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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Expressão dos antígenos “Cancer/Testis” MAGEA4
(CT 1.4) e MAGEC1 (CT 7.1) em carcinoma
espinocelular de cavidade oral
JOSÉ RAPHAEL DE MOURA CAMPOS MONTORO
Ribeirão Preto
2008
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JOSÉ RAPHAEL DE MOURA CAMPOS MONTORO
Expressão dos antígenos “Cancer/Testis” MAGEA4
(CT 1.4) e MAGEC1 (CT 7.1) em carcinoma
espinocelular de cavidade oral
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo, para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Morfofisiologia de
Estruturas Faciais.
Orientador: Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede
Ribeirão Preto
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Montoro, José Raphael de Moura Campos
Expressão dos antígenos “Cancer/Testis” MAGEA4 (CT 1.4) e MAGEC1
(CT 7.1) em carcinoma espinocelular de cavidade oral.
Ribeirão Preto, 2008.
98p.: il.; 30cm
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP – Programa: Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de
Cabeça e Pescoço.
Orientador: Mamede, Rui Celso Martins
1. Antígenos de Neoplasias,
2.
Imuno-histoquímica,
3.
Imunoterapia, 4.
Marcadores Biológicos, 5. Câncer da Boca
FOLHA DE APROVAÇÃO
José Raphael de Moura Campos Montoro
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo, para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Morfofisiologia de
Estruturas Faciais.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _____________________________________________________
Assinatura:_____________________________________________________
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Paulo e Maria Aparecida, em especial à minha mãe (em
memória), meu exemplo de vida, por sempre me estimular a questionar e
buscar repostas e me ensinar o caminho da verdade.
À minha esposa Fabiana, pelo estímulo, compreensão e todo amor emanado
dela.
Aos meus irmãos, Maria Paula e Mario Paulo, por sempre me apoiarem.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede, por todo
ensinamento, experiência e oportunidade oferecida neste tempo. Minha
admiração e gratidão.
Aos Profs. Drs. Marco Antônio Zago e Luciano Neder Serafini, pela valiosa
contribuição na realização deste trabalho, sem eles essa Dissertação não seria
possível.
Aos Profs. Drs. Francisco Veríssimo Mello Filho e Hilton Marcos Alves
Hicz, pelos ensinamentos transmitidos ao longo desse tempo.
Ao Prof. Dr. Luiz de Souza, responsável pela análise estatística, deste e de
outros trabalhos.
Ao Dr. Fabiano P. Saggioro, pela importante ajuda na leitura das lâminas.
Aos médicos assistentes, Marco Antônio Chahud Sabsud, João Virgilio
Piton Francese, Gerson Felisbino dos Reis, Lineu Celso Vigário, Luis
Carlos Conti de Freitas e Gustavo Cavalvanti Dutra Eichenberger, pela
amizade, apoio e formação acadêmica.
Aos meus padrinhos, Bira e Raquel, pelo apoio nas minhas várias idas a
Ribeirão Preto.
Aos amigos e companheiros de pós-graduação, Daniel Hardy Melo, André S.
Lucas, David Livingstone e Rogério Tiveron, pela amizade e união nos
momentos de dificuldade.
Aos funcionários do Arquivo de Patologia, Cesar Alberto Brigato Junior e
Décio Antônio Barrionovo Filho, que fizeram toda a recuperação das lâminas
e dos blocos de parafina.
A técnica do laboratório, Maria Paula Montiani Scandar, pelo apoio técnico-
científico na realização das reações imuno-histoquímicas.
Ao pessoal da secretaria, Rita, Amélia e Rogério e em especial para a
Cecília, que muito me ajudou na elaboração desta Dissertação.
Aos médicos residentes e ex-residentes da Divisão de Cirurgia de Cabeça e
Pescoço do HCFMRP-USP, pela amizade.
Ao Projeto GENCAPO, por todo o apoio técnico-científico.
A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização este
trabalho.
APOIO FINANCEIRO
FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo
LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
LISTA DE ABREVIATURAS
Lista de Abreviaturas
ADAM2- do inglês “metallopeptidase domain 2”
Antígenos CTA- do inglês Cancer/Testis Antigens
bFGF- do inglês “basic Fibroblast growth factor”
BRDT- do inglês “bromodomain testis-specific”
CDI- do inglês “cyclin-dependent kinase inhibitor”
CDK2- do inglês “cyclin-dependent kinase-2”
CEC- carcinoma espinocelular
CT 1.4- do inglês “Cancer/Testis” n° 1.4, sinônimo de MAGEA4
CT 7.1- do inglês “Cancer/Testis” n° 7.1, sinônimo de MAGEC1
CT-X- antígeno CT localizado no cromossomo X
CT não-X- antígeno CT localizado fora do cromossomo X
DNA- ácido desoxirribonucleico
EGFR- do inglês “Epidermal Growth Factor Receptor”
EDTA- etileno diamino tetra acético
HCFMRP-USP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo
HE- hematoxilina e eosina
HIF- do inglês “hypoxia-inducible factor”
IHQ- imuno-histoquímica
IC- intervalo de confiança
kDA- quilodalton
MAGEA4 - do inglês “melanoma antigen ”, família A4
MAGEC1- do inglês “melanoma antigen”, família C1
MHD- do inglês “MAGE homology domain”
Lista de Abreviaturas
MMPs- do inglês “matrix metalloproteinase”
µ
µµ
µm- micrômetro
mM- milimol
NJ- Nova Jersey
NY- Nova York
OMS- Organização Mundial da Saúde
PBS- do inglês “Phosphate Buffer Saline” ou solução salina tamponada
pet-CT- do inglês “positron emission tomography” – “computer tomography”
pH- potencial hidrogeniônico
pRb- Proteína do retinoblastoma
RT-PCR- Reverse Transcription – Polimerase Chain Reaction
SKIP- do inglês “SKI-interacting protein”
TGF-β- do inglês “transforming growth factor β”
TNM- Tumor Node Metastasis (classificação dos tumores malignos)
UICC- International Union Against Cancer
UK- Reino Unido
USA- Estados Unidos da América
VEGF- do inglês “Vascular Endothelial Growth Factor”
LISTA DE FIGURAS
Lista de Figuras
Figura 1: Controles com tecido de testículo para o anticorpo 57B (aumento de
100x). (A) Controle positivo. (B) Controle negativo. .............................................. 47
Figura 2: Controles com tecido de testículo para o anticorpo CT7-33 (aumento
de 100x). (A) Controle positivo. (B) Controle negativo. ......................................... 48
Figura 3: Expressões do anticorpo 57B (aumento 100x). (A) Imunomarcação
classificada com 1+. (B) Imunomarcação 2+. (C) Imunomarcação 3+. (D)
Imunomarcação 4+. .............................................................................................. 55
Figura 4: Expressões do anticorpo CT7-33 (aumento 100x). (A)
Imunomarcação classificada zero. (B) Imunomarcação 1+. (C) Imunomarcação
2+. (D) Imunomarcação 4+. .................................................................................. 57
Figura 5: Representação gráfica da curva de sobrevida independentemente da
expressão ............................................................................................................. 60
Figura 6: Representação gráfica das curvas de sobrevida das expressões
negativa e positiva do anticorpo 57B. ................................................................... 61
Figura 7: Representação gráfica das curvas de sobrevida das expressões
negativa e positiva do anticorpo CT7-33. .............................................................. 62
LISTA DE TABELAS
Lista de Tabelas
Tabela 1: Distribuição de freqüências das variáveis relacionadas ao paciente. ... 51
Tabela 2: Distribuição de freqüências das variáveis relacionadas ao tumor. ....... 52
Tabela 3: Distribuição de freqüências das variáveis histopatológicas. ................. 53
Tabela 4: Distribuição de freqüências das imunomarcações do anticorpo 57B. .. 54
Tabela 5: Distribuição de freqüências das imunomarcações do anticorpo CT7-
33. ......................................................................................................................... 56
Tabela 6: Distribuição de freqüências das variáveis com os níveis da
expressão do anticorpo 57B e valores de p do teste exato de Fisher. .................. 58
Tabela 7: Distribuição de freqüências das variáveis com os níveis da
expressão do anticorpo CT7-33 e valores de p do teste exato de Fisher. ............ 59
RESUMO
Resumo
Montoro, J.R.M.C. Expressão dos antígenos “Cancer/Testis” MAGEA4
(CT1) e MAGEC1 (CT7) em carcinoma espinocelular de cavidade oral. 98f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Com base na diversidade de resultados clínicos e de comportamento tumoral,
os pesquisadores procuram antígenos tumorais que possam servir como
fatores prognósticos e preditivos, ou como imunoterápico, em pacientes com
carcinomas espinocelulares (CEC) de cavidade oral. Objetivo: O presente
estudo visa identificar a expressão imuno-histoquímica dos antígenos CT
MAGEA4 e MAGEC1 nesses tumores, analisar a correlação da expressão com
variáveis relacionadas ao paciente e ao tumor e comparar as curvas de
sobrevida global naqueles que expressam e que não expressam estes
antígenos. Materiais e Métodos: Obteve-se dos blocos de parafina cortes
seriados representativos do tumor que foram marcados com os anticorpos 57B
(MAGE A-4) e CT 7-33 (MAGE C1) para análise da imunomarcação.
Resultados: A expressão do antígeno CT MAGEA4 foi de 56,5% e do
MAGEC1 foi de 47,8%. Não houve relação significante entre a expressão
gênica e as variáveis estudadas, tão pouco houve diferença entre as curvas de
sobrevida. Discussão: Sabe-se que a influência da expressão dos antígenos
CT depende do verdadeiro papel deles na carcinogênese, papel esse que
ainda não está definido. A ausência de significância estatística entre a
expressão dos antígenos CT com as variáveis estudadas e com a sobrevida,
provavelmente, é devida ao tamanho da amostra. Conclusões: O MAGEA4 foi
expresso em 56.5% e o MAGEC1 em 47,8%. Pelo menos um dos antígenos
CT foi expresso em 78,3% dos casos e a sua expressão não teve relação com
as variáveis estudadas, nem com as curvas de sobrevida.
Palavras chave: Antígenos de Neoplasias, Imuno-histoquímica, Imunoterapia,
Marcadores Biológicos, Câncer da Boca.
ABSTRACT
Abstract
Montoro, J.R.M.C. Expression of Cancer/Testis antigens MAGEA4 (CT1) e
MAGEC1 (CT7) in oral squamous cell carcinoma. 2008. 98f. Dissertation
(Master´s Degree) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto.
Given the diversity of clinical results and tumoral behavior, researchers look for
tumoral antigens that can serve as prognostic and predictive factors or as
immunotherapeutic agents in patients with squamous cell carcinoma (SCC) of
the oral cavity. Objective: The present study aims at identifying the
immunohistochemical expression of MAGEA4 and MAGEC1 CT antigens in
these tumors; analyzing the correlation of the expression with variables related
to the patient and the tumor, and comparing overall survival curves in those
tumors that express MAGEA4 and MAGEC1 and those which do not. Material
and Methods: Seriate cuts of the tumor obtained from the paraffin block were
stained with 57B antibody (MAGE A-4) and CT 7-33 (MAGE C1) for
immunomarker analysis. Results: The expression of the MAGEA4 CT antigen
was 56,5% and of MAGEC1 was 47,8%. There was no significant reaction
between the genic expression and the studied variables, nor any difference in
the survival curves. Discussion: It is known that the influence of the expression
of CT antigens depends on their actual role on carcinogenesis. This role,
however, is still not defined. The lack of statistical significance among the CT
antigen expression, the studied variables and survival is probably due to the
size of the sample. Conclusions: MAGE A-4 was expressed in 56.5% and
MAGE C-1 in 47,8%. At least one of the antigens was expressed in 78,3% of
the cases and its expression was not related to the studied variables nor to
survival curves.
Key-words: Tumor Antigens, Immunohistochemistry, Immunotherapy,
Biological Markers, Mouth Neoplasms
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 17
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 22
2.1. Epidemiologia ..................................................................................................... 23
2.2. Comportamento Biológico do CEC de Cavidade Oral ......................................... 26
2.3. Marcadores Tumorais ......................................................................................... 28
2.4. Antígenos CT...................................................................................................... 33
2.5. Expressão dos Antígenos CT nos Diversos Tumores ......................................... 35
2.6. Função dos Antígenos CT .................................................................................. 36
2.7. Os Antígenos CT: MAGEA4 e MAGEC1. ............................................................ 38
3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 40
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 42
4.1. Casuística ........................................................................................................... 43
4.2. Diagnóstico e Estadiamento ............................................................................... 44
4.3. Tratamento e Seguimento .................................................................................. 44
4.4. Reações Imuno-histoquímicas ............................................................................ 45
4.5. Análise das Reações .......................................................................................... 48
4.6. Aquisição das Fotomicrografias .......................................................................... 49
4.7. Comissão de Ética e Pesquisa ........................................................................... 49
48. Análise Estatística ............................................................................................... 49
5. RESULTADOS ................................................................................................. 50
5.1. Descrição da Amostra ........................................................................................ 51
5.2. Análise Microscópica .......................................................................................... 53
5.3. Analise Imuno-histoquímica ................................................................................ 54
5.4. Relação da Expressão dos Anticorpos com as Variáveis Relacionadas ao
Paciente e ao Tumor.......................................................................................... 57
5.5. Análise da Sobrevida Segundo a Expressão dos Anticorpos .............................. 60
6. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 63
6.1.
Expressão do MAGEA4 e MAGEC1 ................................................................... 64
6.2.
Relação da Expressão dos Antígenos CT com as Variáveis Clínico-patológicas 66
6.3.
Expressão dos Antígenos CT e a Sobrevida ...................................................... 69
7. CONCLUSÕES ................................................................................................. 71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 73
9. ANEXOS ........................................................................................................... 83
10. ANEXO DE PUBLICAÇÃO
1. INTRODUÇÃO
Introdução
18
O comportamento biológico do carcinoma espinocelular (CEC) de
cavidade oral é incerto, pois há tumores iniciais que mostram comportamento
agressivo, com metástase regional precoce e baixa sobrevida e, ao contrário,
existem tumores que mesmo avançados demoram a se metastatizar e seus
portadores cursam, após o tratamento, por longos períodos, livres da doença
(KADEMANI et. al., 2005). Com base nessa diversidade de resultados clínicos
e de comportamento tumoral, os pesquisadores procuram fatores prognósticos
e preditivos em pacientes com CEC de cavidade oral. Porém, até hoje, não há
concordância na literatura, no que diz respeito aos resultados, isto é, os fatores
relacionados ao paciente (idade, sexo, raça, condições sócio-econômicas,
tabagismo e etilismo), ao tumor (sítio, estadio, espessura do tumor e análise
histopatológica) e ao tratamento (tipo de tratamento, terapia adjuvante) são
considerados de importância limitada para prever o comportamento biológico
tumoral
(OLAZS, SZABÓ, HORVÁTH, 1998; HOWALDT et al., 1999;
BÀNKFALVI; PIFFKÒ, 2000; BETTENDORF, PIFFKÒ, BÀNKFALVI, 2004;
KUSTNER, COSTA, LÓPEZ, 2004; NÉMETH et al., 2005;).
Atualmente, sabe-se que os únicos fatores que influenciam a sobrevida
são: o comprometimento das margens de ressecção cirúrgica e a metástase
cervical
(MONTORO et al., 2008), sendo a presença de metástase cervical o
fator prognóstico capaz de provocar redução em cerca de 50% na sobrevida
dos pacientes
(GRANDI, ALLOSSIO, MOGLIA, 1985; SHAH, 1990). No
entanto, muitas vezes, esse fator somente é detectado depois do planejamento
terapêutico ter sido realizado, ou seja, depois da cirurgia.
O estudo científico do câncer humano está em uma fase sem
Introdução
19
precedentes, em que os elementos genéticos e moleculares alterados estão
sendo determinados. Essas descobertas foram possíveis graças à recente
evolução nas técnicas de genética molecular, que têm permitido a identificação
de alterações do DNA e das proteínas presentes nos tumores. Atualmente,
sabe-se que os tumores resultam de uma série de passos genéticos que
envolvem alterações de vários genes, essas são desencadeadas por
carcinógenos. Essas alterações, com interpretação e aplicabilidade, ainda não
atingiram amplo domínio. A compreensão desses fundamentos da biologia
molecular torna-se indispensável, pois poderão permitir toda a visão da
patologia, etiologia e, principalmente, da terapêutica do câncer.
Em estudo recente, Figueiredo et al. (2006), analisando antígenos
tumorais específicos (MAGE-1, 4, 10, 12, BAGE, GAGE, LAGE, NYESO-1 e
PRAME) verificaram que esses são expressos em proporções variáveis (6,1 a
48,5%) em CEC de cabeça e pescoço e que em 66,6% dos casos ocorre a
expressão de pelo menos um desses antígenos, sendo que esta expressão se
correlaciona com tumores avançados. Esses resultados nos motivaram na
continuação deste estudo, na busca por expressões desses antígenos em
diferentes sítios de tumores da cabeça e pescoço. Como a técnica da imuno-
histoquímica tem maiores vantagens e, principalmente, maior aplicabilidade
clínica que a Reverse Transcription – Polimerase Chain Reaction (RT-PCR),
passamos a utilizá-la.
Os “Cancer/Testis Antigens” (antígenos CT) formam um grupo de genes
com padrão de expressão típico. São expressos numa variedade de neoplasias
malignas, mas não em tecidos adultos normais, exceto nas células
Introdução
20
germinativas dos testículos
(BOON; OLD, 1997). Daí o termo “antígenos
expressos em câncer e testículos (antígenos CT)” ou “Cancer/Testis Antigens”.
Os antígenos CT são compostos, atualmente, por 44 famílias de genes, com 89
genes individuais ou isoformas.
Entre as 44 famílias de antígenos CT, 19 se demonstraram capazes de
induzir resposta imune em humanos (humoral e/ou celular) (KUROPKAT et al.,
2002). Devido a esse padrão de expressão (expressos em vários tecidos
tumorais e não expressos em tecidos normais) e à capacidade de induzir
resposta imune, os antígenos CT são considerados como potenciais antígenos
alvo para uma vacina contra o câncer. MAGEA e NYESO-1 já são estudados
como potenciais vacinas para o câncer, planejadas para estimular células T
contra tumores. Essas vacinas contêm um ou outro desses antígenos e se
demonstraram capazes de induzir resposta celular e humoral nos ensaios
clínicos a ponto de pequenos grupos de pacientes tratados com elas terem
mostrado benefícios clínicos após a imunização (SCHLIEPHAKE, 2003).
Devido à importância dos antígenos CT como alvos para vacina contra o
câncer, são necessários estudos detalhados da expressão dos antígenos CT
numa variedade de cânceres humanos.
