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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
A INFLUÊNCIA DO ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL SOBRE
O PREJUÍZO COMPORTAMENTAL, BIOQUÍMICO E
MORFOLÓGICO CAUSADO PELA HIPÓXIA-ISQUEMIA
NEONATAL EM RATOS
LENIR ORLANDI PEREIRA SILVA
Porto Alegre
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNICAS
A INFLUÊNCIA DO ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL SOBRE
O PREJUÍZO COMPORTAMENTAL, BIOQUÍMICO E
MORFOLÓGICO CAUSADO PELA HIPÓXIA-ISQUEMIA
NEONATAL EM RATOS
LENIR ORLANDI PEREIRA SILVA
Tese apresentada como requisito parcial à
obtenção do título de Doutora em Neurociências
pelo Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas: Neurociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Alexandre Netto
Porto Alegre
2007
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3
"Algo é só impossível até que alguém duvide
e acabe provando o contrário."
Albert Einstein
4
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, a agradeço a Deus por ter tanto o que e para quem
agradecer.
À primeira pessoa que me recebeu na UFRGS, abriu as portas desta Instituição,
propiciou-me o importante exercício da independência na pós-graduação e
compartilhou comigo sua vasta experiência tanto no saber quanto no conviver. Ao
Mestre Alex, com carinho, obrigada por tudo!
A uma importante colaboradora deste trabalho, não muito paciente, mas sempre
presente, e muito mais que o “Gênio da Histologia”... Profa. Matilde agradeço pela
colaboração em todos os momentos e pelo carinho de sempre!
A uma colaboradora especial, orientadora profissional e emocional presente
nestes 4 anos, e, acima de tudo, a uma grande amiga, para todas as horas. Obrigada
querida amiga Ionara! Ah, aproveito para pedir desculpas ao Tuti e à Marina, pelo
“aluguel” da esposa e mãe.
Aos membros da banca, fico grata pelas contribuições. Ao Prof. Marcellino, pelas
trocas de experiências sobre a estimulação; à Profa. Ângela, por todos os bons fluidos
partilhados e, ao Prof. Aldo, o meu “ídolo” na Neurociência, por ser um belo exemplo a
ser seguido.
À minha antecessora, que me passou os cuidados da HI e deu as primeiras
orientações na familiarização com o laboratório, mas que, muito além disso, tornou-se
uma verdadeira amiga. Sua louca... Nice, obrigada por tudo!
E, um agradecimento especial. Não só agradecerei pela contribuição nos
trabalhos desta, mas muito, muito mais que isso, por me permitirem a experiência da
orientação, sempre com muita paciência, disposição e respeito. Obrigada à Ruth, ao
Anderson, à Paty e ao Ata, alunos IC destaque neste trabalho!
Aos companheiros do grupo (“isquêmicos”, “lesionados”, indecisos, todos!),
agradeço por estarem presentes, seja num dia de experimento, num seminário, na hora
do cafezinho, nos congressos ou na troca de experiência do dia-a-dia. Especialmente, à
amiga catarinense Fernanda, que, juntamente comigo, fez crescer a população de
migrantes e defensores do mais belo estado do Brasil!
5
Aos colegas do grupo do Estresse: Profa Carla e Ana Paula, as anfitriãs do
grupo; à dupla do L, Luísa e Léo, sempre carinhosos, presentes e muito sorridentes; e à
nova geração, “liderada” pela Letícia e Willian, obrigada pelo quase sempre harmonioso
convívio e pelo exercício de dividir.
Aos colegas e professores do PPG Neuro! Agradeço a todos porque foram
muitas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a minha formação e também
para que bons momentos ficassem guardados na lembrança...
Agradeço também ao CNPq, CAPES e UFRGS.
À minha família de Porto Alegre, que me adotou com muito carinho e que, em
muitos momentos, prestou importante colaboração para a execução desta tese
(transporte de ratos, uso do micro em momento de desespero, etc). Vó, sogro, sogra,
Ricardo e Lizandra, obrigada pela disposição em sempre estar prontos para ajudar!
Agora parece ser um bom momento para eu agradecer a minha herança! “Filhas,
a herança que a gente deixa para vocês é o estudo. Aproveitem!” Eu fiz 30 anos e
continuo estudando; levei a sério a célebre frase do meu pai! Obrigada aos meus pais,
minhas irmãs, cunhado e meus fofos sobrinhos por me estimularem, amarem e por
estarem sempre comigo!
E, finalmente, agradeço ao meu Amor por tudo! É um tudo tão extenso que talvez
só seja comparável à importância deste gaúcho da minha vida. O Nando talvez seja o
primeiro responsável por esta tese, já que foi ele que me trouxe para mais perto do
“minuano”. Querido, obrigada por todo o companheirismo, que foi desde o “podes dar
uma olhadinha no gás durante a hipóxia ou nos ratos durante o enriquecimento?”,
“vamos limpar estas lâminas juntos para acabar mais rápido?” até a impressão desta
tese! Juro que vou tentar entender um pouco de psicologia e te ajudar na dissertação...
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................... 7
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................9
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................................10
RESUMO........................................................................................................................ 11
ABSTRACT.................................................................................................................... 12
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 13
1.1 Hipóxia-isquemia encefálica: mecanismos neuropatológicos ............ 14
1.2 Hipóxia-isquemia encefálica: o modelo experimental de Levine-Rice..18
1.3 Enriquecimento Ambiental ...................................................................... 20
1.4 Hipóxia-isquemia e intervenções comportamentais/ambientais ..........25
2 OBJETIVO...................................................................................................................28
2.1 Objetivo Geral............................................................................................29
2.2 Objetivos Específicos................................................................................29
3 RESULTADOS.............................................................................................................30
4 DISCUSSÃO GERAL...................................................................................................32
5 CONCLUSÕES..........................................................................................................45
6 PERSPECTIVAS....................................................................................................... 47
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 49
7
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1 – Esquema do funcionamento da sinapse glutamatérgica..................................4
Figura 2 - Procedimento modificado de Levine; que utiliza a combinação de hipóxia e
isquemia.........................................................................................................8
Figura 3 – Esquema ilustrando os efeitos sensoriais, cognitivos, motores e sociais da
exposição de ratos ao ambiente enriquecido...............................................11
Figura 4 – Sessões coronais representativas do efeito da HI e da estimulação tátil
(TS).............................................................................................................. 14
CAPÍTULO 1
Figura 1 – Desenho experimental................................................................................22
Figura 2 – Performance no protocolo de memória de referência no labirinto
aquático........................................................................................................23
Figura 3 – Teste do protocolo de memória de referência................................................24
Figure 4 – Performance no protocolo de memória de trabalho......................................24
Figura 5 – Medida do volume hipocampal.......................................................................25
CAPÍTULO 2
Figura 1 – Índice de preferência no teste de reconhecimento de objetos.......................54
8
Figura 2 – Performance de ratos e ratas adolescentes no protocolo de memória de
referência......................................................................................................55
Figura 3 – Performance de ratos e ratas adultos no protocolo de memória de
referência………………………………………………………………………….56
Figura 4 – Performance de ratos e ratas adolescentes no protocolo de memória de
trabalho……………………………………………………………………………57
Figura 5 – Performance de ratos e ratas adultos no protocolo de memória de
trabalho…………………………………………………………...……………….58
Figura 6 – Medida do volume hipocampal.......................................................................59
CAPÍTULO 3
Figura 1 – Efeitos do enriquecimento ambiental sobre os níveis de radicais livres (DCF)
em hipocampo e córtex de ratos hipóxico-isquêmicos.................................85
Figura 2 – Efeitos do enriquecimento ambiental sobre a atividade da SOD em
