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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
DALVA PAZZINI
ESTUDO DA INDUÇÃO DE ÚLCERA GÁSTRICA CRÔNICA E
AGUDA: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-ULCEROGÊNICA E
ANTI-OXIDATIVA DE MAYTENUS ILICIFOLIA (CELASTRACEAE).
BAURU- 2007
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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
DALVA PAZZINI
ESTUDO DA INDUÇÃO DE ÚLCERA GÁSTRICA CRÔNICA E
AGUDA: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-ULCEROGÊNICA E
ANTI-OXIDATIVA DE MAYTENUS ILICIFOLIA (CELASTRACEAE).
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e
Pós-graduação da Universidade do Sagrado Coração,
como parte integrante dos requisitos para obtenção do
título de mestre no Programa de Mestrado em
Biologia Oral.
Orientador(a): Profa. Dra. Ana Claudia Bensuaski
de Paula Zurron.
Co-orientador(a): Profa. Dra. Ângela Mitie Otta
Kinoshita.
BAURU- 2007
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DALVA PAZZINI
ESTUDO DA INDUÇÃO DE ÚLCERA GÁSTRICA CRÔNICA E
AGUDA: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-ULCEROGÊNICA E
ANTI-OXIDATIVA DE MAYTENUS ILICIFOLIA
(CELASTRACEAE).
Dissertação apresentada à pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da Universidade do
Sagrado Coração, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de mestre
no Programa de Mestrado em Biologia Oral, sob orientação da Profa. Dra. Ana Cláudia
Bensuaski de Paula Zurron e co-orientação da Profa. Dra. Ângela Mitie Otta Kinoshita.
Banca examinadora:
Profa. Dra. Ana Cláudia Bensuaski de Paula Zurron_____________________________
Profa. Dra. Ângela Mitie Otta Kinoshita______________________________________
Prof. Dr. Djair Caitano do Nascimento_______________________________________
BAURU - 2007
4
“Depois de algum tempo você aprende que as verdadeiras amizades
continuam a crescer mesmo a longas distâncias, e o que importa não é o
que você tem na vida, mas quem você tem na vida.”
(William Shakespeare)
Dedico este trabalho aos meus pais Miguel
Archanjo Pazzini e Maria Calbo Pazzini, que
confiaram e deram seu apoio com amor
incondicional...
5
Em especial, agradeço...
A Deus, por sua infinita força, sempre...
À Profa. Dra. Ana Cláudia Bensuaski de Paula Zurron, pela orientação,
dedicação, paciência e, principalmente, pela amizade.
À amiga Ana Paula, pela acolhida, companheirismo durante nossos
trabalhos e apoio durante os momentos críticos, provas de sua
amizade!
À Profa. Dra. Ângela Mitie Otta Kinoshita, pela co-orientação,
ensinamentos, atenção, exemplo de educadora e amizade.
À Profa. Dra. Silvana Pasetto, pela colaboração, carinho e amizade.
6
Agradecimentos
À amiga Cibele, companheira de curso, pela coragem e amizade.
Aos Professores Dr. Dejair Caitano do Nascimento e Dra. Efigênia de Queiroz
Santana, pelos ensinamentos e amizade.
Aos Professores Oswaldo Baffa (FFCLRP/USP) e Adevailton Bernardo dos
Santos (UFU) pelas discussões acerca dos experimentos em atividade anti-
oxidativa.
Ao Departamento de Física e Matemática (FFCLRP/USP) pela permissão do
uso do Espectrômetro de RSE.
Ao Prof. Dr. Sérgio Augusto Catanzaro Guimarães pelo apoio e confiança.
Aos colaboradores de laboratório, Maira e Wilson pelo apoio.
Ao amigo Sérgio, pelo apoio nos trabalhos em biotério e pela amizade.
Aos funcionários do Departamento de pós-graduação Ricardo, Lílian, Cida e
Ângela, pela atenção.
Aos amigos: Marilene Miguel Michelutti, Prof. Ms. João Marcelo Nabas e Prof.
Dr. Fábio César Ferreira, pela colaboração e apoio.
7
SUMÁRIO
Resumo______________________________________________________________ 8
Abstract _____________________________________________________________ 9
I-Introdução_________________________________________________________ 17
1.1. A patologia da úlcera gástrica ___________________________________________17
1.2. Regulação da Secreção Ácida ___________________________________________18
1.3. O processo de formação da úlcera gástrica e a participação dos radicais livres___ 21
1.4. Propriedades farmacológicas da Maytenus ilicifolia_________________________25
1.5.Espectroscopia de Ressonância do Spin Eletrônico e Atividade Anti-Oxidativa___29
II Objetivos: _________________________________________________________ 34
III. Materiais e Métodos _______________________________________________ 35
3.1. Obtenção do Extrato da Maytenus ilicifolia________________________________35
3.2. Animais _____________________________________________________________35
3.3. Avaliação da atividade preventiva da Maytenus ilicifolia_____________________36
3.3.1.Úlcera induzida pelo etanol___________________________________________________36
3.4. Avaliação da atividade cicatrizante da Maytenus ilicifolia____________________36
3.4.1.Úlcera induzida por ácido acético em ratos ______________________________________36
3.5.Modelo crônico de ulceração por etanol ___________________________________37
3.6. Análise Morfológica ___________________________________________________38
3.7. Avaliação da atividade Anti-Oxidativa da Maytemus ilicifolia por Ressonância do
Spin Eletrônico (RSE) _____________________________________________________39
3.8. Análise dos resultados _________________________________________________ 43
3.8.1. Atividade antiulcerogênica de Maytenus ilicifolia_________________________________43
3.8.2.Avaliação da atividade Anti-Oxidativa da Maytenus ilicifolia por RSE_________________43
IV. Resultados _______________________________________________________ 44
4.1. Estudo in vivo da atividade anti-ulcerogênica de Maytenus ilicifolia: úlcera
induzida por HCl/etanol ___________________________________________________44
4.2. Estudo da atividade cicatrizante de Maytenus ilicifolia: úlcera crônica induzida
pelo ácido acético. ________________________________________________________49
4.3. Indução de úlcera crônica através da ingestão diária de uma solução alcóolica à
25%. ___________________________________________________________________54
4.4. Estudo in vitro da ação anti-oxidativa de Maytenus ilicifolia por Ressonância do
Spin Eletrônico (RSE) _____________________________________________________58
4.4.1.Experimentos do DPPH (2,2-Diphenyl -1 –picrylhydrazyl)__________________________58
4.4.2.Experimentos com DMPO____________________________________________________60
V.DISCUSSÃO ______________________________________________________ 69
VI. Conclusões_______________________________________________________ 83
VII. Referências______________________________________________________ 84
ANEXOS ___________________________________________________________ 95
8
Resumo
Maytenus ilicifolia, (Celastraceae) conhecida como espinheira–santa, é muito usada na
medicina popular no tratamento da úlcera péptica. Vários estudos foram realizados
avaliando ações antiinflamatória, antiulcerogênica e antifúngica com ausência de efeitos
tóxicos. Este trabalho avaliou a ação preventiva e cicatrizante de Maytenus ilicifolia em
animais, bem como a atividade antioxidativa da espécie em estudo pela técnica de
ressonância do spin eletrônico (RSE). Em nosso estudo, Maytenus ilicifolia nas doses de
300 e 500 mg/Kg preveniu a formação de lesões gástricas em 42,2% e 72,0 % (p<0,05 e
p<0,001, respectivamente) quando comparado com o controle negativo tween 80.
Assim, a administração oral de M. ilicifolia uma hora antes do agente ulcerogênico,
preveniu a formação de úlceras, conservando as características de citoproteção da
mucosa gástrica e garantindo a integridade de glândulas e fossetas gástricas. Neste
mesmo experimento, os animais tratados com o controle negativo tween tiveram o
epitélio produtor de muco gástrico e a camada mucosa do estômago de roedores
danificados, sendo observada exfoliação do epitélio de revestimento superficial e
acentuada vascularização. A atividade cicatrizante de M.ilicifolia (500mg/kg, v.o.) foi
da ordem de 63% (p<0,001) em experimentos de úlcera crônica induzida pelo ácido
acético. A análise histológica confirmou este resultado recuperando a camada mucosa
(glândulas e fossetas gástricas) lesada pelo ácido acético, bem como o epitélio de
revestimento superficial. No estudo de indução de úlcera crônica por solução alcoólica
(25 %), foi possível verificar que as mucosas gástricas das mães apresentaram severas
lesões e intensa vascularização. Também foi verificada a degeneração acentuada do
epitélio de borda em escova, reduzindo a absorção intestinal desses animais. Os filhotes
não apresentaram lesões gástricas nem degeneração do epitélio intestinal, mostrando
que estes animais se adaptaram ao processo ulcerogênico dentro do útero materno.
Experimentos in vitro, realizados por Espectroscopia do Spin Eletrônico, comprovaram
a ação anti-oxidativa desta planta. Ensaios com DPPH (2,2-Diphenyl -1 –
picrylhydrazyl) demonstram que a fração polar do extrato de M. ilicifolia na
concentração de 1,0 mg/ml apresenta um efeito inibitório de 50,78% deste radical. Os
experimentos com o radical OH, produzidos pela reação de Fenton e detectados através
do aduto de spin DMPO-OH mostraram que M. ilicifiolia na concentração de 5mg/ml
apresenta um efeito inibitório de 46,35%. O efeito inibitório máximo foi de 90,47%
obtido com a concentração de 50 mg/ml da fração polar de M.ilicifolia.
9
Abstract
Maytenus ilicifolia, (Celastraceae) known as “espinheira-santa”, is very used in the
popular medicine for peptic ulcer treatment. Several studies were made to evaluate the
anti-inflammatory, antiulcerogenic and antifungus activity with absence of toxic effects.
This work evaluates the preventive and healing actions of M. ilicifolia in animals, as
well as the antioxidative activity by Electron Spin Resonance spectroscopy (RSE). In
our study, Maytenus ilicifolia (300 and 500 mg/Kg
-1
, p.o.) prevented the gastric lesions
formation in 42,2% and 72,0% (p <0,05 and p <0,001, respectively) when compared
with the negative control tween 80. Therefore, the oral administration of M. ilicifolia
one hour before the ulcerogenic agent prevented the ulcer formation, conserving the
citoprotection characteristics of the gastric mucosa and assuring the integrity of gastric
glands and gastric fossets. In this same experiment, the animals treated with the
negative control tween, had the epithelium and the mucosa layer damaged. It was also
observed exfoliation of the surface epithelium and accentuated vascularization. The
healing activity of M.ilicifolia (500mg/kg-
1
, p.o.) was 63% (p <0,001) in chronic ulcer
experiments induced by the acetic acid. The histological analysis confirmed the
recovery of the mucosal layer (gastric glands and gastric fossets) and the surface
epithelium harmed by the acetic acid. In the study of chronic ulcer induction by ethanol
(25%), it was possible to verify that the mother's gastric mucosal presented severe
lesions and intense vascularization. It was verified an accentuated degeneration of the
brush border epithelium, reducing the intestinal absorption of these animals. The pups
presented neither gastric lesions nor intestinal epithelium degeneration, showing that
they have adapted to the ulcerogenic process inside of the maternal uterus. Studies in
vitro, conducted with an Electron Spin Resonance spectroscopy, proved the anti-
oxidative action of M ilicifolia. Experiments with DPPH (2,2-Diphenyl -1-
picrylhydrazyl) demonstrate that the polar fraction of M. ilicifolia (1,0 mg/ml) presents
a inhibitory effect of 50,78%. The experiments with the radical OH, produced by the
Fenton Reaction and detected through DMPO-OH, showed that M. ilicifolia (5mg/ml)
presents a inhibitory effect of 46,35%. The maximum inhibitory effect of 90,47% was
obtained with 50 mg/ml of the polar fraction of M. ilicifolia
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Folhas da espécie em estudo Maytenus ilicifolia (Celastraceae).
Figura 2: Molécula de DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (a) Radical Livre e
(b) sem Radical Livre.
Figura 3: Espectros de RSE do DPPH (1mM) após reação com água, em
iguais volumes (100µL). A intensidade da linha central, indicada por I foi
utilizada como indicador da concentração do radical livre. Neste caso, I= (4,49
± 0,28).10
-5
.
Figura 4: Espectros de RSE do DMPO-OH após reação de Fenton utilizando
água. A intensidade da linha central, indicada por I foi utilizada como indicador
da concentração do radical livre. I= (2,33 ± 0,30).10
-4
.
Figura 5: Efeito preventivo de Maytenus ilicifolia (300 e 500mg/Kg, v.o.) e do
controle positivo lanzoprazol (v.o) em modelo de ulceração aguda HCl/etanol
em camundongos. Os resultados estão apresentados como média e erro
padrão da média de 7 animais em cada grupo. ANOVA F (4, 24)= 3,20 para
ILU (mm2). Teste de Tukey: * p<0,05 e ** p<0,001.
Figura 6: Foto mostrando as características histológicas da ulceração aguda
por HCl/etanol em camundongos tratados com o controle negativo (A); notar
hiperemia e exfoliação das células do epitélio de revestimento superficial. Em
(B) pré-tratamento dos animais com 300 mg/Kg do extrato de Maytenus
ilicifolia; notar oraganização do epitélio de revetimento superficial, com rara
hiperemia (Aumento 20X, HE).
Figura 7: Foto mostrando as características histológicas da ulceração aguda
por HCl/etanol em camundongos tratados com o controle negativo (A); notar
hiperemia e exfoliação das células do epitélio de revestimento superficial
(Aumento 20X, HE). Em (B) pré-tratamento dos animais com 500 mg/Kg do
extrato de Maytenus ilicifolia, notar novamente a conservação da organização
do epitélio de revetimento superficial, com rara hiperemia (Aumento 40X, HE).
