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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
VIVIANE ARAÚJO RAVAGNANI
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DA PLANTA Azadirachta indica
(Neem) SOBRE Streptococcus mutans
BAURU
2006
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2
UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
VIVIANE ARAÚJO RAVAGNANI
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DA PLANTA Azadirachta indica
(Neem) SOBRE Streptococcus mutans
Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-graduação, na Universidade do
Sagrado Coração, como parte integrante dos
requisitos para obtenção do título de Mestre no
Programa de Mestrado em Odontologia.
Área de Concentração: Saúde Coletiva.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vanessa Pardi
BAURU
2006
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Ravagnani, Viviane Araújo
R252a
Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da
planta Azadirachta indica (Neem) sobre Streptococus mutans
/Viviane Araújo Ravagnani--2006.
34f.
Orientadora: Profa Dra. Vanessa Pardi
Dissertação de Mestrado em Odontologia (Saúde
Coletiva)- Universidade do Sagrado Coração - Bauru -
SP.
1.Carie 2.Streptococcus mutans 3.Azadirachta indica
4.Neem 5. Avaliação in vitro I.Pardi, Vanessa II.Título.
4
Pensado no ontem, agradecendo o hoje e
deixando fluir o amanhã é que dedico este
trabalho à minha família.
5
AGRADECIMENTOS
À luz do meu bom DEUS, pela percepção concedida para trilhar os caminhos de
uma pesquisadora, em prol da comunidade.
À minha querida família, pela compreensão, paciência e confiança nestes meses de
pesquisa, trilhando comigo neste árduo caminho.
À credibilidade, desenvoltura da orientadora educacional, Prof.ª Drª. Vanessa Pardi,
por proporcionar-me a visão da Odonto-educação com o mestrado nesta renomada
Instituição de Ensino.
Ao Dr. Edmílson Ambrosano, pela doação dos extratos brutos do Neem.
À Aline Rogéria Freire de Castilho, pela ajuda na realização dos experimentos.
Ao técnico do laboratório de Biologia Molecular, Wilson A. Orcini, pela ajuda durante
a realização dos experimentos.
Aos momentos de dedicação, lealdade, credibilidade, respeito e cooperação dos
demais professores deste Curso.
6
As palavras são apenas anzóis, para
apanhar o que está nas entrelinhas.
Clarice Lispector
7
RESUMO
A cárie dental é uma doença infecciosa de origem bacteriana. Sendo assim, uma
forma de controlar a doença é o controle dos microrganismos que produzem ácidos
a partir da dieta e que levam à dissolução da estrutura dentária. O uso de agentes
antimicrobianos é uma alternativa relevante para controle desses microrganismos.
Atualmente, muito tem sido estudado sobre o uso de produtos naturais como
agentes antimicrobianos em Odontologia. Assim, o objetivo do presente trabalho foi
avaliar a atividade antimicrobiana da planta Azadirachta indica, conhecida
popularmente como Neem, sobre Streptococcus mutans por meio do halo de
inibição, da determinação das concentrações inibitória mínima (CIM) e teste de
aderência utilizando-se extrato etanólico das folhas de Neem. Foi preparada uma
solução 40% de folhas de Neem, previamente moídas, em etanol absoluto, que foi
deixada em agitador magnético por 30 minutos e então armazenada ao abrigo da luz
em estufa 37º C, por uma semana. No dia do experimento, essa solução foi
novamente colocada em agitador magnético por dez minutos e então foi filtrada em
papel de filtro qualitativo. Fez-se a diluição seriada da solução e as seguintes
concentrações finais nos tubos foram obtidas: 3200µg/ml, 1600µg/ml, 800µg/ml,
400µg/ml, 200µg/ml e 100µg/ml. Foi utilizado o microrganismo Streptococcus
mutans UA159. O controle positivo foi a Clorexidina (Periogard), o controle negativo
foi meio de cultura de mais bactérias e fez-se um controle com o solvente etanol
absoluto. Não houve presença de halo de inibição para o extrato testado, assim
como para o etanol absoluto. Verificou-se o crescimento bacteriano em todas as
concentrações testadas e a adesão na superfície do vidro. Concluiu-se, dessa forma,
que o extrato testado não apresentou atividade antimicrobiana nas concentrações
testadas, pois não foi possível verificar a CIM e também não foi capaz de inibir a
aderência bacteriana na superfície de vidro.
