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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS ARARAQUARA
ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E
ANTI-TUMORAL DE PROTEINAS INATIVADORAS DE RIBOSSOMOS
EXTRAÍDAS DE PLANTAS
DJAMILE CORDEIRO DE MATOS
ARARAQUARA – SP
2008
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS ARARAQUARA
ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E
ANTI-TUMORAL DE PROTEINAS INATIVADORAS DE RIBOSSOMOS
EXTRAÍDAS DE PLANTAS
DJAMILE CORDEIRO DE MATOS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós Graduação em Análises Clínicas
da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas – UNESP, Campus de
Araraquara, como pré-requisito para a
obtenção do título de Mestre em
Análises Clínicas
Orientadora: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos
ARARAQUARA – SP
2008
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Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
CAPES: 40300005
Matos, Djamile Cordeiro
M433e Estudo comparativo da atividade anti-inflamatória e anti-tumoral de
proteínas inativadoras de ribossomos extraídas de plantas. / Djamile
Cordeiro Matos. – Araraquara, 2008.
116 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação
em Análises Clínicas
Orientador: Iracilda Zeppone Carlos
. 1.Câncer de mama. 2.Câncer de pulmão. 3. Citocinas. I.Carlos,
Iracilda Zeppone, orient. II. Título.
I
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Imunologia Clínica
do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista (UNESP)
de Araraquara com auxílio de bolsa CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior).
II
Aos meus pais,
Vania e Everardo,
com meu eterno
agradecimento,
carinho e amor.
III
" Deus nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados,
capacita os escolhidos.
Fazer ou não fazer é algo que só depende de nossa
vontade e perseverança."
Albert Einstein
IV
Agradecimentos
À Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Farmacêuticas -
Departamento de Análises Clínicas, Laboratório de Imunologia Clínica, pela oportunidade
oferecida.
À Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos, pelo constante entusiasmo, pela orientação
recebida, como também pela amizade demonstrada durante o desenvolvimento desse
trabalho, sempre me dando apoio quando eu desanimava com alguma tarefa.
Ao pesquisador Dr. André Luiz Coelho, por todo apoio dado no início da pesquisa na
forma de informações e material e quando houve problema com as amostras, dando
informações de como resolver.
À Profa. Dra. Ana Paula Ulian pelo apoio dado cedendo as instalações do laboratório
para que eu pudesse isolar a abrina e ricina e por fornecer a pulchelina para a minha
pesquisa.
À Profa. Dra. Ana Cristina Moreira pela ajuda dada no isolamento das proteínas, que
sem essa ajuda eu não teria conseguido isolar sozinhas as proteínas e, provalvemente, eu
não teria sido capaz de realizar este trabalho.
Aos meus queridos pais, Vania e Everardo, por terem sempre estado ao meu lado
apoiando-me em todas as minhas decisões e dando-me todo o carinho e amor. Além de me
ajudarem em todas as etapas desta pesquisa, corrigindo meus erros, apontando soluções
para os problemas que surgiram. Minha eterna gratidão a vocês por serem pais tão
especiais e queridos. Melhores pais eu não poderia pedir a Deus.
Ao meu querido amigo Kico por ter sempre estado ao meu lado, dando-me apoio nos
momentos em que estava cansada e desanimada, sempre conversando comigo até eu
dormir, quando eu tinha insônia.
Aos meus amigos e colegas do laboratório por todo apoio e companheirismo no
tempo que passamos juntos.
V
À Marisa, que sempre me ajudou em todas as etapas desta pesquisa. Obrigada por
tudo, Marisa, do fundo do meu coração. Sem você me ajudando, não sei o que teria sido de
mim.
À Carol, por todos os momentos de descontração, pela companhia às idas às
compras, pelas brincadeiras e tudo mais que passamos juntas.
VI
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
IX
LISTA DE FIGURAS
X
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
XI
RESUMO
XIV
ABSTRACT
XV
Capítulo 1
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4
2.1 – Câncer 4
2.2 – Sistema Imune 5
2.3 – Medicamentos de origem vegetal usados no tratamento do
câncer
11
2.4 – RIPs (Proteínas Inativadoras de Ribossomos) 12
2.4.1 – Usos das RIPs na área de saúde 15
2.5 – Abrus precatorius L. 16
2.6 – Ricinus communis L. 20
2.7 – Abrus pulchellus tenuiflorus 24
3. OBJETIVOS
28
3.1 – Geral 28
3.2 – Específicos 28
4. MATERIAIS E MÉTODOS
29
4.1 – Origem das amostras 29
4.2 – Etapa química 29
4.2.1 – Obtenção do extrato bruto das plantas A.
precatorius e R. Communis
29
4.2.2 – Purificação da abrina e ricina 30
4.3 – Etapa Imunológica 30
4.3.1 – Animais 30
4.3.2 – Obtenção das células do exudato peritoneal 30
4.3.3 – Obtenção dos sobrenadantes das culturas de
células do exsudato peritoneal
31
VII
4.3.4 – Obtenção das células esplênicas 32
4.3.5 – Obtenção dos sobrenadantes das culturas de
células esplênicas
33
4.3.6 – Linhagens celulares 33
4.3.6.1 – Células LM3 e LP07 33
4.3.7 – Avaliação da viabilidade celular de células do
exsudato peritoneal
34
4.3.8 – Avaliação da viabilidade celular das células
esplênicas
35
4.3.9 – Determinação da produção de óxido nítrico 35
4.3.10 – Determinação da atividade inibitória da abrina, da
ricina e da pulchelina em cultura de células peritoneais de
camundongos quanto à produção de NO
36
4.3.11 – Determinação da produção de peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
)
36
4.3.12 – Determinação da atividade inibitória da abrina, da
ricina e da pulchelina em cultura de células peritoneais de
camundongos quanto à produção de H
2
O
2
37
4.3.13 – Cálculo da percentagem de inibição 37
4.3.14 - Dosagem das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12,
TNF-α e IFN-γ
38
4.3.15 – Determinação da atividade anti-proliferativa em
células LM3 e LP07
39
4.3.16 – Análise estatística dos Resultados 40
5. RESULTADOS
41
5.1 – Isolamento das proteínas 41
5.2 – Viabilidade celular em células peritoneais e células
esplênicas
41
5.3 – Determinação da produção de óxido nítrico 45
5.4 – Determinação da produção de peróxido de hidrogênio 48
5.5 – Determinação da antividade inibitória quanto à produção
de NO e H
2
O
2
51
VIII
5.6 – Dosagem das citocinas IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-
α
, IFN-
γ
e
IL-10
53
5.7 – Determinação da atividade anti-proliferativa em células
LM3 e LP07
57
6. DISCUSSÃO
59
7. CONCLUSÕES
71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
Capítulo II
ARTIGO 99
9. APÊNDICE
124
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Porcentagem de viabilidade celular em PEC e células
esplênicas murinas
44
Tabela 2 – Efeitos das RIPs abrina, ricina e pulchelina na produção de
óxido nítrico em culturas de células peritoneais
47
Tabela 3 – Efeitos das RIPs abrina, ricina e pulchelina na produção de
peróxido de hidrogênio em culturas de células peritoneais
50
Tabela 4 – Percentagem de inibição das RIPs sobre a produção de H
2
O
2
e NO em macrófagos peritoneais
52
Tabela 5 – Indução de citocinas por abrina, ricina e pulchelina em células
peritoneais (IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α) e em células esplênicas (IL-10 e
IFN-γ)
56
Tabela 6 – Valores de IC 50 dos compostos para as células LM3 e LP07
após 24 horas de exposição
58
Tabela 7 – Valores de IC 50 dos compostos para as células LM3 e LP07
após 48 horas de exposição
58
X
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: Estrutura molecular do Taxol
®
12
FIGURA 2: Alinhamento esquemático das RIPs representando uma
comparação entre suas estruturas primárias
14
FIGURA 3: Fotos das flores, frutos, sementes e da planta Abrus
precatorius L.
18
FIGURA 4: Fotos da planta, das flores e sementes e da planta Ricinus
communis L.
21
FIGURA 5: Fotos da planta, vagem e flor de Abrus pulchellus
subespécie tenuiflorus
25
FIGURA 6: Viabilidade das células do exsudato peritoneal na
presença de diferentes concentrações da abrina, ricina e
pulchelina.
42
FIGURA 7: Viabilidade de células do exsudato peritoneal e células
esplênicas de camundongos Swiss na presença das
proteínas abrina, ricina e pulchelina
43
FIGURA 8: Produção de óxido nítrico em cultura de macrófagos
Peritoneais
46
FIGURA 9: Produção de peróxido de hidrogênio em cultura de células do
exsudato peritoneal
49
FIGURA 10: Indução de citocinas por abrina, ricina e pulchelina em
macrófagos peritoneais
54
FIGURA 11: Indução de citocinas por abrina, ricina e pulchelina em
células esplênicas
55
XI
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
°C graus Celsius
µg Microgramas
µg/Sq
Micrograma por Square metre
µL Microlitros
µM
Micromolar
µmols Micromols
Å Angstroms
ANOVA Análise de variância
Apaf-1 Fator de ativação de protease apoptótica 1
BSA Buffer Storage Area
BSS Buffer Based Scheduler
BMS Bristol-Myers Squibb
Células NK Células natural killer
Cys Cisteína
cm Centímetro
CO
2
Dióxido de carbon
ConA Concanavalina A
ConBr Concanavalina Br – lectina de Concavalia brasiliensis
cNOS Óxido nítrico sintetase constitutiva
DNA Ácido desoxirribonucléico
D.O. Densidade óptica
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
ER Retículo endoplasmático
EUA Estados Unidos da América
GlcNAc N-acetilglucosamina
GM-CSF Fator estimulante de colônia granulócitos-macrófagos
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
IC
50
Concentração inibitória de 50%
IFN-γ
Interferon-gama
IgE Imunoglobulina E
kDa Quilodaltons
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-2 Interleucina 2
IL-4 Interleucina 4
XII
IL-5 Interleucina 5
IL-6 Interleucina 6
IL-12 Interleucina 12
IL-13 Interleucina 13
LM3 Linhagem de adenocarcinoma de mama
LP07 Linhagem de adenocarcinoma de pulmão
LPS Lipopolissacarídeo
m Metro
M Molar
MAPK Proteinoquinase ativada por mitógeno
MEM Minimum Essencial Medium
mg/Kg Miligramas por quilograma
Min. Minutos
mL Mililitros
mM Milimolar
mm Milímetros
MMPs metaloproteinases de matriz
MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólico
NaCl Cloreto de sódio
NaNO
2
Nitrito de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NF-κB Fator nuclear κB
ng/mL Nanogramas por mililitro
nm Nanomolar
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintetase
O
2
Gás oxigênio
O
2
⋅ -
Íon superóxido
PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos
PAP Pokeweed antiviral proteins
PBS Solução salina tamponada com fosfatos
PEC Células do exsudato peritoneal
PMA Acetato de forbol miristato
Pser Serina fosforilada
RIPs Proteína inativadoras de ribossomos
RNA Ácido ribonucléico
XIII
rRNA Ácido ribonucléico ribossômico
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura – série 1640)
Th1 Tipo de linfócito T helper
Th2 Tipo de linfócito T helper
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TNF-R1 Receptor do fator de necrose tumoral
UNIFOR Universidade de Fortaleza
USP Universidade de São Paulo
UV Ultravioleta
XIV
RESUMO
O câncer é a segunda maior causa de morte em países industrializados,
sendo superado somente para as doenças cardíacas. Os dois tipos de cânceres de
maior incidência no homem são o de próstata e de pulmão, e entre as mulheres são
de mama e de cólon do útero. Abrina, ricina e pulchelina são proteínas inativadoras
de ribossomos do tipo II (RIPs), possuidoras de duas cadeias polipeptídicas, uma
com atividade enzimática N-glicosidase e a outra lectínica. Neste trabalho, a
resposta imune desencadeada pelas RIPs e a atividade anti-proliferativa contra
células tumorais de mama (LM3) e de pulmão (LP07) foram avaliadas. Abrina, ricina
e pulchelina mostraram-se muito tóxicas aos macrófagos (IC
50
= 6,4 ± 1,53, 11,8 ±
1,66 e 19,3 ± 4,0, respectivamente), sendo a abrina a mais tóxica de todas, seguida
pela ricina e esta pela pulchelina. As proteínas não estimularam a produção de NO e
H2O2 em células do exsudato peritoneal, mas causaram leve inibição da produção
de NO estimulada por LPS e uma forte inibição da produção de H2O2 estimulada
pelo PMA. As proteínas testadas estimularam resposta do tipo Th1 e Th2, pois
induziram a produção de IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-12 e IL-10. As células LM3
(adenocarcinoma de mama murino) e LP07 (adenocarcinoma de pulmão murino)
foram mais sensíveis ao potencial tóxico de abrina, ricina e pulchelina do que do
Taxol após 24 e 48 horas de incubação.
PALAVRAS-CHAVE: câncer de mama, câncer de pulmão, abrina, ricina, pulchelina,
taxol, óxido nítrico, peróxido de hidrogênio, citocinas.
XV
ABSTRACT
Cancer is the second major cause of death in industrialized countries, second
only to cardiac diseases. The two more incident cancer types in men are prostate
and lung cancer, and in women are breast and colon cancer. Abrin, ricin and
pulchellin are type II ribosome inactivating proteins (RIPs); they have two polypeptide
chains, one with N-glycosidase activity, and the other lectinic. In this research, we
evaluated the immune response induced by these RIPs and the anti-proliferative
activity against tumoral cells of breast (LM3) and lung (LP07). Abrin, ricin and
pulchellin showed citotoxicity to exsudate peritoneal cells (IC
50
= 6.4 ± 1.53, 11.8 ±
1.66 e 19.3 ± 4.0, respectively). The abrin was the most toxic of all, followed by ricin
and pulchellin. Abrin, ricin and pulchellin didn’t stimulate NO and H
2
O
2
production in
PEC, although they caused a low inhibition of LPS’ NO production stimulation, and a
high inhibition of PMA’s H
2
O
2
production stimulation. The proteins induced a Th1 and
Th2 response; characterized by their ability to stimulated IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-12 e
IL-10 production. The LM3 cells (murine breast adenocarcinoma) and LP07 cells
(murine lung adenocarcinoma) were more sensible to the proteins’ citotoxicity than
Taxol’s citotoxicity after 24 and 48 hours of incubation.
Key-words: breast cancer, lung cancer, abrin, ricin, pulchellin, Taxol, nitric oxide,
hydrogen peroxide, cytokines.
Capítulo 1
1
1- INTRODUÇÃO
O termo “câncer” corresponde ao conjunto de cerca de 100 doenças que têm
em comum o crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos,
podendo metastisar para outras regiões do corpo (Instituto Nacional de Câncer,
2008).
A estimativa de pesquisadores era de que o número de casos novos de câncer
no mundo seria de mais de 10 milhões, dentre os quais, 53% dos casos ocorreriam
nos países em desenvolvimento. Os tumores de pulmão (902.000 casos novos) e
próstata (543 mil) foram os mais freqüentes no sexo masculino, enquanto que no
sexo feminino observaram-se as maiores ocorrências nos tumores de mama (1
milhão de casos novos) e colo do útero (471.000) (PARKIN et al., 2001).
O câncer de pulmão vem representando um grande desafio para os
oncologistas, uma vez que, apesar de todos os avanços diagnósticos e terapêuticos,
a taxa de sobrevida global em cinco anos permanece inalterada em 13% ao longo
das últimas décadas. Clinicamente, o câncer de pulmão é classificado em carcinoma
de pulmão de células não-pequenas (CPCNP) e carcinoma de pulmão de células
pequenas (CPCP). O CPCNP é o mais freqüente, 75 a 80% de todos os casos, e
nestes pacientes o estadiamento clínico é fundamental para estabelecer a estratégia
terapêutica (GINSBERG, VOKES, RABEN, 1997).
Inicialmente o tratamento de carcinoma pulmonar era a cirurgia, fornecendo
uma sobrevida de 3 a 4 meses, sendo posteriormente substituído por radioterapia,
permitindo 6 meses de sobrevida, e, finalmente por quimioterapia sistêmica, esta
fornecendo uma maior sobrevida, de 14 meses nos pacientes tratados (JOHNSON,
GRECO, 1986).
A maioria dos tumores de mama tem seu crescimento relacionado com os
níveis de estrógeno. Com isso, os cânceres de mama ocorrem, principalmente, em
mulheres pós-menopausa, quando a produção de estrógeno pelos ovários está
prejudicada (ACKERMAN et al., 1981). Carcinoma de mama em homens é raro, mas
representa 1% dos casos de câncer masculino. Muitos dos fatores de risco de
câncer de mama em homens envolvem anormalidades no balanço estrógeno e
andrógeno.
2
Fagócitos mononucleares são de extrema importância para a defesa
imunológica do organismo, sendo os macrófagos bem conhecidos por iniciarem uma
resposta imune inata efetiva contra microrganismos (TAYLOR et al., 2005). Os
macrófagos são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da
produção de diversas moléculas e apresentação de antígenos às células T,
conduzindo à expansão e diferenciação de linfócitos específicos para corpos
estranhos e células tumorais (POZZI et al., 2005; PREYNAT-SEAUVE et al., 2006).
A fauna e flora brasileira são importantes fontes de novas substâncias com
potencial terapêutico. As plantas usadas na medicina tradicional e popular têm sido
aceitas, atualmente, como uma fonte importante no descobrimento e
desenvolvimento de drogas para a quimio-prevenção de câncer (ABDULLAEV,
2001).
As espécies sub-arbustivas brasileiras Abrus precatorius (jequiriti) e Abrus
pulchellus subsp. tenuiflorus, pertencem à família Papilionoideae, tribo Abrae e ao
gênero Abrus (MOTA, 1997). O Ricinus communis (mamona) pertence à família
Euphorbiaceae e ao gênero Ricinus (STIRPE, BARBIERI, 1986). A partir das
sementes destas plantas obtêm-se abrina (A. precatorius), ricina (R. communis) e
pulchelina (A. pulchellus). Estas são proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) do
tipo II, possuindo duas cadeias peptídicas unidas por ponte dissulfídicas, sendo que
uma das cadeias possui atividade enzimática N-glicosilase, e a outra cadeia, possui
atividade lectínica.
As RIPs manifestam uma série de atividades biológicas incluindo atividades de
inibição de tradução, e atividades RNA N-glicosilases, antimitogênica,
imunomoduladora, antiproliferativa e antifúngica. Além disso, as RIPs têm efeitos
imunossupressores, tanto sobre a resposta humoral como mediada por células, com
isso, sua administração previne a formação de anticorpos e retarda a rejeição de
transplantes (SPREAFICO et al., 1983; DESCOTES et al., 1985; BENIGNI et al.,
1995). Contudo, essas proteínas são extremamente imunogênicas (THORPE et al.,
1989).
Neste trabalho procuramos, através de testes in vitro de citotoxicidade e
determinação de mediadores produzidos por células do exsudato peritoneal e
células esplênicas, verificar o efeito da abrina, ricina e pulchelina sobre o sistema
imunológico murino. Além disso, através de testes in vitro de citotoxicidade
3
procuramos verificar sua atividade antiproliferativa sobre células de adenocarcinoma
de mama e de pulmão murinos (LM3 e LP07, respectivamente).
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- CÂNCER
Neoplasia é definida como uma massa anormal de tecido cujo crescimento está
desordenado, apresenta certo grau de autonomia e aumenta de tamanho, de forma
mais ou menos constante, em uma determinada extensão sua autonomia não é
completa e depende criticamente do hospedeiro para sua nutrição e suprimento
sangüíneo (KUMAR et al., 1994).
O câncer é a segunda maior causa de morte em países industrializados,
perdendo somente para as doenças cardíacas. Embora as taxas de mortalidade
estejam diminuindo nos últimos anos, devido ao diagnóstico precoce e as diversas
opções de tratamento, a perspectiva para certos cânceres continua desanimadora
(WORKMAN, KAYE, 2002).
No Brasil, as estimativas para 2008 apontam que, à exceção do câncer de pele
do tipo não melanoma, os tipos mais incidentes serão os cânceres de próstata e de
pulmão no sexo masculino e os câncer de mama e de cólon do útero no sexo
feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada no mundo
(Instituto Nacional do Câncer, 2008).
Diversos modelos experimentais, utilizando linhagens de células tumorais
humanas ou murinas, têm sido usados na pesquisa de novos medicamentos para o
tratamento dos mais diversos tipos de cânceres. Dois exemplos de linhagens
tumorais são: a linhagem LM3, obtida a partir de cultura primária de adenocarcinoma
de mama murino (M3) em BALB/c (BAL DE KIER JOFFÉ et al., 1983), e a linhagem
LP07, obtida a partir de cultura primária de adenocarcinoma de pulmão murino (P07)
em BALB/c (URTREGER et al., 2001), obtidos no Instituto H. Roffo, em Buenos
Aires-Argentina.
As células LM3 expressam constitutivamente altas concentrações de
receptores colinérgicos muscarínicos (RCM) em comparação com células do epitélio
mamário murino normal, NMuMG (ESPAÑOL et al., 2002). Estudos com células LM3
e LM2, mostraram que as LM3, capazes de metástase espontânea ao pulmão,
produzem mais óxido nítrico do que as LM2, incapazes de metástase espontânea, e
5
que elas foram menos sensíveis à citotoxicidade mediada por NO-exógeno (EIJÁN
et al, 1998).
Em relação à linhagem LP07, esta é composta por células poliédricas
epitelióides heterogêneas que proliferam lentamente. Somente algumas células de
LP07 expressam citoqueratinas enquanto a maioria delas foi positiva para vimentina
(componente dos filamentos intermediários presentes em astrócitos). Através de
estudos de ultra-estrutura, pesquisadores mostraram que as células LP07
estabelecem uniões rudimentares entre si, formam ductos tipo glandular e
apresentam grânulos secretórios proeminentes, sugerindo uma origem epitélio-
glandular, com componentes neuroendócrinos (URTREGER et al., 2001).
2.2- SISTEMA IMUNE
Há uma correlação direta entre resposta imunológica e inflamação. Uma
atividade inflamatória de curta duração geralmente traz benefícios para o organismo
hospedeiro na presença de agentes agressores, contudo a persistência do processo
inflamatório freqüentemente resulta em dano tecidual e do DNA contribuindo para o
desenvolvimento do câncer (DE VISSER et al., 2006).
Os macrófagos participam tanto na imunidade inata como na adquirida através
de várias atividades, que incluem: fagocitose, produção de agentes microbicidas,
secreção de citocinas, processamento de antígenos e apresentação de epítopos aos
linfócitos T (MLAMBO, SIGOLA, 2003). Através da fagocitose, os macrófagos
destroem muitos microrganismos, produzem diversas moléculas e apresentam
antígenos às células T. Tanto macrófagos como células dendríticas orientam a
resposta imune adaptativa conduzindo à expansão e diferenciação de linfócitos
específicos para microrganismos invasores e também células cancerígenas (POZZI
et al., 2005; PREYNANT-SEAUVE et al., 2006).
Macrófagos executam funções inflamatórias dentro do contexto da resposta
inata e participam da resposta adaptativa apresentando epítopos aos linfócitos T
auxiliares. As atividades dos macrófagos durante o câncer são predominantemente
inespecíficas e induzem citotoxicidade às células tumorais suprimindo respostas de
células T e NK. Estas funções dos macrófagos podem ser mediadas, entre outros
6
fatores, por reativos intermediários do nitrogênio, reativos intermediários do oxigênio
ou TNF-α (ALLEVA, BURGER, ELGERT, 1994).
Em décadas passadas, macrófagos ativados eram definidos como células que
secretavam mediadores inflamatórios e eliminavam patógenos intracelulares
(NORTH, 1978). Contudo, atualmente, pesquisadores observam que os macrófagos
podem ser um grupo de células mais heterogêneo, com diferentes fisiologias e
executando funções imunologicamente distintas (MOSSER, 2003).
A ativação dos macrófagos ocorre em um ambiente de mediadores tais como
citocinas tipo I (IFN-γ, TNF-α) ou sob reconhecimento de padrões moleculares
associados a patógenos, PAMPs, (LPS, lipoproteínas, etc.) e sinais de perigo
endógenos (proteínas de choque térmico). Os macrófagos têm importante papel na
proteção contra patógenos intracelulares e, sob certas condições, contra células
tumorais (VAN GINDERACHTER et al., 2006).
Além disso, os macrófagos exercem atividades anti-proliferativas e citotóxicas,
resultando parcialmente de sua habilidade em secretar espécies reativas do
nitrogênio e oxigênio (óxido nítrico, peroxinitrito, peróxido de hidrogênio, superóxido)
e citocinas pro-inflamatórias (TNF, IL-1, IL-6) (URBAN et al., 1986; STUEHR,
NATHAN, 1989; MYTAR et al., 1999; BONNOTTE et al., 2001).
O NO é sintetizado por uma família de enzimas chamadas de óxido nítrico
sintetases (NOS), que convertem a L-arginina em NO e L-citrulina. Três isoenzimas
foram identificadas como responsáveis pela produção de NO e foram denominadas
de neuronal (nNOS ou NOS 1), induzível (iNOS ou NOS 2) e endotelial (eNOS ou
NOS 3). A iNOS foi originalmente purificada e clonada a partir de macrófagos
ativados, embora células musculares cardíacas, células de músculo liso vascular e
células da glia também produzam NO a partir da iNOS (LOPES-FARRÉ et al., 1998;
SARIH et al., 1993). Enquanto que a NOS neuronal e endotelial são
constitutivamente expressas (cNOS). A produção de NO é primariamente regulada
pela flutuação dos níveis intracelulares de cálcio. Sob estimulação, cNOS produz
uma quantidade pequena de NO por somente pequenos períodos, mediando
funções fisiológicas como transmissão neuronal e regulação do tônus vascular
(NATHAN, 1992; MARLETTA, 1993).
A iNOS é primariamente expressa em macrófagos ativados em resposta a
citocinas, tais como interferon-α, -β, e -γ (IFN-α, -β, e -γ), interleucina-1α e -1β (IL-1α
7
e -1β), fator de necrose tumoral-α e -β (TNF-α e -β), e endotoxinas (LPS) (NATHAN,
1992). A iNOS é induzida sob diversas condições, como: endotoxemia, choque
hemorrágico, sepse, infecção, hepatite, exposição ao ozônio. Sendo que, uma vez
estimulada, gera uma grande quantidade de NO (µM) ao longo da vida da enzima
ativa (por horas ou dias) e ela serve como um importante regulador e efetor durante
inflamação e infecção, executando um importante papel na defesa do hospedeiro
contra patógenos e células tumorigênicas (HIBBS et al., 1987; NATHAN, 1992).
Contudo, espécies de NO de macrófagos ativados podem agir contra células
epiteliais saudáveis vizinhas, danificando seu DNA e induzindo a carcinogênese. O
NO também medeia a vascularização tumoral e o fluxo-sangüíneo tumoral. Observa-
se que baixas concentrações podem ter efeito anti-apoptótico, mas, altas
concentrações de NO podem induzir apoptose em células suscetíveis (HOFSETH et
al., 2003).
Um nível elevado de expressão de NOS induzível e/ou constitutiva é também
observado em uma variedade de cânceres humanos. Nos últimos anos, estudos têm
descrito seu envolvimento em diversos papéis biológicos, afetando a carcinogênese,
incluindo iniciação, promoção, progressão, metástase, microcirculação tumoral e
angiogênese (HOFSETH et al., 2003).
Outro mediador químico produzido pelos macrófagos é o peróxido de
hidrogênio, que é produzido durante o processo redox e, recentemente, passou a
ser considerado como um mensageiro nas cascatas de sinalização intracelular
(RHEE, 1999). A produção celular de O
2
-
e
H
2
O
2
favorece a formação de outras
espécies reativas do oxigênio e nitrogênio (radical hidroxila e peroxinitrito), sendo
que uma produção excessiva desses compostos causa stress oxidativo e pode
exercer um importante papel na carcinogênese (KLAUNIG, KAMENDULIS, 2004).
Além disso, o peróxido de hidrogênio pode causar peroxidação de lipídeos e danos
no DNA, induzindo desta forma apoptose em muitos tipos diferentes de células
(HALLIWELL, ARUOMA, 1991; YOSHIKAWA et al., 2006).
As citocinas são mediadores solúveis liberados por linfócitos e células do
sistema fagocitário, essenciais na comunicação intracelular e em muitos processos
fisiológicos e patofisiológicos. Elas também modulam a inflamação e a imunidade
regulando o crescimento e a diferenciação de leucócitos e também de células não
leucocitárias (OPPENHEIM et al.,1994).
8
As células T helper tipo 1 e T helper tipo 2 se referem aos subtipos de células T
CD4+ αβ TCR dependente do estímulo efetor dominante (O’GARRA e ARAI, 2000).
Essa diferenciação é dependente das citocinas produzidas pelas células
imunológicas. As Th1 produzem interferon-γ (IFN-γ), interleucina-2 (IL-2), fator de
necrose tumoral-alfa (TNF-α), e são eficientes na eliminação de patógenos
intracelulares, via ativação de macrófagos. As células Th2 liberam interleucina-4 (IL-
4), interleucina-5 (IL5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) que ativam a
imunidade humoral e são secretadas de maneira acentuada na presença de
antígenos persistentes (RENGARAJAN et al., 2000). As células Th3, descobertas
posteriormente, produzem elevados níveis de fator de transformação e crescimento
beta (TGF-β) com quantidades variáveis de IL-4 e IL-10, sendo o TGF-β uma
citocina com atividade imunossupressora sobre células apresentadoras de antígenos
e células T (RONCAROLO; LEVINGS, 2000).