hipocampo e córtex de ratos hipóxico-isquêmicos.......................................86
Figura 3 – Efeitos do enriquecimento ambiental sobre os níveis de BDNF em hipocampo
e córtex de ratos hipóxico-isquêmicos.........................................................87
9
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1 – Correlações de Spearman.............................................................................25
Tabela 2 – Área cortical...................................................................................................25
CAPÍTULO 2
Tabela 1 – Área do estriado em animais hipóxico-isquêmicos estimulados em ambiente
enriquecido...................................................................................................60
CAPÍTULO 3
Tabela 1 – Níveis de TBARS em hipocampo e córtex frontal..........................................88
10
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de variância
BDNF Fator neurotrófico derivado do encéfalo
Ca
+2
Íon cálcio
CA1 Subcampo 1 do corno de Ammon
CT Grupo controle
DCF 2’,7’ diclorofluoresceína
DCF-DA Diacetato de 2’,7’diclorofluoresceína
DCFH 2’,7’ diclorofluoresceína (forma reduzida)
EA Enriquecimento ambiental
HI Hipóxia-isquemia
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
LPO Lipoperoxidação
MDA Malondialdeído
N
2
Nitrogênio
NMDA N-metil-D-aspartato
O
2
Oxigênio molecular
O
•
2
Radical superóxido
SOD Superóxido dismutase
TBA Ácido tiobarbitúrico
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido tricloroacético
11
RESUMO
O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do enriquecimento ambiental (EA)
sobre a memória e a morfologia hipocampal, estriatal e cortical, estado oxidativo e
níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF), em ratos Wistar submetidos à
hipóxia-isquemia (HI) neonatal. No capítulo 1 foram examinados os efeitos do EA sobre
o prejuízo na memória observado no labirinto aquático de Morris (LAM) e sobre a atrofia
hipocampal e cortical em animais hipóxicos-isquêmicos adultos. Ratos Wistar machos,
no 7º dia pós-natal (DPN) foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal,
no qual a artéria carótida comum direita é ocluída permanentemente e, na seqüência,
os animais foram mantidos em uma atmosfera hipóxica (90 min, 8% O2-92% N2). Duas
semanas após a HI, os animais foram estimulados em um ambiente enriquecido (1h/dia,
por 9 semanas). No LAM, os animais HI mantidos em ambiente padrão apresentaram
pior performance quando comparados aos grupos CT e o grupo HI enriquecido teve
mesmo comportamento que os grupos CT. Uma significante atrofia hipocampal e
cortical foi identificada nos animais hipóxico-isquêmicos, porém, nesta análise, o EA
não resultou em proteção significativa. O capítulo 2 teve como intuito investigar se a
manutenção em ambiente enriquecido precocemente (8º-30 DPN) seria efetiva na
recuperação da atrofia hipocampal pela HI, e, se os efeitos cognitivos vistos no EA
diário seriam extensivos a outro tipo de memória e, também a outros períodos do
desenvolvimento. Ratos e ratas Wistar machos foram submetidos à HI (conforme
descrito acima) e, no dia seguinte, foram colocados em um ambiente enriquecido. Na
seqüência, a memória de reconhecimento, no teste de reconhecimento de objetos e a
memória espacial no LAM são analisadas. Na vida adulta, os animais foram submetidos
a mais uma sessão experimental no LAM. O déficit cognitivo observado na memória de
reconhecimento nos animais HI foi revertido pela estimulação. Porém, o prejuízo na
memória espacial foi parcialmente revertido pelo EA; a memória de trabalho nas
fêmeas, no período da adolescência, foi mais claramente beneficiada por este efeito. E,
corroborando os resultados do primeiro experimento, a HI resultou em dano tecidual ao
hipocampo e também ao estriado, sem indicação de efeito significativo pela
estimulação. O capítulo 3 teve como objetivo investigar se a modulação do estado
oxidativo e os níveis de BDNF cerebrais podem estar envolvidos no efeito neuroprotetor
cognitivo do EA em animais adultos submetidos à HI. Ratos Wistar machos foram
utilizados neste experimento; os procedimentos de HI e EA foram os mesmos do
primeiro experimento. Os animais foram sacrificados 24 horas após o término do
período de enriquecimento (85º DPN), quando hipocampo e córtex foram dissecados
para a posterior determinação dos parâmetros de estresse oxidativo (quantificação de
radicais livres, dano em macromoléculas e atividade da enzima superóxido dismutase -
SOD) e dos níveis de BDNF. Os resultados demonstraram uma diminuição na
quantidade de radicais livres no hipocampo esquerdo dos animais HI e um aumento
destes níveis no córtex direito; e, também, um aumento na atividade da SOD no
hipocampo direito dos animais HI e uma diminuição desta atividade no hipocampo
esquerdo nos animais não estimulados. Além disso, os níveis de BDNF foram
aumentados no hipocampo dos animais HI mantidos em ambiente padrão. Estes
resultados sugerem que o efeito neuroprotetor cognitivo do EA diário pode não ser
dependente da expressão de BDNF nem do estado oxidativo do hipocampo e córtex.
12
ABSTRACT
This study was undertaken to investigate the environmental enrichment (EE) effects
over memory function and hippocampus and cortex morphology, oxidative status and
brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels, consequent to neonatal hypoxia-
ischemia (HI) in Wistar rats. The objective of chapter 1 was to examine, in adulthood,
the effects of daily EE on memory deficits in the Morris water maze (MWM) and
hippocampal and cerebral damage, caused by neonatal HI. Male wistar rats at the 7
th
postnatal day were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI, comprising
permanent occlusion of the right common carotid artery and a period of hypoxia (90 min,
8%O
2
-92%N
2
). Two weeks after the HI event, animals were stimulated by the enriched
environment (1h/day for 9 weeks). In the MWM, non-stimulated HI animals had worse
performance than controls and HI-enriched rats showed memory performance as good
as that of controls. There was a reduction of both hippocampal volume and cortical area,
ipsilateral to arterial occlusion, in HI animals; EE did not affect these morphological
measurements, despite its clear cognitive neuroprotective effect. The chapter 2
investigated whether early continuous housing in an enriched environment would be
effective in recovering hippocampal atrophy consequent to the neonatal HI, as well as if
the benefits of continuous EE would extending to other memory types, both in adult and
adolescent female and male rats. As described above, animals were submitted to HI
and, starting 1day after the event, they were housed in an enriched environment (8
th
-30
th
PN day). Performances of animals in the novel-object recognition were assessed in the
adolescence period and in the MWM task in the adolescence and, again, in adulthood.
Cognitive deficits arising after neonatal HI in the novel-object recognition test were
completely recovered by the environmental stimulation, in animals of both genders.
However, spatial memory impairment in the MWM was partially prevented by EE; the
effect was observed especially in female adolescent rats on the working memory.
Corroborating the findings of the first experiment, there was no enrichment effect over
hippocampus volume and striatum area. These data indicate that early housing in an
enriched environment recovered performance in the object recognition task and, in
adolescent females, in the working memory spatial task after a neonatal hypoxic-
ischemic event. No effects of enrichment were revealed in adult animal performance nor
in tissue atrophy of hippocampus and striatum consequent to HI. The chapter 3 was
designed to investigate whether the modulation of brain oxidative status and/or BDNF
content in adulthood are involved in functional neuroprotection caused by EE after
neonatal HI. Protocols of the HI and EE utilized in this experiment were the same as of
the first experiment. Male rats were sacrificed 24 hours after the enrichment period, i.e.,
at PN day 85. We have determined BDNF levels and several oxidative stress
parameters, specifically the free radicals levels, macromolecules damage and
superoxide dismutase (SOD) activity, in hippocampus and frontal cortex samples. It was
found a decrease in free radical content in the left hippocampus of HI animals and an
increase in non-stimulated rats in the right cortex; also, increased SOD activity in the
right hippocampus of HI and a decrease of enzyme activity in the left hippocampus of
stimulated groups were found. Moreover, BDNF levels were increased in the
hippocampus of the non-stimulated HI group. These results suggest that the
neuroprotective cognitive effect of daily environmental enrichment may not be
dependent on BDNF expression nor on the oxidative status in hippocampus and cortex.
