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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Construção de cassetes de expressão de proteínas
heterólogas em lactobacilos para uso em vacinas orais
contra a coccidiose aviária
ORIENTADO: João Luiz Silva Moreira
ORIENTADOR: Prof. Dr. Álvaro Cantini Nunes
BELO HORIZONTE
Fevereiro - 2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
JOÃO LUIZ SILVA MOREIRA
CONSTRUÇÃO DE CASSETES DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS
HETERÓLOGAS EM LACTOBACILOS PARA USO EM VACINAS
ORAIS CONTRA A COCCIDIOSE AVIÁRIA
.
ORIENTADOR: ÁLVARO CANTINI NUNES
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Geral
Belo Horizonte, MG
2008
Dissertação apresentada ao Departamento de
Biologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito para obtenção do grau
de mestre em Genética.
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iii
AGRADECIMENTOS
Inicialmente, agradeço ao meu orientador, Professor Álvaro Cantini Nunes, pela
confiança, experiência compartilhada e apoio ao longo desses anos de trabalho em
conjunto.
Aos Professores Jacques Robert Nicoli, Maria de Fátima Horta e Santuza Maria
Ribeiro Teixeira, pelo suporte, sem o qual não poderia ter desenvolvido todo o meu trabalho.
A todos os estudantes e amigos dos laboratórios de Imunologia e Biologia celular de
Parasitas e de Ecologia e Fisiologia de Microorganismos, pela ajuda constante e pela
agradável convivência.
Aos amigos Elimar e Bernardo pela grande e essencial ajuda no cotidiano do
laboratório.
Ao amigo Jamil que sempre demonstrou grande presteza em ajudar-me.
Às funcionárias da Secretaria de Pós Graduação do Departamento de Biologia Geral
– Genética.
A todos os professores que contribuíram para minha formação.
Aos amigos e companheiros da graduação e pós-graduação.
Em especial agradeço à minha família, principalmente os meus pais. Atualmente o
tempo tem passado muito depressa e às vezes não tenho sabido aproveitá-lo bem, junto a
vocês. Contudo, acredito que vocês sabem o quão importantes são para mim e o quanto
gosto de vocês. À minha irmã, que agora já não vejo com freqüência, espero que o futuro
lhe reserve muitas felicidades e que você não as deixe de compartilhar conosco.
OBRIGADO A TODOS...
iv
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................................................... III
SUMÁRIO ............................................................................................................................................................ IV
LISTA DE FIGURAS E TABELAS .................................................................................................................. VI
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ................................................................................................................... VII
RESUMO ............................................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ........................................................................................................................................................... 2
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................................... 3
1. LACTOBACILLUS................................................................................................................................................ 3
2. A CAMADA S DA PAREDE CELULAR DE BACTÉRIAS .......................................................................................... 5
3. LACTOBACILOS COMO VETORES PARA VACINAS ORAIS .................................................................................... 7
4. O PLASMÍDIO PLBSGFPEM
R
......................................................................................................................... 10
5. COCCIDIOSE AVIÁRIA..................................................................................................................................... 12
6. IMUNIDADE NA COCCIDIOSE .......................................................................................................................... 16
7. A FAMÍLIA TRAP E A PROTEÍNA EMTFP250 ................................................................................................. 19
OBJETIVOS ........................................................................................................................................................ 23
OBJETIVO GERAL: .............................................................................................................................................. 23
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................................................................... 23
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................................... 24
1. LINHAGENS BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTIVO ................................................................................... 24
2. TÉCNICAS GERAIS DE MANIPULAÇÃO E ANÁLISE DE DNA RECOMBINANTE ................................................... 24
3. PREPARO DE CÉLULAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO DE E. COLI ........................................................... 24
4. IDENTIFICAÇÃO POR PCR DE CLONES BACTERIANOS TRANSFORMADOS ........................................................ 27
5. OBTENÇÃO DO DNA PLASMIDIANO EM PEQUENA ESCALA ............................................................................. 27
6. EXTRAÇÃO DE DNA DE EIMERIA ................................................................................................................... 27
7. INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES E PREPARO DO EXTRATO PROTÉICO TOTAL DE E.
COLI .................................................................................................................................................................... 28
8. OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES SOLÚVEL E INSOLÚVEL DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES .................................... 28
9. PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES ........................................................................................... 29
10. CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS POR ULTRAFILTRAÇÃO ............................................................................ 29
11. QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS ................................................................................................................ 30
12. RETIRADA DO TAG DE GST DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES ..................................................................... 30
13. ANÁLISE POR SDS-PAGE ........................................................................................................................... 30
14. ANÁLISE POR “WESTERN BLOTTING” ............................................................................................................ 31
15. IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS .......................................................................................................................... 31
v
RESULTADOS .................................................................................................................................................... 32
1. CONSTRUÇÃO DOS VETORES PSECGFPEM
R
E PCYTGFPEM
R
PARA EXPRESSÃO DO GENE REPÓRTER NA
FORMA SECRETADA E CITOPLASMÁTICA ............................................................................................................. 32
2. ANALISE DA EXPRESSÃO DE GFP EM E. COLI ................................................................................................. 36
3. AMPLIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA CODIFICADORA DA REGIÃO C-TERMINAL DA PROTEÍNA EMTFP250 DE
EIMERIA MAXIMA ................................................................................................................................................. 36
4. CONSTRUÇÃO DOS VETORES PLBSCTFPEM
R
, PSECCTFPEM
R
E PCYTCTFPEM
R
........................................ 39
5. CONSTRUÇÃO DOS VETORES DE EXPRESSÃO PGEXCTFP E PTRCHISCTFP .................................................... 39
6. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA CTFP RECOMBINANTE ................................................................. 43
7. IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS COM CTFP RECOMBINANTE ....................................................................... 43
DISCUSSÃO ........................................................................................................................................................ 48
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 52
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................. 53
ANEXOS .............................................................................................................................................................. 64
1. GENETIC TRANSFORMATION OF NOVEL ISOLATES OF CHICKEN LACTOBACILLUS BEARING PROBIOTIC
FEATURES FOR EXPRESSION OF HETEROLOGOUS PROTEINS: A TOOL TO DEVELOP LIVE ORAL VACCINES. ............ 64
2. PROCESSO DE CONSTRUÇÃO DE UM CASSETE DE EXPRESSÃO GENÉTICA PARA A TRANSFORMAÇÃO DE
BACTÉRIAS PARA USO VACINAL E SEUS PRODUTOS. ............................................................................................ 64
vi
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
FIGURA 1. ÁRVORE FILOGENÉTICA DOS GRUPOS DE BACTÉRIAS DA FAMÍLIA LACTOBACILLACEAE. ........................ 4
FIGURA 2. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA PAREDE CELULAR DE UMA BACTÉRIA GRAM-POSITIVA. .................. 6
FIGURA 3. ANÁLISE DAS PUBLICAÇÕES DE PATENTES INTERNACIONAIS SOBRE VACINAS ORAIS. .............................. 8
FIGURA 4. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO VETOR PLBSGFPEM
R
. ................................................................. 11
FIGURA 5. CICLO DE VIDA DE EIMERIA SPP. ............................................................................................................ 13
FIGURA 6. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA PROTEÍNA EMTFP250. ................................................................. 21
FIGURA 7. ANÁLISE POR WESTERN BLOTTING DE EMTFP250 RECOMBINANTE. ....................................................... 22
TABELA 1: SEQÜÊNCIA DOS INICIADORES UTILIZADOS NESSE TRABALHO. ............................................................. 25
FIGURA 8. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS VETORES PGEX E PTRCHIS. ....................................................... 26
FIGURA 9. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS VETORES PSECGFPEM
R
E PCYTGFPEM
R
. ................................ 33
FIGURA 10. VERIFICAÇÃO DA CONSTRUÇÃO DE PSECGFPEM
R
. ............................................................................ 34
FIGURA 11. VERIFICAÇÃO DA CONSTRUÇÃO DE PCYTGFPEM
R
. ............................................................................ 35
FIGURA 12. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GFP PELOS DIFERENTES SISTEMAS DE EXPRESSÃO HETERÓLOGA. ........... 37
FIGURA 13. FRAGMENTO DE EMTFP250 SELECIONADO PARA EXPRESSÃO. ............................................................ 38
FIGURA 14. CONSTRUÇÃO DE PLBSCTFPEM
R
. ...................................................................................................... 40
FIGURA 15. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS VETORES PSECCTFPEM
R
E PCYTCTFPEM
R
. ........................... 41
FIGURA 16. VERIFICAÇÃO DA CONSTRUÇÃO DE PSECCTFPEM
R
E PCYTCTFPEM
R
. ............................................. 42
FIGURA 17. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE EMTFP250 RECOMBINANTE EM FUSÃO COM GST. ............................. 44
FIGURA 18. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE EMTFP250 RECOMBINANTE EM FUSÃO COM HIS. .............................. 45
FIGURA 19. PURIFICAÇÃO DE EMTFP250 RECOMBINANTE EM FUSÃO COM HIS. .................................................... 46
FIGURA 20. REATIVIDADE DE HIS::CTFP COM SOROS DE CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM EMTFP250
RECOMBINANTE. ............................................................................................................................................. 47
vii
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% - porcento
– micro
BAL – bactérias do ácido lático
BSA – “bovine serum albumin” / albumina de soro bovino
CTIT – Coordenadoria de Transferência e Inovação Tecnológica
DAI – “day after infection” / dia da infecção
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP – 2’-desoxirribonucleotídeo 5’-trifosfato
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
ELISA – “enzyme-linked immunosorbent assay” / ensaio de imunoadsorção por ligação
enzimática
EPO – “European Patent Office”
FPLC – “Fast protein liquid chromatography” / cromatografia líquida rápida sob pressão
g – grama
GALT – “gut associated lymphoid tissue” / tecido linfóide associado ao intestino
GDB – “Global Data Bus”
GFP – “Green fluorescent protein” / proteína verde fluorescente
GST – Glutatitiona-S-Transferase
h – horas
His – histidina
IFN – interferon
Ig – imunoglobulina
IL – interleucina
INPADOC – “International Patent Documentation Center”
IPTG – isopropil-tio-β-galactosídeo
kDa – quilo Dalton
L – litro
LB – meio de cultura Luria-Bertani
m – mili
M – molar
nm – nanômetro
NO – óxido nítrico
ºC – graus Célsius
viii
OD – “optical density” / densidade óptica
pb – pares de bases
PCR – “polymerase chain reaction” / reação em cadeia da polimerase
PEG – polietilenoglicol
PMSF – fenilmetilsulfonil fluoreto
rpm – rotações por minuto
SDS – dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio
TGF – “tumor growth factor” / fator de crescimento tumoral
TGI – trato gastrointestinal
TNF – fator de necrose tumoral
Tris – tris-(hidroximetil)-aminometano
U – unidade
USDA – Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
USPTO – “United States Patent and Trademark Office”
UV – ultra violeta
V – volts
WIPO – “World Intellectual Property Organization”
xg – gravidade
1
RESUMO
O desenvolvimento de vacinas orais vivas, através da construção de sistemas de expressão
e destinação de proteínas heterólogas, utilizando lactobacilos como veículos tem se tornado
uma das mais promissoras aplicações desta bactéria na saúde humana e animal. Os
lactobacilos são membros da microbiota gastrointestinal indígena dos animais e apresentam
várias características que fazem deles potencialmente bons candidatos a veículos de
antígenos em processos de vacinação oral, entre elas, resistência a ácidos e sais biliares,
persistência no trato gastrointestinal e modulação imunológica intrínseca. O presente
trabalho teve como objetivo criar ferramentas para o desenvolvimento de um protótipo
vacinal contra a coccidiose aviária, uma parasitose de ampla ocorrência e que é responsável
por grandes prejuízos à economia mundial. Para tal, inicialmente, foram construídos os
vetores pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
para a expressão do gene repórter da proteína
fluorescente verde (GFP) na forma intracitoplasmática e secretada. Então, o segmento
gênico codificador da região C-terminal da proteína EmTFP250 de Eimeria maxima foi
clonado, nos vetores acima, em substituição ao gene repórter. Assim, poderemos verificar
se a forma de endereçamento do antígeno irá influenciar a resposta imunológica.
EmTFP250 é um antígeno de alta massa molecular, presente em estágios assexuados de
Eimeria maxima e que está fortemente associado à imunidade maternal desenvolvida contra
este parasita em frangos recém nascidos. A fim de produzir anticorpos contra tal antígeno,
ele foi expresso, purificado e utilizado para a imunização de animais, deste modo, será
possível verificar a expressão do antígeno por bactérias transformadas com os novos
vetores. Os resultados, em E. coli, indicam que os novos sistemas de expressão estão
funcionando corretamente e que agora é preciso verificar a eficiência dos mesmos em
lactobacilos, que já foram previamente isolados de frangos, identificados e caracterizados
quanto às suas características probióticas.
2
ABSTRACT
The development of live oral vaccines through the construction of new systems for the
expression and cell destination of heterologous proteins, using lactobacilli as delivery
vehicles, has becoming one of the most promising application of these bacteria in the human
and animal healthcare. The lactobacilli are members of the indigenous gastrointestinal
microbiota of animals and show several features that turn out to be good candidates to carry
antigens in oral vaccination processes, such as, acid and bile salts tolerance, persistence
alive into the gastrointestinal tract, and intrinsic immune modulation. The present work aimed
to create new tools for the development of a vaccine prototype against avian coccidiosis, a
major worldwide parasitic disease responsible for huge economic losses. To address that,
first of all we construct two new vectors, pSECGFPEm
R
and pCYTGFPEm
R
, for the
expression of a reporter gene coding the green fluorescent protein (GFP) in intracellular and
secreted forms. So, the coding region of the C-terminus of EmTFP250 antigen of Eimeria
maxima was cloned and replaced GFP into both vectors. In this way, we were able to verify if
the antigen destination will have any influence in the acquired immunological response.
EmTFP250 is an antigen with a high molecular mass, present in the asexual stages of
Eimeria maxima, and it has strong association to maternal immunity transfer to newborn
chicks against this parasite. To generate antibodies against this antigen, it was cloned,
expressed, purified and used to immunize mice, so we will be capable to verify the
expression of EmTFP250 in genetically modified bacteria using these new vectors. Our
results in E. coli demonstrated that they are working finely as planned and now we need to
determine their efficiency in lactobacilli, already isolated from chicken crops, identified to the
species level and characterized by some probiotics features.
3
INTRODUÇÃO
1. Lactobacillus
Lactobacilos são bactérias Gram-positivas, em forma de bastonetes ou cocobacilos,
geralmente imóveis, não formadoras de esporos, anaeróbios aerotolerantes e catalase-
negativos. Estas bactérias são fermentadoras de glicose, a maioria homofermentativa, onde
o ácido lático é o produto majoritário final da fermentação; mas há representantes
heterofermentativos, também com produção de lactato, além de CO
2
e etanol em
quantidades eqüimolares. A conversão de açúcares a ácido lático, dentre outras
características, faz dos Lactobacillus membros do grupo das bactérias láticas (BAL), grande
grupo de bactérias Gram-positivas utilizadas desde tempos imemoriais na confecção,
processamento e preservação de diversos produtos alimentícios.
Os lactobacilos constituem um grupo bastante diverso, com 106 espécies validamente
descritas (Felis e Dellaglio, 2007), sendo encontrados em uma variedade de habitats, como
cavidade oral, trato respiratório, gastrointestinal e urogenital de humanos e outros animais;
associado aos vegetais, à matéria orgânica, além de solos, água, ou quaisquer outras fontes
de substratos fermentáveis com alguns nutrientes especiais, como certas vitaminas, sais e
aminoácidos. Os lactobacilos também estão presentes em muitos tipos de alimentos, como
por exemplo, iogurtes, carnes e derivados, queijos, bebidas fermentadas, cereais, sorvetes,
manteigas, dentre outros (Hammes e Hertel, 2003).
A estrutura filogenética do gênero é bastante complexa, uma árvore representativa é
mostrada na figura 1. As combinações de diferentes metodologias e modelos de inferências
filogenéticas permitiram o reconhecimento de uma série de grupos filogenéticos. Além disso,
a descrição de um grande número de espécies, nos últimos anos, mudou dramaticamente a
estrutura filogenética do gênero, mesmo em um pequeno intervalo de tempo. A principal
discrepância na taxonomia do gênero é a não-correlação entre posição filogenética e
características metabólicas (Felis e Dellaglio, 2007).
Bactérias do gênero Lactobacillus são os principais microrganismos desejáveis
encontrados em grandes quantidades por todo o TGI de aves, mostrando serem fortes
candidatas como probióticos para frangos de corte. Porém, alguns fatores podem determinar
diferenças nas populações e espécies de bactérias presentes no TGI de frangos, como tipo
de criação das aves (extensiva ou intensiva), alimentação, idade e raça (Souza et al., 2007).
4
Figura 1. Árvore filogenética dos grupos de bactérias da família Lactobacillaceae.
A árvore consenso baseia-se em análise de máxima parcimônia de seqüências completas
do gene 16S rRNA (Hammes e Hertel, 2003).
5
2. A camada S da parede celular de bactérias
Quase universalmente presente em Archaea, e encontrada em várias bactérias Gram-
negativas e Gram-positivas (figura 2), a camada S caracteriza-se como um fino envelope
cristalino de constituição (glico)protéica que envolve toda a superfície celular dos
organismos que as possuem. Suas funções biológicas estão ligadas à adesão,
determinação e manutenção da morfologia celular, infecção, crivos (barreiras) moleculares e
arcabouço de enzimas e proteínas de superfície (Smit et al., 2001; Jakava-Viljanen et al.,
2002). Sua estrutura é composta por apenas uma subunidade protéica, a proteína S, cuja
massa varia de 40 a 200 kDa, disposta em arranjos oblíquos, quadrados ou hexagonais
(Beveridge, 1994; Smit et al., 2001).
A maioria das proteínas S encontrada entre os procariotos é ácida (ponto isoelétrico
variando de 4 a 6), contendo alto número de aminoácidos ácidos e hidrofóbicos. A estrutura
primária varia bastante, gerando baixos níveis de homologia entre proteínas S de diferentes
espécies (Jakava-Viljanen et al., 2002). Outra característica muito importante das proteínas
S é a presença de dois domínios morfológicos distintos, inclusive com diferenças funcionais,
onde um destes domínios se liga aos peptídeoglicanos da parede celular, dando ancoragem
à camada S, e o outro permite a adesão específica a outras proteínas, como, por exemplo,
nas proteínas da matriz extracelular de tecidos animais (Smit et al., 2001).