O interferon-γ é um exemplo de citocina pró-inflamatória. É o único membro da
segunda classe de interferons, sendo induzido em células tanto do sistema imune
inato como adquirido, principalmente, células T e células NK. Tem a capacidade de
promover imunidade celular contra patógenos intracelulares, possuindo também um
papel importante nas doenças inflamatórias crônicas, ativando a resposta
inflamatória dos macrófagos presentes no tecido lesado (BOEHM et al., 1997;
GATTONI et al., 2006).
Oh e colaboradores (2007) observaram que tanto IFN-γ com NF-κB são
importantes indutores da produção de NO em células mesenquimais. Também
demonstraram que LPS, flagelina, TNF-α e IL-1β, em combinação com IFN-γ, podem
induzir a produção de NO por células do estroma mesenquimal (MSC).
Fator de necrose tumoral alfa, outra citocina pró-inflamatória, é uma
glicoproteína produzida predominantemente por macrófagos ativados e células T,
que desencadeia uma grande variedade de respostas biológicas, incluindo
inflamação, proliferação, diferenciação e apoptose celular (LIU, 2005). TNF-α parece
atuar na estimulação da iniciação e progressão tumoral, em parte, pela indução da
produção de fatores angiogênicos, quimiocinas, metaloproteinases de matriz
(MMPs) e pela estimulação do crescimento e função de fibroblastos (BALKWILL,
2002). Contudo, TNF-α também é associado com regressão do tumor e aumento do
tempo de sobrevivência de pacientes portadores de câncer (NAKAMOTO et al.,
9
2000). Nesta situação, TNF-α atua ativando a imunidade celular do hospedeiro para
destruir diretamente as células tumorais. No local do tumor, o TNF-α induz apoptose
celular dentro da vasculatura angiogênica, conduzindo à necrose hemorrágica
(ANDERSON et al., 2004). A ligação do TNF-α ao receptor TNF-R1 promove o
recrutamento de diversos adaptadores intracelulares, que por sua vez, ativam
múltiplas vias de transdução de sinais (DEMPSEY et al., 2003).
A interleucina 1 é uma citocina pró-inflamatória envolvida na resposta imune
contra infecções e agressões. Ela é produzida principalmente por monócitos e
macrófagos (BIRD et al., 2002).
A IL-1 exerce influência em diversas funções biológicas (DINARELLO, 1988):
aumenta a quimiotaxia de linfócitos T e B; estimula a síntese de tromboxanos por
neutrófilos e macrófagos; estimula liberação de histamina por basófilos e
degranulação dos eosinófilos; citotoxicidade para células tumorais; estimula a
síntese de Interferon β1 e β2; age como um pirógeno endógeno; induz a síntese de
proteínas de fase aguda (ex. proteína C reativa e fibrinogênio) em hepatócitos
(ENDERS, VAN DER MEER, DINARELLO, 1987); ativa linfócitos T (MIZEL, 1982) e
aumenta a síntese de anticorpos pelas células B (FALKOFF et al, 1983).
IL-1α e β são dois agonistas funcionais da família da IL-1. Acredita-se que elas
induzem respostas celulares idênticas, mas há relatos de diferenças nas suas
atividades. Por exemplo, a produção de anticorpos dependente de célula T é
mediada pela IL-1β, mas não pela IL-1α (NAKAE et al., 2001).
A interleucina 12 é uma proteína heterodimérica de 70 kDa composta por 2
subunidades, IL-12 p35 e IL-12 p40. Esta citocina é produzida por
monócitos/macrófagos, células B e possivelmente outros tipos de células acessórias
primariamente em resposta a bactérias ou produtos bacterianos (KOBAYASHI et al.,
1989; WOLF et al., 1991; GUBLER et al., 1991; D’ANDREA et al., 1992). A IL-12
regula fortemente respostas TH1 e induz citotoxicidade contra patógenos
intracelulares pela ativação de respostas imunes mediadas por células
(BODDUPALLI et al., 2007). Ela possui diversos efeitos sobre as células T e Natural
Killer (NK), tais como, a habilidade de induzir secreção de IFN-γ por células NK e T,
agir como fator de crescimento para células ativadas, aumentar a atividade lítica de
células NK ativadas por linfocina e facilitar respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL)
específicos (TRINCHIERI, 1994; HENDRZAK, BRUNDA, 1995). Além disso, exerce
10
um papel único na regulação do balanço Th1/Th2, no qual células Th1 produzem
IFN-γ e IL-2 promovendo imunidade celular, enquanto células Th2 produzem IL-4, IL-
5, IL-10 e IL-13 promovendo imunidade humoral (MOSMANN, COFFMAN, 1989;
SCOTT, 1993). Foi observado que óxido nítrico pode inibir a indução de IL-12 em
macrófagos ativados (HUANG et al., 1998; MUKHOPADHYAY et al., 1999).
A interleucina 6 é um exemplo de citocina das doenças alérgicas e parasitárias,
correspondendo a uma proteína de 21 kDa, produzida por diversas células incluindo
macrófagos, células endoteliais, neutrófilos e linfócitos. Algumas de suas funções
são estimulação e diferenciação de células B (HIRANO et al., 1986), suporte de
crescimento celular de hibridomas e plasmocitomas e estimulação da síntese de
proteínas de fase aguda hepáticas, após exposição a materiais tóxicos ou agressão
(SCHREIBER et al., 1989). Ela modula diversos processos como proliferação e
diferenciação celular, respostas imunológicas e inflamação (FARIVAR et al., 2006).
Está envolvida na iniciação e manutenção da resposta inflamatória de fase aguda. A
IL-6 aumenta proteínas de resposta de fase aguda associadas com inflamação e
agressão (MATZARAKI et al., 2007).
Em relação às citocinas imunossupressoras, um exemplo é a IL-10. Ela é um
produto de vários tipos celulares incluindo monócitos e células B e T, que diferente
da IL-12, é associado com diferenciação de células Th2 (MOORE et al., 1988;
FIORENTINO, BOND, MOSMANN, 1989). Ela inibe a produção de citocinas de
linfócitos particularmente IFN-γ, por células T e NK, e também inibe proliferação de
células T, agindo primariamente em nível de células acessórias
monócitos/macrófagos (FIORENTINO et al., 1991; HSU, MOORE, SPITS, 1992;
TAGA, TOSATO, 1992). A inibição da produção do IFN-γ ocorre através da
prevenção da produção IL-12 e, em parte, das citocinas co-estimuladoras (IL-1β e,
possivelmente TNF-α) (D’ANDREA et al., 1993). Além disso, IL-10 inibe fortemente a
produção das citocinas pro-inflamatórias IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α por
monócitos ativados por LPS, IFN-γ, ou LPS e IFN-γ. IL-10 é um potente inibidor de
funções de monócitos/macrófagos, incluindo burst oxidativo, produção de óxido
nítrico, citotoxicidade, e produção de citocinas, tais como TNF-α e IL-1 (BOGDAN,
VODOVOTZ, NATHAN, 1991; DE WAAL MALEFYT et al., 1991; FIORENTINO et al.,
1991; GAZZINELI et al., 1992; RALPH et al., 1992; OSWALD et al., 1992).
11
2.3 – MEDICAMENTOS DE ORIGEM VEGETAL USADOS NO
TRATAMENTO DO CÂNCER
O câncer pode ser tratado por cirurgia, radiação, hormônios, imunoterapia e
quimioterapia (American Cancer Society, 2006). A quimioterapia é realizada através
da administração de medicamentos antineoplásicos. Estes podem ser agrupados
nas seguintes categorias: agentes alquilantes polifuncionais, antimetabólicos,
alcalóides vegetais, antibióticos antitumorais, hormônios, (KATZUNG, 2003).
Os alcalóides vegetais são medicamentos originados de plantas, tendo como
exemplos, a vimblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel (TAXOL
®
), docetaxel,
camptotecinas (topotecana e irinotecana) e podofilotoxinas (etoposida e teniposida).
A vimblastina e vincristina são alcalóides derivados da vinca (Vinca rosea),
vinorelbina é um alcalóide semi-sintético da vinca, o paclitaxel é um éster alcalóide
derivado do teixo ocidental (Taxus brevifolia) e do teixo europeu (Taxus baccata), o
docetaxel é um derivado semi-sintético análogo ao paclitaxel, e as podofilotoxinas
são derivados semi-sintéticos da podofilotoxina, que é extraída da raiz do podofilo
(Podophyllum peltatum) (KATZUNG, 2003).
O Taxol
®
, paclitaxel, uma nova droga antineoplásica, é obtido da planta Taxus
brevifoglia Nutt., sendo isolado pela primeira vez em 1969. Sua estrutura molecular
foi publicada pela primeira vez em 1971 (Figura 1). Em 1994, a empresa Bristol-
Myers Squibb licenciou um processo semi-sintético para produzir o taxol
®
,
resolvendo um problema com ambientalista que receavam a extinção das florestas
do Noroeste do Pacífico, nos EUA. Contudo, atualmente a BMS produz taxol
®
através da sua extração de cultura de tecidos de T. brevifoglia (KINGSTON, 2007).
12
Figura 1: Estrutura molecular do Taxol
®
(KINGSTON, 2001).
O mecanismo de ação do taxol
®
é aumentar a polimerização de microtubulos
(SCHIFF et al., 1979). Ele também é capaz de bloquear a mitose, induzir extensiva
formação de conjunto de microtubulos em células, e induzir multinucleação de
células durante a interfase (FUCHS, JOHNSON, 1978; SCHIFF, HORWITZ, 1980;
ROWINSKY et al., 1988).
O taxol
®
completou seus estudos pré-clínicos em 1982, iniciou seus estudos
clínicos de fase I em 1984 e de fase II em 1985 (KINGSTON, 2007). Ele é usado
atualmente, isoladamente ou em combinação com outros agentes antineoplásicos,
tais como cisplatina, no tratamento de câncer de ovário (PICCART; CARDOSO,
2003), câncer de mama (OZOLS, 2003) e câncer de pulmão (DAVIES et al., 2003).
2.4- RIPS (PROTEÍNAS INATIVADORAS DE RIBOSSOMOS)
Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) são proteínas de plantas que
inativam ribossomos de animais. Essa denominação é usada somente para
proteínas contendo domínios rRNA N-glicosidases, pois existem outras proteínas
13
que podem inativar os ribossomos (p.ex. RNAses ou proteases) por outros
mecanismos, mas não são RIPs (PEUMANS et al., 2001).
As proteínas inativadoras de ribossomos são membros de uma classe de
lectinas, chamadas quimerolectinas. Estas são caracterizadas por possuírem, além
do sítio de ligação a carboidratos, um domínio com atividade catalítica ou outra
atividade biológica que age independentemente do domínio ligante de açúcar
(MOREIRA, 1998).
Segundo Mundy e colaboradores (1994), as RIPs podem ser classificadas em 3
tipos de acordo com suas propriedades físicas e estruturais:
• RIPs tipo I: são enzimas monoméricas, de massa molecular entre 25 kDa e 30
kDA (LING, LIU, WAG, 1994), com um domínio RNA N-glicosilase que não
possuem uma cadeia ligante a glicoconjugados e apresentam baixa
citotoxicidade. Algumas delas podem entrar na célula através do mecanismo do
endocitose fase-flúida. Exemplos: saporina (Saponaria officinalis) e a PAP
(CAVALLARO, 1995);
• RIPs tipo II: são proteínas heterodiméricas compostas de duas cadeias
polipeptídicas, de massa molecular em torno de 60 kDa (LING; LIU; WAG,
1994). A cadeia A é a porção com atividade enzimática de remover um resíduo
de adenina de um loop exposto da sub-unidade 28S do RNA ribossomal, com
isso inibindo a síntese protéica (OLSNES, 2004). A cadeia B é uma cadeia
lectínica (STIRPE et al., 1978). A cadeia B pode ligar-se a glicoproteínas ou
glicoconjugados presentes na superfície celular (STEEVES et al., 1999)
mediando o transporte da cadeia A para o citosol, onde terá acesso aos
ribossomos. Exemplos: abrina, ricina e pulchelina (BEAUMELLE, ALAMI,
HOPKINS, 1993).
• RIPs tipo III: são proteínas sintetizadas como precursoras inativas (proRIPs)
que requerem um processamento proteolítico entre os aminoácidos envolvidos
na formação do sítio ativo. As RIPs deste grupo foram caracterizadas no milho
e na cevada (BASS et al., 1992).
14
Figura 2. Alinhamento esquemático das RIPs representando uma comparação entre
suas estruturas primárias (NIELSEN, BOSTON, 2001).
A comparação da seqüência de aminoácidos de RIPs tipo 1 e tipo 2 revela
notável similaridades entre cadeias-A de RIPs tipo 1 e RIPs tipo 2, tão bem quanto
entre as cadeias-B de diferentes RIPs tipo 2. Uma análise acurada indica que a
similaridade da seqüência entre as regiões amino-terminal e a central das RIPs é
muito maior que aquela das seqüências carboxil-terminal (HARTLEY, CHADDOCK,
BONNESS, 1996).
Geralmente, a estrutura terciária de diferentes RIPs é bem conservada, como
demonstrado pelo fato que os traços α-carbono de muitas RIPs são virtualmente
sobreponíveis. Existem, contudo, algumas diferenças principais, especialmente na
região carboxil-terminal e estruturas da superfície do loop. Essas diferenças podem
Tipo 1
Tipo 2
Tipo 3
Domínio N-
licosidase
Peptídio
sinalisador
Domínio N-
licosidase Extensão
C-terminal
Peptídio
sinalisador
Cadeia-A
Domínio
N
-
g
licosidase
Li
g
ante Cadeia-B
Domínio de
ligação lectínica
Extensão
N-terminal
Li
g
ante
Extensão
C-terminal
Domínio N-
licosidase
+
15
explicar as diferenças na atividade e especificidade do substrato das diferentes RIPs
(PEUMANS et al., 2001).
RIPs tipo 2 devem sua atividade de ligação a carboidratos à cadeia-B, que
contêm dois ou possivelmente três sítios de ligação (FRANKEL et al., 1996;
STEEVES et al., 1999). Devido à extrema toxicidade de ricina e abrina, RIPs tipo 2
são usualmente associadas com proteínas altamente tóxicas (BARBIERI, BATTELLI,
STIRPE, 1993). Contudo, RIPs tipo 2 mostram marcadas diferenças em
citotoxicidade. Ricina, por exemplo, causa 50% de morte celular em concentrações
abaixo de 1ng/ml, enquanto que RIP tipo 2 do fruto do sabugueiro não mostram
efeito a 1mg/ml (BATTELLI et al., 1997).
As RIPs tipo II têm a capacidade de ligar-se a glicoproteínas e glicolipídeos na
superfície celular, sendo endocitadas por diferentes processos, clatrina dependentes
ou independentes, direcionando as moléculas para vesículas endossomais, onde
podem ser encaminhadas para uma rota seguinte, dependendo da natureza do
receptor, e serem conduzidos a vários destinos (BARBIERI et al., 1993). Esses
endossomas podem chegar ao complexo de Golgi, e depois as proteínas são
encaminhadas ao lúmen do retículo endoplasmático (RE), onde as duas cadeias
polipeptídicas são separadas por isomerase dissulfídica (SPOONER et al., 2004). A
cadeia A livre no lúmen do RE pode ser interpretada como um peptídeo não-ligado e
envida ao citosol pelo sistema de controle de qualidade do RE (LORD, ROBERTS,
1998). As RIPs tipo II são retro-translocadas utilizando a via de degradação
associada ao RE usualmente seguida por proteínas não-envelopadas, que no citosol
são poliubiquitadas e degradadas por proteases, denominadas proteossomas (TSAI
et al., 2002)
2.4.1- USOS DAS RIPs NA ÁREA DE SAÚDE
RIPs apresentam diversas atividades biológicas incluindo atividades de inibição
da tradução, N-glicosidases, antimitogênica, imunomoduladora, antiproliferativa e
antifúngica. Imunotoxinas baseadas em RIPs têm sido construídas e usadas em
terapia de câncer. Plantas transgênicas carregando o gene de RIP são menos
susceptíveis às infecções virais (NG, WANG, 2004).
16
As propriedades anti-tumorais das RIPs contra diversos tipos de cânceres,
principalmente abrina e ricina, têm sido comprovadas por diversos cientistas.
Mosinger (1951) relatou a ação tóxica da ricina contra sarcoma de ratos, enquanto
Reddy e Sirsi (1969) reportaram a ação inibitória de extrato de jequiriti (A.
precatorius) sobre o crescimento do Sarcoma de Yoshida. Segundo Fodstad e
colaboradores (1984), os resultados dos testes anti-tumorais em animais, com
abrina e ricina, mostraram-se promissores e os estudos clínicos de fase I
começaram, mas foram interrompidos porque foram observados efeitos não vistos
anteriormente em ratos e foram observados, também, remissões nos pacientes
testados. Atualmente, outra ferramenta contra o câncer utilizando essas toxinas é a
produção de imunotoxinas, que consiste em anticorpos monoclonais, contra
antígenos de superfície celular, ligados a cadeia A das toxinas. Contudo, Olsnes e
colaboradores (1989) relataram a menor toxicidade contra os tumores desses
conjugados do que da toxina nativa.
Ricina e abrina também foram usadas no bioterrorismo como armas biológicas,
tendo o seu uso aumentado nos últimos tempos devido à facilidade de obtenção
destas, principalmente, ricina. Esta foi estudada na Primeira Guerra Mundial, e foi
desenvolvida uma arma com a toxina na Segunda Guerra Mundial, porém, esta
arma nunca foi utilizada (CRAIG et al., 1952).
2.5- Abrus precatorius L.
Abrus precatorius L., também chamado jequiriti, é uma trepadeira delgada e
perene que se enlaça ao redor de árvores, arbustos e sebes. Não tem órgãos
especiais de fixação. Folhas são glabrosas com longos internódulos. Tem um galho
delgado e um tronco cilíndrico enrugado com uma casca marrom com textura
esfumaçada. Folhas alternadas compostas paripenadas com estípulas. Cada folha
tem um tamanho de 5 a 10 cm. Carrega de 20 a 24 ou mais folíolos, cada um sendo
1,2 a 1,8 cm de comprimento, oblongas e obtusas. É áspera em ambos finais,
glabrosa no topo e suavemente hirsuta abaixo. Flores são pequenas e de cor violeta
pálido com um talo curto, arranjado em ramalhete. O ovário tem uma placentação
marginal. O fruto, que é uma vagem, é achatado, alongado e forma-truncada com
17
uma ponta deflexa aguda tem em torno de 3 a 4,5 cm de comprimento, 1,2 de
largura e textura sedosa. A vagem ondula para trás quando aberta para revelar
sementes suspensas. Cada fruto contém de 3 a 5 sementes de forma oval, em torno
de 0,6 cm de comprimento. Elas são usualmente de cor escarlate brilhante com uma
esfumaçada textura lustrosa, e uma mancha preta no topo (FERNANDO, 2007).
Esta planta é encontrada em regiões razoavelmente secas em elevações
baixas. Cresce em climas tropicais e todas as áreas tropicais e sub-tropicais. A parte
tóxica desta planta são as sementes das quais são extraídas a abrina, uma potente
proteína tóxica.
18
Figura 3. Fotos das flores, frutos, sementes e da planta Abrus precatorius L. (CITY
OF CORAL SPRINGS, 2008).
19
Do jequiriti pode-se obter uma proteína inativadora de ribossomos tipo II,
chamada abrina. Com quatro isoformas (a, b, c, e d) isoladas (LIN et al., 1981,
1982). McPherson e colaboradores (1973) observaram em cristais de abrina quatro
moléculas protéicas numa unidade assimétrica, sendo que esses cristais difratam a
uma resolução de 3 Å. Mais recentemente, Tahirov e colaboradores (1994)
observaram uma única molécula numa unidade assimétrica que difratou a uma
resolução de 2,1 Å.
A abrina é composta por duas cadeias peptídicas: cadeia A, com atividade
enzimática, e cadeia B, com atividade lectínica (capacidade de ligar-se a
carboidratos). Essas duas cadeias são ligadas por uma ponte dissulfídica formada
entre os resíduos Cys 247 da cadeia A e Cys 8 da cadeia B.
Lin e colaboradores (1982) testaram as 4 isoformas da abrina (a, b, c, e d)
contra células de Sarcoma 180. Observaram que a abrina-a era um inibidor potente
do crescimento e biossíntese de proteína, enquanto que a abrina-b teve uma baixa
eficiência na inibição do crescimento tumoral in vitro, isto pode ser atribuído à sua
instabilidade molecular.
Abrina e ricina inibem a síntese protéica igualmente bem em todas as
linhagens de células epiteliais polarizadas testadas por Melby e colaboradores
(1993) se elas forem adicionadas apicalmente ou basolateralmente. Sítios de ligação
para abrina e ricina são ubíquos em células de mamíferos e seria esperada estarem
em ambos os lados apical e basolateral. Abrina intoxicou células MDCK-I e BeWo
quando adicionada apicalmente e basolateralmente.
Abrina é capaz de induzir apoptose em células HeLa, estas exibindo
características morfológicas e bioquímicas apoptóticas como: encolhimento celular,
fragmentação internucleossomal de DNA, condensação da cromatina e
fragmentação nuclear, quebra de cadeia simples de DNA, externalização de
fosfatidilserina (PS), liberação de citocromo c e ativação de caspases (caspases 3 e
9). A liberação do citocromo C da mitocôndria no citosol inicia uma cascata que
induz a ativação de caspase 3 através da associação de caspase 9 e Apaf-1 (QU;
QING, 2003).
Narayanan, Surolia e Karande (2004) reportaram que o sinal para apoptose é
acionado a um ponto de tempo após a inibição da síntese protéica. Esta via
apoptótica induzida por abrina é caspase-3 dependente e caspase-8 independente e
envolve danos ao potencial de membrana mitocondrial com produção de espécies
20
reativas de oxigênio. A sobre-expressão do proto-oncogene 2 de células B de
leucemia linfocítica bloqueia esta via apoptótica.
Ohba e colaboradores (2004) ao testarem abrina-a com culturas de diferentes
linhagens de células leucêmicas observaram que abrina-a induzia apoptose por
diferentes mecanismos, dependendo da linhagem celular. Em células Jurkat, seguiu-
se a via convencional – translocação de Pser na superfície celular, ativação de
caspase e fragmentação de DNA. Em células CCRF-CEM, iniciou-se com
translocação de PSer na superfície celular e fragmentação de DNA sem qualquer
indução de atividade de caspase. Em MOLT-4, iniciou-se e caracterizou-se com
exposição de PSer e ativação de caspase, mas sem progredir para fragmentação de
DNA. Em HPB-ALL, exposição de PSer foi insignificante, a atividade de caspase
aumentou acentuadamente, mas fragmentação de DNA não foi detectada.
2.6- Ricinus communis L.
Arbusto com aproximadamente 2,5 m de altura, caule ramificado, coloração
verde ou avermelhada. Suas folhas são simples, longo-pecioladas, palmatilobadas
com 7 a 11 lobos de bordos serrados e ápice acuminado. As flores são distribuídas
em racemos terminais, com flores femininas ocupando a porção superior da
inflorescência. Os frutos são cápsulas tricocas, espinhosas, triloculares, com uma
semente em cada lóculo, estas sendo lisas, brilhantes, negras com manchas
brancas (OLIVEIRA, 2007). Floresce ao longo de todo o ano e propaga-se
exclusivamente por sementes. Possui ciclo de vida curto, em torno de 2-3 anos.
Espécie heliófita e seletiva higrófita; desenvolve-se como planta espontânea.
Desenvolve-se melhor em solos férteis e bem drenados, nas regiões com
precipitação anual de pelo menos 700 mm. O excesso de nitrogênio estimula o
crescimento vegetativo à custa da produção de sementes (Instituto Hórus de
Desenvolvimento e Conservação Ambiental, 2007).
21
Figura 4. Fotos da planta, das flores e sementes de Ricinus communis L.
(CICERAN, 2008).
22
Das sementes da mamona obtém-se uma proteína pertencente ao grupo de
proteínas inativadoras de ribossomos do tipo 2, chamada ricina. Como os outros
componentes deste grupo, a ricina também é composta por duas cadeias
polipeptídicas ligadas por uma ligação dissulfídica. A cadeia A é uma enzima
globular de 267 aminoácidos, com um número de elementos estruturais secundários.
Ela tem um sítio ativo pronunciado capaz de reconhecer e acomodar o loop-suporte
do rRNA que é seu alvo (ROBERTUS, MONZINGO, 2004). A cadeia B é uma
proteína em forma de halteres com dois domínios: o domínio I consiste de 1-135
resíduos e o domínio 2 de 136-262 resíduos. Sendo esses domínios homólogos e
cada um é composto por 3 sub-domínios homólogos , chamados de α, β e γ juntos
com uma unidade ligante não relacionada, ou α (RUTENBER, READY, ROBERTUS,
1987). Esses subdomínios têm aproximadamente 40 resíduos de comprimento.
Embora os subdomínios α, β e γ exibam a mesma prega básica, somente as
unidades 1α e 2γ na extremidade final da cadeia B retêm a habilidade de ligar a
galactosídeos. Resíduos conservados no subdomínio γ do domínio C-terminal ligam
um segundo galactosídeo de uma forma similar (ROBERTUS; MONZINGO, 2004).
A cadeia B da ricina liga galactosídeos de superfície celular (BAENZIGER,
TIETE, 1979) e é internalizada por endocitose dependente e independente de
clatrina (SANDVIG, VAN DEURS, 1996). A maioria da toxina endocitada é
transportada a endossomos e lisossomos, mas uma fração da toxina ligada à
superfície alcança o aparato de Golgi (VAN DEURS et al., 1988). Ricina é, então,
transportada retrogradamente ao retículo endoplasmático (ER) (RAPAK et al., 1997).
A ligação dissulfídica intersubunidade é clivada (MASUHO et al., 1982), e a cadeia A
translocada ao citosol onde síntese protéica é cataliticamente inativada pela
depurinação de uma adenina crítica do fator de elongação ligando o sítio numa
estrutura de base do loop de rRNA (ENDO, TSURUGI, 1987).
Fodstad e colaboradores (1984) realizaram um estudo de fase 1 com ricina,
sendo dado na forma de injeções intra venosas a cada duas semanas em doses
variando de 4,5 a 23 µg/m
2
de área superficial corporal estimada. Nesses níveis e
em níveis maiores, observaram que sintomas tipo resfriado com dor e fadiga
muscular apareceram e, em alguns pacientes, náusea e vômito também ocorreram.
Mielossupressão não foi observada. Anticorpos anti-ricina foram detectados no soro
após 2 a 3 injeções de ricina. Observaram uma cinética de primeira ordem na
23
eliminação de ricina do sangue. A cada nível de dose, houve pequenas diferenças
entre os pacientes com relação às concentrações plasmáticas e os efeitos colaterais
A maior dose dada, 23 µg/m
2
, elevou as concentrações plasmáticas em duas vezes
daquelas encontradas previamente ser efetivo terapeuticamente em camundongos
hospedando tumor. Nos pacientes portando diferentes tipos de câncer, observou-se
parcial melhora, e recomendaram a dose de 23 µg/m
2
para um estudo de fase 2 de
ricina.
Ricina tem sido usada na produção de imunotoxinas, um protótipo de soro-
terapia anti-tumoral, formada por anticorpos específicos para antígenos presentes
em células tumorais, e toxinas com atividade anti-tumoral. Grossbard e
colaboradores (1993) observaram que esses imunoconjugados produzem hepato-
toxicidade reversível com transaminasemia, toxicidade megacariocítica com
trombocitopenia e dano endotelial vascular com febre, náusea, dores de cabeça,
mialgias, hipoalbuminemia, dispnéia e edema.
Morlon-Guyot e colaboradores (2003) descobriram que ricina tem um sítio ativo
funcional de lipase na interface entre as duas subunidades (cadeia A e B). Mutação
para alanina da serina 221 catalítica na cadeia A aboliu a atividade de lipase da
ricina, sendo que esta é necessária para uma eficiente translocação da cadeia A e
citotoxicidade. Com isso, observou-se que esta mutação reduziu a taxa de
translocação da cadeia A e inibiu a toxicidade em 35%.
Gonzalez e colaboradores (2006) observaram, em seus experimentos, que
ricina induz macrófagos/monócitos humanos a secretar IL-8 pela ativação da via p38
MAPK. Outros pesquisadores observaram também que ricina estimula macrófagos
murinos e células mononucleares de sangue periférico humano a secretar TNF-α e
IL-1β (LICASTRO et al., 1993; HASSOUN, WANG, 2000; HIGUCHI et al., 2003).
24
2.7- Abrus pulchellus tenuiflorus
Abrus pulchellus, subespécie tenuiflorus, pertence à família Leguminosae,
subfamília Papilionoideae, contém em sua semente uma RIP chamada pulchelina
(RAMOS et al., 1998).