Palavras-chave:
cárie dental, Azadirachta indica, Neem.
8
ABSTRACT
Dental caries is an infectious disease caused by bacteria that produce acids from
diet. These acids dissolved the dental structure. The use of antimicrobials agents is
an important alternative of controlling these bacteria. Nowadays, a lot of studies
about natural products used as antimicrobial in Dentistry has been done. In this way,
the aim of the present study was to evaluate the antimicrobial activity of Azadirachta
indica (Neem) on Streptococcus mutans. The following assays were done: zone of
inhibition,
minimum inhibitory concentration (MIC) and adhesion to glass surface. It
was prepared a solution 40% from ground leaves in absolute ethanol. This mixture
was stirred during 30 minutes and in following was kept at 37º C for a week. Before
using the extract, the mixture was stirred for ten minutes and was vacuum-filtered
through a qualitative filter paper. Serial dilution was made and the final
concentrations in tubes were: 3200µg/ml, 1600µg/ml, 800µg/ml, 400µg/ml, 200µg/ml
e 100µg/ml. The microorganism used was Streptococcus mutans UA159.
Clorhexidine (Periogard) was the positive control, Brain Heart infusion (BHI) plus
bacteria and BHI plus absolute ethanol were the negative controls. The ethanolic
extract and the absolute extract were not capable to inhibit the growth in the plates. It
was verified the growth of bacteria in all the tested concentrations and the adhesion
of them in the glass surface. It was concluded that the extract tested did not present
antimicrobial activity in the tested concentrations because it was not possible to verify
the MIC and they did not inhibit the adhesion of Streptococcus mutans to the glass
surface.
Key words: dental caries, Azadirachta indica, Neem.
9
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................. 10
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................ 12
2.1 Cárie dental.................................................................................................12
2.2 Uso de produtos naturais em Odontologia..................................................14
2.3 Neem ..........................................................................................................15
3. OBJETIVO........................................................................................ 19
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 20
4.1 Origem das amostras..................................................................................20
4.2 Obtenção do extrato de Melia azadirachta..................................................20
4.3 Avaliação da atividade antimicrobiana........................................................20
4.4 Teste de halo de inibição ............................................................................21
4.5 Teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM)..........................................21
4.6 Teste da aderência à superfície do vidro ....................................................22
5. RESULTADOS............................................................................... 23
6. DISCUSSÃO .................................................................................. 24
7. CONCLUSÃO................................................................................. 26
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 27
10
1. INTRODUÇÃO
A cárie dental é uma doença infecciosa de origem bacteriana (van
HOUTE, 1994). Os microrganismos formam um biofilme dental patogênico que
produz ácidos que levam à desmineralização do tecido dental (MARSH, 1994).
Sendo assim, uma forma de controlar a doença é o controle dos microrganismos que
produzem ácidos a partir da dieta e que levam à dissolução da estrutura dentária. O
uso de agentes antimicrobianos é uma alternativa relevante para controle desses
microrganismos.
Embora se observe uma queda na prevalência de cárie dentária no Brasil
e em diversos outros países (HOPCRAFT; MORGAN, 2005; van WYK; van WYK,
2004; ABID 2004, BRASIL, 2004), essa doença permanece atingindo boa parte da
população (PAKSHIR, 2004; AUTIO-GOLD; TOMAR, 2005; PITTS et al., 2005),
sendo, então, necessário o desenvolvimento de novos métodos preventivos e
terapêuticos específicos.
Tem sido observado um crescente aumento no uso de produtos naturais
em saúde devido às suas diversas propriedades biológicas. Segundo Husain et al.