Apesar de todo o conhecimento da função dos antígenos CT em células
normais e malignas, esse ainda é rudimentar e fragmentado. Já está claro que
seus produtos influenciam em diversos processos celulares, incluindo vias de
sinalização, transcrição, translação e recombinação cromossomal, mas ainda
faltam estudos para definir todas as funções dos antígenos CT, tanto nas
células normais quanto nas células em carcinogênese. Recentes estudos
Introdução
21
indicam que a expressão de MAGE pode contribuir para o fenótipo maligno e
que a hiperexpressão de MAGEA2 ou MAGEA6 leva à aquisição de resistência
às drogas quimioterápicas Paclitaxel e Doxirrubicina em células humanas
(TANIURA, KOBAYASHI, YOSHIKAWA, 2005). Por outro lado, há indícios de
que alguns antígenos CT contribuam diretamente para a inibição da apoptose.
A expressão do gene MAGEA4, avaliada por RT-PCR em câncer de
cabeça e pescoço é de 51,5% (PIVOT-PAJOT et al., 2003), porém a expressão
do MAGEA4 ainda não foi avaliada por imuno-histoquímica (IHQ) (anticorpo
57B) nesses tumores, além de nunca ter sido realizada avaliação isolada dos
carcinomas de cavidade oral.
O MAGEC1 também é um CT-X, sua localização é Xq26 e sua função
ainda é desconhecida. Seu antígeno induz resposta imune somente humoral e
é identificado no estudo imuno-histoquímico pelo anticorpo CT7-33. A sua
expressão é variável nos diversos tipos de tumores, podendo variar de 70% em
melanoma a 10% em tumor de cólon. A expressão em câncer de cabeça e
pescoço, analisada por RT-PCR, é de 36% (BUSSO et al., 2005), e, assim
como no MAGEA4, não existe nenhum estudo de expressão por imuno-
histoquímica em câncer de cavidade oral isoladamente.
Acreditamos que somente com melhor entendimento da carcinogênese e
melhor compreensão dos mecanismos alterados dos tumores é que poderá
haver mudanças nesse quadro. Dominando esses conceitos, poderemos ter
melhores informações preditivas, antecipação do diagnóstico, estabelecer
terapia individualizada e, possivelmente, novas formas de terapias voltadas
para as alterações genéticas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
Revisão de Literatura
23
2.1. Epidemiologia
O câncer de cavidade oral está entre as neoplasias mais freqüentes de
cabeça e pescoço. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), são
cerca de 390 mil novos casos por ano, se somados os casos de cânceres de
cavidade oral com os de orofaringe (STEWART; KLEIHUES, 2003). No Brasil,
excluindo o de pele, o câncer oral e o de orofaringe representam a quinta
incidência entre os homens (9,2% dos casos de câncer) e a sétima entre as
mulheres (3,6% dos casos), com um total de 6,7 % de todos os casos
(WÜNSCH FILHO, 2002). No mundo, considerando somente o câncer de
cavidade oral, é o sexto tipo mais comum entre os homens e o oitavo entre as
mulheres (PARKIN et al., 2005).
Estimam-se para 2008, no Brasil, 10.380
casos novos entre os homens e 3.780 casos novos entra as mulheres, gerando
um total de 14.160 casos novos de câncer de boca, correspondendo à taxa de
incidência de 11 casos em 100.000 homens e 3,88 casos em 100.000 mulheres
(INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER-COORDENAÇÃO DE PREVENÇÃO E
VIGILÂNCIA, 2008).
Os cânceres de cavidade oral se distribuem de forma irregular na
população brasileira, assim, a região Sudeste é a que apresenta maior
incidência desse tipo de câncer em todo o Brasil; sua taxa de incidência é de
15,21 casos em 100.000 homens e 4,64 em 100.000 mulheres. Em seguida,
aparece a região Sul, com taxa de incidência de 14,38 em 100.000 homens e
3,66 em 100.000 mulheres e, depois, a Centro-Oeste (incidência de 7,74 em
100.000 homens e 3,27 em 100.000 mulheres). Por fim, vem a região Nordeste
e o Norte, com incidências de 5,93 em 100.000 homens e 3,62 em 100.000
Revisão de Literatura
24
mulheres (Nordeste) e 3,23 em 100.000 homens e 1,61 em 100000 mulheres
(região Norte)
(INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER-COORDENAÇÃO DE
PREVENÇÃO E VIGILÂNCIA, 2008).
A incidência desse câncer no Brasil varia, ainda, de acordo com a
cidade. Assim, São Paulo é a que têm maior incidência, 25,3 casos em 100.000
homens e 4,9 em 100.000 mulheres (padronizados pela idade), sendo essa a
maior incidência da América (WÜNSCH FILHO, 2002). Em segundo lugar, está
Porto Alegre, com 15,9 casos em 100.000 homens e 1,8 em 100.000 mulheres.
Com a menor incidência está a cidade de Goiânia (9,3 em 100.000 homens e
2,3 em 100.000 mulheres).
A taxa de incidência mundial (em 100.000 habitantes) é em média de 5,6
entre os homens e 3,2 entre as mulheres, sendo 11,2 entre os homens nas
regiões mais desenvolvidas do planeta e 4,4 nas regiões menos desenvolvidas.
Para as mulheres, a incidência é de 4,3 nas regiões mais desenvolvidas e 2,9
nas regiões menos desenvolvidas. Essa incidência se distribui de maneira
muito heterogênea, como ocorre no território nacional, havendo regiões com
incidências extremamente altas e outras com baixas. Há regiões do planeta,
como na Austrália e Nova Zelândia, África do Sul, Centro-Sul Asiático e Oeste
Europeu, em que a incidência de câncer de boca, padronizada pela idade, varia
de 8,6 a 40,9 casos em 100.000 homens. Já na Austrália e Nova Zelândia,
Centro-Sul Asiático, alguns países do leste da África e do Oeste Asiático, a
variação no sexo feminino é de 3,3 a 26,3 casos por 100.000 mulheres. Por
outro lado, há regiões em que a incidência no sexo masculino é menor que 2,6
casos em 100.000 homens (Leste Asiático, Norte, Oeste e Centro da África,
Revisão de Literatura
25
Sudeste Asiático e alguns países da América Central e do Norte da América do
Sul), e outras, como Leste Asiático, Norte, Oeste e Centro da África, Sudeste
Asiático e alguns países da América Central e do Leste da América do Sul, em
que a taxa de incidência no sexo feminino é menor que 1,3 (GLOBOCAN,
2002). Esse padrão de incidência reflete a influência de fatores de risco
específicos, como o tabaco e o álcool no Oeste e Sul da Europa e no Sul da
África e o betel no Centro-Sul e Sudeste Asiático. Na Austrália, a alta incidência
é decorrente do câncer de lábio, que tem relação estreita com a exposição
solar
(PARKIN et al., 2005).
Dentro dos tumores de cavidade oral, 95% são CEC, e os outros 5%
correspondem a sarcomas, linfomas e tumores de glândulas salivares (DIB,
2001).
Apesar dos avanços que ocorreram na cirurgia de cabeça e pescoço,
tanto nos novos métodos de diagnóstico por imagem (tomografia
computadorizada, ressonância nuclear magnética, pet-CT); como na
terapêutica, com técnicas de ressecção crânio-faciais, novas drogas
quimioterápicas e diferentes técnicas de radioterapia (hiperfracionada e
conformacional), o câncer de cavidade oral continua com prognóstico
desfavorável, com baixa sobrevida e com taxas de mortalidade elevadas e, o
que é pior, continua aumentando (OLAZS, SZABÓ, HORVÁTH, 1998;
GREENLEE et al., 2001; BETTENDORF, PIFFKÒ, BÀNKFALVI, 2004;
LOTHAIRE et al., 2006; MASSANO et al., 2006).
No Brasil, entre 1979 e 1998, as taxas de mortalidade variaram de 2,16
e 2,96 em 100.000 homens e entre 0,48 e 0,70 em 100.000 mulheres
Revisão de Literatura
26
(STEWART; KLEIHUES, 2003) e o incremento da mortalidade aumenta com
taxa anual de 0,72%
(WÜNSCH FILHO, 2002). No resto do mundo, a taxa de
mortalidade por 100.000 e ajustada para a idade é de 2,9 no sexo masculino e
1,5 no sexo feminino (PARKIN et al., 2005) e também está aumentando.
2.2. Comportamento biológico do CEC de cavidade oral
O comportamento biológico do CEC de cavidade oral é incerto, pois há
tumores iniciais que mostram comportamento agressivo, com metástase
regional precoce e baixa sobrevida, e outros, que mesmo avançados, demoram
a se metastatizar e esses pacientes cursam, após o tratamento, por longos
períodos livres da doença. Baseados nessa heterogeneidade de resultados
clínicos e de comportamento tumoral é que pesquisadores procuram fatores
prognósticos e preditivos em pacientes com CEC da cavidade oral. Porém, os
resultados, até hoje, não são concordes na literatura a ponto de os fatores
relacionados com o paciente (idade, sexo, raça, condições sócio econômicas,
tabagismo e etilismo), com o tumor (sítio, estadio, espessura do tumor e
análise histopatológica) e com o tratamento (tipo de tratamento, terapia
adjuvante) serem considerados de importância limitada para prever o
comportamento biológico tumoral (OLAZS, SZABÓ, HORVÁTH, 1998;
HOWALDT et al., 1999; BÀNKFALVI; PIFFKÒ, 2000; BETTENDORF, PIFFKÒ;
BÀNKFALVI, 2004; KUSTNER, COSTA, LÓPEZ, 2004; NÉMETH et al., 2005).
Atualmente, sabe-se que de todos os fatores, somente o comprometimento das
margens da ressecção cirúrgica e a metástase cervical influenciam na
sobrevida dos pacientes com CEC de cavidade oral
(MONTORO et al., 2008),
Revisão de Literatura
27
sendo a presença de metástase cervical o fator prognóstico capaz de, na sua
presença, provocar redução em cerca de 50% na sobrevida dos pacientes
(SHAH, 1990). No entanto, muitas vezes, esses fatores somente são
detectados depois do planejamento terapêutico ter sido realizado, ou seja,
depois da cirurgia.
Acreditamos que somente com melhor entendimento da carcinogênese e
melhor compreensão dos mecanismos alterados nos tumores é que poderá
haver mudanças neste quadro, pois dominando estes conceitos, poderemos ter
melhores informações preditivas, antecipação do diagnóstico, estabelecer
terapias individualizadas e, possivelmente, novas formas de terapias voltadas
para as alterações genéticas. Esses estudos têm gerado avanços e um rico e
complexo conjunto de conhecimentos, revelando ser o câncer uma doença que
envolve alterações dinâmicas do genoma (HANAHAN; WEINBERG, 2000).
Uma das maiores descobertas na biologia do câncer estabelece que a
carcinogênese é um processo de múltiplos passos de acumulação de
alterações genéticas, que liberam as células neoplásicas dos mecanismos
homeostáticos que regulam a proliferação celular normal, conferindo a elas
crescimento ilimitado e auto suficiente (HAHN; WEINBERG, 2002). A
progressão de uma lesão pré-neoplásica até franca neoplasia, com invasão e
metástase, é o resultado de sucessivas etapas de expansão clonal das células
somáticas ao adquirirem uma vantagem seletiva no crescimento, como
resultado de mutações em genes que controlam a proliferação e a morte
celular (NOWELL, 1976). Sabe-se que são necessários de seis a oito eventos
genéticos para a evolução de um clone de células resultando na aquisição de
Revisão de Literatura
28
um fenótipo maligno
(CALIFANO et al., 1996). As mutações levam à ativação
de proto-oncogenes, que estimula a proliferação celular descontrolada e a
inativação de genes supressores de tumor, resultando na inibição do controle
de proliferação e da morte celular (JORDAN; DALEY, 1997). Segundo
Hanahan e Weinberg (2000), são seis as alterações essenciais na fisiologia da
célula, que coletivamente ditam o crescimento maligno: auto-suficiência em
sinais de crescimento, insensibilidade a sinais inibitórios do crescimento (anti-
crescimento), evasão da morte celular programada (apoptose), angiogênese
sustentada, invasão tecidual e metástase. Essas alterações genéticas que
acompanham a progressão histopatológica de uma lesão pré neoplásica para o
câncer levam a modelos de expressão alterados e modificações na estrutura e
função de proteínas
(FEARON; VOGELSTEIN, 1990). As alterações que
ocorrem nas células cancerosas, comparadas com o tecido normal de origem,
podem ser detectadas por biópsia ou nos fluidos séricos e usados como
marcadores moleculares do câncer (SIDRANSKY, 2002).
2.3. Marcadores tumorais
Os marcadores tumorais, portanto, são atributos biológicos presentes
em células tumorais que as diferenciam das células normais. Cada um dos
passos que levam as lesões pré-neoplásicas às neoplasias malignas é
mediado por complexas vias moleculares e qualquer um dos seus
componentes em cada via são potenciais marcadores tumorais. Os marcadores
tumorais podem ser genes ou seus produtos que são expressos somente em
células tumorais, ou genes e seus produtos que são expressos em células
Revisão de Literatura
29
normais, mas estão expressos de forma aberrante nas células tumorais. São
várias as alterações dos genes que levam à produção de marcadores tumorais:
mutação pontual, amplificação gênica, rearranjo gênico e hiperexpressão.
Esses marcadores podem ser úteis em detectar cânceres em estadios iniciais,
avaliar carga tumoral, monitorar a progressão da doença, determinar a
resposta à terapia, orientar o segmento do paciente e definir terapias anti-
tumorais específicas
(SIDRANSKY, 2002).
Os marcadores tumorais podem ser divididos em quatro grupos, de
acordo com sua função, ou seja, aqueles que promovem: crescimento tumoral;
supressão tumoral; angiogênese, invasão tumoral e potencial metastático e
resposta imune.
Os Marcadores moleculares envolvidos no crescimento tumoral,
proliferação e apoptose, são:
- Receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR, Her-2/neu,
c-erb 3-4): É um receptor transmembrana, mediador de sinais que
resultam numa complexa cascata de vias de sinalização que
influenciam na proliferação celular normal, diferenciação e atividade
mitogênica
(SMITH; HAFFTY, 1999).
- Ciclina D1: É um proto-oncogene considerado importante que atua
durante o ciclo celular, controlando a progressão em G1 (SMITH;
HAFFTY, 1999). A alteração mais comumente relatada da Ciclina D1 é
sua amplificação gênica (11q13) que leva à expressão de uma proteína
Revisão de Literatura
30
estruturalmente normal, mas que em altos níveis leva a célula a um
estado de proliferação incontrolável
(LOTHAIRE et al., 2006).
- Antígeno Ki 67 (MIB-1): É um anticorpo monoclonal que se liga a uma
proteína que é expressa durante as fases G1, S e G2 do ciclo celular.
Existe uma relação diretamente proporcional entre a porcentagem de
células marcadas para Ki 67 no momento da cirurgia e o estadio TNM
(FUMIC-DUNKIC et al., 2003).
- Bcl-2: É uma proteína anti-apoptótica que faz parte do sistema
regulatório do ciclo celular e da apoptose. Alterações nos genes
relacionados com a apoptose podem ter importante papel na
progressão tumoral e na eficácia de terapia citotóxica e radioterápica
(WILSON et al, 2001).
- Fas/FasL: São importantes mediadores de apoptose. O antígeno Fas
é uma proteína de superfície da célula que aciona, em grande parte,
através da ativação da caspase 3, a apoptose na ligação com o seu
ligante FasL. A caspase 3 é uma proteína que atua após a cascata de
transdução do sinal apoptótico (RHEINWALD et al, 2002). O antígeno
Fas é um membro da família das proteínas receptoras de superfície
celular, ao passo que o FasL pertence à família do fator de necrose
tumoral
(CHEN et al., 1999).
- C-myc: A família de genes myc codifica proteínas que se ligam no
núcleo celular e iniciam o processo de divisão celular. C-myc é
ativado por amplificação gênica ou por hiperexpressão do produto do
gene
(EVAN; LITTLEWOOD, 1993).
Revisão de Literatura
31
Os marcadores moleculares envolvidos na supressão tumoral são:
- p27: (Kip) é um inibidor da quinase dependente de ciclina (CDI), um
membro do grupo Cip/Kip, que regula negativamente a progressão da
fase G1 do ciclo celular pela ligação Ciclina E / complexo quinase
ciclina-dependente-2 (CDK2)
(CHOI et al., 2001). É ativado em
resposta a sinais extracelulares como inibição por contato, TGF-β
(KAPRANOS et al., 2001), AMP cíclico e drogas inibitórias do
crescimento (rapamicina)
(MINETA et al., 1999). A redução da
expressão de p27 está associada com a progressão tumoral em
leucoplasias
(HIRAI et al., 2003).
- p53: É um gene supressor de tumor e de aberrações. É a mais comum
alteração genética no câncer oral. A proteína p53, codificada por esse
gene, é uma fosfoproteína de 53 kDA e 393 aminoácidos que tem
importante papel no controle do ciclo celular, atuando como fator na
transcrição, na estabilidade genômica, na diferenciação celular e na
apoptose
(WHYTE, BROTON, SHILLITOE, 2002) Normalmente, essa
proteína é importante na regulação negativa do ciclo celular após
lesão das células, como em exposição à radiação
(PICKSLEY; LANE,
1994).
- Proteína do retinoblastoma (pRb): Essa proteína é o fator chave para
o controle da fase G
1
do ciclo celular. A desregulação da pRb origina
aberrações em várias proteínas celulares como CD
1
e CDK
4
, que é o
mecanismo necessário para o desenvolvimento dos cânceres oral e
faríngeo (SCHLIEPHAKE, 2003).
Revisão de Literatura
32
Os marcadores moleculares envolvidos na angiogênese tumoral são:
- Família do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF): Ao
menos seis membros dessa família foram identificados, incluindo
VEGF-A - fator de permeabilidade vascular, fator de crescimento
placentário, VEGF-B/VEGF - fatores relacionados, VEGF-C/VEGF -
proteínas relacionadas, VEGF-D/c-fos – fator de indução do
crescimento e VEGF-E. A VEGE e o fator básico de crescimento de
fibroblastos (bFGF) são mitogênicos e quimiotáticos para células
endoteliais e são conhecidos por se acumularem no local da
angiogênese
(CHANG et al., 2002).
- Fatores induzidos por hipóxia (HIF 1α e HIF 2α): São proteínas
chaves para a resposta ao estímulo hipóxico. A mucosa existente na
região da cabeça e pescoço não mostra nenhuma reatividade para
esses dois fatores. No entanto, em linhagens celulares de câncer oral,
a hipóxia é um mecanismo que aumenta a regulação de VEGF e HIF
2α
(MOHAMED et al., 2004). Em CEC de cabeça e pescoço, a
hiperexpressão de HIF 1α e HIF 2α estão significativamente
associadas com a alta densidade microvascular e a expressão de
VEGF, resultando em resposta incompleta à quimioterapia e pobre
sobrevida livre de doença e pequena sobrevida geral
(KOUKOURAKIS
et al., 2002).