No Brasil, a espécie Abrus pulchellus (Figura 6) pode ser encontrada
principalmente na região Nordeste. Essa espécie é uma trepadeira perene, cujos
cipós auxiliam no suporte da planta. Os ramos geralmente são finos, pouco
lenhosos, alcançando em média de 2 a 4 m de comprimento. As folhas são
compostas contento de 5 a 20 pares de folíolos dispostos opostamente ao longo da
raque, cujo comprimento pode variar de 5 a 10 cm. As flores são pequenas,
organizadas em cachos e apresentam uma cor violeta clara. O ovário tem uma
placentação marginal. O fruto é uma vargem de 3 a 5 cm de comprimento,
deiscente, contendo de 3 a 6 sementes por fruto. Diferente da espécie Abrus
precatorius, as sementes de Abrus pulchellus possuem uma cor marrom clara
alternada com marrom escuro, apresentando em média 0,5 cm de comprimento.
25
Figura 5. Fotos da planta, vagem e flor de Abrus pulchellus subespécie tenuiflorus.
Figura cedida por André Luiz Coelho Silva.
26
Desta planta também se pode obter uma proteína inibidora de ribossomos, esta
sendo chamada de pulchelina. Ela foi isolada inicialmente por Ramos e
colaboradores (1998) de sementes de Abrus pulchellus por cromatografia de
afinidade em coluna de Sepharose 4B. A pulchelina é uma RIP do tipo 2
heterodimérica sendo constituída por uma cadeia com atividade enzimática RNA N-
glicosilase (cadeia A) ligada a uma cadeia lectínica galactose/N-acetilgalactosamina
(cadeia B) por uma ligação dissulfeto. A cadeia A tem uma massa molecular de
aproximadamente 29k Da e a cadeia B de 31 kDa. Sua toxicidade em mamíferos foi
próxima a da ricina e abrina (DL
50
= 30 mg/Kg de peso corpóreo). Igualmente às
outras RIPs tipo 2, a pulchelina é uma proteína rica em aminoácidos ácidos e certa
quantidade de aminoácidos sulfurados (TAHIROV et al., 1995; HERMANN,
BEHNKE, 1981).
Na pesquisa realizada por Ramos e colaboradores (1998), eles isolaram a
pulchelina e observaram que esta, como outras lectinas tóxicas de plantas, foi
inibida por galactose, açúcares contendo galactose e derivados: galactosamina, α-D-
malibiose, lactose e rafnose. Além disso, a pulchelina mostrou toxicidade contra
camundongos mesmo na presença do açúcar ligante, a não inibição da essa
toxicidade não pode ser explicada por remoção metabólica do açúcar, pois este se
encontrava em grande quantidade.
Ramos e colaboradores (1998) observaram, também, que anticorpos anti-
pulchelina reconheciam parcialmente a abrina, mas não reconheciam a ricina, isto
provavelmente aconteça porque a abrina e pulchelina são obtidas de plantas
pertencentes ao mesmo gênero (Abrus). Silva e colaboradores, em 2005,
observaram uma alta identidade da seqüência de aminoácidos da cadeia A da
pulchelina com da abrina-c (86%), da abrina-a (78%) e da ricina (38%), demonstra
essa similaridade entre abrina e pulchelina; e Goto e colaboradores (2003)
demonstraram a ocorrência de similaridade entre a seqüência de aminoácidos da
cadeia B da pulchelina com abrina-a (81%) e ricina (58%).
Castilho e colaboradores (2008) isolaram 4 isoformas da pulchelina, e
determinaram a DL
50
em camundongos da isoforma 1 foi 25 µg/Kg, da isoforma 2 foi
15 µg/Kg, da isoforma 3 foi 70 µg/Kg e da isoforma 4 foi 60 µg/Kg. Além disso, as
isoformas foram testadas quanto à capacidade hemaglutinante usando sangue
humano, de coelho e cavalo. Eles observaram que as isoformas 1 e 2 promoveram
hemaglutinação de sangue humano nas concentrações de 22,5 e 27,5 ng/mL,
27
contudo somente a 2 aglutinou sangue de coelho (27,5 ng/mL) e cavalo (41,7
ng/mL). Enquanto as isoformas 3 e 4 aglutinam somente sangue de coelho (18,5
ng/mL e 12,3 ng/mL, respectivamente).
28
3- OBJETIVOS
3.1 - Geral
• Avaliar as atividades antiinflamatórias e anti-tumorais no controle de células
tumorais de mama (LM3) e pulmão (LP07) das proteínas abrina, ricina e
pulchelina.
3.2 - Específicos
Utilizando abrina, ricina e pulchelina em várias concentrações:
• Determinar a toxicidade dessas proteínas para células do exsudato peritoneal
(PEC) e células esplênicas murinas.
• Analisar o efeito sobre a produção de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 em culturas de
PEC e IFN-γ e IL-10 em culturas de células esplênicas.
• Detectar ação antiinflamatória exercida por essas proteínas pelo seu efeito
sobre a produção de Óxido Nítrico (NO) e Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) por
PEC murinos.
• Pesquisar o nível de toxicidade sobre linhagens de células tumorais de mama e
de pulmão (LM3 e LP07, respectivamente).
29
4- MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- Origem das amostras
As toxinas abrina, ricina e pulchelina foram extraídas das sementes de Abrus
precatorius, Ricinus communis e Abrus pulchellus subsp. tenuiflorus,
respectivamente. Sementes maduras de Abrus pulchellus tenuiflorus foram
coletadas de plantas cultivadas no Instituto de Física de São Carlos – USP. As
sementes selecionadas de Ricinus communis foram compradas da EMBRAPA. As
sementes de Abrus precatorius foram fornecidas pelo pesquisador Dr. Renato de
Azevedo Moreira, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Ceará. A pulchelina foi fornecida pela professora Dra. Ana
Paula Ulian de Araújo, do Instituto de Física de São Carlos - USP.
4.2- Etapa química
O processo de obtenção das toxinas (abrina e ricina) foi realizado sob a
supervisão das professoras doutoras Ana Paula Ulian de Araújo do Instituto de
Física de São Carlos – USP, e Ana Cristina de Oliveira Moreira da Universidade de
Fortaleza – UNIFOR, Fortaleza, Ceará.
4.2.1- Obtenção do extrato bruto das plantas A. precatorius e R. communis
As sementes foram desprovidas da casca e depois moídas. Em seguida, a
farinha das sementes foi delipidada por maceração em acetona. Foram pesados 10g
da farinha e 100 mL de NaCl 0,15M adicionados a mistura e foi deixada sob agitação
constantemente por 3 horas. As suspensões obtidas foram centrifugadas a 12.000 x
g, durante 20 minutos a 4°C e, em seguida, filtradas em papel de filtro qualitativo,
sendo, então, denominadas de Extrato bruto.
30
4.2.2- Purificação da abrina e ricina
O extrato bruto foi aplicado a uma coluna de galactomanana, obtida de
Adenanthera pavonina L., estabilizada com solução fisiológica, e equilibrada com
NaCl 0,15M. A fração não retida (pico I) foi eluída com a solução de equilíbrio. Para
a eluição da fração retida, pico II, tampão glicina-HCl 0,1M, pH 2,6, foi utilizado. A
concentração de proteínas eluídas foi estimada por medida da absorbância em 280
nm utilizando espectrofotômetro. As frações retidas foram diafiltradas em centriprep
10 (Millipore). A absorbância das amostras foi detectada em espectrofotômetro
utilizando filtro de 280nm. As amostras, dialisadas e concentradas, foram filtradas
com membranas de 0,2 µm para esterilizar as soluções e então, acondicionadas em
freezer -20° C para posterior utilização. A pureza das proteínas foi confirmada por
eletroforese em SDS-PAGE seguindo o método de Laemmli (LAEMMLI, 1970).
4.3- Etapa imunológica
4.3.1- Animais
Em cada experimento foram utilizados 05 camundongos Swiss machos de 6
semanas, pesando entre 18 e 15g, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas – UNESP, situado na cidade de Araraquara. Os animais
foram mantidos em gaiolas de policarbonato, com água e ração (Purina) ad libitum
em local climatizado (23°C ± 2°C, 56 ± 2% de umidade relativa do ar), com controle
de claro e escuro a cada período de 12 horas. Parecer do Comitê de Ética n°
32/2006.
4.3.2- Obtenção das células do exsudato peritoneal
Os animais foram previamente estimulados pela inoculação intraperitoneal de
3,0 mL de tioglicolato de sódio (DIFCO Lab. LTDA) a 3,0%, três dias antes da coleta
de células. Após esse período, os animais foram eutanasiados por inalação em
31
câmara de CO
2
. Estes animais tiveram a pele da região abdominal retirada
assepticamente em câmara de fluxo laminar, Classe 100 (Veco) e o peritôneo
exposto. Na porção mediana superior do abdômen foram injetados 5,0 mL de
solução salina tamponada com fosfatos (PBS) estéril em pH 7,2 e a 4°C, com auxílio
de seringa e agulhas também estéreis. Uma leve massagem manual foi realizada e
as células do exsudato peritoneal foram coletadas com a mesma seringa e
dispensadas em tubo cônico estéril (Corning, Inc., EUA) para preparo da suspensão
celular. As células do exsudato peritoneal foram lavadas três vezes com 5 ml de
PBS (pH 7,2) e centrifugadas a 400 x g por 5 minutos em centrífuga (Fanem, Ind.
Bras.) à temperatura ambiente. As células sedimentadas foram ressuspendidas em
1,0 mL de meio de cultura RPMI-1640 (Sigma) contendo 2β-mercaptoetanol (Sigma)
a 2x10
-5
M, penicilina 100 U/mL (Sigma), estreptomicina 100 U/mL (Sigma), L-
glutamina 2mM (Sigma) e 5% de soro fetal bovino (Cutilab), sendo o meio assim
composto designado de RPMI-1640 completo (RPMI-1640-C). O número de células
foi determinado pela contagem em câmara hemocitométrica de Neubauer (Boeco,
Germany) com a utilização de 10 µL da suspensão celular diluída em 90 µL do
Líquido de Lázarus. As células foram ajustadas à concentração ideal para cada
ensaio em meio RPMI-1640-C.
4.3.3- Obtenção dos sobrenadantes das culturas de células do exsudato
peritoneal
Sobrenadantes das culturas de macrófagos foram utilizados na determinação
das citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-12. As células do exsudato peritoneal foram
ajustadas à concentração de 5 x 10
6
células/mL em meio RPMI-1640-C e
distribuídas em placas de cultura de tecido de 24 cavidades (Corning, Inc., EUA). A
cada cavidade foi adicionado 1,0 mL da suspensão celular e as placas foram
incubadas a 37
o
C por 60 min em estufa contendo tensão constante de 5% de CO
2
(Forma Scientific). Após essa incubação, as células não aderentes foram retiradas
por lavagens com o meio de cultura RPMI-1640-C. Na avaliação da produção de
TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-12 (item.4.3.16) foi adicionado aos macrófagos aderidos a
placa 1mL de RPMI-1640-C e 1mL das RIPs (abrina, pulchelina e ricina) a 0,39 e
32
0,78 ng/mL (concentração no poço) ou LPS a 10 µg/mL (lipopolissacarídeo de
Escherichia coli sorotipo 0111:B4, Sigma Chemical Co., EUA) como controle positivo
ou somente RPMI-1640-C como controle de células. Estas placas foram novamente
incubadas a 37ºC em estufa (Forma Scientific, EUA) com tensão constante de 5%
de CO
2
por mais 24 h. Os sobrenadantes das culturas foram então coletados,
centrifugados em centrifuga refrigerada (Hettich, Alemanha) a 7800 x g durante 10
minutos, aliquotados em microtubos e estocados a -80°C até o momento da
determinação das citocinas através do teste imunoenzimático ELISA de captura.
4.3.4- Obtenção das Células Esplênicas
Para o estudo da produção de IL-10 e IFN-γ foram utilizadas culturas de células
esplênicas. Os animais foram eutanasiados por inalação em câmara de CO
2
e, em
câmara de fluxo laminar Classe 100 (Veco), tiveram a pele da região abdominal
retirada e o peritôneo aberto para a extração do baço. O baço foi retirado e
transportado para uma placa de Petri estéril (Corning, Inc.) contendo 3,0 mL de BSS
(Balanced Salt Solution), pH 7,2, gelado, onde foi macerado cuidadosamente com o
auxílio de pinças estéreis para liberação das células. O conteúdo da placa foi
aspirado várias vezes por seringa de 3,0 mL e agulha 25 x 7,0 para obtenção de
suspensão celular homogênea. Após este procedimento as células foram
transferidas para tubo cônico estéril (Corning, Inc., EUA) de 15,0 mL e centrifugadas
em BSS três vezes a 200 x g por 5 min (Centrífuga Fanem, Ind. Bras.). As células
sedimentadas foram ressuspendidas em 1,0 mL de meio RPMI-1640-C e a
contagem do número de células viáveis foi feita em câmara hemocitométrica de
Neubauer (Boeco, Germany) através da técnica de exclusão com Azul de Trypan
(Vetec) a 0,04% em PBS. Após a contagem, as suspensões celulares foram
ajustadas à concentração de 5x10
6
células/mL para determinação da produção de
IL-10 e IFN-γ.
33
4.3.5- Obtenção dos sobrenadantes da cultura de células esplênicas
A suspensão de células esplênicas foram ajustadas a 5 x 10
6
células/mL,
obtidas como descrito no item 4.3.4. Na avaliação da produção de IL-10 e IFN-γ, a
suspensão de células foi distribuída em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades
(Corning, Inc., EUA), 500 µL por cavidade e acrescentadas de 500 µl da solução de
RIPs (abrina, pulchelina e ricina) em 0,39 e 0,78 ng/mL (concentração no poço) ou
Concanavalina A (ConA) na concentração de 0,5 µg/mL, usada como controle
positivo, ou ainda somente meio de cultura nos controles de células. As placas foram
incubadas a 37
°
C em estufa contendo tensão constante de 5% de CO
2
(Forma
Scientific) por 24 h. Os sobrenadantes das culturas foram então coletados,
centrifugados em centrifuga refrigerada (Hettich, Alemanha) a 7800 xg durante 10
minutos. Os sobrenadantes foram aliquotados em eppendorfs e estocados a -80°C
para posterior dosagem de IL-10 e IFN-γ liberado nos sobrenadantes.
4.3.6- Linhagens celulares
4.3.6.1- Células LM3 e LP07
As linhagens tumorais de adenocarcinoma de pulmão LP07 e LM3 murinos
foram gentilmente cedidas pelo Instituto de Oncologia Angel H. Roffo – Buenos Aires
– Argentina.
A linhagem LP07 foi derivada do tumor P07 mantido por diversas passagens
subcutâneas. A partir da linhagem in vivo, se obteve a linhagem in vitro chamada
LP07. Essas células se metastatizam espontaneamente no pulmão com alta
freqüência. Tanto as células P07 quanto LP07 produzem síndromes paraneoplásicas
como hiperleucocitose, por produção de GM-CSF, hipercalcemia e caquexia
(URTREGER et al., 2001).
A linhagem LM3 é originada de um adenocarcinoma mamário obtido em
camundongo Balb/c, transplantável, com metástase para o pulmão (URTREGER et
al., 1997).
34
4.3.7- Avaliação da Viabilidade Celular de células do exsudato peritoneal
Foi empregada para a determinação da viabilidade celular a técnica
colorimétrica utilizando uma solução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-
difeniltetrazólio (MTT), que se baseia na verificação da atividade e integridade
mitocondrial, interpretada como uma medida de viabilidade celular (MOSMANN,
1983). Esta metodologia baseia-se na redução do sal de MTT por enzimas
microssomais e também pela enzima succinato desidrogenase mitocondrial das
células viáveis. O produto dessa redução são cristais de formazana, insolúveis e de
cor púrpura, acumulando-se nas células devido a sua incapacidade de atravessar a
membrana celular. O álcool isopropílico por sua vez, é utilizado para a solubilização
da formazana, produzindo uma solução homogênea que possibilita a medição da
densidade óptica em espectrofotômetro UV/Visível.
Foram utilizadas suspensões de PEC, ajustadas à concentração de 5x10
6
células/ml. 100 µl dessas suspensões foram adicionados em placas de 96 cavidades
(Corning) e 100µl das RIPs (abrina, ricina e pulchelina) em diferentes concentrações:
0,39, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25, 50, 500, 5000 e 12500 ng/mL (concentração no
poço), LPS a 10 µg/mL, PMA 0,2 µg/mL (acetato de forbol miristato, Sigma
Chemical. Co., EUA) ou somente o meio de cultura RPMI-1640. As placas foram
incubadas por 24 horas em estufa a 37
o
C com tensão constante de 5% de CO
2
.
Após esse período, foram adicionados sobre a cultura celular, 100 µl de uma
solução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólico (MTT) (Across
Organics) a 0,5 mg/mL em RPMI-1640. A placa foi então incubada por mais 3 horas
nas mesmas condições anteriores. Após este período, o conteúdo da placa foi
vertido e 100 µL de álcool isopropílico (Mallinckrodt) foram adicionados a cada
orifício para solubilizar os cristais de formazana formados. Somente células e meio
de cultura RPMI-1640-C foram utilizados como controle, equivalendo a 100% de
viabilidade dos macrófagos. A leitura foi feita em espectrofotômetro UV/Visível
(Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland) a 540nm com
filtro de referência a 620nm (Mosmann, 1983).
35
4.3.8- Avaliação da Viabilidade Celular das células esplênicas
Alíquotas de 100 µL das suspensões de linfócitos, obtidas na concentração
conforme item 4.3.4, foram adicionadas em placas de 96 cavidades para cultivo de
tecidos (Corning, Inc., EUA). Aos linfócitos foram adicionados 100 µL das RIPs
(abrina, ricina e pulchelina) nas concentrações de 0,39 e 0,78 ng/mL, concentração
no poço, (concentrações em que se obteve viabilidade celular acima de 80% em
células peritoneais murinas).
A incubação foi feita em estufa a 37°C, com tensão de 7,5% de CO
2
(Forma
Scientific, EUA) por 24h. A seguir, foram adicionados 20µL de uma solução
concentrada de MTT (5mg/mL e meio RPMI 1640)/cavidade e incubou-se por mais 3
horas em estufa a 37ºC, com tensão de 7,5% de CO
2
(Forma Scientific, EUA). Após
esse procedimento, as placas foram centrifugadas a 800g durante 10 minutos a
10°C em centrífuga refrigerada (Hettich, Alemanha), os sobrenadantes foram
retirados por aspiração com auxílio de uma micropipeta, transferidos para outra
placa. Às células foram adicionados 100µL de álcool isopropílico (Mallinckrodt,
México) em cada cavidade. A leitura foi realizada em espectrofotômetro UV/Visível
(Multiskan Ascent, Labsystems, Filândia) em comprimento de onda de 570nm
(Bautista et al., 2000).
4.3.9- Determinação da produção de óxido nítrico
O óxido nítrico foi quantificado pelo acúmulo de nitrito em meio de cultura e
medido espectrofotometricamente utilizando o reagente de Griess com NaNO
2
como
padrão (Green et al., 1982).
A suspensão celular obtida foi ajustada a 5 x 10
6
células/ml em meio de RPMI-
1640. Foram distribuídos 100µl dessa suspensão celular em placa de 96 cavidades
estéreis. Em algumas cavidades da placa, foram adicionados 100 µl da abrina, ricina
ou pulchelina a 0,39 e 0,78 ng/mL (concentração no poço), em outras, 100 µl da
solução de LPS a 10 µg/ml como agente estimulante (controle positivo), e em outras
cavidades ainda, foram adicionadas 100 µl de meio RPMI-1640 à suspensão celular,
como controle de células (controle negativo). A placa assim constituída foi incubada
36
por 24 horas em estufa a 37°C com tensão constante de CO
2
(5%). Após a
incubação, foram retiradas alíquotas de 50 µl de cada amostra, sendo passadas
para outra placa e adicionados mais 50 µl/cavidade de reagente de Griess,
constituído de 0.1% de N-1-naphthyl-etilenodiamina, 0,1% de sulfanilamida em
solução ácido fosfórico a 3%. Após 10 minutos à temperatura ambiente no escuro,
as placas foram lidas em espectrofotômetro UV/Visível de microplacas (Multiskan
Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland) com filtro de 540 nm. As
concentrações de nitrito de sódio foram calculadas a partir de uma curva padrão
previamente estabelecida com concentrações molares conhecidas de nitrito de sódio
em meio RPMI-1640. Os testes foram realizados em triplicata e os valores expressos
em µmols de NO/5x10
5
células.
4.3.10- Determinação da atividade inibitória da abrina, da ricina e da
pulchelina em culturas de células peritoneais de camundongos quanto à
produção de NO
Células do exsudato peritoneal, na concentração de 5 x 10
6
células/ml, foram
utilizadas. As PEC foram incubadas em presença concomitante de 100 µl de solução
de LPS (10 µg/ml) e 100µl da abrina, ricina ou pulchelina a 0,39 e 0,78 ng/mL
(concentração no poço). A incubação foi feita por 24 horas em estufa a 37°C com
tensão constante de 7,5% de CO
2
. A produção de NO foi medida
espectrofotometricamente através do acúmulo de nitrito no meio de cultura com a
utilização do reagente de Griess de acordo com o item 4.3.11.
4.3.11- Determinação da produção de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A produção de H
2
O
2
foi determinada segundo o método descrito por Pick e
Keisari (1980) e adaptado por Pick e Mizel, em 1981. As células do exsudato
peritoneal dos animais foram obtidas como descrito no item 4.3.2 e ajustadas à
concentração de 2x10
6
células/ml em solução completa de vermelho de fenol
constituída de 140 mM de NaCl; 10 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,0; 5,5
37
mM de dextrose; 0,56 mM de vermelho de fenol e peroxidase de raiz forte, tipo II
(0,01 mg/mL, Sigma). Alíquotas de 100 µl foram adicionadas para placas de cultura
de tecido de fundo plano contendo 96 cavidades (Corning, Inc.) e acrescentadas de
50µl de abrina, ricina ou pulchelina a 0,39 e 0,78 ng/mL (concentração no poço), de
PMA a 0,2 µM (Sigma) em tampão fosfato de potássio (controle positivo) ou somente
solução de vermelho de fenol, como controle de células, e incubadas por 1 h em
estufa a 37
o
C em atmosfera úmida com tensão constante de 5% de CO
2
(Forma
Scientific). Após a incubação, a reação foi interrompida pela adição de 50 µl de
NaOH 5N (Sigma). A seguir foram feitas leituras em espectrofotômetro UV/Visível de
microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland),
com filtro de 620nm. As amostras foram ensaiadas em triplicata. Os resultados foram
expressos em nmols de H
2
O
2
/2x10
5
células peritoneais, a partir de uma curva padrão
previamente estabelecida, constituída de concentrações molares conhecidas de
H
2
O
2
em tampão de vermelho de fenol.
4.3.12- Determinação da atividade inibitória da abrina, da ricina e da
pulchelina em culturas de células peritoneais de camundongos quanto à
produção de H
2
O
2
Células do exsudato peritoneal na concentração de 2x10
6
células/ml foram
utilizadas. As PEC foram incubadas na presença de 50µl de PMA (0,2 µM) e 50 µl
de abrina, ricina ou pulchelina a 0,39 e 0,78 ng/mL (concentração no poço) durante 1
hora em estufa à 37°C com tensão constante de 7,5% de CO
2
. A produção de H
2
O
2
foi medida espectrofotometricamente de acordo com o item 4.3.13.
4.3.13- Cálculo da porcentagem de inibição
Foram calculadas as porcentagens de inibição, através de comparação com os
controles, nos experimentos onde as preparações obtidas a partir das toxinas
apresentavam efeitos inibitórios sobre a produção de NO e H
2
O
2
. A equação foi
utilizada para o cálculo.
38
Onde A, B e C correspondem a:
A = PMA (+), proteína (-)
B = PMA (+), proteína (+)
C = PMA (-), proteína (-)
A = LPS (+), proteína (-)
B = LPS (+), proteína (+)
C = LPS (-), proteína (-)
4.3.14- Dosagem das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α e IFN-γ.
As citocinas IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α foram quantificadas no sobrenadante
obtido da cultura de macrófagos, e IL-10 e IFN-γ no sobrenadante de células
esplênicas através do teste imunoenzimático ELISA, utilizando Kit Pharmingen de
acordo com as instruções do fabricante. As microplacas de poliestireno de 96
cavidades (Corning Inc., NY) foram adsorvidas com um anticorpo de captura (soro
de rato) anti- IL-1β, anti-IL-6, anti-IL-10, anti-IL-12, anti-TNF-α ou anti-IFN-γ de rato
purificado a 4µg/ml (100 µl/cavidade) em tampão PBS e incubadas “overnight” à
temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com solução salina
tamponada com fosfatos, pH 7,2 (PBS) contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Após
a lavagem, foram bloqueadas com 300 µl de BSA a 1% em PBS (PBS/BSA, com 5%
de sacarose e 0,5% de azida sódica) à temperatura ambiente por 60 minutos e
lavadas 3 vezes com PBS-T. Foram adicionados à placa 100 µl de cada citocina
padrão ou sobrenadantes das culturas de células peritoneais. As placas foram
Inibição (%) = A - B x 100
A - C
No teste H
2
O
2
No teste NO
39
incubadas à temperatura ambiente por 120 minutos, e lavadas 4 vezes com PBS/T.
Em seguida, foram adicionados 100 µl/cavidade de anticorpo monoclonal de cabra
anti- IL-1β, anti-IL-6, anti-IL-10, anti-IL-12, anti-TNF-α e anti- IFN-γ de rato marcado
com biotina na concentração de 400 ng/ml em diluente de reagente (1%BSA, 0,05%
de Tween 20 em tampão Tris-NaCl). As placas foram incubadas à temperatura
ambiente por 120 minutos e lavadas 3 vezes com PBS-T, sendo então adicionados
100 µl do conjugado peroxidase-streptavidina diluído em PBS/BSA e incubadas
novamente à temperatura ambiente por 20 minutos. Após esse processo, as placas
foram lavadas 3 vezes com PBS-T e 100 µl do substrato (10mM de tampão citrato-
fosfato, contendo 0,4 mM de tetrametilbenzidina [SIGMA] e 1,2 mM de H
2
O
2
) foram
adicionados em cada cavidade. A reação foi interrompida adicionando-se 50 µl de
H
2
SO
4
2N. A absorbância foi lida a 450nm em espectrofotômetro UV/visível de
microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland) e
as concentrações das citocinas foram quantificadas utilizando uma curva padrão
previamente estabelecida com quantidades conhecidas de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12,
TNF-α, ou IFN-γ padrão. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados
expressos em picogramas/ml.
4.3.15- Determinação da atividade anti-proliferativa em células LM3 e
LP07
A avaliação da atividade da pulchelina, abrina e ricina sobre o crescimento
celular foi realizada utilizando-se linhagens tumorais murinas LM3 (adenocarcinoma
de mama) e LP07 (adenocarcinoma de pulmão).
As linhagens celulares foram mantidas em meio de cultura MEM (Minimum
Essencial Medium, Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado
(Sigma) e 4µg/mL de gentamicina, em estufa a 37°C com atmosfera úmida e tensão
constante de 7,5% de CO
2
(Forma Scientific). Foram realizados repiques celulares 3
vezes por semana. O número de células foi determinado pela contagem em câmara
hemocitométrica de Neubauer (Boeco), utilizando-se corante Azul de Tripan a 0,04%
em PBS e ajustado a uma concentração de 5 x 10
4
células/mL em meio MEM.
40
O crescimento tumoral foi quantificado pela capacidade das células vivas
reduzirem o MTT. Foram adicionados 200µL das linhagens tumorais em placas de
96 cavidades, Corning. Após 24 horas de incubação a 37°C e 7,5% de CO
2
, 200µl
da solução de pulchelina, ricina e abrina, em diferentes concentrações: 0,78, 1,56,
3,13, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 1000 e 10000 ng/mL (concentração no poço) foram
adicionados e incubados por mais 24 horas. Após esse período, foram adicionados
sobre a cultura celular, 100 µl de uma solução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2-5-difeniltetrazólico (MTT) (Across Organics) a 0,5 mg/mL em meio MEM. Após
três horas, o conteúdo da placa foi novamente vertido e 100µL de álcool isopropílico
(Mallinckrodt) foram adicionados a cada cavidade da placa para solubilizar os
cristais de formazana formados. Somente células e meio de cultura foram utilizados
como controle negativo, equivalendo a 100% de viabilidade das células peritoneais,
como droga padrão foi usado Taxol
®
(Sigma) a 0,12, 0,24, 0,49, 0,98, 1,95, 3,91,
7,81, 15,63, 31,25, 62,50, 125 e 250µg/mL (concentração no poço). A leitura da
absorbância foi realizada em espectrofotômetro UV/Visível (Multiskan Ascent,
Labsystems Research Tech. Div., Helsinki, Finland), em comprimento de onda de
540 nm e filtro de referência 620 nm.
