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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA DO NERVO
LARÍNGEO RECORRENTE EM CADÁVERES
HUMANOS
Dissertação de Mestrado
Deivis de Campos
Porto Alegre
2008
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ii
Deivis de Campos
AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA DO NERVO
LARÍNGEO RECORRENTE EM CADÁVERES
HUMANOS
Dissertação de Mestrado
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas: Neurociências da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Neurociências.
Orientadores:
Prof. Dr. Geraldo Pereira Jotz
Prof. Dr. Léder Leal Xavier
Porto Alegre, março de 2008.
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iii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Paulo e Lúcia; pelo Amor..., Carinho... e
Dedicação... nos momentos mais difíceis.
À minha esposa, Viviane; pelo carinho dedicado, compreensão,
amor e cumplicidade durante todos estes anos.
iv
AGRADECIMENTOS
- Ao Prof. Dr. Geraldo P. Jotz, definitivamente mais que um
orientador, um grande amigo; pela confiança, incentivo, e instrução,
desde o princípio desta minha trajetória.
- Ao Prof. Dr. Léder Leal Xavier pela sempre tão valiosa co-
orientação; pela sua camaradagem e disposição em ajudar na
construção desse trabalho. Agradeço também ao aprendizado e
pelo exemplo de profissionalismo.
- À Profª. Drª Matilde Achaval Elena, por ter me recebido na
UFRGS, pelo exemplo de caráter e profissionalismo, aliados a um
grande amor pela ciência.
- Aos meus inestimáveis colegas do Laboratório de Anatomia
Humana da UNISC: Manoel, Claisson, Rodrigo, Edson, Guilherme,
Lucas e Bruno - pelo coleguismo e a camaradagem... Mas,
principalmente pela alegria da convivência.
- Aos Funcionários do Departamento Médico Legal de Porto Alegre.
- Às alunas de Iniciação Científica da PUCRS; Thaís, Mariana,
Lisiani e Laura pelo auxílio nos procedimentos morfométricos.
- Aos Professores do Laboratório de Anatomia Humana da UNISC,
em especial à Profª Leda, ao Prof. Léo, ao Prof. Pedro e à Profª
Taís, por terem sido grandes incentivadores.
- À Bióloga Márcia do Laboratório de Histologia e Patologia da
UNISC, pela mais gentil e paciente colaboração em todos os seus
ensinamentos nas técnicas histológicas.
- Ao Prof. Alexandre Rieger, pelos seus valiosos ensinamentos em
Biofísica, desde a época da graduação.
- Ao Laboratório de Análise de Imagens do Departamento de
Ciências Morfológicas do ICBS, UFRGS.
- Aos professores, funcionários e colegas do PPG Neurociências,
que fizeram parte da minha formação e que me adicionaram uma
visão distinta sobre pesquisa, ciência e vida.
Obrigado!
v
“Suba o primeiro degrau com fé. Você não precisa ver a escada inteira, apenas
dê o primeiro passo”.
Martin Luther King Jr.
vi
RESUMO
Estudos anatômicos prévios demonstram uma assimetria morfológica em
termos de comprimento de fibras e diâmetro destas no Nervo Laríngeo
Recorrente (NLR). Estas assimetrias provavelmente estão relacionadas aos
diferentes tempos de chegada do impulso nervoso à musculatura laríngea
controlada por cada NLR. Conhecer as diferenças morfológicas entre os
nervos direito e esquerdo poderá fornecer subsídios para elucidar os motivos
pelos quais tais diferenças não afetam na função simétrica da musculatura
laríngea. O objetivo desta investigação é estimar alguns parâmetros
morfométricos como a área intraperineural; perímetro intraperineural; área;
perímetro; densidade (número de fibras/mm
2
) e o número total de fibras do
NLR direito e esquerdo de humanos. Os nervos direito e esquerdo foram
coletados em oito cadáveres do sexo masculino. Os nervos foram seccionados
em parafina e corados com Hematoxilina-eosina. Todos os parâmetros
morfométricos foram medidos a partir de imagens digitalizadas com o auxílio
do software Image Pro-Plus 4.1.; sendo estas, obtidas de secções histológicas
(10 μm) da parte distal do NLR (de ambos os lados). Nenhuma diferença
estatística foi observada com relação à área intraperineural; perímetro
intraperineural; densidade (número de fibras/mm
2
) e número total de fibras
entre ambos os lados. Porém, a área e o perímetro de fibras do lado direito são
estatisticamente maiores quando comparadas com o lado esquerdo, 21 e 11%,
respectivamente. Nossos resultados são congruentes com estudos
eletrofisiológicos prévios do NLR, demonstrando haver uma diferença
morfológica entre os nervos direito e esquerdo; podendo esta ser a
fundamentação morfológica para explicar a diferença na velocidade de
condução do impulso nervoso à musculatura intrínseca da laringe, controlada
vii
por cada nervo.
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................ix
LISTA DE TABELAS.................................................................................................xi
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
2 OBJETIVOS...........................................................................................................13
2.1 Objetivo Geral...................................................................................................13
2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................13
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................14
3.1 Preparação do Tecido para Histologia.............................................................15
3.2 Considerações Éticas.......................................................................................16
3.3 Avaliação Morfométrica....................................................................................18
3.3.1 Quantificação da área e perímetro intraperineural total do NLR (PONTO
1)..........................................................................................................................18
3.3.2 Quantificação do número de fibras nervosas do NLR (PONTO 1).............19
3.3.3 Quantificação da área e perímetro das fibras nervosas do NLR (PONTO
1)..........................................................................................................................19
3.3.4 Quantificação da área e perímetro intraperineural total do NLR (PONTO
2)..........................................................................................................................23
3.3.5 Quantificação do número de fibras nervosas do NLR (PONTO 2).............23
3.3.6 Quantificação da área e perímetro das fibras nervosas do NLR (PONTO
2)..........................................................................................................................24
4 ARTIGO.................................................................................................................28
5 CONCLUSÕES......................................................................................................48
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................49
7 ANEXOS................................................................................................................56
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. (A) Nervo Laríngeo Recorrente direito; (B) Nervo Laríngeo Recorrente
esquerdo; (C) Nervo Vago direito; (D) Nervo Vago esquerdo; (E) Artéria
Subclávia e (F) Arco da Aorta.............................................................................5
Figura 2. Representação esquemática da variabilidade no trajeto do segmento
distal esquerdo do NLR, se aproximando da junção
cricotireóidea.......................................................................................................7
Figura 3. Laringe...............................................................................................15
Figura 4. Representação esquemática da metodologia histológica utilizada
para avaliação morfométrica do NLR, em dois pontos de seu segmento em
diferentes secções
ABCD
, bilateralmente.............................................................17
Figura 5. Fotomicrografia de secção transversal do NLR (PONTO 1)..............17
Figura 6. Delineamento (círculo azul) intraperineural para obtenção da área e
perímetro intraperineural do NLR (PONTO 1)...................................................20
Figura 7. Cada quadrante (azul) representa um campo com área de 1860 µm
2
,
usado para quantificar o número de fibras nervosas (PONTO 1).....................20
Figura 8. Delineamento de cinco fibras (círculos azuis) para obtenção da área
e perímetro das fibras nervosas do NLR (PONTO 1).......................................20
x
Figura 9. Delineamento (círculo vermelho) intraperineural para obtenção da
área e perímetro intraperineural do NLR (PONTO 2).......................................25
Figura 10. Cada quadrante (vermelho) representa um campo com área de
1860 µm
2
, usado para quantificar o número de fibras nervosas (PONTO 2)....25
Figura 11. Delineamento de cinco fibras (círculos vermelhos) para obtenção da
área e perímetro das fibras nervosas do NLR (PONTO 2)...............................25
ARTIGO
Figure 1. Schematic representation showing the region of the RLN that was
studied in different sections (A to H), bilaterally….………………………………43
Figure 2. Digitized images of sections of the RLN…………………………….....44
Figure 3. Comparison of intraperineural area (A); intraperineural perimeter (B);
area (C); perimeter (D); density (E) and total number (F) of fibers between the
right (R) and the left (L) RLN…………………………………………………....….45
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Comprimento médio do NLR em diferentes
espécies..............................................................................................................5
Tabela 2. Área, perímetro intraperineural e número de fibras do NLR (PONTO
1) nos oito indivíduos da amostra, através do Programa Image Pro-Plus
4.1.....................................................................................................................21
Tabela 3. Valores obtidos para área e perímetro das fibras do NLR (PONTO 1)
nos oito indivíduos da amostra, através do Programa Image Pro-Plus
4.1.....................................................................................................................22
Tabela 4. Área, perímetro intraperineural e número de fibras do NLR (PONTO
2) nos oito indivíduos da amostra, através do Programa Image Pro-Plus
4.1.....................................................................................................................26
Tabela 5. Valores obtidos para área e perímetro das fibras do NLR (PONTO 2)
nos oito indivíduos da amostra, através do Programa Image Pro-Plus
4.1.....................................................................................................................27
ARTIGO
Table 1. Table showing the parameters of the subjects.......……………………46
Table 2. The Pearson correlation coefficient (r) between the parameters, the
xii
significant correlation is presented in bold……………………………………..…47
1
1 INTRODUÇÃO
O nervo Vago, foi descrito por Marinus, no ano de 100 d.C., pela
primeira vez. A denominação de Vagus foi dada por Domenico de Marchetti
(1626-1688) da Universidade de Pádua, que reescreveu o nervo, dividindo-o
em 16 partes. Tudo indica que Marchetti estudou as variações do trajeto do
nervo e seus ramos, por isto o nome de Vagus, que em Latim significa errante,
incerto, inconstante, confuso e desordenado (SKINNER, 1961).
Em 1807 o anatomista francês François Chaussier, chamou o então
nervo Vago, de Pneumogastrique (Pneumogástrico, em Português). Referência
a ser um nervo de pulmão e estômago. Pela atual terminologia anatômica da
Federação Internacional de Associação de Anatomistas, optou-se pela
terminologia de nervo Vago e não Pneumogástrico (REZENDE, 1992).
Zemlin (2000) referia que o nervo Vago (X par craniano) foi assim
denominado devido ao seu trajeto errático, apresentando extensa distribuição
de ramos nervosos através do pescoço e do tórax, estendendo-se até a
cavidade abdominal. O nervo Vago emerge do crânio através do forame
jugular, onde apresenta duas dilatações, os gânglios jugular (superior) e
nodoso (inferior), tendo uma porção sensitiva, que inerva a dura-máter, a pele
da parte posterior da orelha externa e o meato acústico externo, e uma porção
motora, onde emite ramos faríngeo-esofágicos, laríngeos (ramos sensitivos e
motores), ramos que inervam o pericárdio, o estômago, o pâncreas, o baço, os
rins, o intestino e o fígado.
O gânglio jugular é arredondado e com cerca de 4 mm de diâmetro. O
gânglio inferior é maior e alongado, medindo cerca de 25 mm de comprimento
2
e cerca de 5 mm de largura, no máximo (WILLIAMS et al., 1995). De acordo
com Schnitzlein e colaboradores (1958) o nervo Vago do ser humano contém,
no nível médio cervical, cerca de 16.500 fibras mielinizadas no lado direito e
20.000 no lado esquerdo, contadas em 17 pares de nervos.
Dentre os 12 pares de nervos cranianos, o nervo Vago (X), apresenta
uma miríade de funções sensitivas e motoras que incluem sensibilidade
somática e visceral (MARTIN, 1998), é o principal nervo da divisão craniana do
parassimpático, inervando todas as vísceras torácicas e abdominais. Boa parte
da sensibilidade dessas vísceras, bem como a da laringe, viaja por este nervo.
O Vago é ainda um nervo motor para a laringe, onde é importante para os
mecanismos da fonação (COSENZA, 1990).
O Vago desce no interior da bainha carótica, entre a veia jugular interna
e, sucessivamente, as artérias carótidas interna e comum. Na base do
pescoço, os Vagos direito e esquerdo, têm trajetos diferentes: o direito passa
anteriormente à 1ª porção da artéria subclávia e o esquerdo situa-se entre a
artéria carótida comum e a 1ª porção da artéria subclávia (GARDNER et al.,
1988; DANGELO & FATTINI, 1998).
