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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE
Strongyloides ophidiae (NEMATODA, STRONGYLOIDIDAE)
PARASITAS DE SERPENTES
KARINA RODRIGUES DOS SANTOS
Botucatu – SP
2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE
Strongyloides ophidiae (NEMATODA, STRONGYLOIDIDAE)
PARASITAS DE SERPENTES
KARINA RODRIGUES DOS SANTOS
Tese apresentada junto ao
Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária para
obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Reinaldo José da Silva
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Santos, Karina Rodrigues dos.
Caracterização morfológica e molecular de Strongyloides ophidiae
(Nematoda, Strongyloididae) parasitas de serpentes / Karina Rodrigues dos
Santos. – Botucatu [57p], 2008.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2008.
Orientador: Reinaldo José da Silva
Assunto CAPES: 50502042
1. Parasitologia veterinária 2. Serpente – Parasitas
CDD 636.089696
Palavras-chave: Serpentes; Strongyloides ophidiae
Nome do Autor: Karina Rodrigues dos Santos
Título: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE Strongyloides
ophidiae (NEMATODA, STRONGYLOIDIDAE) PARASITAS DE SERPENTES.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Reinaldo José da Silva
Presidente e Orientador
Departamento de Parasitologia
FMVZ – UNESP – Botucatu
Profª Drª Lucia Helena O`Dwyer
Membro
Departamento de Parasitologia
FMVZ – UNESP – Botucatu
Prof.Dr. Raimundo Souza Lopes
Membro
Departamento de Patologia Clínica Veterinária
FMVZ – UNESP – Botucatu
Profª Drª Mônica Regina Vendrame Amarante
Membro
Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu
Profª Drª Mere Erika Saito
Membro
Departamento de Medicina Veterinária –
Centro de Ciências Agroveterinárias,
Universidade do Estado de Santa Catarina Lages – Santa Catarina
Data da Defesa: 18 de junho de 2008.
v
Aos meus pais e irmãos
Pais: Milton Mendes dos Santos e Eunice Rodrigues dos Santos
Irmãos: Marco Aurélio Rodrigues dos Santos e Thiago Rodrigues dos Santos
Agradeço por acreditarem que valeu, vale e sempre valerá a pena lutar pelos meus sonhos e
pelos meus ideais. Por acreditarem que eu poderia crescer e ser alguém! Sabiam que eu
precisava caminhar e que este caminho não seria fácil, pois muitas vezes quando os
obstáculos me pareciam intransponíveis, quando a caminhada me parecia árdua e o desanimo
me abatia, vocês estavam sempre caminhando ao meu lado, me incentivando e me enchendo
de coragem, tornando assim minha caminhada mais agradável.
Hoje estamos comemorando, não o final da caminhada, mas sim uma etapa dela que foi
vencida! Outras etapas virão e tenho a certeza de que estarão sempre ao meu lado na torcida
por novas conquistas!
Obrigada!
vi
Ao meu orientador Reinaldo José da Silva
À você cabe-me escrever a seguinte mensagem:
“Os vencedores da batalha da vida são os homens perseverantes que, sem se julgarem gênios
se convenceram de que, só pela perseverança e esforço poderiam chegar ao fim almejado.”
Pois, encontrei em você um vencedor, por todo seu esforço e dedicação ao seu trabalho.
Agradeço-te por ter partilhado comigo seus conhecimentos e experiências, com simplicidade e
carinho, e principalmente por me ensinar a ser perseverante, e a lutar pelos meus ideais.
viii
AGRADECIMENTOS
Em especial agradeço à toda minha grande família, que ocupa um espaço enorme
em meu coração: tias (Ivone, Evani, Aparecida ( “in memória”), Neide, Marlene,
Mirtix) tios ( Roberto, Sérgio, Marcos, Paulo, Oswaldo ( “in memória”), Osmar
(“in memória”), Valter ( “in memória”), e à todos os meus primos e primas que são
queridos, mas que são muitos por isso não poderei citá-los aqui, mas sabem que
cada um ocupa uma lugar especial em minha vida. Agradeço-lhes por todo o
apoio, carinho e principalmente por compreenderem a minha ausência!
Agradeço aos professores: Regina Kiomi Takahira, Professor Raimundo Souza
Lopes e professora Aguemi Kohayagawa, que me abriram as portas de entrada
a Botucatu e me aceitaram na grande família do Laboratório Clínico Veterinário.
Cada um destes professores tiveram uma participação especial em minha vida
profissional e pessoal.
Agradeço aos bolos e aos cafezinhos e as conversas com os amigos da
Enfermidades Parasitárias e do laboratório Clínico: Sônia Maria Santi
(Companheira), Paula, Flávio, Thiago, Keila, Sueli, Soninha ( “in memória”),
Wilson e Sr. Matiasi.
Agradeço aos amigos e “vizinhos”, assim denominados por mim: Marlene,
Cristininha, Cláudio (Cabeça), Claudinho, Cláudio (Canjica), João, André,
Maricília e Ana.
Agradeço às amigas de República: Mere Erika Saito, Lívia Figueiredo, Graziela
Barioni, Ana Claúdia dos Santos Valente,
Luciana Bofoni, Karla Conceição H.
de Campos, Letícia Macedo Soares, Joandes Henrique Fonteque, Telma
Paparotto, Viviane Von Ah Lopes, Cynthia Lucidi, Fabíola Sangiorgio, tenho
certeza de que fomos uma grande família; e que foi e são inesquecíveis os
momentos que passamos juntos.
ix
Aos amigos Sandra Bassani Silva, Luciana Pereira Machado, Eunice
Kitamura, Veridiana Fernandes da Silveira, Patrícia neves Batina, Frederico
G. klier, Celmira Calderón, Cleverson de Souza, Luciana Langrafe, Camilo
Bulla, Márcia Hasegawa, Rodrigo Gonzalez Rodrigues, Luciano, Édna,
Raquel Reis Martins, Flávia Quaresma, Flávia Santin, Adriane, Fabiana Ikeda,
Cláudio Matoso, por todo carinho, brincadeiras, risadas, cantorias, ensinamentos
e principalmente pela amizade.
Aos amigos Aline Otsuki, Jaqueline Quintana, Ricardo Carlos, Melanie e
Pedro Paro e seus filhos Paula e Pedro Paro, Meire, Sr Lindenbergue e
Eduardo, amigos que participaram de várias etapas de minha vida, desde muito
antes da realização deste sonho. Agradeço-lhes por cada dica, e por todo apoio,
são como minha segunda família!
Obrigada aos meus eternos amigos de faculdade, Raquel C. Lazinho, Priscila
Bianchi Juliano, Waleska Marques, Denise de Campos Paulocci, Cristiane,
Betina Metzger; Eduardo Romano, Carlos Eduardo Ambrósio (Caju),
professora Maria Adriana, professora Sílvia Cortopassi. Enfim todos que fizerem
parte de minha grande família de São João da Boa Vista.
Aos amigos Pós-graduandos da Parasitologia que me receberam com muito
carinho: Bianca, Hélen, Jayme, Bruna, Giane, Aruaque, Nelson, Thomaz,
Marco, Rebeca, Adriano,
Viviane, Eriquinha, Marcela, Juliana, Ana, André,
Tatiana, Betina, Satie, Érica, Karina, Alberto, Letícia, Diego, Leticinha, Aline,
Patrizia, Denise, Raquel, Fabiana, Daniel, Milena, Cristiane, Renata, Gustavo,
Gisele, Taís, Maurícia, Luciene, Rogério, Carolina e Max.
Em especial aos amigos Bianca Cechetto, Karina Paduan, Gabriel, Samir,
Jayme Souza Neto, Thiago Neves Batista, Flávio Paes, professora Mônica
Regina Vendrame Amarante, a professora Márcia Guimarães, Jocilene e ao
x
professor Paulo Eduardo Martins Ribolla, que muito contribuíram para a
realização deste trabalho.
Aos professores da Parasitologia, do Instituto de Biociências, Professora Mônica,
Professora Lucia Helena, Professora Luciene, Professora Teresa Cristina,
Professora Semiramis, Professor Newton, Professor Wesley, Professor
Alessandro e Professor Paulo; que me acolheram e estavam sempre prontos a
sanarem minhas dúvidas, quando lhes pedia por socorro. Obrigada também por
todo o conhecimento que com humildade e carinho nos passam.
Agradeço as novas amigas Lidiane, Aline, Carla, Helena, Hélen, pelos
momentos de alegria e descontração entre as horas de trabalho.
Aos funcionários e amigos Nilza, Salete, Ângela, Márcia, Maria, Valdir, Roberto
e Heloy, pelo grande auxílio que me dispensaram, pelo carinho e pelas boas
risadas na hora do cafezinho.
À minha família de Botucatu, Fábio Roberto Bursaca, Fabina, Ari, Dona
Jeannete, dona Violeta, Isabella, Sr. João, Flávio, Ronaldo, Cristiane, Dona
Vera, Sr. Celso, Dona Inês (“in memória”) e Fábio Mena, meus sinceros
agradecimentos por me acolherem e tornarem meus dias mais alegres.
Agradeço as queridas amigas de todas as horas:
Bianca, Jacqueline, Tamara,
Negin, por me acolherem na república com todo o carinho.
Aos amigos do curso de inglês: Jumara, Alessandra, Ariane, Ana Paula,
Fernanda, Ricardo, Neide e Janaina, meus sinceros agradecimentos por me
ensinarem que aprender pode ser muito divertido.
Aos amigos da seção de Pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia- Unesp, Campus Botucatu, Denise, Maria e José Roberto, por estarem
sempre prontos e sempre com um sorriso amigo.
xi
Às bibliotecárias: Meirinha, Luciane e Selma e demais funcionários da biblioteca
do Campus da Unesp de Botucatu, pelo carinho e atenção.
Agradeço à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP –Botucatu
pela oportunidade de realização do mestrado e doutorado.
À FAPESP, pelo apoio financeiro, dispensado para a realização prática deste
trabalho (número do processo 06/50968-8)
À CAPES pela bolsa concedida.
xii
A vontade de se tornar algo melhor a cada dia é o que faz do ser humano uma
máquina de sonhar.
Projetar idéias e desejos e lutar para transformar o que um dia foi um simples
pensamento em uma situação real.
Nunca desistir de algo que se deseja muito e que se almeja fazer parte da vida.
O ser humano sonha!
Mas se ele apenas sonhasse nunca saberia do que é capaz,
É preciso conquistar os sonhos!
Autor anônimo.
Nunca deixem que lhe digam que não vale a pena acreditar no sonho que se tem,
Ou que seus planos nunca vão dar certo,
Ou que você nunca vai ser alguém,
“Pois quem acredita sempre alcança!
Trecho de Música de Renato Russo
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.
Fêmea partenogenética de Strongyloides ophidiae (Strongyloididae)
coletado em intestino de Oxyrhopus guibei (Colubridae), no município
de Botucatu, SP. A) Visão geral do helminto; B) Detalhe da cauda –
terminação pontiaguda; C) Detalhe da vulva e ovos; D) Detalhe do
esôfago; E) Detalhe das voltas do ovário em torno do intestino; F)
Detalhe do útero e ovos. A-D, clarificação com fenol; E-F, coloração por
carmim clorídrico........................................................................................
29
FIGURA 2.
Ovo e larvas de Strongyloides ophidiae. (A) ovo larvado; B) larva
rabditóide; C) larva filarióide (L3); D) Detalhe da cauda entalhada da
larva filarióide (L3). A-D, clarificação com fenol.........................................
33
FIGURA 3.
A-D) Macho e fêmeas de vida livre obtidos a partir da coprocultura. A)
visão geral do macho de vida livre; B) Detalhe da região posterior –
notar a presença do espículo; C) visão geral da fêmea de vida livre; D)
detalhe da região da vulva e ovos da fêmea de vida livre.........................
35
FIGURA 4.
Freqüência de parasitas encontrados nas diversas serpentes no
estudo........................................................................................................
37
FIGURA 5.
Parasitas encontrados nas demais serpentes estudadas. A) ovo
morulado; B) Ovos de cestódeos; C) Cyclospora sp.; D) Kalicephalus
sp.; E) Rhabdias sp.; F), Haplometroides buccicola, coloração por
carmim clorídrico........................................................................................
38
FIGURA 6.
Fotografia do gel de agarose a 2% dos produtos amplificados pela PCR
com o uso dos oligonucleotídeos SSUA e SSU22R (Dorris et al. 2002),
de DNA extraído de um pool de 10 fêmeas partenogenéticas de
Strongyloides venezuelensis e pool de 8 fêmeas partenogenéticas de
Strongyloides ophidiae. Poço 1, marcador de tamanho molecular 100
xiv
pares de base (pb) (GE Healthcare Bucs, UK). Poços 2 e 3 (repetições),
banda de amplificação de 350 pb a partir de amostras de DNA de S.
venezuelensis. Poço 4 e 5 (repetições), banda de amplificação de 350
pb a partir de amostras de DNA de S. ophidiae. Poço 6, reação
contendo reagentes, sem adição de
DNA...........................................................................................................
39
FIGURA 7.
Alinhamento múltiplo das seqüências realizado pelo programa
CLUSTAL X (1.81). Os sítios polimórficos são evidenciados pela
ausência do símbolo ( * ). Os símbolos ( - ) representam a ausência de
nucleotídeos (gaps)...................................................................................
40
FIGURA 8.
Relação Filogenética da família Strongyloididae comparada com a
família Rhabdiasidae.................................................................................
42
xv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.
Procedência, data da coleta, sexo e informações sobre o parasitismo
das serpentes Crotalus durissus terrificus incluídas no
estudo........................................................................................................
18
TABELA 2.
Análise morfométrica de fêmeas partenogenéticas de Strongyloides sp.
(n=10) recuperadas de serpente Oxyrhopus
guibei...................................... ..................................................................
28
TABELA 3.
Morfometria dos ovos de Strongyloides sp. (Strongyloididae) obtidos
nos exames coproparasitológicos.............................................................
30
TABELA 4.
Análise morfométrica das larvas rabditóides (L1) de Strongyloides sp.
(Strongyloididae) obtidas da coprocultura.................................................
31
TABELA 5.
Análise morfométrica das larvas rabditóides (L2) de Strongyloides
ophidiae (Strongyloididae) obtidas da coprocultura..................................
31
TABELA 6.
Análise morfométrica das larvas L3 infectantes de Strongyloides sp.
(Strongyloididae) obtidas da coprocultura................................................
32
TABELA 7.
Análise morfométrica de fêmeas de vida-livre e seus ovos de
Strongyloides ophidiae (Strongyloididae) obtidos da coprocultura............
34
TABELA 8. Espécies de serpentes parasitadas, número de serpentes estudadas e
quantidade de serpentes parasitadas e parasitas
encontrados...............................................................................................
36
SUMÁRIO
Página
RESUMO.............................................................................................................. 1
ABSTRACT.......................................................................................................... 3
1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 5
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 7
2.1. As Serpentes....................................................................................... 8
2.2. A classe Nematoda............................................................................. 8
2.3. O gênero Strongyloides....................................................................... 9
2.4. Caracterização morfológica das espécies do gênero Strongyloides.. 11
2.6. Caracterização molecular das espécies do gênero Strongyloides..... 13
3. OBJETIVOS..................................................................................................... 15
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 17
4.1. Seleção dos animais........................................................................... 18
4.2. Análise parasitológica das fezes......................................................... 21
4.3. Caracterização morfológica dos parasitos.......................................... 21
4.4. Técnicas moleculares.......................................................................... 22
4.4.1. Isolamento do DNA dos parasitos............................................ 22
4.4.2. Reações de PCR com emprego do SSU
rDNA.....................................................................................................................
