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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
TATIANA DOS PASSOS
Análise da anotação funcional e expressão gênica diferencial
da família de proteínas WD de
Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos
Requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e Molecular
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger
Co-Orientador: Prof. Dr. Christian Macagnan Probst
CURITIBA
2006
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
TATIANA DOS PASSOS
Análise da anotação funcional e expressão gênica diferencial
da família de proteínas WD de
Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos
Requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e Molecular
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger
Co-Orientador: Prof. Dr. Christian Macagnan Probst
CURITIBA
2006
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Dedico esta conquista a Deus, a mi-
nha família e a quem soube ensinar
a amar, LILA.
- i -
AGRADECIMENTOS
A diretoria do IBMP, Dr. Samuel Goldenberg, Dr. Stênio P. Fragoso, Dr. Claudia N.
Duarte dos Santos e Dr. Marco A. Krieger pelo apoio institucional o qual possibilitou o desen-
volver deste projeto.
A pós-graduação IOC-BCM e ao coordenador Dr. Milton Ozório.
Ao Dr. Marco Aurélio Krieger pela oportunidade de vivenciar a construção do conheci-
mento científico, pelo otimismo e atenção dada à orientação deste trabalho.
Ao co-orientador Dr. Christian M. Probst pela valiosa direção e pelas necessárias inter-
venções no decorrer da minha caminhada no IBMP.
A Dra. Daniela Parada Pavoni pela revisão deste trabalho e sobretudo pela amizade e pelo
pensar do exercício científico, comigo compartilhado.
Aos pesquisadores Dr. Alejandro C. Domingues, Dr. Bruno Dallagiovana, Dr. Andréa
Ávila pela colaboração sempre que solicitada.
As amigas de laboratório e de todas as horas, Rita de C. Rampazzo, Patrícia Morking,
Fabíola Holetz, Vanessa Stella, Viviane Crestan, Dr. Thaís Dietrich.
Aos demais amigos e colegas que de uma maneira direta ou indireta participaram desta
realização.
A Capes pelo apoio financeiro.
- ii -
ÍNDICE
ÍNDICE......................................................................................................................................................... II
ABSTRACT ....................................................................................................................................................V
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................... VI
LISTA DE TABELAS................................................................................................................................ VIII
1 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................1
1.1TRYPANOSOMA CRUZI E A DOENÇA DE CHAGAS ......................................................................................................1
1.2O CICLO DE VIDA DE TRYPANOSOMA CRUZI..............................................................................................................3
1.3METACICLOGÊNESE DE TRYPANOSOMA CRUZI.........................................................................................................5
1.4A BIOLOGIA CELULAR DE TRYPANOSOMA CRUZI ......................................................................................................6
1.5A BIOLOGIA MOLECULAR DE TRYPANOSOMA CRUZI ................................................................................................8
1.6MONITORAMENTO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM LARGA ESCALA: MICROARRANJOS DE DNA......................... 14
1.7A FAMÍLIA DE PROTEÍNAS WD ................................................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ..............................................................................................................................................23
3 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................................24
3.1 PROCEDÊNCIA DOS REAGENTES E MATERIAIS................................................................................................. 24
3.2 SOLUÇÕES E MEIOS DE CULTURA ........................................................................................................................ 25
3.3 MICRORGANISMOS................................................................................................................................................. 26
3.4 OBTENÇÃO DO RNA DE T. CRUZI...................................................................................................................... 28
3.5 AMPLIFICAÇÃO IN VITRO DE RNA ..................................................................................................................... 29
3.6 CONFECÇÃO DO MICROARRANJO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS........................................................................ 29
3.7 MARCAÇÃO DAS AMOSTRAS COM FLUORÓFOROS............................................................................................. 32
3.8 HIBRIDAÇÃO ........................................................................................................................................................... 33
3.9 LEITURA DOS SINAIS OBTIDOS............................................................................................................................. 33
3.10 ANÁLISE E TRATAMENTO DOS SINAIS ................................................................................................................ 33
3.11 NORMALIZAÇÃO DOS DADOS .............................................................................................................................. 34
3.12 IDENTIFICAÇÃO DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS....................................................................... 35
4 RESULTADOS ..........................................................................................................................................38
4.1 HIBRIDAÇÕES COMPARATIVAS............................................................................................................................. 38
4.2 NORMALIZAÇÃO DOS DADOS .............................................................................................................................. 43
4.3 AVALIAÇÃO DA INTENSIDADE DA SONDA......................................................................................................... 49
4.4 SELEÇÃO DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS................................................................................... 49
4.5 AGRUPAMENTO FUNCIONAL DAS SONDAS WD ............................................................................................... 50
4.6 AGRUPAMENTO DAS PROTEÍNAS WD DE T. CRUZI......................................................................................... 52
4.7 MÓDULOS PROTÉICOS PRESENTES NOS SUPRA-GENES................................................................................... 57
4.8 ANÁLISE DE ORTOLOGIA EM TRITRYPS............................................................................................................. 58
4.9 COMPARAÇÃO DE HOMOLOGIA DE SEQÜÊNCIA .............................................................................................. 59
4.10 ATRIBUIÇÃO DE FUNÇÃO POR SIMILARIDADE PARA PROTEÍNAS HIPOTÉTICAS ......................................... 59
- iii -
4.11 ATRIBUIÇÃO FUNCIONAL...................................................................................................................................... 63
4.12 DESCRIÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS BIOINFORMÁTICAS E DE EXPRESSÃO DIFERENCIAL......................... 63
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................................................ 134
6 CONCLUSÃO.......................................................................................................................................... 143
7 PERSPECTIVAS ..................................................................................................................................... 144
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................... 145
- iv -
RESUMO
As proteínas contendo módulos WD representam um dos grupos funcionais gerais mais
comuns em Trypanosoma cruzi. Esse módulo, usualmente encontrado em repetições, se estende por
aproximadamente 40 aminoácidos, geralmente terminando em um dipeptídeo triptofano-ácido
aspártico (WD), sendo que as repetições possivelmente formam uma estrutura circularizada do
tipo beta-propeller. As proteínas contendo módulos WD constituem-se em uma família muito am-
pla, encontrada em todos os eucariotos, cuja função primária do módulo é a formação de um
arcabouço rígido para a interação entre proteínas, sendo que a especificidade funcional das prote-
ínas da família WD é determinada pelo restante da seqüência. As funções são diversas, como
transdução de sinal, regulação da transcrição, controle do ciclo celular e apoptose. O objetivo do
presente trabalho foi identificar, descrever e caracterizar as proteínas WD em T. cruzi, bem como
avaliar o perfil de expressão diferencial a partir de dados de microarranjo e proteômica. Em Try-
panosoma cruzi, foram preditos 211 genes distintos contendo módulos WD identificados, sendo
que após uma etapa de eliminação de redundância gênica, tendo em vista o estado atual da mon-
tagem do genoma dessa parasita, foram definidos 117 seqüências codificadoras minimamente
distintas, denominadas supra-genes. A grande maioria desses supra-genes (81,2%) não apresenta
uma anotação funcional (isto é, são caracterizadas como proteínas hipotéticas), sendo que os ge-
nes contendo anotação funcional estão geralmente associados à citoesqueleto, tráfego de vesícu-
las e sinalização. Uma descrição das características bioinformáticas por similaridade de seqüências
protéicas, bem como a revisão da literatura pertinente, foi realizada para essas 117 proteínas. A
grande maioria das proteínas WD descritas em eucariotos são encontradas em T. cruzi, T. brucei e
Leishmania major, organismos relativamente próximos filogeneticamente e coletivamente denomi-
nados TriTryps. Apenas 3 supra-genes foram encontrados apenas em T. cruzi. A grande maioria
das proteínas WD (88%) não apresenta módulos acessórios identificados. Após análise de simila-
ridade realizada para os 117 genes WD, 37 proteínas hipotéticas (38,9% dos 95 genes sem anota-
ção funcional) foram reanotadas com uma provável função celular. Os principais processos celu-
lares são: biogênese do ribossomo, flagelo, splicing do mRNA. Resultados de microarranjo relati-
vos ao processo de metaciclogênese e ciclo de vida de T. cruzi (PROBST et al., em preparação) e
os resultados de proteômica relativos às formas do ciclo de vida (ATWOOD et al., 2005) foram
analisados. Um total de 44 genes WD (37,60%) mostrou-se modulados por microarranjo durante
o processo de diferenciação e peptídeos foram identificados para 9 proteínas WD, reforçando a
importância funcional dessa família. Dados de um microarranjo de oligonucleotídeos 60 mer, a-
brangendo praticamente todos os genes da família WD foi desenvolvido nesse trabalho. Um total
de 41 genes (29,92%) com expressão diferencial foi identificado. A clonagem destes genes foi
iniciada visando caracterização molecular e funcional posterior.
- v -
ABSTRACT
The WD proteins domain containing represents one of the most common functional
groups of proteins Trypanosoma cruzi. This domain, usually found as repeats, is a short ~40 amino
acids motif, often terminating in a Trp-Asp (WD) dipeptide. These repeats are thought to form a
circularized beta-propeller structures. The WD proteins are a large family found in all eukaryotes
and are implicated in a variety of functions ranging from signal transduction and transcription
regulation to cell cycle control and apoptosis. The objective of the present work was to identify,
to describe and to characterize WD proteins in T. cruzi, as well as evaluate expression profile
from microarray data and proteomics. In T. cruzi, were predicted 211 distinct genes containing
WD domains. After a redundancy elimination step, were very common in the current state of the
assembly of the genome of this parasite, 117 sequences minimally different were defined, named
supra-genes. The great majority of these supra-genes (81.2%) do not present a functional
notation, being characterized as hypothetical proteins. The remaining genes contaim a functional
notation as cytoskeleton association, vesicle trafficking and signaling. A description of the
bioinformatics characteristics for similarity of protein sequences, as well as the revision of
pertinent literature, was carried for these 117 proteins. The great majority of described WD
proteins in eukaryotes are found in T. cruzi, T. brucei and Leishmania major; organisms
phylogenetically related and collectively named TriTryps. Only tree supra-genes were found only
in T. cruzi. The great majority of WD proteins (88%) does not present identified accessory
modules. After analysis of similarity carried for 117 genes WD, 37 hypothetical proteins (38.9%
of the 95 genes without functional notation) were written down with a probable cellular function.
The main cellular processes are: biogenesis of ribosome, flagellum and splicing of mRNA.
Microarray results related to the process of metacyclogenesis and life cycle of T. cruzi (PROBST
et al., in preparation) and proteomics results related to life cycle forms (ATWOOD et al., 2005)
were analyzed. A total of 44 WD genes (37.60%) through microarray analysis revealed modulated
during the process of differentiation and peptides were identified for 9 WD proteins, reinforcing
the functional importance of this family. A 60 mer oligonucleotide practically coring all the genes
T. cruzi of WD family, was developed in this work. A total of 41 genes (29.92%) with diferential
expression were identified. The cloning of these genes was initiated aiming a posterior molecular
and functional characterization.
- vi -
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Distribuição geográfica da Doença de Chagas..........................................................................................................1
Figura 1.2. Ciclo de vida do T. cruzi .............................................................................................................................................4
Figura 1.3 Ilustração esquemática dos elementos estruturais de um motivo WDR............................................................ 19
Figura 1.4 Subunidade β da proteína G heterotrimérica.......................................................................................................... 20
Figura 3.1 Hibridações realizadas no microarranjo de oligonucleotídeos versão 1.0.......................................................... 32
Figura 4.1 Imagem composta das hibridações da metaciclogênese........................................................................................ 40
Figura 4.2 Imagem composta das hibridações do ciclo de vida.............................................................................................. 42
Figura 4.3 Gráficos M vA representando as hibridações realizadas (pré-normalização).................................................... 44
Figura 4.4 Gráficos MvA representando as hibridações realizadas (pré-normalização)..................................................... 45
Figura 4.5 Gráficos MvA representando as hibridações realizadas (pós-normalização) .................................................... 46
Figura 4.6 Gráficos MvA representando as hibridações realizadas (pós-normalização) .................................................... 47
Figura 4.7 Gráfico tipo boxplot representando as hibridações pré-normalização................................................................. 48
Figura 4.8 Gráfico tipo boxplot representado as hibridações pós-normalização................................................................... 48
Figura 4.9 Comparação da intensidade do sinal versus o tamanho da sonda....................................................................... 49
Figura 4.10 Gráficos de Venn representando os genes selecionados em cada experimento.............................................50
Figura 4.11 Clusterização hierárquica das sondas WD selecionadas...................................................................................... 51
Figura 4.12 Distribuição do número de modelos gênicos por supra-gene. .......................................................................... 54
Figura 4.13 Distribuição dos domínios WD em proteínas de T. cruzi................................................................................... 57
Figura 4.14 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD001 na metaciclogênese e no ciclo de vida............ 64
Figura 4.15 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD001 na metaciclogênese e no ciclo de vida............ 65
Figura 4.16 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD001 no ciclo de vida por proteômica...................... 65
Figura 4.17 Avaliação da expressão diferencial de WD002 na metaciclogênese e no ciclo de vida................................. 68
Figura 4.18 Avaliação da expressão diferencial do WD003 na metaciclogênese e no ciclo de vida................................. 69
Figura 4.19 Avaliação da expressão diferencial de WD007 na metaciclogênese e no ciclo de vida................................. 71
Figura 4.20 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD008 no ciclo de vida por proteômica...................... 72
Figura 4.21 Alinhamento entre os supra-genes WD008 e WD009, ambos codificando para a cadeia intermediária da
dineína. .............................................................................................................................................................................................. 73
Figura 4.22 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD009 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 74
Figura 4.23 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD010 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 75
Figura 4.24 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD011 no ciclo de vida por proteômica...................... 75
Figura 4.25 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD013 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 76
Figura 4.26 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD015 no ciclo de vida por proteômica...................... 78
Figura 4.27 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD016 no ciclo de vida por proteômica...................... 79
Figura 4.28 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD018 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 81
Figura 4.29 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD018 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 82
Figura 4.30 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD021 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 83
Figura 4.31 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD022 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 84
Figura 4.32 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD023 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 85
Figura 4.33 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD025 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 86
Figura 4.34 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD030 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 88
Figura 4.35 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD037 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 90
- vii -
Figura 4.36 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD039 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 91
Figura 4.37 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD039 no ciclo de vida por proteômica...................... 91
Figura 4.38 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD040 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 93
Figura 4.39 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD043 no ciclo de vida por proteômica...................... 94
Figura 4.40 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD048 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 96
Figura 4.41 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD051 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 97
Figura 4.42 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD052 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 98
Figura 4.43 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD053 na metaciclogênese e ciclo de vida.................. 99
Figura 4.44 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD056 na metaciclogênese e ciclo de vida................101
Figura 4.45 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD058 na metaciclogênese e ciclo de vida................102
Figura 4.46 Representação da localização das sondas que hibridam com o gene WD058. .............................................103
Figura 4.47 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD060 na metaciclogênese e ciclo de vida................104
Figura 4.48 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD063 na metaciclogênese e ciclo de vida................105
Figura 4.49 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD067 na metaciclogênese e ciclo de vida................106
Figura 4.50 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD068 na metaciclogênese e ciclo de vida................107
Figura 4.51 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD068 no ciclo de vida por proteômica....................108
Figura 4.52 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD071 na metaciclogênese e ciclo de vida................110
Figura 4.53 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD072 na metaciclogênese e ciclo de vida................110
Figura 4.54 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD072 no ciclo de vida por proteômica....................111
Figura 4.55 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD073 na metaciclogênese e ciclo de vida................112
Figura 4.56 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD075 na metaciclogênese e ciclo de vida................113
Figura 4.57 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD077 na metaciclogênese e ciclo de vida................114
Figura 4.58 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD080 na metaciclogênese e ciclo de vida................115
Figura 4.59 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD082 no ciclo de vida por proteômica....................116
Figura 4.60 Avaliação da expressão diferencial supra-gene WD085 na metaciclogênese e ciclo de vida......................117
Figura 4.61 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD095 na metaciclogênese e ciclo de vida................120
Figura 4.62 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD097 na metaciclogênese e ciclo de vida................121
Figura 4.63 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD098 na metaciclogênese e ciclo de vida................122
Figura 4.64 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD100 na metaciclogênese e ciclo de vida................123
Figura 4.65 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD102 na metaciclogênese e ciclo de vida................124
Figura 4.66 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD105 na metaciclogênese e ciclo de vida................125
Figura 4.67 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD107 na metaciclogênese e ciclo de vida................126
Figura 4.68 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD108 na metaciclogênese e ciclo de vida................127
Figura 4.69 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD110 na metaciclogênese e ciclo de vida................128
Figura 4.70. Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD111 na metaciclogênese e ciclo de vida...............129
Figura 4.71. Alinhamento entre sequências SEC13 (WD114 e WD115) anotadas no genoma de T. cruzi...................131
Figura 4.72 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD114 no ciclo de vida por proteômica....................131
Figura 4.73 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD116 na metaciclogênese e ciclo de vida................132
Figura 4.74 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD116 no ciclo de vida por proteômica....................133
Figura 5.1 Representação das funções principais atribuidas aos genes WD de T. cruzi....................................................135
Figura 5.3 Padrão do microarranjo de produtos de PCR (TcBc4.2) utilizado no IBMP..................................................139
Figura 5.4 Padrão do microarranjo de oligonucleotídeos (v.1.0) utilizado para este trabalho.........................................140
- viii -
LISTA DE TABELAS
Tabela 4-1 Descrição dos supra-genes de Trypanosoma cruzi com domínios WD............................. 53
Tabela 4-2 Supra-genes WD, com a definição dos modelos gênicos agrupados.............................. 55
Tabela 4-3 Supra-genes WD contendo outros módulos...................................................................... 58
Tabela 4-4 Supra-genes que não apresentam ortólogos em todos os TriTryps................................59
Tabela 4-5 Grau de similaridade dos supra-genes WD com outros organismos .............................60
Tabela 4-6 Supra-genes WD para os quais foi sugerida a mudança de anotação.............................61
Tabela 4-7 Função geral provável das proteínas WD após reanotação IBMP..................................62
Tabela 5-2 Valores de intensidade relativa das sondas no microarranjo de oligonucleotídeos ..138
1
1 Introdução
1.1
Trypanosoma cruzi e a Doença de Chagas
A Doença de Chagas, também conhecida como Tripanossomíase Americana, é assim chamada
após o médico brasileiro Carlos Chagas descrevê-la pela primeira vez 1909. É caracterizada como
uma infecção preferencialmente crônica, causada por um protozoário parasita, Trypanosoma cruzi,
transmitido ao homem por insetos triatomíneos conhecidos popularmente como barbeiros. Al-
guns gêneros de triatomíneos, considerados domésticos servem como vetores da doença de Cha-
gas. Os principais são Triatoma infestans,
Panstrongylus spp e Rhodnius spp.
A distribuição geográfica da doença de Chagas estende-se do México para o sul da Argentina,
afetando 16 a 18 milhões de pessoas diretamente. Estima-se que outras 100 milhões estejam em
risco (WHO, 2002).
Figura 1.1. Distribuição geográfica da Doença de Chagas.
(http://www.who.int/ctd/chagas/geo.htm).