Ao longo de seu extenso trajeto, o X par emite numerosos ramos
colaterais que, de acordo com as regiões de distribuição, classificam-se em
(GARDNER et al., 1988; DANGELO & FATTINI, 1998; MACHADO, 1998;
SOBOTTA, 2000):
1. O ramo meníngeo: origina-se do gânglio superior, é sensitivo e inerva a
dura-máter da fossa craniana posterior.
2. O ramo auricular: origina-se do gânglio superior e recebe uma
comunicação do nervo Glossofaríngeo (IX par craniano). É sensitivo e emerge
3
do crânio na fissura tímpano-mastóidea para inervar a superfície craniana da
orelha externa, o assoalho do meato acústico externo e a membrana do
tímpano.
3. Os ramos faríngeos: as fibras nervosas que os constituem são motoras e
pertencem, na verdade ao nervo Acessório (XI par craniano), cuja raiz bulbar
se acola ao Vago logo abaixo do gânglio inferior. Os ramos faríngeos
participam, com ramos do nervo Glossofaríngeo e do simpático, da formação
do plexo faríngeo que inerva os músculos da faringe (com exceção do
estilofaríngeo) e do palato mole (exceto o músculo tensor do véu palatino). Os
ramos faríngeos passam entre as artérias carótida interna e externa.
4. O nervo laríngeo superior (NLS): está constituído de fibras nervosas do
nervo Acessório e do Vago. Passa posterior e medialmente às artérias
carótidas, externa e interna e divide-se em dois ramos:
a) ramo interno: é sensitivo e constituído por fibras nervosas do Vago. Em
companhia da artéria tireóidea superior (ATS) perfura a membrana tireo-
hióidea e inerva a mucosa da laringe desde a epiglote e porção posterior da
língua até as pregas vocais.
b) ramo externo: é motor, constituído por fibras nervosas do nervo Acessório
e também chamado nervo laríngeo externo, situa-se profundamente à artéria
tireóidea inferior (ATI) e inerva o músculo constritor inferior da faringe (MCIF) e
o cricotireóideo (da laringe).
5. Os ramos caróticos: são inconstantes e auxiliam o nervo Glossofaríngeo
na inervação do seio e corpo caróticos.
6. Os ramos cardíacos: em número variável, nascem do Vago no pescoço e
no tórax e se dirigem para o coração onde participam da formação do plexo
4
cardíaco com os ramos cardíacos do tronco simpático.
7. O nervo laríngeo recorrente (NLR): abaixo do gânglio inferior, o Vago
recebe o ramo interno do nervo Acessório, cujas fibras se distribuem
juntamente com os ramos do Vago, formando o NLR, citado como um nervo
predominantemente motor mais importante da laringe. Inerva a mucosa da
laringe abaixo das pregas vocais (sensitivo) e todos os músculos intrínsecos
da laringe (motor), com exceção do cricotireóideo. Sendo importante, por esta
razão, no mecanismo da fonação. Sua origem é diferente à direita e à
esquerda. O nervo direito origina-se anteriormente à primeira parte da artéria
subclávia e passa em torno deste vaso. O nervo esquerdo origina-se no tórax,
sobre o lado esquerdo do arco da aorta, e passa em torno deste vaso atrás da
inserção do ligamento arterioso. Ambos os nervos recorrentes ascendem no
interior do sulco traqueoesofágico, penetrando na laringe (Figura 1).
Tais diferenças macroscópicas são de tamanha complexidade que Alves
(1965), descreve o NLR direito como um nervo cervical e o esquerdo, como um
nervo cérvico-torácico. Uma disposição que se correlaciona com o
desenvolvimento dos arcos aórticos no embrião. Antes de penetrar na laringe,
o NLR geralmente se divide em dois ou mais ramos (GARDNER et al., 1988):
1) Ramos colaterais do NLR: a) ramos cardíacos médios: terminam no plexo
cardíaco; b) ramos esofágicos; c) ramos traqueais; d) ramos faríngeos, para o
MCIF; e e) ramo comunicante com o gânglio cervical inferior.
2) Ramos terminais do NLR: a) ramos musculares: distribuem-se para os
músculos cricoaritenóideo lateral, tireoaritenóideo, cricoaritenóideo posterior e
ariaritenóideo; b) ramo comunicante com o nervo laríngeo superior.
5
Figura 1 – (A) Nervo Laríngeo Recorrente direito; (B) Nervo Laríngeo Recorrente esquerdo;
(C) Nervo Vago direito; (D) Nervo Vago esquerdo; (E) Artéria Subclávia e (F) Arco da Aorta.
Modificada de De humani corporis fabrica
epítome: tabulae sex. Quarto livro, gravura 52, figura
2. (Vesalius, 2002).
De acordo com Harrison (1981), a evidente diferença entre o
comprimento do NLR direito e esquerdo, é também encontrada em outras
espécies (Tabela 1).
Tabela 1 – Comprimento médio do NLR em diferentes espécies.
Espécie NLR (esquerdo) NLR (direito) Diferença
Humanos
42.6 cm 32.2 cm
10.4 cm
Girafa
2 m 1.7 m
30 cm
Cães
38.2 cm 21.5 cm 16.7 cm
(Extraído de Harrison, 1981).
A
B
C
D
E
F
6
O NLR nem sempre se situa em uma posição protegida no sulco
traqueoesofágico, mas pode estar ligeiramente anterior a ele (mais
freqüentemente no lado direito) e pode ser acentuadamente lateral à traquéia
no nível da parte inferior da glândula tireóide. No lado direito, o nervo está
igualmente muitas vezes anterior, ou posterior ou entremeado com os ramos
terminais da artéria tireóidea inferior, enquanto, no lado esquerdo, geralmente
está posterior à artéria, embora ocasionalmente anterior a ela (WILLIAMS et
al., 1995).
Em um estudo sobre a relação anatômica do NLR com a ATI Yalcxin
(2006), usando 50 laringes humanas (100 lados), descreve a alta variabilidade
da relação entre o NLR e a ATI, descrevendo 20 diferentes padrões de
variabilidade. De acordo com seu estudo, a incidência da configuração
anatômica difere completamente em ambos os lados; sendo que no lado
esquerdo a localização mais freqüente do principal tronco do NLR, encontra-se
posterior a ATI, e no lado direito situa-se anteriormente a ATI.
A direção pela qual o NLR se aproxima da junção cricotireóidea,
também é de extrema variabilidade. Shindo e colaboradores (2005) classificam
este trajeto em 4 diferentes categorias: ≤ 15° (Tipo I); > 15º e ≤ 30º (Tipo II); >
30º e ≤ 45º (Tipo III); e > 45º (Tipo IV) (Figura 2). Estes autores realizaram 278
dissecções: 149 direitas e 129 esquerdas. Dos 149 nervos do lado direito, 49%
foram tipo II, 28.9% foram do tipo III, 17.4% foram tipo I, e 4.7% foram tipo IV.
Similarmente ao lado direito, o trajeto mais comum do nervo esquerdo é do tipo
II, com 50.4% demonstrando este padrão. O segundo e terceiro tipo mais
comum do nervo esquerdo foi tipo I (26.4%) e tipo III (20.9%), respectivamente,
o qual difere a partir da distribuição do lado direito. Somente 2.3% do nervo
7
esquerdo foi do tipo IV.
Os nervos da laringe são fornecidos por dois ramos do nervo Vago: NLS
e NLR (MOORE & DALLEY, 2001), este último, o NLR, inerva a quase
totalidade da musculatura intrínseca da laringe, donde sua grande importância
na patogenia dos distúrbios da mobilidade. Portanto, em última análise, já é
evidente que a origem, o comprimento, o trajeto e as relações deste importante
ramo da parte cervical do nervo Vago variam segundo o lado considerado,
motivo pelo qual devem ser estudados separadamente (FIGÚN & GARINO,
1994).
Figura 2 – Representação esquemática da variabilidade no trajeto do segmento distal
esquerdo do NLR, se aproximando da junção cricotireóidea. (Extraído de Shindo et al., 2005).
A paralisia do NLR freqüentemente resulta de câncer (25%) e lesão
durante cirurgia da tireóide, porção cervical do esôfago, coração e pulmões
(20%). Devido ao seu maior trajeto no pescoço, as lesões do NLR esquerdo
são muito mais comuns do que as do direito (MCMINN, 1990). Em geral, nos
seres humanos, o NLR esquerdo é de 7 a 10 vezes mais afetado do que o
direito (CUNNING, 1955).
Verificou-se que as causas mais citadas de lesão ao NLR são doenças
8
malignas (tumores esofágicos, tumores centrais, de tireóide e de mediastino),
tumores benignos (centrais ou periféricos), traumas cirúrgicos (em ressecções
cricotraqueais, tireoidectomias e outras), trauma por intubação, doenças
inflamatórias, doenças sistêmicas e alterações idiomáticas (FAWCUS 1992;
BROWN et al., 1996; CAVANAUGH & PARK, 2000; PROCACCIANTE et al.,
2000).
De acordo com Crary e Glowaski (1996), dentre essas causas citadas,
os traumas cirúrgicos são freqüentemente reconhecidos como uma das
principais etiologias de lesão do NLR. Segundo esses autores, a cirurgia da
glândula tireóide é o procedimento cirúrgico mais comum que resulta em
paralisia de pregas vocais. Ressecções de pulmão, dissecções radicais de
pescoço e/ou cirurgias da artéria carótida também podem resultar em danos a
vários ramos do nervo vago contribuindo para paralisias de prega vocal.
Cirurgias do esôfago cervical e abordagens cervicais para região anterior das
vértebras cervicais podem causar dano de tração ao NLR.
Navarro e colaboradores (2003) comentam que a complexa inervação
da laringe tem motivado o aparecimento de um grande número de pesquisas,
em especial àquelas relacionadas ao NLR, definido na literatura como sendo
um dos mais importantes ramos do nervo Vago, devido as suas relações
anatômicas e funcionais.
Périé e colaboradores (1998) relataram que na lesão neural (paralisia
unilateral do NLR e ou do nervo Vago), a prega vocal estaria usualmente
fixada na posição paramediana na hemilaringe afetada. Ainda descreveram
que, os principais sintomas dessa alteração seriam a disfonia, a diplofonia, a
rouquidão e a soprosidade.
9
O NLR, em particular, tem recebido muita atenção devido a sua seqüela
pós-operatória imediata. Danos a este nervo podem causar paralisia das
pregas vocais e disfonia conseqüente, de forma permanente ou transitória
(ESTRELA, 2005).
A morfometria do nervo Vago em humanos demonstra que a área do
corte transversal e o perímetro dos axônios mielinizados sofrem uma
significativa diminuição com a idade, apesar do número total de axônios
permanecer o mesmo (LU et al., 2001).
Em um estudo sobre a morfometria do NLR Nakai e colaboradores
(2000), descrevem que ao longo do processo de envelhecimento humano,
ocorrem significativas mudanças na ultra-estrutura das fibras nervosas. O
mesmo autor ressalta ainda que é a primeira vez que houve um estudo nesse
sentido.
Sunderland e Swaney (1952) descreveram as variações na perda do
tecido conjuntivo epineural ao redor dos fascículos do NLR direito, ao longo de
seu comprimento em 4 cadáveres humanos. As medidas revelaram que
aproximadamente 23 – 33% do nervo estão preenchidos por fascículos
nervosos, no nível inferior ao músculo constritor inferior da faringe. Acima do
músculo MCIF, o NLR apresenta uma área de secção contendo somente 10 –
15% de fascículos nervosos. A ramificação mais baixa do NLR, que supre o
esôfago, traquéia e o MCIF, apresenta uma área de secção com 67% ocupada
por fascículos nervosos.