Revisão de Literatura
33
Os marcadores moleculares envolvidos na invasão tumoral e no
potencial metastático são:
- Metaloproteinases da matriz (MMPs): É uma família de
metaloenzimas que está envolvida no remodelamento e degradação
da matriz extracelular. A família de MMPs está subdividida em
colagenases, gelatinases, stromelisinas, MMP como stromelisina,
MMPs tipo membrana e novas MMPs
(KUROPKAT et al., 2002). Foi
mostrado que as células malignas são capazes de usar as MMPs
para ajudar a quebrar a membrana basal e degradar o estroma
intersticial, facilitando assim a invasão tumoral ou a metastatização
(SCHLIEPHAKE, 2003).
Os marcadores moleculares envolvidos na resposta imune: Nessa
classe de marcadores tumorais inclui a família dos “Antígenos Câncer/Testis
(antígenos CT)”, que é o principal alvo deste estudo.
2.4. Antígenos CT
Os Antígenos CT formam um grupo de genes com um padrão de
expressão típico. São expressos numa variedade de neoplasias malignas e não
são expressos em tecidos adultos normais, exceto nas células germinativas
dos testículos (BOON; OLD, 1997), daí o termo “antígenos expressos em
câncer e testículos (antígenos CT)”. Os antígenos CT são compostos,
atualmente, por 44 famílias de genes com 89 genes individuais ou isoformas.
Revisão de Literatura
34
A identificação do primeiro antígeno CT se deu por meio de cultura de
células tumorais usadas como alvo para o reconhecimento imunológico por
anticorpos e células T do próprio paciente, que tinha melanoma. O antígeno
identificado foi então chamado de antígeno de melanoma (melanoma antigen –
MAGE 1) e a partir daí, com o desenvolvimento de novas técnicas laboratoriais,
seguiram-se o MAGE 2, MAGE 3 até chegar nos 44 antígenos CT
(KNUTH et
al., 1989). Entre as 44 famílias de antígenos CT, 19 demonstraram serem
capazes de induzir resposta imune em humanos (humoral e/ou celular)
(SCANLAN, SIMPSON, OLD, 2004). Devido a esse padrão de expressão
(expressos em vários tecidos tumorais e não expressos em tecidos normais) e
à capacidade de induzir resposta imune, os antígenos CT são considerados
como potencial alvo para uma vacina contra o câncer. MAGEA e NY-ESO-1 já
são estudados como vacina para o câncer planejado para estimular células T
contra tumores. Essas vacinas contêm um ou outro desses antígenos e têm
demonstrado serem capazes de induzir resposta celular e humoral nos ensaios
clínicos e um pequeno grupo de pacientes tratados com essa vacina
mostraram benefícios clínicos após a imunização (DAVIS et al., 2004). Com a
importância dos antígenos CT como alvos para vacina contra o câncer serão
necessários, ainda, estudos detalhados da expressão desses antígenos CT
numa variedade de cânceres humanos.
Os antígenos CT podem ser divididos entre aqueles que são codificados
no cromossomo X (antígenos CT-X) e aqueles que não são codificados no
cromossomo X (antígenos CT não-X). Vinte e dois dos 44 antígenos CT são
CT-X, incluindo os principais antígenos candidatos à vacina anti-câncer, e são
Revisão de Literatura
35
expressos em tecido testicular normal nas espermatogônias, enquanto os CT
não-X são expressos nas fases tardias da espermatogênese
(JUNGBLUTH, et
al., 2000).
2.5. Expressão dos Antígenos CT nos Diversos Tumores
Análises de publicações que descrevem a freqüência de expressão de
genes CT foram utilizadas para gerar um perfil de expressão de 41 dos 44
genes CT em 16 tipos diferentes de cânceres, baseados na análise de RT-PCR
(SCANLAN et al., 2002). Cânceres de bexiga, mama, cólon, pulmão, próstata,
rins e melanoma foram avaliados quanto à expressão de mais de 20 famílias
de genes CT, enquanto que cânceres esofágico, gástrico, de cabeça e
pescoço, de ovário, em leucemia/linfoma, carcinoma hepatocelular e sarcoma o
foram quanto à expressão de 10-20 famílias e, por fim, cânceres pancreático e
cerebral tiveram a expressão estudada em menos de 10 genes CT. Os
tumores, assim analisados, foram classificados em: alto expressores de genes
CT (quando havia expressão em mais de 50% das famílias avaliadas),
moderado expressores (quando havia expressão entre 30-50% das famílias
avaliadas) e baixo expressores de genes CT (quando a expressão era entre
20-30% das famílias avaliadas). Para uma família de gene CT ser considerada
expressa em determinado tumor, ela deveria ser expressa em mais de 20%
dos espécimes do tumor.
De acordo com esses critérios, no grupo em que foram avaliadas mais
de 20 famílias de gene CT, os cânceres de bexiga, de pulmão e o melanoma
foram considerados alto expressores, enquanto que os cânceres de mama e de
Revisão de Literatura
36
próstata moderado expressores e o câncer renal e de cólon baixo expressores
de genes CT. No grupo em que foi avaliada a expressão de 10-20 famílias, o
carcinoma hepatocelular foi considerado alto expressor; os cânceres de
esôfago, de cabeça e pescoço, de ovário e os sarcomas moderado
expressores e o câncer gástrico e a leucemia/linfoma baixo expressores de
genes CT. O câncer de cabeça e pescoço foi avaliado como um grupo único,
pois, não foi avaliado separadamente cada tipo de câncer de cada região
anatômica. Nesse grupo, as cinco famílias de genes CT expressas (das 15
famílias avaliadas) foram: MAGEC1/CT 7.1 (36% de espécimes expressas),
MAGEE1/CT 10 (36%), SSX2/CT 5.2 (35%), MAGEA1/CT 1.1 (28%),
TDRD1/CT 41.1 (22%)
(SCANLAN et al., 2002).
2.6. Função dos Antígenos CT
Apesar dos antígenos CT-X estarem no centro do desenvolvimento de
vacinas experimentais para o câncer, sua função, tanto nas células
germinativas quanto nos tumores é pouco conhecida. A questão central é se
sua expressão contribui para a carcinogênese ou se é somente um produto
irrelevante no processo de transformação celular decorrente de alterações da
cromatina. Indícios têm mostrado que a expressão de antígenos CT como o
MAGE, pode ter papel fundamental na tumorigênese
(SIMPSOM et al., 2005). A
família MAGE, composta por 25 componentes, é caracterizada por uma região
central chamada de domínio homólogo MAGE (MHD) e os estudos mostram
que esse domínio é um importante sítio de interação proteína-proteína
(TANIURA, KOBAYASHI, YOSHIKAWA, 2005). Os genes CT-X produzem
Revisão de Literatura
37
ainda, exclusivamente, a proteína reguladora da transcrição (SKIP), capaz de
promover a interação DNA-proteína que ativa ou reprime a transcrição. Além
disso, eles participam de várias vias de sinalização como a da vitamina D,
ácido retinóico, estrógenos, glicocorticóides, NOTCH 1, transformando o fator
de crescimento β
(Laduron, et al., 2004).
Na via NOTCH 1, o gene MAGEA1 foi encontrado rompendo SKIP
mediadora do sinal de transdução, portanto nessa via, esse gene atua como
repressor transcricional (JUNGBLUTH et al., 2000). A função do MAGEA1 nas
linhagens germinativas não está muito bem elucidada, mas está claro que atua
através da SKIP. É provável também que MAGEA1 reprime a expressão de
genes responsáveis pela diferenciação celular que é uma importante
contribuição para a tumorigênese
(SIMPSOM et al., 2005).
O MAGEA4 foi identificado, na busca de parceiros de ligação da
oncoproteína gankirim. Essa oncoproteína desestabiliza o gene supressor de
tumor retinoblastoma, contribuindo para a desprogramação da entrada e da
saída no ciclo celular gerando interrupção do ciclo e da apoptose
(LI; TSAI,
2002). Parece que genes MAGE codificam moléculas reguladoras
multifuncionais que exercem variados efeitos. Outro exemplo é o necdim,
membro da família MAGE, é um potente supressor da proliferação celular
interagindo através do MHD com diversas oncopreoteínas e proteínas
supressoras de tumor, afetando assim a diferenciação celular (KUWAKO,
TANIURA, YOSHIKAWA, 2004). Recentes estudos indicam que a expressão
de MAGE pode contribuir para o fenótipo maligno e que hiperexpressão de
MAGEA2 ou MAGEA6 leva à aquisição de resistência a drogas
Revisão de Literatura
38
quimioterápicas, como Paclitaxel e Doxirrubicina, em células humanas (GLYNN
et al., 2004). Por outro lado, há indícios que antígenos CT contribuam
diretamente num crucial elemento da transformação maligna, ou seja, na
inibição da apoptose.
Os antígenos CT não X exibem várias funções, como, por exemplo, o
PLU-1, que é um co-repressor da transcrição
(TAN et al., 2003). O produto de
um outro gene CT não X, o BRDT, causa compactação da cromatina. Já o
TPX1 codifica a proteína que prende as células espermatogênicas ao redor das
células de Sertoli e a metaloproteinase ADAM2 participa da ligação do
espermatozóide ao óvulo
(EVANS, 2001; PIVOT-PAJOT et al., 2003; BUSSO et
al., 2005).
Todo o conhecimento da função dos antígenos CT em células normais e
nas malignas ainda é rudimentar e fragmentado; porém, é claro, que seus
produtos influenciam em diversos processos celulares, incluindo sinalização,
transcrição, translação e recombinação cromossomal. Faltam ainda estudos
para definir todas as funções dos antígenos CT, tanto nas células normais
quanto na carcinogênese.
2.7. Os Antígenos CT: MAGEA4 e MAGEC1
O gene MAGEA4 ou CT1-4 é um CT-X de localização Xq28, expresso
durante a maturação das células germinativas na espermatogônia e tem a
função de co-repressor translacional (van der BRUGGEN et al., 2001). O
antígeno MAGEA4 induz resposta imune humoral e celular. Antígenos
produzidos por esses genes são identificados no estudo imuno-histoquímico
Revisão de Literatura
39
pelo anticorpo 57B. A expressão do gene MAGEA4, avaliada por RT-PCR, em
câncer de cabeça e pescoço é de 51,5%
(FIGUEIREDO et al., 2006), porém a
expressão do MAGEA4 ainda não foi avaliada por imuno-histoquímica nesses
tumores, além de nunca se ter feito avaliação dos carcinomas de cavidade oral
isoladamente dos da cabeça e pescoço.
O MAGEC1, também é um CT-X e sua localização é Xq26, porém sua
função ainda é desconhecida. Seu antígeno induz resposta imune somente
humoral e é identificado no estudo imuno-histoquímico pelo anticorpo CT7-33.
A sua expressão é inconstante nos diversos tipos de tumores, podendo variar
desde 70% em melanomas a 10% em tumores do cólon. Sua expressão em
câncer de cabeça e pescoço, analisada por RT-PCR é de 28%
(ATANACKOVIC et al., 2006). Assim como no MAGEA4, não existe nenhum
estudo de expressão por imuno-histoquímica em câncer de cavidade oral
isoladamente.
3. OBJETIVOS
Objetivos
41
O presente estudo com carcinomas espinocelulares de cavidade oral
tem por objetivos:
1- identificar a expressão imuno-histoquímica dos genes MAGE A4
e MAGE C1;
2- analisar a correlação entre a expressão dos genes com variáveis
sócio-demográficas e características histológicas do tumor;
3- comparar as curvas de sobrevida global naqueles que
expressam e que não expressam.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
43
4.1. Casuística
De um total de 45 pacientes operados entre janeiro de 2001 a janeiro de
2006, foram recuperados 23 casos do Arquivo do Serviço de Patologia do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) que foram incluídos neste estudo.
Eram pacientes com CEC de cavidade oral tratados, inicialmente, com cirurgia
curativa no HCFMRP-USP. Os critérios de exclusão foram: pacientes com
tumor de lábio; com tumores que se estendiam além da cavidade oral e
aqueles que perderam o seguimento clínico, nesse período.
Os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (ANEXO 1), aceitando participarem do projeto Gencapo - Banco de
Tumores. Os dados do paciente (idade, sexo, tabagismo e etilismo), do tumor
(sítio, estadiamento clínico e TNM, grau de diferenciação, invasão vascular,
linfática e perineural, infiltrado inflamatório peri-tumoral) e da evolução clínica
foram inseridos no banco de dados. Para uniformizar esses dados, foram
elaborados formulários que eram preenchidos para cada paciente. Assim,
utilizou-se o “FORMULÁRIO DE CADASTRO DOS PACIENTES”, com a
identificação, endereço, diagnóstico, antecedentes pessoais, hábitos
relacionados com o câncer, história familiar de câncer; o “FORMULÁRIO DE
DADOS CLINICOS E LABORATORIAIS” com a história clínica, exame físico
com caracterização da lesão, dos linfonodos e metástase (quando existiam),
estadiamento clínico e informações sobre a terapêutica planejada;
“FORMULÁRIO ANATOMO-PATOLÓGICO” contendo os dados
histopatológicos fornecido pelo serviço de patologia e o estadiamento
Materiais e Métodos
44
patológico; e, por fim, o “FORMULÁRIO DE ACOMPANHAMENTO” com dados
dos exames físico e laboratorial durante o seguimento. As recidivas que
ocorreram, o seu tratamento e as informações sobre o óbito, quando acontecia,
eram anotados nesse questionário. Esses formulários estão no ANEXO 2 e
após o preenchimento dos mesmos, os dados eram transferidos para o site do
Projeto Genoma Clínico, www.compbio.ludwig.org.br/clinicalgenomics/.
4.2. Diagnóstico e Estadiamento
O diagnóstico do tumor era realizado por meio dos dados da história
clínica, do exame clínico e do exame anatomo-patológico da biopsia da lesão.
A tomografia computadorizada, o ultra-som e a ressonância magnética, ou uma
delas, podiam ser realizadas para avaliação da extensão tumoral e da
presença de nódulos cervicais. Todos os pacientes foram estadiados segundo
os critérios da International Union Against Cancer (UICC) de 2002 (SOBIN,
WITTEKIND, 2002).
4.3. Tratamento e Seguimento
Todos os pacientes foram submetidos à ressecção cirúrgica, com intuito
curativo, da lesão primária com margem de segurança, sob anestesia geral.
Durante o ato cirúrgico, colhia-se material para biopsia de congelação. Em
relação ao pescoço, o procedimento utilizado era o esvaziamento cervical de
necessidade, quando houvesse sinais clínicos ou radiológicos da presença de
metástase cervical ou esvaziamento eletivo para aqueles que apresentavam
tumores classificados de T2 a T4, sem sinais de metástase cervical. Pacientes
Materiais e Métodos
45
com tumores classificados como T4 ou que no exame histopatológico
apresentavam margens comprometidas, invasão angio-linfática ou perineural
ou metástase linfonodal em mais de um linfonodo, eram submetidos à
radioterapia pós-operatória.
Após o tratamento, os pacientes retornavam no 1º, 3º, 6º e 12º meses,
no primeiro ano e após, de 6/6 meses, para serem avaliados clinicamente. A
cada seis meses, nos primeiros dois anos, eram solicitadas, rotineiramente,
radiografias de tórax e endoscopia digestiva alta. Após os dois primeiros anos,
esses exames eram anuais.
4.4. Reações Imuno-histoquímicas
Em relação ao processamento tecidual imediato à cirurgia, as peças
cirúrgicas eram fixadas em formalina tamponada a 10% por um período não
superior a 48 horas. Uma vez clivadas, obtinha-se áreas representativas da
neoplasia, que eram então emblocadas em parafina para obtenção dos cortes
histológicos de 4µm de espessura. Esses cortes eram corados com
hematoxilina e eosina (HE). Após serem emblocados em parafina, eram
armazenados em caixas plásticas, e assim permaneceram por até seis anos.
Para cada caso, era selecionado um bloco representativo para a
realização das reações imuno-histoquímicas. Desses eram obtidos cortes
seriados de 4µm em lâminas com solução adesiva de 3-amino-propyltriethoxy-
silano (Sigma Chemical Co.
®
, St. Louis, MO/USA).
Os anticorpos utilizados para as reações imuno-histoquímicas foram:
Materiais e Métodos
46
MAGE A4 (57B, 1: 4.000 em tampão EDTA 1mM, pH 8,0 – Ludwig Institute,
NY) e MAGE C1 (CT 7-33, 1:32.000, solução de ácido cítrico 10mM, pH 6,0 –
Ludwig Institute, NY).
Para evitar reação endógena devido à presença de biotina e avidina,
foram utilizados polímero dextran e sistema de amplificação enzimática
NovoLink (Novocastra, UK). Resumidamente, cortes teciduais de 4µm foram
submetidos à recuperação antigênica pelo calor por 3 minutos em steamer,
com solução de ácido cítrico 10 mM/pH 6.0 para o CT7-33; e para o 57B com
solução de ácido cítrico 1mM/pH 8,0. O bloqueio da peroxidase endógena foi
realizado com solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 6%. A incubação
com o anticorpo primário foi feita a 37ºC em câmara úmida a 4ºC por 12 horas
(overnight). A incubação com anticorpo secundário, diluído em solução salina
tamponada (Phosphate Buffer Salina - PBS), foi realizada por 30 minutos a
37°C. Após lavagens em PBS, os cortes foram incubados por 30 minutos a
37
o
C com o sistema amplificador Novolink. Por fim, os cortes histológicos foram
lavados em água corrente por 10 minutos, contracorados com Hematoxilina de
Harris por 10 segundos, novamente lavados em água corrente, desidratados
em etanol e diafanizados em xilol. A montagem das lâminas foi realizada em
resina Permount (Fisher Scientific®, Fair Lawn, NJ/USA, cód. S15-100).
Para cada bateria de reação foram utilizados controles positivos com
tecido de testículo. Os controles negativos foram estabelecidos através da
omissão do anticorpo primário, que foi substituído por tampão PBS (“blank”)
(Figuras 1 e 2).
Materiais e Métodos
47
Figura 1. Controles com tecido de testículo para o anticorpo 57B (aumento de 100x).
(A) Controle positivo. (B) Controle negativo
.
Materiais e Métodos
48
Figura 2. Controles com tecido de testículo para o anticorpo CT7-33 (aumento de
100x). (A) Controle positivo. (B) Controle negativo.
4.5. Análise das Reações
As análises das reações foram realizadas em microscópio de múltipla
observação, por dois observadores independentes, patologistas cirúrgicos, com
experiência na área, que desconheciam a identidade dos casos. Os valores
foram definidos mediante consenso. As reações foram classificadas
subjetivamente quanto à extensão da imunomarcação em:
• Zero: até 5% das células neoplásicas marcadas;
• 1+: 6 – 25% das células neoplásicas marcadas;
• 2+: 26 – 50% das células neoplásicas marcadas;
Materiais e Métodos
49
• 3+: 51 – 75% das células neoplásicas marcadas;
• 4+: > 75% das células neoplásicas marcadas.
Para fins de análise estatística, não foram consideradas as intensidades
das reações. Foi considerada imunomarcação negativa quando nenhuma
célula neoplásica marcava ou quando a imunomarcação era em até 5% das
células neoplásicas e imunomarcação positiva quando mais de 5% das células
neoplásicas foram marcadas (classificação 1+, 2+, 3+ e 4+).