(1992, apud PAI et al., 2004) as folhas de Neem têm sido utilizadas para o
tratamento de gengivite e periodontite. Venugopal et al. (1998) avaliaram a
prevalência de cárie dental em Mumbai (Índia) e verificaram que crianças que faziam
uso de Neem apresentavam menos cáries.
O Neem apresenta propriedades: antinflamatória, antiartrite, antipiréticas,
hipoglicêmicas, antiúlcera gástrica, espermicida, antifúngica, antibacteriana,
diurética, antimalária, imunomodulatória e antitumoral (BISWAS et al., 2002). Além
da sua eficácia terapêutica, essa planta já é reconhecida como uma fonte natural de
inseticida. Quase todas as partes da planta (talo, casca, raízes, folhas, látex
sementes, frutas, flores) são utilizadas na medicina popular tradicional na Índia como
medicamentos contra diferentes doenças humanas desde a antiguidade
(BRAHMACHARI, 2004).
11
O Neem começou a ser pesquisado como inseticida no Brasil no Estado
do Paraná, em 1986, quando sementes originárias das Filipinas foram estudadas. A
partir dos anos 1990, a planta passou a ser mais conhecida no país e foi plantada
para fins comerciais em São Paulo, Goiás, Mato Grosso e Pará (MARTINEZ, 2006).
Diferentes autores utilizaram diversas partes da árvore Neem e
verificaram sua atividade antimicrobiana contra microrganismos do biofilme dental.
Assim, o uso de produtos naturais para o controle químico desse biofilme é uma
alternativa que pode permitir uma diminuição de gastos com a produção de
antimicrobianos e uma maior abrangência de uso do método pela população.
12
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Cárie dental
Tem sido observada a redução na prevalência da doença cárie em
diversos países (NADANOVSKY; SHEILHAM, 1995; MARTHALER et al., 1996;
BASTING et al., 1997; FREYSLEBEN et al., 2000; NARVAI et al., 2000; VRBIC,
2000; PITTS et al., 2002), sendo que os fatores apontados como responsáveis por
essa diminuição são o amplo uso dos fluoretos, principalmente o da água de
abastecimento público e dos dentifrícios, a redução da freqüência de consumo de
açúcar e a implementação de ações de cunho preventivo e educativo pelos serviços
odontológicos (BRATTHALL et al., 1996; KRASSE 1996; CURY, 1998; CARDOSO,
2003).
Nos últimos anos, têm-se observado expressivos ganhos nos níveis de
saúde bucal das pessoas na maioria dos países industrializados, e também entre
alguns países em processo de desenvolvimento, de acordo com inúmeros estudos
epidemiológicos. Vários são os fatores que contribuíram para a redução da
incidência das doenças mediadas por placas bacterianas, apesar da cárie e doenças
periodontais continuarem sendo os maiores problemas de saúde pública, e
demandarem consideráveis volumes de recursos financeiros para seu combate
(WEYNE, 1999).
O declínio das doenças bucais não ocorreu de forma homogênea e
democrática, pois ainda existe um contingente expressivo de pessoas com muitas
doenças bucais. Essas pessoas, geralmente, pertencem a grupos mais vulneráveis
da população, por serem mais suscetíveis ou estarem expostos a fatores de risco.
Esse fenômeno de concentração da maior parte das doenças e necessidades de
tratamento em uma pequena parcela da população é chamado pelos pesquisadores
de polarização e tem sido documentado tanto em crianças quanto em adultos
(WEYNE, 1999).
Ainda nos dias de hoje, a cárie dental é considerada uma das doenças
mais alarmantes da humanidade, pois continua sendo a maior responsável por
13
perdas dentárias em todas as idades, mais do que qualquer outra doença (MALTZ,
2000).
A cárie dental é uma doença infecciosa de origem bacteriana (van
HOUTE, 1994). Pelo fato de sua etiologia ser multifatorial, é considerada uma
doença complexa que depende da interação de fatores relativos ao hospedeiro, à
dieta rica em carboidratos fermentáveis e à presença de microorganismos
cariogênicos (FERNANDES; ALVES, 1997).
