( PDF ) Estudo da infecção de células endoteliais humanas por arbovírus modulada pelos peptídeos bradicinina e angiotensina 1-7

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Naiara Miranda Rust

Estudo da Infecção de Células Endoteliais Humanas

por Arbovírus Modulada pelos Peptídeos Bradicinina e

Angiotensina 1-7

Dissertação de Mestrado submetida à Universidade

Federal do Rio de Janeiro visando a obtenção do grau de

Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)

Rio de Janeiro

2008

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Rust, Naiara Miranda

Estudo da Infecção de Células Endoteliais Humanas por Arbovírus Modulada pelos Peptídeos

Bradicinina e Angiotensina 1-7/Naiara Miranda Rust

Rust - Rio de Janeiro, UFRJ, IBCCF, 2008

Folhas 109

Orientador: Júlio Scharfstein

Co-orientadora: Luciana Barros de Arruda (IMPPG)

Tese (mestrado) – UFRJ/Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas – Biofísica, 2008.

Referências bibliográficas: 86 a 99

1. Dengue 2. Sindbis 3. Bradicinina 4. Angiotensina 1-7 5.Endotélio 6.Óxido Nítrico 7. Apoptose

I. Scharfstein, J. Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas.

III. Estudo da Infecção de Células Endoteliais Humanas por Arbovírus Modulada pelos Peptídeos

Bradicinina e Angiotensina 1-7

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Naiara Miranda Rust

Estudo da Infecção de Células Endoteliais Humanas por

Arbovírus Modulada pelos Peptídeos Bradicinina e Angiotensina

1-7

Dissertação de Mestrado apresentada

ao Programa de Pós-Graduação do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho da Universidade Federal do Rio

de Janeiro como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de

mestre em Ciências (Biofísica)

Orientador: Júlio Scharfstein

Co-orientadora: Luciana Barros de Arruda

Rio de Janeiro

2008

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Universidade Federal do Rio de Janeiro –

Rio de Janeiro - 2008

Este trabalho foi realizado nos Laboratórios: Laboratório de Imunologia Molecular do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho e Laboratório de Imunobiologia das

Infecções Virais do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, na

Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Dr. Júlio Scharfstein e co-

orientação da Dra. Luciana Barros de Arruda Hinds, com auxílio financeiro das

seguintes entidades CAPES e FAPERJ

Naiara Miranda Rust

Estudo da Infecção de Células Endoteliais Humanas por Arbovírus Modulada

pelos Peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7

Dissertação de Mestrado submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro visando a

obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)

Aprovada por:

__________________________________________________

Presidente, Prof. Dr. Ronaldo da Silva Mohana Borges – IBCCF - UFRJ

__________________________________________________

Profa. Dra. Verônica Maria Morandi da Silva- UERJ

__________________________________________________

Prof. Dra. Jennifer Lowe – IBCCF - UFRJ

__________________________________________________

Orientador, Prof. Dr. Júlio Scharfstein – INCCF - UFRJ

__________________________________________________

Co-orientadora, Profa. Dra. Luciana Barros de Arruda Hinds - IMPPG - UFRJ

Resumo

Os arbovirus são um grupo de vírus transmitidos por artrópodes, onde estão incluídos

alguns vírus associados a infecções humanas como os vírus Sindbis (SINV) e da dengue

(DENV). A infecção por SINV está associada a quadros neurológicos e artrite, ambos

resultado de um quadro inflamatório. A infecção por DENV, pode desenvolver-se como

uma febre clássica ou pode levar a uma alteração na permeabilidade do endotélio

microvascular conduzindo ao extravasamento de líquido, caracterizando a dengue

hemorrágica. Manifestações neurológicas também têm sido relatadas. Esses achados

apontam a resposta inflamatória, a manutenção da hemostasia e integridade do endotélio, e

o rompimento da barreira hematoencefálica como elementos importantes da patogênese

dessas infecções. Bradicinina (BK) e Angiotensina 1-7 (Ang 1-7) são peptídeos vasoativos

encontrados no plasma, envolvidos na manutenção da hemostasia. Agem sobre as células

endoteliais, induzindo a produção de óxido nítrico, o que leva ao relaxamento muscular e

vasodilatação, podendo modular também a apoptose. No presente trabalho, nós avaliamos o

efeito de BK e Ang 1-7 na regulação da infecção por DENV e SINV em linhagens celulares

humanas de endotélio microvascular cerebral (BMEC) e de glioma (U87). Nós observamos

que a BK (10 nM) e Ang 1-7 (100nM) modularam positivamente a replicação de ambos os

vírus de maneira dependente dos receptores B2R e AT1R. A adição dos peptídeos às

culturas retardou a apoptose induzida por esses vírus e esse efeito envolveu também os

receptores B2R e AT1R, além de ter sido bloqueado por inibidor de PI3 cinase (PI3K), a

wortmanina. Além disso, a avaliação da infecção de BMEC com DENV demonstrou que

tanto o vírus, quanto os peptídeos BDK e Ang 1-7, isoladamente, induzem a produção de

NO por essas células. Entretanto, a adição dos peptídeos após a infecção de BMECs

promoveu uma inibição da produção desse mediador. Essa inibição é revertida na presença

dos antagonistas dos receptores B2 e AT1 e da wortmanina, sugerindo que esse evento é

modulado por mecanismos semelhantes aos da modulação da replicação viral e da apoptose.

De fato, o NO inibe a replicação de DENV nessas células e induz apoptose, uma vez que o

tratamento de BMECS infectadas com um inibidor da óxido nítrico sintase (L-NMMA)

promoveu um aumento da replicação viral e uma inibição da apoptose induzida pelo vírus.

Em conjunto, nossos dados indicam que BDK e Ang 1-7 potencializam a infecção por

DENV e SINV em células endoteliais (DENV e SINV) e da glia (SINV), possivelmente por

retardar a apoptose e inibir a produção de NO.

Abstract

The arboviruses are a group of virus transmitted by arthropods, which include some viruses

associated to human infection, such as dengue (DENV) and Sindbis (SINV). SINV

infection is associated to neurological symptoms and arthritis, and both manifestations

involves an inflammatory response. DENV infection causes clinical symptoms that vary

from a relatively mild fever to a severe dengue hemorrhagic fever. The severe clinical

manifestations are associated to altered vascular permeability and plasma leak, caused by

modifications in endothelial cells, and by an extensive inflammatory response. Neurological

manifestations were also observed. These findings suggest that the inflammatory response,

alterations in the endothelium integrity and hemosthasis, and the disruption of the brain

blood barrier are key elements of the pathogenesis of these infections. Bradykinin (BK) and

Angiotensin-1-7 (Ang 1-7) are plasma peptides that regulate vascular permeability and

hemostasis. They modulate endothelial cell function, inducing nitric oxide (NO) production,

which mediates vasodilatation and muscular relaxing, and can also influence cellular

apoptosis. In the present work, we evaluated the effect of BK and Ang 1-7 in the regulation

of DENV and SINV infection in a human brain microvascular endothelial cell line (BMEC)

and in a human glioma cell line (U87). We observed that BK (10nM) and Ang 1-7 (100nM)

positively modulated the replication of both viruses, by a mechanism dependent on B2R

and AT1R receptors. The presence of these peptides in the cultures of infected BMECs

inhibited the apoptosis mediated by the viruses, and this effect was also associated to B2R,

AT1R, and was blocked by an PI3 kinase (PI3K) inhibitor, wortmanin. Furthermore, the

analysis of BMEC infection by DENV demonstrated that the virus and the peptides BK and

Ang 1-7 induced NO production when added alone. However, the addition of the peptides

after BMECs infection promoted an inhibition of NO production. This inhibition was

reverted by B2R and AT1R antagonists and by wortmanin, suggesting that this event is

modulated by mechanisms that are similar to the ones involved in the modulation of viral

replication and apoptosis. In fact, NO inhibits DENV replication in BMECs and induce

apoptosis, given that the addition of an NOS inhibitor (L-NMMA) promoted an increase in

the viral titers and an inhibition of virus-mediated apoptosis. Taken together, our data

indicate that BK and Ang 1-7 potentiate DENV and SINV infection in endothelial (DENV

and SINV) and glia (SINV) cells, and this event may be associated to delay in the apoptosis

and a decrease in NO production.

Sumário

1. Introdução 15

1.1. Arbovírus 15

1.1.1. Família Togaviridae 15

1.1.1.1. Alphavirus 16

1.1.1.1.1. Estrutura e Biossíntese do Vírus Sindbis 17

1.1.1.1.2. Patogênese do Vírus Sindbis 20

1.1.2. Família Flaviviridae 22

1.1.2.1. Vírus da Dengue 23

1.1.2.1.1. Estrutura e Biossíntese do Vírus da Dengue 24

1.1.2.1.2. Manifestações Clínicas e Patogênese da Dengue 27

1.2. Mecanismos de Indução de Apoptose Celular e seu Papel na Infecção

Viral

1.3. Óxido Nítrico 34

1.4. Mediadores Vasoativos 36

1.4.1. Sistema Calicreína-Cinina 36

1.4.2. Sistema Renina-Angiotensina 39

1.4.3. Integração dos Sistemas Calicreína-Cinina e Renina-Angiotensina 42

1.5. Papel do Sistema Renina-Angiotensina em Infecções Virais 44

1.6. Justificativa do Trabalho 45

2. Objetivos 47

2.1. Objetivo Geral 47

2.2. Objetivos Específicos 47

3. Material e Métodos 49

3.1.Cultura de Células 49

3.2. Vírus 50

3.3. Infecção das Células Endoteliais e Macrófagos 50

3.3.1. Análise da Infecção Celular por Plaqueamento 51

3.3.2. Análise da Infecção Celular por Imunofluorescência (IF) 52

3.4. Análise da Expressão de Receptores de Cininas e Angiotensina 52

3.5. Análise da Viabilidade Celular após Infecção com Vírus da Dengue e 53

com vírus Sindbis, na Presença de Cininas e Angiotensina

3.6. Avaliação da Produção de Óxido Nítrico pelas Células Endoteliais após

Infecção com Vírus da Dengue, na Presença de Cininas e Angiotensina

3.7. Analise da Interferência de Óxido Nítrico na Infecção de Células

Endoteliais pelo vírus da Dengue, Modulada por Bradicinina e Angiotensina

1-7

3.8. Analises Estatísticas 56

4. Resultados 57

4.1. Infecção de Células Endoteliais pelos Vírus da Dengue e Sindbis 57

4.2. Bradicinina é Capaz de Potencializar a Infecção de BMECs pelo Vírus

Sindbis.

4.3. Angiotensina 1-7 Modula a Infecção de BMECs pelo Vírus Sindbis

Através dos Receptores de Angiotensina AT

e MAS

4.4. Os peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7 também Potencializam a

Infecção de Células de Glioma (U87) pelos Vírus Sindbis

4.5. Os peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7 Protegem as Células

Endoteliais da Apoptose Induzida por Sindbis.

4.6. Modulação da Infecção de Células Endoteliais pelo Vírus da Dengue

Mediada por Bradicinina e Angiotensina 1-7.

4.7. Bradicinina Modula a Apoptose Celular em BMECs Infectadas com o

Vírus da Dengue

4.8. Os Peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7 Modulam a Produção de

NO em BMECs Infectadas com o Vírus da Dengue via Receptor B

4.9. A via PI3K pode estar Envolvida na Modulação de NO Mediada por

Bradicinina em BMECs Infectadas com o Vírus da Dengue

4.10. Papel do NO na Indução da Apoptose Mediada por DENV2 e na

Regulação da Replicação Viral

5. Discussão 82

6. Conclusões 91

7. Modelo Proposto 92

8. Referências Bibliográficas 93

Dedico essa dissertação ao meu Pai, meu

ídolo, meu grande incentivador. Sei que

onde estiver está orgulhoso de mim.

Obrigada por todo amor que teve por

mim, obrigada por todos os momentos

felizes que tivemos, obrigada pelos

puxões de orelha... A vida não tem a

mesma essência sem você... mas posso te

sentir aqui pertinho.. Saudades eternas.

Eu te amo!!

“Quem busca a verdade, deve

questionar tudo.” (Aristóteles)

Agradecimentos

- Ao meu orientador Júlio por investir e acreditar em mim e pela compreensão;

- A minha co-orientadora Luciana pela confiança depositada em mim, pelo incentivo, apoio,

compreensão e pela amizade;

- A Lígia pelo incentivo, orientação e pelo espaço de trabalho cedido;

- Aos colegas de laboratório, Aline, Ana Carolina, Andreza, Carolina, Débora, Juliana,

Leonardo, Raquel, Rodrigo, Thaline e Sidney, pela grande amizade que vocês têm por mim.

Obrigada pelo apoio, compreensão, carinho. Vocês foram essenciais para a realização desse

trabalho e, principalmente, para eu superar os momentos mais difíceis da minha vida;

- A Leila pelos ensinamentos e apoio na sala de cultura;

- A Daniele pela amizade, ensinamentos e ajuda com as imunofluorescências;

- Aos colegas do laboratório de Imunobiologia, Alessandra, Ilka, Verônica, Larissa, Ana

Carolina, Alda pelo apoio;

- Aos amigos dos laboratórios do Marcelo e da Elvira, obrigada por todo apoio, pelo

material cedido e amizade;

- A Juliana e a Wânia, por serem a minha família aqui no Rio. Obrigada por todo apoio,

compreensão e por toda a amizade e carinho dedicados a mim;

- Aos meus grandes amigos Agatha, Caíque, Daniela, Raphaela e Débora pelo incentivo,

apoio incondicional e pela amizade;

- Especialmente a minha mãe, meu pai, e meus irmãos vocês são a razão de toda a minha

existência. Obrigada pelo amor, confiança e orgulho que vocês têm por mim. O incentivo e

a força que depositaram em mim foi essencial para eu chegar até aqui;

- A todos os meu familiares que sempre torceram por mim;

- À Deus por trilhar o meu caminho e me dar forças para superar todos os obstáculos;

- À todos os colaboradores por todo material cedido.

Lista de Figuras

Figura 1 - Ciclo Viral de Sindbis 19

Figura 2 – Ciclo Viral de Dengue 26

Figura 3 – Patogênese da Dengue 32

Figura 4 – Sistema Calicreína-Cinina 37

Figura 5 – Sistema Renina-Angiotensina 42

Figura 6 – Integração dos Sistemas Calicreína-Cinina e Renina-Angiotensina 43

Figura 7 - Avaliação da Permissividade de BMECs por SINV 58

Figura 8 - Potencialização da Infecção de BMECs pelo Sindbis por

Bradicinina.