4.6. Aquisição das Fotomicrografias
Foi utilizado um sistema digital de aquisição de imagens da marca
ZEISS composto de microscópio Axioskop 2 plus, câmera digital Axiocam HRc
e o programa Axiovision 4.6.3. Para rodar o programa e guardar as imagens foi
utilizado um computador Satélite® INT modelo Pentium 4 intel®.
4.7. Comissão de Ética e Pesquisa
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, sob
o documento n° 7234/2007 (ANEXO 3).
4.8. Análise Estatística
Para a avaliação da relação de cada variável com as expressões do
MAGEA4 e MAGEC1 foi utilizado o teste exato de Fisher. Foram estimadas
curvas de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier para o grupo que
expressava e para o grupo que não expressava o antígeno e o teste aplicado
para compará-las foi o log-rank
(HOSMER; LEMESHOW, 1999).
5. RESULTADOS
Resultados
51
5.1. Descrição da Amostra
Após levantamento de todos os pacientes operados com CEC de
cavidade oral, a partir de 2001, e aplicação dos critérios de inclusão e
exclusão, foram selecionados 23 pacientes para o estudo. Todos tiveram seus
blocos de parafina recuperados no Serviço de Patologia do HCFMRP-USP e
estavam em boas condições para uso. Nessa amostra houve predomínio de
pacientes do gênero masculino (87%). A média da idade dos participantes era
de 55,3 anos, com desvio padrão de 9,7 anos. A menor idade era 29 anos e a
maior 72 anos, sendo que os percentis foram de P
25
=50 anos, e a mediana
(P
50
) de 54 anos e P
75
=60 anos. Pela história clínica, constatou-se que a
maioria dos pacientes era tabagista (91,3%) e etilista (74%), conforme descrito
na Tabela 1. Somando os dois hábitos, o tabagismo e o etilismo estavam
presentes, simultaneamente, em 74% da amostra.
Tabela 1. Distribuição de freqüências das variáveis relacionadas ao paciente (Sexo,
Idade, Tabagismo e Etilismo).
Variável
N° de pacientes
%
Sexo
Masculino 20 87
Feminino 3 13
Idade
< 60 anos 17 74
≥
60 anos
6 26
Tabagismo
Sim 21 91,3
Não 2 8,7
Etilismo
Sim 17 74
Não 6 26
Resultados
52
Na amostra estudada, a localização preferencial foi no assoalho da boca
e 65,2% já tinham metástase cervical. Em 47,8%, o estadiamento clínico foi
classificado como estadio IV (sendo que todos esses eram IVa), conforme
critérios da UICC de 2002, como mostra a Tabela 2.
Tabela 2. Distribuição de freqüências das variáveis relacionadas ao tumor
(Localização do tumor, Estadiamento T, Metástase cervical, Estadiamento clínico).
Variável
N° de pacientes
%
Localização do tumor
Língua
9 39,1
Gengiva
2 8,7
Trígono retromolar
1 4,4
Assoalho
11 47,8
Estadiamento T
T1 2 8,8
T2 13 56,4
T3 4 17,4
T4 4 17,4
Metástase cervical
Presente
15 65,2
Ausente
8 34,8
Estadiamento clí
nico
I 1 4,4
II 3 13
III 8 34,8
IV 11 47,8
Resultados
53
5.2. Análise Microscópica
O exame histopatológico de rotina com HE revelou, em relação ao grau
de diferenciação, que 52,2% dos tumores eram carcinomas espinocelulares
bem diferenciados e somente 4,3% eram pouco diferenciados. A invasão
vascular e linfática estava presente em 17,4%, enquanto que a peri-neural
ocorreu em 13% dos pacientes. O infiltrado inflamatório peri-tumoral estava
presente em 39,1%, sendo classificado como intenso em 8,7% dos tumores
analisados, conforme a Tabela 3.
Tabela 3. Distribuição de freqüências das variáveis histopatológicas (grau de
diferenciação, invasão vascular, invasão linfática, invasão peri-neural, inflamação peri-
tumoral) .
Variável
N° de pacientes
%
Grau de diferenciação
Bem diferenciado
12 52,2
Moderadamente diferenciado
10 43,5
Pouco diferenciado
1 4,3
Invasão vascular
Ausente
19 82,6
Presente
4 17,4
Invasão linfática
Ausente
19 82,6
Presente
4 17,4
Invasão peri
-
neural
Ausente
20 87
Presente
3 13
Inflamação p
eri
-
tumoral
Intenso 2 8,7
Moderado 7 30,4
Ausente 14 60,9
Resultados
54
5.3. Análise Imuno-histoquímica
A expressão dos antígenos CT MAGEA4 e MAGEC1 foi analisada por
IHQ através dos anticorpos que correspondem a esses antígenos, 57B e CT7-
33, respectivamente. As reações imuno-histoquímicas e a análise das reações
foram realizadas, conforme descrito na metodologia.
a) MAGEA4
A expressão do anticorpo 57B foi, preferencialmente, citoplasmática e
ocorreu conforme a freqüência mostrada na Tabela 4.
Tabela 4. Distribuição de freqüências das imunomarcações do anticorpo 57B.
Imunomarcação
N
%
Zero
10 43,5
1+
3 13,0
2+
2 8,7
3+
3 13
4+
5 21,8
Segundo os critérios adotados na metodologia, foi considerada como
expressão positiva para o anticorpo 57B a imunomarcação superior a 5% das
células, ou seja, nos casos com 1+ a 4+ (Figura 3), com isso, a expressão do
antígeno CT MAGEA4 em CEC de cavidade oral foi de 56,5%.
Resultados
55
Figura 3. Expressões do anticorpo 57B (aumento 100x). (A) Imunomarcação
classificada com 1+. (B) Imunomarcação 2+. (C) Imunomarcação 3+. (D)
Imunomarcação 4+.
b) MAGEC1
A expressão do anticorpo CT7-33 também foi, preferencialmente,
citoplasmática e teve a distribuição representada na Tabela 5.
Resultados
56
Tabela 5. Distribuição de freqüências das imunomarcações do anticorpo CT7-33.
Imunomarcação
N
%
Zero
12 52,2
1+
4 17,4
2+
3 13
3+
0 0
4+
4 17,4
Segundo os critérios estabelecidos, a expressão para o anticorpo CT7-
33 (expressão do antígeno CT MAGEC1) em CEC de cavidade oral foi de
47,8% (Figura 4).
Resultados
57
Figura 4. Expressões do anticorpo CT7-33 (aumento 100x). (A) Imunomarcação
classificada zero. (B) Imunomarcação 1+. (C) Imunomarcação 2+. (D) Imunomarcação
4+.
5.4. Relação da Expressão dos Anticorpos com as Variáveis Relacionadas
ao Paciente e ao Tumor.
Foi aplicado o teste exato de Fischer para verificar a significância
estatística entre a expressão dos anticorpos e as variáveis relacionadas ao
paciente (sexo, idade, tabagismo e etilismo) e ao tumor (estadio TNM, estadio
clínico, grau de diferenciação, invasão vascular, linfática e peri-neural e
infiltrado inflamatório peri-tumoral).
Resultados
58
a) Expressão do MAGEA4:
As relações da expressão do anticorpo 57B com as variáveis citadas não
apresentaram significância estatística, como mostra a Tabela 6.
Tabela 6. Distribuição de freqüências das variáveis com os níveis da expressão do
anticorpo 57B e valores de p do teste exato de Fisher.
Variável
Anticorpo 54B
negativo
Anticorpo 54B
positivo
Total
p
n
%
n
%
Sexo
Idade
Tabagismo
Etilismo
Estadio T
Metástase cervical
Grau de
diferenciação
Invasão vascular
Invasão linfática
Invasão peri-neural
Inflamação
peri-tumoral
Estadiamento
clinico
Feminino
Masculino
< 60 anos
≥ 60 anos
Não
Sim
Não
Sim
1
2
3
4
Presença
Ausência
Bem
Moderado
Pouco
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Intenso
Moderado
Ausente
I ou II
III
IV
2
8
7
3
2
8
3
7
1
6
2
1
6
4
5
5
0
9
1
10
0
9
1
1
3
6
3
4
3
66,7
40,0
41,2
50,0
100,0
38,1
50,0
41,2
50,0
46,2
50,0
25,0
40,0
50,0
41,7
50,0
0
47,4
25,0
52,6
0
45,0
33,3
50,0
42,9
42,9
75,0
50,0
27,3
1
12
10
3
0
13
3
10
1
7
2
3
9
4
7
5
1
10
3
9
4
11
2
1
4
8
1
4
8
33,3
60,0
58,8
50,0
0
61,9
50,0
58,8
50,0
53,8
50,0
75,0
60,0
50,0
58,3
50,0
100,0
52,6
75,0
47,4
100,0
55,0
66,7
50,0
57,1
57,1
25,0
50,0
72,7
3
20 0,560
17
6 1.000
2
21 0,178
6
17 1,000
2
13
4
4 0,919
15
8 0,685
12
10
1 1,000
19
4 0,604
19
4 0,104
20
3 1,000
2
7
14 1,000
4
8
11 0,249
Total
10
43,5
13
56,5
23
Resultados
59
b) Expressão do MAGEC1:
Nenhuma das variáveis estudadas mostrou significância estatística com
relação à expressão do anticorpo CT7-33 (Tabela 7), porém, as variáveis idade
(p=0,069) e invasão perineural (p=0,093) apresentaram resultados próximos da
significância (α=0,050).
Tabela 7. Distribuição de freqüências das variáveis com os níveis da expressão do
anticorpo CT7-33 e valores de p do teste exato de Fisher.
Variável
Anticorpo CT7
-
33
negativo
Anticorpo CT7
-
33
positivo
Total
p
n
%
n
%
Sexo
Idade
Tabagismo
Etilismo
Estadio T
Metástase cervical
Grau de
diferenciação
Invasão vascular
Invasão linfática
Invasão peri-neural
Inflamação
peri-tumoral
Estadiamento
clinico
Feminino
Masculino
< 60 anos
≥ 60 anos
Não
Sim
Não
Sim
1
2
3
4
Presença
Ausência
Bem
Moderado
Pouco
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Intenso
Moderado
Ausente
I ou II
III
IV
0
12
11
1
1
11
2
10
1
6
2
3
8
4
6
6
0
11
1
11
1
12
0
2
4
6
2
2
8
0
60,0
64,7
16,7
50,0
52,4
33,3
58,8
50,0
46,2
50,0
75,0
53,3
50,0
50,0
60,0
0
57,9
25,0
57,9
25,0
60,0
0
100,0
57,1
42,9
50,0
25,0
72,7
3
8
6
5
1
10
4
7
1
7
2
1
7
4
6
4
1
8
3
8
3
8
3
0
3
8
2
6
3
100,0
40,0
35,3
83,3
50,0
47,6
66,7
41,2
50,0
53,8
50,0
25,0
46,7
50,0
50,0
40,0
100,0
42,1
75,0
42,1
75,0
40,0
100
0
42,9
57,1
50,0
75,0
27,3
3
20 0,093
17
6 0,069
2
21 1,000
6
17 0,371
2
13
4
4 0,909
15
8 1,000
12
10
1 0,680
19
4 0,317
19
4 0,317
20
3 0,093
2
7
14 1,485
4
8
11 0,154
Total
12
52,2
11
47,8
23
Resultados
60
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0 20
40 60
Tempo (meses)
Curva de
sobrevida
5.5. Análise da Sobrevida Segundo a Expressão dos Anticorpos
a) Sobrevida geral independente da expressão
A curva de sobrevida global estimadas pelo método de Kaplan-Meier
mostrou uma sobrevida de 38% em cinco anos, como mostra a Figura 5.
Figura 5. Representação gráfica da curva de sobrevida
independentemente da expressão.
b) Expressão do MAGEA4:
Como mostrado na Tabela 4, treze pacientes (56,5%) apresentaram
expressão positiva para o anticorpo 57B. Foram estimadas curvas de sobrevida
pelo método de Kaplan-Meier para os pacientes que expressavam o 57B e
para os que não expressavam. A comparação das duas curvas de sobrevida
Resultados
61
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0 20
40 60
Tempo (meses)
57B - 57+
Curvas de sobrevida pela expressão do 57B
pelo teste log-rank não apresentou significância estatística p=(0,330). As
curvas de sobrevida estão representadas na Figura 6.
Figura 6. Representação gráfica das curvas de sobrevida das
expressões negativa e positiva do anticorpo 57B.
Onze pacientes apresentaram expressão do anticorpo CT7-33 positiva.
A probabilidade estimada de um paciente do grupo de expressão positiva ter
sobrevida de 60 meses é de 0,36 (IC 95%: 0,11-0,63), já a probabilidade
estimada de um paciente do outro grupo ter sobrevida de 61 meses é de 0,42
(IC 95%: 0,15-0,67). Apesar dessa diferença de probabilidades, após a
utilização do teste log-rank para comparação das curvas de sobrevida
estimadas pelo método de Kaplan-Meier, a mesma não apresentou
Resultados
62
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0 20
40
60
Tempo (meses)
CT7-33 -
CT7-33 +
Curvas de sobrevida pela expressão do CT7-33
significância estatística (p=0,43). As curvas de sobrevida estão representadas
na Figura 7.
Figura 7. Representação gráfica das curvas de sobrevida das
expressões negativa e positiva do anticorpo CT7-33.
6. DISCUSSÃO
Discussão
64
6.1. Expressão do MAGEA4 e MAGEC1
O tumor de cavidade oral é a quinta incidência de câncer nos homens e
o sétima nas mulheres (WÜNSCH, 2002), mas é a primeira incidência entre os
de cabeça e pescoço, com 14.160 casos novos estimados para 2008
(INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER-COORDENAÇÃO DE PREVENÇÃO E
VIGILÂNCIA, 2008). Apesar dos avanços ocorridos nas últimas décadas, as
taxas de mortalidade seguem aumentando (OLAZS, SZABÓ, HORVÁTH, 1998;
GREENLEE et al., 2001; BETTENDORF, PIFFKÒ, BÀNKFALVI, 2004;
LOTHAIRE et al., 2006; MASSANO et al., 2006). Para reverter esse quadro,
acreditamos que o entendimento da carcinogênese poderá fornecer indicativos
do nível de agressividade que o tumor terá, de tal forma, que uma terapêutica
mais agressiva possa ser usada para controlá-lo. Entre esses, os marcadores
teriam função importante. Devemos lembrar que algumas doenças hereditárias
que cursam com leucoplasia oral, como disceratose congênita (CONNOR et al.,
1986), são mapeadas no cromossomo X, o mesmo da família de genes MAGE,
o que permite imaginar a existência de alguma relação dessa lesão pré-
neoplásica com a expressão desses genes, confirmando a hipótese da
progressão tumoral.
As pesquisas ainda não descobriram um antígeno tumoral específico
que possa servir como marcador tumoral de prognóstico ou para o
desenvolvimento de uma vacina imunológica contra o câncer. Este é o primeiro
estudo que analisa a expressão do MAGEA4 e MAGEC1, antígenos tumorais
específicos, em CEC de cavidade oral, por imuno-histoquímica.
Discussão
65
Estudo prévio realizado por Figueiredo et al. (2006), analisou por RT-
PCR amostra de 33 CECs de cabeça e pescoço, de diversos sítios, e constatou
a expressão de MAGEA4 em 48,5% dos casos. Expressão de MAGEA4,
nesses níveis, também foi encontrada por Ries et al. (2005), ao estudarem 21
espécimes de CEC de cavidade oral por RT-PCR, tendo encontrado expressão
gênica de 57%. Esses resultados são similares aos encontrados neste
trabalho, em que a expressão do MAGEA4 foi de 47,8%, apesar dos métodos
de estudo terem sido diferentes.
O MAGEC1 também já foi avaliado previamente por RT-PCR.
Atanackovic et al. (2006) estudando uma série de antígenos CT em 51
espécimes de CEC de cabeça e pescoço constataram a expressão de
MAGEC1 em 28% dos casos. Em nosso estudo, a expressão do MAGEC1 foi
de 47,8%, maior do que a encontrada por Atanackovic et al. (2006). A diferença
de expressão do MAGEC1 encontrada não deve ser atribuída aos métodos de
estudo imuno-histoquímico e RT-PCR, já que, Sharma et al. (2006),
comparando a expressão de nove antígenos CT em carcinoma urotelial,
analisados por RT-PCR e por IHQ chegaram à conclusão de que as
expressões eram semelhantes com os dois métodos. Provavelmente, essa
discrepância entre os resultados obtidos nesse estudo e aqueles citados por
Atanackovic et al. (2006) seja devida ao fato de que as expressões das
proteínas dos genes apresentam heterogeneidade entre as diferentes áreas do
tumor. Esse fato já foi constatado por diversos estudos, ao verificarem que as
expressões variam de 5% até mais de 75% das células neoplásicas de um
mesmo tumor. (JUNGBLUTH et al., 2000; YAKIREVICH et al., 2003; PRASAD
Discussão
66
et al., 2004; SHARMA et al., 2006; HUDOLIN et al., 2006 a e b). Neste estudo,
61,5% dos casos que expressaram o 57B foram acima de 50% das células
neoplásicas e somente 36,4% dos casos que expressaram o CT7-33 foram em
mais de 50% das células neoplásicas, mostrando a heterogeneidade de
expressão desses antígenos. Atanackovic et al. (2006), analisando vários
estudos de expressão do MAGEA3, verificaram que essa variava de 27-45%,
demonstrando que esta heterogeneidade é vista também em outros antígenos
CT.
Em nossa amostra, a expressão dos antígenos CT estudados se
mostrou freqüente, pois em 78,3% dos pacientes, pelo menos um dos
antígenos foi expresso. Figueiredo et al. (2006) chegaram a resultado
semelhante ao encontrarem a expressão de pelo menos um antígeno CT, em
66,6% dos casos, e, no mesmo ano, Atanackovic et al. constataram que essa
expressão podia chegar a 86%. Esses resultados mostram que é possível
aplicar imunoterapia antígeno-específica em pacientes com CEC de cavidade
oral.
6.2. Relação da Expressão dos Antígenos CT com as Variáveis Clínico-
patológicas
Pouco se sabe da biologia molecular dos tumores e das funções dos
antígenos CT na progressão tumoral. A relação dos antígenos CT com
variáveis clínico-patológicas era pouco estudada; porém, ultimamente, tem sido
dada mais ênfase a esse tipo de análise, sem, no entanto, chegar ao consenso.
Discussão
67
Neste estudo não encontramos correlação significativa da expressão dos
antígenos CT com as variáveis clínico-patológicas estudadas. Apenas a idade
(p=0,069) e a invasão peri-neural (p=0,093) apresentaram tendência à
significância estatística, em relação à expressão do CT7-33. Por não haver
consenso a respeito da agressividade dos cânceres dos idosos e sabendo-se
que essa está presente quando a invasão peri-neural se manifesta,
imaginamos que esse seja um gene ligado à agressividade tumoral.
