( PDF ) Estudos da relevância biológica da modulação da atividade da elastase de neutrófilo por glicosaminoglicanos e da susceptibilidade de peptídeo sintético derivado do Inibidor Tissular de ...

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

GABRIEL LUIZ COCCO NUNES

Estudos da relevância biológica da modulação da atividade

da elastase de neutrófilo por glicosaminoglicanos e da

susceptibilidade de peptídeo sintético derivado do Inibidor

Tissular de Metaloproteases -1 (TIMP-1) à atividade da

catepsina L humana.

Mogi das Cruzes, SP

2007

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

GABRIEL LUIZ COCCO NUNES

Estudos da relevância biológica da modulação da atividade

da elastase de neutrófilo por glicosaminoglicanos e da

susceptibilidade de peptídeo sintético derivado do Inibidor

Tissular de Metaloproteases -1 (TIMP-1) à atividade da

catepsina L humana.

Dissertação apresentada ao programa de

Pós-graduação da Universidade de Mogi

das Cruzes como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em

Biotecnoligia

Área de Concentração: Biológica

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar de Almeida

Mogi das Cruzes, SP

2007

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DEDICATÓRIA

Este trabalho é dedicado à todos aqueles que contribuíram direta

ou indiretamente para sua realização. Pessoas as quais passaram, e por vezes,

permaneceram ativas na minha caminhada deixando marcas indeléveis e

lembranças maravilhosas. A cada um e ao todo, deixo meus mais sinceros

votos de amizade e carinho.

AGRADECIMENTOS

Meus agradecimentos mais honestos e sinceros:

A Deus, pela força e estrutura espiritual fornecida nessa jornada;

Aos meus pais, Martha e Edson, pelo apoio, confiança e por acreditar que eu seria capaz de

ir mais além;

A minha irmã, Nathalia, pelo exemplo de força de vida e de como ser um grande guerreiro;

Ao Prof. Dr. Paulo Cezar de Almeida por ter me ensinado, me orientado, me mostrado

como evoluir neste trabalho;

Ao Amigo Paulo Cezar de Almeida, obrigado pela amizade e respeito;

Ao Prof. Dr. Ivarne Luiz dos Santos Tersariol, pela confiança em mim depositada;

Ao Amigo Fábio Henrique Dyszy, que me acompanha desde o início, sempre bem disposto

a ajudar e trabalhar em equipe, e também pela grande amizade;

Aos amigos do CIIB que conquistei nestes seis anos, amigos que foram, amigos que

chegaram e amigos que voltaram: Tiago Rodrigues, Tatinha, Kátia, Carlos Oliveira,

Cristiano, Vivian, Cíntia, Fabrício, Bruna ...

Aos Amigos da Policlínica, que me acolheram e me auxiliaram neste novo ambiente: Gibi,

Mara, Marly, André, Tatiana Marassi, Erik ...;

Aos amigos de todas as horas, que me deram forças e me apoiaram: Patrícia Pelissaro, Lú e

Marcão, Gabriella Floriano, André (Grampola), Pingo e Adriana ...

RESUMO

Enzimas proteolíticas participam de diversos processos fisiopatológicos, como degradação

intracelular, processamento de pró-hormonios e pró-proteinas, artrite reumatóide, processos

inflamatórios e cancerígenos. Dentre estes processos destaca-se a remodelação local da

matriz extracelular, seja de maneira direta ou indireta, através da ativação de outras

enzimas. Em nosso trabalho avaliamos a capacidade das enzimas catepsina L (E.C.

3.4.22.15) e elastase de neutrófílo (E.C. 3.4.21.37) ativarem a remodelação local da matriz

extracelular via degradação do Inibidor Tissular de metalo-protease 1 (TIMP-1) e a

modulação deste evento por glicosaminoglicanos. Para tal utilizou-se técnicas de cinética

enzimática com peptídeo sintético derivado do TIMP-1 (Abz-AMESVMGYFHRSQ-

EDDnp), analise por eletroforese em SDS-Page e também espectrometria de massas. Os

resultados das cinéticas enzimáticas (k

, K

cat

e K

cat

) indicam que a elastase de neutrófilo

e a catepsina L possuem a capacidade de hidrolizar o peptídeo sintético (que mimetiza a

região de interação entre o TIMP-1 e a Pró-Metalo protease 9) como também, no caso da

elastase, a atividade é modulada positivamente na presença de heparina, dado confirmado

pela eletroforese em SDS-Page com a molécula integral de TIMP-1 em diferentes tempos

de incubação. Entretanto a catepsina L, mostra-se mais eficiente na degradação do TIMP-1

cat

2,270 ± 0,113 µM

-1

1) do que a elastase de neutrrófilo, mesmo quando modulada

por heparina (K

cat

0,33 ± 0,03 e 1,10 ± 0,09 µM

-1

1, respectivamente). Os dados de

espectrometria de massas indicaram o local exato da hidrolise. Uma vez que ambas as

enzimas estão presentes em processos tumorais e inflamatórios estes dados são importantes

na compreensão do mecanismo de regulação destes processos, sinalizando que existe um

controle fino da degradação da matriz extracelular e que este pode ser intensificado por

efeitos em cascata.

Palavras-chave: TIMP – 1; Elastase de Neutrófilo; Catepsina L; Glicosaminoglicanos

ABSTRACT

Proteolytic enzymes participate in a variety of physiological processes, such as intracellular

degradation, processing of prohormones and proproteins, rheumatoid arthritis,

inflammatory and cancerigenous processes. Among these processes, it is distinguished the

local remodeling of extracellular matrix, directly or indirectly, through the activation of

other enzymes. In this work, it was assessed the capacity of the enzymes cathepsin L (E.C.

3.4.22.15) and neutrophil elastase (E.C. 3.4.21.37) in activating the local remodeling of the

extracellular matrix through the degradation of tissular inhibitor of metalloprotease 1

(TIMP-1) and the modulation of this event by glycosaminoglycans. For this, there were

used techniques of enzymatic kinetics with synthetic peptides derived from TIMP-1 (Abz-

AMESVMGYFHRSQ-EDDnp), electrophoresis analysis in SDS-Page and also mass

spectrometry. The results of enzymatic kinetics (k

, K

cat

e K

cat

) indicate that neutrophil

elastase and cathepsin L have the capacity of hydrolyzing the synthetic peptides (that

mimetizes the region of interaction between TIMP-1 and the pro-matrix metalloprotease-9)

and also that, in the case of elastase, the activity is positively modulated in the presence of

heparin, what was confirmed by electrophoresis in SDS-Page with the integral molecule of

TIMP-1 in different incubation times. However, the cathepsin L shows to be more efficient

in degrading TIMP-1 (K

cat

2,270 ± 0,113 µM

-1

1) than the neutrophil elastase, even

when modulated by heparin (K

cat

0,33 ± 0,03 e 1,10 ± 0,09 µM

-1

1, respectively). The

data from spectrometry indicated the exact site of the hydrolysis. Once both enzymes are

present in tumoral and inflammatory processes, these data are important for comprehending

the regulatory mechanisms of these processes, signalizing that there is a fine control of

extracellular matrix degradation and that this one may be intensified by cascade effects.

Key-words: TIMP – 1; Neutrophil Elastase; Cathepsin L; Glycosaminoglycans

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Estrutura tridimensional da catepsina L em modelo de fita. . . . 20

Figura 2 Detalhe do sítio ativo da catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Figura 3 Estrutura tridimensional da elastase de neutrófilo em modelo de

fita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 4 Estrutura cristalográfica do complexo formado entre o TIMP-1

e a MMP-3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 5 Nomenclatura de Schechter e Berger. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Figura 6 Representação esquemática da interação entre a elastase de

neutrófilo e um dado substrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 7 Curva de atividade da elastase em função do pH, na ausência e

presença de heparina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 8 Espectro de massa do substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-

EDDnp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 9 Espectro de massa do incubado de catepsina L com o substrato

sintético. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 10 LC/MS do incubado com catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

Figura 11 Espectro de massa do incubado de elastase com o substrato

derivado do TIMP-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 12 Eletroforese em gel SDS (12,5%) avaliando a influência da

heparina na catalise da molécula de TIMP-1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 13 Gráficos construídos a partir dos dados de densitometria do gel

de eletroforese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 14 Representação da estrutura do peptídeo Abz-

AMESVMGYFHRSQ-EDDnp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 15 Figura esquemática indicando o ponto de hidrólise do

peptídeo derivado do TIMP-1 pela elastase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 16 Figura esquemática indicando o ponto de hidrólise do

peptídeo derivado do TIMP-1 pela catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 17 Resumo esquemático dos resultados obtidos. . . . . . . . . . . . . . 70

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Classificação de peptidases de acordo com seu mecanismo de

catálise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tabela 2 Aminoácidos constituintes do subsítio S

da papaína e

catepsinas B e L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tabela 3 Diferenças observadas na constante de afinidade determinadas

por cinética michaelianas na presença e ausência de heparina. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tabela 4 Constantes de afinidade da elastase de neutrófilo em função do

pH na presença e ausência de heparina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tabela 5 Constantes de afinidade para catepsina L, suando o substrato

comercial e o substrato sintético. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tabela 6 Porcentagens de TIMP-1 remanescentes e produto formado a

partir da degradação do TIMP-1 em diversos tempos de incubação na

ausência de heparina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tabela 7 Comparação da especificidade da catepsina L e elastase na

presença e ausência de heparina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abz Ácido orto-aminobenzoico

Da Daltons

DMF Dimetilformoamida

E-64 L-Trans-Epoxisuccinil-L-Leucilamino (4-guanidino)-butano

EDDnp Etilenodiamino-dinitro-fenil

HNE Elastase de neutrófilo humana

cat

Constante catalítica

cat

Constante de especificidade

Constante de Michaelis-Menten

MCA Metilcumarina

MHC-II Complexo principal de histocompatibilidade classe II

MMP Metalo-protease

MMP-3 Metalo-protease 3 (estromelisina 1)

PMMP-9 Pró Metalo-protease 9 (pró-gelatinase)

PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonila

TIMP Inibidor Tissular de Metalo-protease

UAF Unidades arbritárias de fluorescência

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Ala Alanina

Arg Arginina

Asn Asparagina

Asp Ácido aspártico

Cys Cisteína

Gln Glutamina

Glu Ácido glutâmico

Gly Glicina

His Histidina

Ile Isoleucina

Leu Leucina

Lys Lisina

Met Metionina

Phe Fenilalanina

Pro Prolina

Ser Serina

Thr Treonina

Trp Triptofano

Tyr Tirosina

Val Valina

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.1. Características gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.2. Cisteíno-Peptidases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.2.1 Catepsina L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.3. Serino-Peptidases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

1.3.1. Elastase de Neutrófilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.4. Mecanismo de catálise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.4.1. Serino-Peptidases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.4.2. Cisteíno-Peptidases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

1.5. Especificidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

1.5.1 Catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

1.5.1.1. Subsítio S

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.5.1.2. Subsítio S

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.5.1.3. Subsítio S

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.5.1.4. Subsítio S’

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.5.1.5. Subsítio S’

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

1.5.2. Elastase de Neutrófilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

1.5.2.1. Subsítio S

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

1.5.2.2. Subsítio S

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.5.2.3. Subsítios S

e S

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.5.2.4. Subsítio S’

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.5.2.5. Subsítio S’

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.5.2.6. Subsítio S’

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3. MATERIAIS E MÉTODO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1. Enzimas, Substratos e Moduladores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1.1. Elastase de Neutrófilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1.2. Catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1.3. Substratos cumarínicos Z-FR-MCA e MeOsuc-AAPV-MCA. 40

3.1.4. Inibidor Tissular de Metaloproteases – 1. . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.1.5. Heparina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.2. Substrato sintético derivado da seqüência do TIMP-1. . . . . . . . . . . 40

3.3. Estudo das cinéticas enzimáticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.3.1. Titulação do substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp. 41

3.3.2. Calibração do fluorímetro para o grupo Abz. . . . . . . . . . . . . . 42

3.3.3. Calibração do fluorímetro para MCA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.3.4. Cinéticas enzimáticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.4. Espectrometria de massas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.4.1. Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.4.2. Maldi-Tof. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.4.3. LC-MS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.5. Eletroforese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1. Cinéticas enzimáticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.1. Elastase de Neutrófilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.2. Catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.2. Espectrometria de Massas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.2.1. Catepsina L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.2.2. Elastase de Neutrófilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

4.3. Eletroforese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

5. DISCUSSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

1 INTRODUÇÃO

1.1 Características Gerais

Proteases, proteinases e peptidases, bem como enzimas proteolíticas, são

denominações atribuídas às proteínas que possuem a capacidade de hidrolisar ligações

peptídicas em peptídeos e/ou proteínas. O Nomenclature Committee of the International

Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) recomenda o termo peptidase

para estas enzimas.

