( PDF ) Estudo da atividade antitumoral do ácido 3B-acetil tormêntico

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Gleice da Graça Rocha

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE

TRITERPENOS ISOLADOS DA

CECROPIA LYRATILOBA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFISICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2008

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ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TRITERPENOS ISOLADOS DA

CECROPIA LYRATILOBA

Autor: Gleice da Graça Rocha

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF),

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título

de Mestre em Ciências biológicas (Biofísica)

Orientador: Cerli Rocha Gattass

Rio de Janeiro

Fevereiro, 2008

Os dados experimentais desta dissertação foram obtidos no laboratório de

Imunologia Celular do Instituto de Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF),

Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro com apoio

financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq).

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FICHA CATALOGRÁFICA

Rocha, Gleice da Graça

Estudo da atividade antitumoral de triterpenos isolados da Cecropia

lyratiloba / Gleice da Graça Rocha. - 2008.

xv, 9

6 f: il.; 29,7cm.

issertação (mestrado) – UFRJ. / IBCCF / Programa de Pós graduação

em Ciências Biológicas (Biofísica), Rio de Janeiro, 2008

Orientador: Cerli Rocha Gattass.

Referências Bibliográficas: f 72-8

. Ácido 3β-acetil tormêntico. 2. Leucemia. 3. Apoptose. 4. Tri

terpenos.

I. Gattass, Cerli Rocha. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós graduação

em Ciências Biológicas (Biofísica). III. Estudo da atividade antitumoral

de triterpenos isolados da Cecropia lyratiloba.

iii

Dedico esta dissertação aos meus amados pais

Sonia Maria Cordeiro da Graça e José Gabriel Rocha

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelas bênçãos e pelo conforto nos momentos de dificuldades, que não

foram poucos.

A cada pessoa que está na minha vida e no meu coração, como amigo, porque

é colaboradora ativa na elaboração desta dissertação.

Tendo agradecido a todos, destaco amigos e companheiros mais diretamente

envolvidos nesta jornada.

À minha orientadora Cerli Rocha Gattass por acreditar em mim e me dar todo o

suporte na produção desta dissertação.

À Alyne (Lindinha) e à Deise por me ensinar os primeiros passos dentro do

laboratório de Imunologia Celular.

À Janaína, pelas sugestões que muitas vezes direcionaram os rumos desse

trabalho e pela alegria e empolgação contagiantes.

À Marisol, “minha estagiaria”, pelo companheirismo e dedicação ao nosso

trabalho. Que ele possa render muitos frutos...

À Kelly. Passamos por muita coisa juntas e apesar dos problemas, você

sempre será minha madrinha...

Ao Adonis por sempre está disposto a ouvir os desabafos... Ah, e também

pelas músicas!

Ao Lindomar. Sem ele o laboratório pára.

Em fim, a todos os amigos do Laboratório de Imunologia Celular, pelo respeito

e carinho durante estes anos de esforço.

À professora Viviam Rumjanek pelas discussões férteis.

Ao Tião pela compreensão nas doações de garrafinhas de células.

Ao laboratório de Imunologia Tumoral pela ajuda com os reagentes e

protocolos.

A minha revisora, professora Glória pela ajuda e sugestões.

À Sandrinha, sempre atenciosa e solícita comigo.

À minha irmã, Ana Lúcia pelo incentivo, amor e carinho.

Ao meu esposo, Ed Carlos, pela compreensão, incentivo e amor sem os quais

não conseguiria vencer mais esse desafio.

RESUMO

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TRITERPENOS ISOLADOS DA

CECROPIA LYRATILOBA

Autor: Gleice da Graça Rocha

Orientador: Cerli Rocha Gattass.

Resumo da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

(IBCCF), Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Ciências biológicas (Biofísica)

Apesar dos avanços tecnológicos o tratamento do câncer ainda constitui um

desafio e a taxa de mortalidade por essa doença é muito alta. A presença do

fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR), caracterizado pela resistência do

tumor a diversos quimioterápicos estrutural e funcionalmente diferentes, tem sido

apontada como uma das principais causas da falha quimioterápica no câncer. Por

esse motivo, há uma busca constante por quimioterápicos mais eficientes, capazes

de controlar a evolução da doença e aumentar a expectativa de vida dos pacientes.

Esse projeto visa contribuir para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos

através do estudo da atividade anti-neoplásica de triterpenos isolados de Cecropia

lyratiloba, uma planta da flora brasileira popularmente conhecida como Embaúba. A

atividade de três triterpenos isolados dessa planta, os ácidos euscáfico (AE),

tormêntico (AT) e 3β-acetil tormêntico (AT3) foi avaliada em linhagens de leucemias

mielóide crônica sensível e resistente a múltiplas drogas (MDR). Todas as

substâncias inibiram a viabilidade celular de ambas as linhagens de maneira dose

dependente. Além disso, os IC

calculados demonstraram que esses triterpenos

possuem potencial citotóxico semelhante. O ácido 3β-acetil tormêntico (AT3) induziu

a apoptose em células da linhagem MDR. Esse efeito foi mediado pela via

mitocondrial e involveu aliberação de citocromo c e a ativação de caspase-3. Além

disso, o AT3 não alterou a atividade da proteína MDR, glicoproteína-P (Pgp)

indicando que esse composto não é substrato para essa proteina. Assim, esse

estudo apresenta o 3β-acetil tormêntico como um candidato potencial para o

tratamento de leucemias, incluindo aquelas que apresentam o fenótipo MDR

mediado pela superexpressão da Pgp.

Palavras-chave: Triterpenos; 3

β-acetil tormêntico; Leucemia; Apoptose;

vii

ABSTRACT

STUDY OF ANTITUMOR ACTIVITY OF TRITERPENES ISOLATED FROM

CECROPIA LYRATILOBA.

Autor: Gleice da Graça Rocha

Orientador: Cerli Rocha Gattass.

Abstract da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

(IBCCF), Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Ciências biológicas (Biofísica).

Despite technological advances, the treatment of cancer is still a challenge and

the rate of mortalitity due to this disease is very high. Presence of the multidrug

resistance phenotype (MDR), characterized by tumor resistance to several

chemotherapic structural and functionally different, has been suggested as one of the

main causes of chemotherapic failure in cancer. For this reason, there is a constant

search for more efficient compounds, capable to control the evolution of the illness

and to increase the patients’ life expectation. This project aims to contribute for the

development of new drug candidates through the study of the antitumor activity of

triterpenes isolated from Cecropia lyratiloba, a plant of the Brazilian flora, popularly

known as Embaúba. The activity of three triterpenes isolated from this plant,

Euscaphic acid (EA), Tormentic acid (TA) and 3β-acethyl tormentic acid (3ATA) was

evaluated on sensitive and MDR-resistant leukemia cell lines. They had been

evaluated against sensitive and multidrug resistant leukemic cell lines. All substances

inhibited the viability of the cell lines in a dose dependent way. Moreover, the

calculated IC

demonstrated that these triterpenes have a similar cytotoxic potential.

3β-acethyl tormentic acid (3ATA) induced apoptosis of the MDR cell line. This

process is mediated by the mitochondrial pathway, involved cytochrome c release

and activation of caspase-3. Moreover, 3ATA had no effect on the activity of the

MDR protein, glycoprotein-P (Pgp) indicating that this compound is not substrate of

this protein. Thus, this study presents the 3β-acethyl tormentic acid as a potential

candidate for the treatment of leukemia, including the ones that present MDR

phenotype mediated for the Pgp overexpression.

Key words: Triterpenes; 3

β-acetyl tormentic; Leukemia; Apoptosis;

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

ANT: Adenosine Nucleotide Translocator (Translocador de nucleotídeo adenina)

AE: ácido euscáfico

AT: ácido tormêntico

AT3: 3β-acetil tormêntico

ABCP: ABC placental protein (Proteína ABC placental)

ABC: família “ATP-Binding Cassete”

AIF: Apoptosis inductor Factor (Fator indutor de apoptose)

ATP: adenosine triphosphate (adenosina trifosfato)

ADP: adenosine diphosphate (adenosina difosfato)

Apaf-1: Apoptotic Protease Activating Factor (Fator-1 ativador de protease

apoptótica)

BCRP: Breast Cancer Resistance Protein (proteína de resistência de câncer de

mama)

CSA: Ciclosporin A (Ciclosporina A)

CAD: Caspase Activated DNase (DNase ativada por caspase)

DD: Death Domain (Domínio de morte)

DNA:

deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucléico)

DIOC

(3): 3,3'- dihexyloxacarbocyanine iodide (3,3'- iodeto de diexiloxacarbocianina)

dATP: Deoxyadenosine triphosphate (deoxiadenosina trifosfato)

DMSO: Dimetilsulfóxido

DISC: Death Inducing Signaling (Complexo sinalizador da indução de morte)

∆

: Potencial de membrana mitocondrial

FADD: Fas Associated Death Domain (Domínio de morte associado ao Fas)

ICAD: Inhibitor Caspase Activated DNase (Inibidor de DNase ativada por caspase)

half Inhibitory concentration (Concentração média inibitória)

IAP: Inhibitory Apoptosis Protein (Proteína inibidora de apoptose)

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Brometo de 3-

(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol)

MXR: Mitoxantrone Resistant Protein (proteína de resistência a mitoxantrona)

MRP1/ABCC1: Multidrug Resistance Protein (Proteína-1 associada à resistência a

múltiplas drogas)

MDR: Multidrug Resistance (Resistência a múltiplas drogas)

PTP: Permeability Transition Poro (Poro de permeabilidade de transição)

PARP: Poli-ADP ribose polimerase

PBS: Phosphate buffered saline (Solução fosfato tamponada)

RNA: ribonucleic acid (ácido ribonucléico)

RNA interference: ácido ribonucléico de interferente

SFB: Soro fetal bovino

TNFR: Tumor Necrosis Factor Receptor (Receptor do Fator de Necrose Tumoral)

TNF: Tumor Necrosis Factor (Fator de necrose tumoral)

TRADD/FADD: TNFR1-Associated Death Domain /Fas Associated Death Domain

(Domínio de morte associado ao TNF-R/ domínio de morte associado ao Fas).

TRAIL:

TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (Ligante Indutor de Apoptose

Relacionado ao TNF)

TRAIL-R: TNF-Related Apoptosis-Inducing Receptor (Receptor do Ligante Indutor de

Apoptose Relacionado ao TNF)

VDAC: Voltage-Dependent Anion Channel (Canal aniônico dependente de voltagem)

VP: Verapamil

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Sítios de ação dos agentes citotóxicos....................................................

Figura 2. Principais vias de apoptose em mamíferos..............................................

Figura 3. Mecanismos moleculares de permeabilização da membrana externa.....

mitocondrial.

Figura 4. Estrutura da glicoproteina-P ....................................................................

Figura 5: Estrutura da MRP-1..................................................................................

Figura 6. Estrutura da BCRP...................................................................................

Figura 7: Cecropia lyratiloba. Popularmente conhecida como Embaúba..............

Figura 8: Estrutura dos triterpenos isolados da Embaúba......................................

Figura 9: Efeito dos triterpenos isolados da C. lyratiloba na viabilidade celular da

linhagem de leucemia mielóide crônica, K562. .......................................................

Figura 10: Efeito dos triterpenos isolados da C. lyratiloba na viabilidade celular

da linhagem de leucemia mielóide crônica MDR, Lucena-1. ..................................

Figura 11: Alterações morfológicas induzidas pelo AT3 na linhagem leucêmica

humana MDR, Lucena-1. ........................................................................................

Figura 12: AT3 induz fragmentação de DNA na linhagem leucêmica humana

MDR, Lucena-1 de forma dose dependente............................................................

Figura 13: AT3 induz fragmentação de DNA na linhagem leucêmica humana

MDR, Lucena-1 de forma tempo dependente..........................................................

Figura 14: AT3 induz ativação de caspase 3 na linhagem Lucena-1......................

Figura 15: Apoptose induzida por AT3 é revertida por Zvad-fmk............................

Figura 16: Efeito do AT3 sobre o potencial de membrana mitocondrial (∆ψ

) na

linhagem Lucena-1...................................................................................................

Figura 17: AT3 aumenta os níveis de citocromo c citosólico na linhagem Lucena-

1. ..............................................................................................................................

Figura 18: Furosemida diminui os níveis de fragmentação de DNA induzida por

AT3. .........................................................................................................................

Figura 19: Curva temporal do carregamento de Rho 123 na linhagem Lucena-1.

Figura 20: Efeito de bloqueadores de Pgp sobre o carregamento de Rho 123 na

linhagem Lucena-1. .................................................................................................

Figura 21: Efeito dos bloqueadores de Pgp na viabilidade celular da

Lucena-1. .....................................................................................................

Figura 22: Efeito do AT3 sobre o carregamento de Rho 123 na linhagem

Lucena-1. .....................................................................................................