Em Lactobacillus, a camada S é encontrada em muitas espécies, mas existem algumas
peculiaridades quando comparadas às camadas S de outros procariotos. Nestas bactérias,
as massas moleculares das proteínas S estão entre as menores conhecidas, variando de 43
a 46 kDa. Estas proteínas mostraram-se altamente básicas (pI > 9) ao invés de ácidas, não
são glicosiladas e compartilham de alta homologia principalmente na região C-terminal entre
as espécies (Smit et al., 2001; Jakava-Viljanen et al., 2002). A função da camada S nos
lactobacilos ainda é vagamente conhecida, mas alguns estudos mostram-na como
mediadora da adesão da bactéria a células epiteliais intestinais de aves e também ligação
ao colágeno, laminina e fibronectina, além de funcionar como adesina em células epiteliais
humanas (Jakava-Viljanen et al., 2002; Åvall-Jääskeläinen et al., 2003).
A ultraestrutura da camada S é conhecida em algumas espécies de lactobacilos, como
em L. acidophilus ATCC 4356. Estruturalmente, o domínio responsável pela cristalização e
organização dessa camada S é os 2/3 amino-terminal da proteína SlpA, sendo o terço final
carboxi-terminal o responsável pela ancoragem da proteína S na parede celular (Smit et al.,
2001). Essas propriedades estruturais da proteína S e também da camada S oferecem
novas e diferentes vias de aplicação em biotecnologia: já foram sugeridas utilizações como
matrizes de imobilização de moléculas funcionais, membranas de ultrafiltração, e também,
carreadores de vacinas (Jakava-Viljanen et al., 2002).
6
Figura 2. Representação esquemática da parede celular de uma bactéria Gram-
positiva.
A membrana plasmática lipoprotéica é coberta por várias camadas de peptídeoglicano onde
se encontram ligadas outras moléculas constituintes como, ácido teicóico, lipoteicóico e
polissacarídeos. Externamente há ainda um envelope de proteínas, chamado camada S,
além de inúmeras proteínas associadas, não representadas neste esquema (Adaptado de
Delcour et al., 1999).
7
3. Lactobacilos como vetores para vacinas orais
O desenvolvimento de sistemas de vacinação por via oral é pré-requisito para indução
de imunidade protetora contra a maioria dos patógenos entéricos/de mucosas de homens e
animais. Com raras exceções, as vacinas contra patógenos e toxinas sistêmicas em uso
atualmente são todas veiculadas por via parenteral. As vacinas orais apresentam inúmeras
vantagens em relação às vacinas parenterais. A administração oral é mais conveniente,
segura e pode ser realizada em larga escala sem grandes custos. Além disso, a imunização
oral pode produzir, para um grande número de patógenos, o que se chama de imunidade de
rebanho, ou seja, a imunidade se espalha através dos membros de uma comunidade após a
imunização de um pequeno número de indivíduos (Pouwels et al., 1996). Esta característica
torna as vacinas orais especialmente interessantes para imunização de grandes rebanhos
animais. Outra questão importante é que diversos patógenos, incluindo bactérias, vírus e
parasitas, invadem os hospedeiros através das superfícies mucosas ou mesmo transitam
por estas nos estágios iniciais da infecção. Em homens e animais mais de 60% dos
anticorpos protetores encontrados nas mucosas tem origem da produção diária local e não
do pool sistêmico. Assim a imunização oral, diferente da parenteral, freqüentemente induz
respostas imunes locais além das sistêmicas, resultando na proteção contra a doença e
futuras infecções (Pouwels et al., 1998; Russell-Jones, 2000; Medina et al., 2001; Neutra et
al., 2006).
O reconhecimento da importância do sistema imune associados às mucosas tem
resultado no desenvolvimento de diversos sistemas de veiculação de antígenos a estes
sítios (figura 3) (Husband, 1993, Lamm, 1997, Walker, 1994, Wells et al., 1997). Alguns
destes sistemas são sintéticos e baseiam-se na incorporação dos antígenos vacinais em
lipossomas, microesferas biodegradáveis e mais recentemente nanopartículas. Uma
alternativa a estes sistemas consiste na utilização de partículas virais e plantas
transgênicas. Entretanto a estratégia mais estudada atualmente envolve o desenvolvimento
de bactérias recombinantes. O uso de bactérias como carreadoras de antígenos tem, entre
outras vantagens, baixos custos de produção, maior estabilidade e, portanto, maior vida de
prateleira e facilidade de administração (Medina et al., 2001).
Os lactobacilos vêm sendo estudados por muitos microbiologistas e geneticistas a fim de
funcionarem como veículos carreadores de moléculas de interesse biotecnológico, como
antígenos (bacterianos, virais e de protozoários), citocinas, anticorpos e enzimas (Krüger et
al., 2002; Reid et al., 2003; Pontes et al., 2003). O desenvolvimento de vacinas orais vivas,
através da construção de sistemas de expressão e destinação de proteínas heterólogas,
utilizando os lactobacilos como veículos tem se tornado uma das mais
8
A.
B.
Ano
Número de patentes
Aumento no número de patentes
Número de patentes
Número de patentes
acumulado
Outros
A.
B.
Ano
Número de patentes
Aumento no número de patentes
Número de patentes
Número de patentes
acumulado
Outros
Figura 3. Análise das publicações de patentes internacionais sobre vacinas orais.
(A) Proporção das principais assinaturas de patentes relacionadas a tecnologias de vacinas
orais. (B) Distribuição temporal destas publicações. A pesquisa por documentos de patentes
internacionais foi realizada em bancos de dados Japoneses, USPTO, EPO, WIPO, GDB e
INPADOC. Palavra-chave: oral vaccines (Adaptado de CTIT-UFMG, 2007).
9
promissoras aplicações desta bactéria na saúde humana e animal (Kaur et al., 2002;
Seegers et al., 2002; Hanniffy et al., 2004).
Os lactobacilos são membros da microbiota gastrointestinal indígena dos animais e
apresentam várias características que fazem deles potencialmente bons candidatos a
veículos de antígenos em processos de vacinação oral. Entre elas, resistência a ácidos e
sais biliares, persistência no trato gastrointestinal e modulação imunológica intrínseca
(Perdigon et al., 1998; Seegers, 2002; Christensen et al., 2002; Mohamadzadeh et al.,
2005). Essa capacidade de colonização do trato gastrointestinal é uma característica
importante para um bom vetor vacinal, haja vista que vacinas orais requerem uma dose
maior do que a necessária para vacinas veiculadas por via parenteral (Ryan, 2001). O
contato íntimo com a mucosa permite, em princípio, a indução de uma resposta imune local
contra o antígeno carreado pelo lactobacilo e a modulação imunológica elicitada pelo próprio
veículo vacinal (Pouwels, 1996; 1998).
Além disso, atualmente dispõe-se de grande informação acerca das características
probióticas dos lactobacilos, como, por exemplo, dados sobre adesão, colonização e efeitos
no hospedeiro, produção de substâncias antagonistas, patogenicidade, fisiologia,
imunogenicidade, filogenia e relações microecológicas no trato gastrointestinal de animais
(Macpherson et al., 2004; Hammes e Hertel, 2003). Todos estes dados aliados a vasta e
saudável utilização destas bactérias pela humanidade ao longo de séculos deu aos
lactobacilos o status GRAS (generally regarded as safe).
A segurança é um fator muito importante que deve ser levado em conta quando se
trabalha com vetores vacinais vivos. A despeito do uso de vetores como Salmonella,
Shigella, Listeria, Escherichia coli, Mycobacterium, Bacillus, Vaccinia, entre outros, os
lactobacilos não apresentam patogenicidade residual (Adams et al., 1995; Phalipon et al.,
1995; Havenith, et al., 2002; Dennehy et al., 2005; Atkins et al., 2006). Além de
comprometerem a segurança da vacina, principalmente se considerarmos indivíduos
imunocomprometidos, vetores vacinais potencialmente patogênicos podem reduzir a eficácia
da vacina, uma vez que estimulam respostas imunes contra si próprios. Os Lactobacillus
apresentam-se ainda, como uma ótima alternativa a outras bactérias lácticas, como
Lactococcus lactis, abundantemente estudados como veículos vacinais, pois estas bactérias
não possuem a capacidade de colonização do trato gastrointestinal (Klijn et al., 1995;
Mercenier et al., 2000; Grangette et al., 2002).
Conhecimentos sobre a genética desses microorganismos ainda permanecem limitados,
mas tem aumentado bastante, principalmente nos últimos anos, após o seqüenciamento do
genoma de Lactobacillus plantaram (Kleerebezem et al., 2003), Lactobacillus johnsonii
(Pridmore et al., 2004), Lactobacillus acidophilus (Altermann et al., 2005), Lactobacillus
sakei (Chaillou et al., 2005) e Lactobacillus salivarius (Claesson et al., 2006). Contudo já
10
foram desenvolvidos vários sistemas de expressão de proteínas heterólogas para os
lactobacilos. Sistemas de expressão constitutiva e regulada, com diferentes formas de
endereçamento celular do produto protéico, isto é, intracelular, extracelular ou associado à
parede celular bacteriana. Nestes últimos, a proteína S, formadora da camada S, presente
em diversas espécies de lactobacilos, é muito usada para a ancoragem de antígenos à
superfície celular destas bactérias (Savijoki et al., 1997; Jakava-Viljanen et al., 2002).
Os Lactobacillus têm sido empregados como vetores vacinais para toxinas tetânicas
(Shaw et al., 2000; Grangette et al., 2001; Scheppler et al., 2002; Reveneau et al., 2002),
antígenos protetores de Bacillus anthracis (Zegeres et al., 1999), de Clostridium (Cho et al.,
2000) e Salmonella (Kajikawa et al., 2007), glicoproteínas de coronavírus (Ho et al., 2005),
determinantes antigênicos do vírus influenza (Pouwels, 1996), urease de Helicobacter pylori
(Corthésy et al., 2005), antígenos pneumocócicos (Oliveira et al., 2003, 2006), receptores
para o vírus HIV (Chang et al., 2003) e outros determinantes antigênicos virais (Lee et al.,
2006). Em todos estes trabalhos, os Lactobacillus provaram ser veículos vacinais eficientes,
induzindo respostas imunes locais e sistêmicas contra os antígenos carreados. O
reconhecimento de que espécies autóctones podem executar este papel melhor do que
qualquer outra tem incentivado as pesquisas com lactobacilos de diferentes animais. Desta
forma, o impacto do metabolismo de Lactobacillus sobre a nutrição e a fisiologia de animais
de produção é uma importante área de estudo.
4. O plasmídio pLBSGFPEm
R
Nosso grupo de pesquisa vem, há algum tempo, trabalhando no desenvolvimento de
novos sistemas de expressão para a criação de vetores vacinais orais, baseados em
lactobacilos. Em um trabalho publicado em 2006, descrevemos um novo plasmídio,
pLBSGFPEm
R
, que mostrou ser uma promissora ferramenta para o desenvolvimento de
vacinas orais vivas (figura 4). Este plasmídio apresenta seqüência promotora, peptídeo
sinal, seqüência de ancoragem à superfície celular e terminadora derivadas do gene lbs de
Lactobacillus crispatus; além dos genes emrAM e gfp como marcador de seleção e gene
repórter, respectivamente.
Linhagens isoladas do trato gastrointestinal de frangos e pré-selecionadas quanto às
suas características probióticas, foram transformadas com o novo plasmídio e foi possível
verificar a expressão do gene repórter. Através da visualização das células ao microscópio,
observamos que as linhagens selvagens de lactobacilos transformados apresentavam a
proteína GFP homogeneamente distribuída em sua superfície celular, mostrando o sucesso
do sistema de endereçamento utilizado (Mota et al., 2006).
11
Contudo, o desenvolvimento de sistemas de endereçamento celular que permitem a
produção da proteína repórter e sua manutenção no interior da célula ou sua exportação
para o meio extracelular, é ainda objeto de nossa pesquisa.
Figura 4. Representação esquemática do vetor pLBSGFPEm
R
.
O vetor pLBSGFPEm
R
apresenta seqüência do promotor, peptídeo líder (ou sinal), âncora
e região terminadora (indicado como Ter) do gene lbsA de Lactobacillus crispatus. Os genes
gfp e emrAM, são usados como repórter e marcador de seleção, respectivamente. Através
dos sítios de restrição indicados é possível realizar a deleção e/ou inserção de elementos
genéticos em apenas uma etapa de clonagem (Adaptado de Mota et al., 2006).
12
5. Coccidiose aviária
A coccidiose (ou eimeriose) é uma doença inflamatória do epitélio intestinal de animais,
cujos agentes etiológicos são protozoários parasitas Apicomplexa do gênero Eimeria. Estes
parasitas intracelulares multiplicam-se no TGI dos animais, causando destruição tecidual
das mucosas, prejudicando a absorção de nutrientes e comprometendo a conversão
alimentar, reduzindo assim, o ganho de peso dos animais. Existem sete espécies de Eimeria
(E. acervulina, E. máxima, E. tenella, E. brunetti, E. mitis, E. necatrix e E. praecox), com
ocorrência mundial, capazes de parasitar frangos de corte (Gallus gallus domesticus).
O ciclo parasitário (figura 5) inicia-se quando os oocistos esporulados são ingeridos e
recebem uma série de estímulos, iniciando-se pela ação mecânica exercida pela moela das
aves. Em seguida inicia-se uma fase dependente de ação enzimática, conhecida como
excistação, em que o CO
2
, pH, enzimas proteolíticas do suco pancreático e bile promovem a
liberação dos esporozoítos. Uma vez liberados os esporozoítos, agora móveis vão
rapidamente iniciar o processo de invasão celular. Os esporozoítos invadem as células
epiteliais do TGI, podendo também penetrar na lâmina própria e ir até o epitélio glandular.
Durante esse processo, antígenos presentes nas organelas do complexo apical (roptrias e
micronemas) executam um papel importante no reconhecimento e penetração através da
membrana da célula hospedeira. Em seguida o esporozoíto toma forma arredondada
passando a trofozoíto, é o início do processo de reprodução assexuada por esquizogonia, a
merogonia. O núcleo do trofozoíto começa a se dividir e passa por uma diferenciação
citoplásmica que dá origem aos merozoítos. Merontes maduros podem ser encontrados no
terceiro dia da infecção (DAI), contendo em seu interior 16 a 32 merozoítos que tão logo
rompem a célula hospedeira e penetram em outras células. Antes de se iniciar a fase
gametogônica poderão ocorrer outros ciclos assexuados. A reprodução sexuada ou
gametogonia inicia-se por volta do quarto DAI. Nesta etapa os merozoítos penetram nas
células e desenvolvem-se em microgametas móveis (gameta masculino) ou macrogametas
(gameta feminino). Os microgametas deixam a célula para fecundarem os macrogametas
formando assim um zigoto, em torno do qual se formará uma membrana, dando origem ao
oocisto (oo= ovo, cystis= encistado). O oocisto é uma estrutura geralmente ovóide com
parede dupla altamente resistente ao dessecamento e diversas substâncias químicas,
sendo por isso conhecido como a forma de resistência. Após sair da célula epitelial e ser
eliminado nas fezes, sob condições ambientais adequadas passa por um processo de
esporulação ou esporogonia. A meiose ocorre nesta fase e sendo assim todos os estágios
seguintes do ciclo de vida, exceto pelo gameta feminino fecundado, possuirão um conteúdo
haplóide no DNA (Fernando, 1990). Tal processo depende da presença de O
2
e das
13
Figura 5. Ciclo de vida de Eimeria spp.
Após a ingestão de oocistos maduros, os esporozoítos contidos neste invadem a parede
intestinal do hospedeiro. O parasita é fagocitado por macrófagos, escapa e invade as
células epiteliais, onde se diferenciam e dividem assexuadamente (esquizogonia), formando
os merozoítos. Estes se multiplicam rompendo as células intestinais e alguns entram na fase
sexuada do ciclo (gametogonia), formando gametas que se unem para gerar um novo
oocisto, que é liberado junto às fezes. No meio externo, os oocistos passam por um
processo de maturação (esporogonia), tornando-se infectantes.
Fonte: http://www.iah.bbsrc.ac.uk/ Eimeria/lifecycle.htm
14
condições de temperatura e umidade do ambiente (Macdougald e Reid, 1987). Ao final do
processo cada oocisto esporulado contém quatro esporocistos cada qual com dois
esporozoítos no seu interior.
O ciclo de vida altamente multiplicativo e a alta resistência dos oocistos possibilitam a
fácil disseminação e persistência da doença na avicultura (Ruff, 1999). É uma doença típica
de animais jovens, já que, após uma primeira exposição ao agente, a imunidade se
desenvolve rapidamente, protegendo a ave contra infecções futuras (Williams, 2002).
Infelizmente, não existe imunidade cruzada entre as espécies de Eimeria nas aves e, surtos
posteriores podem decorrer por espécies diferentes, algumas vezes é possível observar até
mesmo infecções mistas, causadas por mais de uma espécie de Eimeria simultaneamente.
A coccidiose pode ainda facilitar a instalação de outras doenças, pois os tecidos intestinais
danificados e as conseqüentes mudanças nas funções do trato intestinal podem quebrar as
barreiras naturais de defesa e permitir a colonização por outros patógenos, tais como
Clostridium perfringens ou Salmonela typhymurium (Becker, 1948; Macdougald, 1997).
Assim como os agentes patogênicos, outros fatores imunossupressores, como o
estresse, podem agir em conjunto com a coccidiose tornando os animais mais susceptíveis
a doenças. Em aves criadas comercialmente, o estresse pode ser induzido por fatores
infecciosos ou ligados ao manejo. Dentre os agentes indutores de estresse, destacam-se
temperatura ambiente, ventilação, qualidade do ar, densidade populacional, competição por
alimento e água, nível de ruído no ambiente e fotoperíodo em que as aves são submetidas
(Dietert e Golemboski, 1994). No estresse, ocorre uma resposta integrada e bidirecional por
atividade dos sistemas nervoso e imune. Ambos os sistemas reconhecem estímulos que
ameaçam a homeostase e iniciam uma resposta adaptativa integrada. O sistema nervoso
pode regular o sistema imune. Células mononucleares possuem receptores para
neurotransmissores e neuropeptídios e tecidos linfóides primários e secundários recebem
inervação simpática. Por outro lado, células linfóides ativadas podem modular a atividade do
sistema nervoso central pela liberação de citocinas (Basedovsky et al., 1977, Kushima et al.,
2003). Portanto o ambiente é um grande determinante da sanidade das aves.
Os coccídeos são, sem sombra de dúvidas, os mais importantes parasitas na avicultura,
seja em termos de distribuição, freqüência ou perdas econômicas (Ruff, 1999). Os custos da
doença estão estimados em torno de U$ 3 bilhões por ano em todo o mundo.