As peptidases são divididas em duas subclasses: as endopeptidases (EC 3.4.21-24 e

EC 3.4.99) e as exopeptidases (EC 3.4.11-19). As endopeptidases atuam no interior da cadeia

polipeptídica e são organizadas em dois grupos, baseado no mecanismo de catálise. A

especificidade das endopeptidases é utilizada exclusivamente para identificar cada enzima em

cada grupo. Estas enzimas estão divididas nas seguintes subclasses: serino-endopeptidases

(EC 3.4.21), cisteíno-endopeptidases (EC 3.4.22), aspartil-endopeptidases (EC 3.4.23),

metalo-endopeptidases (EC 3.4.24) e treonino-endopeptidases (EC 3.4.25). As endopeptidases

que não se incluem nas subclasses EC 3.4.21-25 são elencadas na subclasse E.C 3.4.99.

As exopeptidases, por sua vez, atuam tanto na porção N-terminal como na porção C-

terminal da cadeia polipeptídica. Quando atuam na região C-terminal as exopeptidases

podem liberar um único aminoácido e são denominadas carboxipeptidases (EC 3.4.16-18) ou

dipeptídeos, recebendo a denominação peptidil-dipeptidases (EC 3.4.15). As

carboxipeptidases são divididas em quatro grupos em função do mecanismo de catálise:

serino-carboxipeptidases (EC 3.4.16), as metalo-carboxipeptidases (EC 3.4.17) e as cisteíno-

carboxipeptidases (EC 3.4.18). As exopeptidases que reconhecem a região N-terminal da

cadeia polipeptídica podem liberar um único aminoácido, chamadas aminopeptidases (EC

3.4.11), dipeptídeos ou tripeptídeos, as dipeptidil-peptidases e tripeptidil-peptidases (EC

3.4.14), respectivamente.

A organização das peptidases em famílias segue um critério evolutivo, introduzido por

Rawlings e Barrett na década de 1990. Os grupos compõem-se por membros com

similaridade em suas seqüências primárias estatisticamente consideráveis com ao menos um

membro da família, na parte da molécula responsável pela atividade proteolítica. Cada uma

das famílias é nomeada por uma letra indicando o tipo de catálise, assim sendo, S (serino-

peptidases), T (treonino-peptidases), C (cisteíno-peptidases), A (aspartil-peptidases), M

(metalo-peptidases) e U (desconhecida), seguido de um número atribuído de maneira

arbitrária. O agrupamento em clãs ocorre quando as peptidases apresentam sinais de relações

ancestrais, entretanto divergiram de tal maneira que não se pode mais comprovar suas

relações por meio da simples comparação entre as estruturas primárias (RAWLINGS E

BARRETT, 1993; BARRETT E RAWLINGS 1995). A evidencia mais clara entre a relação

dos membros dos clãs e suas famílias são a homologia de estrutura tridimensional e o alto

grau de homologia entre as seqüências de aminoácidos na região do centro ativo. A

nomenclatura do clã é formada por uma letra indicativa do tipo de catálise (assim como para

as famílias), seguida de uma segunda letra maiúscula arbitrária.

As enzimas proteolíticas que pertencem às quatro classes descritas na Tabela 1 estão

envolvidas na patogênese de várias doenças incluindo infecções parasitárias, virais e

bacterianas, hipertensão arterial, desordens de coagulação e câncer, entre outros.

Tabela 1 – Classificação de peptidases de acordo com seu mecanismo de catálise.

PEPTIDASES

REPRESENTATIVAS

Aminoácidos

presentes no sítio

catalítico.

SERINO-PEPTIDASES

Clã AS Tripsina, Quimotripsina His, Asp, Ser

Clã SB Subtilisina Asp, His, Ser

Clã SC Carboxipeptidase C Ser, Asp, His

Clã SE Carboxipeptidase de Streptomyces Ser, Lys

Clã SF Repressor Lexa Ser, Lys

Clã SH Assembilina de Citomegalovírus His, Ser, His

CISTEÍNO-PEPTIDASES

Clã CA Papaína Cys, His, Asn

Clã CB Endopeptidases virais quimotripsina-

símile

His, Cys, Glu

Clã CC Endopeptidases virais papaína-símile Cys His

Clã CD Caspase His, Cys

Clã CE Endopeptidases de Adenovírus His, Cys

ASPARTIL-PEPTIDASES

Clã AA Pepsina Asp, Asp

Clã AB Endopeptidases de Nodavírus Asp, Asp

METALO-PEPTIDASES

Clã MA Termolisina Glu, Asp, His/ Zn

Clã MB Astacina His, His, His(/Asp)/

Clã MC Metalocarboxipeptidases His, Glu, His/ Zn

Clã MD Zinco D-Ala-A-Ala peptidases His, Asp, His/ Zn

Clã ME Pitrilisina His, His, Glu/ Zn

Clã MF Leucil aminopeptidase Asp, Asp, Glu, Zn

Asp, Lys, Asp, Zn

Clã MG Metionil aminopeptidase Asp, His, Glu, Co

Asp, Asp, Glu, Co

Fonte: Adaptado a partir de Expert Protein Analysis System – Expasy (2007).

1.2 Cisteíno-Peptidases

As cisteíno-peptidases são encontradas em uma grande gama de seres vivos,

englobando protozoários, plantas e animais. Os tecidos de mamíferos apresentam um grande

número de cisteíno-peptidases, dentre elas estão: a catepsina B (EC 3.4.22.1), catepsina L (EC

3.4.22.15), catepsina S (EC 3.4.22.27), catepsina H (EC 3.4.22.16) e catepsina C (EC

3.4.14.1), todas localizadas nos lisossomos.

A papaína (EC 3.4.22.2) foi à primeira enzima a ser classificada como cisteíno-

peptidase (SMITH & KIMMEL, 1960) sendo, portanto, a mais investigada dessa classe; e foi

a primeira a ter sua estrutura tridimensional resolvida (DRENTH ET AL, 1968). As cisteíno-

peptidases que compõe a família da papaína participam do metabolismo celular, nos processos

de conversão de pró-hormônios e pró-proteínas, na degradação de proteínas da matriz

extracelular, em todas as etapas de progressão tumoral, na distrofia muscular e artrite

reumatóide (SIEWINSK ET AL, 1994; II ET AL, 1993; MORT E BUTTLE, 1997;

CATALDO ET AL 1994).

As catepsinas B e L, cisteíno-peptidases pertencentes à família da papaína, podem

participar na formação de metástase através da degradação de vários componentes da matriz

extracelular (SHEAHAN ET AL, 1989; BUCK ET AL, 1992). A relação entre as cisteíno-

peptidases com componentes da membrana basal é importante na compreensão do papel

biológico dessa classe de enzimas nos processos de invasão tumoral e também na

remodelação da matriz (GUINEC ET AL, 1992). Dados da literatura indicam que a papaína e

a catepsina B possuem a capacidade de interagirem com a lâmina da membrana basal

(DALET-FUMERON ET AL, 1998), estes resultados reforçam o papel proposto das cisteíno-

peptidases na degradação de componentes da matriz extracelular. Em função disso, as

interações de cisteíno-peptidases com glicosaminoglicanos podem ser fundamentais para o

entendimento dos processos de remodelação tecidual (ALMEIDA ET AL, 1999).

1.2.1 Catepsina L

A catepsina L madura (Figura 1) é oriunda de um precursor (pré-pró-proteína) de alta

massa molecular (~36KDa) que não apresenta atividade catalítica, uma vez que é inibido pela

sua pró-região. O grau de homologia entre os pró-peptídeos da catepsina L e da papaína é

inferior do que aquele observado entre as enzimas maduras, e apresenta apenas dois motivos

conservados sendo que um deles também é encontrado no pró-peptídeo da catepsina B

(KARRER ET AL, 1993). O precursor da catepsina L é formado por um peptídeo sinal (pré-

peptídeo) com 17 resíduos de aminoácidos, um pró-peptídeo com 96 resíduos e uma enzima

de baixo massa molecular (21KDa, 220 resíduos de aminoácidos) (CARMONA ET AL.,

1996). Enquanto a catepsina B é encontrada unicamente em mamíferos a catepsina L é

relatada em várias espécies animais como o homem, rato, porco, rã, pomba carpa e Euglena

gracillis (BOHLEY E SEGLEN, 1992).

A comparação entre as seqüências primárias da papaína, catepsina B (rato) e catepsina

L (galinha), mostra que as regiões N-terminal (aminoácidos 1-70, numeração da papaína) e C-

terminal (118-212) apresentam identidade de seqüência mais alta, em relação ao domínio

central que possui importantes inserções e deleções. De maneira geral, as seqüências das

catepsinas H e L conservam mais as características da papaína, ao contrário da catepsina B

que difere de forma importante.

As estruturas secundárias das catepsinas H, L e B mostram uma importante

conservação de domínios organizados em α-hélice e dobras β (DUFOUR, 1988). A catepsina

L possui uma estrutura típica de cisteíno-peptidases pertencente à família da papaína, ela é

organizada por dois domínios que flanqueiam o sítio ativo, composto pela Cys

e His

163

. A

Cys

está no domínio composto predominantemente por estruturas do tipo α-hélice, enquanto

a His

163

localiza-se no domínio oposto, com estruturas do tipo dobras β (Figura 2). Pela

comparação dos sítios ativos das catepsinas B e L, através das cristalografias de raios-X,

temos: (a) os subsídios S’ de ambas as enzimas são completamente diferentes, em função da

alça de oclusão próxima ao final dos subsítios S´ da catepsina B; (b) O subsítio S

catepsina L é raso e limitado em relação a catepsina B; (c) O subsitío S

de ambas enzimas

apresentam a maior similaridade entre todos os demais, entretanto a catepsina L acomoda

grupos mais volumosos.

Figura 1: Estrutura Tridimensional da catepsina L em modelo de fita. Do lado esquerdo está

o domínio predominantemente formado por estruturas do tipo α-hélices (em azul)

e ao lado direito o domínio constituído por folhas-β (laranja).

Fonte: PDB File: 1icf

Figura 2: Detalhe do sítio ativo da catepsina L, evidenciando as cadeias laterais da Cys

(em

amarelo) e His

163

(em verde).

Fonte: PDB file 1HNE

A catepsina L é considerada, até o momento, a mais ativa das cisteíno-peptidases

lisossômicas, por hidrolisar os mesmos substratos protéicos com velocidade até dez vezes

superior quando comparada com a catepsina B.

Dentre as funções da catepsina L existem fortes evidencias de funções especificas

como processamento de pró-hormônios, neuro-peptídicos e, também, a conversão de

tiroglobulina em tiroxina nas células epiteliais da tireóide (HONEY AND RUDENSKY,

2003; FRIEDRICHS ET AL., 2003; YASOTHORNSRIKUL

ET AL., 2003).

Um outro ponto de atuação da catepsina L é a remodelação da matriz extracelular. A

atuação das peptidases na remodelação da matriz é essencial para tanto para a sua maturação

quanto para uma deposição controlada dos seus componentes. Extracelularmente, os

colágenos são degradados por colagenases, gelatinases e estromelisinas. Essas proteases

clivam o colágeno em pontos específicos, liberando 1/3 da molécula e seu complementar de

2/3, que são então fagocitados por macrófagos e fibroblastos (EVERTS, ET AL 1996). No

interior dessas células os fagossomos contendo componentes da matriz são fusionados aos

lisossomos onde as catepsinas completam a degradação. Além da degradação intracelular dos

colágenos, as catepsinas podem degradar os componentes da matriz in loco. As células

capazes de liberar catepsinas para o meio extracelular são os macrófagos (catepsinas B, K, L e

S), mastócitos (catepsinas C e L) e células tumorais (catepsinas B, L e S) (PUNTURIERI ET

AL, 2000; WOLTERS ET AL, 1998; HEIDTMANN ET AL, 1993).

Recentemente atribuiu-se a catepsina L a participação na apresentação de antígenos

em macrófagos, através do principal complexo de histocompatibilidade classe II (MHC-II).

Antígenos extracelulares, que são incorporados por macrófagos, são comummente

degradados no sistema lisossomo/endossomo. Os peptídeos resultantes expressam-se na

superfície celular após a formação do complexo principal de histocompatibilidade classe II

(MHC-II). Os heterodímeros αβ do MHC-II são sintetizados no reticulo endoplasmático.

Durante a fase inicial da síntese, o heterodímero αβ se associa com uma proteína de

membrana tipo II, a cadeia invariável (Ii), para formar um complexo monomérico de αβIi. O

complexo αβIi atravessa o complexo de Golgi e é então direcionado ao sistema

lisossomo/endossomo onde ocorre a degradação da porção Ii do complexo monomérico,

permitindo assim que as moléculas do MHC-II encontrar e ligar-se a peptídeos antigênicos. O

processo proteolítico participa ativamente na geração do complexo MHC-II – Peptídeos

antigênicos, sobretudo em dois pontos chaves: (i) degradação do Ii, que é um pré-requisito

para a ligação do MHC-II com os peptídeos; e (ii) geração dos peptídeos antigênicos a partir

de proteínas maiores (

BÜHLING ET AL, 2004).