22
4.4.3. Condições de PCR................................................................... 23
4.4.4. Purificação dos produtos da PCR............................................ 23
4.4.5. Reação de seqüenciamento..................................................... 23
4.4.6. Precipitação.............................................................................. 24
4.4.7. Análise da seqüência............................................................... 24
5. RESULTADOS................................................................................................ 26
5.1. Análise parasitológica das fezes e coproculturas............................... 27
5.2. Caracterização morfológica dos parasitos.......................................... 27
5.2.1. Strongyloides ophidiae.............................................................. 28
5.2.1.1. Fêmeas partenogenéticas............................................ 28
5.2.1.2. Ovos.............................................................................. 30
5.2.1.3. Larva rhabditóide (L1).................................................. 30
5.2.1.4. Larva rhabditóide (L2)................................................. 31
5.2.1.5 Larva filarióide (L3)....................................................... 32
5.2.1.6. Fêmeas de vida-livre.................................................... 33
5.2.1.7. Macho de vida-livre..................................................... 33
5.3. Freqüência dos parasitas encontrados.............................................. 35
5.4. Caracterização molecular de Strongyloides ophidiae........................ 39
5.4.1. Reação em cadeia da polimerase (PCR)................................. 39
5.4.2. Seqüenciamento...................................................................... 40
5.4.3. Análise filogenética.................................................................. 42
6. DISCUSSÃO.................................................................................................... 43
7. CONCLUSÕES................................................................................................ 50
8. BIBLIOGRAFIA............................................................................................... 52
SANTOS, K. R. Caracterização morfológica e molecular de Strongyloides
ophidiae (Nematoda, Strongyloididae) parasitas de serpentes. Botucatu, 2008.
57p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus
de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
No Brasil, o gênero Strongyloides inclui duas espécies parasitas de répteis:
Strongyloide ophidiae e Strongyloides cruzi. A primeira foi descrita em serpente
Mastigodryas bifossatus e a segunda em lagartixa Hemidactylus mabouya. Na
descrição de S. ophidiae apenas a fêmea partenogenética foi caracterizada em 1929
e, desde então, nenhum outro relato sobre esta espécie foi publicado. Estudos
moleculares foram realizados com o objetivo de contribuir para a caracterização de
Strongyloides spp. foram realizados, porém estes não incluíram S. ophidae. No
presente estudo foi realizada a caracterização morfológica e molecular de S.
ophidiae coletados em serpentes da região de Botucatu, Estado de São Paulo,
Brasil. De um total de 125 animais, apenas quatro encontraram-se parasitados por
S. ophidiae, porém fêmeas partenogenéticas foram recuperadas de apenas um
animal. Coproculturas foram realizadas para obtenção das larvas L1, L2 e L3, bem
como machos e fêmeas de vida livre, os quais foram morfologicamente analisados.
Os produtos da PCR apresentaram 350 pb e as seqüências de nucleotídeos
(número de acesso Genbank EU287935) isoladas deste nematódeo de Oxyrhopus
guibei apresentaram 98% de identidade com Strongyloides procyonis (número de
acesso AB272234.1 e AB205054.1) e 97% de identidade com Strongyloides cebus,
Strongyloides stercoralis, Strongyloides sp. “ex snake” e Strongyloides fuelleborni
(Genbank AB277236.1, AF279916.2, AJ417031.1 e AJ407030.1, respectivamente).
A análise filogenética das espécies da família Strongyloididae e Rhabdiasidae
demonstrou que, embora apresente 97% de similaridade com outras espécies, S.
ophidiae encontra-se isolado em um ramo da árvore filogenética, caracterizando
uma identidade diferente em relação a outras espécies analisadas. O presente
estudo caracterizou morfológica e molecularmente S. ophidiae, parasita de
serpentes da região de Botucatu, São Paulo, Brasil.
SANTOS, K.R. Morphological and molecular characterization of Strongyloides
ophidiae (Nematoda, Rhabdiasidae) infecting snakes. Botucatu, 2008. 57p. Tese
(Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
In Brazil the genus Strongyloides includes two reptile parasite: S. ophidiae and S.
cruzi. The former was described in Mastigodryas bifossatus snake and the other in
Hemidactylus mabouya gecko. In the description of S. ophidiae just the
partenogenetic females was characterized in 1929 and, ever since, no other report
about this species was published. Molecular studies for the characterization of
Strongyloides spp. were reported, however these did not include S. ophidae. In the
present study the morphological and molecular characterization of S. ophidiae
obtained from snakes in Botucatu region, São Paulo State, Brazil was accomplished.
Among the 125 studied animals only four snakes were found infected by S. ophidiae,
however partenogenetic females were recovered in only one animal. Fecal exams
had been performed for obtaining L1, L2 and L3 larvae, as well as free-living males
and females, which were morphologically analyzed. PCR products amplified from S.
ophidiae partenogenetic female samples presented about 350 bp. Nucleotide
sequences (Genbank accession numbers EU287935) isolates from these nematodes
from Oxyrhopus guibei presented 98% identity with Strongyloides procyonis
(Genbank acession number AB272234.1 and AB205054.1) and 97% identity with
Strongyloides cebus, Strongyloides stercoralis, Strongyloides sp. ex snake and
Strongyloides fuelleborni (Genbank AB277236.1, AF279916.2, AJ417031.1 and
AJ407030.1, respectively). The analysis of the phylogenetic relationship among the
species of Strongyloididae and Rhabdiasidae demonstrated that, although there are
similarity above 97% with the other species, S. ophidiae was allocated in an isolated
branch of the phylogenetic tree, characterizing a different identity in relation to other
species analyzed. The present study contributed for the morphological and molecular
characterization of S. ophidae from the Botucatu region, São Paulo State, Brazil.
Karina Rodrigues dos Santos Introdução 6
1. INTRODUÇÃO
Os répteis podem ser parasitados por diversos agentes, entre eles, alguns
artrópodes (ácaros e carrapatos), protozoários (amebas, tricomonídeos, coccídeos e
hemoparasitas) e helmintos (cestódeos, trematódeos e nematódeos). Entre os
nematódeos parasitas de répteis, pode-se destacar a ocorrência de Strongyloides
spp. Em estudos realizados em serpentes parasitadas por este nematódeo foram
descritos os seguintes sintomas: anorexia, diarréia e perda de peso, e na
histopatologia do pulmão desses animais foi encontrado severa pneumonia
exsudativa e enterite (HOLT et al., 1979; MADER, 1996; KLINGENBERG, 2000).
Embora as alterações patológicas causadas por este parasita sejam conhecidas, há
poucos trabalhos na literatura relacionados à caracterização morfológica e molecular
das espécies desses nematódeos de répteis.
No Brasil, o gênero Strongyloides é representado por duas espécies parasitas
de répteis: Strongyloides ophidiae e S. cruzi. S. ophidae foi descrita por Pereira
(1929) em Mastigodryas bifossatus no Estado de São Paulo, sendo que, na
descrição da espécie, apenas a fêmea partenogenética foi caracterizada e, desde
então, nenhum outro trabalho sobre a caracterização morfológica das outras formas
evolutivas (larvas rabdtóides, filarióides bem como machos e fêmeas de vida livre)
desta espécie foi publicado. Strongyloides cruzi foi descrito posteriormente por
Rodrigues (1968) em Hemidactylus mabouia procedente do Rio de Janeiro. Para
essa espécie, há uma descrição do macho e da fêmea de vida livre.
Recentemente, têm sido publicados na literatura alguns estudos moleculares
com o objetivo de contribuir para a caracterização das espécies do gênero
Strongyloides (DORRIS e BLAXTER, 2000; DORRIS et al., 2002). Mesmo assim,
esses estudos não incluíram S. ophidae.
Verifica-se que em relação às espécies do gênero Strongyloides parasitas de
serpentes brasileiras, há uma carência muito grande na literatura sobre a
caracterização morfológica e molecular, justificando assim a realização de estudos
com essa abordagem.
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 8
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. As Serpentes.
As serpentes pertencem ao reino Animal, Filo Chordata, Subfilo Vertebrata,
Classe Reptila, Ordem Squamata e Subordem Serpentes. A classe Reptilia contém
5.141 espécies agrupadas em quatro ordens e três subordens de répteis viventes.
(WALLACH e BOEVER, 1983; BORGES, 1999).
No Brasil existem nove famílias de serpentes, porém, as espécies mais
encontradas na região de Botucatu, Estado de São Paulo, pertencem apenas a três
famílias (Boidae, Colubridae e Viperidae), a saber: Boa constrictor amarali (Boidae);
Echinantera sp., Oxyrhopus guibei, Philodryas olfersii, Philodryas patagoniensis,
Sibynomorphus mikani, Spilotes pullatus, Thamnodynastes sp., Waglerophis
merremii (Colubridae); e Bothrops alternatus, Bothrops jararaca, Bothrops neuwiedii
e Crotalus durissus terrificus (Viperidae) (SILVA, 2000).
2.2. Classe Nematoda.
A classe Nematoda inclui vermes filiformes, cilíndricos e alongados;
apresentam simetria bilateral; tubo digestivo completo; são de sexos separados, às
vezes com grande dimorfismo sexual; podem ser parasitas, de vida livre, ou com
alternância de gerações parasitária e de vida livre; são ovíparos, porém com
algumas espécies vivíparas; e suas dimensões variam de 1 mm a 1 m (REY, 2001).
Estima-se que haja cerca de 500 mil espécies de nematódeos, sendo que
existem numerosas espécies deste grupo que parasitam anfíbios, répteis, aves e
mamíferos (REY, 2001). Entre os répteis brasileiros, existem descritas mais de 120
espécies de nematódeos parasitas, entre eles os do gênero Strongyloides
(VICENTE et al., 1993).
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 9
2.3. O gênero Strongyloides.
O gênero Strongyloides inclui 52 espécies de nematódeos parasitas de
vertebrados. Poucas espécies têm como hospedeiros, os anfíbios, os répteis e as
aves. A maioria dos hospedeiros compreende mamíferos domésticos, incluindo
gatos e cães, e os animais de produção como bovinos, ovinos e suínos (GROVE,
1989; DORRIS et al., 2002). No Brasil, existem diversas espécies que acometem um
grande número de hospedeiros (VICENTE et al., 1990, 1993, 1995, 1997).
As espécies do gênero Strongyloides descritas nos diferentes grupos de
vertebrados são: mamíferos: S. chapini, S. ferreirai, S. fuelleborni, S. myopotami, S.
papillosus, S. ransomi, S. ratti, S. stercoralis, S. venezuelenses, S. westeri, S.
agoutii, S. akbari, S. ardeae, S. cebus, S. nasua, S. cubaensis, S. dasypodis, S.
elephantis, S. erschowi, S. felis, S. lutrae, S. martis, S. minimum, S. mustelorum, S.
nasua, S. planiceps, S. procyonis, S. putorii, S. quiscali, S. ratti, S. robustus, S.
rostombekowi e S. vulpis (GROVE, 1989; VICENTE et al., 1997); aves: S. avium, S.
pavonis, S. turkemica, S. quiscali, S. oswaldoi, S. herodiae e S. minimum (VICENTE
et al., 1995; GROVE, 1989); anfíbios: S. carinii, S. pereirai, S. spiralis e S. physali,
S. amphibiophilus, S. bufonis (VICENTE et al., 1990; GROVE, 1989); répteis: S.
cruzi, S. ophidiae, S. mirzai, S. serpentis, S. gulae e S. darevskyi (GROVE, 1989;
VICENTE et al.,1993).
Os nematódeos do gênero Strongyloides pertencem à família Strongyloididae.
São helmintos que apresentam uma fase de vida livre e uma fase parasitária. Na
fase de vida livre existem representantes machos e fêmeas e na fase parasitária,
apenas a fêmea partenogenética, que é encontrada no intestino delgado (BAKER,
1983; KLINGENBERG, 1993, LANE e MADER, 1996; KLINGENBERG, 2000;
HARVEY, 2001).
Strongyloides stercoralis foi descoberta pelo médico Louis Normand e descrita
por Bavay (1876 apud LITTLE, 1966a), que o denominou de Anguillula stercoralis
(“anguillula” = enguia, “stercus”= esterco). Estes pesquisadores encontraram larvas
que in vitro se desenvolviam em machos e fêmeas de vida livre. Posteriormente,
Bavay (1877), analisando o parasita encontrado por ele e o encontrado por
Normand, concluiu que se tratavam de espécies distintas, pelas diferentes
morfologias, denominando o seu nematódeo de A. intestinales. Grassi (1878)
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 10
encontrou a mesma fêmea parasita que Bavay (1876 apud LITTLE, 1966a)
descreveu como A. stercoralis e observou que esta depositava ovos na luz intestinal
e em cultura in vitro observou uma larva com cauda truncada. Grassi (1879a apud
LITTLE, 1966a), colocou o nematódeo encontrado por ele no gênero Strongyloides e
em outro trabalho (GRASSI, 1979b apud LITTLE, 1966a), o denominou de
Strongyloides intestinales. Finalmente, Stiles e Hassal (1902 apud NEVES et al.
2005), revendo a taxonomia deste nematódeo, definiram a espécie como S.
stercoralis (“Strongylus” = arredondado = esférico) (LITTLE, 1966a; GROVE, 1989;
NEVES et al., 2005).
Alfieri (1908) encontrou um nematódeo similar ao S. stercoralis no intestino de
um sapo e considerou a possibilidade deste atuar como reservatório da infecção
para o homem. Loss (1911) e Baylis (1923) também encontraram parasitas
semelhantes em mamíferos, aves e répteis (GROVE, 1989).
As conseqüências da infecção por nematódeo do gênero Strongyloides em
répteis foram descritas por Klingenberg (1993) sendo elas: anorexia, diarréia e perda
de peso, e na histopatologia do pulmão desses animais foram encontrados severa
pneumonia exsudativa e enterite. Holt et al. (1979) realizaram exames
histopatológicos do intestino delgado e encontraram hiperemia, associado com
hemorragia e reação inflamatória da lâmina própria. Estes ao examinarem o pulmão
dessas serpentes encontraram pneumonia exsudativa e crescimento bacteriano
após cultura do exsudato. Também relatam uma massa em pâncreas que na
histopatologia mostrou regiões com infiltrados inflamatórios. Por outro lado, a
identificação das espécies do gênero Strongyloides que acometem as serpentes
brasileiras é ainda precária.
No Brasil, S. ophidiae foi originalmente descrito infectando M. bifossatus
(=Drymobius bifossatus) (PEREIRA, 1929) e apenas a fêmea partenogenética foi
descrita.
Na Índia, Mirza (1935) descreveu um Strongyloides encontrado em uma
serpente Eryx johnii e a denominou de S. stercoralis var. eryxi e, posteriormente,
Singh (1954) examinando serpentes da espécie Ptyas mucosus encontrou esses
mesmos nematódeos e redescreveu a espécie denominando-a de S. mirzai. Relata
ainda que, analisando a parasitemia das serpentes Ptyas mucosus, encontrou uma
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 11
grande quantidade de serpentes parasitadas, e serpentes com baixas (de 10 a 15
exemplares em um único hospedeiro) e com altas infecções (de 100 a 125
espécimes por hospedeiro) (SINGH, 1954).
Little (1966b) realizou estudos morfológicos de Strongyloides gulae e S.
serpentis encontrados em Natrix cyclopion cyclopion, N. taxispilota taxispilota,
Agkitrodon piscivorus leucostoma, A. contortrix contortrix, Coluber constrictor
flaviventris, Lampropeltis getulis holbrooki e Heterodon platyrhinos platyrhinos.
Holt et al. (1979), reportaram três casos de infecção pelo nematódeo
Strongyloides sp. em serpentes Python reticulatus, Elaphe obsoleta quadrivittata e
Elaphe obsoleta obsoleta. O relato de Holt et al. (1979) foi baseado em achados de
ovos e larvas de Strongyloides nas fezes destas serpentes, além de apresentar
dados histopatológicos de intestino, pulmão e pâncreas. Entretanto, os autores não
isolaram e nem caracterizaram a fêmea partenogenética.
Recentemente, Dorris et al. (2002), caracterizaram molecularmente
Strongyloides de serpentes, mas não definiram as espécies envolvidas no
parasitismo, pois possuíam apenas as larvas infectantes (L3), obtidas de fezes de
Naja sp..
O registro mais recente sobre a ocorrência de S. ophidiae no Brasil é o de
Rossellini et al. (2004), que relatou sua presença em dois novos hospedeiros: C.
durissus terrificus e P. olfersii.
2.4. Caracterização morfológica das espécies do gênero Strongyloides.
A dificuldade para se definir características diferenciais para Strongyloides
spp. fez com que muitas espécies deste gênero fossem identificadas apenas com
base nas espécies hospedeiras. Este aspecto dificultou a identificação das espécies
de Strongyloides relatadas em outros hospedeiros, como por exemplo, Alfire (1908)
que encontrou S. stercoralis em sapos; Baylis (1923) que relatou a ocorrência de
nematódeos semelhantes a S. stercoralis em mamíferos, aves e répteis; e Ranson
(1911 apud LITTLE, 1966a) que encontrou S. papilosus em ovinos.