Aproximadamente 80% destes custos devem-se a mortalidade, baixo ganho de peso e
conversão alimentar, e os 20% restantes a quimioterapia (Williams, 1999). Apesar disso, a
ocorrência da doença nas suas formas clínicas, com alta mortalidade e perdas produtivas
severas não é comum devido ao advento das drogas comumente utilizadas nas explorações
avícolas. Portanto, o mais comum de se observar atualmente é a ocorrência da coccidiose
subclínica, caracterizada principalmente pela redução no ganho de peso e
15
comprometimento na conversão alimentar. Algumas espécies são mais patogênicas em
termos de dose de inoculação de oocistos necessários para se produzir os sintomas clínicos
da doença, como anorexia, arrepiamento das penas, diarréia, fraqueza e o pobre
desenvolvimento físico (Reid, 1975).
O grande crescimento da indústria avícola nos últimos 50 anos coincidiu com o
desenvolvimento e o uso eficiente de medicamentos coccidiostáticos para inibir ou bloquear
as manifestações da doença. Mais de 230 toneladas destas drogas são vendidas
anualmente, somente na Inglaterra (Shirley et al., 2007). Entretanto, a resistência
progressiva dos parasitas aos fármacos é um fator limitante para o controle da coccidiose
nas granjas. Além disso, a preocupação crescente do mercado mundial com a qualidade
dos produtos tem induzido os produtores a restringirem o uso dos anticoccídicos já que,
seus resíduos metabólicos, prejudiciais à saúde, podem ser depositados nos ovos e carne
das aves (Rana et al., 1993; Williams, 2006). Em 2008 será publicado, pelo Parlamento e
Conselho Europeu, um ofício em que será informada a decisão de banir o uso destas
substâncias até dezembro de 2012 (Regulamentação [EC] No. 1831/2003, Artigo 11). Desde
a introdução da primeira sulfa, no final dos anos quarenta, até o uso atual pela indústria
avícola de mais de vinte medicamentos diferentes, a coccidiose tem-se mantido como a
mais custosa e a mais comum doença da produção avícola, a despeito dos avanços na
quimioterapia, nutrição, manejo e genética (Danforth e Ruff, 1999).
Alternativamente, já existem pelo menos dez vacinas disponíveis no mercado,
produzidas a partir de oocistos vivos dos parasitos (Dalloul e Lollehoj, 2005). Algumas delas
utilizam oocistos virulentos, como a Coccivac
®
(Schering-Plough Animal Health, UK),
Immucox
®
(Vetech Laboratories, Canadá), Nobilis
®
COX ATM, VAC M
®
(Intervet, Holanda),
Inovocox
®
(Embrex, Inc., USA), ADVENT
®
(Novus International, USA) e mais recentemente
Inmuner
®
Gel-Coc (Vacunas Inmuner, Argentina). Todas essas apresentam eficácia relativa,
pois apesar de induzirem resposta imune eficaz (principalmente entre a 3ª e 4ª semanas de
vida), elas induzem infecções leves, com efeitos sobre o ganho de peso, a conversão
alimentar e a pigmentação da pele das aves (Macdougald, 1997; Danforth, 1998). Outras
vacinas, como a Livacox
®
(Biopharm, República Tcheca) e Paracox
®
(Schering-Plough
Animal Health, UK), utilizam oocistos atenuados. Finalmente, há um grande esforço para o
desenvolvimento de vacinas recombinantes. Apesar de inúmeros antígenos protetores já
terem sido identificados (Ding et al., 2004; Min et al., 2004; Schaap et al., 2004; Lillehoj et
al., 2005; Periz et al., 2007), apenas a vacina CoxAbic
®
(ABIC Veterinary Products, Israel)
esta disponível no mercado atualmente. Entretanto, assim como as vacinas que contém
oocistos atenuados, as vacinas recombinantes, dentre outras desvantagens, são laboriosas
e onerosas, o que as torna economicamente pouco viáveis para o controle da coccidiose
aviária (Shirley et al., 2007).
16
Há então uma abertura de espaço para uma terceira via, ou seja, a criação de vacinas
eficazes sem riscos de patogenicidade adquirida. O desenvolvimento de uma vacina viva
contra eimeriose, utilizando-se microrganismos potencialmente probióticos, isolados do TGI
de indivíduos sadios, e, modificados geneticamente, poderia se constituir em um método
eficiente e de alto valor custo-benefício. As vantagens de vacinação oral por Lactobacillus
transformados contra coccidiose aviária são várias. Primeiramente, seria possível combinar
linhagens de Lactobacillus geneticamente modificados que veiculam diferentes antígenos,
fenômeno denominado co-expressão, de modo a aumentar a eficácia da vacinação, além da
possibilidade de construção de sistemas de expressão de moléculas estimuladoras
(Seegers, 2002), como citocinas, por exemplo. Segundo Jenkins (1998), uma vacina efetiva
contra coccidiose precisaria conter antígenos de diversos estágios de desenvolvimento do
parasita. Na vacinação atual, que utiliza a atenuação da virulência dos organismos, somente
a forma atenuada administrada é que gera a resposta imune – para a imunização contra as
várias espécies, suas respectivas linhagens vivas é que são introduzidas na vacinação.
Outra vantagem leva em consideração questões econômicas. As leis de mercado
exigem que os custos de aplicação de vacinas, recombinantes ou não, ou uso de
medicamentos, tem que ser menores do que as perdas causadas pela coccidiose. Enquanto
estima-se que o custo da criação de cada nova droga anticoccídica seja de U$ 100 milhões,
a aplicação custa cerca de U$ 0,05 por ave, indicando, em termos econômicos, que a
vacinação pode facilmente competir com as drogas anticoccídicas (Jenkins, 1998). Já o
custo de produção de parasitas, atenuados ou não, é bastante elevado quando comparados
à produção/crescimento de bactérias lácteas, tecnologia dominada há milênios pela
humanidade. Além do barateamento, a tecnologia de vacinação por Lactobacillus
transformados geneticamente oferece a massificação da produção, além de vias alternativas
de aplicação da vacina, como inoculações em ração ou em água, com redução ainda maior
dos custos.
Adicionado a isso, estão os efeitos positivos dos Lactobacillus na saúde das aves como
probióticos, desde a imunomodulação do hospedeiro e outras características anteriormente
citadas até a inibição da invasão do parasita (Dalloul et al., 2003; Tierney et al., 2004;
Dalloul et al., 2005; Haghighi et al., 2006).
6. Imunidade na coccidiose
As aves infectadas por coccídeos desenvolvem uma sólida imunidade que as protege
contra infecções posteriores. A imunidade desenvolvida não previne a invasão das células
pelos esquizontes, mas impede o desenvolvimento destes em seu interior (Lillehoj, 1999).
17
A principal forma de imunidade envolvida nessa proteção é a celular, realizada
principalmente por células T residentes no tecido linfóide associado ao intestino. Os
linfócitos T parecem responder à coccidiose tanto pela produção de citocinas como por
ataque citotóxico direto nas células afetadas (Allen e Fetterer, 2002).
Devido ao complexo ciclo de vida destes parasitas, em cada estágio o parasita utiliza
nichos diferentes dentro do hospedeiro, desde os espaços extracelulares das mucosas até
os meios intracelulares dos enterócitos e outras células do epitélio. Na fase extracelular, o
parasita é suscetível a anticorpos, complemento, citocinas e à fagocitose. No interior da
célula, o parasita é afetado pela atividade citotóxica e por mecanismos intracelulares de
defesa, tais como produção de radicais livres e enzimas (Allen e Fetterer, 2002).
A resposta imune contra a coccidiose nas aves ocorre nos tecidos linfóides associados
ao intestino (GALT), que incluem a bursa de Fabricius, as tonsilas cecais, as placas de
Peyer e linfócitos agregados ao epitélio e a lâmina própria da parede do trato gastrointestinal
(Befus et al., 1980). Entre seus constituintes encontram-se as células apresentadoras de
antígenos, as imunorreguladoras e as efetoras. Os tecidos efetores da mucosa consistem
principalmente em células T, predominantemente células T CD4+ de memória/efetoras, além
de um número elevado de células B e plasmócitos, principalmente do isótipo imunoglobulina
A (IgA), além de células NK. O papel das diferentes populações de células T na resposta
imune contra os coccídeos em aves parece ser diferente conforme a espécie de Eimeria
(Allen e Fetterer, 2002). Células dendríticas e células M são reconhecidas como células
apresentadoras de antígeno da mucosa intestinal (Befus et al., 1980). Os leucócitos
residentes intestinais dos frangos compreendem 80% de linfócitos, 10 a 15% de monócitos,
aproximadamente 5% de células mononucleares e menos de 1% de leucócitos
polimorfonucleares e plasmócitos. O sistema imune associado ao intestino tem como
funções gerais processar e apresentar antígenos, produzir anticorpos locais e ativar a
imunidade mediada por células (Befus et al., 1980; Lillehoj, 1999; Lillehoj et al., 2003).
A ativação de células B pode ocorrer no intestino, linfonodos e baço. A diferenciação em
plasmócitos ocorre dentro dos tecidos linfóides extra-intestinais, de modo que os anticorpos
podem ser liberados localmente ou entrar na mucosa via corrente sangüínea. A ação dos
anticorpos contra a Eimeria inclui opsonização, participação da citotoxidade por meio da lise
por complemento e prevenção da invasão pela imobilização e bloqueio das formas
parasitárias extracelulares na superfície do epitélio. Os anticorpos circulantes, específicos
para vários estágios do parasita, são detectáveis dentro de uma semana após a inoculação
dos oocistos, alcançando o nível máximo em um ou dois meses e, então, declinando, apesar
de persistirem na circulação. Nos frangos, as imunoglobulinas predominantes nas secreções
intestinais são as IgA e IgM, capazes de atravessar diretamente a superfície epitelial.
Embora a imunoglobulina G possa ser encontrada no intestino, acredita-se que seja
18
derivada da circulação, pois ao atravessar as paredes dos vasos surge nos fluidos
intestinais. Este processo é aumentado quando se desenvolve uma reação inflamatória com
alterações na permeabilidade nas paredes dos vasos. (Kawazoe, 2000).
A IgA pode atuar como um anticorpo secretório, assim sua principal função inclui a
prevenção da entrada de antígenos ambientais no organismo. Os anticorpos secretórios
podem se ligar à superfície dos patógenos e evitar, por bloqueio, a aderência destes ao
epitélio. Apesar da ausência de anticorpos, frangos com agamaglobulinemia são resistentes
a reinfecção por coccídeos (Lillehoj, 1999).
Células exibindo marcadores para células NK também estão envolvidas na imunidade
intestinal. A população destas células aumenta durante a infecção primária por coccídeos.
As células NK demonstram atividade citotóxica para uma variedade de células alvo. Nos
frangos, a atividade das células NK foi demonstrada no baço, no sangue periférico, no timo,
na bursa e no intestino. A atividade das células NK aumenta com a idade e seu potencial
citotóxico não fica completamente desenvolvido até a ave atingir seis de semanas de vida
depois da eclosão. Supõe-se que as células NK são ativas na primeira linha de defesa do
hospedeiro por causa da íntima proximidade com o intestino, no qual grande e variada
quantidade de substâncias antigênicas é introduzida constantemente. A observação de que
os linfócitos intraepiteliais intestinais dos frangos incluem células NK, que medeiam a
citotoxidade espontânea, sugere que as células NK desempenhem um papel importante na
defesa local (Lillehoj, 1999).
Os macrófagos da mucosa intestinal fagocitam esporozoítos durante a infecção primária
e secundária, porém sua atividade não parece aumentada nas aves imunizadas. São fontes
de várias citocinas inflamatórias que podem modular a resposta imune celular (Allen e
Fetterer, 2002, Dalloul et al., 2007).
Estudos recentes indicaram que os linfócitos intra-epiteliais intestinais medeiam a função
dos efetores através da secreção de citocinas biologicamente ativas. Em frangos, as
informações existentes sobre as citocinas produzidas no intestino são limitadas. Tem sido
descrita a secreção de interferon- (IFN-), de interleucina-15 (IL-15) e de fator crescimento
tumoral- (TGF-) em galinhas em resposta aos coccídeos. O TGF- talvez possa ter um
papel modulador no crescimento das vilosidades intestinais. O IFN- está envolvido na
diferenciação, maturação e proliferação de células hematopoiética e aumenta a imunidade
não específica contra patógenos microbianos, virais e parasitários. O IFN- é uma citocina
importante produzida na coccidiose em aves, ativando macrófagos, células T e células NK.
Recentemente, identificou-se e relatou-se a presença de IL-15 no intestino de frangos.
Embora sua função biológica permaneça desconhecida, um nível alto de expressão nos
19
tecidos intestinais indica seu papel na resposta imune local contra patógenos (LILLEHOJ,
1999).
O fator de necrose tumoral- (TNF-) é uma citocina inflamatória secretada por
macrófagos ativados. Sua atividade é detectada em aves infectadas. Aves com coccidiose
tratadas com TNF- têm um aumento na perda de peso, enquanto aves tratadas com
anticorpos policlonais para TNF-, revertem a perda de peso, o que sugere que esta citocina
possa ter um importante papel na fisiopatologia da coccidiose. Radicais livres, incluindo,
espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico (NO), são também produzidos por macrófagos
ativados e por outros leucócitos fagocíticos. Níveis plasmáticos aumentados de NO podem
ser detectados seis dias após a infecção primária por E. acervulina, E. maxima e E. tenella,
mas o aumento do nível não ocorre durante a infecção secundária. Esta observação sugere
que a produção de NO pode estar associada à resistência à infecção pela resposta imune
inata à coccidiose (Allen e Fetterer, 2002; Qureshi et al., 2000).
As respostas imunes intestinais contra coccídeos que conduzem a uma imunidade
protetora envolvem o inter-relacionamento complexo de fatores solúveis, leucócitos, células
epiteliais, células endoteliais e outros fatores fisiológicos dos tecidos linfóides associados ao
intestino. As pesquisas sobre a imunidade contra a coccidiose demonstram que as
respostas imunes os coccídeos são extremamente complexas, envolvendo mecanismos
efetores diferentes dependendo do estágio de desenvolvimento do parasita (Lillehoj et al.,
2003).
7. A família TRAP e a proteína EmTFP250
A família TRAP (thrombospondin-related anonymous protein) é constituída de proteínas
secretadas de micronemas de protozoários Apicomplexa que contém um ou mais tipos de
domínios de adesão, incluindo pelo menos uma cópia do domínio de trombospondina tipo 1
(TSP-1) e geralmente um domínio integrina tipo 1, responsáveis pela adesão do parasita às
células hospedeiras (Naitza et al., 1998). Essas proteínas possuem também uma região c-
terminal, altamente conservada, caracterizada por um domínio transmembrana e uma cauda
citoplasmática, envolvidas com a mobilidade do parasita (Kappe et al., 1999). Inúmeros
membros desta família estão sendo diretamente associados com a invasão de células do
hospedeiro e/ou locomoção, incluindo Plasmodium berghei TRAP (Sultan et al., 1997) e
CTRP (Dessens et al., 1999), Toxoplasma gondii MIC2 (Carruthers et al., 1999), Neospora
caninum (Lovett et al., 2000) e Eimeria tenella MIC1 (Bumstead e Tomley, 2000). Devido a
essa significância funcional, proteínas da família TRAP são vistas como candidatas vacinais
potenciais, especialmente a proteína TRAP de P. berghei, contra a malária (Schneider et al.,
2001).
20
EmTFP250 é um antígeno de alta massa molecular, presente em estágios assexuados
de Eimeria maxima e que está fortemente associado à imunidade maternal desenvolvida
contra este parasita em frangos recém nascidos (Witcombe et al., 2003).
A imunidade maternal e o fenômeno em que anticorpos protetores, parasita-específicos,
são transferidos de aves de postura para suas crias através da gema dos ovos (Rose,
1972). Em frangos, acredita-se que a o efetor primário deste evento seja a imunoglobulina G
(IgG), já que este anticorpo é encontrado em grandes quantidades (miligramas) nas gemas
dos ovos (Losch et al., 1986; Rose e Orlans, 1981) e seus níveis no soro de frangos recém-
nascidos correlacionam-se fortemente com a imunidade à infecção por Eimeria (Smith et al.,
1994).
Já foi demonstrado que, após infecção de galinhas por Eimeria maxima, os anticorpos
protetores maternais (IgG) gerados, reconhecem predominantemente e de modo intenso
uma proteína de alta massa molecular (EmTFP250) em extratos protéicos de estágios
assexuados do parasita. Quando essa proteína foi utilizada para imunização de aves
matrizes, ela mostrou-se capaz de induzir a produção e transferência de anticorpos
maternais, que proveram proteção parcial a frangos posteriormente desafiados com E
maxima (Smith et al., 1994).
EmTFP250 (figura 6) foi clonada e caracterizada como sendo um novo membro da
família TRAP (Witcombe et al., 2003). Tal proteína apresenta 2334 aminoácidos e uma
massa molecular predita de aproximadamente 246 kDa (Figura 6). O polipeptídeo possui
uma alta porcentagem de resíduos de ácido glutâmico, glicina e cisteína, com 12.3, 11.8 e
10.6%, respectivamente. Além disso, o número de resíduos com carga positiva é quase 3
vezes maior que os negativos, tornando a proteína negativamente carregada. Os principais
tipos de domínios estruturais são TSP-1-like e EGF-like, que juntos correspondem a 86% da
proteína. O último domínio, encontrado em diversas proteínas de eucariotos, está envolvido
em funções como a coagulação, ativação do complemento e adesão celular (Campbell e
Bork, 1993).
Em 2004, Witcombe e colaboradores produziram uma proteína recombinante, derivada
da região C-terminal de EmTFP250, capaz de induzir forte resposta imunológica em frangos
e que, assim como EmTFP250, era reconhecida por anticorpos (IgG) maternais protetores
(figura 7). Como a proteína recombinante era capaz de reconhecer à nativa, foi possível
confirmar a localização desta no interior dos micronemas de E maxima. Esses resultados
apontam que a proteína EmTFP250 e seu derivado recombinante não somente são
imunogênicos, como a resposta imunológica por eles elicitada é capaz de proteger frangos
imunizados contra a coccidiose causada por E. maxima. Tudo isso torna este antígeno um
potencial candidato vacinal.
21
N-terminal
Peptídeo sinal e regiões transmembrana
C-terminal
Domínios trombospondina tipo 1 (TSP-1) (16)
Domínio tipo fator de crescimento epidérmico (EGF-like) (31)
Regiões hidrofílicas
Cauda citoplasmática
N-terminal
Peptídeo sinal e regiões transmembrana
C-terminal
Domínios trombospondina tipo 1 (TSP-1) (16)
Domínio tipo fator de crescimento epidérmico (EGF-like) (31)
Regiões hidrofílicas
Cauda citoplasmática
Figura 6. Representação esquemática da proteína EmTFP250.