1.3 Serino-peptidases

As serino-peptidases estão entre as primeiras enzimas a serem estudadas

extensivamente. O interesse nesta família de peptidases é mantido em parte por um crescente

reconhecimento de seu envolvimento em diversos processos fisiológicos e patológicos.

Somado ao papel biológico, feito pelas enzimas digestivas como a tripsina, as serino-

peptidases também atuam amplamente como reguladoras, através da ativação proteolítica de

precursores protéicos (VAN DE VEM ET AL., 1993). Exemplos desta regulação incluem a

ativação do tripsinogênio em tripsina (HUBER & BODE, 1978) e o controle de diversos

passos da cascata de coagulação (fatores VIIa, IXa, Xa

) (DAVIE ET AL., 1991).

Um motivo para o contínuo estudo das serino-peptidases têm sido a sua caracterização

para a compreensão dos mecanismos correlacionais entre estrutura e função. Até

recentemente as enzimas pertencentes a essa classe de peptidases eram divididas em dois

grupos distintos em função de sua estrutura: as similares a quimiotripsina e as similares a

subtilisina. (MATTHEWS, 1977). Entretanto a estrutura cristalográfica da carboxipeptidase II

de trigo revelou um terceiro grupo estrutural.

As três classes de serino-peptidases distinguem-se pela ausência de algum motivo

conservado na estrutura secundária ou terciária, mas em cada caso, os resíduos catalíticos de

serina e a histidina possuem uma orientação geométrica idêntica. Em menor grau, os grupos

adjacentes que estabilizam o estado de transição do substrato estão arranjados de maneira

similar (LIAO ET AL., 1992).

1.3.1 Elastase de neutrófilo

A elastase de neutrófilo (E.C. 3.4.21.37) é uma enzima lisossomal, de

aproximadamente 25kDa, armazenada em grandes quantidades nos grânulos azurófílos de

leucócitos e neutrófilos em mamíferos, pertencente à família das quimiotripsina, caracterizada

assim, pela tríade catalítica formada pelos resíduos Asp

, Ser

173

e His

na enzima em sua

forma ativa (BEYNON E BOND, 1989).

Intracelularmente essa enzima é responsável pela degradação de microorganismos

exógenos que são fagocitados pelas células fagocitárias. Caso seja lançada para o meio

extracelular, a elastase pode promover uma degradação local da matriz extracelular o que

facilita a migração do neutrófilo e também pode modular a expressão de citocinas na

superfície epitelial e endotelial. A modulação inata de citocininas pela elastase é um potencial

iniciador e polarizador da resposta imune adaptativa (FITCH ET AL, 2006).

Estruturalmente as proteases da família da quimiotripsina consistem em dois

domínios, ambos apresentando extensas regiões de folhas-β antiparalelas dispostas como em

um barril e uma região C-terminal em α-hélice. Em alguns casos, como na elastase, o

segmento que conecta os dois domínios também é organizado na forma de uma α-hélice.

(CZAPINSKA E OTLEWSKI, 1999) (Figura 3).

É sabido que durante processos inflamatórios (ITOH. E NAGASE, 1995) e também na

Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (PETTERSON E ADLER, 2002) neutrófilos liberam

grandes quantidades de elastase para a matriz extracelular, provocando um burst local desta

enzima. Uma vez na matriz, a elastase desencadeia o processo de remodelação local da matriz

através da ativação das metalo-proteases (MMPs), facilitando assim a migração de

macrófagos, e outras células fagocitárias.

Figura 3: Estrutura tridimensional da elastase de neutrófilo. É possível verificar a existência

de dois domínios bem definidos, formados exclusivamente por folhas-β (em

laranja)

Fonte: PDB: 1HNE

As MMPs de matriz extracelular caracterizam-se pela dependência de Zn

em seus

centros ativos para atividade catalítica, esse íon coordena a estrutura dessas proteases

conferindo-lhes correto posicionamento dos resíduos de Glu e His, responsáveis pela

atividade catalítica. Pertencem a essa família as gelatinases, estromelisinas, matrilisinas, entre

outras (BEYNON E BOND, 1989). O mecanismo de inibição dessa categoria de proteases

envolve o bloqueio do Zn

necessário para catálise, por inibidores endógenos denominados

Tissue Inhibitors of Metalloproteases (TIMPs) através da formação de complexos

estequiométricos 1:1 (NAGASE ET AL, 1997). Esse grupo de inibidores é considerado como

regulador do turnover da matriz extracelular (EMONARD E GRIMAUD, 1990). O TIMP-1

em particular, é uma glicoproteína que apresenta massa molecular variando entre 29-30 kDa

consistindo de 184 aminoácidos (NAGASE, 1996), sendo descrito como capaz de inibir a

conversão da pró-gelatinase (PMMP-9) para sua forma ativa (TAYLOR ET AL, 1996) e

também capaz de inibir a atividade da estromelisina-1 (MMP-3), como apresentado na Figura

4, que é responsável pelo processamento proteolítico da PMMP-9. Entretanto, a PMMP-9

encontra-se normalmente complexada ao TIMP-1, não permitindo sua ativação (NAGASE,

1997).

Figura 4: Estrutura cristalográfica do complexo formado entre o TIMP-1 e a MMP-3.

Segmento contendo a ligação Val

-Cys

que foi utilizado como base para o

desenho do peptídeo sintético.

Fonte: adaptado de Gomis-Ruth F. X et al (1997)

O arranjo das pontes dissulfeto do TIMP-1 indicam que ele é constituído de dois

domínios, o N-terminal (resíduos 1-124) e o C-terminal (resíduos 127-184). A interação entre

TIMP-1 e o precursor da MMP-9 ocorre através do domínio C-terminal do inibidor e domínio

C-terminal hemopexina da PMMP-9.

Em estudos da degradação do TIMP-1, o que resulta em um aumento da atividade de

metalo-proteases na matriz extracelular, foi determinado que a elastase de neutrófilo é capaz

de inativar o TIMP-1, através da clivagem da ligação Val

-Cys

que se localiza no domínio

N-terminal, capaz de se complexar à MMP-3 (NAGASE E AL, 1997; YOTH E NAGASE,

1995).

1.4 Mecanismo de catálise

1.4.1 Serino-peptidases

Um mecanismo baseado em dados químicos e estruturais é apresentado aqui em

relação a quimiotripsina, embora seja aplicável a todas as serino-peptidases.

Após a ligação do substrato à enzima, o resíduo de Ser

195

(numeração da

quimiotripsina) promove um ataque nucleofílico ao grupo carbonila da ligação peptídica a ser

clivada formando um intermediário tetraédrico. Estudos estruturais por difração de raios-X

indicam que a Ser

195

está perfeitamente posicionada para que ocorra este ataque. O ataque

envolve a transferência de um próton do anel imidazólico da His

formando um íon imidazol.

Esse processo é auxiliado pelo efeito de polarização do íon carboxilato não solvatado do

Asp

102

que forma uma ponte de hidrogênio com a His

. O intermediário tetraédrico tem uma

existência bem definida, apesar de temporária.

O intermediário tetraédrico decompõe-se no intermediário acil-enzima sob a força

impulsora da doação do próton N

da His

. O grupo amino de saída é liberado da enzima e

substituído por uma molécula de água do solvente. O intermediário acil-enzima é altamente

suscetível à clivagem hidrolítica.

O intermediário acil-enzima é deacilado pelo reverso das etapas anteriores, seguido da

liberação do produto carboxilado resultante, regenerando a enzima ativa. Neste processo a

água é o nucleófilo que ataca e a Ser

195

é o grupo de saída.

1.4.2 Cisteíno-peptidases

As enzimas do Clã CA seguem um mesmo mecanismo de catálise, baseando na alta

nucleofilicidade do grupo tiol (-SH) do resíduo Cys

(numeração da papaína) presente no

sítio ativo, que ataca nucleofilicamente o carbono da carbonila da ligação peptídica

susceptível à hidrólise. Também, o resíduo Hys

159

, por intermédio do par iônico imidazol-

tiolato, confere elevada nucleofilicidade ao grupo tiol da Cys

(POLGAR, 1990). Além da

Cys

e da Hys

159

, o resíduo Asn

175

tem sua importância para a atividade das enzimas do clã

CA, por interagir com a Hys

159

por intermédio de forças de Van Der Walls, formando assim a

tríade catalítica Cys-His-Asn.

O mecanismo proposto para a catálise das cisteíno-peptidases é baseado no

mecanismo descrito para as serino-peptidases. A primeira etapa da reação de hidrólise por

uma endopeptidase da família C

é a ligação não covalente entre a enzima e o substrato,

formando o complexo de Michaelis. A etapa seguinte é a acilação da enzima e a formação do

primeiro produto, R’NH

. A acil-enzima reage com uma molécula de H

O para a formação de

segundo produto (desacilação da enzima), regenerando, assim, a enzima ativa. Storer e

Ménard (1994) propõem que as etapas de acilação e desacilação da enzima envolvem a

formação de dois intermediários tetraédricos e quatro estados de transição. Tais

intermediários são acompanhados pela formação de carga negativa no oxigênio da carbonila

do substrato, denominado oxiânion, que é estabilizado pela formação de duas pontes de

hidrogênio, uma na cadeia principal no resíduo Cys

e outra na cadeia lateral do resíduo

Gln

(MÉNARD ET AL, 1995).

1.5 Especificidade

A habilidade de uma enzima em diferenciar dois ou mais substratos que competem

entre si, poder ser encarada como a definição de especificidade de uma dada enzima a um

substrato. A natureza das interações eletrostáticas dos aminoácidos e as interações destes com

os aminoácidos envolvidos no mecanismo de catálise são fatores que se correlacionam

diretamente na especificidade enzimática.

O estudo da especificidade de uma peptidase utilizando substratos naturais gera

informações qualitativas a cerca dos sítios de hidrólise, entretanto, não permite quantificar e

delinear a especificidade primária destas enzimas. Um exemplo é o estudo da especificidade

da catepsina B sobre a cadeia β da insulina. Em pH ácido, a atividade exopeptidásica é maior

quando comparada à atividade endopeptidásica, o que leva a uma difícil caracterização do

local exato da hidrólise.

Os substratos peptídicos sintéticos permitem detectar de maneira mais clara a

atividade enzimática, determinar as suas constantes cinéticas características e também fazer

comparações diretas em relação à especificidade primária entre duas ou mais enzimas.

Quando em 1967 Schechter e Berger relataram seu trabalho fundamental sobre sítios

de ligação de substratos da papaína, coube-lhes apenas confiar em dados cinéticos. O estudo

avaliou a dependência das cinéticas de substratos na extensão de uma cadeia de polialanina e

os experimentos demonstraram que as cinéticas são influenciadas pela extensão da cadeia

polipeptídica em sete aminoácidos e, assim, concluíram que existem sete subsítios de ligação

na molécula da papaína (S

-S

e S’

-S’

), cada um podendo acomodar um único aminoácido

de um dado substrato (P

-P

e P’

-P’

). (Figura 5)

Os subsítios S

interagem com os aminoácidos P

situados do lado N-terminal do sítio

de clivagem, e os subsítios S’

interagem com os aminoácidos P’

localizados na região C-

terminal do sítio de clivagem (SCHECHTER E BERGER, 1967).

A nomenclatura sugerida por Schechter e Berger (1967) permitiu descrever o sítio

ativo de diversas peptidases. As definições das interações enzima substrato e sua

nomenclatura tornaram-se padrões para a designação dos subsítios de interações de um

substrato polipeptídico e uma enzima proteolítica.

Figura 5: Nomenclatura de Schechter e Berger. Os subsítios da enzima interagem com os

aminoácidos na posição Pn no substrato, situado ao lado N-terminal do ponto de

hidrólise e os subsítios S’

com os aminoácidos P’

localizados no lado C-terminal.

1.5.1 Catepsina L

Quando um número suficiente de estruturas protease/inibidor tornou-se disponível, as

definições de Schecheter e Berger (1967) em relação aos subsítios de ligação do substrato

sobre as enzimas da família da papaína foram redefinidas. A base e as paredes dos subsitíos

de ligação são formadas por quatro segmentos da cadeia. Duas alças curtas no domínio L

(resíduos 19-25 e 61-69) e duas alças longas no domínio R (resíduos 136-162 e 182-213)

(TURK E GUNCAR, 2003).

As estruturas sobrepostas de complexos de catepsinas com inibidores análogos a

substratos revelam que os resíduos do substrato ligam-se ao longo da fenda catalítica em uma

conformação estendida. Com as cadeias laterais orientadas para os domínios L e R, de

maneira alternada. Os resíduos P

, P

e P’

ligam-se de maneira bem definida aos seus

respectivos subsítios. Esta acomodação é orientada pelas interações que envolvem átomos da

cadeia principal e das cadeias laterais. Os subsítios S

e S’

permitem apenas uma ligação

superficial do substrato, em contra ponto o subsítio S

apresenta-se como uma cavidade mais

profunda. A localização do resíduo P

é mediada somente por interações da cadeia lateral. Em

função disso, as geometrias de ligação estão dispersas por uma ampla área e exclusivas para

cada substrato.