A cárie dentária é uma doença multifatorial, onde hospedeiro,
microrganismos, dieta e tempo estão envolvidos (NEWBRUN, 1978), além de fatores
determinantes como saliva, presença de flúor, escolaridade, classe social, renda,
conhecimento, atitudes e comportamento do indivíduo (FEJERSKOV; MANJI,1990).
Newbrun (1988) apresentou um modelo explicativo para o surgimento da
cárie incluindo no diagrama de Keyes um quarto círculo, o tempo, que deve estar
agindo simultaneamente com os outros três para que a cárie ocorra. Este diagrama
foi chamado de modelo de Keyes modificado (FIGURA 1):
Figura 1 – Modelo de Keyes modificado.
Fonte:
Newbrun (1988).
Sem lesão Sem lesão
de cárie de cárie
Hospedeiro Substrato
e dentes
Sem lesão Sem lesão
de cárie de cárie
Tempo
Lesão de
cárie
Microbiota
14
2.2 Uso de produtos naturais em Odontologia
Diversos produtos naturais têm sido utilizados na medicina popular há
milhares de anos e verifica-se que o uso desses produtos tem sido muito mais
difundido e pesquisado em Medicina do que em outras áreas da saúde, como a
Odontologia. Esses fitoterápicos podem exercer inibição no crescimento ou
desenvolvimento de bactérias que fazem parte do biofilme dentário humano.
Diversos estudos in vitro têm demonstrado o efeito da própolis sobre S.
mutans (IKENO et al., 1991; PARK et al., 1998; KOO et al., 1999). A própolis é uma
resina natural não tóxica coletada de diferentes plantas pela abelha Apis mellifera e
tem sido utilizado há séculos na medicina popular (BURDOCK, 1998)
Alguns autores estudaram o alho como antimicrobiano contra bactérias
orais e verificaram diminuição do número de bactérias quando pacientes fizeram uso
de enxaguatórios com esse produto (ELNIMA et al., 1983; RAMACCIATO, 2000).
Walsh e Longstaff (1987) sugeriram a utilização do óleo de melaleuca
contra bactérias periodontopatogênicas pois obtiveram CIM de 400ppm para
estreptococos mutans e de 200ppm para várias bactérias anaeróbias orais, com
exceção de cepas de A. viscocus (800ppm).
Ramacciato et al. (1999), a fim de testaram as propriedades
antimicrobianas do óleo da M. alternifólia sobre as cepas padrões de estreptococos
orais e S. aureus, in vitro, obtendo como resultados para as cepas de estreptococos
orais: CIM<0,0125% e CBM
100
= 0,4% e para o S. aureus: CIM = 0,1% e CBM
100
=
0,2%. No teste de aderência em superfície de vidro para os microrganismos orais, a
concentração obtida (0,1%) mostrou-se suficiente para inibir totalmente a aderência
bacteriana.
Yamamoto e Ogawa (2002) avaliaram a atividade antimicrobiana de
sementes de Perilla, uma erva tradicional do Japão utilizada há muito tempo na
medicina popular do sudeste asiático, sobre estreptococos cariogênicos e sobre P.
gingivalis e concluíram que essas sementes são uma alternativa como agente
antimicrobiano para prevenção de doenças periodontais e cárie dental.
15
Al-lafi e Ababneh (1995) avaliaram a atividade antibacteriana de miswak
(Salvadora persica) sobre bactérias orais aeróbicas e anaeróbicas. Verificaram que o
extrato aquoso a 10% foi capaz de inibir o crescimento de Streptococcus mutans em
88%; S. mitis em 83%; S. aureus em 96%, e estreptococos anaeróbios em 79%.