Para a identificação precisa destes nematódeos é necessária a
caracterização morfológica de todas as formas evolutivas do parasito, ou seja, ovo,
larva, macho e fêmea de vida livre, e a fêmea parasita.
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 12
Descrições detalhadas de estágios de vida-livre, e da fêmea parasitária de S.
stercoralis, S. fülleborni, S. cebus, S. myopotami, S. venezuelensis, S. ratti, S. lutrae,
S. dasypodis, S. ardeae, S. physali, S. serpentis e S. gulae foram realizadas por
Little (1966b) e S. cruzi e S. ophidiae por Rodrigues (1868) e Pereira (1929),
respectivamente.
Little (1966a,b) definiu características que servem como base para um
detalhamento do gênero, como:
- Ovários, que em algumas espécies de Strongyloides podem estar
espiralados, tanto anteriormente como posteriormente ao redor do intestino, sendo o
número de voltas um auxílio na identificação das espécies.
- A forma do estoma (orifício bucal) , vista em uma posição “en face”, provou
ser o critério mais valioso para essa caracterização, este pode ser classificado
dentro de quatro grupos: 1simples, angular, complexo e com dentes esofagianos.
Um estoma angular tem um ou mais ângulos: triangular, retangular, hexagonal e em
forma de seta. Um estoma complexo possui multicâmaras, com câmaras de
diferentes números e formas. O estoma com dentes esofagianos tem projeções que
passam pelo fim da extremidade anterior do esôfago ao limite do estoma.
- O número e arranjo das papilas genitais nos machos de vida livre e as
papilas cefálicas dos estágios adultos de ambos os sexos, são características
importantes.
- A posição da vulva na fêmea de vida livre, que na maioria das espécies
forma um eixo de 90 graus entre o corpo e a vagina, enquanto outros apresentam o
eixo rotacionado posteriormente, fazendo com que os lábios da vulva se projetam
ventralmente.
- O arranjo dos ovos em uma única fileira no interior do útero da fêmea de
vida-livre, são características utilizadas para a determinação das espécies.
Ainda em serpentes, foram descritas as espécies S. serpentis (LITTLE,
1966b) e S. ophidiae (PEREIRA, 1929). A fêmea parasita de S. serpentis apresenta
estoma oval; ovário anterior usualmente espiralado duas vezes ao redor do intestino,
e ocasionalmente reto; ovário posterior usualmente reto e ocasionalmente fazendo
um espiral parcialmente; útero com até 10 ovos, medindo de 44 a 55 µm de
comprimento por 23 a 26 µm de largura. Os ovos ainda apresentaram estágios de
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 13
desenvolvimento embrionário. A fêmea de vida livre apresentou o corpo sem
constrição atrás da vulva; lábios da vulva proeminentee e útero com ovos dispostos
em uma única fileira. O macho de vida livre apresenta espículo moderadamente
curvado; papila pré-anal, medioventral próxima ao ânus; o espículo era diferente de
todas as espécies; em vista lateral, anteriormente era reto, alargando-se
gradualmente e alcançando maior largura próximo ao começo do terço posterior do
comprimento, estreitando abruptamente e terminando ventralmente encurvado
(ponta em forma de anzol).
A fêmea partenogenética de S. ophidiae, que é a única espécie descrita em
serpentes brasileiras, apresenta as seguintes características morfológicas: corpo
delgado, afilando-se um pouco anteriormente, e terminando com uma cauda cônica.
Extremidade anterior truncada, com pequeno orifício bucal. Esôfago alongado, mais
dilatado em sua porção posterior, e medindo de 1,05 a 1,13 mm (cerca de 1/3 do
comprimento do corpo), e tendo de largura, posterior, cerca de 0,03 mm. Vulva
saliente, na reunião dos 2/3 anteriores com o terço posterior do corpo, distando da
extremidade posterior, de 0,8 a 1,2 mm, ovejetor curtíssimo, aparelho genital didelfo
e anfidelfo, com úteros divergentes, contendo de 6 a 7 ovos, com um ou dois
blastômeros. O ramo anterior do aparelho genital chega apresentar cerca de 0,03
mm do esôfago e o ramo posterior vai de 0,06 a 0,1 mm da extremidade posterior do
corpo. Ânus, de 0,07 a 0,1 mm da extremidade posterior. Ovos, com cerca de 0,038
mm de comprimento por 0,015 a 0,023 mm de largura máxima.
2.6. Caracterização molecular das espécies do gênero Strongyloides.
Atualmente existem vários modelos que possibilitam a determinação da
variabilidade genética de diferentes organismos. Estes modelos foram desenvolvidos
a partir de reação em cadeia pela polimerase (PCR) e vêm possibilitando o
conhecimento da filogenia de diversas espécies animais.
Em relação ao gênero Strongyloides, poucos estudos moleculares foram
realizados para caracterização genética das espécies. Dorris et al. (2002) avaliaram
Strongyloides de serpentes, porém não definiram as espécies incluídas no estudo,
uma vez que possuíam apenas as larvas infectantes (L3). Estes autores utilizaram o
segmento correspondente à pequena subunidade do gene de Rna ribossômico (SSU
Karina Rodrigues dos Santos Revisão de Literatura 14
rDNA), amplificado pela PCR, utilizando-se oligonucleotídeos universais
SSUA/SSU22R.
Além deste exemplar obtido de serpentes, outras 9 amostras de Strongyloides
foram estudadas a partir de uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo bovinos,
roedores, primatas e as três espécies conhecidas do ser humano (DORRIS et al.,
2002).
As seqüências do gene SSU rDNA de Strongyloides spp. foram muito
similares entre si, quando colocadas na árvore filogenética, sendo que algumas
espécies apresentaram ramificações próximas.
Empregando-se parâmetros de máxima probabilidade (Bayesian Markov chai
Monte Carlo), S. cebus, S. papillosus e S. fuelleborni kelleyi apresentaram a mesma
seqüência de nucleotídeos assim como S. stercoralis, S. fuelleborni fuelleborni e
Strongyloides sp. ex. snake, nesta estudo o gênero foi agrupado em dois
cladogramas: o primeiro, denominado de “stercoralis”, que inclui Strongyloides sp.
ex. snake, S. stercoralis e S. fuelleborni fuelleborni e o segundo denominado de
“cebus”, que contém S. ratti, S. suis, S. venezuelensis, S. papillosus, S. fuelleborni
kelleyi e S. cebus.
Dorris et al. (2002) destacam o fato de que Strongyloides sp. ex. snake seja
grupo-irmão para parasitas de primatas, por terem sido agrupados no mesmo
cladograma dos dois maiores agentes causadores de estrongiloidíase em humanos
(S. stercoralis e S. fuelleborni).
Além da existência de poucos estudos moleculares com o gênero
Strongyloides, as espécies parasitas de répteis não foram completamente
estudadas. Alguns estudos nesse contexto apresentaram apenas dados
morfológicos enquanto em outros somente dados moleculares foram abordados,
comprovando assim a necessidade de realização de mais estudos, principalmente,
aqueles que fazem uma abordagem conjunta das duas técnicas.
Karina Rodrigues dos Santos Objetivos 16
3. OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivo a caracterização morfológica e
molecular de S. ophidiae (Nematoda, Strongyloididae) parasitas de serpentes no
Brasil.
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 18
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Seleção dos animais.
Foram avaliadas 125 serpentes de diversas espécies e procedências, recém
capturadas da natureza e doadas ao CEVAP/UNESP (Centro de Estudos de
Venenos e Animais Peçonhentos de Botucatu). Todos os animais que fizeram parte
deste estudo foram identificados e os dados referentes a esses foram anotados e
protocolos individuais (Tabela 1).
Foram coletadas amostras de fezes desses animais, para realização de
exames coproparasitológicos com a finalidade de se determinar as serpentes
parasitadas por nematódeos do gênero Strongyloides.
TABELA 1. Espécie, procedência, data da coleta e sexo das serpentes incluídas no estudo.