EmTFP250 é uma proteína antigênica presente em estágios assexuados de Eimeria
maxima. Ela é membro da família TRAP (thrombospondin-related anonymous protein), que
compreende proteínas de micronema de protozoários Apicomplexa envolvidas com a
invasão das células hospedeiras e motilidade do parasito (Adaptado de Witcombe et al.,
2003).
22
Figura 7. Análise por western blotting de EmTFP250 recombinante.
O western blotting foi realizado com a proteína EmTFP250 recombinante, usando soro de
frangos imunes reativos contra a EmTFP250 nativa. Canaleta 1, soro de frangos de 3 dias
de vida filhos de galinhas infectadas com E maxima. Canaleta 2, soro de frangos de 12 dias
de vida, filhos de galinhas infectadas com E maxima e que foram também infectados com E
maxima. As canaletas 3 e 4 correspondem a soros de frangos adultos imunizados com
extrato total de merozoítos de E maxima e não infectados, respectivamente (Witcombe et
al., 2004).
23
OBJETIVOS
Objetivo Geral:
Construção de vetores plasmidiais de expressão de um antígeno de Eimeria maxima para a
modificação genética de bactérias probióticas do gênero Lactobacillus que serão
administrados por via oral a frangos de corte para imunização contra coccidiose aviária.
Objetivos Específicos:
1. Construção dos vetores pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
para expressão do gene
repórter da proteína fluorescente verde (GFP) na forma citoplasmática e secretada.
2. Analisar a expressão de GFP em E. coli, nas três formas de endereçamento –
associada à parede bacteriana, intracitoplasmática e secretada – por Western
blotting.
3. Amplificar por PCR o segmento gênico codificador da região C-terminal da proteína
EmTFP250 de Eimeria maxima.
4. Construção dos vetores pLBScTFPEm
R
, pSECcTFPEm
R
e pCYTcTFPEm
R
, para o
endereçamento diferencial do antígeno de Eimeria maxima.
5. Construção dos vetores pGEXcTFP e pTrcHiscTFP, para expressão e purificação do
antígeno recombinante EmTFP250, de Eimeria maxima.
6. Imunização de camundongos com a proteína recombinante cTFP para obtenção de
anticorpos policlonais contra a mesma e avaliação da resposta humoral destes
animais em ensaios de Western blotting.
24
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Linhagens bacterianas e condições de cultivo
Todos os experimentos de clonagens e expressão protéica foram realizados com a
linhagem de Escherichia coli TOP10, cultivada em meio LB (10 g/L NaCl, 10 g/L triptona, 5
g/L extrato de levedura), 2xYT (10 g/L NaCl; 20 g/L triptona; 10 g/L extrato de levedura), ou
SOB (0,5 g/L NaCl, 20 g/L triptona, 5 g/L extrato de levedura, 2.5 mM KCl, 10mM MgCl
2
) a
37 ºC, sob agitação constante, com adição de ampicilina a 50 - 100 μg/mL. Para culturas em
meio sólido, foram adicionados 1,5% de ágar bacteriológico ao meio líquido.
2. Técnicas gerais de manipulação e análise de DNA recombinante
Métodos de amplificação de DNA por PCR e digestão com enzimas de restrição foram
empregados de acordo com os protocolos descritos por Sambrook et al. (1989) e Ausubel
et. al. (1995). A lista dos iniciadores utilizados nesse trabalho está na tabela 1. Os
resultados destas manipulações foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% ou
mais concentrado, preparado com tampão TAE (0,04 M Tris-acetato; 0,001 M EDTA, pH
8,0), contendo brometo de etídio 0,1 mg/ml e visualizados em luz UV. Enzimas de restrição
foram adquiridas das empresas Promega, Invitrogen e New England Biolabs. Os tampões
utilizados nas reações e a temperatura de incubação utilizada para cada enzima foram
àqueles recomendados pelos próprios fornecedores. A purificação de fragmentos de DNA
(solução ou de gel de agarose) foi realizada utilizando-se o “GFX
TM
PCR DNA and Gel Band
Purification Kit” (GE Healthcare), seguindo as recomendações do fabricante. Utilizamos a
enzima T4 DNA ligase (Invitrogen) para ligar fragmentos a diferentes plasmídeos. O
seqüenciamento dos vetores foi realizado no laboratório NAGE – Núcleo de Análise e
Expressão Gênica, utilizando o “ETKit” (GE Healthcare).
Para a clonagem e expressão em E. coli do antígeno recombinante EmTFP250 em fusão
com GST (Glutationa S-Transferase) e HIS (Histidina) foram utilizados, respectivamente, os
vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e pTrcHis-TOPO (Invitrogen) (Figura 8), de acordo com
instruções do fabricante. Os demais vetores foram gerados a partir do plasmídio
pLBSGFPEm
R
AB (Figura 4)(Mota et al., 2006).
3. Preparo de células competentes e transformação de E. coli
Células termocompetentes de Escherichia coli TOP10 foram preparadas como descrito
abaixo. Uma colônia isolada foi inoculada em 10 mL de meio LB e incubada sob agitação
25
55AAGCTTCAGAAGATCCTATTAGAACTGTATGTTTAGTerminador – R
55CTCGAGGAATTGCACCCCATTCCAGCCC-TFP250 – S
55CTCGAGCATGTGTTTTCCTCCPromotorRevATG
55GGATCCCGGTCATTTTAACTTGCTAPromotor – S
55GTCGACGAATTCTTAAGTCGATGTAGTerminador – S
55GAATTCCTGAATGTCGCCGCTGTCGGCC-TFP250 – R
57GAATTCTGCTTTGTATAGTTCATCCATGCCATG GFP – R
57CTCGAGGCTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT GFP – S
Tm (ºC)Seqüência (5´- 3´)Iniciadores
55AAGCTTCAGAAGATCCTATTAGAACTGTATGTTTAGTerminador – R
55CTCGAGGAATTGCACCCCATTCCAGCCC-TFP250 – S
55CTCGAGCATGTGTTTTCCTCCPromotorRevATG
55GGATCCCGGTCATTTTAACTTGCTAPromotor – S
55GTCGACGAATTCTTAAGTCGATGTAGTerminador – S
55GAATTCCTGAATGTCGCCGCTGTCGGCC-TFP250 – R
57GAATTCTGCTTTGTATAGTTCATCCATGCCATG GFP – R
57CTCGAGGCTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT GFP – S
Tm (ºC)Seqüência (5´- 3´)Iniciadores
Tabela 1: Seqüência dos iniciadores utilizados nesse trabalho.
Os sítios de restrição inseridos nos iniciadores estão destacados em negrito.
26
Figura 8. Representação esquemática dos vetores pGEX e pTrcHis.
(A) O vetor pGEX codifica a proteína glutationa S-transferase (GST), que pode ser usada
posteriormente em sistemas de purificação por cromatografia de afinidade. Seu sítio de
clonagem encontra-se precedido de uma seqüência sinal para clivagem enzimática com
trombina. (B) O vetor pTrcHis permite a adição de uma cauda de poli-His à proteína de
interesse que esta sendo expressa. Esta cauda, também tem como objetivo facilitar a
purificação da proteína por cromatografia de afinidade.
27
(180 rpm) à 37 C por 12 h. Cerca de 1 mL da pré-cultura era transferido para uma nova
cultura de 50 mL de meio LB e novamente incubada a 37 ºC sob forte agitação até a
obtenção de OD
600nm
entre 0,2-0,5. As células foram coletadas por centrifugação a 5000 xg
por 10 minutos e concentradas em 3 mL de solução para indução de competência (1 g
triptona; 0,5 g extrato de levedura; 0,5 g NaCl; 10 mM MgCl
2
;10 mM MgSO
4
; PEG 8000 10%
(p/v); 5 mL DMSO após ajuste para 7,5; terminando com ajuste do volume para 100 mL) e
incubada por 10 minutos no gelo. A suspensão foi dividida em alíquotas de 100 L e estas
foram estocadas a -80ºC, após a adição e homogeneização de glicerol (15%).
A transformação por choque térmico foi feita adicionando 1 a 5 μl do de DNA (1-50 ng) a
uma alíquota de 50 μl de TOP10 termocompetente e incubando a mistura em gelo por 30
minutos. A cultura recebeu choque térmico de 42 C por 1 minuto e voltou para o gelo por
mais 1 minuto. Adicionou-se 500 μl de meio SOB e incubou-se a 37 C por 1h. A cultura
transformada foi plaqueada em placas de meio 2xYT-ágar + 100 μg/ml de ampicilina e
incubada a 37 C por 16h.
4. Identificação por PCR de clones bacterianos transformados
As colônias transformadas foram repicadas simultaneamente para outras placas de LB
ou 2xYT-ágar + 100 μg/ml de ampicilina e para tubos contendo 30 μl de tampão de lise para
PCR (10 mM Tris pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% de Tween20) e posteriormente fervidas a 95
C por 10 minutos. Os restos celulares foram separados por centrifugação a 14.000 rpm por
2 minutos e 4 μl do sobrenadante foram utilizados para a reação de PCR.
5. Obtenção do DNA plasmidiano em pequena escala
Para a obtenção de DNA plasmidiano, colônias bacterianas foram inoculadas em 3 ml de
meio LB + 100 μg/ml ampicilina e incubados a 37C por 16 horas sob agitação de 180 rpm.
Para extração do DNA plasmidiano, foi utilizado o “GFX
TM
Plasmid Mini Kit” (GE Healthcare),
conforme instruções do fabricante. A análise da eficiência da extração foi feita aplicando-se
1 μl das amostras em géis de agarose 1% e/ou por espectrofotometria em 260 nm.
6. Extração de DNA de Eimeria
A extração de DNA de Eimeria maxima foi realizada segundo metodologia empregada
por Zhao et al., (2001), com modificações. Inicialmente os oocistos purificados e mantidos
em 2% dicromato de potássio foram incubados com 4 % hipoclorito, por 1h a 4 ºC. Este
28
tratamento prévio permite a esterilização dos oocistos e auxilia na digestão da camada
externa da parede dos mesmos, tornando-os mais susceptíveis à digestão com protease.
Então, em 10 l de uma suspensão de oocistos (5x10
5
oocistos/l) foram adicionados 35l
de uma solução saturada de NaCl e incubado a 55 ºC por 1h sob agitação leve e
intermitente. Após isso, a suspensão foi preparada para a digestão com protease através
da adição de 300 l de tampão TE (10mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 8), 3 l de 10 % SDS
e 10 l de proteinase K (20 mg/ml). Após 1h de incubação a 37 ºC, o DNA foi purificado com
o auxilio de “Wizard
®
DNA Purification Kit” (Promega), de acordo com instruções do
fabricante.
7. Indução da expressão de proteínas recombinantes e preparo do extrato protéico
total de E. coli
Colônias isoladas foram inoculadas em 4 mL de meio 2xYT com ampicilina (100 μg/mL)
e incubadas por 16 h sob agitação (30 ºC ou 37 C a 180 rpm). Este pré-inóculo foi diluído
1:50 em 25 mL de meio 2xYT c/ antibiótico e incubados até atingirem a OD
600
aproximada
de 0,6. Em seguida, foram retirados 1,5 mL da cultura (tempo zero) e foi adicionado IPTG
para 1,0 mM final, sendo que a partir deste ponto foram coletadas amostras em tempos
diferentes de indução (3 e 5 h). A fim de garantir que quantidades aproximadamente iguais
de proteína total seriam analisadas, a cada tempo de indução, era determinada a densidade
ótica da cultura (OD
600
) de tal modo que fosse coletado o mesmo número de células nas
amostras correspondentes aos vários tempos de indução.
Após a retirada das amostras, as bactérias foram coletadas por centrifugação (14.000
rpm, 3 min, 4 ºC) e o sedimento lavado uma vez com PBS (NaCl 127 mM; 2.7 mM KCl; 10
mM Na
2
HPO
4
; 1.76 mM KH
2
PO
4
, pH 7,4). O sedimento foi ressuspendido em 50 L de água
estéril e posteriormente foi adicionado 50 L de tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris-HCl
62.5 mM pH 6,8; Glicerol 10 %; SDS 2 %; -mercaptoetanol 5 %; Azul de Bromofenol
0,00125 %) (mantido no gelo). As amostras foram aquecidas a 100 C por 10 min e após
resfriamento em gelo, foram centrifugadas a 12.000 rpm por 1 min. O sobrenadante foi
então submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida.
8. Obtenção das frações solúvel e insolúvel das proteínas recombinantes
Culturas de bactérias (100 mL), contendo plasmídio apropriado e induzidas como
descrito anteriormente, foram sedimentadas por centrifugação a 3.000 xg por 15 min, 4 ºC.
As células foram ressuspendidas em 5 mL de tampão de ligação, apropriado para cada
29
cromatografia. Foi utilizado PBS e BB (20 mM Na
2
HPO
4
, 0,5 M NaCl, 100 mM Imidazol, pH
7,4) para purificação de proteínas em fusão com GST e poli-His, respectivamente. A estes
tampões foi adicionada Lisozima (100 ·g/mL) e inibidores de protease (Leupeptina 10 g/mL,
Pepstatina-A 1 M e PMSF 1 mM). O material foi incubado por 30 min a 4 ºC sob agitação,
submetido a 6 etapas de congelamento (em N
2
líquido) e descongelamento (37 ºC) e
centrifugado a 12.000 rpm por 10 min a 4
o
C. O sobrenadante (fração solúvel) foi
recuperado, seringado para quebrar o DNA cromossômico e passado em filtro 0,45 μm
(Millipore). O pellet (fração insolúvel) foi ressuspendido com 1 volume de PBS.
9. Purificação das proteínas recombinantes
As frações solúveis dos extratos protéicos, obtidas como descrito anteriormente, foram
submetidas à cromatografia de afinidade, como se segue. Para as proteínas em fusão com
GST, as frações solúveis foram incubadas com a resina de Glutationa Sepharose
®
(GE
Healthcare) (pré-equilibrada com PBS) por 30 min a 4 ºC, sob agitação constante . O
material que não interagiu com a resina foi removido após centrifugação a 500 xg por 5 min,
4 ºC. A resina recuperada foi lavada 3 vezes com PBS. A fim de eluir as proteínas
recombinantes, a resina era incubada por 10 min a temperatura ambiente com Tampão de
eluição (50 mM Tris, pH 8.0, EDTA 1 mM e glutationa reduzida 10 mM) e então centrifugada
nas mesmas condições anteriores.
Já as proteínas em fusão com poli-His foram purificadas em minicolunas HisTrap
TM
HP
(GE Healthcare) com o auxílio do cromatógrafo ÄKTAprime plus (GE Healthcare), de acordo
com instruções do fabricante. Os tampões de ligação (20 mM Na
2
HPO
4
, 0,5 M NaCl, 100
mM Imidazol, pH 7,4) e de eluição (20 mM Na
2
HPO
4
, 0,5 M NaCl, 500 mM Imidazol, pH 7,4)
foram preparados logo antes das cromatografias, filtrados e de-aerados. A eluição se fez por
gradiente.
As diversas frações coletadas foram submetidas à análise em SDS-PAGE e coradas
com nitrato de prata, conforme descrito abaixo, para verificar a eficiência da purificação.
10. Concentração das proteínas por ultrafiltração
As frações protéicas puras foram concentradas e de-salinizadas para posterior
utilização. Os eluatos advindos da cromatografia foram centrifugados em tubos Amicon
®
Ultra-4 10,000 NMWL (Millipore) a 3.000 x g por 15 min, 4 ºC. Após a concentração foi feito
o “desalting” com PBS, pH 7,6.
30
11. Quantificação das proteínas
A quantificação das proteínas purificadas foi realizada pelo método de Bradford (1976),
com modificações. Em microplaca de 96 poços de fundo chato, eram colocados 20 μl de
proteína ou do padrão de soroalbumina bovina em duplicatas. A cada poço eram
adicionados 180 μl da solução de Bradford, diluída conforme especificação do fabricante.
Após 10 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a densidade óptica era
determinada em leitor de ELISA em filtro de 600 nm. Calculava-se a quantidade da proteína
de interesse em relação à curva padrão de soroalbumina.
12. Retirada do tag de GST das proteínas recombinantes
Após a purificação, as proteínas em fusão com GST foram clivadas com Trombina (USB)
para a retirada do tag de GST. Para tal, as proteínas foram previamente concentradas por
ultrafiltração, em tubos Amicon
®
Ultra-4, conforme descrito anteriormente, e de-salinizadas
com PBS, para retirada do tampão de eluição. Então, as proteínas foram incubadas com
trombina (10 U/g proteína de fusão) por 18h a 25 ºC, Para a verificação do resultado, o
produto de digestão foi submetido à análise em SDS-PAGE e corado com nitrato de prata.
13. Análise por SDS-PAGE
As proteínas foram separadas em SDS-PAGE utilizando-se gel separador a 12,5%.
Estes foram preparados a partir de uma solução de 40% de acrilamida/bisacrilamida 29:1
em Tris-HCl 375 mM pH 8,8 e SDS 0,1%. O gel de empacotamento foi preparado com Tris-
HCl 125 mM pH 6,8, contendo 4% de acrilamida/bisacrilamida 29:1 e 0,1% de SDS.
A eletroforese se procedeu em tampão de corrida (Tris-HCl 25 mM; Glicina 192 mM, pH
8,3; SDS 0,1%) a 200 V por 1 h aproximadamente. As proteínas foram ou coradas em
solução de Azul de Coomassie ou Nitrato de Prata, de acordo com os protocolos descritos a
seguir, ou transferidas para membrana de nitrocelulose, conforme a técnica de “Western
blotting”.
Coloração por Azul de Coomassie: os géis foram corados em solução de Coomassie
[Azul de Coomassie 0,1% em Metanol:Ácido acético:Água (5:2:5)] por 3 h, descorados em
solução Metanol 30%; Ácido acético 10%, incubados em solução preservativa (Etanol 25%;
Glicerol 1,5 %) por 1 h e montados em papel celofane previamente umedecido.
Coloração por Nitrato de Prata: os géis foram incubados em solução fixadora (Etanol
40%; Ácido acético 10%) por 30 min e posteriormente tratados como descrito no protocolo
31
fornecido pelo fabricante do "kit" PlusOne SILVER STAINING (Pharmacia), esta
metodologia é baseada naquela descrita por Heukeshoven e Dernick (1985).
14. Análise por “Western blotting”
As proteínas submetidas à eletroforese SDS-PAGE foram transferidas para membranas
de nitrocelulose (GE Healthcare) a 100 V por 1 h (no gelo) ou 30 V por 16 h (4 C) em
tampão de transferência (Tris 25 mM; Glicina 192 mM; Metanol 20 %; pH 8,3).