A transmissão do protozoário parasita ao homem pode ocorrer através do contato com as
fezes e urina de triatomíneos infectados com T. cruzi. Frequentemente os insetos defecam no
hospedeiro humano enquanto se alimentam de sangue e a entrada dos parasitas ocorre via o local
da picada (PRATA, 2001). Esta forma de infecção é responsável pela maioria dos casos registra-
dos.
2
O segundo mecanismo de transmissão responsável por aproximadamente 10% dos casos
de infecção por T. cruzi é a transmissão via transfusões sanguíneas ou hemo-derivados. O terceiro
mecanismo de transmissão é por via congênita, onde a probabilidade de crianças de mães chagási-
cas serem infectadas varia de 0 a 10% dos casos e pode ocorrer fora das áreas endêmicas (PRATA,
2001). Outro mecanismo esporádico de transmissão inclui contaminação acidental durante traba-
lhos em laboratório, via aerossóis formados durante centrifugação ou com seringas contaminadas.
Microepidemias de Doença de Chagas aguda provavelmente ocorrem por contaminação
oral, através da ingestão de alimentos contaminados como carne, caldo-de-cana, suco de frutas ou
açaí e são reportados na região amazônica (PINTO et al., 2004). Em fevereiro de 2005, um surto
de Doença de Chagas aguda no estado de Santa Catarina foi detectado, por uma forma não usual
de transmissão da doença no estado. Caldo-de-cana contaminado com T. cruzi foi ingerido por
veranistas em um estabelecimento às margens da BR101 no município de Navegantes. Vinte e três
casos foram diagnosticados por testes sorológicos e parasitológicos, com quatro óbitos.
(http://www.parasitologia.org.br/noticia.php?id=60).
A Doença de Chagas aguda é caracterizada por altos níveis de parasitas no sangue e teci-
dos refletindo o sucesso que o parasita apresenta na evasão da resposta imune inata do hospedeiro
e na habilidade do mesmo infectar uma ampla variedade de tipos celulares. Embora algumas vezes
a fase aguda seja associada com sintomas severos, morte nesta fase é relativamente rara e geral-
mente ocorre em crianças ou em pessoas com imunodeficiências (TARLETON, 2003). A fase
aguda da doença, quando sintomática, caracteriza-se por parasitemia elevada, febre, mal estar, ce-
faléia, adenopatia generalizada, edema subcutâneo, disfunção cardíaca, hepatomegalia e espleno-
megalia. A letalidade desta fase pode ser decorrência de meningoencefalite e insuficiência cardíaca
(RASSI et al., 2000).
Os casos agudos não tratados podem evoluir para fase crônica, onde na maioria dos paci-
entes é assintomática (forma crônica assintomática) e outros manifestam distúrbios cardíacos e
digestivos, como megaesôfago e megacólon (DIAS, 2000).
O controle da Doença de Chagas ocorre predominantemente por bloquear os meios de
transmissão, onde o combate aos insetos vetores e o desenvolvimento econômico e social das
áreas endêmicas são relevantes para diminuir ou eliminar o contato vetor-homem. Intervenções
diretas e indiretas sobre insetos vetores e seleção de doadores de sangue atuam como medidas
preventivas da Doença de Chagas (DIAS, 1994; GOLDENBERG & KRIEGER, 1997).
Até o momento não há vacina disponível contra infecção por T.cruzi, sendo a quimiotera-
pia o único meio de tratamento para Doença de Chagas. A eliminação do protozoário é possível
com duas drogas, Benzonidazol (Bz) e Nifurtimox (Nf), predominantemente na fase aguda da
doença (RASSI & LUQUETTI, 2003), podendo ser a eficácia da droga cepa-dependente e o alto
grau de toxicidade fatores limitantes no tratamento. Investigações visando avaliar a suscetibilidade
3
e resistência ao Bz em clones isolados da cepa Colombiana, em modelo murino recentemente
infectado (fase aguda) demonstraram alta resistência dos clones à quimioterapia nesta cepa, com-
prometendo as possibilidades de cura e/ou controle da doença em indivíduos cronicamente infec-
tados com aesta cepa (CAMANDAROBA et al., 2003). Contudo o efeito benéfico do tratamento
com Bz em modelo murino de cardiomiopatite chagásica crônica, infectado com cepa Colombia-
na, revela um decréscimo no parasitismo, miocardite e níveis de anticorpos após tratamento
(GARCIA et al., 2005).
1.2
O ciclo de vida de Trypanosoma cruzi
Segundo a revisão de TYLER E ENGMAN (2001), o ciclo evolutivo de T. cruzi envolve a
passagem obrigatória em dois hospedeiros. Durante o seu ciclo de vida, o parasita sofre alterações
morfológicas, ultra-estruturais, funcionais e bioquímicas.
No sangue periférico do hospedeiro mamífero, formas tripomastigotas de T. cruzi consti-
tuem uma população heterogênea constituídas de duas morfologias básicas, as quais são geralmen-
te descritas como delgadas ou largas. Consequentemente, o inseto vetor, quando faz o repasto
sanguíneo em um animal infectado, ingere uma população pleomórfica de tripomastigotas sanguí-
neos e menos de 10% de formas amastigotas.
Durante o repasto sanguíneo, as formas tripomastigotas no sangue do hospedeiro mamífe-
ro são ingeridas pelo inseto vetor. Ao atingirem o sistema digestivo, as formas tripomastigotas
sanguíneas transformam-se em epimastigotas. Há relatos que tripomastigotas podem se transfor-
mar em uma forma aredondada a qual possui um flagelo livre, geralmente referida como esfero-
mastigota. No intestino as formas epimastigotas dividem-se repetidamente por um processo de
fissão binária e podem aderir à parede das células intestinais através de hemidesmossomas (GAR-
CIA & AZAMBUJA, 1991). No reto, certa porção de epimastigotas diferencia-se em tripomasti-
gotas metacíclicos, que ao serem eliminados com as excretas do triatomíneo, podem penetrar, via
o local da picada por descontinuidades da pele ou mucosas, conduzindo à infecção.
A transformação epimastigota-tripomastigota metacíclico é chamada de metaciclogênese e
é guiada por interações hidrofóbicas entre o flagelo e a parede do intestino e mediada por AMP
cíclico.
Tripomastigotas metacíclicos são capazes de infectar uma variedade de células nucleadas
de mamíferos. A característica principal das formas tripomastigotas que não se dividem (formas
metacíclicas e formas derivadas de tecidos) pode ser a invasão de células de mamíferos. Estas for-
mas longas, altamente móveis, expressam um número de moléculas de reconhecimento e sinaliza-
4
ção celular que medeiam á adesão e penetração em uma ampla variedade de tipos celulares (BUR-
LEIGH & WOOLSEY, 2002).
A invasão ocorre por um mecanismo não usual no sentido que é diferente da fagocitose
clássica. O processo envolve o recrutamento e fusão de lisossomos da célula hospedeira para o
local de entrada do parasita (SCHENKMAN et al., 1991; TARDIEUX et al., 1992; ANDREWS,
1995). Este evento é suportado pela presença de marcadores lisossomais na membrana dos vacúo-
los que contêm parasitos e colocalização dos mesmos com grupos de lisossomos.
Os tripomastigotas escapam do vacúolo lisossomal e se diferenciam em formas amastigo-
tas. Os amastigotas proliferam no citoplasma da célula hospedeira e a alta densidade de amastigo-
tas, aliada à condições fisiológicas, bioquímicas e moleculares ainda não completamente elucida-
das, origina tripomastigotas sanguíneos. Como mencionado acima, dois tipos morfológicos de
tripomastigotas sanguíneos são observados - formas delgadas, com um núcleo alongado, um kD-
NA subterminal e um pequeno flagelo livre – formas largas com um núcleo oval, kDNA termi-
nal e um longo flagelo (BRENER, 1973 ).
Células que são prematuramente lisadas podem também liberar amastigotas, que são ob-
servados na corrente sanguínea durante a fase aguda. Essas formas amastigotas são capazes de
propagar a infecção, uma vez que elas podem infectar células, particularmente células fagocíticas,
embora por um mecanismo diferente dos tripomastigotas (TYLER & ENGMAN, 2001).
Finalmente tripomastigotas e amastigotas no sangue de um mamífero infectado comple-
tam o ciclo de vida, quando do repasto sanguíneo pelo inseto vetor. O ciclo de vida do T. cruzi
está ilustrado na Figura 1.2.
Figura 1.2. Ciclo de vida do T. cruzi
(modificado de www.dpd.cdc.gov/dpdx).
5
1.3
Metaciclogênese de Trypanosoma cruzi
A transformação de epimastigotas em tripomastigotas metacíclicos (metaciclogênese) o-
corre naturalmente no trato digestivo do inseto vetor (BRENER, 1973; DE SOUZA, 1984). A
metaciclogênese é um evento crucial no ciclo de vida do T. cruzi e tem sido o tópico de muitas
investigações que usam culturas in vitro (KOLLIEN & SCHAUB, 2000). O estudo da morfogênese
dos tripanossomatídeos fornece informações importantes relativas à diferenciação em eucariotos
inferiores.
O estabelecimento de condições experimentais para cultura axênica de T. cruzi tornou pos-
sível o estudo da metaciclogênese. Tripomastigotas metacíclicos podem ser obtidos “espontanea-
mente” em culturas na fase estacionária de crescimento (CAMARGO, 1964).
CONTRERAS et al. (1985) descreveram um meio semi-definido que reproduz a metaci-
clogênese in vitro do T. cruzi sem que ocorra replicação celular. Nesta condição, epimastigotas do
clone Dm28c cultivados em meio LIT são submetidos a um estresse nutricional em meio TAU
(Triatominie Artificial Urine) que simula a urina do inseto vetor e posteriormente são incubados em
TAU S (TAU suplementado com 10% de soro fetal bovino). Ao final de seis dias de incubação a
28ºC, aproximadamente 95% das células da cultura são tripomastigotas metacíclicos.
CONTRERAS et al. (1985) utilizaram um meio de diferenciação quimicamente definido
para obter grandes quantidades de tripomastigotas metacíclicos, onde investigaram também as
propriedades biológicas, assim como a síntese de proteínas e expressão de antígenos de superfície
estágio-específicos durante a diferenciação in vitro.
O aminoácido L-Prolina foi adicionado ao meio TAU (TAU P) e mais tarde outros dois
aminoácidos adicionados ao meio TAU P, o ácido glutâmico e ácido aspártico, acrescido de glico-
se, resultou em meio quimicamente definido, TAU 3AAG. L-Prolina potencializa a transformação
de T. cruzi atuando como fonte de energia, o que é confirmado em um trabalho comparativo de
alguns fatores que induzem a formação do estágio metacíclico de T. cruzi (HOMSY et al., 1989).
Deste modo, o estresse nutricional resultante da transferência de epimastigotas cultivados
em meio rico em nutrientes (LIT) para um meio pobre (TAU S, TAU P, TAU 3AAG) pode de-
sencadear o processo de diferenciação do parasita. O estresse nutricional provocaria um desequilí-
brio metabólico que afetaria o programa de expressão gênica, conduzindo à expressão preferencial
de proteínas envolvidas no processo de diferenciação.
Em uma série de experimentos de metaciclogênese em meio quimicamente definido, foi
noticiado que epimastigotas aderem ao substrato da garrafa de cultura antes da diferenciação para
tripomastigotas. Interessantemente, um fenômeno similar tem sido observado no interior do hos-
pedeiro invertebrado, onde no intestino, os epimastigotas se dividem repetidamente por um pro-
6
cesso de fissão binária e podem aderir às células intestinais por hemidesmossomas (ZELEDON et
al., 1999).
O papel de AMPc na taxa de metaciclogênese do T. cruzi em meio quimicamente definido,
TAU P e TAU suplementado com glicose (TAU G), foi avaliado e os resultados mostram que o
processo de metaciclogênese foi estimulado quando células em diferenciação foram colocadas em
presença de AMPc ou análogos (GONZALEZ-PERDOMO et al., 1988).
1.4
A biologia celular de Trypanosoma cruzi
T. cruzi apresenta o corpo celular de todas as formas evolutivas do ciclo de vida revestido
por uma membrana plasmática típica, citoplasma com organelas especializadas e núcleo compar-
timentalizado. Todos os membros da família Trypanosomatidae possuem um flagelo, o qual e-
merge de uma área de invaginação da membrana que reveste o corpo celular e forma a bolsa flage-
lar. Importantes funções celulares são atribuídas ao flagelo como a motilidade do parasita, intera-
ção inseto vetor-célula hospedeira e antigenicidade.
A superfície da membrana apresenta um número de macromoléculas com funções distin-
tas importantes para a sobrevivência do parasita em ambientes geralmente desfavoráveis. A maio-
ria das macromoléculas na superfície de T. cruzi são membros das três grandes famílias: muci-
nas/mucinas-like, trans-sialidases/sialidases-like e glicoinositolfosfolipideos (GIPLs) (FRASCH,
2003).
O citoesqueleto é característico em tripanossomatídeos pela presença de uma camada de
microtúbulos localizada abaixo da membrana plasmática e designada como microtúbulos subpeli-
culares. Observações mostram que os microtúbulos subpeliculares são conectados uns aos outros
e com a membrana plasmática por pequenos filamentos de natureza desconhecida. Esta associa-
ção é provavelmente responsável pela rigidez da célula. Microtúbulos são essencialmente constitu-
ídos de alfa e beta tubulina. Pouca informação é conhecida sobre filamentos intermediários em
tripanossomatídeos (DE SOUZA, 2002).
O flagelo é uma estrutura presente em todos os membros da família Trypanosomatidae. O
flagelo de T. cruzi tem uma estrutura básica o qual é similar a outros flagelos, mostrando um pa-
drão de nove pares de microtúbulos periféricos e um par central. O tamanho é variável dependen-
do do estágio de desenvolvimento. Usualmente o flagelo é aderido ao corpo celular em uma região
determinada do flagelo, a região FAZ (Flagellar Attachment Zone) (BRENER & BARRAL-NETTO,
2000).
Peroxisomos são designados glicossomos em tripanossomatídeos. Esta organela é definida
como uma estrutura citoplasmática, envolta por membrana única a qual contém catalase e oxida-
7
ses. Estudos de fracionamento celular e análises bioquímicas encontraram enzimas glicolíticas
localizadas neste compartimento celular.
Acidocalcissomo é uma organela que foi primeiro caracterizada em Trypanosoma brucei. A-
presenta-se como um vacúolo citoplasmático o qual contém uma alta concentração de cálcio e
atividade ATPase de translocação Ca
++
H
+
. Outros elementos têm sido encontrados no interior
da organela como P, Mg, Na, Zn, Cl, K e S. Funcionalmente o acidocalcissomo apresenta envol-
vimento em vários processos biológicos. O primeiro e melhor caracterizado é o papel na estoca-
gem de cálcio a ser utilizado em certos momentos do ciclo de vida do parasita, onde o forneci-
mento de cálcio do ambiente torna-se insuficiente. O cálcio está envolvido em vários processos de
sinalização incluindo transformação celular e interação celular, sendo que a participação no arma-
zenamento de energia e regulação de pH do citoplasma também foi documentada (DO CAMPO
& MORENO, 1999).
Reservossomos são organelas geralmente esféricas com diâmetro médio de 0,7 µm, cerca-
das por uma unidade de membrana. Sua morfologia, entretanto, pode variar com as condições e a
cepa do parasita. A matriz do reservossomo é ligeiramente densa e apresenta inclusões eletrolu-
centes. Estudos citoquímicos mostraram que a matriz é feita principalmente de proteínas e as in-
clusões contêm lipídios (DE SOUZA, 1984). Estas organelas foram assim denominadas porque
todas as macromoléculas ingeridas pelo parasita através de um processo endocítico acumulam-se
nela. Os reservossomos em epimastigota estão localizados principalmente na região posterior da
célula. Eles desaparecem gradualmente quando epimastigotas são incubados em meio pobre, con-
dição que dispara o processo de transformação de epimastigotas não infectivos em formas tripo-
mastigotas infectivas (BONALDO et al., 1988).
PORTO-CARREIRO et al. (2000) propuseram, com base na cinética de endocitose, que a
rede formada por túbulos e vesículas acídicas, que se estende da região anterior do epimastigota
até as proximidades dos reservossomos, constitui o endossoma inicial, sendo que um marcador do
endossoma inicial já foi clonado e seqüenciado (ARARIPE et al., 2005).
O núcleo de T. cruzi apresenta organização estrutural similar a de outras células eucarióti-
cas. Seu tamanho é relativamente pequeno, medindo aproximadamente 2,5 µm, sendo que sua
forma difere entre as várias formas do parasita. Epimastigotas apresentam um núcleo arredonda-
do, com um nucléolo grande e uma região de heterocromatina próxima ao envelope nuclear. Em
contraste, tripomastigotas apresentam um núcleo alongado, sem um nucléolo evidente e com o
material de heterocromatina ocupando todo o espaço nuclear (ELIAS et al., 2001).
O nível de compactação da cromatina também está associado aos eventos de transcrição,
assim nos tripomastigotas são observados níveis mais elevados de compactação da cromatina e
mais reduzido de transcrição. Os níveis de compactação da cromatina, em tripomastigotas são
atribuídos ás variante de suas histonas H1 que se dissociam mais facilmente dos nucleossomos e
8
conferem à cromatina uma estrutura mais aberta do que a de outros eucariotos (ELIAS et al.,
2001).
Em T. cruzi, assim como em outros membros da ordem Kinetoplastida, existe apenas uma
mitocôndria que se estende por todo o corpo celular. Numa certa porção da mitocôndria, locali-
zada próximo ao corpúsculo basal, existe um arranjo complexo de fibrilas de DNA na matriz mi-
tocondrial (kDNA), formando uma estrutura conhecida como cinetoplasto, a qual é característica
da ordem Kinetoplastida.
O kDNA é composto por dois tipos de moléculas circulares, os minicírculos e maxicírcu-
los que são topologicamente concatenados formando uma rede na matriz mitocondrial. Minicírcu-
los codificam pequenos RNAs guias envolvidos no processo de edição de RNA, enquanto os ma-
xicírculos codificam rRNAs e proteínas mitocondriais. Os tripanossomatídeos apresentam dife-
renças no arranjo de kDNA, de acordo com a espécie e o estágio de desenvolvimento. O estado
topológico do DNA e sua regulação por diferentes enzimas representam um aspecto importante
no entendimento da organização e função do DNA em tripanossomatídeos. Além disso, enzimas
que participam da replicação, transcrição e recombinação do kDNA representam alvos potenciais
para quimioterapia em infecções por tripanossomatídeos (GONZALES-PERDOMO et al., 1990,
CAVALCANTI et al., 2004).
O cinetoplasto das formas epimastigotas e amastigotas de T. cruzi apresentam morfologia
similar. O material filamentoso está arranjado como uma fileira de fibrilas fortemente empacotada,
orientadas paralelamente ao eixo longitudinal do protozoário. Existe um espaço entre o cineto-
plasto e a membrana mitocondrial interna no qual é possível ver cisternas. O cinetoplasto de tri-
pomastigotas tem formato mais arredondado e pode apresentar dois aspectos: uma estrutura em
três ou quatro fileiras duplas de fibras paralelas, usualmente denominadas cinetoplasto em forma
de cesta (MEYER & De SOUZA, 1976) ou uma estrutura na qual os filamentos estão em um
estado disperso, perdendo o arranjo ordenado típico do cinetoplasto da maioria dos tripanossoma-
tídeos.