Figura 9 - Angiotensina 1-7 Modula a Infecção de BMECs por Sindbis,

Mediada pelos Receptores AT

e MAS

Figura 10 - Os peptídeos Angiotensina 1-7 e Bradicinina Modulam a

Infecção de U87 pelo Virus Sindbis, Mediada pelos Receptor Específicos

Figura 11 - Modulação da Apoptose Celular Induzida por SINV, Mediada

por Angiotensina 1-7 e Bradicinina

Figura 12 - Análise da Expressão de Receptores de Bradicinina em BMECs

Infectadas por Vírus da Dengue.

Figura 13 - Potencialização da Infecção de BMECs pelo Vírus da Dengue

Mediada por Bradicinina.

Figura 14 - Potencialização da Infecção de BMECs pelo Vírus da Dengue

Mediada por Angiotensina 1-7

Figura 15 - Angiotensina 1-7 Modula a Infecção de BMECs pelos Vírus da

Dengue e Sindbis, Mediada pelos Receptores AT

e MAS

Figura 16 - Bradicinina Inibe a Apoptose Induzida por DENV em BMECs. 73

Figura 17 - Bradicinina Inibe a Produção de NO em Células Endoteliais,

Induzida pelo Vírus da Dengue.

Figura 18 - Angiotensina 1-7 Inibe a Produção de NO em Células

Endoteliais, Induzida pelo Vírus da Dengue

Figura 19 - A inibição da Produção de NO em BMECs Infectadas por

DENV, Mediada por Bradicinina, pode ser Via PI3K.

Figura 20 - L-NMMA Inibe a Produção de NO em BMECs sem Interferir na

Viabilidade Celular.

Figura 21 - Papel do NO na Apoptose Induzida por DENV2 e na Regulação 81

da Replicação Viral

Figura 22 – Mecanismos de Modulação da Infecção por Dengue em Células

Endoteliais

Abreviações

A779 – antagonista do receptor de angiotensina 1-7

Ac – anticorpo

AKT – proteína cinase B (“Protein Kinase B”)

Ang 1-7 – angiotensina 1-7

Ang II – angiotensina II

– receptor para angiotensina II tipo 1

- receptor para angiotensina II tipo 2

R – receptor B

de bradicinina

R – receptor B

de bradicinina

BK – bradicinina

BMEC – células endoteliais microvascular cerebral humana (“Brain microvascular

endothelial cells”)

BSA – albumina de soro bovino (“Bovine serum albumin”)

C3a –anafilotoxina 3 do complemento

C5a –anafilotoxina 5 do complemento

C6/36 – linhagem de células de mosquito Aedes albopictus

CPE – efeito citopático

CPM – carboxipeptidase M ou cininase I

Des-BDK – des-Arg

-bradicinina

DAF-FM – 4-amino-5-metilamino-2,7-difluoresceína

DCs – células dendríticas

DENV-2 – dengue vírus sorotipo-2

ECA – enzima conversora de Angiotensina tipo 1ou cininase II

ECA 2 - enzima conversora de Angiotensina tipo 2

eNOS – óxido nítrico sintase endotelial

Fc – porção constante da imunoglobulina

FHD – febre hemorrágica de dengue

GPCRs – receptores acoplados a proteína G-regulatória

HK – cininogênio de alto peso molecular

HOE 140 – antagonista de B

HUVEC – célula endotelial de veia de cordão umbilical humano

ICAM-1 – molécula de adesão intracelular

IFN-γ – interferon gama

IL – interleucina

iNOS – óxido nítrico sintase induzível

JEV – vírus da encefalite Japonesa

[Leu

]-des-Arg

-BDK – antagonista do receptor de bradicinina

Lis – lisinopril

LK – cininogênio de baixo peso molecular

Losartan – antagonista do receptor AT

LPS – lipopolissacaídeo de parede de bactérias gram negativas

MAS – receptor de angiotensina 1-7

MHC – molécula de histocompatibilidade principal

MIF – fator inibidor de migração

MIP – proteína inflamatória de macrófago

MOI – multiplicidade de infecção

NEP – endopeptidase neutra

NF-κB – fator de transcrição κ B

nNOS - óxido nítrico sintase neuronal

NO – óxido nítrico

OMS – organização mundial de saúde

ORF – região aberta de leitura

PAF – fator ativador de plaqueta

PBMC – células polimorfonucleres de sangue periférico

PBS – salina tamponada em fosfato

PFU – unidade formadora de placa

PKC – proteína cinase C

p,i. – pós infecção

P.I. – iodeto de propídeo

PI3K – fosfatidilinositol 3-cinase

RNA – ácido ribonucléico

SINV - Sindbis

SFB – soro fetal bovino

TNF-α – fator alfa de necrose tumoral

VCAM-1 – molécula de adesão vascular

VEGF – fator de crescimento de endotélio vascular

WEV– vírus do oeste do Nilo

Wort – wortmanina

1. Introdução

1.1 – Arbovirus

Os Arbovíus compreendem um grupo de vírus que são transmitidos por vetores

artrópodes. A replicação viral ocorre tanto no hospedeiro invertebrado quanto no

hospedeiro vertebrado (Nathanson, 1996). Mais de 500 vírus ecologica e

epidemiologicamente distintos pertencem a esse grupo (Tesh, 1982), sendo os mais

importantes para saúde pública pertencentes às famílias Flaviviridae, Togaviridae e

Bunyaviridae (Kuniholm et al., 2006). Além do modo de transmissão, esses vírus têm

como característica serem envelopados e possuírem RNA como genoma (Romanos,

2002).

1.1.1 – Família Togaviridae

Originalmente os Togaviridae eram formados por diversos gêneros agrupados

baseados nos seguintes itens (i) - RNA fita simples não segmentado; (ii) forma de

transcrição – RNA funciona como mRNA; e (iii) modo de transmissão. Devido a essas

características, os Flavivirus foram inicialmente classificados como pertencentes a essa

família. Estudos sobre a estrutura do genoma e replicação estabeleceram a criação da

família Flaviviridae, ficando apenas os gêneros Alphavirus e Rubivirus como membros

de Togaviridae. Os rubivirus são representados pelo vírus da rubéola. Esses vírus não

são capazes de replicar em células de insetos, apenas células de vertebrados causando

pouco efeito citopático, diferentemente dos alphavirus (rev. Schlesinger e Schlesinger,

1996).

1.1.1.1 – Alphavirus

Os alphavirus compreendem uma variedade de espécies de vírus que

compartilham características moleculares e estruturais, mas são responsáveis por

diferentes síndromes em humanos e em modelos experimentais de animal. As infecções

em humanos podem ser assintomáticas, causar febre branda, ou gerar doenças graves,

acometendo as articulações e o sistema nervoso central, com subseqüente encefalite

(Johnston e Peters, 1996). Todos os alphavirus patogênicos para humanos replicam e

são transmitidos por mosquitos, entretanto, alguns membros do grupo têm sido isolados

de outros artrópodes hematófagos como carrapato. A distribuição geográfica desses

vírus está relacionada com a presença do mosquito vetor, sendo abundante em regiões

tropicais (Strauss e Strauss, 1994).

O vírus Sindbis (SINV) é o representante dos alphavirus mais estudado, sendo

considerado o protótipo para o estudo de replicação e utilização como vetor biológico

(Johnston e Peters, 1996), sendo amplamente distribuído pela Europa, África, Ásia e

Austrália (Kurkela, et al., 2005). O primeiro registro de infecção por SINV foi em

1952, quando o vírus foi isolado de mosquito do gênero Culex coletado na vila de

Sindbis próximo ao Cairo (Taylor et al., 1955). Hoje se sabe que SINV pode também

ser transmitido pelos gêneros Aedes e Culisela, geralmente adquiridos de aves (Laine et

al., 2004).

Durante anos SINV foi considerado um vírus não patogênico, pois não haviam

sido caracterizados os sintomas da infecção pelo vírus. Em 1961, na Uganda, sintomas

clínicos foram observados em infecção por SINV (Gresikova et al., 1978), mas apenas

em 1980 evidências sorológicas associaram rachaduras e artrites epidêmicas ao vírus.

Mais recentemente demonstraram que SINV foi identificado como agente etiológico da

doença conhecida como “Pagosta” (Kurkela et al., 2005).

Os sintomas da Pagosta aparecem na fase aguda da doença após um período de

aproximadamente 8-9 dias que corresponde à incubação do vírus. O paciente apresenta

inflamação nas articulações, rachadura na pele, fadiga, enxaqueca, febre branda e dor

muscular (Kurkela, et al., 2005; Laine et al., 2004). O acometimento das articulações,

provavelmente, permanece por mais de 12 meses, dependendo da idade do paciente. O

diagnóstico pode ser dado por detecção do RNA viral no sangue ou isolando o vírus da

pele (Kurkela, et al., 2005).

1.1.1.1.1 - Estrutura e Biossíntese Viral do Vírus Sindbis

SINV é formado por um nucleocapsídeo icosaédrico composto por 240 cópias da

proteína do capsídeo (C), envolto por uma bicamada lipídica derivada da membrana

celular do hospedeiro. As duas glicoproteínas virais do envelope, E1 e E2, encontram-se

na forma de heterodímeros E1-E2, e interagem com o capsídeo através de projeções

internas na camada lipídica (rev. Schlesinger e Schlesinger, 1996).

O genoma é composto por RNA fita simples, de polaridade positiva, contendo

11,5 kb, arranjado em dois módulos. O primeiro módulo que corresponde a dois terços

da região 5’ codifica proteínas não estruturais (nsPs 1-4), requeridas para a replicação e

transcrição do RNA. O segundo módulo, correspondente a um terço da região 3’,

codifica as proteínas estruturais E1, E2 e C. O terminal 5’ é capeado por 7-

metilguanosina e o terminal 3’ é poliadenilado (rev. Schlesinger e Schlesinger, 1996).

A biossíntese viral (Fig. 1) se inicia com a entrada do vírus na célula hospedeira,

via endocitose, após interação entre receptores celulares ainda não caracterizados com a

glicoproteína de envelope E2. Anticorpos neutralizantes contra a proteína E2 e

mutações em E2 ou E1 são capazes de alterar a capacidade de infecção do vírus (Chanas

et al., 1982). As vesículas contendo vírus sofrem processo de acidificação levando a

dissociação do heterodímero E1-E2 e concomitante trimerização da subunidade E1

(Schlesinger e Schlesinger, 1996). Esta mudança inicia a fusão do envelope lipídico

com a membrana do endossomo, promovendo a liberação do genoma viral contido no

nucleocapsídeo para o citoplasma (Strauss e Strauss, 1994), evento que permite acesso

dos ribossomos celulares ao RNA viral para iniciar a tradução.

A poliproteína produzida é co-traducionalmente e pós-traducionalmente clivada

em quatro regiões, dando origem às proteínas não estruturais (nsP1-4) requeridas para a

iniciação da amplificação do RNA viral. A protease ativa responsável pela clivagem

está localizada no domínio C-terminal da nsP2 (Strauss e Strauss, 1994; Schlesinger e

Schlesinger, 1996). O RNA fita positiva é também utilizado como molde para gerar a

fita complementar negativa, que dará origem a novos genomas, e ao RNA subgenômico.

As proteínas estruturais são sintetizadas como poliproteína a partir do mRNA

subgenômico. As glicoproteínas do envelope E1 e precursor de E2 (PE2) são separadas

por clivagem da peptidase sinal, formando um heterodímero que migra através da via

secretória para a membrana plasmática (Frolov, et al., 1996).

No citoplasma, o complexo composto da subunidade C e do genoma viral forma

o nucleocapsídeo, que se associa à membrana plasmática, adquirindo um envelope

Figura 1 – Ciclo Viral de Sindbis. 1. Adsorção e entrado do vírus por endocitose. 2.

Liberação do RNA viral no citoplasma. 3. Tradução do genoma em poliproteína viral. 4. RNA

(+) será transcrito em RNA (-) por nsP. 5 e 6. RNA (-) dará origem a novos RNA (+) que serão

traduzidos em proteínas estruturais. 7, 8 e 9. As proteínas estruturais são transportadas até a

membrana por via secretória. 10. Genoma viral se liga ao capsídeo. 11 e 12. Saída do vírus por

botamento. 13. Partícula viral madura.

contendo a bicamada lipídica e as glicoproteínas virais (Frolov et al., 1996).

RNA (+)

RNA (-)

www2.cbm.uam.es/.../Virologia/Togavirus.htm

1.1.1.1.2 - Patogênese do Vírus Sindbis

Devido à interação do vírus com a célula hospedeira ser mediada pela

glicoproteína E2, a mudança de apenas um aminoácido dessa proteína afeta a virulência

de estágios iniciais da replicação de SINV em neurônios (Griffin, 1998). Além disso,

anticorpos neutralizantes contra a proteína E1, são capazes de diminuir a infecção em

células VERO. No entanto, anticorpos subneutralizantes contra essa mesma proteína

viral induzem aumento da infecção em linhagem de macrófagos mediada por receptor

Fc (Chanas et al., 1982).

Estudos comprovam que SINV é capaz de infectar uma variedade de linhagens

de células de inseto e de vertebrados, tanto in vitro quanto in vivo, como neurônios

(Griffin, 1998; Lewis, et al., 1996, 1999; Lin et al., 1999), fibroblasto, célula muscular

(Frolov, et al., 1996), célula tumoral (Tseng et al., 2002) dentre outras. Em cultura de

células de vertebrados infectadas com SINV, é observada uma drástica redução na

transcrição do mRNA do hospedeiro, devido ao direcionamento da maquinaria celular

para produção do mRNA viral (Frolov, et al., 1996). Além disso, a célula exibe efeito

citopático e morte em 24 - 48 h pós infecção (p.i.). Em contraste, em células de inseto, o

efeito citopático da replicação viral é mínimo, com estabelecimento de infecção

persistente pelo vírus (Johnston e Peters, 1996; Frolov, et al., 1996).

Dados da literatura têm demonstrado que a doença causada pela infecção de

camundongos por SINV é dependente da idade do hospedeiro (Taylor et al., 1955) e da

cepa viral utilizada (Griffin, 1998). O SINV tem tropismo pelo sistema nervoso, sendo

capaz de induzir apoptose em neurônios jovens, conduzindo a morte do hospedeiro

(Lewis et al., 1996). Neurônios maduros seriam resistentes por expressarem proteínas

inibidoras de morte programada (Lewis et al., 1996; Griffin, 1998).