Em seguida as membranas foram incubadas em solução TBS-T (Tris-HCl 20 mM pH
7,6; NaCl 137 mM; Tween20 0,05%) com 5% p/v de leite em pó desnatado para
bloqueio durante 2 h aproximadamente. Após o bloqueio as membranas foram incubadas
em soluções de TBS-T + 5% de leite e os respectivos soros nas diluições indicadas durante
2 h, sendo depois lavadas com TBS-T 3 vezes de 15 min. As membranas foram então
incubadas em nova solução TBS-T + 5% de leite e o segundo anticorpo, anti-IgG de
camundongo conjugado com peroxidase, em diluições variadas por 1,5 h. Em seguida as
membranas foram novamente lavadas em solução TBS-T 3 vezes de 15 min. Outras duas
lavagens de 5 min foram feitas em solução TBS. As revelações foram feitas utilizando-se o
"Kit ECL PLUS" (GE Healthcare), segundo instruções do fabricante, em conjunto com o
aparelho STORM 840 (GE Healthcare).
15. Imunização dos animais
Fêmeas de camundongos BALB/c com 4/5 semanas de vida foram imunizadas com as
proteínas recombinantes purificadas para obtenção de anticorpos policlonais. Para isso, as
proteínas foram previamente submetidas à eletroforese (SDS-PAGE), coradas com azul de
Coomassie e a banda de interesse excisada do gel. Em seguida, a banda era triturada
manualmente com auxílio de N
2
líquido, ressuspendida em PBS e acrescido de hidróxido de
alumínio, como adjuvante. Foram realizadas 3 imunizações com um intervalo de 14 dias
cada. Em cada imunização foram injetados aproximadamente 10 g de proteína
recombinante e 30 g do adjuvante, por via subcutânea. Uma semana após a terceira
imunização os animais foram parcialmente sangrados pelo plexo retrorbital para avaliação
da resposta humoral, por “Western blotting”. O sangue foi incubado a 37
o
C por 30 min, o
coágulo foi sedimento por centrifugação e o soro coletado no sobrenadante.
32
RESULTADOS
1. Construção dos vetores pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
para expressão do gene
repórter na forma secretada e citoplasmática
Em estudos anteriores realizados pelo nosso grupo foi desenvolvido um novo vetor para
expressão de proteínas heterólogas em bactérias láticas denominado pLBSGFPEm
R
. Esse
vetor possui um cassete gênico que permite a expressão de GFP ancorada à superfície
celular de lactobacilos. Novas linhagens de lactobacilos, isoladas de frangos de corte e
caracterizadas quanto algumas características probióticas, foram transformadas com tal
vetor e foi possível verificar que as bactérias expressavam com sucesso o gene repórter gfp.
(Mota et al., 2006). Assim como a seqüência do promotor e peptídeo sinal influenciam os
níveis de expressão de um gene e de exportação da proteína sintetizada, outros fatores,
como o tipo de endereçamento da proteína, podem interferir na modulação da resposta
imunológica, no caso de uma vacina oral (Wu e Chung, 2006; Cortes-Perez et al., 2007).
Neste contexto, decidimos construir novos vetores para expressão do gene repórter na
forma secretada e citoplasmática (figura 9).
O vetor pSECGFPEm
R
foi construído a partir da deleção da região codificadora da
âncora do plasmídio pLBSGFPEm
R
, permitindo assim a secreção da proteína GFP pela
célula. A deleção da ancora se deu pela clonagem do produto de PCR da região
terminadora do gene lbsA de L. crispatus, de tamanho aproximado de 300 pb, em pCR2.1-
TOPO
®
. Esse plasmídio foi digerido com as enzimas EcoRI e HindIII para liberação do
fragmento correspondente à região terminadora, que foi então purificado e ligado ao
plasmídio pLBSGFPEm
R
, também digerido com EcoRI e HindIII (figura 10).
Já a construção do vetor pCYTGFPEm
R
baseou-se na deleção do peptídeo sinal do
vetor pSECGFPEm
R
, deste modo a proteína GFP permaneceria no interior da célula.
Inicialmente, o produto de PCR da região promotora do gene lbsA de L. crispatus, de
aproximadamente 250 pb, foi clonado em pCR2.1-TOPO
®
. Esse plasmídio foi digerido com
as enzimas XhoI e BamHI para liberação do fragmento correspondente à região promotora,
que foi então purificado e ligado ao plasmídio pSECGFPEm
R
, também digerido com XhoI e
BamHI (figura 11).
De modo semelhante ao que ocorreu com pLBSGFPEm
R
, bactérias E. coli
transformadas com pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
apresentavam fluorescência verde,
quando irradiadas com luz UV longa, demonstrando a funcionalidade dos novos vetores,
pelo menos nesta bactéria.
33
A.
B.
A.
B.
A.
B.
Figura 9. Representação esquemática dos vetores pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
.
(A) O vetor pSECGFPEm
R
foi construído a partir da deleção da região codificadora da
âncora do plasmídio pLBSGFPEm
R
, permitindo assim a secreção da proteína GFP pela
célula. (B) Para a construção do vetor pCYTGFPEm
R
foram deletadas as regiões de âncora
e peptídeo sinal do vetor pLBSGFPEm
R
, deste modo a proteína GFP permanece no interior
da célula.
34
XhoI/HindIII
Clone 1
XhoI
/
EcoRI
XhoI
/HindIII
Clone 4
XhoI
/
EcoRI
1000 –
650 –
850 –
pb
1650 –
5000 –
XhoI/HindIII
Clone 1
XhoI
/
EcoRI
XhoI
/HindIII
Clone 4
XhoI
/
EcoRI
1000 –
650 –
850 –
pb
1650 –
5000 –
Figura 10. Verificação da construção de pSECGFPEm
R
.
Eletroforese em gel de agarose 1,4% corado com brometo de etídio. As digestões
XhoI/HindIII liberam um fragmento de aproximadamente 1000 pb correspondente ao gene
gfp e a seqüência terminadora do gene lbsA (sem a âncora). As digestões XhoI/EcoRI
liberam um fragmento de 720 pb, correspondente ao gene gfp. Deste modo é possível
constatar a ausência da seqüência codificadora da âncora do gene lbsA e a funcionalidade
dos sítios de EcoRI e HindIII, utilizados nesta etapa de clonagem.
35
EcoRI
/
HindIII
Clone 3
XhoI
/
EcoRI
BamHI
/
XhoI
200 –
300 –
650 –
850 –
EcoRI
/
HindIII
Clone 5
XhoI
/
EcoRI
BamHI
/
XhoI
EcoRI
/
HindIII
Clone 6
XhoI
/
EcoRI
BamHI
/
XhoI
pb
5000 –
EcoRI
/
HindIII
Clone 3
XhoI
/
EcoRI
BamHI
/
XhoI
200 –
300 –
650 –
850 –
EcoRI
/
HindIII
Clone 5
XhoI
/
EcoRI
BamHI
/
XhoI
EcoRI
/
HindIII
Clone 6
XhoI
/
EcoRI
BamHI
/
XhoI
pb
5000 –
Figura 11. Verificação da construção de pCYTGFPEm
R
.
Eletroforese em gel de agarose 1,4% corado com brometo de etídio. As digestões
XhoI/EcoRI liberam um fragmento de aproximadamente 720 pb correspondente ao gene
gfp. As digestões EcoRI/HindIII liberam um fragmento de aproximadamente 300 pb,
correspondente a região terminadora do gene lbsA. Finalmente, as digestões BamHI/XhoI
liberam um fragmento de aproximadamente 250 pb, correspondente ao promotor do gene
lbsA. Pode-se verificar a ausência da seqüência codificadora do peptídeo sinal e da âncora
do gene lbsA.
36
2. Analise da expressão de GFP em E. coli
Como já foi dito anteriormente, bactérias E. coli transformadas com os novos vetores de
expressão construídos são capazes de expressar o gene gfp. Contudo ainda não era
possível saber se os sistemas de endereçamento estavam funcionando corretamente. No
intuito de resolver tal questão diferentes extratos protéicos, produzidos a partir de culturas
de células transformadas com pLBSGFPEm
R
, pSECGFPEm
R
ou pCYTGFPEm
R
foram
submetidos à eletroforese em SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de
nitrocelulose, pela técnica de Western blotting (figura 12-canaletas 3, 4 e 5,
respectivamente). Essa membrana foi então incubada com anticorpo monoclonal –GFP na
concentração de 1 g/ml. Nos dois últimos extratos (caneletas 4 e 5) foi possível identificar
uma proteína de aproximadamente 30 kDa que corresponderia a GFP, já na canaleta 3 a
proteína encontrada apresenta peso molecular superior, o que poderia ser explicado pelo
fato de que neste extrato a proteína GFP encontra-se fusionada a uma seqüência de
ancoragem a superfície celular bacteriana. Como controle negativo (canaleta 1) e positivo
(canaleta 2) da expressão de GFP, foram testados extratos de E. coli não transformada e
transformada com o vetor TOPO-GFP, respectivamente. No controle positivo podemos ver
que a proteína reconhecida pelo anticorpo apresenta massa molecular superior ao esperado
para GFP, isto ocorre pois a seqüência do sítio múltiplo de clonagem do vetor é expressa
em fusão com o inserto, que neste caso é o gene gfp.
3. Amplificação da seqüência codificadora da região C-terminal da proteína
EmTFP250 de Eimeria maxima
Para a construção de vetores para expressão de antígenos de Eimeria era necessário
inicialmente amplificar e clonar a seqüência codificadora destes. Optamos pela escolha de
apenas um antígeno, que deveria já estar bem caracterizado quanto à imunogenicidade, isto
nos pouparia tempo e futuros problemas experimentais. Foram desenhados primers,
baseados no trabalho de Witcombe (2004), para amplificar a seqüência codificadora da
região C-terminal da proteína EmTFP250.
Após a extração do DNA genômico de oocistos de Eimeria máxima, este foi utilizado
como molde para a amplificação do antígeno selecionado com os primers desenhados. O
amplicon gerado, de tamanho aproximado de 660 pb, foi clonado em pCR2.1-TOPO®, que
foi então seqüenciado para confirmação do gene amplificado (figura 13).
37
30 –
40 –
50 –
kDa
2 3 4 5
1
30 –
40 –
50 –
kDa
2 3 4 5
1
Figura 12. Análise da expressão de GFP pelos diferentes sistemas de expressão
heteróloga.
Extratos de culturas de E. coli transformadas com os vetores pLBSGFPEm
R
(3),
pCYTGFPEm
R
(4) e pSECGFPEm
R
(5) foram submetidos à eletroforese em SDS-PAGE e
transferidos para membrana de nitrocelulose, por Western blotting, para avaliação da
expressão de GFP. O controle negativo (1) e positivo (2) da expressão de GFP
correspondem a extratos de E. coli não transformada e transformada com o vetor TOPO-
GFP, respectivamente. A membrana foi incubada com anticorpo monoclonal anti-GFP na
concentração de 1 g/ml. O anticorpo secundário anti-IgG de camundongo foi diluído na
proporção de 1:10.000. As setas indicam o reconhecimento de GFP pelo anticorpo, as
demais bandas são inespecíficas ou produtos de degradação de GFP.
38
650 -
500 -
850 -
pb
A.
B.
CTCGAGGAATTGCACCCCA TTCCAGCCCCCGGTAC GGAAACAGGCGAAGGAGAGGGAGAGACC
GAGACAGGCGAAGGCGAAACTGGTGAAGCAGGTGGCGAGGAAGGCGAGCAAACAGGAGAAGG
CGAAGTGCAGCCCCCAGAAGAAGAGCTTCCTGGGGAGAGTGTAACTGAGCCTGAGGAGAAGCC
TGAGGAGGAGCTACCTGAGGAGGAGGTTACTGAGCCTGAGGAGAAGCCTGAGGAGGGTGTGAC
TCAGCCTGAGGAGACACCTGAGCAGCCTGTTGAGGGTACCGAAGAAGAGGGCAAGCAGGAGTC
TGAGGCTGCCCCCGAAACTCCTGCCGTCCAGCCAAAACCAGAGGAGGGTCACGAACGCCCAGA
ACCCGAAGAGGAGGAGGAGAAGAAGGAAGAAGGCGGCGGCTTCCCAACAGCTGCAGTGGCAG
GAGGTGTTGGTGGTGTGTTGCTCATAGCTGCTGTAGGTGGTGGTGTTGCAGCCTTCACTAGCGG
CGGAGGTGGCGCTGGCGCACAGGAGGCAGAACAGGTCGAGTTCGAAGGAGAAGATACCGGAG
CAGCAACTGCCGAGACACCTGAAGCCGATACAGTTATCGACATCACAGACGAAGACGACTACTG
GGCCGACAGCGGCGACATTCG GAATTC
650 -
500 -
850 -
pb
650 -
500 -
850 -
pb
A.
B.
CTCGAGGAATTGCACCCCA TTCCAGCCCCCGGTAC GGAAACAGGCGAAGGAGAGGGAGAGACC
GAGACAGGCGAAGGCGAAACTGGTGAAGCAGGTGGCGAGGAAGGCGAGCAAACAGGAGAAGG
CGAAGTGCAGCCCCCAGAAGAAGAGCTTCCTGGGGAGAGTGTAACTGAGCCTGAGGAGAAGCC
TGAGGAGGAGCTACCTGAGGAGGAGGTTACTGAGCCTGAGGAGAAGCCTGAGGAGGGTGTGAC
TCAGCCTGAGGAGACACCTGAGCAGCCTGTTGAGGGTACCGAAGAAGAGGGCAAGCAGGAGTC
TGAGGCTGCCCCCGAAACTCCTGCCGTCCAGCCAAAACCAGAGGAGGGTCACGAACGCCCAGA
ACCCGAAGAGGAGGAGGAGAAGAAGGAAGAAGGCGGCGGCTTCCCAACAGCTGCAGTGGCAG
GAGGTGTTGGTGGTGTGTTGCTCATAGCTGCTGTAGGTGGTGGTGTTGCAGCCTTCACTAGCGG
CGGAGGTGGCGCTGGCGCACAGGAGGCAGAACAGGTCGAGTTCGAAGGAGAAGATACCGGAG
CAGCAACTGCCGAGACACCTGAAGCCGATACAGTTATCGACATCACAGACGAAGACGACTACTG
GGCCGACAGCGGCGACATTCG GAATTC
Figura 13. Fragmento de EmTFP250 selecionado para expressão.
(A) Amplificação da região C-terminal de EmTFP250. O fragmento de 666 pb codifica parte
da região hidrofílica, domínio transmembrana e cauda citoplasmática desta proteína. (B)
Seqüência nucleotídica do fragmento amplificado em A. A região de anelamento dos primers
esta mostrada em verde e as seqüências sublinhadas referem-se aos sítios para XhoI e
EcoRI.
39
4. Construção dos vetores pLBScTFPEm
R
, pSECcTFPEm
R
e pCYTcTFPEm
R
Dispondo do antígeno de Eimeria maxima clonado e dos vetores pLBSGFPEm
R
,
pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
, todas as ferramentas para a construção dos vetores
capazes de expressar tal proteína estavam prontas. Como o antígeno clonado em pCR2.1
TOPO fora amplificado utilizando primers que inseriam sítios para as enzimas XhoI e EcoRI
no amplicon, bastava digerir este vetor com tais enzimas para se obter um fragmento que
poderia ser clonado nos vetores em construção. Deste modo, os vetores pLBSGFPEm
R
,
pSECGFPEm
R
e pCYTGFPEm
R
foram digeridos com XhoI e EcoRI, purificados e ligados
com o fragmento correspondente a cTFP. Assim, numa única etapa de clonagem foi
possível substituir o gene repórter gfp pela seqüência codificadora do antígeno de Eimeria
escolhido, gerando os vetores pLBScTFPEm
R
(figura 14), pSECcTFPEm
R
e pCYTcTFPEm
R
(figuras 15 e 16). O primeiro vetor permite o ancoragem da proteína cTFP à superfície da
parede celular de bactérias Gram-positivas, já os dois últimos destinam-se a expressão de
cTFP intracelularmente e para exportação, respectivamente.
5. Construção dos vetores de expressão pGEXcTFP e pTrcHiscTFP
Uma vez construídos os vetores que permitem a expressão do antígeno de eimeria nas
três diferentes formas de endereçamento celular, era necessário agora, verificar o
funcionamento dos mesmos. Para isso era preciso mostrar que o antígeno estava sendo
expresso por bactérias transformadas com tais vetores. Foi decidido que seria necessário
obter anticorpos contra cTFP para a realização de ensaios de Western blotting. Porém era
preciso produzir cTFP recombinante em quantidades suficientes para os experimentos de
imunização de camundongos.
Duas estratégias diferentes de expressão foram testadas, a primeira produziria o
antígeno recombinante em fusão com GST e a segunda em fusão com HIS. A seqüência
codificadora de cTFP, clonada em pCR2.1-TOPO, foi inserida nos vetores pGEX-4T-3 e
pTrcHis-TOPO (figura 8), gerando pGEX-cTFP e pTrcHis-cTFP.
40
A.
B.
500 –
pb
1000 –
5000 –
2
3
41
A.
B.
500 –
pb
1000 –
5000 –
2
3
41
500 –
pb
1000 –
5000 –
2
3
41
Figura 14. Construção de pLBScTFPEm
R
.
O vetor pLBScTFPEm
R
(A) foi construído a partir da substituição do gene repórter gfp, do
vetor pLBScTFPEm
R
, pela seqüência codificadora da região C-terminal do antígeno
EmTFP250. (B) Verificação da construção de pLBScTFPEm
R
através de digestões. 1 –
Digestão com EcoRI/HindIII, liberando um fragmento de 690 pb correspondente a região de
ancoragem e terminadora. 2 – Digestão com XhoI/EcoRI, liberando um fragmento de 660 pb
correspondente ao antígeno. 3 – Digestão com BamHI/EcoRV, liberando um fragmento de
340 pb correspondente ao promotor e peptídeo sinal. 4 – Digestão com ApaI/BamHI,
liberado um fragmento de 1200 pb correspondente ao gene de resistência à eritromicina.
41
A.
B.
A.
B.
A.
B.
Figura 15. Representação esquemática dos vetores pSECcTFPEm
R
e pCYTcTFPEm
R
.
Os vetores pSECcTFPEm
R
(A) e pCYTcTFPEm
R
(B), foram construídos a partir da
substituição do gene repórter gfp, dos vetores pSECcTFPEm
R
e pCYTcTFPEm
R
,
respectivamente, pela seqüência codificadora da região C-terminal do antígeno EmTFP250,
de Eimeria maxima.