1.5
A biologia molecular de Trypanosoma cruzi
1.5.1 Organização genômica dos tripanossomatídeos
O genoma de T. cruzi apresenta grande variabilidade intra-específica e possui duas frações,
mitocondrial e nuclear. Apesar da estrutura clonal das populações desta espécie, trocas genéticas
parecem contribuir para tal heterogeneidade (MACHADO & AYALA, 2001; GAUNT et al.,
2003).
Os cromossomos dos tripanossomatídeos não se condensam durante o ciclo celular, difi-
cultando a análise de seus cariótipos (VICKERMAN & TETLEY, 1977). Portanto, o número de
9
cromossomos em T. cruzi foi avaliado por eletroforese em campo pulsado e outras técnicas com-
plementares, por exemplo, hibridação com sondas teloméricas. Os dados disponíveis antes da
liberação do seqüenciamento do genoma de T. cruzi sugeriam que o tamanho fosse de 87 Mbp
(CANO et al., 1995). Isolados de T. cruzi I e II mostraram um número variável de bandas cromos-
somicas entre 17 e 22 compreendidas em 0,4 e 3,3 Mbp genoma haplóide (VARGAS et al., 2004).
A maioria dos cromossomos ocorre aos pares, mas não é possível excluir a existência de
cromossomos presentes em uma única cópia ou em cópias múltiplas. Os homólogos divergem em
seus tamanhos, provavelmente devido a diferenças no número de seqüências repetitivas, particu-
larmente nos domínios sub-teloméricos, e a grandes deleções ou inserções em regiões internas. Os
minicromossomos são raros, podendo estar ausentes em certas cepas (HENRIKSSON 1996).
Apesar de sua notável variabilidade intra-específica, que inclui vasto polimorfismo cro-
mossômico numérico e estrutural, o cariótipo do T. cruzi tende a conservar sua organização gênica.
Assim, vários grupos de genes ligados, inclusive grandes famílias multigênicas, são observados
com a mesma estrutura, em diferentes linhagens (HENRIKSON et al., 1995). Do mesmo modo, o
cariótipo de T. cruzi é estável nas diferentes formas evolutivas (AYMERICH & GOLDENBERG,
1989).
Projetos em consórcio para o sequenciamento genômico de T.cruzi foram iniciados em
1996, sendo que a primeira versão não anotada de um milhão de leituras foi liberada em 2004
(LUCHTAN et al., 2004) e finalmente, em 2005, foi publicada a primeira versão referente à mon-
tagem do seqüenciamento do genoma de T. cruzi (EL-SAYED et al., 2005). A cepa utilizada para o
seqüenciamento foi a CL Brener, um membro do subgrupo IIe (TIBAYRENC, 2003) por ser uma
das melhores caracterizadas experimentalmente (ZINGALES et al., 1997). Contudo a cepa CL
Brener acabou revelando-se como tendo um genoma muito complexo, dificultando sua monta-
gem. A complexidade se dá pelo fato da cepa CL Brener ser híbrida, sendo que dados de diferen-
tes grupos (BRISSE et al., 1998; MACHADO & AYALA, 2001; GAUNT et al., 2003; BRISSE et
al., 2003) são consistentes com o fato de que a cepa é resultante de dois eventos distintos de hibri-
dação, entre o subgrupo IIb e IIc, sendo que este último também é aparentemente híbrido, deri-
vado de T. cruzi I (WESTENBERGER et al., 2005 apud EL-SAYED et al., 2005).
O seqüenciamento foi feito através da técnica de “whole genome shotgun” (WGS), sendo que
o alto conteúdo de repetições do genoma - inicialmente estimado em 35% (AGUERO et al., 2000)
e posteriormente revelado acima de 50% - e a sua natureza híbrida limitaram a estratégia de se-
quenciamento progressivo de clones em cromossomos artificiais de bactérias (EL-SAYED et al.,
2005). No total, foi produzida uma cobertura genômica de 19 vezes. Os parâmetros de montagem
tiveram de ser adaptados para lidar com a variabilidade dos alelos divergentes entre as cepas pa-
rentais, e também foi necessário gerar posteriormente uma cobertura genômica de 2,5 vezes da
10
cepa Esmeraldo, pertencente ao subgrupo IIb, para que fosse possível distinguir os dois haplóti-
pos e auxiliar na montagem (EL-SAYED et al., 2005).
A montagem totalizando 67 Mb consiste de 5.489 scaffolds, contendo 8.740 contigs, os
quais representam muito bem o estado extremamente fragmentado da atual versão do genoma. A
análise da fração anotada, que perfaz 60,7 Mb, demonstra que 30,5 Mb são compostos de seqüên-
cias encontradas pelo menos duas vezes, o que sugere que elas são oriundas dos diferentes hapló-
tipos que compõe o genoma da cepa CL Brener (EL-SAYED et al., 2005).
Os dois haplótipos mostram um alto grau de sintenia, com a maioria das diferenças causa-
das por inserções ou deleções nas regiões teloméricas ou intergênicas, ou pela amplificação de
seqüências repetitivas. A divergência média entre os dois haplótipos é de 5,4% e as regiões codifi-
cadoras de proteínas são consideravelmente mais conservadas (2,2%) (EL-SAYED et al., 2005).
A estimativa do conteúdo gênico foi de 12.000. Atualmente, 22.570 modelos gênicos fo-
ram preditos, sendo que 6.159 representam alelos presentes no haplótipo IIb, 6.043 representam
alelos dos outros haplótipos e 10.368 representam seqüências que não puderam ser atribuídas a
um haplótipo (EL-SAYED et al., 2005).
A maioria das seqüências repetitivas do genoma de T. cruzi são retrotransposons, seqüên-
cias teloméricas e famílias gênicas de proteínas de superfície. As maiores famílias gênicas são as
proteínas de superfície associadas à mucina (MASP), trans-sialidades (TS), mucinas e a glicoprote-
ase de superfície gp63, as quais perfazem cerca de 18% dos genes codificadores de proteínas.
O genoma de outros dois tripanossomatídeos, T. brucei e L. major, também foram publica-
dos em 2005 (BERRIMAN et al., 2005; IVENS et al., 2005), o que permitiu fazer comparações
entre os três patógenos, que compartilham muitas estruturas celulares, mas que possuem diferen-
ças grandes em sua forma de interagir com o hospedeiro. A análise do proteoma compartilhado
por esses organismos revelou um conjunto de 6.158 grupos de genes ortólogos (COG, clusters of
orthologous genes), bem como 1.014 COGs compartilhados por somente dois dos tripanossomatí-
deos (EL-SAYED et al.., 2005).
Mesmo tendo divergido provavelmente há mais de 200 milhões de anos (OVERATH et
al., 2001; STEVENS et al., 2001), os genomas dos tripanossomatídeos apresentam um grau muito
grande de sintenia. De todos os genes de T. brucei e L. major, 68 e 75% permanecem no mesmo
contexto genômico de T. cruzi. Além disso, a grande maioria (94%) dos COGs triplos que formam
o proteoma central dos três tripanossomatídeos estão em regiões de sintenia conservada.
1.5.2 A transcrição policistrônica
Na maioria dos eucariotos, exons e introns alternam-se ao longo dos genes. O evento de
transcrição é, na maioria dos casos, regulado por uma seqüência promotora à montante da região
codificadora. Ao transcrito primário, em sua extremidade 5’, é adicionado um resíduo metil-
11
guanosina-trifosfato (m7Gppp, ou cap) e, em sua extremidade 3’, uma cauda poli-A. Pela reação
de cis-splicing, são removidos os introns deste transcrito e o exons são ligados (PROUDFOOT et
al., 2002).
Os tripanossomatídeos apresentam diferenças com relação a esse perfil. Até recentemente,
não havia nenhum indício da existência de introns nos genes desses organismos. Essa visão foi
modificada em 2000, quando foi identificado um intron em um gene codificador da enzima poli-A
polimerase de T. brucei e T. cruzi (MAIR et al., 2000). A existência de uma maquinaria de remoção
de introns foi comprovada pela identificação de um gene codificador do snRNA U1 em T. brucei
(DJIKENGI et al., 2001).
A transcrição nos tripanossomatídeos produz unidades policistrônicas (VANHAMME &
PAYS, 1995; TEIXEIRA, 1998; TEIXEIRA & DA ROCHA, 2003) que são representadas por
uma única molécula de RNA geralmente contendo diversos genes que não são relacionados a uma
determinada via metabólica, como ocorre nos operons de procariotos. Além disso, os genes de
uma mesma unidade de transcrição policistrônica podem apresentar diferenças grandes nos níveis
de expressão, demonstrando a importância de mecanismos pós-transcricionais de controle da ex-
pressão gênica (VANHAMME & PAYS, 1995). Essa molécula de RNA deve ser processada, pelo
mecanismo do trans-splicing (SUTTON & BOOTHROYD, 1986), para gerar unidades monocis-
trônicas traduzíveis.
No processo de trans-splicing, semelhante ao processo de cis-splicing, as unidades codificado-
ras são separadas e é adicionada na extremidade 5’ uma seqüência extremamente conservada, es-
pécie-específica, de 39 nucleotídeos, denominada seqüência líder (SL) ou miniexon (McCARTHY-
BURKE et al., 1989; NILSEN, 1992), a qual também é encontrada em nematódeos (KRAUSE &
HIRSH, 1987), trematódeos e em Euglena sp.
Nesta reação, participam duas moléculas de RNA, uma doadora e outra aceptora. A doa-
dora é um precursor do miniexon que, em T. cruzi, possui cerca de 110 nucleotídeos (ZWI-
ERZYNSKI & BUCK, 1991). A aceptora é o transcrito derivado da unidade policistrônica ao qual
o miniexon é transferido. O complexo enzimático envolvido nesta reação é semelhante ao descrito
para a de cis-splicing (LAIRD, 1989).
Os transcritos processados são estabilizados pela estrutura cap 4 do miniexon (ULLU &
TSCHUDI, 1991) e pela adição de uma cauda poli-A, na extremidade 3’, sendo que a adição de
ambos elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et al., 1993). Regiões ricas em resíduos de
pirimidinas, além de uma seqüência consenso (AG) para o trans-splicing, regulam a adição do minie-
xon em um cistron e da cauda poli-A no cistron a montante. Deleções nestas regiões impedem o
correto processamento destes transcritos (MATTHEWS et al., 1994).
Os três tipos de RNA polimerase, I, II e III, descritos em eucariotos superiores, já foram
observados em tripanossomatídeos (CORNELISSEN et al., 1989). Os genes que codificam para as
12
suas subunidades principais foram clonados e caracterizados nestes protozoários (KOCK et al.,
1988; EVERS et al, 1989; SMITH et al., 1989). Em T. cruzi, apenas promotores associados aos ge-
nes ribossomais, transcritos pela pol I, promotores da pol III e o associado ao miniexon, transcri-
to pela pol II, foram caracterizados (DIETRICH et al., 1993; NUNES et al., 1997). Ainda não fo-
ram identificadas as regiões promotoras para os demais genes transcritos pela RNA polimerase II
que codificam seqüências protéicas (GILINGER & BELLOFATTO, 2001). A atividade destes
promotores de T. cruzi parece ser controlada por fatores de transcrição que são cepa-específicos.
Por exemplo, o promotor ribossomal da cepa CL não é funcional em outras cepas.
1.5.3 A regulação da expressão gênica em
Trypanosoma cruzi
T. cruzi apresenta diversas características peculiares, como a estrutura menos condensada
da cromatina, o caráter repetitivo de seu genoma, a distribuição dos genes ao longo do cromos-
somo em grandes segmentos contendo de dezenas a centenas de genes cuja região codante se en-
contra na mesma polaridade da molécula de DNA, a edição das moléculas de RNA mitocondrial,
o trans-splicing, a transcrição policistrônica e a ausência de seqüências promotoras típicas para a
transcrição de genes codificadores de proteínas. Todos esses elementos reforçam a idéia de que a
regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos possua características distintas com relação
aos outros organismos. O fato de que genes presentes na mesma unidade policistrônica apresen-
tam níveis de mRNA processado distintos corroboram à idéia de que essa regulação se dê em ní-
vel pós-transcricional.
Na maioria dos eucariotos, a regulação da expressão gênica é, em grande parte, atribuída
ao controle do início de transcrição pela RNA polimerase II. No entanto, conforme descrito aci-
ma, isso não parece ocorrer em T. cruzi. À exceção dos promotores dos genes do miniexon, ne-
nhum promotor característico para esta enzima foi observado e há evidências de que o início da
transcrição da maioria dos genes codificadores de proteínas seja promíscua (VANHAMME &
PAYS, 1995; CLAYTON, 2002). Assim, os mecanismos de regulação da expressão gênica, devem
ocorrer, em sua maioria, após o término da transcrição, e são denominados de regulação pós-
transcricional. Tal regulação possui diversos pontos potenciais de ocorrência, os quais podem ser
organizados da seguinte forma:
•
Trans-splicing
: o processamento do mRNA policistrônico em unidades de mRNA monocis-
trônico, com a concomitante adição da seqüência líder (SL) e da cauda poli-A pode ser um sí-
tio de controle pós-transcricional.
• Exportação do núcleo para o citoplasma: alguma forma de controle seletivo da passagem
dos mRNAs do núcleo para o citoplasma pode causar expressão diferencial.
13
• Degradação citoplasmática dos mRNAs: cada mRNA tem uma meia-vida própria e o ba-
lanço entre a sua produção e degradação seria o principal elemento na determinação da quan-
tidade de proteína que será produzida. No caso do T. cruzi, o fator inicial dessa equação (trans-
crição) provavelmente não está sendo regulado de forma fina e, portanto, a obtenção de regu-
lação gene-específica seria determinada pela degradação, a qual é um mecanismo regulatório
pós-transcricional.
• Associação à maquinaria de tradução: caso o mRNA seja processado e esteja disponível no
citoplasma, sem estar sendo degradado, ainda é possível que tal elemento não tenha sua in-
formação transformada em proteína. Fatores controlando o acesso dos mRNAs citoplasmáti-
cos à maquinaria de tradução podem atuar de forma seletiva, criando um mecanismo de con-
trole pós-transcricional da expressão gene-específica.
• Estabilidade protéica: um fenômeno pós-traducional, mas sem dúvida uma forma de um
organismo sem um controle restrito sobre a transcrição de seus genes poder criar diferenças
no conjunto de proteínas disponíveis em determinado momento.
• Modificações pós traducionais modificações pós traducionais como hiper metilação de
histona H2A e mono acetilação de histonas H2A, H2B e H4 (JANSEN et al., 2006) são even-
tos de remodelação da estrututa da cromatina em Trypanosoma. Outras modificações como
acetilação, metilação, glicosilação, ancora de GPI são descritas e modulam a expressão, a di-
versidade e as funções protéicas.
Da mesma forma, fatores epigenéticos, ou seja, aqueles que modificam a cromatina sem
alterar a seqüência de nucleotídeos, tais como acetilação, ADP-ribosilação ou fosforilação de pro-
teínas da cromatina e metilação ou hidroxilação de bases poderiam estar atuando na regulação da
expressão gênica destes parasitos.
As formas epimastigotas e amastigotas transcrevem muito mais que as formas tripomasti-
gotas, contudo, a redução no nível de transcrição é geral e não gene dependente (ELIAS et al.,
2001). Entretanto, é possível observar que a expressão de alguns genes pode manter-se constante
ou aumentar, mesmo com a queda dos níveis de transcrição (ABUIN et al., 1999; TOMAS &
KELLY, 1996; RECINOS et al., 2001). Também é possível observar proteínas de expressão tran-
siente nas formas em diferenciação (CONTRERAS et al., 1985). Em T. cruzi, foi demonstrado que
moléculas de RNA mensageiro podem ser mantidas estáveis e não associadas à polissomos, , sen-
do passíveis de tradução in vitro (GOLDENBERG et al., 1985). Há evidências de que o controle da
associação à maquinaria de tradução seja o mecanismo principal na expressão diferencial de alguns
genes durante a metaciclogênese de T. cruzi (ÁVILA et al., 2001; DALLAGIOVANNA et al., 2001;
FRAGOSO et al., 2003).
14
Ainda, experimentos realizados com o gene da amastina de Leishmania indicam que a sua
expressão é dependente de seqüências contidas na região 3’UTR deste gene. Tais seqüências seri-
am responsáveis pela associação desta molécula de RNA mensageiro aos polissomos e pelo au-
mento de sua taxa de tradução, sem que a estabilidade deste transcrito fosse alterada (BOUCHER
et al., 2002).
A relevância da porção 3’-UTR na regulação da expressão gênica também pode ser avalia-
da em experimentos de transfecção envolvendo genes estágio-específicos (gp85/tripomastigotas
sangüíneos e amastigotas, gp72/epimastigotas, gp82/tripomastigotas metacíclicos) ou de expres-
são constitutiva (gGAPDH e hsp60) e o gene da luciferase, como gene repórter. Nestes ensaios, a
região 3’-UTR dos genes em estudo foram inseridas logo depois do gene da luciferase. Após a
transfecção das diferentes formas evolutivas de T. cruzi com estas construções, foi possível obser-
var que construções com as regiões 3’-UTR específicas justapostas ao gene da luciferase tiveram
padrão de expressão idêntico aos de seus genes de origem (NOZAKI & CROSS, 1995).
Por outro lado, há descrições de que a estabilidade dos transcritos de certos genes em tri-
panossomatídeos varia ao longo do ciclo celular, alterando a sua expressão (HEHL et al., 1994;
BERBEROF et al., 1995; NOZAKI & CROSS, 1995). Muitos fatores que contribuem para esta
estabilidade foram caracterizados (CLAYTON, 2002; D´ORSO et al., 2003; SBICEGO et al.,
2003).
Seqüências presentes nas regiões intergênicas e 5’ UTR também podem estar relacionadas
à expressão gênica em T. cruzi. Foi descrita uma proteína que reconhece especificamente motivos
poli [dT-dG] em fitas simples de regiões intergênicas de T. cruzi, e que pode estar envolvida em
mecanismos de regulação gênica (DUHAGON et al., 2003).
A identificação de elementos que podem estar atuando na capacidade de mRNAs distintos
se associarem à maquinaria de tradução constitui em uma forma de se regular pós-
transcricionalmente a expressão gênica. A fosforilação de proteínas ácidas nos ribossomos pode
alterar a função destas organelas e ter um papel na regulação da expressão gênica em T. cruzi
(GOMEZ et al., 2001). O produto do gene TcJ6p, uma chaperonina de T. cruzi, parece estar en-
volvida no início da tradução (SALMON et al., 2001).
1.6
Monitoramento da expressão gênica em larga escala: microarranjos de DNA
A técnica de microarranjo foi proposta inicialmente por SCHENA et al. (1995), em um arti-
go descrevendo a aplicabilidade da técnica na quantificação de um conjunto restrito de genes de
Arabidopsis thaliana. Logo após, o mesmo grupo demonstrou a aplicabilidade da técnica para um
conjunto maior de genes, contendo fragmentos grandes do genoma de Saccharomyces cerevisiae (S-
CHENA et al., 1995), 1000 genes humanos (SCHENA et al., 1996), genes relacionados ao câncer
15
(DeRISI et al., 1996) e a doenças inflamatórias (HELLER et al., 1997). Estes primeiros artigos fo-
cam principalmente na demonstração da viabilidade da técnica, deixando as questões biológicas
para um papel secundário ou praticamente ausente. No entanto, os três anos seguintes represen-
tam uma mudança radical na utilização dos microarranjos, principalmente pela avaliação do trans-
criptoma completo do S. cerevisiae em um microarranjo (LASHKARI et al., 1997), que foi utilizado
também na avaliação do transcriptoma no ciclo celular desta levedura (SPELLMAN et al., 1998).