Figura 23: Efeito dos bloqueadores de Pgp na viabilidade celular da

Lucena-1. .....................................................................................................

xii

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Lista de quimioterápicos substratos dos transportadores ABC 21

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Concentração média inibitória dos triterpenos 41

xiv

SUMARIO

FICHA CATALOGRÁFICA iii

FICHA DE APROVAÇÃO iv

AGRADECIMENTOS v

RESUMO viii

ABSTRACT ix

LISTA DE ABREVIATURAS x

LISTA DE FIGURAS xii

LISTA DE QUADROS xiv

LISTA DE TABELAS xv

1. INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

1.2 Mecanismos de ação dos quimioterápicos

1.3 Morte celular por apoptose

1.4 Resistência a quimioterapia

1.5 MDR e quimioterapia

1.6 Produtos naturais como fonte de novos quimioterápicos

2. OBJETTVOS

2.1 Objetivo geral

2.2 Objetivos específicos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Soluções e reagentes

3.2 Obtenção dos triterpenos

3.3 Linhagens tumorais

3.4 Avaliação da viabilidade celular:

3.5 Avaliação da morfologia celular por microscopia ótica:

3.6 Avaliação da morte celular por fragmentação de DNA:

3.7 Avaliação da ativação de caspases:

3.8 Medida da variação do potencial de membrana da mitocôndria

3.9 Analise da liberação de citocromo c mitocondrial

3.10 Medida de atividade de proteínas MDR:

3.11 Efeito de AT3 sobre o carregamento de Rho 123

4. RESULTADOS

4.1 Triterpenos inibem a viabilidade de linhagens leucêmicas:

4.2 AT3 induz apoptose em linhagem leucêmica MDR:

4.3 Apoptose induzida pelo AT3 envolve ativação da via mitocondrial.

4.4 AT3 induz ativação de caspase-3

4.5 AT3 não interfere com a atividade da Pgp

4.6 Efeito do AT3 sobre o carregamento de Rho 123

5. DISCUSSÃO

6.CONCLUSÕES

7. PERSPECTIVAS

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

9. ANEXOS

xvi

1. Introdução

1.1. O câncer

O câncer é uma doença que resulta de alterações intracelulares que

geralmente ocasionam a perda do controle da proliferação e/ou desregulação dos

mecanismos de morte (senescência celular, apoptose). O câncer é um dos líderes

em causa mortis no mundo (World Health Organization, 2007). Das 58 milhões de

mortes que ocorreram no mundo em 2005, 7.6 milhões (13%) foram devidas ao

câncer. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a expectativa, é que esse índice

continue aumentando, com uma estimativa de 9 milhões de mortes em 2015 (World

Health Organization, 2007). Dentre os tipos de cânceres que mais matam estão o de

pulmão (1.3 milhões/ano) e o de cólon (655.000/ano). No Brasil, a morbidade

associada ao câncer só é superada pelas doenças cardiovasculares. De fato, as

estimativas do INCa para os anos de 2008 e 2009 apontam para o surgimento de

aproximadamente meio milhão de novos casos de câncer. Dentre esses as

leucemias atingirão aproximadamente 200 pessoas a cada 100.000 habitantes

(www.inca.gov.br).

As leucemias são cânceres de origem clonal que comprometem os diversos

elementos das linhagens sanguíneas (Fialkow et al., 1967)

A célula na qual ocorre

a transformação leucêmica pode ser uma célula-tronco hematopoiética, um

precursor linfóide ou mielóide ou um linfócito maduro. Logo, existem diferentes tipos

de leucemias, as linfóides, mielóides, mielodisplásicas, etc, que ainda podem ser

divididas em agudas ou crônicas (Goasguen et al., 1996). Essas doenças são

caracterizadas pelo acúmulo de células anormais da linhagem atingida em

determinada etapa da diferenciação (Tsiftsoglou et al., 2003). Os principais

sintomas das leucemias decorrem do acúmulo dessas células na medula óssea,

prejudicando ou impedindo a produção dos glóbulos vermelhos (causando anemia),

dos glóbulos brancos (causando infecções) e das plaquetas (causando hemorragias)

(Kufe et al., 2003).

A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença maligna do tecido

hematopoiético, caracterizada pela proliferação na medula óssea de células

blásticas de linhagem mielóide, com conseqüente prejuízo da produção de células

normais.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa que

exibe anormalidade específica resultante da transformação de uma única célula

tronco pluripotente. A LMC foi o primeiro tipo de câncer associado a um marcador

citogenético, o cromossomo Filadélfia (Nowell e Hungerford, 1960). O cromossomo

Filadélfia foi descrito como sendo um resultado da translocação de parte do gene abl

no cromossomo 9 para o gene bcr no cromossomo 22; essa mutação resulta no

gene quimérico bcr/abl. A proteína hibrida bcr/abl, produto desse gene, é uma

tirosina cinase constitutivamente ativa que induz proliferação celular (Tefferi et al.,

2006). A LMC apresenta curso trifásico: fase crônica, com duração média de 3,5

anos, fase acelerada e fase blástica, esta última pouco responsiva à quimioterapia

convencional (Champlin e Golden, 1985; Xu, Wahner e Nguyen, 2004). Um dos

tratamentos no combate da LMC é feito com a utilização de Mesilato de imatinib que

atua como um inibidor seletivo da tirosina cinase, funcionando como um antagonista

contra a proteina bcr/abl (de Kogel e Schellens, 2007). No entanto, casos de

resistência a esse fármaco já tem sido relatados (Apperley, 2007; Chung et al.,

2006). Atualmente outros inibidores da proteína bcr/abl têm sido desenvolvidos na

tentativa de driblar a resistência ao Imatinib (Cortes et al., 2007).

1.2. Mecanismos de ação dos quimioterápicos

A terapia do câncer visa à inibição do crescimento e proliferação da célula

tumoral ou a indução seletiva da morte dessas células e a conseqüente erradicação

do tumor. Ao lado da cirurgia e radioterapia, a quimioterapia é uma das principais

técnicas utilizadas para o tratamento do câncer. Por ser um método sistêmico, a

quimioterapia é muito empregada no tratamento de leucemias.

Os quimioterápicos sejam de origem natural ou sintética, são substâncias de

alta toxidez que visam à indução da morte ou à inibição do ciclo celular da célula

tumoral. Eles podem ser divididos em três principais grupos com base em seus

modos e sítios de ação: antimetabolitos, agentes genotóxicos e inibidores do fuso

mitótico (Igney e Krammer, 2002) (Figura 1).

Dentre os antimetabolitos podem-se citar os antifolatos que são compostos

inibidores da dihidrofolato redutase, uma enzima envolvida no metabolismo de

nucleotídeos, tendo como exemplo clássico o metotrexato (Hryniuk, 1975). Outro

grupo de antimetabolitos são os antagonistas da pirimidina que atuam bloqueando a

formação dos nucleotídeos pirimidínicos ou causando a terminação prematura da

molécula ao serem incorporados na nova fita de DNA. Exemplos de quimioterápicos

incluídos nesse grupo são o 5-fluorouracil (5-FU) (Chaudhuri et al., 1958) e a

gemcitabina (Hertel et al., 1990). Os antagonistas da purina constituem outro grupo

de antimetabolitos, os quais inibem a síntese de adenina e guanina. Um exemplo

desse tipo de fármaco é o 6-mercaptopurina.

Os agentes genotóxicos se ligam ao DNA ou o danificam indiretamente por

afetar enzimas envolvidas na replicação, levando a indução da apoptose. Essa

classe de compostos pode ser subdividida em diversos grupos. Um deles é o

formado pelos agentes alquilantes, que são compostos que modificam as bases do

DNA, interferem com replicação e transcrição e levam a mutação. Um exemplo de

composto pertencente a esse grupo é a cisplatina (Ghosh, Saha, Mahapatra, 2007).

Outro grupo de agentes genotóxicos são os agentes intercalantes, os quais se ligam

a hélice do DNA e interferem com a atividade das polimerases. Um exemplo desse

grupo é a doxorubicina (Marks e Venditti, 1976). Outro grupo é aquele composto

pelos inibidores das topoisomerases. Um exemplo é o topotecan (Hartmann e Lipp,

2006)

Os inibidores do fuso mitótico têm a função de interromper a mitose, uma vez

que afetam a formação/funcionamento das fibras do fuso mitótico. Exemplos incluem

os alcalóides da vinca (Jordan et al., 1992).

Figura 1. Sítios de ação dos agentes citotóxicos (Adaptação de Lugmani, 2005)

Ao longo das últimas décadas, muitos estudos foram feitos visando esclarecer

quais mecanismos moleculares estariam sendo induzidos pelos agentes

antitumorais. Hoje se sabe que não só a quimioterapia como outros métodos

terapêuticos tais como irradiação gama e imunoterapia, tem seus efeitos mediados

pela ativação da apoptose (Fulda e Debatin, 2006; Kim et al., 2006).

1.3. Morte celular por apoptose

A apoptose é um programa de morte celular evolutivamente conservado que

ocorre, na maioria das células, em diversas situações fisiológicas e patológicas

(Hengartner, 2000). O processo apoptótico é caracterizado por uma série de

alterações morfológicas e bioquímicas. Entre essas se inclui diminuição do volume

celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear, “blebs” de membrana e

formação de corpos apoptóticos (Assunção e Linden, 2004). O componente central

deste processo é um sistema proteolítico que envolve uma família de cisteína

proteases conhecida como caspases, as quais estão envolvidas na iniciação e

execução da apoptose (Fuentes-Prior e Salvessen, 2004). Essas proteínas

encontram-se no citoplasma sob a forma de pro-enzimas e sua ativação requer a

clivagem do pró-domínio. Existem dois grupos de caspases, as iniciadoras e as

efetoras. As iniciadoras (8, 10, 9) são capazes de ativar as efetoras. Já as efetoras

(3, 6 e 7) são as responsáveis pela clivagem de substratos intracelulares, tais como

ICAD (Inhibitor Caspase Activated DNase) com conseqüente liberação de CAD

(Caspase Activated DNase), endonuclease responsável pela degradação

internucleossomal do DNA; clivagem e ativação de gelsolina, uma proteína que

regula a dinâmica da actina; clivagem da lamina, proteína estrutural mais abundante

do envelope nuclear; ativação do fator condensador de cromatina (Acinus), clivagem

de PARP (Poli-ADP Ribose Polimerase), enzima envolvida no reparo do DNA. Estes

conjuntos de eventos levam ao desmantelamento e morte celular (Hengartner, 2000;

Zörnig et al., 2001; Kaufmann e Earnshaw, 2000).

A indução da apoptose pode ser mediada por duas vias principais: a via

extrínseca e a via intrínseca. A via extrínseca também conhecida como via dos

receptores de morte requer o envolvimento de receptores da membrana

citoplasmática (Figura 2). Esses receptores são membros da superfamília de

Receptores de Fatores de Necrose Tumoral. Os mais bem caracterizados são TNFR

(Tumor Necrosis Factor Receptor), Fas e TRAIL-R (TNF-Related Apoptosis-Inducing

Ligand Receptor), os quais possuem um domínio de morte (Death Domain, DD).

Quando um ligante, TNF (Tumor Necrosis Factor), Fas ligante ou TRAIL (TNF-

Related Apoptosis-Inducing Ligand

)

respectivamente, se associa a um dos desses

receptores, ele se oligomeriza e sofre mudança conformacional. Em seguida, os

receptores recrutam as moléculas adaptadoras, FADD (Fas Associated Death

Domain) ou TRADD/FADD (TNFR1-Associated Death Domain /Fas Associated

Death Domain) (Fulda e Debatin, 2004). Essas moléculas adaptadoras medeiam à

interação do receptor ativado com a procaspase-8. Juntos, receptor, FADD ou

TRADD/FADD e procaspase-8 formam o complexo indutor de morte conhecido como

DISC (Death Inducing Signaling Complex), no qual a procaspase-8 sofre uma auto-

ativação proteolítica passando a ser chamada de caspase-8 (Wajant et al., 2005).

Esta por sua vez ativa diretamente a procaspase-3 que então cliva outras proteínas

envolvidas na morte celular.

A apoptose é um processo regulado em diferentes níveis. Na via extrínseca

tanto a expressão das moléculas que compõem essa via quanto seus respectivos

níveis de ativação podem ser regulados. Um exemplo disso é a expressão

aumentada de Fas e Fas ligante em células T ativadas. FLIP, uma importante

molécula reguladora da via dos receptores de morte atua inibindo o recrutamento e

ativação da caspase-8 através de sua ligação com a molécula adaptadora FADD

(Oyarzo et al., 2006; Lavrik et al., 2005) (Figura 2 ).

A via intrínseca é caracterizada pelo envolvimento da mitocôndria no processo

apoptótico. Nesta via alguns tipos de agentes anti-neoplásicos, radiação UV e outros

estímulos citotóxicos são capazes de perturbar a estabilidade das membranas

mitocondriais e levar a liberação para o citosol de proteínas pro-apoptóticas

anteriormente presentes no espaço intermembranar mitocondrial. Entre elas pode-se

citar o citocromo c (Bossy-Wetzel e Green, 1999), que interage com a molécula

adaptadora Apaf-1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1) na presença de dATP

(deoxyadenosine triphosphate) ou ATP (adenosine triphosphate) e pro-caspase 9,

formando um complexo denominado apoptossomo (Guerrero, Chen e Wang, 2007).

Nesse complexo a pro-caspase-9 é processada e ativada. Uma vez ativada, a

caspase-9 cliva as caspases efetoras 3,6 e 7 possibilitando que exerçam suas

atividades (Srinivasula et al., 1998; Kroemer et al., 2007). Outras proteínas

mitocondriais liberadas no citosol têm atividade pro-apoptótica, entre elas temos o

AIF (Apoptosis Inductor Factor) que induz condensação e fragmentação de DNA

independente de caspase (Susin et al., 1999) e Smac/Diablo que neutraliza o efeito

inibitório das proteínas inibidoras de caspases (Du et al., 2000) (Figura 2).