Os mecanismos envolvidos no aumento da resistência à apoptose por neurônios

maduros não são bem conhecidos. Sabe-se que a apoptose induzida por SINV em

neonatos pode ser bloqueada por inibidores de caspase-3 (Labrada et al., 2002), e por

membros da família de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 (Jan e Griffin, 1999) e Bax

(Lewis et al., 1999). A indução de apoptose foi também bloqueada por inibidores de

acidificação do endossomo. Esses experimentos demonstraram que o processo de

apoptose inicia com a interação entre glicoproteínas do vírus e receptor celular sem

depender da replicação viral e que a apoptose é engatilhada durante o processo de fusão

do envelope viral com a membrana da célula hospedeira (Jan e Griffin, 1999; Lewis et

al., 1999; Jan et al., 2000).

Não apenas a indução de apoptose está envolvida na maior susceptibilidade de

neonatos a infecção por SINV. Labrada e colaboradores demonstraram em 2002 que em

cérebro de camundongos adultos a expressão de genes para IFN está aumentada, quando

comparada com neonatos. A indução desse gene resulta em retardo da morte desses

camundongos, mostrando um efeito protetor do IFN. Além disso, camundongos

neonatos apresentam maiores níveis de expressão de genes inflamatórios no cérebro,

como genes para MIP-2 e RANTES (Labrada et al., 2002), e níveis aumentados de

algumas citocinas pro-inflamatórias, como TNF-α, IFN-γ, IFN-α/β e IL-6 no soro de

camundongos infectados com o vírus Sindbis (Klimstra, et al., 1999).

Em alguns modelos murinos de infecção intracerebral, foi observado que a

eliminação da infecção está associada à presença de anticorpos neutralizantes contra a

proteína E2, além da presença de outros tipos celulares, como os linfócitos T CD4

e T

CD8

(Rowell e Griffin, 1999). Em geral, infecções no tecido cerebral são bem

controladas, e a barreira endotelial sangüínea serve como proteção contra a maioria das

células do sistema imune. Somente os linfócitos T conseguem ultrapassar esta barreira,

caso os antígenos se apresentem no tecido cerebral. Mesmo assim, a escassez de

moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e de moléculas co-

estimulatórias inibem a ativação desses linfócitos. Desta forma, a diferença de resposta

imune entre os modelos murinos, pode estar associada a diferentes padrões de resposta

imunológica, com a síntese e liberação de diversas citocinas as quais serão

determinantes para a severidade da infecção (Rowell e Griffin, 1999).

1.1.2 –Família Flaviviridae

A família Flaviviridae inclui três gêneros, os Flavivirus, os Pestivirus e

Hepacivirus (vírus da hepatite C - HCV). Esses três gêneros possuem diversidade

biológica e não apresentam reatividade sorológica cruzada entre si. No entanto, as

similaridades na morfologia, na organização do genoma e na estratégia de replicação

permitiram o agrupamento desses três gêneros em uma única família. O vírus da febre

amarela foi o primeiro vírus identificado como causador de doença em humanos

transmitido por artrópodes. Esse achado permitiu a criação da família Flaviviridae

(flavus derivado do latim amarelo) que recebeu esse nome devido ao seu vírus tipo

(Rice, 1996).

Os Pestivirus são causadores de moléstias em animais, principalmente bovinos e

suínos, sendo de grande importância econômica. O gênero Hepacivirus é caracterizado

por vírus capaz de infectar humanos, mas não há evidências de transmissão mediada por

vetores (Rice, 1996).

1.1.2.1 – Vírus da Dengue

O vírus da dengue (DENV) pertence ao gênero Flavivirus, que compreende

cerca de 70 vírus, sendo que 67 são transmitidos por artrópodes. Dentre os arbovírus,

55% estão associados a doenças em humanos, como dengue, febre amarela, vírus da

encefalite Japonesa (JEV) e vírus do Oeste do Nilo (WNV), todos eles importantes para

saúde publica mundial (Monath e Heinz, 1996; Lee et al., 2005), sendo dengue

considerada como prioridade pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 2002).

O DENV se distribui na natureza na forma de quatro sorotipos geneticamente

distintos denominados DENV 1-4. A transmissão é feita através de mosquitos das

espécies Aedes aegypti e Aedes albopictus (Rice, 1996), sendo que para a última espécie

não foi registrado casos de transmissão no Brasil (Degallier et al., 2003).

O número de casos de infecção por dengue vem aumentando nos últimos anos, e

estima-se que 100 milhões de novos casos sejam registrados anualmente, incluindo a

incidência de casos fatais. Dados da OMS indicam que cerca de 2,5 milhões de pessoas,

em 100 países tropicais e subtropicais, estejam sob o risco de infecção, o que gera um

grave problema para a saúde publica em todo mundo (WHO, 2002; Pires Neto et al.,

2005). Os primeiros casos de dengue no Brasil foram registrados em 1986-87 e

associados com o sorotipo 1. Desde então, vários surtos importantes associados aos

sorotipos 2 e 3 vêm sendo registrados, chegando a mais de 1 milhão de casos. Quase

duas centenas de óbitos notificados em 2002 (Nogueira, et al., 1999; DeSimone, et al.,

2004). No ano de 2007, foram registrados de janeiro a novembro, 536.519 casos de

dengue clássica, incluindo 1.275 casos de febre hemorrágica de dengue (FHD) e 136

óbitos, de acordo com dados do Ministério da Saúde (Ministério da Saúde, 2007).

1.1.2.1.1 – Estrutura e Biossíntese do Vírus da Dengue

O vírus da dengue possui como genoma uma molécula de RNA fita simples e

polaridade positiva, inserida em um capsídeo protéico, icosaédrico, formado por várias

cópias de uma única proteína (C). Essa estrutura está recoberta por um envelope lipídico

onde encontram-se ancoradas por regiões hidrofóbicas as proteínas E e M (Rigau-Perez,

et al., 1998; Monath e Heinz, 1996). A proteína E é a principal estrutura exposta na

superfície da partícula, e está organizada em homodímeros paralelos a superfície do

vírus. Cada monômero contém três domínios: o centro estrutural amino terminal, o

domínio que contém o peptídeo hidrofóbico essencial para a fusão vírus-célula e,

finalmente, o terminal carboxílico, que vem sendo proposto como o domínio de ligação

nas regiões dos receptores celulares (Lee e Lobigs, 2002).

O RNA genômico possui cerca de 10,7 Kb, é capeado na extremidade 5’, mas

não é poliadenilado em 3’, e apresenta um único “open reading frame” (ORF),

codificando para uma única grande poliproteína. Flanqueando esse ORF estão regiões

não codificantes (UTR) nas extremidades 5’ e 3’ que contém seqüências conservadas e

complementares (Proutski, et al., 1997). Essas estruturas localizadas nas regiões UTRs

estão envolvidas no processo de síntese e tradução do RNA (Alvarez et al., 2005;

Holden et al., 2005).

Assim como mostrado com o vírus Sindbis, a biossíntese viral (Fig. 2) se inicia

com a interação de receptores específicos na superfície da célula hospedeira com a

proteína E do vírus da dengue (Chen, et al., 1997), permitindo a posterior internalização

da partícula viral por endocitose em vesículas recobertas por clatrina (Chambers, 1990).

A acidificação do endossomo promove uma mudança de conformação na proteína E de

dímeros para trímeros, promovendo a fusão do envelope viral com a membrana do

endossomo (Modis, et al., 2004). Após a fusão, o RNA viral é liberado no citoplasma e

a replicação viral se inicia (Rice, 1996).

O complexo de replicação (CR) exibe enzimas com multi-domínios que

apresentam atividades coordenadas, como RNA sintase, RNA cap, helicase e atividade

de protease (Selisko et al., 2006). O CR está localizado nas membranas celulares e

envolve as proteínas NS3, NS5, que são respectivamente a protease e a RNA polimerase

RNA dependente; a proteína NS1 (glicoproteína); as proteínas hidrofóbicas NS2A e

NS4A; além de fatores celulares do hospedeiro (Mackenzie et al., 1998; Westaway, et

al., 1997). As proteínas virais são geradas a partir da transcrição e tradução em uma

poliproteína, a qual é clivada co-traducionalmente e pós-traducionalmente, pelo

domínio N-terminal da NS3 e por proteases celulares (Speigth et al., 1988). A tradução

ocorre associada ao retículo endoplasmático rugoso, permitindo a translocação das

proteínas prM, E e NS1 para o lúmen, enquanto as demais proteínas permanecem no

citoplasma (C, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (Rice, 1996).

Assim como a tradução, a replicação também ocorre associada ao retículo

endoplasmático rugoso. Através da fita de RNA polaridade positiva é formada uma fita

negativa complementar, essa serve como molde para a síntese de novas fitas de RNA

positivas, que darão origem a novas proteínas ou novos virions. No citoplasma, a

proteína C interage com o RNA viral para formar o capsídeo (Rice, 1996; Uchil et al.,

2006). Os vírus morfologicamente maduros são transportados à superfície celular pela

via secretória e liberados por exocitose. Assim como a entrada, a saída das partículas

virais dep ação e

prom m

írus

Figura 2 – Ciclo Viral de Dengue 1. Adsorção e entrado do vírus por endocitose. 2.

Fusão do envelope viral com a membrana do endossoma. 3. Liberação do RNA viral no

citoplasma. 4. Tradução da poliproteína viral associada a membrana do retículo endoplasmático.

5 e 6. Replicação viral. 7. Os vírus imaturos são transportados para a membrana por via

secretória. 8. Os vírus maduros são liberados por exocitose.

ende da queda do pH para que a proteína E sofra mudança de conform

ova a fusão com a membrana celular. Em 8 a 10 horas pós-infecção já existe

partículas virais prontas e, em cerca de 20 horas começa haver a liberação de v

(Rice, 1996).

RNA RNARNA RNA

2 3

1.1.2.1.2 – Manifestações Clínicas e Patogênese da Dengue

A maioria das infecções causadas pelo vírus da dengue apresenta sintomas

brandos como febre, dor de cabeça e mialgia, sendo denominada febre clássica da

dengue (FD). Entretanto alguns indivíduos podem desenvolver sintomas mais graves

como coagulopatia vascular disseminada, extravasamento capilar, trombocitopenia e

disfunção plaquetária, e podem evoluir ao óbito. As formas mais graves são

classificadas como febre hemorrágica da dengue (FHD) e síndrome do choque da

dengue (SCD) (rev. em Rothman, 2004; Bhamarapravati, et al., 1989; Rothman e Ennis,

1999; Huang, et al., 2001).

A patogênese causada pela infecção por dengue e, principalmente, os

mecanismos de desenvolvimento de formas graves ainda permanecem desconhecidos.

Fatores genéticos do hospedeiro (Halstead, 2001; Loke, et al., 2001; Zivna, et al., 2002)

e diferenças de virulência entre as cepas virais (Rico-Hesse, et al., 1997; Leitmeyer, et

al., 1999; Cologna, et al., 2003) podem favorecer o desenvolvimento de formas graves,

entretanto, a potencialização da infecção por mecanismos imunopatológicos também

vem sendo avaliada (Green, et al., 1999; Halstead e O’Rourke, 1977; Rothman e Ennis,

1999). A primeira hipótese criada para explicar o desenvolvimento de formas graves foi

relacionada a potencialização da infecção mediada por anticorpos ou “enhancement”.

De acordo com essa hipótese, anticorpos produzidos em infecções prévias teriam reação

cruzada com antígenos de infecções correntes, mas estes anticorpos não teriam atividade

neutralizante. A formação de imunocomplexos vírus-anticorpo facilitaria a infecção de

células alvo que possuem receptores para a porção Fc de imunoglobulinas (FcγR)

(Halstead e O’Houke, 1977). O aumento da carga viral mediado pelo “enhancement” foi

observado em estudos feitos com monócitos e macrófagos humanos infectados com

dengue, na presença de anticorpos heterólogos em concentrações subneutralizantes

(Anderson, et al., 1997; Chen, et al., 2000).

Além de facilitar a infecção de células alvo, a formação de imunocomplexos

poderia ativar o sistema complemento, com subseqüente liberação de anafilatoxinas

envolvidas com o aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de líquido

(Halstead e O’Rourke, 1977; Rothman e Ennis, 1999). De fato, o nível de proteínas do

complemento, C3a e C5a, alcançam o pico no período de defervescência quando o

extravasamento de líquido torna-se mais aparente (Malasit, 1987).

A patofisiologia da dengue envolve também outros componentes do sistema

imune. Nesse sentido, a ativação de linfócitos T e a produção de citocinas tem sido

descritas como importantes para a patogênese de formas graves (Rothman 1998), e a

fisiologia da doença parece ser resultado de uma exacerbada resposta imune. A ativação

de células T pelo vírus induz a liberação de citocinas, atividade citotóxica e produção de

células T de memória vírus-específica (Bashyam et al., 2006). Durante a infecção

secundária, células de memória são ativadas por vírus heterólogos, e a mudança de

apenas um epítopo é capaz de induzir a secreção de distintas citocinas e aumentar ou

diminuir a atividade citolítica de células T. Esta resposta imune exacerbada pode

culminar no desenvolvimento de FHD (Bashyam et al., 2006; Imrie et al., 2007). Além

disso, a mudança do tipo Th1 para uma resposta Th2, com aumento de IL-4 e IL-10

também tem sido associada ao desenvolvimento de FHD (Chatuverdi et al., 1999).

Entretanto, apenas o “enhancement” e/ou a exacerbação da resposta mediada por

linfócitos T não explica totalmente as principais manifestações clínicas relacionadas a

FHD, que é caracterizada por alterações no endotélio microvascular, incluindo aumento

na permeabilidade, extravasamento de líquido, além de quadros de trombocitopenia e

hemoconcentração (rev. em Rothman, 2004).

Tem sido caracterizado, in vitro, que células endoteliais são permissivas ao vírus

da dengue (Avirutnan et al., 1998; Huang et al. 2000; Peyreffite et al., 2006). A

infecção dessas células leva a ativação do sistema complemento e indução de apoptose

(Avirutnan et al., 1998). Esses fatores poderiam contribuir para o dano causado ao

endotélio, o que pode gerar um desequilíbrio na homeostasia e conduzir ao

extravasamento de líquido (Halstead, 1988; Rothman e Ennis, 1999). A infecção de

células endoteliais induz, ainda, aumentada produção de IL-6 (Huang et al. 2000), IL-8

(Avirutnan et al., 1998; Bosch, et al., 2002; Talavera, et al., 2004) e RANTES

(Avirutnan et al., 1998). A secreção de IL-8 pode ser induzida pela proteína, NS5

(Medin et al., 2005), sendo capaz de causar alterações no citoesqueleto de células

endoteliais levando a desorganização das junções do tipo “tight.” A alteração das

junções provoca aumento na permeabilidade endotelial que culmina com o

extravasamento de líquido (Talavera et al., 2004).