Microarranjos são, em princípio e na prática, extensões de métodos baseados em hibrida-
ções (Sourthern e Northern blots, dot blots), os quais há décadas são utilizados para identificar e
ácidos nucléicos em amostras biológicas. Projetos de seqüenciamento genômico, desenvolvimento
de técnicas de automação e vantagens nos métodos de marcação fluorescente para detecção de
ácidos nucléicos propiciaram a confecção e aplicabilidade dos microarranjos para uma série de
propósitos (EISEN & BROWN, 1999).
Microarranjos de DNA são arranjos microscópicos de um grande número de seqüências
de DNA (sondas) imobilizadas em superfícies sólidas, geralmente lâminas de vidros especializadas
e para as quais amostras de interesse (alvos) são marcadas com corantes fluorescentes e hibridadas
para o arranjo de DNA. Após tempo suficiente para hibridação e etapas apropriadas de lavagem,
uma imagem do arranjo pode ser adquirida através do escaneamento, processo no qual a lâmina é
submetida a um feixe de raio laser em um comprimento de onda específico, o qual possibilita a
detecção dos sinais fluorescentes emitidos pelos fluoróforos utilizados no processo de marcação
dos alvos. A representação de espécies de ácidos nucléicos individuais em uma amostra complexa,
por exemple, RNA total e polissomal é refletida pela quantidade de hibridação para sondas de
DNAs complementares imobilizados em posições conhecidas no microarranjo. Contudo, a preci-
são dos resultados obtidos é alcançada por minimizar as variáveis existentes nas múltiplas etapas,
desde seleção e confecção das sondas, preparação dos alvos, condições de hibridação, análise das
imagens, produção e interpretação dos resultados.
Análises da expressão gênica em Kinetoplastida, através do uso de microarranjos de DNA
e por iniciativas que antecederam os projetos genomas nestes organismos, têm sido publicadas nos
últimos anos. Os dados geram de maneira consistente informações acerca da expressão gênica
estágio específica, ao longo dos estágios evolutivos de organismos como Trypanosoma brucei, onde
um arranjo com 21.024 produtos de PCR foi gerado de uma biblioteca genômica e para os quais
somente 2% dos genes apresentaram expressão diferencial, em nível de transcritos, nas formas
sanguíneas e procíclicas da cepa TREU927/4 (DIEHL et al., 2002), da cepa monomórfica LIS-
TER 427 e pleomórfica TREU927 (BREMS et al., 2005).
Em T. cruzi, microarranjos mostrando a variabilidade genética e expressão diferencial em
dois genomas (cepa Silvio e CL Brener) com sondas oriundas de EST (Expressed Sequence Tags) têm
sido reportados (BAPTISTA et al., 2004), assim como a análise da expressão diferencial de genes
16
em populações susceptíveis e resistentes a benzonidazol in vitro (MURTA et al., 2006) e o perfil
transcricional das fases tripomastigotas e amastigotas induzidas in vitro (MINNING et al., 2003).
Em Leishmania major cepa Friedlin, microarranjos de DNA hibridados com amostras de
mRNA total das formas procíclicas e metacíclicas, em comparações diretas, demonstram 15% dos
genes modulados em pelo menos um experimento de hibridação. Contudo em experimentos de
replicata e ou triplicata, um percentual modesto de genes apresentou modulação em dois ou mais
pontos da diferenciação (SAXENA et al., 2003).
Outro trabalho de microarranjo em Leishmania utilizou 22.000 sondas, avaliando o mRNA
total e encontrou um percentual de 3,2% de sondas com expressão diferencial (AKOPYANTS et
al., 2004). Microarranjos incluindo clones de uma biblioteca de cDNA e ORFs de Leishmania
(n=1900) quantificaram 35% de genes diferencialmente expressos em amastigotas comparados
com 12% em tripomastigotas metacíclicos (ALMEIDA et al., 2004).
Trabalhos pioneiros foram realizados utilizando microarranjos de DNA como ferramenta
para estudar genômica funcional do processo de metaciclogênese in vitro do T. cruzi, clone Dm28c,
onde um arranjo formado por sondas oriundas de PCR gene-específica e bibliotecas de cDNA
(n=6.400) representativas das principais fases da diferenciação em meio quimicamente definido,
foram interrogados com um conjunto amplo de hibridações (n=94) (PROBST, 2005). Outro tra-
balho de caracterização genômica funcional das formas infectivas do ciclo de vida de T. cruzi (me-
tacíclicos versos tripomastigotas de cultura celular), identificou um conjunto de genes diferencial-
mente expressos nestas duas fases evolutivas, quando comparadas com epimastigotas e amastigo-
tas, em hibridações realizadas com réplicas biológicas e técnicas (n=36), em que mais de 80% dos
genes que tinham uma razão de mudançca (fold change) de 1,5 foram considerados pelo teste SAM
(Significant Analysis of Microarray) como tendo uma variação estatisticamente significante. Dentre as
categorias funcionais para as quais puderam ser associados os genes diferencialmente expressos
estão metabolismo, replicação, transcrição, processamento e tradução e 63% dos genes aumenta-
dos em metacíclicos estão anotados como codificadores para proteínas hipotéticas (PAVONI,
2005).
Em conjunto, estes dois trabalhos desenvolvidos no Instituto de Biologia Molecular do
Paraná identificaram genes cuja expressão em nível de mRNA fração total e polissomal encontra-
se modulada durante a diferenciação in vitro e o ciclo de vida do parasita, os quais apontam para
oportuna caracterização posterior. Dentre as abordagens metodológicas possíveis para produzir
um conhecimento mais amplo e específico a respeito da expressão diferencial dos genes diferenci-
almente expressos em T. cruzi, um novo desenho experimental para um microarranjo que contem-
ple genes específicos e previamente selecionados, pode agora ser desenvolvido.
17
1.6.1 Microarranjos de oligonucleotídeos longos
Microarranjos de oligonucleotídeos têm sido uma das plataformas de escolha para análises
da expressão gênica em organismos cujos dados genômicos encontram-se disponíveis. Metodolo-
gicamente, os mesmos são produzidos com sondas entre 50 e 70 monomer (mer), depositadas robo-
ticamente em lâminas especiais para microarranjos, ou sintetizados in situ diretamente em uma
matriz sólida por tecnologia de fotolitografia (25 mer, Affymetrix), nos quais amostras de interesse
são marcadas e hibridadas sob condições apropriadas.
Dados da literatura indicam que oligonucleotídeos a partir de 50 mer, provêem maior es-
pecificidade e sensibilidade para detecção dos sinais de hibridação quando comparados com oli-
gonucleotídeos de, por exemplo, 25 mer, havendo para oligonucleotídeos menores, na maioria dos
casos, a necessidade de sintetizar alguns pares de oligonucleotídeos por gene. LEISKE et al. (2006)
examinaram a importância de existir múltiplas sondas (60 mer) diretamente contra um mesmo
alvo e concluíram que um par de oligonucleotídeos foi suficiente para análise genômica do mi-
crorganismo Burkholderia cenocepacia J2345[A1] (organismo modelo para aquele estudo especialmen-
te por apresentar um genoma rico em CG (66,9%), o que desafia o desenho e aplicação de micro-
arranjo), patógeno oportunista em pacientes imunodeprimidos e especialmente em portadores de
fibrose cística.
Muitos estudos demonstram que oligonucleotídeos de 50 a 70 mer, por serem mais especí-
ficos e sensíveis, determinam resultados mais satisfatórios, na sua maioria quando focados em
genes altamente expressos. RAMDAS et al. (2004) incluiu em um microarranjo de oligonucleotí-
deos com sondas entre 30 e 70 mer, depositados em concentrações entre 20 e 50µM, genes ex-
pressos em baixos níveis em células RKO de câncer de cólon (Sinal/background= 2) e concluiu que
oligonucleotídeos de 70 mer foram capazes de detectar genes pouco expressos.
Como ferramenta de análise para identificar perfil de expressão gênica estágio-específico,
microarranjos de oligonucleotídeos de 70 mer demonstram total aplicabilidade no estudo de ge-
nomas de parasitas patogênicos como, por exemplo, Plasmodium falciparum. BOZDECH et al.
(2003) realizaram uma comparação direta entre os estágios trofozoítas e esquizontes do ciclo de
vida intra-eritrocítico com um microarranjo de 8500 oligonucleotídeos, cobrindo 8008 ORF predi-
tas.
1.7
A
família
de proteínas WD
O repertório de genes que codificam proteínas hipotéticas anotadas no genoma de T. cruzi
perfaz 50%. Análises do transcriptoma da metaciclogênese e ciclo de vida de T. cruzi (PROBST
2005; PROBST & KRIEGER, em preparação; PAVONI 2005) em um microarranjo de cDNA o
qual apresenta uma cobertura em número de genes de aproximadamente 50%, frente aos 12,000
18
módulos gênicos preditos pelo genoma do parasita, corroboram a falta de anotação funcional para
metade dos mesmo. Contudo estudo proteômico em quatro estágios do ciclo de vida de T. cruzi,
identificou um percentual de 30% (838 de 2784) de proteínas previamente documentadas ou espe-
radas serem mais abundante em todos aqueles estágios, 1008 proteínas são anotadas como hipoté-
ticas (ATWOOD et al. 2005). No contexto de proteínas hipotéticas de T. cruzi, módulos conserva-
dos, quando presentes nas seqüências protéicas, reforçam o critério de seleção para caracterização
bioinformática, molecular e funcional destas proteínas, sobretudo quando dados de expressão
diferencial são disponíveis. Na etapa de anotação das sondas no microarranjo acima citado, busca
por similaridade e homologia em banco de dados de proteínas, revelou um número expressivo de
proteínas apresentando motivos WD, associados a papéis relevantes do ponto de vista estrutural e
potencialmente funcional. As proteínas apresentando motivos WD em T. cruzi passaram a ter a-
tenção especial neste trabalho.
Análise genômica e pós genômica em Kinetoplastida apresentam muitos desafios, deter-
minados sobretudo pelo número de genes de um parasita individual e a necessidade de gerar estra-
tégias eficientes para ensaios experimentais, sendo o desafio óbvio a atribuição funcional (GULL,
2001). Ferramentas de análises genômica in silico, para identificação gênica e atribuição funcional
são rotineiramente empregadas, as quais utilizam bancos de seqüências nucleotídicas e de proteí-
nas que possibilitam também estudos de genômica comparativa. Melhorias nos programas com-
putacionais criados para identificação de prováveis homólogos tornam esta etapa mais rápida, fácil
e confiável (ALTSCHUL et al., 1997).
Segundo uma abordagem filogenômica para predição funcional de genes não caracteriza-
dos, Jonathan A. Eisen em 1998 discute que a identificação e análise de similaridade, a qual pode
ser devido à homologia (resultado de evolução divergente a partir de um ancestral comum), não
pode ser alcançada diretamente por comparação entre duas seqüências. Nestes casos, a inferência
de homologia é fundamentada em níveis de positividade e ou similaridade, os quais são valores
aumentados em relação aos encontrados devido a fatores de convergência (relacionados à similari-
dade gênica). Nem todos os homólogos são similares em sequência, podendo ser muito divergen-
tes e a similaridade difícil ou impossível de detectar. Finalmente nem toda similaridade de seqüên-
cia é devido à homologia. Em muitos casos a identificação de homólogos não é suficiente para
realizar predição funcional específica, devido ao fato que nen todos os homólogos apresentam a
mesma função.
Proteínas com motivo WD (triptofano-ácido aspártico) são definidas pela presença de um
motivo que compreende uma região de 44 a 60 aminoácidos que tipicamente contém o dipeptídeo
GH (glicina-histidina) na porção amino-terminal e o dipeptídeo WD na porção carboxi-terminal.
Usualmente, estas proteínas contêm mais de um domínio WD – de 4 a 16 repetições, as quais
estão arranjadas de maneira a formar uma estrutura rígida, conhecida como β-propeller -, caracteri-
19
zando o que se chama de WD repeat (WDR) (SMITH et al., 1999). O grupo estrutural β-propeller é
composto de 4 a 8 unidades, arranjadas em um anel. Cada unidade consiste de uma folha β com 4
fitas antiparalelas (GARCIA-HIGUERA et al., 1998).
As WDR não são caracterizadas por uma seqüência rigidamente conservada, mas sim por
um núcleo conservado, entre o dipeptídeos GH e WD, o qual configura um padrão regular, que
em certas regiões permite limitada variação de aminoácidos em cada posição (GARCIA-
HIGUERA et al., 1998). O padrão regular do motivo WD está ilustrado abaixo.
Figura 1.3 Ilustração esquemática dos elementos estruturais de um motivo WDR.
O x representa qualquer aminoácido encontrado na posição, [0-?] indica um número de aminoácidos possí-
veis de existir e as colunas verticais representam o grupo de aminoácidos mais freqüentemente encontrado
na posição ao longo das regiões variáveis (SMITH
et al.,
1999).
20
O protótipo das proteínas com WDR e melhor caracterizado é a proteína G heterotriméri-
ca, sendo a sua estrutura cristalográfica conhecida (WALL et al, 1995). Sua estrutura é composta
das subunidades α, β e γ, sendo a subunidade α de interação com GTP e esta interação é estabili-
zada pelas subunidades β e γ. A subunidade β é composta de duas regiões distintas: um segmento
α-hélice amino-terminal, seguido de 7 unidades repetidas do (WDR), ilustrados na Figura 1.4. Pro-
teínas G estão envolvidas com transdução de sinal através da membrana plasmática (GARCIA-
HIGUERA et al., 1998).
Figura 1.4 Subunidade β da proteína G heterotrimérica.
O segmento em vermelho corresponde a um único WDR. Os segmentos em verde e azul correspondem aos
outros 6 motivos WDR. O segmento em α hélice corresponde à subunidade γ (http://BMERC-
www.bu.edu/wdrepeat).
Proteínas WD são membros de uma grande família estrutural, não tendo, contudo, o do-
mínio WD per se implicações funcionais claramente conhecidas.
Uma vez que os domínios WDR estão envolvidos e atuam como locais de interação com
outras proteínas, esta caracterização permite avaliar três papeis funcionais gerais, segundo VAN
NOCKER & LUDWIG (2003).
• Servir de locais de interação para duas ou mais proteínas e estimular interação transiente entre
as mesmas. Este tipo de papel é bem ilustrado pela proteína Gβ, já mencionada. As GTPases
heterotriméricas associam-se funcionalmente a uma variedade de receptores de membrana pa-
ra propagar a resposta celular a sinais extracelulares.
• Servir como componente integral de complexos protéicos. Este modelo funcional é prova-
velmente melhor ilustrado pelo complexo U3 snoRNA (small nucleolar RNA), envolvido em
21
splicing de pequenas subunidades de RNA ribossomal. Das 28 subunidades de U3, sete são
proteínas WDR. Muitas outras proteínas WDR são encontradas em complexos relativamente
estáveis, incluindo o complexo de poro nuclear, o fator de transcrição geral TFIID, e o com-
plexo SET1 histona metiltransferase em leveduras.
• Atuar como domínio modular de interação, entre domínios subordinados a WDR, em proteí-
nas multidomínios. Presumidamente, WDR nestes casos atua aproximando as proteínas multi-
domínio para próximo aos alvos.
Na ausência de uma função predita e/ou experimentalmente associada, proteínas da famí-
lia WD podem ser associadas de forma especulativa a diversas funções celulares como transdução
de sinal, splicing do pré-mRNA, regulação da transcrição, montagem do citoesqueleto e tráfego
vesicular.
Análises de genômica comparativa são reportadas na literatura, buscando relacionamentos
funcionais com base em seqüências conhecidas, para proteínas WDR. O número destas proteínas
em T. cruzi, com função putativa ou sem função anotada pervazem aproximadamente 82%.
Nos cinetoplastídeos Leishmania major, Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi, que tiveram
seus genomas recentemente seqüenciados e anotados, pouca informação é disponível acerca da
superfamília de proteínas WD.
Um gene que codifica uma proteína WD em Leishmania amazonensis foi identificado e carac-
terizado molecularmente. O gene denominado LAWD codifica um produto protéico denominada
antígeno triptofano-ácido aspártico de Leishmania (LAWD) o qual apresenta 7 domínios WD es-
tendendo-se para região carbóxi-terminal. A proteína LAWD tem natureza antigênica, sendo que
a proteína rLAWD (proteína recombinante) pôde ser reconhecida pelo soro de pacientes com
leishmaniose (proteína recombinante) e induziu resposta imune em modelo murino. Vacina de
DNA com o gene LAWD e IL12 em camundongos tem reduzido significantemente as lesões nos
tecidos em comparação com a infecção controle, servindo como gene candidato para estudos de
vacinas de DNA em leishmaniose humana. Contudo a função de LAWD permanece desconhecida
(CAMPBELL et al., 2004).
Em T. cruzi, o primeiro membro da família de proteínas WD foi identificado por BRO-
MLEY et al., 2004. Um gene de cópia única codifica a proteína denominada de β-propeller 1
(TcBPP1) e uma análise de sequencia indica a presença de quatro repetições WD com 90% de
probabilidade. Análises de homologia foram positivas com T. brucei, Leishmania, Mus musculus e
Homo sapiens com proteínas de função desconhecida. Estudos de localização celular do gene
TcBPP1, fusionado à GFP (green fluorescent protein) apontam para localização mitocondrial em trans-
fectantes com regiões amino e carbóxi-terminal de TcBPP1. Como hipótese dos autores, um papel
regulatório que envolva interação proteína-proteína, no contexto mitocondrial, tende a ser avaliza-
do.
22
Na maioria dos casos, proteínas localizadas na mitocôndria, incluindo tripanossomas, po-
dem ser identificadas pele presença de uma pré-seqüência amino-terminal de 20-60 aminoácidos
com potencial para formar uma α-hélice anfipática e este arranjo facilita o reconhecimento pela
maquinaria de importe mitocondrial. No entanto, certas proteínas mitocondriais não apresentam
esta pré-seqüência e são importadas para mitocôndria por seqüências sinais internas (BROMLEY
et al., 2004). Análises da região amino-terminal de TcBPP1 por ferramentas online predizem a au-
sência de pré-seqüência com potencial para formar uma α-hélice, implicando que esta proteína é
sinalizada para mitocôndria por outra seqüência não canônica (EMANUELSON et al., 2000. Pou-
cas proteínas localizadas para mitocôndria com domínios WD são descritas, sendo uma delas a
proteína Net2p em levedura, uma proteína de 80kDa associada à mitocôndria, a qual contém repe-
tições WD na extensão carbóxi-terminal e uma região coiled-coil na região amino-terminal. Por en-
saios de duplo híbrido existem evidências que Net2p interage com Dnm1p, uma GTPase associa-
da à membrana com papel crucial na divisão mitocondrial (CERVENY et al., 2001).