Para a liberação das proteínas pró-apoptóticas do espaço intermembranar é

necessário que a membrana externa da mitocôndria se torne permeável a elas.

Atualmente, dois mecanismos têm sido propostos para explicar o processo de

permeabilização da membrana mitocondrial externa. O primeiro envolve a indução

de uma alteração transitória da permeabilidade da membrana externa da

mitocôndria ocasionada pela abertura do Poro de Permeabilidade Transitória (PTP)

(Gogvadze et al., 2006) que é um canal iônico aberto em resposta ao aumento da

concentração de cálcio na mitocôndria ou ao estresse oxidativo (Sharpe et al.,

2004). Este poro é uma estrutura poli-proteica localizada no sítio de contato entre as

Figura 2. Principais vias de apoptose em mamíferos (Adaptação de Hengartner, 2000)

membranas mitocondriais interna e externa. Uma das proteínas chave deste

complexo é a ANT (Adenine Nucleotide Translocator), presente em abundancia na

membrana interna. Normalmente esta proteína funciona como um transportador de

ATP/ADP, no entanto pode também funcionar como um poro não específico. Outra

proteína é a VDAC (Voltage- Dependent Anion Channel) presente em abundancia na

membrana externa mitocondrial. A última proteína pertencente a essa estrutura é a

ciclofilina D localizada na matriz mitocondrial (Costantini et al., 2000). A abertura do

poro deflagra um processo de inchaço osmótico da matriz mitocondrial, perda de

potencial de membrana mitocondrial, ruptura da membrana externa mitocondrial e

conseqüente liberação de moléculas do espaço intermembranar tal como citocromo

c (Gogvadze et al., 2001, Bouchier-Hayes et al., 2005). Por outro lado, esse poro

também pode se abrir de uma forma transicional e em uma pequena porção da

mitocôndria. Assim somente parte da mitocôndria estaria com poros abertos em um

determinado tempo, nesse caso a liberação de citocromo c ocorre sem uma ampla

perda de potencial mitocondrial dentro da população mitocondrial da célula (Szalai et

al., 1999; Orrenius, 2004) (Figura 3).

O segundo mecanismo de permeabilização de membrana externa mitocondrial

envolve a atividade de membros pró-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2. A

família Bcl-2 consiste de mais de 30 proteínas que são divididas em três subgrupos:

(1) fatores de morte Bax “like” que favorecem a liberação de proteínas pro-

apoptóticas mitocondriais, que incluem Bax, Bak e Bok; (2) fatores de morte BH3-

only que são compostos principalmente por Bid e Bim e contribuem para o

funcionamento das proteínas pro-apoptóticas Bax e Bak, através da indução da

homo-oligomerização dessas proteínas na membrana externa mitocondrial e (3)

fatores de sobrevivência Bcl-2 “like” que inibem a liberação de moléculas pro-

apoptóticas mitocondriais, nos quais se incluem Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w e Mcl-1; (Sharpe

et al., 2004; Orrenius, 2004)

Assim, Bax, que em células saudáveis se localiza no citosol na forma de

monômeros, em células apoptóticas sofre uma mudança conformacional, a qual

favorece a exposição de um sitio específico possibilitando a formação de

homodímeros que se translocam para a mitocôndria onde se inserem na membrana

mitocondrial externa (Burlacu, 2003). O complexo protéico composto por Bax

oligomerizado forma um canal que leva à permeabilização da membrana

mitocondrial externa e à conseqüente liberação de citocromo c e outras moléculas

pro-apoptóticas (Cory e Adams, 2002). Há relatos na literatura de que o poro

formado por Bax e outros membros pro-apoptóticos da família Bcl-2 gera

permeabilização transitória na membrana mitocondrial sem uma alteração imediata

no potencial de membrana mitocondrial (Eskes et al., 1998; Antignani e Youle,

2006) (Figura 3 )

A atividade de Bax é regulada por várias proteínas. Dentre elas pode-se citar a

proteína Bid, membro BH3-only da família Bcl-2. Normalmente Bid é encontrado no

citosol, uma vez na presença de caspase-8 ativada ele é clivado na sua porção

amino-terminal à forma de Bid truncado, tBid, que se transloca para a mitocôndria.

Na mitocôndria tBid interage e ativa Bax, por induzir sua homo-oligomerização,

iniciando assim a liberação de citocromo c e outras proteínas intermembranares

(Eskes at al., 2000; Kuwana e Newmeyer, 2003). Portanto tBid interliga as vias

extrínseca e intrínseca, funcionando como uma alça de amplificação de ativação de

caspases e indução de apoptose.

Além dos mecanismos já descritos, baseado em experimentos mostrando que

Bax estimula a liberação de citocromo c em lipossomos sintéticos reconstituídos de

VDAC, alguns pesquisadores sugeriram que Bax, Bak e outras proteínas da família

Bcl-2 sejam capazes causar um alargamento do poro formado por VDAC, o

suficiente para permitir o efluxo de citocromo c (Shimizu et al., 1999). Normalmente o

citocromo c liberado na via mitocondrial é encontrado no espaço intermembranar

ancorado a membrana interna mitocondrial através do fosfolipídio aniônico

cardiolipina. Evidencias mostraram que a dissociação do citocromo c da cardiolipina

é o primeiro passo crítico para a liberação do citocromo c para o citosol e

conseqüente indução da apoptose (Orrenius, 2004). Esta dissociação geralmente se

dá pela oxidação deste fosfolipídio por espécies reativas de oxigênio (Ott et al.,

2007).

Figura 3

. Mecanismos moleculares de permeabilização da membrana externa mitocondrial

(Adaptação de Bouchier-Hayes et al., 2005)

Os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2, tais como Bcl-2 e Bcl-XL atuam

modulando os fatores que induzem a permeabilidade mitocondrial. Estas proteínas

mantêm a integridade da membrana externa mitocondrial ao se ligar a Bax

impedindo sua oligomerização, prevenindo, assim a liberação de citocromo c (Kluck

et al., 1997; Sharpe, 2004). Elas também são capazes de interagir com VDAC

(proteína componente do PTP), bloqueando a abertura do poro formado por esta

proteína (Shimizu et al., 2000).

Além da modulação efetuada pelos membros da família Bcl-2, a via intrínseca

também é regulada pelas IAPs (Inhibitor Apoptosis Protein), uma importante família

de supressores que inibem diretamente as caspases ativadas. Atualmente são

descritas oito IAPs diferentes em humanos. Seu mecanismo consiste na inibição

direta das pro-caspases e caspases 9, 3 e 7 (Debatin, 2004). Mutações em

membros desta família de inibidores estão associadas ao aumento de casos de

diversos tipos de câncer e a resistência do tumor a quimioterapia. Dentre os

diferentes tipos de IAPs descritas pode-se citar a survivina cuja superexpressão está

associada ao aparecimento de câncer de estomago, mama, pulmão, próstata,

pâncreas e outros e a XIAP que é a IAP mais potente e também a melhor

caracterizada. Sua superexpressão está correlacionada com um pior prognóstico em

pacientes com leucemia mielóide aguda (Malaguarnera, 2004; Nachmias et al.,

2004).

Além das vias clássicas, extrínseca e intrínseca, outras vias apoptóticas são

relatadas na literatura. Uma delas é a via mediada pelo reticulo endoplasmático.

Nessa via, caspase 12, localizada no lado citoplasmático do RE é considerada a

caspase iniciadora (Nakagawa et al., 2000). Foi sugerido que a cisteína protease,

calpaina-m, ativada por estresse no RE (aumento dos níveis de cálcio

citoplasmático) seria responsável pela clivagem e ativação da procaspase 12. Por

outro lado, caspase-12 possui um domínio recrutador semelhante aquele presente

na caspase-9, ao qual Apaf-1 interage e forma o complexo apoptossomo. Assim, é

provável que semelhantemente a caspase-9, a caspase-12 seja ativada pela

associação com uma proteína apaf-1-”like” (Nakagawa e Yuan, 2000). Mais tarde foi

proposto que caspase-12 ativa a proteína JNK, que fosforila e ativa Bim, uma

proteína BH3-only essencial para a liberação de citocromo c mediada por Bax. (Lei

e Davis, 2003; Wang, Liu e Cui, 2005).

Outra via de apoptose descrita é a via mediada por granzima B. Células natural

Killer e linfócitos T citotóxicos, os dois principais tipos de linfócitos citotóxicos,

exercem um papel essencial na destruição de células infectadas por agentes virais e

de células tumorais. Os dois principais mecanismos de citotoxidade usada por essas

células incluem a ativação da via do receptor de morte Fas e exocitose de grânulos.

Na exocitose de grânulos, duas proteínas são requeridas. Uma delas é a perforina,

uma proteína formadora de poros que facilita a entrada dos outros componentes dos

grânulos nas células alvo. A outra é a granzima B, uma serina- protease cujos

substratos são semelhantes aos da família de caspases (Pinkoski et al., 2001). Uma

vez liberada pelos linfócitos citotóxicos, granzimas B se ligam aos seus receptores e

então são endocitadas. Quando liberadas no citosol, as granzimas B podem ativar

diretamente a caspase-3 ou indiretamente através da clivagem de Bid a tBid,

ativação de Bax e liberação de citocromo c (Konno et al., 1999; Wang, Liu e Cui,

2005).

Embora as vias apoptóticas exerçam papel crucial na morte de células tumorais

em resposta a agentes citotóxicos usados em pacientes de câncer, a apoptose não

é o único mecanismo de morte ativado por fármacos anti-neoplásicos. Esse fato é

resultado de observações de que em alguns casos os inibidores gerais de caspases

não são capazes de inibir totalmente a morte de células tratadas com agentes

citotóxicos, sugerindo que quando a apoptose está bloqueada outros mecanismos

de morte podem ser ativados (Kim et al., 2006). Além disso, alguns estudos

mostraram que células tumorais também podem ser eliminadas pela ativação de

mecanismos de morte não apoptóticos tais como necrose, catástrofe mitótica e

autofagia (Brown e Attardi, 2005; Fulda e Debatin 2006).

1.4. Resistência à quimioterapia

Apesar das vantagens da quimioterapia, o desenvolvimento de mecanismos de

resistência pelas células tumorais tem prejudicado os resultados desse tipo de

tratamento, levando a falhas quimioterápicas e contribuindo para o mau prognóstico

do paciente (Borowski et al., 2005).

A resistência à quimioterapia pode ser de dois tipos: intrínseca ou adquirida. A

resistência intrínseca é aquela que está presente no tumor desde o diagnóstico,

levando esse tumor a não responder aos quimioterápicos de primeira linha. A

estatística clínica mostra que uma em cada 10

-10

células tumorais são resistentes

a um determinado quimioterápico. Clinicamente um tumor é detectável quando

contem aproximadamente 10

células, o que significa que a massa tumoral que no

momento está respondendo a quimioterapia contém entre 10 e 1000 células

resistentes, as quais têm o potencial de repovoar o tumor, após a eliminação das

células sensíveis (Lugmani, 2005). A resistência adquirida geralmente aparece após

algum tipo de quimioterapia: o tumor que inicialmente respondia ao tratamento

reaparece com um fenótipo de resistência ao quimioterápico usado e a outros não

relacionados (Baird e Kaye, 2003). Tanto a resistência intrínseca quanto a adquirida

pode ser a um quimioterápico, sendo chamada de resistência específica ou a vários

quimioterápicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados, caracterizando

uma resistência a múltiplas drogas (Multidrug Resistance, MDR) (Larsen et al.,

2000; Ozben, 2006).

A Resistência a Múltiplas Drogas é um dos principais responsáveis pela falha

quimioterápica no câncer por reduzir severamente a eficácia da quimioterapia em

diversos tipos de tumores. Mesmo quando tratado com altas doses do

quimioterápico o paciente com tumor MDR tem um prognóstico muito ruim e na

maioria das vezes vai a óbito. De fato, a observação de que cerca de 50% dos

pacientes que inicialmente respondem a quimioterapia recidivam e morrem por

metástases generalizadas é atribuída ao desenvolvimento do fenótipo de resistência

a múltiplas drogas.

A MDR é um fenômeno multifatorial e vários mecanismos de resistência

coexistem numa mesma célula tumoral tornado-a refratária ao tratamento. Entre os

mecanismos de resistência encontrados em tumores MDR pode-se citar o aumento

do efluxo da droga, a diminuição do influxo da droga, o seqüestro intracelular da

droga (Duvvuri e Krise, 2005), intensificação dos sistemas de detoxificação, a

alteração dos alvos intracelulares da droga (perda da afinidade droga-alvo) (Baird e

Kaye, 2003), aumento dos mecanismos de reparo do DNA e mecanismos de evasão

da apoptose (Borowski et al., 2005).