Figura 8: Foto mostrando as características histológicas da ulceração aguda
por HCl/etanol em camundongos tratados com o controle negativo (A); notar
hiperemia e exfoliação das células do epitélio de revestimento superficial
(Aumento 20X, HE). Em (B) pré-tratamento dos animais com 30 mg/Kg de
lanzoprazol, notar novamente a conservação da organização do epitélio de
revetimento superficial, sem hiperemia (Aumento 40X, HE).
11
Figura 9: Índice de lesão ulcerativa (ILU) causada pela administração de ácido
acético na mucosa gástrica de roedores. Os animais foram tratados por 14 dias
(via oral) com tween (controle negativo), ranitidina (controle positivo) e
Maytenus ilicifolia ( 500 mg/Kg)
Os resultados estão apresentados como média e erro padrão da média de 7
animais em cada grupo. ANOVA F(3, 18)= 2,84 para ILU (mm2). Teste de
Dunnett´s: ** p<0,001.
Figura 10: Indução de úlcera por ácido acético 30% na mucosa gástrica de
roedores (A, B), tratados com o controle negativo tween. É possível notar que
tanto o epitélio de revestimento superficial, quanto a camada mucosa do
estômago (glândulas e fossetas gástricas) encontram-se desorganizados (A)
(Aumento 20X, HE), também é possível verificar intensa vascularização
(hiperemia) e lesão gástrica (B) (Aumento 40X, HE).
Figura 11: Foto mostrando a cicatrização da mucosa gástrica em animais
tratados com 500mg/Kg de Maytenus ilicifolia, via oral, por 14 dias
consecutivos (A,B), após a indução de úlcera crônica por ácido acético 30%. É
possível notar que o epitélio produtor de muco gástrico e a camada mucosa do
estômago de roedores estão íntegros em A (aumento 20X, HE) e B (Aumento
40X, HE).
Figura 12: Foto mostrando a mucosa gástrica de roedores cicatrizada por
ranitidina (100mg/Kg) durante 14 dias de tratamento após ulceração por ácido
acético 30%. O epitélio de revestimento superficial e a camada mucosa
encontram-se integros com raro aumento na vascularização (Aumento 20X em
A e 40X em B, HE).
Figura 13: Em (A) Estômago de roedor (mãe) tratada com etanol 25% por 60
dias. Observar intensa vascularização e lesões na parede do estômago. Nesta
figura o tecido mostra um início de regeneração. Aumento original 20x – final
200x (HE).
Em (B) após o tratamento por 60 dias com etanol 25%, a mucosa gástrica
apresenta aumento na vascularização local e há a presença de lesão ulcerativa
na parede do estômago. Aumento original 20x – final 200x (HE).
Figura 14: Mucosa gástrica de roedor (filhote) com 45 dias de tratamento com
etanol 25% (intra-uterino e após o nascimento, via oral). Em (A e B) nota-se
intensa hiperemia sem, no entanto, apresentar lesões na mucosa gástrica.
Aumento original 20x – final 200x (A) e Aumento original 40x – final 400x (B)
(HE).
Figura 15: Intestino de roedor (mãe) mantida com soulção alcóolica a 25% por
60 dias. Observar extremidades das vilosidades (degeneração acentuada dos
enterócitos) (A).
Em (B) Intestino de roedor (filhote) mantido com solução alcóolica a 25% por
45 dias. Observar as extremidades das vilosidades sem aparente degeneração
dos enterócitos.
12
Figura 16: Espectros de RSE do DPPH (1mM) após reação com água e com a
fração polar de Maytenus ilicifolia em diferentes concentrações.
Figura 17: Intensidade do sinal do DPPH (média e desvio padrão) em função
da concentração do extrato de Maytenus ilicifolia.
Figura 18: Espectros de RSE do DPPH após reação com água e com a fração
polar de Maytenus ilicifolia nas concentrações de 2mg/ml, 30 mg/ml e 50
mg/ml.
Figura 19: Espectros de RSE do aduto DMPO-OH após reação com água e
com a fração polar de Maytenus ilicifolia em diferentes concentrações.
Figura 20: Intensidade do sinal do aduto DMPO-OH (média e desvio padrão)
em função da concentração do extrato de Maytenus ilicifolia.
Figura 21 A: Espectros RSE de DMPO-OH em diferentes instantes de tempo
após a reação de Fenton com água.
Figura 21 B: Intensidade da linha central do DMPO-OH em diferentes instantes
de tempo após a reação de Fenton com água.
Figura 22 A: Espectros RSE de DMPO-OH em diferentes instantes de tempo
após a reação de Fenton com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia na
concentração de 2,55 mg/ml.
Figura 22 B: Intensidade da linha central do DMPO-OH em diferentes instantes
de tempo após a reação de Fenton com a fração polar do extrato de Maytenus
ilicifolia na concentração de 2,5 mg/ml.
Figura 23: Intensidade da linha central do DMPO-OH em diferentes instantes
de tempo após a reação de Fenton com a fração polar do extrato de Maytenus
ilicifolia na concentração de 2,55 mg/ml (curva verde) e com água (curva azul).
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Valores médios e desvio padrão da intensidade da linha central dos
espectros de ressonância do spin eletrônico (RSE) do radical DPPH após
reação com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia.
Tabela 2: Taxa do potencial inibitório do extrato de Maytenus ilicifolia (fração
polar do extrato) com relação ao radical DPPH.
Tabela 3: Valores médios e desvio padrão da intensidade da primeira linha
central dos espectros de ressonância do spin eletrônico (RSE) do radical
DMPO-OH após reação com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia em
diferentes concentrações.
Tabela 4: Potencial inibitório da fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia
com relação ao radical OH.
Tabela 5: Parâmetros de ajuste das curvas referentes à reação com água e
com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia na concentração de 2,50
mg/ml.
14
LISTA DE ABREVIATURAS
RSE= ressonância do spin eletrônico
DPPH= 1,1-Diphenyl-1-picrylhdrazyl
DMPO-OH= (5,5- Dymethyl N-oxide pyrroline) em reação com radical OH
ILU= índice de lesão ulcerativa
EGF= fator de crescimento epidermal
ECL= célula enterocromafin “like”
M
3
R= receptor muscarínico colinérgico
H
2
R= receptor histaminérgico
CCK
2
R= subtipo de receptor de gastrina
AMPcíclico= adenosina monofosfato (esterificado nas posições 3´e 5`da molécula de
ribose)
SNC= sistema nervoso central
PGE
2
= prostaglandina E
2
TGI= tratogastrointestinal
O
2
= ânion superóxido
H
2
O
2
= peróxido de hidrogênio
OH= radical hidroxila
XO= enzima xantina oxidase
PMN= polimorfonucleares
MPO= enzima mieloperoxidase
SOD= enzima superóxido desmutase
GSH-px= enzima glutationa peroxidase
NO= óxido nítrico
NP-SH= compostos sulfidrílicos endógenos não protéicos
CCl
4
= tetracloreto de carbono
TGF α = fator de crescimento transformador α
LDL= Low Density Lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade)
FeSO
4
= sulfato ferroso
DMPO= 5,5-dimetil-1-pirroline-n-oxido
DAINES= drogas antiinflamatórias não esteroidais
15
COX= enzima ciclooxigenase
TNF α = fator de necrose tumoral α
IL-1β = interleucina 1 β
HR GC-FID= cromatografia gasosa de alta resolução e detectora de ionização em
chama
HRGC-MS= cromatografia gasosa de alta resolução associada à espectometria de
massa
u.a.= unidades arbitrárias
16
17
I-Introdução
1.1. A patologia da úlcera gástrica
Nos últimos 20 anos, o estudo de doenças relacionadas à úlcera péptica e
duodenal tem aumentado significativamente devido ao advento de várias técnicas, as
quais têm possibilitado o estudo mais detalhado da mucosa gástrica (BRZOZOWSKI,
2003).
De acordo com Repello & Llesuy em 2002, a etiologia das úlceras
gastroduodenais ocorreram devido à presença de uma bactéria, Helicobacter pylori e
também por vários outros agentes agressivos como secreção ácida, estresse, fumo,
drogas antiinflamatórias não esteroidais, deficiência de nutrientes e pepsina. Esses
mesmos autores relatam que fatores protetores da mucosa como bicarbonato, muco,
fluxo sanguíneo, regeneração celular, e ainda agentes endógenos como prostaglandinas
e fator de crescimento epidermal (EGF) devem modular a proteção da úlcera gástrica.
A mucosa gástrica exposta à agentes ulcerogênicos necrotizantes como aspirina,
indometacina, ácidos biliares, álcool e isquemia, desenvolve características
morfológicas, alterações ultra-estruturais e funcionais que refletem em injúrias. As
lesões agudas da mucosa gástrica estão associadas com: 1) ruptura da camada e
superfície hidrofóbica da membrana, 2) injúria e esfoliação da superfície do epitélio
com perda da barreira e função elétrica, 3) injúria profunda na camada mucosa
incluindo célula endotelial microvascular, zona de proliferação celular, célula parietal e
principal. Danos do endotélio microvascular levam a uma parada da microcirculação,
cessando oxigênio e transporte de nutrientes. Todos esses eventos resultam na formação
de erosão e ulceração da mucosa. A diferença entre erosão e úlcera é que a erosão se
18
implanta na mucosa, enquanto a úlcera penetra na camada muscular da mucosa (JONES
& EMERSON, 1999).
Experimentos in vivo sugerem que a gastrina e a acetilcolina estimulam a célula
enterocromafin “like” (ECL), a liberar histamina. ECL tem um “único maquinário” para
controlar a síntese e a estocagem de histamina sob diferentes condições fisiológicas. A
ativação de seus receptores causa influxo de cálcio seguido por liberação da histamina
estocada (PRINZ et al., 2003).
O desenvolvimento de potentes drogas anti-secretoras, como antagonistas do
receptor de histamina e inibidores da bomba de prótons, resultam na formação de
bicarbonato de sódio, que é secretado na superfície das células epiteliais na cavidade
gástrica (TSUKIMI et al., 2001).
1.2. Regulação da Secreção Ácida
Com relação à secreção ácida, a via neural estimula diretamente células parietais
e células G no antro, responsáveis pela liberação de gastrina, bem como células ECL
presente na glândula oxíntica, promovendo a liberação de histamina. A estimulação
direta e indireta da célula parietal é mediada principalmente por três receptores:
muscarínico colinérgico (M
3
R), histaminérgico (H
2
R) e receptor de gastrina/CCK-B
(CCK
2
R). Desses três receptores, entretanto, o H
2
R parece ser o receptor chave na
secreção ácida gástrica, pois antagonistas de H
2
R não inibem somente a secreção ácida
estimulada pela histamina, mas também a secreção ácida estimulada por gastrina e
acetilcolina (AIHARA et al., 2003).
Os mesmos autores relatam que a ativação de receptores de histamina resulta
num aumento dos níveis intracelulares de AMPc, o qual age como segundo mensageiro
para a transferência do sinal na etapa final da secreção ácida. Por outro lado, a
19
estimulação do receptor muscarínico M
3
, pela acetilcolina, ou do receptor CCK
2
R pela
gastrina, resulta num sinal mediado pelo aumento intracelular de íons cálcio livre.
Embora a histamina tenha sido reconhecida como um potente secretagogo da
secreção ácida desde 1920, o seu papel fisiológico no estômago é novamente tema de
debates; também a acetilcolina e gastrina são de grande importância na estimulação da
produção ácida gástrica (BAROCELLI & BALLOBENI 2003).
Ligantes colinérgicos não somente estimulam a liberação de histamina a parir
das células ECL, como também estimulam diretamente a célula parietal por ativação do
receptor M3 na superfície celular. Por essa razão, um antagonista do receptor M3 pode
inibir completamente, tanto direta quanto indiretamente, a secreção ácida visto que as
vias de estimulação da célula parietal não são distintas (WILKES et al., 1991). A
inibição da ativação do receptor de hsitamina H2 é um meio efetivo e seguro de regular
a secreção ácida gástrica.
A gastrina é outro secretagogo responsável pela secreção ácida gástrica, a qual é
liberada em resposta à produtos da digestão como aminoácidos. Sua inibição é
promovida pela somatostatina (produzida pelas células D) quando o pH cai abaixo de 3
no antro. O ácido aplicado diretamente à célula G inibe a secreção de gastrina; já na
célula D, o mesmo procedimento estimula a secreção de somatostatina, o que
consequentemente inibe a liberação de gastrina (ZAVROS et al., 2002).
A terapêutica da secreção ácida gástrica tem avançado nos últimos anos, devido
ao aumento da especificidade de fármacos envolvidos na inibição da secreção ácida
gástrica (SACHS, 2003). A úlcera péptica, o refluxo gastroesofágico e o sangramento
na parte superior do estômago são condições que aumentam a demanda no cuidado à
saúde. A supressão de ácido é uma terapia comum nessas situações. Estudos de custo
20
comparando os diversos supressores de ácido incluem benefícios econômicos
prevenindo complicações (ERSTAD, 2003).
Os agentes farmacológicos, como antagonistas de receptor H2 e inibidores da
bomba, são frequentemente utilizados no tratamento de doenças relacionadas à acidez
tais como úlcera gastroduodenal e esofagite de refluxo. O aumento da compreensão do
mecanismo preciso da secreção ácida gástrica no receptor, enzimas e sistema de
transdução de sinal citoplasmático, possibilita o desenvolvimento de uma efetiva
farmacoterapia antisecretora (AIHARA et al., 2003).