4.3.16- Análise Estatística dos Resultados
A análise estatística dos resultados foi realizada por intermédio do programa
estatístico GraphPad Instat aplicando-se análise de variância com determinação do
nível de significância para p<0,05, através de comparações múltiplas pelo teste de
Tukey. Todos os experimentos foram realizados usando cinco animais e cada
determinação foi executada em triplicata.
41
5. RESULTADOS
5.1- Isolamento das proteínas
A pulchelina, 1,25 mg/mL, solubilizada em Tris 20mM NaCl 10mM pH 8,0
apresenta D.O. (densidade óptica) de 1,0, o que equivale à concentração de 1,25
mg/mL no comprimento de onda de 280nm (Mota, 1997).
No isolamento da abrina e ricina obteve-se soluções puras em PBS, nas
concentrações 2,024 e 1,78 mg/mL, respectivamente. A D.O. da abrina apresentam
o valor de 1,24 (Ishiguro, et al., 1964), e ricina de 1,156 (Lin et al., 1969).
Observamos que as proteínas ao serem tratadas com 2-mercaptoetanol e
aplicadas no gel de eletroforese SDS-PAGE, mostraram-se em duas bandas no gel,
correspondendo às duas cadeias polipeptídicas, uma de 30 kDa e 33 kDa para
abrina, e uma de 31 kDa e 33 kDa para ricina.
5.2- Viabilidade celular em células peritoneais e células esplênicas
Nos ensaios de determinação da viabilidade celular foi verificado que os
macrófagos são sensíveis ao potencial tóxico das proteínas abrina, ricina e
pulchelina. Os valores dos IC
50
, em 24 h de incubação, para abrina foi 6,4 ± 1,53
ng/mL, para ricina 11,8 ± 1,66 ng/mL e para pulchelina 19,3 ± 4,0 (Fig. 6).
42
Figura 6. Viabilidade das células do exsudato pertitoneal na presença de
diferentes concentrações da abrina, ricina e pulchelina. Foram utilizadas
suspensões de células do exsudato peritoneal ou de células esplênicas ajustadas à
concentração de 5x10
6
células/mL. Solução de MTT foi adicionada às PEC
previamente incubados com soluções de abrina, ricina ou pulchelina em diversas
concentrações durante 24h de incubação.
02468101214
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% viabilidade
Concentração ng/mL
Abrina
02468101214
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% viabilidade
Concentração ng/mL
Ricina
0 5 10 15 20 25
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% viabilidade
Concentração ng/mL
Pulchelina
43
Figura 7: Viabilidade de células do exsudato peritoneal e células esplênicas de
camundongos Swiss na presença das proteínas abrina, ricina e pulchelina.
Foram utilizadas suspensões de células do exsudato peritoneal ou de células
esplênicas ajustadas à concentração de 5x10
6
células/mL. Solução de MTT foi
adicionada aos macrófagos/linfócitos previamente incubados com soluções de 0,39
e 0,78 ng/mL de abrina, ricina ou pulchelina, ou LPS 10µg/mL (macrófagos), ou
Concanavalina A 0,5µg/mL (linfócitos) durante 24h de incubação. As células em
meio de cultura (RPMI-16400) foram utilizadas como controle, equivalendo a 100%
de viabilidade. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão de
triplicata de 5 animais.
*** p<0,001, significativo em relação ao controle negativo.
** p<0,01, significativo em relação ao controle negativo.
* p<0,05, significativo em relação ao controle negativo.
0
20
40
60
80
100
0,78
0,78
0,39
0,39
% viabilidade
PEC
Céls. esplênicas
0,39 0,78
Abrina Ricina
Pulchelina
C-
L
P
S
C
o
n
A
PM
A
44
Tabela 1 – Porcentagem de viabilidade celular em PEC e células esplênicas
murinas após exposição às concentrações de 0,39 e 0,78 ng/mL
Viabilidade (%)
Macrófagos Linfócitos
Abrina 0,39 ng/mL 84,03 ± 1,46 95,60 ± 1,59
Abrina 0,78 ng/mL 83,90 ± 2,56 96,50 ± 0,96
Ricina 0,39 ng/mL 97,14 ± 2,86 98,65 ± 0,41
Ricina 0,78 ng/mL 84,34 ± 1,49 96,00 ± 1,96
Pulchelina 0,39 ng/mL 98,68 ± 1,53 95,74 ± 1,27
Pulchelina 0,78 ng/mL 90,61 ± 2,54 94,27 ± 2,06
LPS 10 µg/mL
71,08 ± 0,16 ------
PMA 0,2 µg/mL
99,92 ± 0,15 ------
ConA 0,5 µg/mL
------ 100 ± 0,00
45
As concentrações de 0,39 e 0,78 ng/mL foram escolhidas para a realização dos
demais testes, pois macrófagos e linfócitos apresentaram viabilidade acima de 80%
em presença das proteínas nestas concentrações (Figura 7 e Tabela 1).
5.3- Determinação da produção de óxido nítrico
As células do exsudato peritoneal dos camundongos foram incubadas em
triplicata com as soluções de abrina, ricina e pulchelina nas concentrações de 0,39 e
0,78 ng/mL, além do LPS (controle positivo) ou apenas meio RPMI-1640-C (controle
negativo).
Após incubação por 24h, as proteínas não induziram níveis de NO
estatisticamente significativos (p> 0,05) em relação ao controle negativo. (Fig. 8 e
Tabela 2).
46
0,39 0,78 0,39 0,78 0,39 0,78 C+ C-
0
20
40
60
80
100
120
Controles
Pulchelina
Concentração de NO (µmol/5x10
5
celulas)
Abrina Ricina
***
Figura 8. Produção de óxido nítrico em cultura de células do exsudato
peritoneal. Os macrófagos peritoneais foram cultivados em meio RPMI-1640-C (C-)
e com o LPS (C+). Os macrófagos peritoneais foram incubados com as soluções das
proteínas por 24h nas concentrações de 0,39 e 0,78 ng/mL. Aos sobrenadantes das
culturas, foi adicionado o reagente de Griess, e após 10 min. a placa foi lida em
espectrofotômetro a 540nm. A concentração de nitrito foi obtida de uma curva
padrão com quantidades conhecidas de NaNO
2
. Os resultados foram expressos
como a média ± desvio-padrão de triplicata de 5 animais.
***p<0,001, estatisticamente significante em relação ao controle negativo.
Tabela 2. Efeitos das RIPs abrina, ricina e pulchelina na produção de óxido nítrico em culturas de células peritoneais
Produção de NO (µmols/ 5x10
5
células)
Abrina (ng/mL) Ricina (ng/mL) Pulchelina (ng/mL) LPS Cont. Neg.
0,39 0,78 0,39 0,78 0,39 0,78
2,51 ± 0,99 2,80 ± 0,67 1,59 ± 0,70 3,29 ± 0,59 1,81 ± 0,76 3,56 ± 0,96 104,44 ± 2,48 3,58 ± 0,63
48
5.4- Determinação da produção de peróxido de hidrogênio
As células do exsudato peritoneal dos camundongos foram incubadas em
triplicata com as soluções de abrina, ricina e pulchelina nas concentrações de 0,39 e
0,78 ng/mL, além de PMA (controle positivo) ou tampão completo de vermelho de
fenol (controle negativo).
As proteínas nas concentrações citadas acima não induziram níveis de H
2
O
2
estatisticamente significativos (p>0,05) em relação ao controle negativo (Fig. 9 e
Tabela 3).
49
0,39 0,78 0,39 0,78 0,39 0,78 C+ C-
0
5
10
15
20
25
Controles
Pulchelina
Ricina
Concentração de H
2
O
2
(nmols/2x10
5
células)
Abrina
***
Figura 9. Produção de peróxido de hidrogênio em cultura de células do
exsudato peritoneal. As células peritoneais foram cultivadas em vermelho de fenol
completo (C-) ou com o PMA (C+). As células foram incubadas com as soluções de
proteínas por 1h (0,39 e 0,78 ng/mL). A reação foi interrompida, e a seguir foram
lidas em espectrofotômetro a 620nm. Os resultados foram expressos em nanomols
de H
2
O
2
/2x10
5
células, como a média ± desvio-padrão de triplicata de 5 animais.
***p<0,001, estatisticamente significante em relação ao controle negativo.
Tabela 3. Efeitos das RIPs abrina, ricina e pulchelina na produção de peróxido de hidrogênio em culturas de células
peritoneais
Produção de H
2
O
2
(nmols/2x10
5
células)
Abrina (ng/mL) Ricina (ng/mL) Pulchelina (ng/mL) PMA Cont. Neg.
0,39 0,78 0,39 0,78 0,39 0,78
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 22,39 ± 2,87 0,00 ± 0,00
51
5.5- Determinação da atividade inibitória quanto à produção de NO e
H
2
O
2
Para a realização desses testes, a viabilidade celular das células do exsudato
peritoneal foi testada na presença concomitante das proteínas e dos agentes
estimulantes (PMA ou LPS), demonstrando uma viabilidade superior a 80%,
satisfatória para a realização dos ensaios.
As soluções de abrina, ricina e pulchelina inibiram a liberação de H
2
O
2
após 1
hora de incubação nas concentrações de 0,39 e 0,78 ng/mL, confirmando o fato de
não induzirem a sua produção (Fig. 9). As porcentagens de inibição das proteínas
sobre a produção de H
2
O
2
estão ilustradas na Tabela 4.
As proteínas abrina, ricina e pulchelina inibiram fracamente a produção de NO
após 24 horas de incubação. As porcentagens de inibição das proteínas sobre a
produção de NO estão ilustradas na Tabela 4.
Tabela 4 – Percentagem de inibição das RIPs sobre a produção de H
2
O
2
e NO em células peritoneais
Inibição (%)
Abrina (ng/mL) Ricina (ng/mL) Pulchelina (ng/mL)
0,39 0,78 0,39 0,78 0,39 0,78
NO 20,13 ± 5,70 21,56 ± 2,38 16,59 ± 4,02 11,22 ± 4,34 21,18 ± 3,21 10,28 ± 4,50
H
2
O
2
76,04 ± 1,09
70,11 ± 2,26 71,09 ± 1,95 57,74 ± 0,23 86,81 ± 2,80 20,68 ± 2,03
53
5.6- Dosagens das citocinas IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-
γ
e IL-10
As soluções de abrina, ricina e pulchelina nas concentrações de 0,39 e 0,78
pg/mL foram testadas em macrófagos para determinar se as mesmas são capazes
de induzirem a produção de IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α, e em linfócitos para IL-10 e
IFN-γ.
A abrina em todas as concentrações testadas não induziu a produção de IL-6 e
TNF-α, contudo induziu levemente a produção de IL-1β e fortemente a produção de
IL-10, IL-12 e IFN-γ, sendo que para IL-12, a estimulação foi muito maior do que a
exercida pelo LPS.
A ricina em todas as concentrações testadas não induziu a produção de IL-6,
contudo, na concentração de 0,78 pg/mL, houve a indução de IFN-γ, TNF-α, IL-1β,
IL-10 e IL-12, tendo resultados estatisticamente significativos (p<0,001). Na
concentração de 0,39 pg/mL, houve indução de IL-1β, IL-12, IL-10 e IFN-γ.
Com relação à pulchelina, não houve estimulação da produção de IL-6 e IL-1β,
mas houve estimulação de TNF-α, IL-10, IFN-γ, na concentração de 0,39 pg/mL, e
de IL-10, IFN-γ e IL-12, na concentração de 0,78 pg/mL.
54
Figura 10: Indução de citocinas por abrina, ricina e pulchelina em macrófagos
peritoneais. Sobrenadantes coletados de macrófagos incubados somente na
presença de LPS (1µg/mL), ou de meio de cultura (RPMI-1640) foram utilizados,
respectivamente, como controle positivo (LPS) e negativo (C-). Cada barra
representa a média ± desvio padrão de três experimentos independentes realizados
em duplicata. A análise estatística foi realizada através de análise de variância
(ANOVA) utilizando o pós-teste de Turkey. ** p<0,01 e *** p<0,001 quando
comparados ao controle negativo (RPMI-C).
0
5000
10000
15000
20000
25000
0,78
0,78
0,390,39
Concentração de IL-6 pg/mL
***
0,39
0,78
LPS
RPMI
Abrina
Ricina
Pulchelina
Controles
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0,78
0,78
0,390,39
**
**
***
***
***
Concentração de IL-12 pg/mL
***
0,39 0,78
LPS RPMI
Abrina
Ricina Pulchelina
Controles
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0,78
0,78
0,39
0,39
***
***
***
Concentração de IL-1 beta (pg/mL)
**
***
0,39
0,78
LPS C-
Abrina Ricina
Pulchelina
Controles
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
***
0,78
0,78
0,39
0,39
Concentração TNF-alfa pg/mL
***
***
0,39
0,78
LPS
RPMI
55
Figura 11: Indução de IFN-γ e IL-10 por abrina, ricina e pulchelina em células
esplênicas. Sobrenadantes de linfócitos incubados somente na presença de
solução de Conconavalina A (0,5µg/mL), ou de meio de cultura (RPMI-1640) foram
utilizados, respectivamente como controle positivo e negativo. Cada barra
representa a média ± desvio padrão de três experimentos independentes realizados
em duplicata. A análise estatística foi realizada através de análise de variância
(ANOVA) utilizando o pós-teste de Turkey. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 quando
comparados ao controle negativo (RPMI-C).
0
100
200
300
400
500
***
***
***
***
***
***
0,78
0,78
0,390,39
Concentração de IFN-gama (pg/mL)
0,39
0,78
ConA
C-
Controles
Abrina
Ricina
Pulchelina
***
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
***
***
***
***
***
***
Controles
Pulchelina
Ricina
0,78
0,78
0,390,39
Concentração de IL-10 (pg/mL)
0,39
0,78 ConA
C-
Abrina
***
Tabela 5. Indução de citocinas por abrina, ricina e pulchelina em células peritoneais (IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α) e em
células esplênicas (IL-10 e IFN-γ).
Produção (pg/mL)
Abrina (ng/mL) Ricina (ng/mL) Pulchelina (ng/mL)
0,39 0,78 0,39 0,78 0,39 0,78 LPS/ConA RPMI-C
IL-1β
270,90 ± 8,79 390,06 ± 14,02 296,07 ± 41,4 346,34 ± 20,84 135,61 ± 33,55 139,34 ± 16,58 1832,53 ± 71,04 136,03 ± 17,63
IL-6
3657,89 ± 172,34 3757,06 ± 373,76 3828,10 ± 351,16 3402,37 ± 436,20 3282,16 ± 262,22 3189,14 ± 355,72 21834,77 ± 506,09 3855,44 ± 267,88
IL-10
305,27 ± 37,53 321,64 ± 39,55 158,26 ± 8,26 196,93 ± 44,68 365,04 ± 35,13 195,34 ± 15,20 355,15 ± 28,30 71,83 ± 5,98
IL-12
5837,15 ± 139,58 5017,75 ± 63,81 4082,59 ± 156,31 3445,40 ± 245,81 2023,64 ± 148,05 2905,74 ± 170,15 2844,12 ± 122,62 2281,41 ± 51,67
TNF-α
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 34,84 ± 2,25 30,44 ± 6,12 0,00 ± 0,00 131,64 ± 8,08 0,00 ± 0,00
IFN-γ
383,89 ± 13,41 367,29 ± 10,30 337,51 ± 4,62 371,46 ± 1,68 357,00 ± 6,22 361,84 ± 8,57 432,26 ± 10,91 6,00 ± 2,03
57
5.7- Determinação da atividade anti-proliferativa em células LM3 e LP07
As células de carcinoma de mama (LM3) e pulmão (LP07) foram incubadas em
triplicata por 24 horas com as proteínas abrina, ricina e pulchelina nas
concentrações de 0,78, 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 1000 e 10000 ng/mL e
meio MEM (controle negativo). O Taxol foi utilizado como droga padrão nas
concentrações de 0,12, 0,24, 0,49, 0,98, 1,95, 3,91, 7,81, 15,63, 31,25, 62,50, 125 e
250µg/mL.
Nos ensaios para determinação de atividade anti-proliferativa, verificou-se que
as células LM3 e LP07 são sensíveis ao potencial tóxico das proteínas abrina, ricina
e pulchelina, isoladamente, além da droga padrão, Taxol
®
. Os valores médios de
IC
50
para as células LM3 e LP07 por 24 e 48 horas de exposição, estão
apresentados nas Tabelas 6 e 7, respectivamente.
58
Tabela 6 – Valores de IC 50 dos compostos para as células LM3 e LP07 após 24
horas de exposição
IC
50
(ng/mL) LM3 LP07
Abrina 81,54 ± 2,56 175,2 ± 2,60
Ricina 822 ± 1,45 1084,9 ± 2,75
Pulchelina 74,98 ± 2,69 1127,0 ± 2,41
Taxol
®
193,89.10
3
± 1,36 134,0.10
3
± 1,15
Tabela 7 – Valores de IC 50 dos compostos para as células LM3 e LP07 após 48
horas de exposição
IC
50
(ng/mL) LM3 LP07
Abrina 42,8 ± 6,36 37,44 ± 5,52
Ricina 590,3 ± 2,26 609,2 ± 4,0
Pulchelina 91,94 ± 4,58 80,11 ± 5,76
Taxol
®
12,65.10
3
± 2,7 85,84.10
3
± 1,99
59
6- DISCUSSÃO
Primeiramente, neste trabalho, foi determinada a concentração inibitória 50%
(IC
50
) das proteínas sobre macrófagos murinos. Em seguida, analisamos a
viabilidade celular em macrófagos e em linfócitos tratados com as proteínas nas
concentrações que seriam utilizadas nos testes imunológicos propriamente ditos, na
presença e ausência de LPS ou PMA, de forma que se assegurasse a capacidade
destas células responderem aos estímulos utilizados mostrando-se viáveis.
Em ratos, os sintomas de intoxicação por ricina são lesões necróticas graves
no fígado, pâncreas e rins, inflamação e hemorragia graves no intestino, ascite
maciça e efusão pleural (DERENZINI et al., 1976). Baseado nisso, procuramos
encontrar, através do teste de viabilidade celular, uma concentração das proteínas
que não apresentasse efeitos tóxicos, mas possuísse valor terapêutico.
A determinação do IC
50
foi realizada em células peritoneais murinas com tempo
de incubação de 24 horas. Pelos resultados apresentados na Figura 7, observa-se
que os macrófagos mostraram-se muito sensíveis ao potencial tóxico das proteínas,
sendo a abrina (IC
50
= 6,4 ± 1,53 ng/mL) mais tóxica do que a ricina (IC
50
= 11,8 ±
1,66 ng/mL), e esta que a pulchelina (IC
50
= 19,3 ± 4,0 ng/mL).
As diferenças observadas na toxicidade de diferentes RIPs não podem ser
conferidas somente pela capacidade da proteína entrar nas células, o que é
conferido pela presença da cadeia B (cadeia lectínica), pois depende também da
capacidade da proteína escapar, ao menos em parte, da degradação por
proteossomas (STIRPE; BATTELLI, 2006). Olsnes e colaboradores (1978)
observaram que células HeLa possuíam mais receptores para ricina (1 a 3x10
7
) do
que para modecina (2x10
5
), contudo, a modecina foi muito mais tóxica que a ricina
para estas células, o que fez com que concluíssem que a toxicidade não está
relacionada com o número de receptores e conseqüentemente à quantidade de
proteína que se liga na célula.
Os resultados da viabilidade celular em linfócitos tratados com abrina, ricina e
pulchelina nas concentrações utilizadas na dosagem das citocinas IL-10 e IFN-γ
demonstraram uma viabilidade acima de 90%, o que garante uma resposta
imunológica adequada (Fig. 7 e Tabela 1).
60
A função primordial do sistema imune é proteger o hospedeiro contra invasão
de patógenos através de diferentes componentes celulares incluindo macrófagos,
neutrófilos, linfócitos (T e B). Essas células em resposta a danos teciduais migram
rapidamente para o sítio de agressão iniciando uma resposta inflamatória
produzindo vários mediadores que se inter-relacionam.
Os macrófagos podem ser ativados a partir da estimulação com LPS e IFN-γ.
Uma das principais características dos macrófagos ativados é o aumento de sua
capacidade de liberar mediadores pró-inflamatórios e citotóxicos como
intermediários do oxigênio e nitrogênio, enzimas hidrolíticas e citocinas as quais
podem agir na destruição de antígenos. No entanto, esses mediadores não são
específicos e a liberação em excesso e descontrolada pode destruir tecidos normais
(MONCADA et. al., 1991).
Outra característica dos macrófagos ativados é a capacidade de distinguir
células normais das células com mitose estimulada ou células tumorais, e lisar
apenas as tumorais. Esse reconhecimento seletivo pode ocorrer pela ligação de
macrófagos ativados na superfície da membrana celular (FILDER e SCHROIT,
1998).
Os macrófagos quando ativados produzem diversos mediadores químicos e
biológicos, como espécies reativas do nitrogênio e oxigênio e citocinas. O óxido
nítrico é o componente principal do grupo chamado espécies reativas do nitrogênio.
Ele exerce diversas funções no organismo como, neurotransmissão, homeostasia
vascular, regulação imune e defesa do organismo (GATTI et al., 2004). Segundo
Salvemini e colaboradores (1996), o óxido nítrico é um potente vasodilatador e seu
envolvimento na resposta inflamatória pode ter relação com sua capacidade de
aumentar a permeabilidade vascular e o edema através de mudanças no fluxo
sangüíneo local e do aumento na produção de prostaglandinas pró-inflamatórias.
Nos últimos anos, estudos demonstraram que o NO está envolvido em diversos
processos biológicos afetando a carcinogênese, incluindo iniciação, promoção,
progressão, metástase, micro-circulação tumoral e angiogênese (HOFSETH et al,
2003).
Durante a defesa contra organismos patogênicos, o NO produzido por
macrófagos ativados pode atuar contra células epiteliais saudáveis vizinhas,
danificando seu DNA e promovendo a carcinogênese. Baixas concentrações desse
61
mediador podem ter efeito anti-apoptótico, enquanto que altas concentrações podem
induzir apoptose em células suscetíveis (HOFSETH et al., 2003).
Com relação à produção de NO pelas proteínas no presente estudo, não foi
observada uma estimulação significativa (Fig. 8 e Tabela 2), e as proteínas
exerceram uma leve inibição da produção do NO estimulada pelo LPS (Tabela 4),
variando de 10,28 ± 4,5 a 21,56 ± 2,38 por cento.
Narayanan e colaboradores (2004) observaram através de seus estudos que
abrina induz apoptose em células JR4 Jurkat, o que pode ser através da via
mitocondrial, além disso, eles relataram que a abrina induz a produção ROS, este
sendo um efeito da perda do potencial de membrana da mitocôndria, que
desencadeia eventos apoptóticos.
O peróxido de hidrogênio corresponde a outro mediador químico produzido por
macrófagos ativados durante uma resposta inflamatória, sendo ele um dos principais
componentes do grupo de espécies reativas do oxigênio (ROS). O peróxido de
hidrogênio passou a ser considerado como um mensageiro nas cascatas de
sinalização intracelular (RHEE, 1999). Níveis intracelulares moderados de ROS
mostraram-se importantes como um estimulador de proliferação celular, porém, altos
níveis podem resultar em dano celular, incluindo peroxidação dos lipídeos, danos ao
DNA, oxidação de proteínas e inativação de enzimas, que podem conduzir à morte
celular (BURDON, 1996; DREHER, JUNOD, 1996).
As proteínas avaliadas não induziram a produção de H
2
O
2
(Fig. 9 e Tabela 3),
porém elas exerceram uma forte inibição de sua produção (Tabela 4), ao redor de
70%, sendo esses resultados inéditos para a ricina e a pulchelina. É interessante
notar que uma substância com capacidade inibidora de H
2
O
2
pode apresentar
grande potencial antiinflamatório e, consequentemente, contribuir ao não surgimento
da carcinogênese. Resultados similares foram observados em trabalho anterior
realizado em nosso laboratório utilizando a fração acetato de etila obtida da planta
Alchornea glandulosa (LOPES et al., 2005).
A partir das sementes de A. precatorius pode-se obter quatro isoformas de
abrina (A-D) e uma aglutinina, esta sendo muito menos tóxica (DL
50
= 5 mg/Kg) em
relação à abrina (DL
50
= 2,8 µg/Kg) (OLSNES, PHIL, 1973). Em experimentos
utilizando a aglutinina na forma nativa, tem-se observado que ela estimula
macrófagos murinos a produzir 150 µM de óxido nítrico quando as células foram
tratadas com 10ng/mL da aglutinina. Além disso, a aglutinina também estimulou alta
62
liberação de peróxido de hidrogênio por macrófagos, sendo esta estimulação
independente da concentração de aglutinina testada (TRIPATHI, MAITI, 2003).
Os fagócitos podem migrar até os sítios de inflamação direcionados por um
processo denominado quimiotaxia. Receptores específicos são encontrados na
membrana dessas células e a ligação fator quimiotático/receptor pode desencadear
uma série de eventos celulares e bioquímicos, incluindo alterações no potencial de
membrana e fluxo de íons, rearranjo do citoesqueleto, extravasamento do conteúdo
citoplasmático, liberação de vários mediadores como as citocinas (HAMPTON et al.,
1998; FORMAN e TORRES, 2001; LUM et al., 2002).
Citocinas são peptídeos endógenos envolvidos na resposta imune. O delicado
equilíbrio das citocinas e de outros mediadores inflamatórios parece ser o fator
principal que pode conduzir a uma hiper-inflamação ou uma hiper-imunossupressão,
ambos podendo afetar órgãos vitais não envolvidos na agressão inicial (DELONG,
BORN, 2004).
Interleucina-1 é uma citocina pró-inflamatória produzida por macrófagos,
monócitos e células epiteliais. A secreção de IL-1 ativa uma cascata pró-inflamatória,
incluindo proliferação de células Th1, produção de TNF-α, IFN-γ, IL-2 e IL-12.
Produção aumentada de IL-1 é uma característica de desordens auto-imunes, como
artrite reumatóide (DINARELLO, 1991). A atividade da IL-1β diretamente influencia a
severidade das doenças inflamatórias auto-imunes crônicas, tais como esclerose
múltipla, doença óssea inflamatória e artrite reumatóide (DINARELLO, 1991;
BIOQUE et al., 1995).
Enquanto que o TNF-α é o principal mediador da inflamação, com ações
diretas sobre a destruição tecidual e reparação de lesões (BEUTLER, 1999). Além
disso, TNF-α medeia muitos eventos cruciais para a iniciação de eventos
inflamatórios agudos e crônicos, incluindo sobre-regulação da expressão de
moléculas de adesão (SPRINGER et al., 1987; SPINGER, 1990), indução de outras
citocinas de resposta precoce (IL-1 e IL-6) (LUKACS, STRIETER, KUNKEL, 1993) e
a ativação de citocinas quimiotáticas específicas para leucócitos (quimiocinas)
(OPPENHEIM et al., 1991). O TNF-α também tem a capacidade de estimular a
produção de NO em macrófagos através da expressão de iNOS, então estimulando
a atividade microbicida destas células (CARLOS et al., 2004)
No presente trabalho, observou-se uma produção de IL-1β, estatisticamente
significativa, pela abrina e ricina nas concentrações testadas (p<0,001), contudo a
63
pulchelina não apresentou estimulação significativa (p>0,05). Em relação à produção
de TNF-α, somente a ricina (0,78 ng/mL) e a pulchelina (0,39 ng/mL) apresentaram
produção significativa (p<0,001) ao redor de 34,84 pg/mL e 30,44 pg/mL,
respectivamente (Fig. 10 e Tabela 5). Nossos resultados em relação à pulchelina
são inéditos sem nenhum relato na literatura.
Korcheva e colaboradores (2007) demonstraram que ricina na concentração de
10 ng/mL estimulou a produção de TNF-α (aproximadamente 20 pg/mL) em
macrófagos da medula óssea de camundongos C57BL/6J (5x10
6
células), valor
diferente do encontrado neste trabalho. Um dos fatores que poderia estar
influenciando nesse resultado é que os pesquisadores americanos não realizaram o
teste do sal de tetrazólio, MTT, que nos assegura a viabilidade celular intrínseca do
teste.
Licastro e colaboradores (1993) relatam a indução da liberação de IL-1β e TNF-
α por células mononucleares humanas do sangue periférico quando tratadas com
abrina. A liberação de TNF-α foi dose-dependente. A máxima liberação destas
citocinas ocorreu quando as células foram tratadas com abrina 5,0 pM, sendo que,
quando usado concentrações maiores da proteína não ocorreu liberação delas, após
24 horas de incubação. Além disso, observaram que quando o tempo de incubação
foi aumentado para 48 horas, houve uma menor produção de TNF-α e maior
produção de IL-1β, quando comparado com incubação de 24 horas. Os autores
sugeriram que estas citocinas produzidas por macrófagos estimulados e/ou lesados
pela abrina podem contribuir para a patogênese das lesões e outros efeitos
observados após intoxicação por abrina.
Ricina também estimulou a produção de TNF-α em células RAW 264.7, uma
linhagem de macrófagos murinos, sendo também dose-dependente até a
concentração de 100 ng/mL de ricina, e concentrações acima desta induz menor
produção da citocina (KORCHEVA et al., 2005).