Superexpressão de proteínas anti-apoptóticas, de IAPs e a deleção ou

mutação de genes que controlam o ciclo celular são alguns dos mecanismos

utilizados pelas células tumorais para escapar da morte por apoptose. Estudos

realizados in vitro e in vivo têm demonstrado que a superexpressão de Bcl-2 confere

resistência a diversos tipos de quimioterápicos e à irradiação. Em vários tipos de

tumores, os altos níveis de expressão de Bcl-2 são associados a um prognóstico

pobre (Weller et al., 1995). Outras proteínas anti-apoptóticas superexpressas em

tumores são Bcl-xl e FLIP (Irmler et al., 1997). Esta última é encontrada em altos

níveis em melanomas humanos, um tipo de tumor conhecido por sua resistência. A

superexpressão das IAPs também é encontrada em diversos tipos de tumores. A

IAP, survivina, é superexpressa em muitos tumores humanos incluindo os

neuroblastomas (Ambrosini et al., 1997). Outro mecanismo de resistência é a

inativação de genes pro-apoptóticos, tais como Bax. Em muitos tumores o gene de

Bax está mutado. A redução dos níveis de Bax está relacionada com a baixa

resposta a quimioterápicos e a baixa sobrevida (Krajewski at al., 1995). Alterações

da via de p53, um mecanismo caracterizado por mutações no gene TP53, tornam o

tumor mais resistente a apoptose. Tumores que possuem o gene da p53 mutado são

intrinsecamente resistentes a doxorrubicina e recidivam mais rapidamente (Lowe et

al., 1994).

Entretanto, o mecanismo de resistência mais bem estudado é aquele que

resulta da alteração de transportadores de membrana, proteínas que atuam como

bombas de efluxo, diminuindo os níveis intracelulares do quimioterápico, impedindo

assim que a concentração necessária para sua eficácia seja alcançada (Gottesman,

2002). Até o momento os transportadores mais bem estudados pertencem à

superfamília ABC (ATP-Binding Cassete) de transportadores. Atualmente são

conhecidas mais de 100 proteínas transportadoras (entre procariotos e humanos).

No entanto cerca de apenas 10 proteínas são descritas com capacidade de conferir

o fenótipo de resistência (Ozben, 2006). A primeira proteína transportadora

representante da superfamília ABC de transportadores a ser identificada foi a

glicoproteina-P/ABCB1 (Pgp). Ela foi identificada em 1976 por Juliano e Ling na

membrana plasmática de células MDR e foi considerada por eles a primeira proteína

com características de uma bomba de efluxo. Tempos depois outros cientistas

corroboraram seus achados e a Pgp então, foi reconhecida como uma proteína

transportadora de drogas ATP dependente, capaz de transportar agentes citotóxicos

contra um gradiente de concentração (Borst et al., 2000).

A Pgp (Figura 4), tem 170 kDa e é codificada pelo gene ABCB1 (MDR1). É

glicosilada na primeira alça extracelular e é composta por doze domínios

transmembranares hidrofóbicos. Esses domínios são responsáveis pelo

reconhecimento, ligação e efluxo dos substratos. Essa proteína também é composta

por dois sítios de ligação a nucleotídeos localizados no espaço intracelular e

participam da ligação e hidrolise do ATP. A Pgp sofre uma modificação

conformacional e os domínios transmembranares se reorganizam em três domínios

compactos. Essa reorganização abre um poro central e permite o transporte de

drogas hidrofóbicas (Teodori et al., 2006; Pérez-tomás, 2006). A glicoproteina-P

consegue transportar substratos hidrofóbicos, compostos orgânicos neutros ou

catiônicos. Dentre os quimioterápicos transportados pela Pgp pode-se citar

vincristina, doxorrubicina e paclitaxel. Outros exemplos de substratos podem ser

encontrados no quadro 1.

Por um longo tempo, acreditou-se que a Pgp fosse a única proteína capaz de

conferir a resistência a múltiplas drogas em células de mamíferos. No entanto,

diversos casos de células tumorais humanas apresentando o fenótipo MDR mesmo

na ausência de Pgp apontavam para existência de outras proteínas capazes de

conferir resistência (Borst et al., 2000; Ozben, 2006).

Em 1992, S. Cole e R. Deeley observaram a amplificação e aumento da

expressão de um gene, o MRP1 (ABCC1) em células de linhagem de câncer de

pulmão (small-cell lung cancer) que apresentavam resistência a múltiplas drogas e

ausência de expressão de Pgp. Assim, a Proteína-1 Associada à Resistência a

Múltiplas Drogas (Multidrug Resistance Protein-1, MRP1/ABCC), pertencente à

família ABC de transportadores, codificada pelo gene MRP1, foi identificada e

reconhecida como o segundo tipo de bomba de efluxo. Da mesma forma que

acontece com Pgp, a transfecção do gene MRP1 confirmou a habilidade da proteína

MRP1 em conferir resistência a um grande números de drogas (Grant et al., 1994;

Deeley e Cole, 2006).

A proteína MRP1 (Figura 5) tem 190 kDa, possui 17 domínios

transmembranares responsáveis pela reconhecimento, ligação e transporte do

substrato, também possui dois domínios intracelulares de ligação a nucleosídeo e

sua porção N-terminal é extracelular. Essa proteína é capaz de transportar como

substratos anions orgânicos isolados ou conjugados a glutationa, glucuronato ou

sulfato. Como pode ser visto no quadro 1, um grande número de quimioterápicos

Figura 4

: Estrutura da glicoproteina-P

que são substratos para a Pgp também são transportados pela MRP1 com exceção

do paclitaxel que é fracamente transportado pela MRP1 e do metatrexato que não é

transportado pela Pgp (Kruh et al., 2001; Borst et al., 2000; Deeley e Cole, 2006).

Mais exemplos de quimioterápicos transportados pela MRP1 estão no quadro 1.

Após a identificação da MRP1 outras proteínas MRPs foram descritas.

Atualmente são conhecidos nove membros da família MRP, no entanto a função de

algumas delas não é conhecida (Teodori, 2006).

Outro transportador ABC envolvido na MDR foi clonado por Ross e Doyle em

1998 (Doyle et al., 1998) de uma linhagem de câncer de mama (MCF-7/Adr/Vp).

Esta proteína faz parte da subfamília ABCG, é codificada pelo gene ABCG2. Foi

chamada de proteína de resistência de câncer de mama (Breast Cancer Resistance

Protein, BCRP), mas também é conhecida como ABCG2, ABCP (ABC Placental

protein) ou MXR (Mitoxantrone Resistant protein). A BCRP (Figura 6) é um hemi-

transportador e para exercer sua função precisa se dimerizar. Além disso, tem 72

kDa, seis domínios transmembranares e apenas um sitio de ligação a nucleotídeo.

Sua expressão está relacionada à baixa resposta a quimioterapia. Ela tem

capacidade de extruir moléculas grandes e hidrofóbicas tanto positiva quanto

negativamente carregados, além de quimioterápicos como mitoxantrona, topotecan,

metotrexato e outros (Robey et al., 2007; Pérez-tomás, 2006).

Figura 5

: Estrutura da MRP-1

Figura 6

. Estrutura da BCRP.

1.5. MDR e Quimioterapia

Uma vez que a proteína MDR bombeia o quimioterápico para fora da célula,

impedindo que ele atinja a concentração letal, uma das estratégias clínicas

desenvolvida para reverter o fenótipo MDR e tratar pacientes com esse tipo de tumor

foi o uso de substâncias que interferem na atividade da bomba.

Assim, no início da década de 80 foi encontrado o primeiro composto capaz

de aumentar in vitro o acúmulo intracelular de muitos agentes antitumorais, tais

como vincristina e doxorubicina. Este composto, conhecido como verapamil era

capaz de inibir a atividade da Pgp possivelmente por competir diretamente com os

substratos deste transportador (Yusa e Tsuruo, 1989). Além do verapamil outros

compostos demonstraram atividade inibidora da Pgp in vitro, dentre eles pode-se

citar a ciclosporina e a quinina (Wigler e Patterson, 1994) que juntamente com

outros formaram a primeira geração de reversores (Gottesman, Fojo e Bates, 2002;

Donnenberg e Donnenberg, 2005). Entretanto, embora essas substâncias já fossem

Quadro 1

. Lista de quimioterápicos substratos dos transportadores ABC

(Adaptação de Nobili et al., 2006)

empregadas na clínica para outras indicações, seu uso como moduladores requeria

dosagens elevadas, resultando em níveis inaceitáveis de toxicidade. Por esse

motivo, novos compostos foram investigados (Nobili, 2006; Donnenberg e

Donnenberg, 2005).

A segunda geração de moduladores, composta principalmente de análogos

dos inibidores da primeira geração, visava encontrar compostos mais específicos e

menos tóxicos. Faziam parte dessa nova geração o dexverapamil e o valspodar

(PSC 833) que embora mais eficientes que os compostos originais ainda

apresentavam alta toxidez e baixa seletividade (Nobili, 2006).

Uma terceira geração de moléculas foi desenvolvida com o objetivo de driblar

as limitações dos moduladores anteriores. De fato, além de inibir especifica e

eficientemente a proteína transportadora, nenhum dos compostos dessa geração

estão em “trial” clínico em diferentes tipos de tumores, causou alterações relevantes

na farmacocinética das drogas co-administradas. Um dos compostos mais

promissores, o tariquidar, que se encontra em fase III de “trial” clínico, tem mostrado

tanto um alto potencial inibidor e quanto uma alta seletividade para a Pgp

(Hubensack et al., 2007; Fox e Bates, 2007).

Apesar dos esforços desenvolvidos, até o momento nenhum inibidor

específico para os transportadores MDR, foi aprovado para uso clínico o que levou

os cientistas a buscar abordagens alternativas para reverter ou ultrapassar esse

fenômeno. Novas estratégias para reverter o MDR, tais como o uso de

oligonucleotídeos e tecnologia de RNA de interferência (siRNA) (Rumpold et al.,

2005; Lage, 2006), tem se mostrado efetivas in vitro, mas ainda não estão em uso

clínico. Outra estratégia de grande interesse é a utilização de compostos citotóxicos

(em níveis toleráveis) que não sejam substratos para as proteínas transportadoras

MDR e que exerçam seu efeito independente da presença de transportadores

(Pérez-Tomás, 2006; Nobili et al., 2006).

Dada a inespecificidade destas bombas e o seu impacto na sobrevida dos

pacientes, a busca por substancias com o potencial de superar estes e outros

mecanismos de resistência é extremamente relevante para a clínica.

1.6. Produtos Naturais como fonte de novos quimioterápicos

Apesar da quimioterapia ter trazido soluções para muitos problemas clínicos, a

busca de novas drogas mais efetivas e com melhor seletividade ainda se faz

necessária (Borowski et al., 2005).

Vários trabalhos mostram que produtos de origem vegetal lideram as estruturas

que se tornarão a principal fonte de novos agentes com potencial farmacológico

(Newman, Cragg & Snader, 2000; 2003; Ravelo et al., 2004). Em relação a drogas

antitumorais e antiinfecciosas, cerca de 60% dos produtos já no mercado ou em

teste clínico são de origem vegetal (Gragg & Newman, 1999, 2001, 2005).

Dentre os grupos de substâncias de origem natural que possuem atividade

antitumoral, vários triterpenos já foram identificados (Pisha et al., 1995; Kim et al.,

2000; Elegbede, Flores & Wang, 2003; Lee et al., 2003; Eiznhamer, 2004). Os

triterpenos , assim como os outros compostos da classe dos terpenos, são produtos

do metabolismo secundário de plantas, biossintetizados através da ciclização do

esqualeno.

Nosso grupo vem trabalhando com uma série de triterpenos isolados de

plantas brasileiras que tiveram sua atividade tumoricida identificada. No estudo com

o ácido pomólico, um triterpeno extraído da Chrysobalanus icaco, a atividade

antitumoral deste composto em linhagens leucêmicas sensíveis e resistentes a

múltiplas drogas foi verificada (Fernandes et al., 2003). Posteriormente, foi

demonstrado que a atividade antitumoral do ácido pomólico se dá através da

apoptose num processo iniciado pela ativação da via mitocondrial e dependente de

caspase (Fernandes et al., 2005). Foi mostrado também que a atividade citotóxica

desse composto é modulada, mas não inibida pela superexpressão de proteínas

anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xl (Fernandes et al., 2007). Esse triterpeno mostrou ser

efetivo em células de pacientes portadores de leucemia mielôide crônica resistente

ou não a múltiplas drogas (Vasconcelos et al., 2007). Nosso grupo também está

investigando a atividade do ácido oleanólico, um triterpeno extraído da Licania

tomentosa, sobre uma linhagem de leucemia mielóide crônica (Koschek, 2005). Os

resultados mostraram que esse triterpeno é citotóxico para essa linhagem, matando

as células por apoptose, num processo que envolve ativação de caspase 8,9 e 3.

Outros trabalhos, direcionados para avaliar o mecanismo de atividade anti-MDR dos

triterpenos estudados mostraram que os ácidos betulínico e oleanólico matam

linhagens tumorais que expressam Pgp ou MRP1 e que enquanto o ácido betulínico

não inibe a atividade de nenhuma destas bombas (Delou, 2006), o ácido oleanólico

modula a atividade da MRP1 (Braga et al., 2007). A identificação de atividade anti-

MDR nesses triterpenos aumentou nosso interesse nesta classe de compostos.

As plantas pertencentes ao gênero Cecropia (cecropiaceae) são

popularmente empregadas para o tratamento de asma, pressão alta, diabetes e

ansiedade. Recentemente, a atividade anti-hipertensiva do extrato metanólico da C.

lyratiloba foi mostrado (Ramos Almeida et al., 2006). Apesar disso, as propriedades

farmacológicas desta planta ainda não estão bem descritas.

Como parte do programa de estudos para avaliação das propriedades

terapêuticas de plantas brasileiras, as propriedades fitoquímicas e farmacológicas da

Cecropia lyratiloba (Figura 7) estão sendo investigadas. Estudos fitoquímicos

levaram a identificação de diferentes triterpenos pentacíclicos, entre os quais o ácido

euscáfico (AE), ácido tormêntico (AT) e o ácido 3β-acetil tormêntico (AT3) (Figura 8).

