grupos

de coelhos que receberam as drogas com preservativo (Grupo I) e livres de

preservativo (Grupo II) ......................................................................................... 49

Figura 6- Curva cinética comparativa da concentração em relação ao tempo

entre os grupos de coelhos que receberam as drogas com preservativo (Grupo

I) e livres de preservativo (Grupo II) ...................................................................... 49

Figura 7- Curva comparativa da meia-vida entre as formulações com e sem

preservativo.................................................................................................... ....... 50

Figura 8- Análise granulométrica da triancinolona com preservativo

(TACP).............................................................................................................. ..... 51

Figura 9- Análise granulométrica da triancinolona sem preservativo

(TASP)............................................................................................................... .... 51

Figura 10- Variabilidade da pressão intra-ocular em relação ao tempo para os

grupos de coelhos que receberam as drogas com preservativo (Grupo I) e

livres de preservativo (Grupo II) ............................................................................ 53

Figura 11- Representação esquemática das curvas obtidas no estudo

eletrorretinográfico (Grupo I) ................................................................................. 54

Figura 12- Representação esquemática das curvas obtidas no estudo

eletrorretinográfico (Grupo II) ................................................................................ 55

Figura 13- Variabilidade da amplitude da onda B ................................................. 56

Figura 14- Cortes semifinos da retina dos animais, corados com azul de

toluidina ................................................................................................................. 57

LISTA DE TABELAS

__________________________________________

Lista de Tabelas

_____________________________________________________________________________________

Tabela 1- Potência relativa e dose equivalente dos principais corticosteróides

(Adaptado de HAYNES-JR; MURAD, 1990) ......................................................... 26

Tabela 2- Condições cromatográficas .................................................................. 39

Tabela 3- Concentrações (µg/mL) de Triancinolona com preservativo álcool

benzílico (Grupo I) e Triancinolona livre de preservativo (Grupo II) nos dias

observados............................................................................................................ 48

Tabela 4- Valores tonométricos (mmHg) .............................................................. 52

RESUMO

__________________________________________

Resumo

_____________________________________________________________________________________

OLIVEIRA, R.C. Estudo comparativo da farmacocinética vítrea e toxicidade

retiniana entre o acetonido de triancinolona com e sem preservativo , em

olhos de coelhos. 74f. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

O objetivo deste estudo foi avaliar a farmacocinética vítrea e a toxicidade

retiniana dos dois tipos de triancinolona, com e sem preservativo álcool

benzílico, em olhos de coelhos. Foram utilizados sessenta coelhos albinos

machos, divididos em dois grupos: Grupo I, composto por 25 coelhos, que

receberam 4mg (0,1mL) intravítreo de trinancinolona com preservativo álcool

benzílico (TACP), no olho direito e Grupo II, formado por 25 coelhos, os quais

receberam também no olho direito, 4mg (0,1mL) de triancinolona livre de

preservativo (TASP). Foram sacrificados cinco coelhos de cada grupo nos dias

3, 7, 14, 21 e 28 após a injeção intravítrea, sendo a dosagem da triancinolona

realizada por cromatografia líquida (CLAE). Todos os animais foram avaliados

por meio de exame ocular externo e oftalmoscopia binocular indireta. A pressão

ocular foi aferida antes e imediatamente após as injeções em todos os coelhos,

e nos dias 14 e 28 após as aplicações. Para o estudo da toxicidade, 10 coelhos

foram utilizados, sendo escolhidos, aleatoriamente, cinco de cada grupo. Vinte

e quatro horas antes da injeção e no vigésimo sétimo dia após, os cinco

coelhos do grupo I e os cinco do grupo II foram submetidos ao

eletrorretinograma. No vigésimo oitavo dia, esses dez animais foram

sacrificados e tiveram os olhos direitos processados para análise

histopatológica.

A concentração intravítrea de triancinolona observada nos olhos dos

animais do grupo I apresentou médias de 1713.34µg/mL, 1250.62µg/mL,

Resumo

_____________________________________________________________________________________

770.52µg/mL, 436.44µg/mL, e 203.3µg/mL, nos dias 3, 7, 14, 21 e 28,

respectivamente. No grupo II, a média da concentração intravítrea de

triancinolona observada nos mesmos dias foi 1362.50µg/mL, 655.66µg/mL,

507.06µg/mL, 289.82µg/mL e 119.54µg/mL, respectivamente.

Os resultados obtidos indicam que a injeção intravítrea de triancinolona

com preservativo álcool benzílico e a triancinolona livre de preservativo

apresentaram maior diferença de concentração vítrea da droga nos olhos de

coelhos do grupo I no sétimo dia do estudo (valor-p<0,03). Nos demais dias,

não se constatou diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Os

estudos, histológico e eletrorretinográfico, não evidenciaram toxicidade do

tecido retiniano.

Palavras-chave: Triancinolona; Preservativo Álcool Benzílico; Farmacocinética

vítrea; Retina

ABSTRACT

__________________________________________

Abstract

____________________________________________________________________________________

OLIVEIRA, R.C. Vitreous pharmacokinetics and retinal toxicity

comparative study of preserved and non preserved triamcinolone in

rabbits eyes. 74f. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

The purpose of this study was to determine the intravitreous pharmacokinetic

profile of benzyl alcohol triamcinolone acetonide formulation, and preservative-

free triamcinolone acetonide formulation, and evaluate potential signs of toxicity

to the retina.

Sixty New Zealand male white rabbits, divided in two groups, were enrolled in

the study. In group I, 25 rabbits received 4mg (0,1mL) of preservative benzyl

alcohol triamcinolone acetonide formulation into the vitreous of the right eye. In

group II, 25 rabbits received 4mg (0,1mL) preservative-free triamcinolone. Five

rabbits of each group was euthanized at 3, 7, 14, 21 e 28 days after injections,

and intravitreal drug levels were determined by high-performance liquid

chromatography (HPLC). Ocular pressure of the experimental eye was

measured preoperatively, postoperatively, and on 14 and 28 days after

injection. Five animals in each group were randomly chosen 27 days after

injection for light microscopy examination. Eletroretinography (ERG) was

performed on both eyes of each five rabbits of group I and II at baseline and 27

days after injection.

After injection, the median triamcinolone intravitreous concentration in the group

I was 1713.34µg/mL, 1250.62µg/mL, 770.52µg/mL, 436.44µg/mL, e

203.3µg/mL, on days 3, 7, 14, 21 and 28 respectively. In the group II, the

median triamcinolone intravitreous concentration observed on days 3, 7, 14, 21,

e 28 were 1362.50µg/mL, 655.66µg/mL, 507.06µg/mL, 289.82µg/mL, e

Abstract

____________________________________________________________________________________

119.54µg/mL, respectively. There was no evidence of toxic effects on both

groups based on histological and ERG findings.

Our findings showed that preservative benzyl alcohol triamcinolone acetonide

formulation, and preservative-free triamcinolone acetonide formulation had

different vitreous concentration at 7 days after injection. No toxic reactions in

the retina were observed in both groups.

Key words: Triamcinolone; Preservative benzyl alcohol; Vitreous

pharmacokinetics Retina.

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO .................................................................................................. 21

1.1. Administração de Drogas Intravítreas .............................................................. 22

1.2. Corticosteróides .............................................................................................. 22

1.3. Aplicações e Perspectivas dos Corticosteròides em Doenças do Segmento

Posterior do Olho ............................................................................................ 27

1.4. Relevância do Estudo ..................................................................................... 31

2- OBJETIVOS ..................................................................................................... 32

3- MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 34

3.1. Injeção Intravítrea ............................................................................................ 35

3.1.1. Materiais ................................................................................................ 35

3.2. Animais ........................................................................................................... 35

3.3. Procedimentos Cirúrgicos ............................................................................... 35

3.4. Dosagem de Triancinolona Intravítrea ............................................................. 37

3.5. Análise Granulométrica................................................................................. .... 39

3.6. Estudo de Toxicidade Retiniana ..................................................................... 40

3.6.1. Observação Clínica ............................................................................... 40

3.6.2 Eletrorretinografia ................................................................................... 41

3.6.3 Estudo Histopatológico ........................................................................... 43

3.7. Análise Estatística ........................................................................................... 45

4- RESULTADOS ................................................................................................. 46

4.1. Dosagem de Triancinolona .................................................................................. 47

4.2. Análise Granulométrica.................................................................................. ....... 50

4.3. Observação Clínica ............................................................................................. 51

4.4. Eletrorretinografia ................................................................................................ 53

4.5. Estudo Histopatológico ........................................................................................ 56

5- DISCUSSÃO ..................................................................................................... 58

6- CONCLUSÕES ................................................................................................. 65

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 67

8- ANEXO ............................................................................................................. 73

ANEXO DE PUBLICAÇÃO

1- INTRODUÇÃO

__________________________________________

Introdução

____________________________________________________________________________________

Nos últimos anos, o desenvolvimento farmacêutico permitiu o surgimento

de inúmeras drogas com potencial de aplicação no tratamento de doenças

intra-oculares. As vantagens do olho em tratamentos farmacológicos e

cirúrgicos são decorrentes de sua acessibilidade e transparência. A

administração tópica, com o uso de colírios, mostra-se adequada apenas para

tratar doenças do segmento anterior do olho. A administração sistêmica requer

doses elevadas para que se tenha concentração intravítrea satisfatória.