O ácido gástrico é secretado pelas células parietais em resposta à influência do
Sistema Nervoso Central (SNC) e por regulação local, através de receptores de
membrana. A ativação desses receptores gera mudanças em segundos mensageiros, os
quais determinam a atividade da bomba de prótons gástrica, a H
+
, K
+
-ATPase. A
regulação nervosa ocorre principalmente por modulação da atividade de uma variedade
de núcleos no hipotálamo via neurotransmissores e peptídeos, como resposta a
estímulos alimentares (HIRSCHOWITZ et al, 1995).
Ainda esses autores relataram que o controle da secreção ácida na mucosa
gástrica se dá por ativação de receptores de acetilcolina, histamina e gastrina, os quais
possuem caráter ativador da secreção; assim como também receptores para o fator de
crescimento epidermal (EGF) e prostaglandinas (PGE2) com função inibitória.
O receptor de EGF está presente em células parietais de mamíferos. Estudos
demonstraram que o EGF inibe seletivamente a resposta histamínica de glândulas
gástricas de coelhos, com conseqüente redução da secreção ácida gástrica, contribuindo
como importante fator no processo de cicatrização natural (HIRSCHOWITZ et al,
1995).
21
Paula e colaboradores em 2005 descreveram que ratos desnutridos (que se
alimentam com dieta contendo uma quantidade menor de proteína do que o normal),
apresentam menor susceptibilidade à ulceração aguda da mucosa gástrica, devido a uma
maior produção de fatores citoprotetores da mucosa gástrica como muco e
prostaglandina E
2
.
1.3. O processo de formação da úlcera gástrica e a participação
dos radicais livres
Sabe-se que o etanol é um potente agente causador de úlceras gástricas, isto
porque o contato direto deste agente com a mucosa gástrica, solubiliza o muco protetor
deixando assim, a mucosa gástrica indefesa à ação hidrolítica e proteolítica do ácido
clorídrico e da pepsina, respectivamente. O etanol pode induzir ainda um aumento na
secreção do ácido gástrico e por contato direto, alterar a rede de vascularização local e
romper vasos sanguíneos que irrigam a mucosa gástrica desencadeando um processo
necrotizante no tecido. Deste modo, a hipersecreção gástrica juntamente com a
fragilidade da rede vascular e a dissolução da camada muco protetora da mucosa
gástrica constituem os principais fatores envolvidos na instalação de uma úlcera
induzida pelo etanol (PANDOLFINO et al., 2000).
Paula et al. em 2005, também relataram que os extensos danos causados pelo
etanol na mucosa gástrica estão correlacionados com a degranulação de mastócitos, os
quais são responsáveis pela liberação de neuropeptídios e mediadores inflamatórios,
incluindo histamina e leucotrienos. Ainda, a indução de úlceras por etanol não é
prevenida por agentes anti-secretórios como a cimetidina, mas sim por agentes que
aumentam os fatores defensivos da mucosa gástrica como as prostaglandinas E2.
Pacheco et al., 2006 relataram que o etanol é considerado um agente irritante da
mucosa gástrica, o qual destrói a camada de muco e bicarbonato, que atuam na proteção
22
da mucosa gástrica contra o ácido clorídrico e outros agentes agressores. O etanol atua
bloqueando a citoproteção gástrica por precipitação de proteínas, liberação de radicais
livres e redução da concentração de compostos sulfidrilas nas células da mucosa.
O processo ulcerogênico está relacionado ao estresse oxidativo e este é
considerado um desequilíbrio entre os mecanismos de defesa do organismo (moléculas
antioxidantes naturais como a glutationa), em relação ao número de substâncias
oxidantes produzidas pelo agente indutor de lesão ou ainda por alterações bioquímicas
do próprio organismo. Este fato causa prejuízo na fisiologia do trato-gastrointestinal
(TGI) e favorece a formação de doenças como gastrite e úlceras gástricas (LIH-BRODY
et al., 1996).
Além de mecanismos secretórios e citoprotetores, tem sido destacada a
participação dos radicais livres de oxigênio gerados no processo de oxidação durante a
inflamação, que na mucosa gastroduodenal causam lesões pépticas. Os radicais livres
são moléculas que agridem a membrana celular devido à peroxidação lipídica, ácidos
nucléicos, enzimas e receptores; ocasionando alterações na estrutura, além de alterações
na atividade celular (ANDREOLI, 2000).
Ito e colaboradores em 1998 relataram que dentre os radicais livres envolvidos
na patogênese da úlcera gástrica destacam-se os derivados do oxigênio, compostos por 4
elétrons, o ânion superóxido (O
2
), o peróxido de hidrogênio (H
2
0
2
) e o radical hidroxila
(OH), que são reduzidos a 1 e 2 elétrons, respectivamente.
La Casa et al., (2000), relatam que o processo de peroxidação lipídica resulta no
aumento da atividade da enzima Xantino-Oxidase (XO) que, por sua vez induz aumento
da produção e da liberação de radicais livres. Isto traz como conseqüência também a
ativação dos leucócitos polimorfonucleares (PMN), que migram para o espaço
23
intersticial e com isso promovem a liberação de mais radicais livres, ocasionando
consequentemente inflamação e lesão do tecido (MOTILVA et al., 1996).
Também Villegas et al., (2001) relataram a importância da enzima
mieloperoxidase (MPO), enzima que serve como marcador enzimático de leucócitos e
permite a quantificação da ocorrência do processo inflamatório no tecido lesado. Sem
esquecer que outras enzimas como a superóxido desmutse (SOD) e a glutationa
peroxidase (GSH-px) apresentam-se com suas dosagens aumentadas em estudos de
ulceração gástrica.
Além disso, tem sido sugerido que os radicais livres gerados por neutrófilos
devem favorecer a formação de lesões crônicas induzidas pela administração de ácido
acético (ITO et al., 1998).
Sabe-se que a cimetidina, quando administrada em ratos submetidos à ulceração
por ácido acético, inibe a saída de secreção ácida e diminui o tamanho das lesões devido
a uma estimulação de fatores de crescimento como o fator de crescimento epidermal
(EGF) (TARNAWSKI et al., 2001). Ainda a cimetidina é considerada uma droga
amplamente usada como agente anti-secretório gástrico na prevenção e tratamento de
úlceras gástricas (DIAS et al., 2000).
A ulceração gástrica crônica induzida por ácido acético é uma lesão necrótica
profunda, a qual envolve toda a mucosa gástrica, penetrando através da camada
muscular da mucosa. A cicatrização da mucosa é um processo dinâmico de
preenchimento de defeitos da mucosa com proliferação e migração de células epiteliais
e tecido conectivo resultando na reconstrução da arquitetura da mucosa (TARNAWSKI
et al., 1995).
Vários estudos mostram também o envolvimento de hormônios gastrointestinais
como a gastrina na patofisiologia das úlceras gástricas (DOCKRAY, 1999), a
24
participação do peptídeo somatostatina e do fator de crescimento epidermal (EGF) na
cicatrização do processo ulcerogênico (TARNAWSKI et al., 2001).
Componentes que auxiliam não apenas no processo de cicatrização das lesões
gastroduodenais, como também contribuem com a qualidade da cicatrização destas
lesões, estão sob investigação.
Fatores de crescimento, como o EGF, são fatores de crescimento que se ligam à
receptores celulares de membrana do tipo tirosina quinase, os quais estimulam
elementos celulares importantes da cicatrização de úlceras como angiogênese,
granulação e re-epitelização tecidual (SZABO & VINCZE, 2000). A cicatrização é o
processo em que ocorre a substituição do tecido lesado por tecido conjuntivo
vascularizado (BRASILEIRO FILHO et al, 1994).
O EGF é um polipeptídeo com 53 aminoácidos sintetizado em glândulas
salivares, rim, glândula duodenal de Brunner’s, pâncreas, fígado e glândulas mamárias
de lactantes. Grandes quantidades de EGF têm sido encontrado no lúmem do trato
gastro-intestinal (ELLIOT et al., 2000).
Paula et al., 2007 mostram que o EGF, um fator cicatricial recentemente
descoberto na mucosa gástrica, está presente no estômago de roedores tratados com um
óleo essencial obtido das cascas de uma planta bastante comum na Amazônia, a espécie
Croton cajucara Benth, conhecida popularmente como “sacaca”. Este estudo fornece
um novo mecanismo de ação antiulcerogênico da planta, já que mecanismos
citoprotetores em roedores, foram evidenciados por Hiruma-Lima e colaboradores no
ano de 2002.
Também Toma et al., 2004 demonstraram que o EGF foi encontrado no
estômago de roedores tratados com alcalóides obtidos de Senecio brasiliensis, e que os
mesmos têm o papel de favorecer a cicatrização de úlceras gástricas.
25
Fatores de crescimento como o EGF, fator de crescimento transformador-α
(TGF-α) e fator de crescimento fibroblasto básico (bFGF) participam da proteção da
mucosa e cicatrização de úlcera. O EGF e TGF-α estimulam a produção de muco
oferecendo proteção gástrica contra agentes agressores. Inibidores da bomba de prótons
influenciam fatores de crescimento de forma positiva, diminuindo a secreção gástrica
(BLANDIZZI et al, 1999).
Muitos produtos farmacêuticos têm sido usados no tratamento de úlcera
gastroduodenal e doença péptica. Muitas vezes, esse tratamento não cicatriza as lesões
gástricas com qualidade e conseqüentemente a recidiva dessas lesões é considerado um
fator comum (TOMA et al., 2002). Assim, a terapia de úlceras gástricas e duodenais
continua sendo um importante objetivo da pesquisa nesta área.
1.4. Propriedades farmacológicas da Maytenus ilicifolia
O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas tem evoluído com a
civilização e, por um longo tempo, produtos de origem mineral, animal e de plantas
foram as principais origens de drogas (RATES, 2000). Nos últimos anos, tem havido
um crescente interesse na terapêutica natural, especialmente naquela derivada de
plantas. Isso se deve ao fato do uso abusivo e/ou incorreto de drogas sintéticas e o e ao
difícil acesso da população à tratamentos farmacológicos, resultando em efeitos
colaterais indesejáveis.
Ainda Rates (2000) relata que o uso potencial de muitas plantas como origem de
novas drogas é ainda pouco explorado, sendo pequena a investigação relacionada às
suas propriedades farmacológicas e composição fitoquímica.
Maytenus
ilicifolia
,
planta da família Celastraceae, conhecida como espinheira-
santa, está distribuída em regiões tropicais e subtropicais do Brasil (Figura 1). Esta
26
espécie é amplamente empregada na medicina popular no tratamento de dispepsias e
úlcera gástrica. Vários estudos foram realizados avaliando a ação antiinflamatória,
antiulcerogênica e antifúngica de M. ilicifolia (DUARTE & DEBUR, 2004).
Também Rattmann et al., 2006 relataram que a infusão das folhas de M ilicifolia
pode ser usada como contraceptivo e também contra o câncer.
Figura 1: Folhas da espécie em estudo Maytenus ilicifolia (Celastraceae).
Oliveira et al, 1991, em trabalho realizado com duas espécies de Maytenus
(Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium), demonstraram ausência de efeitos tóxicos,
inclusive efeitos abortivos e teratogênicos. Os mesmos relatos de ausência de toxicidade
foram evidenciados por Ferreira et al., 2004 em três meses de observação em animais de
27
experimentação. Assim, mesmo em doses extremamente elevadas, não foi possível
estimar a dose letal 50% (DL
50
).
As propriedades farmacológicas de M. ilicifolia podem ser justificadas pela
presença de compostos fenólicos tais como taninos, flavonóides e triterpenos (JORGE
et al, 2004). Flavonóides são agentes antiinflamatórios, pois diminuem a formação de
mediadores pró-inflamatórios como prostaglandinas, leucotrienos, espécies reativas de
oxigênio e óxido nítrico. Os mesmos autores relatam que triterpenos tem efeito
antiulcerogênico devido à capacidade de estimular a produção de muco ou de manter o
conteúdo de prostaglandinas elevado na mucosa gástrica.
Também vale a pena ressaltar que análises fitoquímicas têm revelado a presença
de variados compostos químicos como maytenina e pristimerina, flavonóides
glicosídicos, ainda catequina e epicatequina, triterpenos e triterpenóides presentes nas
folhas e raízes de Maytenus ilicifolia (RATTMANN et al., 2006).
Os mesmos autores relatam que o efeito antiinflamatório e antinociceptivo
foram comprovados, além da propriedade de reduzir a severidade de lesões gástricas
induzidas pelo método de estresse e contenção ao frio. Esta propriedade anti-úlcera se
deve à presença de compostos polifenóicos como taninos condensados e flavonóides,
assim como triterpenos presentes no extrato de M. ilicifolia.
Cipriani et al., 2006, também realizaram testes fitoquímicos com M ilicifolia e
isolaram um polissacarídeo, a arabinogalactana do tipo II, que está relacionada com a
atividade anti-úlcera. Neste trabalho, os autores realizaram um pré-tratamento com
arabinogalactana seguido da indução de úlcera por etanol e verificou um efeito
citoprotetor da mucosa gástrica. O mecanismo sugerido foi que as substâncias contidas
em M. ilicifolia têm a propriedade de se ligar à superfície da mucosa gástrica e formar
uma camada citoprotetora, contribuindo com a atividade anti-secretória e com a
28
proteção da mucosa gástrica por aumentar a produção de muco e por remover radicais
livres.
Vellosa et al., 2006 demonstraram que a espécie em estudo apresenta poderoso
potencial anti-oxidante devido à presença de polifenóis e flavonóides neutralizantes de
radicais livres ao testarem o extrato obtido das cascas e da raiz de M. ilicifolia. Sabendo
que os radicais livres estão envolvidos em várias patologias como doenças
degenerativas, envelhecimento e câncer, o extrato de M. ilicifolia pode ser útil no
tratamento de doenças mediadas por estes componentes.