Confirmando nossa hipótese, Chitale et al. (2005) e Krüger et al. (2007)
constataram que a expressão do MAGEC-1 teve correlação significativa com o
grau do tumor e comportamento mais agressivo em tumores de ovário e de
mama.
A avaliação dos antígenos CT NY-ESO-1, MAGE-1 e MAGE-3, por RT-
PCR e IHQ, em CEC de cabeça e pescoço, realizada por Kienstra et al. (2003),
em 45 amostras, mostrou que não havia relação da expressão dos antígenos
CT com dados clínico-patológicos, como ocorreu neste estudo. Ries et al.
(2004), estudando MAGEA1 ao MAGEA6 em CEC de cavidade oral, também
não encontraram relação entre a expressão desde genes e grau de
diferenciação, tamanho do tumor, metástase linfonodal e estadio.
A relação da expressão dos antígenos CT com variáveis clínico-
patológicas também já foi estudada em outros tumores. Assim, a análise dos
antígenos CT MAGE-A1, MAGE-A3/4 e NY-ESO-1 em carcinoma de pênis e de
próstata não mostraram relação com características clínico-patológicas
(HUDOLIN et al., 2006 a e b).
Discussão
68
No estudo de Figueiredo et al. (2006), com CEC de cabeça e pescoço,
foi encontrada associação estatisticamente significante da expressão de
antígenos CT com o tamanho do tumor e o tabagismo. Quanto ao tamanho, os
autores verificaram que o gene MAGE-4 encontrava-se expresso em dezesseis
casos (48,5%), sendo que 43,8% eram tumores T4. A expressão em cada
estadiamento foi de 25% entre os tumores T1, 50% entre os T2, 43% entre os
T3 e 70% entre os T4. Quanto ao tabagismo, os autores constataram a relação
da quantidade de cigarros consumidos por dia com a expressão gênica. Esses
autores ainda verificaram que havia relação da expressão de MAGEA4 no
tumor primário com menor incidência de metástases linfonodais. Essas
afirmações nos levam a imaginar que o gene MAGEA4 participa na
carcinogênese reduzindo a agressividade tumoral, ao contrário do MAGEC1.
Por outro lado, em estudos com outros tumores, foi mostrado que no
carcinoma de bexiga e de vulva, a expressão do MAGEA4 estava
significantemente associada com estadio avançado, metástase linfonodal e
tumores de alto grau (KOCHER et al., 2002; BELLATI et al., 2007). Em tumores
de ovário, Yakirevich et al. (2003) observaram haver expressão de MAGEA4,
em tumores malignos, enquanto naqueles “borderline”, a expressão era rara e
nos benignos e no tecido normal não o expressavam, mostrando uma
correlação entre a expressão do MAGEA4 e a progressão tumoral. Em
contrapartida, alguns outros estudos estão apontando para um efeito de
supressão tumoral com a expressão dos antígenos CT. Estudos mostraram
que o MAGEA4 foi capaz de induzir supressão da atividade tumorigênica em
Discussão
69
carcinomas de fígado (NAGAO et al., 2003) e promover apoptose no carcinoma
pulmonar que não pequenas células (PEIKERT et al., 2006).
Novos estudos serão necessários para determinar o papel dos antígenos
CT na carcinogênese e sua relação com variáveis clínico-patológicas,
principalmente, porque a dificuldade em coletar e acompanhar os pacientes
para realizar esse tipo de estudo faz com que a análise recaia sobre um
pequeno número de participantes, dificultando a interpretação dos resultados.
6.3. Expressão dos Antígenos CT e a Sobrevida
O papel da expressão dos antígenos CT na sobrevida ainda é incerto e
poucos são os estudos que analisam essa relação. Na literatura, encontramos
trabalhos que não demonstram a influência da expressão dos antígenos CT na
sobrevida, outros, em que essa expressão diminui a sobrevida e, por fim,
aqueles em que a expressão aumenta a sobrevida.
Neste estudo, as curvas de sobrevida dos pacientes com expressão
positiva foram comparadas com as de expressão negativa, pelo teste log-rank,
para os dois marcadores, e não encontramos diferença estatisticamente
significante. Resultados semelhantes obtiveram Bellati et al. (2007), analisando
45 casos de câncer de vulva, ao estudar os antígenos CT MAGEA1, MAGEA4
e NYESO-1.
Já na análise da relação dos antígenos CT com sobrevida em outros
tumores, Kocher et al. (2002) e Yakirevich et al. (2003) mostraram que a
expressão do MAGEA4 estava relacionada com a piora da sobrevida global e
específica em câncer de ovário e bexiga, respectivamente. Por outro lado,
Discussão
70
outros estudos mostram que a expressão de antígenos CT está relacionada
com melhor prognóstico. Assim, o MAGEC1 em tumores de mama (KRÜGER
et al., 2007), e o CT10 em carcinoma urotelial (SHARMA et al., 2006)
mostraram relação com melhor sobrevida livre de doença e melhor sobrevida
global, respectivamente.
Como podemos observar, os resultados são contraditórios, talvez pelos
estudos terem sido realizados com diferentes tipos de tumores ou com
amostras pequenas. O que sabemos é que a influência da expressão dos
antígenos CT depende do verdadeiro papel deles na carcinogênese, papel
esse, que ainda não está definido. Serão, pois, necessárias mais pesquisas,
com amostras adequadas e estudos prospectivos para definir a verdadeira
influência da expressão dos antígenos CT na sobrevida de pacientes com
câncer.
7. CONCLUSÕES
Conclusões
72
Com base na análise efetuada em carcinoma espinocelular de boca,
concluímos:
- O MAGE A-4 foi expresso em 56.5% e o MAGE C-1 em 47,8%.
- Pelo menos um dos antígenos CT MAGEA4 e MAGEC1 foi
expresso em 78,3% dos casos, e a sua expressão:
- não tem relação com as variáveis estudadas;
- nem com as curvas de sobrevidas.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas
74
ATANACKOVIC D., BLUM I., CAO Y., WENZEL S., BARTELS K., FALTZ C.,
HOSSFELD D.K., HEGEWISCH-BECKER S., BOKEMEYER C., LEUWER R.
Expression of Cancer-Testis Antigens as Possible Targets for Antigen-Specific
Immunotherapy in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Cancer Biology
& Therapy, 2006; 5(9): 1218-1225.
BÀNKFALVI A., PIFFKÒ J. Prognostic and predictive factors in oral cancer: the
role of the invasive tumor front. J Oral Pathol Med, 2000; 29: 291-298.
BELLATI F., NAPOLETANO C., TARQUINI E., PALAIA I., LANDI R., MANCI N.,
SPAGNOLI G., RUGHETTI A., PANICI P.B., NUTI M. Cancer testis antigen
expression in primary and recurrent vulvar cancer: Association with prognostic
factors. European Journal of Cancer, 2007; 43: 2621-2627.
BETTENDORF O., PIFFKÒ J., BÀNKFALVI A. Prognostic and predictive factors
in oral squamous cell cancer: important tools for planning individual therapy?
Oral Oncology, 2004; 40: 110-119.
BOON T., OLD L.J. Cancer Tumor antigens. Curr Opin Immunol, 1997; 9: 681-
683.
BUSSO D., COHEN D.J., HAYASHI M., KASAHARA M., CUASNICU P.S.
Human testicular protein TPX1/CRISP-2: localization in spermatozoa, fate after
capacitation and relevance for gamete interaction. Mol. Hum. Reprod, 2005; 11:
299–305.
CALIFANO J., van der RIET P., WESTRA W., NAWROZ H., CLAYMAN G.,
PIANTADOSI S., CORIO R., LEE D., GREENBERG B., KOCH W.,
SIDRANSKY D. Genetic Progression Model for Head and Neck Cancer:
Implications for Field Cancerization. Cancer, 1996; 56: 2488-2492.
CHANG J.T., CHEN I.H., LIAO C.T., WANG H.M., HSU Y.M., HUNG K.F., LIN
C.J., HSIEH L.L., CHENG A.J. A reverse transcription comparative real-time
PCR method for quantitative detection of angiogenic growth factors in head and
neck cancer patients. Clin Biochem, 2002; 35: 591-596.
CHEN Q., SAMARANAYAKE L.P., ZHEN X., LUO G., NIE M., LI B. Up-
regulation of Fas ligand and down-regulation of Fas expression in oral
carcinogenesis. Oral Oncol, 1999; 35: 548-553.
Referências Bibliográficas
75
CHITALE D.A., JUNGBLUTH A.A., MARSHALL D.S., LEITAO M.M., HEDVAT
C.V., KOLB D., SPAGNOLI G.C., IVERSEN K., SOSLOW R.A. Expression of
cancer-testis antigens in endometrial carcinomas using a tissue microarray.
Mod Pathol, 2005; 18: 119-126.
CHOI C.S, CHOI G., JUNG K.Y., CHOI J.O., CHAE Y.S. Low expression of
p27(Kip1) in advanced mucoepidermóide carcinomas of head and neck. Head
Neck, 2001; 23: 292-297.
CONNOR J.M., GATHERER D., GRAY F.C., PIRRIT L.A., AFFARA N.A.
Assignment of the gene for dyskeratosis congenita to Xq28. Hum Genet, 1986;
72(4): 348-51.
DAVIS I.D., CHEN W., JACKSON H., PARENTE P., SHACKLETON M.,
HOPKINS W., CHEN Q., DIMOPOULOS N., LUKE T., MURPHY R., SCOTT
A.M., MARASKOVSKY E., MCARTHUR G., MACGREGOR D., STURROCK S.,
TAI T.Y., GREEN S., CUTHBERTSON A., MAHER D., MILORADOVIC L.,
MITCHELL S.V., RITTER G., JUNGBLUTH A.A., CHEN Y.T., GNJATIC S.,
HOFFMAN E.W., OLD L.J., CEBON J.S. Recombinant NY-ESO-1 protein with
ISCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibody and CD4+ and CD8+
T cell responses in humans. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2004; 101: 10697-
10702.
DIB LL. Epidemiologia, Diagnóstico, Patologia e Estadiamento dos Tumores
Malignos da Cavidade Oral. In: Tratado de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e
Otorrinolaringologia. Ed. Atheneu, 2001, pág. 265-275.
EVAN G.I, LITTLEWOOD T.D. The role ofc-myc in cell growth. (Review) Curr
Opin Genet Dev, 1993; 3: 44-49.
EVANS J.P. Fertilin b and other ADAMs as integrin ligands: insights into cell
adhesion and fertilization. Bioessays, 2001; 23: 628-639.
FEARON E.R., VOGELSTEIN B.A. A genetic model for colorretal
tumorigenesis. Cell, 1990; 61: 759-767.
FIGUEIREDO D.L., MAMEDE R.C., PROTO-SIQUEIRA R., NEDER L., SILVA
WA J.R., ZAGO M.A. Expression of cancer testis antigens in head and neck
squamous cell carcinomas. Head & Neck, 2006; 28(7): 614-619.
Referências Bibliográficas
76
FUMIC-DUNKIC L., KATIC V., JANJANIN S., KLAPAN I., SIMUNCIC A., VCEV
A. Retrospective analysis of Ki-67 antigen expression in paraffin tissue blocks of
laryngeal squamous cell carcinoma. Am J Otolaryngol, 2003; 24: 106-110.
GLOBOCAN 2002 Database – IARC - International Agency for Research on
Cancer. (http://www-dep.iarc.fr/GLOBOCANmenu.htm).
GLYNN S.A., GAMMELL P., HEENAN M., O'CONNOR R., LIANG Y., KEENAN
J., CLYNES M. A new superinvasive in vitro phenotype induced by selection of
human breast carcinoma cells with the chemotherapeutic drugs paclitaxel and
doxorubicin. Br. J. Cancer, 2004; 91: 1800-1807.
GRANDI C., ALLOSSIO M., MOGLIA D.E.A. Prognostic significance of
lymphatic spread in head and neck carcinomas: therapeutic implications. Head
Neck Surg, 1985; 8: 67.
GREENLEE R.T., HILL-HAMON M.B., MURRAY T., THUN M. Cancer statistics.
CA Cancer J Clin, 2001; 51: 15-36.
HAHN W.C., WEINBERG R.A. Modelling the molecular circuitry of cancer. Nat
Rev Cancer, 2002; 2(5): 331-41.
HANAHAN D., WEINBERG R.A. The hallmarks of cancer. Cell, 2000; 100(1):
57-70.
HIRAI T., HAYASHI K., TAKUMIDA M., UEDA T., HIRAKAWA K., YAJIN K.
Reduced expression of p27 is correlated with progression in precancerous
lesions of the larynx. Auris Nasus Larynx, 2003; 30: 163-168.
HOSMER, D.W., LEMESHOW, S. Applied Survival Analysis. New York: Wiley,
1999, p. 27-72.
HOWALDT H.P., KAINZ M., EULER B., VORAST H. Proposal for modification
of the TNM staging classification for cancer of the oral cavity. J Craniomaxillofac
Surg, 1999; 27(5): 275-288.
Referências Bibliográficas
77
HUDOLIN T., JURETIC A., SPAGNOLI G.C., PASINI J., BANDIC D.,
HEBERER M., KOSICEK M., CACIC M. Immunohistochemical Expression of
Tumor Antigens MAGE-A1, MAGE-A3/4, and NY-ESO-1 in Cancerous and
Benign Prostatic Tissue. The Prostate, 2006a, 66: 13-18.
HUDOLIN T., JURETIC A., PASINI J., TOMAS D., SPAGNOLI G.C., HEBERER
M., DIMANOVSKI J., KRUSLIN B. Immunohistochemical expression of tumor
antigens MAGE-A1, MAGE-A3/4, and NY-ESO-1 in squamous cell carcinoma of
the penis. Urology, 2006b, 68(1): 205-207.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER-COORDENAÇÃO DE PREVENÇÃO E
VIGILÂNCIA. Incidência de Câncer No Brasil - Estimativa 2008 -
(http://www.inca.gov.br/estimativa/2008/).
JORDAN R.C., DALEY T. Oral squamous cell carcinoma: new insights. J Can
Dent Assoc., 1997; 63(7): 517-518, 521-525.
JUNGBLUTH A.A., STOCKERT E., CHEN Y.T., KOLB D., IVERSEN K.,
COPLAN K., WILLIAMSON B., ALTORKI N., BUSAM K.J., OLD L.J.
Monoclonal antibody MA454 reveals a heterogeneous expression pattern of
MAGE-1 antigen in formalin-fixed paraffin embedded lung tumors. Br. J.
Cancer, 2000; 83: 493-497.
KADEMANI D., BELL R.B., BAGHERI S., HOLMGREN E., DIERKS E.,
POTTER B., HOMER L. Prognostic Factors in Intraoral Squamous Cell
Carcinoma: The Influence of Histologic Grade. J Oral Maxillofac Surg, 2005; 63:
1599-1605.
KAPRANOS N., STATHOPOULOS G.P., MANOLOPOULOS L., KOKKA E.,
PAPADIMITRIOU C., BIBAS A., YIOTAKIS J., ADAMOPOULOS G. p53, p21
and p27 protein expression in head and neck cancer and their prognostic value.
Anticancer Res, 2001; 21: 521-528.
KIENSTRA M.A., NEEL H.B., STROME S.E., ROCHE P. Identification of NY-
ESO-1, MAGE-1 e MAGE-3 in head and neck squamous cell carcinoma. Head
& Neck, 2003; 25(6): 457-463.
KNUTH A., WÖLFEL T., KLEHMANN E., BOON T., MEYER ZUM
BÜSCHENFELDE K.H. Cytolytic T-cell clones againstan autologous human
Referências Bibliográficas
78
melanoma: specificity study anddefinition of three antigens by immunoselection.
Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86: 2804-2808.
KOCHER T., ZHENG M., BOLLI M., SIMON R., FORSTER T., SCHULTZ-
THATER E., REMMEL E., NOPPEN C., SCHMID U., ACKERMANN D.,
MIHATSCH M.J., GASSER T., HEBERER M., SAUTER G., SPAGNOLI G.C.
Prognostic relevance of MAGE-A4 tumor antigen expression in transitional cell
carcinoma of the urinary bladder: a tissue micro array study. Int J Cancer, 2002;
100: 702-705.
KOUKOURAKIS M.I., GIATROMANOLAKI A., SIVRIDIS E., SIMOPOULOS C.,
TURLEY H., TALKS K. GATTER K.C., HARRIS A.L. Hypoxia-inducible factor
(HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of
squamous cell head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2002; 53:
1192-1202.
KRÜGER S., OLA V., FELLER A.C., FISCHER D., FRIEDRICH M. Expression
of Cancer-Testis Antigen CT7 (MAGE-C1) in Breast Cancer: An
Immunohistochemical Study with Emphasis on Prognostic Utility. Pathology
Oncology Reserch, 2007; 13(2): 91-96.
KUROPKAT C., PLEHN S., HERZ U., DUNNE A.A., RENZ H., WERNER J.A.
Tumor marker potential of serum matrix metalloproteinases in patients with
head and neck cancer. Anticancer Res, 2002; 22: 2221-2227.
KUSTNER E.C., COSTA I.F., LÓPEZ J.L. Oral cancer risk and molecular
markers. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2004; 9: 377-384.
KUWAKO K., TANIURA H., YOSHIKAWA K. Necdin-related MAGE proteins
differentially interact with the E2F1transcription factor and the p75 neurotrophin
receptor. J. Biol. Chem, 2004; 279: 1703-1712.
LADURON S., DEPLUS R., ZHOU S., KHOLMANSKIKH O., GODELAINE D.,
DE SMET C., HAYWARD S.D., FUKS F., BOON T., DE PLAEN E. MAGE-A1
interacts with adaptor SKIP and the deacetylase HDAC1 to repress
transcription. Nucleic Acids Res, 2004; 32: 4340-4350.
Referências Bibliográficas
79
LI J., TSAI M.D. Novel insights into the INK4–CDK4/6– Rb pathway: counter
action of gankyrin against INK4 proteins regulates the CDK4-mediated
phosphorylation of Rb. Biochemistry, 2002; 41: 3977-3983.
LOTHAIRE P., DE AZAMBUJA E., DEQUANTER D., LALAMI Y., SOTIRIOU C.,
ANDRY G., CASTRO G.J.R., AWADA A. Molecular markers of head and neck
squamous cell carcinoma: promising signs in need of prospective evaluation.
Head Neck, 2006; 28(3): 256-269.
MASSANO J., REGATEIRO F.S., JANUÁRIO G., FERREIRA A. Oral
squamous cell carcinoma: Review of prognostic and predictive factors. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2006; 102: 67-76.
MINETA H., MIURA K., SUZUKI I., TAKEBAYASHI S., AMANO H., ARAKI K.,
HARADA H., ICHIMURA K., WENNERBERG J.P., DICTOR M.R. Low p27
expression correlates with poor prognosis for patients with oral tongue
squamous cell carcinoma. Cance,r 1999; 85: 1011-1017.
MOHAMED K.M., LE A., DUONG H., WU Y., ZHANG Q., MESSADI D.V.