Visando aumentar a eficácia do tratamento de doenças vítreorretinianas,

têm sido utilizadas injeções dessas drogas diretamente no globo ocular. Por

meio de injeção subconjuntival ou subtenoniana, a droga pode ser depositada

próxima à esclera para que atinja o segmento posterior, difundindo-se através

dela. Mas são as injeções realizadas diretamente no interior da cavidade vítrea

que garantem níveis terapêuticos da droga, sem causar danos sistêmicos.

Novas pesquisas estão sendo direcionadas para as doenças capazes de

provocar perda visual grave como a degeneração macular relacionada com a

idade, a retinopatia diabética, a obstrução venosa da retina e outras patologias

que causam danos à retina e à mácula. Essas pesquisas envolvem a utilização

de drogas, que têm por objetivo principal o de regredirem o edema retiniano

e/ou inibirem a formação de neovasos, e conseqüentemente, melhorarem a

acuidade visual (GILLIES et al., 2006).

A triancinolona, que é um corticosteróide sintético, é uma das drogas

mais pesquisadas e utilizadas na prática clínica, que pode ser injetada pela via

Introdução

____________________________________________________________________________________

subtenoniana e intravítrea, sendo que na última, o medicamento tem se

mostrado mais efetivo para o tratamento das doenças da retina (BONINI-FILHO

et al., 2005).

1.1. Administração de Drogas Intravítreas

A liberação da droga diretamente na cavidade vítrea, em casos de

doenças do segmento posterior do olho, surge diante da necessidade de se

manter níveis terapêuticos adequados no seu local de ação, isto é, no vítreo,

na retina, ou na coróide. Desse modo, evitam-se também efeitos adversos

associados ao tratamento sistêmico e problemas relacionados às vias

perioculares, como ptose e celulite. Porém, a injeção intravítrea possui riscos

inerentes ao procedimento como hemorragia intra-ocular, descolamento de

retina, glaucoma, catarata e endoftalmite.

1.2. Corticosteróides

A atividade antiinflamatória do cortisol (hidrocortisona), o hormônio

produzido no córtex das glândulas adrenais humanas, foi descoberta na

década de 40 e vários dos seus derivados sintéticos têm se mostrado úteis no

controle de processos inflamatórios e auto-imunes. A introdução dos

corticosteróides como método terapêutico em doenças oculares ocorreu há

mais de 50 anos (GORDON; McLEAN, 1950). Essas drogas têm sido

largamente empregadas, tanto no tratamento de alterações inflamatórias do

segmento anterior quanto do segmento posterior do olho, reduzindo as

conseqüências da sua resposta, particularmente a cicatrização e a

Introdução

____________________________________________________________________________________

neovascularização (DUKE-ELDER; ASHTON, 1951; LEIBOWITZ;

KUPFERMAN, 1980). O seu efeito parece ser inespecífico e sua ação pode ser

percebida em processos de causa alérgica, traumática ou infecciosa.

Clinicamente, os corticóides não atuam de forma direta para corrigir uma

desordem específica, mas provavelmente modificam a resposta do organismo

a um estímulo exógeno ou endógeno (CHARAP, 1992).

Evidências indicam que a ação farmacológica dos corticosteróides

ocorre através de proteínas receptoras (FRANGIE; LEIBOWITZ, 1993)

resultando em alterações no sistema imunológico, em quase todos os seus

aspectos (CHARAP, 1992). Há inibição da migração de neutrófilos para o

espaço extracelular e sua aderência no endotélio vascular no local da lesão

tecidual. Em doses terapêuticas, os corticosteróides também inibem a migração

de macrófagos, interferem na atividade linfocítica e reduzem o número de

linfócitos T e B (LEIBOWITZ; KUPFERMAN, 1980). Outras células e

substâncias moduladoras da resposta inflamatória têm seu comportamento

modificado por essas drogas como os basófilos, que inibem a liberação de

histamina induzida por estímulo dependente de IgE (SCHLEIMER, 1985); a

fosfolipase A2, ao ser inibida, evita a biossíntese do ácido aracdônico e a

conseqüente formação das prostaciclinas, tromboxano A, prostaglandinas e

leucotrienos (CHARAP, 1992). Os corticosteróides também diminuem a

permeabilidade capilar, a proliferação de fibroblastos e a quantidade de

depósito de colágeno, o que influencia na reparação dos tecidos (LEOPOLD;

PURNELL; CAMON, 1951).

Introdução

____________________________________________________________________________________

Na oftalmologia, os corticosteróides são usados para tratar diversas

doenças, sendo especialmente indicados para reduzir processos inflamatórios

e alérgicos de doenças oculares e no pós-operatório, principalmente por via

tópica. Porém, ao mesmo tempo em que são úteis no controle inflamatório da

maioria das afecções superficiais do olho, podem melhorar os sintomas e

mascarar a progressão de doenças de etiologia fúngica ou herpética, por

exemplo, podendo levar a um déficit visual severo, ou até à perda da visão.

Além disso, não devem ser utilizados em casos de lacerações ou abrasões

mecânicas do olho, pois retardam a cicatrização e estimulam a disseminação

de infecções, justamente devido à sua ação na resposta imunológica. Outras

complicações oculares que podem surgir são úlceras corneais, glaucoma

cortisônico (mais comum com a terapia tópica) e a catarata subcapsular

posterior, que é mais freqüente com o tratamento sistêmico por período

superior a um ano. A corticoterapia sistêmica é comumente utilizada em casos

de uveítes e neurite óptica, por exemplo, e em pacientes cujo quadro

oftalmológico manifesta-se associado a processos inflamatórios extra-oculares.

De qualquer modo, podem surgir efeitos adversos gerais como: hipertensão

arterial sistêmica, hiperglicemia, maior susceptibilidade a infecções, úlceras

pépticas e psicose quando o tratamento torna-se crônico (HAYNES JR;

MURAD, 1990). O uso de corticosteróides deve, então, ser feito apenas

quando sua indicação for indispensável e seus efeitos adversos oculares e

sistêmicos devem ser conhecidos e detectados precocemente.

A escolha do corticosteróide a ser empregado varia de acordo com a

enfermidade ocular presente e sua dose deve ser ajustada individualmente.

Introdução

____________________________________________________________________________________

Para uso local, as drogas mais utilizadas clinicamente são a prednisolona, a

dexametasona e a betametasona. Para uso sistêmico opta-se, geralmente,

pela prednisona e metilprednisolona, enquanto a triancinolona é preferida para

aplicação intra ou periocular. A Tabela 1 mostra a potência relativa e a dose

equivalente dos corticosteróides.

Tabela 1- Potência relativa e dose equivalente dos principais corticosteróides

(Adaptado de HAYNES-JR; MURAD, 1990)

CORTICOSTERÓIDE

POTÊNCIA RELATIVA

DOSE EQUIVALENTE (mg)

Cortisol 1 20

Cortisona 0,8 25

Prednisona 4 5

Prednisolona 4 5

Metilprednisolona 5 4

Triancinolona 5 4

Betametasona 25 0,75

Dexametasona 25 0,75

O Acetonido de Triancinolona (9-fluoro - 11, 21 dihydroxy - 16, 17 - [( 1 -

methylethylidene) bis (oxy)] pregna 1,4 - diene - 3,20 - dione) é um

corticosteróide que tem sido bastante utilizado na prática oftalmológica, sendo

droga promissora na inibição da proliferação celular. Sua baixa solubilidade

isolada proporciona maior tempo de liberação da droga em meios intra-

oculares (HASHIZOE et al., 1994). Recentemente, a triancinolona tem sido foco

de inúmeros estudos clínicos, com resultados bastante promissores no

tratamento do edema macular diabético, em obstruções venosas, cistóide pós-

Introdução

____________________________________________________________________________________

operatório e proposta como tratamento alternativo para a degeneração macular

relacionada à idade (DMRI).

1.3. Aplicações e Perspectivas dos Corticosteróides em Doenças do

Segmento Posterior do Olho

Os corticosteróides são usados, tradicionalmente, por causa de sua

capacidade de diminuir a migração de leucócitos, limitando seu acesso aos

locais de inflamação e de redução da produção de citocinas. Para se obter

esses efeitos no segmento posterior do olho, a única alternativa foi, por muito

tempo, a via sistêmica. Recentemente, tornou-se freqüente o uso de injeções

perioculares e intravítreas de corticosteróides, principalmente a triancinolona,

para o tratamento de algumas doenças retinianas como neovascularização de

coróide, telangiectasias justafoveais idiopáticas, edema macular secundário à

retinopatia diabética, obstrução venosa, uveítes e pseudofacia, além de ser

utilizada para visibilização intra-operatória da hialóide posterior (PEYMAN;

MOSHFEGHI, 2004).