Malmgren e Gacek (1981), medindo a quantidade de fascículos e
tecidos epineurais ao redor do NLR, direito e esquerdo, em 28 indivíduos que
passaram por laringectomia, verificaram que a quantidade de tecido epineural
10
é de 70 – 90% em secção através do nervo. O número de fascículos nervosos
presente dentro desta secção pode variar de 1 a 11. Os autores não
descrevem os componentes do tecido epineural, mas as largas proporções
destes tecidos indicam uma função protetora do nervo. Este estudo foi restrito
a porção distal do nervo ao nível da cartilagem cricóide.
Tiago e colaboradores (2002) descrevem alguns estudos em que a
avaliação morfométrica do NLR do lado esquerdo apresenta uma
predominância das fibras mielínicas de maior diâmetro, quando comparada
com o lado direito, e que isso pode estar relacionado a uma velocidade de
condução mais rápida do impulso nervoso já que este nervo possui um trajeto
mais longo. Os mesmos autores também descrevem outros estudos onde não
são encontradas diferenças nas freqüências das fibras mielínicas no NLR
quando comparados os dois lados.
Moore e Dalley (2001) e Gardner e colaboradores (1988), ressaltam que
os músculos intrínsecos da laringe possuem ação combinada em seus
movimentos, ou seja, estes grupos musculares não podem ser contraídos
voluntariamente de um só lado (Machado, 1998). Tais descrições sugerem que
o NLR, direito e esquerdo, apesar de possuir assimetria, tanto nas suas
origens, quanto em suas formas, desempenham uma ação orquestrada nos
músculos intrínsecos da laringe.
De um modo geral, a literatura carece de comentários que esclareçam
como os NLR, direito e esquerdo, mesmo possuindo origens e comprimentos
distintos (DANGELO & FATTINI, 1998), possam controlar de forma simétrica
os músculos responsáveis pela fonação.
A aplicação de novas tecnologias na cirurgia da glândula tireóide, aliada
11
à visualização intra-operatória dos nervos da laringe tem permitido uma
significante redução da paralisia laríngea pós-operatória (THOMUSCH et al.,
2003). O sucesso para o uso adequado destes métodos ainda depende do
conhecimento minucioso da inervação laríngea (KRUSE et al., 2006).
Recentes estudos utilizando histoquímica e microscopia tem fornecido
novos entendimentos a cerca da inervação laríngea, bem como, o surgimento
de novas teorias, que sustentam novas reformulações, acerca da distribuição
das fibras sensoriais e motoras da laringe (MARANILLO et al., 2005).
Diversos autores, entre eles Navarro e colaboradores (2003), comentam
que os estudos correlacionados à histologia com a clínica se fazem
necessários para confirmação ou nova formulação de teorias que acarretem
modificações do comportamento vocal (disfonia) e do processo de deglutição
(disfagia) observadas na Clínica Otorrinolaringológica e de Cirurgia de Cabeça
e Pescoço (ESTRELA, 2005).
Navarro e colaboradores (2003), também chamam atenção para a
importância do uso de tecidos humanos na pesquisa científica, citando que tais
procedimentos permitem a detecção de alterações inerentes ao processo de
envelhecimento que não conseguimos detectar quando utilizamos modelos
animais com período de sobrevida relativamente curto. A avaliação histológica
de nervos sensoriais em outras espécies (ratos) não evidencia diferenças
estatisticamente significantes, quando comparadas diferentes faixas etárias. O
mesmo estudo na espécie humana, que apresenta uma sobrevida maior, já
detecta algumas diferenças.
A complexa inervação da laringe, aliada as dificuldades na
comprovação funcional dos ramos nervosos para a laringe, tem motivado o
12
surgimento de um vasto número de pesquisas, especialmente àquelas
relacionadas ao NLR, definido na literatura como um dos mais importantes
ramos do nervo Vago. Sabe-se que lesões do NLR, por cirurgias de pescoço,
traquéia, esôfago ou coração, acarretam em modificações do comportamento
vocal (disfonias) e do processo de deglutição (disfagia). Considerando a
importância deste nervo no que se refere ao controle do mecanismo da
fonação, torna-se imprescindível seu conhecimento histomorfológico, que
proporciona mais segurança nos procedimentos cirúrgicos, próximo a esta via
nervosa (BARKMEIER & LUSCHEI, 2000).
Embora existam diversos estudos descrevendo a anatomia
macroscópica (SCHWEIZER, 1997); vascular (MOREAU et al., 1998); clínica
(PREMACHANDRA et al., 1990); junção neuromuscular (GAMBINO et al.,
1990); alterações morfológicas com o processo de envelhecimento (NAKAI et
al., 2000) em relação ao NLR, há uma relevância clínica e/ou fisiológica muito
grande em se avaliar o padrão histomorfológico do NLR, bilateralmente.
A avaliação morfométrica no NLR, direito e esquerdo, poderia
enriquecer a literatura da neurobiologia da voz, bem como possuir uma grande
aplicabilidade clínica, uma vez que poderá elucidar os motivos pelos quais tais
diferenças morfológicas nos nervos não afetam na função simétrica da
musculatura intrínseca da laringe. E ainda as dificuldades na comprovação
funcional dos ramos nervosos para a laringe tornam este assunto
extremamente intrigante e desafiador para o pesquisador que pretenda
ingressar em este campo.
13
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
-Estudar a morfometria do Nervo Laríngeo Recorrente direito e
esquerdo, em cadáveres humanos, através da microscopia óptica e métodos
morfométricos.
2.2 Objetivos Específicos
-Avaliar a morfometria de ambos os Nervos Laríngeos Recorrentes, a
fim de verificar se o padrão histológico é ou não semelhante, bilateralmente.
-Analisar as reais diferenças morfológicas que poderiam explicar a
função simétrica desempenhada na musculatura responsável pela fonação
humana, através da aferição e quantificação dos seguintes dados
morfométricos: (1) área e (2) perímetro de secção transversal
intraperineural, (3) área e (4) perímetro das fibras nervosas, (5) densidade
das mesmas, (6) número total de fibras nervosas e a (7) correlação destes
parâmetros morfológicos com outros parâmetros dos indivíduos como a
idade, o peso, a altura e o Índice de Massa Corporal (IMC).
14
3 MATERIAL E MÉTODOS
Para este estudo, foram utilizados oito cadáveres adultos do sexo
masculino com idade superior a 18 anos, que sofreram óbito por causas extra-
cervicais e com menos de 24 horas post-mortem, todos provenientes do
Departamento Médico Legal (DML) de Porto Alegre – RS. Através da ficha de
óbito, foram obtidas informações pregressas dos cadáveres, sendo utilizado
como critério de exclusão, indivíduos portadores de disfunções que poderiam
influenciar nos resultados.
Para iniciar o processo de dissecção da região cervical, o tecido dessa
região foi previamente lavado com ácido acético e o cadáver era colocado em
posição de hiperextensão cervical. Realizou-se uma incisão cervical
longitudinal seguindo a linha da necropsia, abrindo-se as estruturas plano a
plano. A dissecção do NLR se estendeu profundamente em direção ao seu
ponto de entrada na laringe (junção cricotireóidea).
Após, realizada a dissecação, o NLR foi marcado com tinta preta da
marca Nankin
®
, 1 cm antes de entrar na laringe, nível da borda inferior da 3ª
cartilagem traqueal, em ambos os lados. Depois de realizada a marcação; foi
extraído um fragmento de 2,5 cm de seu segmento previamente marcado,
bilateralmente (Figura 3).
Os fragmentos foram cortados para avaliação morfométrica em dois
pontos: (PONTO 1) um cm antes de penetrar na laringe (marcação) e (PONTO
2) um cm abaixo do ponto de marcação, nível da borda inferior da 5ª
cartilagem traqueal; em ambos os pontos foram feitas quatro secções
ABCD
cada
uma com espessura de 10 μm. Os intervalos entre as secções representam
15
100 μm em ambos os pontos, bilateralmente (Figura 4).
Figura 3 - Laringe. Dissecação profunda da região ântero - lateral esquerda. A, traquéia; B,
NLR; C, músculo cricotireóideo; D, cartilagem cricóide; E, glândula tireóide rebatida e o ponto
de marcação do NLR para avaliação morfométrica (
*
).
3.1 Preparação do Tecido para Histologia
No preparo do tecido para microscopia óptica, foram obedecidas as
seguintes etapas:
1ª Etapa: Coleta do Material
O material coletado foi lavado em soro fisiológico.
2ª Etapa: Fixação
Os fragmentos dos nervos foram imediatamente colocados em frascos
individuais, identificados, com solução fixadora Bouin (ácido pícrico – ácido
acético – formalina) por 24 horas.
A
D C
B
E
*
16
3ª Etapa: Tratamento pós-fixação - Desidratação
Os fragmentos dos nervos foram colocados em água corrente durante
24 horas. Posteriormente, o material foi transferido para as seguintes
concentrações crescentes de etanol: 50%, 70%, 80%, 90% e 100%.
4ª Etapa: Diafanização
Dois banhos de xilol (15 minutos cada).
5ª Etapa: Impregnação em parafina
O material permaneceu durante 3 horas em parafina líquida
(aproximadamente 56ºC).
Os blocos obtidos após a impregnação em parafina foram aparados e
cortados em micrótomo rotativo da marca Leica
®
, modelo RM2125RT na
espessura de 10 μm. Em seguida as seções foram colocadas em lâminas de
vidro previamente albuminizadas, secadas e coradas pelo método
convencional de hematoxilina-eosina.
3.2 Considerações Éticas
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS (ANEXO A). Encontram-
se em anexo o modelo do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(ANEXO B) que foi assinado, em duas vias, um pelo responsável familiar do
sujeito, e outro, na ausência deste último, pela autoridade legal responsável
17
pelo sujeito, respeitando os preceitos da Lei, principalmente no que diz
respeito aos princípios de autonomia, beneficência, não maleficência, justiça,
eqüidade e sigilo. A amostra foi composta exclusivamente por indivíduos sob a
responsabilidade legal do DML.
Figura 4 – Representação esquemática da metodologia histológica utilizada para avaliação
morfométrica do NLR em dois pontos de seu segmento em diferentes secções
ABCD
,
bilateralmente. O PONTO 1 situa-se a nível da borda inferior da 3ª cartilagem traqueal e o
PONTO 2 a nível da borda inferior da 5ª cartilagem traqueal. L, Laringe; T, Traquéia; M,
Marcação.
Figura 5 – Fotomicrografia de secção transversal do NLR (PONTO 1). Detalhe para os
resquícios da marcação com tinta preta Nankin
®
(setas).
M
L
A
B
C
D
1cm
1cm
L
NLR
direito
NLR
esquerdo
100
μ
m
M
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
T
A
B
C
D
PONTO 1
PONTO 2
18
3.3 Avaliação Morfométrica
Todos os procedimentos da avaliação morfométrica foram realizados no
Laboratório de Análise de Imagens do Departamento de Ciências Morfológicas
do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
As secções histológicas foram avaliadas em microscópio de luz da
marca Nikon
®
, modelo Eclipse E600, com objetiva de 10 e 40x e aumento final
de 100 e 400x, respectivamente; acoplado ao Software Image-Pro Plus 4.1.
Para que fosse garantida a padronização bilateral da análise
morfométrica do NLR (PONTO 1), foram consideradas apenas as secções
histológicas que apresentavam resquícios da marcação (tinta preta) agregada
ao tecido epineural (Figura 5).
3.3.1 Quantificação da área e perímetro intraperineural total do NLR
(PONTO 1):
Para obter as medidas da área e perímetro do nervo, as imagens foram
digitalizadas (10x); sendo avaliadas quatro secções por lâmina (nervo),
bilateralmente (Ver Tabela 2). O procedimento utilizado para a aferição destas
medidas foi através do delineamento intraperineural do NLR, a partir das
imagens digitalizadas (Figura 6). No software IPP 4.1 foi obtido o valor da área
e perímetro intraperineural total do NLR. A estimativa da área intraperineural
foi utilizada para o cálculo da densidade e número total de fibras do nervo.