Novos fármacos obtidos de produtos naturais inibiram a produção de radicais
livres de oxigênio em neutrófilos, efeito bastante útil no tratamento de úlceras por etanol
e estresse, pois sua patofisiologia está associada a um excesso da produção de radicais
livres de oxigênio na de mucosa gástrica (BLANDIZZI et al, 1999).
O extrato aquoso liofilizado de M. ilicifolia inibiu a secreção ácida gástrica em
mucosa gástrica isolada de rã devido a um possível efeito antagonista sobre receptores
histamínicos H
2
(FERREIRA et al., 2004). De forma semelhante à cimetidina, os
mesmos autores verificaram que o extrato de M. ilicifolia, inibiu a secreção ácida
gástrica basal, assim como também a secreção ácida estimulada por histamina.
Por fim, esses autores relataram que a ação gastroprotetora do extrato aquoso
liofilizado das folhas de M. ilicifolia se deve a presença de compostos fenólicos (taninos
condensados).
De acordo com Galvez et al., 2000a, doenças inflamatórias crônicas do trato-
gastrointestinal (TGI), estariam relacionadas diretamente à uma resposta anormal e
desordenada do sistema imunológico mediante um estímulo inócuo, envolvendo
diversos mediadores da inflamação. Um intenso desequilíbrio bioquímico relacionado à
29
tentativa de regulação do sistema imunológico também contribuiria para a instalação
dessas patologias.
Por outro lado, radicais livres derivados do oxigênio e também do nitrogênio
têm sido propostos como agentes envolvidos no aparecimento e desenvolvimento de
úlcera e doença de Crohn, os quais seriam indicativos de estresse oxidativo no tecido
gastrointestinal (HARRIS et al., 1992).
Hoje, o tratamento de doenças do trato-gastrointestinal (TGI) consiste de drogas
com atividade antiinflamatória e/ou antioxidante como sulfasalazina e o ácido 5-
aminosalicílico; porém até o momento, nenhuma droga foi totalmente eficaz em
promover a cura destas lesões ou então capaz de impedir seu aparecimento.
Amostras vegetais com propriedades antioxidantes, principalmente flavonóides,
tem sido também avaliadas em modelos experimentais relacionados a esta patologia e os
bons resultados obtidos indicam que esta classe de compostos químicos como futura
classe terapêutica para o tratamento de afecções do TGI (GALVEZ, et al., 1994;
GALVEZ et al., 2000a; GALVEZ et al., 2000b).
Desta forma várias plantas medicinais têm sido usada para tratar desordens do
trato gastrointestinal (Gracioso et al., 2000; Hiruma-Lima et al, 2002; Toma et al.,
2004, Paula et al.; 2006); isto é uma importante razão para investigar o efeito
antiulcerogênico de plantas medicinais com uso tradicional na doença gástrica.
1.5.Espectroscopia de Ressonância do Spin Eletrônico e
Atividade Anti-Oxidativa
A Espectroscopia por Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) é uma técnica
capaz de detectar qualquer sistema com spin eletrônico resultante diferente de zero.
30
Dentre os diversos materiais que possuem essa característica, destacam-se os radicais
livres, pois os mesmos estão presentes em diversos processos biológicos, como no
objetivo do nosso estudo, as lesões gástricas.
Na RSE, a amostra interage com um campo magnético externo e, ao mesmo
tempo, um campo de microondas. O campo magnético externo tem como função
orientar os spins presentes na amostra, os quais adquirem duas orientações: paralela e
anti-paralela ao campo. O estado paralelo é o de menor energia, enquanto que o estado
anti-paralelo é instável e de maior energia. Quando a separação entre esses dois níveis
corresponde à energia do campo de microondas, ocorre o fenômeno da ressonância.
Nesta situação, ocorre uma absorção líquida do campo de microondas, conseqüência da
transição entre os dois níveis de energia, o qual é registrado pelo equipamento. Quanto
maior o número de spins (ou concentração de radicais livres), maior será a absorção de
energia do campo de microondas (SWARTZ et al., 1972), possibilitando o uso desta
técnica para quantificar os radicais livres presentes em uma determinada amostra.
A atividade anti-oxidativa de substâncias pode ser monitorada através de reações
envolvendo radicais livres. A substância mais utilizada para esta aplicação é o DPPH
(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Esta molécula é caracterizada como um radical livre
estável, por possuir um elétron desemparelhado que virtualmente desloca-se pela
molécula toda, sem dimerizar, como ocorre com a maioria dos outros radicais (figura
2a). Esta deslocalização também dá origem a uma cor violeta escura à solução, com
uma banda de absorção óptica em 520nm. Quando esta molécula reage com uma
substância doadora de Hidrogênio, ela tem sua coloração alterada para amarelo escuro, e
passa a ter a conformação mostrada na figura 2b (MOLYNEUX, 2003).
31
(a) (b)
Figura 2: Molécula de DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (a) Radical Livre e (b)
sem Radical Livre.
Classicamente esta molécula é utilizada em testes de ação anti-oxidativa de
substâncias pela da espectrofotometria, através da mudança de sua coloração de violeta
para amarelo. Porém, sabe-se na prática, que nem sempre esta alteração é perceptível à
técnica trazendo erros na quantificação.
A Ressonância do Spin Eletrônico é uma técnica capaz de detectar os radicais
livres diretamente e possui alta sensibilidade. O número mínimo de spins necessários
para gerar um espectro com boa relação sinal/ruído é em torno de 2.10
11
spins, o que
corresponde a uma concentração em torno de 3.10
-9
M (SWARTZ et al., 1972). Por
apresentar uma maior precisão em relação à espectroscopia óptica, a RSE vem sendo
amplamente utilizada para esta aplicação. Na prática, a ação anti-oxidativa é avaliada
pela comparação do espectro do DPPH reagindo com a substância teste e sem reagir
com a mesma.
Outro procedimento bastante utilizado para estes estudos é através da reação de
Fenton, onde o radical OH é gerado. Como este radical é altamente reativo, sua duração
é muito curta, impossibilitando sua detecção. Para que ele possa ser detectado por RSE,
32
utiliza-se a técnica conhecida como spin-trap. Neste procedimento, durante a reação de
Fenton, associa-se a molécula DMPO (5,5-dimethyl N-oxide pyrroline), o qual reage
com o radical OH, formando um aduto de spin: DMPO-OH, que é um composto estável
e possível de ser detectado por RSE. Desta forma, a ação de substâncias sobre o radical
OH pode ser avaliado por RSE, utilizando a reação de Fenton e medindo e comparando
as intensidades do aduto de spin DMPO-OH das soluções com e sem a substância teste.
A RSE foi utilizada em vários trabalhos para avaliação de substâncias anti-
oxidantes naturais. Trouillas et al., (2003) estudaram a atividade anti-oxidativa, anti-
inflamatória e antiproliferativa do extrato de 16 plantas (Filipendula
ulmaria,Lithospermum officinal, Alchemilla vulgaris, Rosmarinius officinalis, Achillea
millefolium, Betula pendula, Hieracium pilosella, Equisetum arvensse, Lamium album,
Cynara scolymus, Humulus lupulus, Vaccinium myrtillus, Chamomilla recutita, Lotus
corniculatus, Melilotus officinalis, Urtica dioýica) popularmente utilizadas em forma de
chá em Limousin (França). O estudo da atividade anti-oxidativa foi realizada através da
reação dos extratos das plantas com uma solução de radical livre estabilizada DPPH e
através da reação de Fenton.
Através do registro dos espectros da solução de DPPH reagindo com água
(referência) e com o extrato de M. ilicifolia, calculou-se o percentual inibitório do
radical, para cada planta, através da dupla integração do sinal de RSE e da fórmula (1):
bgref
extractref
ratioinibition
−
−
=_
(1)
onde:
-inibition_ratio: é o percentual de oxidação obtido pelo uso do extrato, ref, extract e bg
referem-se ao resultado da dupla integração do sinal de RSE da referência
33
(DPPH+água), do extrato (DPPH+extrato) e do sinal de fundo (tubo vazio),
respectivamente. O mesmo procedimento foi adotado para avaliar o efeito das
substâncias no radical OH, através da reação de Fenton com e sem os extratos. Os
resultados da ação anti-oxidante dos extratos foram correlacionados com as
propriedades anti-inflamatórias e anti-proliferativa (de células tumorais) para cada
planta.
Okawa et al, (2001) também utilizaram o DPPH e RSE para monitorar a
atividade anti-oxidativa de flavonóides obtidos de plantas medicinais (Hordeum vulgare
var. nudum, Scutellaria baicalensis, Sophora japonica, Ephedra sinica, Cinnamomum
cássia, Glycine max, Silybum marianum).
Também Kurihara et al., (2003) utilizaram o DMPO-OH e RSE para avaliar o
efeito anti-oxidativo do chá “Oolong” no estado oxidativo da LDL (Low Density
Lipoprotein).
Assim sabendo que o processo de ulcerogênese envolve a participação de
radicais livres, e que novos fármacos obtidos a partir de produtos naturais mostram
inibição na produção de radicais livres de oxigênio, melhorando a patologia da úlcera
gástrica, faz-se necessário o estudo de novas drogas, como o da espécie em estudo,
Maytenus ilicifolia.
34
II Objetivos:
Neste trabalho foi estudada a atividade anti-oxidativa, preventiva e cicatrizante
do extrato das folhas da espécie Maytenus ilicifolia, uma espécie de planta pertencente à
família CELASTRACEAE. A atividade anti-ulcerogênica de M ilicifolia foi realizada
em animais para ser avaliado o grau de severidade das lesões gástricas, presentes no
processo de prevenção e cicatrização das úlceras gástricas. Um estudo paralelo de
atividade anti-oxidativa foi avaliado in vitro pela Espectroscopia de Ressonância do
Spin Eletrônico (RSE).
35
III. Materiais e Métodos
3.1. Obtenção do Extrato da Maytenus ilicifolia
As folhas de Maytenus ilicifolia, depois de secas à 40º C em estufa de circulação
de ar e devidamente trituradas em moinho de facas, foram colocadas em contato com o
solvente etanol (70%). Após filtração, o solvente foi evaporado em rotoevaporador. A
seguir foi realizada a partição usando água:diclorometano (1:1, v/v), separando
compostos polares e apolares, respectivamente.
A liofilização foi usada para secar a fração polar utilizada em ensaios de
atividade anti-oxidante e o rotoevaporador foi usado para secar o solvente da fração
apolar, a qual foi testada em animais para verificação da atividade anti-ulcerogênica.
3.2. Animais
Para determinação da atividade antiulcerogênica de M. ilicifolia foram utilizados
ratos, machos, Wistar (250 ± 50) e ratos fêmeas, Wistar com 9 semanas (185g). Todos
os animais foram aclimatados às condições do biotério antes da manipulação
experimental, sob temperatura (23 ± 2º C) e ciclos claro-escuro de 12 horas controlados.
Os animais foram alimentados com ração NUVILAB e tiveram livre acesso à água.
Os protocolos experimentais foram analisados pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Universidade do Sagrado Coração (PROTOCOLO No
048/06 em anexo). A avaliação do projeto seguiram as recomendações do Canadian
Council on Animal Care (OLFERT et al; 1993).
36
3.3. Avaliação da atividade preventiva da Maytenus ilicifolia
3.3.1.Úlcera induzida pelo etanol
Modelo agudo: úlcera induzida por HCl/ etanol (MIZUI & DOTEUCHI, 1983)
Após 24h de jejum, os grupos experimentais foram tratados uma hora antes da
indução da lesão gástrica. Grupos de animais receberam lansoprazol 30mg/Kg (controle
positivo), água (controle negativo) e o extrato de Maytenus ilicifolia. Todos os
tratamentos foram realizados por via oral, em dose-volume final de 10ml/Kg.
A lesão gástrica foi induzida pela administração oral de 0,2 ml de uma solução
0,3M HCl/etanol 60%. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 1 hora
após a administração do agente lesivo; em seguida, os estômagos foram retirados e
inflados com 2,0 ml de solução de NaCl 0,9% e abertos ao longo da grande curvatura.
Após este procedimento, os estômagos permaneceram em formalina 5% durante um
período adicional de 30 minutos para fixação das lesões ulcerativas, e posterior
determinação do índice de lesões ulcerativas (ILU).
3.4. Avaliação da atividade cicatrizante da Maytenus ilicifolia
3.4.1.Úlcera induzida por ácido acético em ratos
Os experimentos foram realizados de acordo com o método de Takagi et al.,
(1969) com ratos sob jejum de 24h, com acesso livre a água. Sob anestesia (ketamina e
copazine), os estômagos desses animais foram expostos e foi injetado 0,05 ml de uma
solução de ácido acético 30% na camada subserosa da porção glandular do estômago.
Após 2 dias, foram iniciados os tratamentos, por via oral (uma vez ao dia) das amostras
de Maytenus ilicifolia (500 mg/Kg da fração apolar), ranitidina (100mg/Kg) e Tween 80
à 12% por 14 dias consecutivos. Um dia após a última administração das drogas, os
37
animais foram sacrificados, os estômagos removidos e abertos no sentido da maior
curvatura para determinação das lesões gástricas. As lesões foram determinadas através
da medida do comprimento e da largura das mesmas, com o auxílio de um paquímetro
digital Digimatic (Mitutoyo Corporation, Japan) sendo seu resultado expresso em mm
2
.
A fórmula (2) usada para indicar o índice de cicatrização ou índice de cura foi:
controleárea
tratadoáreacontroleárea
curade
−
=(%)
(2)
3.5.Modelo crônico de ulceração por etanol
Indução de úlcera gástrica pela administração diária de uma solução alcoólica à 25%
(Guerreiro 1990)
Ratas albinas Wistar foram aleatoriamente distribuídas em 2 grupos
experimentais: controle (n=10) e tratado (n= 12).