A localização de subsítios de ligação além de S

e S’

não é prejudicada pelas

interações da cadeia principal. Cada resíduo liga-se na superfície da enzima à sua própria

maneira. Em função disso Turk et al (1998) sugerem que as ligações alem de S

e S

’ não

deveriam ser classificadas como subsítios, mas sim como áreas. Dessa maneira as peptidases

pertencentes à família da papaína representam uma classe especial de peptidase, a qual

apresenta um número limitado de subsítios, em oposição as serino-peptidases da família da

quimiotripsina que possuem seis subsítios. As descrições dos subsítios da catepsina L estão

mais bem esclarecidas nos tópicos que seguem.

1.5.1.1 Subsítio S

O subsítio S

das enzimas da família da papaína acomoda preferencialmente resíduos

básicos. A maioria dos substratos sintéticos descritos para essa família contém Lys ou Arg na

posição P

(BROCKLEHURST, 1990).

1.5.1.2 Subsítio S

O aminoácido que ocupa o subsítio S

é crucial para a diferenciação das peptidases da

família da papaína.

A maioria dos substratos descritos contém Phe na posição S

(BARRETT E

KIRSCHKE, 1981), entretanto, o subsítio S

aceita de maneira geral aminoácidos

hidrofóbicos aromáticos (LECAILLE ET AL, 1999) ou não aromáticos (BRÖMME ET AL,

1999). A natureza dos aminoácidos envolvidos no subsítio S

pode explicar as diferentes

especificidades encontradas nas peptidases da família da papaína (TABELA 2) (MUSIL ET

AL, 1991).

Tabela 2 – Aminoácidos constituintes do subsítio S

da papaína e catepsinas B e L.

Aminoácidos (numeração da papaína)

Enzima

68 133 157 160 205

Papaína Pro Val Val Ala Ser

Catepsina B humana Pro Ala Gly Ala Glu

Catepsina L humana Met Ala Met Gly Ala

Fonte: Adaptado a partir de Portaro et al (2000)

1.5.1.3 Subsítio S

O subsítio S

da catepsina L é formado por resíduos de Asn

, Glu

e Leu

. Poucos

são os resultados sobre a especificidade em relação ao subsítio S

disponíveis na literatura.

Koga et al (1990) demonstraram que a catepsina L, em contra ponto à papaína, acomoda um

aminoácido hidrofóbico nesta posição.

De acordo com os dados obtidos a partir da cristalografia da catepsina L os subsítios

das catepsinas B e L podem ser considerados similares tem termos de sua especificidade.

Considerando-se apenas os resíduos hidrofóbicos, a ordem preferencial na catepsina L

é: Phe, Trp, Leu e Tyr. Os substratos que apresentam His na posição P

, também são bastante

susceptíveis a hidrolise pela catepsina L, entretanto, resíduos ácidos fazem com que a

hidrolise seja afetada negativamente (PORTARO ET AL, 2000).

1.5.1.4 Subsítio S’

Os subsítios S

’ da papaína, catepsina B e catepsina L possuem um amplo grau de

especificidade. As diferenças residem no tamanho e na hidrofobicidade deste subsítio. A

catepsina B acomoda preferencialmente resíduos hidrofóbicos e volumosos, enquanto a

catepsina L aceita substratos com aminoácidos como Ser, Ala, Asn, Gln e Lys na posição P

’.

(MÉNARD ET AL, 1993).

1.5.1.5 Subsítio S’

A especificidade do subsítio S’

da catepsina L é muito similar ao da papaína, sendo

ambas enzimas capazes de hidrolisar com eficiência substratos que contenham Phe em P’

(BRÖMME E KIRSCHKE, 1993).

O S’

da catepsina L é, por sua natureza, preferencialmente hidrofóbico, acomodando

principalmente Trp, Leu e Tyr (PORTARO ET AL, 2000). Este padrão também foi observado

em cristalografia de raios-X da pró-catepsina L, onde a Met

da pró-região interage com o

Trp

177

da enzima. (COULOMBE ET AL, 1996).

1.5.2 Elastase de Neutrófilo

A elucidação das estruturas espaciais de diversas enzimas pertencentes à família da

quimiotripsina, como por exemplo, quimiotripsina bovina, elastases suínas e de neutrófilo e

trombina, mostra que domínio catalítico e os sítios de ligação do substrato nas enzimas

similares a quimiotripsina estão localizados no espaço entre os domínios destas enzimas. Os

resíduos funcionais estão posicionados preferencialmente na alça de ligação. O subsítio S

constituído por três folhas β (resíduos 189-192, 214-216 e 226-228; numeração da

quimiotripsina) e por um sítio de ligação de oxiânion (Gly

193

e Ser

195

), pertencem ao barril-β

C-terminal (CZAPINSKA E OTLEWSKI, 1999). Os demais subsítios estão sumarizados na

figura 6, e suas descrições são dadas nos subitens abaixo.

1.5.2.1 Subsítio S

A especificidade neste grupo é dada, sobretudo pela interação entre o aminoácido que

ocupa a posição P

. A elastase tem por preferência resíduos hidrofóbicos de pequenas ou

médias dimensões. O subsítio S

possui uma forma semi-esférica e possui uma característica

bastante hidrofóbica. Curiosamente este subsítio contém uma carga negativa da Asp

226

que,

no entanto, não está disponível para a interação com a cadeia lateral do aminoácido P

, uma

vez que está bloqueado pela Val

216

e Val

190

. O subsítio S

acomoda bem resíduos de Leu, Ile,

Val ou Met. A intensa ligação de cadeias laterais de Ile e/ou Val é uma característica própria

da elastase que a distingue de praticamente todas as outras serino-peptidases. Uma possível

explicação para essa característica pode ser a grande flexibilidade intrínseca deste subsítio

como conseqüência da sua constituição e interação com outras porções da estrutura (BODE

ET AL, 1989).

1.5.2.2 Subsítio S

O subsítio S

da elastase, pautado pelos resíduos Phe215 - Leu99 e próximo ao anel

himidazol da His57, apresenta-se em forma de taça e bastante hidrofóbico. Ele acomoda

cadeias laterais de tamanho médio e com característica hidrofóbica, tendo preferência por

resíduos de prolina (BODE ET AL, 1989).

1.5.2.3 Subsítios S

e S

. Cadeias laterais longas e hidrofóbicas podem fazer interações hidrofóbicas com a

superfície da enzima, sobretudo com a Phe

192

e a Val

216

. Em conformidade ao já visto para

outras serino-peptidases, a interação entre P3-S3 é caracterizada por duas pontes de

hidrogênio intramoleculares entre os grupos NH do substrtato e a carbonila do da Val

216

Cadeias laterais de Ala direcionam-se através das cadeias laterais da Phe

215

e da Arg

217

subsítio S

em direção a moléculas de água. Curiosamente, substratos com Lys em P

ou P

são muito menos reativas do que quando comparadas com Ala. Em contraste substratos com

resíduos de cadeia lateral aromática ou grupos hidrofóbicos longos e com carga são mais bem

aceitos e estabilizam melhor o substrato na enzima (YASUTAKE E POWERS, 1981).

Figura 6: Representação esquemática da interação entre a elastase de neutrófilo (HLE) e um

dado substrato. Os subsítios estão representados por S1, S1’, etc. e os resíduos do

substrato por P

, P’

etc.

Fonte: adaptado a partir de Bode et al (1989)

1.5.2.4 Subsítio S’

O subsítio S’

é reativamente hidrofóbico, ladeado pelas Cys

e Cys

, que formam

uma ponte dissulfeto, e pela Phe

. Este subsítio não possui uma alta especificidade em

relação às cadeias laterais que acomoda, podendo, assim, receber quase todos os aminoácidos,

com duas exceções: Pro ou resíduos muito volumosos e hidrofóbicos, como Trp (BODE,

1989).

1.5.2.5 Subsítio S’

Estudos de afinidade para este subsítio indicam que ele possui uma grande afinidade

por cadeias laterais fenólicas, como da Tyr.

1.5.2.6 Subsítio S’

O subsítio S’

é formado pelas cadeias laterais da Phe

, Leu

e Val

o que lhe

confere uma característica hidrofóbica levando-o a acomodar de maneira preferencial

substratos com P’

que possuam longas cadeias alifáticas (BODE, 1989).

2 OBJETIVOS

a) Estudar a especificidade das enzimas catepsina L e Elastase de Neutrófilo Humana

em relação ao substrato sintético derivado da seqüência do Inibidor Tissular de Metalo

Protease – 1 (TIMP-1) em relação aos seus substratos comerciais e determinação das

constantes cinéticas (k

, K

cat

e K

cat

/ k

) para cada um dos casos;

b) Determinar a influência da heparina nas constantes de especificidade da elastase.

c) Caracterizar os produtos de hidrólise de cada uma das enzimas através dos

fragmentos gerados e analisados por espectrometria de massa;

d) Correlacionar às posições P e P’ do substrato hidrolisado com a especificidade e

características dos subsítios S e S’.

3 MATERIAIS E MÉTODO

3.1 Enzimas, Substratos e Moduladores

3.1.1 Elastase de Neutrófilo.

A elastase de neutrófilo (50µg) foi adquirida comercialmente da Calbiochem /

Novabiochem (la Jolla, Califórnia USA), foi diluída em 100 µl de tampão Hepes 10mM, 0,14

M NaCl, em pH 7,4. O sítio ativo foi titulado com fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), de

acordo com (BARRETT, 1981).

3.1.2 Catepsina L

A enzima catepsina L foi expressa, purificada e ativada como descrito por Illy (1997).

A concentração estoque (736 µM). A titulação do sítio ativo da enzima foi feita com inibidor

L-Trans-Epoxisuccinil-L-Leucilamino (4-guanidino)-butano (E-64) de acordo com Barrett e

Kirschke (1981). Todo o processo de expressão foi feito no Núcleo Integrado de

Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes (NIB – UMC) sob a orientação do Prof.

Dr. Luiz R. Nunes e Profª Drª. Regina C. de Oliveira

3.1.3 Substratos Cumarínicos Z-FR-MCA e MeOSuc-AAPV-MCA.

Os substratos derivados cumarínicos utilizados para os ensaios fluorimétricos foram

adquiridos comercialmente da Sigma-Aldrich.

3.1.4 Inibidor Tissular de Metaloproteases – 1 Recombinante

Cedido pela Profª. Drª. Gillian Murphy do Departamento de Oncologia da

Universidade de Cambridge, Reino Unido.

3.1.5 Heparina

A heparina de pulmão bovino foi cedida pelo Prof. Dr. Ivarne Luiz dos Santos

Tersariol do Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica da Universidade de Mogi das

Cruzes (CIIB-UMC).

3.2 Substrato sintético derivado da seqüência do TIMP-1

O substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp foi sintetizado no Departamento de

Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) pela Profª Drª Maria Juliano e Pr.

Dr. Luiz Juliano Neto. A modificação realizada no peptídeo em relação a seqüência natural do

TIMP-1 foi a substituição do resíduo de Cys

por um resíduo de Met (Abz-

AMESVMGYFHRSQ-EDDnp). Essa modificação foi introduzida por conveniência para a

síntese do mesmo.

Trata-se de um substrato fluorescente com supressão interna de fluorescência cuja

aplicação no estudo da especificidade de proteases está bem consolidada. O substrato contém

um grupo florescente, ácido orto-aminobenzóico (Abz) ligado à porção N-terminal e um

supressor da fluorescência, etilenodiamino-dinitro-fenil (EDDnp), na porção C-terminal.

Enquanto a cadeia peptídica estiver integra e os dois grupos estiverem relativamente próximos

à fluorescência do composto será mínima. A partir do momento da hidrólise a fluorescência

irá aumentar.

Por se tratar de um aumento proporcional ao número de moléculas hidrolisadas, este

índice de variação de fluorescência torna-se uma medida direta da velocidade de hidrólise que

pode ser utilizada para a determinação das constantes cinéticas.

3.3 Estudos das cinéticas enzimáticas

3.3.1 Titulação do substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp

Para a titulação do substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp foram feitas cinco

diluições em água, que foram então submetidas a leitura da absorbância (λ = 365 nm) no

espectrofotômetro U-2001 da Hitachi (Japão) com cubetas de quartzo de 3mL e caminho

óptico de 1cm. Os valores de absorbância obtidos eram analisados através de regressão linear

com o softwear GRAFIT v. 3.01 (Leatherbarrow, 1993) da onde se origina uma reta

(absorbância x volume de substrato) cujo coeficiente angular foi utilizado para determinar a

concentração (em µM) a partir da equação:

[]

angularecoeficient

substrato ≡

sendo ξ = 17300 M

-1

3.3.2 Calibração do fluorímetro para o grupo Abz.

Para padronizar o fluorímetro (mod. F-2500, Hitachi, Japão) efetuou-se primeiramente

a hidrólise total do substrato (Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp) em concentrações

crescentes (0,054 µM, 0,108 µM, 0,162 µM, 0,216 µM e 0,270 µM) com papaína (10nM). A

fluorescência do substrato foi monitorada em λ

= 320nm, λ

=420nm, fendas de excitação

e emissão 10nm e 20nm, respectivamente, e 700V. Os dados obtidos foram analisados por

regressão linear no softwear GRAFIT v. 3.01 (Leatherbarrow, 1993) de onde se obteve uma

reta (fluorescência x concentração). O coeficiente angular desta reta corresponde à constante

do aparelho, em UAF/ µM. Essa constante permite a conversão da velocidade de UAF/min

para M/min.