19
3.3.2 Quantificação número de fibras nervosas do NLR (PONTO 1):
As imagens do nervo foram digitalizadas (40x). Foram avaliados quatro
campos por secção, com área do campo de 1860 µm
2
(Ver Tabela 2); os
campos foram sobrepostos na parte superior, inferior, esquerda e direita da
área intraperineural do NLR. Para evitar erro de amostragem, foram incluídas
as fibras localizadas sobre as linhas superior e esquerda e excluídas as fibras
localizadas sobre as linhas inferior e direita que delimitavam o campo (Figura
7). A densidade e o número total de fibras contadas puderam ser obtidos
através das seguintes equações:
Densidade de fibras = número total de fibras contadas / área do campo X
número de campos analisados
Número total de fibras = densidade de fibras X área intraperineural estimada
3.3.3 Quantificação da área e perímetro das fibras nervosas do NLR
(PONTO 1):
Para obter as medidas da área e perímetro das fibras, as imagens foram
digitalizadas (40x); sendo avaliadas cinco fibras por secção. Foram escolhidas
para a avaliação das medidas as fibras situadas na parte superior central,
inferior central, esquerda central, direita central e o centro do NLR (área
intraperineural). O procedimento utilizado para a aferição destas medidas foi
através do delineamento das fibras (Figura 8). Assim como na aferição da área
e perímetro intraperineural total do NLR, foi possível obter o valor da área e
perímetro das fibras do NLR (Ver Tabela 3).
20
Figura 6 – Delineamento
(círculo azul) intraperineural
para obtenção da área e
perímetro intraperineural do
NLR (PONTO 1). Aumento de
10x.
Figura 7 – Cada quadrante
(azul) representa um campo
com área de 1860 µm
2
, usado
para quantificar o número de
fibras nervosas (PONTO 1).
Aumento de 40x.
Figura 8 - Delineamento de
cinco fibras (círculos azuis)
para obtenção da área e
perímetro das fibras nervosas
do NLR (PONTO 1). Aumento
de 40x.
21
Tabela 2 – Área, perímetro intraperineural e número de fibras do NLR (PONTO 1) nos oito indivíduos da
amostra, através do Programa Image Pro-Plus 4.1.
Área intraperineural (μm
2
) Perímetro intraperineural (μm) Número de fibras
Secção
(NLR)
A B C D A B C D A B C D
1 D
204667.4
206266.8
213863.9
226197.6
2010.10
1986.910
2090.445
2133.028
Q1 11
Q2 10
Q3 11
Q4 12
Q1 10
Q2 11
Q3 10
Q4 11
Q1 10
Q2 10
Q3 12
Q4 12
Q1 11
Q2 11
Q3 11
Q4 10
1 E
42318.34
39050.37
39938.49
41114.96
981.3437
871.3280
868.7521
884.3548
Q1 14
Q2 15
Q3 14
Q4 12
Q1 12
Q2 14
Q3 13
Q4 13
Q1 16
Q2 12
Q3 13
Q4 16
Q1 12
Q2 13
Q3 13
Q4 15
2 D
57354.87
316851.2
293571.1
303963.9
1087.899
2373.760
2338.739
2406.706
Q1 10
Q2 9
Q3 8
Q4 9
Q1 11
Q2 8
Q3 8
Q4 8
Q1 9
Q2 10
Q3 9
Q4 7
Q1 6
Q2 7
Q3 7
Q4 7
2 E
299419.5
307401
322003.1
261145.7
2419.492
2346.360
2508.831
2258.066
Q1 11
Q2 10
Q3 13
Q4 12
Q1 10
Q2 14
Q3 12
Q4 13
Q1 13
Q2 14
Q3 15
Q4 10
Q1 14
Q2 13
Q3 11
Q4 10
3 D
222206.9
195636.3
195820.8
177808.5
1979.702
1941.728
1954.691
1912.308
Q1 8
Q2 8
Q3 8
Q4 7
Q1 9
Q2 8
Q3 8
Q4 8
Q1 7
Q2 8
Q3 9
Q4 8
Q1 7
Q2 8
Q3 7
Q4 8
3 E
198739
172964.3
194694.4
233979.2
1966.215
1820.703
1892.530
2152.735
Q1 11
Q2 10
Q3 10
Q4 12
Q1 12
Q2 15
Q3 13
Q4 12
Q1 10
Q2 12
Q3 12
Q4 10
Q1 10
Q2 12
Q3 15
Q4 16
4 D
143260.3
113633.2
145501.7
147397.2
1727.226
1609.035
1765.446
1755.728
Q1 11
Q2 12
Q3 11
Q4 10
Q1 11
Q2 10
Q3 10
Q4 11
Q1 11
Q2 11
Q3 10
Q4 12
Q1 11
Q2 12
Q3 12
Q4 11
4 E
168243
304456
223783.2
165855.4
2079.205
2596.479
2105.144
1848.974
Q1 15
Q2 14
Q3 14
Q4 13
Q1 14
Q2 14
Q3 16
Q4 10
Q1 16
Q2 13
Q3 15
Q4 15
Q1 16
Q2 13
Q3 15
Q4 12
5 D
197589.4
228377.6
150761.3
259184.9
1946.467
2105.503
1711.625
2175.565
Q1 11
Q2 10
Q3 10
Q4 11
Q1 10
Q2 11
Q3 12
Q4 9
Q1 11
Q2 11
Q3 11
Q4 12
Q1 11
Q2 13
Q3 11
Q4 12
5 E
134978.9
148762
113610.2
174513.7
1736.188
1729.519
1531.905
1803.90
Q1 12
Q2 13
Q3 15
Q4 13
Q1 12
Q2 12
Q3 10
Q4 12
Q1 12
Q2 10
Q3 12
Q4 12
Q1 13
Q2 12
Q3 15
Q4 13
6 D
290330.7
284767.4
309769.3
282368.3
2516.554
2312.948
2499.093
2276.968
Q1 10
Q2 8
Q3 9
Q4 9
Q1 10
Q2 10
Q3 10
Q4 11
Q1 8
Q2 8
Q3 7
Q4 9
Q1 7
Q2 8
Q3 8
Q4 9
6 E
236651.3
236420.6
180588.2
171088
2059.684
2031.025
1786.722
1752.636
Q1 14
Q2 10
Q3 12
Q4 11
Q1 12
Q2 13
Q3 11
Q4 12
Q1 12
Q2 12
Q3 13
Q4 14
Q1 14
Q2 13
Q3 12
Q4 15
7 D
54636.68
69319.50
59819.30
68373.70
994.4493
1115.829
1052.256
1087.862
Q1 11
Q2 12
Q3 11
Q4 12
Q1 10
Q2 10
Q3 12
Q4 11
Q1 10
Q2 8
Q3 9
Q4 10
Q1 10
Q2 11
Q3 10
Q4 10
7 E
262891.2
262983.5
225528.7
226478.3
2170.425
2096.493
1918.351
1924.201
Q1 12
Q2 13
Q3 11
Q4 14
Q1 13
Q2 13
Q3 14
Q4 12
Q1 11
Q2 13
Q3 13
Q4 14
Q1 14
Q2 13
Q3 12
Q4 11
8 D
246771.3
238717
231165.5
222932.5
1999.734
1960.417
1949.669
1914.217
Q1 13
Q2 13
Q3 12
Q4 11
Q1 15
Q2 10
Q3 16
Q4 14
Q1 19
Q2 14
Q3 16
Q4 14
Q1 15
Q2 13
Q3 19
Q4 15
8 E
80310.84
79412.54
89062.86
88515.81
1172.089
1144.789
1213.949
1206.101
Q1 21
Q2 19
Q3 22
Q4 19
Q1 19
Q2 18
Q3 25
Q4 22
Q1 27
Q2 24
Q3 21
Q4 18
Q1 25
Q2 20
Q3 21
Q4 17
D, direito; E, esquerdo. Avaliação da área e perímetro intraperineural através de quatro secções
ABCD
do NLR. Avaliação do número de fibras
através de quatro campos
Q1234
por secção. Cada campo representa 1860 μm
2
.
22
Tabela 3 – Valores obtidos para área e perímetro das fibras do NLR (PONTO 1) nos oito
indivíduos da amostra, através do Programa Image Pro-Plus 4.1.
Área das fibras (μm
2
) Perímetro das fibras (μm)
Secção
(NLR)
A B C D A B C D
114.0307 81.23260 126.0440 166.0882 46.83040 39.58777 48.57711 53.23071
175.8133 140.5362 111.1704 133.2901 57.16081 51.99273 47.52288 52.45757
180.9618 128.5229 169.9020 143.2058 57.77836 44.02946 54.17899 52.79117
139.7735 78.56298 130.6205 146.8289 50.24603 36.96771 51.37805 50.24890
1 D
110.2170 139.0107 160.1770 148.7357 44.72194 50.57962 52.50720 53.45548
91.52969 136.3411 71.50757 102.9709 39.04514 48.03448 34.67837 42.71943
135.0063 131.5739 100.6827 134.2435 48.57711 49.08871 40.97272 47.52288
109.2634 108.3101 89.81351 110.5984 45.70125 43.41191 40.97272 43.08118
93.43656 131.9553 114.7935 92.86450 40.35517 47.70376 45.08369 39.91849
1 E
105.4498 172.5716 94.38999 82.37672 44.72194 56.54038 41.25668 36.86175
322.0701 178.1015 130.6205 200.4119 80.63541 57.30778 48.32131 59.49404
337.8971 166.4696 231.3032 269.8219 78.37710 56.35950 65.12408 69.89936
349.7197 229.3963 250.9439 161.1304 79.53036 65.24576 69.02601 54.94639
212.0438 225.5825 231.4938 220.0526 60.26143 64.65924 66.81159 62.65386
2 D
331.0324 232.8286 298.6156 264.4827 77.57867 64.73416 74.01033 66.54007
152.1681 231.4938 244.0792 158.4608 51.01629 64.91504 66.73667 51.37805
169.3299 189.1614 241.0282 107.1660 55.92570 59.49404 66.33102 42.53855
174.2878 220.8154 213.5693 111.3611 57.51969 62.62570 55.08051 43.15611
173.1437 171.9995 218.3364 131.5739 57.05485 52.14545 60.57643 47.77868
2 E
127.5695 168.7579 198.8864 160.9397 47.88463 57.20469 59.41911 52.7630
249.6091 162.0838 188.5893 200.6026 68.62037 52.06647 58.05945 58.54576
157.5073 175.2412 158.8421 196.7888 50.68557 57.77836 54.48825 62.65673
182.8687 177.9108 174.0971 216.8110 56.46546 54.49112 55.51718 61.37199
183.4408 203.2722 233.4007 256.6645 59.74984 56.64634 64.89357 63.78588
3 D
150.4519 202.8908 193.1658 219.2899 53.56143 62.03918 57.90674 65.78839
155.0284 166.0882 139.0107 181.5339 51.84576 56.07554 52.86609 57.41661
121.8489 140.5362 108.5008 106.0219 44.62555 48.24639 44.21034 44.46614
110.5984 154.4564 127.5695 156.9353 43.84858 54.50971 48.90783 54.25391
163.9907 168.1858 102.0175 210.7090 50.01839 54.07303 43.15611 58.90751
3 E
151.2147 118.6072 164.5628 211.4717 50.17397 48.83291 53.81723 63.19649
103.5430 145.8754 112.5052 119.1793 47.37303 53.01880 47.70376 46.85856
109.6449 143.0151 128.3323 106.4033 43.51786 54.50971 47.80971 43.15611
135.1970 115.5562 138.4387 115.7469 46.67769 44.28526 47.70376 45.36766
99.15716 111.9332 133.0994 148.5451 42.10188 44.46614 51.73693 50.76049
4 D
114.9842 100.8733 126.2347 116.8910 43.80470 42.28275 49.19466 45.77617
151.2147 112.3146 121.2768 118.7979 52.28244 48.06551 45.33949 46.46865
135.5784 144.7313 118.7979 117.6538 51.19717 52.07053 46.90532 48.17147
106.7846 128.5229 117.6538 116.7004 42.56959 47.95955 46.21285 46.0630
116.5097 141.6803 114.0307 103.1616 45.90742 51.37805 45.59529 42.64164
4 E
101.4454 159.4142 97.25030 84.47428 42.97523 55.76724 41.59028 33.62413
187.2545 207.0859 140.7269 142.4431 62.40093 65.81656 53.77048 50.61065
168.1858 207.8487 130.6205 133.4808 55.77585 62.80657 47.73192 49.45046
156.1725 180.1991 140.9176 154.4564 52.42941 59.23824 50.94137 52.30773
259.1434 182.2966 128.5229 147.7823 70.36707 60.69811 48.14043 51.12225
5 D
231.1125 168.7579 148.1637 162.8466 62.91253 58.72377 51.55893 53.30563
157.3167 107.5474 119.5607 125.6626 53.56143 46.21285 45.59529 46.90532
99.72922 80.27917 96.67823 139.5828 43.15611 43.41191 47.08620 48.65203