Como exemplo de proteínas que apresentam apenas WDR, pode-se citar as proteínas
RACK1 e SEC13. RACK1 é um receptor de proteína quinase C, com sete WDR, encontrado em
muitas espécies, de Chlamydomonas a humanos, com status de proteína altamente conservada. SEC
13 uma proteína envolvida com tráfego vesicular. As funções de RACK1, além de ancorar proteí-
nas cinase C, ampliam-se para coordenar interações entre moléculas sinalizadoras chaves, e ocupa
papel central em processos biológicos essenciais, como crescimento celular (McCAHILL et al.,
2002).
Homólogas a RACK 1 em Crithidia fasciculata (CACK), em L. infantum (LACK) e T. brucei
(TRACK) foram descritas. A proteína CACK é altamente conservada em espécies de Leishmania e
apresenta distribuição citoplasmática, próximo à membrana, havendo evidências experimentais de
localização próxima ao núcleo em outras espécies de Leishmania (TALADRIZ et al., 1999).
LACK/p36 é uma proteína citoplasmática não associada à membrana de L. infantum, que induz
resposta imune contra infecção. LACK apresenta quatro domínios WD40 (GONZALEZ-
ASEGUINOLAZA et al., 1999).
A proteína TRACK em T. brucei, expressa através do ciclo de vida do parasita, foi associa-
da à citocinese celular. Por mecanismos de expressão induzida por tetraciclina de RNA de interfe-
rência, a proteína TRACK foi implicada na inibição do crescimento e atraso no início da citocine-
se celular nas formas sanguíneas. Em contraste, formas procíclicas são capazes de iniciar a citoci-
nese na ausência de TRACK, porém param o processo ao longo da divisão celular (ROTHBERG
et al., 2006).
23
2 Objetivos
Devido ao fato de que o módulo WD é um dos mais comuns entre as proteínas de T. cruzi
e por estar presente em proteínas de função desconhecida e diferencialmente expressas, foram em
conjunto com outras proteínas, contempladas no projeto de Genômica Funcional de T. cruzi em
desenvolvimento no IBMP. A meta do projeto é caracterizar molecularmente e funcionalmente os
genes envolvidos nos principais processos biológicos de T. cruzi. Para esta dissertação os objetivos
propostos são:
• Levantamento e organização dos genes anotados com módulos WD no genoma de T.cruzi.
• Descrição das categorias funcionais preditas pelo genoma, para proteínas WD com módulos
adicionais.
• Revisão da anotação para proteínas hipotéticas conservadas contendo módulos WD, por
busca de similaridade em banco de dados.
• Análise da expressão gênica da família WD por microarranjo de cDNA e oligonucleotídeos
durante a metaciclogênese e no ciclo de vida de T. cruzi.
• Identificação de genes alvo para caracterização molecular e ensaios funcionais, por metodo-
logias de genética reversa e identificação de complexos protéicos.
24
3 Materiais e métodos
3.1
Procedência dos reagentes e materiais.
Ambion:
“Kit Amino Allyl MessageAmp
TM
aRNA”.
Amicon:
Microcon 30.
Amersham-Pharmacia Biotech:
dCTP-Cy3; dCTP-Cy5; dNTPs; RNAse H; Taq DNA polimerase.
Apligene:
Proteinase K.
BioRad:
Agarose, azul de bromofenol, xilenocianol.
Corning:
Lâminas para microarranjo CMT ULTRA GAPS II.
Cult-lab:
Soro fetal bovino.
Difco:
Extrato de levedura, infuso de fígado, triptose.
Gibco:
Gentamicina; RPMI; solução de aminoácidos (MEM non-essencial aminoacids).
Invitrogen:
Kit “BioPrime DNA Labeling System”; DTT; EDTA; Fenol; RNA ladder, RNase OUT
TM
; Sa-
carose; Tris base.
Merck:
Acetato de Sódio; ácido acético; ácido bórico; ácido clorídrico; álcool isoamílico, citrato de
sódio, cloreto de cálcio; cloreto de lítio; cloreto de magnésio; cloreto de potássio; cloreto de sódio,
clorofórmio; etanol absoluto; fosfato de potássio monobásico; fosfato diabásico de sódio; glicina;
glicose; hidróxido de sódio; maltose; SDS; sulfato de amônia; sulfato de magnésio.
Microbiológica:
Hemina.
Millipore:
Colunas microcon 30 (Microcon Amicon Bioseparations).
25
Nunc:
Garrafas para cultivo de células.
Promega:
ΦX174 DNA/HaeIII; DNase RQ1 (livre de atividade tipo RNase) RNAsin; ImProm-II™
Reverse Transcriptase.
Qiagen:
QIAquick 96 PCR purification Kit; RNeasy®; RNAse-free DNase.
Sigma:
β mercaptoetanol; ácido L-aspártico; ácido L-glutâmico; brometo de etídeo; BSA; ciclohe-
ximida; DEAE-celulose; DEPC; DMSO; DNA de esperma de salmão; ficoll; formaldeído; for-
mamida; glicerol; heparina; hepes; L-prolina; NP40; RNA sample buffer.
The Midland:
Oligonucleotídeos 60 e 70 mer.
USB:
Isotiocianato de guanidina; MOPS; sacarose, uréia.
3.2
Soluções e meios de cultura
Clorofórmio/ Álcool-isoamílico: 24 partes de clorofórmio e 1 parte de álcool isoamílico.
Colchão de sacarose: sacarose 2 M, em tampão de lise celular hipotônico.
Fenol saturado: fenol adicionado de solução de tris base 100 mM.
FCI: Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico: 25 partes de fenol saturado, 24 partes de clorofórmio
1 parte de álcool isoamílico.
H
2
O ultrapura: sistema de filtragem milli-Q (Millipore) e tratada com dietil pirocarbonato
(DEPC).
Meio LIT (Liver infusion Tryptose): extrato de levedura 15 g/l; fosfato diabásio de sódio 11,56 g/l,
glucose 2,2 g/l; hemina 0,02 g/l; infuso de fígado 5 g/l; KCL 0,4 g/l; NaCl 4,4 g/l; soro fetal bo-
vino 10% (v/v) e triptose 5 g/l pH 7,2 ajustado com HCl.
Meio TAU (Triatomine Artificial Urine): CaCl
2
2,0 mM; KCl 17 mM; MgCl
2
2,0 mM; NaCl 190 mM;
tampão fosfato 8,0 mM, pH 6,0.
Meio TAU3AAG: TAU suplementado com: ácido L-aspártico 2,0 mM; ácido glutâmico 50 mM;
glicose 10,0 mM e L-prolina 10,0 mM.
Solução de Denhardt (50 X): Albumina bovina sérica (BSA) fração V 1% (p/v); ficoll 400 1 %
(p/v) e polivinilpironidona 1% (p/v).
26
Solução para hibridação dos microarranjos: SSC 6 X; Denhardt’s 5 X; DNA de esperma de
salmão tipo III fragmentado e desnaturado 0,25 mg/ml; SDS 0,5% (p/v) e formamida 50%.
Solução de lavagem do microarranjo de menor estringência: SDS 0,01% (p/v) e SSC 0,5 X
Solução para lavagem do microarranjo de maior estringência: SSC 0,06 X.
Solução para neutralização: NaCl 1,5 M, tris HCl 0.5 M pH 8.0.
Solução para ressuspensão de polissomos: EDTA 10 mM; NaCl 100 mM; SDS 0,5% (p/v) e
tris-HCl 10 mM, pH7,5.
SSC: (Standard saline-citrate) (20 X): citrato de sódio 0,3M, pH 7,0 e NaCl 3M.
Tampão de lise celular: β-mercaptoetanol 8% (v/v); EDTA 10 mM; isotiocianato de guanidina
5M e tris-HCl 50 mM pH7,0
Tampão de lise celular hipotônico: β-mercaptoetanol 5 mM; cicloheximida 10 µg/ml; heparina;
20U/ml; MgCl2 5 mM; NaCl 10 mM e tris-HCl 10 mM pH7,0.
Tampão MOPS: acetato de sódio 5 mM pH 7,0; EDTA 2 mM pH 8,0; MOPS 20 mM.
Tampão NKM: cicloheximida 10 µg/ml; heparina 20U/ml; Hepes pH 7,4; KCl 5 mM; MgCl2
1,5 mM e NaCl 140 mM.
Tampão de amostra para DNA (10 X): azul de bromofenol 0,25%; ficoll 400 25% e xilenocia-
nol 0,25% em tampão TBE 1 X.
Tampão de amostra para RNA: corante- MOPS 1 X; glicerol 25%; azul de bromofenol 0,25%-
formaldeido 15%; formaldeído 6%; formamida 80% e tampão MOPS 1 X.
Tampão para ressuspensão de RNA total: EDTA 1 mM, SDS 0,1% e tris-HCl 10 mM pH7,5
Tampão PBS (10 X): KCl 2,7 mM; KH
2
PO
4
1,5 mM; Na
2
HPO
4
4,3 mM.
Tampão TBE (10 X): ácido bórico 55 g/l; EDTA 8,3 g/l e tris base 108 g/l.
Tampão TE: EDTA 1 mM e tris-HCl 10 mM pH 7,6.
Tampão de reação 10 X para Taq DNA Polimerase (Invitrogen): Tris HCl 200 mM, KCl 500
mM pH 8,4.
Tampão para espotagem das sondas: DMSO 50%.
Tampão PBS (10 X): KCl 2,7 mM; KH
2
PO
4
1,5 mM; Na
2
HPO4.7H
2
O 4,3 mM.
3.3
Microrganismos
Trypanosoma cruzi
Células de Trypanosoma cruzi clone Dm28c (Didelphis marsupialis) mantidas em nitrogênio lí-
quido foram utilizadas para cultura em meio axênico. As fases epimastigota, epimastigota em es-
trsse nutricional, epimastigotas em 12 horas de diferenciação e tripomastigota metacíclico foram
2
7
obtidas por metaciclogênese in vitro CONTRERAS et al., (1988) e formas amastigotas intracelula-
res foram obtidas por cultura de células.
Cultivo de
T. cruzi
EPIMASTIGOTAS: Para obter formas Epimastigotas de T. cruzi, parasitas em fase loga-
rítimica de crescimento em meio LIT a 28°C, após 3 dias em cultura axênica, foram repicados
mediante inóculo de 1 x 10
6
células/ml. Ao atingirem densidade celular de aproximadamente 2 à 3
x 10
7
células/ml foram recuperados por centrifugação a 8000 x g por 10 minutos.
EPIMASTIGOTAS EM ESTRESSE NUTRICIONAL: Parasitas em fase final de
crescimento logarítmico, após cinco dias de cultura em meio LIT e ao atingirem densidade celular
de aproximadamente 7 x 10
7
células
/ml foram submetidos ao estresse nutricional, em meio TAU,
na concentração de 5 x 10
8
células/ml, por duas horas, a 28°C. Após o estresse nutricional as célu-
las foram mantidas por 24 horas, em meio TAU3AAG, na concentração de 5 x 10
8
células/ml,
período este no qual os parasitas aderem-se as paredes da garrafa de cultivo como condição para
diferenciação (CONTRERAS et al., 1985). Amostras de interesse foram coletadas em 12 horas.
TRIPOMASTIGOTAS METACÍCLICOS: Formas tripomastigotas metacíclicas foram
obtidas segundo CONTRERAS et al., (1985). Após o estresse nutricional descrito acima, as células
foram cultivadas por 96 horas, em meio TAU 3AAG, na concentração final de 5 x 10
8
à 28°C.
Durante este período os parasitas aderem-se às paredes das garrafas de cultivo e diferenciaram-se
nas formas tripomastigotas metacíclicas, soltando-se do substrato (BONALDO et al., 1988). Os
tripomastigotas do sobrenadante da cultura foram purificados por cromatografia de troca iônica
em coluna de DEAE celulose equilibrada em PBS (De SOUZA, 1984). As células foram congela-
das com cicloheximida (1 mg/5 x 10
8
células).
AMASTIGOTAS: Aproximadamente 10
8
tripomastigotas metacíclicos foram utilizados
para inocular as garrafas com células Vero. As culturas infectadas eram mantidas a 37°C com 5%
de CO
2
e monitoradas diariamente. Após a verificação de amastigotas no interior da célula, o meio
de cultura RPMI era trocado. Ao observar tripomastigotas no sobrenadante, contava-se o número
de células de tripomastigota e de amastigota. Sobrenadantes com mais de 80% de tripomastigotas
eram recolhidos, meio de cultura adicionado e nova contagem de parasitas no sobrenadante eram
realizadas após 24 horas. Garrafas de cultura com percentual menor que 80% eram mantidas a
28°C para recuperação de amastigotas. Os sobrenadantes eram recolhidos, incubados por 30 mi-
nutos com cicloheximida (1mg para cada 5 x 10
8
células) e centrifugados a 8000 g por 15 minutos.
O pellet celular era lavado em PBS contendo cicloheximida e estocado a -20°C.
28
3.4
Obtenção do RNA de T. cruzi
3.4.1 RNA polissomal de epimastigotas e epimastigotas em estresse nutricional
A extração de moléculas de RNA associadas à polissomos foi realizada segundo GOL-
DENBERG et al., (1985).
Inicialmente 5 x 10
10
epimastigotas foram mantidas em seu meio de cultivo acrescida de
cicloheximida- 10 µg/ml, durante 10 minutos, a temperatura ambiente, e 30 minutos, em gelo. As
células foram recuperadas por centrifugação a 8000 x g por 10 minutos a 4° C e lavadas com tam-
pão NKM. A lise dos parasitas foi realizada com 13 ml de tampão de lise celular hipotônico, a-
crescido de cicloheximida 10 µg/ml, heparina 20U/ml, β-mercaptoetanol 5 mM e 1% de Nonidet
P 40. As células foram lisadas em homogeneizador do tipo Dounce, por 3 minutos, a 4°C e moni-
toradas ao microscópio óptico. Quando as células conservando ainda sua morfologia, tornaram-se
translúcidas, a lise celular foi interrompida pela adição de sacarose 2 M, acrescida de cicloheximida
10 µg /ml, heparina 20U/ml e β-mercaptoetanol 5 mM.
A seguir foram sedimentados os núcleos a 9000 x g por 10 minutos a 4°C e as mitocôn-
drias a 9000 x g por 30 minutos a 4°C. A fração polissomal foi obtida após ultracentifugação do
sobrenadante pós mitocondrial, contendo colchão de sacarose 2 M (sempre acrescido de ciclohe-
ximida 10 µg/ml, heparina 20U/ml e β-mercaptoetanol 5 mM) a 365000 x g por 2 horas a 4°C. O
sobrenadante foi descartado e o sedimento, contendo as moléculas de RNA associados à polisso-
mos foram congelados a -70° C por uma noite.
Após o descongelamento e homogeneização em 5 ml de solução de ressuspensão de polis-
somos com auxílio de Dounce, o RNA foi extraído pelo método de fenol a quente (SCHERRER,
1969). Para tanto, fenol saturado previamente aquecido a 65°C foi adicionado e esta mistura foi
vigorosamente agitada e mantida a 65°C, por 3 minutos, com agitação intermitente. A seguir, esta
mistura foi centrifugada por 5 minutos, a 2000 rpm, à temperatura ambiente e recolhida à fase
aquosa onde a mesma foi precipitada com acetato de sódio 3M (1/10 v) e isopropanol (v/v).
Nestas condições o RNA foi mantido a -20°C até o momento do uso. O RNA foi recuperado por
centrifugação a 16000 x g por 15 minutos e o sedimento lavado três vezes com etanol 70%. O
RNA foi ressuspenso em água ultrapura, tratado com DNase e purificado com RNeasy™. Quan-
tidade e qualidade dos RNA extraídos foram estimadas.
3.4.2 RNA polissomal de tripomastigotas metacíclicos e amastigotas
A lise de 10
9
células de parasitas foi realizada em 10 ml de tampão de lise celular hipotôni-
co e 1% (v/v) de Nonidet P-40 por 3 minutos, a 4°C. A lise celular foi interrompida pela adição
29
de colchão de sacarose 2M acrescida de cicloheximida 10 µg/ml, heparina 20U/ml e β-
mercaptoetanol 5 mM.
A extração de RNA fração polissomal de tripomastigotas metacíclicos e amastigotas foi
realizado como descrito acima. O tratamento com DNase - 100 µg de cada amostra de RNA fo-
ram mantidas a 37° C por 30 minutos, em BSA 100 µg/ml, DNase RQ1 10U, DTT 0,05%, MgCl
2
10 mM, NaCl 50 mM, RNasin 1U/ul e tris-HCl 50 mM pH 8,0. A seguir a amostra foi aquecida a
70°C por 10 minutos e purificada pelo Kit RNeasy, segundo recomendações do fabricante.
3.5
Amplificação in vitro de RNA
A amplificação do RNA foi realizada utilizando-se o Kit Amino Allyl MessageAmp™ (Am-
bion). As primeiras fitas de cDNA foram geradas em uma reação com oligodT -promotor T7, first
strand buffer, inibidor de RNase, dNTPs e transcriptase reversa, conforme volumes recomendados
pelo fabricante, por 2 horas a 42°C. A segunda fita foi sintetizada em uma reação com second strand
buffer, dNTPs, DNA polimerase e RNase H, conforme volumes recomendados pelo fabricante,
por 2 horas a 16°C. O cDNA foi purificado em colunas de afinidade do próprio Kit e a transcrição
ocorreu adicionando-se dNTPs 10 mM, T7 reaction buffer e T7 enzime mix, por 14 horas a 37° C.
Após esta incubação, o DNA foi degradado com DNase I. O RNA foi purificado em colunas de
afinidade do próprio Kit.
A quantidade e qualidade do RNA amplificado foram determinadas em absorbância 260
nm e em gel de agarose/formaldeido 1% respectivamente. Alíquotas de 1 µg dos RNAs comple-
mentares aos RNA mensageiros, ou simplesmente cRNA, foram realizadas e armazenadas a -
70°C.
3.6
Confecção do microarranjo de oligonucleotídeos
3.6.1 Seqüência dos genes da família WD
O acesso às seqüências codificantes (CDS), anotadas no genoma de T. cruzi (EL-SAYED et
al. 2005a), foi possível através do uso da interface e banco de dados GeneDB v.2.1
(www.genedb.org). As informações referentes à anotação do genoma de T. cruzi foram armazena-
das localmente e uma pesquisa pelo banco de domínios e famílias de proteínas PFAM v.20.0
(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) pelo identificador do módulo WD (PFAM0400) loca-
lizou um total de 211 modelos gênicos.
30
3.6.2 Alinhamento das seqüências WD
Com objetivo de diminuir ou eliminar a redundância entre os genes e criar uma identidade
única para os mesmos, favorecendo as etapas posteriores de desenho dos oligonucleotídeos para
confecção do microarranjo e toda a etapa de análise bioinformática das proteínas WD, as 211 se-
qüências nucleotídicas foram submetidas a um programa computacional de alinhamentos múlti-
plos, DIALIGN (MORGENSTERN, 2004).
3.6.3 Desenho e síntese das sondas
Oligonucleotídeos de 60 a 70 mer, complementares a 95 seqüências gênicas WD distintas
de T. cruzi, foram desenhados com o auxílio de um programa computacional (OligoArray 2.0) de
desenho de oligonucleotídeos em escala genômica para microarranjo (ROUILLARD et al. 2003), o
qual avalia e combina diferentes parâmetros para assegurar a especificidade dos oligonucleotídeos
para os genes alvo.