42
pCYT
EcoRI / XhoI
41 32 41 32
pSEC
A
KpnI
1000 –
650 –
400 –
300 –
pb
B C D
5000 –
pCYT
EcoRI / XhoI
41 32 41 32
pSEC
A
KpnI
1000 –
650 –
400 –
300 –
pb
B C D
5000 –
Figura 16. Verificação da construção de pSECcTFPEm
R
e pCYTcTFPEm
R
.
Eletroforese em gel de agarose 1,4% corado com brometo de etídio. As digestões simples,
com a enzima kpnI, funcionam como controle positivo para a presença da seqüência
codificadora de cTFP, uma vez que o gene gfp não possui sítio para tal enzima. As
digestões duplas, com as enzimas EcoRI e XhoI, liberam fragmentos de 720 pb (gfp) ou 666
pb (cTFP), permitindo assim a confirmação das construções. (A) – pLBSGFPEm
R
. (B) –
produto de PCR de cTFP purificado. (C) – pSECcTFPEm
R
clone 1. (D) – pLBSGFPEm
R
. Os
números 1, 2, 3 e 4 correspondem aos diferentes clones obtidos.
43
6. Expressão e purificação da proteína cTFP recombinante
Para a purificação de cTFP em fusão com GST, células de E. coli transformadas com o
plasmídio pGEXcTFP foram plaqueadas em LB-ágar e uma colônia isolada foi escolhida para
indução da expressão da proteína GST::cTFP. A fração solúvel dos extratos de bactéria foi
coletada e as proteínas recombinantes purificadas por cromatografia de afinidade em resina
de Glutationa Sepharose
®
(figura 17-A).
Já para a purificação de cTFP em fusão com cauda de 6xHis, células de E. coli
transformadas com o plasmídio pTrcHiscTFP foram plaqueadas em LB-ágar e uma colônia
isolada foi escolhida para indução da expressão da proteína His::cTFP. A fração solúvel dos
extratos de bactéria foi coletada e as proteínas recombinantes purificadas por cromatografia
de afinidade em FPLC (figuras 18, 19- A e 19-B).
7. Imunização de camundongos com cTFP recombinante
Baseados em resultados anteriormente obtidos (não mostrados) foi possível constatar que
soros de animais imunizados com cTFP em fusão com GST somente apresentavam
reatividade significativa contra a proteína GST. Para que os anticorpos fossem específicos
contra cTFP decidimos que seria necessário clivar com trombina a GST da proteína de fusão
purificada, uma vez que o vetor pGEX (figura 16-A) nos permite tal opção e a proteína cTFP
não possui sitio para clivagem por essa enzima. As frações de GST::cTFP purificadas foram
concentradas e incubadas com trombina, na concentração indicada pelo fabricante. Como
precisávamos da proteína purificada para imunização de animais, decidimos submeter o
produto de digestão com trombina à eletroforese em SDS-PAGE (figura 17-B). O gel era
corado com Azul de Coomassie e em seguida a banda relativa à cTFP digerida era cortada
com bisturi e preparada para a imunização dos animais.
Como as frações obtidas da purificação de His::cTFP apresentavam contaminantes,
optou-se por concentrá-las e submetê-las a eletroforese em SDS-PAGE (figura 19-C). Após
coloração com Azul de Coomassie a banda correspondente à His::cTFP era cortada e
preparada para a imunização dos animais.
Camundongos BALB/c foram imunizados com 3 doses de aproximadamente 10 g de
proteína com 14 dias de intervalo entre cada dose. Associado aos antígenos foi administrado
30 g de Alúmem como adjuvante.
Para avaliar a resposta humoral dos camundongos, foram realizados ensaios de Western
blotting, como pode ser observado na figura 20. Nota-se que tanto os animais imunizados com
a proteína em fusão com GST, quanto em fusão com His desenvolveram anticorpos contra
cTFP.
44
2 3 4 5
6 7
8
kDa
9 10
50 –
20 –
80 –
1
30 –
A.
B.
kDa
37 –
46 –
26 –
2 3 4 5
6 7
8
kDa
9 10
50 –
20 –
80 –
1
30 –
2 3 4 5
6 7
8
kDa
9 10
50 –
20 –
80 –
1
30 –
A.
B.
kDa
37 –
46 –
26 –
Figura 17. Expressão e purificação de EmtFP250 recombinante em fusão com GST.
(A) A partir de culturas transformadas com o plasmídio pGEX-cTFP foram preparados
extratos totais, antes (2) e após a indução da expressão da proteína recombinante (3). Em
seguida as células foram lisadas e centrifugadas. Em (4) vê-se a fração de proteínas
insolúveis e em (5) a fração solúvel, do sobrenadante. Esta última fração foi incubada com a
resina de Glutationa-Sepharose
®
. Em (6) vê-se as proteínas que não interagem com a
resina. Após a lavagem da resina as proteínas de fusão com GST (GST::cTFP) foram
eluídas com glutationa (canaletas 7, 8 e 9), contudo parte ainda permaneceu ligada à resina
(10). (B) Os eluatos foram concentrados, dialisados, digeridos com trombina e então
submetidos à eletroforese. A banda de aproximadamente 46 kDa, correspondente à proteína
EmTFP250, foi recortada do gel para imunização dos camundongos. No gel pode-se ver as
bandas correspondentes à trombina (37 kDa) e ao GST (26 kDa). Os extratos e produtos de
purificação foram submetidos à eletroforese em SDS-PAGE e posteriormente corados com
Azul de Coomassie. (1) Marcador de peso molecular. A seta indica a expressão de
GST::cTFP.
45
AT2007Aug21no002:10_UV AT2007Aug21no002:10_Conc AT2007Aug21no002:10_Fractions
0
500
1000
1500
mAu
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 37 Waste
A.
B.
2 3 4 5
kDa
50 –
20 –
1
30 –
AT2007Aug21no002:10_UV AT2007Aug21no002:10_Conc AT2007Aug21no002:10_Fractions
0
500
1000
1500
mAu
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 37 Waste
A.
B.
2 3 4 5
kDa
50 –
20 –
1
30 –
2 3 4 5
kDa
50 –
20 –
1
30 –
Figura 18. Expressão e purificação de EmTFP250 recombinante em fusão com His.
(A) A partir de culturas transformadas com o plasmídio pTrcHis-cTFP foram preparados
extratos totais, antes (2) e após a indução da expressão da proteína recombinante (3). Em
seguida as células foram lisadas e então centrifugadas. Em (4) vê-se a fração de proteínas
solúveis, do sobrenadante e em (5) a fração insolúvel. (B) Esta última fração foi submetida à
cromatografia de afinidade. As proteínas de fusão com His (His::cTFP) foram eluídas com
Imidazol. Os extratos (A) foram submetidos à eletroforese em SDS-PAGE e posteriormente
corados com Azul de Coomassie. (1) Marcador de peso molecular. A seta indica a
expressão de His::cTFP.
46
AT2007Aug21no002:10_UV AT2007Aug21no002:10_Fractions
-50
0
50
100
150
200
mAu
35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Waste
A.
B.
C.
kDa
50 –
20 –
70 –
30 –
kDa
30 –
50 –
20 –
3 6
8
10 2513
14
16
18
20
22
11 12
AT2007Aug21no002:10_UV AT2007Aug21no002:10_Fractions
-50
0
50
100
150
200
mAu
35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Waste
A.
B.
C.
kDa
50 –
20 –
70 –
30 –
kDa
30 –
50 –
20 –
3 6
8
10 2513
14
16
18
20
22
11 12
kDa
30 –
50 –
20 –
3 6
8
10 2513
14
16
18
20
22
11 12
Figura 19. Purificação de EmTFP250 recombinante em fusão com His.
(A) Ampliação do cromatograma da figura 18 mostrando a região de eluição de His::cTFP.
As barras vermelhas na parte inferior da figura delimitam as frações coletadas. (B)
Visualização, em SDS-PAGE, das frações eluídas (acima enumeradas). (C) As frações 6 a
16 foram concentradas, dialisadas, submetidas à eletroforese e coradas com Azul de
Coomassie. A banda de aproximadamente 50 kDa, correspondente à proteína EmTFP250
recombinante, foi recortada do gel para imunização de camundongos.
47
2
kDa
50 –
20 –
1
3
A B A B A B
2
kDa
50 –
20 –
1
3
A B A B A B
Figura 20. Reatividade de His::cTFP com soros de camundongos imunizados com
EmTFP250 recombinante.
Extratos de culturas de E. coli não transformadas (A) e His::cTFP purificada (B) foram
submetidos à eletroforese em SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose,
por Western blotting. As membranas (1) e (2) foram incubadas com soro de camundongos
imunizados com His::cTFP e GST::cTFP, respectivamente, na diluição de 1:100. O soro pré-
imune está representado pela membrana (3). O anticorpo secundário anti-IgG de
camundongo foi diluído na proporção 1:6.000 e as membranas foram reveladas por
quimiluminescência. As setas indicam o reconhecimento da proteína recombinante pelos
anticorpos.
48
DISCUSSÃO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado
um desafio para os profissionais inseridos em toda essa cadeia a produtiva. Estimativas
indicam que o suprimento de alimentos necessários para atender aos requerimentos
nutricionais da população humana durante os próximos quarenta anos equivale à
quantidade previamente produzida ao longo de toda a história, suplantando deste modo à
produção atual. Com isto, é esperado que a demanda global de carne eleve-se mais de 60%
em relação ao consumo atual, por volta do ano 2020 (Aho, 2005; Simons, 2005).
A avicultura é um dos setores agropecuários que mais tem crescido nas últimas
décadas. Segundo dados do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA,
2005), a produção mundial de frangos cresceu sistematicamente nos últimos 30 anos,
passando de 7,47 milhões de toneladas em 1970, para 40 milhões de toneladas no final do
século XX. A produção de aves está rapidamente se expandindo em muitos países em
desenvolvimento, como o Brasil, que no início do século XXI tornou-se o maior produtor
mundial (Almeida, 2000). Porém, como a competição pelo mercado internacional é muito
representativa, padrões de qualidade são fundamentais para garantir bons preços e
mercados importadores.
A produção de carne de frango no Brasil, para atendimento do mercado externo, baseia-
se nas criações comerciais ou industriais, onde são aplicados modelos de manejo
consagrados, a fim de obter altos índices de produção. As aves são criadas de maneira
intensiva, em granjas, onde são submetidas a diversas fontes de estresse. Para que este
estresse não torne a produção economicamente inviável, diversos aditivos alimentares,
como drogas antimicrobianas (usadas como promotores de crescimento) e hormônios, são
utilizados com o objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico das
aves, resultando em maior ganho de peso e redução do impacto das doenças (Ferreira e
Kussakawa, 1999).
Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo
destes produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes
animais e do homem, como conseqüências desta suplementação. Nos Estados Unidos, em
1995, aproximadamente 94, 98 e 75% das dietas inicial, de crescimento e de terminação,
respectivamente, de frangos de corte eram suplementadas com drogas antimicrobianas. Em
2002, estes valores foram reduzidos para 64, 66 e 48 % (Chapman & Johnson, 2002). No
Brasil, os promotores de crescimento estão sendo utilizados de forma contínua em
aproximadamente 95% das granjas avícolas comerciais de frangos de corte (Simons, 2005).
Os antimicrobianos podem alterar a microbiota do trato digestivo e deprimir os
mecanismos de defesa dos animais, além de deixar resíduos indesejáveis à saúde do
49
homem na carne (Rana et al., 1993; Jin et al., 1997). Além disso, a presença de
concentrações baixas de antimicrobianos pode ser responsável pelo aumento dos
fenômenos de resistência bacteriana aos mesmos. Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial. Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio-ambiente e estarem presentes na carne e nos ovos dos animais (Joint
WHO/FAO/OIE, 2003).
Por causa destas evidências, a ausência de microrganismos potencialmente patogênicos
e a ausência de resíduos de produtos químicos têm se tornado os principais indicadores de
qualidade da carne de frango. Assim, a avicultura brasileira precisará se adaptar às futuras
normas de comércio internacional, pois alguns países importadores (principalmente os
europeus) não mais aceitarão carne de frango oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de produtividade de seus plantéis.
Isto tem gerado a necessidade de se buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade relacionados ao uso dos aditivos alimentares. Além disto,
ainda existem prejuízos relacionados ao impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de frangos de corte. Hoje, obtém-se um frango pesando 2,3
kg com 45 dias de idade. Sem tais aditivos, o tempo de abate de ser elevado em até sete
dias, o que representa aumento nos custos de produção (Bedford, 2000).
A alternativa mais promissora baseia-se no uso dos probióticos como aditivos
alimentares. Isto é interessante pois as próprias bactérias benéficas da microbiota intestinal
das aves poderiam ser empregadas em substituição aos antimicrobianos. Estas bactérias
poderiam favorecer o equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o que seria refletido em
melhoria da saúde e boa produtividade. Contudo estes microrganismos devem possuir
algumas propriedades, como: estarem viáveis no alimento; não serem patogênicos;
resistirem às condições adversas no TGI; estimularem as defesas locais; não possuírem
genes de resistência a antimicrobianos e, se possível, colonizarem a mucosa gastrintestinal.
Os probióticos podem suprimir a presença de microrganismos indesejáveis no TGI de
aves atuando pela exclusão competitiva (Nurmi e Rantala, 1973; Reid et al., 2002; Nicoli et
al. 2003), por modularem a atividade imunológica (Hoyos, 1997; Nicoli et al. 2003; Brisbin et
al., 2008), por inibirem a ação de toxinas (Fuller, 1975) e pela produção de metabólitos
bactericidas, como ácido lático (Bonilla, 1992). Neste sentido, trabalhos científicos
(Nashashon et al., 1996; Cerqueira, 2000; Mountzouris et al., 2007) têm sido conduzidos
tentando avaliar a eficiência da utilização dos probióticos, em substituição aos produtos
químicos, para modular a saúde de aves comerciais e proporcionar um ganho de peso
adequado.
50
A possibilidade de unir uma alternativa aos promotores de crescimento e às vacinas
contra a coccidiose atualmente disponíveis, tem nos incentivado a desenvolver uma nova
vacina oral cuja veiculação seria realizada por lactobacilos com características probióticas.
O presente trabalho deteve-se, portanto, em criar novas ferramentas para a concretização
desta idéia.
Como já relatado por alguns autores, a forma de endereçamento de um antígeno pode
influenciar a modulação imunológica induzida por este. Por isso a construção de novos
vetores, que permitissem o endereçamento do antígeno expresso para o meio intracelular e
extracelular foram objetos primários deste estudo. Como já havíamos relatado que o gene
repórter gfp, do vetor pLBSGFPEm
R
, era expresso nas bactérias utilizadas durante as
etapas de clonagem realizadas, decidimos então manter este gene nos novos vetores
construídos. Dessa maneira poderíamos acompanhar facilmente o sucesso de cada etapa
das novas construções. Através da análise por western blotting foi possível verificar que a
proteína GFP expressa por culturas de E. coli transformadas com o vetor pLBSGFPEm
R
realmente apresentava um maior peso molecular se comparado à GFP expressa por
culturas de E. coli transformadas com os novos vetores. Isso é um forte indício de que a
região de ancoragem à superfície celular de lactobacilos, está sendo expressa em fusão
com o gene repórter de gfp. Também foi possível constatar que a GFP expressa por culturas
de E. coli transformadas com os novos vetores apresentava pesos moleculares muito
semelhantes, algo já esperado. Contudo, alguns experimentos, utilizando lactobacilos, ainda
devem ser conduzidos para eliminar quaisquer dúvidas acerca do correto endereçamento
dos três sistemas disponíveis.
De posse dos sistemas de expressão recém desenvolvidos, a etapa seguinte era a
substituição do gene repórter pelo antígeno de Eimeria desejado. Como o presente trabalho
atem-se em criar um protótipo vacinal era preciso que o antígeno de trabalho apresentasse
imunogenicidade comprovada e que obviamente não fosse muito grande, evitando assim,
novos problemas metodológicos. Por tais características a proteína EmTFP250, descrita em
2003 por Witcombe e colaboradores e expressa sob forma recombinante em 2004, foi
escolhida. Esta proteína apresentava ainda a vantagem de induzir um fenômeno conhecido
como imunidade maternal.
A partir da seqüência de EmTFP250 depositada no GenBank foram desenhados primers
para a amplificação da região codificadora da porção C-terminal desta proteína. O fragmento
gerado foi então utilizado para substituir o gene repórter gfp dos vetores previamente
construídos. Contudo, não havíamos como mostrar que o antígeno estava sendo expresso
pelas células bacterianas. Os níveis de expressão, caso estivesse sendo expressa, eram
suficientemente baixos, para que pudéssemos visualizar diferenças em extratos protéicos
submetidos à SDS-PAGE (dados não mostrados). Assim, a forma encontrada para resolver
51
a questão foi produzir anticorpos contra tal proteína para a futuras analises de expressão
por western blotting.
Para a produção de anticorpos, foi necessário produzir o antígeno recombinante em
grandes quantidades. Como visto dois diferentes sistemas de expressão foram utilizados.
Inicialmente foi usado o sistema de expressão em fusão com GST. As bactérias
expressaram a proteína recombinante em grandes quantidades e de forma solúvel,
facilitando assim a purificação da mesma. Contudo nos experimentos de imunização ficou
evidente que a proteína de fusão, no caso GST, interferiu acentuadamente na especificidade
dos anticorpos gerados (dados não mostrados). Por isso, optamos por tentar clivar o GST
das proteínas recombinantes purificadas. Como não poderíamos prever a eficiência de
digestão enzimática para a nossa proteína optamos por seguir, paralelamente, com uma
segunda estratégia de expressão desta proteína. Escolhemos então um sistema de
expressão em fusão com a cauda poli-His, pela facilidade da purificação da proteína de
interesse por cromatografia de afinidade em colunas carregadas com níquel.
As duas estratégias foram desenvolvidas simultaneamente com fins comparativos. As
proteínas em fusão com GST foram satisfatoriamente clivadas com trombina e submetidas à
eletroforese em SDS-PAGE para separação do produto de digestão. De modo semelhante,
as proteínas com cauda de His foram submetidas à eletroforese, pois o processo de
cromatografia muitas vezes deixava contaminantes na amostra de interesse. A possibilidade
de imunização dos camundongos com bandas cortadas do gel de poliacrilamida tornou
nossa escolha bastante pertinente.
Deste modo pudemos produzir os anticorpos contra EmTFP250 recombinante através
das duas metodologias de purificação e com títulos aparentemente iguais. Vimos que a
clivagem com trombina foi essencial para a produção de anticorpos específicos contra
EmTFP250 e que esta estratégia apresenta-se até mais viável do que o sistema de fusão
com poli-His, devido aos melhores resultados de purificação obtidos.