13
1 INTRODUÇÃO
14
A hipóxia-isquemia (HI) encefálica é a maior causa de mortalidade aguda e de
morbidade neurológica crônica que ocorre em recém-nascidos, e pode ser
conseqüência de vários processos patológicos, como asfixia intra-uterina severa e
outras complicações da gravidez e do parto (BERGER & GARNIER, 1999). Estimativas
recentes da Organização Mundial de saúde indicam que dos 37% de casos de
mortalidade infantil antes dos 5 anos de idade, 23% são relacionados com asfixia
perinatal (DURAN et al., 2007). Há evidências de que a epilepsia, a paralisia cerebral e
deficits cognitivos e motores, entre outros, podem estar associados a eventos hipóxico-
isquêmicos no período neonatal (THORNGREN-JERNECK et al., 2004; LINDSTROM et
al., 2006). Os prejuízos cognitivos e motores são de grande importância clínica,
podendo interferir nas atividades do cotidiano e resultar em total dependência para as
atividades da vida diária (GILLBERG, 2003).
1.1 Hipóxia-isquemia encefálica: mecanismos neuropatológicos
Diferentes mecanismos estão relacionados com a hipóxia-isquemia neonatal:
menor perfusão sistêmica devida a hipovolemia, diminuição do aporte sangüíneo do
parênquima cerebral, com conseqüente déficit energético, e peroxidação de
macromoléculas biológicas por geração de radicais livres gerados durante a reperfusão
dos tecidos (SAUGSTADT, 1996). No encéfalo, os processos patológicos relacionados
com a HI envolvem principalmente a excitotoxicidade glutamatérgica, o estresse
oxidativo e a inflamação (MISHRA & DELIVORIA-PAPADOPOULOS, 1999; MCLEAN &
FERRIERO, 2004).
A excitotoxicidade, como mecanismo de dano neuronal, é desencadeada a
partir de um desequilíbrio entre a liberação e a recaptação de glutamato. Este
15
neurotransmissor excitatório, ao ser liberado pelas vesículas pré-sinápticas, atua sobre
receptores pós-sinápticos, a saber: N-metil-D-aspartatto (NMDA), a-amino-3-hidroxi-5-
metil-4-isoxazolproprionato (AMPA) e cainato. Esta atividade glutamatérgica na fenda
sináptica é regulada por astrócitos, os quais têm o importante papel de remover
rapidamente o glutamato e convertê-lo em glutamina, substância que é restituída ao
neurônio para novamente ser convertida à glutamato (MAGISTRETTI et al. 1999). Este
mecanismo de recaptação do glutamato requer um gasto energético e,
conseqüentemente, sofre prejuízo na presença de falência energética (Figura 1).
A hipóxia-isquemia, por alterar tanto a produção de ATP quanto a glicogenólise,
implica em desequilíbrio na neurotransmissão glutamatérgica. A recaptação ineficiente
do glutamato resulta na manutenção prolongada deste neurotransmissor na fenda
sináptica e, subseqüentemente, em maior ativação dos receptores pós-sinápticos. O
receptor NMDA, que é super-expressado no encéfalo em desenvolvimento, permite o
influxo dos íons Na
+
e Ca
+
e também de água em quantidades excessivas ao neurônio
pós-sináptico. A água e o Na
+
desencadeiam a morte celular por necrose e o aumento
intracelular dos níveis de Ca
+
resulta em disfunção
mitocondrial, falência energética,
ativação de proteases e de fosfolipases, que vão culminar com a morte neuronal por
apoptose (MCLEAN & FERRIERO, 2004).
16
Figura 1 – Esquema do funcionamento da sinapse glutamatérgica.
A condição hipóxico-isquêmica também altera o metabolismo energético das
células. A tensão tecidual de oxigênio é expressivamente reduzida causando uma
ineficiência da respiração mitocondrial e da produção de ATP pela fosforilação
oxidativa. Assim, é estimulada a glicólise anaeróbica com aumento na produção de
lactato, fato que precede o desenvolvimento de dano encefálico (KRISTIAN, 2004). O
aumento nos níveis de radicais livres é apontado como desencadeador de dano aos
componentes mitocondriais e, ainda, pode ser responsável pela inibição da citocromo c
oxidase, um importante marcador do metabolismo aeróbico (CADENAS & DAVIES,
2000 e SHARPE & COOPER, 1998).
Espécies reativas de oxigênio, tais como o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), o
ânion superóxido, e os radicais hidroxil e peroxil, são continuamente produzidos como
subproduto do metabolismo energético. Devido a sua alta reatividade, as espécies
17
radicalares atuam sobre as moléculas constitutivas das células causando prejuízos
funcionais importantes. Em contrapartida, existem mecanismos de defesa antioxidante
responsáveis pela inibição e redução das lesões causadas pelos radicais livres nas
células. Esses mecanismos podem ser enzimáticos: a superóxido dismutase (SOD) que
converte radicais superóxido em H
2
O
2
; a catalase (CAT) que é responsável pela
metabolização do H
2
O
2
; e a glutationa peroxidase (GPx) que remove os radicais peroxil
dos peróxidos. Atividades antioxidantes não enzimáticas, exercidas pelas vitaminas E e
C e pela glutationa, também desempenham papel importante nos mecanismos de
defesa antioxidante (HALLIWELL, 1992). Na HI, ocorre alteração funcional e estrutural
das mitocôndrias, o que vem a resultar em acúmulo de radicais livres. E, como principal
implicação do desequilíbrio entre a produção de radicais livre e a atividade antioxidante
também ocorre excitotoxicidade, com dano e possível morte celular, conseqüente à
peroxidação lipídica, destruição protéica e danos ao DNA (FERRIERO, 2001).
O encéfalo exibe uma resposta imune adaptativa na presença da HI. Esta
envolve a liberação de citocinas pela microglia, as quais são mediadoras da resposta
inflamatória, e está associada a maior lesão tecidual após um evento hipóxico-
isquêmico (MCLEAN & FERRIERO, 2004). Foi descrito que a expressão de
interleucina (IL)-1 aumentou após a HI neonatal e que a administração de antagonistas
do receptor da IL-1 reduziu o dano encefálico (GROW & BARKS, 2002). No entanto, o
mecanismo pelo qual os mediadores inflamatórios influenciam a patogênese da HI
permanece desconhecido. Um indicativo do mecanismo envolvido nas conseqüências
da inflamação pela HI é a ação da microglia. As células da microglia, quando ativadas
pelo evento hipóxico-isquêmico, além da liberação de citocinas estimulam também a
18
liberação de glutamato, radicais livres e óxido nítrico. Desta forma, a inflamação seria
mais um fator a contribuir para a excitotoxicidade e morte celular (WOOD, 1995).
O resultado desses eventos é a lesão tecidual por morte celular; no caso da HI,
o principal alvo encefálico são as células piramidais do hipocampo, especialmente da
região CA1, visto que essas células apresentam vulnerabilidade seletiva ao dano
isquêmico (ITO et al., 1975; PULSINELLI et al., 1982).
1.2 Hipóxia-isquemia encefálica: o modelo experimental de Levine-Rice
O interesse no estudo da encefalopatia hipóxico-isquêmica, sua fisiopatologia e
o desenvolvimento de estratégias terapêuticas serviu como motivação para o
desenvolvimento e o aprimoramento de modelos experimentais. O modelo atualmente
mais utilizado para o estudo da HI neonatal em roedores é aquele proposto por Levine
(1960) e modificado por Rice e colaboradores (1981). Este consiste na associação de
uma isquemia unilateral, ou seja, na ligação unilateral da artéria carótida comum
de um dos lados, seguida de hipóxia sistêmica produzida pela inalação de uma
mistura gasosa contendo apenas 20 % de oxigênio, por determinado período de
tempo (vide Figura 2; RICE et al., 1981; VANNUCCI & VANNUCCI, 2005).
O procedimento experimental é realizado aos 7 dias de vida pós-natal
porque o encéfalo de roedores com 7 dias de idade corresponde, em nível de
desenvolvimento, ao encéfalo dos humanos ao nascimento quando a camada
neuronal do córtex está completa, a matriz germinativa está involuída e a
substância branca sofreu pouca mielinização (VANNUCCI et al, 1997).