Os 10 animais do grupo controle foram divididos em 3 gaiolas, sendo 2 gaiolas
com 3 animais e 1 gaiola com 4 animais. O grupo tratado foi dividido em 4 gaiolas com
3 animais cada.
No grupo tratado foi administrado álcool etílico absoluto à água em
concentrações crescentes de 1%, 8%, 15%, 20%, e 25%, alteradas semanalmente,
evitando assim que houvesse abstinência ou, perda de interesse dos animais, pela
solução preparada.
O grupo controle recebeu apenas água. As soluções alcoólicas e a água para o
grupo controle, foram trocadas nas segundas, quartas e sextas-feiras, sempre no mesmo
horário.
38
Após o período de pré-gestação, as ratas foram colocadas com machos da
mesma idade e espécie, não alcoólatras, na proporção de duas fêmeas para um macho,
por 3 noites. Durante este período, tanto as ratas controle como as do grupo tratado,
receberam ração ad libitum e água pura. O terceiro dia foi considerado dia 0 de
gestação.
Após o acasalamento, as ratas controles e tratadas foram separadas em pares,
mantidas em gaiolas com suas respectivas dietas. O grupo controle recebeu água ad
libitum e o grupo tratado 25% de solução alcoólica. Os animais foram pesados
semanalmente.
Do grupo tratado, 6 ratas (mães) e 5 filhotes foram mantidos por mais 35 dias
(estando com aproximadamente 45 dias de vida) recebendo solução alcoólica a 25%, os
quais foram, então, sacrificados para retirada dos estômagos e porção proximal do
duodeno para posterior análise histopatológica. Também foram analisados os referidos
órgãos de 1 rata do grupo controle para comparação.
3.6. Análise Morfológica
Após o sacrifício dos animais submetidos à úlcera induzida por ácido acético; as
amostras dos estômagos coletadas foram imersas em paraformoldeído 4% por 24 horas,
lavadas em tampão PBS (3x por 10 min), desidratadas em série crescente de álcool,
diafanizadas com xilol e embebidas em Paraplast à 59 ºC. Cortes com 6 µm de
espessura, obtidos em micrótomo semi-automático (RM 2155 Leica) foram coletados
em lâminas previamente preparadas com albumina. Posteriormente os cortes das peças
foram corados com hematoxilina e eosina (Junqueira & Carneiro, 2005). As imagens
foram analisadas e capturadas por um fotomicroscópio (Zeiss) acoplado a uma câmera
digital (Leica DFC 280), para verificar a ação antiulcerogênica de Maytenus ilicifolia.
39
3.7. Avaliação da atividade Anti-Oxidativa da Maytemus ilicifolia por
Ressonância do Spin Eletrônico (RSE)
A avaliação da atividade Anti-Oxidativa do extrato das folhas da planta em
estudo foi realizada in vitro por RSE, através da reação deste extrato com o DPPH e
com o DMPO-OH, conforme descrito na introdução.
No primeiro experimento, 100µl da solução etanólica de DPPH (1mM) foi
misturada a 100µl da solução do extrato em diferentes concentrações e também a 100µl
de água (referência). Esta mistura foi colocada em um tubo capilar, que foi transferido a
um tubo de quartzo, próprio para medidas no espectrômetro. Os compostos foram
realizados em triplicata e seus espectros foram registrados no espectrômetro.
Os parâmetros de aquisição dos espectros foram: Campo Central 3380G,
modulação 1G, varredura 100G, tempo de varredura 1minuto, potência de microondas
50mW. Todas as medidas foram realizadas em triplicata e a intensidade da linha central
(I) foi utilizada como parâmetro indicador da concentração do radical livre. A figura
(3), a seguir, mostra o espectro do radical DPPH, e o processo utilizado para medir (I).
40
Figura 3: Espectros de RSE do DPPH (1mM) após reação com água, em iguais volumes
(100µL). A intensidade da linha central, indicada por I foi utilizada como indicador da
concentração do radical livre. Neste caso, I= (4,49 ± 0,28).10
-5
.
A intensidade dos espectros relativos a cada concentração de extrato foi utilizada
para construir a curva Intensidade versus concentração de Extrato. Estes dados
experimentais foram ajustados pela função exponencial a seguir (equação 3), utilizando
o software Microcal Origin, onde I representa a intensidade e c representa a
concentração:
cb
eAI
.
.
−
=
(3)
3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440
-3.0x10
-5
-2.0x10
-5
-1.0x10
-5
0.0
1.0x10
-5
2.0x10
-5
3.0x10
-5
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (G)
I
41
A fim de correlacionar estes resultados com os experimentos in vivo, realizamos
o mesmo procedimento com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia nas
concentrações de 30mg/ml e 50mg/ml, que foram as concentrações utilizadas nos
experimentos in vivo. Realizamos o experimento também com a concentração de
2mg/ml que corresponde aproximadamente ao chá, utilizado popularmente.
No segundo experimento, utilizamos a reação de Fenton para gerar o radical OH
e testar a eficácia do extrato contra este radical. Nesta reação, foram utilizados volumes
iguais (50 µl) de Fe(SO
4
)(10mM), H
2
O
2
( 100mM), DMPO (200mM) e tampão fosfato
10mM. A esta mistura, foram adicionados 50µl de água (referência) e 50µl das soluções
dos extratos em diferentes concentrações (0 a 50 mg/ml). Os espectros de RSE desta
mistura foram registrados alguns minutos após a reação. Os compostos foram feitos em
triplicata e os parâmetros de aquisição dos espectros foram: Campo Central 3380G,
modulação 1G, varredura 100G, tempo de varredura 1minuto, potência de microondas
100mW. A intensidade da primeira linha central foi utilizada como parâmetro indicador
da concentração do radical livre. A figura 4 mostra os espectros do aduto de spin
DMPO-OH após reagir com água e exemplifica o procedimento adotado para se obter a
média e o desvio padrão das intensidades (I). De forma análoga ao experimento
anterior, a intensidade dos espectros relativos a cada concentração de extrato foi
utilizada para construir a curva Intensidade versus concentração de Extrato e a equação
4 foi utilizada para o ajuste dos dados experimentais.
42
Figura 4: Espectros de RSE do DMPO-OH após reação de Fenton utilizando água. A
intensidade da linha central, indicada por I foi utilizada como indicador da concentração
do radical livre. I= (2,33 ± 0,30).10
-4
.
3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440
-1.8x10
-4
-9.0x10
-5
0.0
9.0x10
-5
1.8x10
-4
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (G)
I
43
Para o estudo da cinética da reação de Fenton com o extrato, realizamos outro
experimento onde um espectro foi registrado a cada minuto, após a reação. Utilizamos a
reação com água, como parâmetro, e a reação com extrato em concentração de 2,5
mg/ml.
Os dados experimentais das intensidades em função do tempo foram ajustados
pela função exponencial a seguir (equação 4), utilizando o software Microcal Origin,
onde I é a intensidade do sinal, t o tempo, A, B, k
1
e k
2
são parâmetros do ajuste da
curva.
tktk
BeAeI
21
−−
+=
(4)
3.8. Análise dos resultados
3.8.1. Atividade antiulcerogênica de Maytenus ilicifolia
Os resultados farmacológicos foram expressos como média ± desvio padrão da
média, seguidos da análise de variância de uma via (ANOVA). Posteriormente segue-se
o teste de Dunnet, quando se quer comparar cada grupo teste em relação aos resultados
obtidos com o grupo controle. Ainda usa-se o teste de Tukey, quando se busca a
comparação de cada amostra entre si. O nível de significância foi de p<0.05.
3.8.2.Avaliação da atividade Anti-Oxidativa da Maytenus ilicifolia por RSE
Conforme descrito na seção anterior, a média e o desvio padrão da intensidade
do espectro foi adotado como indicador da concentração do radical livre. Os dados
experimentais foram ajustados por funções exponenciais utlizando-se o software
Microcal Origin 7.5.
44
IV. Resultados
4.1. Estudo in vivo da atividade anti-ulcerogênica de Maytenus ilicifolia:
úlcera induzida por HCl/etanol
Em experimentos de úlcera induzida por HCl/etanol, foi possível verificar que Maytenus
ilicifolia nas doses de 300 e 500 mg/Kg previniu a formação de lesões gástricas em
42,2% e 72,0 % (p<0,05 e p<0,001, respectivamente) quando comparado com o
controle negativo. Lansoprazol usado como controle positivo neste modelo
experimental, previniu a formação de úlceras em 50,6 %, p<0,05 (Figuras 5,6,7 e 8).
Nas figuras 6,7 e 8 a avaliação morfológica complementa os dados de farmacologia de
indução de úlcera gástrica por HCl/etanol. É possivel notar que em (A) nas figuras 6,7 e
8 o agente ulcerogênico danificou todo o revestimento epitelial produtor de muco
gástrico, assim como também a camada mucosa do estômago de roedores. Nas figuras 6
e 7 (B), a adminstração oral de Maytenus ilicifolia nas doses de 300 e 500 mg/Kg
(respectivamente) uma hora antes do agente ulcerogênico HCl/etanol, previniu a
formação de úlceras no estômago dos animais, conservando assim as características de
citoproteção da mucosa gástrica.
Na figura 8 (B) é possível notar que o controle positivo lansoprazol na dose de 30
mg/Kg, previniu a formação de úlcera gástrica nos animais de experimentação, quando
comparado ao controle negativo (figura 8 A), onde é possível observar exfoliação do
epitélio de revestimento superficial e acentuada hiperemia.
45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
tratamentos
ILU (mm
2
)
água
lanzo
ES (300 mg/Kg)
ES (500 mg/Kg)
Figura 5: Efeito preventivo de Maytenus ilicifolia (espinheira santa nas doses de 300 e
500mg/Kg) e do controle positivo lansoprazol (via oral) em modelo de ulceração aguda
HCl/etanol em camundongos.Os resultados estão apresentados como média e erro
padrão da média de 7 animais em cada grupo. ANOVA F
(4, 24)
= 3,20 para ILU (mm
2
).
Teste de Tukey: * p<0,05 e * p<0,001.
*
*
*
46
Figura 6: Foto mostrando as características histológicas da ulceração aguda por
HCl/etanol em camundongos tratados com o controle negativo (A, Aumento 10X);
notar hiperemia e exfoliação das células do epitélio de revestimento superficial. Em (B)
pré-tratamento dos animais com 300 mg/Kg do extrato de Maytenus ilicifolia; notar
oraganização do epitélio de revestimento superficial, com rara hiperemia (Aumento
40X, HE).
A
B
47
Figura 7: Foto mostrando as características histológicas da ulceração aguda por
HCl/etanol em camundongos tratados com o controle negativo (A); notar hiperemia e
exfoliação das células do epitélio de revestimento superficial (Aumento 10X, HE). Em
(B) pré-tratamento dos animais com 500 mg/Kg do extrato de Maytenus ilicifolia, notar
novamente a conservação da organização do epitélio de revestimento superficial, com
rara hiperemia (Aumento 40X, HE).
A
B
48
Figura 8: Foto mostrando as características histológicas da ulceração aguda por
HCl/etanol em camundongos tratados com o controle negativo (A); notar hiperemia e
exfoliação das células do epitélio de revestimento superficial (Aumento 10X, HE). Em
(B) pré-tratamento dos animais com 30 mg/Kg de lansoprazol, notar novamente a
conservação da organização do epitélio de revestimento superficial, sem hiperemia
(Aumento 40X, HE).
A
B
49
4.2. Estudo da atividade cicatrizante de Maytenus ilicifolia: úlcera crônica
induzida pelo ácido acético.
A seguir, também foi avaliada a ação curativa de Maytenus ilicifolia em experimento de
ulceração crônica induzida por ácido acético 30%, na mucosa gástrica de roedores.
Após a indução da úlcera, esperou-se 48 horas para o início do tratamento diário com
M. ilicifolia por via oral, durante 14 dias consecutivos.
A atividade curativa de Maytenus ilicifolia na dose de 500 mg/Kg mostrou que a
espécie em estudo cicatrizou em torno de 60% as lesões induzidas pelo ácido acético de
maneira significativa (p<0,001; figuras 9 e 11) quando comparado ao controle negativo
tween (Figura 10). Ranitidina usada como controle positivo mostrou uma atividade
cicatrizante da ordem de 58% (p<0,001; figura 12); resultado semelhante ao registrado
por Maytenus ilicifolia (Figura 11).
Na figura 10 (A, B) onde há a evidência de lesões gástricas, o tratamento por 14 dias foi
realizado somente com o controle negativo tween. É possível notar que tanto o epitélio
produtor de muco gástrico quanto a camada mucosa, apresentam-se desorganizados,
perdendo as características funcionais da mucosa gástrica. Também é evidenciada a
presença de hiperemia, a qual é comum em estômago afetado pelo processo
ulcerogênico.
Nas figuras 11 e 12 (A,B), as lesões gástricas induzidas pelo ácido acético foram
cicatrizadas pelo tratamento diário de M. ilicifolia (500mg/Kg) e pelo controle positivo
ranitidina (100mg/Kg) em 14 dias. É possível notar que o epitélio de revestimento
superficial, assim como a camada mucosa encontram-se íntegros, recuperando as
características funcionais da mucosa gástrica.
50
0
5
10
15
20
25
30
35
tween ranitidina ES
ILU (mm
2
)
Figura 9: Índice de lesão ulcerativa (ILU) causada pela administração de ácido acético
na mucosa gástrica de roedores. Os animais foram tratados por 14 dias (via oral) com
tween (controle negativo), ranitidina (controle positivo) e a planta teste espinheira santa
(ES).