115.7469 104.3057 100.6827 117.0817 47.62883 44.90282 46.13792 47.26708
92.86450 82.37672 84.09290 97.63167 41.00376 37.73510 41.66520 42.97523
5 E
95.72480 107.1660 91.14832 108.5008 42.90031 45.18965 41.84608 43.15611
102.5895 163.9907 158.4608 157.5073 43.59278 54.17899 51.14754 52.43228
149.1171 128.5229 147.7823 204.2256 49.94634 53.12189 50.57269 59.23824
137.2945 137.4852 168.7579 176.5760 46.83040 49.63134 54.50971 58.92844
187.8266 233.210 183.4408 166.8510 58.57105 65.27679 59.08552 54.38516
6 D
181.1525 157.5073 183.0594 175.8133 55.95099 50.01839 57.59461 54.25655
120.1327 116.1283 136.7225 100.4920 43.82712 44.57209 49.94347 46.13505
148.9264 121.6582 132.3367 134.6249 54.25391 45.51631 46.57460 50.50469
144.5406 170.0927 129.0950 138.6293 52.27957 57.52256 45.80720 51.81473
131.1926 196.7888 126.0440 141.6803 46.63093 57.33881 46.13792 49.30062
6 E
162.2745 147.4009 141.2990 100.6827 53.04984 49.47863 49.45046 45.29560
91.52969 121.4675 102.3988 123.9465 37.84116 45.06799 43.54316 46.90532
113.8401 152.5495 103.1616 150.8333 41.15360 51.15041 42.09782 50.76049
117.8445 135.7690 126.2347 114.2214 46.75548 49.73443 45.72941 43.00626
126.8068 99.53854 100.8733 159.2235 46.49968 40.02158 41.15360 50.68557
7 D
119.9420 128.7136 74.36787 141.4896 46.16609 49.40370 34.08897 50.09905
139.0107 160.9397 122.6116 67.12177 47.73192 40.6420 47.59374 33.18746
92.67381 134.4342 105.4498 87.52527 40.97272 47.55391 45.18965 34.34764
150.0706 110.9797 110.5984 78.56298 51.30313 45.36766 42.64164 35.47680
120.3234 103.1616 102.3988 93.05518 42.06375 42.10188 39.48181 41.33448
7 E
126.6161 134.2435 142.4431 70.17276 45.44258 50.09905 50.53573 36.78683
145.713 140.893 64.465 71.853 50.127 49.569 35.027 35.545
89.810 119.340 114.349 77.994 37.755 46.311 44.141 39.169
132.722 135.829 124.306 100.820 46.637 48.760 47.432 43.312
81.321 116.918 79.878 45.455 37.087 47.692 38.436 28.748
8 D
93.456 103.927 90.569 59.729 38.642 41.855 40.734 31.921
57.492 59.107 85.211 58.569 31.715 32.837 42.039 31.823
56.391 84.502 113.933 55.217 30.388 38.016 45.341 32.006
64.954 91.352 75.645 85.456 35.027 38.597 35.987 40.237
52.526 73.076 73.223 77.798 34.142 35.080 36.063 37.757
8 E
65.810 62.850 67.963 61.113 35.836 35.447 34.531 31.952
D, direito; E, esquerdo. Em cada secção
ABCD
está representada a avaliação de cinco fibras.
23
3.3.4 Quantificação da área e perímetro intraperineural total do NLR
(PONTO 2):
Para obter as medidas da área e perímetro do nervo no PONTO 2, as
imagens foram digitalizadas (10x); sendo avaliadas em quatro secções por
lâmina, bilateralmente (Ver Tabela 4). O procedimento utilizado para a aferição
destas medidas foi através do delineamento intraperineural do NLR, a partir
das imagens projetadas no computador (Figura 9). Com o software IPP 4.1 foi
possível estimar o valor da área e do perímetro intraperineural total do NLR. A
obtenção da área intraperineural foi necessária para o cálculo da densidade e
número total de fibras do nervo a partir de amostragem representativa. Ao final
obteve-se as medidas de 8 seções por nervo (PONTO 1 + PONTO 2).
3.3.5
Quantificação do número de fibras nervosas do NLR (PONTO 2):
As imagens do nervo foram digitalizadas a partir da objetiva de 40x.
Foram avaliados cinco campos por secção, com área representativa do campo
de 1860 µm
2
(Ver Tabela 4); os campos foram sobrepostos no centro da
imagem; parte superior esquerda; superior direita; inferior esquerda e inferior
direita da área intraperineural do NLR. Para evitar erro de amostragem, foram
excluídas as fibras projetadas sobre as linhas inferior e direita que delimitavam
o campo (Figura 10). Conhecendo a área intraperineural total obtida com a
soma dos campos (PONTO 1 + PONTO 2) obteve-se um total de 36 campos
avaliados por nervo, a partir desta avaliação foi estimada a densidade e o
número total de fibras do NLR.
24
3.3.6 Quantificação da área e perímetro das fibras nervosas do NLR
(PONTO 2):
Para obter as medidas da área e do perímetro das fibras nervosas, as
imagens foram digitalizadas para o computador a partir da objetiva de 40x;
sendo avaliadas cinco fibras por secção (Ver Tabela 5). Foram escolhidas para
a avaliação das medidas as fibras situadas em pontos onde não haviam sido
avaliadas no PONTO 1 (próximo ao centro; na parte superior esquerda;
superior direita; inferior esquerda e inferior direita) (Figura 11). O procedimento
utilizado para a aferição destas medidas foi através do delineamento das fibras
nas imagens projetadas no computador. A partir das fibras aferidas nos dois
pontos (PONTO 1 + PONTO 2), obteve-se uma avaliação de 40 fibras por
nervo.
25
Figura 9 – Delineamento
(círculo vermelho)
intraperineural para obtenção
da área e perímetro
intraperineural do NLR (PONTO
2). Aumento de 10x.
Figura 10 – Cada quadrante
(vermelho) representa um
campo com área de 1860 µm
2
,
usado para quantificar o
número de fibras nervosas
(PONTO 2). Aumento de 40x.
Figura 11 - Delineamento de
cinco fibras (círculos vermelhos)
para obtenção da área e
perímetro das fibras nervosas
do NLR (PONTO 2). Aumento
de 40x.
26
Tabela 4 – Área, perímetro intraperineural e número de fibras do NLR (PONTO 2) nos oito indivíduos da
amostra, através do Programa Image Pro-Plus 4.1.
Área intraperineural (μm
2
) Perímetro intraperineural (μm) Número de fibras
Secção
(NLR)
A B C D A B C D A B C D
1 D
124626.7
122842
171390.2
178244.8
1373.927
1388.173
1675.909
1715.858
Q1 13
Q2 13
Q3 17
Q4 15
Q5 15
Q1 11
Q2 12
Q3 10
Q4 11
Q5 13
Q1 9
Q2 10
Q3 13
Q4 10
Q5 10
Q1 12
Q2 9
Q3 10
Q4 11
Q5 9
1 E
89322.74
101626
101952
104706.6
1208.980
1300.893
1330.305
1334.883
Q1 12
Q2 7
Q3 10
Q4 8
Q5 9
Q1 10
Q2 11
Q3 11
Q4 14
Q5 15
Q1 14
Q2 11
Q3 10
Q4 7
Q5 10
Q1 13
Q2 14
Q3 12
Q4 11
Q5 12
2 D
132049.7
138833
140287.9
140789.4
1471.042
1445.534
1463.168
1440.836
Q1 12
Q2 13
Q3 13
Q4 11
Q5 12
Q1 12
Q2 11
Q3 9
Q4 11
Q5 13
Q1 13
Q2 10
Q3 11
Q4 12
Q5 9
Q1 10
Q2 8
Q3 9
Q4 10
Q5 9
2 E
160170.7
146354.5
132015.2
135197.1
1634.701
1526.911
1504.272
1475.905
Q1 14
Q2 10
Q3 12
Q4 12
Q5 10
Q1 11
Q2 12
Q3 9
Q4 12
Q5 11
Q1 12
Q2 10
Q3 12
Q4 14
Q5 8
Q1 15
Q2 10
Q3 13
Q4 12
Q5 11
3 D
81660.07
75994.16
71635.56
77251.23
1196.433
1198.831
1157.540
1194.824
Q1 14
Q2 15
Q3 12
Q4 15
Q5 12
Q1 12
Q2 14
Q3 13
Q4 14
Q5 14
Q1 12
Q2 10
Q3 12
Q4 13
Q5 12
Q1 15
Q2 13
Q3 13
Q4 13
Q5 12
3 E
142209.1
175528.5
177215.2
176345.7
1654.982
1678.283
1708.035
1684.973
Q1 14
Q2 13
Q3 11
Q4 13
Q5 12
Q1 11
Q2 12
Q3 10
Q4 11
Q5 11
Q1 12
Q2 14
Q3 10
Q4 12
Q5 11
Q1 9
Q2 11
Q3 12
Q4 9
Q5 10
4 D
70016.95
67752.41
68875.38
70323.90
1055.158
1061.720
1020.977
1076.161
Q1 16
Q2 15
Q3 17
Q4 19
Q5 18
Q1 18
Q2 15
Q3 18
Q4 17
Q5 18
Q1 18
Q2 18
Q3 18
Q4 19
Q5 18
Q1 20
Q2 21
Q3 15
Q4 20
Q5 20
4 E
90673.95
91999.85
86272.23
92089.24
1212.073
1202.817
1186.107
1217.274
Q1 13
Q2 16
Q3 15
Q4 17
Q5 15
Q1 17
Q2 16
Q3 15
Q4 15
Q5 14
Q1 19
Q2 16
Q3 15
Q4 14
Q5 15
Q1 21
Q2 18
Q3 15
Q4 18
Q5 14
5 D
100230.1
103844.7
102872
101947.6
1254.248
1259.054
1258.972
1254.987
Q1 19
Q2 14
Q3 16
Q4 17
Q5 18
Q1 15
Q2 16
Q3 18
Q4 20
Q5 15
Q1 15
Q2 16
Q3 19
Q4 16
Q5 15
Q1 15
Q2 16
Q3 13
Q4 14
Q5 12
5 E
67060.19
64962.96
63505.35
65131.86
1102.809
1075.626
1086.775
1081.490
Q1 17
Q2 15
Q3 17
Q4 17
Q5 18
Q1 19
Q2 18
Q3 18
Q4 19
Q5 18
Q1 19
Q2 15
Q3 18
Q4 16
Q5 16
Q1 19
Q2 17
Q3 16
Q4 14
Q5 17
6 D
89576.29
90427.52
91262.53
90519.29
1344.536
1282.430
1357.270
1312.240
Q1 20
Q2 15
Q3 17
Q4 20
Q5 20
Q1 16
Q2 16
Q3 16
Q4 18
Q5 14
Q1 16
Q2 17
Q3 15
Q4 16
Q5 15
Q1 14
Q2 13
Q3 17
Q4 19
Q5 15
6 E
115132.2
113566.2
117820.4
117531.3
1315.613
1418.462
1377.648
1360.139
Q1 13
Q2 12
Q3 10
Q4 11
Q5 15
Q1 12
Q2 11
Q3 13
Q4 11
Q5 9
Q1 13
Q2 15
Q3 16
Q4 12
Q5 13
Q1 9
Q2 11
Q3 9
Q4 11
Q5 9
7 D
129246
129802.5
133353
165983.8
1443.655
1487.092
1422.411
1692.741
Q1 17
Q2 13
Q3 14
Q4 13
Q5 16
Q1 12
Q2 14
Q3 13
Q4 12
Q5 15
Q1 17
Q2 16
Q3 18
Q4 15
Q5 14
Q1 9
Q2 15
Q3 12
Q4 8
Q5 12
7 E
100197.7
98912.94
99574.70
100491.6
1256.861
1220.359
1228.214
1252.992
Q1 16
Q2 16
Q3 17
Q4 13
Q5 14
Q1 18
Q2 19
Q3 13
Q4 15
Q5 14
Q1 14
Q2 14
Q3 14
Q4 16
Q5 15
Q1 13
Q2 17
Q3 13
Q4 15
Q5 14
8 D
27271.8
26772.5
26941.2
272453.8
2072.029
2071.590
2071.881
2103.259
Q1 12
Q2 10
Q3 11
Q4 13
Q5 12
Q1 12
Q2 11
Q3 16
Q4 10
Q5 11
Q1 13
Q2 12
Q3 10
Q4 14
Q5 14
Q1 13
Q2 9
Q3 8
Q4 16
Q5 15
8 E
85920.19
86154.75
86612.80
84788.11
1291.219
1300.340
1291.342
1273.286
Q1 14
Q2 13
Q3 14
Q4 16
Q5 15
Q1 18
Q2 16
Q3 13
Q4 12
Q5 21
Q1 18
Q2 17
Q3 18
Q4 16
Q5 15
Q1 16
Q2 16
Q3 13
Q4 19
Q5 20
D, direito; E, esquerdo. Avaliação da área e perímetro intraperineural através de quatro secções
ABCD
do NLR. Avaliação do número de fibras
através de cinco campos
Q12345
por secção. Cada campo representa 1860 μm
2
.