3.3.3 Calibração do fluorímetro para MCA

Concentrações de MCA livre (5 à 100nM) foram submetidos à leitura da sua

fluorescência, monitorados em λ

= 360nm, λ

=480nm, fendas de excitação e emissão

10nm e 10nm, respectivamente, e 700V. Os dados obtidos foram analisados por regressão

linear no softwear GRAFIT v. 3.01 (Leatherbarrow, 1993) de onde se obteve uma reta

(fluorescência x concentração). O coeficiente angular desta reta corresponde à constante do

aparelho, em UAF/ µM. Essa constante permite a conversão da velocidade de UAF/min para

M/min.

3.3.4 Cinéticas Enzimáticas

A solução estoque do substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp foi preparada em

DMF 10% em H

0, a solução de Z-FR-MCA foi feita diretamente em H

0, ambas mantidas à

4ºC. Na determinação dos parâmetros cinétios utilizou-se fluorímetro F-2500 (Hitachi, Japão)

ajustado como descrito anteriormente. Foram utilizadas cubetas de caminho óptico 1cm e

volume final 2mL.

Para a elastase de neutrófilo os ensaios foram feitos em tampão Hepes 10mM, 0,14 M

NaCl, em pH 7,4 e 0,05% de Triton X-100. Sendo a concentração final de 2,0nM. Para as

cinéticas com heparina a concentração final foi de 50µM. Para a catepsina L os ensaios foram

feitos em tampão acetato de sódio 400mM, EDTA1mM em pH 5,5 e DTT (5mM) para a

ativação, sendo a concentração final de 2,0nM.

Para a curva de pH com a elastase de neutrófilo (pH 5,0 – 10,0), na ausência e

presença de heparina, utilizou-se tampão acetato de sódio 25mM, MES 25mM, TRIS 25mM,

Glicina 25mM, 0,14 M NaCl e 0,05% Triton X-100.

Para assegurar que as soluções de reação estavam livres de contaminastes com

atividade proteolítica, foram mantidas no compartimento termostatizado durante 5 minutos e

monitorada sua fluorescência, antes da adição da enzima.

A variação linear da florescência por unidade de tempo foi convertida em nanomols de

substrato hidrolisado por minuto, baseado na curva de fluorescência da solução do peptídeo

com concentração previamente conhecida.

As constantes cinéticas foram determinadas a partir das velocidade iniciais de

hidrólise ( ≤ 10% da hidrólise total, através da extrapolação da fluorescência máxima

possível, para cada concentração de substrato) utilizando a equação descrita por Michaelis-

Mentem, no softwear GRAFIT v. 3.01 (Leatherbarrow, 1993). A velocidade máxima,

expressa em UAF/mim, foi então corrigida para mM/min permitindo o cálculo das constantes

cinéticas. Os desvios padrão, na determinação de K

e k

cat

foram sempre menores que 5%.

3.4 Espectrometria de Massas

As análises por espectrometria de massas foram feitas no Centro de Toxicologia

Aplicada do Instituto Butantan (CAT-CEPID) sob a orientação do Prof. Dr. Daniel C

Pimenta.

3.4.1 Amostras

Para os ensaios de espectrometria de massas, foram preparadas as seguintes soluções:

a) Controle: Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp (10mM), em solução aquosa.

b) Incubado 1: Catepsina L (10nM) mais Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp (10µM), em

tampão acetato de sódio 400mM, EDTA1mM em pH 5,5 e DTT (5mM).

c) Incubado 2: Elastase (10nM) mais Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp (10µM) em tampão

Hepes 10mM, 0,14 M NaCl, em pH 7,4.

Todas as amostras foram mantidas por 60 minutos em banho termostatizado a 37ºC.

Após o tempo de incubação a atividade enzimática foi interrompida com a adição de

inibidores específicos, para a catepsina L foi usado E-64 e para elastase de neutrófilo PMSF.

3.4.2 Maldi-Tof

Para a espectrometria de massas tipo MALDI-TOF, as análises foram realizadas em

um instrumento MALDI-ToF/Pró (Amersham). As amostras, em solução, foram misturadas

na proporção 1:1 (v:v) com uma solução supersaturada de matriz para peptídeos (ácido

cinâmico) ou matriz para proteínas (ácido sinápico), depositadas sobre a placa de amostragem

(0,4-0,8 µL) e deixadas secar no ambiente. Foi utilizado o modo automático de controle do

equipamento e aquisição de dados do software de controle do equipamento.

3.4.3 LC-MS

As amostras previamente secas foram dissolvidas em 0,1% ácido fórmico e

depositadas no amostrador do auto-injetor. 20 µL de amostra são injetadas

em um sistema de HPLC/Espectrometria de Massass (LC/MS) tipo Quadrupolo, MSQ

Surveyor (Thermo Finnigan) sob fluxo constante de 1 mL/min, e submetida a

uma separação cromatográfica por fase reversa em coluna Bischoff NPS C18 1.5

(4.6 x 14 mm), utilizando como solventes A: ácido fórmico 0,1% e solvente B:

ACN: H

O:ácido fórmico/900:100:0,1 e um programas de gradiente linear de 0 a

100% de B em 6 minutos. O controle do instrumento, a aquisição e o

processamento de dados foram realizados pelo pacote de programas Xcalibur

(Thermo Finnigan).

3.5 Eletroforese

Para a analise eletroforética foram preparados dois incubados, a saber:

a) Elastase + TIMP-1; e

b) Elastase + TIMP-1 + Heparina

A partir destes incubados foram sendo retiradas alíquotas em tempos pré-

determinados: 20, 40, 60, 90 e 120 minutos. As alíquotas foram aplicadas em gel de SDS-

Page (12,5%) segundo Laemmli (Laemmli, U.K., 1970). O gel foi corado com nitrato de prata

e analisado por densitometria.

4 RESULTADOS

4.1 Cinéticas enzimáticas

4.1.1 Elastase de Neutrófilo

Visando a necessidade de um substrato que nos permitisse o acompanhamento da

atividade da elastase de neutrófilo humano, optamos pela utilização do substrato comercial

derivado cumarínico MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA, que foi utilizado como padrão para a

comparação com os dados obtidos para o substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp

(Tabela 3).

O substrato também foi ensaiado na presença de heparina, como modulador da

atividade catalítica. Na determinação das constantes de especificidade (k

cat

) após a

determinação individual das constantes de afinidade (K

) e de catálise (k

cat

) observamos que

o valor determinado para hidrólise do peptídeo Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp na

presença de heparina é aproximadamente quatro vezes maior, diferentemente do peptídeo

comercial, que apresenta um decréscimo na atividade (Tabela 3).

Tabela 3: Diferenças observadas na constante de afinidade determinadas por cinética

michaelianas na presença e ausência de heparina.

Cinéticas Michaelianas

[E]: 2,0 nM

Cinéticas

Michaelianas +

µM heparina

[E]: 2,0 nM

cat

(mM

-1

)

cat

(mM

-1

)

MeOSuc-AAPV-MCA

30,0

± 3,0 20,0 ± 2,0

Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp

330,0

± 30,0 1100,0 ± 90,0

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

A figura 7 mostra a atividade enzimática (k

cat

) da elastase em função do pH na

ausência e presença de heparina (50µM). Quando a enzima é ensaiada na presença de

heparina existe uma variação de 0,5 no pH ótimo da enzima, indo de 8,0 para 8,5. Os valores

das constantes de afinidade estão listados na tabela 4.

Figura 7: Curva de atividade da elastase em função do pH (5,5 – 10,5) na ausência de

heparina (pontos brancos) e na presença de 50µM de heparina (pontos pretos)

1086

140

120

100

Kcat/km (uM-1s-1)

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

Tabela 4: Constantes de afinidade da elastase de neutrófilo em função do pH na presença e

ausência de heparina.

pH Sem heparina

cat

(µM

-1

)

Heparina (50 µM)

cat

(µM

-1

)

5,0 0,462 2,263

5,5 4,676 6,788

6,0 9,580 22,641

6,5 42,070 43,006

7,0 79,460 63,385

7,5 104,005 108,654

8,0 111,015 133,559

8,5 79,934 140,347

9,0 58,432 110,918

9,5 35,060 74,700

10,0 10,515 48,663

10,5 4,67669 22,641

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

4.1.2 Catepsina L

À mesma maneira que procedido para a elastase de neutrófilo, utilizou-se um substrato

comercial, derivado cumarínico, o Z-FR-MCA para verificar a atividade enzimática e também

como padrão para comparação dos dados com o substrato derivado da seqüência do TIMP-1.

As constantes cinéticas, neste caso, foram determinadas individualmente por cinética

Michaeliana (Tabela 5).

Tabela 5: Constantes de afinidade para a catepsina L, usando o substrato comercial (Z-FR-

MCA) e o substrato sintético derivado da seqüência do TIMP-1(Abz-

AMESCMGYFHRSQ-EDDnp).

Substrato k

cat

-1

)

Z-FR-MCA

1350,0

± 67,0

Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp 2270,0 · 110,0

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

4.2 Espectrometria de Massas

Em um primeiro momento, como o intuito de avaliar a integridade do substrato, foi

feito o espectro de Massas apenas deste, nas mesmas condições em que seria submetido à

hidrólise pelas enzimas. O resultado está apresentado na figura 8.

No espectro de Massas do substrato é possível evidenciar três picos distintos

(numerados de 1 a 3). O pico de número 1 corresponde ao substrato integro, e apresenta uma

massa de 1885,72 Da, o que corresponde ao peso calculado através da seqüência de

aminoácidos. Os picos dois e três, também se referem ao substrato na sua totalidade,

entretanto possuem uma diferença de massa de 16 e 32 unidades (picos 2 e 3 respectivamente)

em relação ao pico 1. Essa diferença é em função de os grupos Abz/EDDnp perderem

moléculas de oxigênio durante o processo de ionização da amostra. A perda dessas moléculas

de oxigênio também se reflete aumentando a intensidade do pico, uma vez que a intensidade

do sinal observado está ligada diretamente a quão protonável é a seqüência em questão.

Figura 8: Espectro de Maldi-Tof, do substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp. O pico 1 refere-se ao substrato integro, assim como

os picos 2 e 3. A diferença entre eles é referente a perda de um e dois oxigênios pelos grupos Abz/EDDnp. (

Fonte: Dados obtidos

experimentalmente.)

Esses dados demonstram que o substrato está integro na solução estoque usado para os

ensaios posteriores, portanto, qualquer fragmento de massa molecular menor ao descrito

anteriormente para a molécula integra, é devido exclusivamente ao processo hidrolítico das

enzimas.

4.2.1 Catepsina L

Após confirmar-se pelas cinéticas enzimáticas a habilidade da catepsina L em

hidrolisar o substrato Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp, passamos para os experimentos de

espectrometria de Massas, para, então, identificar a ligação peptídica hidrolisada.

O incubado contendo o substrato e catepsina L foi primeiramente analisado por

espectrometria de Massas do tipo MALDI-TOF em função da necessidade de um volume

pequeno de amostra e rapidez na aquisição dos dados. A figura 9 mostra os dados obtidos.

O espectro de massa do incubado mostra um pico com uma boa intensidade de sinal e

com uma massa molecular de 582 Da. Este pico refere-se ao produto de hidrólise obtido pela

ação da catepsina L. Após analise dos possíveis pontos de hidrolise presentes na molécula do

substrato, verificou-se que a ligação hidrolisada foi entre o resíduo de His e o resíduo de Arg,

gerando os fragmentos Abz-AMESVMGYFH e RSQ-EDDnp. A massa real calculada do

fragmento RSQ-EDDnp é de 614 Da, a diferença entre esta e a observada experimentalmente

deve-se mais uma vez à perda de um oxigênio pelo grupo EDDnp.

Para confirmar a hidrolise no ponto sugerido, uma alíquota do incubado foi submetida

à espectrometria de massa do tipo LC-MS, uma vez que o fragmento (1290 Da) não

apresentaria sinal mensurável no MALDI-TOF uma vez que não possui resíduos que possam

ser protonáveis e, com isso, identificados com clareza.

Figura 9: Espectro de massa do incubado de catepsina L com o substrato sintético. A seta indica o fragmento gerado pela ação

enzimática. O produto de hidrólise possui uma massa real de 614Da, referente a seqüência RSQ-EDDnp. A diferença entre a

massa calculada e a encontrada deve-se a perda de um oxigênio. (

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.)