Os critérios para o desenho dos oligonucleotídeos foram os seguintes:
• Tamanho entre 60 e 70 mer;
• Temperatura de fusão entre 87
o
C e 91
o
C
• Conteúdo de GC entre 40 e 60%
• Ausência de seqüência monorepetidas: AAAAA, CCCCC, GGGGG, TTTTT
• Ausência de auto-complementariedade da sonda com energia livre acima de 65
o
C
• Ausência de hibridação com outros genes com energia livre acima de 60
o
C
• Distância da extremidade 3´ do gene igual ou inferior a 500 nucleotídeos.
Os genes para os quais não foram desenhadas sondas com esses critérios foram reanalisa-
dos, mudando-se a distância da extremidade 3´ de 500 para 1000 nucleotídeos. Finalmente, os
genes que não passaram nesse critério foram submetidos à seguintes condições:
• Tamanho entre 60 e 70 mer;
• Temperatura de fusão entre 84
o
C e 94
o
C
• Conteúdo de GC entre 30 e 70%
• Ausência de seqüência monorepetidas: AAAAA, CCCCC, GGGGG, TTTTT
• Ausência de auto-complementariedade da sonda com energia livre acima de 65
o
C
• Ausência de hibridação com outros genes com energia livre acima de 60
o
C
• Distância da extremidade 3´ do gene igual ou inferior a 1000 nucleotídeos.
31
Uma vez desenhados, os oligonucleotídeos foram comercialmente sintetizados em concen-
trações variáveis entre 20 e 40 nanomoles, em placas de 96 poços, onde foram ressuspensos com
água ultrapura, a uma concentração final de 100 µM. As placas permaneceram sob agitação a tem-
peratura ambiente por duas horas e foram armazenadas a -20° C.
3.6.4 Preparação e deposição das sondas em lâminas de vidro
As sondas de oligonucleotídeos foram preparadas segundo protocolo de HOEN et al.
2003. Resumidamente, 500 pmol de cada sonda foram retirados da solução estoque (100
pmol/µl), replaqueadas com pipeta multicanal para placa de 384 poços. Um volume de 5 µl de
DMSO 100% foi adicionado a cada sonda. A concentração final dos oligonucleotídeos para espo-
tagem foi de 50 µM em 10 µl de DMSO 50%. As placas foram incubadas a temperatura ambiente
por aproximadamente 50 minutos.
A deposição dos oligonucleotídeos em lâminas ULTRA GAPS II (25 x 75 mm), revestidas
com aminosilano (Corning) foi realizada roboticamente em um MiniQarray (Genetix). O pós pro-
cessamento das lâminas ocorreu por crosslink das sondas quando da exposição à luz ultravioleta, a
uma energia de 650 mJ/cm
2
.
O microarranjo de oligonucleotídeos, versão 01 confeccionado no IBMP, apresenta um
total de 288 spots, em três réplicas, cada uma delas contendo 8 setores de 10 colunas por 10 li-
nhas, sendo :
• 137 sondas correspondentes aos genes WD.
• 64 sondas correspondentes aos genes codificadores de enzimas de ubiquitinação de T. cru-
zi.
• 33 sondas controle correspondentes.
• 35 sondas relativas a actina e via de regulação do citoesqueleto.
As 19 posições restantes foram ocupadas com DMSO 50%.
A seqüência das sondas utilizadas está disponível no anexo (CD incluso).
3.6.5 Controles internos e externos do microarranjo
Os controles internos foram genes de T. cruzi que supostamente teriam uma expressão não
modulada durante os processos estudados.
Como controle externo, foi utilizado o gene Q do bacteriófago lambda, clonado em plas-
mídeo pQE30 e foi amplificado com iniciadores gene-específico.
32
3.6.6 Desenho experimental das hibridações
Amostras de RNA amplificado in vitro, correspondente a fração polissomal de epimastigo-
tas (E), epimastigotas em estresse nutricional (S), e epimastigotas em diferenciação por 12 horas
(12h), de dois experimentos distintos de metaciclogênese in vitro do T. cruzi, denominados Met16 e
Met19, foram utilizadas para o primeiro conjunto de 6 hibridações.
Amostras de cRNA polissomal de tripomastigotas metacíclicos (Mp) dos experimentos 02
e 03 e amostras de cRNA polissomal de amastigota (Ap) dos experimentos 03 e 04 foram utiliza-
dos no segundo conjunto de 6 de hibridações como ilustrado na Figura 3.1
A. Experimento metaciclogênese 16 e 19
B. Experimento 02 e 03 ciclo de vida.
Figura 3.1 Hibridações realizadas no microarranjo de oligonucleotídeos versão 1.0
O sentido da flecha representa a marcação utilizada: a ponta sempre está direcionada para a amostra mar-
cada com Cy5
3.7
Marcação das amostras com fluoróforos
Uma vez as amostras de RNA referentes a fração polissomal terem sido submetidas à am-
plificação in vitro, foram convertidas a cDNA e a marcação ocorreu durante a síntese da segunda
fita. Para tanto, foram utilizados 2 µg de cRNA em uma reação de transcriptase reversa com 2000
Epimastigota
Tripomastigota
metacíclico
Amastigotas
Epimastigota
Estresse
12h
33
pmol de random primers (hexâmeros), 25 nmol de cada dNTP, 2U de transcriptase reversa (Prome-
ga) nas condições tampões recomendadas para enzima, em um volume final de 30 µl , a 42°C,
durante duas horas. O RNA foi degradado após adição de 15 µl de NaOH 0,1N e incubação a
70ºC, por 10 minutos. O pH da solução foi neutralizado com adição de 15 µl de HCl 0,1N e as
amostras foram concentradas e purificadas com 400 µl de água e centrifugação em colunas Micro-
con 30 a 12000 x g. A segunda-fita foi sintetizada em 50 µl a 37°C por duas horas, utilizando-se
20 µl de Random Primers Solution e 1 µl da enzima Klenow (ambos reagentes do Kit BioPrime DNA
Labeling System) e 6 nmol de dATPs, dCTPs, dTTPs, e 3 nmol de dCTPs e 2 noml de dCTP-Cy3
ou dCTP-Cy5. Após quatro lavagens em 400 µl de água ultrapura em colunas microcon 30, as
amostras foram concentradas para 20 µl, misturadas com 100 µl de solução de hibridação (SSC 6x;
Denhardt’s 5 x; DNA de esperma de salmão tipo III fragmentado e desnaturado 0,25 mg/ml; SDS
0,5% (p/v) e formamida 50%), desnaturadas a 94°C por 5 minutos e colocadas sobre a lâmina já
acoplada à estação de hibridação.
3.8
Hibridação
As lâminas do microarranjo foram acopladas à estação de hibridação GeneTAC (Genomic
Solution), na qual todo o processo de hibridação e de lavagens pós hibridação são automatizados.
As hibridações ocorreram durante 16 horas a 42°C. As lavagens pós-hibridação foram realizadas
com solução de maior estringência (SSC 0,06 x) para menor estringência (SSC 0,5 x; SDS 0,01%)
duas vezes por 5 minutos a 42°C. Após lavagens as mesmas eram secas através de centrifugação.
3.9
Leitura dos sinais obtidos
Imagens de microarranjo foram obtidas por escanear cada slide em um Scanner 418 Array
(Affymetrix) o qual possui um laser que excita os fluoróforos Cy3 e Cy5 em comprimentos de
onda de 532 nm e 635 nm respectivamente.
3.10
Análise e tratamento dos sinais
As imagens criadas pela leitura dos sinais obtidos são analisadas pelo Software Spot (BEARE
& BUCKLEY, 2004). Inicialmente o programa estabelece coordenadas para cada um dos spots, no
processo de gradeamento, de forma semi-automática. Deste modo são delimitadas as áreas a se-
rem analisadas.
34
A seguir, em uma nova etapa denominada segmentação, os pixels que compões as imagens
são classificados como correspondentes, ou não, aos spots. Para tanto o software Spot aplica o mé-
todo de segmentação por forma variável uma vez que, em geral spots do microarranjo de T cruzi
versão 4 apresentam formas variáveis.
A partir da identificação dos pixels contidos nos spot e de seus valores digitalizados de zero
a 65535 (2
16
), realizou-se o cálculo da mediana, entre todos estes valores para produzir o valor
unitário correspondente a um spot, em um dos canais de uma lâmina.
3.11
Normalização dos dados
A normalização dos dados de microarranjo visa torná-los mais próximos possível aos
níveis de expressão presentes nas amostras originais, pela redução do erro associado à variação
sistemática presente nas diferentes etapas que constituem um experimento de microarranjo.
O método de escolha empregado para normalizar os dados neste trabalho foi à normaliza-
ção global, não linear que contempla os seguintes pontos (DUDOIT et al., 2002).
1- Concentrações relativas das moléculas de RNA mensageiro nas amostras estudadas a-
presentam-se, em sua maioria, iguais. Caso haja expressão diferencial em um grau elevado, essa
deve ser relativamente simétrica, isto é, a somatória das diferenças das sondas com expressão dife-
rencial aumentada menos a somatória das diferenças das sondas m expressão diferencial diminuída
deve ser próxima à zero. Apesar desta premisa não ser verdadeira para todos os casos, ela repre-
senta, a priore a situação mais verossímil, sendo uma solução conservadora, pois maximiniza a se-
melhança entre as duas amostras de forma estritamente relativa, tal pressuposição é adequada.
2- As fontes de heterogeneidade entre os dois canais, que são normalmente as variáveis
normalizadas, não são homogêneas, ou seja, apresentam diferentes intensidades de acordo com as
condições de espotagem. Neste caso cada spot deve ser normalizado por um valor que seja refe-
rente ao grupo no qual o mesmo se encontra presente.
Frente a estes elementos, uma pequena fração das sondas que constituem o microarranjo é
esperada como tendo valores diferentes de intensidade entre os dois canais. As outras sondas, que
não deveriam apresentar expressão diferencial, representariam uma excelente estimativa de dos
valores distintos de incorporação dos fluoróforos utilizados e essa diferença de incorporação seria
ajustada pelo processo de normalização.
Os softwares R (R Development Core Team), Bioconductor (DUDOIT et al., 2003) e LIMMA
(SMYTH, 2004) foram utilizados para extração dos valores de background dos spots, transforma-
ção logarítmica na base 2 e normalização global não linear., pelo método de Loess, o qual consiste
em uma transformação da fórmula de intensidade das diferentes hibridações, em uma fórmula de
35
intensidade idêntica, eliminando em grade parte os ruídos técnicos acrescidos durante o processo
(SMYTH, 2004). Após normalização intra microarranjo, é feita a normalização inter-microarranjo.
Para esta normalização foi utilizado o método de normalização por quartiles (BOLSTADT et al.,
2003).
3.12
Identificação de genes diferencialmente expressos
3.12.1
Teste SAM-
Significance Analysis of Microarray
TUSHER et al. (2001) desenvolveram um método de análise de microarranjo, que vem
sendo usado de forma ampla em estudos de microarranjo, que foi denominado de SAM (Significan-
ce Analysis of Microarrays). Esse teste se baseia em uma versão modificada do teste-t e tem as seguin-
tes características:
• Ao teste-t clássico, é acrescentado um termo acessório, cuja função é diminuir o valor da
estatística calculada, através do aumento da variância calculada. Isto serve para evitar a a-
tribuição de DEG (diferentially expressed genes) quando o valor de variância é muito baixo,
pois não houve réplicas suficientes para seu cálculo. Dessa forma, o teste se torna mais
conservador.
• O cálculo da probabilidade de expressão diferencial não é baseado em uma distribuição
clássica, como a de Student, mas é estimada dos próprios dados, a partir de permutas.
• Finalmente, é feito uma correção para múltiplos testes através do controle do FDR (False
discovery rate), o qual consiste em permutar valores repetidos de intensidade, relativos ao
devio padrão para cada gene, com o objetivo de estimar o percentual de genes diferenci-
almente expressos ao acaso (TUSHER et al., 2001).
36
A idéia do teste-t é calcular a diferença entre as médias das intensidades do gene avaliado entre
as duas amostras estudadas, dividida pela variância dessas médias, conforme a fórmula abaixo, na
qual t
i
é o valor da estatística t para a sonda i, x
ij
é a média dos valores de intensidade nas réplicas
da amostra j, e s
i
é a variância das médias de todas as amostras j.
Conforme discutido acima, o método SAM incorpora um fator compensatório para as
situações nas quais a variância é muito baixa, o que leva a valores muito altos da estatística. A for-
mulação do SAM está demonstrada abaixo:
S
i
é calculado agregando-se os dados das duas amostras, de acordo com a seguinte fórmu-
la.
S
0
é calculado da seguinte forma:
• Seja s
α
o α percentil dos valores de s
i
. Seja d
i
α
igual ao cálculo da estatística SAM para
esse percentil;
• Compute os 100 percentis dos valores de s
i
, denotado por q
1
< q
2
...< q
100
.
• Para α E (0; 0,05; 0,10 ... 1,0)
o A) Compute v
j
=mad(d
i
α
| S
i
E [q
j
, q
j+1
]), j=1, 2, ..., n, no qual mad é o desvio
mediano absoluto da média, dividido por 0,64.
o B) Compute cv(α), que é o coeficiente de variação dos valores v
j
i
ii
i
s
xx
t
21
−
=
0
21
ss
xx
d
i
ii
i
+
−
=
+
−+
−+−
=
2121
2
22
2
11
11
2
).1().1(
nnnn
snsn
s
i
37
• Compute um valor de α cujo coeficiente de variação seja o menor dentre todos com-
putados. O valor de s
α
é desta forma o valor de s
0
Após o cálculo da estatística d
i
, o FDR para esse valor de estatística é calculado a partir de
uma permutação dos dados.
3.12.2 Descrição e revisão das categorias funcionais
Análises das predições funcionais atribuídas aos genes WD pelo consórcio de sequencia-
mento genômico de T. cruzi (TSK) foram realizadas neste trabalho, utilizando uma nova etapa de
busca por similaridadade com seqüências nucleotídicas e protéicas depositadas no National Center
for biotechnology Information (NCBI), através do algorítimo BLAST. A descrição gene a gene, ocorreu
por considerar e avaliar o grau de consenso entre cada gene WD e os maiores Hits identificados.
Dados da literatura também foram utilizados para contrução do catálago informativo dos genes
WD.
38
4 Resultados
No presente trabalho, foi realizada uma investigação, por métodos bioinformáticos, do
número de proteínas de Trypanosoma cruzi contendo domínios WD, agregando às mesmas informa-
ções relativas a características da seqüência codificante e existência de literatura descrevendo a
função dessas proteínas, principalmente em organismos da ordem dos Kinetoplastida.
Além de descrever as características das proteínas de T. cruzi contendo domínios WD,
também foram identificados genes com expressão modulada. Para isso, utilizamos dados previa-
mente publicados, relativos à análise genômica funcional por microarranjo da metaciclogênese
(PROBST, 2005) e das formas do ciclo evolutivo (PROBST et al., em preparação) de T. cruzi, bem
como uma análise em larga escala das proteínas das formas do ciclo evolutivo de T. cruzi (AT-
WOOD et al., 2005).
Visando aprofundar a caracterização dos níveis dos mRNAs dos genes WD, foi também
desenvolvido para este trabalho um microarranjo contendo oligonucleotídeos (60 a 70 mer) com-
plementares a todos os genes contendo domínio WD de T. cruzi. Esta etapa foi necessária porque
a cobertura do microarranjo utilizado nos experimentos citados no parágrafo anterior era incom-
pleta (cerca de 50% dos genes WD). Com isso, foi possível identificar com melhor precisão genes
WD diferencialmente expressos nos modelos biológicos de interesse ao nosso grupo, etapa essen-
cial para a determinação de quais genes seria prioritária a caracterização funcional, dentro do pro-
jeto mais amplo do IBMP de determinar os eventos moleculares necessários para o processo de
diferenciação de T. cruzi.
Primeiramente, iremos descrever os resultados gerais obtidos com o microarranjo de oli-
gonucleotídeos desenvolvido no presente trabalho.
4.1
Hibridações comparativas
Visando aumentar a cobertura da análise por genômica funcional de T. cruzi, utilizamos o
microarranjo de oligonucleotídeos idealizado para esse trabalho com amostras utilizadas nos expe-
rimentos de hibridação comparativa da metaciclogênese e ciclo de vida realizados anteriormente,
contendo cada um dos processos duas réplicas biológicas.
As populações de cRNA oriundos do mRNA da fração polissomal foram hibridados com
o microarranjo de oligonucleotídeo de T. cruzi, v 1.0, conforme o esquema apresentado no item
3.7.8. O desenho experimental priorizou as hibridações entre as amostras de maior interesse du-
rante o processo de diferenciação do T. cruzi, e para as quais, segundo este desenho, foi possível
extrair dados relevantes acerca da expressão diferencial dos genes WD. Segundo o proposto por
39
KERR & CHURCHILL (2001), o desenho experimental denominado de comparação direta, bus-
ca avaliar de modo direto amostras de interesse, considerando que não havia sentido incluir no
desenho experimental, uma amostra referência, a qual seria avaliada várias vezes e que não costu-
ma ser a amostra de maior interesse em experimentos de microarranjo. Optamos por abolir a par-
ticipação de amostra referência para avaliar igualmente e diretamente todas as amostras de maior
interesse no contexto da diferenciação celular de T. cruzi.
As imagens referentes às hibridações foram adquiridas após as lâminas do microarranjo, te-
rem sido escaneadas em comprimento de onda de 550 e 649 nm, relativos à emissão de fluores-
cência para Cy3 e Cy5 respectivamente. Houve uma sobreposição das imagens obtidas pelos dois
corantes, gerando uma imagem composta para cada hibridação comparativa. Uma visão geral das
imagens compostas, referentes à análise de metaciclogênese está representada na Figura 4.1. É
possível observar nessas imagens, que representam uma das três replicatas de espotagem, que os
spots apresentam-se uniformes quanto ao tamanho, morfologia e distribuição. Além disso, é possí-
vel observar artefatos de hibridação e lavagem, como bolhas e manchas, que quando presentes
podem comprometer a obtenção do sinal dos spots. No entanto, com a utilização de triplicatas de
espotagem em uma mesma lâmina, é possível obter dados com qualidade dos spots, pois essa ma-
nobra minimiza as perdas de sinal por artefato. Além da triplicata da espotagem de toda a repre-
sentação do microarranjo, cada sonda foi espotada duas vezes, uma ao lado da outra, visando au-
mentar o grau de reprodutibilidade técnica, o que também pode ser visto ao se observar o sinal e a
expressão diferencial obtida que são equivalentes.
40
Figura 4.1 Imagem composta das hibridações da metaciclogênese
A. E x S (Met16); S x 12h (Met16); 12h x E (Met16). B. E x S (Met19); S x 12h (Met19); 12h x E (Met19).
A
B
41
É possível também verificar a quantidade de expressão diferencial existente nessas hibrida-
ções. Os spots em coloração amarela representam sondas para as quais os sinais de hibridação fo-
ram semelhantes nas duas amostras analisadas; sinais mais vermelhos representam sondas cujo
mRNA alvo está aumentado na amostra marcada com Cy5 (a segunda amostra da hibridação)
enquanto que sinais mais verdes representam sondas cujo mRNA alvo está aumentado na amostra
marcada com Cy3 (a primeira amostra da hibridação).