19
O modelo de HI em ratos de 7 dias apresenta muitas vantagens: é altamente
reproduzível, de baixo custo, possui baixa mortalidade, produz injúria cerebral em 90%
dos ratos e permite a recuperação do fluxo sangüíneo, mesmo com a oclusão da
carótida. Pela natureza progressiva da hipóxia/isquemia, são encontrados alterações no
fluxo sangüíneo e desarranjos metabólicos celulares similares aos observados na
injúria cerebral perinatal humana, causando dano localizado no córtex cerebral, no
estriado, no hipocampo e no tálamo, regiões cerebrais freqüentemente afetadas após
asfixia severa em humanos (WALTON et al, 1999). O dano encefálico é geralmente
encontrado limitado ao hemisfério ipsilateral à isquemia, onde é freqüentemente
observada diminuição do número celular, da arborização dendrítica e do número de
espinhos dendríticos, bem como atrofia tecidual (DUMAN et al., 2004; XIA et al., 2005).
Além disso, déficits mnemônicos são observados no labirinto aquático de Morris (ALMLI
et al., 2000; MCAULIFFE et al., 2006), labirinto radial de 8 braços (MISHIMA et al.,
2005) e esquiva inibitória (ARTENI et al., 2003) em animais submetidos ao modelo de
Levine-Rice. Há evidências de que os déficits observados no labirinto aquático podem,
em parte, ser devidos à perda dos neurônios da região CA1 do hipocampo resultante da
diminuição do aporte sangüíneo para esta região (NUNN et al., 1994; OLSEN et al.,
1994).
20
Figura 2 - Procedimento modificado de Levine; que utiliza a combinação de hipóxia e
isquemia.
1.3 Enriquecimento Ambiental
É sabido que a estimulação no período neonatal pode afetar o comportamento
e as respostas endócrinas, além de ter um efeito positivo sobre o processo de
envelhecimento, protegendo o hipocampo da perda neuronal e das disfunções
relacionadas à idade (MOHAMMED et al., 1993). No caso da hipóxia-isquemia
neonatal, que é acompanhada pela diminuição dos níveis de receptores de
glicocorticóides no hipocampo, a estimulação tátil nas primeiras semanas de vida pós-
natal provoca um aumento no número destes receptores em animais adultos (MEANEY
37
o
C
Hipóxia Sistêmica:
exposição durante
90 min a uma
atmosfera com 8%
O
2
e 92% N
2
Isquemia Unilateral:
ligação permanente da artéria
carótida comum direita
21
& AITKEN, 1985), estimula a neurogênese hipocampal pós-natal (WARSHLAK &
WEINSTOCK, 1990) e previne a atrofia hipocampal (RODRIGUES et al. 2004). Por
outro lado, no caso da isquemia cerebral em animais adultos, diversas alterações
hipocampais adaptativas têm sido encontradas, tais como, re-estruturação dendrítica
(BIERNASKI & CORBETT, 2001), sinaptogênese reativa (HOMER et al., 1996) e
neurogênese aumentada (YAGITA et al., 2001), evidenciando a presença de uma
plasticidade sináptica estimulada pelo dano encefálico. Estas mudanças, segundo
Briones e colaboradores (2004), podem sinalizar que o encéfalo lesado tornar-se mais
sensível aos efeitos de um treino comportamental, visto que já experienciou mudanças
adaptativas prévias. No dano pela HI neonatal, talvez, este mesmo efeito possa
também ocorrer, o que justifica em parte, a importância da estimulação comportamental
precoce.
O enriquecimento ambiental (EA) é definido como uma combinação de
interação social, exercícios físicos e exposição continuada a “possibilidades de
aprendizagem” que, segundo Krech e colaboradores (1960), pode alterar a estrutura e
função do encéfalo de roedores. Na literatura, o ambiente enriquecido tem sido referido
a condições de moradia em caixas ou câmaras exploratórias, onde há a facilitação da
estimulação sensorial, cognitiva e motora (vide Figura 3; NITHIANANTHARAJAH &
HANNAN, 2006). Para isto, são utilizadas caixas-moradia maiores do que as caixas-
padrão de laboratório, o número de animais mantidos no ambiente enriquecido também
é maior e ainda, objetos para exploração e outros que possibilitem atividade física
(rodas, rampas) fazem parte do ambiente enriquecido. Em estudos com animas com
dano encefálico, a exposição ao enriquecimento ambiental pode desempenhar papel
22
importante na plasticidade neuronal hipocampal e, também, melhorar as funções
cognitivas afetadas (VAN PRAAG et al., 2000).
O protocolo da estimulação por EA é variável. Geralmente, há variações no
tamanho das caixas, na composição, duração, complexidade social e de estímulos por
objetos, e na freqüência da troca de objetos. Alguns trabalhos utilizam a manutenção
permanente dos animais no ambiente enriquecido após um evento isquêmico, enquanto
outros também utilizam a estimulação prévia (BIERNASKIE & CORBETT, 2001;
BELAYEV et al., 2003). Ainda, existem estudos que utilizam a manutenção permanente
no ambiente, enquanto outros utilizam um protocolo de estimulação durante um
determinado período do dia (RAMPON et al.,2000; Frick & FERNANDES, 2003;
GOBBO & MARA, 2004). Esta variedade de protocolos de estimulação acaba por
dificultar a discussão e a comparação dos efeitos do enriquecimento ambiental sobre os
mais diversos aspectos avaliados (BENNETT et al., 2005).
Diversos estudos têm demonstrado que o córtex cerebral de animais
acondicionados em um ambiente enriquecido apresenta maior espessura, em
comparação com animais que vivem em condições padrão. Este efeito cortical pode
ocorrer por inúmeros fatores, dentre eles, aumento do soma neuronal, do número e
comprimento dos dendritos, bem como do número de espinhas dendríticas (DIAMOND
et al., 1964). Recentemente, estes achados foram corroborados por estudos que
demonstram que o EA pode influenciar a recuperação após um evento isquêmico,
induzindo mudanças estruturais no córtex contralateral, com aumento na densidade dos
espinhos dendríticos e do número de neurônios no giro denteado (HOHANSSON, 1996;
TUOR et al., 2001, PUURUNEN et al., 2001, JOHANSSON & BELLCHENKO, 2002).
23
Figura 3 – Esquema ilustrando os efeitos sensoriais, cognitivos, motores e sociais da
exposição de ratos ao ambiente enriquecido (NITHIANANTHARAJAH & HANNAN,
2006).
Belayev e colaboradores (2003) verificaram que ratos expostos a um EA por
duas semanas antes e 6 dias após um evento isquêmico mostraram maior preservação
das células piramidais da região CA1 do hipocampo em relação a animais não expostos
ao EA. Outro estudo demonstrou que os neurônios piramidais das camadas II e III do
córtex do hemisfério não lesado em ratos isquêmicos expostos ao EA apresentavam
maior número de espinhas dendríticas, em comparação com animais mantidos em um
ambiente padrão (JOHANSSON & BELICHENKO, 2002).
O EA também pode causar mudanças neuroquímicas. Em estudo recente foi
verificado que o fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) teve seus níveis
aumentados em ratos que viveram em um ambiente enriquecido, comparando-se com
animais que viveram em condições padrão (GOBBO & O’MARA, 2004). Os fatores
neurotróficos controlam as vias de sinalização intra e intercelular que formam os
24
circuitos neuronais durante o desenvolvimento e regulam a plasticidade bem como a
sobrevivência neuronal, o crescimento axonal e a neurotransmissão no encéfalo adulto
(MATTSON et al., 2004).