O aumento na expressão de moléculas de adesão, como VCAM, ICAM e E-

selectina (Cardier, et al., 2005; Anderson, et al., 1997) também tem sido observado após

a infecção de células endoteliais. Esses eventos podem ser responsáveis pelo

recrutamento de leucócitos para o local de infecção, potencializando a resposta

inflamatória e contribuindo para o aumento da permeabilidade vascular com posterior

extravasamento de líquido.

Além da ação direta do vírus na célula endotelial, mediadores inflamatórios

presentes no soro ou secretados por outras células, também podem atuar na ativação do

endotélio (Cardier et al., 2005). Pacientes com FHD apresentam alto nível de citocinas

inflamatórias como TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1, IL-10, IL-12 e IFN-γ (Azeredo, et al.,

2001; Bethell, et al., 1998; Hober, et al.,1993; Chatuverdi, et al., 1999; Huang, et al.,

2000). Foi demonstrado que monócitos infectados com o vírus da dengue, na presença

de anticorpos produzem TNF-α e esta produção compromete a barreira endotelial em

modelo in vitro (Anderson, et al., 1997). A relação entre macrófagos, altos níveis de

TNF-α e extravasamento de líquido também foi determinada em camundongos que

desenvolveram dengue hemorrágica (Chen et al., 2007).

A trombocitopenia e hemoconcentração são outras manifestações características

da FHD/SCD. Embora os mecanismos envolvidos nesses processos tenham sido pouco

estudados, existem evidências de que os sistemas de coagulação e fibrinólise estejam

ativados durante a infecção. É possível que o desequilíbrio entre esses sistemas possa

aumentar a susceptibilidade de FHD. A trombocitopenia parece ser resultado não só de

uma diminuição da produção de plaquetas (Mitrakul et al, 1987; La Russa e Innis,

1995), mas principalmente, à sua ativação exacerbada levando ao consumo exagerado

(Krishnamurti, et al., 2001). A ativação do endotélio pode ter um papel primordial nesse

processo, uma vez que a infecção de células endoteliais promove a adesão de plaquetas

(Krishnamurti, et al., 2002).

A ativação do endotélio e destruição/disfunção de plaquetas já foram também

relacionados a presença de autoanticorpos induzidos pela infecção (Lin, et al., 2002).

Anticorpos específicos para proteína não estrutural-1 (NS1), que apresentam reação

cruzada com endotélio, induzem apoptose das células endoteliais por uma via

dependente de mitocôndria e regulada por óxido nítrico (NO) (Lin, et al., 2002; Lin, et

al., 2004, Falconar, 1997). Esses anticorpos induzem também a ativação dessas células,

incluindo expressão de ICAM e maior capacidade de adesão de PBMC, além de induzir

a secreção de IL-6, IL-8 e MCP-1, por um mecanismo associado a ativação de NF-kB

(Lin, et al., 2005). Anticorpos anti-plaquetas, também foram observados em pacientes, e

apresentaram atividade citotóxica, especialmente quando obtidos de pacientes com FHD

(Lin, et al., 2001). A presença de anticorpos anti-plaquetas e anti-células endoteliais

poderia, então, estar relacionada à coagulopatia e vasculopatia.

A alteração da função e integridade do endotélio pode facilitar a disseminação

da infecção para outros sítios, como o sistema nervoso central (SNC). Em geral, a

infecção por dengue não está associada a manifestações neurológicas. Entretanto, tem

sido demonstrado que alguns casos de formas graves apresentam sintomas de

encefalopatia (Cam, et al., 2001). A patofisiologia dos sintomas neurológicos tem sido

atribuída a edema cerebral, hemorragia microcapilar, e falha hepática. Alguns estudos

têm sugerido, ainda, um potencial neurotropismo do vírus, e capacidade de atravessar a

barreira hematoencefálica, levando à encefalite, como ocorre com outros flavivirus, tais

como, WNV, StLouis, JEV (Chatuverdi, et al., 1991; Lum, et al., 1996; Miagostovich,

et al., 1997; Wang, et al., 2004). Linhagens de neuroblastoma susceptíveis à infecção,

sofrem apoptose dessas por um mecanismo dependente de caspase. Entretanto, a

apoptose induzida pelo vírus da dengue é um evento relativamente tardio na infecção

celular, e inicialmente, o vírus induz mecanismos anti-apoptóticos, assegurando a

sobrevivência dessas células através da ativação de PI3K/AKT, que só mais tardiamente

é seguido de ativação da apoptose (Lee, et al., 2005).

A ativação de células endoteliais induz a liberação de vários mediadores

químicos, como o NO, prostaglandinas, citocinas (Kono, Y. et al., 2002). Esses

mediadores podem agir na manutenção da homeostase vascular e na integridade das

células endoteliais. É possível que infecção pelo vírus da dengue também induza a

liberação desses mediadores em células endoteliais.

Figura 3 – Patogênese da Dengue

1.2 – Mecanismos de Indução de Apoptose Celular e seu Papel na Infecção Viral

A indução de morte celular por apoptose envolve a ativação de diferentes

caspases e pode ser induzida por duas principais vias (Mehmet, 2000). A via dependente

de receptor de morte é disparada pela interação dos ligantes específicos aos receptores

de superfície FAS e TNFR, levando a ativação de caspase-8 (Medema, et al., 1997). Já a

via mitocondrial está associada a uma alteração de potencial de membrana das

mitocôndrias, levando a liberação de citocromo c presente na membrana dessas

organelas para o citoplasma e está associada a ativação de caspase 9 (Li, et al., 1997).

Extravasamento de Líquido

Quimioci

EC ativ

nas, NO

ada

Ativação de

plaquetas

TNF-a,

IL-6, IL-8,

IN F-γ

ativação

CD4

CD8

lise

Ativa complemento

C3a,

C5a

Extravasamento de LíquidoExtravasamento de Líquido

Quimioci

EC ativ

nas, NO

ada

Ativação de

plaquetas

Quimioci

EC ativ

nas, NO

ada

Ativação de

plaquetas

TNF-a,

IL-6, IL-8,

IN F-γ

ativação

CD4

CD8

lise

TNF-a,

IL-6, IL-8,

IN F-γ

ativação

CD4

CD8

lise

CD4CD4

CD8

CD8CD8

lise

Ativa complemento

C3a,

C5a

Ativa complemento

C3a,

C5a

Essas vias podem ser indiretamente controladas por uma via de sinalização

intracelular que envolve a ativação da proteína fosfatidil inositol 3-cinase (PI3K), a qual

fosforila e ativa a proteína cinase B (AKT) (Cantley, et al., 2002; Kane, et al., 1999). A

proteína AKT ativada fosforila uma série de proteínas citoplasmáticas, induzindo

mecanismos anti-apoptóticos. Os alvos celulares de AKT são, principalmente, proteínas

envolvidas na indução de apoptose pela via mitocondrial. Dentre esses, está a proteína

Bad, que quando fosforilada, é seqüestrada no citoplasma, impedindo sua migração para

a mitocôndria. A própria caspase 9 também pode ser fosforilada por AKT, tendo sua

ativação bloqueada. Sabe-se, ainda, que a ativação de PI3K está envolvida na regulação

de vários processos celulares como proliferação, crescimento e sobrevivência celular, e

ativação de NF-kB, mecanismos esses que também envolvem ativação de AKT

(Cantley, et al., 2002; Kane, et al., 1999). Em contrapartida, a desfosforilação de AKT

ativa caspase conduzindo a apoptose (Lee, et al., 2005).

A indução da apoptose tem sido relacionada como um mecanismo citopatológico

comum na infecção viral. Tem sido observado que a forma severa de dengue é

associada com quadro de apoptose do tecido cerebral, intestino, fígado e pulmão. Essas

observações foram feitas através de tecido obtidos de indivíduos que chegaram ao óbito

como conseqüência de FHD (Limonata et al., 2007). A infecção de neurônios pelo vírus

Sindbis também induz apoptose, por mecanismo provavelmente relacionado com a

ativação de caspase-3 (Labrada, et al., 2002). Além disso, alguns Flavivirus, como o

vírus da dengue e o vírus da encefalite japonesa, induzem morte celular por apoptose

via caspase-9. Entretanto a indução da apoptose é um evento tardio na infecção viral,

inicialmente o vírus ativa a via da PI3K induzindo via de sobrevivência celular (Lee et

al., 2005).

1.3 – Óxido Nítrico

Óxido nítrico (NO) é um gás hiper–reativo que difunde facilmente entre as

membranas biológicas, e está presente em vários tecidos animais desempenhando

diversas funções. Em células de mamíferos, três tipos de enzimas são responsáveis pela

produção de NO a partir da L-arginina: a óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), NOS

induzível (iNOS) e NOS endotelial (eNOS). As três enzimas se assemelham na estrutura

e no modelo catalítico, mas diferenciam no mecanismo de controle da atividade, no

tempo e espaço (Alderton et al., 2001).

A enzima de nosso interesse é a eNOS, expressa em células endoteliais, miócitos

cardíacos e plaquetas do sangue (Palmer et al., 1992), além de ser encontrada em

linhagens de células do sistema imune, como células NK, linfócitos T e células

monocíticas (Bogdan, 2001). A eNOS encontra-se como uma proteína ancorada no

complexo de Golgi sendo transportada para cavéolas na membrana plasmática,

juntamente com caveolina-1, via vesículas. Sinais de estresse ou estímulo por VEGF,

bradicinina, serotonina, dentre outros, resultam na fosforilação de tirosina ou serina de

proteínas específicas, ativação da PI3K e subseqüente ativação de AKT. A ativação

dessas pelos referidos agonistas é mediada por receptores acoplados a proteína G

regulatória, levando ao influxo de Ca

intracelular. Este processo aumenta a afinidade

de eNOS por calmodulina, promovendo sua fosforilação. Em conseqüência disso, a

eNOS se dissocia de caveolina-1, favorecendo a produção de NO no citoplasma (Govers

and Rabelink, 2001).

NO tem papel importante na regulação de vários eventos fisiológicos, incluindo

vasodilatação e relaxamento do músculo liso dos vasos (arteríola e artérias), além de

funcionar como neurotrasmissor em vários processos e em patologias que envolvem o

endotélio vascular (Rogers and Fuseler, 2007). NO inibe o processo de agregação de

plaquetas, adesão de leucócitos e plaquetas ao endotélio (Radomski et al., 1987), e

apoptose celular (Hoffmann et al., 2001). O comprometimento na produção desse gás

tem sido associado a hipertensão, doenças no coração, aterosclerose e diabetes (Govers

and Rabelink, 2001; Vallance and Chan, 2001). Além disso, NO tem efeito citotóxico

ou citostático, sendo, portanto, importante na defesa do hospedeiro contra patógenos

(Akaike e Maeda, 2000). Dados da literatura demonstram que monócitos humanos

infectados com o vírus da dengue são capazes de produzir NO, e que esse inibe a

replicação viral através da inibição da polimerase viral (Neves-Souza et al., 2005;

Takhampunya et al., 2006). Pacientes com infecção secundária que desenvolveram

FHD, apresentam baixos níveis de óxido nítrico no plasma. Em contrapartida, a carga

viral nesses pacientes encontra-se aumentada quando comparada com pacientes com FD

ou FHD primária (Chareonsirisuthigul et al., 2007).

O óxido nítrico também está envolvido no controle da apoptose celular, mas

seus efeitos nesse processo ainda não foram bem estabelecidos. Sabe-se que NO pode

ter efeito anti ou pró-apoptótico dependendo do tipo celular, das condições

experimentais, dentre outros fatores. Dados da literatura indicam que a bradicinina é

capaz de inibir a apoptose de células endoteliais de cordão umbilical (HUVEC) via

indução de óxido nítrico (Kono, Y. et al., 2002). Em contrapartida, NO pode induzir

apoptose em uma variedade de células como macrófagos, células β do pâncreas,

neurônios, hepatócitos, dentre outras (Li e Wogan, 2005).

1.4. Mediadores Vasoativos

1.4.1 – Sistema Calicreína-Cinina

As cininas compõem um grupo de peptídeos vasoativos representado,

principalmente, pela bradicinina (BK). Esses peptídeos estão relacionados com o

aumento da permeabilidade vascular, indução de inflamação, quimiotaxia de

neutrófilos, dor, além de contribuir para a manutenção da homeostase vascular (Bhoola

et al., 1992; Campbell et al., 2001; Moreau et al., 2005).

A ativação do sistema calicreína-cinina se inicia com a ação de serino proteases

– calicreína plasmática e calicreína tissular, sobre a molécula de cininogênio (Mandle et

al., 1976; Bhoola et al., 1992). O gene do cininogênio, localizado no cromossomo 3q26,

origina transcritos que codificam duas proteínas, o cininogênio de alto peso molecular

(HK) e o cininogênio de baixo peso molecular (LK). Ambos possuem a mesma

seqüência de aminoácido na região N-terminal, mas o LK possui uma porção C terminal

mais curta, desprovida dos domínios de ligação para pré-calicreína. HK possui 6

domínios, sendo 1, 2 e 3 localizados na cadeia pesada e 5 e 6 na cadeia leve conectados

pelo domínio 4, que contém a seqüência da cinina. A clivagem do HK pela calicreína

plasmática no domínio 4, libera o nonapeptídeo ativo BK (Fig. 3), alvo de nosso

trabalho. A calicreína plasmática é produzida no fígado, sendo secretada

predominantemente, por células hepáticas na forma inativa de pré-calicreína. Já a

calicreína tissular está distribuída no rim, sistema nervoso central, pâncreas, baço,

dentre outros. Tem como substrato o LK liberando a calidina (Lisi-BK), mas pode atuar

também no HK (rev. Moreau et al., 2005).

Figura 4 – Sistema Calicreína-Cinina

As cininas geradas são rapidamente degradadas e metabolizadas por

metaloproteinases. Dentre estas, podemos citar a enzima conversora de angiotensina

(ECA), a endopeptidase neutra (NEP), a carboxipeptidase N (CPN), a carboxipeptidase

M (COM) e a aminopeptidase P (APP). Essas enzimas dependem de zinco no seu sítio

ativo e, excetuando a CPN, todas são glicoproteínas ancoradas a membrana, podendo

ser encontradas na forma solúvel em fluidos biológicos (rev. Moreau et al., 2005). De

fato, utilização de inibidores da ECA potencializa a ação da bradicinina. Este efeito é

possível devido a degradação do peptídeo, mas também pela capacidade da ECA em

interagir com o B

R e impedir a fosforilação dos resíduos de serina impossibilitando a

desensibilização do receptor (Tschöpe et al., 2002).