27
Tabela 5 – Valores obtidos para área e perímetro das fibras do NLR (PONTO 2) nos oito
indivíduos da amostra, através do Programa Image Pro-Plus 4.1.
Área das fibras (μm
2
) Perímetro das fibras (μm)
Secção
(NLR)
A B C D A B C D
77.138 72.856 124.233 99.376 34.035 34.862 44.510 41.672
84.893 58.520 123.425 120.905 37.864 27.961 46.460 43.469
80.147 106.226 142.288 97.272 36.689 43.218 46.981 39.109
65.884 60.795 60.819 81.248 35.447 32.361 30.571 35.965
1 D
24.195 44.941 135.658 76.550 18.662 26.893 41.755 35.934
131.695 58.813 96.489 117.236 44.927 30.853 39.138 43.042
135.046 56.660 85.823 125.480 44.595 29.566 37.188 43.763
72.024 36.526 82.006 103.538 32.862 25.276 37.279 40.446
181.823 73.272 67.474 107.425 53.069 36.718 33.872 39.806
1 E
116.795 84.081 79.951 98.765 44.767 35.404 35.688 38.256
82.031 111.535 69.431 64.832 35.907 44.324 32.707 34.325
130.863 96.343 104.538 76.379 46.740 40.329 42.686 35.671
70.850 76.722 105.444 83.988 33.009 35.751 38.365 35.619
72.098 92.648 82.471 115.597 32.846 39.947 35.252 42.826
2 D
81.884 69.407 80.979 92.869 38.680 34.035 36.247 39.048
57.639 75.474 51.488 84.673 30.875 34.025 27.280 38.696
109.187 91.817 91.083 75.401 41.147 39.080 40.072 37.366
90.716 67.963 95.083 64.563 35.022 32.859 41.013 33.042
117.823 82.128 84.550 77.333 42.523 38.899 38.124 36.709
2 E
97.835 63.095 76.771 74.789 41.703 29.762 35.728 36.796
79.266 85.358 54.116 61.700 36.157 37.996 30.853 32.806
122.006 73.933 95.486 111.804 44.036 34.184 40.313 41.391
64.636 61.774 122.373 37.211 34.683 34.083 45.024 24.498
42.495 124.379 87.829 106.398 26.049 46.385 37.777 40.928
3 D
63.731 71.657 103.829 73.174 31.485 35.673 40.061 36.557
25.590 90.177 100.030 87.266 20.690 37.994 36.783 38.673
106.642 112.025 63.608 93.333 39.709 41.851 32.124 39.165
43.327 67.792 84.844 75.278 24.818 34.600 34.225 33.619
83.083 70.312 125.113 87.364 36.455 33.429 44.400 34.667
3 E
134.802 99.474 59.988 116.967 44.078 42.372 31.315 42.883
62.238 115.988 69.920 51.327 33.592 43.701 36.774 30.464
66.593 52.966 89.492 102.924 36.300 35.080 40.054 45.868
84.135 100.477 65.884 76.232 38.673 41.122 36.073 38.597
67.694 85.064 93.823 68.917 34.888 38.696 43.075 38.209
4 D
94.581 75.719 95.070 58.618 39.815 37.033 43.205 32.395
82.985 104.465 54.043 53.211 41.887 43.290 31.380 30.075
77.456 57.419 73.272 54.605 36.980 31.639 36.720 31.400
59.303 55.926 62.361 57.174 33.181 32.891 33.592 31.876
74.520 33.492 40.416 66.397 36.354 25.879 26.871 34.692
4 E
91.083 45.309 43.743 45.480 47.120 29.427 28.954 29.266
110.728 108.893 74.716 109.064 44.769 45.533 38.597 43.366
132.600 93.847 102.606 100.771 47.035 39.353 43.754 42.535
118.606 125.358 125.480 124.918 46.849 49.019 47.110 51.575
88.710 100.648 99.621 43.988 39.634 42.449 41.770 28.931
5 D
79.193 77.333 62.850 121.199 37.896 37.400 32.998 46.668
69.700 70.679 72.587 64.318 35.652 37.713 37.163 36.019
57.786 65.223 62.801 80.807 35.706 39.719 39.094 42.427
47.510 70.410 68.355 86.924 36.202 37.346 39.169 42.472
87.535 61.774 67.914 69.749 43.127 38.025 36.980 38.414
5 E
54.972 51.205 70.410 47.731 36.408 33.203 38.597 31.510
103.119 80.024 69.945 93.896 42.794 40.787 35.782 40.215
94.752 111.364 87.119 95.706 41.596 46.052 39.558 41.596
112.074 83.890 85.554 91.817 43.160 38.673 38.048 39.612
102.875 120.612 104.416 118.973 47.745 47.562 44.143 45.426
6 D
99.572 123.964 95.340 103.462 39.504 49.935 40.917 43.419
103.853 128.954 69.798 120.710 44.724 49.859 37.194 46.472
91.768 126.948 101.896 75.278 41.046 49.720 42.794 36.667
78.434 99.401 64.758 111.902 35.965 38.673 32.891 45.480
77.969 91.303 140.698 139.474 36.537 42.845 50.451 51.499
6 E
82.593 94.777 113.713 142.019 37.346 40.237 44.219 51.358
113.933 152.367 174.802 128.269 44.871 52.460 56.236 49.309
217.689 110.704 155.181 98.373 62.148 43.227 54.574 39.719
182.337 123.817 168.514 184.955 57.045 51.705 53.852 60.906
140.208 146.985 157.236 127.874 49.148 55.016 53.086 44.843
7 D
131.450 141.652 166.337 150.826 47.531 51.153 56.732 50.194
94.092 101.431 110.214 90.862 40.841 39.482 48.197 42.566
82.716 143.413 60.306 71.731 38.696 50.011 33.128 37.713
83.376 103.804 59.523 89.492 40.215 41.641 31.693 39.590
78.141 118.924 132.673 68.281 38.436 45.815 49.989 35.264
7 E
59.939 86.581 93.113 95.804 33.203 39.277 39.395 40.993
79.242 196.918 82.495 144.685 37.420 59.731 37.087 49.224
111.242 169.004 95.486 332.919 44.617 50.637 41.122 75.070
114.275 114.178 149.652 176.123 44.217 44.326 50.161 55.059
335.855 155.719 211.940 138.447 74.047 53.528 62.039 49.828
8 D
83.327 183.707 136.710 177.273 38.383 54.144 49.591 54.252
72.098 94.312 89.395 71.290 37.789 41.122 41.402 40.993
117.480 105.664 118.435 103.829 45.059 42.901 45.502 43.995
68.355 75.890 95.535 72.660 38.544 36.957 40.939 36.848
82.398 119.340 109.187 72.196 38.673 48.188 44.617 35.545
8 E
89.321 132.967 74.960 111.095 39.040 47.819 37.194 44.823
D, direito; E, esquerdo. Em cada secção
ABCD
está representada a avaliação de cinco fibras.
28
4 ARTIGO
Editorial Manager(tm) for The Laryngoscope (ANEXO C)
Manuscript Draft
Manuscript Number:
Title: Histological asymmetry of the human recurrent laryngeal nerve
Article Type: Original Study
Section/Category: Voice
Keywords: Larynx, Recurrent Laryngeal Nerve, Phonation.
Corresponding Author: Dr Leder Leal Xavier, Ph.D
Corresponding Author's Institution: PUCRS
First Author: Deivis De Campos
Order of Authors: Deivis De Campos; Mariana F Rodrigues; Geraldo P
Jotz, M.D.; PhD; Leder Leal Xavier, Ph.D
Manuscript Region of Origin:
Abstract: Objectives/Hypothesis: Histological studies of the human recurrent
laryngeal nerves (RLNs) have described differences in fiber length and
thickness between the right and left RLNs. This asymmetry is probably involved
in the different times of arrival of the stimuli to the laryngeal musculature
controlled by each nerve. Histological and structural differences between the
right and left RLNs could explain the synchronicity of laryngeal musculature
contraction despite the differing nerve lengths. The purpose of this investigation
was to shed some light on this paradigm by obtaining estimates of some
morphometric parameters such as intraperineural area; intraperineural
perimeter; fiber area; fiber perimeter; fiber density (number of fibers/mm
2
) and
total number of nerve fibers in the right and left RLN of humans. Study Design:
29
Morphological study of human recurrent laryngeal nerves. Methods: The right
and left RLNs were studied in a total sample of eight human specimens
obtained from necropsies, this tissue was embedded and sectioned in paraffin
(10 μm) and stained with hematoxilin-eosin. The morphometric parameters
were measured in digitized images obtained from histological sections of the
distal part of the RLN (both sides) using Image Pro Plus Software 4.1. Results:
No statistical differences between the two RLNs were observed in the
intraperineural area; intraperineural perimeter; density (number of fibers/mm
2
)
and total number of fibers. However, the area and perimeter of fibers of the
right side were statistically larger when compared with the left side, 21 and
11%, respectively. Conclusions: The different time of arrival of the stimulus to
the laryngeal musculature controlled by the RLN, shown in previous
electrophysiological studies, could be partly explained by the morphological
findings of the present study.
30
Histological asymmetry of the human recurrent laryngeal nerve
Deivis de Campos
1
; Mariana Freitas Rodrigues
4
; Geraldo Pereira Jotz
1,2,3
;
Léder Leal Xavier
4
.
1
Programa de Pós Graduação em Neurociências, Instituto de Ciências Básicas
da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Sarmento
Leite 500, 90.050-170, Porto Alegre, RS, Brazil.
2
Departamento de Ciências Morfológicas, Instituto de Ciências Básicas da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Sarmento Leite
500, 90.050-170, Porto Alegre, RS, Brazil.
3
Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço – Faculdade de Medicina
– Universidade Luterana do Brasil, RS, Brazil. Avenida Farroupilha 8001,
92.425-900, Canoas, RS, Brazil.