O BDNF tem sido proposto como importante fator relacionado com os efeitos
neuroprotetores do EA. Está bem estabelecido na literatura que ocorre um aumento dos
níveis de BDNF após um período de estimulação em ambiente enriquecido
(NITHIANANTHARAJAH & HANNAN, 2006; ZHU et al, 2006). Tem-se ainda
evidenciado a íntima relação da neurogênese hipocampal com os níveis de BDNF
(Rossi et al., 2006). Além das alterações estruturais e funcionais do encéfalo, a
estimulação ambiental é também considerada importante para atenuar déficits
cognitivos e preservar a integridade tecidual após lesão cerebral em ratos (PASSINEAU
et al., 2001). Estudos têm demonstrado que ratos mantidos em um ambiente
enriquecido após evento isquêmico tiveram melhor aquisição no teste do labirinto
aquático de Morris após um período de ambientação (PUURUNEN et al., 1997,
PUURUNEN et al., 2001, JOLKKONEN et al., 2003, BRIONES et al., 2000) além de
apresentarem melhor performance no labirinto radial (LEGGIO et al., 2005), e no
labirinto radial motivado pelo escape da água (BENNETT et al., 2005).
Existem também evidências da interação entre os efeitos protetores do
enriquecimento ambiental e o estresse oxidativo. Um estudo relacionou a melhora
cognitiva e motora em ratos velhos pelo enriquecimento com a simultânea diminuição
do estresse oxidativo (FERNÁNDEZ et al, 2004). Este resultado sugere mais um
possível mecanismo de ação do enriquecimento ambiental.
25
Ainda, o aumento dos níveis de sinaptofisina foi relatado juntamente com
recuperação da memória em ratos velhos mantidos em ambiente enriquecido (FRICK &
FERNANDEZ, 2003). A sinaptofisina é uma proteína pré-sináptica ligante de cálcio
localizada nas membranas das vesículas pré-sinápticas que contêm
neurotransmissores. Reduções nos níveis de sinaptofisina têm sido associadas ao dano
cognitivo pelo envelhecimento e também em quadros neuropatológicos (LIU et al.,
1996).
1.4 Hipóxia-isquemia e intervenções comportamentais/ambientais
Alguns estudos avaliaram o impacto de experiências precoces sobre a função
cognitiva e as respostas comportamentais ao estresse em animais que passaram por
um insulto biológico. O primeiro deles, que investigou o efeito de intervenções
comportamentais em animais hipóxico-isquêmico, foi publicado em 2002
(FERNÁNDEZ-TERUEL et al). Entre as conclusões desse trabalho, ressalta-se o efeito
cognitivo benéfico nos animais hipóxico-isquêmicos submetidos à separação de curto
período durante o período neonatal. Um trabalho recente do nosso grupo de pesquisa
analisou o efeito morfológico de um outro tipo de manipulação, a estimulação tátil, em
ratos HI. A estimulação tátil por um período de 10 minutos do oitavo ao vigésimo
primeiro dia pós-natal resultou em recuperação da atrofia hipocampal consequente à HI
(Figura 4; RODRIGUES et al, 2004).
26
Figura 4 – Sessões coronais representativas do efeito da HI e da estimulação tátil (TS).
É possível observar a recuperação da atrofia hipocampal pela TS (HI+ST) em
comparação com o grupo de animais não estimulados –HI (modificado de RODRIGUES
et al., 2004).
Há também um bom número de trabalhos acerca dos efeitos do EA sobre o
dano encefálico isquêmico em modelos animais adultos (JOHANSON, 1996; GOBBO &
MARA, 2004). Porém, para nosso conhecimento, não existem estudos verificando o
papel deste tipo de estímulo ambiental sobre um dano encefálico causado por um
evento hipóxico-isquêmico neonatal. A proporção que se estabelece em relação ao
número de estudos com dano isquêmico no adulto e a HI neonatal não é diretamente
27
proporcional à incidência e a morbi-mortalidade desta patologia, visto que nascem,
ainda hoje, muitas crianças que sofrem por toda a vida as conseqüências do dano
encefálico isquêmico perinatal.
Logo, nesta Tese decidimos investigar as conseqüências da estimulação pelo
enriquecimento ambiental em animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal.
Considerando-se a abordagem que será utilizada neste estudo, a hipótese de trabalho
é que o enriquecimento ambiental poderá causar efeitos neuroprotetores cognitivos e
morfológicos sobre as conseqüências deletérias da hipóxia-isquemia. Alguns dos
possíveis mecanismos relacionados com os efeitos supracitados serão investigados,
com o intuito de contribuir para o conhecimento dos aspectos moleculares e funcionais
envolvidos na estimulação ambiental.
28
2 OBJETIVO
29
2.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste estudo é verificar o efeito de distintos protocolos de
enriquecimento ambiental sobre: (1) memória espacial, (2) memória de reconhecimento,
(3) morfologia encefálica, (4) estado oxidativo e (5) níveis de BDNF hipocampal, em
ratos submetidos a um evento hipóxico-isquêmico no período neonatal.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Analisar, no período adulto, o comportamento no labirinto aquático de
Morris e mensurar o volume hipocampal e a área cortical de ratos machos
submetidos à hipóxia-isquemia neonatal e estimulados em ambiente
enriquecido diariamente, duas semanas após a HI, durante 9 semanas;
2.2.2 Avaliar, nos períodos da adolescência e da vida adulta, o comportamento
no teste de reconhecimento de objetos e no labirinto aquático de Morris e
analisar o volume hipocampal e a área estriatal de ratos machos e fêmeas
submetidos à hipóxia-isquemia neonatal e mantidos em ambiente
enriquecido do oitavo ao trigésimo dia de vida pós-natal;
2.2.3 Mensurar, no período adulto, alguns parâmetros de estresse oxidativo e
de BDNF em hipocampo e córtex de ratos machos submetidos à HI
neonatal e estimulados em ambiente enriquecido diário, desde o
desmame até a idade adulta.
30
3 RESULTADOS
31
Os resultados desta Tese serão apresentados na forma de artigos que relatam
os experimentos relacionados aos objetivos específicos.
3.1 Capítulo 1 (Objetivo 2.2.1)
“Effects of daily environmental enrichment on memory defcits and brain injury
following neonatal hypoxia-ischemia in the rat.”
(Pereira, L. O., Arteni, N. S., Petersen, R. C., Da Rocha, A. P., Achaval, M., &
Netto, C. A.. Effects of daily environmental enrichment on memory deficits and brain
injury following neonatal hypoxia-ischemia in the rat. Neurobiology of Learning and
Memory, 87: 101-108, 2007)
3.2 Capítulo 2 (Objetivo 2.2.2)
“Effects of early environmental housing after hypoxia ischemia in the neonatal rat.”
Lenir Orlandi Pereira, Atahualpa Cauê Paim Strapasson, Patrícia Machado Nabinger,
Matilde Achaval, Carlos Alexandre Netto
(a ser submetido para publicação)
3.3 Capítulo 3 (Objetivo 2.2.3)
“Long-term effects of environmental stimulation following hypoxia-ischemia on
the oxidative state and BDNF levels in rat hippocampus and frontal cortex.”