Alguns estudos mostraram a eficácia terapêutica da injeção intravítrea

de 4mg de triancinolona na melhora da acuidade visual e estabilização

angiográfica da neovascularização de coróide em pacientes com DMRI

exsudativa (CHALLA et al., 1998; DANIS et al., 2000), assim como na

resolução do edema macular diabético e normalização da espessura retiniana

foveal (MARTIDIS et al., 2002). As principais hipóteses relacionadas ao

mecanismo de ação dos corticosteróides na retina são: a inibição do fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF), restabelecimento da barreira hemato-

Introdução

____________________________________________________________________________________

retiniana por meio da redução da permeabilidade e efeito anti-angiogênico

(FLOMAN; ZOR, 1977; ISHIBASHI et al., 1985). O VEGF, uma citocina

angiogênica e um fator de permeabilidade, é secretado a partir das células

gliais, das células do EPR e do endotélio vascular; está presente na retina e no

vítreo em baixos níveis (BUDDI; ELIOTT, 2004). É possível que essa

expressão do VEGF pelo EPR normal seja responsável, ao menos

parcialmente, pelo efeito trófico do epitélio sobre a coriocapilar

(BLAAUWGEERS et al., 1999). Acredita-se ainda, que haja um equilíbrio

natural entre o VEGF e o fator derivado do EPR, uma citocina anti-angiogênica,

e que uma alteração nesse equilíbrio seja responsável pela angiogênese

coroidal que leva ao crescimento de vasos sangüíneos anormais no espaço

sub-retiniano e/ou sub-EPR, caracterizando a neovascularização de coróide

(OHNO-MATSUI et al., 2001). Maior expressão do VEGF provoca também

aumento da permeabilidade vascular, responsável pelo surgimento de edema

retiniano e promove a migração e a proliferação de células endoteliais, etapas

essenciais para a neovascularização da retina. Assim, o VEGF é reconhecido

como alvo terapêutico promissor para a regulação da angiogênese (WITMER et

al., 2003). As conseqüências de sua inibição têm sido estudadas por meio do

uso de corticóides tradicionais e de novas drogas angiostáticas como o

Macugen® (Pfiser/Eyetech, EUA), que bloqueiam a isoforma VEGF 165 e foi

recentemente aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) dos EUA

para uso em pacientes com DMRI exsudativa; Lucentis® (Novartis/Genentech,

EUA), o fragmento ativo de um anticorpo recombinante humanizado para o

VEGF e o Anecortave® (Alcon, EUA), um corticosteróide sintético modificado

Introdução

____________________________________________________________________________________

sem ação glucocorticóide e que não causa aumento da pressão ocular. Os dois

primeiros são injetados diretamente na cavidade vítrea, enquanto o último é

administrado através de injeção periocular (SINGERMAN; MILLER, 2003). O

uso off-label de bevacizumabe (Avastin®, Genentech, EUA) intravítreo tem se

mostrado seguro e eficaz para o tratamento da DMRI exsudativa (RICH et al.,

2006).

Outras substâncias atuam sinergicamente com o VEGF na angiogênese,

como o fator derivado de células estromais-1 (SDF-1). O SDF-1 é a principal

citocina que mobiliza as células-tronco hematopoéticas (HSC), que têm função

hemangioblástica, e as células progenitoras endoteliais (EPC) para os locais

onde há dano vascular (HATTORI; HEISSIG; RAFFI, 2003). Sabe-se que a

expressão do SDF-1 aumenta em olhos nos quais estão presentes afecções

como: edema macular e retinopatia diabética proliferativa, além de

correlacionar-se diretamente com a gravidade da doença (BUTLER et al.,

2005). Um dos mecanismos de ação dos corticosteróides na resolução do

edema macular diabético após a injeção intravítrea seria também a redução

dos níveis de substâncias como o SDF-1 e do subseqüente recrutamento de

EPC, o que, teoricamente, provoca regressão de neovascularização (BUTLER

et al., 2005).

Estudos indicam que os corticóides atuam, ainda, nas junções

intercelulares, modulando a expressão de algumas moléculas de adesão e

permeabilidade na retina como a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1). A

ICAM-1 é expressa constitucionalmente no EPR e nas células endoteliais dos

vasos da coróide, sendo um componente importante para as interações

Introdução

____________________________________________________________________________________

intercelulares durante a resposta inflamatória, mediando a adesão e o

extravasamento de leucócitos. Penfold et al. (2000) demonstraram que a

triancinolona é capaz de reduzir a expressão de ICAM-1, após estudo com um

modelo de barreira hemato-retiniana externa. Os autores sugerem que o

mesmo pode ocorrer in vivo e as conseqüentes reduções da permeabilidade

vascular e de estímulos inflamatórios seriam, então, os principais efeitos da

injeção intravítrea de triancinolona (PENFOLD et al., 2000). Anteriormente,

Singer et al. (1994) evidenciaram, in vitro, que a dexametasona pode regular a

permeabilidade através de sua ação sobre tight junctions, resultando no

aumento da resistência transepitelial e da zonulae occludens-1 (ZO-1), uma

proteína de membrana que participa das junções intercelulares (SINGER et al.,

1994).

O relato de toxicidade retiniana provocada pelos veículos de alguns

corticosteróides de depósito, após injeção intravítrea (HIDA et al., 1986),

reforça a importância de estudos abrangendo tais preservativos. Também há

relato de que injeções intravítreas de triancinolona com preservativo álcool

benzílico, em olhos de coelhos, nas dosagens 0,5mg ou 1mg não causaram

toxicidade retiniana, e que, quando a droga foi administrada na dose de 4 e

8mg observou-se, à microscopia eletrônica, destruição de fotorreceptores da

retina externa e migração de células “macrófagos-like” para o espaço sub-

retiniano. Esse estudo também mostrou um dano mais extenso, quando se

injetou 20mg da droga (YU et al., 2006). Entretanto, outros estudos revelam

ausência de toxicidade retiniana após injeção intravítrea de 4 e 16mg de

triancinolona com e sem preservativo (KIM et al., 2006).

Introdução

____________________________________________________________________________________

1.4. Relevância do Estudo

A injeção intravítrea de triancinolona é um procedimento realizado em

larga escala, por oftalmologistas do mundo todo, no tratamento de patologias

do segmento posterior do olho. Trata-se de um estudo preliminar na

comparação das duas drogas com e sem preservativo álcool benzílico. É

pioneiro no Brasil e representa um importante passo no que diz respeito à

segurança do método, já que existem dúvidas geradas por outros trabalhos

publicados.

2. OBJETIVOS

__________________________________________

Objetivos

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Objetiva o presente estudo:

• Avaliar a farmacocinética vítrea dos dois tipos de triancinolona,

após a injeção intravítrea das drogas, em olhos de coelhos.

• Avaliar a ocorrência de possível toxicidade retiniana causada pela

triancinolona, e/ou pelo preservativo álcool benzílico por

intermédio de eletrorretinografia e estudo histopatológico.

3. MATERIAL E MÉTODOS

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Material e Métodos

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3.1. Injeção Intravítrea

3.1.1. Materiais

Acetonido de Triancinolona 40mg/mL, 0,1mL, ou seja, 4mg da droga

foram injetados na cavidade vítrea de olhos de coelhos. No grupo I foi utilizada

droga contendo preservativo álcool benzílico em sua formulação (TACP -

Kenalog® Bristol-Myers, EUA), e no grupo II, droga livre do preservativo (TASP

- Ophthalmos® São Paulo, Brasil) para o estudo comparativo.

3.2. Animais

Sessenta coelhos Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus), machos, com

idade média de quatro meses, e peso de 2000g a 2500g, foram utilizados no

estudo, de acordo com a resolução da Association for Research in Vision and

Ophthalmology (ARVO) para estudo em animais. O protocolo da pesquisa foi

aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(FMRP-USP) (Anexo 1). Os procedimentos anestésico-cirúrgicos foram

realizados no Hospital Veterinário Dr. Halim Atique da Faculdade de Medicina

Veterinária da Universidade de Rio Preto (UNIRP), em São José do Rio Preto-

SP, cujo biotério abrigou os animais durante todo o período de estudo.

Os animais foram divididos em dois grupos. O grupo I (TACP) composto

por 25 animais, que receberam 4mg de Acetonido Triancinolona importada com

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

preservativo álcool benzíliço (Kenalog® Bristol-Myers, EUA), através de

injeções intravítreas. O grupo II (TASP) formado por 25 coelhos, que foram

submetidos a injeções intravítreas de Triancinolona nacional (Ophthalmos®,

Brasil) sem preservativo em sua formulação.

As análises do vítreo realizaram-se 3, 7, 14, 21 e 28 dias da injeção,

quando cinco animais de ambos os grupos foram sacrificados em cada um

desses dias.

Vinte e quatro horas antes da injeção, e no vigésimo sétimo dia após a

mesma, os cinco animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente, foram

submetidos ao ERG.

No vigésimo oitavo dia, os mesmos cinco coelhos de cada grupo, que

haviam sido submetidos ao ERG, foram sacrificados e tiveram seus olhos

direitos enucleados e processados para microscopia de luz, como descrito a

seguir.

As injeções intravítreas nos olhos dos animais foram realizadas no

Centro Cirúrgico do Hospital Veterinário da UNIRP, sob cuidados de assepsia e

com medidas pós-operatórias para evitar complicações imediatas (Figuras 2 e

3). As injeções intravítreas e a posterior eutanásia dos animais foram

acompanhadas pelo médico veterinário, responsável pela administração das

drogas anestésicas (Figura 2).

Os coelhos ficaram confinados em gaiolas individuais, em ambiente com

temperatura média de 25ºC, com ar condicionado e exaustor de ar (Figura 3), e

luminosidade variando de acordo com a luz solar. Não houve restrição de água

nem de alimentação (ração animal própria para a espécie).

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

3.3. Procedimentos Cirúrgicos

A anestesia foi realizada utilizando-se uma injeção intramuscular de

30mg/Kg de Cloridrato de Ketamina (Ketamin®, Cristália - 50mg/ml), e

4,0mg/Kg de Xilasina (Coopazine®, Schering-Plough Coopers - 20mg/ml), além

da instilação tópica de Cloridrato de Tetracaína 1% + Cloridrato de Fenilefrina

0,1% (Anestésico®, Allergan) no olho direito dos animais. Para a dilatação

pupilar foi instilada uma gota de Fenilefrina 2,5% e uma de Tropicamida 1%.