Animal Espécie Procedência Data da
coleta
Sexo
001 Sibynomorphus mikanii Pardinho, SP 05/08/2005 F
002 Sibynomorphus mikanii Itatinga, SP 04/07/2005
003 Oxyrhopus guibei Avaré, SP 29/07/2005
004 Oxyrhopus guibei Lençóis Paulista, SP 19/07/2005 F
005 Waglerophis merremi Lençóis Paulista, SP 18/07/2005
006 Crotalus durissus terrificus Sítio da Moçada, Botucatu, SP 14/07/2005 F
007 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, km 12,
Pardinho, SP
12/07/2005 F
008 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, km 12,
Pardinho, SP
12/07/2005 M
009 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, km 12,
Pardinho, SP
12/07/2005 M
010 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, km 12,
Pardinho, SP
12/07/2005 M
011 Crotalus durissus terrificus Anhumas, SP 08/08/2005 F
012 Crotalus durissus terrificus Lageado-Cafezal, SP 18/07/2005 F
013 Crotalus durissus terrificus Sítio Pesqueiro do Mariano,
Botucatu, SP
19/07/2005 M
014 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, Km 12,
Pardinho, SP
12/07/2005 F
015 Crotalus durissus terrificus Fazenda em Anhembi, SP 07/07/2005 M
016 Crotalus durissus terrificus Sítio Pesqueiro do Mariano,
Botucatu, SP
19/07/2005 F
017 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, Km 12,
Pardinho, SP
12/01/2005 F
018 Crotalus durissus terrificus Botucatu, SP 31/08/2005 M
019 Crotalus durissus terrificus Cerqueira César, SP 29/08/2005 F
020 Crotalus durissus terrificus Fazenda Edgárdia, Botucatu,
SP
29/08/2005 F
021 Crotalus durissus terrificus Fazenda Jacioba, Pardinho, SP 12/07/2005 F
022 Crotalus durissus terrificus Itatinga, SP 13/08/2005 F
023 Oxyrhopus guibei Fazenda Edgárdia, Botucatu, 01/09/2005 M
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 19
SP
024 Oxyrhopus guibei Rubião Junior, Botucatu, SP 30/08/2005 F
025 Thamnodynastes sp. Itatinga, SP 13/08/2005 I
026 Crotalus durissus terrificus Estrada Pirambóia, SP 09/09/2005 M
027 Crotalus durissus terrificus Horto florestal, Anhembi, SP 06/09/2005 M
028 Crotalus durissus terrificus Morada do Sol, Botucatu, SP 12/09/2005 M
029 Crotalus durissus terrificus Fazenda São Vicente, Itatinga,
SP
14/09/2005 M
030 Spilotes pullatus Agropecuária, São Marino, SP 15/09/2005 M
031 Boa constrictor amarali Rio Bonito, Botucatu, SP 06/07/2005 F
032 Bothrops neuwiedii Sítio da Usina São Manoel, SP 26/07/2005 F
033 Bothrops jararaca Granja Monte Alvão, Itatinga,
SP
15/09/2005 F
034 Bothrops jararaca Horta, Fazenda Monte Alegre,
SP
16/09/2005
035 Philodryas patagoniensis COHABI, Botucatu, SP 28/09/2005 F
036 Crotalus durissus terrificus Botucatu, SP 16/09/2005 F
037 Oxyrhopus guibei Rubião Junior, Botucatu, SP 08/09/2005 F
038 Echinantera occipitalis Rubião Junior, Botucatu, SP 08/09/2005 F
039 Crotalus durissus terrificus Botucatu, SP 20/09/2005 F
040 Bothrops alternatus Lins, SP 29/07/2005 F
041 Crotalus durissus terrificus Sítio Atálio Cocho, Pardinho, SP 16/11/2005 F
042 Bothrops jararaca Lageado, Botucatu, SP 17/11/2005 F
043 Echinantera occipitalis Botucatu, SP 08/11/2005 F
044 Oxyrhopus guibei Rau Epaminondas Madeira s/n 07/11/2005 M
045 Oxyrhopus guibei Sítio Paraizinho, Pardinho, SP 15/11/2005 F
046 Boa constrictor amarali Rubião Júnior, Botucatu, SP 24/11/2005 M
047 Crotalus durissus terrificus Sítio Paraizinho, Pardinho, SP 05/10/2005 F
048 Crotalus durissus terrificus Bofete, SP 15/11/2005 M
049 Crotalus durissus terrificus Sítio Santa Luiza, Taguaí, SP 11/10/2005 M
050 Crotalus durissus terrificus Fazenda São Pedro, Conchas,
SP
10/11/2005 M
051 Spilotes pullatus Avaré, SP 10/01/2006 M
052 Rachidelus brazili São Manoel, SP 08/11/2005 F
053
Waglerophis merremi Cerqueira César, Botucatu, SP 24/11/2006 F
054 Phalotris lativittatus Rubião Júnior, Botucatu, SP 20/11/2005 M
055 Sibynomorphus mikanii Botucatu, S.P. 19/12/2005 M
056 Oxyrhopus guibei Lageado, Botucatu, SP 27/01/2006 F
057 Liophis sp. Botucatu, SP 06/02/2006 F
058 Erythrolampus aesculapii Botucatu, SP 09/01/2006 F
059 Oxyrhopus guibei Botucatu, SP 05/02/2006 F
060 Boa constrictor amarali São Pedro, SP 06/01/2006
061 Sibynomorphus mikanii Botucatu, SP 20/03/2006
062 Oxyrhopus guibei Botucatu, SP 12/02/2006 F
063 Waglerophis merremi Botucatu, SP 12/03/2006 F
064 Boa constrictor amarali Botucatu, SP 14/03/2006
065 Bothrops moojeni Lençóis Paulista, SP 13/02/2006 F
066 Boa constrictor amarali Botucatu- S.P. 05/04/2006 F
067 Oxyrhopus guibei Fazenda Lageado, Botucatu, SP 29/03/2006 F
068 Crotalus durissus terrificus Fazenda Lageado, Botucatu, SP 10/04/2006 M
069 Micrurus corallinus Rubião Júnior, Botucatu, SP 11/04/2006 F
070 Crotalus durissus terrificus Botucatu, SP 11/04/206 M
071 Crotalus durissus terrificus SABESP, Botucatu, SP 04/04/2006
072 Bothrops jararaca Casa da Agricultura Pardinho,
SP
19/04/2006 F
073 Sibynomorphus mikanii Fazenda Lageado, Botucatu, SP 18/04/2006 M
074 Sibynomorphus mikanii Fazenda Lageado, Botucatu, SP 18/04/2006 F
075 Boa constrictor amarali Rio Bonito, Botucatu, SP 01/04/2006 F
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 20
076 Crotalus durissus terrificus Sítio Boa Vista Negrão,
Botucatu, SP
20/04/2006 M
077 Crotalus durissus terrificus Sítio Boa Vista Negrão,
Botucatu, SP
20/04/2006 F
078 Crotalus durissus terrificus Sítio Boa Vista Negrão,
Botucatu, SP
20/04/2006 F
079 Dipsas indica Sítio Boa Vista Negrão,
Botucatu, SP
20/04/2006 M
080 Dipsas indica Sítio Boa Vista Negrão,
Botucatu, SP
20/04/2006 F
081 Crotalus durissus terrificus Sítio Dois Rios, Laranjal
Paulista, SP
20/04/2006 F
082 Crotalus durissus terrificus Fazenda Feltrin- Bofete 24/04/2006 M
083 Bothrops neuwiedii Condomínio Califórnia II ,
Rubião Júnior, Botucatu, SP
24/04/2006 M
084 Crotalus durissus terrificus Rio Santa Inácia, Bofete, SP 01/05/2006 M
085 Boa constrictor amarali Bofete, SP 01/05/2006 M
086 Crotalus durissus terrificus Rio Bonito, Botucatu, SP 02/05/2006 F
087 Crotalus durissus terrificus Sítio Novo Horizonte, Botucatu,
SP
04/05/2006 F
088 Oxyrhopus guibei Botucatu, SP 16/05/2006 F
089 Simophis rhinostoma Botucatu, SP 16/05/2006 F
090 Crotalus durissus terrificus Sítio Bocaininha, Santa Maria
da Serra, SP
11/04/2006 M
091 Crotalus durissus terrificus Sítio da Andorinhas, Pardinho,
SP
04/05/2006 M
092 Crotalus durissus terrificus Sítio Bocaininha, Santa Maria
da Serra, SP
11/05/2006 F
093 Crotalus durissus terrificus Duratex, Botucatu, SP 24/05/2006 M
094 Crotalus durissus terrificus São Manoel, SP 24/05/2006 M
095 Bothrops neuwiedii Botucatu, SP 04/06/2006 F
096 Oxyrhopus guibei Distrito Maristela, Botucatu, SP 05/06/2006 M
097 Oxyrhopus guibei Avaré, SP 30/05/2006 M
098 Philodryas patagoniensis Unesp Lageado, Botucatu, SP 01/06/2006 M
099 Crotalus durissus terrificus Botucatu, SP 31/05/2006 M
100 Bothrops alternatus Sabesp, Botucatu, SP 31/07/2006 F
101 Crotalus durissus terrificus
Botucatu, SP 10/07/2006 F
102 Crotalus durissus terrificus Sítio N. S. Rosário, Conchas,
SP
02/08/2006 F
103 Crotalus durissus terrificus Chácara Santo Antônio,
Botucatu, SP
26/07/2006 M
104 Oxyrhopus guibei Botucatu, SP 17/08/2006 M
105 Dipsas indica Recanto da Amizade, Botucatu,
SP
30/08/2006 M
106 Crotalus durissus terrificus Sítio Casa Branca, Anhembi, SP 06/09/2006 F
107 Crotalus durissus terrificus Anhembi, SP 01/08/2006 F
108 Crotalus durissus terrificus Sítio Viana, Laranjal Paulista,
SP
10/08/2006 M
109 Bothrops jararaca Granja, Botucatu, SP 14/09/2006 M
110 Crotalus durissus terrificus Itatinga, SP 14/09/2006 F
111 Boa constrictor amarali Botucatu, SP 11/07/2006 M
112 Philodryas patagoniensis - - -
113 Philodryas patagoniensis - - -
114 Crotalus durissus terrificus - - -
115 Philodryas patagoniensis Botucatu, SP 11/10/2006 F
116 Oxyrhopus guibei Chácara Santo Antônio,
Botucatu, SP
21/10/2006 F
117 Crotalus durissus terrificus Anhembi, SP 03/10/2006 F
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 21
118 Crotalus durissus terrificus Anhembi, SP 03/10/2006 F
119 Crotalus durissus terrificus Botucatu, SP 04/10/2006 M
120 Crotalus durissus terrificus Pardinho, SP 17/10/2006 F
121 Philodryas patagoniensis Botucatu, SP 30/10/2006 F
122 Crotalus durissus terrificus Eucatex, Botucatu, SP 13/11/2006 F
123 Crotalus durissus terrificus Sítio Santa Terezinha, São
Francisco, Itaporanga, SP
11/2006 F
124 Oxyrhopus guibei Potaria Lageado, Botucatu, SP 16/01/2007 M
125 Boa constrictor amarali Edgárdia, Botucatu, SP 11/01/2007 F
4.2. Análise parasitológica das fezes.
Para os exames coproparasitológicos foram realizados os métodos de Willis-
Molley (método da flutuação) e a técnica sedimentação simples (HOFFMANN,
1987). Os exames foram realizados com objetivo de detecção de ovos larvados
característicos de nematódeos dos gêneros Strongyloides ou Rhabdias.
Para a identificação das amostras de animais infectadas por Strongyloides, foi
realizada a coprocultura com as amostras das fezes positivas para ovos larvados.
Para tanto, esses ovos foram incubados utilizando papel filtro umedecido placas de
Petri em temperatura de 25-27ºC e umidade relativa alta (80%), durante sete dias.
Para a extração das larvas infectantes foi utilizado o Método de Roberts e O’Sulivan
(HOFFMANN, 1987).
Além disso foram utilizados como substratos: fezes esterilizadas de eqüinos,
xaxim autoclavado e carvão em grãos; a água utilizada para umidificar a cultura
também foi esterilizada.
4.3. Caracterização morfológica dos parasitos.
Os ovos e larvas de Strongyloides obtidos na coprocultura e os adultos
coletados do intestino das serpentes foram imediatamente analisados em sistema
computadorizado de análise de imagens Lite Qwin 3.1 (Leica, Microsystems,
Wetzlar, Alemanha).
As larvas rabditóides (L1 e L2) foram identificadas pela morfologia do esôfago
e do corpo. As larvas L3 foram diferenciadas pela morfologia do esôfago e da cauda,
que é entalhada no gênero Strongyloides.
As formas adultas parasitas foram coletadas em animais que foram a óbito no
cativeiro ou através de lavagem intestinal das serpentes recém capturadas,
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 22
empregando-se solução fisiológica em volume correspondente a 1% do peso
corporal do animal, como recomendado por Mader (1996).
Para as análises morfométricas foram utilizadas 10 fêmeas partenogenéticas
recuperadas de O. guibei (animal 004) e larvas L1, L2 e L3 das serpentes S. mikanii
(animal 001), O. guibei (animal 045) e uma Thamnodynastes sp.(animal 025),
encontradas após a coprocultura e fêmeas de vida livre.
Nessa etapa, as fêmeas partenogenéticas foram clarificadas com fenol e
mensuradas o comprimento e largura, o comprimento e largura dos ovos,
comprimento do esôfago, distância da vulva a extremidade posterior, localização do
aparelho genital, distância do ânus a extremidade posterior. Além disso, os machos
e fêmeas de vida livre foram também analisados morfologicamente após terem sido
recuperados da coprocultura. Nas formas de vida livre foram mensurados:
comprimento e largura do corpo, do esôfago, distância do anel nervoso à
extremidade anterior, tamanho do gubernáculo e espículo, distância da abertura anal
à extremidade posterior e nas fêmeas ainda foram mensuradas a distância da vulva
à extremidade posterior e comprimento e largura dos ovos.
4.4. Técnicas moleculares.
4.4.1. Isolamento do DNA dos parasitos.
Fêmeas partenogenéticas de S. ophidae foram fixadas em etanol 70%, AFA
(álcool, formol e ácido acético) e álcool isopropílico até a realização do estudo. O
DNA genômico foi extraído de 8 nematódeos com a utilização do kit de extração de
DNA Quiamp da (QIAGEN, GmbH, Hilden, Alemanha) segundo instruções do
fabricante.
4.4.2. Reações de PCR com o emprego do SSU rDNA.
O segmento correspondente à seqüência do gene SSU rDNA (pequena
subunidade ribossomal do DNA ribossômico) foi amplificado pela reação em cadeia
pela polimerase (PCR) utilizando-se os oligonucleotídeos universais SSUA (Forward
5’- AAA GAT TAA GCC ATG CAT G -3’) e SSU22R (Reverse 5’- GCC TGCTGC
CTT CCT TGG A -3’) segundo as condições descritas por Dorris et al. (2002).
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 23
Para amplificação do material genético foi utilizado termociclador My Cycler
Thermal Cycler (Bio-Rad
). Os produtos amplificados foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose 2% (Ameresco) corado com brometo de etídio (0,5
L/mL) utilizando-se uma cuba horizontal Hoefer HE 99 (GE Healthcare, Bucks,
U.K.) em solução de TAE 1X (Tris-base 0,4 M; ácido acético 0,20M e solução de
EDTA 0,5M, pH 8,0). Após a amplificação as amostras receberam 2 L de corante
de corrida (0,01g de azul de bromofenol e 10 mL de TE para um volume final de 10
mL), e em seguida aplicadas no gel. A visualização das bandas foi feita em
transluminador de luz UV (ultravioleta).
4.4.3. Condições de PCR.
A amplificação foi realizada numa reação com 10 l, 10 mM Tris-HCl 1,5 mM
MgCl
2
, 50 mM KCl, pH 8,3, 100 mM de cada dNTP, 100 ng de DNA genômico e 0,5
unidades de Taq polimerase (GE Healthcare, Bucks, U.K.). A PCR compreendeu 35
ciclos, precedidos por 95
o
C durante 5 minutos. Cada ciclo foi constituído por 30
segundos, a 95
o
C (temperatura de desnaturação), 30 segundos a 58,1
o
C
(temperatura de anelamento)
e 30 segundos a 72
o
C (temperatura de síntese de
DNA).
4.4.4. Purificação dos produtos da PCR.
As amostras resultantes da reação de PCR foram purificadas com auxílio da
enzima EXOSAP - IT, (USB). Para esta reação foram utilizados 2 µl da enzima para
cada 8 µl de amostra, incubados a 37°C por 1h e a 80°C por 20 minutos.
4.4.5. Reação de seqüenciamento.
A reação de seqüenciamento foi preparada para um volume final de 20 µl. Os
reagentes foram utilizados nas seguintes proporções: 4 l de 2,5x Save Money (400
mM Tris-HCl pH 9,0, 10 mM MgCl
2
), 4 l BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA), 3,2 mol do ONT
M13 forward, e 4 l do DNA e H
2
O q.s.p.. As reações foram igualmente realizadas
com termociclador Whatman Biometra
(T Gradient). Os ciclos de temperatura
foram programados para: 25 ciclos de 95°C por 10 seg, 50°C por 5 seg, 60°C por 4
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 24
min, com rampa de 1°C/seg, como recomendado pelo fabricante. As cromatografias
de seqüenciamento foram realizadas no Seqüenciador ABI PRISM
377 (Applied
Biosystems).
4.4.6. Precipitação.
Os produtos das reações de seqüenciamento foram submetidos ao protocolo
de precipitação alcoólica. Para cada amostra foram adicionados 80 l de isopropanol
65%, e, a seguir, a mistura foi incubada a temperatura ambiente (TA) por 20
minutos. Em seguida, a amostra foi centrifugada a velocidade de 2000g por 25
minutos, a temperatura ambiente. O isopropanol foi removido invertendo o tubo e,
adicionando-se, em seguida, 200 µl de etanol 70% e centrifugando-se a velocidade
de 2000g por 5 minutos a temperatura ambiente. Todo o etanol foi removido com
auxílio de micropipeta, uma vez que resíduos desta substância podem resultar em
manchas fluorescentes, interferindo na leitura do gel. A amostra foi seca a
temperatura ambiente e o DNA foi eluído em 2 µl de tampão de amostra contendo
Formamidina Hi-Di
TM
(Applied Biosystems) + tampão de corrida (25 mM EDTA pH
8,0 contendo 50 mg/ml Blue Dextran) (5:1) (Applied Biosystems, USA). No momento
da aplicação no gel, as amostra foram aquecidas a 95º C por 5 minutos e
rapidamente transferida para o gelo.
4.4.7. Análise da seqüência.
A seqüência forward e reverse, foram geradas com auxílio do programa
MERGER (HTTP://bioweb.pasteur.fr/seqanal/aligment/intro-uk.html
) para obtenção
da seqüência consenso que a seguir foram comparadas com outras disponíveis no
GenBank, e identificadas utilizando-se o BLASTn
(HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi
). Alinhada utilizando o programa
CLUSTAL X versão 1.81 (THOMPSON et al. 1997). Posteriormente a seqüência foi
utilizada para a construção da árvore filogenética utilizando-se o programa MEGA
versão 3.1 (KUMAR et al., 2001). Taxas de divergência foram conduzidas,
utilizando-se os métodos de máxima parcimônia (MP) e distância (NJ) na
reconstrução filogenética do fragmento estudado. Para se estimar o índice de
Karina Rodrigues dos Santos Material e Métodos 25
consistência das análises de distância foram utilizadas árvores com teste de
bootstrap sobre 1000 réplicas.
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 27
5. RESULTADOS
5.1. Análise parasitológica das fezes e coproculturas.
Das 125 serpentes analisadas, foram encontrados ovos larvados nas fezes,
característicos de Strongyloides spp. ou Rhabdias spp. em 39 indivíduos (31,2%),
pela técnica de Willis e/ou pelo exame direto.
Na coprocultura, amostras de fezes de apenas 4 animais (3,2%) encontraram-
se positivas para Strongyloides sp., sendo um exemplar de S. mikanii (animal 001),
duas O. guibei (animais 004 e 045) e uma Thamnodynastes sp.(animal 025).
Entretanto, oito serpentes que apresentaram resultados negativos nos exames
coproparasitológicos, quando vieram a óbito, apresentaram-se parasitadas por
nematódeos do gênero Rhabdias.
5.2. Caracterização morfológica dos parasitas.
Dos quatro animais infectados por S. ophidiae, foi possível recuperar fêmeas
partenogenéticas de apenas uma serpente, pois três animais vieram a óbito no
cativeiro, porém a necropsia dos mesmos não foi realizada devido ao avançado
estado de decomposição dos animais.
As análises morfométricas das 10 fêmeas partenogenéticas recuperadas de
O. guibei (animal 004) e larvas L1, L2 e L3 das serpentes S. mikanii (animal 001),
das duas O. guibei (animal 045) e Thamnodynastes sp.(animal 025) e ovos das
serpentes O. guibei (animal 004) e Thamnodynastes sp. (animal 025), estão
apresentadas nas Tabelas de 2, 3,4,5, 6 e Figuras 1 e 2.
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 28
5.2.1. Strongyloides ophidiae.
5.2.1.1. Fêmeas partenogenéticas.
As fêmeas partenogenéticas apresentaram o corpo delgado, terminado com
uma cauda cônica. A extremidade anterior apresentou-se truncada, com um
pequeno orifício bucal (estoma), mas neste trabalho, não foi possível a visualização
do mesmo, pois os exemplares analisados apresentaram resquícios de mucosa e/ou
detritos.
O esôfago dessa fêmea apresentou-se longo, filariforme, e o anel nervoso
não foi observado. O sistema reprodutor é didelfo e anfidelfo, curto e com ovos (2 a
5) e a vulva apresentou-se localizada no meio do corpo. O ovário anterior
apresentou duas voltas em torno do intestino e o posterior uma volta parcial ao redor
do intestino e, além disso, o ramo posterior do ovário se estende até quase a
abertura anal (Figura 1). O resultado da análise morfométrica está apresentado na
Tabela 2.
TABELA 2. Análise morfométrica de fêmeas partenogenéticas de Strongyloides sp. (n = 10)
recuperadas de serpente Oxyrhopus guibei.
Variáveis (µm)
Média Mínimo Máximo
Comprimento
4700,3 3524,8 5371,8
Largura
50,6 41,2 57,9
Esôfago total
1632,6 1425,8 1902
Distância ramo genital anterior-
esôfago
235,1 102,6 374,1
Distância ramo posterior-
extremidade posterior
328,1 130,4 604
Anus
13,6 9,5 30,8
Distância vulva-extremidade
posterior
2292,5 1759,4 2620,4
Distância ânus-extremidade
posterior
105,3 63,8 123,8
Ovos (n = 57)
Comprimento
51,8 48,4 54,5
Largura
32,4 30,5 33, 6
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 29
A
C D
E
B
F
FIGURA 1. Fêmea partenogenética de Strongyloides ophidiae (Strongyloididae) coletado em
intestino de Oxyrhopus guibei (Colubridae), no município de Botucatu, SP. A)
Visão geral do helminto; B) Detalhe da cauda – terminação pontiaguda; C)
Detalhe da vulva e ovos; D) Detalhe do esôfago; E) Detalhe das voltas do
ovário em torno do intestino; F) Detalhe do útero e ovos. A-D, clarificação com
fenol; E-F, coloração por carmim clorídrico.
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 30
5.2.1.2. Ovos.
Os ovos apresentaram-se elípticos com casca delgada, larvados e de
medidas ligeiramente maiores daqueles analisados ainda no útero das fêmeas
partenogenéticas (Tabela 3 e Figura 2).
TABELA 3. Morfometria dos ovos de Strongyloides sp. (Strongyloididae) obtidos nos
exames coproparasitológicos.
Animais
Variáveis
Oxyrhopus guibei
(n = 9)
Thamnodynastes sp.
(n=4)
Comprimento
75,8 (39,93 - 85,62)*
63,1 (54,02-67,56)
Largura
43,9 (37,14 - 47,95) 33,1 (31,02-34,65)
* Os valores apresentados representam a média (mínimo - máximo).
5.2.1.3 Larva rhabditóide (L1).
As larvas de primeiro estádio foram encontradas após a realização da
coprocultura. Estas apresentaram esôfago do tipo rhabditiforme, com corpo, istmo e
bulbo distintos e evidentes; anel nervoso peri-esofagiano envolvendo a região do
istmo. O intestino possui células indiferenciadas e luz retilínea e apresentam cauda
afilada. O primórdio genital foi raramente observado. Os dados morfométricos estão
apresentados na Tabela 4.