De maneira mais detalhada, a hibridação E x S (Met16) figura 4.1 A, mostra um sinal mé-
dio, com predominância das sondas com ausência de expressão diferencial (coloração amarela),
sendo que os artefatos que estão presentes na borda direita (restos de solução de hibridação que
escorreram) potencialmente não afetam os resultados, pois não bloqueiam as réplicas das sondas
de forma igual. As hibridações S x 12h (Met16) e 12h x E (Met16) apresentam um sinal mais forte,
com predominância de sondas demonstrando expressão diferencial (cores avermelhadas e esver-
deadas), com ausência de artefatos de hibridação. Na figura 4.2, podemos observar o padrão das
imagens compostas das hibridações referentes ao ciclo de vida. De um modo geral, essas imagens
das hibridações apresentam uma intensidade relativamente menor, o que pode ser explicado por
variações de algum parâmetro da hibridação, pois elas foram processadas independentemente. Há
a ocorrência de artefatos, os quais novamente não afetam a capacidade de extração de dados rela-
tivos a todas as sondas, pela existência de replicação e pela sua ocorrência aleatória. Como são
comparações de formas relativamente distantes biologicamente, há uma grande quantidade de
expressão diferencial (spots com coloração avermelhada ou esverdeada). É possível também obser-
var a corroboração das réplicas biológicas, nas quais as sondas para determinado gene nos dois
experimentos apresentam a mesma coloração.
42
Figura 4.2 Imagem composta das hibridações do ciclo de vida
A. E x M (replicata A); M x A (repl. A); A x E (repl. A). B. E x M (repl. B); M x A (repl. B); A x E (repl. B).
A
B
43
4.2
Normalização dos dados
A etapa de normalização é essencial para a eliminação do ruído acrescentado aos dados, o
qual é criado pelas etapas de processamento da amostra de forma global e sistemática. Sem essa
etapa, os dados obtidos podem não representar o elemento que estamos querendo mensurar, isto
é, a quantidade de mRNA da célula.
Geralmente, a normalização mais utilizada é a que leva como premissa o fato de que a
maioria dos genes não deve ser modulado. Dessa forma, espera-se que a maioria do sinal dos spots
apresente uma razão entre os dois canais igual a um. No entanto, essa premissa para o microarran-
jo de oligonucleotídeos de T. cruzi desenvolvido nesse trabalho não é válida.
Isso se deve à dois fatores principais: o pequeno número de sondas presentes nesse micro-
arranjo e à tendenciosidade inerente ao fato de que o microarranjo está focado em algumas poucas
vias biológicas que podem mostrar modulação acima da média dos demais genes do genoma.
Portanto, as conclusões relativas ao microarranjo de oligonucleotídeos devem ser conside-
radas de forma ponderada, preferindo-se a identificação de expressões diferenciais altamente con-
fiáveis, em detrimento de variações mais gerais e, possivelmente, menos confiáveis.
Na Figura 4.3 e 4.4 podemos verificar os dados resultantes das hibridações realizadas, an-
tes da etapa de normalização, o eixo X representa a média da intensidade do sinal nos dois canais
(Cy3 e Cy5), em escala logarítmica de base 2 e o eixo Y representa a diferença entre a intensidade
do sinal dos dois canais, também em escala logarítmica de base 2. Cada um dos pontos representa
os valores de um spot.
Nesse gráfico é possível visualizar a grande dispersão dos dados, especialmente entre os
spots com intensidade mais fraca (à esquerda na figura). Além disso, é possível ver como os pontos
estão distribuídos de forma não linear em relação ao eixo X.
Na Figura 4.5 e 4.6 estão representados esses mesmos dados, após a realização da normali-
zação. É possível ver que os pontos estão distribuídos de forma linear ao longo do eixo X. Além
disso, é possível evidenciar que as comparações E x S apresentam uma quantidade de sondas dife-
rencialmente expressas bem menor.
44
Figura 4.3 Gráficos M vA representando as hibridações realizadas (pré-normalização)
A. Metaciclogênese Met16, B. Metaciclogênese Met19.
A
B
45
Figura 4.4 Gráficos MvA representando as hibridações realizadas (pré-normalização)
C. Ciclo de vida repl. A; D. Ciclo de vida repl. B
C
D
46
Figura 4.5 Gráficos MvA representando as hibridações realizadas (pós-normalização)
A. Metaciclogênese Met16, B. Metaciclogênese Met19.
A
B
47
Figura 4.6 Gráficos MvA representando as hibridações realizadas (pós-normalização)
C. Ciclo de vida repl. A; D. Ciclo de vida repl. B
Os mesmos resultados observados nas Figuras 4.3, 4.4, 4.5 e 4.6 estão evidenciados na
Figura 4.7 e 4.8. Nesse tipo de gráfico, denominado boxplot, estão representado os pontos princi-
pais da distribuição de cada hibridação. A caixa maior representa os valores da distribuição que
estão entre o primeiro (25%) e o terceiro (75%) quartil; a linha central representa a mediana ou
segundo quartil (50%). As barras horizontais representam as estimativas dos valores máximos
esperados da dstribuição e os pontos presentes além dessas barras, representam resultados fora do
esperado (outliers).
48
As hibridações marcadas em vermelho são relativas a Met16, as marcadas em verde a
Met19, as marcadas em azul escuro ao ciclo de vida replicata A e as marcadas em azul claro ao
ciclo de vida replicata B.
Nessas figuras, é possível evidenciar com maior facilidade o fato de que após a normaliza-
ção, os valores medianos de cada hibridação correspondem ao valor de zero no eixo Y (M).
Figura 4.7 Gráfico tipo
boxplot
representando as hibridações pré-normalização.
Figura 4.8 Gráfico tipo
boxplot
representado as hibridações pós-normalização.
49
4.3
Avaliação da intensidade da sonda
Para investigar se o tamanho da sonda influenciou a intensidade do spot (sonda) e confor-
me mencionado anteriormente, o microarranjo de oligonucleotídeos continha sondas com tama-
nho variando entre 60 e 70 mer. Uma possibilidade é que a intensidade do sinal da sonda seria
dependente do tamanho da sonda, sendo que sondas menores apresentariam um sinal mais fraco e
vice-versa. Na Figura 4.9 uma análise visando responder essa pergunta foi feita, evidenciando que
não há diferenças perceptíveis de que a intensidade seja dependente do tamanho da sonda.
Figura 4.9 Comparação da intensidade do sinal versus o tamanho da sonda
Eixo X, tamanho da sonda; Eixo Y: intensidade média do sinal em escala logarítmica de base 2. A Linha
preta corresponde a regressão linear e a linha vermelha à valores relativos ao
backgroud.
4.4
Seleção de genes diferencialmente expressos
A seleção dos genes diferencialmente expressos foi realizada através do teste estatístico
SAM, utilizando-se os critérios de 75% de razão de mudança mínima (fold change) e FDR (false
Discovery rate) de 5%. O critério de razão de mudança mínima representa uma medida subjetiva
de importância biológica do resultado de expressão diferencial, quando os experimentos são pla-
nejados de maneira a terem uma avaliação estatística que busque controlar as variações técnicas e
biológicas existentes. O valor de 75% de fold change estabelecido para este trabalho apresentou-se
adequado, pois mudanças pequenas podem estar ocorrendo no ambiente intracelular e serem bio-
lógicamente significantes no contexto celular. O critério estabelecido de 5% de genes falsos positi-
vos, a priore, mostrou-se satisfatória. Somente as sondas que foram selecionadas em ambas replica-
tas biológicas serão listadas. Na Figura 4.10, é possível ver os gráficos de Venn com as contagens
de genes diferencialmente expressos em ambas réplicas com suas concordâncias e discordâncias.
50
Comparação E x S: Nenhuma sonda selecionada
Comparação S x 12h: WD004, WD016, WD040, WD048, WD058, WD062, WD072,
WD091, WD104, WD108, WD114.
Comparação 12h x E: WD072, WD082, WD091, WD108.
Comparação E x M: WD022, WD054, WD111
Comparação M x A: WD009, WD044, WD054, WD063, WD085, WD097, WD101,
WD102, WD104, WD107, WD110.
Comparação A x E: WD016, WD053, WD054, WD063, WD068, WD069, WD082,
WD101, WD104, WD105, WD107.
Figura 4.10 Gráficos de Venn representando os genes selecionados em cada experimento.
Em cada replicata, o valor inferior a direita, acrescido dos demais valores, representa o número de sondas
WD (n=95) no microarranjo de oligonucleotídeos versão 1.0. Os valores menores representam o número de
genes diferencialmente expressos, nas amostras listadas das réplicas biológicas e selecionados após critério
de 75% de fold change e 5% de FDR. Os valores de interseção representam o número de genes expressos
em ambas replicatas.
4.5
Agrupamento funcional das sondas WD
Na figura 4.11 temos a representação de uma clusterização hierárquica com dados selecio-
nados dos genes WD obtidos com o microarranjo de oligonucleotídeos. Nessa figura é possível
observar os diversos padrões obtidos, que demonstram a complexidade da expressão diferencial
obtida para os genes WD no presente trabalho.
51
Figura 4.11 Clusterização hierárquica das sondas WD selecionadas.
Sucintamente, cada linha representa o dado de uma sonda e cada coluna representa cada
uma das 12 comparações realizadas. Células em preto representam igualdade de expressão na
comparação, células em verde representam genes mais expressos na primeira amostra biológica,
listada na identificação de cada comparação realizada e, células em vermelho representam genes
mais expressos na segunda amostra listada. Diferentes tonalidades de verde e vermelho, do mais
fraco para o mais intenso, representam graus progressivamente aumentados de expressão diferen-
cial.
Um resultado importante de ser observado nessa figura é a coerência entre as sondas repli-
cadas dentro do microarranjo, pois a maioria das sondas foi agrupada lado a lado, mostrando que
seu padrão é extremamente reprodutível.
52
4.6
Agrupamento das proteínas WD de T. cruzi
Conforme mencionado na Introdução, a anotação do genoma de T. cruzi apresenta uma
quantidade de genes preditos muito superior ao que se estimava. Esses genes são denominados
modelos gênicos, pois, na verdade, representam genes potenciais, os quais podem refletir diversos
tipos de relação entre as seqüências codificadoras, como fragmentos de um mesmo gene, alelos de
um mesmo gene e genes parálogos, uma situação que é muito comum em T. cruzi, no qual é possí-
vel encontrar diversas cópias de um mesmo gene, geralmente dispersos em tandem. A justificativa
para a primeira causa (fragmentos gênicos) seria a existência de muitas seqüências repetitivas que
prejudicariam o processo de montagem do genoma; a justificativa para a segunda causa (alelos) é
dada pelo fato de que a cepa selecionada para o seqüenciamento do genoma, a CL Brener, é híbri-
da e, muitas vezes, os dois haplótipos são distintos o suficiente para não serem montados, como
usual, em um único segmento, mas se mantém em duas frações independentes.
Portanto, para possibilitar a análise funcional das proteínas distintas de T. cruzi, especial-
mente relacionado ao que são elementos gênicos independentes no contexto do projeto de genô-
mica funcional, isto é, seqüências nucleotídicas distintas o suficiente para não apresentarem hibri-
dação cruzada, fizemos uma reorganização desses modelos gênicos, em elementos denominados
nesse trabalho de supra-genes, os quais podem representar desde fragmentos do mesmo gene até
parálogos, mas em geral representam alelos do mesmo gene. De um total inicial de 211 modelos
gênicos de T. cruzi contendo domínios WD, chegamos a 117 supra-genes, representados na Tabela
4-1. A grande maioria (n=95; 81,2%) destes genes codificam para proteínas hipotéticas, sendo o
restante (n=22; 18,8%) proteínas com função putativa, por apresentarem homologia com seqüên-
cias descritas de outros organismos e implicadas em vias funcionais. Conforme será comentado
abaixo, essa anotação funcional é a realizada pelo TSK e, após uma análise local, foi possível atri-
buir funções putativas mais informativas para algumas das proteínas hipotéticas.
53
Tabela 4-1 Descrição dos supra-genes de Trypanosoma cruzi com domínios WD.
Gene Anotação
Gene Descrição
WD001 activated protein kinase C receptor
WD061 hypothetical protein, conserved
WD002 ARP2/3 complex subunit
WD062 hypothetical protein, conserved
WD003 beta prime COP protein
WD063 hypothetical protein, conserved
WD004 beta propeller protein
WD064 hypothetical protein, conserved
WD005 chromatin assembly factor 1 subunit B
WD065 hypothetical protein, conserved
WD006 coatomer alpha subunit
WD066 hypothetical protein, conserved
WD007 coronin
WD067 hypothetical protein, conserved
WD008 dynein intermediate chain
WD068 hypothetical protein, conserved
WD009 dynein intermediate chain
WD069 hypothetical protein, conserved
WD010 eIF3 subunit
WD070 hypothetical protein, conserved
WD011 GTP-binding protein beta subunit-like
WD071 hypothetical protein, conserved
WD012 hypothetical protein
WD072 hypothetical protein, conserved
WD013 hypothetical protein
WD073 hypothetical protein, conserved
WD014 hypothetical protein, conserved
WD074 hypothetical protein, conserved
WD015 hypothetical protein, conserved
WD075 hypothetical protein, conserved
WD016 hypothetical protein, conserved
WD076 hypothetical protein, conserved
WD017 hypothetical protein, conserved
WD077 hypothetical protein, conserved
WD018 hypothetical protein, conserved
WD078 hypothetical protein, conserved
WD019 hypothetical protein, conserved
WD079 hypothetical protein, conserved
WD020 hypothetical protein, conserved
WD080 hypothetical protein, conserved
WD021 hypothetical protein, conserved
WD081 hypothetical protein, conserved
WD022 hypothetical protein, conserved
WD082 hypothetical protein, conserved
WD023 hypothetical protein, conserved
WD083 hypothetical protein, conserved
WD024 hypothetical protein, conserved
WD084 hypothetical protein, conserved
WD025 hypothetical protein, conserved
WD085 hypothetical protein, conserved
WD026 hypothetical protein, conserved
WD086 hypothetical protein, conserved
WD027 hypothetical protein, conserved
WD087 hypothetical protein, conserved
WD028 hypothetical protein, conserved
WD088 hypothetical protein, conserved
WD029 hypothetical protein, conserved
WD089 hypothetical protein, conserved
WD030 hypothetical protein, conserved
WD090 hypothetical protein, conserved
WD031 hypothetical protein, conserved
WD091 hypothetical protein, conserved
WD032 hypothetical protein, conserved
WD092 hypothetical protein, conserved
WD033 hypothetical protein, conserved
WD093 hypothetical protein, conserved
WD034 hypothetical protein, conserved
WD094 hypothetical protein, conserved
WD035 hypothetical protein, conserved
WD095 hypothetical protein, conserved
WD036 hypothetical protein, conserved
WD096 hypothetical protein, conserved
WD037 hypothetical protein, conserved
WD097 hypothetical protein, conserved
WD038 hypothetical protein, conserved
WD098 hypothetical protein, conserved
WD039 hypothetical protein, conserved
WD099 hypothetical protein, conserved
WD040 hypothetical protein, conserved
WD100 hypothetical protein, conserved
WD041 hypothetical protein, conserved
WD101 hypothetical protein, conserved
WD042 hypothetical protein, conserved
WD102 hypothetical protein, conserved
WD043 hypothetical protein, conserved
WD103 hypothetical protein, conserved
WD044 hypothetical protein, conserved
WD104 hypothetical protein, conserved
WD045 hypothetical protein, conserved
WD105 hypothetical protein, conserved
WD046 hypothetical protein, conserved
WD106 hypothetical protein, conserved
WD047 hypothetical protein, conserved
WD107 katanin
WD048 hypothetical protein, conserved
WD108 neurobeachin/beige-like protein
WD049 hypothetical protein, conserved
WD109 notchless homolog
WD050 hypothetical protein, conserved
WD110 periodic tryptophan protein 2
WD051 hypothetical protein, conserved
WD111 peroxisomal targeting signal type 2 receptor
WD052 hypothetical protein, conserved
WD112 poly(A) export protein
WD053 hypothetical protein, conserved
WD113 protein kinase
WD054 hypothetical protein, conserved
WD114 protein transport protein sec13
WD055 hypothetical protein, conserved
WD115 protein transport protein sec13
WD056 hypothetical protein, conserved
WD116 protein transport protein sec31
WD057 hypothetical protein, conserved
WD117 telomerase component (pseudogene)
WD058 hypothetical protein, conserved
WD059 hypothetical protein, conserved
WD060 hypothetical protein, conserved
54
Na Tabela 4-2 estão identificados os modelos gênicos que foram agrupados nos 117 supra-
genes. A forma como esses modelos gênicos foram agrupados está descrita no item 3.7.2 e a re-
presentação da similaridade entre os modelos gênicos que foram agrupados dentro de cada supra-
gene está no anexo I, disponível no CD disponibilizado com o presente trabalho, no qual há uma
representação gráfica de um alinhamento múltiplo, focado principalmente em mostrar como, de
maneira geral, os modelos gênicos classificados dentre cada supra-gene. Portanto, quando os mo-
delos gênicos alinhados são muito grandes, é feito um redimensionamento para que seja possível
visualizar, em uma única página, as semelhanças entre os mesmos, à custa da visualização das se-
qüências nucleotídicas.
O número médio de modelos gênicos por supra-gene é de 1,97 sendo que a distribuição
do número de modelos gênicos por supra-gene está representada na
Figura 4.12. Conforme pode ser visto nessa figura, temos 26 supra-genes com somente um
modelo gênico (os modelos gênicos são realmente genes distintos), 72 supra-genes com dois mo-
delos gênicos (em sua grande maioria serão alelos entre si), 15 supra-genes com três modelos gêni-
cos (em sua grande maioria são compostos de um alelo principal e um alelo fragmentado em dois
modelos gênicos) e 4 supra-genes com quatro modelos gênicos (em sua maioria, são dois alelos,
cada um com dois fragmentos).
Figura 4.12 Distribuição do número de modelos gênicos por supra-gene.