Embora a atividade antitumoral do AE e do AT já tenha sido reportada (Kim et al.,

2000), o AT3 é uma estrutura pouco conhecida e sua atividade tumoral não foi

investigada. Além disso, nada se sabe sobre a ação desses triterpenos sobre

linhagens leucêmicas sensíveis ou que expressam o fenótipo MDR.

Figura 7:

Cecropia lyratiloba. Popularmente conhecida como Embaúba

Figura 8:

Estrutura dos triterpenos isolados da Embaúba.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade tumoricida e anti-MDR de

triterpenos isolados da Cecropia lyratiloba.

2.2. Objetivos específicos

• Investigar a atividade de triterpenos isolados da C. lyratiloba sobre a

viabilidade celular de linhagens tumorais leucêmicas.

• Investigar se o ácido 3β-acetil tormêntico é capaz de induzir fragmentação de

DNA

• Investigar se o ácido 3β-acetil tormêntico é capaz de perda de potencial

mitocondrial e liberação de citocromo c.

• Investigar se ácido 3β-acetil tormêntico é capaz de induzir ativação de

caspases

• Investigar o efeito do ácido 3β-acetil tormêntico na atividade da proteína

transportadora Pgp/ABCB1.

3 MATERIAL & MÉTODOS

3.1. Soluções e reagentes:

• Meio de cultura: Para a cultura das linhagens não aderentes (K562 e Lucena) foi

utilizado o meio RPMI (Life Technologies, INC., USA) complementado com HEPES

(3 g/l) (Promega, USA), glicose (2g/l) e água bi-destilada q.s.p um litro.

• Soro fetal bovino (SFB) – Fornecido por GIBCO (Carlsbad, CA). Inativado a 56ºC e

mantido a -20ºC até o uso. Utilizado no meio de cultura a 10% (v/v).

• Dimetilsulfóxido (DMSO): Fornecido pela Sigma (St Louis, MO) . Usado para

dissolver reagentes.

• Solução de HFS: solução hipotônica contendo 0,1% de Citrato de Sódio, 0,1% de

Triton X-100 e 50 µg/ml de iodeto de propídeo. Estocado 10X concentrado a -20ºC

e diluído no momento do uso (1:10).

• Rodamina 123: Fornecida pela Sigma (St Louis, MO). Solução estoque a 0,5 mg/ml

(em PBS) foi armazenada a -20ºC. A concentração de uso é 200ng/mL (em PBS).

• Verapamil - Fornecido pela Sigma (St Louis, MO). O composto foi dissolvido em

DMSO, diluído com meio até a concentração de 100 mM e estocada a -20ºC. No

momento do uso essa solução foi diluída com meio até as concentrações de 10, 25

e 50 µM

• Ciclosporina A (CSA) – Fornecido por Sigma (St Louis, MO). O composto foi

dissolvido em DMSO, diluído com meio até a concentração de 10mM e estocada a

-20ºC. No momento do uso essa solução foi diluída com meio até a concentração

de 0,5; 1 e 2 µM.

• Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol (MTT) – Fornecido pela

sigma (St Louis, MO). A concentração da solução foi de 2,5 mg/ml em PBS 1X e

mantida sob refrigeração (4ºC)

• DIOC

(3) – Fornecido pela Sigma (St Louis, MO). O composto foi dissolvido em

DMSO, diluído com meio até a concentração de 40µM e estocado a -20ºC. No

momento do uso essa solução foi diluída com PBS até a concentração de 40nM.

• Furosemida: O composto foi dissolvido em DMSO, diluído em meio até a

concentração de 20 mM e estocada a -20ºC. No momento do uso essa solução foi

diluída com meio até a concentração de 1,1 mM.

• Zvad-fmk: O reagente proveniente do Kit CaspGlow (Biovision) foi diluido com PBS

a concentração de 10µl/ml e mantido congelado a -20ºC. A concentração de uso foi

de 20µM.

• Anticorpo anti-citocromo c-PE: O anticorpo foi fornecido pela Santa Cruz

biotechnology (Santa Cruz, CA) na proporção 1:10 diluído no momento do uso com

PBS.

• Solução de Lise: Fornecido pela BD (Franklin Lakes, NJ). Mantido a 4ºC, usado na

proporção 1:10. Diluído com PBS no momento do uso.

3.2. Obtenção dos triterpenos:

Os triterpenos, ácido euscáfico (AE), ácido tormêntico (AT) e 3-acetil

tormêntico (AT3) foram extraídos da planta Cecropia lyratiloba var. lyratiloba Miquel

pelo grupo da professora Maria Kaplan. Esta foi coletada na Serra do Mendanha,

Rio de Janeiro, RJ, Brasil e identificada pelo botânico Dr. Jorge Pedro P. Carauta.

Uma amostra do espécime foi depositada no herbário Alberto Castellanos, FEEMA

(Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente), Rio de Janeiro, RJ, sobre o

número de registro (GUA 47028). Uma suspensão aquosa do extrato metanólico de

foi parcionada sucessivamente com hexano, diclorometano, acetato de etila e

butanol. A fração CH

foi submetida a cromatografia contracorrente de alta

velocidade usando uma mistura de hexano: acetato de etila: metanol: água (1: 2: X:

1) com X = [A (1.25); B (1.50) and C(1.75)] como eluente. De acordo com o perfil

obtido por TLC, o material eluido resultou na separação dos ácidos euscáfico (2α-

OH, 3α-OH), tormêntico (2α-OH, 3β-OH), e 3-acetil tormêntico (2α-OH, 3β-OAc). A

pureza e caracterização desses compostos foram determinadas pela medida de

suas GC/MS,

H and

C NMR, pontos de fusão e rotações opticais. Os triterpenos

conhecidos foram identificados por comparação com dados físicos e espectrais

anteriormente reportados. Para o uso, as soluções estoque dos triterpenos foram

preparadas em dimetilsulfoxido (1mg do composto /100µL de DMSO) e

posteriormente diluídas com meio nas concentrações de uso.

3.3. Linhagens tumorais:

O estudo da atividade citotóxica dos triterpenos, como já mencionado, foi

realizado em linhagens de leucemia mielóide crônica. Uma das linhagens utilizadas

foi a K562, estabelecida por Lozzio e colaboradores (1981), a partir de uma efusão

de liquido pleural de um paciente com LMC em fase blástica. Essa linhagem é

composta por células multipotentes, espontaneamente capazes de se diferenciar em

progenitores da série eritrocítica, granulocítica e monocítica (Lozzio e Lozzio, 1981).

Outra linhagem utilizada foi à linhagem MDR derivada da K562, Lucena-1. Esta

linhagem foi desenvolvida no laboratório da professora Vivian Rumjanek através de

exposições crescentes de células K562 ao quimioterápico vincristina até a

concentração de 60 nM (aumentando 3 nM a cada duas semanas). Ela possui cinco

vezes mais cópias do gene MDR-1 (gene da glicoproteina-p) que sua parental K562.

Similarmente, ela expressa de forma funcional e estável altos níveis de Pgp em sua

membrana plasmática. Como característica de tumor MDR, a Lucena-1 é resistente

tanto aos alcalóides da vinca quanto a outras classes de quimioterápicos não

relacionados (Rumjanek et al., 2001). As células foram mantidas em garrafas de

cultura com dois repiques semanais (10

células/ mL) em meio RPMI contendo

antibióticos (penicilina e estreptomicina) e 10% de soro fetal bovino

3.4. Avaliação da viabilidade celular:

O método de MTT (Mosmann, 1983) foi utilizado para medir o efeito dos

triterpenos na viabilidade celular das linhagens tumorais. Para o experimento, 180µl

de uma suspensão celular (10

/ poço) foram distribuídos em placas de cultura (96

poços) e mantidos em estufa de CO

(5%) a 37°C por 24 horas. Após este tempo, as

células foram incubadas com meio, diferentes concentrações dos compostos a

serem testados (ácidos euscáfico, tormêntico e 3β-acetil tormêntico) ou DMSO nas

mesmas concentrações carreadas pela droga e mantidas na estufa por diferentes

intervalos de tempo. Então, as células foram tratadas com 20µL de MTT (2,5 mg/mL)

e mantidas na estufa por 4 horas. Em seguida a placa foi centrifugada, o

sobrenadante descartado e o pellet dissolvido com 150µL de DMSO. A densidade

ótica foi medida num Leitor de ELISA (Benchmark/BioRad) a 570nm com filtro de

referência a 655nM. Para cálculo da percentagem de inibição da viabilidade celular

foram utilizadas como controle as culturas tratadas com o solvente utilizado para

dissolver os triterpenos nas mesmas concentrações carreadas por eles. Os

resultados foram expressos como média ± desvio padrão de pelo menos três

diferentes experimentos. Os valores de IC

(concentração inibitória média) dos

ensaios de atividade citotóxica foram calculados a partir das curvas de concentração

(MTT) utilizando o programa estatístico Origin 6.0.

3.5. Avaliação da morfologia celular por microscopia ótica:

Esse estudo foi realizado com a linhagem leucêmica Lucena-1. Para a

microscopia ótica, 180 µL de uma suspensão de células (10

/ poço) foram

plaqueadas em placa de cultura (96 poços) e tratadas com AT3 na concentração de

50 µg/ml por 8 horas. Após o tratamento, as células foram recolhidas e aderidas em

lâminas de vidro por centrifugação durante 3 minutos a 400 rpm, utilizando uma

citocentrifuga (Incibrás). Em seguida, as células foram coradas com um “kit” para

coloração diferencial rápida em hematologia (Instant Prov, Newpro), da seguinte

forma: a lâmina foi submersa por 10 segundos no corante I (solução de

ciclohexadieno a 0.1%), 7 segundos no corante II (solução de azobenzenosulfônico

a 0.1%) e 5 segundos no corante III (solução de fenotiazina a 0.1%). A morfologia

celular foi, então, observada em microscópio invertido (Olimpus) usando o aumento

de 400X.

3.6. Avaliação da morte celular por fragmentação de DNA:

A análise do mecanismo de morte, baseada no aparecimento de núcleos

hipodiplóides foi feita por citometria de fluxo (FACS) em células marcadas com

Iodeto de Propídio (um marcador de DNA) (Fernandes et al., 2003; 2005). Para isso,

180µl de uma suspensão de células (1x10

/ poço) foi plaqueada em placa de cultura

(96 poços) por 24 horas. Após esse período, as células foram tratadas com meio ou

com diferentes concentrações do AT3 por até 48 horas. Após esse período as

células foram centrifugadas por 10 segundos a 14000 rpm, ressuspendidas em

200µl de HFS (uma solução hipotônica de citrato de sódio a 0.1%; 0,1% de Triton X-

100 e 50 µg/ml de iodeto de propideo) e em seguida, incubadas por 60 minutos à

4ºC, no escuro. Após a incubação as amostras foram analisadas no FACS, canal FL-

2. Como controles, em alguns poços as células foram pré-incubadas por 2h com o

inibidor geral de caspases Z-vad-FMK (20 µM) ou co-incubadas com o inibidor de

Bax, furosemida na concentração de 1,1mM e então tratadas com o triterpeno. Os

resultados foram expressos como média ± desvio padrão de pelo menos três

diferentes experimentos.

3.7. Avaliação da ativação de caspases:

A ativação de caspase-3 foi medida utilizando-se o Kit comercial CaspGlow

(BioVision) conforme instruções do fabricante. Em resumo, a linhagem tumoral foi

plaqueada e tratada como descrito no item 3.2.4. Em seguida, as células foram

recolhidas em tubos especiais para Facs, centrifugadas a 1200 rpm por 7 minutos. O

pellet foi ressuspendido em 100µl da solução do Kit (1:200) e incubado por até 1

hora em estufa à 37ºC. Após esse período as células foram lavadas duas vezes com

o tampão de lavagem do Kit. A solução do Kit possui moléculas conjugadas ao

fluorocromo FITC que se ligam irreversivelmente as caspases-3 ativadas. O

percentual das células com caspase-3 ativada foi medido por citometria de fluxo,

canal FL-1. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão de pelo

menos três diferentes experimentos

3.8. Medida da variação do potencial de membrana da mitocôndria:

Para avaliar o envolvimento da via mitocondrial na apoptose foram feitas

análises da variação do potencial de membrana mitocondrial (∆ψ

) por citometria de

fluxo, em células tratadas com AT3 e marcadas com DIOC

(3) (Amarante-Mendes

et al., 1998; Ormerod, 2000). Para essa avaliação, 180 µl de uma suspensão de

células (1x10

/ poço) foram plaqueadas em placa de cultura (96 poços) e após 24h

de incubação, tratadas com meio ou com 50µg/mL do composto diferentes períodos

de tempo. Então, as células foram centrifugadas por 10 segundos a 14000 rpm,

ressuspendidas em 200 µl de uma solução contendo DIOC

(3) a 20 nM e em

seguida, incubadas por 30 minutos à 37ºC, no escuro. Após a incubação as

amostras foram analisadas no FACS, canal FL1. Os resultados foram expressos

como média ± desvio padrão de pelo menos três diferentes experimentos

3.9. Analise da liberação de citocromo c mitocondrial:

A liberação de citocromo c é um evento característico da via mitocondrial.