4
Laboratório de Biologia Tecidual, Departamento de Ciências Morfofisiológicas,
Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul, Av. Ipiranga 6681, 90.610-000 Porto Alegre, RS, Brazil.
Footnotes to the title: Asymmetry of recurrent laryngeal nerve
Corresponding author: Dr. Léder Leal Xavier
Laboratório de Biologia Tecidual
Departamento de Ciências Morfofisiológicas
Faculdade de Biociências
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Av. Ipiranga, 6681
Porto Alegre/RS
90619-900 Brazil
Phone: +55(51)3320-3545
Fax: +55(51)3320-3612
E-mail: [email protected]
* Manuscript
31
INTRODUCTION
The recurrent laryngeal nerve (RLN) is a branch of the vagus nerve
which follows a long course through the thoracic cavity and neck, it is primarily
associated with motor innervations of the intrinsic laryngeal muscles,
1
responsible for breathing, voice production and airway protection during
swallowing.
2
The right and left RLNs display asymmetric lengths. In men, the average
length of the left nerve is 43 cm while that of the right nerve is 32 cm, giving an
average difference of 11 cm, although the range extends from 5.7 to 15 cm.
3
This asymmetry between the lengths of the RLNs also occurs in other animal
species.
4,5
This asymmetry is arises because the right and left RLNs take different
routes to the larynx, the left RLN travels with the vagus nerve until its branching
point near the aortic arch in the thoracic cavity. After looping under the aortic
arch, it ascends along the tracheo-oesophageal crease towards the larynx. The
right RLN does not descend as far inferiorly as the left RLN. It branches from
the vagus in the thoracic cavity near the subclavian artery. After looping around
the subclavian artery, the right RLN travels towards the larynx along the
tracheo-oesophageal groove.
6
When the right and left RLNs are compared, the differences in
parameters such as length and route to the larynx are well described, however,
for some aspects such as the synchronicity of laryngeal musculature
contraction there is little information available and some findings are
controversial. One previous study showed that the arrival of motor impulses is
32
simultaneous in both sides of the laryngeal musculature
4
while other studies
have shown a difference in this parameter between the right and left RLN.
3,7,8
The answer to this question, whether the conduction of RLN is
symmetric or asymmetric, could lie in, a possible difference between the right
and left RLNs in terms of the nerve impulse conduction, any such difference
would certainly be related to parameters such as nerve fiber length and
diameter. Thus, the study of some histological/morphometric parameters of this
nerve would be very important to the elucidation of this paradigm.
Furthermore, this nerve is clinically important, as it is easily damaged by
trauma resulting from surgical procedures to the neck, trachea, oesophagus, or
heart, so producing voice alterations, dysphagy and dyspnea.
9
The aim of our study was to analyze some morphometric parameters:
intraperineural area; intraperineural perimeter; fiber area; fiber perimeter; fiber
density (number of fibers/mm
2
) and total number of fibers, that are involved in
the intensity and velocity of nerve conduction in the right and left RLNs in
humans. In addition, a correlation was made between these morphometric
measurements and other parameters of the subjects [Age, Weight, Height and
Body Mass Index (BMI)].
MATERIALS AND METHODS
Human tissue
All the nerves analyzed were obtained in the Department of Legal
Medicine from necropsies of eight males. The age, weight, height and body
mass index (BMI) of the subjects are presented in Table I. This study was
33
approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, RS - Brazil.
Histology
The dissection of the RLN extended deeply towards the point where it
enters the larynx (cricothyroid joint). The segments of RLN used in our
histological analysis were obtained 1 and 2 cm below the cricothyroid joint (Fig.
1). These segments were fixed in a Bouin solution [picric acid (71.5%) - acetic
acid (4.8%) - formalin (23.8%)] for 24 hours, they were embedded in paraffin
wax and sectioned (10 μm, with intervals of 100 μm) using a microtome (Leica),
the sections were mounted onto slides, deparaffinized with xylene, rehydrated,
and stained with hematoxylin-eosin (HE), washed in water, dehydrated in a
graded series of ethanol, cleared with xylene, covered with Entellan and
coverslips. At least four sections were obtained from each segment and
analyzed.
Morphometric measurements
Digitized images of the RLN sections were obtained using an Olympus
BX 50 microscope (10x and 40x) coupled to a video camera (Leica DC 300F)
interfaced by Leica Image 50 (IM50) software. The images obtained were
measured using Image Pro Plus Software (Image Pro-Plus 4.1, Media
Cybernetics, Silver Spring, USA).
The digitized images of the RLN (10x) were displayed onto a high-
resolution video monitor. The nerve fiber density (number of fibers/mm
2
) was
estimated using a previously described protocol of planar morphometry.
10
Briefly, five squares, named areas of interest (AOI) measuring 1860 μm
2
were
34
overlaid onto each obtained image, the fibers located inside this square or
intersected by the upper and/or left edge of the AOI were counted, the fibers
intersected by the lower and/or right edge of the AOI were not counted. The
fiber density was obtained using the following equation: Fiber density = (total
number of fibers counted /AOI area X total number of AOIs). To estimate the
intraperineural area and perimeter, the digitized images of the sections were
outlined and the corresponding parameters were measured (8 images for each
nerve). To estimate the fiber area and perimeter, the same delineation
procedure was carried out in the fibers previously counted within the AOIs (Fig.
2A-F). The total number of fibers in each nerve was estimated by multiplying
the fiber density by the total intraperineural area.
Since the tissue shrinkage factor caused by the fixation and paraffin wax
embedding procedures could not be calculated,
11
in our study the area,
perimeter and fiber density were not expressed in micrometers. The results
were expressed as a percentage of the right nerve that was considered to be
100%. The calculation of total number of nerve fibers is not affected by the
tissue shrinkage, thus it is expressed in numbers of nerve fibers/nerve.
Statistical analysis
The statistical analysis was performed using the GraphPad Prism 4.0
Software. The comparisons between the right and left RLNs from each subject
were performed using a paired t test, (p < 0.05). To analyze the correlation
between the morphometric measurements (intraperineural area, intraperineural
perimeter, fiber area, fiber perimeter, neuronal density and total number of
fibers) with other parameters of the subjects [Age, Weight, Height and Body
35
Mass Index (BMI)] the Pearson's correlation coefficient was calculated (p <
0.05).
RESULTS
In all the histological sections, the qualitative analysis of the collected
nerves demonstrates that the RLN presents a significant amount of
epineurium/adipose (Fig. 2.AB).
With the use of HE staining the measured fibers were seen to have well
defined boundaries. In all analyzed sections it was possible to visualize the
variable caliber of the RLN fibers (Fig. 2.CDEF).
Quantitative comparison of the total intraperineural area demonstrated
no statistically significant difference between the right and left nerves,
(p=0.268) (Fig. 3A). Similarly, there was no significant difference in the
intraperineural perimeter (p=0.536) (Fig. 3B).
Measurement of the fiber area demonstrated the existence of a
significant difference between the right and left RLNs. The fiber area in the right
nerve was found to be 21% larger than that on the left nerve (p=0.0023) (Fig.
3C). There was also a significant difference between the fiber perimeter of the
right and left nerves, the latter being found to be 11% smaller (p=0.0009) (Fig.
3D).
Measurement of the fiber density in the right and left RLN showed no
statistically significant difference (p=0.062) (Fig. 3E).
The mean total number of nerve fibers in the right RLN was 795.8 + 37.6
fibers/nerve, and for the left RLN it was 1204.8 + 49.3 fibers/nerve. This
difference was not statistically significant (p=0.158) (Fig. 3F).
36
The values of Pearson's correlation coefficient are presented in Table II.
The intraperineural perimeter of left RLN was positively correlated with BMI.
The fiber area and perimeter of right RLN is correlated with weight and BMI.
DISCUSSION
In the nerves collected for the present study, large portions of
epineurium and adipose tissue were found in the distal part of the RLNs. This
may result from the need for additional protection for the nerve within the
laryngeal region. Extra padding surrounding the RLN could help to prevent
damage resulting from, for example: blows to the neck; compression and
elongation related to movements of the head such as flexion, extension and
rotational movements and the elevation and depression that occur during
swallowing and voice production.
12
Although there is little evidence of blood vessels in the histological
images obtained in the present study some blood vessels were seen together
with the adipose tissue, which may represent ramifications of the inferior thyroid
artery.
13
The variation in the caliber of the RLN fibers found in our study is
consistent with other studies performed in humans, and confirms that the
human RLN contains fibers of various calibers, thus characterizing it as a mixed
nerve.
14
Our study is the first that carried out in a well delimitated region of RLN,
this precaution was taken to avoid misleading results. Previous investigations
into nerve fiber density and diameter of RLNs, in both, humans and animals,
have produced varying results. These results may indicate differences between
37
individuals within species or, more probably, a failure to section nerves at a
specified position. It has been demonstrated that the numbers of both bundles
and individual fibers depend upon the level at which sectioning is carried out.
Moreover, this information lacking in many reports.
4
Evidence has been
produced to show that the topography of the RLN is different depending on the
location at which the section is made. Close to the insertion point of the RLN
into the larynx, the topography was more uniform, while sections taken
proximally revealed compartments comprising myelinated fibers of varying
diameter size.
14
Physiological evidence is in accordance with this
morphological differences in different portions of RLN. For example, differences
in the velocity of conduction was found between distal and proximal portions of
human RLN, distal conduction velocity was approximately 30 m/sec, while that
of the proximal portion was approximately 65 m/sec.
15
The main result found in our study is the significant difference in fiber
area and perimeter between the right and left human RLN. A similar result was
poorly described in a study involving RLN fiber analysis in humans, it was
reported that the right RLN had fewer large fibers than the left in sections taken
6 and 9 cm below the lower border of the cricoid.
16
Another study suggests that
in humans and giraffes, the left RLN contains more large, fast-conducting
fibers.
4
In rats, no difference was found in the number of myelinated fibers
between the right and left RLNs. However, the myelinated fibers of the right
RLN were statistically larger in diameter than the fibers of the left RLN.
5
In
horses, it was reported that the total number of fibers, mean fiber diameter and
percentage of thickest fibers for the left RLN were significantly lower than those
of the right RLN.
17
In fact, all these previous studies are in accordance, at least
in part, with the results found in the present study.
38
CONCLUSION
To our knowledge, the present study represents the first complete light-
microscopic study of the human RLN using planar morphometry in a well
defined region of this nerve, and as such contributes towards enhancing our
understanding of phonation in general. The results of the present study seem to
be consistent with those obtained in previous investigations involving both
human
7
and animal
5,8,17
RLNs. It is interesting that the left RLN presents a slight
delay in the impulse when compared to the right RLN,
7,8
probably because the
left RLN is longer. However, probably this longer latency in the left RLN cannot
be explained only by its longer length, but also by the reduced fiber area in
comparison with the right RLN, reported in our study.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Márcia Goetze and Edson Fiedler A. Jr., for their assistance
with the histological procedures. This work was supported by CNPq and
CAPES.
39
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42
Figure Legends
Fig. 1. Schematic representation showing the region of the RLN that was
studied in different sections (A to H), bilaterally. Legends: L, larynx; W,
windpipe.
Fig. 2. Digitized images of sections of the RLN. A, B – Images of intraperineural
area estimation; C,D – Area of interest used to estimate fiber density and total
number fibers; E,F - Images of fiber area and perimeter estimation. Legends:
Fiber inclusion (•) and exclusion (X) in study. C, collagen fibrils; AT, adipose
tissue; BV, blood vessel; AOI, area of interest.
Fig. 3. Comparison of intraperineural area (A); intraperineural perimeter (B);
area (C); perimeter (D); density (E) and total number (F) of fibers between the
right (R) and the left (L) RLN. Legends: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
Table I. Table showing the parameters of the subjects. Race, Age, Weight and
Height, Body Mass Index (BMI), period between death and the collection of the
fragment (∆t) and Cause of Death.