Procedeu-se no olho direito a assepsia com povidine tópico (PVPI), e logo em

seguida foi realizada a injeção intravítrea a 4mm do limbo, com seringas de 1ml

e agulhas de insulina (BD®, 0,30 x 13 30G1/2). Foi instilado colírio de

Gatifloxacino (Zymar®, Allergan), a partir do pós-operatório imediato, quatro

vezes ao dia durante cinco dias (Figuras 2 e 3).

Figura 1- Injeção intravítrea.

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

3.4. Dosagem de Triancinolona Intravítrea

A dosagem da triancinolona na cavidade vítrea foi realizada nos 25

animais de cada grupo (50 olhos), por pesquisadores do Laboratório de

Farmacotécnica e Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Empregou-se a técnica de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

O equipamento utilizado foi o cromatógrafo líquido Waters, equipado

com bomba modelo 515, injetor automático modelo 717 plus, detector de

ultravioleta modelo 2487-dual lambda absorbance, software Millenium



v.2.15.01. A coluna empregada foi do tipo C18 de 3,9mm de diâmetro e 150mm

de comprimento, com partículas de 5µm (Nova-Pak



, Waters, USA).

A validação é o processo estabelecido por um estudo de laboratório

visando garantir que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,

assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar

precisão, exatidão, linearidade, sensibilidade e especificidade adequadas à

análise.

Os reagentes utilizados foram: Triancinolona acetonide-TA (Sigma

chemical Co, St. Louis, MO, USA), água ultra filtrada (Milli Q plus, Millipore,

USA) e acetonitrila grau CLAE (J.T. Baker, Division Mallinckrodt Baker, INC,

Phillipsburg, NJ, USA).

As condições cromatográficas estabelecidas para o ensaio encontram-se

descritas na Tabela 2. Uma solução de TA 25µg/mL em acetonitrila foi utilizada

com padrão de referência.

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

Tabela 2- Condições cromatográficas.

Fase móvel Água: acetonitrila (40:60)

Fluxo da fase móvel (mL/minuto) 0,6

Modo do fluxo isocrático

Comprimento de onda no UV (nm) 240

Temperatura da coluna ambiente

Para avaliação da concentração da droga intravítrea, cinco coelhos de

cada grupo foram sacrificados nos dias 3, 7, 14, 21 e 28 dias após as injeções

intra-oculares, com dose letal de tiopental sódico intravenoso (Thiopentax®,

Cristália, Brasil), 100mg/Kg. Em seguida, os animais foram decapitados e os

olhos que receberam as drogas, imediatamente enucleados; o vítreo foi

completamente removido e, logo a seguir, conservado a -18ºC para posterior

determinação da concentração de triancinolona intravítrea pela técnica de

CLAE.

As amostras de vítreo foram descongeladas, homogeneizadas,

acrescidas de 1,0 ml de fase móvel, filtradas em filtros Millex® (0,45U) e

analisadas em duplicata. A quantidade de droga foi expressa como

concentração equivalente de triancinolona, em µg/mL de vítreo. Também foi

realizado o estudo de meia-vida da droga no vítreo.

3.5. Análise Granulométrica

Para se obter a medida dos grânulos de triancinolona TACP e TASP, foi

utilizada a técnica de espalhamento (ou difração) da luz, através do

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

equipamento Hydro 2000S(A), da Malrven Instruments Ltd., Malvern, UK -

Programa: Mastersizer Ver. 5.22.

3.6. Estudo de Toxicidade Retiniana

3.6.1. Observação Clínica

Desconhecendo a que grupo pertencia, dois examinadores realizaram os

exames de inspeção e oftalmoscopia binocular indireta (Topcon®, Japão) em

todos os animais. Esses exames foram feitos no pré-operatório e, nos dias 3, 7,

14, 21 e 28, após a injeção intravítrea. Foram pesquisados os seguintes dados:

quemose, hiperemia ou secreção conjuntival, edema de córnea, hipópio,

catarata, opacidade vítrea e descolamento de retina. Para a dilatação pupilar

foram utilizados tropicamida 0,5% e fenilefrina 2,5% tópicos.

Cinco animais de cada grupo foram submetidos à tonometria através de

TonoPen® (Mentor, EUA) antes da injeção, tendo sido feita escolha aleatória

dos mesmos. O exame foi repetido logo após a injeção, e nos dias 3, 14 e 28

após o procedimento; o valor da pressão ocular considerado para cada olho

avaliado foi a média de três aferições. Após a aferição da PO no pós-operatório

imediato, quando foi constatada a elevação abrupta dos níveis pressóricos, foi

procedida uma paracentese da câmara anterior para conseqüente redução da

PO.

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

Figura 2- Biotério do Hospital Veterinário Dr. Halim Atique, onde os animais ficaram

confinados após a injeção.

3.6.2. Eletrorretinografia

A função retiniana foi avaliada através de ERG (LKC, EPIC 2000), de

acordo com o protocolo da International Society of Electrophysiology of Vision

(ISCEV). Foi realizado um estímulo tipo flash, utilizando-se uma cúpula de

Ganzfeld (Figura 4). O exame foi dividido em duas fases: fase 1 ou escotópica

(adaptação ao escuro durante 30 minutos, na qual foram estudados os

bastonetes, e fase 2 ou fotópica (adaptação à luz durante 10 minutos), quando

se estudaram os cones. Na primeira fase foram realizados os passos

escotópico B, resposta máxima combinada e potenciais oscilatórios, e na

segunda, os passos fotópico B e flicker (30Hz).

Cinco animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente, foram

submetidos ao exame de eletrorretinografia vinte e quatro horas antes da

injeção, e no vigésimo sétimo dia após a mesma. Os coelhos foram submetidos

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

ao ERG sob anestesia com injeção intramuscular de 30mg/Kg de Cloridrato de

Ketamina (Ketamin®, Cristália - 50mg/ml), 4,0mg/Kg de Xilasina (Coopazine®,

Schering-Plough Coopers - 20mg/ml) e da instilação tópica de Cloridrato de

Tetracaína 1% + Cloridrato de Fenilefrina 0,1% (Anestésico colírio®, Allergan).

Figura 3- Técnica de realização do ERG: (A) Disposição dos eletrodos. (B) ERG

(LKC, EPIC 2000). (C) Cúpula de Ganzfeld.

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

3.6.3. Estudo histopatológico

No estudo histopatológico, realizado após 28 dias, foram utilizados 10

coelhos, cinco de cada grupo, os mesmos que foram previamente submetidos

ao ERG. Os olhos experimentais desses animais foram analisados com

microscópio de luz.

Os coelhos foram sacrificados com dose letal de tiopental sódico

intravenoso (Thiopentax®, Cristália) e, em seguida, decapitados e enucleados

ambos os olhos. Foram livrados dos tecidos adjacentes e colocados em

solução fixadora (Figura 5).

A solução fixadora empregada para a preparação do exame com

microscopia de luz foi o formaldeído 4% (recentemente preparado a partir do

paraformaldeído) em tampão fosfato de Sorensen 0,1M, pH 7,2. Uma calota

posterior do globo ocular foi separada por meio de incisão equatorial ao nível

da inserção dos músculos retos e, então, dividida em duas partes por um corte

horizontal passando pelo nervo óptico, permanecendo no fixador por 24 horas,

a 4 graus Celsius. Em seguida, as peças foram incluídas rotineiramente em

parafina. Dos blocos, foram produzidos 12 cortes de 5µm de espessura, em

micrótomo Reichert-Jung, modelo RM 2065 (Leica Instruments®, Alemanha).

Os cortes corados em hematoxilina e eosina foram observados com o

microscópio de luz (Carl Zeiss®, Alemanha) e imagens representativas da

retina fotografadas utilizando-se o fotomicroscópio Axiophot (Carl Zeiss,

Alemanha).

Dois olhos de cada grupo, e dois olhos esquerdos (controles) dos

respectivos coelhos, escolhidos aleatoriamente, tiveram o segmento posterior

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

recortado do restante do globo ocular e dividido em duas peças por um corte

horizontal passando pelo nervo óptico. As peças foram, então, imersas em

solução de formaldeído 2% e glutaraldeído 2% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2,

durante quatro horas, a 4ºC. Após lavagem em tampão durante 30 minutos,

fragmentos desses segmentos, com aproximadamente 1,0mm de espessura,

foram refixados em tetróxido de ósmio (OsO

) a 1,0% em tampão fosfato 0,1M, pH

7,2, por duas horas, a 4ºC, e desidratados com uma série crescente de etanóis.

Os fragmentos de retina foram, então, tratados com óxido de propileno e incluídos

em Epon 812. Quatorze cortes semifinos de 0,5µm obtidos com ultramicrótomo

Reichert Ultracut S (Leica Instruments®, Alemanha) foram colhidos em lâminas de

vidro, corados com azul de toluidina 1,0% e analisados com microscópio de luz

(Carl Zeiss®, Alemanha). A partir desses cortes, foram obtidos registros

fotográficos de imagens representativas da retina, utilizando-se o fotomicroscópio

Axiophot. Caso fosse detectada alteração, seria procedido o estudo com

microscópio eletrônico (Philips®, EM 208, EUA).