Os resultados estão apresentados como média e erro padrão da média de 7 animais em
cada grupo. ANOVA F
(3, 18)
= 2,84 para ILU (mm
2
). Teste de Dunnett´s: * p<0,001.
*
*
51
Figura 10: Indução de úlcera por ácido acético 30% na mucosa gástrica de roedores (A,
B), tratados com o controle negativo tween. É possível notar que tanto o epitélio de
revestimento superficial, quanto a camada mucosa do estômago (glândulas e fossetas
gástricas) encontram-se desorganizados (A) (Aumento 20X, HE), também é possível
verificar intensa vascularização local (hiperemia) e lesão gástrica (B) (Aumento 40X,
HE).
A
B
52
Figura 11: Foto mostrando a cicatrização da mucosa gástrica em animais tratados com
500mg/Kg de Maytenus ilicifolia, via oral, por 14 dias consecutivos (A,B), após a
indução de úlcera crônica por ácido acético 30%. É possível notar que o epitélio
produtor de muco gástrico e a camada mucosa do estômago de roedores estão íntegros
em A (aumento 20X, HE) e B (Aumento 40X, HE).
B
A
53
Figura 12: Foto mostrando a mucosa gástrica de roedores cicatrizada por ranitidina
(100mg/Kg) durante 14 dias de tratamento após ulceração por ácido acético 30%. O
epitélio de revestimento superficial e a camada mucosa encontram-se íntegros com rara
hiperemia (Aumento 20X em A e 40X em B, HE).
A
B
54
4.3. Indução de úlcera crônica através da ingestão diária de uma solução
alcóolica à 25%.
Em experimentos crônicos usando como agente lesivo o etanol (25%), observou-se que
a mucosa gástrica das mães que receberam tratamento do agente lesivo por 60 dias
apresentou sérias lesões na mucosa gástrica e intensa hiperemia (Figura 13). Já os
filhotes, que receberam tratamento intra-uterino de etanol 25% e continuaram a receber
após o nascimento, apresentaram intensa hiperemia na mucosa gástrica, mas não
apresentaram úlceras (Figura 14).
Nas mesmas condições experimentais em que foram analizados os estômagos de
roedores (mães e filhotes) submetidos ao tratamento crônico com a solução alcoólica de
etanol a 25%, foram analizadas também as mucosas intestinais desses animais. Na
figura 15 (A), é possível notar que o tratamento com a solução alcoólica à 25% por 60
dias, causou no grupo das mães uma degeneração acentuada dos enterócitos (ou epitélio
da borda em escova), fazendo com que as vilosidades intestinais desses animais
tivessem sua capacidade absortiva prejudicada.
Na figura 15 (B) o tratamento dos roedores filhotes com solução alcoólica à 25%
aparentemente não danificou a mucosa intestinal, isto relata uma certa resistência desses
animais frente ao agente lesivo, mostrando que provavelmente esses animais se
adaptaram ao processo ulcerogênico dentro do útero materno.
55
Figura 13: Em (A) Estômago de roedor (mãe) tratada com etanol 25% por 60 dias.
Observar intensa vascularização local (hiperemia) e lesões na parede do estômago.
Nesta figura o tecido mostra um início de regeneração. Aumento original 20x – final
200x (HE).
Em (B) após o tratamento por 60 dias com etanol 25%, a mucosa gástrica apresenta
aumento de vascularização e lesões ulcerativas na parede do estômago. Aumento
original 20x – final 200x (HE).
B
A
56
Figura 14: Mucosa gástrica de roedor (filhote) com 45 dias de tratamento com etanol
25% (intra-uterino e após o nascimento, via oral). Em (A e B) nota-se intensa hiperemia
sem no entanto apresentar lesões na mucosa gástrica. Aumento original 20x – final 200x
(A) e Aumento original 40x – final 400x (B) (HE).
A
B
57
Figura 15: Intestino de roedor (mãe) mantida com soulção alcoólica a 25% por 60 dias.
Observar extremidades das vilosidades (degeneração acentuada dos enterócitos) (A).
Em (B) Intestino de roedor (filhote) mantido com solução alcóolica a 25% por 45 dias.
Observar as extremidades das vilosidades sem aparente degeneração dos enterócitos.
A
B
58
4.4. Estudo in vitro da ação anti-oxidativa de Maytenus ilicifolia por
Ressonância do Spin Eletrônico (RSE)
4.4.1.Experimentos do DPPH (2,2-Diphenyl -1 –picrylhydrazyl)
A figura 16 mostra os espectros do radical DPPH após reagir com água e com a
fração polar do extrato de M. ilicifolia em diferentes concentrações. Através destes
espectros podemos notar a ação anti-oxidativa de M. ilicifolia, observando-se a sua
capacidade de neutralizar o radical presente no DPPH.
Figura 16: Espectros de Ressonância do spin eletrônico (RSE) do radical DPPH (1mM)
após reação com água e com soluções da fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia
em diferentes concentrações.
3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440
-2.0x10
-5
-1.0x10
-5
0.0
1.0x10
-5
2.0x10
-5
3.0x10
-5
4.0x10
-5
5.0x10
-5
6.0x10
-5
7.0x10
-5
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (G)
0 mg/ml
0,5 mg/ml
1,0 mg/ml
1,5 mg/ml
2,0 mg/ml
2,5 mg/ml
59
A tabela 1 mostra os resultados referentes a cada concentração do extrato e a
figura 17 mostra os valores das intensidades da linha central dos espectros (I) em função
das concentrações do extrato, gerado com os dados da tabela 1.
A tabela 2 mostra os valores da taxa inibitória (inibition ratio), onde utilizamos a
intensidade do espectro ao invés da dupla integração, como indicador da concentração
do radical.
Tabela 1
:
Valores médios e desvio padrão da intensidade da linha central dos espectros de ressonância
do spin eletrônico (RSE) do radical DPPH após reação com a fração polar do extrato de Maytenus
ilicifolia.
Concentração (mg/ml) Intensidade (u.a.) Intensidade Relativa (%)
0 (4,49 ± 0,28).10
-5
(100,00 ± 6,24)
0,5 (2,69 ± 0,21).10
-5
(59,91 ± 4,68)
1,0 (2,21 ± 0,06).10
-5
(49,22 ± 1,34)
1,5 (0,66± 0,03).10
-5
(14,70 ± 0,67)
2,0 (0,33± 0,05).10
-5
(7,35 ± 1,11)
2,5 (0,24± 0,06).10
-5
(5,35 ± 1,34)
Tabela 2:
Taxa do potencial inibitório do extrato de Maytenus ilicifolia (fração polar do extrato) com
relação ao radical DPPH.
Concentração (mg/ml) Taxa inibitória (%)
0,5 40,09
1,0 50,78
1,5 85,30
2,0 92,65
2,5 94,65
60
Figura 17: Intensidade do sinal do radical DPPH (média e desvio padrão) em função da
concentração do extrato de Maytenus ilicifolia.
Os dados experimentais foram ajustados pela função exponencial (equação 1),
utilizando o software Microcal Origin, e os valores das constantes A e b de melhor
ajuste foram, respectivamente, (4.55 ± 0.33).10
-5
e (1,02 ± 0.14) ml/mg
A fim de correlacionar estes resultados com os experimentos in vivo, realizamos
a mesma reação com a fração polar de M. ilicifolia nas concentrações de 30mg/ml e
50mg/ml, que foram as concentrações utilizadas nos experimentos in vivo. Realizamos o
experimento também com a concentração de 2mg/ml que corresponde
aproximadamente ao chá, utilizado popularmente. Os resultados encontram-se na figura
18. Utilizando-se a figura 17 e a equação (1), podemos notar que a solução preparada
com 30mg/ml da folha proporciona o mesmo efeito da solução de 2,9 mg/ml do extrato
puro. A solução com 50mg/ml destruiu completamente o sinal do radical DPPH. O chá,
usado popularmente, na concentração de 2mg/ml, reduziu a intensidade do sinal em
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0.00
8.90x10
-6
1.78x10
-5
2.67x10
-5
3.56x10
-5
4.45x10
-5
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Intensidade Rel (%)
Intensidade
Concentração Extrato (mg/ml)
61
aproximadamente 36% e tem o mesmo efeito da solução aquosa do extrato liofilizado
de 0,5 mg/ml.
Figura 18: Espectros de RSE do DPPH após reação com água e soluções aquosa de
folhas de Maytenus ilicifolia nas concentrações de 2mg/ml, 30 mg/ml e 50 mg/ml.
332 334 336 338 340 342 344
-4.0x10
-5
-2.0x10
-5
0.0
2.0x10
-5
Solução 50mg/ml
Solução 30mg/ml
Amplitude
Campo Magnético (mT)
água
Chá 2mg/ml
62
4.4.2.Experimentos com DMPO
A figura 19 mostra os espectros do aduto de spin DMPO-OH após reagir com
água e com soluções aquosas de extrato liofilizado de M. ilicifolia com diferentes
concentrações. Este resultado mostra a eficácia do extrato em reduzir a concentração do
radical livre OH.
Figura 19: Espectros de ressonância do spin eletrônico (RSE) do DMPO-OH após
reação com água e com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia em diferentes
concentrações.
3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440
-2.0x10
-4
-1.0x10
-4
0.0
1.0x10
-4
2.0x10
-4
3.0x10
-4
4.0x10
-4
5.0x10
-4
50 mg/ml
20 mg/ml
10 mg/ml
5,0 mg/ml
2,5 mg/ml
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (G)
0 mg/ml
63
A tabela 3 mostra os resultados referentes a cada concentração do extrato e a
figura 20 mostra os valores das intensidades (I) em função das concentrações do extrato,
gerado com os dados da tabela 2. Os dados experimentais foram ajustados pela função
exponencial (equação 1), utilizando o software Microcal Origin, onde I representa a
intensidade e c representa a concentração e os valores das constantes A e b de melhor
ajuste foram, respectivamente, (2,2 ± 0,02).10
-4
e (0,07 ± 0,01) ml/mg. A tabela 4
mostra os valores da Taxa inibitória em %.
Tabela 3: Valores médios e desvio padrão da intensidade da primeira linha central dos espectros de
ressonância do spin eletrônico (RSE) do radical DMPO-OH após reação com a fração polar do extrato de
Maytenus ilicifolia em diferentes concentrações.
Concentração (mg/ml) Intensidade (u.a.) Intensidade Relativa (%)
0 (2,33 ± 0,3).10
-4
(100,00 ± 12,83)
2,5 (1,94 ± 0,06).10
-4
(83,26 ± 2,47)
5,0 (1,25 ± 0,10).10
-4
(53,64 ± 4,16)
10,0 (1,09± 0,14).10
-4
(46,78 ± 6,18)
20,0 (0,62± 0,06).10
-4
(26,61 ± 2,72)
50,0 (0,22± 0.03).10
-4
(9,53 ± 1,38)
64
Tabela 4: Potencial inibitório da fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia com relação ao radical
OH.
Concentração taxa inibitória (%)
2,5 mg/ml 16,74
5,0 mg/ml 46,35
10,0 mg/ml 53,22
20,0 mg/ml 73,39
50,0 mg/ml 90,47
65
Figura 20: Intensidade do sinal do aduto DMPO-OH (média e desvio padrão) em
função da concentração do extrato de Maytenus ilicifolia.
As figuras 21 A e 21 B mostram a evolução temporal da reação de Fenton com
água e as figura 22 A e 22 B, a reação de Fenton com o extrato de M ilicifolia com
concentração de 2,5 mg/ml (Tabela 5). As curvas 21 B e 22 B foram ajustadas pela
função (equação 2). A figura 23 mostra as duas curvas da evolução temporal.
0 10 20 30 40 50
0.0
4.7x10
-5
9.3x10
-5
1.4x10
-4
1.9x10
-4
2.3x10
-4
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
Intensidade Rel (%)
Concentração (mg/ml)
Intensidade (u.a.)
66
Figura 21 A: Espectros de Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) de DMPO-OH em
diferentes instantes de tempo após a reação de Fenton com água.
Figura 21 B: Intensidade da linha central do DMPO-OH em diferentes instantes de
tempo após a reação de Fenton com água.
3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440
-1.0x10
-4
-5.0x10
-5
0.0
5.0x10
-5
1.0x10
-4
1.5x10
-4
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (G)
4 minutos
7 minutos
12 minutos
20 minutos
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2.0x10
-5
4.0x10
-5
6.0x10
-5
8.0x10
-5
1.0x10
-4
1.2x10
-4
1.4x10
-4
1.6x10
-4
1.8x10
-4
2.0x10
-4
2.2x10
-4
tempo (minutos)
Data1_B
67
Figura 22A: Espectros RSE de DMPO-OH em diferentes instantes de tempo após a
reação de Fenton com a fração polar do extrato na concentração de 2,5 mg/ml.
Figura 22 B: Intensidade da linha central do DMPO-OH em diferentes instantes de
tempo após a reação de Fenton com a fração polar do extrato de Maytenus ilicifolia na
concentração de 2,5 mg/ml
3320 3340 3360 3380 3400 3420 3440
-5.0x10
-5
0.0
5.0x10
-5
1.0x10
-4
1.5x10
-4
Intensidade (u.a.)
Campo Magnético (G)
0 s
100s
220s
340s
1060s
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0.0
2.0x10
-5
4.0x10
-5
6.0x10
-5
8.0x10
-5
1.0x10
-4
1.2x10
-4
1.4x10
-4
1.6x10
-4
1.8x10
-4
Tempo (minutos)
curvatemporal_B
68
Figura 23: Intensidade da linha central do DMPO-OH em diferentes instantes de tempo
após a reação de Fenton com solução extrato de Maytenus ilicifolia na concentração de
2,5 mg/ml (curva verde) e com água (curva azul).