Além dos macrófagos serem potentes células secretoras de citocinas, os
linfócitos T compartilham essa atividade. Células T são freqüentemente classificadas
em 2 categorias, tipo 1 (Th1) e tipo 2 (Th2). Células Th1 são as principais produtoras
de IFN-γ e IL-2, e células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. As citocinas Th1
aumentam a imunidade mediada por células e as citocinas Th2 aumentam a
imunidade humoral (MOSMANN et al., 1986).
64
Interferon-γ é uma glicoproteína homodimérica produzida por ambas as células
T CD4+ e CD8+ e células NK (YOUNG, HARDY, 1990). No caso de células CD4+,
IFN-γ é primariamente produzido pelo subconjunto Th1. IFN-γ exibe várias
propriedades clássicas de ativação de macrófagos (FARRAR, SCHREIBER, 1993).
Ele aumenta a expressão de antígenos de MHC classe II, induz produção de vários
intermediários reativos do oxigênio, e potencializa síntese de citocinas como TNF-α,
IL-1β e IL-6. IFN-γ potencializa a produção de TNF-α em monócitos estimulados com
LPS pelo aumento tanto da transcrição de TNF-α como da estabilidade do mRNA do
TNF-α (HAYES, FREEMAN, DONNELLY, 1995). Nossos resultados de produção de
IFN-γ mostram em todas as concentrações testadas, alta produção de IFN-γ (ao
redor de 300 pg/mL, p<0,001, comparados com o controle negativo) (Fig. 11 e
Tabela 5).
O IFN-γ tem demonstrado potencializar a inibição do crescimento de células de
câncer de mama in vitro (CORADINI et al., 1997; LINDNER e BORDEN, 1997).
Estudo demonstrou que os linfócitos e IFN-γ colaboram para a proteção contra o
desenvolvimento de sarcomas carcinógeno-induzidos, carcinomas epiteliais
espontâneos e também para a seleção por células tumorais com imunogenicidade
reduzida (SHANKARAN et al., 2001).
O IFN-γ foi originalmente definido como um agente com ação antiviral, mas
suas propriedades incluem a regulação de vários aspectos da resposta imune, como
a estimulação da atividade microbicida dos macrófagos, estimulação da
apresentação de antígenos pelas moléculas do complexo de histocompatibilidade
principal, coordenação das interações entre os leucócitos e o endotélio, efeitos na
proliferação celular e na apoptose, bem como na estimulação e repressão de vários
genes cuja significância funcional ainda permanece obscura (BOEHM et al., 1997).
Quando uma resposta inflamatória aguda é ativada, a seqüência de citocinas
pró-inflamatórias inicia-se com a produção imediata de IL-1 e TNF-α. Eles estimulam
a liberação de IL-6 que realiza um importante papel iniciando a reação hepática de
fase aguda (LUSTER et al., 1994).
A Interleucina-6 é uma citocina multifuncional com vários efeitos estimuladores
sobre o crescimento celular e inflamação. A IL-6 é produzida por células B e T,
células endoteliais, fibroblastos, macrófagos e células epiteliais. Ela está envolvida
na iniciação e manutenção da resposta inflamatória de fase aguda. Além disso,
65
aumenta proteínas de resposta de fase aguda associadas com inflamação e dano
tecidual, tem sido implicada na diferenciação de células progenitoras
hematopoiéticas, na proliferação e diferenciação de uma variedade de tipos
celulares, por exemplo, células neuronais e mielóides (SCHELLER, OHNESORGE,
ROSE-JOHN, 2006). IL-6, como outras citocinas cujos receptores compartilham a
subunidade de transdução gp130, tem sido mostrada inibir a produção de TNF-α
tanto in vivo e como in vitro (ADERKA, LE, VILCEK, 1989).
Nossos resultados mostram uma produção de IL-6 (Fig 10 e Tabela 5) pelas
proteínas nas concentrações testadas similar à observada no controle de células
(células somente com meio de cultura), ou seja, não observamos liberação de IL-6
estatisticamente significativas pelas proteínas. Diferente de nossos resultados,
Korcheva e colaboradores (2005) observaram um aumento nos níveis de IL-1β,
TNF-α e IL-6 no soro de camundongos, 24 horas após serem tratados por via
intravenosa com ricina (12µg/100g de peso corpóreo).
A IL-12 é uma citocina imuno-reguladora que promove imunidade mediada por
células. Ela estimula a produção de IFN-γ por células NK e T. A IL-12 está envolvida
na indução e manutenção de respostas Th1 (BROMBACHER, KASTELEIN, ALBER,
2003). Altos níveis de IL-12 produzidos por células dendríticas ativam células T CD4
para secreção de citocinas Th1. Contudo, células dendríticas secretoras de IL-12
não polarizam fortemente a secreção de citocinas por células T CD8+, mas aumenta
bastante a avidez funcional das células T, provavelmente em parte através da
expressão aumentada de CD8 αβ (XU et al., 2003).
Outra citocina determinada foi IL-12, na qual observamos uma alta indução
desta citocina pelas proteínas, sendo maior que a indução pelo LPS, utilizado como
controle positivo. Contudo a produção desta citocina pela pulchelina na
concentração 0,39 ng/mL não foi estatisticamente significativa, sendo levemente
menor que a encontrada no controle negativo (células somente na presença do meio
de cultura) (Fig. 10 e Tabela 5).
Um dado importante que nos chama a atenção é a produção de mediadores
antiinflamatórios. A resposta antiinflamatória inicia-se com a produção de IL-1ra,
receptor solúvel de TNF-α e IL-10. Isto reduz os níveis e atividade de IL-1 e TNF-α.
Dependendo do estímulo físico, outras citocinas como fator de crescimento derivado
de plaqueta (PDGF) e fator de transformação e crescimento beta (TGF-β) são
66
produzidos e desempenham um papel no processo de remodelação do tecido
(KELLY, 1990; RUBIN et al. 1995).
A IL-10 é produzida por várias células, incluindo linhagem de
monócitos/macrófagos, queratinócitos, linfócitos T e B e mastócitos. Ela possui
atividades imuno-modulatórias potentes, afetando múltiplos tipos celulares em
diferentes formas. Então, IL-10 induz proliferação ou diferenciação de mastócitos,
linfócitos T citotóxicos, células B, e timócitos; aumenta citotoxicidade dependente de
antígeno mediada por monócito, e respostas de células T a IL-2. A IL-10 também
possui funções imunossupressoras, diminuindo a atividade de células T e NK e
inibindo função de apresentação de antígenos. IL-10 é também um potente inibidor
de monócitos/macrófagos, suprimindo sua capacidade de secretar citocinas e servir
como células acessórias para estimulação da função de célula T (PARRY et al.,
1997).
A produção de IL-10 em culturas de linfócito na presença das proteínas em
estudo mostra valores de moderados a altos (Fig. 11, Tabela 5), demonstrando que
as RIPs do gênero Abrus induziram maiores liberações, podendo significar proteínas
com capacidade antiinflamatória.
Mota (1997) observou que a isoforma 3 da pulchelina induziu significativamente
exsudação de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos Swiss após 6
horas da injeção intraperitoneal. Além disso, todas as isoformas apresentaram
atividade quimiotática in vitro para neutrófilos humanos.
A IL-10 tem sido sugerida como um potente sinal de recrutamento para
migração de leucócitos in vivo (PARRY et al., 1997) e assim sendo essa migração
de neutrófilos pode ser devido à estimulação da produção de IL-10 pela pulchelina
observada no presente estudo. Outro dado que corrobora com a produção de IL-10
é de que a administração de ricina induz uma resposta de IgE, aumentando também
a resposta contra outros antígenos administrados concomitantemente (THORPE et
al., 1989).
Tudo leva a crer que abrina, ricina e pulchelina, por serem imunogênicas,
podem funcionar como coadjuvantes contribuindo para o aumento da resposta
imune contra diversos antígenos a que o organismo se exponha conjuntamente. Isso
reflete diretamente nas observações atuais de que as imunizações mais eficientes
englobam ambas as respostas Th1 e Th2. Nesse ponto particular, em nosso estudo,
67
essas proteínas induziram esses dois tipos de resposta imune observada a partir de
seu perfil de citocinas:
-abrina promoveu a produção de IL-1β, IL-12, IFN-γ e IL-10;
- ricina produziu IL-1β, IL-12, IFN-γ, TNF-α e IL-10;
- pulchelina promoveu a produção de IL-12, TNF-α, IFN-γ e IL-10.
Sabe-se que as interações entre as células tumorais com seu microambiente
podem afetar o crescimento tumoral e a formação de metástase. O microambiente
tumoral pode variar entre os tipos de tumores e os estágios da doença, fato que é
complexo e consiste de muitos fatores e tipos celulares. Dentre os componentes do
microambiente tumoral, as células inflamatórias e as citocinas têm demonstrado
desempenhar um papel-chave no câncer de mama (BEN-BARUCH, 2003). Outro
fato, não menos importante quanto às proteínas em análise, é que pela presença de
forte toxicidade, elas podem ser utilizadas como antitumorais.
Em 2005, o câncer foi o responsável por 13% de todas as mortes no mundo.
Os principais tipos de câncer com maior mortalidade foram: pulmão, estômago,
fígado, cólon e mama. No Brasil, as estimativas para 2008 apontam que, à exceção
do câncer de pele do tipo não melanoma, os tipos mais incidentes serão os cânceres
de próstata de pulmão no sexo masculino e os câncer de mama e de cólon do útero
no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada no
mundo (Instituto Nacional do Câncer, 2008).
O câncer de pulmão está associado ao ato de fumar. A contínua exposição aos
carcinógenos do cigarro resulta no acúmulo de diversas alterações de genes
relacionados à tumorigênese conduzindo a lesões bronquiais neoplásicas (PANANI,
ROUSSOS, 2006).
Com relação ao câncer de mama, o histórico familiar e a exposição
acumulativa ao longo da vida a hormônios reprodutivos, este sendo o mais
significativo e bem caracterizado fator de risco para o desenvolvimento desse tipo de
tumor (POLYAK, 2006).
Mulheres, que entraram na menarca precocemente, ou que entraram na
menopausa tardiamente, podem desenvolver câncer de mama pelo prolongamento
do tempo de exposição ao estrógeno. Este induz a proliferação celular, tanto
benigna como maligna e induz a secreção de fatores de crescimento mitógenos por
estimulação direta (SCHNITT et al., 1988).
68
O papel do sistema imune na proteção contra o câncer tem sido marcado por
duas posições extremas. Sugere-se que a imuno-vigilância seja responsável pela
detecção e eliminação das células tumorais, sendo o principal mecanismo pelo qual
o desenvolvimento tumoral é controlado. Por outro lado, a imuno-estimulação prediz
que baixa reatividade imune contra tumores, como é usualmente observada em
pacientes com câncer, é estimulante para o crescimento das células tumorais
(JAKÓBISIAK, LASEK, GOLAB, 2003). A infiltração tumoral por células inflamatórias
tem sido detectada em humanos e em tumores experimentais. Sendo estes
infiltrados predominantemente compostos por linfócitos e macrófagos, mas células
dendríticas, granulócitos e mastócitos também podem estar presentes (BOON et al.,
1994).
A presença de anticorpos, em pacientes com tipos distintos de tumores, que
reconhecem antígenos e que pode estar vinculada com síndromes paraneoplásicas,
o que indica uma resposta policlonal e multifuncional nestes pacientes (ANTOINE et
al., 1999; BAZHIN et al., 2001; FERNANDEZ MADRID et al., 2005).
Deve-se levar em conta que as proteínas com elevada expressão nas células
tumorais, poderiam estar atuando como antígenos desencadeando uma resposta
imune humoral em portadores de tumor (FISZMAN et al., 2005). Baseados nessa
descoberta, pesquisadores estão desenvolvendo um novo tratamento contra o
câncer chamado imunotoxinas, nas quais as moléculas de toxicidade conhecida são
acopladas às moléculas de anticorpos contra antígenos específicos tumorais. Os
anticorpos funcionam direcionando as toxinas para as células tumorais.
Algumas imunotoxinas têm sido produzidas utilizando-se proteínas inativadoras
de ribossomos (RIPs) dos tipos I e II. Contudo, as RIPs do tipo II não podem ser
usadas sem passarem por tratamento, bloqueando-se seus sítios de ligação
lectínica, para que as imunotoxinas não se liguem às células sadias que possuem
receptores contendo carboidratos em sua composição. Outra opção foi utilizar
somente a cadeia com atividade enzimática, cadeia A, das RIPs tipo II, na produção
das imunotoxinas, que tem se mostrado mais promissoras (FRACASSO et al., 2004).
Realizando-se a técnica colorimétrica, que utiliza solução de brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), demonstramos a citotoxicidade, após 24 e
48 horas de incubação, em linhagens de câncer de mama (LM3) e câncer de pulmão
(LP07) murinos (Tabelas 6 e 7), através da determinação do IC
50
da abrina, da ricina
e da pulchelina em diversas concentrações, e comparamos os resultados obtidos
69
com os encontrados quando utilizamos soluções em diversas concentrações de
Taxol
®
, um medicamento antineoplásico utilizado em rotina contra câncer de pulmão
(DAVIES et al., 2003) e de mama (OZOLS, 2003).
Em nosso trabalho, observamos que as proteínas se mostraram extremamente
mais tóxicas às células tumorais do que o Taxol
®
tanto em 24 horas (Tabela 6),
como em 48 horas de incubação (Tabela 7). A citotoxicidade da abrina, ricina e
taxol
®
, com exceção da pulchelina, elevou-se com o aumento do tempo de
incubação com as células LM3. As proteínas mostraram maior toxicidade às células
LM3 do que às LP07 após 24 horas de incubação, enquanto que com tempo de
incubação de 48 horas, a toxicidade às duas linhagens celulares é equivalente. Em
relação ao Taxol
®
, este se mostrou mais tóxico às células LP07 com 24 horas de
incubação, a situação se invertendo com o tempo de incubação de 48h, onde o
Taxol
®
mostra maior toxicidade às células LM3.
Estudos realizados com diferentes tipos celulares mostram alta variabilidade na
sensibilidade entre as RIPs. Experimentos utilizando células mutantes com várias
alterações no transporte intracelular de proteínas mostraram que elas são mais
resistentes às RIPs do que células normais (ROFF et al., 1990; LAURIE; ROBBINS,
1991). Resultados de experimentos sugerem que existe uma correlação entre a
citotoxicidade das RIPs e a rota intracelular delas nas células, o que pode variar
entre diferentes tipos celulares dependendo da expressão de diferentes tipos de
moléculas-ligantes na superfície celular, da variedade de ligantes conduzindo-as a
diferentes compartimentos e a disponibilidade de várias vias de transporte das RIPs
para o alvo citosólico (SANDVIG et al., 2002).
Abrina-a, uma isorforma da abrina, mostrou atividade citotóxica e cito-
aglutinante contra diversas linhagens tumorais como Jurkat, CCRF-HSB-2, MOLT-4,
RPMI8402 e BALL-1. CCRF-CEM e BALM-1 foram fracamente aglutinadas pela
abrina-a, mas elas foram muito sensíveis ao potencial tóxico da abrina-a. Enquanto
que, as células NALM-6 foram fortemente aglutinadas, mas mostrando pouco menos
sensíveis ao citotoxicidade promovida pela toxina (MORIWAKI et al., 2000).
Fodstad e colaboradores (1977) transplantaram células ascíticas de Ehrlich em
camundongos e depois trataram esses camundongos com abrina e ricina.
Observaram que a abrina aumentou o tempo de sobrevivência dos camundongos
entre 43 e 93%, em relação aos camundongos não tratados com a proteína, os
animais apresentaram somente uma pequena perda de peso, que foi recuperado
70
após o sexto dia. Contudo, a ricina só aumentou o tempo de sobrevida em 29%, mas
as duas proteínas promoveram uma considerável redução na formação de ascites.
71
7 - CONCLUSÃO
Através dos resultados obtidos com o presente trabalho, pode-se concluir que:
- Os macrófagos murinos mostraram-se sensíveis ao potencial tóxico da abrina,
ricina e pulchelina: abrina >ricina>pulchelina;
- As concentrações das proteínas utilizadas nos testes imunológicos determinaram
viabilidade acima de 80% em culturas de células do exsudato peritoneal e células
esplênicas;
- A abrina, ricina e pulchelina não induziram a estimulação da produção de óxido
nítrico, exercendo uma leve inibição sobre a produção deste mediador estimulada
pela presença do LPS;
- A abrina, ricina e pulchelina não induziram a estimulação da produção de peróxido
de hidrogênio, exercendo uma forte inibição sobre a produção deste mediador
estimulada pela presença do PMA.
- Quanto à produção das citocinas:
--a abrina promoveu a produção de IL-1β, IL-12, IFN-γ e IL-10.
--a ricina produziu IL-1β, IL-12, IFN-γ, IL-10 e TNF-α.
--e a pulchelina promoveu a produção de IL-12, TNF-α, IFN-γ e IL-10.
As proteínas apresentaram tanto uma resposta Th1 (resposta imune celular) como
Th2 (resposta imune humoral).
- A abrina, ricina e pulchelina nas concentrações testadas não induziram a produção
de IL-6 pelos macrófagos.
- Quanto à citotoxicidade das proteínas sobre as células LM3 e LP07:
-- As proteínas mostraram-se mais tóxicas do que a droga controle, Taxol, em
ambos os tempos de incubação.
72
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDULLAEV, F.I. Plant-derived agents against cancer. In: GUPTA, S.K. (Ed)
Pharmacology and therapeutics in the new millennium. New Delhi: Narosa Puplising
House, 2001. p. 345-354.
ACKERMAN, G.E.; SMITH, M.E.; MENDELSON, C.R.; MACDONALD P.C.;
SIMPSON, E.R. Aromatization of androstenedione by human adipose tissue stromal
cells in monolayer culture. J. Clin Endocrinol. Metab., v. 53, p. 412-417, 1981.
ADERKA, D.; LE, J.; VILCEK, J. IL-6 inhibits lipopolysaccharide-induced tumor
necrosis factor production in cultured human monocytes, U937 cells, and in mice. J
Immunol, v. 143, p. 3517-3523, 1989.
ALLEVA, D.C.; BURGER, C.J.; ELGER, K.D. Tumor-Induced regulation of
suppressor macrophage nitric oxide and TNF-α production: role of tumor-derived IL-
10, TGF-β, and prostaglandin E
2
. J Immunol, v. 153, p. 1674-1686, 1994.
AMERICAN CANCER SOCIETY. Cancer facts and figures 2004. Atlanta, 2004. 60 p.
Disponível em: www.cancer.org Acesso em: 13 nov. 2006.
ANDERSON, G.M.; NAKADA, M.T.; DEWITTE, M. Tumor necrosis factor-alpha in the
pathogenesis and treatment of cancer. Curr. Opin. Pharmacol., v. 4, n. 4, p. 314–
320, 2004.
ANTOINE, J.C.; ABSI, L.; HONNORAT, J.; BOULESTEIX, J.M.; DE BROUKER, T.;
VIAL, C.; BUTLER, M.; DE CAMILLI, P.; MICHEL, D. Antiamphiphysin antibodies are
associated with various paraneoplastic syndromes and tumors. Arch Neurol, v. 56,
p. 151-152, 1999.
BAENZIGER, J.; TIETE, D. Structural determinants of Ricinus communis agglutinin
and toxin specificity for oligosaccharides. J. Biol. Chem., v. 257, p. 4147-4151,
1979.
73
BAL DE KIER JOFFÉ, E.; PURICELLI, L.; VIDAL, M.C.; LUSTIG, E.S.
Characterization of two murine mammary adenocarcinoma tumors with different
metastatic ability. J Exp Clin Cancer Res, v. 2, p. 151–160, 1983.
BALKWILL, F. Tumor necrosis factor or tumor promoting factor? Cytokine Growth
Factor Rev., v. 13, n. 2, p. 135-141, 2002.
BARBIERI, L.; BATTELLI, M. G.; STIRPE, F. Ribosome inactivating proteins from
plants. Biochim. Biophys. Acta., v. 1154, p. 237–282, 1993.
BARBIERI, L.; VALBONESI, P.; BONORA, E.; GORINI, P.; BOLOGNESI, A.;
STIRPE, F. Polynucleotide:adenosine glycosidase activity of ribosome-inactivating
proteins: effect on DNA, RNA and poly(A). Nucleic Acids Res., v. 25, p. 518–522,
1997.
BASS, H. W.; OBRIAN, G.R.; ROBERTS, J.K.; BOSTON, R.S. A maize ribosome-
inactivating protein is controlled by the transcriptional activator Opaque-2. Plant
Cell., v. 4, p. 225-234, 1992.
BATTELLI, M. G.; CITORES, L.; BUONOMICI, L.; FERRERAS, J. M.; DE BENITO,
F. M.; STIRPE, F.; GIRBES, T. Toxicity and cytotoxicity of nigrin b, a two-chain
ribosome-inactivating protein from Sambucus nigra: comparison with ricin. Arch.
Toxicol., v. 71, p. 360–364, 1997.
BAUTISTA, G.C.R.; ACOSTA, G.E.; TOLEDO, G.I.I. Evaluación del bioensayo de
MTT para determinar la proliferación in Vitro de linfocitos de bovino, frescos y
congelados/ Evaluation of the MTT to determine in Vitro proliferation of fresh and
frozen bovine lymphocytes. Vet. Mex., v. 31, n. 2, p. 101-106, 2000.
BAZHIN, A.V.; SHIFRINA, O.N.; SAVCHENKO, M.S.; TIKHOMIROVA, N.K.;
GONCHARSKAIA, M.A.; GORBUNOVA, V.A.; SENIN, I.I.; CHUCHALIN, A.G.;
PHILIPPOV, P.P. Low titre against recoverin in sera of patients with small cell lung
cancer without a loss of vission. Lung Cancer, v. 34, p. 99-104, 2001.
74
BEAUMELLE, ALAMI, M., HOPKINS, C. R. ATP-dependent translocation of ricin
across the membrane of purified endosomes. J. Biol. Chem., v. 268, p. 23661-
23669, 1993.
BEN-BARUCH, A. Host microenvironment in breast cancer development:
Inflammatory cells, cytokines and chemokines in breast cancer progression:
reciprocal tumor–microenvironment interactions. Breast Cancer Res., v. 5, n. 1, p.
31–36, 2003.
BENIGNI, F.; CANEVARI, S.; GADINA, M.; ADOBATI, E.; FERRERI, A.J.M.;
FERRARIS DI CELLE, E.; COMOLLI, R.; COLNAGHI, M.I. Preclinical evaluation of
the ribosome-inactivating proteins PAP-1, PAP-S and RTA in mice. Int. J.
Immunopharmacol., v. 17, p. 829–839, 1995.
BEUTLER, B.A. The role of tumor necrosis factor in health and disease. J
Rheumatol Suppl., v. 57, p. 16-21, 1999.
BIOQUE, G.; CRUSIUS, J.B.; KOUTROUBAKIS, I.; BOUMA, G.; KOSTENSE, P.J.;
MEUWISSEN, S.G.; PEÑA, A.S. Allelic polymorphism in IL-1β and IL-1 receptor
antagonist (IL-1RA) genes in inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol, v.102,
p. 379–383, 1995.
BIRD, S.; ZOU, J.; WANG, T.; MUNDAY, B.; CUNNINGHAM, C.; SECOMBES. J.
Evolution of interleukin-1beta. Cytokine Growth Factor Rev., v. 13, p. 483—502,
2002.
BODDUPALLI, C. S.; GHOSH, S.; RAHIM, S. S.; NAIR, S.; EHTESHAM, N. Z.;
HASNAIN, S. E.; MUKHOPADHYAY, S. Nitric oxide inhibits interleukin-12 p40
through p38 MAPK-mediated regulation of calmodulin and c-rel. Free Radic Biol
Med., v. 42, n. 5, p. 686-697, 2007.
BOEHM, U.; KLAMP, T.; GROOT, M.; HOWARD, J.C. Cellular responses to
interferon-gamma. Annu. Rev. Immunol., v. 15, p. 749–795, 1997.
75
BOGDAN, C.; VODOVOTZ, Y.; NATHAN, C. Macrophage deactivation by interleukin
10. J. Extx Med., v. 174, p. 1549, 1991.
BONNOTTE, B.; LARMONIER, N.; FAVRE, N.; FROMENTIN, A.; MOUTET, M.;
MARTIN, M.; GURBUXANI, S.; SOLARY, E.; CHAUFFERT, B.; MARTIN, F.
Identification of tumorinfiltrating macrophages as the killers of tumor cells after
immunization in a rat model system. J. Immunol., v. 167, p. 5077–5083, 2001.
BOON, T.; CEROTTINI, J.C.; VAN DEN EYNDE, B.; VAN DER BRUGGEN, P.; VAN
PEL, A. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol, v.12, p.
337–366, 1994.
BROMBACHER, F.; KASTELEIN, R. A.; ALBER, G. Novel IL-12 family members
shed light on the orchestration of Th1 responses Trends Immunol, v. 24, n.4, p.
207-212, 2003.
BURDON, R. H. Control of cell proliferation by reactive oxygen species. Biochem.
Soc. Trans., v. 24, p. 1028 – 1032, 1996.
CARLOS, I. Z.; MONNAZZI, L. G. S.; FALCÃO, D. P.; DE MEDEIROS, B. M. M.
TNF-α, H2O2 and NO response of peritoneal macrophages to Yersinia enterocolitica
O:3 derivatives. Microbes and Infection, v. 6, p. 207–212, 2004.
CASTILHO, P.V.; GOTO, L.S.; ROBERTS, L. M.; ARAÚJO A.P.U. Isolation and
characterization of four type 2 ribosome inactivating pulchellin isoforms from Abrus
pulchellus seeds. FEBS J, v. 275, p. 948–959, 2008.
CAVALLARO, U. α
2
-macroglobulin receptor mediates binding and citotoxicity of plant
ribosome-inactivating proteins. Eur. J. Biochem., v. 232, p. 165-171, 1995.
CICERAN, M. Ricinus Communis L. Disponível em:
http://www.istrianet.org/istria/flora/herbs-roots-vegies/ricinus-communis.htm.
Acessado em 02 de fevereiro de 2008.
76
City of Coral Springs. Disponível em:
http://www.coralsprings.org/environment/sandyridge/Vegetation%20Survey/RosaryP
ea.cfm. Acessado em 02 de fevereiro de 2008.
CORADINI, D.; BIFFI, A.; COSTA, A.; PELLIZZARO, C.; PIRRONELLO, E.; DI
FRONZO, G. Effect of sodium butyrate on human breast cancer cell lines. Cell
Prolif., v. 30, p. 149, 1997.
CRAIG, H.L.; ALDERKS, O.H.; CORWIN, A.H.; DIEKE, S.H.; KAREL, C.L.
Preparation of toxic ricin. US Patent Office, v. 3, n. 60, p. 165, 1952.
D'ANDREA, A.; RENGARAJU, M.; VALIANTE, N.M.; CHEHIMI, J.; KUBIN, M.;
ASTE, M.; CHAN, S.H.; KOBAYASHI, M.; YOUNG, D.; NICKBARG, E.; CHIZ-
ZONITE, R.; WOLF, S.F.; TRINCHIERI, G. Production of natural killer cell stimulatory
factor (NKSF/IL-12) by peripheral blood mononuclear cells. J. Exp. Med., v. 176, p.
1387–1398, 1992.
D'ANDREA, A.; ASTE-AMEZAGA, M.; VALIANTE, N. M.; MA, X.; KUBIN, M.;
TRINCHIERI, G. Interleukin 10 (IL-10) Inhibits Human Lymphocyte Interferon γ-
Production by Suppressing Natural Killer Cell Stimulatory Factor/IL-12 Synthesis in
Accessory Cells. J. Exp. Med., v. 178, p. 1041-1048, 1993.
DAVIES, A. M.; LARA JR, P. N.; MACK, P. C.; GANDARA D. R. Docetaxel in non-
small cell lung cancer: a review. Expert Opin Pharmacother, v. 4, n. 4, p. 553-565,
2003.
DELONG, W.G.; BORN, C.T. Cytokines in patients with polytrauma. Clin. Orthop., v.
422, p. 57–65, 2004.
DEMPSEY, P.W.; DOYLE, S.E.; HE, J.Q.; CHENG, G. The signaling adaptors and
pathways activated by TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev., v. 14, p.
193-209, 2003.
77
DERENZINI, M.; BONETTI, E.; MARIONOZZI, V.; STIRPE, F. Toxic effects of ricin:
studies on the pathogenesis of liver lesions. Virchows Arch B Cell Pathol, v. 20, p.
15-28, 1976.
DESCOTES, G.; ROMANO, M.; STIRPE, F.; SPREAFICO, F. The immunological
activity of plant toxins used in the preparation of immunotoxins II. The
immunodepressive activity of gelonin. Int. J. Immunopharmacol., v. 7, p. 455–463,
1985.
DE VISSER, K.E.; EICHTEN, A.; COUSSENS, L.M. Paradoxical roles of the immune
system during cancer development. Nat. Rev. Câncer, v. 6, p. 24–37, 2006.
DE WAAL MALEFYT, R.; ABRAMS, J.; BENNETT, B.; FIGDOR, C.G.; DE VRIES,
J.E. Interleukin 10 (IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an
autoregulatory role of IL-10 produced by monocytes. J. Exp. Med., v. 174, p. 1209,
1991.