Figura 4- (A) Dissecção do globo ocular; (B) retirada do vítreo após enucleação.

A B

Material e Métodos

____________________________________________________________________________________

3.7. Análise Estatística

O estudo considerou uma amostra de 60 coelhos (unidade

experimental), nos quais foram realizadas injeções intravítreas e que foram

sacrificados ao longo de 28 dias. Nos dias 3, 7, 14, 21 e 28 foram sacrificadas

cinco unidades de cada grupo e as concentrações de triancinolona intravítrea

determinadas em µg/mL.

As pressões oculares foram aferidas antes e depois da injeção, no

terceiro dia, no décimo quarto dia e no vigésimo oitavo dia após o

procedimento. Os valores tonométricos dos animais do grupo I foram

comparados àqueles verificados nos animais do grupo II, em cada dia de

pressão aferida.

Os resultados do ERG também foram analisados. As amplitudes das

ondas A e B foram estudadas separadamente, comparando-se os valores

obtidos antes e após vinte e sete dias da injeção intravítrea.

Nessa análise estatística descritiva e exploratória foram observadas a

mediana, a variação interquartílica (respectivamente o 1

e o 3

quartis) e a

amplitude total descritas nas Tabelas 1 e 2, tendo sido utilizado o teste não-

paramétrico U de Mann-Whitney. O nível de significância (α) utilizado nas

inferências foi de 5% de probabilidade.

Para a verificação dos dados no plano cartesiano foram utilizados

gráficos Box-Plot (mediana e quartis) e gráfico de linhas.

4. RESULTADOS

__________________________________________

Resultados

_____________________________________________________________________________________

4.1. Dosagem de Triancinolona

Para a comparação das concentrações de triancinolona entre os grupos

I (TACP) e II (TASP), ao longo do tempo, não foram verificadas diferenças

estatisticamente significativas para os tempos de 3, 14, 21 e 28 dias (valor-

p>0,05) e foram detectadas diferenças estatisticamente significantes para sete

dias (valor-p<0,03) após a injeção intravítrea, indicando maior concentração de

triancinolona com preservativo nesse período. No terceiro dia, a concentração

de triancinolona no grupo I (TACP) apresentava uma mediana de 1903,1µg/ml,

e de 1032,9µg/ml no grupo II (TASP). No sétimo dia, as concentrações de

triancinolona dos grupos I e II apresentavam concentrações com medianas de

1213,0µg/ml e de 570,1µg/ml, respectivamente, quando foi observada

diferença estatisticamente significativa. Nos demais dias estudados, assim

como no terceiro, não houve diferenças estatisticamente significantes entre os

dois grupos. As medianas das concentrações nos dias 14, 21 e 28 no grupo I

(TACP) foram de 857,8 µg/ml, 442,0 µg/ml e 248,6 µg/ml, respectivamente. Já

no grupo II (TASP), os valores das medianas nesses mesmos dias foram de

516,6 µg/ml, 347,9 µg/ml e 102,8 µg/ml, respectivamente (Tabela 3).

Pode-se notar o comportamento dos dados nas Figuras 5 e 6, com a

apresentação dos valores de mediana. A Figura 5 revela a grande variabilidade

experimental observada em cada grupo.

Resultados

_____________________________________________________________________________________

O estudo farmacocinético da meia-vida no vítreo revelou 8,166 ± 1,287

dias no grupo que recebeu a formulação de triancinolona com preservativo, e

7,995 ± 2,793 dias no grupo sem preservativo (Figura 7).

Tabela 3- Concentrações (µg/ml) de TACP (Grupo I) e TASP (Grupo II) nos dias

observados.

Tempo

Mínimo

artil

Mediana

quartil

Máximo

Grupo I

3 dias 835,6 1573,1 1903,2 1944,8 2310,0

7 dias 678,9 1173,7 1213,0 1215,9 1971,6

14 dias

362,9 807,0 857,8 864,8 960,1

21 dias

122,1 385,0 442,0 564,3 668,8

28 dias

64,3 172,7 248,6 255,5 275,4

Grupo II

3 dias 1005,7 1010,6 1032,9 1770,6 1992,7

7 dias 371,6 526,2 570,1 897,1 913,3

14 dias

304,7 342,4 516,6 682,7 688,9

21 dias

124,0 147,8 347,9 391,8 437,6

28 dias

30,8 77,2 102,8 190,9 196,0

Resultados

_____________________________________________________________________________________

Figura 5- Variabilidade da concentração em relação ao tempo para os grupos de

coelhos que receberam as drogas com preservativo – grupo I / TACP (verde) e sem

preservativo – grupo II / TASP (azul) (Box-Plot).

Figura 6- Curva cinética comparativa da concentração de triancinolona (em µg/mL -

diluída em 10 mL) em relação ao tempo entre os grupos de coelhos que receberam as

drogas com preservativo - grupo I / TACP (vermelho) e sem preservativo - grupo II /

TASP (azul).

Resultados

_____________________________________________________________________________________

0 7 14 21 28

Com AB

Sem AB

Dias

Ln[µg/mL]

Figura 7- Curva comparativa da meia-vida entre as formulações com preservativo

álcool benzílico (TACP = com AB) e sem preservativo (TASP = sem AB).

4.2. Análise Granulométrica

Essa análise mostrou a maior medida do tamanho dos grânulos de

triancinolona na formulação com preservativo em relação à droga sem

preservativo (Figuras 8 e 9).

Resultados

_____________________________________________________________________________________

Figura 8 - Análise granulométrica da triancinolona com preservativo (TACP)

Figura 9 - Análise granulométrica da triancinolona sem preservativo (TASP)

4.3. Observação Clínica

No acompanhamento pós-operatório dos animais, o exame de inspeção

revelou hiperemia conjuntival e edema corneano na maioria dos coelhos dos

dois grupos, logo após a injeção da droga intravítrea; provavelmente pelo

Resultados

_____________________________________________________________________________________

aumento súbito da pressão ocular, havendo resolução do mesmo após

paracentese de alívio. Não foi observada secreção ocular externa nem hipópio

em nenhum animal de ambos os grupos. Também não se detectou

opacificação do cristalino durante o período estudado.

Os achados oftalmoscópicos mostraram-se dentro da normalidade, não

ocorrendo hemorragias ou descolamento de retina em qualquer animal.

Quanto à tonometria, foi observado aumento súbito da pressão ocular,

imediatamente após a injeção intravítrea em ambos os grupos, havendo

regressão gradativa durante os dias estudados (Tabela 4; Figura 10).

Comparando as drogas com preservativo (grupo I – TACP) versus sem

preservativo (grupo II – TASP) em relação à pressão intra-ocular, ao longo do

tempo, chegou-se à conclusão de que não houve diferenças estatisticamente

significativas através do teste de Mann-Whitney (valor-p < 0,05). Quando a

comparação foi feita entre os valores de cada grupo, houve um aumento

significativo da pressão intra-ocular imediatamente após a injeção e no terceiro

dia após o procedimento (p < 0,05).

Tabela 4 – Valores tonométricos brutos (em mmHg) entre os dois grupos

TACP TASP

Pré

19, 11

7, 16, 9 8, 17, 7, 8, 13

30 segundos

58, 54, 90, 86, 80 89, 55, 63, 60, 89

3 dias

63, 42, 39, 34, 27 42, 32, 42, 37, 43

14 dias

59, 39, 35, 27, 22 37, 29, 37, 34, 39

28 dias

28, 35, 34, 35, 32 14, 34, 32, 27, 39

Resultados

_____________________________________________________________________________________

Figura 10- Variabilidade da pressão intra-ocular em relação ao tempo para os grupos

de coelhos que receberam as drogas com preservativo - grupo I / TACP (verde) e sem

preservativo - grupo II / TASP (azul).

4.4. Eletrorretinografia

O ERG não mostrou sinais de toxicidade retiniana causada pela

triancinolona, de ambos os grupos, ou pelo veículo álcool benzílico, do grupo I,

na cavidade vítrea. As amplitudes das ondas A e B permaneceram normais

após os 27 dias de avaliação (Figuras 11 e 12). Houve alta variabilidade dos

dados nos dois grupos, porém não foi observada diferença estatisticamente

significativa antes da injeção intravítrea e 27 dias após a mesma, quando

Resultados

_____________________________________________________________________________________

comparados os olhos com as drogas (direitos) com os olhos contralaterais,

virgens de tratamento (Figura 13).

Figura 11- Representação esquemática das curvas obtidas no estudo

eletrorretinográfico (resposta máxima combinada) de um olho experimental de um

animal do Grupo I antes da injeção intravítrea de triancinolona com preservativo -

TACP (esquerda) e após 27 dias (direita).

PRÉ PÓS

Resultados

_____________________________________________________________________________________

Figura 12- Representação esquemática das curvas obtidas no estudo

eletrorretinográfico (resposta máxima combinada) de um olho experimental de um

animal do Grupo II antes da injeção intravítrea de Triancinolona livre de preservativo -

TASP (esquerda) e após 27 dias (direita).

RÉ

ÓS

Resultados

_____________________________________________________________________________________

Antes

Depois

TD TE KD KE

Droga

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Amplitude da onda

Figura 13- Variabilidade da amplitude da onda B de acordo com a droga utilizada para

os olhos direito (tratamento) e esquerdo (controle). K = grupo I (TACP); T = grupo II

(TASP); D = olhos direito; E = olhos esquerdo.