RSQ-EDDnp

A figura 10 refere-se aos experimentos de LC-MS. Na parte superior (Figura 9 A)

podemos verificar dois cromatogramas de fase reversa onde se observa a eluição da região C-

terminal no início do gradiente e o produto N-terminal, em função da sua característica mais

hidrofóbica, é retido mais tempo na coluna o que aumenta o seu tempo de retenção Os tempos

de retenção são de 0,39 minutos e 3,69 minutos, respectivamente.

A figura 9 B apresenta o espectro de massa para cada um dos picos observados. Na

parte superior da figura a região C-terminal com m/z = 598 e na parte inferior o fragmento N-

terminal com duas cargas, ou seja, m/z = 637 (m=1290 – 16, correspondendo a perda de um

oxigênio e z=2). Os demais íons que podem ser vistos no cromatograma podem ser da fase

móvel, impurezas, fragmentação das moléculas ou reagentes presentes no incubado.

Ao verificar-se a presença do fragmento com massa de 1290 Da pelo método LCMS,

pode-se, com clareza afirmar o ponto de hidrólise sugerido pelos experimentos prévios em

MALDI-TOF.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

Time (min)

100

Relative Abundance

3.69

0.53

2.92 6.443.60

5.21

0.36

3.82 6.640.70 6.93

3.12 6.205.14 5.860.85 1.43 4.44

4.63

1.64 5.312.542.071.861.16 2.32 5.703.930.02

0.39

0.36

0.53

3.69

0.70

3.43

3.16

1.661.54

1.331.06 5.211.81 2.24 2.99

4.640.26 4.97

5.69 6.373.77

2.85 6.985.24 6.746.084.402.36 4.08

NL:

3.50E5

m/z =

638.40-

639.40 F:

G3_06101012

4949

NL:

5.90E5

m/z =

598.29-

598.81 F:

G3_06101012

4949

NL:

5.90E5

m/z =

598.29-

598.81 F:

G3_06101012

4949

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

100

Relative Abundance

146.13

377.27

598.53

620.53

178.38

337.27

418.27

513.28

666.41

731.54

952.56 1080.81

1320.21867.30

1192.07 1483.09 1578.22 1840.111756.73 1927.62

242.51

786.67

142.13

637.54

186.51

596.53

451.40

279.14

808.80

692.41

902.93

1050.19 1627.731203.20 1289.08 1718.481507.47 1865.87 1969.87

NL: 2.60E5

G3_061010124949#20-27 RT:

0.32-0.44 AV: 8 T: {0,0} + p

ESI corona sid=75.00

det=1153.00 Full ms [

100.00-2000.00]

NL: 2.82E5

G3_061010124949#214-219 RT:

3.64-3.72 AV: 6 T: {0,0} + p

ESI corona sid=75.00

det=1153.00 Full ms [

100.00-2000.00]

Figura 10: LCMS do incubado com catepsina L. Em A está o cromatograma de fase reversa, onde o pico com tempo de retenção de 3,69

minutos é a porção N-terminal do substrato e o pico com tempo de retenção de 0,39 minutos é referente a porção C-terminal.

Em B está o espectro de massa de cada pico, onde na parte superior vemos a região C-terminal (598,53Da) e na parte inferior a

porção N-terminal com duas cargas (637Da), ambos indicados com uma seta vermelha e sua seqüência. (

Fonte: Dados obtidos

experimentalmente.)

Figura 10: LCMS do incubado com catepsina L. Em A está o cromatograma de fase reversa, onde o pico com tempo de retenção de 3,69

minutos é a porção N-terminal do substrato e o pico com tempo de retenção de 0,39 minutos é referente a porção C-terminal.

Em B está o espectro de massa de cada pico, onde na parte superior vemos a região C-terminal (598,53Da) e na parte inferior a

porção N-terminal com duas cargas (637Da), ambos indicados com uma seta vermelha e sua seqüência. (

Fonte: Dados obtidos

experimentalmente.)

A A

B B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

Time (min)

100

Relative Abundance

3.69

0.53

2.92 6.443.60

5.21

0.36

3.82 6.640.70 6.93

3.12 6.205.14 5.860.85 1.43 4.44

4.63

1.64 5.312.542.071.861.16 2.32 5.703.930.02

0.39

0.36

0.53

3.69

0.70

3.43

3.16

1.661.54

1.331.06 5.211.81 2.24 2.99

4.640.26 4.97

5.69 6.373.77

2.85 6.985.24 6.746.084.402.36 4.08

NL:

3.50E5

m/z =

638.40-

639.40 F:

G3_06101012

4949

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

100

Relative Abundance

146.13

377.27

598.53

620.53

178.38

337.27

418.27

513.28

666.41

731.54

952.56 1080.81

1320.21867.30

1192.07 1483.09 1578.22 1840.111756.73 1927.62

242.51

786.67

142.13

637.54

186.51

596.53

451.40

279.14

808.80

692.41

902.93

1050.19 1627.731203.20 1289.08 1718.481507.47 1865.87 1969.87

NL: 2.60E5

G3_061010124949#20-27 RT:

0.32-0.44 AV: 8 T: {0,0} + p

ESI corona sid=75.00

det=1153.00 Full ms [

100.00-2000.00]

NL: 2.82E5

G3_061010124949#214-219 RT:

3.64-3.72 AV: 6 T: {0,0} + p

ESI corona sid=75.00

det=1153.00 Full ms [

100.00-2000.00]

Abz-AMESVMGYFH

RSQ-EDDnp

4.2.2 Elastase de Neutrófilo

O incubado com elastase foi submetido também a analise por MALDI-TOF com o

intuito de verificar o ponto de hidrólise. Após analise dos possíveis pontos de hidrólise

presentes na molécula do substrato correlacionando-os com as massas presentes no espectro

obtido (Figura 11), verificou-se que a ligação hidrolisada foi entre o resíduo de Met e o

resíduo de Val, dando origem aos fragmentos e, sendo a massa de cada fragmento 668 e 1217

Da, respectivamente. Os picos referentes aos produtos gerados estão destacados na figura,

com as suas respectivas seqüências.

No caso deste incubado não houve a necessidade de fazer ensaios utilizando LCMS,

uma vez que os dois fragmentos puderam ser observados com o uso do Maldi-Tof.

Figura 11: Espectro de Maldi-Tof do incubado de elastase com o substrato derivado do TIMP-1. Os produtos de hidrolise estão indicados

com a seta vermelha, e sua seqüência correspondente. (

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.)

Abz-AMESV

MGYFHRSQ-EDDnp

4.3 Eletroforese

Visando uma correlação mais informações acerca da influência da heparina como

modulador da elastase na degradação do TIMP-1, nosso próximo passo foi avaliar, através de

eletroforese em gel de SDS-Page, a degradação da molécula integral do TIMP-1 na ausência e

presença de heparina em diferentes tempos de incubação e analisar posteriormente por

densitometria. A figura 12 mostra os resultados obtidos, as pistas marcadas com (+) são

aquelas onde a elastase foi incubada com heparina nas pistas marcadas com (-) não houve

incubação com heparina, os tempos de incubação estão descritos em minutos.

Figura 12: Eletroforese em gel SDS (12,5%) avaliando a influência da heparina na catalise da

molécula de TIMP-1. As pistas marcadas com o sinal (-) não possuem heparina e

as pistas marcadas com (+) possuem heparina.

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

Foi realizada a análise por densitometria das bandas observadas nos ensaios de

eletroforese realizados conforme Figura 13. Os valores estão listados na tabela 6

Figura 13: Gráficos construídos a partir dos dados de densitometria do gel de eletroforese.

Em A verifica-se o consumo da molécula de TIMP-1 pela elastase e em B o

aparecimento do produto de hidrólise.

0 20 40 60 80 100 120

100

% TIMP-1

Tempo (min)

TIMP + HNE

TIMP + HNE + HEP

0 20406080100120

% Produto Formado

Tempo (min)

TIMP + HNE

TIMP + HNE + HEP

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

Tabela 6: Porcentagens de TIMP-1 remanescente e produto formado a partir da degradação

do TIMP-1 em diversos tempos de incubação na presença e ausência de

Heparina. As porcentagens foram calculadas a partir dos dados obtidos pela

densitometria do gel em SDS-Page.

Tempo (min) % TIMP % Produto formado

Sem

Heparina

Com Heparina

(50µM)

Sem

Heparina

Com Heparina

(50µM)

0 100 100 0 0

20 83 58 17 42

40 67,7 49 32,3 51

60 59,6 44 40,4 56

90 54,1 40 45,9 60

120 53,5 38 46,5 62

Fonte: Dados obtidos experimentalmente.

5 DISCUSSÃO

A hidrólise do inibidor tissular da metaloproteases-1, TIMP-1, constitui passo

fundamental na regulação da atividade das metaloproteases-3 e -9, e, consequentemente, na

degradação da matriz extracelular. A habilidade da elastase em processar o TIMP-1 é relatada

na literatura por Nagase et al (1997) e Ioth e Nagase (1995). Em nosso trabalho apresentamos

aspectos cinéticos deste processo e a influência de glicosaminoglicanos na degradação do

inibidor.

No presente estudo foi observado a influência da heparina na hidrólise do TIMP-1 pela

elastase, com utilização da proteína de TIMP-1 integral, bem como com o emprego de

substrato sintético com apagamento intramolecular da fluorescência contendo 13 resíduos de

aminoácido referentes às posições de 65 a 76 do inibidor humano.

Nos ensaios realizados a heparina foi utilizada como modelo de glicosaminoglicano

polisulfatado, neste caso o heparam sulfato presente na matriz extracelular e na superfície das

células, e a elastase de neutrófilo como protease presente em processos inflamatórios e

tumorais.

Outra protease estudada, como capaz de hidrolisar o TIMP-1, foi a catepsina L, a qual

reconheceu o peptídeo sintético empregado como substrato. Todavia, não tivemos material

disponível para realizar ensaios da proteína de TIMP-1 integral com esta enzima. A

verificação da potencial atividade da catepsina L como enzima capaz de degradar o TIMP-1

teve como base a indicação da literatura de que esta protease é encontrada na matriz

extracelular em processos tumorais (WOLTERS ET AL, 1998; SKRYDLEWSKA, 2005).

Nos ensaios com o peptídeo sintético a análise de especificidade das enzimas

estudadas foi realizada tendo em vista que um peptídeo de 13 resíduos de aminoácidos

(Figura 14), contendo os resíduos mostrados, não deve apresentar estrutura rígida, a qual deve

ter transição contínua em solução aquosa.

Figura 14: Representação da estrutura do peptídeo Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp

OHO

Ala

Met

Val

Met

Phe

Glu

Ser

Gly

Tyr His

Ser

Gln

Arg

A hidrólise do peptídeo Abz-AMESVMGYFHRSQ-EDDnp pela elastase de neutrófilo

humano ocorreu entre os mesmos resíduos de Val

↓Met

como demonstrado para hidrólise

da proteína do TIMP-1 integral por Nagase et al (1997). Todavia, com a utilização do

peptídeo sintético também foi possível observar que a atividade enzimática sobre a seqüência

do substrato na presença de 50

µM de heparina foi aproximadamente 3,3 vezes maior que

quando comparado aos ensaios cinéticos realizados na ausência de heparina. Estes dados

indicaram que a interação da elastase com a heparina poderia promover uma regulação

positiva na degradação do TIMP-1 por esta enzima. Esta indicação foi confirmada em ensaios

de eletroforese em SDS com a proteína integral de TIMP-1 na presença e ausência de

heparina, onde foi observado que a formação de produto no tempo inicial reflete os dados

cinéticos, ou seja, cerca de 3 vezes mais produto formado. (Figura 13).

Outro aspecto observado com a utilização de substratos sintéticos foi referente à

influência da região P’ (produto –NH-...) na interação enzima-substrato. Na hidrólise do

substrato sintético MeOSuc-AAPV-MCA a ligação hidrolisada foi a existente entre o resíduo

de Val e o grupamento MCA. Neste caso, não havia resíduos de aminoácidos realizando

interação com os subsítios descritos como S’ da enzima e nos experimentos cinéticos não foi

observada influência da heparina na hidrólise do substrato, não havendo alteração

significativa nas constantes determinadas (Figura 15).

Figura 15. Figura esquemática indicando o ponto de hidrólise do peptídeo derivado do

TIMP-1 pela elastase e os aminoácidos que ocupam os subsítios desta enzima

OHO

Ala

Met

Val

Met

Phe

Glu

Ser

Gly

Tyr His

Ser

Gln

Arg

S4 S3 S2 S1

P4 P3 P2 P1

S1' S2 ' S3'

P1' P2 ' P3'

Estes resultados sugerem que a influência da heparina na hidrólise do peptídeo tem

como fator determinante a interação de resíduos de aminoácidos com subsítios da região S’ da

enzima. Esta observação sugere que eventuais alterações estruturais decorrentes da interação

da heparina com a elastase têm maior influência em regiões específicas da estrutura da

enzima.

Com relação a aspectos de especificidade da elastase humana de neutrófilo (HNE) na

hidrólise do substrato derivado da seqüência do TIMP-1, observa-se que o mesmo apresenta

no subsítio P

um resíduo de valina. A preferência do subsítio S

da HNE é por resíduos

pertencentes ao grupo dos alifáticos e hidrofóbicos, como Leu e Ile (BODE, 1989). A

similaridade entre as cadeias laterais da Leu e Ile quando comparadas com a da Val, justifica

essa acomodação.