DINARELLO, C.A. Biology of interleukin 1. Faseb J, v. 2, p. 108-115, 1988.
DINARELLO, C.A. Inflammatory cytokines: interleukin-1 and tumor necrosis factor as
effector molecules in autoimmune diseases. Curr Opin Immunol, v. 3, p. 941–948,
1991.
DREHER, D.; JUNOD, A. F. Role of oxygen free radicals in cancer development.
Eur. J. Cancer, v. 32, p. 30–38, 1996.
EIJÁN, A.M.; DAVEL, L.E.; RUEDA, H.A.; ROZENBERG, G.; LUSTIG, E.S.; JASNIS,
M.A. Differential nitric oxide release and sensitivity to injury in different mammary
tumor cell lines. Int J Mol Med, v. 2, p. 625-630, 1998.
ENDERS, S.; VAN DER MEER, J.W.M.; DINARELLO, C.A. Interleukin 1 and the
pathogenesis of fever. Eur J Clin Invest., v. 17, p. 469-474, 1987.
78
ENDO, Y., MITSUI, K. MOTIZUKI, M., TSURUGI, K. The mechanism of action of ricin
and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. The site and the characteristics of
the modification in 28S ribosomal caused by the toxins. J. Biol. Chem., v. 262, 5908-
5912, 1987.
ENDO, Y.; TSURUGI, K. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. J. Biol. Chem.,
v. 262, p. 8128-8130, 1987.
ENDO, Y.; GLUCK, A.; WOOL, I. G. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-
chain recognition and catalysis. J. Mol. Biol., v. 254, p. 848–855, 1991.
ESPAÑOL, A.; EIJÁN, A.M.; MAZZONI, E.; DAVEL, L.; JASNIS, M.A.; SACERDOTE
DE LUSTIG, E.; SALES, M.E. Nitric oxide synthase, arginase and cyclooxygenase
are involved in muscarinic receptor activation in different murine mammary
adenocarcinoma cell lines. Int J Mol Med, v. 9, p. 651-657, 2002;
FALKOFF, R.J.M.; MURAGUCHI, A.; HONG, J-X.; BUTLER, J.L.; DINARELLO, C.A.;
FAUCI, A,S. The effects of interleukin 1 in human B cell activation and proliferation. J
Immunol., v. 131, p. 801-805, 1983.
FARIVAR, A. S.; MERRY, H. E.; FICA-DELGADO, M. J.; MCCOURTIE, A. S.;
MACKINNON-PATTERSON, B. C.; MULLIGAN, M. S. Interleukin-6 regulation of
direct lung ischemia reperfusion injury. Ann Thorac Surg., v. 82, n. 2, p. 472-478,
2006.
FARRAR, M. A.; SCHREIBER, R. D. The molecular cell biology of interferon-γ and its
receptor. Annu. Rev. Immunol., v. 11, p. 571, 1993.
FERNANDEZ MADRID, F.; KARVONEN, R.L.; ENSLEY, J.; KRAUT, M.; GRANDA,
J.L.; ALANSARI, H.; TANG, N.; TOMKIEL, J.E. Spectra of antinuclear antibodies in
patients with squamous cell carcinoma of the lung and of the head and neck. Cancer
Detect Prev, v. 29, p. 59-65, 2005.
79
FERNANDO, R. Abrus precatorius L. IPCS INCHEM Home. Disponível em:
<http://www.inchem.org/documents/pims/plant/abruspre.htm>. Acesso em 25 fev
2007.
FILDER, I.J.; SCHROIT, A.J. Recognition and destruction of neoplasic cells by
activated macrophages: discrimination of altered self. Biochim. Biophys. Acta, v.
948, p. 151-173, 1998.
FIORENTINO, D.F.; BOND, M.W.; MOSMANN, T.R. Two types of mouse helper T
cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. J.
Exp. Med., v. 170, p. 2081, 1989.
FIORENTINO, D.F.; ZLOTNIK, A.; MOSMANN, T.R.; HOWARD, M.H.; O'GARRA, A.
IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J. Immunol., v. 147, p.
3815, 1991.
FISZMAN, G.; CATTANEO, V.; DE LA TORRE, E.; COLOMBO, L.; MIDDONNO, C.;
SACERDOTE DE LUSTIG, E.; SALES, M. E. Autoanticuerpos contra receptores
muscarínicos en cáncer de mama. Rev Quim Viva, v. 3, n. 4, 2005.
FODSTAD, O.; KVALHEIM, G.; GODAL, A.; LOTSBERG, J.; AAMDAL, S.; HOST,
H.; PIHL, A. Phase I study of the plant protein ricin. Cancer Res., v. 44, p. 862-865,
1984.
FODSTAD, O.; OLSNES, S.; PIHL, A. inhibitory effect of abrin and ricin on the
growth of transplantable murine tumors and of abrin on human cancers in nude mice.
Cancer Res, v. 37, p. 4559-4567, 1977.
FORMAN, H.J.; TORRES, M. Redox signaling in macrophages. Mol. Aspects Med.,
v. 22, p.189-216, 2001.
FRACASSO, G.; BELLISOLA, G.; CASTELLETTI, D.; TRIDENTE, G.;
COLOMBATTI, M. Immunotoxins and other conjugates: preparation and general
characteristics. Mini Rev Med Chem., v. 4, p. 545-562, 2004.
80
FRANKEL, A. E.; BURBAGE, C.; FU, T.; TAGGE, E.; CHANDLER, J.; WILLINGHAM,
M. C. Ricin toxin contains at least three galactose-binding sites located in B chain
subdomains 1a, 1b, and 2g. Biochemistry., v. 35, p. 14749–14756, 1996.
FRANZ, H. The ricin story. In: Franz, H. (Ed) Advances in Lectin Res,v. 1, Verlag
Volk und Gesundheit, Berlin, p. 10–25, 1988.
FUCHS, D. A.; JOHNSON, R. K. Cytologic evidence that taxol, an antineoplastic
agent from Taxus brevifolia, acts as a mitotic spindle poison. Cancer Treat. Rep., v.
62, p. 1219-1222, 1978.
GATTI, G.; SIMSEK, S.; ZURRIDA, S.; KURNE, A.; GIANNETTI, I.; DEMIRER, S.;
SMEETS, A.; CALDARELLA, P.; VENTO, A.R.; GIRALDO, A.; LUINI, A. Possible
role of nitric oxide in the biology of breast carcinoma: review of the available
literature. The Breast, v. 13, n. 1, p. 1-6, 2004.
GATTONI, A.; PARLATO, A.; VANGIERI, B.; BRESCIANI, M.; DERNA, R.
Interferongamma: biologic functions and HCV therapy (type I/II) (1 of 2 parts). Clin.
Ter., v. 157, n. 4, p. 377–386, 2006.
GAZZINELLI, K.T.; OSWALD, I.P.; JAMES, S.L.; SHER, A. IL-10 inhibits parasite
killing and nitrogen oxide production by IFN-γ-activated macrophages. J. Immunol.,
v. 148, p. 1792, 1992.
GINSBERG, R.J.; VOKES, E.E.; RABEN, A. Cancer of the lung. In: DEVITA
JUNIOR. Cancer: principles and practices of oncology. 5
th
ed. Philadelphia:
Lippincott-Raven, p. 658-677, 1997.
GONZALEZ, T. V.; FARRANT, S. A.; MANTIS, N. J. Ricin induces IL-8 secretion
from human monocyte/macrophages by activating the p38 MAP kinase pathway.
Molecular Immunology., v. 43, p. 1920–1923, 2006.
81
GOTO, L.S.; BELTRAMINI, L.M.; DE MORAES, D.I.; MOREIRA, R.A.; ARAÚJO,
A.P.U. Abrus pulchellus type-2 RIP, pulchellin: heterologous expression and refolding
of the sugar binding B chain. Protein Expr Purif., v. 31, n. 1, p. 12-18, 2003.
GREEN, L.C.; WAGNER, D.A.; GLOGOWSKI, J.; SKIPPER, P.L.; WISHNOK, J.S.;
TANNENBAUM, S.R. Analysis of nitrate, nitrite, and [
15
N] nitrate in biological fluids.
Analytic. Biochem., v. 126, n. 1, p. 131-138, 1982.
GROSSBARD, M.; LAMBERT, J.; GOLDMACHER, V.; SPECTOR, N.; KINSELLA, J.;
ELISEO, L.; CORAL, F.; TAYLOR, J.; BATTLER, W.; EPSTEIN, C.; NADLER, L.
Anti-134-blocked ricin: a phase 1 trail of 7-day continuous infusion in patients with B-
cell neoplasm. J. Clin. Oncol., v. 11, p. 726-737, 1993.
GUBLER, U.; CHUA, A.O.; SCHOENHAUT, D.S.; DWYER, C.M.; MCCOMAS, W.;
MOTYKA, K.; NABAVI, N.; WOLITZKY, A.G.; QUINN, P.M.; FAMILLETTI, P.C.;
GATELY, M.K. Coexpression of two distinct genes is required to generate secreted
bioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor. Proc Natl. Acad. Sci. USA., v. 88,
p. 4143, 1991.
HALLIWELL, B.; ARUOMA, O.I. DNA damage by oxygen-derived species. Its
mechanism and measurement in mammalian systems. FEBS Lett., v. 281, p. 9–19,
1991.
HAMPTON, M.B.; KETTLE, A.J.; WINTERBOURN, C.C. Inside the neutrophil
phagossome: oxidants, myeloperoxidade and bacterial killing. Blood, v. 92, p. 3007-
3017, 1998.
HARTLEY, M. R.; CHADDOCK, J. A.; BONNESS, M. S. The structure and function of
ribosome-inactivating proteins. Trends Plant Sci., v. 1, p. 254–260, 1996.
HASSOUN, E.; WANG, X. Ricin-induced toxicity in the macrophage J744A.1 cells:
the role of TNF-alpha and the modulation effects of TNF-alpha polyclonal antibody. J.
Biochem. Mol. Toxicol., v.14, p. 95–101, 2000.
82
HAYES, M. P.; FREEMAN, S. L.; DONNELLY, R. P. Interferon-y priming of
monocytes enhances LPS-induced TNF-a production by increasing both transcription
and mRNA stability. Cyrokine, v. 7, p. 427, 1995.
HENDRZAK, J.A.; BRUNDA, M.J. Interleukin-12: biologic activity, therapeutic utility,
and role in disease. Lab. Invest., v. 72, p. 619–637, 1995.
HERMANN, M.S.; BEHNKE, W.D. A characterization of abrin A from the seeds of the
Abrus precatorius plant. Biochim. Biophys. Acta., v. 667, p. 370-410, 1981.
HIBBS, J. B. JR.; TAINTOR, R. R.; VAVRIN, Z. Macrophage cytotoxicity: role for L-
arginine deiminase activity and amino nitrogen to nitrate. Science., v. 235, p. 473–
476, 1987.
HIGUCHI, S., TAMURA, T., ODA, T. Cross-talk between the pathways leading to the
induction of apoptosis and the secretion of tumor necrosis factor-alpha in ricin-treated
RAW 264.7 cells. J. Biochem., v. 134, p. 927–933, 2003.
HIRANO, T.; YASUKAWA, K.; HARADA, H.; WATANABE, T.T.Y.; MATSUDA, T.;
KASHIWAMURA, S-I.; NAKAJIMA, K.; KAYAMA, K.; IWAMATSU, A.; TSUNASAWA,
S.; SAKIYAMA, F.; MARSUI, H.; TAKAHARA, Y.; TANIGUCHI, T.; KISHIMOTO, T.
Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B
lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature, v. 324, p. 73–76, 1986.
HOFSETH, L. J.; HUSSAIN, S.P.; WOGAN, G.N.; HARRIS, C.C. Nitric oxide in
cancer and chemoprevention. Free Radic Biol Med., v. 34, n. 8, p. 955–968, 2003.
HSU, D.H.; MOORE, K.W.; SPITS, H. Differential effects of IL-4 and IL-10 on IL-2-
induced IFN-gamma synthesis and lymphokine-activated killer activity. Int.
Immunol., v. 4, p. 563, 1992.
HUANG, F. P.; NIEDBALA, W.; WEI, X. Q.; XU, D.; FENG, G. J.; ROBINSON, J. H.;
LAM, C.; LIEW, F. Y. Nitric oxide regulates Th1 cell development through the
83
inhibition of IL-12 synthesis by macrophages. Eur. J. Immunol., v. 28, p. 4062–4070,
1998.
INSTITUTO HÓRUS DE DESENVOLVIMENTO E CONSERVAÇÃO AMBIENTAL.
Disponível em:
http://www.institutohorus.org.br/download/fichas/Ricinus_communis.htm. Acesso em:
25 fev 2007.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER. Disponível em:
<http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=322>. Acesso em: 12 nov 2008.
ISHIGURO, M.; TAKAHASHI, T.; FUNATSU, G.; HAYASHI, K.; FUNATSU, M.
Biochemical studies on ricin. i. purification of ricin. J. Biochem. Tokyo, v. 55, p. 587-
592, 1964.
JAKÓBISIAK, M.; LASEK, W.; GOLAB, J. Natural mechanisms protecting against
cancer. Immunol Lett, v. 90, p. 103–122, 2003.
JOHNSON, D.H.; GRECO, F.A. Small cell carcinoma of the lung. Crit. Rev. Oncol.
Hematol., v. 4, p. 303-336, 1986.
JUAN, T.G. Proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) y sus aplicaciones en la
construcción de inmunotoxinas para la terapia experimental del cáncer. Anal. Real.
Acad. Farm., v. 66, n. 3, p. 1-21, 2000.
KATZUNG, B.G. Quimioterapia do câncer. In: Farmacologia básica & clínica.
Tradução por Patricia Lydie Voeux. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003. Cap.
55, p. 803-832.
KELLY, J. Cytokines of the lung. Am. Rev. Respir. Dis., v. 141, p. 765-788, 1990.
KHAN, T.; WARING, P. Macrophage adherence prevents apoptosis induced by ricin.
Eur J Cell Biol., v. 62, n. 2, p. 406-414, 1993.
84
KINGSTON, D. G. I. Taxol, a molecule for all seasons (Review). Chem. Commun.,
867-880, 2001.
KINGSTON, D. G. I. The shape of things to come: structural and synthetic studies of
taxol and related compounds. Phytochemistry, v. 68, p. 1844–1854, 2007.
KLAUNIG, J.E.; KAMENDULIS, L.M. The role of oxidative stress in carcinogenesis.
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., v. 44, p. 239–267, 2004.
KOBAYASHI, M.; FITZ, L.; RYAN, M.; HEWICK, R.M.; CLARK, S.C.; CHAN, S.;
LOUDON, R.; SHERMAN, F.; PERUSSIA, B.; TRINCHIERI, G. Identification and
purification of natural killer cell stimulatory factor (NKSF), a cytokine with multiple
biologic effects on human lymphocytes. J. Exp. Med., v. 170, p. 827, 1989.
KORCHEVA, V.; WONG, J.; CORLESS, C.; IORDANOV, M.; MAGUN, B.
Administration of ricin induces a severe inflammatory response via nonredundant
stimulation of ERK, JNK, and P38 MAPK and provides a mouse model of hemolytic
uremic syndrome. Am J Pathol., v. 166, n. 1, p. 323–339, 2005.
KORCHEVA, V.; WONG, J.; LINDAUER, M.; JACOBY, D. B.; IORDANOV, M. S.;
MAGUN, B. Role of apoptotic signaling pathways in regulation of inflammatory
responses to ricin in primary murine macrophages. Mol Immunol., v. 44, p. 2761–
2771, 2007.
KUMAR, V.; CONTRAN, R.S.; ROBBINS, S.L. Patologia básica. Rio de Janeiro:
Guanabara-Koogan, 1994.608p.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of
Bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
LAURIE, S.M.; ROBBINS, A.R.J. A toxin-resistant mouse L-cell mutant defective in
protein transport along the secretory pathway. Cell Physiol., v. 147, p. 215-223,
1991.
85
LICASTRO, F., MORINI, M.C, BOLOGNESI, A., STIRPE, F. Ricin induces the
production of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta by human
peripheral-blood mononuclear cells. Biochem. J., v. 294, p. 517–520, 1993.
LIN, J.Y.; LEE, T.C.; HU, S.; TUNG, T.C. Isolation of four isotoxic proteins and one
agglutinin from jequiriti bean (Abrus precatorius). Toxicon, v. 19, p. 41-51, 1981.
LIN, J.Y.; LEE, T.C.; HU, S.; TUNG, T.C. Inhibitory effects of four isoabrins on the
growth of Sarcoma 180 cells. Cancer Res., v. 42, p. 276-279, 1982.
LINDNER, D.J.; BORDEN, E.C. Synergistic antitumor effects of acombination of
interferon and tamoxifen on estrogen receptor-positive and –negative human tumor
cell lines in vivo and in vitro, 1997.
LING, J.; LIU, W. Y.; WANG, T. P. Cleavage of supercoiled double-stranded DNA by
several ribosome-inactivating proteins in vitro. FEBS Lett., v. 345, p. 143–146, 1994.
LING, J.; LI, X. D.; WU, X.; LIU, W. Y. Topological requirements for recognition and
cleavage of DNA by ribosomeinactivating proteins. Biol. Chem. Hoppe Seyler., v.
376, p. 637–641, 1995.
LIU, Z.G. Molecular mechanism of TNF signaling and beyond. Cell Res., v. 15, p. 24-
27, 2005.
LOPES, F.C.; CALVO, T.R.; VILEGAS, W.; CARLOS, I.Z. Inhibition of hydrogen
peroxide, nitric oxide and TNF-alpha production in peritoneal macrophages by ethyl
acetate fraction from Alchornea glandulosa. Biol Pharm Bull., v. 28, n. 9, p. 1726-
1730, 2005.
LÓPEZ-FARRÉ, A.; RODRÍGUEZ-FEO, J. A.; SÁNCHEZ DE MIGUEL, L.; RICO, L.;
CASADO, S. Role of nitric oxide in the control of apoptosis in the microvasculature.
Int J Biochem Cell Biol, v. 30, n. 10, p. 1095-1106, 1998.
86
LORD, J. M.; ROBERTS, L. M. Toxin entry: retrograde transport through the
secretory pathway. J. Cell Biol., v. 140, p. 733–736, 1998.
LUKACS, N. W.; STRIETER, R. M.; KUNKEL, S. L. Cytokines in acute inflammation.
Curr. Opin. Hematol., v. 1993, p. 26, 1993.
LUM, H.K.; BUTT, Y.KC.; LO, S.C.L. Hydrogen peroxide induces a rapid production
of nitric oxide in mung bean (phaseolus aureus). Nitric Oxide, v.6, p.205-213, 2002.
LUSTER, M.I.; GERMOLEC, D.R.; YOSHIDA, T.; KAYAMA, F.; THOMPSON, M.
Endotoxin-induced cytokine gene expression and excretion in the liver. Hepatology,
v. 19, p. 480-488, 1994.
MANUAL MERCK DE INFORMAÇÃO MÉDICA – SAÚDE PARA A FAMÍLIA. Seção
15, Capítulo 166. Disponível em: <http://www.msd-
brazil.com/msdbrazil/patients/manual_Merck/sumario.html>. Acessado em: 09 abril
2008.
MARLETTA, M. A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J. Biol. Chem., v.
268, p. 12231–12234, 1993.
MARTIN, S. The proteins of the seeds of Abrus precatorius. Proc. R. Soc., v. 42, p.
3331–3333, 1887.
MASUHO, Y.; KISHIDA, K.; SAITO, M.; UMEMOTO, N.; HARA, T. Importance of the
antigen-binding valency and the nature of the cross-linking bond in ricin A-chain
conjugates with antibody. J. Biochem., v. 91, p. 1583-1591, 1982.
MATZARAKI, V.; ALEXANDRAKI, K. I.; VENETSANOU, K.; PIPERI, C.;
MYRIANTHEFS, P.; MALAMOS, N.; GIANNAKAKIS, T.; KARATZAS, S.; DIAMANTI-
KANDARAKIS, E.; BALTOPOULOS, G. Evaluation of serum procalcitonin and
interleukin-6 levels as markers of liver metastasis. Clin Biochem, v. 40, p. 336–342,
2007.
87
McPHERSON, A. Jr; RICH, A. Studies on crystalline abrin: X-ray diffraction data,
molecular weight, carbohydrate content and subunit structure. FEBS Lett., v. 35, p.
257-261, 1973.
MELBY, E. L.; JACOBSEN, J.; OLSNES, S.; SANDVIG, K. Entry of Protein Toxins in
Polarized Epithelial Cells. Cancer Res., v. 5, p. 1755-1760, 1993.
MIZEL, S.B. Interleukin 1 and T cell activation. Immunol Rev., v. 63, p. 51-72, 1982.
MLAMBO, G.; SIGOLA, L. B. Rifampicin and dexamethasone have similar effects on
macrophage phagocytosis of zymosan, but differ in their effects on nitrite and TNF-a
production. Int Immunopharmacol, v. 3, p. 513–522, 2003.
MONCADA, S.; PALMER, R.M.J.; HIGGS, E.A. Nitric oxide: physiology,
pathophysiology and pharmacology. Pharmacol. Rev., v. 43, n. 2, p. 109-142, 1991.
MOORE, K.W.; VIEIRA, P.; FIORENTINO, D.F.; TROUNSTINE, M.L.; KHAN, T.A.;
MOSMANN, T.K. Homology of cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) to the
Epstein-Barr virus gene BCRF1. Science, v. 248, p. 1230, 1988.
MOREIRA, R.A. Lectinas vegetais: uma abordagem química e físicoquímica.
Tese de Titular, UFC, 600p, 1998.
MORIWAKI, S.; OHBA, H.; NAKAMURA, O.; SALLAY, I.; SUZUKI, M.; TSUBOUCHI,
H.; YAMASAKI, N.; ITOH, K. Biological Activities of the Lectin, Abrin-a, Against
Human Lymphocytes and Cultured Leukemic Cell Lines. J Hematother Stem Cell
Res., v. 9, n. 1, p. 47-53, 2000.
MORLON-GUYOT, J.; HELMY, M.; LOMBARD-FRASCA, S.; PIGNOL, D.; PIÉRONI,
G.; BEAUMELLE, B. Identification of the Ricin Lipase Site and Implication in
Cytotoxicity. J. Biol. Chem., v. 278, n. 19, p. 17006–17011, 2003.
MOSINGER, M. Sur les reactions neuroendocriniennes et genitals dans l’intoxication
par ricine. Cont. Rend. Soc. Biol., vol 145, p. 412-415, 1951.
88
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods., Amsterdam, v. 65, p.
55-63, 1983.
MOSMANN, T.R.; CHERWINSKI, H.; BOND, M.W.; GIEDLIN, M.A.; COFFMAN, R.L.
Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of
lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol, v. 136, n. 7, p. 2348-2357,
1986.
MOSMANN, T.R.; COFFMAN, R.L. Heterogeneity of cytokine secretion patterns and
functions of helper T cells. Adv. Immunol., v. 46, p. 111–147, 1989.
MOSSER, D. M. The many faces of macrophage activation. J Leukoc Biol, v. 73, p.
209-212, 2003.
MOTA, D.M. Pulchelinas, lectinas galactose-específicas, de sementes de Abrus
pulchellus: purificação e estudos de propriedades químicas e biológicas. 1997.
120f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza.
MUKHOPADHYAY, S.; GEORGE, A.; BAL, V.; RAVINDRAN, B.; RATH, S. Bruton’s
tyrosine kinase deficiency in macrophages inhibits nitric oxide generation leading to
enhancement of IL-12 induction. J. Immunol., v. 163, p. 1786–1792, 1999.
MUNDY, J.; LEAH, R.; BOSTON, R.; ENDO, Y.; STIRPE, F. Genes encoding
ribosome-inactivating proteins. Plant Mol. Biol. Rep., v. 12, p. 60-62, 1994.
MYTAR, B.; SIEDLAR, M.; WOLOSZYN, M.; RUGGIERO, I.; PRYJMA, J.;
ZEMBALA, M. Induction of reactive oxygen intermediates in human monocytes by
tumour cells and their role in spontaneous monocyte cytotoxicity. Br. J. Cancer, v.
79, p. 737–743, 1999.
89
NAKAE, S.; ASANO, M.; HORAI, R.; IWAKURA, Y. Interleukin-1 beta, but not
interleukin-1 alpha, is required for T-cell-dependent antibody production.
Immunology, v. 104, p. 402-409, 2001.
NAKAMOTO, T.; INAGAWA, H.; TAKAGI, K.; SOMA, G. A new method of antitumor
therapy with a high dose of TNF perfusion for unresectable liver tumors. Anticancer
Res., v. 20, p. 4087–4096, 2000.
NARAYANAN, S.; SUROLIA, A.; KARANDE, A. A. Ribosome-inactivating protein and
apoptosis: abrin causes cell death via mitochondrial pathway in Jurkat cells.
Biochem. J., v. 377, p. 233–240, 2004.
NATHAN, C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J., v. 6,
p. 3051–3064, 1992.
NG, T.B.; CHAN, W.Y.; YEUNG, H.W. Proteins with abortifacient, ribosome
inactivating, immunomodulatory, antitumor and anti-AIDS activities from
Cucurbitaceae plants. Gen. Pharmac., v. 23, p. 575, 1992.
NG, T. B.; WANG, H. X. Flammin and velin: new ribosome inactivating polypeptides
from the mushroom Flammulina velutipes. Peptides, v. 25, n. 6, p. 929-933, 2004.
NICOLAS, E., BEGGS, J. M., HALTIWANGER, B. M., AND TARASCHI, T. F. A new
class of DNA glycosylase/apurinic/apyrimidinic lyases that act on specific adenines in
single-stranded DNA. J. Biol. Chem., v. 273, p. 17216–17220, 1998.
NIELSEN, K.; BOSTON, R. S. Ribosome-inactivating proteins: a plant perspective.
Annu.Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., v. 52, p. 785-816, 2001.
O’GARRA, A.; ARAI, N. The molecular basis of T helper 1 and T helper 2 cell
differentiation. Trends Cell Biol., v. 10, n. 12, p. 542-550, 2000.
OH, I.; OZAKI, K.; SATO, K.; MEGURO, A.; TATARA, R.; HATANAKA, K.; NAGAI,
T.; MUROI, K.; OZAWA, K. Interferon-c and NF-κB mediate nitric oxide production by
90
mesenchymal stromal cells. Biochem Biophys Res Commun., v. 355, p. 956–962,
2007.
OHBA, H.; MORIWAKI, S.; BAKALOVA, R.; YASUDA, S.; YAMASAKI, N. Plant-
derived abrin-a induces apoptosis in cultured leukemic cell lines by different
mechanisms. Toxicol Appl Pharmacol., v.195, p. 182– 193, 2004.
OLIVEIRA, R. B. Plantas tóxicas. Disponível em:
http://br.geocities.com/plantastoxicas/mamona.html. Acessado em: 25 fevereiro
2007.
OLSNES, S.; PIHL, A. Isolation and properties of abrin: a toxic protein inhibiting
protein synthesis: evidence for different biological functions of its constituents –
peptide chains. Eur. J. Biochem., v. 35, p. 179–185, 1973.
OLSNES, S.; PIHL, A., Abrin, ricin and their associated agglutinins. In:
CUATRECASAS, P. (Ed) The specificity and action of animal, bacterial and plant
toxins receptors and recognition. London: Chapman and Hall, 1976. P. 131-173.
(Series B).
OLSNES, S.; SANDVIG, K.; EIKLID, K.; PIHL, A properties and action mechanism of
the toxic lectin modeccin: interaction with cell lines resistant to modeccin, abrin, and
ricin. J Supramol Struct, v. 9, p. 15-25, 1978.
OLSNES, S.; SANDVIG, K.; PETERSEN, O.W.; VAN DEURS, B. Immunotoxins-
entry into cells and mechanisms of action. Immunol. Today, vol 10, p. 291-295,
1989.
OLSNES, S. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon, v. 44, n.4, p. 361-
370, 2004.
OPPENHEIM, J. J.; ZACHARIAE, C. O. C.; MUKAIDA, N.; MATSUSHIMA, K.
Properties of the novel proinflammatory “intercrine” cytokine family. Annu. Rev.
Immunol., v. 9, p. 617, 1991.
91
OPPENHEIM, J. J.; RUSCETTI, F. W.; FALTYNEK, C. R. Cytokines. In: STITES, D.
P.; STOBO, J. D.; WELLS, J. V. Basic Clin immunol. 8. ed. Connecticut: Appleton &
Lange, 1994. cap. 9, p. 105-123.
OSWALD, I.P.; GAZZINELLI, R.T.; SHER, A.; JAMES, S.L. IL-10 synergizes with IL-
4 and transforming growth factor-β to inhibit macrophage cytotoxic activity. J.
Immunol., v. 148, p. 3578, 1992.
OZOLS, R. F.; BUNDY, B. N.; GREER, B. E.; FOWLER, J. M.; CLARKE-PEARSON,
D.; BURGER, R. A.; MANNEL, R. S.; DEGEEST, K.; HARTENBACH, E. M.;
BAERGEN, R. Phase III Trial of Carboplatin and Paclitaxel Compared With Cisplatin
and Paclitaxel in Patients With Optimally Resected Stage III Ovarian Cancer: A
Gynecologic Oncology Group Study. J Clin Oncol., v. 21, n. 17, p. 3194-3200, 2003.