Apesar de mostrarmos apenas o resultado de western blotting em que os anticorpos
contra EmTFP250 testados reconhecem a proteína com cauda de histidina, vimos também
que tais anticorpos também reconhecem a proteína em fusão com GST. Contudo, ainda é
necessário verificarmos se estes anticorpos são capazes de reconhecer a proteína nativa,
em extratos protéicos de oocistos de Eimeria maxima.
52
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Em resumo, os novos cassetes de expressão, contendo o gene repórter gfp, parecem
em ordem e funcionando corretamente, pelo menos em células de E. coli. Além disso os
anticorpos gerados contra EmTFP250 recombinante aparentemente apresentam-se
específicos e com títulos suficientemente altos para a realização de futuros ensaios de
western blotting, com extratos de culturas de E. coli transformadas com os plasmídeos
contendo os cassetes vacinais.
Contudo, há ainda muito que se fazer. A começar pelos ensaios de expressão de
EmTFP250, tanto por E. coli quanto por lactobacilos. Algumas linhagens de lactobacilos,
descritas por Mota e colaboradores (2006), já foram transformadas com os vetores
pLBSGFPEm
R
e pLBScTFPEm
R
. Embora a expressão de GFP por tais lactobacilos já tenha
sido vista ainda é necessário verificar sua localização celular, assim como transformar essas
linhagens com os demais vetores.
De posse dos novos anticorpos será possível verificar se os lactobacilos irão expressar o
antígeno assim como fizeram com GFP. Só então estaríamos seguros para dar continuidade
à pesquisa, iniciando os experimentos de imunização das aves com tais bactérias
modificadas.
Os lactobacilos selecionados como veículos da vacina almejada deverão ainda ser
caracterizados quanto à modulação imunológica por eles induzida em aves comerciais.
53
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ANEXOS
Seguem anexos os trabalhos derivados da presente dissertação.
1. Genetic transformation of novel isolates of chicken Lactobacillus bearing probiotic
features for expression of heterologous proteins: a tool to develop live oral vaccines.
Mota, R. M., Moreira, J. L. S., Souza, R. M., Horta, M. F., Teixeira, S. M. R., Neumann, E.,
Nicoli, J. R., Nunes, A. C.
BMC Biotechnology, 2006; 6: 2.
2. Processo de construção de um cassete de expressão genética para a
transformação de bactérias para uso vacinal e seus produtos.
Nunes, A. C., Moreira, J. L. S., Mota, R. M., Souza, M. R., Horta, M, F., Teixeira, S. M. R.,
Nicoli, J. R.
Patente: Privilégio de Inovação n. PI0107040-0 - 04/2007.
BioMed Central
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BMC Biotechnology
Open Access
Research article
Genetic transformation of novel isolates of chicken Lactobacillus
bearing probiotic features for expression of heterologous proteins:
a tool to develop live oral vaccines
Rodrigo M Mota
†1
, João Luiz S Moreira
†1,2
, Marcelo R Souza
2
, M Fátima
Horta
3
, Santuza MR Teixeira
3
, Elisabeth Neumann
4
, Jacques R Nicoli
2
and
Álvaro C Nunes*
1
Address:
1
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627,
31.270-901, Belo Horizonte, MG, Brazil,
2
Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,
Av. Antônio Carlos 6627, 31.270-901, Belo Horizonte, MG, Brazil,
3
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627, 31.270-901, Belo Horizonte, MG, Brazil and
4
Centro Universitário Newton Paiva,
Rua Goitacases 1762, 30.190-052, Belo Horizonte, MG, Brazil
Email: Rodrigo M Mota - rodrigo_m_mota@yahoo.com.br; João Luiz S Moreira - moreira@icb.ufmg.br; Marcelo R Souza - mrgalo@ufmg.br;
M Fátima Horta - [email protected]; Santuza MR Teixeira - [email protected]r; Elisabeth Neumann - [email protected];
Jacques R Nicoli - jnicoli@icb.ufmg.br; Álvaro C Nunes* - can[email protected]
* Corresponding author †Equal contributors
Abstract
Background: The use of lactic acid bacteria as vehicles to delivery antigens to immunize animals is a
promising issue. When genetically modified, these bacteria can induce a specific local and systemic immune
response against selected pathogens. Gastric acid and bile salts tolerance, production of antagonistic
substances against pathogenic microorganisms, and adhesive ability to gut epithelium are other important
characteristics that make these bacteria useful for oral immunization.
Results: Bacteria isolated on de Man, Rogosa and Sharpe medium (MRS) from different gastrointestinal
portions of broiler chicks were evaluated for their resistance to artificial gastric acid and bile salts,
production of hydrogen peroxide, and cell surface hydrophobicity. Thirty-eight isolates were first typed at
species level by PCR amplification of 16S-23S rRNA intergenic spacers using universal primers that anneal
within 16S and 23S genes, followed by restriction digestion analyses of PCR amplicons (PCR-ARDRA). An
expression cassette was assembled onto the pCR2.1-Topo vector by cloning the promoter, leader
peptide, cell wall anchor and terminator sequences derived from the laminin binding S-layer protein gene
of L. crispatus strain F5.7 (lbs gene). A sequence encoding the green fluorescent protein (GFP) was inserted
as reporter gene, and an erythromycin resistance gene was added as selective marker. All constructs were
able to express GFP in the cloning host E. coli XL1-Blue and different Lactobacillus strains as verified by
FACS and laser scanning confocal microscopy.
Conclusion: Lactobacillus isolated from gastrointestinal tract of broiler chickens and selected for probiotic
characteristics can be genetically modified by introducing an expression cassette into the lbs locus. The
transformed bacteria expressed on its cell wall surface different fluorescent proteins used as reporters of
promoter function. It is possible then that similar bacterial model expressing pathogen antigens can be
used as live oral vaccines to immunize broilers against infectious diseases.
Published: 05 January 2006
BMC Biotechnology 2006, 6:2 doi:10.1186/1472-6750-6-2
Received: 02 September 2005
Accepted: 05 January 2006
This article is available from: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/6/2
© 2006 Mota et al; licensee BioMed Central Ltd.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0
),
which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
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Background
Probiotics are food or preparations containing live micro-
organisms, traditionally regarded as safe for human and
animal use. When ingested in sufficient numbers, probi-
otics are believed to play an important role in the control
of host intestinal microbiota and modulation of host
immune responses [7]. Both local and systemic immune
responses can be modulated by probiotics, with produc-
tion of a set of cytokines such as IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-
12, and nitric oxide (NO) [8,26]. The increasing regula-
tions and bans on the use of anticoccidial drugs in com-
mercial poultry production, urges the need for novel
approaches and alternative strategies to control avian
eimeriosis. Probiotics are an alternative to antimicrobial
drugs commonly employed as growth-promoter to broil-
ers, avoiding drug residues to accumulate in animal car-
Table 1: Lactobacillus strains isolated from different portions of chicks gastrointestinal tract, species identification by PCR-ARDRA and
some probiotic features
Isolate Species identification
a
Bile salt inhibition (%)
b
Hydrophobicity (%)
c
H
2
O
2
production
d
Gizzard
1M14C L. reuteri 14 89 nd
e
1M14E L. johnsonii 59 35 +
2M14C L. reuteri 21 58 ++
2M14L L. acidophilus 58 52 +
2M14E L. acidophilus 92 88 +
3M14C L. reuteri 25 42 +
3M14L L. johnsonii 24 61 +
4M14C L. reuteri 19 64 +
4M14L L. reuteri 54 36 +
4M14E L. acidophilus 96 5 -
5M14C L. reuteri 18 78 +
5M14E L. vaginalis 100 75 ++
Small intestine
1D14C L. salivarius 13 60 +++
2D14C L. vaginalis 71 67 ++
2D14E L. acidophilus 46 76 -
3D14C L. reuteri 13 83 ++
3D14L L. crispatus 36 88 ++
4D14C L. reuteri 13 88 +
4D14L L. reuteri 20 57 +
5D14E L. acidophilus 083-
Large intestine
1G14E Lactobacillus 27 78 -
2G14E L. acidophilus 37 55 -
3G14C L. reuteri 14 67 ++
3G14L L. johnsonii 22 45 -
4G14C L. vaginalis 37 25 ++
4G14L L. reuteri 40 35 ++
4G14E L. vaginalis 100 72 -
5G14C L. salivarius 43 66 +++
5G14L L. crispatus 41 35 +
Ceca
2C14E L. acidophilus 72 55 -
2C14L L. acidophilus 10 78 -
3C14C L. reuteri 084++
3C14L L. johnsonii 24 83 +
3C14E L. acidophilus 80 64 +
4C14C L. salivarius 43 92 +++
4C14L L. acidophilus 73 79 nd
5C14C L. salivarius 41 83 +++
5C14E L. acidophilus 064+
a
Isolates typed by 16S-23S rRNA PCR-ARDRA according to Moreira et al. (2005)
b
Percentage of optical density reduction after 6 h growing in MRS containing 0.3% bile salts
c
Percentage of microbial adhesion to xylene
d
H
2
O
2
production in TMB-Plus (+++, dark blue; ++, blue; +, light blue/blue border; -, none)
e
Not determined
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casses and in the meat [11]. In ourdays, most of the
probiotic preparations studied or commercialised con-
tains lactic acid bacteria (LAB).
Criteria for screening of Lactobacillus strains for use as pro-
biotics includes functional characteristics such as the abil-
ity to resist environmental conditions found in the
digestive tract (low gastric pH and bile salts), to antago-
nize or competitively exclude pathogens by secretion of
antimicrobial substances or to compete for nutrients and
adhesion sites. LAB can produce different antimicrobial
components such as organic acids, hydrogen peroxide,
carbon peroxide, diacetyl, low molecular weight antimi-
crobial substances, bacteriocins, and adhesion inhibitor
[24]. Production of hydrogen peroxide by Lactobacillus has
been considered an important ecological factor that
allows them to dominate some ecosystems like human
vagina [20]. The adhesiveness of LAB may involve passive
forces, electrostatic interactions, hydrophobic steric
forces, lipoteicoic acids and lectins [24]. The hydrophobic
nature of the outermost surface of microorganisms facili-
tates the adhesion of bacteria to host epithelium, confer-
ring an advantage for competition and colonization in the
gastrointestinal tract [28].
Besides their well known nutritional benefits and almost
null pathogenicity, showed as millenary food supple-
ments, the use of LAB as bacterial systems to express het-
erologous proteins or as vehicles to carry immunizing
antigens after genetic modification is becoming a promis-
ing issue [18,22]. However, the successful expression of
heterologous proteins in LAB depends on the promoter
compatibility between the species or strains used as vector
or hosts [13]. As pointed out by Pouwels et al. [18], the
control of transcription and translation may differ greatly
between two Lactobacillus species, implying that the
knowledge generated for one organism may not simply be
extrapolated to another. Genes that are efficiently
expressed in one Lactobacillus species are not necessarily
expressed in other species, or are expressed with different
efficiency and/or with a different regulatory mechanism.
Therefore, the correct typing of new isolates with probi-
otic properties is crucial for the development of a success-
ful oral vaccine.
L. crispatus strains possess different S-proteins capable to
bind proteins of intestinal extracellular matrix such as col-
lagens (CbsA protein) and laminin (LbsA protein). The S-
promoter responsible for the high level of transcription of
stable mRNAs coding the S-protein monomers, which are
capable to crystallizing into regular arrays and cover the
Lactobacillus cell wall [5], is a good candidate to direct
mRNA synthesis of chimerical genes for expression of het-
erologous proteins at the S-layer. The C-terminal one-
third region of these S-proteins is responsible for the
Growth inhibition by bile salts of three different strains of L acidophilusFigure 1
Growth inhibition by bile salts of three different
strains of L. acidophilus. L. acidophilus strains 5C14E (A),
2G14E (B) and 2M14E (C) were grown to an OD
600 nm
of 0.6
(logarithmic phase) and 1 % inoculated in MRS broth contain-
ing or not 0.3 % oxgall in a microtiter plate. Readings at
OD
600 nm
were taken at 15 min intervals during 12 h of incu-
bation at 37°C in a Microplate Spectrophotometer System
SpectraMax 340. Percentage of growth inhibition was calcu-
lated after 6 h as (1 – A
BS
/A
CT
) × 100.
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attachment to the peptidoglycan layer and incorporation
of that sequence to chimerical proteins halts them to bac-
terial surface [25].
The aim of this study was to develop a transforming vector
to express heterologous proteins using novel strains of
Lactobacillus isolated from different gastrointestinal
regions of broiler chickens and previously selected for
some probiotic properties.
Results
Thirty-eight isolates of bacteria were obtained from differ-
ent gastrointestinal portions of five broiler chickens and
selected as Gram-positive non-sporing, catalase negative,
and presenting rods with diverse sizes. Table 1 summa-
rizes the characteristics these isolates. Species identifica-
tion by 16S-23S rRNA ARDRA showed that 7 different
species were recovered in the following order: 12 L. reuteri
(31,6%), 11 L. acidophilus (29,0%), 4 L. johnsonii (10,5%),
4 L. salivarius (10,5%), 4 L. vaginalis (10,5%), 2 L. crispatus
(5,3%), and 1 Lactobacillus spp (2,6%). L. reuteri and L.
acidophilus were more frequently isolated from gizzard
and ceca, respectively. The highest biodiversity in term of
number of different Lactobacillus species was found in
intestines.
The strains were screened for the following probiotic cri-
teria: in vitro gastric juice and bile salts resistance, surface
hydrophobicity, and production of H
2
O
2
. All strains were
highly resistant to acidic pH, showing low (about 5%) or
no decrease of viable cell numbers 3 h after incubation at
pH 2.5 (data not shown). On the other hand, bile salts tol-
erance varied markedly between strains (Table 1), even for
same species (Fig. 1). Some isolates showed no or few
growth inhibition in MRS broth supplemented with 0.3%
oxgall, while others were moderately or highly susceptible
to bile salts. The MATS (Microbial Adhesion To Solvents)
method was used to evaluate the hydrophobic/
hydrophilic cell surface properties of Lactobacillus isolates
and to compare with those of other probiotic bacteria
[16]. The bacterial adhesion to xylene at a high ionic
strength of 0.1 M (pH 6.2) reflects cell surface hydropho-
bicity or hydrophilicity because electrostatic interactions
are absent. Our results indicated that most of Lactobacillus
isolates (79%) have hydrophobic surfaces (Table 1). Inter-
estingly, all Enterococcus strains co-isolated in this study
were highly hydrophilic (data not shown). The antagonis-
tic capacity was evaluated by the production of H
2
O
2
in
TMB-Plus agar medium under anaerobic condition fol-
lowed by air exposure. The results showed that most of
Lactobacillus strains (75%) produced H
2
O
2
(Table 1). The
four isolates typed as L. salivarius (1D14C, 5G14C, 4C14C
and 5C14C) produced more H
2
O
2
than other species
while seven L. acidophilus, one L. johnsonii (3G14L) and L.
vaginalis (4G14E) were unable to produce H
2
O
2
.
In order to develop an expression vector for genetic
manipulation of these new isolates of Lactobacillus, we
PCR amplified the nucleotide sequences of the promoter,
the leader peptide, the cell wall anchor and the terminator
of lbs gene using genomic DNA of L. crispatus strain F5.7
(primers depicted in Table 2). As shown in Figure 2, a 344
pb fragment encompasses the regions containing the pro-
moter, 5' untranslated portion and the leader peptide of
the lbs gene. Figure 2 upper panel shows the alignment of
this PCR product cloned into the pCR2.1-Topo and the
sequence of the lbsA gene of L. crispatus (accession number
AB110090). Figure 2 lower panel shows the alignment of
the 600 bp PCR product encoding part of the coding
region of lbsB gene that corresponds to the putative cell
wall anchor and the terminator (accession number
AB110091). These two fragments of the lbs gene were
assembled into an expression cassette to produce recom-
binant proteins in fusion with the C-terminus of Lbs pro-
tein, which should allow the heterologous protein to be
attached to the bacteria cell wall. The expression cassette
was constructed into pCR2.1-Topo backbone opposite to
the lac promoter (Fig. 3). This plasmid was chosen
because it harbours replication origin for E. coli (pUC ori-
gin), which is not functional in Gram-positive bacteria
such as Lactobacillus spp. Thus, we expected to integrate
the expression cassette into the chromosome by homolo-
gous recombination within the S-layer protein locus,
present in almost all species isolated from chicken [2]. The
plasmid integration has probably occurred since we have
not detected on gel electrophoresis of DNA extracted from
transformed, erythromycin resistant and GFP-positive
Lactobacillus, any DNA band that might correspond to
plasmid DNA (-data not shown).
The expression of gfp mut2 gene in E. coli XL1-Blue trans-
formed with the pLBS-GFP-EmR plasmid results in green
fluorescent bacteria, as measured by FACS at 488 nm exci-
tation wavelength (data not shown). The transformation
of chicken Lactobacillus isolates F5.7, 1M14C, 1M14E
and 3M14L, and the human strain of L. delbrueckii UFV
H2b20, with the plasmid pLBS-GFP-EmR was also suc-
cessful as evaluated by PCR amplification of the gfp gene
from the transformants (data not shown). However, the
analysis by FACS was unsuccessful due to a strong green
auto fluorescence displayed by all non-transformed con-
trol Lactobacillus when excited at 488 nm. To overcome
this problem, we performed confocal microscopy analyses
that could discriminate the fluorescence from the bacteria
expressing GFP and the auto fluorescence using different
excitation wavelengths. As shown in Figure 4, by exciting
at 458 nm we were able to detect the control bacteria as
non-fluorescent while the most of cells transformed with
the pLBS-GFP-EmR plasmid showed a strong green fluo-
rescence.
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Discussion
In order to exert health-promoting effects, probiotic bac-
teria need to resist and survive the inhospitable condi-
tions of chicken gastrointestinal tract. The fact that a high
percentage of Lactobacillus cells adhered to xylene, an apo-
lar solvent, demonstrated hydrophobic cell surface of
these strains. However, some Lactobacillus isolates and all
Enterococcus co-isolated strains showed more hydrophilic
cell surface properties. Many previous studies on the phys-
icochemistry of microbial cell surfaces have shown that
the presence of (glyco-) proteinaceous material on the cell
surface results in higher hydrophobicity, whereas
hydrophilic surfaces are generally associated with the
presence of polysaccharides [17]. The high hydrophobic-
ity of most strains isolated in this prospecting study could
facilitate bacteria-host cells interactions and improve anti-
gen delivering to the immune cells present in the gastroin-
testinal associated lymphoid tissue (GALT).