Lenir Orlandi Pereira, Patrícia Nardin, Patrícia Machado Nabinger, Atahualpa Cauê
Paim Strapasson, Carlos Alberto Saraiva Gonçalves, Ionara Rodrigues Siqueira
1,3
,
Carlos Alexandre Netto
(a ser submetido para publicação)
32
4 DISCUSSÃO GERAL
33
Esta tese teve como objetivo geral estudar as conseqüências do enriquecimento
ambiental sobre parâmetros comportamentais, morfológicos e bioquímicos
apresentados após um evento hipóxico-isquêmico no período neonatal em ratos. O
enfoque comportamental é voltado para a memória, por ser esta uma importante função
encefálica que permite ao indivíduo se adaptar ao ambiente, construir sua própria
história e, por último, fazer parte e construir a cultura de uma população (BENFENATI,
2007). Além disso, é consenso na literatura vigente que o déficit mnemônico é uma das
principais conseqüências cognitivas da encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal,
tanto em humanos, quanto em modelos animais (WANG et al., 2002; MANERU et al.,
2003). Já no que tange às alterações morfológicas, foi realizado um estudo da extensão
da lesão em estruturas vulneráveis à HI, as quais também são relacionadas com a
neurobiologia da memória. O hipocampo é o principal objeto de estudo, pois se
apresenta como alvo primeiro da lesão hipóxico-isquêmica. Esta suscetibilidade é mais
seletiva às células do Corno de Amon, principalmente os neurônios piramidais da área
CA1 hipocampal (SCHMIDT-KASTNER & FREUND, 1991; GEE et al., 2006). O córtex e
o estriado também foram estudados, pela estreita relação que têm com a formação da
memória e por serem estruturas encefálicas que igualmente sofrem dano pela HI. Na
seqüência do estudo morfológico, hipocampo e córtex também foram analisados sob o
aspecto bioquímico. O dano oxidativo, apontado como um dos principais mecanismos
de dano celular pela HI (MCLEAN & FERRIERO, 2004), e os níveis de BDNF, citado
como mediador das conseqüências do enriquecimento ambiental, (ROSSI et al., 2006;
ZHU et al., 2006;) foram os parâmetros bioquímicos definidos para serem avaliados
nesta tese.
34
A apresentação da estimulação por enriquecimento ambiental como estratégia
para a recuperação dos efeitos deletérios da HI vem motivada pelos consistentes
resultados neuroprotetores desta estimulação sobre outras neuropatologias. Estudos
recentes têm indicado efeito benéfico do EA especialmente sobre o prejuízo funcional e
alterações morfológicas pelo envelhecimento, e também em modelos de isquemia no
adulto e doenças neurodegenerativas em roedores (JOHANSSON, 2004; COSTA,
2007; MORA et al., 2007). Ainda, a estimulação ambiental tem sido apontada como
fator importante na prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas em
humanos (BRIONES, 2006).
Efeito cognitivo da estimulação diária no ambiente enriquecido, com início 2
semanas após a hipóxia-isquemia neonatal em ratos adultos.
No primeiro experimento, a exposição (1h/dia) no ambiente enriquecido,
iniciada 2 semanas após a HI e mantida por 9 semanas, resultou na prevenção do
prejuízo na memória de referência e na memória de trabalho de ratos adultos hipóxico-
isquêmicos, observadas no labirinto aquático de Morris. O déficit mnemônico
encontrado como seqüela da HI corrobora os dados previamente publicados por Ikeda
e colaboradores (2001), Arteni e colaboradores (2003) e MCAULIFFE e colaboradores
(2006), os quais demonstraram que roedores submetidos à hipóxia-isquemia neonatal
apresentaram pior performance no labirinto radial, na esquiva inibitória e labirinto
aquático de Morris, respectivamente. Por outro lado, o resultado referente à
recuperação cognitiva pelo EA após um evento hipóxico-isquêmico é o primeiro a ser
publicado na literatura vigente consultada. Existem, porém, estudos demonstrando os
efeitos benéficos do ambiente enriquecido sobre os prejuízos comportamentais
35
conseqüente a eventos isquêmicos em animais adultos, ou mesmo, comparando-se a
performance de animais controle com animais enriquecidos (PUURUNEN et al.,
2001;LEGGIO et al., 2005).
Efeito morfológico da estimulação diária no ambiente enriquecido, com início 2
semanas após a hipóxia-isquemia neonatal em ratos adultos.
O efeito morfológico da hipóxia-isquemia neonatal foi encontrado pela avaliação
do volume hipocampal analisado através da utilização do método de Cavalieri. Este
método foi idealizado pelo matemático Bonaventura Cavalieri e é conhecido como
“princípio de Cavalieri” (MANDARIN-DE-LACERDA, 1995). Ele propôs cortar um objeto
por planos de cortes paralelos com uma espessura conhecida e medir as áreas dos
cortes do objeto. A soma das áreas multiplicada pela espessura estima, sem viés, o
volume do objeto independentemente da forma do objeto e da orientação dos cortes. O
achado, pela mensuração do volume do hipocampo, foi uma atrofia desta estrutura em
toda a sua extensão no hemisfério ipsilateral à oclusão arterial (Capítulo 1). E ainda,
estudos prévios, tanto do nosso grupo de pesquisa quanto de outros grupos, já haviam
indicado este efeito em decorrência da encefalopatia hipóxico-isquêmica (RODRIGUES
et al., 2004; MISHIMA et al., 2005). Além do hipocampo, observou-se dano no córtex
dos animais submetidos à HI, em comparação com os animais não-isquêmicos.
A hipótese de trabalho referente ao efeito do enriquecimento ambiental sobre a
extensão da lesão encefálica, especificamente hipocampo, córtex e estriado, não foi
confirmada. Ficou claro que a exposição dos animais ao ambiente enriquecido, 1 hora
por dia, 2 semanas após a HI, não resultou em proteção morfológica das estruturas
analisadas, no que se refere à extensão do dano tecidual. Ressalta-se aqui, o fato de
36
que este dado é apresentado como uma ausência de efeito sobre o volume da lesão
tecidual e não sobre um efeito morfológico generalizado. Outrossim, acredita-se na
possibilidade de existência de alterações morfológicas, por exemplo, sabe-se que o
aumento no número de espinhos dendríticos pode resultar da estimulação ambiental,
sem necessariamente evitar a atrofia de determinada estrutura (LEGGIO et al., 2005).
Outros estudos envolvendo as conseqüências do EA não encontraram efeito benéfico
nas variáveis morfológicas investigadas. Farrel e colaboradores (2001) encontraram
maior morte celular na região CA1 após estimulação por EA e Gobbo e Mara (2004)
indicaram que o EA não protegeu a morte celular em CA1 após a isquemia global.
Neste trabalho, o que pode ter contribuído para a não identificação do efeito
morfológico estudado foi o fato da estimulação pelo enriquecimento ambiental ter
iniciado “tardiamente”. Porém, a palavra “tardio” perde seu sentido no momento em que
observa-se uma evidente recuperação cognitiva pós-lesão. Ao contrário, é importante
ressaltar o achado de que não obstante o enriquecimento ambiental tenha começado 2
semanas após a HI, foi possível seu efeito neuroprotetor. Este se torna um resultado
importante na medida em que é identificada uma janela terapêutica de até 2 semanas
para a implementação de uma estratégia de recuperação da encefalopatia hipóxico-
isquêmica. O conceito de janela terapêutica, na clínica, assume importante papel
devido a sua importância para a efetividade de uma estratégia de tratamento (AMATO
& DONATI, 2000).
O Capítulo 2 apresenta-se como uma continuação do primeiro experimento e
vem responder à seguinte questão: se a estimulação no ambiente enriquecido tivesse
início precoce, na seqüência da HI, seria identificado o efeito morfológico do EA sobre a
37
atrofia hipocampal? Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da manutenção
de ratos e ratas em um ambiente enriquecido, iniciando no dia seguinte à HI, sobre a
memória e a morfologia encefálica.
Efeito cognitivo da estimulação contínua no ambiente enriquecido, com início 1
dia após a hipóxia-isquemia neonatal em ratas e ratos adolescentes e adultos.
No Capítulo 2 foram avaliadas também a memória de reconhecimento de
objetos e a memória espacial durante o período da adolescência, permitindo assim uma
análise temporal/evolutiva do comportamento dos animais. Os resultados deste
experimento confirmam tanto a presença do déficit cognitivo quanto da atrofia
hipocampal conseqüente à HI, observados no Capítulo 1. Tanto no período da
adolescência quanto na vida adulta houve prejuízo de memória espacial, bem como de
reconhecimento de objetos na adolescência. Um outro estudo já havia analisado a
memória de animais 7 e 16 semanas após o evento hipóxico-isquêmico, onde foi
relacionado o aumento do dano encefálico com o agravamento do prejuízo cognitivo ao
longo dessas semanas (MISHIMA et al., 2005). Quanto ao dano morfológico, a atrofia
hipocampal foi evidente nos animais submetidos à HI, assim como o dano ao estriado.