PANANI, A.D.; ROUSSOS, C. Cytogenetic and molecular aspects of lung cancer.
Cancer Lett., v. 239, p. 1-9, 2006.
PARKIN, D.M.; BRAY, F.; FERLAY, J.; PISANI, P. Estimating the world cancer
burden: Globocan 2000. Int J Cancer., v. 94, n. 2, p. 153-156, 2001.
PARRY, S.L.; SEBBAG, M.; FELDMANN, M.; BRENNAN, F. M. Contact with T Cells
Modulates Monocyte IL-10 Production: Role of T Cell Membrane TNF-α. J Immunol,
v. 158, p. 3673-3681, 1997.
PEUMANS, W.J.; HAO, Q.; VAN DAMME, E.J.M. Ribosome-inactivating proteins
from plants: more than RNA N-glycosidases? FASEB J, v. 15, p. 1493-1506, 2001.
PICCART, M. J.; CARDOSO, F. Progress in systemic therapy for breast cancer: an
overview and perspectives. EJC Supplements, v. 1, n. 2, p. 56-69, 2003.
PICK, E.; KEISARI, Y. A simple colorimetric method for the measurement of
hydrogen peroxide produced by cells in culture. J. Immunol. Methods., v. 38, p.
161-170, 1980.
92
PICK, E.; MIZEL, D.J.; Rapid microassays for the measurement of superoxide and
hydrogen peroxide production by macrophages in culture using an automatic enzyme
immunoassay reader. J. Immunol. Methods., v. 46, p. 211-226, 1981.
POLYAK, K. Pregnancy and breast cancer: the other side of the coin. Cancer Cell.,
p. 151-152, 2006.
POZZI, L.A.; MACIASZEK, J.W.; ROCK, K.L. Both dendritic cells and macrophages
can stimulate naive CD8 T cells in vivo to proliferate, develop effector function, and
differentiate into memory cells. J. Immunol., v. 175, p. 2071–2081, 2005.
PREYNAT-SEAUVE, O.; SCHULER, P.; CONTASSOT, E.; BEERMANN, F.;
HUARD, B.; FRENCH, L.E. Tumor-infiltrating dendritic cells are potent antigen-
presenting cells able to activate T cells and mediate tumor rejection. J. Immunol., v.
176, p. 61–67, 2006.
QU, X.; QING, L. Abrin induces HeLa cell apoptosis by Cytochrome c release and
caspase activation. J. Bioch. Molec. Biol., v. 37, n. 4, p. 445-453, 2004.
RALPH, P.; NAKOINZ, I.; SAMPSON JOHANNES, A.; FONG, S.; LOWE, D.; MIN,
H.Y.; LIN, L. IL-10, T lymphocyte inhibitor of human blood cell production of IL-1 and
tumor necrosis factor. J. Immunol., v. 148, p. 808, 1992.
RAMOS, M.V.; MOTA, D.M.; TEIXEIRA, C.R.; CAVADA, B. S.; MOREIRA, R.A.
Isolation and parcial characterisation of highly toxic lectins from Abrus pulchellus
seeds. Toxicon, v. 36, n. 3, p. 477-484, 1998.
RAPAK, A.; FALNES, P. O.; OLSNES, S. Retrograde transport of mutant ricin to the
endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., v. 94, p. 3783–3788, 1997.
REDDY, V.V.; SIRSI, M. Effect of Abrus precatorius L. on experimental tumors.
Cancer Res., v. 29, p. 1447-1451, 1969.
93
RENGARAJAN, J.; SZABO, S.J.; GLIMCHER, L.H. Transcriptional regulation of
Th1/Th2 polarization. Immunol Today, v. 21, n. 9, p. 479-483, 2000.
RHEE, S.G. Redox signaling: hydrogen peroxide as intracellular messenger. Exp.
Mol. Med., v. 31, p. 53–59, 1999.
ROBERTUS, J.D.; MONZINGO, A.F. The structure of ribosome inactivating proteins.
Medicine Chem., v.4, p. 477-486, 2004.
ROFF, C.F.; HALL, C.W.; ROBBINS, A.R. Recovery of Function in Chinese Hamster
Ovary Cell Mutants with Temperature-Sensitive Defects in Vacuolar Acidification. J.
Cell. Biol., v. 110, p. 1023-1032, 1990.
RONCAROLO, M.G.; LEVINGS, M.K. The role of different subsets of T regulatory
cells in controlling autoimmunity. Curr Opin Immunol, v. 12, n. 6, p. 676-683, 2000.
RONCUZZI, L.; GASPERI-CAMPANI, A. DNA-nuclease activity of the single-chain
ribosome-inactivating proteins dianthin 30, saporin 6 and gelonin. FEBS Lett., v. 392,
p. 16–20, 1996.
ROWINSKY, E. K., DONEHOWER, R. C., JONES, R. J.; TUCKER, R. W.
Microtubule changes and cytotoxicity in leukemic cell lines treated with taxol. Cancer
Res., v. 48, p. 4093-4100, 1988.
RUBIN, P.; JOHNSTON, C.J.; WILLIAMS, J.P.; McDONALD, S.; FINKELSTEIN, J.N.
A perpetual cascade of cytokines postirradiation leads to pulmonary fibrosis. Int. J.
Radiat. Oncol. Biol. Phys., v. 33, p. 99-109, 1995.
RUTENBER, E.; READY, M.; ROBERTUS, J.D. Structure and evolution of ricin B
chain. Nature, v. 326, p. 624-626, 1987.
SALVEMINI, D.; WANG, Z.; WYATT, P.S.; BOURDON, D.M.; MARINO, M.H.;
MANNING, P.T.; CURRIE, M.G. Nitric oxide: a key mediator in the early and late
94
phase of carrageenan-induced rat paw inflammation. Br. J. Pharmaol., v. 118, p.
829-838, 1996.
SANDVIG, K.; VAN DEURS, B. Toxin-induced cell lysis: protection by 3-
methyladenine and cycloheximide. Exp. Cell Res., v. 200, p. 253–262, 1992.
SANDVIG, K.; VAN DEURS, B. Endocytosis, intracellular transport, and cytotoxic
action of Shiga toxin and ricin. Physiol. Rev., v. 76, p. 949–966, 1996.
SANDVIG, K.; GRIMMER, S.; LAUVRAK, S.U.; TORGERSEN, M.L.; SKRETTING,
G.; VAN DEURS, B.; IVERSEN, T.G. Pathways followed by ricin and Shiga toxin into
cells. Histochem. Cell Biol., v. 117, p. 131-141, 2002.
SARIH, M.; SOUVANNAVONG, V.; ADAM, A. Nitric oxide synthase induces
macrophage death by apoptosis. Biochem Biophys Res Commun., v. 191, n. 2, p.
503-508, 1993.
SCHELLER, J.; OHNESORGE, N.; ROSE-JOHN, S. Interleukin-6 trans-signalling in
chronic inflammation and cancer. Scand J Immunol., v. 63, p. 321–329, 2006.
SCHIFF, P. B.; FANT, J.; HORWITZ, S. B. Promotion of microtubule assembly in
vitro by taxol. Nature, v. 277, p. 665 – 667, 1979.
SCHIFF, P. B.; HORWITZ, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast
cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 77, p. 1561-1565, 1980.
SCHNITT, S.J.; SILEN, W.; SADOWSKY, N.L.; CONNOLLY, J.L.; HARRIS, J.R.
Ductal carcinoma in situ (intraductal carcinoma) of the breast. N Engl J Med, v. 318,
p. 898-903, 1988.
SCHREIBER, G.; TSYKIN, A.; ALDRED, A.R.; THOMAS, T.; FUNG, W.P.;
DICKSON, P.W.; COLE, T.; BIRCH, H.; DE JONG F.A.; MILLAND, J. The acute
phase response in the rodent. Ann N Y Acad Sci, v. 557, p. 61–85, 1989.
95
SCOTT, P. IL-12: initiation cytokine for cell-mediated immunity. Science, v. 260, p.
496–497, 1993.
SHANKARAN, V.; IKEDA, H.; BRUCE, A.T.; WHITE, J.M.; SWANSON, P.E.; OLD,
L.J.; SCHREIBER, RD. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour
development and shape tumour immunogenicity. Nature, v. 410, n. 6832, p. 1107-
1111, 2001.
SILVA, A.L.C.; GOTO, L.S.; DINARTE, A.R.; HANSEN, D.; MOREIRA, R.A.;
BELTRAMINI, L.M.; ARAÚJO, A.P.U. Pulchellin, a highly toxic type 2 ribosome-
inactivating protein from Abrus pulchellus: cloning, heterologous expression of A-
chain and structural studies. FEBS J., v. 272, p. 1201-1210, 2005.
SPOONER, R. A.; WATSON, P. D.; MARSDEN, C. J.; SMITH, D. C.; MOORE, K. A.;
COOK, J. P.; LORD, J. M.; ROBERTS, L. M. Protein disulphide-isomerase reduces
ricin to it’s A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J., v. 383, p. 285–
293, 2004.
SPREAFICO, F.; MALFIORE, C.; MORAS, M.L.; MARMONTI, L.; FILIPPESCHI, S.;
BARBIERI, L.; PEROCCO, P.; STIRPE, F. The immunomodulatory activity of the
plant proteins Momordica charantia inhibitor and pokeweed antiviral protein. Int. J.
Immunopharmacol., v. 5, p. 335–344, 1983.
SPRINGER, T. A.; DUSTIN, M. L.; KISHIMOTO, T. K.; MARTIN, S. D. The
lymphocyte function-associated LFA-I, CD2, and LFA-3 molecules: cell adhesion
receptors of the immune system. Annu. Rev. Immunol., v. 5, p. 223, 1987.
SPRINGER, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature, v. 346, p. 425,
1990.
STEEVES, R. M., DENTON, M. E., BARNARD, F. C., HENRY, A., AND LAMBERT,
J. M. Identification of three oligosaccharide binding sites in ricin. Biochemistry, v.
38, p. 11677–11685, 1999.
96
STIRPE, F.; GASPERI-CAMPANI, A.; BARBIERI, L.; LORENZONI, E.;
MONTANARO, L.; SPERTI, S.; BONETTI, E. Inhibition of protein synthesis by
modeccin, the toxin of Modecca digitata. FEBS Lett., v. 85, p. 65-67, 1978.
STIRPE, F.; BARBIERI, L. Ribosome-inactivating proteins up do date. FEBS Lett, v.
195, n. 1-2, p. 1-8, 1986.
STIRPE, F.; BATTELLI, M.G. Ribossome-inactivating proteins: progress and
problems. Cell. Mol. Life Sci., v. 63, p. 1850-1866, 2006.
STUEHR, D.J.; NATHAN, C.F. Nitric oxide, a macrophage product responsible for
cytostasis and respiratory inhibition in tumor target cells. J. Exp. Med., v. 169, p.
1543–1555, 1989.
TAGA, K.; TOSATO, G. IL-10 inhibits human T cell proliferation and IL-2 production.
J. Immunol., v. 148, p. 1143, 1992.
TAHIROV, T.H.; LU, T.H.; LIAW, Y.C.; CHU, S.C.; LIN, J.Y. A new crystal form of
abrin-a from the seeds of Abrus precatorius. J. Mol. Biol., v. 235, p. 1152-1153,
1994.
TAHIROV, T.H.; LU, T.C.; LIAW, Y.C.; CHEN, Y.L.; LIN, J.Y. Crystal structure of
abrin-a at 2.14 Å. J. Mol. Biol., v. 250, p. 354-367, 1995.
TAYLOR, P.R.; MARTINEZ-POMARES, L.; STACEY, M.; LIN, H.-H.; BROWN, G.D.;
GORDON, S. Macrophage receptors and immune recognition. Annu. Rev.
Immunol., v. 23, p. 901–944, 2005.
THORPE, S.C.; MURDOCH, R.D.; KEMENY, D.M. The effect of castor bean toxin,
ricin, on rat IgE and IgG responses. Immunology, v. 68, p. 307–311, 1989.
TRINCHIERI, G. Interleukin-12: a cytokine produced by antigen-presenting cells with
immunoregulatory functions in the generation of T-helper cells type 1 and cytotoxic
lymphocytes. Blood, v. 84, p. 4008–4027, 1994.
97
TRIPATHI, S.; MAITI, T. K. Stimulation of murine macrophages by native and heat-
denatured lectin from Abrus precatorius. Int Immunopharmacol, v. 3, n. 3, p. 375-
381, 2003.
TSAI, B.; YE, Y.; RAPOPORT, T. A. Retro-translocation of proteins from the
endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., v. 3, p. 246–255,
2002.
URBAN, J.L.; SHEPARD, H.M.; ROTHSTEIN, J.L.; SUGARMAN, B.J.; SCHREIBER,
H. Tumor necrosis factor: a potent effector molecule for tumor cell killing by activated
macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 83, p. 5233–5237, 1986.
URTREGER, A.J.; LADEDA, V.E.; PURICELLI, L.; RIVELLI, A.; VIDAL, M.; DEL, C.;
SACERDOTE DE LUSTIG, E.; BAL DE KIER JOFFÉ, E. Modulation of fibronectin
expression and proteolitic activity associated with the invasive and metastic
phenotype in two new murine mammary tumor cell times. Int. J. Oncol., v.11, p. 489-
496, 1997.
URTREGER, A.J.; DIAMENT, M.J.; RANUNCOLO, S.M.; DEL C VIDAL, M.;
PURICELLI, L.I.; KLEIN, S.M.; DE KIER JOFFE, E.D. New murine cell line derived
from a spontaneous lung tumor induces paraneoplastic syndromes. Int. J. Oncol., v.
18, n. 3, p. 639-647, 2001.
VAN DEURS, B.; SANDVIG, K.; PETERSEN, O.W.; OLSNES, S.; SIMONS, K.;
GRIFFITHS, G. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-
Golgi network. J. Cell Biol., v. 106, p. 253–267, 1988.
VAN GINDERACHTER, J.A.; MOVAHEDI, K.; GHASSABEH, G.H.; MEERSCHAUT,
S.; BESCHIN, A.; RAES, G.; DE BAETSELIER, P. Classical and alternative
activation of mononuclear phagocytes: Picking the best of both worlds for tumor
promotion. Immunobiol, v. 211, p. 487-501, 2006.
WINKIPEDIA: The free encyclopedia. Cancer. Disponível em:
<http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer>. Acesso em: 09 abril 2008.
98
WOLF, S.F.; TEMPLE, P.A.; KOBAYASHI, M.; YOUNG, D.; DICIG, M.; LOWE, L.;
DZIALO, K.; FITZ, L.; FERENZ, C.; HEWICK, K.M. Cloning of cDNA for natural killer
cell stimulatory factor, a heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and
natural killer cells. J. Immunol., v. 146, p. 3074, 1991.
WORKMAN, P.; KAYE, S.B. Translating basic cancer research into new cancer
therapeutics. Trends Mol. Med., v. 8, S1–S9, 2002.
XU, S.; KOSKI, G.; FARIES, M.; BEDROSIAN, I.; MICK R.; MAEURER, M.;
CHEEVER, M.A.; COHEN, P.A.; CZERNIECKI, B.J. Rapid high efficiency
sensitization of CD8+ T cells to tumor antigens by dendritic cells leads to enhanced
functional avidity and direct tumor recognition through an IL-12-dependent
mechanism. J Immunol., v. 171, n. 5, p. 2251-2261, 2003.
YOSHIKAWA, A.; SAITO, Y.; MARUYAMA, K. Lignan compounds and 4,4′-
dihydroxybiphenyl protect C2C12 cells against damage from oxidative stress.
Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 344, p. 394–399, 2006.
YOUNG, H. A.; HARDY, K. J. Interferon-y: producer cells, activation stimuli, and
molecular regulation. Pharmac. Ther., v. 45, p. 137, 1990.
Capítulo 2
99
------------------------------ Mensagem Original -------------------------------
Assunto: Submission Confirmation
De: "International Immunopharmacology" [email protected]
Data: Sex, Junho 20, 2008 6:03 pm
Para: [email protected]
Dear Dr Iracilda Zeppone Carlos,
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inflammatory and anti-tumoral activity" has been received by International Immunopharmacology
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Your username is: carlosiz
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Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Elsevier Editorial System International Immunopharmacology
100
A mixed Th1/Th2 response to abrin, ricin and pulchellin: correlation with anti-
inflammatory and anti-tumoral activity
Djamile C. de Matos
a
, Priscila V. Castilho
b
, Ana Cristina de O. M. Moreira
c
, Ana
Paula U. Araújo
b
, André L. C. Silva
d
, Lucas L. Colombo
e
, Iracilda Z. Carlos
a*
a
Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP
– Universidade Estadual Paulista: Rua Expedicionários do Brasil, 1601, CEP 14801-
902, Araraquara, São Paulo, Brasil
b
Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, Brasil
c
Universidade de Fortaleza, Centro de Ciências da Saúde, Fortaleza, Ceará, Brasil
d
Departamento de Bioquímica e biologia molecular, Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza, Brasil
e
Área de pesquisa, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Oncologia “Angel
H. Roffo”, Universidade de Buenos Aires, Argentina
* To whom correspondence should be addressed. e-mail: [email protected]
101
Abstract
Abrin, ricin and pulchellin are type-2-ribosome-inactivating proteins, obtained from
seed of Abrus precatorius, Ricinus communis and Abrus pulchellus tenuiflorus. In this
study, we determined the mixed Th1/Th2-immune response stimulated by them and
their anti-tumoral activity against breast and lung tumoral lineage (LM3 and LP07,
respectively). Abrin, ricin and pulchellin presented a high inhibition of H
2
O
2
production
in murine PEC, and stimulated the production of Th1 and Th2 cytokines, like IL-1β,
TNF-α, IFN-γ, IL-12 and IL-10. The proteins were more toxic to LM3 and LP07 cells
than Taxol, an anti-neoplasic drug currently used in breast and lung cancer treatment.
Keywords: abrin, ricin, pulchellin, cytokines, hydrogen peroxide, tumoral cells
1. Introduction
In 2005, cancer was responsible for 13% of all the deaths in the world. The main
cancer types with higher mortality rate were lung, stomach, liver, colon and breast. In
Brazil, the estimative for 2008 indicates that, exceptionally for the no-melanoma skin
cancer type, the most incident cases will be prostate and lung cancer in men and
colon and uterus cancer in women, following the same profile of the magnitude seen
in the world [1].
Abrin, ricin and pulchellin are proteins obtained from seeds of Abrus precatorius,
Ricinus communis and Abrus pulchellus tenuiflorus, respectively. They are members
of type-2-ribosome-inactivating proteins (RIPs), which are composed by two
polypeptide chains, an enzymatic-A chain that has N-glycosidase activity, and a
lectinic-B chain, specific galactose, capable of binding to cells [2,3,4]. Published data
about pulchellin activity in immune system are inexistent. The ability of abrin and ricin
102
to kill several murine and human cell lines, like Sarcoma 180, Ehrlich ascites cells
have been related [5,6].
Ricin is able to stimulate human peripheral-blood mononuclear cells to produce IL-1β
and TNF-α [7], cytokines responsible to mediate cellular immune response (Th1). All
RIPs and ricin [8] are strongly immunogenic, and their administration to animals
induces antibodies production, with cross-reaction only among RIPs from plants
belonging to the same family [9]. RIPs are also very allergenic and ricin induces IgE
response after its administration [10]. The production of immunoglobulin, including
IgE, associated with antibody and allergic responses can occur by stimulatingTh2
profile with IL4, IL-5, IL-6 and IL-10 production [11].
It is known that the RIPs’ cytotoxic effect is not only due to their N-glycosidase
activity, their stimulation of cytokine production is also important. In this work, we
determined their stimulation of IL-1β, TNF-α, IL-12, IFN-γ and IL-10 production and
their citotoxicity to murine breast and lung adenocarcinoma cells.
2. Material and methods
2.1. Isolation of the proteins
Pulchellin was isolated from the seeds of Abrus pulchellus as described [12]. Abrin
and ricin were isolated from the seeds of Abrus precatorius and Ricinus communis,
respectively. Dehulled seeds of A. precatorius and R. communis were ground by a
mixer and the fine flour obtained was suspended (1:10 w/v) in saline solution (0.9%
NaCl) for 3 hours at 4°C and centrifuged at 12000 g for 20 minutes at 4°C. The
supernatant was loaded onto an immobilized Adenanthera pavonina L.
galactomannans column, previously equilibrated with the same solution. The
103
unbound material was eluted from the column with saline solution, whereas the
absorbed proteins were obtained in a single peak elution with a solution 0.1M glicine.
The fractions containing abrin or ricin were dialyzed with PBS solution pH 7.2. The
samples were sterilized using 0.22µm-membrane and conditioned at -80°C to
posterior utilization.
2.2. Animals
Six-week old male Swiss mice (6-8 weeks old, 18 to 25 g) were used. The animals
were maintained in a polycarbonate box (at 23 ± 1 ºC, 55 ± 5% humidity, 10-18
circulations/h and a 12-hour light/dark cycle), with water and food available ad
libitum. The experiments were performed in accordance with the regulations of
Research Ethics Committee (# 32/2006), Faculty of Pharmaceutical Sciences,
UNESP, São Paulo, Brazil.
2.3. Peritoneal exsudate cells (PEC)
Thioglycollate-elicited peritoneal exsudate cells (PEC) were harvested from the Swiss
mice by using 5.0 ml of sterile PBS, pH 7.4. The cells were washed twice by
centrifugation at 200g for 5 minutes at 4°C and re-suspended in appropriate medium
for each test.
2.4. PEC supernatant
The supernatants of PEC-culture were used in the TNF-α, IL-1β e IL-12
104
determination. The cells were adjusted at 5 x 10
6
cells/mL in a RPMI-1640-C medium
and 500 µL were placed into each well of 48 microtitre plates (Corning, Inc., EUA).
The plate was incubated for 1 hour at 37°C under 5% CO
2
(Forma Scientific). After
that, the non-adherent cells were removed through washes with RPMI-1640-C
medium. After that, 250µL of RPMI-1640-C medium and 250µL of abrin, ricin or
pulchellin at 0.78 ng/mL were added to the adherent peritoneal cells. Cells incubated
with lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 (Sigma) at 10µg/mL or only
with RPMI-1640-C medium were used as positive and negative controls, respectively.
The plates were incubated for 24 hours at 37°C under 5% CO
2
(Forma Scientific).
The supernatants were collected and centrifuged at a refrigerated centrifuge (Hettich,
Germany) at 7800 xg for 10 minutes, aliquot and stored at -80°C until the moment of
use.
2.5. Splenic cells
The spleens were aseptically collected and placed on a sterile Petri plate (Corning,
Inc.) with 3.0 mL RPMI-1640 culture medium (Sigma). The cell suspension was
obtained by tweezing the spleen and washing it three times with the RPMI-1640
described before. The cells were re-suspended in a concentration of 5x10
6
cells/mL
of RPMI-1640 with 5% of fetal bovine serum, 100 U/mL of penicillin, 100 U/mL of
streptomycin and 50mM of 1-mercaptoethanol.
105
2.6. Splenic cells supernatant
For the IFN-γ and IL-10 production, 500 µL of the cellular suspension and 500 µL of
abrin, ricin or pulchellin at 0.78ng/mL were placed into each well of 48 microtitre
plates (Corning, Inc., EUA). The present study used cells with Concanavalin A
(ConA) at 0.5 µg/mL or RPMI-1640-C medium as positive and negative controls,
respectively. The plates were incubated for 24 hours at 37°C under 5% CO
2
(Forma
Scientific). The supernatant was collected and centrifuged at a refrigerated centrifuge
(Hettich, Germany) at 7800 xg for 10 minutes. The supernatants were aliquot and
stored at -80°C for a later use.
2.7. Assessment of cellular viability
For the cellular viability assay, it was used the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (MTT) test [13]. The cells were re-suspended in RPMI-
1640 containing 5% of fetal bovine serum, 100 U/mL of penicillin, 100 U/mL of
streptomycin and 50 mM of 1-mercaptoethanol in order to obtain an adjustment to
the concentration of 5x10
6
cells/mL. It was added 100µL of the cellular suspension
and 100 µL of the abrin, ricin and pulchellin, in different concentrations in each well of
the plate and incubated for 24 hours at 37°C under 5% of CO
2
. The MTT was added
(100 µL) and the plate was incubated for 3 hours at 37°C under 5% of CO
2
. The
formazan formed was dissolved in acidic 2-propanol and the optical density was
measured using a microplate reader (Multiskan, Labsystem) equipped with a 540nm
filter and 620 nm reference filter. The optical density of dissolved formazan in the
control (untreated cells) was taken as 100% of viability.
106
2.8. Hydrogen Peroxide (H
2
O
2
) inhibition
PEC cells were re-suspended at a concentration of 2x10
6
cells/ml in a solution of
phenol red containing 140 mM NaCl, 10 mM potassium phosphate, pH 7.0, 5.5 mM
dextrose, 0.56mM phenol red, and type II horseradish peroxidase, 0.01 mg/mL,
(Sigma). Aliquots of 100 µL were transferred to flat-bottomed 96-well culture plates
(Corning). A 50 µl volume of the abrin, ricin or pulchellin at 1.17 ng/ mL and 50 µl of
phorbol myristate acetate (PMA, Sigma) at 0.2 mM were added. PMA was used as
positive control, and buffered phenol red, as negative control. The plates were
incubated for one hour at 37 °C under 5% CO
2
and the reaction was stopped by the
addition of 50 µl of 4 N NaOH. Experiments were run in triplicate. Absorbance was
determined with an automatic ELISA photometer using a 620 nm filter. The results
were expressed as nanomols of H
2
O
2
mL
-1
peritoneal cells, from a standard curve
established in each test consisting of known molar concentrations of H
2
O
2
in buffered
phenol red [14, 15].
2.9. IL-1β, IL-10, IL-12, TNF-α and IFN-γ measurement
The IL-1β, IL-12, TNF-α cytokine released in the supernatant of PEC culture, IFN-
and IL-10 in the supernatant of spleen cells were quantified by immunenzymatic
assay (ELISA). The 96-well plates were coated overnight at 4°C with 100 µL/well of a
purified rat anti-mouse cytokine capture antibody (anti-IL-1β, anti-IL-10, anti-IL-12,
anti- TNF-α) (Kit BD OptEIA, San Diego, CA) in 0.1M sodium carbonate buffer, pH
9.5 (IL-1β and IFN-γ) or 0.2M sodium phosphate buffer, pH 6.5 (IL-12, IL-10 and
TNF-α). Plates were washed three times with 0.01M phosphate – buffered (pH 7.2)
saline (PBS) containing 0.05% Tween 20 (PBS-T). Plates were blocked with 200
107
µL/well of 0.01M phosphate – buffered (pH 7.2) saline (PBS) containing 10% fetal
bovine serum at room temperature for 60 minutes, and washed three times with PBS-
T. 100 µL of standard murine cytokines (BD OptEIA) or samples (supernatant of
PEC/lymphocytes culture) were added to appropriate wells. Plates were incubated at
room temperature for 120 minutes, washed five times with PBS-T, and 100µL of
antibody biotinylated goat anti-mouse cytokine IL-1β, IL-12, TNF-α, IFN-γ and IL-10 +
Streptavidin-Horseradish peroxidase conjugate reagent (BD OptEIA) were added in
each well. Plates were incubated at room temperature for 60 minutes, and washed
seven times with PBS-T. Plates were then washed seven times with PBS-T and 100
µL of substrate tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide (BD
Pharmingen
TM
TMB Substrate Reagent) were added to each well and the plates were
incubated for 30 minutes in the dark. The reaction was stopped by adding 50 µL of 2
N H
2
SO
4
. Absorbance was read at 450nm by a microplate reader (Multiskan Ascent,
Labsystems®), and cytokine concentrations were calculated by a curve of known
concentrations of IL-1β, IL-12, TNF-α, IFN-γ, IL-10 standards. Results were
expressed in picograms/mL.
2.10. Anti-proliferative activity against LM3 and LP07
Cellular growth was quantified using MTT assay [13]. After trypsinization, the cells
were washed and adjusted at a concentration of 5×10
4
cell/ml. 200 µl of the tumoral
cell suspension were plated in each well of flat-bottomed 96-well culture plates
(Corning), and incubated at 37°C under 5% CO
2
. The microtiter plates containing
cells were pre-incubated for 24 hours to allow stabilization prior to the addition of the
samples. After this period, 200 µl of the abrin, ricin, pulchellin or Taxol (Sigma) in
108
different concentrations were added and incubated for 24 or 48 hours in the same
conditions. After cultivation, the medium was replaced for fresh medium containing 1
mg/ml of MTT. After three hours, the medium was removed and 100 µL of isopropilic
alcohol (Mallinckrodt) was added to solubilize the formazan crystals formed. The
absorbance was measured at 540nm with a reference filter of 620 nm on a
spectrophotometer (Multiskan Ascent, Labsystems). The 50% inhibitory
concentration for cell-growth (IC
50
) values were expressed as the dose resulting in
50% reduction of tumoral cell growth and were calculated by linear regression using
Microcal Origin 7.0.