O miswak (Salvadora persica) foi estudado por Almas, 2004, em estudo in
vivo. O autor avaliou o efeito imediato da mastigação do graveto Miswak, de uma
solução do graveto na concentração de 50%, de uma solução salina (controle
negativo) e da escovação (controle positivo) sobre S. mutans e Lactobacilli. O autor
verificou que a redução de S. mutans foi significativamente maior no grupo que
utilizou miswak comparado com o grupo escovação; entretanto, não houve diferença
entre os grupos para o número de lactobacilos.
Jagtap e Karkera (2000) avaliaram a Junglandaceae regia, planta utilizada
como palito mastigável para manutenção da higiene oral na região temperada da
Europa, no Himalaia, na China e no Japão (ALMAS; AL-LAFI, 1995). Verificaram que
tanto o extrato aquoso quanto o extrato alcoólico inibiram fortemente o crescimento,
a aderência in vitro e a produção de ácido e a agregação induzida por glucano dos
Streptococcus mutans, o que justifica a indicação dessa planta para a manutenção
da higiene oral.
Dentifrícios com extratos herbais foram estudados por Lee et al., em
2004. Foram avaliados 14 dentifrícios contra diferentes microrganismos (S. mutans,
S. sanguis, A. Viscous e C. albicans) e verificaram que apenas um deles apresentou
atividade antimicrobiana consistente contra todos os quatro microrganismos
testados. Apenas nove tiveram efeito inibidor sobre S. mutans.
2.3
Neem
A planta Azadirachta indica A. Juss, também conhecida por Melia indica,
Melia azadirachta e Antelaea azadirachta, e conhecida popularmente como nim ou
margosa pertence à família Meliácea e é originária das regiões áridas da Índia
(BUTTERWORTH; MORGAN, 1971; KOUL et al., 1990; SCHUMUTTERER, 1990).
Suas folhas são verde-escuras, compostas e imparipenadas. Freqüentemente se
16
aglomeram nos extremos dos ramos, simples e sem estípulas. As flores são
brancas, reúnem-se em inflorescências, são aromáticas, apresentam estames
crescentes formando um tubo, são pentâmeras e hermafroditas. Com 1,5 a 2,0cm de
comprimento, o fruto apresenta-se como uma baga ovalada que, quando maduro,
apresenta polpa amarelada e casca branca, dura, contendo óleo marrom no interior
de uma semente ou, raramente, em duas (RADWANSKI; WICKENS,1981;
BAUMER, 1983; NEVES; NOGUEIRA, 1996).
O Neem é uma planta medicinal bastante utilizada para curar diferentes
doenças em humanos; várias partes da árvore de Neem e seus compostos isolados
têm mostrado atividade medicinal e biológica (SCHMUTTERER, 1995;
DEVAKUMAR; SUKH DEV, 1996; BISWAS et al., 2002; SINGH; SINGH, 2002).
Cerca de 135 compostos, de diferentes estruturas, já foram isolados de diversas
partes do Neem (KRAUS, 1995; DEVAKUMAR; SUKH, 1996).
Vários estudos verificaram atividade antimicrobiana, anticárie e
antifúngica de extratos aquosos de diferentes galhos de plantas mastigáveis
(BUADU; BOKAYE YODEM 1973; ROTIMI; MOSADOMI, 1987; AL-LAFI; ABABNEH,
1995; AL-BAGIEH; ALMAS, 1997).
Segundo Pai et al. (2004), o Neem é considerado por indianos e asiáticos
do sul, há milhares de anos, instrumento preferido para a manutenção da saúde dos
dentes e das gengivas. Ainda segundo esses autores, mastigar sementes e folhas
de Neem e utilizar seus gravetos para escovação fazem parte dos costumes de
higiene oral dessa população.
Milhares de pessoas na Índia e na África utilizam pequenos galhos de
Neem como escovas de dente e para prevenção de doenças periodontais. O
mecanismo pelo qual ocorre a prevenção não é bem certo, podendo-se sugerir que
ocorra devido às massagens regulares nas gengivas, impedimento da formação de
placas bacterianas, ou pelas propriedades anti-sépticas do Neem ou se pelas três
hipóteses juntas. Segundo Baumer (1993), há algumas empresas alemãs que
fabricam pastas dentais usando o Neem como composto ativo, sendo verificado que
as mesmas têm sido muito eficazes na prevenção e cura de inflamações nas
gengivas e nas doenças periodontais.