Ao observar-se o efeito do enriquecimento ambiental, percebe-se uma clara
recuperação do déficit cognitivo observado na memória de reconhecimento de objetos,
tanto nas ratas quanto nos ratos hipóxico-isquêmicos. No entanto, não foi tão evidente
o efeito do EA sobre a memória espacial: na adolescência, as fêmeas HI apresentaram
recuperação do déficit de memória de trabalho no labirinto aquático e, na vida adulta,
este efeito foi encontrado nos machos.
38
Efeito morfológico da estimulação contínua no ambiente enriquecido, com início
1 dia após a hipóxia-isquemia neonatal em ratas e ratos adolescentes e adultos.
Confirmando o resultado apresentado no Capítulo 1, também neste estudo não
foi encontrado efeito neuroprotetor do enriquecimento ambiental sobre a atrofia
hipocampal. Da mesma forma, o dano ao estriado não foi amenizado pela estimulação.
Ratifica-se então o resultado de que o efeito cognitivo do EA não está relacionado à
prevenção/recuperação da extensão do dano tecidual ao hipocampo, córtex e estriado.
Além da possibilidade de existirem outras conseqüências morfológicas do EA, seu
efeito cognitivo pode estar vinculado a mudanças bioquímicas e fisiológicas encefálicas.
Aumento da densidade de receptores glutamatérgicos e aumento dos níveis de
sinaptofisina são algumas das alterações que acompanham a recuperação funcional
pelo EA (JOLKKONEN et al., 2003; LAMBERT et al., 2005), ambas relacionadas com
aumento da neurotransmissão e plasticidade. Ickes e colaboradores (2000)
demonstraram um aumento nos níveis das neurotrofinas, fator de crescimento neuronal
(NGF) e BDNF, no córtex e hipocampo de animais mantidos em ambiente enriquecido.
E, ainda, Fernández e colaboradores (2004) apresentaram resultados associando os
efeitos cognitivos e motores do EA com a diminuição do estresse oxidativo pelo
envelhecimento.
É consensual o fato da estimulação ambiental resultar em efeitos benéficos
após um evento isquêmico, por ocasião de uma doença neurodegenerativa ou mesmo
na prevenção dos déficits cognitivos do envelhecimento. Porém, há que se ressaltar
que os mecanismos neurobiológicos que medeiam as conseqüências desta estimulação
são minimamente conhecidos. De encontro com esta afirmação, reconhece-se que
39
embora de grande importância clínica, a encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal
carece do desenvolvimento de opções terapêuticas, tanto na área reabilitação quanto
no âmbito farmacológico. Então, o conhecimento dos mecanismos relacionados com os
efeitos cognitivos do enriquecimento ambiental poderia apresentar-se como importante
opção terapêutica também em estudos com humanos.
Efeitos da hipóxia-isquemia neonatal e do enriquecimento ambiental diário
sobre o estado oxidativo e os níveis de BDNF em hipocampo e córtex de ratos adultos.
O objetivo do Capítulo 3 foi investigar se os níveis de BDNF e/ou o estado
oxidativo estão correlacionados com a neuroproteção funcional em hipocampo e córtex
de ratos machos hipóxico-isquêmicos. Estes dois procedimentos experimentais foram
realizados a partir das estruturas encefálicas de animais submetidos à hipóxia-isquemia
neonatal no 7º dia de vida pós-natal e estimulados em ambiente enriquecido a partir do
desmame, durante 9 semanas (1h/dia). Cabe ressaltar que o procedimento de
estimulação utilizado neste estudo foi o mesmo utilizado no Capítulo 1. Esta opção foi
feita devido ao fato de que o efeito neuroprotetor cognitivo foi melhor evidenciado nos
animais mantidos no enriquecimento diário, mesmo que iniciado 2 semanas após a HI.
A partir desta observação, os achados bioquímicos observados aqui relacionam-se
diretamente com o efeito cognitivo do EA apresentado no primeiro experimento desta
tese. Então, para os experimentos do Capítulo 3, o sacrifício dos animais aconteceu
aproximadamente 24 horas após o fim do período de enriquecimento porque foi este o
momento no qual os animais tiveram seu comportamento observado (Capítulo 1) e,
ainda, para permitir uma avaliação, na totalidade, das conseqüências do período de
enriquecimento. Os níveis de BDNF foram similares no córtex e hipocampo esquerdo.
40
No entanto, ocorreu um aumento significativo de BDNF no hipocampo direito dos
animais hipóxico-isquêmicos mantidos em ambiente padrão. Chama-se a atenção ao
fato de que os animais HI estimulados no ambiente enriquecido tiveram semelhantes
níveis de BDNF, comparando-se com os animais dos grupos controle.
O fator neurotrófico derivado do encéfalo é apontado como importante
neuroprotetor. Além de ter seus níveis aumentados em conseqüência a eventos
isquêmicos (PLOUGHMAN et al., 2007), a administração de BDNF é indicada como
estratégia terapêutica para esses eventos (AMLI et al., 2000). Conseqüências
morfológicas e cognitivas são abordagens comuns nos estudos envolvendo as funções
do BDNF. Melhor performance no labirinto aquático de Morris e maior sobrevivência das
células piramidais da região CA1 hipocampal são algumas delas (GOBBO & MARA,
2004). A hipótese envolvendo os efeitos cognitivos do enriquecimento ambiental vem
pautada nesses dados; sendo assim, esperava-se um aumento nos níveis de BDNF
nos grupos estimulados. Surpreendentemente, os resultados indicaram um aumento de
BDNF apenas no grupo hipóxico-isquêmico mantido em ambiente padrão. Analisando
conjuntamente os resultados do Capítulo 1 com os do Capítulo 3, temos um aumento
de BDNF relacionado com um déficit mnemônico (grupo HI não-estimulado) e uma
recuperação cognitiva da HI associada a níveis padrão de BDNF em córtex e
hipocampo (grupo HI enriquecido). Esta análise destaca uma correlação inversa do
BDNF com a cognição, porém este não é o primeiro trabalho a encontrar este resultado.
Koh e colaboradores (1995) administraram BDNF como pré-tratamento para a privação
de oxigênio e glicose em cultura de neurônios e encontraram uma potencialização da
morte celular por necrose. E também, pré-tratamento com BDNF potencializou a
41
neurodegeneração induzida por NMDA (PREHN, 1996). O mecanismo proposto para os
efeitos deletérios do BDNF inclui a ativação de canais de sódio, os quais induzem a
liberação de íons Ca
2+
do retículo endoplasmático via receptor trkB (Blum et al., 2002;
Rose et al., 2003). Isto posto, é possível concluir que o efeito cognitivo do
enriquecimento ambiental parece não ser mediado por um aumento nos níveis de
BDNF, nem no hipocampo, nem no córtex frontal em animais submetidos à hipóxia-
isquemia neonatal. Por outro lado, o aumento nos níveis desta neurotrofina apenas no
grupo hipóxico-isquêmico mantido em ambiente padrão não descarta a relação da
neuroproteção cognitiva do EA com o BDNF. Este resultado é um forte indicativo para a
motivação de novos estudos incluindo esta temática.
A partir disto, apresenta-se na próxima sessão desta tese a avaliação do estado
oxidativo do hipocampo e córtex como possível mediador do efeito funcional do
enriquecimento ambiental.
Também como parte do Capítulo 3, realizou-se a quantificação da formação de
radicais livres, a medida dos níveis de lipoperoxidação pela detecção de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico, a medida dos níveis de dano em proteínas pela medida
tióis total e a medida da atividade da superóxido dismutase, como medida da atividade
antioxidante dos tecidos avaliados em hipocampo e córtex de ratos machos adultos
submetidos à hipóxia-isquemia no período neonatal. Os principais achados deste
estudo foram um aumento na quantidade de DCF formado no hipocampo dos animais
HI e no córtex dos animais não estimulados; um aumento da lipoperoxidação pelo
enriquecimento ambiental no hipocampo esquerdo e, ainda, aumento da atividade da
42
SOD no hipocampo ipsilateral e diminuição desta atividade nos grupos mantidos em
ambiente padrão no hipocampo contralateral à isquemia.