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 31
TABELA 4. Análise morfométrica das larvas rhabditóides (L1) de Strongyloides sp.
(Strongyloididae) obtidas da coprocultura.
Animais
Variáveis
(µm)
Sibynomorphus
mikanii
(n=18)
Oxyrhopus guibei
(n=20)
Thamnodynastes sp.
(n=4)
Oxyrhopus guibei
(n=7)
Comprimento
246,4 (186-336)*
249,1 (211,8-288,1) 243,3 (214,7-267,9) 308,4 (268,2-397,4)
Largura
13,9 (10,47-19,07)
12,0 (9,6- 14,13) 15,3 (14,5-15,59) 18,4 (5,2-20,4)
Esôfago total
76,7 (59,84-95,19)
74,6 (56,09- 92,83) 68,0 (63,21-70,5) 78,4 (66,7-90,0)
Ânus
28,6 (17-38,32)
32,8 (19,38- 46,54) 23,0 (19,22-26,57) 33,0 (17,7-51,3)
* Os valores apresentados representam a média (mínimo - máximo)
5.2.1.4 Larva rhabditóide (L2).
Estas são morfologicamente semelhantes às larvas de primeiro estádio, com
um esôfago ainda rhabditóide, porém mais alongado, e com a divisão entre bulbo e
istmo menos evidente. A cavidade bucal é menos evidente que nas L1, o primórdio
genital foi observado em poucas larvas, e esta também apresenta a cauda afilada e
o corpo mais alongado, delgado e afilado. A análise morfométrica desta forma
evolutiva está representada na Tabela 5 e Figura 2.
TABELA 5. Análise morfométrica das larvas rhabditóides (L2) de Strongyloides ophidiae
(Strongyloididae) obtidas da coprocultura.
Animais
Variáveis
(µm)
Sibynomorphus mikanii
(n = 17)
Oxyrhopus guibei
(n = 20)
Oxyrhopus guibei
(n = 7)
Comprimento
458,0 (301,7-600,3)* 312,1 (226,3-547,2) 435,83 (316,2- 620,6)
Largura
20,3 (14,1-32,8) 14,4 (10,9-29,0) 18,8 (16,44-22,7)
Esôfago total
107,5 (77,0-134,9) 82,4 (40,9- 176,8) 122,1 (91,8-186)
Ânus
39,3 (23,5-56,3) 35,9 (12,9- 55,7) 47,4 (38,8-51,85)
* Os valores apresentados representam a média (mínimo - máximo)
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 32
5.2.1.5 Larva filarióide (L3).
As larvas de terceiro estádio são alongadas, mais delgadas que as de
segundo estádio, com esôfago longo e do tipo filariforme, possuindo uma cauda
afilada com a extremidade entalhada (Tabela 6 e Figura 2).
TABELA 6. Análise morfométrica das larvas L3 infectantes de Strongyloides ophidiae
(Strongyloididae) obtidas da coprocultura.
Animais
Variáveis
(µm)
Sibynomorphus
mikanii (n = 30)
Oxyrhopus guibei
(n = 30)
Thamnodynastes
sp. (n = 5)
Oxyrhopus guibei
(n = 7)
Comprimento
495,9 (407,6-664,3)* 486,4 (421,8-602,8) 576,6 (527,5-631,7) 599,6 (553,2-669,1)
Largura
14,7 (11,7-18,9) 14,9 (11,8-18,7) 18,6 (16,7-20,7) 19,1 (16-23,7)
Esôfago total
179,3 (98,95-289,2) 171,0 (111,8-254) 162,8 (114,2-268,0) 191,1 (144,5-290,6)
Ânus
48,6 (28,1-74,3) 63,0 (32,3-103,1)
61,1(53,1-75,2) 62,6 (55,4- 69,5)
* Os valores apresentados representam a média (mínimo - máximo)
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 33
A
B
C
D
FIGURA 2. Ovo e larvas de Strongyloides ophidiae. (A) ovo larvado; B) larva rhabditóide
(L2); C) larva filarióide (L3); D) Detalhe da cauda entalhada da larva filarióide
(L3). A-D, clarificação com fenol.
5.2.1.6. Fêmeas de vida-livre.
Possuem o corpo curto, com parede fina, e cutícula com finas estriações
transversas. O esôfago é rhabditóide, curto, e a sua porção anterior (muscular) é
separada do corpo por uma leve constrição. O anel nervoso se localiza na porção
final do istmo esofagiano. O sistema reprodutor é didelfo e anfidelfo, com a vulva
próxima ao meio do corpo e vagina curta. O corpo não apresenta constrição
posterior à vulva, os lábios dessa são proeminentes; e útero com uma única fileira
de ovos (Tabela 7 e Figura 3).
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 34
TABELA 7. Análise morfométrica de fêmeas de vida-livre e seus ovos de Strongyloides
ophidiae (Strongyloididae) obtidos da coprocultura.
Animais
Variáveis
(µm)
Sibynomorphus mikanii
(n=8)
Oxyrhopus guibei
(n=10)
Comprimento
847,0 (644,8-1008,9)* 826,1 (711,8-1089,1)
Largura
39,2 (25,0-46,0) 36,9 (30,2-52,9)
Esôfago total
142,7(107,7-174,6) 149,3 (116,9-260,8)
Ânus
97,4 (75,5-122,8) 99,8 (93,86-108,7)
Distância vulva-
extremidade posterior
432,2(334,1-502,0) 412,7 (345,5-560,9)
Distância ânus-
extremidade posterior
411,2 (314,4-502,9) 389,4 (289,3-448)
Ovos
(n = 42)
(n = 12)
Comprimento
42,0 (23,5- 63,5)
46,9 (34,15-51,4)
Largura
27,2 (17,2- 35,4)
29,7 (25,5-38,9)
* Os valores apresentados representam a média (mínimo - máximo)
5.2.1.7. Macho de vida-livre.
O único macho de vida livre encontrado neste estudo apresentou
comprimento de 417,8 µm; largura de 16,6 µm; corpo cilíndrico, atenuado nas duas
extremidades, sendo a posterior pontiaguda; o esôfago é do tipo rhabditóide, de
comprimento total de 71,8 µm (bulbo e ístimo); apresenta dois espículos iguais que
medem 33,5 µm de comprimento e um gubernáculo com 14,9 µm de comprimento;
neste não foi possível a observação de papilas pré-anais nem papilas pós-anais
(Figura 3).
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 35
FIGURA 3. Macho e fêmeas de vida livre de obtidos a partir da coprocultura. A) visão geral
do macho de vida livre; B) Detalhe da região posterior – notar a presença do
espículo; C) visão geral da fêmea de vida livre; D) detalhe da região da vulva e
ovos da fêmea de vida livre.
5.3. Freqüência dos parasitas encontrados.
Além da infecção por S. ophidiae, os animais encontraram-se parasitados por
outros helmintos e protozoários; em um total de 52 (41,6%) animais. Destes 45
animais (36%) apresentaram infecções simples e sete (5,6%) infecções múltiplas.
Dentre esses parasitas a prevalência foi de 22,4% para nematódeos do
gênero Rhabdias spp.; 5,6% para ovos larvados; 4% para ovos morulados; 0,8%
para Kalicephalus spp.; 3,2% para ovos de cestódeos; 0,8% para o trematódeo
Haplometroides buccicola 4,8% para Trichomonas spp.; 1,6% Cyclospora spp., 0,8%
para larvas e 0,8% de coccídeos não identificados (Tabela 8, Figuras 4 e 5).
A
B
C
D
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 36
TABELA 8. Espécies de serpentes parasitadas, número de serpentes estudadas e
quantidade de serpentes parasitadas e parasitas encontrados.
Serpente
hospedeira
Serpentes
estudadas
Serpentes
parasitadas
Parasita
BOIDAE
Boa constrictor amarali
9 3 Rhabdias spp., Trichomonas spp.
COLUBRIDAE
Dipsas indica
3 0 -
Echinantera occipitalis
2 2 Rhabdias spp.e Trichomonas spp.
Erythrolampus aesculapii
1 0 -
Liophs sp. 1 1 Ovos larvados
Oxyrhopus guibei
17 10
Rhabdias spp., Strongyloides
ophidiae, Trichomonas spp. e ovos
larvados
Phalotris lativittatus
1 1
Haplometroides buccicola
Philodryas patagoniensis
6 3
Rhabdias spp.e Kalicephalus spp.,
ovos larvados, larvas
Rachidelus brazili
1 0 -
Simophis rhinostoma
1 0 -
Spilotes pullatus
2 1 Rhabdias spp.
Sibynomorphus mikani
6 2
Strongyloides ophidiae e Rhabdias
spp.
Thamnodynastes sp. 1 1
Strongyloides ophidiae
Waglerphis merremi
3 2
Rhabdias spp., Trichomonas spp.
e ovos morulados
ELAPIDAE
Micrurus corallinus
1 0 -
VIPERIDAE
Bothrops alternatus
2 1 Ovo larvado
Bothrops jararaca
5 4
Rhabdias spp., Cyclospora spp.,
Ovos larvados
Bothrops moojeni
1 0 -
Bothrops neuwiedii
3 1 Rhabdias spp.
Crotalus durissus terrificus
59 16
Strongyloides e Rhabdias spp.,
ovos de cestódeos, ovos
morulados, Trichomonas spp.,
Cyclospora spp. e Coccídeos
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 37
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
Rhabdias spp.
Strongyloides o
p
hidiae
Haplometroides buccicola
Kali
c
epha
l
us spp.
O
v
os
d
e
ces
t
ódeos
Tric
h
omonas spp
.
C
yc
l
o
spor
a
spp.
Co
c
cíd
e
o
s
larva
s
O
vo
s
la
r
vad
o
s
O
vo
s
m
o
r
u
l
a
d
o
s
Parasitas
Freqüência (%
)
FIGURA 4. Freqüência de parasitas encontrados nas serpentes incluídas no estudo.
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 38
A
B
C
D
E
F
FIGURA 5. Parasitas encontrados nas demais serpentes estudadas. A) ovo morulado; B)
ovos de cestódeos; C) Cyclospora sp.; D) Kalicephalus sp.; E) Rhabdias sp.; F)
Haplometroides buccicola, coloração por carmim clorídrico.
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 39
5.4. Caracterização molecular de Strongyloides ophidiae.
5.4.1. Reação em cadeia da polimerase (PCR).
Os produtos amplificados pela PCR a partir de fêmeas partenogenéticas de S.
ophidiae apresentaram aproximadamente 350 pares de base (Figura 6).
FIGURA 6. Fotografia do gel de agarose a 2% dos produtos amplificados pela PCR com o
uso dos oligonucleotídeos SSUA e SSU22R (Dorris et al. 2002) de DNA
extraído de um pool de 10 fêmeas partenogenéticas de Strongyloides
venezuelensis e pool de 8 fêmeas partenogenéticas de Strongyloides ophidiae.
Poço 1, marcador de tamanho molecular 100 pares de base (pb) (GE
Healthcare Bucs, UK). Poços 2 e 3 (repetições), banda de amplificação de 350
pb a partir de amostras de DNA de S. venezuelensis. Poço 4 e 5 (repetições),
banda de amplificação de 350 pb a partir de amostras de DNA de S. ophidiae.
Poço 6, reação contendo reagentes, sem adição de DNA.
1 2 3 4 5 6
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 40
5.4.2. Seqüenciamento.
A comparação entre espécie estudada com as seqüências de outras espécies
de Strongyloides disponíveis no Genbank demonstrou diferenças em alguns
nucleotídeos do fragmento seqüenciado (assinalado com asteriscos) (Figura 7).
CLUSTAL X (1.81) multiple sequence alignment
S. stercoralis TTTAAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. fuelleborni TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S.sp. ex snake TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. procyonis TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. f. kellyi TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. papillosus p TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. cebus TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. venezuelensis TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. suis TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S. ratti TATTAAACATGAAACCCCAGAAAGCTCATWATVACAGCTATAGACTACACNGDTAAATAT
S. westeri TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
S.ophidiae TTTTAAACATGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
ParastrongyloidesTATCATACGTGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAGACTACACGGT-AAATAT
Rhabditophanes ACGTTCACGTGAAACCGCGGAAAGCTCATTATAACAGCTATAATTTACACGGC-AAATTC
Rhabdias bufonis ATTTTATGGTTAAACTGCGAACGGCTCATTACAACAGCAATAATCAGCATG---AAGTTT
* **** * * ****** * ***** *** ** ** *
S. stercoralis TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTATTTATACCACATTAGTG
S. fuelleborni TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTATTTATACCACATTAGTG
S. sp. ex snake TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTATTTATACCACATTAGTG
S. procyonis TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTATTTATACCACATTAGTG
S. f. kellyi TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. papillosus p TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. cebus TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. venezuelensis TTTAGTNGGATAACCGATGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. suis GTTAGTAGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. ratti TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. westeri TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTTTTATACCACATTAGTG
S. ophidiae TTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTACCTATACCACATTAGTG
ParastrongyloidesTTTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCTTCATAAGCCACATTCGTG
Rhabditophanes CCTAGTTGGATAACTGAGGTAATTCTTGAGCTAATACACGCAATCTAAGCCACATCCGTG
Rhabdias bufonis TCCTTATGGATACTTGCAGTAATTCTGGAGMTMATACACGTGTGACCTTCGGGTTCATTT
***** * ******** *** * ******* * * *
S. stercoralis GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTTTATATTGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
S. fuelleborni
GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTTTATATTGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
S. sp. ex snake GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTTTATATTGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
S. procyonis GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT-ATATTGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
S. f. kellyi GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--TTTCGGTTGACTCAAAATATCCTTGCTGATT--
S. papillosus p GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--TTTCGGTTGACTCAAAATATCCTTGCTGATT--
S. cebus GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--TTTCGGTTGACTCAAAATATCCTTGCTGATT--
S. venezuelensis GTGCGTGGATTTGATGAAACCATTT--TTTCGGTTGACTCAAAATATCCTTGCTGATT--
S. suis GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--TTTCGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
S. ratti GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--TTTCGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
S. westeri GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--TATTGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
s. ophidiae GTGCGTTTATTTGATTAAACCATTT--GTCTGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
ParastrongyloidesGTGCGTTTATTTGATTAAACCAAAT---AATGGTTGACTCAAAATATCCTCGCTGATT--
Rhabditophanes GTGCGTTTATTTGATTAAACTAGAA---ATTGGTTGACTCAAAATATCTTTGCTGAAC--
Rhabdias bufonis TTTAGATTCACTAACCGGGATACCGTTGAGTGAT-GACTCTGATTA-CCTTGCAGACCGC
* * * * * * * ***** * ** * * ** **
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 41
S. stercoralis ---TTGTTACTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. fuelleborni ---TTGTTACTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. sp. ex snake ---TTGTTACTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. procyonis ---TTGTTACTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. f. kellyi ---TTGTTATTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. papillosus p ---TTGTTATTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. cebus ---TTGTTATTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. venezuelensis ---TTGGTATTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. suis ---TTGTTATTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. ratti ---TTGTTACTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. westeri ---TTATTATTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
S. ophidiae ---TTGTTACTAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGGTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
Parastrongyloides---TT--TAACAAAAC-ATACCGTATGTGTATCTGCTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
Rhabditophanes ---TACTCACGTAGTC-ATGCCGTATAAGTATCTGCTTTATCAACTTTCGATGGTAGGGT
Rhabdias bufonis ATGCTTTCGCAGCGGCGATTCATTCTGATTGACTGTCCTATCAACTTGC--TAGTAGAGT
* ** * * * * *** ********* * * **** **
S. stercoralis ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. fuelleborni ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. sp. ex snake ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. procyonis ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. f. kellyi ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. papillosus p ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. cebus ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. venezuelensis ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGATAGGGAG
S. suis ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. ratti ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTTGACTCCGGAGAGGGAG
S. westeri ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
S. ophidiae ATTGGCCTACCATGGTTGTGACGGATAACGGAGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
ParastrongyloidesATTGGCCTACCATGGTGTTGACGGATAACGGGGAATTAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
Rhabditophanes
ATTGGCCTACCATGGTGTTGACGGATAACGGAGAATCAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAG
Rhabdias bufonis AGTGGTCTACTAGGGTGATTACGGGTRACGGAGRATTAGGGTTYGAYTCCGGARARGRWG
* *** **** * *** * **** * **** * ** ****** ** ****** * * *
S. stercoralis CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. fuelleborni CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. sp. ex snake CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. procyonis CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. f. kellyi CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. papillosus p CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. cebus CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. venezuelensis CCTGATAAACGGCT-CCACATCCAAGGAANGC
S. suis CCTGAGAAACGGCTACCAAATCCAAGGAAGGC
S.ratti CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. westeri CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
S. ophidiae CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
ParastrongyloidesCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
Rhabditophanes CCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGC
Rhabdias bufonis CCTKAGARACGGCWRCYACATCCAAGGAAGGC
*** * * ***** * * ********** **
FIGURA 7. Alinhamento múltiplo das seqüências realizado pelo programa CLUSTAL X
(1.81). Os sítios polimórficos são evidenciados pela ausência do símbolo ( * ). Os
símbolos ( - ) representam a ausência de nucleotídeos (gaps).