17
Wolinsky et al, em 1996, avaliaram in vitro o efeito inibitório dos extratos
derivados de gravetos de Neem sobre a agregação e o crescimento bacteriano,
adesão à hidroxiapatita e produção de glucanos insolúveis. Verificaram não haver
inibição do crescimento bacteriano em cepas de estreptococos que testaram na
presença de concentrações iguais ou menos a 320µg/ml do extrato. Entretanto,
verificaram que o extrato de gravetos de Neem pode afetar alguns fatores de
virulência de alguns estreptococos, o que pode influenciar a formação do biofilme.
Almas (1999) comparou a efetividade da atividade antimicrobiana de
gravetos mastigáveis de Neem (Azadirachta indica) e de Arak (Salvadora pérsica). O
autor verificou que os extratos dos dois gravetos, na concentração 50%, foram
efetivos sobre Streptococcus mutans e Streptococcus faecalis, sendo que, para esse
último microrganismo, o extrato de Arak foi mais efetivo em concentrações mais
baixas.
Vanka et al. (2001) verificaram o efeito do bochecho com extrato de Neem
sobre os níveis salivares de Streptococcus mutans e lactobacillus por um período
maior do que dois meses e verificaram o efeito ao reverter lesões iniciais de cárie.
Lactobacillus foram inibidos apenas pela clorexidina, enquanto S. mutans foram
inibidos tanto pela clorexidina quanto pelo extrato de Neem com e sem álcool.
Concluíram que estudos de longa duração são essenciais e que os dados parecem
provar o efeito de inibir S. mutans e reverter lesões iniciais de cárie.
Pai et al. (2004) desenvolveram um estudo in vivo, durante seis semanas,
utilizando-se um gel de extrato de folha de Neem (25mg/g) para verificar a formação
de placa dental, tendo como controle positivo bochecho de clorexidina 0,2%.
Verificaram que houve diferença estatisticamente significante na formação de placa
e na contagem de microrganismos após três e seis semanas de estudo entre os
grupos que utilizaram o extrato de Neem e aqueles do grupo controle negativo e
positivo. O extrato de Neem apresentou melhor eficácia em comparação ao
digluconato de clorexidina para bochecho disponível comercialmente.
Pai et al. (2004) avaliaram por seis semanas a eficácia clínica, usando
índice de placa e índice gengival, de géis contendo clorexidina e extrato de Neem e
um bochecho comercial com clorexidina. Verificaram que os géis apresentaram
18
diferença estatisticamente significante quando comparados ao controle. Entretanto,
não apresentaram diferença entre si. Dessa forma, os autores concluíram que há
uma melhor eficácia terapêutica quando se utiliza géis para tratamento de infecções
orais do que quando se faz uso de bochechos.
19
3. OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho é avaliar atividade antimicrobiana das
folhas da planta Azadirachta indica, conhecida popularmente como Neem, sobre
Streptococcus mutans, por meio da avaliação do Halo de inibição, Concentração
Inibitória Mínima e teste de aderência à superfície do vidro.
20
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Origem das amostras
Para o presente estudo foram utilizadas amostras de Streptococcus
mutans (UA159) pertencentes ao acervo de microrganismos do Laboratório de
Microbiologia e Imunologia Oral da Universidade do Sagrado Coração. As espécies
foram mantidas sob congelamento (freezer -20º C), em alíquotas de 5,0ml em meio
BHI (Brain Heart Infusion - Difco) adicionado de 20% de glicerol.
4.2 Obtenção do extrato de
Melia azadirachta
Foram coletados folhas e ramos que foram secos separadamente em
estufa a 40
o
C, por 48h (para os ramos até 96h) e foram, posteriormente, triturados
em moinho de facas até a obtenção do pó, que foi armazenado em vidro
hermeticamente fechado e etiquetado com os referidos dados de coleta.