Tabela 5: Parâmetros de ajuste das curvas referentes à reação com água e com extrato de Maytenus
ilicifolia na concentração de 2,50 mg/ml
*
χ
2
= 2,7. 10
-12 **
χ
2
= 4,1 10
-12
Parâmetro Extrato 2,50 mg/ml
*
Água
**
A
(9,1 ± 2,1).10
-4
(5,3 ± 0,4).10
-4
k
1
(0,87 ± 0.09) (0,51 ± 0,04)
B
(1,60 ± 0,10) 10
-4
(1,2 ± 0,01).10
-4
k
2
(0,144 ±0,006) (0,078 ± 0,006)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0.0
2.0x10
-5
4.0x10
-5
6.0x10
-5
8.0x10
-5
1.0x10
-4
1.2x10
-4
1.4x10
-4
1.6x10
-4
1.8x10
-4
2.0x10
-4
2.2x10
-4
Água
Extrato
Intensidade
Tempo (minutos)
69
V.DISCUSSÃO
Úlceras gástrica e duodenal são patologias comuns que podem ser induzidas por
vários fatores como estresse, tabagismo, alcoolismo, deficiências nutricionais, drogas
anti-inflamatórias não-esteroidais (DAINEs) e sais biliares (Berenguer et al., 2006;
Jainu & Devi, 2006). Também fatores como predisposição genética, secreção ácida
alterada, rápido esvaziamento gástrico, falhas no mecanismo de defesa da mucosa
contribuem para o desenvolvimento desta patologia (QUAN & TALLEY, 2002).
Procedimentos cirúrgicos no tratamento da úlcera péptica foram substituídos por
intervenções farmacológicas (utilização de antagonistas de receptor H2 e de inibidores
de bomba protônica) consideradas estratégias eficazes contra desordens gástricas
(BRZOZOWSKI, 2003). Entretanto, esses agentes farmacêuticos não são
completamente efetivos e podem provocar efeitos adversos (ALPER, 1993). Extratos e
princípios ativos de plantas serviriam como um guia para o desenvolvimento de novas
drogas (GONZALES et al., 2000).
De acordo com Jainu & Devi (2006), as lesões gástricas se desenvolvem
quando há um desequilíbrio entre os fatores protetores e agressivos da mucosa. Também
sabe-se que a infecção por Helicobacter pylori e outros agentes agressivos como
secreção ácida e pepsina, alterações em agentes protetores da mucosa como
bicarbonato, muco, fluxo sanguíneo, regeneração celular, prostaglandinas, fator de
crescimento epidermal (EGF) e ainda drogas antiinflamatórias não esteroidais
(DAINES) são os maiores responsáveis por danos à mucosa gastroduodenal (PAWLIK
et al, 2002; REPELLO & LESUY, (2002). DAINEs causam injúrias gástricas devido à
inibição da enzima ciclooxigenase (COX) e supressão de prostaglandinas (PG) que são
efeitos mediados sobre a mucosa gástrica (WALACE et al., 2000; BERENGUER et al.,
2006).
70
Em experimentos de úlcera induzida por HCl/etanol, foi possível verificar que
Maytenus ilicifolia nas doses de 300 e 500 mg/Kg previniu a formação de lesões
gástricas em 42,2% e 72,0 % (p<0,05 e p<0,001, respectivamente) quando comparado
ao controle negativo. Lansoprazol usado como controle positivo neste modelo
experimental, previniu a formação de úlceras em 50,6 %, p<0,05 (Figuras 5,6,7, e 8).
A administração do etanol causa edema no tecido, hemorragia subepitelial,
esfoliação celular e infiltração de células inflamatórias que podem contribuir para a
indução dos danos na mucosa e geração de espécies reativas de oxigênio
(KOUNTOURAS et al., 2001). O etanol atua ainda destruindo a camada de muco e
bicarbonato com consequente bloqueio da citoproteção gástrica por precipitar proteínas,
liberando radicais livres e reduzindo compostos sulfidrilas e prostaglandinas nas células
da mucosa (Pacheco et al., 2006); além de causar a degranulação de mastócitos o que
leva à liberação de mediadores inflamatórios como a histamina e leucotrienos (Paula et
al., 2005).
Também é relatado que o etanol em contato direto com a mucosa gástrica,
solubiliza o muco protetor deixando assim, a mucosa gástrica indefesa à ação hidrolítica
e proteolítica do ácido clorídrico e da pepsina, respectivamente. Esta substância pode
induzir ainda, um aumento da secreção do ácido gástrico e por contato direto, alterar a
rede de vascularização local e romper vasos sanguíneos que irrigam a mucosa gástrica
desencadeando processos necrotizantes no tecido (MIZUI & DOUTEUCHI, 1983;
LEWIS & HANSON, 1991; TABATA et al., 1996; EVANS, 1996). Deste modo, a
hipersecreção gástrica juntamente com a fragilidade da rede vascular e a dissolução da
camada muco-protetora da mucosa gástrica constituem os principais fatores envolvidos
na instalação da úlcera induzida pelo etanol (MIZUI & DOUTEUCHI, 1983; OATES &
71
HAKKINEN, 1988; LEWIS & HANSON, 1991; TABATA et al., 1996; EVANS, 1996,
PANDOLFINO et al., 2000).
A síntese de muco fortalece a barreira protetora contra agentes lesivos, o qual
tem uma importante função na proteção gástrica. A camada de muco oferece uma
barreira contra a pepsina luminal protegendo a mucosa da digestão proteolítica (ALLEN
& FLEMSTROM, 2005); assim a camada de muco em forma de gel aderente, garante
uma proteção para ácidos e para a pepsina luminal.
A análise morfológica mostra que que nas figuras 6, 7 e 8 (A) o agente
ulcerogênico danificou todo o revestimento epitelial produtor de muco gástrico, assim
como também a camada mucosa do estômago de roedores. Nas figuras 6 e 7 (B), a
adminstração oral de Maytenus ilicifolia nas doses de 300 e 500 mg/Kg
(respectivamente) uma hora antes do agente ulcerogênico HCl/etanol, previniu a
formação de úlceras no estômago dos animais, conservando assim as características de
citoproteção da mucosa gástrica. O mesmo acontece com o controle positivo
lansoprazol (30 mg/Kg) onde na figura 8 (B) nota-se a prevenção da formação de úlcera
gástrica nos animais de experimentação, quando comparado ao controle negativo (figura
8 A), onde verifica-se exfoliação do epitélio de revestimento superficial e acentuado
aumento na vascularização local (hiperemia).
Os experimentos de uso crônico do etanol (como acontece no alcoolismo) em
animais mostrou que a mucosa gástrica das mães que receberam tratamento do agente
lesivo por 60 dias apresentou sérias lesões na mucosa gástrica e intensa hiperemia
(Figura 13). Já os filhotes, que receberam tratamento intra-uterino de etanol 25% e
continuaram a receber após o nascimento, apresentaram intensa hiperemia na mucosa
gástrica, mas não apresentam úlceras (Figura 14).
72
Na figura 15 (A), é possível notar que o tratamento com a solução alcóolica à
25% por 60 dias, causou no grupo das mães uma degeneração acentuada dos enterócitos
(ou epitélio da borda em escova), fazendo com que as vilosidades intestinais desses
animais tivessem sua capacidade absortiva prejudicada.
Já na figura 15 (B) o tratamento dos roedores filhotes com solução alcóolica à
25% aparentemente não danificou a mucosa intestinal; isto demonstra uma certa
resistência desses animais frente ao agente lesivo, mostrando que provavelmente esses
animais se adaptaram ao processo ulcerogênico dentro do útero materno.
Paula et al., 2005 relatam que animais submetidos a desnutrição protéica intra-
uterina apresentam um menor número de lesões gástricas quando comparado aos
animais normoprotéicos. Isto porque a desnutrição já é um fator de estresse para o
animal dentro do útero materno, que ao adaptar-se à situação, enfrenta o processo de
ulcerogênese como um fato normal.
Provavelmente um estudo mais detalhado dos diferentes tecidos embrionários
seria necessário para determinar quais os órgãos afetados pelo processo de alcoolismo
durante a gestação destes roedores.
O uso crônico de álcool é um fator de risco para a saúde, porque durante a
gestação ocorrem diversos processos fisiológicos (indução, proliferação, diferenciação,
morfogênese e maturação) que levam à formação da maioria dos tecidos e órgãos do
embrião (TEN CATE; 2001, GE et al., 2007).
Acredita-se que um número distinto de mecanismos fetotóxicos celulares e
bioquímicos, atuem simultaneamente durante o período embrionário com o consumo de
álcool durante a gestação. Os danos fetais dependem principalmente do tempo de
exposição, frequência e quantidade de bebida alcoólica ingerida durante a gravidez, o
73
estado de saúde, hábitos maternos e estrutura genética da mãe e do feto (SANT´ANNA,
2006).
Sabe-se que os possíveis mecanismos de ação do álcool sobre tecidos fetais
atuam: na formação de radicais livres, causando a peroxidação lipídica e na alteração na
expressão gênica da morfologia craniofacial (SANT´ANNA; 2006), também na
deficiência de ácido retinóico (forma ativa da vitamina A) que pode causar apoptose das
células da crista neural (DELTOUR et al., 1996) e nas alterações da estrutura e função
das membranas celulares afetando proliferação, adesão, migração, maturação celular e
comunicação intercelular segundo ARMANT & SAUNDERS (1996). Os mesmos
autores relatam ainda que o álcool pode também alterar a fluidez da membrana e de suas
proteínas de membrana, incluindo fatores de crescimento (reguladores da proliferação,
diferenciação e sobrevivência celular) e os receptores celulares, os quais transferem
sinais químicos da superfície celular para seu interior.
Apesar de verificar que em nossos experimentos uma degeneração do epitélio de
borda em escova do intestino delgado; não foi observado um alto grau de destruição dos
órgãos do trato gastrointestinal desses animais e nem a formação de úlceras gástricas;
porém sabe-se que em 2001, Costa e colaboradores relataram que o etanol causou
alterações no processo de sinalização celular, pelo álcool, acarretando em danos
funcionais transitórios ou permanentes e até mesmo morte celular.
Pacheco et al., em 2006 relataram que o etanol é considerado um agente irritante
da mucosa gástrica, o qual destrói a camada de muco e bicarbonato, que atuaria na
proteção da mucosa gástrica contra o ácido clorídrico e outros agentes agressores. O
etanol atua bloqueando a citoproteção gástrica por precipitação de proteínas; também
age direto no epitélio gástrico causando peroxidação lipídica. O uso do etanol induz
74
estresse oxidativo com liberação de radicais livres e redução da concentração de
compostos sulfidrilas nas células da mucosa.
De acordo com Lih-Brody et al (1996), o processo ulcerogênico está relacionado
ao estresse oxidativo e este é considerado um desequilíbrio entre os mecanismos de
defesa do organismo (moléculas antioxidantes naturais como a glutationa), em relação
ao número de substâncias oxidantes produzidas pelo agente indutor de lesão ou ainda
por alterações bioquímicas do próprio organismo.
Radicais livres derivados do oxigênio representam importante papel na
patogênese de injúria aguda da mucosa gástrica por isquemia-reperfusão, estresse,
drogas antiinflamatórias e etanol em ratos. Os radicais livres gerados por neutrófilos
podem ser fatores importantes no atraso da cicatrização de úlcera gástrica crônica
induzida por ácido acético (HAMAISHI et al, 2006).
Durante a realização do experimento de indução de úlcera crônica por ácido
acético em estômagos de ratos, o qual permite avaliar uma possível atividade curativa
sobre uma lesão já estabelecida (Takagi et al., 1969), observou-se que Maytenus
ilicifolia na dose de 500 mg/Kg, foi eficaz em reduzir 60% das lesões induzidas por este
agente lesivo de maneira significativa (p<0,001; figuras 9 e 11) quando comparado ao
controle negativo tween (Figura 10). Ranitidina usada como controle positivo mostrou
uma atividade cicatrizante da ordem de 58% (p<0,001; figura 12); resultado semelhante
ao registrado por Maytenus ilicifolia (Figura 11).
É bem conhecido que em muitos modelos de úlcera, as lesões são muito
pequenas e diferentes histologicamente da úlcera péptica crônica humana, com relação a
patomorfologia e características de cura (BROZOZOWSKI, 2003). Um dos únicos
modelos reais de úlcera péptica para avaliar o processo de cicatrização é o modelo
75
introduzido por Takagi et al., (1969), que é o modelo de úlcera induzido pelo ácido
acético em ratos.
Neste modelo, houve uma cicatrização significativa quando se utilizou a fração
apolar de Maytenus ilicifolia (500 mg/Kg, v.o.), apresentando resultado semelhante a
aquele obtido com a droga padrão ranitidina. Esse processo de cura é acompanhado de
aumento de fluxo sanguíneo gástrico na área da úlcera e de aumento significativo de
gastrina plasmática e citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1β
(BROZOZOWSKI et al., 2001). Os mesmos autores relatam que com a progressão do
processo curativo da úlcera, o fluxo sanguíneo na margem da úlcera e os elevados níveis
de TNF-α, IL-1β e gastrina decaem gradualmente.
Na figura 10 (A, B) onde há a evidência de lesões gástricas, o tratamento por 14
dias foi realizado somente com o controle negativo tween. É possível notar que tanto o
epitélio produtor de muco gástrico quanto a camada mucosa, apresentam-se
desorganizados, perdendo as características funcionais da mucosa gástrica. Também é
evidenciada a presença de hiperemia, a qual é comum em estômago afetado pelo
processo ulcerogênico.