2.11. Statistical Analysis
The results are expressed as means ± S.D. Each experiment was performed at least
three times. One-way ANOVA with Tukey’s post test was performed using GraphPad
InStat version 3.00 for Windows 95, Graph-Pad Software, San Diego, California,
U.S.A. Values of p< 0.05 were considered statistically significant.
3. Results
3.1. Assessment of cellular viability
In the cellular-viability test it was verified that abrin, ricin and pulchellin showed a high
citotoxicity to murine PEC after 24 hours of incubation. The 50% inhibitory
concentration were 6.4 ± 1.53 ng/mL, 11.8 ± 1.66 ng/mL and 19.3 ± 4.0 ng/mL for
abrin, ricin and pulchellin, respectively.
109
To perform the other tests the concentrations at 0.39 ng/mL (well concentration) were
chosen, where it could be observed a good cellular viability >80% (data not
presented), which made possible the occurrence of a satisfactory immune response.
3.2. H
2
O
2
inhibition
Abrin, ricin and pulchellin incubated with PEC cells in the PMA’s presence inhibited
the hydrogen peroxide production after one hour of incubation, values varying from
71.09 ± 1.95 to 86.81 ± 2.80 (Table 1).
3.3. IL-1β, IL-10, IL-12, TNF-α and IFN-γ measurement
The cytokines IL-1β, TNF-α, IL-12 (Figure 1), IFN-γ and IL-10 (Figure 2) were
determined by ELISA. Abrin did not stimulate the TNF-α production, but it induced
lightly IL-1β and strongly IL-10, IL-12 and IFN-γ (p<0.001); ricin showed ability to
induce IL-1β, IFN-γ, IL-12 (p< 0.001) and IL-10 (p<0.05); and pulchellin was not able
to induce the IL-1β production and stimulated IFN-γ, TNF-α and IL-10 (p< 0.001).
3.4. Measurement of anti-proliferative activity against LM3 and LP07
It was observed that abrin, ricin and pulchellin, when incubated with LM3 and LP07
cells for 24 or 48 hours of incubation, were more cytotoxic than Taxol, a current
anticancer drug obtained from Taxus brevifolia and utilized against breast and lung
cancer. Abrin showed the highest toxicity followed by pulchellin and ricin. Their
110
citotoxicity was higher to LM3 than to LP07 with 24 hours of incubation, but it was
similar to both cells lineage within 48 hours (Table 2 and 3).
4. Discussion
Macrophages have presented inflammatory functions within the innate response and
they contribute to an adaptive response presenting the epitope-antigen to help T
cells. The macrophages activities during cancer are predominantly unspecific and
they induce citotoxicity to tumoral cells by suppressing T and NK cells response.
These macrophages functions can be mediated, among other factors, by reactive
nitrogen species, reactive oxygen species or TNF-α [16]. According to researchers,
the PEC consists of 20-25% of macrophages, 1% of mast cells with the remainder
being neutrophiles [17]. Initially, it was determined the IC
50
by utilizing PEC at 24
hours of incubation. It was observed that PEC was sensible to the toxic potential of
the proteins, abrin being the most toxic (IC
50
= 6.4 ± 1.53 ng/mL), followed by ricin
(IC
50
= 11.8 ± 1.66 ng/mL), and by pulchellin (IC
50
= 19.3 ± 4.0 ng/mL). Due to their
high citotoxicity, the concentration of 0.39 ng/mL (well concentration), which showed
>80% viability, was chosen to perform the immunological tests.
Macrophages can be activated by LPS and IFN-γ stimulation. The major activated
macrophage feature is enhancing its capacity of releasing pro-inflammatory and
cytotoxic mediators like oxygen and nitrogen species, hydrolytic enzymes and
cytokines, which can act at the antigens’ destruction, although, their exceeded and
uncontrolled production can destroy normal tissues [18]. In the present experiments,
abrin, ricin and pulchellin were not able to induce H
2
O
2
production, but they inhibit the
H
2
O
2
production stimulated by PMA, at a rate around 70% (Table 1). It is interesting
111
to note that a substance with H
2
O
2
inhibitory capacity can show, among other things,
a high anti-inflammatory potential, and consequently it contributes for the reduction of
carcinogenesis sprouting. Similar results were observed in an earlier research in our
laboratory using etil acetate fraction obtained from Alchornea glandulosa [19].
Different results observed in others studies showed that abrin induces apoptosis in
JR4 Jurkat cells that can occur in the mitochondrial pathway. Moreover, they related
that abrin induces ROS production, which is a mitochondrial membrane potential loss
effect leading to apoptotic events [20].
Cytokines are endogenous peptide involved in immune response. The delicate
equilibrium between cytokines and other inflammatory mediators seems to be the
major factor that leads to a hyper-inflammation or hyper-immune-suppression, both
being able to affect vital organs not involved in initial injury [21]. IL-1-release
activates a pro-inflammatory cascade, including Th1 cells proliferation, TNF-α, IFN-γ,
IL-2 and IL-12 production [22]. The TNF-α is responsible for several crucial events to
initiate acute and chronic inflammatory events, like over-regulation of adhesion
molecules expression [23, 24], induction of other cytokines of early response (IL-1
and IL-6) [25] and the activation of specific leucocytes chemiotatic cytokines [26].
It was showed that abrin and ricin induced significant IL-1β production (p<0.001),
although pulchellin did not induce a significant production (p>0.05). Considering TNF-
α production, only pulchellin stimulated its production at 30.44pg/mL (Fig. 1). It was
observed an induction of IL-1β and TNF-α release by human mononuclear cells from
peripheral blood when treated with abrin. The TNF-α release was dose-dependent.
The maximum release of these cytokines occurred when cells were treated with abrin
at 5.0pM. Besides, when used in higher concentrations, the release did not occur
after 24 hours of incubation. The researchers suggested that these cytokines
112
released by macrophages stimulated and/or injured by abrin can contribute to the
pathogenesis damage and other observed effects after abrin intoxication [7]. Ricin
also stimulated TNF-α production in murine marrow bone macrophages (C57BL/6J)
when these cells were treated with 10ng/mL of ricin, they released about 20 pg/mL of
TNF-α [27].
The lymphocytes shared the activity of cytokine production with macrophages. T cells
are frequently classified in 2 categories, type 1 (Th1) and type 2 (Th2). Th1 cells are
the major producer of IFN-γ and IL-2; and Th2 cells produce IL-4, IL-5, IL-6 and IL-
10. The Th1 cells induce cellular immunity; and Th2 cytokines induce humoral
immunity [28]. IFN-γ is a cytokine produced by T CD4+ (mainly Th1 subset), CD8+
cells and NK cells [29]. IFN-γ has several classical properties of macrophages
activation [30]. It over-regulates the class II MHC antigen expression and enhances
cytokine synthesis like TNF-α, IL-1β and IL-6. The IFN-γ production seen in the
present experiment was high, around 300pg/mL (p< 0.001), when cells were treated
with the proteins (Fig. 1). The lymphocytes and IFN-γ contribute to host protection
against sarcoma carcinogen-induced, spontaneous epithelial carcinoma development
and tumoral cells selection with reduced immunogenicity [31].
IL-12 is an immune-regulatory cytokine that promotes cellular immunity. High levels
of IL-12 produced by dendritic cells activate T CD4 cells to release Th1 cytokines
[32]. In the present study, abrin and ricin stimulated a higher production of IL-12 by
PEC than the one by LPS (Fig. 1), but pulchellin did not show a significant production
(p> 0.05). IL-10, a Th2 cytokine, has powerful immunomodulatory activities, affecting
several cellular types by different ways. In the present research, the proteins showed
moderate to high level of stimulation of IL-10 (Fig. 2), which shows that the proteins
can have anti-inflammatory activity. Researchers have demonstrated that IL-10
113
promotes the development of Th2 cytokines, and inhibits the development of Th1
cytokines in response to antigen [33]. Pulchellin 3 was related with the induction of
significant neutrophile exudation to peritoneal cavity in a Swiss mouse after 6 hours
of intra-peritoneal injection. Moreover, pulchellin was chemiotatic in vitro to human
neutrophiles [34]. The IL-10 is related as a powerful signal of leucocytes migration
recruitment in vivo [35] and it is suggested that the stimulation of PEC migration
caused by pulchellin 3 can be due to the stimulation of IL-10 production observed in
the present experiments. Other fact that corroborates with IL-10 production is that
ricin administration induces IgE response enhancing the response against other
antigens concomitantly administered [10].
Abrin, ricin and pulchellin are very immunogenic so it is believed that they can be
used like co-adjutant contributing to enhance immune response against several
antigens concomitantly administered. This reflects directly in current observations
that efficient immunization conglobates both Th1 and Th2 response [36, 37]. A mixed
Th1 and Th2 response was observed in some researches with animals immunized
with vaccines containing proteins obtained from bacteria like CRM197, a mutant
diphtheria toxin [38], or from parasite like the protein obtained from Leishmania
donovani [39]. The same pattern of immune response was observed here using
abrin, ricin and pulchellin.
It is known that interactions between tumoral cell and its micro-environment can
affect the tumoral grown and the metastasis development. The tumoral micro-
environment can vary among tumoral types and the illness phase. Among the
tumoral micro-environment components, the inflammatory cells and the cytokines
play a key-role in breast cancer [40].
114
It must be taken in account that the over-expression proteins in tumoral cells could
be acting as antigens leading to a humoral immune response in the tumor host [41].
Based on this discovery, researchers are developing a new treatment against cancer,
called immunotoxins, which toxic molecules are linked to antibodies against specific
tumoral antigens. The antibodies act directing the toxins to tumoral cells, excluding
health cells of their toxic effects. Some immunotoxins have been produced with type
1 and 2 RIPs [42]. However, the type 2 RIPs cannot be used without treatment,
blocking their sites of lectin linking, to force the immunotoxins not to attack health
cells possessing carbohydrates at their surfaces. Other option was to use only
enzymatic chain of type 2 RIPs, which shows more promissory results [42].
By MTT assay, it is determined the 50% inhibitory concentration (IC
50
) of the abrin,
ricin and pulchellin in murine breast adenocarcinoma cells (LM3) and lung
adenocarcinoma cells (LP07) after 24 or 48 hours of incubation (Table 2 and 3). Its
results were compared with the obtained Taxol results, which is a currently anti-
neoplasic drug against breast and lung cancer [43, 44]. It was observed that the RIPs
showed higher citotoxicity than Taxol in 24 and 48 hours of incubation to both cell-
lines. Abrin and ricin were more toxic with the enhancement of time of incubation for
LM3 cells. The RIPs were more toxic to LM3 cells than LP07 cells after 24 hours of
incubation; however the toxicity to LP07 cells and LM3 cells were similar after 48
hours of incubation.
With these results it can be concluded that abrin, ricin and pulchellin can present
anti-tumoral activity against murine breast and lung cancer, with a more powerful
response than Taxol’s. Although they produce different cytokines, a mixed Th1/Th2
immune response is activated, which may contribute to their antitumoral and anti-
inflammatory activity.
115
Acknowledgements
The authors are grateful to Marisa Campos Polesi Placeres, the technician of the
Laboratório de Imunologia Clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas of
UNESP, Araraquara, São Paulo, Brazil and to CAPES by the financial support.
References
[1]Instituto Nacional de câncer. Disponível em:
<http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=322>. Access in November 12
th
2008.
[2]Olsnes S, Pihl A. Isolation and properties of abrin: a toxic protein inhibiting protein
synthesis: evidence for different biological functions of its constituents – peptide
chains. Eur. J. Biochem. 1973; 35: 179–185.
[3]Olsnes S, Pihl A. Different biological properties of the two constituent peptide
chains of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. Biochemistry 1973; 12:
3121–3126.
[4]Silva ALC, Horta ACG, Moreira RA, Beltramini LM, Araújo APU. Production of
Abrus pulchellus ribosome-inactivating protein from seeds callus culture. Toxicon
2003; 41: 841–849.
[5]Fodstad O, Olsnes S, Pihl A. Inhibitory Effect of Abrin and Ricin on the Growth of
Transplantable Murine Tumors and of Abrin on Human Cancers in Nude Mice.
Cancer Res 1977; 37: 4559-4567.
[6]Lin JY, Lee TC, Hu S, Tung TC. Inhibitory effects of four isoabrins on the growth of
Sarcoma 180 cells. Cancer Res. 1982; 42: 276-279.
116
[7]Licastro F, Morini MC, Bolognesi A, Stirpe F. Ricin induces the production of
tumour necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta by human peripheral-blood
mononuclear cells. Biochem. J. 1993; 294: 517–520.
[8]Thorpe SC, Kemeny DM, Panzani R, Lessof MH. Allergy to castor bean. I. Its
relationship to sensitization to common inhalant allergens (atopy). J. Allergy Clin.
Immunol. 1988; 82: 62–66.
[9]Strocchi P, Barbieri L, Stirpe F. Immunological properties of ribosome-inactivating
proteins and of a saporin-IgG conjugate. J. Immunol. Methods 1992; 155: 57–63.
[10]Thorpe SC, Murdoch RD, Kemeny DM. The effect of castor bean toxin, ricin, on
rat IgE and IgG responses. Immunology 1989; 68: 307–311.
[11]Coffman RL, Mocci S, Garra AO. The stability and reversibility of Th1 and Th2
populations. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999; 238: 1–12.
[12]Castilho PV, Goto LS, Roberts LM, Araújo APU. Isolation and characterization of
four type 2 ribosome inactivating pulchellin isoforms from Abrus pulchellus seeds.
FEBS Journal 2008; 275: 948–959.
[13]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983; 65: 55-63.
[14]Pick E, Keisari Y. A simple colorimetric method for the measurement of hydrogen
peroxide produced by cells in culture. J. Immunol. Methods. 1980; 38: 161-170.
[15]Pick E, Mizel DJ. Rapid microassays for the measurement of superoxide and
hydrogen peroxide production by macrophages in culture using an automatic
enzyme immunoassay reader. J. Immunol. Methods. 1981; 46: 211-226.
[16]Alleva DC, Burger CJ, Elger KD. Tumor-Induced Regulation of Suppressor
Macrophage Nitric Oxide and TNF-α Production: Role of Tumor-Derived IL-10,
TGF-β, and Prostaglandin E
2
. J Immunol 1994; 153: 1674-86.
117
[17]Remer KA, Brcic M, Jungi TW. Toll-like receptor-4 is involved in eliciting an LPS-
induced oxidative burst in neutrophiles. Immunology Letters 2003; 85(1): 75-80.
[18]Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology
and pharmacology. Pharmacol. Rev. 1991; 43(2): 109-142.
[19]Lopes FC, Calvo TR, Vilegas W, Carlos IZ. Inhibition of hydrogen peroxide, nitric
oxide and TNF-alpha production in peritoneal macrophages by ethyl acetate
fraction from Alchornea glandulosa. Biol Pharm Bull. 2005; 28, n. 9: 1726-30.
[20]Narayanan S, Surolia A, Karande AA. Ribosome-inactivating protein and
apoptosis: abrin causes cell death via mitochondrial pathway in Jurkat cells.
Biochem. J. 2004; 377: 233–240.
[21]Delong WG, Born CT. Cytokines in patients with polytrauma. Clin. Orthop. 2004;
422: 57–65.
[22]Dinarello CA. Inflammatory cytokines: interleukin-1 and tumor necrosis factor as
effector molecules in autoimmune diseases. Curr Opin Immunol 1991; 3: 941–8.
[23]Springer TA, Dustin ML, Kishimoto TK, Martin SD. The lymphocyte function-
associated LFA-I, CD2, and LFA-3 molecules: cell adhesion receptors of the
immune system. Annu. Rev. Immunol. 1987; 5: 223.
[24]Springer TA. Adhesion receptors of the immune system. Nature 1990; 346: 425.
[25]Lukacs NW, Strieter RM, Kunkel SL. Cytokines in acute inflammation. Curr. Opin.
Hematol. 1993; 1993: 26.
[26]Oppenheim JJ, Zachariae COC, Mukaida N, Matsushima K. Properties of the
novel proinflammatory “intercrine” cytokine family. Annu. Rev. Immunol. 1991; 9:
617.
118
[27]Korcheva V, Wong J, Lindauer M, Jacoby DB, Iordanov MS, Magun B. Role of
apoptotic signaling pathways in regulation of inflammatory responses to ricin in
primary murine macrophages. Mol Immunol 2007; 44: 2761–2771.
[28]Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, Giedlin MA, Coffman RL. Two types of
murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine
activities and secreted proteins. J Immunol 1986; 136 (7): 2348-2357.
[29]Young HA, Hardy KJ. Interferon-y: producer cells, activation stimuli, and
molecular regulation. Pharmac. Ther. 1990; 45: 137.
[30]Farrar MA, Schreiber RD. The molecular cell biology of interferon- and its
receptor. Annu. Rev. Immunol. 1993; 11: 571.
[31]Shankaran V, Ikeda H, Bruce AT, White JM, Swanson PE, Old LJ, et al. IFN
gamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape
tumour immunogenicity. Nature 2001; 410(6832): 1107-11.
[32]Xu S, Koski G, Faries M, Bedrosian I, Mick R, Maeurer M, et al. Rapid high
efficiency sensitization of CD8+ T cells to tumor antigens by dendritic cells leads
to enhanced functional avidity and direct tumor recognition through an IL-12-
dependent mechanism. J Immunol. 2003; 171(5): 2251-61.
[33]Laouini D, Alenius H, Bryce P, Oettgen H, Tsitsikov E, Geha RS. IL-10 is critical
for Th2 responses in a murine model of allergic dermatitis. J. Clin. Invest. 2003;
112:1058–1066.
[34]Mota DM. Pulchelinas, lectinas galactose-específicas, de sementes de
Abrus pulchellus: purificação e estudos de propriedades químicas e biológicas.
1997. 120f. Thesis (Master in Biochemistry) – Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza, 1997.
119
[35]Parry SL, Sebbag M, Feldmann M, Brennan FM. Contact with T Cells Modulates
Monocyte IL-10 Production: Role of T Cell Membrane TNF-α. J Immunol 1997;
158: 3673-3681.
[36]Evans TG, Fitzgerald T, Gibbons DC, Keefer MC. Th1/Th2 cytokine responses
following HIV-1 immunization in seronegative volunteers. Clin Exp Immunol 1998;
111: 243-250.
[37]Basu R, Bhaumik S, Basu JM, Naskar K, De T, Roy S. Kinetoplastid Membrane
Protein-11 DNA Vaccination Induces Complete Protection against Both
Pentavalent Antimonial-Sensitive and -Resistant Strains of Leishmania donovani
That Correlates with Inducible Nitric Oxide Synthase Activity and IL-4 Generation:
Evidence for Mixed Th1- and Th2-Like Responses in Visceral Leishmaniasis. J
Immunol 2005; 174: 7160-7171.
[38]Kamboj KK, King CL, Greenspan NS, Kirchner HL, Schreiber JR. Immunization
with Haemophilus influenzae Type b–CRM197 Conjugate Vaccine Elicits a Mixed
Th1 and Th2 CD4+ T Cell Cytokine Response That Correlates with the Isotype of
Antipolysaccharide Antibody. J Infect Dis 2001; 184: 931–5.
[39]Mazumdar T, Anam K, Ali N. A mixed Th1/Th2 response elicited by a liposomal
formulation of Leishmania vaccine instructs Th1 responses and resistance to
Leishmania donovani in susceptible BALB/c mice. Vaccine 2004; 22: 1162–1171.
[40]Ben-Baruch A. Host microenvironment in breast cancer development:
Inflammatory cells, cytokines and chemokines in breast cancer progression:
reciprocal tumor–microenvironment interactions. Breast Cancer Res. 2003; 5 (1):
31–36.
120
[41]Fiszman G, Cattaneo V, De La Torre E, Colombo L, Middonno C, Sacerdote de
Lustig E, et al. Autoanticuerpos contra receptores muscarínicos en cáncer de
mama. Revista Química Viva 2005; 3(4): 101-117.
[42]Fracasso G, Bellisola G, Castelletti D, Tridente G, Colombatti M. Immunotoxins
and Other Conjugates: Preparation and General Characteristics. Mini Rev Med
Chem 2004; 4: 545-562.
[43]Davies AM, Lara Jr PN, Mack PC, Gandara DR. Docetaxel in non-small cell lung
cancer: a review. Expert Opin Pharmacother 2003; 4(4): 553-565.
[44]Ozols RF, Bundy BN, Greer BE, Fowler JM, Clarke-Pearson D, Burger RA,
Mannel RS, Degeest K, Hartenbach EM, Baergen R. Phase III Trial of
Carboplatin and Paclitaxel Compared With Cisplatin and Paclitaxel in Patients
With Optimally Resected Stage III Ovarian Cancer: A Gynecologic Oncology
Group Study. J. Clin. Oncol. 2003; 21(17): 3194-3200.
121
Table 1 – H
2
O
2
production inhibition of proteins in peritoneal cells percentage
Inibition (%)
Abrina (ng/mL) Ricina (ng/mL) Pulchelina (ng/mL)
0.39 0.39 0.39
H
2
O
2
76.04 ± 1.09 71.09 ± 1.95 86.81 ± 2.80
Table 2 – IC50 values of substances of LM3 and LP07 cells after 24 hours of
incubation
IC
50
(ng/mL) LM3 LP07
Abrina 81.54 ± 2.56 175.2 ± 2.60
Ricina 822 ± 1.45 1084.9 ± 2.75
Pulchelina 74.98 ± 2.69 1127.0 ± 2.41
Taxol
®
193.89x10
3
± 1.36 134.0x10
3
± 1.15
Table 3 – IC50 values of substances of LM3 and LP07 cells after 48 hours of
incubation
IC
50
(ng/mL) LM3 LP07
Abrin 42.8 ± 6.36 37.44 ± 5.52
Ricin 590.3 ± 2.26 609.2 ± 4.0
Pulchellin 91.94 ± 4.58 80.11 ± 5.76
Taxol
®
12.65x10
3
± 2.7 85.84x10
3
± 1.99
122
Figure 1 Proteins effects on TNF-α, IL-12 and IL-1β synthesis in peritoneal cells. For the cytokine immunoassay,
adherent cells (5x10
6
/ml) were incubated for 24 hours with abrin, ricin or pulchellin at 0.39 ng/mL (well concentration).
Cells incubated just with LPS (10 µg/ml) were used as a positive control and cell in culture medium (RPMI-1640) as a
negative control. One-way ANOVA with Turkey test was performed. *** p<0.001, ** p<0.01 vs. negative control.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
**
***
***
Controls
RPMILPS
Pulchellin
Ricin
Abrin
Concentration of IL-12 pg/mL
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
RPMI
Controls
LPS
Pulchellin
Ricin
Abrin
***
***
**
Concentration of IL-1 beta (pg/mL)
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Controls
RPMI
LPS
Pulchellin
RicinAbrin
***
***
Concentration of TNF-alpha (pg/mL)
123
Figure 2 Proteins effects on IFN-γ and IL-10 synthesis in lymphocytes. For the cytokine immunoassay, splenic cells
(5x10
6
cells/ml) were incubated for 24 hours with abrin, ricin or pulchellin at 0.39 ng/mL (well concentration). Cells
incubated just with Concanavalin A (0.5 µg/ml) were used as a positive control and cell in culture medium (RPMI-1640)
as a negative control. One-way ANOVA with Turkey test was performed. *** p<0.001, * p<0.05 vs. negative control.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
***
***
*
***
Controls
RPMI
ConA
PulchellinRicin
Abrin
Concentration of IL-10 (pg/mL)
0
100
200
300
400
500
***
***
***
***
Controls
RPMI
ConAPulchellin
Ricin
Abrin
Concentration of IFN-gamma (pg/mL)
124
APÊNDICE
PREPARO DE SOLUÇÕES, REAGENTES E MEIOS DE CULTURA
• Líquido de Lázarus
Violeta de genciana 1% - 2mL
Ácido acético glacial – 3mL
Água destilada q.s.p 100mL
• Meio MEM
Minimum Essential Médium (GIBCO) – 9,6g
NaHCO3 – 2,2g
Água mili-Q q.s.p 1L
Solubilizar os pós em 80% da água mili-Q utilizando um Becker de 1L. Ajustar
o pH da solução para 7,0-7,2. Em um balão volumétrico de 1L, ajustar o volume da
solução. Esterilizar o meio através de filtração com membrena de 0,22µm. Após
esterilização, aliquotar o meio em frascos de 200mL. Estocar sob refrigeração a 4°C.
No momento do uso, adicionar ao meio:
Soro fetal bovino - 10%
Garamicina (80mg/mL) - 50µL
Meio MEM - 100mL
• Meio RPMI-1640
Dissolver o conteúdo de um frasco em 100mL de água mili-Q.
Acrescentar:
HEPES – 2,38g
Bicarbonato de sódio – 2g
Ajustar o pH em 7,0 – 7,2. Em seguida, completar o volume para 1L e
esterilizar utilizando membrana 0,22µm. Após esterilização, aliquotar o meio em
frascos de 1L. Estocar sob refrigeração a 4°C.
125
No momento do uso, adicionar ao meio
Penicilina – 100U/mL
Estreptomicina – 100 U/mL
Glutamina – 2mM
Mercaptoetanol – 50mM
Soro fetal bovino – 5%.
• Peroxidase
Pesar 1mg de peroxidase e adicionar 1mL de tampão fosfato. Aliquotar e
armazenar a -20°C.
• Reagente de Griess
Sulfanilamida – 1,0g
Naftietilenodiamina – 0,1g
Ácido orto-fosfórico – 2,5mL
Água mili-Q q.s.p 100mL
Dissolver a sulfanilamida e naftietilenodiamina. Acrescentar, aos poucos, o
ácido orto-fosfórico. Completar o volume para 100mL. Manter o reagente sob
refrigeração a 4°C. Proteger da luz.
• Solução Azul de Trypan
Solução concentrada
Azul de Trypan – 0,4g
PBS* q.s.p 100mL
Solução para uso
Solução concentrada – 1mL
PBS* q.s.p 10mL
126
• Solução de cloreto de amônio (NH
4
Cl)
NH
4
Cl – 4,55g
Água mili-Q q.s.p. 500mL
Dissolver o pó e autoclavar.
• Solução de LPS
Dissolver 1mg de LPS em 1mL de meio RPMI, esterilizar por filtração
utilizando membrana de 0,22µm e armazenar a -20°C. Posteriormente diluir para a
concentração de 10µg/mL, utilizando RPMI-1640.
• Solução de MTT - tetrazólio
Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) – 10mg
PBS* - 2mL
Meio RPMI sem soro fetal bovino – 8mL
Solubilizar o sal de MTT em PBS* estéril, em seguida deixando no banho de
ultra-som por aproximadamente 10 minutos. Por fim, adicionar o meio RPMI sem
soro fetal bovino.
• Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Solução 1:
Na
2
HPO
4
.H
2
O – 27,4g
Água mili-Q q.s.p 386mL
Solução 2:
NaH
2
PO
4
.H
2
O – 7,88g
Água mili-Q q.s.p. 114mL
Solução estoque: preparar, inicialmente, as soluções 1 e 2. Em seguida, misturar as
duas soluções e completar o volume para 1L com água mili-Q e autoclavar. O pH
deve ser de 7,2. Armazenar sob refrigeração a 4°C.
Solução de uso:
Solução estoque – 40mL
127
NaCl – 8,5g
Água mili-Q q.s.p 1L
Ajustar o pH, se necessário, e autoclavar. Armazenar sob refrigeração a 4°C.
• Solução de vermelho de fenol completa para H
2
O
2
Solução de vermelho de fenol
Vermelho de fenol – 0,5g
Água mili-Q q.s.p 50mL
Dissolver no ultra-som.
Solução de peroxidase
Peroxidase – 1mg
Tampão fosfato – 1mL
Tampão fosfato para H
2
O
2
KH2PO4 – 1,36g
K2HPO4 – 2,282g
NaCl – 8,18g
Dextrose – 0,99g
Água mili-Q q.s.p 1L
Dissolver os pós e acertar pH 7,0.
Para preparar 10mL de solução de vermelho de fenol completa para H
2
O
2:
Tampão fosfato para H
2
O
2
– 9,7mL
Solução de vermelho de fenol - 200µL
Peroxidase - 100µL
• Tampão fosfato de potássio
Fosfato dissódico anidro – 11,46g
Na
2
HPO
4
.7H
2
O – 21,57g
Fosfato monopotássio – 2,65g
128
Água destilada q.s.p 1L
Acertar pH 7,2
• Teste imunoenzimático ELISA de captura
As soluções preparadas para a realização do ELISA estão descritas a seguir:
Carbonato de sódio 0,1M
NaHCO
3
– 8,4g
Na
2
CO
3
– 3,56
Água mili-Q q.s.p 1L
pH 9,5
Fosfato de sódio 0,2M
Na
2
HPO
4
– 11,8g
NaH
2
PO
4
– 16,1g
Água mili-Q q.s.p 1L
pH 6,5
Diluente de ensaio
PBS* com 10% de soro fetal bovino
Tampão de lavagem
PBS* com 0,05% de Tween 20
Solução de parada
H
2
PO
4
– 11,22 mL
Água mili-Q q.s.p 100mL
• Tioglicolato 3%
Colocar 3g do meio em 100mL de água destilada. Distribuir em tubos e
autoclavar.
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