The viability of probiotics is not an essential requirement
for some antigen delivery since killed bacteria also stimu-
late the host immune system when ingested in sufficient
numbers [16]. However, various biotherapeutic mecha-
nisms are dependent on metabolic activity such as the
direct competition for nutrients or secretion of antimicro-
bial substances. For the efficiency of an oral vaccine, cell
viability is also probably fundamental. However, bacteria
entering the gastrointestinal tract must be able to resist to
certain local stresses such as the gastric pH and bile salts.
In this context, the stress resistance showed by the Lacto-
bacillus isolated in the present study would be important
for these bacteria to exert a probiotic or oral live vaccine
action. Since many pathogens, including Eimeria spp. spo-
rozoites [10], are very sensitive to H
2
O
2
, its production by
most of the Lactobacillus strains also could assure their suc-
cess in the gut ecosystem and improve the vaccination
process.
Non-pathogenic lactic acid bacteria (LAB) are attractive as
live carriers to deliver protective antigens to the mucosal
immune system. Lactococcus lactis is the LAB system for
antigen delivery better established and used actually. Sev-
eral molecular tools were constructed to allow antigen
expression in three cellular locations, intracellular,
secreted or anchored to the cell wall [3], combined to the
adjuvant expression of IL-12 [4]. Such studies with a novel
mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7
Antigen anchored to the cell surface and a secreted form
of IL-12 showed that this prophylactic immunization can
provide long-lasting immunity in mice against human
Papillomavirus type 16-induced tumors and, also the
therapeutic immunization with L. lactis recombinant
strains induced regression of palpable tumors in treated
mice a week after tumoral cells injection [4]. However,
Lactococcus lactis is not a probiotic bacterium, being una-
ble to adhere to the intestine cells and competitively
exclude pathogens. Both persisting (Lactobacillus
plantarum NCIMB8826/pMEC127) and non-persisting
(Lactococcus lactis MG1363/pMEC46) strains of lactic acid
bacteria have been evaluated by Grangette et al. [9] and
seem to elicit a very strong specific and protective humoral
response by the systemic and nasal routes of administra-
tion. The same authors have also shown that persistence
and viability of the strain impacts on its immunogenicity
and on the level of protection it may induce, indicating
that Lactobacillus is more efficient than Lactococcus as a vac-
cine delivery vehicle [9]. Recently, the development of an
efficacious vaccine against infection with Helicobacter felis,
delivered by recombinant Lactobacillus strains producing
H. pylori urease B (UreB) subunit, elicited UreB-specific
antibodies and results in a decreased H. felis load in the
stomachs of vaccinated mice. This was the first report of
successful induction of partial protection against a patho-
gen with a mucosal prime-boost regimen in which recom-
binant Lactobacillus strains were used as antigen-delivery
vehicles [6].
A new plasmid for genetic transformation of Lactobacillus
species allowing expression of heterologous proteins
attached to the cell wall components was successfully con-
structed into an E. coli plasmid vector backbone. This plas-
mid was able to transform E. coli XL1-Blue cloning host
from non-fluorescent to green fluorescent cells, which
could be measured by FACS analyses or easily visualized
Table 2: Primers used to amplify the portions of S-layer protein gene of Lactobacillus crispatus (lbs), the green fluorescent protein gene
(gfp mut2), and the erythromycin gene (ermAM) used as selective marker, respectively.
Primer sequence Amplicon Size (bp)
5'GGATCCCGGTCATTTTAACTTGCTA 3'
5'CTCGAGGATATCTGCAGCGTTAACAGAAACAGCTG 3' lbs promoter plus leader peptide 344
5'GAATTCATGCACAACGCATTCTTCTATG 3'
5'AAGCTTCAGAAGATCCTATTAGAACTGTATGTTTAG 3' lbs anchor plus terminator 600
5'CTCGAGGCTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT 3'
5'GAATTCTGCTTTGTATAGTTCATCCATGCCATG 3' gfp mut2 720
5'GGGCCCTCTAGCACAAAAAGAAAAACG 3'
5'GGATCCTCTAGAGTCTAGGGACCTCTTTAGC 3' erm AM 1200
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Alignments of Lactobacillus crispatus Lbs gene sequences and PCR amplified sequences of L. crispatus strain F5.7 used to assem-ble the expression cassette of plasmid pLBS-GFP-Em
R
Figure 2
Alignments of Lactobacillus crispatus Lbs gene sequences and PCR amplified sequences of L. crispatus strain
F5.7 used to assemble the expression cassette of plasmid pLBS-GFP-Em
R
. Upper panel shows the promoter plus
leader peptide sequences aligned to LbsA gene and lower panel shows the C-terminal anchor plus terminator sequences
aligned to LbsB gene.
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by standard fluorescence microscopy using fluorescein
isothiocyanate (FITC) filter settings. Transformation of
four different species of Lactobacillus, L. crispatus, L. johnso-
nii, L. reuteri and L. delbrueckii, from chicken or human
origin, was also successful despite an unexpected strong
green autofluorescence of non-transformed cells, reported
here for the first time. Although the autofluorescence of
native lactobacillus cells made FACS analyses or standard
fluorescence microscopy not applicable, it could be abol-
ished by exciting GFP at a wavelength lower than 488 nm
using a laser confocal microscopy set at 458 nm. This
could explain the constant use of the UV mutant of GFP
by others researchers instead gfp mut2 or mut3 genes [8].
Usually, intrinsic problems related to the genetic modifi-
cation could arise after the selection of novel isolates such
as the presence of restriction/modification enzymes
which could interfere with the establishment of new exog-
enous plasmids. Also, the presence of cryptic plasmids
may result in incompatibility with the exogenous vector,
as well as genetic exchange between plasmid from differ-
ent bacteria present in the gastrointestinal tract. Our strat-
egy to avoid these problems was to include in the
characterization of the probiotic potential of the novel
isolates, electrophoretic analyses for the presence of extra-
chromosomal DNA elements and to exclude those strains
bearing endogenous plasmids. The persistence of the
introduced plasmid was monitored through the detection
of the new genetic traits such as the antibiotic resistance
and gfp gene expression as well as by PCR analyses of the
GFP sequence. Also, GFP expression was detected after
growing for several generations in the absence of drug
selection.
Conclusion
Thirty-eight Lactobacillus strains were isolated from gas-
trointestinal tract of free-range chicks. Bacteria selected for
some probiotic features (gastric juice and bile salts toler-
ance, high surface hydrophobicity and production of
hydrogen peroxide) expressed the reporter protein GFP
after transformation using a plasmid vector carrying an
expression cassette assembled with lbs gene sequences.
These results are currently being applied in our laborato-
ries to develop an oral live vaccine to protect broiler chicks
against eimeriosis, a major poultry disease.
Methods
Chickens
Five 14-day-old broiler chickens were raised under natural
conditions and received commercial diet for pullets and
water ad libitum, without any kind of medication (no vac-
cination, antibiotics, hormones or coccidiostatics).
Bacteria isolation
Chickens were sacrificed by cervicaldislocation and giz-
zard, small intestine, large intestine, and ceca removed
aseptically. In a laminar flow hood, samples were placed
into sterile tubes containing 0.9% saline and homoge-
nized with a glass rod. Decimal dilutions in saline were
plated onto MRS agar and kept for 48 h at 37°C in anaer-
obiosis. Bacteria isolates, previously selected as described
above (partially identified as pertaining to Lactobacillus
genus), were cultured in de Man, Rogosa and Sharpe
broth (MRS, Difco, Detroit, MI, USA) after inoculation
with 1% of a fresh stationary culture and incubated in an
anaerobic chamber (Forma Scientific Co., OH, USA) con-
taining an atmosphere of 85% N
2
, 10% H
2
and 5% CO
2
).
L. crispatus strain F5.7 was gently provided by Prof. Eli-
nalva Maciel Paulo (Universidade Estadual de Feira de
Santana, BA, Brazil), and the human strain UFV H2b20 of
L. delbrueckii was gently provided by Dr. Célia Alencar de
Moraes, Universidade Federal de Viçosa, MG, Brazil).
Escherichia coli XL1-Blue was from Stratagene, CA, USA. E.
coli was grown aerobically in Luria-Bertani (LB) medium.
All the bacteria were stored at -80°C in respective broth
with 30% glycerol.
Plasmid pLBS-GFP-Em
R
constructed to transform chicken LactobacillusFigure 3
Plasmid pLBS-GFP-Em
R
constructed to transform
chicken Lactobacillus. The promoter, leader peptide, C-
terminal anchoring and terminator sequences of lbs gene of L.
crispatus strain F5.7 were PCR amplified, cloned and assem-
bled by overlapping restriction fragments onto pCR2.1-
TOPO vector. The genes ermAM and gfp mut2 were also
PCR amplified from other plasmids and used as selective
marker and reporter gene, respectively.
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Confocal scanning laser micrographs of GFP fluorescence of transformed Lactobacillus delbrueckiiFigure 4
Confocal scanning laser micrographs of GFP fluorescence of transformed Lactobacillus delbrueckii. (A – C)
Genetically transformed lactobacillus with plasmid pLBS-GFP-Em
R
, and (D – F) control cells. Bacteria were grown overnight,
washed, killed with sodium azide, and photographed under a laser scanning microscope (LSM) at scale of 54,8 × 54,8 µm. (C)
Represents merged images of (A,B), and (F) represents merged images of (D,E).
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DNA extraction
Chromosomal DNA was isolated from overnight cultures
of Lactobacillus sp in 10 ml MRS broth at 37°C. After wash-
ing the cells with 10 ml of deionised water, the pellet was
resuspended in 1 ml of 5 M LiCl and incubated during 1
h under constant shaking. Cells were washed once more
with 1 ml of deionised water and the pellet was suspended
in 1 ml of protoplasting buffer (25 mM sucrose, 50 mM
Tris HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 10 mg of lysozyme ml
-1
,
100 µg of RNaseA ml
-1
). After incubation during 1 h at
37°C and centrifugation at maximum speed in a micro-
centrifuge for 5 min, the pellet was resuspended in 500 µl
of protoplasting buffer without sucrose and lysozyme,
and 100 µl of 10% sodium dodecyl sulphate were added
to allow cells lysis. The mixture was extracted once with
phenol, with phenol-chloroform-isoamyl alcohol
(25:24:1) and with chloroform-isoamyl alcohol (24:1).
After isopropanol precipitation the DNA was dissolved in
100 µl of TE buffer.
PCR-ARDRA of 16S-23S rRNA intergenic spacers
Lactobacillus isolates were identified to species-level by
16S-23S rRNA PCR-ARDRA according to Moreira et al.
[14] using universal primers annealing into conserved
regions of 16S and 23S rRNA genes [27]. PCR amplicons
were digested by a set of 11 restriction enzymes and elec-
trophoresed in a 1.4% agarose gel and visualized by UV
transillumination after ethidium bromide staining. All
restriction enzymes were purchased from Promega Corpo-
ration (Madison, WI, USA).
Screening criteria for probiotic properties
Gastric juice tolerance: Lactobacillus stationary phase cul-
tures were diluted 10 fold in simulated gastric juice (NaCl
2 g l
-1
, pepsin 3.2 g l
-1
, pH adjusted to 2.5 with concen-
trated HCl) and incubated at 37°C for 3 h. Bacteria viabil-
ity was evaluated by plating 0.1 ml aliquots of serial
dilutions from control (cells in saline) and gastric juice
treated cells onto MRS agar. Colony forming units (cfu)
were enumerated after incubation at 37°C during 24 h
and the percentage of growth inhibition was calculated as
(1 – log cfu
AGJ
/log cfu
CT
) × 100 [15], where cfu
AGJ
and
cfu
CT
were the counts for simulated gastric juice and con-
trol, respectively.
Bile salts tolerance: Bile tolerance was evaluated according
to Walker and Gilliland [29] adapted to microtiter plates.
Briefly, Lactobacillus strains were fresh grown until an
OD
600 nm
of 0.6 and 1% inoculated in MRS broth contain-
ing or not 0.3 % oxgall (Oxoid Co.) in a microtiter plate.
Then, OD
600 nm
were determined at 15 min intervals dur-
ing 12 h of incubation at 37°C in a Microplate Spectro-
photometer System SpectraMax 340 (Molecular Devices,
CA, USA). The percentage of growth inhibition was calcu-
lated as (1 – A
BS
/A
CT
) × 100 for 6 h of incubation.
Surface hydrophobicity: Microbial adhesion to solvents
(MATS) was measured to evaluate the hydrophobicity of
bacterial cell surface [12,17]. Lactobacillus stationary phase
cultures were centrifuged, washed twice and adjusted to
an OD
600 nm
of 0.6 with 0.1 M KNO
3
, pH 6.2 (A
0
). A vol-
ume of 0.2 ml of xylene was added to 1.2 ml of cell sus-
pension and after a 10 min pre-incubation at room
temperature, the two-phase system was mixed on a vortex
for 2 min. The aqueous phase was removed after 30 min
and its OD
600 nm
was measured (A
1
). The percentage of
MATS was calculated as (1 – A
1
/A
0
) × 100. Percentage val-
ues smaller than 50% were considered as hydrophilic, and
values higher than 50% as hydrophobic.
Hydrogen peroxide formation: H
2
O
2
-producing strains
were identified by an agar medium assay optimised to
detect H
2
O
2
production according to Rabe & Hillier [19].
Briefly, 2 µl of Lactobacillus stationary phase cultures were
spotted onto the surface of TMB-Plus agar supplemented
with 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) and horserad-
ish peroxidase, and incubated at 37°C for 18 h in an
anaerobic chamber. Then, plates are exposed to air for 30
min, and a blue pigment appears if H
2
O
2
was produced.
The intensity of blue colour was assigned as +++ if was
dark blue (almost black), ++ if was blue, + if was bluish
generally with a blue border, and – if colour was absent.
Cloning of the PCR-amplified products
The typical reaction mixture contained 10 pmol of each
primer, 0.2 mM of each deoxyribonucleotide triphos-
phate, reaction buffer with 1.5 mM MgCl
2
, 5 U of Taq
DNA polymerase (Phoneutria Biotecnologia & Serviços,
Brazil), and 10 ng of template DNA. PCR products were
cleaned-up using the Concert™ Rapid PCR Purification
System and cloned in E. coli XL1-Blue into pCR2.1-TOPO
vector using the Invitrogen TOPO TA cloning kit (Invitro-
gen Life Technologies, Carlsbad, USA). PCR was per-
formed on cell lysates of ampicillin-resistant
transformants using M13 specific primers to confirm the
size of the inserts. Inserts were digested with restriction
enzymes, excised from the gel and purified with the Con-
cert™ Rapid Gel Extraction System according to the manu-
facturer's instructions (Invitrogen Co.).
Plasmid DNA preparation and transformation
Plasmid DNA from E. coli was isolated using the commer-
cial kit GFX™ Micro Plasmid Prep kit (Amersham Bio-
sciences, Piscataway, NJ, USA) by alkaline lysis method. E.
coli XL1-Blue was used as host strain for the construction
of the plasmids, and chemically competent cells were
transformed according to the manufacturer's procedure.
Lactobacillus strains were electrotransformed with 1–2 µg
of pLBS-GFP-Em
R
plasmid according to the optimised
procedure of Serror et al. [23].
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Plasmid constructions
Plasmids were constructed using standard molecular clon-
ing and PCR fusion (overlap extension) techniques [21].
Primers were purchased from Invitrogen Life Technolo-
gies (São Paulo, Brazil) and Integrated DNA Technologies,
Inc. (Coralville, IA, USA), and are listed in Table 1. Plas-
mid pLBS-GFP-Em
R
(Fig. 3) was designed to contain the
'backbone' elements of the cloning vector pCR2.1-Topo:
the replication determinants (pUC ori), and ampicillin
and kanamycin resistance markers for E. coli. The Lactoba-
cillus specific sequences were PCR amplified from
genomic DNA of L. crispatus strain F5.7 to assemble the
expression cassette containing the lbs promoter, leader
peptide, anchor and terminator sequences. Homologous
sequences to the anchor region of Lbs are found in other
S-layer proteins from different Lactobacillus species, such
as Slp of L. acidophilus (accession X89375, X89376), SlpH
of L. helveticus (accession X91199, X92752), Lgs of L. gall-
inarum (accession AY597259, AY597266), Slp of L. sunto-
ryeus (accession AY641395), Cbs of L. crispatus (accession
AF001313, AF079365), with nucleotide identities higher
than 80% to 90%. These nucleotide stretches can be
enough to allow plasmid integration at lbs locus via
homologous recombination, otherwise it will be unable
to propagate in Lactobacillus. An erythromycin resistance
marker (ermAM) was amplified from plasmid pRV566.
The Aequorea victoria GFP was PCR amplified from com-
mercial plasmid (Clontech, Palo Alto, CA, USA) and used
as reporter gene to test the expression of heterologous pro-
teins.
Sequencing and sequence analysis
DNA sequencing was carried out at the Núcleo de Análise
de Genoma e Expressão Gênica (NAGE), Instituto de
Ciências Biológicas, UniversidadeFederal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil, using a DYEnamic™
ET Dye Terminator Cycle Sequencing kit for MegaBACE™
DNA Analysis Systems (Amersham Biosciences, USA) in
combination with a MegaBACE™ 1000 automated
sequencing system. Both polynucleotide strands of the
cloned DNA were sequenced, using M13 forward and
reverse primers. The sequences obtained were compared
to sequences held in GenBank DNA database using the
BLAST algorithm [1].
Confocal scanning laser microscopy
Confocal microscopy work was performed using a LSM
510 META inverted confocal scanning laser microscope
(Carl Zeiss Ltd., Germany) carried out at the Centro de
Microscopia (CEMEL), Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,
MG, Brazil. Randomly selected areas of each sample were
imaged using a ×63 magnification objective with a numer-
ical aperture of 1.4. Confocal illumination was provided
by a Kr/Ar laser (458-nm laser excitation) fitted with a
long-pass 520-nm emission filter (greenfluorescence sig-
nal).
Authors' contributions
RMM, JLSM and MRS carried out all the experiments: dis-
section of chicks, bacteria isolation, DNA extraction, PCR
amplification, gel electrophoresis, restriction digestion,
and cloning. MFH and SMRT participated to the discus-
sion of the results, and the manuscript draft. EN and JRN
participated to the study design. ACN conceived and
designed the study, and coordinated and participated to
the manuscript draft. All authors read and approved the
final manuscript.
Acknowledgements
The authors acknowledge Maria Fernanda Brito de Almeida for technical
help during initial cloning experiments, Nirtes Schaper for chickens raise
and rearing, Fernanda Bastos for DNA sequencing, Carolina Cunha for con-
focal microscopy assistance, Elimar Faria and Jucélia Marize Pio for the val-
uable technical assistance. The work was supported by Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). JLSM, MFH,
SMRT and JRN are CNPq research fellows.
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