Assim, para confirmar o envolvimento desta via no processo de morte induzido pelo

AT3, a liberação de citocromo c foi investigada. Para isso as células foram

incubadas e tratadas com o triterpeno de escolha por vários intervalos de tempo a

fim de saber o momento em que se obtém o máximo de citocromo c citosólico. Após

esses períodos, as células foram recolhidas em tubos especiais para FACS e

centrifugadas a 1200 rpm, por 7 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet

ressuspendido em uma solução de lise (Becton, Dickinson) e incubado por 30

minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as células foram novamente

centrifugadas, e lavadas com uma solução de PBS com 5% de SFB e

recentrifugadas. Após o sobrenadante ser descartado, as células foram

ressuspendidas em 40µL da solução contendo o anticorpo anti-citocromo c-FITC

(1:10) e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, as

amostras foram analisadas por citometria de fluxo, canal FL-1.

3.10. Medida de atividade de proteínas MDR:

Este ensaio se baseia no uso da substância fluorescente, rodamina 123

(Rho 123), que é substrato para a proteína MDR, Pgp. Como esta substância entra

passivamente na célula e é extruída pela atividade desta proteína, a alteração deste

transporte pelo composto bloqueador, reflete seu efeito na atividade das proteínas

transportadoras (Neyfakh, 1988).

Para determinar o tempo no qual acontece o carregamento máximo de Rho

123 (200ng/ml) uma cinética foi realizada. Para esse experimento 160µl de uma

suspensão celular (10

células/poço) foram distribuídas em tubos especiais para

FACS. As células foram incubadas com 200ng/ml de Rho 123 por 0, 10, 20, 30 e 60

minutos (volume final em cada tubo de 200µl).

Para avaliar a presença e o funcionamento da proteína de efluxo

superexpressa na linhagem Lucena-1, 160µl de uma suspensão celular

(10

células/poço) foram distribuídas em tubos especiais para FACS. As células

foram incubadas por 30 minutos com 200ng/ml de Rho 123 na ausência e na

presença de diferentes concentrações dos bloqueadores verapamil (10, 25, 50µM)

ou ciclosporina A (0,5; 1 e 2 µM) (volume final em cada tubo de 200µl).

3.11. Efeito de AT3 sobre o carregamento de Rho 123:

Para analisar o efeito do AT3 sobre a atividade da Pgp , numa primeira etapa,

160µl de células (10

células/poço), distribuídas em tubos especiais para FACS,

foram incubadas por 30 minutos em estufa de CO

(5%) a 37ºC na presença de 20µl

do corante fluorescente Rho 123 (200 ng/mL), seguida da adição de 20µl de meio

(controle da atividade da bomba) ou 20 µl do triterpeno (12,5; 25; 37,5 ou 50µg/mL).

Células incubadas apenas com meio (sem corante) foram usadas para controle da

auto-fluorescência. Verapamil na concentração de 25 µM foi utilizado como controle

positivo. Na segunda etapa, as células foram lavadas uma vez com PBS e mantidas

em gelo (cerca de 4ºC) até o momento da leitura da fluorescência intracelular em

aparelho de FACS, canal FL-1.

4 RESULTADOS

4.1. Triterpenos da C. lyratiloba inibem a viabilidade de linhagens

leucêmicas:

O efeito dos triterpenos sobre a viabilidade de linhagens tumorais sensíveis

(K562) e resistentes a múltiplas drogas (Lucena-1) foi investigado pelo método

colorimétrico do MTT. Esse método se baseia no fato do composto MTT ser reduzido

pela enzima mitocondrial, NADH desidrogenase de células metabolicamente ativas,

gerando cristais de cor violácea chamados de Formazan (Mossman, 1983). Assim,

quanto maior a quantidade de cristal formado maior o número de células viáveis.

Primeiramente a atividade citotóxica dos triterpenos foi testada sobre a

linhagem K562. Células dessa linhagem foram incubadas por 48 horas com

diferentes concentrações dos ácidos euscáfico (AE), tormêntico (AT) e 3β-acetil

tormêntico (AT3) e então a percentagem de inibição da viabilidade foi calculada. Os

resultados mostraram que em 48h de incubação todos os triterpenos inibiram a

viabilidade celular da linhagem K562 de uma maneira dose-dependente (Figura 9).

A atividade citotóxica dos triterpenos também foi testada na linhagem MDR,

Lucena-1, que é uma linhagem derivada da linhagem K562 que expressa o fenótipo

de resistência a múltiplas drogas.

Os resultados mostraram que, assim como para a linhagem K562, o

tratamento com os triterpenos AE, AT e AT3 causou a inibição da viabilidade celular

da linhagem Lucena-1 de maneira dose dependente (Figura 10).

A concentração média inibitória (IC

) dos triterpenos para as linhagens

tumorais foi calculada a partir das curvas de concentração (tabela 1). Os valores dos

foram semelhantes entre todos os triterpenos estudados tanto para a K562

igura 9

: Efeito dos triterpenos isolados da C. lyratiloba na viabilidade celular da linhagem

de leucemia mielóide crônica, K562. 1x 10

células foram plaqueadas e 24h depois,

diferentes concentrações dos compostos foram adicionados. Após 48h de incubação a

viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os resultados expressam a média ± DP

de 4 experimentos em triplicata.

como para a Lucena-1 mostrando que eles possuem atividades antitumorais

semelhantes.

Estes resultados revelaram a presença de atividade anti-MDR nestes

triterpenos e confirmam que as diferenças estruturais não influenciam suas

atividades.

Figura 10

: Efeito dos triterpenos isolados da C. lyratiloba na viabilidade celular da linhagem

de leucemia mielóide crônica MDR, Lucena-1. 1x 10

células foram plaqueadas e 24h depois,

diferentes concentrações dos compostos foram adicionados. Após 48h de incubação a

viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os resultados expressam a média ± DP de

4 experimentos em triplicata.

4.2. AT3 induz apoptose em linhagem leucêmica MDR:

Uma vez sabendo que a MDR ainda é um desafio na quimioterapia e poucos

são os compostos capazes de driblar essa resistência e que o AT3 além de ser uma

estrutura inédita apresentou atividade citotóxica semelhante aos outros isômeros, as

outras etapas do trabalho foram realizadas utilizando esse triterpeno e a linhagem

Lucena-1.

Tendo em vista que o AT3 apresentou atividade citotóxica sobre a linhagem

Lucena-1, a próxima etapa desse trabalho foi tentar esclarecer o mecanismo de

morte induzido, assim como a via intracelular ativada por ele. Dessa maneira a

linhagem Lucena-1 foi incubada por 8 horas com AT3 na concentração de 50 µg/ml.

Após esse tempo a cultura celular foi corada e então observada ao microscópio ótico

no aumento de 400X. Nesse aumento foram observadas células com modificações

morfológicas características de apoptose, tais como condensação da cromatina,

diminuição do volume celular e corpos apoptóticos (Figura 11).

Para confirmar que o processo de morte ativado pelo AT3 era apoptose,

células foram incubadas com diferentes concentrações do triterpeno (12,5; 25; 37,5;

50 µg/ml) por 48h ou com AT3 50µg/mL por diferentes intervalos de tempos (4; 8;

12; 24 e 48 horas). Em seguida essas células foram recolhidas e analisadas quanto

Tabela1

: Concentração inibitória média (IC

) após 48h de

incubação das linhagens leucêmicas com os triterpenos

à presença de fragmentação de DNA. Isso foi feito incubando as células com um

tampão hipotônico contendo triton x-100, e iodeto de propídeo e quantificando a

percentagem de núcleos hipodiplóides por citometria de fluxo. Os resultados

mostraram que em 48 horas de tratamento o AT3 foi capaz de induzir fragmentação

de DNA de maneira dose dependente. A percentagem de fragmentação variou de

aproximadamente 20% para AT3 12,5 µg/mL a 70% para AT3 50µg/mL (Figura 12).

Uma cinética feita com 50µg/mL de AT3 mostrou que em 8 horas esse composto foi

capaz de induzir cerca de 40% de fragmentação de DNA (Figura 13).

Figura 11

: Alterações morfológicas induzidas pelo AT3 na linhagem leucêmica humana

MDR, Lucena-1. Células (1x10

/poço) foram plaqueadas e após 24 horas incubadas com

50 µg/ml de AT3 por 8 horas. Após esse tempo, as células foram centrifugadas, coradas e

observadas ao microscópio ótico (aumento de 400X). (A) Morfologia das células incubadas

apenas com meio (B) Morfologia das células tratadas com AT3. Seta preta mostra

condensação da cromatina, seta vermelha mostra fragmentação de DNA e setas azuis

mostram corpos apoptóticos.

Figura 12

: AT3 induz fragmentação de DNA na linhagem leucêmica humana MDR,

Lucena-1 de forma dose dependente. Células (1x10

/poço) foram plaqueadas e após 24

horas incubadas com diferentes concentrações de AT3 por 48 horas. Após esse tempo, as

células foram incubadas com o tampão HFS (contendo 50 µg/ml de iodeto de propídeo)

por 1h a 4ºC. A percentagem de células com fragmentação do DNA foi quantificada em

citometro de fluxo (FL-2). (A) Histograma representativo do ciclo celular da linhagem

Lucena-1. (B) Quantificação do pico sub-G1 do ciclo celular em células marcadas com

iodeto de propídeo. Os resultados expressam a média ± DP de 3 experimentos em

triplicata.

Figura 13

: AT3 induz fragmentação de DNA na linhagem leucêmica humana MDR,

Lucena-1 de forma tempo dependente. Células (1x10

/poço) foram plaqueadas e após 24

horas incubadas por diferentes tempos com 50µg/mL de AT3 por até 48 horas. Após esse

tempo, as células foram incubadas com o tampão HFS por 1h a 4ºC e a % de células com

fragmentação do DNA foi quantificada em citometro de fluxo (FL-2). (A) Histograma

representativo do ciclo celular da linhagem Lucena-1. (B) Quantificação do pico sub-G1 do

ciclo celular em células marcadas com iodeto de propídeo. Os resultados expressam a

média ± DP de 4 experimentos em triplicata.

4.3. AT3 induz ativação de caspase-3:

Caspases são os elementos chaves no processo apoptótico. Independente da

via inicial de sinalização, receptores de morte ou mitocondrial, a ativação da

maquinaria apoptótica leva à ativação de uma cascata de cisteína proteases, as

caspases, cuja atividade resulta no desmantelamento celular (Fuentes-Prior &

Salvesen, 2004; Wang, Liu e Cui, 2005). Na apoptose iniciada por ativação de

receptores de morte, a principal caspase iniciadora ativada é a 8 enquanto na via

mitocondrial, a caspase iniciadora é a caspase 9 (Chen & Wang, 2002). Nos dois

casos, a principal efetora ativada é a caspase 3. De modo a confirmar o mecanismo

de morte induzido pelo AT3, as células incubadas com 50 µg/mL de AT3 por

diferentes tempos foram avaliadas quanto à presença de caspase-3 ativada.

A ativação de caspase-3 foi avaliada utilizando um kit comercial que contem

em sua composição, moléculas conjugadas à fluoresceína (FITC). Essas moléculas

entram na célula e se ligam irreversivelmente à caspase-3 ativada e após lavagens a

fluorescência dessa população foi medida por citometria de fluxo. Como mostrado

na figura 14 foi possível observar que houve ativação de caspases-3. De modo que

em 4 horas de tratamento já é possível observar a ativação de caspase e em 48

horas o percentual de células com caspase-3 ativada chega a aproximadamente

70%.

A participação das caspases no processo de morte ativado pelo AT3 foi

confirmada quando o bloqueador geral de caspase, Zvad-fmk (20µM), foi utilizado.

Na figura 15 é possível observar que quando as células foram pré-incubadas com

Zvad o percentual de núcleos hipodiplóides foi reduzido a níveis próximos ao do

controle (Figura 15).

Figura 14: AT3 induz ativação de caspase-3 na linhagem Lucena-1. Células (1x10

/poço)

foram plaqueadas e após 24 horas, incubadas por diferentes tempos com 50 µg/mL de AT3.

Após esse período, as células foram incubadas por 1h a 37ºC com o reagente do Kit (1:200),

e após duas lavagens foram analisadas em citômetro de fluxo canal FL-1. (A) Histograma

representativo da ativação da caspase-3. (B) Quantificação do percentual de células com

ativação de caspase-3 após tratamento por diferentes tempos com AT3 (50µg/mL). Os

resultados expressam a média ± DP de 3 experimentos em triplicata.

4.4. Apoptose induzida pelo AT3 envolve ativação da via mitocondrial:

Uma vez que o mecanismo de morte induzido pelo AT3 foi identificado como

sendo apoptose, a via (intrínseca ou extrínseca) ativada por este triterpeno foi

investigada. Dados da literatura mostram que outros triterpenos induzem apoptose

por ativação da via mitocondrial (Fulda et al., 1998; Fernandes et al., 2005). Assim,

primeiramente foi investigado se o AT3 era capaz de induzir a morte por essa via

Figura 15

: Apoptose induzida por AT3 é revertida por Zvad-fmk. Células (1x10

/poço) foram

plaqueadas e após 24 horas foram pré-incubadas ou não por 2 horas com o bloqueador

geral de caspase, Zvad (20 µM). Em seguida foram tratadas por 8 horas com 50 µg/mL de

AT3. Após esse tempo, as células foram incubadas com o tampão HFS por 1h a 4ºC. O

percentual de células com fragmentação do DNA foi quantificada em citometro de fluxo (FL-

2). (A) Histograma representativo do ciclo celular da linhagem Lucena-1. (B) Quantificação

do pico sub-G1 do ciclo celular em células marcadas com iodeto de propideo. Os resultados

expressam a média ± DP de 2 experimentos em triplicata.