Foi preparada uma solução 40% das folhas de Neem em etanol absoluto,
que ficou por 30min em agitador magnético. Essa solução foi guardada em estufa
por uma semana ao abrigo da luz. No dia da realização do experimento, essa
solução ficou em agitação por dez minutos e então foi filtrada em papel filtro
qualitativo.
4.3 Avaliação da atividade antimicrobiana
Para o preparo do inoculo bacteriano, foram utilizadas culturas recentes
das amostras de Streptococcus mutans padronizadas pela escala 1 de Mc Farland,
em meio BHI, que representa 10
8
UFC/ml.
Foram testadas as seguintes soluções:
21
Extrato etanólico de Neem - 3200µg/ml, 1600µg/ml, 800µg/ml, 400µg/ml,
200µg/ml e 100µg/ml;
Etanol absoluto – veículo;
Digluconato de clorexidina 0,12% (Periogard, Colgate) – controle positivo;
Meio + bactéria – controle negativo.
4.4 Teste de halo de inibição
Foram colocados 200µl de inóculo bacteriano em 100ml de meio BHI
ágar. Essa solução foi homogeneizada e distribuída em três placas de petri (
100mm). Foram preparados discos de papel (
5mm) que foram embebidos em 20µl
das soluções testadas e em seguida foram colocados sobre a superfície do ágar.
Após duas horas, as placas foram colocadas em jarras de CO
2
e incubadas em
estufa a 37ºC, por 24h. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
4.5 Teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A determinação da CIM foi realizada em meio líquido, utilizando-se a
técnica de macrodiluição (PIDDOCK, 1990; PHILLIPS, 1991). A suspensão
bacteriana foi colocada em meio BHI caldo na proporção 1:500, da forma que se
obteve a concentração de 2-4 x 10
5
ufc/ml. Após a homogeneização, 4960
l dessa
solução foram transferidos para tubos de vidro esterilizados e então 40
l das
diferentes concentrações dos extratos foram colocadas nestes tubos (3200µg/ml a
100µg/ml). Os tubos foram, então, homogeneizados com auxílio de um vórtex em
baixa velocidade e incubados nas condições descritas no item 4.4. A CIM é
considerada a menor concentração do extrato onde não houver crescimento
bacteriano visível.
22
4.6 Teste da aderência à superfície do vidro
Foi colocado inóculo bacteriano na proporção 1:500 (v/v) em meio BHI
caldo contendo 1% de sacarose. Após a homogeneização, essa solução foi
distribuída (4960
l) em tubos de vidro previamente esterilizados e, posteriormente,
40
l das diferentes soluções (solução de Neem, veículo, controle positivo e
negativo) foram colocadas Após homogeneização em vórtex, os tubos foram
colocados em jarras de CO
2
e incubados em estufa a 37ºC, por 24h, numa
inclinação de 30º. Apos incubação, os tubos foram lavados delicadamente com soro
fisiológico e a inibição da aderência sobre a superficie de vidro foi considerada a
menor concentração do extrato onde não houvesse aderência bacteriana visível.
23
5. RESULTADOS
Após 24h, verificou-se a formação do halo de inibição nas placas de petri
apenas ao redor do controle positivo.
Em relação à CIM, verificou-se que apenas a solução do tubo em que foi
colocado clorexidina não apresentou crescimento bacteriano.
Na avaliação da superfície do vidro, verificou-se que apenas no grupo
controle positivo ocorreu a inibição da aderência bacteriana sobre a superfície de
vidro, onde as bactérias não se aderiram.
24
6. DISCUSSÃO
A cárie dental é uma doença multifatorial causada por bactérias que
colonizam e se acumulam na superfície do dente formando o biofilme dental, sendo
que o primeiro passo para o início da colonização é a adesão dos microrganismos
(GIBBONS, 1984). Uma forma de prevenir a cárie, então, é a inibição da aderência
de S. mutans à hidroxiapatita e à subseqüente colonização da superfície dental
(TARSI et al., 1997). Dessa forma, no presente estudo, além de se propor avaliar a
atividade antimicrobiana por meio da determinação da Concentração Inibitória
Mínima, propôs-se, também, verificar a capacidade de inibir a adesão de
microrganismos à superfície do vidro.