4.5. Estudo Histopatológico

No estudo histopatológico com microscopia de luz, a retina apresentou

aspecto normal em todos os olhos estudados, de ambos os grupos, após o

vigésimo oitavo dia de avaliação. Especificamente, não foram observados

sinais de necrose retiniana, perda de fotorreceptores, restos celulares,

degeneração cística, infiltrados inflamatórios ou hipocelularidade das camadas

nucleares (Figura 14). O corpo dos fotorreceptores encontrava-se intacto, sem

sinais de picnose. A concentração dos cones variou de quatro a sete por

Resultados

_____________________________________________________________________________________

100µm

em ambos os grupos. Os vacúolos apresentaram-se dentro da

normalidade. Também não foram encontradas alterações na camada de

células ganglionares e no epitélio pigmentado.

Grupo I (TACP) Controle

Grupo II (TASP) Controle

Figura 14- Cortes semifinos da retina dos animais, corados com azul de toluidina:

Aspecto morfológico normal preservado, tanto nos coelhos tratados (A) e (C), como

nos respectivos controles (B) e (D).

5. DISCUSSÃO

__________________________________________

Discussão

_____________________________________________________________________________________

O presente estudo demonstrou o comportamento da formulação

contendo triancinolona e preservativo álcool benzílico (TACP), e da formulação

da mesma droga sem preservativo (TASP), após a injeção na cavidade vítrea

de olhos de coelhos.

Em relação à concentração intravítrea, observou-se maior concentração

da droga no grupo I apenas no sétimo dia após a injeção intravítrea da droga.

Nos dias 3, 14, 21 e 28 não houve diferença estatisticamente significativa entre

os grupos. O comportamento da curva de concentração mostrou regressão

gradativa da droga na cavidade vítrea, em ambos os grupos, durante os dias

estudados. As medianas dos níveis intravítreos de triancinolona variaram de

1903,2µg/ml, no terceiro dia, a 248,6µg/ml, 28 dias após a injeção intravítrea,

no grupo I. No grupo II, a variação das medianas foi de 1032,9µg/ml, no

terceiro dia, e de 102,8µg/ml no vigésimo oitavo dia após o procedimento.

Kim et al. (2006), ao compararem a farmacocinética de uma formulação

contendo triancinolona com preservativo álcool benzílico e livre de preservativo,

em olhos de coelhos, observaram meia-vida semelhante da droga entre as

formulações, na concentração de 4mg, sendo de 24 dias nos olhos em que

foram injetados triancinolona livre de preservativo, e de 23 dias, nos olhos que

continham a droga com preservativo álcool benzílico em sua fórmula. Nesse

mesmo estudo foi observado que a meia-vida aumentou para trinta e nove dias

quando foi injetada triancinolona numa concentração de 16mg. Em nosso

trabalho, a quantidade de triancinolona encontrada em ambos os grupos foi

Discussão

_____________________________________________________________________________________

inferior à observada no estudo de Kim et al. (2006). Como conseqüência, a

meia-vida encontrada em ambas as formulações (TACP = 8,166 ± 1,287 ; TASP

= 7,995 ± 2,793 dias) também foi inferior àquela verificada por Kim ( TACP = 23 ;

TASP = 24 dias). Vários fatores podem influenciar na diferença de

concentração de droga, como, por exemplo, tamanho do olho coelho, tipos de

seringa ou agulha, eliminação de sobrenadante da formulação. Ober et al.

(2006) descreveram essa variação, e que agulhas de menor calibre, utilizadas

nas injeções, e a remoção do preservativo aquoso da fórmula através de filtros,

parecem aumentar a concentração da mesma, porém, ainda assim, com

resultados variados. Spandau et al. (2005) também observaram que o método

de preparação da triancinolona no laboratório pode alterar a concentração da

droga. Enfim, é natural que haja alteração na concentração da droga, quando

se trata de estudos realizados em diferentes centros de pesquisa. Desde

animais de diferentes tamanhos, agulhas de calibres variados, seringas de

medidas distintas, laboratórios com técnicas específicas para confecção da

triancinolona, até mesmo o fato dos procedimentos injeção intravítrea e

dissecção do globo ocular serem realizados por diferentes pesquisadores,

podem contribuir para essa diferença de concentração da droga, entre o nosso

trabalho e o estudo de Kim et al. (2006). Por se tratar de um estudo

comparativo, foi fundamental o fato de a mesma técnica ter sido empregada

pelo mesmo pesquisador para a injeção de ambas as formulações do

corticóide, o que reduz drasticamente parte dos vieses decorrentes dos motivos

acima apresentados.

Discussão

_____________________________________________________________________________________

É importante ressaltar a dificuldade na precisão da dose decorrente do

pequeno volume a ser injetado (precisão de medida de volume) e em função do

tipo de formulação (precisão na concentração). Nesse ultimo aspecto, cabe

enfatizar que por se tratar de uma suspensão a velocidade de sedimentação

estará diretamente relacionada às características de sua composição e

também à uniformidade de dispersão de partículas alcançada durante o

processo de reconstituição (agitação) que antecede a administração.

A análise granulométrica realizada no presente estudo mostrou um

tamanho maior do grânulo da triancinolona com preservativo (TACP), em

relação à droga sem preservativo (TASP), o que pode, talvez, explicar a

absorção mais rápida dessa e a menor concentração no sétimo dia do estudo.

As medidas tonométricas realizadas antes da injeção, logo após a

mesma, e nos dias 3, 14 e 28, mostraram que não houve diferença

estatisticamente significativa entre os dois grupos durante os dias estudados.

No entanto, quando cada grupo foi analisado separadamente, houve aumento

significativo da mesma imediatamente após a injeção e no terceiro dia do

estudo, não havendo, a partir de então, novos picos hipertensivos em nenhum

dos olhos estudados durante o período de 28 dias. Thompson (2006) observou

aumento significativo da pressão intra-ocular em 9,7% de 93 olhos de

pacientes diabéticos submetidos à injeção intravítrea de triancinolona para

tratamento de edema macular (follow-up = 140 dias). Entretanto, McGee et al

(2005) não observaram aumento significativo da pressão intra-ocular após

injeção intravítrea de triancinolona em olhos de coelhos. Já no estudo de Kai et

al (2006) foi detectado aumento significativo da pressão ocular após injeção

Discussão

_____________________________________________________________________________________

intravítrea de triancinolona com preservativo em olhos de coelhos albinos, o

que corrobora com nossos achados.

Acredita-se que a hipertensão ocular induzida por corticosteróides seja

dependente da dose e da duração do tratamento e, presumivelmente, o reflexo

da quantidade da droga que atinge a câmara anterior e a malha trabecular

(BECKER, 1965; ARMALY, 1967). A presença da droga nessa região do olho

não foi avaliada no presente estudo e, apesar de isto ser esperado, não se

pode assegurar que tenha atingido níveis terapêuticos. Outro ponto importante

a ser discutido é o tempo de seguimento, já que alguns estudos mostram

ocorrência de elevação da pressão intra-ocular meses após o procedimento de

injeção intravítrea de triancinolona (Kai, 2005; Thompson, 2006). Um período

de seguimento superior a 28 dias e com amostra maior, talvez pudesse ter

evidenciado hipertensão ocular posterior a esse período. Novas pesquisas

poderão trazer dados clínicos relevantes sobre o tema.

Todavia, alguns fatores devem ser considerados na interpretação dos

resultados tonométricos. Ficou demonstrado, em estudo anterior, que os

coelhos apresentam menor susceptibilidade para o aumento da pressão ocular

induzida por uso de corticosteróide do que o homem (KNEPPER et al., 1978).

Futuros testes clínicos deverão excluir, obviamente, pacientes com história de

glaucoma ou de aumento da pressão ocular após uso de corticosteróides.

O uso de ketamina intramuscular para a anestesia dos animais, durante

os procedimentos, é capaz de provocar o aumento da pressão ocular em olhos

de coelhos. Sabe-se, porém, que o efeito hipertensivo da droga é, em média,

de apenas 7% (ANTAL; MUCSI; FALUDI, 1978). Quanto ao eletrorretinograma,

Discussão

_____________________________________________________________________________________

não é relatada influência da ketamina no resultado do exame (SASOVETZ,

1978).

Os exames de inspeção e oftalmoscopia binocular indireta não

evidenciaram sinais de toxicidade que pudessem ser atribuídos à triancinolona

ou ao preservativo álcool benzílico, incluindo a formação de catarata. Porém, o

tempo de seguimento pode não ter sido suficientemente longo para possibilitar

sua ocorrência, pois é sabido que a catarata é uma conseqüência adversa do

uso prolongado de corticosteróides (URBAN; COTLIER, 1986). Islam, Vernon e

Negi (2007) observaram formação de catarata em 81% de olhos de pacientes

diabéticos submetidos a tratamento com triancinolona intravítrea até dois anos

após a aplicação. No presente estudo, não houve, portanto, trauma

cristalineano com a agulha, no momento das injeções intravítreas, que pudesse

provocar rápida opacificação do mesmo.

A ausência de sinais de toxicidade intra-ocular foi confirmada nos

estudos com ERG e histopatologia. Os cortes incluídos em parafina foram

examinados e a avaliação detalhada foi feita nos cortes semifinos, incluídos em

resina, que apresentaram melhor qualidade de preservação e melhor definição

de imagem em face da sua reduzida espessura. O exame realizado com o

microscópio de luz evidenciou normalidade anatômica da retina dos animais

estudados, não se observando lesão de fotorreceptores, morte celular,

necrose, presença de macrófagos ou demais infiltrados inflamatórios. A

camada de células ganglionares, bem como o epitélio pigmentado da retina,

mostraram-se sem alterações nos dois grupos e nos respectivos controles.