% Fragmentação do DNA

apoptótica. Como já mencionado, a alteração do potencial de membrana

mitocondrial, juntamente com a liberação de moléculas pró-apoptóticas do espaço

intermembranar mitocondrial, tais como citocromo c, AIF, SMAC/DIABLO são

eventos característicos da via intrínseca ou mitocondrial. Estes eventos ocorrem em

conseqüência da abertura do Poro de Permeabilidade Transitória (PTP) na

membrana da mitocôndria (Orrenius, 2004). O DIOC

(3) é um fluorocromo catiônico

que é acumulado na matriz mitocondrial devido ao gradiente eletroquímico mantido

na membrana interna de mitocôndrias viáveis. A abertura do PTP leva a alteração do

potencial de membrana interna da mitocôndria. Esta alteração de potencial é

refletida pela perda da habilidade de acumular o fluorocromo. Desse modo, a

diminuição da intensidade da fluorescência celular causada pelo menor acúmulo do

fluorocromo, reflete a perda de potencial (Amarante-Mendes et al., 1998; Ormerod,

2000; Vermes, Haanen & Reutelingsperger, 2000).

Para investigar se o AT3 é capaz de induzir alteração no potencial mitocondrial,

células da linhagem Lucena-1 foram tratadas por diferentes tempos com 50µg/ml de

AT3 e após esses períodos, incubadas com uma solução contendo DIOC

(3) e em

seguida analisadas por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que, em 12

horas, o AT3 induz perda de potencial mitocondrial (Figura 16) em cerca de 20% da

população celular analisada. Assim, para confirmar o envolvimento da via intrínseca

na morte induzida por AT3 à liberação de citocromo c, um evento peculiar da via

mitocondrial, foi avaliada. Para isso, células da linhagem Lucena-1 foram tratadas

por 8, 24 e 48 horas com 50 µg/ml de AT3 e após esse período incubadas com o

anticorpo anti-citocromo c conjugado a PE (1:10). A média de intensidade de

fluorescência foi medida por citometria de fluxo.

Os resultados mostraram que células incubadas com 50µg/ml de AT3 por

diferentes tempos apresentaram aumento nos níveis de fluorescência média quando

comparadas as células não tratadas (Figura 17). Esse dado indica que os níveis de

citocromo c citosólicos aumentaram com o tratamento. Juntos esses resultados

comprovam a participação da via mitocondrial na morte induzida pelo AT3.

Como descrito na introdução, um dos mecanismos possíveis para a liberação

de citocromo c da mitocôndria para o citosol é a abertura de um poro formado pela

proteína pro-apoptótica Bax. Assim, o envolvimento de Bax no processo apoptótico

induzido por AT3 foi avaliado utilizando-se Furosemida, um inibidor específico da

translocação de Bax do citosol para a membrana externa mitocondrial. Para isso,

células da linhagem Lucena-1 foram incubadas com AT3 50µg/mL por 8 horas na

presença ou ausência de furosemida a 1,1 mM. Após esse período a percentagem

de núcleos hipodiplóides foi avaliada por citometria. O resultado mostrou que em 8

horas de tratamento, 50µg/ml de AT3 foi capaz de induzir aproximadamente 39% de

fragmentação de DNA. No entanto, quando o AT3 foi co-incubado com o inibidor de

Bax o percentual de núcleos hipodiplóides é reduzido em cerca de 50%, como

representado na figura 18.

Figura 16: Efeito do AT3 sobre o potencial de membrana mitocondrial (

∆

) na linhagem

Lucena-1. Células (1x10

/poço) foram plaqueadas e após 24 horas incubadas por

diferentes tempos com 50 µg/mL de AT3. Após esses tempos as células foram

incubadas com uma solução de DIOC

(3) a 20 nM e a alteração de ∆ψ

medida em

citometro de fluxo (FL-1). (A) Histograma representativo da retenção de DIOC

(3) na

linhagem Lucena-1. (B) Quantificação da variação do ∆ψ

após tratamento por diferentes

tempos com 50µg/mL de AT3. Os resultados expressam a média ± DP de 5

experimentos em triplicata.

Figura 17

: AT3 aumenta os níveis de citocromo c citosólico na linhagem Lucena-1.

Células (1x10

/poço) foram plaqueadas e após 24 horas incubadas por diferentes

tempos com 50 µg/mL de AT3. Após esse período, as células foram incubadas com

anticorpo anti-citocromo c conjugado ao fluorocromo PE (1:10) por 30 minutos (A)

Histograma representativo do aumento da intensidade da fluorescência após tratamento

com AT3. (B) Quantificação da média de intensidade de fluorescência após tratamento

por diferentes tempos com AT3. Os resultados expressam a média ± DP de 3

experimentos em triplicata.

Figura 18

: Furosemida diminui os níveis de fragmentação de DNA induzida por AT3.

Células (1x10

/poço) foram plaqueadas e após 24 horas foram co-incubadas ou não

com o bloqueador de Bax, Furosemida (1,1mM) e AT3 50µg/ml por 8 horas. Após esse

tempo, as células foram incubadas com o tampão HFS por 1h a 4ºC. O percentual de

células com fragmentação do DNA foi quantificada em citometro de fluxo (FL-2). (A)

Histograma representativo do ciclo celular da linhagem Lucena-1. (B) Quantificação do

pico sub-G1 do ciclo celular em células marcadas com iodeto de propídeo. Os

resultados expressam a média ± DP de 4 experimentos em triplicatas.

% Fragmentação do DNA

4.5. AT3 não interfere com a atividade da Pgp:

Como descrito em materiais e métodos a atividade da Pgp pode ser avaliada

medindo-se a capacidade da célula MDR em reter a Rodamina 123 (Rho 123), um

substrato específico para essa proteína (Neyfakh, 1988). Assim, inicialmente o

tempo no qual o máximo de carregamento de Rodamina 123 é atingido foi

determinado. Para isso, a linhagem Lucena-1 foi incubada por diferentes tempos

(10, 20, 30 e 60 minutos) com Rodamina 123 (200ng/ml) e a fluorescência

intracelular foi avaliada por FACs. Os resultados mostraram que na faixa de 30-60

minutos o carregamento máximo de Rodamina 123 foi alcançado (Figura 19). Desta

forma, o tempo de 30 minutos foi escolhido para a realização dos demais

experimentos.

Figura 19

: Curva temporal do carregamento de Rho 123 na linhagem Lucena-1. As

células foram incubadas com Rho 123 (200ng/ml) durante diferentes tempos (10, 20,

30 e 60 minutos), lavadas com PBS e a fluorescência média intracelular referente a

quantidade de Rho 123 acumulada após o carregamento foi medida por citometria

de fluxo (FL-1).

Para comprovar a presença e funcionalidade da Pgp experimentos de

carregamento de Rho 123 foram realizados na presença ou ausência de diferentes

concentrações dos moduladores da Pgp (verapamil e ciclosporina A). Os resultados

mostraram que os inibidores utilizados foram capazes de aumentar o carregamento

da Rho 123 de forma dose dependente (Figura 20), indicando que a Pgp presente

na linhagem Lucena -1 é funcional.

Figura 20

: Efeito de bloqueadores de Pgp sobre o carregamento de Rho 123 na linhagem

Lucena-1. As células foram incubadas com Rho 123 (200ng/ml) na ausência, coluna (0), ou

na presença de diferentes concentrações de verapamil (10, 25 e 50 µM) ou CSA (0,5; 1 e 2

µM) e lavadas com PBS. A fluorescência média intracelular referente a quantidade de Rho

123 acumulada após o carregamento foi medida por citometria de fluxo (FL-1). (A) Média

de fluorescência do carregamento de Rho 123 na ausência (0) e na presença de verapamil

(VP 10, VP 25 e VP 50). (B) Média de fluorescência do carregamento de Rho 123 na

ausência (0) e na presença de CSA (CSA 0,5; CSA 1 e CSA 2).

Para a certificação de que os bloqueadores nessas concentrações e no tempo

de trinta minutos não interferem na viabilidade celular da linhagem Lucena-1, células

foram incubadas por 30 minutos com diferentes concentrações dos bloqueadores e

então a percentagem de viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT. Os

resultados mostraram que nesse tempo nenhum dos inibidores, nem mesmo na

maior concentração foi citotóxico para células dessa linhagem (Figura 21).

Figura 21

: Efeito dos bloqueadores de Pgp na viabilidade celular da Lucena-1. 1x 10

células foram transferidas para tubos de FACs e diferentes concentrações de

verapamil (A) ou ciclosporina A (B) foram adicionados. Após 30 minutos de incubação

a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Os resultados expressam a média

± DP de 3 experimentos em triplicata.

4.6. Efeito do AT3 sobre o carregamento de Rho 123:

Para investigar se o AT3 é capaz de modular a atividade de transporte da

Pgp, células da linhagem Lucena-1 foram incubadas com Rho 123 na presença e

na ausência de diferentes concentrações do AT3 ou do bloqueador verapamil

(25µM). Os resultados demonstraram que nenhuma das concentrações de AT3

utilizadas foi capaz de modular a atividade da Pgp (Figura 22). Esse dado revela que

o AT3 exerce sua ação citotóxica na célula sem interferir com a funcionalidade desta

bomba.

Figura 22

: Efeito do AT3 sobre o carregamento de Rho 123 na linhagem Lucena-1. As

células foram incubadas sem Rho 123 (coluna AF) e com Rho 123 (200ng/ml) na

ausência, [coluna (0)], ou na presença de verapamil 25 µM (coluna VP 25) ou AT3 12,5;

25; 37,5 e 50 µg/mL (colunas AT3 12,5; AT3 25; AT3 37,5 e AT3 50). A fluorescência

média intracelular referente à quantidade de Rho 123 acumulada após o carregamento

foi medida por citometria de fluxo (FL-1). (A) Histograma representativo de um

experimento de carregamento da Rho em diferentes condições (B) Média de

fluorescência do carregamento de Rho 123 na ausência (0) e na presença de AT3. Os

resultados expressam a média ± DP de 5 experimentos em triplicata.

Para garantir que as concentrações de AT3 e tempo de incubação utilizados

para avaliar o seu efeito sobre a atividade da Pgp não interferem na viabilidade

celular da linhagem Lucena-1, células foram incubadas por 30 minutos com

diferentes concentrações do composto e a percentagem de viabilidade celular foi

avaliada. Os resultados mostraram que nesse tempo nenhuma das concentrações

de AT3 foi citotóxica para células dessa linhagem (Figura 23).

Figura 23

: Efeito dos bloqueadores de Pgp na viabilidade celular da Lucena-1. 1x10

células foram plaqueadas e então, diferentes concentrações de AT3 foram

adicionadas. Após 30 minutos de incubação a viabilidade celular foi medida pelo

ensaio de MTT. Os resultados expressam a média ± DP de 3 experimentos.

5 DISCUSSÃO

Um dos maiores problemas na terapia do câncer é a expressão do fenótipo de

resistência a múltiplas drogas nos tumores. Dificuldades encontradas no

desenvolvimento de estratégias que possam ser utilizadas pela clínica para vencer

esse problema têm incentivado a busca por compostos que não sejam substratos

para as proteínas MDR, ou seja, compostos capazes de matar tumores MDR. Nos

últimos anos, produtos naturais e modificações químicas de drogas antitumorais já

existentes tem liderado a busca por novos agentes anti-neoplásicos. Esse trabalho

investigou a atividade antitumoral dos triterpenos ácido euscáfico (AE), tormêntico

(AT) e 3β-acetil tormêntico (AT3), isolados da Cecropia lyratiloba, uma planta

conhecida popularmente como Embaúba.

Os dados obtidos mostraram que os três triterpenos são ativos contra

linhagens leucêmicas sensível (K562) e resistente a múltiplas drogas - MDR

(Lucena-1). A atividade antitumoral de alguns desses triterpenos não está limitada a

leucemias. Trabalho de nosso grupo mostrou que o AE é capaz de inibir a

viabilidade celular de tumores sólidos tais como cólon, pulmão e laringe (Rocha et

al., 2007) e que o AT3 é efetivo também em células de melanoma murino (dados

não publicados). Além disso, a capacidade de matar células que expressam o

fenótipo MDR não é específica para esses triterpenos uma vez que resultados

semelhantes foram descritos para outros triterpenos como os ácidos betulínico

(Fernandes et al., 2003; Jung et al., 2007) e pomólico (Fernandes et al., 2003, 2005;

Vascancelos et al., 2007). A avaliação da concentração de triterpeno necessária

para inibir a viabilidade celular em 50% das células (IC

), revelou que os três

triterpenos isolados da C. lyratiloba têm atividade semelhante, mostrando que as

diferenças na estrutura da molécula não interferem com o potencial citotóxico. Além

disso, a diferença dos valores de IC

obtidos para a linhagem sensível e resistente é

muito pequena. Como a Lucena-1 expressa 20X mais Pgp que a sua parental K562,

esses resultados indicam que a atividade dos triterpenos não é alterada pela

superexpressão da Pgp (Rocha et al., 2007). Resultados semelhantes foram

observados com o ácido pomólico (Fernandes et al., 2003; Vasconcelos et al.,

2007).