Não foi possível verificar a Concentração Inibitória Mínima nas
concentrações testadas e, avaliando-se a adesão das bactérias à superfície do
vidro, verificou-se que o extrato também não foi capaz de impedir essa adesão.
Utilizou-se etanol absoluto no presente estudo para se extrair os compostos ativos
das folhas de Neem, deixando a solução armazenada por uma semana. Em
diferentes estudos utilizando o Neem, seja na área agronômica ou de saúde, os
autores utilizam diferentes concentrações e formas de extração dos compostos
ativos.
Pai et al. (2004) utilizaram etanol 70% e folhas maceradas, que ficaram
armazenadas por uma semana, e verificaram que o gel de extrato de Neem a 20%
foi eficiente em reduzir o índice de placa e contagem de bactérias em estudo clínico
por seis semanas (S. mutans e Lactobacilli). Wolinsky et al. (1996) utilizaram talos
com casca moídos em água fervente, que foram filtrados em papel qualitativo e em
seguida essa solução foi liofilizada. Verificaram que, nas concentrações entre
7,5µg/ml e 320µg/ml, não houve redução do crescimento bacteriano para as
bactérias avaliadas, inclusive para S. mutans. Entretanto, verificaram que o extrato
apresentou atividade de agregação entre todos os estreptococos orais testados.
Diversos outros estudos demonstraram o efeito antiplaca, anticárie e antibacteriano
de diferentes plantas que possuem ramos mastigáveis, sendo recomendados como
instrumentos de higiene oral (ALMAS, 1999).
25
Esses mesmos autores (WOLINSKY et al, 1996) comentam que avaliaram
outros componentes da planta Neem e verificaram, em estudo não publicado, que as
folhas e sementes não apresentaram um nível de inibição de aderência e inibição de
formação de glucanos como os gravetos da casca da planta. No presente estudo, o
extrato de folhas de Neem não apresentou capacidade de inibir a adesão à
superfície de vidro, em concordância com esse autor.
Dessa forma, sugere-se que outros estudos sejam realizados avaliando-se
outras partes da planta, como o ramo, as sementes, o óleo extraído das sementes, e
utilizando-se outras formas de se tentar extrair o composto ativo das diversas partes
da planta, como etanol em diferentes concentrações, água, Tween. Durante a
realização desse estudo, fez-se um ensaio com o óleo de Neem; no entanto, não foi
possível diluí-lo com os compostos utilizados para diluição de óleo, o que sugere que
haja necessidade de uso de outros métodos como a liofilização e a roto evaporação
para a produção de compostos solúveis em água e álcool.
O uso de produtos naturais para o controle químico do biofilme dental é
uma alternativa que pode permitir uma diminuição de gastos com a produção de
antimicrobianos e permitir uma maior abrangência de uso do método pela
população. Almas (2001) afirma que gravetos mastigáveis exercem papel importante
no auxílio aos cuidados em saúde oral para países em desenvolvimento onde há
restrição financeira e cuidados para saúde oral limitados.
Atualmente, no Brasil, muito se tem investido em Neem devido à sua
comprovada eficácia como inseticida. Resta agora estudar as outras partes da planta
a fim de se comprovar sua atividade antimicrobiana contra microrganismos orais e a
partir daí indicar o uso desse produto natural para higiene oral também no Brasil, em
semelhança a países asiáticos, uma vez que o mesmo é um país em
desenvolvimento e que apresenta parcela da população em estados miseráveis.
26
7. CONCLUSÃO
Pela metodologia utilizada, verificou-se que o extrato não apresentou
atividade antimicrobiana nas concentrações testadas, pois não foi possível verificar a
CIM e também não foi capaz de inibir a aderência bacteriana à superfície de vidro.
27
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