Discussão

_____________________________________________________________________________________

Alguns estudos revelam alterações histológicas da retina após injeção

intravítrea de triancinolona. Yu et al. (2006) observaram destruição da camada

externa de fotorreceptores e migração de células “macrófagos-like” para o

espaço subrretiniano, após injeção de triancinolona intravítrea em olhos de

coelhos nas doses de 4, 8 e 20mg, sendo que nessa última dosagem também

foi evidenciado dano mais extenso e aumento de grânulos de pigmentos nas

células do epitélio pigmentado da retina, além de alterações citoplasmáticas.

Kim et al. (2006) não evidenciaram alterações histológicas na retina após a

administração de triancinolona intravítrea em olhos de coelhos, o que corrobora

com os resultados obtidos em nosso trabalho.

O presente estudo utilizou-se apenas de animais sadios, com olhos

normais, para que qualquer efeito adverso pudesse ser atribuído à droga ou ao

preservativo álcool benzílico, injetados na cavidade vítrea, e não a uma

patologia prévia, como inflamações intra-oculares, que talvez pudessem alterar

a farmacocinética da droga. Os efeitos adversos como glaucoma, toxicidade e

catarata, devem ser complementados com novas investigações, principalmente

com relação ao tempo de seguimento e ao número de animais envolvidos no

estudo. Também se torna necessário um estudo comparativo da eficácia entre

as duas drogas em seres humanos, no tratamento do edema macular

diabético, por exemplo, já que houve diferença estatisticamente significativa

entre os grupos no sétimo dia de estudo.

6. CONCLUSÕES

__________________________________________

Conclusões

_____________________________________________________________________________________

O presente estudo mostrou que a formulação contendo triancinolona e

preservativo álcool benzílico (TACP) apresentou níveis de concentração de

droga maiores que a da formulação sem preservativo (TASP), apenas no

sétimo dia de estudo, e que no restante do período estudado, o comportamento

entre as formulações foi semelhante.

O procedimento de injeção intravítrea de triancinolona, que já é bastante

utilizado no tratamento de doenças do segmento posterior do olho em

humanos, mostrou-se um método seguro para se obter níveis terapêuticos da

droga na cavidade vítrea de olhos de coelhos.

Não foram evidenciados sinais de toxicidade retiniana, que pudessem ter

sido causados pela presença da triancinolona e/ou do preservativo álcool

benzílico na cavidade vítrea, após a realização de ERG e histopatologia. A

função da retina e seu aspecto anatômico mantiveram-se preservados ao final

do vigésimo oitavo dia de avaliação

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

__________________________________________

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Intravitreal Triamcinolone Acetonide: A Morphological Study. Retina; 5: 531-6,

2006.

8. ANEXO

__________________________________________

ANEXO

_____________________________________________________________________________________

ANEXO 1

APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

ANEXO DE PUBLICAÇÃO

__________________________________________

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

Vitreous pharmacokinetics and retinal toxicity comparative study of preserved

and non preserved triamcinolone in rabbits eyes

RC Oliveira

*, R Jorge

, RC Siqueira

, MA Bonini-Filho

, A Haddad

, FM Damico

, A

Maia-Filho

, PTB Crispim

, AS Cunha-Jr

Department of Ophthalmology, Otohrinolaryngology Head and Neck Surgery, School

of Medicine of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.

Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Agents, School of

Medicine of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.

Department of Ophthalmology, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.

Faculty of Veterinary Medicine, University of Rio Preto, São José do Rio Preto, São

Paulo, Brazil.

Department of Mathematics, Federal University of Rondônia, Porto Velho, Rondônia,

Brazil.

Faculty of Pharmacy, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas

Gerais, Brazil.

*Corresponding author. Tel.: 55-69-3229 2929; Fax: 55-69-3229 1820

E-mail address: [email protected]

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

ABSTRACT

Purpose: To compare the intravitreous pharmacokinetic profile of benzyl alcohol

triamcinolone acetonide formulation (TA-BA) versus preservative-free triamcinolone

acetonide formulation (TA-PF), and evaluate potential signs of toxicity to the retina.

Methods: A total of 60 New Zealand male white rabbits, divided in two groups, were

studied. In TA-BA group, 30 rabbits received 4mg (0,1ml) of preservative benzyl

alcohol triamcinolone acetonide formulation into the vitreous of the right eye. In TA-PF

group, 30 rabbits received 4mg (0,1ml) of preservative-free triamcinolone. The

intravitreal drug levels were determined in 25 animals from each group by high-

performance liquid chromatography (HPLC). The toxicity of the intravitreal injections

was evaluated in five animals from each group by electroretinography (ERG) and by

light microscopy. Results: Median intravitreal concentrations of TA-BA-(µg/mL) were

1903.1, 1213.0, 857.8, 442.0, 248.6 at 3,7,14, 21 and 28 days after injection. Intravitreal

concentrations of TA-PF-(µg/mL) were 1032.9, 570.1, 516.6, 347.9, 102.8 at 3,7,14, 21

and 28 days after injection. At 7 days after injection, the median triamcinolone

intravitreous concentration in TA-BA group was higher than the mean concentration in

TA-PF group. TA half-lives observed were 8,166 ± 1,287 days in TA-BA group, and

7,995 ± 2,793 days in TA-PF group. There was no evidence of toxic effects on both

groups based on histological and ERG findings. Conclusions: Our findings showed that

preservative benzyl alcohol triamcinolone acetonide formulation, and preservative-free

triamcinolone acetonide formulation had different vitreous concentration just at 7 days

after injection. No toxic reactions in the retina were observed in both groups.

Keywords: Triamcinolone; Preservative benzyl alcohol; Vitreous pharmacokinetics

Retina.

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

INTRODUCTION

The treatment of posterior segment diseases of the eye is to a significant extent

limited by the difficulty in delivering effective doses of drugs to the vitreous, retina and

choroid

1,2

. Some chronic diseases need a prolonged treatment and, regarding the

posterior tissues of the eye, the difficult is to delivery the active drug to this region.

Topical delivery is not effective due to the limited intraocular penetration. Chronic

systemic administration may be effective but has numerous side effects, especially with

corticosteroid therapy. Intravitreal injections of drugs maintain the therapeutic level of

the agent without systemic side effects

3-5

Intravitreal administration of triamcinolone acetonide has been widely used for

the treatment of eye diseases including edema secondary to diabetic retinopathy, central

and branch retinal vein occlusion

, Irving-Gass Syndrome

1,2,7

, uveits

3,6,7

, choroidal

neovascularization associated with age related macular degeneration

7-9

, and proliferative

vitreoretinopathy

3,10

. Unfortunately, there have been reports of sterile endophthalmitis

11-14

and vision loss thought to be related to the preservative and/or dispersion agent

15,16

In the present study, the intravitreous pharmacokinetic profile of benzyl alcohol

triamcinolone acetonide formulation, and preservative-free triamcinolone acetonide

formulation was compared, and evaluated potential signs of toxicity to the retina.

MATERIALS AND METHODS

Sixty male New Zealand white rabbits, weighting approximately 2.0 to 2.5 Kg,

were studied. Throughout the observation period, the animals were maintained at the

animal facility of the Faculty of Veterinary Medicine of the University of Rio Preto, São

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. They were kept in a quiet and climatically

controlled environment, with free access to standard rabbit chow and water.

Experiments were carried out in accordance with the guidelines set forth by the

Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) statement for the use

of animals in ophthalmic and vision research. The study was approved by the Ethics

Committee for Animal Experimentation of the School of Medicine of Ribeirão Preto,

University of São Paulo.

Surgical Procedures

The animals were divided into two groups. In group I, 4 mg of benzyl alcohol

triamcinolone acetonide formulation 40 mg/ml (TA - Kenalog® Bristol-Myers, EUA)

were injected into the vitreous of the right eye of 25 rabbits. In group II, 25 rabbits

received 4 mg of preservative-free triamcinolone acetonide formulation 40 mg/ml (TA-

PF - Ophthalmos® São Paulo, Brazil).

The rabbits were anesthetized with an intramuscular injection of 30 mg/Kg

ketamine hydrochloride (Ketamin®, Cristália, Brazil – 50 mg/ml) and 4 mg/Kg xylasine

hydrochloride (Coopazine®, Schering-Plough Coopers, Brazil – 20 mg/ml). The ocular

surface was then anesthetized by topical instillation of 1% proparacaine ophthalmic

drops (Anestésico®, Allergan). The pupils were dilated with 1 drop each of

phenilephrine hydrochloride (2.5% w/v) and tropicamide (0.5% w/v). At baseline,

clinical eye examination was performed, and after adequate anesthesia and akinesia

were obtained, the right eye was injected 1 mm behind the surgical limbus in the

superotemporal quadrant with 0.1 ml of either benzyl alcohol triamcinolone acetonide

formulation (Kenalog®) and preservative-free triamcinolone acetonide formulation

Anexo de Publicação

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(Ophthalmos®). Anterior chamber paracentesis was performed to reduce the intraocular

pressure in all rabbits.

Five animals of each group were were euthanized with an overdose of

intravenous thiopental (Thiopentax®, Cristália, Brazil) 100 mg/Kg at 3, 7, 14, 21 e 28

days following injection and their right eyes were immediately enucleated. The vitreous

of 25 animals of each group were completely removed and frozen at -18

C until the

triamcinolone concentrations were determined.