Karina Rodrigues dos Santos Resultados 42
5.4.3. Análise filogenética.
As seqüências de nucleotídeos isoladas desse nematódeo parasita de O.
guibei (Genbank com número de acesso EU287935) apresentou 98% de identidade
com Strongyloides procyonis (Genbank AB272234.1 e AB205054.1) e 97%
identidade com Strongyloides cebus, Strongyloides stercoralis, Strongyloides sp. “ex
snake” e Strongyloides fuelleborni (Genbank AB277236.1, AF279916.2, AJ417031.1
e AJ407030.1, respectivamente).
A análise da relação filogenética entre as espécies da família Strongyloididae
e Rhabdiasidae demonstrou que embora apresente similaridade acima de 97% com
outras espécies S. ophidiae foi alocado em um braço isolado da árvore filogenética
(Figura 8).
Strongyloides cebus
Strongyloides venezuelensis
Strongyloides papillosus
Strongyloides fuelleborni kellyi
Strongyloides suis
Strongyloides ratti
Strongyloides westeri
Strongyloides stercoralis
Strongyloides fuelleborni fuelleborni
Strongyloides sp. ex snake
Strongyloides procyonis
Strongyloides ophidiae
Parastrongyloides trichosuri
Rhabditophanes sp. Kr3021
Rhabdias bufonis
99
66
69
62
60
99
54
80
0.05
FIGURA 8. Relação Filogenética da família Strongyloididae comparada com a família
Rhabdiasidae.
Karina Rodrigues dos Santos Discussão 44
6. DISCUSSÃO
Existem poucos relatos sobre a ocorrência de espécies do gênero
Strongyloides parasitas de serpentes. Até o momento, apenas quatro espécies:
foram descritas S. ophidae (PEREIRA, 1929), S. mirzai (SINGH, 1954), S. serpentis
(LITTLE, 1966b) e S. gulae (LITTLE, 1966b).
S. ophidiae, parasita de intestino de M. bifossatus, foi a única espécie descrita
no Brasil, e mesmo assim, com base exclusivamente em fêmeas partenogenéticas
(PEREIRA, 1929). Nenhum outro estudo foi realizado para a caracterização dessa
espécie. Sendo assim, o presente trabalho vem contribuir para a caracterização
morfológica e molecular de S. ophidiae, principalmente pelas descrições das formas
de vida livre, ainda não descritas para a espécie, como também pelos aspectos
moleculares abordados no estudo.
Nas fêmeas partenogenéticas recuperadas de O. guibei o ovário apresentou-
se espiralado em relação ao intestino, tanto anteriormente como posteriormente.
Essa característica é semelhante aos achados de Little (1966b), no qual a espécie
S. serpentis, estudada por esse autor, também apresentou um ovário duas vezes
espiralado anteriormente e parcialmente espiralado posteriormente. Essa morfologia
também se assemelha às das fêmeas parasitas descritas por Pereira (1929),
denominada de S. ophidiae. A fêmea parasita de S. mirzai descrita por Singh (1954)
diferiu das fêmeas deste estudo,bem como de S. ophidiae (PEREIRA, 1929), de S.
serpentis (LITTLE, 1966b) e de S. gulae (LITTLE, 1966b), por apresentar ovário
espiralado ao redor do intestino, com três voltas anteriormente e uma volta
posteriormente.
Com relação à morfometria das fêmeas partenogenéticas, S. ophidiae
apresentou comprimento e largura do corpo, comprimento do esôfago total e
distância entre o ânus e a extremidade posterior maiores do que as espécies S.
serpentis e S. gulae. A única variável em que estes nematódeos se assemelharam
foi a distância entre a vulva e a extremidade posterior. Com relação aos ovos no
interior do útero de S. ophidiae apresentaram comprimento semelhante aos dos
ovos de S. serpentis e S. gulae. Por outro lado, as larguras dos ovos de S. serpentis
e S. gulae, foram menores que as de S. ophidiae. Estes aspectos demonstram
Karina Rodrigues dos Santos Discussão 45
claramente a identidade de S. ophidiae, baseadas nas suas características
morfológicas e morfométricas.
Neste trabalho duas serpentes que se encontravam parasitadas por S.
ophidiae eliminaram nas fezes ovos contendo larva de primeiro estádio, e segundo
Little (1966a,b), o tipo de estádio de desenvolvimento eliminado nas fezes é um
importante fator na identificação da espécie, o que permite concluir que este seja o
padrão de eliminação de ovos por S. ophidiae, já que as fezes foram coletadas
diretamente do hospedeiro e imediatamente analisadas. As medidas dos ovos
apresentaram-se ligeiramente maiores que as medidas encontradas no trabalho de
Pereira (1929) e apresentaram-se muito semelhantes aos valores encontrados por
Rossellini et al. (2004) que relataram a presença de S. ophidiae nas serpentes C.
durissus terrificus e P. olfersii. Não há descrição na literatura de medidas de ovos
para as demais espécies de Strongyloides de serpentes.
Com relação às larvas de primeiro estádio, as características de esôfago
rabditóide e comprimento e largura do corpo encontrados neste trabalho são muito
semelhantes às descrições realizadas para o gênero Strongyloides. Este estudo
relata pela primeira vez a descrição de larvas de primeiro estádio em serpentes.
Little (1966a,b) e Vieira et al. (2006) destacam a presença do primórdio genital neste
estádio larval, foi observado em poucas larvas no presente estudo.
As larvas de segundo estádio, assim como as de primeiro estádio, não
apresentaram morfologia e morfometria distintas do gênero Strongyloides, não
havendo também relatos deste estádio em espécies parasitas de serpentes.
As larvas de terceiro estádio apresentaram comprimento e largura do corpo,
comprimento do esôfago e cauda maiores que as encontradas nas serpentes
estudadas por Little (1996b). A morfologia e morfometria das L3 encontradas não
contribuíram para a confirmação da espécie de S. ophidiae por não haver estudos
sobre esse estádio para esta espécie e por estas apresentarem características e
dados morfométricos semelhantes às descritas para as outras espécies. Segundo
Vieira et al. (2006) as L3 das diferentes espécies de Strongyloides podem
apresentar diferenças entre si de comprimento total do corpo, mas esses autores
acreditam que esta diferença não seja suficiente para a determinação da espécie.
Karina Rodrigues dos Santos Discussão 46
Nas fêmeas de vida livre, a forma do útero e a disposição dos ovos em uma
única fileira se assemelharam às descritas por Little (1966b) para S. serpentis, mas
que também são indistinguíveis das características de S. gulae. Portanto, essa
forma evolutiva também tem pouca contribuição para a identificação das espécies.
Apenas um macho de vida livre foi encontrado nas coproculturas, mas este
apresentou a morfologia do espículo diferente das descrições da literatura para S.
serpentis (LITTLE, 1966b), assemelhando-se a descrição realizada para as outras
espécies de Strongyloides, e os dados morfométricos apresentaram-se próximos
aos encontrados em S. cruzi (RODRIGUES, 1968; VICENTE et al., 1993).
Tomados em conjunto, os dados morfológicos e morfométricos obtidos no
presente estudo, principalmente das formas de vida livre, vêm acrescentar
informações que contribuem sobremaneira para a caracterização de S. ophidiae.
Em relação à caracterização molecular, o único relato envolvendo
Strongyloides em serpentes foi realizado por Dorris et al. (2002). Na PCR, o padrão
de banda (350 pb) encontrado foi semelhante aos encontrados para os
Strongyloides de serpentes estudadas por Dorris et al. (2002). Adicionalmente, no
seqüenciamento do amplificado de amostras deste nematódeo, foi observado uma
identidade de 97% entre S. ophidiae e Strongyloides sp. coletado de serpente.
Todavia na árvore filogenética, essas duas espécies foram alocadas em ramos
diferentes, destacando-se assim as diferenças genéticas entre elas.
Strongyloides ophidiae apresentou maior identidade genética (98%) com S.
procyonis, parasita de Procyon lotor (SATO et al., 2006). Apesar da proximidade
genética entre essas duas espécies, morfologicamente estas apresentaram
diferenças na forma do ovário. Strongyloides procyonis difere de S. ophidiae por
apresentar o ovário liso e reto. A região genômica utilizada neste estudo é muito
conservada por isso as espécies do gênero apresentam identidades muito próximas,
mas essa pequena diferença já indica que a espécie em questão é diferente das
anteriormente estudadas através De estudos moleculares. O presente estudo
representa a primeira caracterização molecular de S. ophidiae, que somado às
características morfológicas das formas parasitas e de vida-livre aqui descritas
contribuem para a caracterização da espécie.
Karina Rodrigues dos Santos Discussão 47
Neste estudo apenas quatro exemplares de serpentes, das espécies O.
guibei, S. mikani, Thamnodynastes sp. e C. durissus terrificus, estavam parasitadas
por S. ophidiae, indicando que a prevalência desta infecção na população de
serpentes da região de Botucatu, São Paulo, é muito baixa (3,2%). Este é o único
estudo realizado até o presente momento sobre prevalência deste nematódeo em
serpentes. Os trabalhos da literatura se restringem ao relato de ocorrência no Brasil,
tanto na descrição espécie (PEREIRA, 1929) como no relato de Rossellini et al.
(2004), parasitando dois novos hospedeiros, as serpentes: C. durissus terrificus e P.
olfersii.
Na Índia, Mirza (1935) encontrou serpentes Ptyas mucosus, parasitadas por
S. mirzai, e relatou a ocorrência de infecções baixas (de 10 a 15 exemplares em um
único hospedeiro) e altas (de 100 a 125 espécimes por hospedeiro) (SINGH, 1954).
Little (1966) realizou estudos morfológicos de S. gulae e S. serpentis encontrados
em Natrix cyclopion cyclopion, N. taxispilota taxispilota, Agkitrodon piscivorus
leucostoma, A. contortrix contortrix, Coluber constrictor flaviventris, Lampropeltis
getulis holbrooki e Heterodon platyrhinos platyrhinos, mas não relata sua prevalência
nesses animais. Holt et al. (1979) reportaram três casos de infecção pelo nematódeo
Strongyloides sp. em serpentes, Python reticulatus, Elaphe obsoleta quadrivittata e
Elaphe obsoleta obsoleta. O relato de Holt et al. (1979) foi baseado em achados de
ovos e larvas de Strongyloides nas fezes destas serpentes, e em dados
histopatológicos do intestino delgado, pulmões e pâncreas.
Dos diferentes substratos testados, aquele que favoreceu a maior
recuperação de larvas foi o carvão ativado em grãos, mas a maior parte das
coproculturas deste estudo foi realizada em papel de filtro, devido à escassez do
carvão ativado em grãos. Além dos diferentes tipos de substratos, foram testadas
diferentes temperaturas, para cada substrato. Os melhores resultados foram obtidos
com a temperatura ambiente para fezes eqüinas esterilizadas e xaxim autoclavado.
No caso da cultura com carvão, a temperatura de 27º C e 80% de umidade propiciou
os melhores resultados. O método do papel de filtro forneceu resultados satisfatórios
nas duas condições de temperatura. Não foi possível chegar à identificação de
alguns ovos ou larvas encontrados nos exames coproparasitológicos, pois os
Karina Rodrigues dos Santos Discussão 48
resultados das coproculturas foram negativos. Além disso, algumas coproculturas
resultaram em pequenas quantidades de larvas.
Além de S. ophidiae os animais encontravam-se parasitados por outros
helmintos e protozoários, sendo Rhabdias spp. (22,4%) o parasita mais encontrado,
corroborando com outros trabalhos como o de Silva et al. (2001), que estudando a
freqüência de nematódeos em 24 exemplares de serpentes C. durissus terrificus no
cativeiro, encontraram parasitas no estômago (16,7%), intestino (12,5%) e pulmão
(70,8%). A prevalência de Rhabdias spp. em serpentes C. durissus terrificus
procedentes da região foi de 44%. (SILVA et al., 2008). Araujo et al. (1999) ao
necropsiarem alguns espécimes C. durissus terrificus e Bothrops alternatus,
mantidas em cativeiro, encontraram helmintos dos gêneros Rhabdias. Grego (2000)
estudou 138 ofídios da espécie B. jararaca, provenientes de várias cidades do
Estado de São Paulo e identificou diversos parasitas e dentre eles o nematódeo da
espécie Rhabdias vellardi na porcentagem de 34%. Dias et al.(2004), encontraram
prevalência de 33,3% de Rhabdias labiata em C. durissus terrificus. Santos et al.
(2006) relataram prevalência de 31,6% de Rhabidas spp. em serpentes da espécie
C. durissus terrificus. Assim como em outros estudos, dentre os helmintos que
parasitam serpentes, tem sido observada uma alta prevalência de nematódeos do
gênero Rhabdias.
Kalicephalus sp. foi encontrada neste estudo em Philodryas patagoniensis
(0,8%). Vicente et al. (1993) relataram a presença de Kalicephalus spp. infectando
inúmeras espécies de serpentes das famílias Boidae, Colubridae e Viperidae,
demonstrando que este também é um parasita muito comum em serpentes. Este
nematódeo foi relatado no trabalho de Araújo et al. (1999) e no estudo realizado por
Grego (2000), que encontrou 27,5% das serpentes B. jararaca, parasitadas por K.
costatus e K. inermis. Em C. durissus terrificus, foi observado prevalência de 58,3%
de K. inermis inermis e 33,3% de K. costatus inermis (Dias et al., 2004) e também de
5,3% por Kalicephalus spp (Santos et al., 2006).
Trichomonas sp. foi encontrada parasitando seis exemplares de serpentes:
duas B. constrictor amarali, E. occipitalis, O. guibei, W. merremi e C. durissus
terrificus, com prevalência de 4,8%. Este protozoário foi descrito pela primeira vez no
Brasil por Vilela et al. (2003) em intestino de B. jararaca. Neste mesmo trabalho são
Karina Rodrigues dos Santos Discussão 49
citadas ocorrências de tricomonídeos em Eunectes murinus e outras serpentes da
África e Índia.
Cyclospora sp. também foi encontrada neste trabalho numa porcentagem de
1,6%. Este protozoário foi anteriormente relatado em serpentes Coluber scalaris,
Coronella austriaca, Natrix viperinus, Vipera aspis, Natrix natrix, Natrix stolata e Ninia
sebaeI. No Brasil foi descrita a espécie de C. schneideri na serpente Anylius scytale
scytale (LAISON, 2005).
Haplometroides buccicola foi encontrada numa porcentagem de 0,8% em P.
lativitatus. Este trematódeo foi descrito a partir de exemplares coletados em Micrurus
sp. no Paraguai (ODHNER, 1911 apud SILVA et al. 2007). Posteriormente, foram
relatados em Epicrates cenchria crassus, Micrurus frontalis, Leptotyphlops koppesi,
Phalotris lativittatus (SILVA et al., 2007) e Micrurus corallinus (SANTOS et al., 2008).
A literatura sobre helminto de serpentes brasileiras é rica, porem há ainda
muito que se conhecer visto que a maioria das espécies de ofídios brasileiros não
foram estudados. Este estudo demonstrou a presença de vários parasitas nas
serpentes avaliadas. Ressaltando que para S. ophidiae, não se conhecia nenhuma
informação sobre sua prevalência, que os nossos achados demonstraram ser muito
baixa e sugerem que novos estudos devam ser conduzidos para o melhor
conhecimento da fauna parasitária de serpentes.