Correlation between VEGF and HIF-1alpha expression in human oral
squamous cell carcinoma. Exp Mol Pathol, 2004; 76: 143-152.
MONTORO J.R.M.C., MAMEDE R.C.M., HICZ H.A., SOUZA L., et al. Fatores
prognósticos no Carcinoma Espinocelular de cavidade oral. Rev Bras
Otorrinolaringol, 2008. In press.
NAGAO T., HIGASHITSUJI H., NONOGUCHI K., SAKURAI T., DAWSON S.,
MAYER R.J., ITOH K., FUJITA J. MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein
gankyrin and suppresses its tumorigenic activity. J Biol Chem, 2003; 278:
10668-10674.
NÉMETH Z., VELICH N., BOGDAN S., UJPÁL M., SZABÓ G., SUBA Z.S. The
prognostic role of clinical, morphological and molecular markers in oral
squamous cell tumors. Neoplasma, 2005; 52: 95-102.
NOWELL P.C. The Clonal evolution of tumor cell populations. Science, 1976;
194: 23-28.
Referências Bibliográficas
80
OLAZS L., SZABÓ I., HORVÁTH A. A combined treatment for advanced oral
cavity cancers. Cancer, 1998; 62: 1267-1274.
PARKIN D.M., BRAY F, FERLAY J., PISANI P. Global Cancer Statistics, 2002.
CA Cancer J Clin, 2005; 55; 74-108.
PEIKERT T., SPECKS U., FARVER C., ERZURUM S.C., COMHAIR S.A.
Melanoma antigen A4 is expressed in non-small cell lung cancers and promotes
apoptosis. Cancer Res, 2006; 66: 4693-4700.
PICKSLEY S.M., LANE D.P. p53 and Rb: their cellular roles. Curr Opin Cell
Biol, 1994; 6: 523-526.
PIVOT-PAJOT C., CARON C., GOVIN J., VION A., ROUSSEAUX S.,
KHOCHBIN S. Acetylation-dependent chromatin reorganization by BRDT, a
testis-specific bromodomain-containing protein. Mol. Cell Biol, 2003; 23: 5354-
5365.
PRASAD M.L., JUNGBLUTH A.A., PATEL S.G., IVERSEN K., HOSHAW-
WOODARD S., BUSAM K.J. Expression and significance of Cancer Testis
Antigens in primary mucosal melanoma of the head and neck. Head & Neck,
2004; 26(12): 1053-1057.
RHEINWALD J.G., HAHN W.C., RAMSEY M.R., WU J.Y., GUO Z., TSAO H.,
DE LUCA M., CATRICALÀ C., O'TOOLE K.M. A two-stage, p16 (INK4A)- and
p53-dependent keratinocyte senescence mechanism that limits replicative
potential independent of telomere status. Mol Cell Biol, 2002; 22: 5157-5172.
RIES J., SCHULTZE-MOSGAU S., NEUKAM F., DIEBEL E., WILTFANG J.
Investigation of the expression of melanoma antigen-encoding genes (MAGE-
A1 to –A6) in oral squamous cell carcinomas to determine potential targets for
gene-based cancer immunotherapy. Int J Oncol, 2005; 26(3): 817-24.
SCANLAN M.J., GURE A.O., JUNGBLUTH A.A., OLD, L.J., CHEN Y.T.
Cancer/testis antigens: an expanding family of targets for cancer
immunotherapy. Immunol Rev, 2002; 188: 22-32.
Referências Bibliográficas
81
SCANLAN MJ, SIMPSON AJG, OLD, LJ. The cancer/testis genes: Review,
standardization, and commentary. Cancer Immunity 2004; 4: 1-15.
SCHLIEPHAKE H. Prognostic relevance of molecular markers of oral cancer –
A review. J Oral Maxillofac Surg, 2003; 32: 233-245.
SHAH J. Cervical lymph node metastasis, its diagnostic, therapeutic and
prognostic implications. Oncology, 4: 61, 1990.
SHARMA P., SHEN Y., WEN S., BAJORIN D.F., REUTER V.E., OLD L.J.,
JUNGBLUTH A.A. Cancer-Testis Antigens: Expression and Correlation with
Survival in Human Urothelial Carcinoma. Clin Cancer Res, 2006; 12(18): 5442-
5447.
SIDRANSKY D. Emerging molecular markers of cancer. Nature
Reviews/Cancer, 2002; 2: 211-219.
SIMPSOM A.J.G., CABALLERO O.L., JUNGBLUTH A.A., CHEN Y.T., OLD L.J.
Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nature Reviews Cancer,
2005; 5: 615-625.
SMITH B.D., HAFFTY B.G. Molecular markers as prognostic factors for local
recurrence and radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma.
Radiat Oncol Invest, 1999; 7: 125-144.
SOBIN L.H., WITTEKIND C.H. TNM: classification of malignant tumors. 6.ed.
New York, John Wiley & Sons, INC., 2002.
STEWART B.W., KLEIHUES P. World cancer report. Lyon: IARC Press; 2003.
TAN K., SHAW A.L., MADSEN B., JENSEN K., TAYLOR-PAPADIMITRIOU J.,
FREEMONT P.S. Human PLU-1 Has transcriptional repression properties and
interacts with the developmental transcription factors BF-1 and PAX9. J. Biol.
Chem, 2003; 278: 20507-20513.
Referências Bibliográficas
82
TANIURA H., KOBAYASHI M., YOSHIKAWA K. Functional domains of necdin
for protein-protein interaction, nuclear matrix targeting, and cell growth
suppression. J. Cell. Biochem, 2005; 94: 804-815.
van der BRUGGEN P., TRAVERSARI C., CHOMEZ P., LURQUIN C., et al. A
gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human
melanoma. Science, 2001; 254: 1643-1647.
WHYTE D.A., BROTON C.E., SHILLITOE E.J. The unexplained survival of cells
in oral cancer: what is role of p53? J Oral Pathol Med, 2002; 31: 25-33.
WILSON G.D., SAUNDERS M.I., DISCHE S. RICHMAN P.I., DALEY F.M.,
BENTZEN S.M. bcl-2 expression in head and neck cancer: an enigmatic
prognostic marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2001; 49: 435-441.
WÜNSCH FILHO V. The epidemiology of oral and pharynx cancer in Brazil.
Oral Oncol, 2002; 38: 737-746.
YAKIREVICH E., SABO E., LAVIE O., MAZAREB S., SPAGNOLI G.C.,
RESNICK M.B. Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 Cancer-Testis
Antigens in Serous Ovarian Neoplasms. Clin Cancer Res, 2003; 9(17): 6453-
60.
9. ANEXOS
Anexos
84
ANEXO 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Anexos
85
ANEXO 2
QUESTIONÁRIOS UTILIZADOS NO SEGUIMENTO DOS PACIENTES
FORMULÁRIO DE CADASTRO DOS PACIENTES
::.Dados de identificação
Nº de
Identificação:
Nome do
Paciente:
Número do
prontuário no
hospital:
Hospital:
Paciente:
Internado Ambulatorial
Diagnóstico
principal:
Controle
Especificar diagnóstico:
Carcinoma
Especificar:
CID-10:
Entrevistador:
::.Informações Gerais
Data da
Entrevista:
dd/mm/aaaa
Início da
entrevista:
hh:mm
Sexo:
Feminino Masculino
Meu nome é ..................... De início eu quero agradecer o(a) senhor(a) por participar nesse estudo. Nós estamos conduzindo um
estudo com a finalidade de esclarecer se determinadas características e hábitos de homens e mulheres podem ter relação com
algumas doenças. Eu farei várias perguntas cujas respostas serão registradas neste caderno. Devo dizer que tudo que o(a)
senhor(a) responder na entrevista será estritamente confidencial e as informações colhidas das inúmeras pessoas que irão
participar do estudo serão usadas apenas em relatos científicos, sem nenhuma identificação pessoal.
Os possíveis benefícios desse estudo dependem de que as respostas sejam as mais reais (verdadeiras, sinceras) possíveis. Por
favor pergunte se não entender o significado de alguma questão. A qualquer momento
o(a) senhor(a) pode se recusar a continuar ou
a responder perguntas específicas. Além do questionário o estudo inclui a coleta de uma amostra de sangue.
Se houver necessidade de entrar em contato com o(a) senhor(a), poderia fornecer seu endereço e telefone?
Endereço:
Bairro:
Cidade:
Anexos
86
Cep:
00000-000
Telefone:
- (DDD)- 0000-0000
Podemos começar? O(A) Sr(a) poderia assinar essa folha de consentimento?
Data de
Nascimento:
dd/mm/aaaa
Qual é a
sua idade?
Qual a sua profissão? (aquela que o(a) sr(a) exerceu por mais tempo)
Por quanto tempo o(a) sr(a) exerceu esta profissão? anos
Pergunte ao entrevistado como ele/ela se classifica racialmente. Pergunte sobre a raça/origem dos avós.
O entrevistador decide sobre a classificação racial.
Raça:
Branco Mulato
Negro Oriental Índio Outra:
O(A) Sr.(a) já fez algum tratamento para a doença atual? (A doença que o(a) trouxe ao hospital agora?) Sim Não
Se "Sim", então qual tratamento?
Qual a cidade onde o(a) Sr.(a) mora? Sigla do Estado : - Cidade
Há quanto tempo o(a) Sr.(a) mora nessa cidade?(anos) (Se menos de 1 ano codifique como 00):
Se o(a) Sr.(a) esta morando há menos de 1 ano nessa cidade, onde o(a) Sr.(a) morava antes?
Sigla do Estado : - Cidade
Em que cidade/estado/país o(a) sr.(a) nasceu?
Brasileiro : Sigla do Estado : - Cidade
Estrangeiro : País :
O(A) sr.(a) estudou em escola?
Sim Não
Selecione a opção mais elevada quanto ao grau de instrução: Alfabetizado Primário Completo
Primário Incompleto Secundário Completo Secundário Incompleto Técnico Universitário
::.Histório de Câncer no Entrevistado e na Família
Quantos irmãos o(a) Sr(a) teve? :
Quantos irmãs o(a) Sr(a) teve? :
Quantos filhos o(a) Sr(a) teve? :
Quantos filhas o(a) Sr(a) teve? :
OBS
:
Segue as opções de preenchimento : Coloque os números e letras em vermelho
correspondentes aos campos nos quadros
em branco da tabela anexada abaixo :
Tipo de familiar : Próprio(a) Paciente : 01 Mãe: 02 Pai: 03 Irmão: 04 Irmã : 05 Filho: 06 Filha : 07
Vivo/Morto : Vivo: V Morto: M
Tumor : Sim: S Não: N IGN: I
Tabagismo : Sim: S Não: N IGN: I
Anexos
87
Tipo de
familiar
Vivo/Morto
Idade atual
ou da morte
Tumor
Tipo de tumor
(CID-10)
Idade no
diagnostico
Tabagista
::.História de Tabagismo
O(A) Sr.(a) fuma ou já fumou em média 1 cigarro, charuto ou cachimbo, diariamente, pelo menos por 1 ano?
Sim, ainda fuma Nunca fumou Somente no passado
(se parou de fumar há menos de 12 meses assinalar(sim, ainda fuma)
Gostaríamos que o(a) sr.(a) descrevesse os períodos de sua vida em que fumou cigarro, charuto ou cachimbo, as quantidades que
fumou e outros detalhes. Por favor, tente lembrar as mudanças mais importantes quanto à quantidade e tipo de cigarro. Ignore as
mudanças que ocorreram por períodos curtos(menos de 1 ano).
Nota para o entrevistador:
Evite a superposição de anos para consumo do mesmo tipo de cigarro, por exemplo: utilize 30
-
40, 41
-
45 ao invés de 30-40, 40-45.
OBS: Segue as opções de preenchimento : Coloque os números em vermelho correspondentes aos campos nos quadros em
branco da tabela anexada abaixo :
Tipo de Tabaco : Cigarro : 01 Charuto : 02 Cachimbo : 03
Que tipo de tabaco o(a) sr.(a) fuma ou já fumou?
Tipo de Tabaco
Idade de Início
ldade que Parou
N
º por Dia
::.Hábitos de Bebida
O(A) Sr(a) já tomou (ingeriu) bebidas alcoólicas pelo menos 1 vez por mês?
Sim, ainda bebe Nunca Só no passado
(se parou nos últimos 12 meses, a resposta é (sim ainda bebe)
Quando o(a) Sr(a) costuma beber(ou bebia)?
Nas refeições Entre as refeições Ambos
Descreva os períodos de sua vida durante os quais o(a) tomou bebidas alcoólicas. Por favor, tente resumir as mudanças mais
importantes em sua vida em relaçãoà quantidade e tipo de bebida. Ignore quaisquer mudanças ocorridas durante curtos períodos de
tempo(menos de 1 ano). ou bebidas consumidas ocasionalmente.
NOTA PARA O ENTREVISTADOR: Evite a superposição de anos de consumo de uma mesma bebida, por exemplo: utilize 30-
40,41-45ao invés de 30-40,40-45. perguntar separadamente para cada bebida.
OBS. Destilados: uísque, conhaque, cachaça e vodca.
OBS
:
Segue as opções de preenchimento: Coloque os números em vermelho correspondentes aos campos nos quadros em
branco da tabela anexada abaixo :
Bebida : Vinho : 01 Cerveja : 02 Destilados : 03
Anexos
88
Unidade: Copo pequeno -50ml: 01 Copo médio -100ml: 02 Copo grande -250ml: 03 1/2 garrafa pequena ou lata - 330ml: 04
Garrafa 700-750ml : 05 Garrafa - 1L : 06
Por : Dia : 01 Semana : 02 Mês : 03
Bebida
Idade de
Início
ldade que
Parou
Unidade
Unidade
Consumidas
Por
Anexos
89
FORMULÁRIO DE DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS: CABEÇA E PESCOÇO
Nº de Identificação: Nome do Paciente:
::.Dados Clínicos e Laboratoriais ao Diagnóstico de Cabeça e Pescoço
PRIMEIRA CONSULTA
QUEIXA E DURAÇÃO
Peso habitual antes da
doença:
(KG)
Altura:
(cm)
Perda de Peso:
Sim Não (KG) (%) (meses)
IMC:
Alterações Visuais:
Sim Não (meses)
Dificuldade
Respiratória/Dispnéia:
Sim Não (meses) Traqueostomia: Sim Não Data
Realização: dd/mm/aaaa
Disfagia:
Sim Não (meses)
Disfonia:
Sim Não (meses)
Dor:
Sim Não (meses)
Feridas:
Sim Não (meses) Localização:
Lesões externas
visíveis:
Sim Não (meses) Localização:
Nódulos ou massas::
Sim Não (meses) Localização:
Obstrução Nasal:
Sim Não (meses) Lado: Esquerda Direita
Odinofagia:
Sim Não (meses)
Otalgia:
Sim Não (meses)
Rinorréia:
Sim Não (meses)
Sangramentos:
Sim Não (meses)
Sensação de corpo
estranho:
Sim Não (meses) Localização:
Tosse:
Sim Não (meses) Outras Queixas:
LOCALIZAÇÃO DA LESÃO
CID
-
10
C00 - Neoplasia maligna do lábio
C01 - Neoplasia maligna de base de língua
C02 - Neoplasia maligna de outras partes e partes não especificadas de língua
C03 - Neoplasia maligna de gengiva
Anexos
90
C04 - Neoplasia maligna de assoalho da boca
C05 - Neoplasia maligna de palato
C06 - Neoplasia maligna de outras partes e de partes não especificadas da boca
C09 - Neoplasia maligna da amígdala
C10 - Neoplasia maligna da orofaringe
C11 - Neoplasia maligna da nasofaringe
C12 - Neoplasia maligna do seio piriforme
C13 - Neoplasia maligna da hipofaringe
C14 - Neoplasia maligna de outras localidades e de localidades mal definidas do lábio cavidade oral e faringe
C30 - Neoplasia maligna da cavidade nasal e do ouvido médio
C31 - Neoplasia maligna dos seios da face
C32 - Neoplasia maligna da laringe
TAMANHO DO TU
MOR
Tamanho:
cm X cm X cm
LINFONDOS COMPROMETIDOS CLINICAMENTE
E1 NIVEL I D:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E2 NIVEL II D:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E3 NIVEL III D:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Lin
fonodo:
cm
E4 NIVEL IV D:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E5 NIVEL V D:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E6 NIVEL I E:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E7 NIVEL II E:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E8 NIVEL III E:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E9 NIVEL IV E:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E10 NIVEL V E:
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E11 NIVEL VI :
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
E12 NIVEL VII :
Sim Não
Nº de Linfonodos:
Maior Linfonodo:
cm
METÁSTASES À DISTÂNCIA
SNC:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Pulmão:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Fígado:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Ossos:
Sim Não Data: dd/mm/aaaa Qual ?:
Outros
órgãos:
Sim Não Data: dd/mm/aaaa Qual ?:
MN Clinico:
T N M
Anexos
91
INFORMAÇÕES TERAPÊUTICAS
Cirurgia
realizada:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Notas:
Radioterapia:
Sim Não Data início:
dd/mm/aaaa
Data término:
Tipo de
Radioterapia:
Dose:
cGy
Quimioterapia:
Sim Não
(Preencha a tabela abaixo somente se a sua resposta em Quimioterapia for Sim)
Drogas
Dose
Nº Dias
Ciclos
Data Ini.