Nas figuras 11 e 12 (A,B), as lesões gástricas induzidas pelo ácido acético foram
cicatrizadas pelo tratamento diário de M. ilicifolia (500mg/Kg) e pelo controle positivo
ranitidina (100mg/Kg) em 14 dias. É possível notar que o epitélio de revestimento
superficial, assim como a camada mucosa encontram-se íntegros, recuperando as
características funcionais da mucosa gástrica.
No modelo de úlcera gástrica crônica induzida por ácido acético a lesão
apresenta aspecto necrótico e profundo, envolvendo toda mucosa gástrica e penetrando
na camada muscular da mucosa (TARNAWSKI et al., 1995).
76
No período inicial de cura da úlcera, ocorre uma supressão notável da acidez
gástrica e expressão de fatores de crescimento como EGF e TGF-α, os quais controlam
a proliferação celular, apresentam atividade anti-secretória (KONTUREK et al., 1992) e
são indutores do aumento da síntese de proteínas na área de lesão (SZABO & VINCZE,
2000). Considerando que M. ilicifolia possui em sua constituição química compostos
fenólicos como taninos, flavonóides e triterpenos (Jorge et al, 2004), atribui-se
principalmente à presença de taninos a atividade anti-secretória, podendo-se desta forma
favorecer a explicação da atividade cicatrizante de M. ilicifolia.
A cura da úlcera é um processo de reconstrução da arquitetura da mucosa que
envolve a migração e a proliferação de células epiteliais e inflamatórias. Aqui a síntese
e a degradação de moléculas da matriz extracelular e componentes do tecido conectivo,
assim como também a síntese de fatores de crescimento e citocinas contribuem para a
cicatrização da mucosa gástrica (TARNAWSKI et al., 1995).
Na região de cicatrização, as glândulas gástricas dilatam e as células epiteliais
que sublinham essas glândulas expressam o fator de crescimento epidermal (EGF) que é
um dos principais fatores mitóticos que influenciam a proliferação das células epiteliais
para reconstrução da mucosa e que aceleram a cicatrização de úlceras crônicas
(KONTUREK et al., 1998). Vários estudos demonstram que o EGF aumenta a
regeneração epitelial com deposição de colágeno, inibição de secreção ácida e estímulo
da síntese de prostaglandinas (KITAZAWA et al., 1990).
Variadas espécies vegetais (Kielmeyera coriacea, Nigella sativa, Achillea
millefolium L, Pfaffia sp) apresentam atividade antiulcerogênica devido ao aumento de
fatores citoprotetores como prostaglandinas, muco e bicarbonato, assim como também
por inibição da secreção ácida basal estimulada por histamina e betanecol (GOULART
77
et al (2005); EL-DAKHAKHNY et al, (2000), CAVALCANTI et al (2006); Freitas et
al (2003).
A eficácia do extrato de M. ilicifolia como agente antiúlcera está
experimentalmente comprovado. Avaliações fitoquímicas têm revelado a presença de
uma grande variedade de metabólitos secundários, os quais podem explicar o seu uso
popular e eficácia como fitofármaco (RATTMANN et al., 2006).
Cordeiro et al (1999) estudando diferentes espécies de Maytenus entre elas,
Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium, detectaram a presença dos triterpenos
friedelan-3-ol e friedelin e, ainda, compostos polifenólicos. Os triterpenos foram
encontrados nas folhas das duas espécies pela técnica de HRGC-FID (cromatografia
gasosa de alta resolução e detector de ionização em chama). A técnica de HRGC-MS
(cromatografia gasosa de alta resolução associada à espectrometria de massa)
possibilitou a identificação de triterpenos menores, sendo que ambas as espécies
apresentaram o mesmo perfil cromatográfico, diferindo apenas na concentração relativa
de alguns compostos. Foram identificados 14 compostos em ambos os extratos:
friedelin, friedelan-3-ol, α-tocoferol, simiarenol, lupeol, lupenone, β-amyrin, β-
sitosterol, stigmasterol, campesterol, ergosterol, brassicasterol, squaleno e ácido
hexadecanóico. Este estudo fitoquímico relata a presença de variados compostos de
atividade anti-úlcera, garantindo a eficácia do uso de M. ilicifolia em distúrbios do trato
gastrointestinal.
Segundo Hamaishi et al (2006), catequinas, pertencentes ao grupo de polifenóis,
são potenciais agentes antioxidantes e estimulantes da produção de muco gástrico, os
quais mostraram ação protetora da mucosa gástrica em lesão aguda e cicatrização de
úlceras crônicas.
78
A presença de taninos, catequinas e flavonóides contribuem para um aumento
dos mecanismos de defesa da mucosa gastrointestinal contra fatores agressivos,
possivelmente relacionada à geração de NO e participação de grupos sulfidrila
endógenos. Compostos polifenóicos em baixas concentrações possuem efeito
antiinflamatório devido ao aumento da resistência capilar, porém em altas doses há
evidências que aumentam fatores pró-inflamatórios (ANDREO et al, 2006).
De acordo com a literatura compostos sulfidrílicos endógenos não protéicos
(NP-SH) são compostos chave para proteger a mucosa gástrica contra a injúria gástrica
induzida por etanol (SZABO & VATTAY, 1990). Normalmente, o dano causado pelo
etanol é acompanhado por uma diminuição da concentração de compostos NP-SH,
porque os grupamentos SH se ligam aos radicais livres formados devido a ação de
agentes nocivos (ANDREO et al., 2006).
A Espectroscopia por Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) vem sendo
empregada como técnica para estudar a ação anti-oxidativa in vitro de plantas
medicinais; desta forma realizamos testes de atividade antioxidante com a fração polar
de Maytenus ilicifolia, a fim de correlacionar esta atividade com o estudo de atividade
antiulcerogênica.
Ito e colaboradores em 1998 relataram que dentre os radicais livres envolvidos
na patogênese da úlcera gástrica destacam-se os derivados do oxigênio, compostos por 4
elétrons, o ânion superóxido (O
2
), o peróxido de hidrogênio (H
2
0
2
) e o radical hidroxila
(OH), que são reduzidos a 1 e 2 elétrons, respectivamente.
A avaliação da atividade anti-oxidativa do extrato das folhas da planta em estudo
foi realizada in vitro por RSE, através da reação destes extratos com o DPPH e com o
DMPO-OH.
79
Tradicionalmente, estudos da atividade anti-oxidativa in vitro são feitos através
da espectrofotometria, utilizando reações envolvendo radicais livres. A substância mais
utilizada para esta aplicação é o DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) cuja cor
“natural” é o violeta escuro, com uma banda de absorção óptica em 520nm. Ela tem sua
coloração alterada de violeta para amarelo escuro, quando reage com uma molécula
doadora de Hidrogênio (Molyneux, 2003). Porém, sabe-se que na prática, esta transição
de cores nem sempre é observável por esta técnica, pois as bandas de absorção ópticas
são geralmente largas. Com isto a espectroscopia por RSE apresenta vantagens, pois
através desta técnica medimos diretamente a concentração de radicais livres com grande
sensibilidade.
Trouillas et al., (2003), realizaram o estudo da atividade anti-oxidativa do
extrato de 16 plantas medicinais, através da solução de radical livre estabilizada (DPPH)
e da reação de Fenton. Neste estudo, os autores mostraram que a referida técnica do
RSE é bastante utilizada no estudo da atividade antioxidante.
A figura 16 mostra os espectros do radical DPPH após reagir com água e com a
fração polar do extrato de M. ilicifolia em diferentes concentrações e a figura 17 (com
tabelas 1 e 2) mostram os valores das intensidades da linha central dos espectros em
função das concentrações do extrato. Através destes espectros pode-se notar a ação anti-
oxidativa de M. ilicifolia, observando-se a sua capacidade de neutralizar o radical
presente no DPPH.
A fim de correlacionar estes resultados com os experimentos in vivo, realizamos
os mesmos experimentos com a fração polar de M. ilicifolia nas concentrações de
30mg/ml e 50mg/ml, que foram as concentrações utilizadas nos experimentos in vivo.
Assim, em nosso trabalho, o estudo de atividade anti-oxidativa de Maytenus
ilicifolia utilizando o radical DPPH, mostrou que a fração polar da espécie em estudo na
80
concentração de 1,0 mg/ml, apresenta uma taxa inibitória de 50,78% do radical.
Também realizamos um ensaio com a concentração de 2,9 mg/ml do extrato puro de M.
ilicifolia e verificamos uma atividade inibitória de mais de 95% (Figura 18). Ainda os
experimentos realizados com a concentração de 50mg/ml da fração polar de M. ilicifolia
destruiu completamente o sinal do radical DPPH.
Utilizando-se da figura 17 e a equação (1), podemos notar que a solução
preparada com 30mg/ml da fração polar do extrato de M. ilicifolia, proporciona o
mesmo efeito da concentração de 2,9 mg/ml do extrato puro. Vale salientar que estes
resultados estão de acordo com Trouillas et al., 2003.
Realizamos o experimento também com a concentração de 2 mg/ml que
corresponde aproximadamente ao chá utilizado popularmente, verificamos que houve
uma redução na intensidade do sinal em aproximadamente 36% e este resultado é
equivalente ao efeito da fração polar do extrato de M. ilicifolia na concentração de 0,5
mg/ml.
Okawa et al., 2001, testou compostos fenólicos isolados de várias plantas
medicinais quanto ao seu efeito neutralizante de radicais livres através do estudo do
radical DPPH. Esses autores correlacionaram seus resultados com o estudo da estrutura-
atividade desses compostos, mostrando que não só o número de radicais OH, mas
também, a sua posição pode ser importante para mediar a potência de ação.
Em outros experimentos, utilizamos a reação de Fenton para produzir o radical
OH e o “spin trapp” DMPO. O “spin trapp” DMPO forma um aduto de spin, ou seja,
uma ligação química mais estável que o radical OH, cujo tempo de vida é muito curto,
impossibilitando a sua detecção por RSE.
81
Em 2003, Kurihara et al utilizou a técnica da RSE com o “spin trapping” DMPO
em teste com o chá de “Oolong” e verificou que o mesmo possui efeito redutor do
radical OH.
Através da técnica da reação de Fenton para produzir o radical OH e o “spin
trapp” DMPO, Lin e colaboradores (1998) mostraram que o extrato fresco de duas
plantas exibiu efeito hepatoprotetor contra a toxicidade causada por CCl
4
e por possuir
atividades anti-lipoperoxidativa e anti- radicais livres.
A figura 19 mostra os espectros do aduto de spin DMPO-OH após reagir com
água e com a fração polar do extrato liofilizado de M. ilicifolia em diferentes
concentrações.
Em nosso estudo, foi possível verificar que a espécie em estudo na concentração
de 10mg/ml apresenta uma taxa inibitória de 53,22%; seu efeito máximo foi obtido com
50,0 mg/ml inibindo 90,47% do radical OH (Tabela 4). Esses resultados estão de acordo
com Lin et al, (1998) e Kurihara et al, (2003).
Ainda as figuras 21 A e 21 B revelam os espectros de Ressonância do Spin
Eletrônico (RSE) de DMPO-OH em diferentes instantes de tempo após a reação de
Fenton com água (controle), e as figuras 22 A e 22B mostram os espectros RSE de
DMPO-OH em diferentes instantes de tempo após a reação de Fenton com a fração
polar do extrato de M. ilicifolia na concentração de 2,5 mg/ml (Tabela 5). Estes
resultados mostram a eficácia do extrato em reduzir a concentração do radical livre OH.
Realizamos ainda um estudo cinético, medindo a intensidade do radical em
intervalos de tempo, de 3 a 21 minutos. O ajuste exponencial destas curvas nos mostram
que as constantes cinéticas (k
1
e k
2
), obtidas na reação com extrato, são maiores que os
obtidos com a água, mostrando que o extrato de Maytenus ilicifolia não apenas reduz a
concentração do radical no momento da reação, como também atua em sua cinética,
82
reduzindo a concentração do radical mais rapidamente que o processo natural, da reação
com a água (Figura 23).
Desta forma, tanto em experimentos in vitro quanto aqueles realizados com
animais, foi possível observar uma significativa ação antiulcerogênica e anti-oxidativa
por parte das frações apolar e polar do extrato de Maytenus ilicifolia garantindo assim
sua efetividade no tratamento de enfermidades do trato-gastrointestinal. Ainda um
estudo morfológico comprovou a severidade das lesões gástricas em animais sem
tratamento farmacológico e a comprovada ação preventiva e cicatrizante dessas lesões
gástricas quando os animais foram tratados com M.ilicifolia.
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VI. Conclusões
Foi possível observar em experimentos in vivo que a espécie em estudo Maytenus
ilicifolia apresenta atividade preventiva e cicatrizante da mucosa gástrica, sendo este
efeito muito próximo aos efeitos obtidos com as drogas antiulcerogênicas
tradicionalmente usadas no mercado, como lansoprazol e ranitidina. Esses dados são
evidenciados através do estudo morfológico realizado em nossos laboratórios, onde M.
ilicifolia preservou as características dos tecidos da mucosa gástrica de roedores.
No modelo experimental de ulceração crônica com a administração diária de etanol
25%, foi demonstrado que esta solução alcoólica agride a mucosa gástrica de ratos
adultos (mãe), porém não agride a mucosa gástrica dos filhotes. Este fato se deve
provavelmente ao estresse sofrido por parte dos filhotes dentro do útero materno, os
quais se adaptaram a tal situação e, não apresentaram lesões em suas mucosas gástricas.
Ainda foi possível detectar uma significativa atividade anti-oxidativa por parte de
Maytenus ilicifolia, a qual complementa os estudos de atividade anti-úlcera em animais,
já que o processo ulcerogênico está relacionado com estresse oxidativo. Desta forma, M.
ilicifolia possui evidências científicas que comprovam sua eficácia como agente anti-
ulcerogênico.
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