Os resultados acima citados não permitem uma exata conclusão de
alterações específicas pela hipóxia-isquemia neonatal ou pelo enriquecimento
ambiental. Esta observação a longo prazo, em considerando o evento hipóxico-
isquêmico, possivelmente é influenciada pela adaptação, especialmente do sistema
celular antioxidante. Os mecanismos de defesa antioxidante envolvem: defesa
enzimática com a superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase; e os
antioxidantes não-enzimáticos, dentre eles o ácido ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol
(Vitamin E), os carotenóides e os flavonóides. (VALKO et al., 2007). O desequilíbrio na
relação quantidade de radicais livres produzidos e atividade antioxidante de um tecido é
que pode ter importante papel no dano celular. No presente estudo, um aumento de
DCF formado, ou seja um aumento na produção de radicais livres, no córtex de animais
HI não estimulados pode indicar uma ineficácia na atividade do sistema antioxidante da
estrutura encefálica estudada. Sendo assim, pode-se sugerir que, mesmo 3 meses
depois de um evento hipóxico-isquêmico, sinais de dano oxidativo podem ser
apontados no encéfalo de roedores. Este dado se relaciona diretamente com o
resultado do Capítulo 1, no qual o enriquecimento ambiental iniciado somente 2
semanas após a HI, foi efetivo em recuperar e/ou prevenir o prejuízo cognitivo; se o
dano encefálico por estresse oxidativo pode perdurar por longos períodos após a HI,
uma estimulação, ainda que “tardia” pode ser efetiva na recuperação de suas
conseqüências.
43
As medidas de lipoperoxidação não sofreram diferença pela HI, nem no
hipocampo nem no córtex dos animais estudados. No entanto, foi observado um
surpreendente efeito do enriquecimento no sentido de aumentar os níveis de TBARS no
hipocampo contralateral. Este aumento na lipoperoxidação pode apontar um efeito
deletério da estimulação sobre o encéfalo acometido pela HI, visto que a
lipoperoxidação indica a degradação dos lipídeos das membranas celulares
(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Um estudo prévio também encontrou aumento
da morte celular em CA1 hipocampal relacionado ao enriquecimento ambiental
(FARREL et al., 2001). Porém, a grande maioria dos estudos publicados aponta o efeito
protetor do enriquecimento ambiental (JOHANSSON, 2004; LEGGIO et al., 2005). São
necessários mais estudos para permitir uma discussão mais conclusiva da possível
participação da estimulação ambiental no aumento dos níveis de estresse oxidativo.
A superóxido dismutase é uma importante enzima participante do sistema de
defesa antioxidante. Existem dois tipos principais: SOD1, dependente de cobre e zinco,
presente no citoplasma das células, SOD2, dependente de manganês, na mitocôndria,
e recentemente foi identificada uma SOD3, cobre-dependente, localizada no espaço
extracelular (VALKO et al., 2007). A SOD catalisa a dismutação do superóxido em
H
2
O
2
. No Experimento 3, foi encontrado aumento da atividade da SOD no hipocampo
ipsilateral e no hipocampo contralateral nos grupos mantidos em ambiente padrão.
Ambos os resultados corroboram trabalhos publicados anteriormente. Bidmon e
colaboradores (1998) utilizaram um modelo de fototrombose focal, em ratos, e
encontraram um aumento da SOD2 30 e 60 dias após a fototrombose. Ainda,
Candelario-Jalil e colaboradores (2001) encontraram aumento da SOD2 até 72 horas
44
após isquemia cerebral transitória. O aumento da superóxido dismutase sugere que a
produção de superóxido pode ser mantida em níveis acima do normal por longo período
após um evento neuropatológico. Os resultados deste estudo confirmam o papel do
estresse oxidativo no dano tecidual em animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal
e apresentam evidências de que o status oxidativo dos tecidos acometidos pode
manter-se alterado até mesmo meses após a HI.
Foi encontrado, também, um aumento na atividade da SOD no hipocampo
contralateral à isquemia nos animais não-estimulados. Em contrapartida, um estudo
demonstrou que o tratamento combinado do enriquecimento ambiental com uma dieta
antioxidante foi efetivo em aumentar a atividade da SOD e de outras enzimas
antioxidantes (OPII et al., 2007).
Não foram encontradas diferenças na medida de tióis totais no hipocampo e
córtex dos animais em estudo. Porém um estudo prévio encontrou uma diminuição nos
níveis de tióis 150 minutos após a HI neonatal (DAFRÉ et al., 2003). Esta discrepância
entre os resultados está provavelmente relacionada com a considerável diferença no
momento de sacrifício de animais entre o estudo citado e o experimento desta tese.
Por fim, pode-se verificar que não é claro o papel do estresse oxidativo e os
níveis de BDNF como mediadores da resposta cognitiva em animais hipóxico-
isquêmicos estimulados em ambiente enriquecido. Outros estudos são necessários
para a identificação de possíveis mecanismos que atuem como mediadores da resposta
funcional do enriquecimento ambiental após um evento isquêmico.
45
5 CONCLUSÕES
46
Os resultados obtidos nesta Tese permitem concluir que:
O enriquecimento ambiental diário, iniciado duas semanas após a hipóxia-
isquemia encefálica neonatal, resultou na recuperação do prejuízo na memória espacial
sem alterar a atrofia hipocampal e o dano cortical em ratos adultos;
O enriquecimento ambiental realizado após a hipóxia-isquemia encefálica
neonatal, mantido do oitavo ao trigésimo dia pós-natal, reverteu o déficit na memória de
reconhecimento de ratos e ratas adolescentes, e o prejuízo na memória de trabalho em
ratas adolescentes; porém este protocolo de enriquecimento não resultou em proteção
morfológica em relação à extensão da atrofia hipocampal e da lesão estriatal;
A hipóxia-isquemia neonatal aumentou os níveis do fator neurotrófico derivado
do encéfalo – BDNF - no hipocampo ipsilateral à oclusão arterial, medido 24 após o
final do período de enriquecimento, sem causar alterações no córtex frontal;
O efeito cognitivo do enriquecimento ambiental diário parece não estar
relacionado com os altos níveis de BDNF em hipocampo e córtex frontal, conforme a
hipótese de trabalho sugeria;
Os dados sugerem que o enriquecimento ambiental reverte o aumento nos
níveis de BDNF induzidos pela hipóxia-isquemia neonatal;
A hipóxia-isquemia resultou em aumento na atividade da superóxido dismutase,
efeito este parcialmente revertido pelo enriquecimento ambiental;
O enriquecimento ambiental não alterou os níveis de radicais livres nem o dano
oxidativo em lipídios.
47
6 PERSPECTIVAS
48
Investigar outras variáveis morfológicas que possam ser influenciadas pelo
enriquecimento ambiental, tais como arborização dendrítica e densidade de espinhos
dendríticos nos hipocampos dos animais submetidos à hipóxia-isquemia;
Avaliar o efeito temporal do enriquecimento ambiental sobre os níveis de BDNF,
ou seja, no início e durante o período de estimulação, buscando possível relação deste
com os níveis desta neurotrofina;
Examinar a relação entre as alterações induzidas pelo enriquecimento
ambiental em animais HI e os níveis de sinaptofisina hipocampal, por ser esta uma
importante proteína para a neurotransmissão;
Analisar outros parâmetros que possam dar maior suporte para o estudo da
relação entre o enriquecimento ambiental o estado oxidativo do hipocampo e córtex de
ratos submetidos à hipóxia-isquemia neonatal;
Investigar o efeito do enriquecimento ambiental e da hipóxia-isquemia neonatal,
em longo prazo, a atividade de algumas enzimas envolvidas no metabolismo
energético, tais como a citocromo c oxidase e succinato desidrogenase.
49
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