Table II. The Pearson correlation coefficient (r) between the parameters, the
significant correlation is presented in bold. Legend: R= Right RLN; L= Left RLN;
BMI= Body Mass Index; NS= Not significant; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
A
B
C
D
43
Figure 1
A
B
C
D
1cm
1cm
L
RLN
Right
RLN
Left
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
100
μ
m
W
E
F
G
H
44
A
Mean Intraperineural Area=100%
Mean Perimeter Area=100%
BV
AT
C
B
Mean Intraperineural Area=138%
Mean Perimeter Area=93%
C
100μm
100μm
Right RLN Left RLN
C
30μm
x
x
Fibers Density=100%
AOI=1860 μm
2
xx
x
x
x
x
D
30μm
x
x
Fibers Density=127,7%
AOI=1860 μm
2
x
x
x
x
x
x
x
x
x
A
Mean Intraperineural Area=100%
Mean Perimeter Area=100%
BV
AT
C
B
Mean Intraperineural Area=138%
Mean Perimeter Area=93%
C
100μm
100μm
Right RLN Left RLN
C
30μm
x
x
Fibers Density=100%
AOI=1860 μm
2
xx
x
x
x
x
D
30μm
x
x
Fibers Density=127,7%
AOI=1860 μm
2
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Figure 2
45
Intraperineural Area (IA)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
RL
IA (%)
Number of Fibers (NF)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
RL
Estimated NF / Nerve
Intraperineural Perimeter (IP)
0
20
40
60
80
100
120
RL
IP (%)
Fiber Area (FA)
0
20
40
60
80
100
120
RL
FA (%)
*
*
Fibers Density (FD)
0
20
40
60
80
10 0
12 0
14 0
RL
FD (%)
Fiber Perimeter (FP)
80
85
90
95
100
105
110
R L
FP (%)
***
EF
DC
AB
Intraperineural Area (IA)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
RL
IA (%)
Number of Fibers (NF)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
RL
Estimated NF / Nerve
Intraperineural Perimeter (IP)
0
20
40
60
80
100
120
RL
IP (%)
Fiber Area (FA)
0
20
40
60
80
100
120
RL
FA (%)
*
*
Fibers Density (FD)
0
20
40
60
80
10 0
12 0
14 0
RL
FD (%)
Fiber Perimeter (FP)
80
85
90
95
100
105
110
R L
FP (%)
***
EF
DC
AB
Figure 3
46
TABLE I
Subjects Race Age
Weight (Kg)
Height (m)
BMI (Kg/m
2
)
Δt (minutes)
Cause of the Death
1 White 47 42
1,65
15,44 195 Sudem death
2 Black 21 95 1,78 30,06 255 Gunshot
3 White 37 78 1,64 29,10 255 Sudem death
4 White 43 63 1,77 20,12 525 Hepatic carcinoma
5 White 67 72 1,72 24,40 760 Coronary thrombosis
6 White 82 72 1,74 23,78 465 Sudem death
7 White 45 63 1,63 23,71 350 Multiple trauma
8 Black 30 80 1,84 23,66 708 Gunshot
Total - 48,85+
19,98 70,62+15,47 172,12+7,58 23,78+4,64 439,12+213,35 -
47
TABLE II
Age Weight Height BMI
Intraperineural
area (R)
r=-0.445
p=NS
r=0.2414
p=NS
r=0.5065
p=NS
r=0.013
p=NS
Intraperineural
area (L)
r=-0.278
p=NS
r=0.5691
p=NS
r=0.2545
p=NS
r=0.53
p=NS
Intraperineural
perimeter (R)
r=0.017
p=NS
r=0.2334
p=NS
r=0.5385
p=NS
r=-0.01
p=NS
Intraperineural
perimeter (L)
r=-0.21
p=NS
r=0.6391
p=NS
r=-0.0144
p=NS
r=0.76
p=0.02*
Fiber area (R)
r=-0.27
p=NS
r=0.7902
p=0.0196*
r=0.0801
p=NS
r=0.84
p=0.007**
Fiber area (L)
r=-0.085
p=NS
r=0.3603
p=NS
r=-0.241
p=NS
r=0.50
p=NS
Fiber perimeter
(R)
r=-0.049
p=NS
r=0.8023
p=0.0166*
r=0.1422
p=NS
r=0.84
p=0.008**
Fiber perimeter
(L)
r=0.1948
p=NS
r=0.4315
p=NS
r=-0.1521
p=NS
r=0.55
p=NS
Fiber density (R)
r=0.49
p=NS
r=-0.2889
p=NS
r=0.3153
p=NS
r=-0.43
p=NS
Fiber density (L)
r=-0.14
p=NS
r=0.0569
p=NS
r=0.5878
p=NS
r=-0.19
p=NS
Total number of
fibers (R)
r=-0.29
p=NS
r=-0.2889
p=NS
r=0.3153
p=NS
r=-0.09
p=NS
Total number of
fibers (L)
r=-0.28
p=NS
r=0.0569
p=NS
r=0.5878
p=NS
r=0.43
p=NS
48
5 CONCLUSÕES
Os dados apresentados neste estudo mostram uma evidente assimetria
entre os nervos laríngeos recorrentes direito e esquerdo; tanto em seu
comprimento médio, quanto na área e perímetro total das fibras nervosas que
os compõem. Frente a estes resultados, pode-se presumir que a velocidade de
condução do impulso nervoso em ambos os nervos é diferente; pois não há
nenhum indício morfológico que permita que ambos os nervos tenham
velocidades iguais. Estes dados provêm evidências de que o nervo esquerdo
deva apresentar um leve retardo em sua velocidade de condução do impulso
elétrico, quando comparado ao nervo direito.
Não houve correlações significativas entre a idade e altura dos
indivíduos que compõem a amostra, com os parâmetros morfométricos de
ambos os lados. Entretanto, observou-se uma correlação positiva entre o peso
dos indivíduos e a área e perímetro das fibras nervosas do lado direito,
mostrando-se significativa, ou seja, à medida que o peso aumenta a área e o
perímetro das fibras do lado direito também aumentam.
A correlação entre o Índice de Massa Corporal e os demais parâmetros
morfométricos, mostrou-se somente significativa para o perímetro
intraperineural do lado esquerdo e a área e perímetro das fibras do lado direito;
sendo todas elas também positivas.
49
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54
SKINNER, H. A. The origin of medical terms. 2.ed. Baltimore, Williams, Wilkins,
1961. 313 p.
SOBOTTA, J. Atlas de Anatomia Humana. 21ª ed. Volume 1. Rio de Janeiro:
Editora Guanabara Koogan, 2000. 405 p.
SUNDERLAND, S.; SWANEY, W. E. The intraneural topography of the
recurrent nerve in man. Anatomical Record. 114:411-426, 1952.
THOMUSCH, O.; SEKULLA, C.; TIMMERMANN, W.; NEUMANN, H. J.;
KRUSE, E.; MUHLIG, H. P.; HAMELMANN W. H.; RICHTER, C.; VO, J.;
DRALLE, H. Intraoperative neuromonitoring in thyroid surgery – results of
the German prospective multicentre study. Eur Surg. 35:240-245, 2003.
TIAGO, R. S. L.; MUNHOZ, M. S. L.; FARIA, F. P., GUILHERME, A. Aspectos
histomorfométricos do nervo laríngeo superior. Revista Brasileira de
Otorrinolaringologia. 68 (2):157-165, 2002.
VESALIUS, Andreas. De humani corporis fabrica: epítome: tabulae sex. São
Paulo: Ateliê Editorial, 2002. 262 p.
WILLIAMS, P. L.; WARWICK, R.; DYSON, M.; BANNISTER H. L. Gray
55
Anatomia. 37 ed. Volume 2. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1995.
1489 p.
ZEMLIN, W.R. Princípios de Anatomia e Fisiologia em Fonoaudiologia. 4ª ed.
Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2000. 624 p.
56
ANEXOS
57
ANEXO A
58
ANEXO B
INSTITUTO GERAL DE PERÍCIAS – DEPARTAMENTO MÉDICO-LEGAL
CONSETIMENTO LEGAL / TERMO DE COMPROMISSO
Data: ___/___/___
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
I. A complexa inervação da laringe, aliada as dificuldades na comprovação
funcional dos ramos nervosos para a laringe, tem motivado o surgimento de
um vasto número de pesquisas, especialmente àquelas relacionadas ao nervo
laríngeo recorrente, definido na literatura como um dos mais importantes
ramos do nervo Vago. Sabe-se que lesões do nervo laríngeo recorrente
acarretam modificações do comportamento vocal (disfonias) e do processo de
deglutição (disfagia), observados na Clínica Otorrinolaringológica e de Cirurgia
de Cabeça e Pescoço. Considerando a importância deste nervo no que se
refere ao controle do mecanismo da fonação, propusemo-nos a realizar este
trabalho, que tem por objetivo estudar a morfometria do nervo laríngeo
recorrente bilateralmente, em cadáveres humanos. O uso de tecidos humanos
permite a detecção de alterações inerentes ao processo de envelhecimento,
que não podem ser detectadas quando se utiliza modelos animais com período
de sobrevida relativamente curto (ratos).
A importância de buscar conhecer melhor a morfometria do nervo laríngeo
recorrente, está em procurar compreender melhor seus aspectos funcionais
desempenhados sobre a laringe e, também, poder planejar com mais
segurança atos cirúrgicos próximos a esta via nervosa.
II. Para este estudo, estudar-se-ão 20 (vinte) cadáveres humanos do sexo
masculino, com idade superior a 18 anos, com menos de 24 horas de pós-
mortem, e que tenham sofrido óbito por causas extracervicais. Os
procedimentos experimentais exigirão a retirada de material biológico (será
extraído um segmento de 1 (um) centímetro do nervo laríngeo recorrente, na
altura da 1ª, 2ª e 3ª cartilagens traqueais, bilateralmente), para análise
histológica. Salientando que a coleta do material não provocará
desfiguramento no cadáver. Não haverá alteração no plano de dissecção da
necropsia e nem no tempo de devolução do individuo para seus familiares.
III. Todos os procedimentos serão realizados na sala de necropsia do
Departamento Médico Legal (DML) de Porto Alegre / RS.
IV. Este projeto não apresenta patrocinadores.
Pelo presente Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, declaro que,
eu Dr. Franscisco Silveira Benfica, Chefe da Seção de Ensino e Pesquisa –
DML, na condição de responsável legal pelas pesquisas no Departamento
Médico Legal, autorizo a realização dos procedimentos relacionados a este
projeto de pesquisa nos corpos sob nossa responsabilidade, dentro dos
preceitos éticos da Legislação Vigente.
Fui igualmente informado:
• da garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou
esclarecimento a qualquer dúvida acerca dos procedimentos, riscos,
benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa;
• da liberdade de retirar meu consentimento, a qualquer momento, e
excluir ente indivíduo sob minha responsabilidade legal da
participação neste estudo;
59
• da garantia de que o indivíduo sob minha responsabilidade legal não
será identificado quando da divulgação dos resultados e que as
informações obtidas serão utilizadas para fins científicos vinculados ao
presente projeto de pesquisa;
• de que se existirem gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo
orçamento da pesquisa.
O pesquisador Responsável por este Projeto de Pesquisa: “Avaliação
Morfométrica do Nervo Laríngeo Recorrente em Humanos” é o Prof. Dr.
Geraldo Pereira Jotz, CRM 17270, tendo este documento sido revisado e
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa dessa Instituição em
___/___/___. Os telefones de contato do referido pesquisador são: 51-
33163146 / 81239869
_____________________
Dr. Franscisco S. Benfica Prof. Dr. Geraldo Pereira Jotz
Chefe da Seção de Ensino e Pesquisa – DML Pesquisador
(data: ___/___/___)
Observação: o presente documento, baseado no item IV das Diretrizes e
Normas Regulamentadoras para a Pesquisa em Saúde, do Conselho
Nacional de Saúde (Resolução 196/96), será assinado em duas vias, de
igual teor, ficando uma via em poder do DML e outra com o Pesquisador
Responsável.
60
ANEXO C
Livros Grátis
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