A posição P

é ocupada por um resíduo de serina, que possui um grupo OH em sua

cadeia lateral. A interação desse aminoácido com o subsítio S

pode ser prejudicada por essa

característica, uma vez que à mesma maneira do subsítio S

, ele acomoda preferencialmente

resíduos hidrofóbicos. A interação entre P

e S

pode ser conseqüência das demais interações

entre o substrato do TIMP-1 e a enzima, não sendo, portanto, fundamental na ação

enzimática.

Conforme descrito por Yasutake e Powers (1981), substratos com cadeias laterais

longas e dotadas de carga são bem aceitas pelos subsítio S

e S

promovendo uma melhor

interação do que quando comparado a cadeias laterais unicamente hidrofóbicas e curtas. Na

posição P

do substrato está localizado um resíduo de Glu, e em P

a presença de um resíduo

de Ser. As cadeias laterais dos resíduos de Glu (P

) e Ser (P

)

não são as ideais para estes

subsítios, uma vez que não promovem os contatos para a estabilização do substrato na

enzima, através de pontes de hidrogênio (BODE, 1989).

Em relação aos resíduos posicionados na porção P´, a primeira posição é ocupada por

uma Met, o que vai de encontro a característica pouco hidrofóbica do subsítio S

’

, entretanto,

excetuando-se resíduos de prolina e resíduos essencialmente hidrofóbicos e muito volumosos,

este subsítio não possui um alto grau de especificidade, podendo acomodar os demais

aminoácidos.

A posição P’

é ocupada por um resíduo de Gly, que possui em sua cadeia lateral

apenas um átomo de hidrogênio. Mesmo não se tratando de um aminoácido com as

características essenciais para subsítio S’

, que acomoda resíduos de cadeias laterais fenólicas,

a interação pode ser apenas superficial, não sendo, portanto fundamental para o

posicionamento do substrato do TIMP-1 na enzima.

O subsítio S’

acomoda cadeias alifáticas de características hidrofóbicas, entretanto na

posição P’

existe uma tirosina, que em sua cadeia lateral apresenta um grupo fenol. Como a

cadeia lateral da Tyr é volumosa o contato deste resíduo com o subsítio deve ser superficial,

mantido por interações hidrofóbicas, com os resíduos de Phe, Leu, e Val nele localizado.

Outro ponto de interesse em nosso estudo foi monitorar a participação da catepsina L

como uma possível protease capaz de hidrolisar o TIMP-1, ativando assim as metaloproteases

de matriz facilitando assim a migração de células tumorais.

A catepsina L mostrou-se capaz de reconhecer o peptídeo Abz-AMESVMGYFHRSQ-

EDDnp como seu substrato, hidrolisando a ligação His

↓Arg

. Ainda com o uso do

substrato sintético pudemos avaliar que, assim como para a elastase, existe a influência da

região P’ na acomodação do substrato na enzima. Em comparação ao substrato comercial, Z-

FR-MCA, onde na região P’ está tão somente o grupamento MCA o peptídeo Abz-

AMESVMGYFHRSQ-EDDnp pode-se observar que o substrato derivado do TIMP-1 é 1,7

vezes mais susceptível à ação da catepsina L. (Figura 16).

Figura 16: Figura esquemática indicando o ponto de hidrólise do peptídeo derivado do

TIMP-1 pela Catepsina L e os aminoácidos que ocupam os subsítos desta enzima

OHO

Ala

Met

Val

Met

Phe

Glu

Ser

Gly

Tyr His

Gln

Arg

S3 S2 S1

P3 P2 P1

S1' S2 ' S3'

P1' P2 ' P3'

Ser

O subsítio S

da catepsina L, assim como das outras enzimas pertencentes à família da

papaína, não é o responsável pela especificidade primária da enzima e acomoda

preferencialmente resíduos básicos. A partir dos nossos dados de espectrometria de massa

evidenciamos que o resíduo de His ocupa a posição P

no substrato de maneira eficiente, por

se tratar de um aminoácido com cadeia lateral básica, indo de encontro ao descrito para as

enzimas da família da papaína. (BROCKLEHURST, 1990).

O resíduo em P

trata-se de uma Phe. Segundo o trabalho Barrett e Kirschke (1981) o

subsítio S

das proteases da família da papaína interage com aminoácidos hidrofóbicos, em

função de sua natureza físico-química. Portaro et al (2000) confirmam este resultado, e

demonstram que dentre os resíduos hidrofóbicos, a catepsina L aceita preferencialmente

resíduos de Phe. Esta combinação de S

com resíduos básicos flanqueados por um resíduo

hidrofóbico em S

mostra-se como fundamental para o reconhecimento do substrato e

posterior ação hidrolítica.

Em P

o substrato apresenta um resíduo de Tyr, que possui característica hidrofóbica.

A especificidade do subsítio S

encontra-se em acomodar resíduos hidrofóbicos mais

volumosos. A presença do resíduo de Tyr na posição P

corrobora com essa especificidade,

entretanto é o que possui a menor afinidade pelo subsitío, quando comparado com os demais

resíduos do mesmo grupo físico-químico (KOGA ET AL, 1990), possivelmente pela presença

de um grupo OH ligado ao anel benzênico, contribuindo com uma característica levemente

polar e com isso perturba a interação neste subsítio.

Segundo a literatura, o subsítio S’

da catepsina L é de certa maneira inespecífico,

podendo, com isso, acomodar um grande número de resíduos. Entretanto, a catepsina L,

apresenta uma preferência por não hidrofóbicos (MENÁRD ET AL, 1993). O substrato

derivado do TIMP-1 apresenta em P’

um resíduo de Arg. Não existem, entretanto, dados na

literatura de substratos que contenham esse aminoácido na posição P’

, contudo devido a sua

similaridade com o resíduo de Lys a enzima seja capaz de acomodá-la, entretanto com alguma

diferença na especificidade.

Segundo Brömme e Kirschke (1993) a catepsina L tem forte preferência por

aminoácidos hidrofóbicos em S’

, dentre os quais Trp, Leu e Tyr. No substrato sintético

derivado do TIMP-1 o aminoácido que ocupa a posição P’

é uma Ser que possui em sua

cadeia lateral um grupo OH, o que está fora dos padrões de especificidade do subsítio. A

interação do resíduo de Ser em S’

possivelmente está ocorrendo como uma conseqüência das

demais interações dos outros subsítios, que acabam por forçar a orientação da Ser em S’

Um dado interessante de nosso trabalho foi verificar que o substrato Abz-

AMESVMGYFHRSQ-EDDnp é mais susceptível a ação da catepsina L do que quando

comparado com a elastase, mesmo na presença de heparina. Ao analisarmos as

especificidades dos subsítios de ambas as enzimas em relação ao substrato a catepsina L

mostra-se como aquela que possui as melhores características para a acomodação do

substrato, isso fica mais evidente quando se comparam os valores das constantes de

especificidade, onde a catepsina L, mesmo na ausência de heparina possui um valor 6,9 vezes

maior quando comparada com a elastase na ausência de heparina e 2,0 vezes na presença de

heparina. (tabela 7)

Tabela 7: Comparação da especificidade da catepsina L e elastase na presença de heparina

Enzimas K

cat

(µM

-1

)

Sem Heparina Heparina (50µM)

Elastase

0,330

± 0,030 1,100 ± 0,090

Catepsina L

2,270

± 0,113

---

Uma característica de processos inflamatórios e tumorais é a acidificação do micro

ambiente variando de pH 7,2 até 5,5. Essa acidificação é um fator importante no controle do

“turnover” dos componentes da matriz; uma diminuição no pH da matriz leva a alteração na

síntese de proteínas e de proteoglicanos em cartilagens, por exemplo (RAZAQ S. ET AL,

2003). O balanço entre a entrada e saída de prótons da célula é de grande importância uma

vez que grande parte das exercidas pelos neutrófilos, como a eliminação de microorganismos,

migração celular, citotoxicidade de células tumorais e liberação de enzimas dos grânulos

azurófilos, são dependentes diretamente do pH. (COAKLEY, 2002).

Em relação aos dados que obtivemos, temos que a elastase atua eficientemente em pH

alcalino (7,5-8,5) ao passo que a catepsina L, por tratar-se de uma enzima lisossomal, tem um

pH ótimo próximo a 5,5. Quando são liberadas para a matriz nos processos descritos, a

catepsina L atua de maneira eficiente, uma vez que está em um ambiente que possui um pH

próximo a aquele que ela necessita para sua ação. Especificamente no caso de processos

inflamatórios a ação da catepsina L pode estar diretamente ligada à fase pré-aguda e aguda,

que em função da liberação de diferentes mediadores do sistema imune possui o pH ideal para

a atuação desta enzima. Ao contrário, a elastase que irá encontrar um ambiente

completamente desfavorável, e por conta disso, terá sua atividade reduzida em

aproximadamente 90% (tabela 4). Entretanto, na fase crônica do processo inflamatório, o pH

do micro ambiente está mais próximo ao pH fisiológico, favorecendo assim a ação da

elastase.

Por conta de estar em um ambiente que favorece a sua denaturação, a ação da elastase

no processo inflamatório (pré-agudo e agudo) contará com um tempo reduzido, isso evidencia

que o pH ácido encontrado no micro ambiente, atua como um regulador da ação enzimática,

uma vez que se a elastase fosse liberada em condições fisiológicas a degradação da matriz não

seria apenas local, mas sim se propagaria de modo a causar lesão tecidual, de maneira

reversível, no caso de ativar apoptose, ou irreversível, que é o caso da necrose. Ao se restaurar

a homeostase da lesão a catepsina L que estava ativa, passa a sofrer redução na sua atividade

também. Nossos dados em conjunto com a literatura, parecem mostrar que a elastase e a

catepsina L atuam em momentos diferentes no processo infamatório e tumoral.

A elastase atua em um único ponto na molécula de TIMP-1, como fica evidente tanto

nos experimentos de espectrometria de massas com o peptídeo sintético quanto na

eletroforese utilizando a molécula integral do TIMP-1, mesmo com outros pontos favoráveis a

hidrólise. Em função dessa característica podemos avaliar a elastase como uma enzima

processadora. Quanto a ação da catepsina L, ainda falta-nos avaliar a sua ação sobre a

molécula integral do TIMP-1, para determinar de maneira factível que esta possui também

ação processadora, ao invés de meramente degradar o TIMP-1, em partes que não sejam

importantes no processo de inibição das MMPs pelo TIMP-1, mesmo que os ensaios com

espectrometria de massa mostrem que o peptídeo sintético é susceptível a sua ação.

Nossos resultados indicam que a elastase quando na matriz extracelular, em processos

inflamatórios liga-se a heparina. Uma vez complexada à heparina, a elastase é capaz de

processar o TIMP-1 com maior eficiência. Entretanto a catepsina L, também presente na

matriz em diversos processos patológicos, não só reconhece o TIMP-1 como seu substrato,

mas o degrada com maior eficiência do que a elastase, mesmo na presença de heparina. A

figura abaixo (figura 17) mostra de maneira esquemática os resultados obtidos em nosso

estudo.

Figura 17: Resumo esquemático dos resultados obtidos. Em vermelho as enzimas testadas.

As setas em azul indicam a proposta de degradação, a espessura das setas refere-se

à eficiência do processo.

REFERÊNCIAS

ALMEIDA, P.C., NANTES, I.L., RIZZI, C.C.A., JUDICE, W.A.S., CHAGAS, J.R.,

JULIANO, L., NADER, H.B., E TERSARIOL I.L.S. Cysteine proteinase activity regulation:

A possible role of heparin and heparin-like glycosaminoglycans. J. Biol. Chem. v.274 n.43

30433-30438, 1999.

BARRETT AJ, KIRSCHKE H. CATHEPSIN B, CATHEPSIN H, AND CATHEPSIN L.

Methods Enzymol. v.80, Pt C p.535-561, 1981.

BARRETT, A.J E RAWLINGS, N.D. Families and clans of serine peptidases. Arch.

Biochem. Biophy

. v.318, p.274-250, 1995.

BARRETT, A.J.; Leukocyte elastase. Methods Enzymol v.80 p.581-588, 1981.

BEYNON R. J., BOND J. S. Proteolytic Enzymes : A practical approach

. Oxford

University Press, 1989.

BODE W, MEYER E JR, POWERS JC. Human leukocyte and porcine pancreatic elastase: X-

ray crystal structures, mechanism, substrate specificity, and mechanism-based inhibitors.

Biochemistry. v.28, n.5, p.1951-1963, 1989.

BOHLEY, P., E SEGLEN, P.O. Proteases and proteolysis in the lysosome. Experientia. v.48,

151-157, 1992.

BROCKLEHURST K. Papain and related proteins. Nature

. v.345, n.6274 p.394, 1990.