Os efeitos produzidos pelas cininas são mediados por dois subtipos de receptores

transmembrana, da família rodopsina, acoplados a proteína-G heterodimérica, receptor

de cinina B

R) e receptor de cinina B

R) (Regoli e Barabé, 1980; Prado et al.,

2002). O B

R é constitutivamente expresso na superfície de células endoteliais, células

do músculo liso, fibroblastos, neurônios, astrócitos, neutrófilos e células dendríticas

Cininogênio

Des-BK

Cininase I

Receptor B1

Receptor B2

ECA

Produto inativo

Lisil-BK

Calicreína

Plasmática

Calicreín

a Tissular

Des-Lisil-BK

Receptor B1

Receptor B2

Cininogênio

Des-BK

Cininase I

Receptor B1

Receptor B2

ECA

Produto inativo

Lisil-BK

Calicreína

Plasmática

Calicreín

a Tissular

Des-Lisil-BK

Receptor B1

Receptor B2

(Aliberti et al., 2003, Moreau et al., 2005). O engajamento do B

R é ativado por BK ou

lisil-BDK. Células endoteliais ativadas via B

R liberam várias substâncias, como óxido

nítrico, prostaglandinas, catecolaminas e citocinas associadas com a coagulação do

sangue e tônus vascular, além de aumentar a concentração de Ca

intracelular (Kono, et

al., 2002). O excesso de agonista induz a fosforilação de resíduos de serina presentes na

região C-terminal, promovendo a endocitose de B

R associada à caveola (Prado et al.,

2002; Tschöpe et al., 2002). Em contraste, a expressão de B

R é induzida por danos

causado no tecido através de trauma e/ou inflamação. Em tecidos normais a expressão é

ausente, ou quando existente encontra-se em níveis basais. O B

R é ativado pela [des-

Arg

]-BK ou [des-Arg

]-lisil-BK. Esses peptídeos são produtos do metabolismo de

cininas gerados por ação da enzima cininase I (carboxipeptidase M/N) e possuem a

região C-terminal truncada (Marceau, 1995). Os efeitos da ativação desse receptor são

muito semelhantes aos produzidos pela ativação de B

R. No entanto, B

R não possui a

seqüência de aminoácidos presente no C-terminal de B

R envolvida com a

internalização, portanto esse receptor não sofre o processo de endocitose (Prado et al.,

2002).

Para avaliar os efeitos dos peptídeos na ativação de seus receptores, foram

desenvolvidos fármacos com habilidade de antagonizar a ação das cininas. Os

antagonistas mais potentes para B

R são des-Arg

[Leu

]-BK e a des-Arg

[Leu

calidina (Burch e DeHass, 1990) e para B

R é o HOE 140 (D-Arg-[Hyp

-Thi

-D-Tic

Oic

]BK (Hock et al., 1991).

Trabalhos feitos por nosso grupo demonstram que tripomastigotas de

Trypanosoma cruzi clivam o cininogênio exposto na superfície celular liberando

cininas, que por sua vez ativam os receptores

R ou B

R promovendo a invasão de

células endoteliais (Nery et al., 1997; Scharfstein et al., 2000). Além disso, foi descrito

que as cininas são capazes de induzir a maturação de células dendríticas (DC),

aumentando a expressão de moléculas de superfície como MHC classe II, CD40, CD80

e CD86 por mecanismos dependentes da ativação de B

R. Utilizando modelo de

inflamação alérgica Th2 dependente demonstramos que a BK estimula produção de IL-

12 por DCs, deste modo direcionou a resposta adaptativa para perfil Th1 (Aliberti et al.,

2003).

Em trabalhos posteriores, nosso grupo demonstrou que a liberação de cininas em

tecidos infectados pelo T. cruzi ativa DC via B

R. A migração de DC carregando

antígenos para linfonodos drenantes, apresentam antígenos para linfócitos T virgens

intensificando a produção de citocinas (Aliberti et al., 2003, Monteiro et al., 2006;

Scharfstein et al., 2007).

Esta proposição mecanística foi subsequentemente comprovada utilizando

diversos modelo de infecção de T. cruzi (Aliberti et al., 2003, Monteiro et al., 2006;

Monteiro et al., 2007; Scharfstein et al., 2007)

1.4.2 – Sistema Renina-Angiotensina

O sistema renina-angiotensina também está envolvido no controle da

homeostase vascular através da geração de peptídeos, a partir do angiotensinogênio,

denominados angiotensina. O angiotensinogênio é uma glicoproteína, da família das

serpinas, produzida principalmente por hepatócitos. A hidrólise do angiotensinogênio

pela enzima renina, tem como subproduto o decapeptídeo angiotensina I (Ang I), que é

processado por ação da enzima conversora de angiotensina 1 (ECA) em um

octapeptídeo denominado angiotensina II (Ang II) (rev. Burrel et al., 2004).

Recentemente foi descrito uma nova enzima participante do sistema renina-

angiotensina, a enzima conversora de angiotensina 2 (ECA 2). A ECA 2 é uma

metaloproteinase dependente de zinco, que possui 42% de identidade com o sítio

catalítico da ECA (Donoghue et al., 2000). Encontra-se expressa em grandes

quantidades em células endoteliais do coração, rim e testículos. ECA 2 tem importante

papel no controle da homeostase vascular, pois hidrolisa Ang II, um potente

vasoconstrictor, em um peptídeo de função inversa, o vasodilador denominado

angiotensina 1-7 (Ang 1-7). ECA 2 também é capaz de clivar Ang I em angiotensina 1-

9, que por sua vez pela ação da ECA origina Ang 1-7 (Fleming et al, 2005). A via da

angiotensina está demonstrada na Figura 4.

As ações desses peptídeos são mediadas por 3 tipos de receptores acoplados a

proteína G (GPCR): AT

, AT

, MAS, além de AT

(não acoplado a GPCR). Os

receptores AT

medeiam a maioria das ações fisiológicas clássicas da Ang II, incluindo

vasoconstricção e hipertensão, enquanto que os receptores AT

modulam a função de

(Kurdi, et al., 2005). Além disso, há indícios da participação desses receptores em

apoptose celular e no reparo tecidual (Goldenberg, et al., 2001). A Ang 1-7 medeia os

efeitos de que são, na maioria das vezes, opostos aos da Ang II, através da ativação do

receptor MAS que é originado do proto-oncogene mas (Santos, et al., 2003).

Entretanto, nem todos os efeitos mediados pela Ang 1-7 são dependentes desse

receptor. Experimentos realizados utilizando A779, antagonista do receptor MAS, não

foi capaz de reverter o efeito da Ang 1-7 no tecido vascular, além disso, esse peptídeo é

capaz de induzir aumento na pressão arterial mediado pelo receptor AT

, como

evidenciado em experiências utilizando seu antagonista losartan. Esse aumento na

pressão é ainda mais forte quando utilizado o antagonista do receptor AT

(PD123319).

Esses fatos evidenciam que Ang 1-7 pode mediar suas funções também via receptores

, AT

ou, ainda, por um complexo mecanismo envolvendo reação cruzada ou

interações físicas entre os três receptores, MAS, AT

e AT

(Santos e Ferreira, 2007).

Efeitos mediados pela Ang 1-7 que não envolvem nenhum desses receptores e que

parecem estar associados a presença de um receptor ainda não caracterizado também já

foram descritos (Silva, et al., 2007).

Ang 1-7 está presente na circulação sangüínea e em tecidos, incluindo coração,

rim e tecido endotelial (Santos, et al., 2005). A presença da ECA 2 no endotélio faz

desse tecido o maior gerador de Ang 1-7 e também o maior alvo desse peptídeo. A

ativação do endotélio pela angiotensina 1-7, promove a liberação de óxido nítrico (NO),

prostaglandinas e fatores relaxantes responsáveis pelo fenômeno de vasodilatação. Esse

peptídeo é capaz de estimular a produção de óxido nítrico através da fosforilação de

eNOS por um mecanismo via AKT dependente de PI3K (Santos e Ferreira, 2007,

Holger et al., 2007). A ação da angiotensina 1-7 no endotélio propiciou a escolha desse

peptídeo no desenvolvimento do nosso trabalho.

Figura 5 – Sistema Renina-Angiotensina

1.4.3 – Integração dos Sistemas Calicreína-Cinina e Renina-Angiotensina

Embora didaticamente os sistemas calicreína-cinina e renina-angiotensina sejam

classificados de maneira distinta, eles estão em constante interação no organismo para

manter a homeostase vascular (Fig. 5). A BK, gerada através da clivagem do

cininogênio pela calicreína, promove a vasodilação, produção de NO, de prostaciclina,

de ativador de plasminogênio tecidual (tPA), e diminui a pressão sanguínea. Entretanto,

ela pode ser clivada pela ECA em um peptídeo inativo. A enzima ECA é responsável

pela clivagem de Ang I em Ang II, peptídeo que possui ação vascular contrária a BK.

Além disso, ECA também é capaz de gerar Ang 1-7 diretamente de Ang I. Uma outra

enzima, a prolilcarboxipeptidase (PRCP), é capaz de degradar Ang II e ativar pré-

calicreína, contribuindo para o balanço entre os dois sistemas. Por sua vez, a calicreína é

capaz de ativar a pró-renina em renina (Schmaier et al., 2003).

Renina

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang 1-9

ECA

ECA 2

Ang 1-7

ECA

Receptor MAS

Receptor AT1

Receptor AT2

ECA 2

Angiotensinogênio

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang 1-9

ECA

ECA 2

Ang 1-7

ECA

Receptor MAS

Receptor AT1

Receptor AT2

ECA 2

Renina

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang 1-9

ECA

ECA 2

Ang 1-7

ECA

Receptor MAS

Receptor AT1

Receptor AT2

ECA 2

Angiotensinogênio

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang 1-9

ECA

ECA 2

Ang 1-7

ECA

Receptor MAS

Receptor AT1

Receptor AT2

ECA 2

angioten o receptor

2 2

(Cam

ima, ou

m sido descrito

também

causa um idade de

cininogen et al.,

2002).

Figura 6 – Integração dos Sistemas Calicreína-Cinina e Renina-Angiotensina. 1. Clivagem

da BK pela ECA. 2. Clivagem da Ang I. 3. PRCP pode clivar Ang II e ativar pré-calicreína. 4.

Calicreína ativa pró-renina em renina. 5. Heterodimerização de AT1 com B

R. 6. Interação de

R com receptor MAS. As linhas e setas representadas em vermelho demonstram a via

inibitório da ECA.

Alguns eventos podem alterar o padrão de resposta dos receptores de cinina e

sina. A heterodimerização entre o receptor de angiotensina AT

com

induz um aumento da sinalização via AT

e diminuição da resposta mediada por B

pell, 2002). Além disso, Ang 1-7 é capaz de potencializar a resposta de BK, via

R, através da ligação desse peptídeo no sítio ativo da ECA, inativando a enz

por interação do receptor MAS após ser estimulado, com o B

R. Te

, que o estímulo do receptor AT

, por Ang II, na presença de antagonista de AT

a acidificação intracelular. Essa acidificação faz aumentar a ativ

ases, que leva a ativação do sistema calicreína-cinina (rev. Tschöpe

Cininogênio (HK)

BDK

Prorenina

Calicreína

Produto inativo

Renina

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang1-7

PRCP

AT1

AT2

MAS ECA

NEP

ECA

Angiotensinogênio

Produto inativo

Pré-calicreína

Prorenina

Calicreína

Produto inativo

Renina

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang1-7

PRCP

AT1

AT2

MAS ECA

NEP

ECA

Produto inativo

Pré-calicreína

Cininogênio (HK)

BDK

Prorenina

Calicreína

Produto inativo

Renina

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang1-7

PRCP

AT1

AT2

MAS ECA

NEP

ECA

Angiotensinogênio

Pré-calicreína

Produto inativo

Prorenina

Calicreína

Produto inativo

Renina

Ang I (1-10)

Ang II (1-8)

Ang1-7

PRCP

AT1

AT2

MAS ECA

NEP

ECA

Pré-calicreína

Produto inativo

1.5. Papel do Sistema Renina- Angiotensina em Infecções Virais

Estudos recentes têm demonstrado que o sistema renina-angiotensina contribui

para o desenvolvimento de doenças respiratórias agudas causadas por infecções virais

(Nicholls e Peiris, 2005). Dano alveolar difuso e mudanças histopatológicas associadas

com síndrome respiratória aguda severa (SARS) podem ser iniciados por gases nocivos

ou agentes infecciosos, incluíndo os vírus influenza e coronavirus. O coronavirus é

envelopado, com genoma RNA fita simples polaridade positiva, possui na porção N-

terminal uma glicoproteína (S) que medeia a ligação do vírus com o receptor celular

ECA 2, possibilitando a entrada do vírus na célula hospedeira (Mizutani et al., 2005;

Turner et al., 2004).

Dados da literatura demonstram que a ECA 2 tem um efeito protetor na infecção

por esses vírus, enquanto a ECA tem efeito prejudicial (Turner et al., 2004). Estudos

constataram altos níveis de ECA no fluido bronqueoalveolar de indivíduos que

desenvolveram síndromes respiratórias agudas. De fato, o tratamento de ratos, que

apresentam injúria pulmonar aguda, com inibidores da ECA foi capaz de retardar o

desenvolvimento de SARS (Turner et al., 2004).

A utilização de camundongos nocaute tem tentado esclarecer a participação das

enzimas ECA e ECA 2 no desenvolvimento de doenças pulmonares agudas.

Camundongos nocaute para o gene Eca2 apresentam maior dano no pulmão quando

comparados com o controle. Corroborando com esse achado, o tratamento com uma

proteína humana recombinante rhuECA2 foi capaz de diminuir a injúria. Em

contrapartida, a ECA está relacionada com o desenvolvimento da SARS por mecanismo

dependente de AT

(Imai et al., 2005).