Karina Rodrigues dos Santos Conclusão 51
6. CONCLUSÕES
De acordo com a metodologia proposta e a forma de análise empregada para
a caracterização morfológica e molecular de S. ophidiae (Nematoda,
Strongyloididae) parasita de serpentes no Brasil é possível concluir que:
1. As características morfológicas das formas de vida livre vêm acrescentar
informações que contribuem sobremaneira para a caracterização de S.
ophidiae.
2. Os diferentes aspectos morfológicos e morfométricos da fêmea
partenogenética demonstram claramente a identidade de S. ophidiae.
3. S. ophidiae apresenta característica molecular que o diferiu das demais
espécies de parasitas de serpentes.
Karina Rodrigues dos Santos Referências Bibliográficas 53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
.
1. ALFIERI, F. Intorno allá genesi della “Anguillula intestinalis” della rana. Giorn.
R. Accad. Med. Torino., v.14; p.265-267, 1908.
2. ARAÚJO, T.; MORO, L; LÚCIA, M; GOLLOUBEFF, B; VASCONCELOS, A.C.
Ocorrência de alguns endo e ectoparasitos no serpentário da UNIFENAS -
Universidade de Alfenas - MG. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.36, p.19-22,
1999.
3. BAKER, M.R. Nematode Parasitism in amphibians and reptiles. Can. J. Zool.,
v.6, p.747-757, 1983.
4. BAVAY, A. Sur l’anguillule intestinale (Anguillula intestinalis), nouveau ver
nematóide trouvé par le Dr. Normand chez lês malades atteints de diarrehée
de Cochincnhine. Compt. Rend. Sci. Biol., v.84, p.266-268, 1877.
5. BAYLIS, H.A. Report on a colletion of parasitc nematodes, mainly from Egypt.
Part III. Camallinidae, etc. with a note on Prostmayria and an appendix on
Acanthocephala. Parasitol., v.15, p.24-38, 1923.
6. BORGES, R.C. Serpentes peçonhentas brasileiras: manual de identificação,
prevenção e procedimentos em casos de acidentes. São Paulo, 1999.
7. DIAS, R. J. P.; ALMEIDA, S. J. B.; PRIETO, D. B.; LIMA, S. S. Aspectos
ecológicos dos nematóides parasitos de Crotalus durissus terrificus Laurenti,
1768 (Ophidia, Viperidae),em Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil. Rev. bras.
Zoociências, v.6, n.2, p.231-235, 2004.
8. DORRIS, M.; BLAXTER, M. The small subunit ribosomal RNA sequence of
Strongyloides stercoralis. Intern. J. Parasitol., v.30, p.939-941, 2000.
9. DORRIS, M.; VINEY, E. M.; BLAXTER, L. M.; Molecular phylogenetic analysis
of the genus Strongyloides and related nematodes. Intern. J. Parasitol., v.32,
p.1507-1517, 2002.
1
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação
- Referências – Elaboração. Rio de Janeiro, 2002. 24p.
BIOSIS. Serial sources for the BIOSIS preview database. Philadelphia, 1996. 468p.
Karina Rodrigues dos Santos Referências Bibliográficas 54
10. GRASSI, G.B. L’Anguillula intestinalis. Nota preventiva. Gazz. Med. Ital.
Lomb., v.5, p.471-474, 1878.
11. GREGO, K.F. Patologia comparada das principais infecções parasitárias
acometendo as serpentes da espécie Bothrops jararaca (Wied,1824). 2000.
155f. Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental e Comparada) –
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo,
São Paulo.
12. GROVE, D. I. Strongyloidiasis: A major roundworm infection in man.
London, New York, Philadelphia: Taylor & Francis. 1989. 336p.
13. HOFFMANN, R.P. Diagnóstico de parasitismo veterinário. Porto Alegre:
Sulina, p.33-39, 1987.
14. HARVEY, S.C.; VINEY, M.E.; Sex Determination in the Parasitic Nematode
Strongyloides ratti. Gen. Soc. Am., v.158, p.1527-1533, 2001.
15. HOLT, P.E.; COOPER, J.E.; NEEDHAM, J.R. Strongyloides infection in
snakes: three case reports. Vet. Rec., v.10, p.213-214, 1979.
16. KLINGENBERG, R. J. Understanding reptiles parasites. Califórnia:
Advanced Vivarium Systems, 1993. 83p.
17. KLINGENBERG, R. J. Reptilian parasite testing. In: FUDGE, A. M.
Laboratory medicine avian and exotic pets. Philadelphia: W.B.Saunders,
2000. p.486.
18. KUMAR, S.; TAMURA, K.; JAKOBSEN; I.B.; NEI. M. MEGA 2: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics., v.17, n.12,
p.1244-1245, 2001.
19. LAISON, R. The genus Cyclospora (Apicomplexa: Eimeriidae), with a
description of Cyclospora schneideri n. sp. in the snake Anilius scytale scytale
(Aniliidae) from Amazonian Brasil- A Review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz.,
v.100, n.2, p.103-110, 2005.
20. LANE, T. M.; MADER, D. R. Parasitology. In: MADER, M. R. Reptile
medicine and surgery. Philadelphia: W. B. Saunders Co., p.277-281, 1996.
Karina Rodrigues dos Santos Referências Bibliográficas 55
21. LITTLE, M.D. Comparative Morphology of six species of Strongyloides
(Nematoda) and redefinition of the genus. J. Parasitol.,v.52, n.52, p.69-84,
1966a.
22. LITTLE, M.D. Seven New Species of Strongyloides (Nematoda) From
Lousiana. J. Parasitol., v.52, n.52, p.85-97, 1966b.
23. LOSS, A. The anatomy and life history of Agchylostoma duodenale Dub. A
monograph. Part II. The development in the free state. Rec. Egypt. Govt.
School Med., v.4, p.159-613, 1911.
24. MADER, M. R. Reptile medicine and surgery. Philadelphia: W. B. Saunders
Co., p.277-281, 1996.
25. MIRZA, M.B.; SINGH, S.N. “Strongyloides akbari n. sp. A new nematode
parasite from Crocidura coerula, with a note on some species of the genus
Strongyloides”. Proc. Indian Acad. Sci., v.2, p.503-507, 1935.
26. NEVES, D.P.; MELO, A.L.; GENARO, O.; LINARDI, P.M. Parasitoses
emergentes. Parasitologia Humana. Rio de Janeiro: Atheneu, 2005.
27. PEREIRA, C. Strongyloides ophidiae. Bol. Biol., v.15, p.16-17, 1929.
28. REY, L. Parasitologia. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 856p.
29. RODRIGUES, O.H. Sobre nova espécie do gênero Strongyloides Grassi,
1879 (Nematoda, Rhabdiasoidea). Atas Soc. Biol., v.12, p.31-32, 1968.
30. ROSSELLINI, M.; SANTOS, K. R.; BARELLA, T. H.; SILVA, R. J. Ocorrência
de Strongyloides ophidiae (Nematoda, Strongyloididae) em Crotalus durissus
terrificus (Serpente, Viperidae) e Philodryas olfersii (Serpentes, Colubridae). In:
VII Semana da Bio, realizada no Instituto de Biociências da Unesp de
Botucatu, Proceedings…Botucatu: São Paulo, 2004.
31. SANTOS, K. R.; BARRELLA, T. H.; SILVA, R. J. Freqüência de
Endoparasitoses em Serpentes Crotalus durissus terrificus (Serpentes,
Viperidae) In: 14
◦
Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & 2
◦
Simpósio Latino-Americano de Rickettsioses. Proceedings... Ribeirão Preto,
2006. p.390.
32. SANTOS, K. R., BARRELLA, T. H., ZICA, E. O. P., SILVA, R. J. New Reports
on the parasitism by Haplometroides buccicola (Digenea, Plagiorchiidae) in
Karina Rodrigues dos Santos Referências Bibliográficas 56
snakes from Brazil. J. Venom. Anim. Toxins. Incl. Trop. Dis., v.60, n.2, 2008.
In press.
33. SATO, H.; SAUZUKI, K.; OSANAI, A.; KAMYIA, H.; FURUOKA, H.
Indentification and characterization of the threadworm, Strongyloides
procyonis, from feral raccoons (Procyon lotor) in Japan. J. Parasitol., v.92,
p.63-68, 2006.
34. SILVA, R.J. As serpentes. Jaboticabal: Funep, 2000. 141p.
35. SILVA, R.J.; BARELLA, T.H.; NOGUEIRA, M.F.; O’DWYER, L.H. Frequency
of Helminths in Crotalus durissus terrificus (Serpentes, Viperidae) in captivity.
Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.10, n. 2, p.91-93, 2001.
36. SILVA, R.J.; FERREIRA, V.L.; STRÜSSMAN, C. New species of
Haplometroides (Digenea: Plagiorchidae) from Phalotris nasutus
(Gomes,1915) (Serpentes, Colubridae). J. Parasitol., v.93, n.4, p.917-921,
2007.
37. SILVA, R.J.; Frequency of rhabdiasid nematodes in wild Crotalus durissus
terrificus (serpentes, viperidae) from Botucatu region, São Paulo state, Brazil.
J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis., v.13, n.1 p.122-129, 2008.
38. SINGH, S.N. Studies on The Morphology and Life-History of Strongyloides
mirzai n.sp. from Snakes in India. J. Helminth., v. 28, n.1/2, p.25-34, 1954.
39. THOMPSON, J.D.; GIBSON, T.J.; PLEWNIAK, F.; JEANMOUGIN, F.;
HIGGINS, D.C. CLUSTRAL X: windows interface: flexible strategies for
multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Acids Res., v.24,
p.4876-4882, 1997.
40. VICENTE, J. J.; RODRIGUES, H. O.; GOMES, D. C.; PINTO, R.M.
Nematódeos do Brasil. Parte V: Nematódeos de anfíbios. Rev. Bras. Zool.,
v.7, p.452-683, 1990.
41. VICENTE, J. J.; RODRIGUES, H. O.; GOMES, D. C.; PINTO, R.M.
Nematódeos do Brasil. Nematódeos de répteis. Parte III: Rev. Bras. Zool.,
v.10, p.1-183, 1993.
Karina Rodrigues dos Santos Referências Bibliográficas 57
42. VICENTE, J. J.; RODRIGUES, H. O.; GOMES, D. C.; PINTO, R.M.
Nematódeos do Brasil. Nematódeos de aves. Parte IV: Rev. Bras. Zool., v.12,
p.1-273, 1995.
43. VICENTE, J. J.; RODRIGUES, H. O.; GOMES, D. C.; PINTO, R.M.
Nematódeos do Brasil. Parte V: Nematódeos de mamíferos. Rev. Bras. Zool.,
v.14, n.1, p.1-452, 1997.
44. VIEIRA, F. M.; LIMA, S. S.; BESSA, E.C.A. Morfologia e Biometria de
Strongyloides sp. Grassi, 1879 (Rhabditoidea: Strongyloididae) parasito
gastrointestinal de Hydrochaeris hydrochaeris (Linneus, 1766) (Rodentia:
Hydrochaeridae) no município de Juiz de Fora, Minas gerais. Rev. Bras.
Parasitol. Vet., v.15, n.1, p.7-12, 2006.
45. VILELA, F.C.; SILVA, M.G.; BARRELLA, T.H.; SILVA, R.J. Trichomoniasis in
Bothrops jararaca (Serpentes, Viperidae). J. Venom. Anim. Toxins. Incl.
Trop. Dis., v.9, n.1, p.105-110, 2003.
46. WALLACH, J. D., BOEVER, W. J. Reptiles and amphibians. In:___. Diseases
of exotic animals: medical and surgical management. Philadelphia:
Saunders., p.979-1047, 1983.
MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF Strongyloides
ophidiae (NEMATODA, RHABDIASIDAE).
Karina Rodrigues dos Santos; Bianca Cechetto Carlos; Karina dos Santos Paduan;
Samir Moura Kadri; Thomaz Henrique Barrella; Mônica Regina Vendrame
Amarante; Paulo Eduardo Martins Ribolla; Reinaldo José da Silva
Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, UNESP, Distrito de Rubião Júnior,
Botucatu, São Paulo, Brazil, CEP 18618-000, Phone: +55-14-38116239, Fax: +55-14-
38153744, e-mail: [email protected]
ABSTRACT
The aim of the study is to report morphological data concerning parasitic females, rhabditoid
and filarioid larva, free-living female forms, eggs and a molecular DNA analysis from a pool
of eight Strongyloides ophidiae parasitic females. These samples were obtained in the small
intestine of Oxyrhopus guibei (Serpentes, Colubridae) collected in Lençóis Paulista city,
State of São Paulo, Brazil. DNA amplification by PCR resulted in a 350 base-pair (bp) band
for samples containing S. ophidae and S. venezuelensis DNA. S. ophidae nucleotide sequence
analysis showed 98% identity with Strongyloides procyonis and 97% with Strongyloides
cebus, Strongyloides stercoralis, Strongyloides fuelleborni and another Strongyloides sp. ex.
snake.
Key-words: Strongyloides ophidiae, Nematode, Oxyrhopus guibei, snakes.
INTRODUCTION
The genus Strongyloides Grassi, 1879 includes 52 nematodes species parasite of
vertebrates. Domestic mammals including cats, dogs and farm animals such as bovine, sheep
and swine are the main host for Strongyloides spp. Few species of Strongyloides have been
reported in amphibians, reptiles and birds (Grove, 1989; Dorris et al., 2002).
In Brazil, Strongyloides ophidiae Pereira, 1929 and Strongyloides cruzi were reported
infecting reptiles. The former was described in a snake Mastigodryas bifossatus Raddi, 1820
(Pereira, 1929) and, the second, in a Hemidactylus mabouia Moreau de Jonnès, 1818, gecko
(Rodrigues, 1968).
Pereira (1929) described S. ophidiae, but only parasitic females and the eggs were
analyzed in the species description. Since then, no other S. ophidiae report was published.
Rhabditoid and filarioid larvae as well as free-living male and female forms of this nematode
were not studied.
Recently, molecular studies have been accomplished for characterization of
Strongyloides spp. (Dorris e Blaxter, 2000; Dorris et al., 2002). However, those studies did
not include snakes Strongyloides species from Brazil.
In the present study are presented morphological and molecular data of S. ophidiae
collected from the Oxyrhopus guibei snake Duméril & Bibron Duméril, 1854.
MATERIAL AND METHODS
Source of nematode materials
The study was performed with one adult female specimen of Oxyrhopus guibei snake
from the municipality of Lençóis Paulista, São Paulo State, Brazil and that was donated to the
Center for the Study of Venous and Venomous Animals of São Paulo State University
(CEVAP/UNESP), Botucatu, São Paulo State, Brazil.
Parasitological exams
Parasitological exams revealed the presence of embrionated eggs and their
morphology was characteristic to the genus Strongyloides. Additionally, snake feces culture
was accomplished in order to obtain the L3 larvae to confirm the Strongyloides presence.
Snake feces samples were cultivated in sterilized paper filter on petri dish and maintained in
incubator at 25
o
C and 80% humidity, during seven days, to obtain L1, L2, L3 stages and also
free-living female forms (Hoffmann, 1987).
Parasitic females, eggs, rhabditoid and filarioid larvae, and free-living forms were
analyzed in an image analysis computerized system (Qwin Lite 3.1, Leica Microsystems,
Wetzlar, Germany). The voucher specimens were deposited in the Coleção Helmintológica de
Referência (CHIBB) in Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, at
Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu city, São Paulo state, Brazil.
DNA extraction, polimerase chain reaction (PCR)
DNA samples were extracted from a pool of eight Strongyloides ophidiae parasitic
females and a pool of ten Strongyloides venezuelensis parasitic females fixed in 70% ethanol,
using kit Quiamp (QIAGEN, GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacter’s
instructions. Samples were eluted in 100 µl of TE buffer and 2 µl were used for PCR
amplification.
A SSU rDNA gene segment was amplified by PCR using SSUAF primer (5’- AAA
GAT TAA GCC ATG CAT G -3’) and SSU22R primer (5’-GCC TGCTGC CTT CCT TGG
A-3’) according to Dorris et al. (2002). Amplification was carried out in a 10 μl reaction, 10
mM Tris-HCl 1.5 mM MgCl
2
, 50 mM KCl, pH 8.3, 100 μM each dNTP, 0.2 μM of each
primer and 0.5 U of Taq DNA polymerase (GE Healthcare, Bucks, U.K.)