Tendo em vista a similaridade do potencial antitumoral dos triterpenos da C.

lyratiloba, o ácido 3β-acetil tormêntico foi escolhido para o estudo do mecanismo de

ação e das vias de transdução de sinal da atividade desses triterpenos sobre a

linhagem MDR Lucena 1. Os resultados obtidos mostraram que 3β-acetil tormêntico

induz apoptose de maneira dose e tempo dependente, num processo dependente da

ativação de caspases uma vez que tratamento com zVAD, um inibidor geral de

caspases, diminuiu severamente a apoptose induzida por esse triterpeno.

A investigação das vias de sinalização envolvidas na toxidez do AT3,

mostrando alteração do potencial mitocondrial e liberação de citocromo c, indica a

ativação da via mitocondrial. A ativação dessa via apoptótica já foi descrita para

outros triterpenos entre eles, os ácidos betulínico (Fulda et al., 2001) e pomólico

(Fernandes et al., 2005). O 3β-acetil tormêntico também induz alteração do

potencial mitocondrial indicando que sua atividade é mediada pela via intrínseca.

Entretanto, seu efeito é mais moderado do que o observado com o ácido pomólico

em HL-60 (Fernandes et al., 2005). Assim, enquanto esse triterpeno induz perda de

potencial mitocondrial (∆

) em cerca de 80% das células, com o AT3 observou-se

desacoplamento em 20% das células de Lucena-1.

Classicamente, na ativação da apoptose pela via intrínseca, há alteração do

potencial de membrana interna mitocondrial (∆

), seguida da liberação de

citocromo c mitocondrial, ativação de caspases e fragmentação nuclear. O

fenômeno de alteração do potencial de membrana interna mitocondrial é causado

pelo aumento na permeabilidade transitória da membrana mitocondrial (Fulda et al.,

1998; Tsujimoto e Shimizu, 2007), que pode ser gerado pela abertura do poro de

permeabilidade de transição. Entretanto, não há qualquer citação na literatura sobre

quanto de despolarização é necessária para induzir apoptose. Porém, há relatos de

apoptose em situações de pouca perda de potencial mitocondrial (Ly et al., 2003;

Schimmer et al., 2001; Li, Du e Darzynkiewicz, 2000). Finucane e colaboradores

(1999) mostraram que células da linhagem HL-60 tratadas com estaurosporina

sofrem apoptose com liberação de citocromo c mitocondrial e ativação de caspases,

mas com pequena alteração no ∆ψ

. Portanto, esses resultados suportam a

sugestão de que o AT3 esteja induzindo apoptose pela via mitocondrial apesar da

percentagem de células que apresentam alteração no ∆ψ

ser menor que a de

fragmentação de DNA.

A liberação de citocromo c é uma etapa crucial na ativação intrínseca (Bayir et

al., 2006). Algumas hipóteses poderiam ser levantadas para explicar a relação entre

o efeito do AT3 sobre o potencial de membrana mitocondrial e a liberação de

citocromo c. Dados da literatura mostram que o poro de permeabilidade transitória

pode operar de dois modos: (1) em estado de alta condutância, o qual está

associado com uma abertura persistente do poro de permeabilidade transitória,

resultando numa redução do

∆ψ

prolongada e marcante. (2) em estado de baixa

condutância, que está associado com uma abertura transitória do poro e uma

alteração passageira do ∆ψ

(Szalai et al., 1999). Portanto, pode-se postular que a

liberação de citocromo c induzida pelo AT3 não necessite da completa e irreversível

redução no potencial de membrana mitocondrial, mas esteja relacionada à abertura

transitória do poro, operando em baixa condutância. Também tem sido descrito que

proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 tais como Bax poderiam, ao se translocar

para a membrana externa mitocondrial, formar canais que levariam a saída do

citocromo c para o citoplasma (Gogvadze et al., 2001). Outra possibilidade seria a

interferência do AT3 nesse processo. Yang e colaboradores (2005) mostraram que o

tratamento de uma linhagem leucêmica com o composto TGHQ resultou em baixa

perda de potencial mitocondrial e indução de apoptose caracterizada pela ativação

das caspases 9 e 3 e liberação de citocromo c. Além disso, esse composto também

induziu translocação de Bax do citosol para a mitocôndria. Os resultados obtidos

com o AT3 sugerem que ele seja capaz de induzir a translocação de Bax para a

mitocôndria. De fato, em células co-incubadas com furosemida, um inibidor

específico da translocação de Bax, o percentual de fragmentação de DNA induzido

por AT3 foi reduzido em cerca de 50%, sugerindo o envolvimento de Bax na

apoptose induzida pelo AT3. Entretanto como mostrado em resultados à inibição de

Bax não inibiu totalmente a morte induzido pelo AT3 sugerindo o envolvimento de

outras moléculas pró-apoptóticas.

O fato do AT3 mostrar efeito citotóxico em células que expressam o fenótipo

MDR e baixa toxidez para linfócitos ativados (50% menor que o observado na célula

tumoral) apontam este triterpeno como um composto de grande potencial para o

tratamento de tumores resistentes a múltiplas drogas.

A MDR é reconhecidamente

uma das principais causas de falha na quimioterapia do câncer e piora

significativamente o prognóstico do paciente. Na grande maioria dos casos os

tumores desenvolvem algum tipo de resistência em poucos anos, o que os torna

fatais.

A superexpressão de proteínas transportadoras é um dos mecanismos efetores

da MDR mais bem conhecidos (Mimeault et al., 2007; Haimeur et al., 2004; Kourti et

al., 2007). Estas proteínas extruem ativamente os quimioterápicos da célula,

reduzindo sua concentração intracelular e, desse modo, impedindo que eles

exerçam seu efeito citotóxico. A maioria dos quimioterápicos comumente usados,

tais como os taxanos, antraciclinas, alcalóides da vinca são substratos para uma ou

mais bombas (Ozvegy-Laczka et al., 2005). Mesmo drogas alvo específicas como os

inibidores de tirosina cinase têm mostrado ser substratos para algumas dessas

bombas. Investigadores têm relatado a correlação entre uma baixa resposta ao

tratamento e superexpressão de Pgp ou MRP1 em diversos tipos de tumores sólidos

e leucemias (Larkin et al., 2004; van der Heuvel-Eibrink et al., 2001; van der Kolk et

al., 2000). Estudos têm demonstrado que a expressão intrínseca ou adquirida da

Pgp é uma das causas mais freqüente deste fenótipo de resistência na clínica. Por

exemplo, pacientes com carcinoma mamário expressando Pgp estão três vezes

mais suscetíveis à falhas na resposta a quimioterapia que pacientes cujos tumores

são Pgp negativo (Trock et al., 1997). A percentagem de pacientes com leucemia

mielóide aguda (MLA) que tem superexpressão de Pgp é alta no diagnóstico (30%),

aumenta na primeira recaída (50%) e é maior em pacientes idosos (70%) (Leith et

al.,1998). Nessa neoplasia a superexpressão de Pgp ou do gene MDR1, reduz

significativamente a taxa de remissão do paciente (del Poeta et al.,1999).

Após 30 anos de investimentos no conhecimento sobre esses transportadores

ainda não existem estratégias terapêuticas capazes de superar a ação dessas

bombas de efluxo no tumor (O`Connor, 2007). Uma das primeiras estratégias

terapêuticas utilizadas para reverter o fenótipo MDR envolve o uso de moduladores

ou reversores como adjuvantes em regimes terapêuticos com as drogas disponíveis

no mercado. Entretanto, nos estudos clínicos, todas as gerações de inibidores

desenvolvidos, mesmo aqueles mais específicos (de terceira geração) não

proporcionaram melhorias ao tratamento (Szakacs et al., 2006). Um dos problemas

dessa estratégia é a pouca seletividade dos atuais inibidores, visto que esses

transportadores são expressos fisiologicamente nos tecidos do corpo (Kuppens et

al., 2005; Breedveld, Beijnen Schellens, 2006). Por isso o uso de moduladores gera

uma série de efeitos colaterais para o paciente como evidenciados por estudos

clínicos (Sonneveld et al., 2001; Dalton et al., 1995).

A ineficiência dessa estratégia impulsionou os cientistas a buscarem novas

abordagens terapêuticas para superar a MDR. A pesquisa por novas substâncias

capazes de matar um tumor MDR sem a necessidade do uso de um modulador é

uma das estratégias mais promissoras. O uso de um composto que não seja

substrato para a bomba, ou seja, que consiga matar um tumor MDR sem interferir

com o funcionamento do transportador é de grande relevância para a clínica. Isso

devido à presença fisiológica das proteínas MDR nos tecidos, as quais são afetadas

indiscriminadamente pelo uso de bloqueadores não seletivos. Por isso, o tratamento

adjuvante com um modulador geralmente leva ao aumento dos níveis de toxidez do

quimioterápico. O AT3, diferentemente de moduladores convencionais da Pgp como

o verapamil e a ciclosporina A, não aumentou a quantidade de Rodamina 123

carregada, ou seja, o AT3 não interferiu com o funcionamento da Pgp e por isso a

quantidade de Rodamina 123 acumulada durante o período de carregamento foi

baixa. Esses resultados sugerem fortemente que o AT3 não seja substrato para a

Pgp e que seu efeito citotóxico em tumores que superexpressam essa proteína se

dê independentemente da presença desta bomba. A ineficácia dos quimioterápicos

disponíveis na clínica para o tratamento de um tumor MDR, como por exemplo, as

leucemias mielôide crônica que superexpressam Pgp e são por isso resistentes ao

Imatinib, torna o AT3 uma grande promessa para o tratamento desse tipo de tumor e

também uma esperança para pacientes, até então, desenganados pelos médicos.

Atualmente, ainda são poucos os candidatos a quimioterápicos, relatados na

literatura, com capacidade de matar tumores resistentes a múltiplas drogas. Entre os

raros compostos com esse tipo de potencial temos a curcumina e seus derivados, os

quais possuem atividade citotóxica em linhagem de tumor de mama MDR (Poma et

al., 2007), as lectinas que são capazes de inibir a viabilidade tanto de tumor de cólon

sensível quando resistente a múltiplas drogas (Valentiner et al., 2002) e a

dimetilesfingosina que é citotóxica contra linhagens de leucemia mielóide aguda

humana sensível e MDR (Jendiroba et al., 2002). Além disso, parte dos esforços

para driblar a resistência a múltiplas drogas tem sido direcionada na tentativa de

“melhorar” os quimioterápicos já disponíveis. Nesse campo nos temos estudos com

daunorubicina glicosilada, que tem mostrado capacidade de matar linhagens de

leucemia que superexpressa P-gp (Fang et al., 2006) e os derivados do taxol, os

quais se mostraram ativos em tumores MDR (Geney et al., 2002). No entanto, a

grande maioria dos artigos ainda descrevem a descoberta de compostos com

potencial de inibir a atividade da Pgp (Lim et al., 2007; Meschini et al., 2007; Mei et

al., 2004; Molnár et al., 2004). Juntas, essas informações revelam a dificuldade de

se encontrar compostos com atividade anti-MDR e ressaltam mais uma vez a

relevância dos resultados obtidos com o AT3.

Como mencionado, outras proteínas transportadoras são capazes de conferir

o fenótipo MDR, por isso o efeito do AT3 sobre a funcionalidade de outras proteínas

MDR tais como MRP1 e BCRP será investigado futuramente, assim como o efeito do

AT3 sobre células que expressam outros mecanismos de resistência, tais como

superexpressão de Bcl-2 e IAPs.

6 CONCLUSÕES

Portanto este trabalho corrobora com outros trabalhos da literatura que

apresentam os triterpenos como uma classe de produtos naturais com excelente

potencial antitumoral. Todos os triterpenos extraídos da planta C.lyratiloba testados

inibiram a viabilidade das linhagens de leucemia mielóide crônica, incluindo a que

expressa o fenótipo MDR. Dentre esses, o 3β-acetil tormêntico, semelhantemente a

outros triterpenos, demonstrou ser capaz de ativar a via intrínseca da apoptose

induzindo a permeabilização de membrana externa mitocondrial e liberação de

citocromo c. Também foi demonstrado nesse trabalho que esse composto não

interfere na atividade da proteína MDR, glicoproteína-P o que sugere o 3β-acetil

tormêntico como um composto que pode ser usado no tratamento de tumores que

superexpressam essa proteína.

7 PERSPECTIVAS

Dando continuidade ao estudo da atividade antitumoral dos triterpenos

isolados da Cecropia lyratiloba pretendo ainda:

1. Verificar a ativação das caspases iniciadoras 8 e 9 na via apoptótica induzida

pelo AT3

2. Verificar se AT3 é capaz de modular os níveis de ROS e se esta modulação está

envolvida na indução da morte celular

3. Medir os níveis de Bax citosólicos e mitocondriais

4. Verificar se a inibição da translocação de Bax diminui o nível de citocromo c

liberado no citosol.

5. Estudar se o AT3 interfere com os níveis e atividades de proteínas sinalizadoras

como as MAPK

6. Estudar o efeito de AT3 sobre a atividade de outras proteínas MDR como as

MRP e a BCRP.

7. Verificar se o AT3 é citotóxico para tumores in vivo e em células de pacientes

que expressem ou não o fenótipo de resistência a múltiplas drogas.

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Páginas consultadas:

INCA, 2007: http://www.inca.gov.br

World Health Organization, 2007: http://www.who.int/cancer/en/

9. ANEXOS

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