Como já foi dito, ECA cliva o peptídeo Ang I em Ang II, que é clivado por ECA

2 gerando Ang 1-7. ECA 2 também é capaz de clivar Ang I gerando Ang 1-9. Dessa

forma ECA 2 regula negativamente as funções de Ang II. A ligação de SARS-CoV na

ECA 2 leva a sua inibição, e faz aumentar a disponibilidade de Ang II. De fato, observa-

se uma correlação entre a intensidade da injúria pulmonar e os níveis de Ang II no

pulmão e no plasma. A ação da Ang II parece ser mediada pelo receptor AT

, uma vez

que camundongos nocaute para esse receptor apresentam uma diminuição na injúria

pulmonar, enquanto que o bloqueio de AT

aumenta o dano pulmonar (Imai et al.,

2005).

1.6. Justificativa do trabalho

A descoberta de um vírus RNA fita simples polaridade positiva, capaz de se

ligar a enzima conversora de angiotensina 2 promovendo alterações vasculares por

mecanismos dependentes do sistema renina-angiotensina, é um importante precedente a

ser considerado nos estudos sobre o impacto destas infecções sobre o controle de

permeabilidade vascular.

Nas infecções causadas pelos vírus Sindbis e dengue e, particularmente, nas

formas severas de FHD, é plausível que a ativação de complemento por

imunocomplexos, associados a produção de citocinas pro-inflamatórias, estejam

implicadas nas alterações microvasculares observadas na dengue. Por outro lado, o

papel desse peptídeos vasoativos nessas alterações nunca foi avaliado. Neste projeto,

nós propusemos investigar o impacto da ativação dos sistemas calicreína-cinina e

renina-angiotensina sobre o endotélio, partindo da premissa que células endoteliais

infectadas pelo vírus dengue sejam sensíveis aos peptídeos vasoativos gerados nesses

sistemas.

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

O endotélio vascular e a integridade da barreira hematoencefálica têm um papel

central na patogênese da infecção por arbovírus como os vírus da dengue e Sindbis.

Pouco se sabe sobre a relação entre a resposta inflamatória e os componentes

fisiológicos envolvidos na hemostasia, controle de coagulação, e permeabilidade

vascular observados nessa doença. Os componentes dos sistemas renina-angiotensina e

calicreína-cinina ainda não foram objeto de estudo sistemático em infecções por

arbovirus. Portanto o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel desses peptídeos e

seus receptores na infecção do endotélio mediada pelos vírus da dengue e Sindbis,

buscando compreender uma possível correlação entre hemostasia, inflamação e

infecção.

2.2. Objetivos específicos

1. Utilizamos os vírus da dengue e Sindbis para verificar a influência das vias cinina-

calicreína e renina-angiotensina (i) na infecção de células de endotélio microvascular

cerebral humanas (BMECs), (ii) em linhagens de glioma humano, e caracterizar o papel

dos receptores B

R e B

R, MAS e AT

2. Investigar o papel desses peptídeos na regulação dos mecanismos de apoptose

induzidos pelos vírus.

3. Avaliar se a ativação de BMECs infectadas por DENV e SINV tem impacto sobre a

produção de NO pelo vírus da dengue e o papel dessa modulação no controle da carga

viral e da sobrevivência da célula.

3. Metodologia

3.1. Cultura de Células

As células de linhagem de endotélio microvascular cerebral humano (BMEC,

gentilmente cedida pelo Dr. Dennis J Grab, The Jonhs Hopkins University, EUA) foram

cultivadas em meio 199 (M199) acrescido de 10% de soro fetal bovino inativado (SFB -

Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) e ciprofluoxacina a 20 µg/mL (Sigma Chem Co; St

Louis, MO, EUA), a 37 ºC em atmosfera úmida contendo 5% CO

Linhagens de células VERO, originadas de rim de macaco, foram mantidas em

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA)

suplementado com 5% soro fetal bovino inativado (Sigma Chem Co; St Louis, MO,

EUA), 20 µg/mL de ciprofluoxacina a 37 ºC em atmosfera úmida contendo 5% CO

Células de glioma humano da linhagem U87 (gentilmente cedida pelo Dr. Dumith C.

Bou Habib, Fiocruz, RJ) foram cultivadas em meio RPMI 10% SFB inativado por calor,

suplementado com Hepes, β-mercatoetanol (50 μM), l-glutamina (2 mM), e antibiótico

a 37 ºC em atmosfera úmida contendo 5% CO

Células da linhagem C6/36, derivadas de espécies de mosquito Aedes albopictus

foram mantidas em meio de cultura Leibovitz L-15 (Invitrogen, Grand Island, NY,

EUA), suplementado com 5% soro fetal bovino (Sigma Chem Co; St Louis, MO, EUA)

e 10 μg/ml de gentamicina (Sigma Chem Co), a 28

C, em ambiente de CO

Após tratamento com tripsina, as células foram plaqueadas em placas de 6 e 24

poços de acordo com o modelo experimental.

3.2. Vírus

As amostras de vírus dengue 2 (DENV-2), cepa Nova Guiné (NG), foram

gentilmente cedidas por Dr. Ricardo Galler (Biomanguinhos, Fiocruz, Rio de Janeiro).

Amostras de vírus dengue 2 (cepa Jamaica) (Deubel et al., 1988) foram gentilmente

cedidas pela Dra. Claudia N. Duarte dos Santos (IBMP, Paraná). O vírus Sindbis

(SINV) foi gentilmente cedido pela Dra. Andréia T. DaPoian (IBqM, UFRJ, Rio de

Janeiro).

A propagação e manutenção viral de DENV-2 NG e SINV foram feitas em

cultura de células VERO por 5-7 dias. O sobrenadante foi coletado após observação de

efeito citopático, filtrado e estocado a -80 ºC. Para DENV-2 Jamaica a manutenção e

propagação foram feitas em cultura de células C6/36, em meio contendo 2% de soro

fetal bovino.

3.3. Infecção das Células Endoteliais e Macrófagos

Células das linhagens BMEC ou U87 foram plaqueadas em placas de 24 ou 6 poços

(10

células/poço ou 10

células/poço, respectivamente) e foram infectadas com as

amostras de vírus da dengue ou Sindbis, em multiplicidade de infecção (MOI) de 10 a

0,1. Os vírus foram diluídos em 200 µL de meio de cultura sem soro, e adicionados a

cultura por 60-90 minutos a 37º C em atmosfera úmida contendo 5% CO

. Após a

incubação o inóculo foi removido, as células foram lavadas 1X com PBS e mantidas

com 500 µL de meio com 10% SFB, inativado ou ativado, a 37º C, sendo este momento

caracterizado como tempo zero de infecção.

Para avaliar o papel do engajamento de receptores de cininas e angiotensina, na

infecção das diferentes linhagens celulares pelos vírus dengue e Sindbis, foram

utilizados os agonistas e antagonistas específicos de cada receptor. As células foram

infectadas como descrito e os respectivos agonistas/antagonistas foram adicionados em

diferentes períodos de tempo após a infecção, como apontado nos resultados. Lisinopril,

um inibidor da ECA, foi acrescentado a cultura na concentração de 25 µM 30 minutos

antes da BK, para evitar uma possível degradação desse peptídeo pela ECA, que poderia

estar presente no sobrenadante da cultura. Após 48h de cultura, os sobrenadantes foram

recolhidos e a infecção foi avaliada por plaqueamento ou imunofluorescência, como

descrito a seguir.

Agonistas: bradicinina – 10 nM (receptor B2) (Calbiochem),

angiotensina (1-7) – 100 nM (receptor MAS) (cedido pelo Dr. Robson

Santos)

Antagonistas: Hoe-140 – 100 nM (receptor B2) (Aventis Pharmaceuticals, NJ, EUA),

[Leu8]des-Arg9-BK – 100 nM (receptor B1) (Sigma),

Losartan – 1 µM (receptor AT1), (cedido pelo Dr. Robson Santos)

A779 – 1 µM (receptor MAS) (cedido pelo Dr. Robson Santos)

3.3.1. Análise da Infecção Celular por Plaqueamento:

Após 24 e 48 horas de

infecção, os sobrenadantes das culturas foram recolhidos e a infecção foi avaliada

através de plaqueamento em células VERO. As células foram plaqueadas em placas de

24 poços (em duplicata) na concentração de 7,5x10

cel/poço em DMEM-5% SFB. Foi

feita diluição seriada dos sobrenadantes de BMEC e U87, infectadas com DENV-2 e

SINV, em DMEM sem soro, iniciando em 10

-1

até a diluição de 10

-6

e 10

-8

respectivamente. 200 µl de cada diluição foram adicionados sobre a cultura de células

VERO. Após a incubação de 60 minutos a 37 ºC/5% CO

, os sobrenadantes foram

retirados e foram adicionados 500 µl de carboximetilcelulose (CMC) a 3%.

Após sete dias de incubação a 37º C, as células foram fixadas por 2h com

formaldeído 10%, lavadas e coradas com cristal violeta 0,04% por 10 minutos. Após

retirar o corante, as placas formadas foram contadas e o título viral determinado em

PFU/ml.

3.3.2. Análise da Infecção Celular por Imunofluorescência (IF)

para posterior titulação, as células infectadas foram fixadas com paraformaldeído 4% e

bloqueadas com cloreto de amônio (NH

Cl) por 30 minutos. Após o bloqueio, as células

foram lavadas com PBS 1% BSA e permeabilizadas com saponina 0,1%. Em seguida,

as células foram incubadas com

As células foram

plaqueadas em placas de 24 poços sobre lamínulas pré-tratadas com gelatina 2%. Após

24 e 48 horas de infecção os sobrenadantes das culturas foram recolhidos e estocados

anticorpo anti-DENV2 (gentilmente cedido pela Dra.

Claudia Duarte dos Santos) por 60 minutos. Após incubação, as células foram lavadas

novamente e incubadas com anticorpo anti-Ig de camundongo conjugado a FITC

(Sigma Chemical Co) por 60 minutos. A presença e localização das partículas virais

foram visualizadas em microscópio de fluorescência Axioplan II (Zeiss, Alemanha).

3.4. Análise da Expressão de Receptores de Cininas e Angiotensina

As células endoteliais foram infectadas com DENV-2 e SINV como descrito e a

expressão de receptores B1R (bradicinina) e B2R (desArg-bradicinina) foi avaliada por

IF ou citometria de fluxo (FACS), utilizando anticorpos específicos. Para análise por

FACS as células foram recolhidas, lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído 4%,

por 10 minutos e bloqueadas com PBS 1% BSA por 30 minutos. Para a marcação com o

anticorpo anti-B2 as células foram permeabilizadas com saponina 0,1%, lavadas e

incubadas com o anticorpo obtido da Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). Após 90

minutos as células foram lavadas e incubadas com anti-IgG de cabra conjugado a

Rodamina (Sigma Chemical Co). Para marcação de B1R, após o bloqueio, as células

foram incubadas por 18h a 4º C com soro hiperimune de rato. Em seguida as células

foram incubadas com anti-IgG de rato conjugado a FITC (Sigma Chemical Co).

3.5. Análise da Viabilidade Celular após Infecção com Vírus da Dengue e com

Vírus Sindbis, na Presença de Cininas e Angiotensina

BMECs foram plaqueadas em placas de 6 poços na concentração de

5x10

cel/poço em M199-10% SFB inativado. Após 24h de aderência, as células foram

infectadas com os vírus DENV-2 e SINV no MOI de 5 e 0,1 respectivamente, como

descrito anteriormente na item 3.2. Os peptídeos BK (10 nM), Ang 1-7 (100 nM) foram

acrescentados 24h p.i. na presença ou ausência dos seus respectivos antagonistas, HOE

140 (100 nM) e Losartan (1 µM) ou A779 (1 µM). Existem evidências de que PI3

cinase (PI3K) e fosforilação do fator AKT podem estar envolvidas no aumento da

sobrevivência celular em diferentes modelos, incluindo o modelo de infecção por

dengue em células neuroblastoma (Datta, et al., 1999; Lee, et al., 2005). O papel da via

PI3K na modulação da infecção e da apoptose foi avaliado pela adição do inibidor

específico wortmanina (100 nM) às culturas de células infectadas, tratadas ou não com

bradicinina ou angiotensina 1-7. O inibidor foi adicionado 30 minutos antes dos

peptídeos.

Para a análise da apoptose celular as células foram recolhidas, 48h p.i. para

DENV-2 e 24h , 36h e 48h p.i. para SINV, lavadas 1x 500µL de tampão de FACS (PBS

+ 10% SFB + 0,02% de azida), 1x com tampão de anexina (10 mM de Hepes + 140 mM

NaCl + 2,5 mM CaCl

, pH 7,4) e marcadas com anexina V conjugada a AlexaFluor 488

(1:20; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA) por 20 minutos/4ºC.

As células foram ressuspendidas em 200µL de tampão de anexina e foi adicionado

iodeto de propídeo PI (100µg/mL em PBS, Sigma, ST Louis, MO, USA) no momento

de aquisição das células. As células foram analisadas por citometria de fluxo,

utilizando-se o equipamento FACScalibur (Becton Dickson Immunocytometry System,

EUA). Foram adquiridos 10000 eventos e a análises foram realizadas utilizando-se o

programa CellQuest.

3.6. Avaliação da Produção de Óxido Nítrico pelas Células Endoteliais após

Infecção com Vírus da Dengue, na Presença de Cininas e Angiotensina

BMECs foram plaqueadas na concentração de 3x10

cel/poço em M199-10%

SFB, em placas de 24 poços, sobre lamínulas pré-tratadas com gelatina 2%. Após 24h

as células foram infectadas com DENV-2 MOI 5, como descrito.

Após incubação de 18h a 37 ºC, as células foram lavadas 2X com PBS,

incubadas por 20 min a 37 ºC com DAF-FM (Molecular Probes) diluído em M199 sem

soro. Em seguida, o meio contendo a sonda foi retirado e foi acrescentado meio 199 sem

soro por mais 20 min. As células foram lavadas 2X com PBS e foi adicionado M199

10% SFB. BK (20 nM) ou Ang 1-7 (100 nM) foram adicionados a cultura na presença

ou ausência dos antagonistas Hoe 140 (200 nM), Losartan (1 µM) e A779 (1 µM), por

10min. Lisinopril (25 µM) foi adicionado a cultura 30 min. antes da BK. Após

incubação com os estímulos as células foram lavadas 2X com PBS e as lamínulas foram

montadas em lâminas contendo n-propilgalato. As lâminas foram analisadas em

microscópio de fluorescência.

Com intuito de avaliar a importância da via da AKT na produção de óxido

nítrico pelas BMECs, wortmanina foi adicionada, na concentração de 100 nM, no tempo

zero de infecção e 18 h após infecção, no momento de adição do Lisinopril.