Data Fim
Tipo de
Quimiotera
pia
(especificar):
Anexos
92
FORMULÁRIO ANÁTOMO PATOLÓGICO: CABEÇA E PESCOÇO
Nº de Identificação: Nome do Paciente:
Infiltrado inflamatório
peri-tumoral:
Ausente Escasso Moderado Intenso
Margens Cirúrgicas:
Com displasia de alto grau (especificar o local ):
Envolvida por tumor invasivo(especificar o local ):
Com carcinoma in situ (especificar o local ):
Não avaliável
Livres de tumor
Lesões em órgãos adjacentes
::.Protocolo Anátomo Patológico Cabeça e Pescoço
2
)
EXAME MACROSCÓPI
CO
Tamanho do Tumor - dimensão máxima em centímetros
(maiores diâmetros e espessura tomada a partir da superfície mucosa normal)
cm X cm X cm
Crescimento:
Exofítico Endofítico
Área de comprometimento do tumor
3
)
EXAME MICROSCÓPICO
Tipo Histológico - Carcinoma Epidermóide
Variante Morfológica:
Outro :
Verrucoso Adenoescamoso
Linfoepitelial Escamoso Basalóide Escamoso Adenóide Fusocelular
(Sarcomatóide)
Grau de diferenciação:
Bem diferenciado Moderadamente Pouco Diferenciado
Para microinvasivo ( o componente in situ predomina, com invasão focal da lâmina própria)
Profundidade de
invasão do tumor:
Microinvasivo Lâmina Própria Plano Muscular Cartilagem Outras
Estruturas
Infiltração Vascular
Sanguínea:
Ausente Presente Não-avaliável
Linfática:
Ausente Presente Não-avaliável
Invasão Peri-neural:
Ausente Presente Não-avaliável
Anexos
93
Linfonodos
NÍVEL I D
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL II D
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL III D
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL IV D
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL V D
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL I E
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL II E
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL III E
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL IV E
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL V E
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL VI
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
NÍVEL VII
Nº dissecado
nº comprometido
invasão extracapsular
Estadiamento
Patológico:
T cm X N cm X M cm
FORMULÁRIO DE ACOMPANHAMENTO: CABEÇA E PESCOÇO
Nº de Identificação: Nome do Paciente:
::.Acompanhamento de Cabeça e Pescoço
A) RECIDIVAS
Recidiva Local:
Sim
Não
Data:
dd/mm/aaaa
Recidiva Regional -
Cervical:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Nível:
Direito Esquerdo
Nível:
Direito Esquerdo
Nível:
Direito Esquerdo
B) TRATAMENTO REALIZADO PARA A RECIDIVA
Anexos
94
Notas:
Cirurgia:
Sim Não Se sim, Data:
dd/mm/aaaa
Notas:
Radioterapia:
Sim Não
Se sim, Data Início:
dd/mm/aaaa
Data Fim:
dd/mm/aaaa
Se sim, tipo de
Radioterapia:
Se sim, Dose:
Quimioterapia:
Sim Não
Anexos
95
Drogas
Dose
Ciclos
Data Início
Data Término
Tipo de
Quimioterapia
(especificar):
C) METÁSTASES À DISTÂNCIA
SNC:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Pulmão:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Fígado:
Sim Não Data:
dd/mm/aaaa
Ossos:
Sim Não Data: dd/mm/aaaa Qual ?:
Outros órgãos:
Sim Não Data: dd/mm/aaaa Qual ?:
D) TRATAMENTO REALIZADO PARA A METÁSTASES À DISTÂNCIA
Notas:
Cirurgia:
Sim Não Se sim, Data:
dd/mm/aaaa
Notas:
Radioterapia:
Sim Não
Se sim, Data Início:
dd/mm/aaaa
Data Fim:
dd/mm/aaaa
Se sim, tipo de
Radioterapia:
Se sim, Dose:
Anexos
96
Quimioterapia:
Sim Não
Drogas
Dose
Ciclos
Data Início
Data Término
Tipo de
Quimioterapia
(especificar):
E) SEGUNDA LESÃO
Cavidade oral:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Orofaringe:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Hipofaringe:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Laringe:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Esôfago:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Pulmão:
Sim Não
Data:
dd/mm/aaaa
Outros:
Sim
Não
Data:
dd/mm/aaaa Qual ?:
F) TRATAMENTO DA SEGUNDA LESÃO
Notas:
Cirurgia:
Sim Não Se sim, Data:
dd/mm/aaaa
Notas:
Anexos
97
Radioterapia:
Sim Não
Se sim, Data Início:
dd/mm/aaaa
Data Fim:
dd/mm/aaaa
Se sim, tipo de
Radioterapia:
Se sim, Dose:
Quimioterapia:
Sim Não
Drogas
Dose
Ciclos
Data Início
Data Término
Tipo de
Quimioterapia
(especificar):
G) INFORMAÇÕES SOBRE O ÓBITO
Óbito:
Sim Não (preencha os itens abaixo somente se for sim)
Data Óbito:
dd/mm/aaaa
Tipo de Óbito:
Outra causa Óbito pela neoplasia
Se por outra causa,
informe qual:
Anexos
98
ANEXO 3
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
10. ANEXO DE PUBLICAÇÃO
Expressão do MAGEA4 e MAGEC1 em carcinoma espinocelular de cavidade
oral
José Raphael M C Montoro
1
Rui Celso M Mamede
2
1
Pós-graduando em Nível de Mestrado do Programa de Oftalmologia,
Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo.
2
Professor Titular do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e
Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo.
Anexo de Publicação
2
RESUMO
Com base na diversidade de resultados clínicos e de comportamento tumoral,
os pesquisadores procuram antígenos tumorais que possam servir como
fatores prognósticos e preditivos, ou como imunoterápico, em pacientes com
carcinomas espinocelulares (CEC) de cavidade oral. Objetivo: O presente
estudo visa: identificar a expressão imuno-histoquímica dos antígenos CT
MAGEA4 e MAGEC1 nesses tumores, analisar a correlação da expressão com
variáveis relacionadas ao paciente e ao tumor e comparar as curvas de
sobrevida global naqueles que expressam e que não expressam esses
antígenos. Materiais e Métodos: Foram obtidos dos blocos de parafina cortes
seriados representativos do tumor que foram à imuno-histoquímica com os
anticorpos 57B (MAGE A-4) e CT 7-33 (MAGE C1) para análise da
imunomarcação. Resultados: A expressão do antígeno CT MAGEA4 foi de
56,5% e do MAGEC1 foi de 47,8%. Não houve relação significante entre a
expressão gênica e as variáveis estudadas, tão pouco houve diferença entre as
curvas de sobrevida. Discussão: Sabe-se que a influência da expressão dos
antígenos CT depende do verdadeiro papel deles na carcinogênese, papel
esse, que ainda não está definido. A ausência de significância estatística entre
a expressão dos antígenos CT com as variáveis estudadas, provavelmente, é
devida ao tamanho da amostra. Conclusões: O MAGE A-4 foi expresso em
56.5% e o MAGE C-1 em 47,8%. Pelo menos um dos antígenos CT foi
expresso em 78,3% dos casos e a sua expressão não teve relação com as
variáveis estudadas, nem com as curvas de sobrevida.
Palavras chave: Antígenos de Neoplasias, Imuno-histoquímica, Imunoterapia,
Marcadores Biológicos, Câncer da Boca.
Anexo de Publicação
3
ABSTRACT
Given the diversity of clinical results and tumoral behavior, researchers look for
tumoral antigens that can serve as prognostic and predictive factors or as
immunotherapeutic agents in patients with squamous cell carcinoma (SCC) of
the oral cavity. Objective: The present study aims at identifying the
immunohistochemical expression of MAGEA4 and MAGEC1 CT antigens in
these tumors; analyzing the correlation of the expression with variables related
to the patient and the tumor, and comparing overall survival curves in those
tumors that express MAGEA4 and MAGEC1 and those which do not. Material
and Methods: Seriate cuts of the tumor obtained from the paraffin block were
stained with 57B antibody (MAGE A-4) and CT 7-33 (MAGE C1) for
immunomarker analysis. Results: The expression of the MAGEA4 CT antigen
was 56,5% and of MAGEC1 was 47,8%. There was no significant reaction
between the genic expression and the studied variables, nor any difference in
the survival curves. Discussion: It is known that the influence of the expression
of CT antigens depends on their actual role on carcinogenesis. This role,
however, is still not defined. The lack of statistical significance among the CT
antigen expression, the studied variables and survival is probably due to the
size of the sample. Conclusions: MAGE A-4 was expressed in 56.5% and
MAGE C-1 in 47,8%. At least one of the antigens was expressed in 78,3% of
the cases and its expression was not related to the studied variables nor to
survival curves.
Key-words: Tumor Antigens, Immunohistochemistry, Immunotherapy,
Biological Markers, Mouth Neoplasms.
Anexo de Publicação
4
INTRODUÇÃO
O câncer de cavidade oral está entre as neoplasias mais freqüentes de
cabeça e pescoço. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), são
cerca de 390 mil novos casos por ano, se somados os casos de cânceres de
cavidade oral com os de orofaringe
1
. No Brasil, excluindo o de pele, o câncer
oral e o de orofaringe representam a quinta incidência entre os homens (9,2%
dos casos de câncer) e a sétima entre as mulheres (3,6% dos casos), com um
total de 6,7 % de todos os casos
2
. No mundo, considerando somente o câncer
de cavidade oral, é o sexto tipo mais comum entre os homens e o oitavo entre
as mulheres
3
.
Estimam-se para 2008, no Brasil, 10.380 casos novos entre os
homens e 3.780 casos novos entra as mulheres, gerando um total de 14.160
casos novos de câncer de boca, correspondendo à taxa de incidência de 11
casos em 100.000 homens e 3,88 casos em 100.000 mulheres
4
.
O comportamento biológico do carcinoma espinocelular (CEC) de
cavidade oral é incerto, pois há tumores iniciais que mostram comportamento
agressivo, com metástase regional precoce e baixa sobrevida e, ao contrário,
existem tumores que mesmo avançados demoram a se metastatizar e seus
portadores cursam, após o tratamento, com longos períodos, livres da doença
5
.
Com base nessa diversidade de resultados clínicos e de comportamento
tumoral, os pesquisadores procuram fatores prognósticos e preditivos em
pacientes com CEC de cavidade oral. Porém, ainda não há consenso, no que
diz respeito aos resultados, isto é, os fatores relacionados ao paciente (idade,
sexo, raça, condições sócio econômicas, tabagismo e etilismo), ao tumor (sítio,
estadio, espessura do tumor e análise histopatológica) e ao tratamento (tipo de
Anexo de Publicação
5
tratamento, terapia adjuvante) são considerados de importância limitada para
prever o comportamento biológico tumoral
6
. Atualmente, sabe-se que de todos
os fatores, somente o comprometimento das margens da ressecção cirúrgica e
a metástase cervical influenciam na sobrevida dos pacientes com CEC de
cavidade oral
7
.
O estudo científico do câncer humano está em uma fase sem
precedentes, em que os elementos genéticos e moleculares alterados estão
sendo determinados. Essas descobertas foram possíveis graças à recente
evolução nas técnicas de genética molecular, que têm permitido a identificação
de alterações do DNA e das proteínas presentes nos tumores. Atualmente,
sabe-se que os tumores resultam de uma série de passos genéticos que
envolvem alterações de vários genes, essas são desencadeadas por
carcinógenos. Essas alterações, com interpretação e aplicabilidade, ainda não
atingiram amplo domínio. A compreensão desses fundamentos da biologia
molecular torna-se indispensável, pois poderão permitir toda a visão da
patologia, etiologia e, principalmente, da terapêutica do câncer.
Os “Cancer/Testis Antigens” (antígenos CT) formam um grupo de genes
com padrão de expressão típico. São expressos numa variedade de neoplasias
malignas, mas não em tecidos adultos normais, exceto nas células
germinativas dos testículos
8
. Os antígenos CT são compostos, atualmente, por
44 famílias de genes, com 89 genes individuais ou isoformas, dessas, 19
famílias se demonstraram capazes de induzir resposta imune em humanos
(humoral e/ou celular)
9
. Devido a esse padrão de expressão (expressos em
vários tecidos tumorais e não expressos em tecidos normais) e à capacidade
Anexo de Publicação
6
de induzir resposta imune, os antígenos CT são considerados como potenciais
antígenos alvo para uma vacina contra o câncer. MAGEA e NYESO-1 já são
estudados como potenciais vacinas para o câncer, planejadas para estimular
células T contra tumores
10
.
O gene MAGEA4 ou CT 1.4 é um CT-X de localização Xq28, expresso
durante a maturação das células germinativas na espermatogônia e tem a
função de co-repressor translacional
11
. O antígeno MAGEA4 induz resposta
imune humoral e celular. Antígenos produzidos por esses genes são
identificados no estudo imuno-histoquímico pelo anticorpo 57B. O MAGEC1,
também é um CT-X e sua localização é Xq26, porém sua função ainda é
desconhecida. Seu antígeno induz resposta imune somente humoral e é
identificado no estudo imuno-histoquímico pelo anticorpo CT7-33. A sua
expressão é inconstante nos diversos tipos de tumores, podendo variar desde
70% em melanomas a 10% em tumores do cólon.
Este trabalho teve como objetivo avaliar a expressão imuno-histoquímica
dos genes MAGE A4 e MAGE C1 em CEC de cavidade oral, bem como
analisar a correlação entre a expressão dos genes com variáveis sócio-
demográficas e características histológicas do tumor e comparar as curvas de
sobrevida global naqueles que expressam e que não expressam.
MATERIAIS E MÉTODOS
Seleção dos pacientes
De um total de 45 pacientes operados entre janeiro de 2001 a janeiro de
2006, foram localizados 23 casos do Arquivo do Serviço de Patologia do
Anexo de Publicação
7
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) que foram incluídos neste estudo.
Eram pacientes com CEC de cavidade oral, tratados inicialmente com cirurgia
curativa no HCFMRP-USP. Os critérios de exclusão foram: pacientes com
tumor de lábio; com tumores que se estendiam além da cavidade oral e
aqueles que perderam o seguimento clínico, nesse período. Os participantes
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido aceitando
participarem do projeto Gencapo - Banco de Tumores. Os dados do paciente
(idade, sexo, tabagismo e etilismo), do tumor (sítio, estadiamento clínico e
TNM, grau de diferenciação, invasão vascular, linfática e peri-neural, infiltrado
inflamatório peri-tumoral) e da evolução clínica foram inseridos no banco de
dados.
O diagnóstico do tumor foi feito pela história clínica, exame clínico e
biópsia da lesão. Exames complementares (tomografia computadorizada, ultra-
som e ressonância magnética) foram realizados, quando necessário, para
avaliação da extensão tumoral e da presença de nódulos cervicais. Todos os
pacientes foram estadiados segundo os critérios da International Union Against
Cancer (UICC) de 2002
12
. Após o tratamento, os pacientes retornavam no 1º,
3º, 6º e 12º meses, no primeiro ano e após, de 6/6 meses, para serem
avaliados clinicamente. A cada seis meses, nos primeiros dois anos, eram
solicitados rotineiramente radiografias de tórax e endoscopia digestiva alta.
Após os dois primeiros anos esses exames eram anuais.
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
HCFMRP-USP, sob o documento n° 7234/2007.
Anexo de Publicação
8
Reações Imuno-histoquímicas
Para cada caso, era selecionado um bloco representativo para a
realização das reações imuno-histoquímicas. Desses eram obtidos cortes
seriados de 4µm em lâminas com solução adesiva de 3-amino-propyltriethoxy-
silano (Sigma Chemical Co.
®
, St. Louis, MO/USA).
Os anticorpos utilizados para as reações imuno-histoquímicas foram:
MAGE A4 (57B, 1: 4.000 em tampão EDTA 1mM, pH 8,0 – Ludwig Institute,
NY) e MAGE C1 (CT 7-33, 1:32.000, solução de ácido cítrico 10mM, pH 6,0 –
Ludwig Institute, NY).
Para evitar reação endógena devido à presença de biotina e avidina,
foram utilizados polímero dextran e sistema de amplificação enzimática
NovoLink (Novocastra, UK). Resumidamente, cortes teciduais de 4µm foram
submetidos à recuperação antigênica pelo calor por 3 minutos em steamer,
com solução de ácido cítrico 10 mM/pH 6.0 para o CT7-33 e com solução de
ácido cítrico 1mM/pH 8,0 para o 57B. O bloqueio da peroxidase endógena foi
realizado com solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 6%. A incubação
com o anticorpo primário foi feita a 37ºC em câmara úmida a 4ºC por 12 horas
(overnight). A incubação com anticorpo secundário, diluído em PBS, foi
realizada por 30 minutos a 37°C. Após lavagens em PBS, os cortes foram
incubados por 30 minutos a 37
o
C com o sistema amplificador Novolink. Por fim,
os cortes histológicos foram lavados em água corrente por 10 minutos,
contracorados com Hematoxilina de Harris por 10 segundos, novamente
lavados em água corrente, desidratados em etanol e diafanizados em xilol. A
montagem das lâminas foi realizada em resina Permount (Fisher Scientific®,
Anexo de Publicação
9
Fair Lawn, NJ/USA, cód. S15-100).
Para cada bateria de reação foram utilizados controles positivos com
tecido de testículo. Os controles negativos foram estabelecidos através da
omissão do anticorpo primário, que foi substituído por tampão PBS (“blank”).
As reações foram analisadas em microscópio de múltipla observação,
por dois observadores independentes, patologistas cirúrgicos, com experiência
na área, com desconhecimento da identidade dos casos e definidas mediante
consenso. As reações foram classificadas subjetivamente quanto à extensão
da imunomarcação em: Zero: até 5% das células neoplásicas marcadas; 1+: 6
– 25% das células neoplásicas marcadas; 2+: 26 – 50% das células
neoplásicas marcadas; 3+: 51 – 75% das células neoplásicas marcadas; 4+: >
75% das células neoplásicas marcadas.
Análise Estatística
Para a avaliação da relação de cada variável com as expressões do
MAGEA4 e MAGEC1, foi utilizado o teste exato de Fisher. Foram estimadas
curvas de sobrevida, pelo método de Kaplan-Meier para o grupo que
expressava e para o grupo que não expressava o antígeno e o teste aplicado
para compará-las foi o log-rank
13
.
RESULTADOS
Após a aplicação dos critérios de exclusão, foram selecionados 23
pacientes para o estudo. A média da idade era de 55,3 anos, com desvio
padrão de 9,7 anos. A menor idade era 29 anos e a maior 72 anos, sendo que
os percentis foram de P
25
=50 anos, e a mediana (P
50
) de 54 anos e P
75
=60
Anexo de Publicação
10
anos, 74% dos pacientes estava acima dos 60 anos. Em relação às outras
variáveis clínicas, 87% eram do sexo masculino, o tabagismo estava presente
em 91,3% da amostra e o etilismo em 74%.
A expressão do MAGEA4 foi de 56,5%, a expressão 1+ ocorreu em 13%
dos casos; 2+ em 8,7%; 3+ em 13% e 4+ em 21,8% (Figura 1).
A Expressão do MAGEC1 foi de 47,8%, com as expressões divididas
em: 1+ em 17,4%; 2+ em 13%; 3+ em nenhuma amostra e 4+ em 17,4%
(Figura 2).
Pelo menos um dos antígenos CT estudado foi expresso em 78,3% dos
pacientes.
Para analisar a relação da expressão dos antígenos CT com as variáveis
clínico-patológicas, foi aplicado o teste exato de Fischer e foram analisadas as
variáveis relacionadas ao paciente (sexo, idade, tabagismo e etilismo) e ao
tumor (estadio TNM, estadio clínico, grau de diferenciação, invasão vascular,
linfática e peri-neural e infiltrado inflamatório peri-tumoral).
As relações da expressão do anticorpo 57B com as variáveis citadas não
apresentaram significância estatística, como mostra a Tabela 1.
A expressão do anticorpo CT7-33 também não mostrou significância
estatística em relação às variáveis clínico-patológicas (tabela 2), somente as
variáveis idade (p=0,069) e invasão peri-neural (p=0,093) apresentaram
resultados próximos da significância (α=0,050).
As curvas de sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier
e comparadas pelo teste log-rank, não mostraram significância estatística, tanto
para a expressão do 57B (p=0,330) quanto para a expressão do CT-33
Anexo de Publicação
11
(p=0,43) (Figuras 3 e 4).
DISCUSSÃO
As pesquisas ainda não descobriram um antígeno tumoral específico
que possa servir como marcador tumoral de prognóstico ou para o
desenvolvimento de uma vacina imunológica contra o câncer. Este é o primeiro
estudo que analisa a expressão do MAGEA4 e MAGEC1, antígenos tumorais
específicos, em CEC de cavidade oral, por IHQ.