PCR reactions were performed on My cycler Thermal Cycler Bio-Rad
®
(T Gradient)
and were conducted by 35 cycles (30 s at 95
o
C, 30 s at 58,1
o
C and 30 s at 72
o
C) preceded by
95
o
C for 5 min and followed by a 7 min at 72
o
C. PCR products were visualized by ethidium
bromide (0.5 μl/ml) staining after electrophoresis in a 2% agarose gel using a horizontal cube
Hoefer HE 99 (GE Healthcare, Bucks, U.K.) in solution of TAE 1X (Tris base 0.4 M; acetic
acid 0.20 M and EDTA 0.5 M solution, pH 8.0).
DNA Sequencing
PCR primers and dNTPs were removed before sequencing: 5 μl of PCR products was
incubated with 1 μl of ExoSapIT (GE Healthcare, Bucks, U.K.) for 45 min at 37°C, followed
by 20 min at 80°C for enzyme inactivation. Amplified fragments were sequenced in both
forward and reverse direction by using ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction
kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), according to the manufacter’s instructions. For
each sequencing reaction aproximately 10 ng of purified DNA, was combined with 3.2 pmol
of primer (sense and/or reverse) used in the amplification reaction. Nucleic acid sequence
analysis was performed on an automated Applied Biosystems 377 DNA sequencer.
Nucleic acid sequences analysis was performed using MERGER package software
(http://bioweb.pastuer.fr/seqanal/alignment/intro-uk.html) used for to produce the consensus
sequence of each DNA sample. Sequences were aligned with the CLUSTAL X software,
version 1.81 (Thompson et al. 1997). To obtain a better alignment, both pairwise and multiple
alignments parameters were changed from the default set. Divergences were estimated by the
pairwise alignment using MEGA software (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)
(Kumar et al., 1994). Distance method (Neigbour-joining/NJ) was used in construction of the
phylogenetic tree (Saitou e Nei, 1987). The bootstrap test was applied to estimate the
confidence of branching patterns of the neighbor-joing tree (Felsinstein, 1985).
RESULTS
Morfological characterization of S. ophidiae
The parasitic females (n = 10)
Parasitic females presented slender body, 4700.3 (3524.8-5371.8) μm long and 50.6
(41.2-57.9) μm wide, ending with a conic tail, 105.3 (63.77-123.8) μm long. The anterior
extremity is truncated and presents the stoma, however detail of this structure were not
observed. Oesophagus is long, filariform, 1632.6 (1425.8-1902) μm long. Nerve ring was not
observed. Reproductive system is didelphic and amphidelphic; the distance of the anterior
genital to the oesophagus was 235.1 (102.6-374.1) μm and posterior genital branch to the
posterior extremity was 328.1 (130.4-604) μm. The vulva is located on the mid-ventral of the
body. The distance of vulva to posterior extremity was 2292.5 (1759.4-2620.4). The anterior
ovary presented spiraled twice around intestine and the posterior ovary making a partial
spiral. The posterior ovary extends to almost the anal opening. The uterus is short, containing
a single row of eggs (2 to 5), which measure (n = 57) 51.8 (48.4-54.5) μm long e 32.4 (30.5-
33. 6) μm wide (Figure 1A-C).
Eggs found in feces (n =7)
Eggs found in the feces were lightly smaller than the eggs in the uterus of the parasitic
female. They were elliptic, embryonated and with a thin shell, 44.5 (30.6- 51.03) μm long
and 30.8 (25.55- 39) μm wide (Figure 1D).
First-stage larvae (L1) (n = 20)
First-stage larvae presented total length of 249.1 (211.8-288.1) μm and wide of 12.0
(9.6-14.1) μm. Rhabditiform oesophagus, with body, isthmus, and bulb, with total length of
74.6 (56.1-92.8) μm and an inconspicuous nerve ring involving the isthmus area was
presented. A narrowly tapered tail, with 32.8 (19.4-46.5) μm was observed (Figure 1E).
Second-stage larvae (L2) (n = 20)
These were morphologically similar to the first-stage rhabditoid larvae, however the
body was longer and thinner, 312.1 (226.3-547.2) μm long and 14.4 (10.9-29.0) μm wide.
Oesophagus is still rhabditoid, however more extended and with a less evident division
between bulb and isthmus, 82.4 (40.9-176.8); buccal cavity was less evident than in L1, the
genital primordium was not visible, and also presents a thin tail, 35.9 (12.9-55.7) μm (Figure
1F).
Third-stage filarioid larvae (n = 30)
The infective third-stage larvae was elongated, thinner than second-stage rhabditoid
larvae, and presented 486.4 (421.8-602.8) μm long and 14.9 (11.78-18.7) μm wide, with a
long and filariform oesophagus, with 171.0 (111.8-254) μm long, possessing a thin tail, with
truncated and notched tip, 63.0 (32.3- 103.1) μm long (Figure 1G-H).
Free-living females (n = 10)
Free-living females showed a small body, with 826.1 (711.8-1089.1) μm long and 36.9
(30.2-52.9) μm wide and a thin cuticle with fine transverse striations. Rhabditoid oesophagus
presented a short constriction between the anterior portion and bulb area with 149.3 (116.9-
260.8). Nerve ring was located at posterior end of esophageal isthmus. Reproductive system
was didelphic and amphidelphic, vulva was in the middle of the body, vagina was very short.
The distance between vulva and anterior extremity was 412.7 (345.5-560.9) μm and 389.4
(289.3-448) μm was measured from the vulva to the posterior extremity. The body didn’t
show a constriction behind vulva that had prominent lips; one single row of eggs is found in
the uteri. Eggs were 46.9 (34.15- 51.4) μm long and 29.7 (25.5-38.9) μm wide. The tail
measured 99.8 (93.86-108.7) μm long (Figure 1I).
Free-living males
Free-living males were not found.
Molecular characterization of Strongyloides ophidae.
A 350 base-pair (bp) amplification band was obtained by PCR using two DNA
samples of each species. Lanes 2 and 3 show a 350 bp amplification band from each DNA
sample of S. venezuelensis, and Lanes 4 and 5, the same band using two DNA samples from
Strongyloides ophidiae (Figure 2). The Strongyloides ophidiae nucleotide sequence (Genbank
acession number EU287935) isolated from O. guibei presented 98% identity with
Strongyloides procyonis (Genbank acession number AB272234.1 and AB205054.1) and 97%
identity with Strongyloides cebus, Strongyloides stercoralis, Strongyloides sp. ex snake and
Strongyloides fuelleborni (Genbank acession number AB277236.1, AF279916.2, AJ417031.1
and AJ407030.1, respectively).
The phylogenetic relationship analysis among species of the families Strongyloididae
and Rhabdiasidae families demonstrated S. ophidiae was allocated in an isolated branch of the
phylogenetic tree, although have presented 97 to 98 % similarity relationship with several
species (Figure 3).
DISCUSSION
There are few reports on the occurrence of Strongyloides spp. infecting snakes and
until now only four species, S. ophidae (Pereira, 1929), S. mirzai (Singh, 1954), S. serpentis
(Little, 1966) and S. gulae (Little, 1966) were described.
Strongyloides ophidiae was described in the intestine of a M. bifossatus snake from
Brazil, but just the parasitic females were analyzed for the species description (Pereira, 1929).
No other studies were accomplished with Strongyloides spp. from Brazilian snakes. The
present work contributes to morphological characterization of S. ophidiae, mainly with free-
living forms description, as well as to knowledge of this nematode molecular aspects.The
parasitic females recovered from O. guibei presented ovary spiraled around the intestine in the
anterior and posterior regions, as reported for S. serpentis by Little (1966). According to this
author, S. serpentis presents an ovary twice spiraled anteriorly and occasionally making
partial spiral the posterior region. This characteristic also resembled the parasitic females of S.
ophidiae described by Pereira (1929). On the contrary, the parasitic female of S. mirzai
(Singh, 1954) differs of S. ophidiae (Pereira, 1929), S. serpentis (Little, 1966) and S. gulae
(Little, 1966) for presenting ovary with three spirals around the intestine anteriorly and one
spiral posteriorly.
Regarding parasitic females morfometry, S. ophidiae possessed body length and
width, oesophagus length and tail larger than presented in . S. serpentis and S. gulae. The only
reseamblence among these nematodes was the distance between the vulva and posterior
extremity. The eggs into the uterus of S. ophidiae, S. serpentis and S. gulae presented similar
length. On the other hand, the eggs width S. serpentis and S. gulae was smaller than S.
ophidiae`s. These morphological and morphometric data clearly demonstrate the identity of S.
ophidiae.
According to Little (1966), eggs development stage found in feces is an important
factor for species identification. O. guibei feces were collected directly from host and
immediately analyzed. Because all analyzed eggs were cleavage we can conclude that S.
ophidae eggs in feces contain first stage larvae.
Eggs measured in the present study were lightly larger than the ones described by
Pereira (1929) but were very similar to S. ophidiae’s in Crotalus durissus terrificus and
Philodryas olfersii snakes (Rossellini et al., 2004).
The first-stage larvae presented rhabditoid oesophagus and body length and width
were very similar to the descriptions for Strongyloides spp. However, this is the first report of
Strongyloides first-stage larvae in snakes. Little (1966) and Vieira et al. (2006) detach the
importance of the genital primordium characterization in this larvae stage, but this was
observed in a few larvae the present study.
The second-stage rhabditoid larvae as well as the first-stage larvae, did not presented
distinct morphology and morphometry in comparison with Strongyloides spp., but they have
not been previously reported in snakes either.
S. ophidiae third-stage larvae morphology analysis showed that the body length and
width, oesophagus length, and tail length were larger than snakes Strongyloides species’
studied by Little (1966). However, these different morphology and morfometry did not
contribute to the S. ophidiae identification for two reasons: there were no morphological
studies about that larvae stage in this species. The other reason is Strongyloides spp. L3 larvae
can present differences in body length which are not enough for the species identification,
according to Vieira et al. (2006).
In free-living female forms, the uteri morphology and eggs disposition (in a single
row) resembled S. serpentis and S. gulae’s (Little, 1966). Therefore, Strongyloides free-living
female form also brings little contribution to be used to distinguish among species.
Morphological and morfometric data obtained in the present study, concerning mainly
free-living forms, contribute to the better characterization of S. ophidiae, since just the
parasitic female was described (Pereira, 1929).
Molecular data about Strongyloides species were provided exclusively by Dorris et al.
(2002). The amplified 350 bp band presented in this study is similar to that found in
Strongyloides ex. snakes by Dorris (2002), but DNA sequencing analysis showed 97%
identity among S. ophidiae and Strongyloides cebus, Strongyloides stercoralis, Strongyloides
sp. ex snake and Strongyloides fuelleborni. In the neighbor-joining phylogenetic tree
Strongyloides procyonis, Strongyloides stercoralis, Strongyloides sp. ex snake and
Strongyloides fuelleborni were allocated in the same branche. On the other hand S. ophidiae
was allocated in a distinguished branch, reinforcing the genetic differences among them.
Strongyloides ophidiae presented larger genetic identity (98%) with Strongyloides
procyonis from Procyon lotor (raccoon) (Sato et al., 2006). In spite of the genetic proximity
between these species, S. procyonis differs of S. ophidiae for presenting the straight ovaries
(Little, 1966). The genomic region analyzed in this study is very conserved in the genus
Strongyloides that explains the close identity between S. ophidiae and S. procyonis.
This study presents the first molecular analysis in addition with morphological and
morphometric data from parasitic and free-living forms of S. ophidae providing a significant
contribution to the species characterization.
AKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP – Processo 06/50968-8) and Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES).
REFERENCES
DORRIS, M. AND M. BLAXTER. 2000. The small subunit ribosomal RNA sequence of
Strongyloides stercoralis. Internacional Journal for Parasitology 30: 939-941.
DORRIS, M.; E. M. VINEY, AND L. M. BLAXTER. 2002. Molecular phylogenetic analysis
of the genus Strongyloides and related nematodes. Internacional Journal for Parasitology
32: 1507-1517.
FELSENSTEIN, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.
Evolution 39: 783
KUMAR, S. K. TAMURA, I. B. JAKOBSEN AND M. NEI. 2001. MEGA 2: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics 17: 1244-1245.
GROVE, D. I. 1989. Strongyloidiasis: A major roundworm infection in man. Taylor &
Francis, London, New York, Philadelphia, 336p.
HOFFMANN, R.P. 1987. Diagnóstico de parasitismo veterinário. Sulina, Porto Alegre, 33-
39.
LITTLE, M.D. 1966. Seven new species of Strongyloides (Nematoda) from Lousiana. Journal
of Parasitology 52: 85-97.
PEREIRA, C. 1929. Strongyloides ophidiae. Boletim Biológico de São Paulo 15: 16-17.
REY, L. 2001. Parasitologia. 3.ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 856p.
RODRIGUES, O.H. 1968. Sobre nova espécie do gênero Strongyloides Grassi, 1879
(Nematoda, Rhabdiasoidea). Atas Sociedade de Biologia 12:31-32.
ROSSELLINI, M., K. R. SANTOS, T. H. BARELLA AND R. J SILVA. 2004. Ocorrência de
Strongyloides ophidiae (Nematoda, Strongyloididae) em Crotalus durissus terrificus
(Serpente, Viperidae) e Philodryas olfersii (Serpentes, Colubridae). Anais... VII Semana
da Bio, do Instituto de Biociências da Unesp de Botucatu, Botucatu, São Paulo.
SATO, H., K. SAUZUKI, A. OSANAI, H. KAMYIA, AND H. FURUOKA. 2006.
Identification and characterization of the threadworm, Strongyloides procyonis, from
feral raccoons (Procyon lotor) in Japan. The Journal of Parasitology 92: 63-68.
SAITOU, N. AND M. NEI. 1987. The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-425.
SINGH, S.N. 1954. Studies on The Morphology and Life-History of Strongyloides mirzai
n.sp. from snakes in India. Journal of Helminthology 28: 25-34.
THOMPSON, J.D., T.J. GIBSON, F. PLEWNIAK, F. JEANMOUGIN AND D.C. HIGGINS.
1997. CLUSTRAL X: windows interface: flexible strategies for multiple sequence
alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24: 4876-4882.
VIEIRA, F. M., S. S. LIMA AND E.C.A. BESSA. 2006. Morfologia e Biometria de
Strongyloides sp. Grassi, 1879 (Rhabditoidea: Strongyloididae) parasito gastrointestinal
de Hydrochaeris hydrochaeris (Linneus, 1766) (Rodentia: Hydrochaeridae) no município
de Juiz de Fora, Minas gerais. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 15: 7-12.
Figure 1. A-C) Parasitic female of Strongyloides ophidiae: A) detail of the anterior region –
note the oesophagus and ovary spiraled around the intestine, B) detail of the vulva
and eggs, C) detail of the tail – note the ovary partially spiraled around the intestine;
D) egg; E-I) free-living forms – E) L1 rhabditoid larvaee; F) L2 rhabditoid larvaee;
G) L3 filarioid larvaee; H) detail of the tip and truncated tail of L3 filarioid larvaee;
I) free-living female. A,B,C – bar 200 μm; D, E, F, G – bar 30 μm; H– bar 10 μm.
Figure 2. Agarose gel electrophoresis (2%) showing PCR amplification of the SSU rDNA
gene with SSUA and SSU22R primer set (Dorris et al., 2002) using two DNA
samples of each Strongyloides venezuelensis and Strongyloides ophidiae species.
Lane 1, 100 base-pair (bp) marker (GE Healthcare Bucs, UK). Lanes 2 and 3 – 350
bp amplification band from S. venezuelensis DNA samples. Lanes 4 and 5 – 350 bp
amplification band from S. ophidiae DNA samples. Lane 6. Reaction containing
only reagents (without DNA).
Strongyloides cebus
Strongyloides venezuelensis
Strongyloides papillosus
Strongyloides fuelleborni kellyi
Strongyloides suis
Strongyloides ratti
Strongyloides westeri
Strongyloides stercoralis
Strongyloides fuelleborni fuelleborni
Strongyloides sp. ex snake
Strongyloides procyonis
Strongyloides ophidiae
Parastrongyloides trichosuri
Rhabditophanes sp. Kr3021
Rhabdias bufonis
99
66
69
62
60
99
54
80
0.05
Figure 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on Strongyloides rDNA gene.
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