3.7. Análise da Interferência de Óxido Nítrico na Infecção de Células Endoteliais

pelo Vírus da Dengue, Modulada por Bradicinina e Angiotensina 1-7

Para avaliar o efeito do oxido nítrico na infecção pelo vírus da dengue em

células endoteliais, o inibidor da enzima óxido nítrico sintase, L-NMMA foi adicionado

no tempo zero de infecção, na concentração de 250µM. Após 48 h de infecção, foi feita

a titulação por plaqueamento dos sobrenadantes. A eficácia do inibidor L-NMMA foi

avaliada por imunofluorescência utilizando DAF. As células foram cultivadas com L-

NMMA nas concentrações de 50 µM, 100 µM, 200 µM e 500 µM. Após 30 minutos, as

células foram marcadas com DAF como descrito acima.

Avaliação da citotoxicidade do inibidor L-NMMA foi feita por técnica de XTT.

As células foram cultivadas com L-NMMA nas concentrações de 250 µM e 500 µM.

Após 48h de incubação foi feita a técnica de XTT de acordo com Delorenzi et al,

(2001). Resumidamente, as células foram mantidas em cultura na presença ou ausência

de L-NMMA por 48h. Após esse período as células foram incubadas por 2-4h a 37º C

com 50 µL da solução de XTT. A leitura foi feita em leitor de microplaca utilizando

filtro de 450nm. O corante XTT é metabolizado por enzimas mitocondriais levando a

formação de um composto colorido solúvel em água.

3.9. Análises Estatísticas

Foi realizado o teste t de Student para amostras não pareadas através do

assistente gráfico PrimGraphPad 4. Os dados foram expressos com significância

estatística quando p ≤ 0,05.

4. Resultados

4.1. Infecção de Células Endoteliais pelos Vírus da Dengue e Sindbis

Para validar nosso modelo experimental, inicialmente, nós testamos a

permissividade da linhagem celular de endotélio microvascular cerebral humana

(BMEC) a infecção por SINV e DENV. BMECs foram infectadas com o SINV na

multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 e, após 24 e 48 h, os sobrenadantes das

culturas foram recolhidos e a avaliação foi determinada por plaqueamento em células

VERO. Nós observamos que 24 h de infecção com SINV são suficientes para detecção

de vírus nos sobrenadantes. No entanto, as experiências seguintes foram realizadas 48 h

pós infecção (p.i.), porque a carga viral tornou-se mais elevada, (Figura 7A) e o efeito

citopático é mais pronunciado. Nós também testamos MOIs mais elevados, mas isso

resultou em alta mortalidade celular (dado não mostrado). Portanto, adotamos o MOI de

0,1 nos demais experimentos.

Para avaliar a infecção por DENV, foram utilizadas duas cepas de DENV2, a

cepa Nova Guiné (NG) e a cepa Jamaica (que não induz a formação de placas de lise).

As células endoteliais foram infectadas com diferentes MOIs, e a infecção foi avaliada

após 48 h, por plaqueamento (NG) ou imunofluorescência (Jamaica). Nós observamos

que com MOI de 1 já é possível detectar vírus nas células, enquanto que uma grande

quantidade de células é infectada no MOI de 10 (Fig. 7B e C). Para facilitar a

comparação entre diversos tratamentos de células infectadas com o vírus da dengue

(NG), utilizamos um MOI intermediário (MOI=5).

Figura 7. Avaliação da permissividade de BMECs por SINV e DENV. A) BMECs

foram cultivadas com SINV (MOI=0,1). Após 24 h e 48 h de infecção, os sobrenadantes

foram coletados e a infecção foi avaliada por plaqueamento em células VERO. B) e C)

BMECs foram infectadas com DENV2 Nova Guiné (B) e DENV2 Jamamica (C)

(MOIs=1 e 10). A carga viral foi avaliada 48 h p.i. por plaqueamento em células VERO.

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

100000

120000

20000

40000

60000

80000

SINV

24hrs

SINV

48hrs

PFU (x10

) / mL

MOI=0

DEN

MOI=1

DEN

MOI=10

1000

2000

3000

4000

5000

6000

PFU / mL

DEN

MOI=1

DEN

MOI=10

1000

2000

3000

4000

5000

6000

PFU / mL

Mock MOI 1

MOI 10

Mock MOI 1

MOI 10

Mock MOI 1

MOI 10

DENV Jamaica

DENV Nova Guiné SINV

4.2. Bradicinina é Capaz de Potencializar a Infecção de BMECs pelo Vírus Sindbis.

Uma vez otimizado o modelo celular de infecção viral, iniciamos os estudos para

avaliar se os componentes das vias de cinina-calicreína e renina-angiotensina poderiam

modular essa infecção. Embora o principal foco do nosso trabalho seja a infecção pelo

DENV, optamos por iniciar os estudos com o SINV, uma vez que este vírus produz

títulos virais mais elevados, sendo comumente utilizado como protótipo de infecção do

grupo arbovírus. Para avaliar o papel de cininas na infecção por SINV, BMECs foram

infectadas com SINV e, após 24 h de infecção o peptídeo bradicinina (BK) foi

adicionado a cultura, na presença ou ausência do antagonista do receptor B

R – HOE

140. A carga viral foi então avaliada por plaqueamento 24 h após a adição do peptídeo

(48 h p.i.). Para minimizar a degradação da BK pela enzima conversora de angiotensina

(ECA), acrescentamos lisinopril ao meio de cultura, antes de estimular as células com

BK. Dados não mostrados revelam que o lisinopril não modula a carga viral. Entretanto

a adição e BK ao meio contendo lisinopril promoveu um aumento significativo na

infecção. Esse efeito é mediado por B2R, uma vez que a adição de lisinopril sozinho

não interferiu na carga viral (Fig. 8).

Figura 8. Potencialização da Infecção de BMECs pelo Sindbis por Bradicinina.

BMECs foram cultivadas com SINV (MOI=0,1). Bradicinina (10nM) foi adicionada a

cultura após 24 h de infecção, o antagonista HOE-140 (100 nM) e Lisinopril (25 μM)

foram adicionados a cultura 30 minutos antes da adição de BK. Após 48 h de infecção o

sobrenadante foi coletado e a carga viral avaliada por plaqueamento em células VERO.

(*) indica p < 0,05 em relação a cultura apenas com SINV; (**) indica p < 0,05 em

relação aos tratamentos.

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

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SINV

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SINV

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SINV

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/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

HOE-140/Lis

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

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SINV

logPFU

/ml

SINV

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SINV

logPFU

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SINV

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SINV

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SINV

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/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

HOE-140/Lis

BK/Lis

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

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SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

HOE-140/Lis

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

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SINV

logPFU

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SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

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SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

SINV

logPFU

/ml

HOE-140/Lis

BK/Lis

4.3. Angiotensina 1-7 Modula a Infecção de BMECs pelo Vírus Sindbis através dos

Receptores de Angiotensina AT

e MAS

Avaliamos também se o peptídeo vasoativo angiotensina 1-7 é capaz de modular

a infecção de BMECs por SINV. Para isso infectamos BMECs com SINV MOI de 0,1

por 48 h e o peptídeo foi adicionado em cultura 24 h p.i.. Assim como BK, Ang 1-7

potencializou a infecção de células endoteliais por SINV (Figura 8). Recentemente, o

receptor MAS foi caracterizado como o principal responsável pelos efeitos desse

peptídeo, entretanto, como descrito na literatura, além do MAS, angiotensina 1-7 pode

mediar seus efeitos via receptores AT

e AT

(Santos e Ferreira, 2007). Nós observamos

que a adição de A779, antagonista de MAS, não foi capaz de reverter o efeito

potencializador de Ang 1-7. Entretanto, surpreedentemente, o antagonista aumentou

ainda mais o efeito da Ang 1-7. Em seguida, avaliamos se o efeito potencializador

induzida por Ang 1-7, poderia ser mediada pelo receptor AT

. Nossos dados mostram

que, Losartan (Los), reverteu parcialmente o aumento da carga viral induzido por Ang

1-7 (Fig. 9A e B).

Figura 9. Angiotensina 1-7 Modula a Infecção de BMECs pelo Vírus Sindbis

através dos Receptores de Angiotensina AT

e MAS. BMECs foram cultivadas com

SINV (MOI=0,1). Angiotensina 1-7 (100 nM) foi adicionada a cultura após 24 h de

infecção, os antagonistas A779 (1 μM) (A) ou Los (1 μM) (B) foram adicionados a

cultura 15-30 minutos antes da adição de Ang 1-7. Após 48h de infecção o sobrenadante

foi coletado e a carga viral avaliada por plaqueamento em células VERO. (*) indica p <

0,05 em relação a cultura apenas com SINV; (**) indica p < 0,05 em relação aos

tratamentos.

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1

SINV

A779

Ang 1-7

logPFU/ml

-7

logPFU/ml

SINV

A779

Ang 1

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

Los

Ang 1-7

-- +

SINV

++ +

logPFU/ml

Los

Ang

-7

-- +

SINV + + +

logPFU/ml

4.4. Os Peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7 Potencializam a Infecção de

Células de Glioma (U87) pelos Vírus Sindbis.

Além de células endoteliais, resolvemos ampliar nossos estudos testando o efeito

de BK e Ang 1-7 sobre linhagem celular de glioma humano (U87). U87 foi infectada

com SINV, MOI de 0,1, após 24 h de infecção BK (10 nM) ou Ang 1-7 (100 nM) foram

adicionadas a cultura e 48 h p.i. o sobrenadante foi avaliado. Assim como observamos

com BMECs, BK é capaz de mediar um aumento significativo da infecção de U87 por

SINV. O mecanismo utilizado parece envolver ambos os receptores B

R e B

R, uma

vez que o aumento da carga viral é revertido na presença dos respectivos antagonistas

HOE 140 (Fig. 10A) e [Leu8]des-Arg9-BK (Fig. 10B). Os resultados obtidos com a

adição de Ang 1-7 em cultura de U87 infectada com SINV, corroboram os dados

apresentados para esse vírus em BMECs. Ang 1-7 potencializa a infecção por

mecanismo que envolve o engajamento do receptor AT

visto que losartan reverte o

efeito do peptídeo na cultura (Fig. 10C). Além disso, a adição do antagonista do

receptor MAS também induz o aumento da potencialização da infeção mediada por Ang

1-7 (Fig. 10D).

Figura 10. Os Peptídeos Angiotensina 1-7 e Bradicinina Modulam a Infecção de

U87 pelo Vírus Sindbis, mediada pelos Receptores Específicos. U87 foram

cultivadas com SINV (MOI=0,1). A e B) Bradicinina (10 nM) foi adicionada a cultura

após 24 h de infecção, os antagonistas HOE-140 (A) (100 nM) ou B

R, [Leu8]des-

Arg9-BK (100 nM) (B) foram adicionado a cultura 30 minutos antes da adição de BK.

Lisinopril (25 μM) foi adicionado junto aos antagonistas. C e D) Angiotensina 1-7 (100

nM) foi adicionada a cultura após 24 h de infecção, os antagonistas A779 (1 μM) (C) ou

Los (1 μM) (D) foram adicionados a cultura 15-30 minutos antes da adição de Ang 1-7.

Após 48 h de infecção o sobrenadante foi coletado e a carga viral avaliada por

plaqueamento em células VERO. (*) indica p < 0,05 em relação a cultura apenas com

SINV; (**) indica p < 0,05 em relação aos tratamentos.

Log PFU/ml

SINV SINV+BDK SINV+Bk+HoeSINV SINV+BDK SINV+Bk+Hoe

SINV

HOE - 140

+++

-++

--+

Log PFU/ml

SINV SINV+BDK SINV+Bk+HoeSINV SINV+BDK SINV+Bk+Hoe

SINV

HOE - 140

+++

-++

--+

SINV SINV+BDK SINV+Bk+HoeSINV SINV+BDK SINV+Bk+Hoe

SINV

HOE - 140

+++

-++

--+

Log PFU/ml

SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1

SINV

des-

Arg

-BK

SINV

SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1

SINV

[Leu

]

des-

SINV

Log PFU/ml

SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1

SINV

des-

Arg

-BK

SINV

SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1

SINV

[Leu

]

des-

SINV

SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1

SINV

des-

Arg

-BK

SINV

SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1SINV SINV+BDK SINV+BDK+Ant. B1

SINV

[Leu

]

des-

SINV

Log PFU/ml

Ang1-7

SINV

A779

SINV

A779

Ang1-7

SINV

A779

Log PFU/ml

Ang1-7

SINV

A779

SINV

A779

Ang1-7

SINV

A779

Log PFU/ml

Ang1-7

SINV

A779

SINV

A779

Ang1-7

SINV

A779

Log PFU/ml

Ang1-7

SINV

A779

SINV

A779

Ang1-7

SINV

A779

Ang1-7

SINV

A779

SINV

A779

Ang1-7

SINV

A779

Log PFU/ml

SINV

Los

Ang 1-7

SINV

Los

Ang 1-7

Log PFU/ml

SINV

Los

Ang 1-7

SINV

Los

Ang 1-7

4.5. Os Peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7 Protegem as Células Endoteliais

da Apoptose Induzida por Sindbis.

A infecção por diferentes arbovírus resulta em apoptose celular. Entretanto,

dados da literatura demonstram que alguns arbovírus, como os flavivirus são capazes de

inibir a apoptose celular em um momento inicial de infecção, por um mecanismo

associado a ativação da via da PI3K e fosforilação do fator AKT, o qual deve ser

importante para garantir o sucesso da replicação viral. Entretanto, nesse mesmo estudo

após 24 h de infecção, não se observa mais AKT fosforilado, o que é seguido da

ativação de caspases e conseqüente indução da apoptose (Lee et al, 2005). Uma vez que

peptídeos como a BK e Ang 1-7 estão associados a ativação de vias de sobrevivência

celular e inibição da apoptose, e que o retardo na indução de morte celular poderia

resultar numa maior replicação viral, nós avaliamos se a presença desses peptídeos

poderia estar regulando o processo de apoptose induzido pelo vírus SINV. Nós

observamos que a adição tanto de BK quanto de Ang 1-7 inibiram a apoptose induzida

pelo SINV. Tal como observado nos experimentos de replicação viral, o efeito de BK e

Ang (1-7) foi mediado pelos receptores B

R e AT1, respectivamente. Observamos,

ainda, que a adição de um inibidor da PI3K – wortmanina sugere um papel para essa via

no processo de inibição da apoptose (Fig. 11 A e B).