Estudo prévio realizado por Figueiredo et al. (2006), analisou por RT-
PCR amostra de 33 CECs de cabeça e pescoço, de diversos sítios, e constatou
a expressão de MAGEA4 em 48,5% dos casos
14
. Expressão de MAGEA4
nestes níveis também foi encontrada por Ries et al. (2005), ao estudar 21
espécimes de CEC de cavidade oral por RT-PCR, tendo encontrado expressão
gênica de 57%. Esses resultados são similares aos encontrados neste
trabalho, em que a expressão do MAGEA4 foi de 47,8%, apesar dos métodos
de estudo terem sido diferentes
15
.
MAGEC1 também já foi avaliado previamente por RT-PCR. Atanackovic
et al. (2006), estudando uma série de antígenos CT em 51 espécimes de CEC
de cabeça e pescoço, constataram a expressão de MAGEC1 em 28% dos
casos
16
. Em nosso estudo, a expressão do MAGEC1 foi de 47,8%, maior do
que a encontrada por Atanackovic et al. (2006). A diferença de expressão do
MAGEC1 encontrada não deve ser atribuída ao método de estudo imuno-
histoquímica e RT-PCR, já que, Sharma et al. (2006), comparando a expressão
de nove antígenos CT em carcinoma urotelial, analisados por RT-PCR e por
Anexo de Publicação
12
IHQ chegaram à conclusão de que as expressões eram semelhantes com os
dois métodos
17
. Provavelmente, essa discrepância entre os resultados obtidos
nesse estudo e aqueles citados por Atanackovic et al. (2006) seja devida ao
fato de que as expressões das proteínas dos genes apresentam
heterogeneidade entre as diferentes áreas do tumor. Esse fato já foi constatado
por diversos estudos, ao verificarem que as expressões variam de 5% até mais
de 75% das células neoplásicas de um mesmo tumor
17,18
. Neste estudo, 61,5%
dos casos que expressaram o 57B foram acima de 50% das células
neoplásicas e somente 36,4% dos casos que expressaram o CT7-33 ocorreram
em mais de 50% das células neoplásicas, mostrando a heterogeneidade de
expressão desses antígenos. Atanackovic, analisando vários estudos de
expressão do MAGEA3, verificou que esta variava de 27-45%, demonstrando
que essa heterogeneidade é vista também em outros antígenos CT
16
.
Em nossa amostra, a expressão dos antígenos CT estudados se
mostrou freqüente, pois em 78,3% dos pacientes, pelo menos um dos
antígenos foi expresso. A resultado semelhante chegaram Figueiredo et al.
(2006), ao encontrarem a expressão de pelo menos um antígeno CT, em
66,6% dos casos, e, no mesmo ano, Atanackovic et al. (2006) constataram que
essa expressão podia chegar a 86%
14,16
. Esses resultados mostram que é
possível aplicar imunoterapia antígeno-específica em pacientes com CEC de
cavidade oral.
Pouco se sabe da biologia molecular dos tumores e das funções dos antígenos
CT na progressão tumoral. A relação dos antígenos CT com variáveis clínico-
Anexo de Publicação
13
patológicas era pouco estudada, porém, ultimamente, tem sido dada mais
ênfase a esse tipo de análise sem, no entanto, chegar ao consenso.
Neste estudo não encontramos correlação significativa da expressão dos
antígenos CT com as variáveis clínico-patológicas estudadas. Apenas a idade
(p=0,069) e a invasão peri-neural (p=0,093) apresentaram tendência à
significância estatística, em relação à expressão do CT7-33. Há a possibilidade
de marcador estar associado à agressividade tumoral, confirmando essa
hipótese, Krüger et al e Chitale et al. constataram que a expressão do MAGEC-
1 teve correlação significativa com o grau do tumor e comportamento mais
agressivo em tumores de ovário e de mama
19,20
.
A avaliação dos antígenos CT NYESO-1, MAGE1 e MAGE3, por RT-
PCR e imuno-histoquímica, em CEC de cabeça e pescoço, realizado por
Kienstra et al. (2003), em 45 amostras, mostrou que não havia relação da
expressão dos antígenos CT com dados clínico-patológicos, como ocorreu
neste estudo
21
. Ries et al. (2004) estudando MAGEA1 ao MAGEA6 em CEC de
cavidade oral também não encontraram relação entre a expressão destes
genes e o grau de diferenciação, tamanho do tumor, metástase linfonodal e
estadio
15
.
No estudo de Figueiredo et al. (2006) com CEC de cabeça e pescoço, foi
encontrada associação estatisticamente significante da expressão de antígenos
CT com o tamanho do tumor e o tabagismo. Quanto ao tamanho, os autores
verificaram que o gene MAGE4 encontrava-se expresso em dezesseis casos
(48,5%), sendo que 43,8% eram tumores T4. A expressão em cada
estadiamento foi de 25% entre os tumores T1, 50% entre os T2, 43% entre os
Anexo de Publicação
14
T3 e 70% entre os T4. Quanto ao tabagismo, os autores constataram a relação
da quantidade de cigarros consumidos por dia com a expressão gênica.
Figueiredo et al. (2006) ainda verificaram que havia relação da expressão de
MAGEA-4 no tumor primário com menor incidência de metástases
linfonodais
14
. Essas afirmações nos levam a imaginar de que o gene MAGEA4
participa na carcinogênese reduzindo a agressividade tumoral, ao contrário do
MAGEC-1.
Por outro lado, em estudos com outros tumores, foi mostrado que no
carcinoma de bexiga e de vulva, a expressão do MAGEA4 estava
significantemente associada com estadio avançado, metástase linfonodal e
tumores de alto grau
22,23
. Em tumores de ovário, Yakirevich et al., (2003),
observaram haver expressão de MAGEA4, em tumores malignos, enquanto
naqueles “borderline” a expressão era rara e nos benignos e tecido normal não
o expressavam, mostrando uma correlação entre a expressão do MAGEA4 e a
progressão tumoral
24
. Em contrapartida, alguns outros estudos estão
apontando para um efeito de supressão tumoral com a expressão dos
antígenos CT. Assim, MAGEA4 foi mostrado induzir supressão da atividade
tumorigênica em carcinomas de fígado e promover apoptose no carcinoma
pulmonar que não pequenas células
25,26
.
Novos estudos serão necessários para determinar o papel dos antígenos
CT na carcinogênese e sua relação com variáveis clínico-patológicas,
principalmente, porque a dificuldade em coletar e acompanhar os pacientes
para realizar esse tipo de estudo faz com que a análise se recaia sobre
pequeno número de participantes, dificultando a interpretação dos resultados.
Anexo de Publicação
15
O papel da expressão dos antígenos CT na sobrevida ainda é incerto e
poucos são os estudos que analisam esta relação. Na literatura encontramos
trabalhos que não demonstram a influência da expressão dos antígenos CT na
sobrevida, outros em que essa expressão diminui a sobrevida e, por fim,
aqueles em que a expressão aumenta a sobrevida.
Neste estudo as curvas de sobrevida dos pacientes com expressão
positiva foram comparadas com as de expressão negativa, pelo teste log-rank,
para os dois marcadores, e não encontramos diferença estatisticamente
significante. Resultados semelhantes obtiveram Bellati et al. (2007), analisando
45 casos de câncer de vulva, ao estudar os antígenos CT MAGEA1, MAGEA4
e NY-ESO-1
23
.
Já na análise da relação dos antígenos CT com sobrevida em outros
tumores, Yakirevich et al. e Kocher et al. mostraram que a expressão do
MAGEA4 estava relacionada com piora da sobrevida global e específica em
câncer de ovário e bexiga, respectivamente
22,24
. Por outro lado, outros estudos
mostram que a expressão de antígenos CT está relacionada com melhor
prognóstico. Assim, o MAGEC1, em tumores de mama e o CT10 em carcinoma
urotelial, mostraram relação com melhor sobrevida livre da doença e melhor
sobrevida global, respectivamente
17,19
.
Como podemos observar, os resultados são contraditórios, talvez pelos
estudos terem sido realizados com diferentes tipos de tumores ou com
amostras pequenas. O que sabemos é que a influência da expressão dos
antígenos CT depende do verdadeiro papel deles na carcinogênese, papel
esse que ainda não está definido. Serão, pois, necessários mais estudos, com
Anexo de Publicação
16
amostras adequadas, e estudos prospectivos para definir a verdadeira
influência da expressão dos antígenos CT na sobrevida de pacientes com
câncer.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Stewart B.W., Kleihues P. World cancer report. Lyon: IARC Press; 2003.
2. Wünsch Filho V. The epidemiology of oral and pharynx cancer in Brazil. Oral
Oncol, 2002; 38: 737-746.
3. Parkin D.M., Bray F, Ferlay J., Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. CA
Cancer J Clin, 2005; 55: 74-108.
4. Instituto Nacional de Câncer-Coordenação de Prevenção e Vigilância -
Incidência de Câncer no Brasil - Estimativa 2008-
(http://www.inca.gov.br/estimativa/2008/).
5. Kademani D., Bell R.B., Bagheri S., Holmgren E., et al. Prognostic Factors in
Intraoral Squamous Cell Carcinoma: The Influence of Histologic Grade. J
Oral Maxillofac Surg, 2005; 63: 1599-1605.
6. Bettendorf O., Piffkò J., Bànkfalvi A. Prognostic and predictive factors in oral
squamous cell cancer: important tools for planning individual therapy? Oral
Oncology, 2004; 40: 110-119.
Anexo de Publicação
17
7. Montoro J.R.M.C., Mamede R.C.M., Hicz H.A., Souza L., et al. Fatores
prognósticos no Carcinoma Espinocelular de cavidade oral. Rev Bras
Otorrinolaringol, 2008 (aguarda publicação).
8. Boon T., Old L.J. Cancer Tumor antigens. Curr Opin Immunol, 1997; 9: 681-
683.
9. Kuropkat C., Plehn S., Herz U., Dunne A.A., Renz H., Werner J.A. Tumor
marker potential of serum matrix metalloproteinases in patients with head
and neck cancer. Anticancer Res, 2002; 22: 2221-2227.
10. Marchand M. et al. Tumor regressions observed in patients with metastática
melanoma treated with antigenic peptide encoded by MAGE-3 and
presented by HLA-A1. Int J. Cancer, 1998; 18: 219-230.
11. van der Bruggen P., Traversari C., Chomez P., Lurquin C., et al. A gene
encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human
melanoma. Science, 2001; 254: 1643-1647.
12. Sobin L.H., Wittekind C.H. TNM: classification of malignant tumors. 6.ed.
New York, John Wiley & Sons, INC., 2002.
13. Hosmer, D.W, Lemeshow, S. Applied Survival Analysis. New York: Wiley,
1999.
Anexo de Publicação
18
14. Figueiredo D.L.A., Mamede R.C.M., M.D., Zago M,A., et al. Expression of
cancer testis antigens in head and neck squamous cell carcinomas. Head &
Neck, 2006; 28(7): 614-619.
15. Ries J., Schultze-Mosgau S., Neukam F., Diebel E., Wiltfang J. Investigation
of the expression of melanoma antigen-encoding genes (MAGE-A1 to –A6)
in oral squamous cell carcinomas to determine potential targets for gene-
based cancer immunotherapy. Int J Oncol, 2005; 26(3): 817-24.
16. Atanackovic D., Blum I., Cao Y., Wenzel S., et al. Expression of Cancer-
Testis Antigens as Possible Targets for Antigen-Specific Immunotherapy in
Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Cancer Biology & Therapy,
2006; 5(9): 1218-1225.
17. SHarma P., Shen Y., Old L.J., Jungbluth A.A., et al. Cancer-Testis Antigens:
Expression and Correlation with Survival in Human Urothelial Carcinoma.
Clin Cancer Res, 2006; 12(18): 5442-5447.
18. Jungbluth A.A., Stockert E., Chen Y.T.N. et al. Monoclonal antibody MA454
reveals a heterogeneous expression pattern of MAGE-1 antigen in formalin-
fixed paraffin embedded lung tumours. Br. J. Cancer, 2000; 83: 493-497.
19. Krüger S., Ola V., Feller A.C., Fischer D., Friedrich M. Expression of
Cancer-Testis Antigen CT7 (MAGE-C1) in Breast Cancer: An
Anexo de Publicação
19
Immunohistochemical Study with Emphasis on Prognostic Utility. Pathology
Oncology Reserch, 2007; 13(2): 91-96.
20. Chitale D.A., Jungbluth A.A., Marshall D.S., et al: Expression of cancer-
testis antigens in endometrial carcinomas using a tissue microarray. Mod
Pathol, 2005; 18: 119-126.
21. Kienstra M.A., Neel H.B., Strome S.E., Roche P. Identification of NY-ESO-1,
MAGE-1 e MAGE-3 in head and neck squamous cell carcinoma. Head &
Neck, 2003; 25(6): 457-463.
22. Kocher T., Zheng M., Bolli R., Simon R., et al. Prognostic relevance of
MAGE-A4 tumor antigen expression in transitional cell carcinoma of the
urinary bladder: a tissue microarray study. Int J Cancer, 2002; 100: 702-705.
23. Bellati F., Napoletano C., Tarquini E., Palaia I. et al. Cancer testis antigen
expression in primary and recurrent vulvar cancer: Association with
prognostic factors. European Journal of Cancer, 2007; 43: 2621-2627.
24. Yakirevich E., Sabo E., Lavie O., Mazareb S., et al. Expression of the
MAGE-A4 and NY-ESO-1 Cancer-Testis Antigens in Serous Ovarian
Neoplasms. Clin Cancer Res, 2003; 9(17): 6453-60.
Anexo de Publicação
20
25. Nagao T., Higashitsuji H., Nonoguchi K., et al. MAGE-A4 interacts with the
liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity. J Biol
Chem, 2003; 278: 10668-10674.
26. Peikert T., Specks U., Farver C., et al. Melanoma antigen A4 is expressed
in non-small cell lung cancers and promotes apoptosis. Cancer Res, 2006;
66: 4693-4700.
Anexo de Publicação
21
LEGENDAS DE FIGURAS
Figura 1. Expressões do anticorpo 57B (aumento 100x). (A) Imunomarcação
classificada com 1+. (B) Imunomarcação 2+. (C) Imunomarcação 3+. (D)
Imunomarcação 4+.
Figura 2. Expressões do anticorpo CT7-33 (aumento 100x). (A) Imunomarcação
classificada zero. (B) Imunomarcação 1+. (C) Imunomarcação 2+. (D) Imunomarcação
4+.
Figura 3. Representação gráfica das curvas de sobrevida das expressões negativa e
positiva do anticorpo 57B.
Figura 4. Representação gráfica das curvas de sobrevida das expressões negativa e
positiva do anticorpo CT7-33.
Anexo de Publicação
22
Figura 1
Figura 2
Anexo de Publicação
23
Figura 3
Figura 4
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0 20 40
60
Tempo (meses)
CT7-33 -
CT7-33 +
Curvas de sobrevida pela expressão do CT7-33
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0 20 40 60
Tempo (meses)
57B - 57+
Curvas de sobrevida pela expressão do 57B
Anexo de Publicação
24
Tabela 1. Distribuição de freqüências das variáveis com os níveis da expressão do
anticorpo 57B e valores de p do teste exato de Fisher.
Variável
Anticorpo 54B
negativo
Anticorpo 54B
positivo
Total
p
n
%
n
%
Sexo
Idade
Tabagismo
Etilismo
Estadio T
Metástase cervical
Grau de
diferenciação
Invasão vascular
Invasão linfática
Invasão peri-neural
Inflamação
peri-tumoral
Estadiamento
clinico
Feminino
Masculino
< 60 anos
≥ 60 anos
Não
Sim
Não
Sim
1
2
3
4
Presença
Ausência
Bem
Moderado
Pouco
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Intenso
Moderado
Ausente
I ou II
III
IV
2
8
7
3
2
8
3
7
1
6
2
1
6
4
5
5
0
9
1
10
0
9
1
1
3
6
3
4
3
66,7
40,0
41,2
50,0
100,0
38,1
50,0
41,2
50,0
46,2
50,0
25,0
40,0
50,0
41,7
50,0
0
47,4
25,0
52,6
0
45,0
33,3
50,0
42,9
42,9
75,0
50,0
27,3
1
12
10
3
0
13
3
10
1
7
2
3
9
4
7
5
1
10
3
9
4
11
2
1
4
8
1
4
8
33,3
60,0
58,8
50,0
0
61,9
50,0
58,8
50,0
53,8
50,0
75,0
60,0
50,0
58,3
50,0
100,0
52,6
75,0
47,4
100,0
55,0
66,7
50,0
57,1
57,1
25,0
50,0
72,7
3
20 0,560
17
6 1.000
2
21 0,178
6
17 1,000
2
13
4
4 0,919
15
8 0,685
12
10
1 1,000
19
4 0,604
19
4 0,104
20
3 1,000
2
7
14 1,000
4
8
11 0,249
Total
10
43,5
13
56,5
23
Anexo de Publicação
25
Tabela 2. Distribuição de freqüências das variáveis com os níveis da expressão do
anticorpo CT7-33 e valores de p do teste exato de Fisher.
Variável
Anticorpo CT7
-
33
negativo
Anticorpo CT7
-
33
positivo
Total
p
n
%
n
%
Sexo
Idade
Tabagismo
Etilismo
Estadio T
Metástase cervical
Grau de
diferenciação
Invasão vascular
Invasão linfática
Invasão peri-neural
Inflamação
peri-tumoral
Estadiamento
clinico
Feminino
Masculino
< 60 anos
≥ 60 anos
Não
Sim
Não
Sim
1
2
3
4
Presença
Ausência
Bem
Moderado
Pouco
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Ausência
Presença
Intenso
Moderado
Ausente
I ou II
III
IV
0
12
11
1
1
11
2
10
1
6
2
3
8
4
6
6
0
11
1
11
1
12
0
2
4
6
2
2
8
0
60,0
64,7
16,7
50,0
52,4
33,3
58,8
50,0
46,2
50,0
75,0
53,3
50,0
50,0
60,0
0
57,9
25,0
57,9
25,0
60,0
0
100,0
57,1
42,9
50,0
25,0
72,7
3
8
6
5
1
10
4
7
1
7
2
1
7
4
6
4
1
8
3
8
3
8
3
0
3
8
2
6
3
100,0
40,0
35,3
83,3
50,0
47,6
66,7
41,2
50,0
53,8
50,0
25,0
46,7
50,0
50,0
40,0
100,0
42,1
75,0
42,1
75,0
40,0
100
0
42,9
57,1
50,0
75,0
27,3
3
20 0,093
17
6 0,069
2
21 1,000
6
17 0,371
2
13
4
4 0,909
15
8 1,000
12
10
1 0,680
19
4 0,317
19
4 0,317
20
3 0,093
2
7
14 1,485
4
8
11 0,154
Total
12
52,2
11
47,8
23
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