Drug Level Analysis

The intravitreal drug levels were determined by high-performance liquid

chromatography (HPLC). The equipment used was Waters, pump 515, automatic

injector 717 plus, UV detector 2487-dual lambda absorbance, software Millenium



v.2.15.01 (Nova-Pak



, Waters, USA). A C-18 column (5µm; 3.9 x 150 mm) was also

used for separation. The flow rate used was 0.6 ml/min with a mobile phase of 60% of

acetonitrile and 40% of water by the volume.

The amount of triamcinolone was expressed as triamcinolone equivalent

concentration (µg/ml).

TA-BA and TA-PF Granulometry

Triamcinolone granules size from both formulations were evaluated by Hydro

2000S(A), da Malrven Instruments Ltd., Malvern, UK.

Anexo de Publicação

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Clinical Examination

Clinical evaluation included ocular inspection and binocular indirect

ophthalmoscopy (Topcon®, Tokio, Japan) preoperatively and at 3, 7, 14, 21, and 28

days after injection, in all animals, and was done by two blinded observers.

The intraocular pressure (IOP) of the experimental eyes was measured in five

animals of each group at baseline and at 3, 14 and 28 days after injection using

TonoPen® (Mentor, US).

Electroretinographic Study

Retinal function was evaluated in both eyes of another 5 animals of each group

at baseline and at 27 days after injection by electroretinography (ERG) using a LKC

model EPIC 2000 unit with a Ganzfeld flash unit (VPA-10, Cadwell), in accordance

with the International Society of Electrophysiology of Vision (ISCEV). Scotopic ERGs

were performed after at least 30 minutes of dark adaptation and photopic ERGs were

performed at a frequency of 30 Hz after at least 10 minutes of light adaptation.

Histopathologic Study

Five rabbits from each group, used for ERG analysis, were killed at 28 days for

histopathologic analysis. The experimental eyes were enucleated and then prepared for

light and electron microscopy.

The eyes were hemisected at the equator and their posterior segments were fixed

in 2% formaldehyde plus 2%glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2, for 4

hours, at 4

C. After washing in buffer, small pieces were fixed in 1% osmium tetroxide

in 0.1 M phosphate buffer for 2 hours, at 4

C. They were then dehydrated in graded

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

ethanol, cleared in propylene oxide and embedded in Epon 812 resin. Semi thin sections

(0.5µm) were stained with Toluidine blue for examination by light microscopy (Carl

Zeiss®, Germany). If any change was detected at light microscopy, electron microscopy

(Philips®, EM 208, EUA) would then be performed.

Statistical Analysis

The Mann-Whitney non parametric test was used to compare intravitreal

triamcinolone levels. The same test was used to study IOP in both groups. For all tests,

the level of significance was set at α = 0.05, two tailed.

RESULTS

In vivo Release Study

The triamcinolone concentration in the vitreous along 28 days of evaluation is

presented in Figures 6 and 7. Median intravitreal concentrations of TA-BA-(µg/mL)

were 1903.1, 1213.0, 857.8, 442.0, 248.6 at 3,7,14, 21 and 28 days after injection.

Intravitreal concentration of TA-PF-(µg/mL) were 1032.9, 570.1, 516.6, 347.9, 102.8 at

3,7,14, 21 and 28 days after injection. Median benzyl alcohol triamcinolone acetonide

(TA-BA) vitreous concentration was higher than preservative-free triamcinolone

acetonide (TA-PF) only 7 days after injection. In other study periods, there was no

statistically significant difference in TA vitreous concentrations between both groups

(Figures 1 and 2). The half-lives of triamcinolone in TA-BA group and TA-PF group

were found to be 8,166 ± 1,287 and 7,995 ± 2,793 days, respectively (Figure 10).

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

TA-BA and TA-PF Granulometry

Triamcinolone particles’ size analysis showed that TA-PF granules had smaller size

when compared to TA-BA ones. (Figures 8 and 9)

Clinical Examination and IOP analysis

Mild hyperemia was noticed under eye inspection immediately after injection in

all rabbits. After day-one study period, no inflammatory signs were noticed under eye-

inspection in any rabbit from both groups. Indirect ophthalmoscopy did not show

evidence of drug toxicity in the animals from both groups during the 28 days period of

the study. There was no endophthalmitis, retinal detachment or cataract after injections.

There was a significant increase in intraocular pressure immediately after

intravitreal injection of TA and at 3 days after the procedure in both groups (p<0,05).

The statistical analysis of IOP between TA-BA group and TA-PF group showed no

significance at any study period (p>0,05) (Figure 3).

Electroretinography Study

By ERG, no signs of retinal toxicity were observed in the experimental eyes of

any 5 animals of each group. At 27 days, the A-wave amplitude and the B-wave

amplitude were not significantly different from baseline (Figures 4, 5 and 6).

Histopathologic Study

Histopathologic examination of the experimental eyes showed no signs of retinal

toxicity or inflammatory cell infiltration. No structural abnormalities were noted at day

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

28 by light microscopy and the normal anatomy of the retina was preserved in both

groups (Figure 7).

DISCUSSION

The present study showed a statistically significant difference between TA-BA

and TA-PF concentrations 7 days after injection, when TA-BA (group I) was higher

than TA-PF (group II). This quicker initial clearance of triamcinolone may be related to

smaller triamcinolone granules from TA-PF, facilitating its clearance, although in

previous reports using a different TA-PF formulation, vitreous levels of TA-BA and

TA-PF were not significantly different

Intravitreal triamcinolone levels from both formulations shows variability

regarding the same group and study period. This variation has been verified elsewhere

and is related to drug shaking and aspiration bias intrinsic to the procedure

. This also

may also explain our 3-day triamcinolone dosage of less than 2 mg of TAAC in both

groups, when compared to the ~3,5mg reported by Kim for both formulations at the

same study period (estimated data according to elimination rate constant). As a

consequence, extrapolated TA half-lives from both formulations (TA-PF: 7,995 ±

2,793; TA-BA: 8,166 ± 1,287 days) were also lower than the ones reported by Kim

(TA-PF: 24 days; TA-BA: 23 days). However, since the procedures in both groups were

performed by the same experienced retinal surgeon, using an adequate number of

animals

7,23,34,35

, bias regarding the intravitreal injection were equalized, allowing precise

conclusions mainly regarding comparative analysis.

No difference on intraocular pressure was verified between both groups;

however a significant increase on intraocular pressure occurred in both groups

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

immediately and at 3 days after injection. Similar increase on intraocular pressure was

verified by Kai et al.

in rabbits, and by Thompson (2006)

, in humans, although

rabbits have less susceptibility to develop secondary ocular hypertension due to

corticosteroids when compared to humans. Although, McGee et al.

did not observe a

significant IOP increase after IVTA in rabbits eyes. In addition, cataract is also an

important complication of intraocular steroids

31,37,38

and was not observed in the present

study probably due to the short follow-up period.

The present study showed no clinical signs of toxicity regarding both TA

formulations. There was also no signs of retinal toxicity after ERG and histopathologic

studies. Accordingly, Kim et al.

also studied histopathologic and ERG results after

intravitreal injections of preservative benzyl alcohol triamcinolone acetonide

formulation and preservative-free triamcinolone acetonide formulation in rabbits eyes,

and observed no toxicity signs. However, Yu et al.

observed histopathologic

alterations after intravitreal triamcinolone injection in rabbits eyes.

In summary, both TA formulations show similar vitreous pharmacokinetics on

normal rabbit eyes, except for a higher decrease on TA levels 7 days after TA_PF

injection, probably related to TA-PF granules size. Both TA were well tolerated and did

not lead to any retina toxicity.

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Anexo de Publicação

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Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

FIGURES LEGENDS

Figure 1- In vivo profile of triamcinolone concentration after intravitreal injections. A

comparative box-plot graphic between group I (TA-BA) and group II (TA-PF).

Figure 2- Comparative kinetic curve between group I (TA-BA) and group II (TA-PF).

Figure 3- Comparative IOP box-plot graphic between group I (TA-BA) and group II

(TA-PF).

Figure 4- Representative electroretinography of an eye receiving preservative benzyl

alcohol triamcinolone acetonide formulation (TA-BA – group I) at baseline (left) and at

27 days after injection (right).

Figure 5- Representative electroretinography of an eye receiving preservative-free

triamcinolone acetonide formulation (TA-PF – group II) at baseline (left) and at 27 days

after injection (right).

Figure 6- ERG statistical analysis. There was no statistical difference in B-wave

amplitude between the preoperative period and 27 days after injection, in both groups

(R = right eye; L = left eye).

Figure 7- Semi thin section of the retina of a group I rabbit (A = 28 days after TA-BA

injection; B = control / left eye) and a group II rabbit (C = 28 days after TA-PF

injection; D = control / left eye).

Figure 8- TA-BA representative granulometry

Figure 9- TA-PF representative granulometry

Figure 10- Comparative TA half-lives curve between group I (TA-BA) and group II

(TA-PF).

Anexo de Publicação

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Figure 1

Figure2

Anexo de Publicação

____________________________________________________________________________________

Figure 3

Figure 4

Anexo de Publicação

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Figure 5

Figure 6

Anexo de Publicação

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Figure 7

Anexo de Publicação

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Figure 8

Figure 9

Anexo de Publicação

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Figure 10

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