Figura 11. Modulação da Apoptose Celular Induzida por SINV, mediada por

Angiotensina 1-7 e Bradicinina. BMECs foram infectadas com SINV MOI 0,1, 24 h

p.i. os peptídeos foram adicionados na presença ou ausência do seus antagonistas. BK

(10 nM) e HOE-140 (100 nM) (A) ou Ang 1-7 (100 nM), Los (1 μM) e A779 (1 μM)

(B). O inibidor da via da PI3K (Wort 100 nM) foi adicionada junto com os peptídeos. A

avaliação da apoptose foi realizada 12h (36 h p.i.) após a adição dos peptídeos, através

de dupla marcação das células com iodeto de propídeo e anexina V, e análise por

citometria de fluxo. As células negativas para ambos marcadores foram consideradas

vivas, enquanto que aquelas positivas apenas para anexina V, foram consideradas em

apoptose. Os dados são representativos de 3 experimentos independentes.

Vivas

Mortas Apoptose

% células

SINV

SINV+BK

SINV+BK+HOE-140

SINV+BK+WO

Vivas

Mortas Apoptose

% células

Vivas

Mortas Apoptose

Vivas

Mortas Apoptose

% células

SINV

SINV+BK

SINV+BK+HOE-140

SINV+BK+WORT

SINV

SINV+BK

SINV+BK+HOE-140

SINV+BK+WO

Vivas

Mortas Apoptos

% células

SINV

SINV+Ang 1-7

SINV+Ang 1-7+A779

SINV+Ang 1-7+LOS

SINV+Ang 1-7+WORT

Vivas

Mortas Apoptos

% células

Vivas

Mortas Apoptos

% células

SINV

SINV+Ang 1-7

SINV+Ang 1-7+A779

SINV+Ang 1-7+LOS

SINV+Ang 1-7+WORT

SINV

SINV+Ang 1-7

SINV+Ang 1-7+A779

SINV+Ang 1-7+LOS

SINV+Ang 1-7+

WORT

4.6. Modulação da Infecção de Células Endoteliais pelo Vírus da Dengue mediada

por Bradicinina e Angiotensina 1-7.

A patogênese da dengue é caracterizada por eventos que envolvem alterações no

endotélio vascular, como extravasamento de líquido, sendo que essas alterações podem

ser dependentes de ação direta ou indireta do vírus. Baseando-se nesses dados e na

resposta observada pelo vírus Sindbis nas células endoteliais, o modelo experimental

utilizado anteriormente foi mantido. BMECs foram infectadas com o vírus da dengue

sorotipo 2 (DENV2) (cepas Nova Guiné e Jamaica) nas multiplicidades de infecção

(MOI) indicadas nas figuras. Primeiramente nós avaliamos se a infecção de BMECs

pelo vírus da dengue é capaz de modular a expressão dos receptores de bradicinina B

e B

R. Como podemos observar por análise de citometria de fluxo a infecção por

dengue induz aumento na expressão de B

R e B

R (Fig. 12). Além disso, esses dados

nos permitiram concluir que a linhagem de célula utilizada expressa constitutivamente o

receptor B

R. Considerando que a infecção por DENV é capaz de aumentar a expressão

dos receptores de bradicinina, nós avaliamos se a presença desse peptídeo pode modular

a infecção do vírus em cultura de BMEC. Para isso BK foi adicionada em cultura junto

com o vírus ou 24 h p.i.. Podemos observar através de imunofluorescência que BK

adicionada junto com o vírus não foi capaz de modular a infecção por DENV2 cepa

Jamaica. No entanto, em culturas tratadas com BDK 24 h p.i. observa-se um aumento

significativo da infecção de BMECs por DENV2 tanto com a cepa Jamaica quanto a

cepa Nova Guiné (Fig. 13A, B e C). Avaliamos também se o peptídeo Ang 1-7 é capaz

de modular a infecção de BMECs por DENV2. Como observado com BK, BMECs

infectadas com DENV2 (Jamaica) e cultivadas com Ang 1-7 não apresentaram alteração

da infecção (Fig. 14A). Entretanto quando o peptídeo foi adicionado 24 h p.i. Ang 1-7

foi capaz de potencializar a infecção de BMECs pelo DENV2 cepas Jamaica e Nova

Guiné (Fig. 14B e C). Para verificar o papel dos receptores MAS e AT

na modulação

da infecção de BMECs por angiotensina 1-7, os antagonistas A779 e Losartan,

respectivamente, foram previamente adicionados a cultura. Dados preliminares

demonstram que o aumento da infecção foi parcialmente revertido na presença dos

antagonistas, indicando que ambos os receptores podem estar envolvidos no aumento da

infecção mediado pela Ang 1-7 (Fig. 15A e B).

Figura 12. Análise da Expressão de Receptores de Bradicinina em BMECs

Infectadas por Vírus da Dengue. BMECs foram cultivadas com meio de cultura ou

DENV2 (cepa Jamaica), após 48 h de infecção as células foram retiradas do poço com

auxílio de “cell scraper”. As células foram marcadas com anticorpo anti-B

R e anti-B

após serem lavadas com PBS as células foram incubadas com soro hipermune de rato

conjugado a FITC (B

R) e anticorpo secundário anti-cabra conjugado a rodamina (B

R).

As células foram lavadas, ressuspendidas em PBS e avaliadas por citometria de fluxo.

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

lulas

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DENV

Receptor

% c

lulas

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

lulas

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

lulas

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Receptor

% c

B1R B2R

Meio

DEN

Meio

DENV

Receptor

% c

lulas

Figura 13. Potencialização da Infecção de BMECs pelo Vírus da Dengue mediada

por Bradicinina. A e B) BMECs foram infectadas com DENV2 (cepa Jamaica),

bradicinina (10 nM) foi adicionada a meio 199 (M199) + Lis no tempo zero de infecção

(A) ou após 24 h p.i. (B). Após 48 h a infecção foi avaliada por imunofluorescência. C)

BMECs foi infectada com DENV2 (cepa Nova Guiné) (MOI=5), após 24 h de infecção

BK foi adicionada ao M199. Após 48 h de infecção o sobrenadante foi coletado e a

carga viral avaliada por plaqueamento em células VERO. (*) indica p < 0,05. Os dados

são representativos de 3 experimentos independentes.

logPFU/ml

DENV

logPFU/ml

DENV

logPFU/ml

DENV Jamaica

DENV Nova Guiné

DEN DEN DEN + BDK DEN + BDK

DENV DENV DENV + BK DENV + BK

DENV Jamaica

DEN DEN DEN + BK DEN + BK

DENV DENV DENV + BK DENV + BK

Figura 14. Potencialização da Infecção de BMECs pelo Vírus da Dengue mediada

por Angiotensina 1-7. A e B) BMECs foram infectadas com DENV2 (cepa Jamaica),

angiotensina 1-7 (100 nM) foi adicionada a cultura no tempo zero de infecção (A) ou

após 24 h p.i. (B). Após 48 h a infecção foi avaliada por imunofluorescência. C)

BMECs foi infectada com DENV2 (cepa Nova Guiné) (MOI=5), após 24 h de infecção

Ang 1-7 foi adicionada em cultura. Após 48 h de infecção o sobrenadante foi coletado e

a carga viral avaliada por plaqueamento em células VERO. (*) indica p < 0,05. Os

dados são representativos de 3 experimentos independentes.

logPFU/ml

Ang 1-7

DENV +

logPFU/ml

Ang 1-7

DENV +

logPFU/ml

Ang 1-7

DENV +

logPFU/ml

Ang 1-7

DENV +

DENV Jamaica

DENV Nova Guiné

DEN DEN DEN + Ang (1

7) DEN + Ang (1

DEN Ang (1

7) Ang (1

DENV Jamaica

DENV DENV + DENV +

DEN DEN

DEN + Ang (1

7) DEN + Ang

DENV DENV

Ang (1

7) Ang

DENV + DENV +

Figura 15. Angiotensina 1-7 Modula a Infecção de BMECs pelos Vírus da Dengue

e Sindbis, Mediada pelos Receptores AT

e MAS. BMECs foram cultivadas com

DENV2 (MOI=5). Angiotensina 1-7 (100 nM) foi adicionada a cultura após 24 h de

infecção, os antagonistas A779 (1 μM) (A) ou Los (1 μM) (B) foram adicionados a

cultura 15-30 minutos antes da adição de Ang 1-7. Após 48 h de infecção o

sobrenadante foi coletado e a carga viral avaliada por plaqueamento em células VERO.

(*) indica p < 0,05 em relação a cultura apenas com DENV2; (**) indica p < 0,05 em

relação aos tratamentos.

logPFU/ml

* *

Ang 1-7

DENV

A779

logPFU/ml

* *

Ang 1-7

DENV

A779

Ang 1-7

DENV

Los

logPFU/ml

Ang 1-7

DENV

Los

Ang 1-7

DENV

Los

logPFU/ml

4.7. Bradicinina Modula a Apoptose Celular em BMECs Infectadas com o Vírus

da Dengue

Como observado, os peptídeos vasoativos BK e Ang 1-7 foram capazes de

aumentar a infecção de DENV2 em células endoteliais. Visto que esses peptídeos

medeiam a sobrevivência celular em infecção com SINV, avaliamos também se BDK é

capaz de modular a apoptose em células infectadas com DENV2. Dados preliminares

indicam que a adição de BK a cultura de BMECs infectadas por DENV é capaz de inibir

a apoptose dessas células. O pré-tratamento da cultura com HOE-140 foi capaz de

reverter o efeito da inibição da apoptose mediado por BK, indicando que esse peptídeo

está atuando via receptor B

R (Fig. 16).

Figura 16. Bradicinina Inibe a Apoptose Induzida por DENV em BMECs. BMECs

foram infectadas com DENV MOI de 5. 24 h p.i. BK (10 nM) foi adicionada ao meio

199 (M199) suplementado com lisinopril, na presença ou ausência do seu antagonista

(HOE-140 (100 nM)). A avaliação da apoptose foi realizada 24 h (36 h p.i.) após a

adição dos peptídeos, através de dupla marcação das células com iodeto de propídeo e

anexina V, e análise por citometria de fluxo. As células positivas apenas para anexina

V, foram consideradas em apoptose. Os dados são representativos de 2 experimentos

independentes.

14,23

DENV

10,98

DENV+BDK

15,21

DENV+BDK+

HOE-140

7,63

Meio

Anexina V

I.P.

14,23

DENV

14,23

DENV

14,23

DENV

10,98

DENV+BDK

10,98

DENV+BDK

15,21

DENV+BDK+

HOE-140

15,21

DENV+BDK+

HOE-140

7,63

Meio

7,63

Meio

Anexina V

I.P.

4.8. Os Peptídeos Bradicinina e Angiotensina 1-7 Modulam a Produção de NO em

BMECs Infectadas com o Vírus da Dengue

Sabe-se que tanto bradicinina quanto angiotensina 1-7 são capazes de induzir a

produção de óxido nítrico em células endoteliais através da ativação da enzima óxido

nítrico sintase (eNOS) (Kono, et al., 2002). A liberação de NO pode ser também

induzida por patógenos e, em infecções virais, NO pode ter efeito citotóxico e contribuir

para a eliminação do vírus (Akaike e Maeda, 2000). Baseado nessas informações, nós

avaliamos se a produção de NO pode ser modulada pelo vírus da dengue e se esses

peptídeos estão envolvidos nesse processo. Para isso nós incubamos BMECs com

DENV2 (MOI=5) ou sobrenadante de células VERO não infectadas (Mock), após 18 h

de infecção as células foram incubadas com DAF-FM (4-amino-5-metilamino-2’,7’-

difluorofluoesceina diacetato), um composto não fluorescente capaz de atravessar a

membrana celular passivamente, reagir com NO e formar um composto fluorescente. As

células foram estimuladas com bradicinina e angiotensina 1-7, na presença ou ausência

dos respectivos antagonistas, e avaliadas por microscópio de fluorescência. Podemos

observar que as BMECs produzem óxido nítrico em níveis basais e essa produção é

aumentada na presença de DENV2 e na presença dos estímulos, BK e Ang 1-7. Esse

efeito não foi observado no controle Mock. Entretanto, em células infectadas e tratadas

com os peptídeos ocorre uma diminuição na produção desse mediador. Esse efeito pode

ser parcialmente revertido quando pré-tratamos a cultura com os antagonistas dos

receptores. A utilização de HOE-140 indica que BK inibe NO através do engajamento

do receptor B

R (Fig. 17A e B). Já o peptídeo Ang 1-7 modula a produção de NO via os

receptores MAS e AT

, visto que tanto a utilização de A779 e, principalmente, de

losartan foi capaz de restaurar parcialmente a produção de NO. Esses dados indicam que

pode estar ocorrendo uma cooperação entre esses dois receptores (Fig. 18A e B).

Figura 17. Bradicinina Inibe a Produção de NO em Células Endoteliais, Induzida

pelo Vírus da Dengue. BMECs foram infectadas com DENV2 (MOI=5), ou tratadas

com sobrenadante de células VERO (Mock), 18 h p.i. as células foram incubadas com

DAF (5 μM) por 20 minutos a 37º C, lavadas e estimuladas com BK (20 nM) por 10

minutos, na presença ou ausência do antagonista HOE-140 (200 nM). Lisinopril (25

μM) foi adicionado a cultura 30 minutos antes da BK. As lâminas foram avaliadas em

microscópio de fluorescência utilizando objetiva de 100x. As situações foram realizadas

em duplicata. Este dado é representativo de 5 experimentos.

MeioMeioMeioMeioMeioMeioMeioMeioMeio

Mock

MeioMeio

MeioMeioMeioMeioMeioMeio

DENV + BK/Lis

Meio

Mock

DENV + BK/Lis + HOE -140

DENV

MeioMeioMeioMeioMeioMeioMeioMeioMeio

Mock

MeioMeio

MeioMeioMeioMeioMeioMeio

DENV + BK/Lis

Meio

Mock

DENV + BK/Lis + HOE -140

DENV

Figura 18. Angiotensina 1-7 Inibe a Produção de NO em Células Endoteliais,

Induzida pelo Vírus da Dengue. BMECs foram infectadas com DENV2 (MOI=5), 18

h p.i. as células foram incubadas com DAF (5 μM) por 20 minutos a 37º C, as células

foram lavadas e estimuladas com Ang 1-7 (100 nM) por 10 minutos, na presença ou

ausência dos antagonistas A779 (1 μM) (MAS) ou Losartan (1 μM) (AT1). As lâminas

foram avaliadas em microscópio de fluorescência utilizando objetiva de 100x. As

situações foram realizadas em duplicata. Este dado é representativo de 5 experimentos.

DENV + Ang (1-7)