BROMME D, KIRSCHKE H. N-peptidyl-O-carbamoyl amino acid hydroxamates:

irreversible inhibitors for the study of the S2' specificity of cysteine proteinases. FEBS Lett.

v.322, n.3, p.211-214, 1993.

BRÖMME D, LI Z, BARNES M, MEHLER E. Human cathepsin V functional expression,

tissue distribution, electrostatic surface potential, enzymatic characterization, and

chromosomal localization. Biochemistry

. v.38 n.8 p.2377-2385, 1999.

BUCK, M.R., KARUTIS, D.G., DAY, N.A., HONN, K.V., E SOLANE, B.,F. Degradation of

extrcellular-matrx proteins by human cathepsin B from normal and tumor tissues. Biochem J

v.282, p.273-278, 1992.

BÜHLING F, WALDBURGN, REISENAUER A, HEIMBURG A., GOLPON H. E WELTE

T. Lysosomal cysteine proteases in the lung: role in protein processing and

immunoregulation. Eur Respir J v.23, p.620-628, 2004.

CARMONA, E., DUFOUR, E., PLOUFFE, C., TAKEBE, S., MANSON, P., MORT, J. S., E

MENARD, R. Potency and selectivity of the cathepsin L propetide as an inhibitor of cysteine

proteases. Biochemistry v.35, p.8149-8157, 1996.

CATALDO, A. M. HAMILTON, D. J. E NIXON, R. A. Lysosomal abnormalities in

degenerating neurons link neuronal compromise to senile plaque development in Alzheimer

disease. Brain Res

. v. 640, n.1-2, p.68-80, 1994.

COAKLEY, R.. J., TAGGART C., MCEVALNEY N. G., O’NEILL S. J., Cytosolic pH and

the inflammatory microenvironment modulate cell death in human neutrophils after

phagocytosis Blood v. 100 n. 9 p. 3383-3391, 2002

COULOMBE R, GROCHULSKI P, SIVARAMAN J, MENARD R, MORT JS, CYGLER M.

Structure of human procathepsin L reveals the molecular basis of inhibition by the

prosegment. EMBO J. v.15, n.20, p.5492-5503, 1996.

CZAPINSKA H, OTLEWSKI J. Structural and energetic determinants of the S1-site

specificity in serine proteases. Eur J Biochem. v.260 n.3, p.571-595, 1999.

DALET-FUMERON, V., BOUDJENNAH, L., E PAGANO, M. Binding of the cysteine

proteinases papain and cathepsin B-like to coated laminin: use of synthetic peptides from

laminin and from the laminim binding region of the beta 1 integrin subunit to characterize the

binding site. Arch. Biochem. Biophys.

v.358, p.283-290, 1998.

DAVIE EW, FUJIKAWA K, KISIEL W. The coagulation cascade: Initiation, maintenance

and regulation. Biochemistry v.30 p.10363-10370, 1991.

DRENTH, J., JANSONIUS J.N., KOEKOEK, R., SWEN, H. M., E WOLTHERS, B.G

Structure of papain. Nature v.218 n.145, p.929-932 1968.

DUFOR, É. Sequence homologies, hydrophobic profiles and secondary structures of

cathepsin-B, cathepsin-H and cathepsin-L: Comparison with papain and actinidin. Biochimie

v.70, n.10, p.1335-1342, 1998.

EMONARD H., GRIMAUD J. A. Matrix metalloproteinases. A review. Cell. Mol. Biol. v.36,

p.131-153, 1990.

EVERTS V, VAN DER ZEE E, CREEMERS L, BEERTSEN W. Phagocytosis and

intracellular digestion of collagen, its role in turnover and remodeling. Histochem J v.28

p229–245, 1996.

FITCH PM, ROGHANIAN A, HOWIE SE, SALLENAVE JM. Human neutrophil elastase

inhibitors in innate and adaptive immunity. Biochem Soc Trans. v.34, n.2, p.279-282, 2006.

FRIEDRICHS, B., TEPEL, C., REINHECKEL, T., DEUSSING, J., VON FIGURA, K.,

HERZOG, V., PETERS, C., SAFTIG, P. AND BRIX, K. Thyroid functions of mouse

cathepsins B, K and L.

J. Clin. Invest. v.111, p.1733-1745, 2003.

GOMIS-RUTH F. X., MASKOS K., BETZ M., BERGER A., HUBER R., SUZUKI K.,

YOSHIDA N., NAGASE H., BREW K., BOURENKOV G. P., BARTUNIK H., BODE W.

Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.

Nature,

v.389 n.6646, p.77-81, 1997.

GUINEC, N., DALET-DUMERON, V., E PAGANO, M. Quantitative study of the binding

ofcysteine proteinases to basement nenbranes. FEBS Lett

. v.24, p.305-308, 1992.

HEIDTMANN HH, SALGE U, HAVEMANN K, KIRSCHKE H, WIEDERANDERS B.

Secretion of a latent, acid activatable cathepsin L precursor by human non-small cell lung

cancer cell lines. Oncol Res. v.5, p.441–451, 1993.

HONEY, K. AND RUDENSKY, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen

presentation. Nat. Rev. Immunol

. v.3, 472-482, 2003.

HUBER R, BODEW . Structural basis of the activation and actioonf trypsin. Acc Chem Res

v.11 p.114-122, 1978.

II, K., ITO, H., KOMINAMI, E., E HIRANO, A., Abnormal distribution of cathepsin

proteinases and endogenous inhibitors (cystatins) in the hippocampus of patients with

alzheimer-disease, parkinsonism-dementia complex on guan, and senile dementia and in the

aged. Virchows. Arch. A. Pathol. Histophatol

. v.423 n.3, p.185-194, 1993.

ITOH Y., NAGASE H. Preferential inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinases-1

that is bound to the precursor of matrix metalloproteinase 9 (progelatinase B) by human

neutrophil elastase. J. Biol. Chem, v.270 n.28, p.16518-16521, 1995.

KARRER, K.M., PEIFER, S.L., E DITOMAS, M.E. Two distinct gene subfamilies within the

family of cysteine proteinase genes. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.

v.90, p.3063-3067, 1993.

KOGA H, YAMADA H, NISHIMURA Y, KATO K, IMOTO T. Comparative study on

specificities of rat cathepsin L and papain: amino acid differences at substrate-binding sites

are involved in their specificities.J Biochem v.108, n.6, p.976-982, 1990.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4.

Nature v.227, p.680-685, 1970

LECAILLE F, SERVEAU C, GAUTHIER F, LALMANACH G. Revisiting the S2 specificity

of papain by structural analogs of Phe. FEBS Lett v.445 n.2-3 p.311-4, 1999.

LIAO D, BREDDAM K, SWEET RM, BULLOCK T, REMINGTON SJ. Refined atomic

model of wheat serine carboxypeptidase II at 2.2 A resolution. Biochemistry v.31, p.9796-

9812, 1992.

LLY, C; QURAISHI, O.; WANG, J.; PURISIMA, E.; VERNET, T.; MORT, J.S. Role of the

occluding loop in cathepsin B activity. J. Biol. Chem. v.272 p.1197-1202, 1997.

MATTHEWS BW. X-RAY STRUCTURE OF PROTEINS. In: Neurath H, Hill RL, eds. The

proteins, vol 3. New York: Academic Press. pp 404-590, 1977.

MENARD R, CARMONA E, PLOUFFE C, BROMME D, KONISHI Y, LEFEBVRE J,

STORER AC. The specificity of the S1' subsite of cysteine proteases.Fesb Lett v.328, n.1-2,

p.107-110, 1993.

MENARD R, PLOUFFE C, LAFLAMME P, VERNET T, TESSIER DC, THOMAS DY,

STORER AC. Modification of the electrostatic environment is tolerated in the oxyanion hole

of the cysteine protease papain. Biochemistry

. v. 34, n.2, p.464-471, 1995.

MORT J.S., BUTTLE D.J. Cathepsin B. Int. J. Biochem. Cell

. B. v.29, n.5, p.715-720,

1997.

MUSIL D, ZUCIC D, TURK D, ENGH RA, MAYR I, HUBER R, POPOVIC T, TURK V,

TOWATARI T,

KATUNUMA N, ET AL. The refined 2.15 A X-ray crystal structure of human liver cathepsin

B: the structural basis for its specificity. EMBO J. v.10, n.9, p.2321-2330, 1991.

NAGASE H. Activation mechanisms of matrix metalloproteinases. Biol. Chem

. v.378, p.151,

1997.

NAGASE H. Zinc Metalloproteases in Health and Disease, (Hope, N. M. ed.) p.153-204,

Taylor & Francis, London, 1996.

NAGASE H., SUZUKI K., CAWSTON T. E., BREW K. Involvement of a region near

valine-69 of tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-1 in the interaction with matrix

metalloproteinase 3 (stromelysin 1). Biochem. J

. v.325 p.163-167, 1997.

PETTERSON, C. A., ADLER K.B. Airways Inflammation and COPD* Epithelial-Neutrophil

Interactions. Chest. v. 121 n.5 142S 150S, 2002

POLGAR, L. Mechanims of Protease Action, CCR Press, Boca Raton, Flórida, 123, 1990.

PORTARO FC, SANTOS AB, CEZARI MH, JULIANO MA, JULIANO L, CARMONA E.

Probing the specificity of cysteine proteinases at subsites remote from the active site: analysis

of P4, P3, P2' and P3' variations in extended substrates. Biochem J. v.347, n.1, p.123-129,

2000.

PUNTURIERI A, FILIPPOV S, ALLEN E, ET AL. Regulation of elastinolytic cysteine

proteinase activity in normal and cathepsin K-deficient human macrophages. J Exp Méd.

v.192 p.789–800, 2000.

RAWLINGS, N.D E BARRETT, A.J. Evolutionary families of peptidases. Biochem J

. v.290,

p. 205-218, 1993.

RAZAQ, S. WILKINS, R.J., URBAN, J.P. The effect of extracelluar pH on matrix turnover

by cells of the bovine nucleus pulposus. Eur. Spine J. v. 12 p. 341-349, 2003

SCHECHTER, I E BERGER, A. On the size of the active site in proteases. I. Papain.

Biochem. Biophys. Res. Commun. v.27 n.2, p.157-162, 1967.

SHEAHAN, K., SHUJA, S., E MURNANE, M.J. Cysteine protease activities and tumor

development in human colorectal carcinma. Cancer Res

. v.49, p.3809-3814, 1989.

SIEWINSK, M., GUTOWICZ, J., KIELAN, W. E BOLANOWSKI, M. Cysteine peptidase

inhibitors and activator in urine of patients with colorectal-cancer. Oncology v.51 n.5, p.446-

449, 1994.

SKRYDLEWSKA E., SULKOWSKA, M., KODA M., SULKOWSKI S. Proteolytic-

antiproteolytic balance and its regulation in carcinogenesis. World Journal Gastroenterol

v.11(9) p.1251-1266, 2005

SMITH E.L E KIMMEL J.R. The enzimes 4, 2

(Boyer, P.D., Larely, H. e Myrback, K. ed)

New York, Academic Press p.133-173, 1960.

SPENCER J.L., STONE, P.J., NUGENT, M.A. New Insights into the Inhibition of Human

Neutrophil Elastase by Heparin. Biochemistry

v.45 p.9104-9120, 2006

STORER, A., C. E MÉNARD, R. Catalytic mechanism in the papain family of cysteine

peptidases. Methods Enzymol

. v.224, p.468-500, 1994.

TAYLOR K. B., WINDSOR L.J., CATERINA N.C.M., BODDEN M. K., ENGLER J. A.

The mechanism of inhibition of collagenase by TIMP-1 J. Biol. Chem

. v.271, p.23938-

23945, 1996.

TURK, D. E GUNGAR, G. Lysossomal Cysteine proteases (cathepsins): promissing drug

targets. Acta Cryst

. p.203-213, 2003.

VAN DE VEN WJ, ROEBROEK AJ, VAN DUIJNHOVEN HL. Structure and function of

eukaryotic proprotein processing enzymes of the subtilisin family of serine proteases. Crit

Rev Oncogen v.4 p.115-136, 1993.

WOLTERS PJ, RAYMOND WW, BLOUNT JL, CAUGHEY GH. Regulated expression,

processing, and secretion of dog mast cell dipeptidyl peptidase I. J Biol Chem ; v.273,

p.15514–15520, 1998.

YASOTHORNSRIKUL, S., GREENBAUM, D., MEDZIHRADSZKY, K. F., TONEFF, T.,

BUNDEY, R., MILLER, R., SCHILLING, B., PETERMANN, I., DEHNERT, J.,

LOGVINOVA, A. ET AL. Cathepsin L in secretory vesicles functions as a prohormone-

processing enzyme for production of the enkephalin peptide neurotransmitter. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA v.100, p.9590-9595, 2003.

YASUTAKE A, POWERS JC. Reactivity of human leukocyte elastase and porcine pancreatic

elastase toward peptide 4-nitroanilides containing model desmosine residues. Evidence that

human leukocyte elastase is selective for cross-linked regions of elastin. Biochemistry

. v.20,

n.13, p.3675-3679, 1981.

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