55
Tabela 4-2 Supra-genes WD, com a definição dos modelos gênicos agrupados
Gene Descrição Modelos gênicos
WD001 activated protein kinase C receptor 8621.t00012; 8621.t00013
WD002 ARP2/3 complex subunit 8642.t00003; 4966.t00004
WD003 beta prime COP protein 7103.t00003; 7211.t00001
WD004 beta propeller protein 8115.t00002; 7815.t00001
WD005 chromatin assembly factor 1 subunit B 5857.t00006; 4574.t00010
WD006 coatomer alpha subunit 8466.t00016
WD007 coronin 5798.t00008; 5936.t00010
WD008 dynein intermediate chain 7502.t00006; 7426.t00007
WD009 dynein intermediate chain 8600.t00003; 4937.t00011
WD010 eIF3 subunit 6080.t00008; 8730.t00023
WD011 GTP-binding protein beta subunit-like protein 8230.t00003; 7426.t00017
WD012 hypothetical protein 6919.t00010; 2437.t00001; 6026.t00002
WD013 hypothetical protein 7091.t00015; 7875.t00005
WD014 hypothetical protein, conserved 4598.t00004; 7118.t00019
WD015 hypothetical protein, conserved 4598.t00007; 7118.t00024
WD016 hypothetical protein, conserved 4655.t00002; 6824.t00016
WD017 hypothetical protein, conserved 4770.t00013; 5881.t00002
WD018 hypothetical protein, conserved 4773.t00004; 7579.t00003
WD019 hypothetical protein, conserved 4801.t00009; 8822.t00029
WD020 hypothetical protein, conserved 4811.t00004; 5505.t00002
WD021 hypothetical protein, conserved 4838.t00003; 6847.t00025
WD022 hypothetical protein, conserved 4881.t00001
WD023 hypothetical protein, conserved 4911.t00011
WD024 hypothetical protein, conserved 4911.t00011
WD025 hypothetical protein, conserved 4972.t00001; 6945.t00002; 5391.t00010; 8250.t00001
WD026 hypothetical protein, conserved 5396.t00002; 5354.t00005
WD027 hypothetical protein, conserved 5408.t00006; 5921.t00003
WD028 hypothetical protein, conserved 5427.t00001; 3845.t00005; 5655.t00001
WD029 hypothetical protein, conserved 5442.t00001; 8190.t00003; 7472.t00006
WD030 hypothetical protein, conserved 5506.t00015; 7005.t00018
WD031 hypothetical protein, conserved 5539.t00007; 5630.t00006
WD032 hypothetical protein, conserved 5617.t00003; 7092.t00020
WD033 hypothetical protein, conserved 5741.t00003; 4807.t00004
WD034 hypothetical protein, conserved 5747.t00002; 6930.t00039
WD035 hypothetical protein, conserved 5757.t00019; 4869.t00017; 7429.t00017
WD036 hypothetical protein, conserved 5811.t00002; 5913.t00001; 485.t00002
WD037 hypothetical protein, conserved 5829.t00008; 8263.t00010
WD038 hypothetical protein, conserved 5997.t00003; 8149.t00012
WD039 hypothetical protein, conserved 6091.t00007; 7432.t00003
WD040 hypothetical protein, conserved 6093.t00003; 8287.t00004
WD041 hypothetical protein, conserved 6711.t00009; 7972.t00010
WD042 hypothetical protein, conserved 6851.t00002; 8292.t00001; 8291.t00006
WD043 hypothetical protein, conserved 6853.t00003; 7918.t00009; 6091.t00001
WD044 hypothetical protein, conserved 6855.t00002; 6089.t00013; 8646.t00032
WD045 hypothetical protein, conserved 6979.t00015; 5625.t00002
WD046 hypothetical protein, conserved 6985.t00007; 8646.t00008
WD047 hypothetical protein, conserved 7000.t00016; 7187.t00022; 4863.t00008; 7187.t00013
WD048 hypothetical protein, conserved 7044.t00011; 8633.t00005
WD049 hypothetical protein, conserved 7052.t00016
WD050 hypothetical protein, conserved 7092.t00016; 8611.t00002
WD051 hypothetical protein, conserved 7112.t00011
WD052 hypothetical protein, conserved 7118.t00034; 8605.t00005
WD053 hypothetical protein, conserved 7144.t00002; 5591.t00005; 8501.t00004
WD054 hypothetical protein, conserved 7149.t00004; 7111.t00009
WD055 hypothetical protein, conserved 7177.t00003; 8774.t00005
WD056 hypothetical protein, conserved 7206.t00017
WD057 hypothetical protein, conserved 7208.t00012; 4888.t00003
WD058 hypothetical protein, conserved 7253.t00003; 8668.t00002; 8652.t00010
WD059 hypothetical protein, conserved 7369.t00014; 7786.t00006
56
Tabela 4-2 continuação
Gene Descrição Modelos gênicos
WD061 hypothetical protein, conserved 7414.t00033; 4749.t00001; 5773.t00003; 7413.t00011
WD062 hypothetical protein, conserved 7473.t00002; 5580.t00002; 8453.t00007
WD063 hypothetical protein, conserved 7474.t00006; 8000.t00001
WD064 hypothetical protein, conserved 7478.t00011; 6176.t00001; 2253.t00001; 8746.t00008
WD065 hypothetical protein, conserved 7502.t00003; 7426.t00009
WD066 hypothetical protein, conserved 7624.t00023
WD067 hypothetical protein, conserved 7624.t00029
WD068 hypothetical protein, conserved 7626.t00001; 8755.t00007
WD069 hypothetical protein, conserved 7660.t00008; 6931.t00017; 691.t00001
WD070 hypothetical protein, conserved 7678.t00013
WD071 hypothetical protein, conserved 7678.t00023
WD072 hypothetical protein, conserved 7696.t00010
WD073 hypothetical protein, conserved 7739.t00039
WD074 hypothetical protein, conserved 7773.t00008; 7945.t00008
WD075 hypothetical protein, conserved 7875.t00001
WD076 hypothetical protein, conserved 7889.t00007; 6179.t00012
WD077 hypothetical protein, conserved 7891.t00017
WD078 hypothetical protein, conserved 7913.t00015; 6885.t00010
WD079 hypothetical protein, conserved 7920.t00003; 8672.t00001
WD080 hypothetical protein, conserved 8019.t00009
WD081 hypothetical protein, conserved 8158.t00012; 7443.t00002
WD082 hypothetical protein, conserved 8171.t00009; 8258.t00012
WD083 hypothetical protein, conserved 8181.t00003; 8325.t00006
WD084 hypothetical protein, conserved 8264.t00002; 7536.t00006
WD085 hypothetical protein, conserved 8291.t00004; 6851.t00004
WD086 hypothetical protein, conserved 8328.t00041
WD087 hypothetical protein, conserved 8359.t00016; 5654.t00003
WD088 hypothetical protein, conserved 8364.t00008
WD089 hypothetical protein, conserved 8385.t00020; 8300.t00019
WD090 hypothetical protein, conserved 8387.t00022
WD091 hypothetical protein, conserved 8421.t00009; 8796.t00008
WD092 hypothetical protein, conserved 8458.t00012; 8480.t00014
WD093 hypothetical protein, conserved 8467.t00008; 7507.t00004
WD094 hypothetical protein, conserved 8526.t00007; 4726.t00005
WD095 hypothetical protein, conserved 8530.t00013; 7830.t00006
WD096 hypothetical protein, conserved 8564.t00009; 7152.t00012
WD097 hypothetical protein, conserved 8643.t00034
WD098 hypothetical protein, conserved 8649.t00003
WD099 hypothetical protein, conserved 8689.t00006; 5725.t00002
WD100 hypothetical protein, conserved 8694.t00006; 8462.t00011
WD101 hypothetical protein, conserved 8696.t00008; 5991.t00009
WD102 hypothetical protein, conserved 8707.t00014
WD103 hypothetical protein, conserved 8717.t00017; 8388.t00002
WD104 hypothetical protein, conserved 8737.t00015; 6380.t00021
WD105 hypothetical protein, conserved 8794.t00025; 8419.t00002
WD106 hypothetical protein, conserved 8796.t00012; 8421.t00013
WD107 katanin 7128.t00005; 5982.t00004
WD108 neurobeachin/beige-like protein 7651.t00003; 6062.t00004; 6061.t00001
WD109 notchless homolog 8590.t00002; 6221.t00003; 2407.t00001
WD110 periodic tryptophan protein 2 6912.t00014; 7916.t00012
WD111 peroxisomal targeting signal type 2 receptor 7164.t00016; 4764.t00004
WD112 poly(A) export protein 8727.t00013; 5688.t00002
WD113 protein kinase 8538.t00012
WD114 protein transport protein sec13 6985.t00002; 8646.t00002
WD115 protein transport protein sec13 7882.t00014
WD116 protein transport protein sec31 6890.t00029; 8305.t00001; 5536.t00008
WD117 telomerase component (pseudogene) 7912.t00013
57
4.7
Módulos protéicos presentes nos supra-genes
Como critério de seleção, todos os 117 supra-genes continham módulos característicos da
família WD, de acordo com a representação presente no banco de dados PFAM. A distribuição de
módulos WD por supra-gene está representada na Figura 4.13.
Conforme pode ser visto a maioria das proteínas WD em T. cruzi contém 4 ou 5 módulos
(n=53; 45,3%), sendo que as que contêm três ou mais módulos representam 86,3% do total de
proteínas com módulos WD (n=101). Os supra-genes WD048 (codificando uma proteína hipoté-
tica) e WD117 (fragmento do componente protéico da telomerase) são os que contêm o maior
número de módulos (n=10) enquanto que os supra-genes WD032 e WD069 (ambos codificando
proteínas hipotéticas conservadas) tem somente um módulo WD. Pelo fato do módulo WD estar
envolvido em interação proteína-proteína, é geralmente encontrado em um número grande de
cópias, o que está em acordo com nossos resultados, demonstrando a alta confiabilidade de que a
predição do módulo represente, na verdade, uma proteína realmente contendo módulos WD. Os
supra-genes que apresentaram um conjunto de módulos WD inferior a 3 (n=16, 13,7%) represen-
tam proteínas com menor probabilidade de serem funcionalmente de interação (erro de predição
do domínio) ou se apresentam truncadas (erro de montagem do genoma), tendo, nesse caso, pro-
vavelmente mais domínios WD que foram perdidos. A elucidação desse problema necessita do
seqüenciamento desses genes, de preferência de seus cDNAs.
Figura 4.13 Distribuição dos domínios WD em proteínas de
T. cruzi
.
58
Além do módulo WD, poucos supra-genes apresentam outros módulos funcionais predi-
tos (n=14; 12,0%), sendo que para 5 deles o módulo extra representa a anotação funcional deter-
minada pelo TSK (WD003, WD006, WD108, WD110 e WD113). Para os nove genes restantes,
todas proteínas hipotéticas conservadas, o módulo extra predito pode servir para uma indicação
funcional mais precisa, o que será visto em maiores detalhes mais adiante.
Tabela 4-3 Supra-genes WD contendo outros módulos
Gene descrição Domínios extras
WD003 beta prime COP protein Coatomer WD associated region (PF04053)
WD006 coatomer alpha subunit Coatomer (COPI) alpha subunit C-terminus (PF06957)
WD015 hypothetical protein, conserved M-protein repeat (PF02370), quatro cópias
WD039 hypothetical protein, conserved PDZ domain (PF00595)
WD048 hypothetical protein, conserved Dip2/Utp12 family (PF04003)
WD061 hypothetical protein, conserved Beige/BEACH domain (PF02138)
WD069 hypothetical protein, conserved EF-hand calcium-binding domain (PS00018)
WD078 hypothetical protein, conserved WWE (PF02825)
WD091 hypothetical protein, conserved EGF-like domain signature 2 (PS01186)
WD092 hypothetical protein, conserved EF-hand calcium-binding domain (PS00018)
WD096 hypothetical protein, conserved EF hand (PF00036)
WD108 neurobeachin/beige-like protein Beige/BEACH domain (PF02138)
WD110 periodic tryptophan protein 2 Periodic tryptophan protein 2 WD associated domain (PF04047)
WD113 protein kinase Protein kinase domain (PF00069)
Um resultado importante que emerge dessa análise da existência de outros domínios é a
grande proporção de supra-genes sem domínios extras (88,0%). No entanto, a grande maioria
desses genes possui segmentos relativamente grandes sem módulos preditos (dados não mostra-
dos). Isso pode representar a possibilidade de que nesses segmentos existam regiões funcionais
ainda não caracterizadas, uma situação comum em T. cruzi. Um exemplo disso é a família das qui-
nases, as quais não apresentam os módulos acessórios mais comuns às quinases de eucariotos su-
periores, mas as suas seqüências, em geral, são bem maiores do que somente o módulo caracterís-
tico de quinase (EL-SAYED et al., 2005). Da mesma forma, as proteínas contendo módulos WD,
que podem estar envolvidas em vias de sinalização e regulação através da montagem de comple-
xos, podem conter módulos acessórios novos, mais característicos de tripanossomatídeos.
4.8
Análise de ortologia em TriTryps
Concomitantemente com a publicação do genoma de T. cruzi (EL-SAYED et al., 2005),
também foram publicados os genomas de outros dois tripanossomatídeos de interesse: T. brucei
(BERRIMAN et al., 2005) e L. major (IVENS et al., 2005), os quais são de forma abreviada deno-
minados TriTryps.
Esses três organismos apresentam uma grande conservação de genes ortólogos, bem como
de sua localização nos cromossomos, isto é, também há conservação na sintenia entre os TriTryps.
Com isso, é possível identificar claramente quais seriam os possíveis ortólogos entre esses três
organismos, não somente pela similaridade de seqüência, mas também pela posição no cromos-
59
somo. A anotação dessas relações de homologia estão disponíveis no sistema de banco de dados
genômicos GeneDB (http://www.genedb.org).
Esses dados de ortologia foram analisados para os 117 supra-genes WD e, em sua grande
maioria (n= 109; 92,3%) foram encontrados ortólogos nos outros dois TriTryps. As exceções
estão representadas na
Tabela 4-4, e se constituem de 3 genes somente encontrados em Trypanosoma cruzi (um deles ano-
tado como proteína hipotética conservada) e 5 encontrados somente em T. cruzi e T. brucei. Por-
tanto, não foram identificados quaisquer ortólogos entre T. cruzi e L. major, que não ocorressem
em T. brucei. Esses cinco genes possivelmente representam elementos que surgiram após a separa-
ção entre as linhas evolutivas dos Trypanosoma e das Leishmanias que ocorreu provavelmente há
mais de 350 milhões de anos (FERNANDES et al., 1993).
Tabela 4-4 Supra-genes que não apresentam ortólogos em todos os TriTryps
Gene Descrição
T.cruzi
T.brucei
L. major
WD012
hypothetical protein
WD013
hypothetical protein
WD040
hypothetical protein, conserved
WD015
hypothetical protein, conserved
WD046
hypothetical protein, conserved
WD088
hypothetical protein, conserved
WD094
hypothetical protein, conserved
WD108
neurobeachin/beige-like protein, putative
O organismo no qual foi evidenciando um gene órtologo está marcado em cinza.
4.9
Comparação de homologia de seqüência
Visando identificar quais seriam os possíveis ortólogos dos supra-genes WD, foi realizado
um BLASTp com as seqüências dos genes WD contra as seqüências protéicas disponíveis no
GenBank (Anexo II, no CD). Na Tabela 4-5 podemos observar o grau de positividade obtido para
os 117 supra-genes WD contra as proteínas de T. brucei e L. major, além de uma indicação binária
(Sim ou Não) se foram encontrados ortólogos putativos em outros organismos. O grau de positi-
vidade é contado calculando-se quantos aminoácidos são idênticos ou de função similar dentre
aqueles presentes em uma HSP (high-scoring segment pair).
4.10
Atribuição de função por similaridade para proteínas hipotéticas
Na Tabela 4-6, é possível verificar que para 37 dos 117 supra-genes WD (31,6%) foi pos-
sível sugerir uma função putativa à proteínas anteriormente anotadas como somente “hipotéticas
conservadas”. Essa atribuição funcional foi obtida através da análise do resultado do BLASTp.
60
Tabela 4-5 Grau de similaridade dos supra-genes WD com outros organismos
Gene
T. brucei
L. major
Outros
Gene
T. brucei
L. major
Outros
WD001
92% 77% S
WD060
78% 75% S
WD002
75% N S
WD061
56% 43% N
WD003
86% 79% S
WD062
77% 66% S
WD004
81% 73% S
WD063
55% 43% S
WD005
62% 53% S
WD064
61% 57% S
WD006
91% 80% S
WD065
75% 71% N
WD007
73% 59% S
WD066
61% 45% N
WD008
85% 76% S
WD067
70% 55% ?
WD009
68% 65% S
WD068
88% 81% S
WD010
93% 70% S
WD069
65% 52% N
WD011
84% 68% N
WD070
72% 73% N
WD012
N N N
WD071
78% 62% S
WD013
N N N
WD072
90% 87% S
WD014
48% 46% S
WD073
93% 87% S
WD015
55% 47% S
WD074
48% 39% S
WD016
80% 62% S
WD075
98% 93% S
WD017
82% 72% S
WD076
64% 48% S
WD018
82% 82% S
WD077
83% 70% N
WD019
65% 65% S
WD078
55% 47% N
WD020
65% 65% S
WD079
75% 62% S
WD021
67% 55% S
WD080
79% 61% S
WD022
72% 63% S
WD081
67% 57% S
WD023
68% 57% S
WD082
90% 79% S
WD024
68% 57% S
WD083
76% 69% S
WD025
54% 50% N
WD084
69% 67% S
WD026
60% 54% N
WD085
80% 66% S
WD027
90% 73% S
WD086
65% 45% N
WD028
67% 40% S
WD087
58% 50% N
WD029
76% 68% N
WD088
76% N S
WD030
75% 58% N
WD089
80% 62% S
WD031
66% 61% S
WD090
81% 71% S
WD032
78% 78% S
WD091
49% 39% N
WD033
91% 82% S
WD092
53% 43% N
WD034
51% 51% N
WD093
67% 57% S
WD035
58% 54% N
WD094
50% 50% N
WD036
77% 57% S
WD095
77% 60% S
WD037
66% 39% N
WD096
48% 45% N
WD038
67% 54% N
WD097
78% 61% S
WD039
54% 46% N
WD098
55% 46% S
WD040
42% 42% N
WD099
62% 51% S
WD041
59% 47% N
WD100
55% 60% N
WD042
59% 46% N
WD101
66% 48% N
WD043
90% 81% S
WD102
93% 76% S
WD044
70% 61% S
WD103
76% 67% N
WD045
66% 66% S
WD104
75% 57% N
WD046
49% N N
WD105
66% 40% N
WD047
53% 40% S
WD106
75% 65% S
WD048
53% 40% S
WD107
67% 55% S
WD049
80% 72% S
WD108
56% N S
WD050
65% 55% S
WD109
87% 84% S
WD051
68% 47% N
WD110
88% 81% S
WD052
59% 54% S
WD111
85% 78% S
WD053
58% N N
WD112
82% 71% S
WD054
74% 67% N
WD113
60% 51% S
WD055
81% 59% S
WD114
79% 61% S
WD056
74% 65% S
WD115
73% 60% S
WD057
59% 50% N
WD116
79% 66% S
WD058
80% 80% S
WD117
NA NA NA
WD059
72% 61% S
61
Tabela 4-6. Supra-genes WD para os quais foi sugerida a mudança de anotação
Gene Descrição Reanotação (IBMP)
WD011 GTP-binding protein beta subunit-like Hypothetical protein, conserved
WD016 hypothetical protein, conserved TcWDR63, putativa
WD017 hypothetical protein, conserved TcUTP21, putative
WD018 hypothetical protein, conserved
TcUTP7
WD019 hypothetical protein, conserved
phospholipase A2, activating protein like
WD020 hypothetical protein, conserved
Ciao1-like protein
WD021 hypothetical protein, conserved
TcRRP9
WD022 hypothetical protein, conserved
TcCDC40
WD023 hypothetical protein, conserved
TcWDR51A, putative
WD027 hypothetical protein, conserved
TcWDR68, putative
WD028 hypothetical protein, conserved
TcWDR27, putative
WD032 hypothetical protein, conserved
TcBOP1, putative
WD033 hypothetical protein, conserved
TcODA16, putative
WD036 hypothetical protein, conserved
WDR52-like, putative
WD043 hypothetical protein, conserved
TcIFP80
WD044 hypothetical protein, conserved
TcIFT140
WD048 hypothetical protein, conserved
TcUtp12
WD049 hypothetical protein, conserved
TcIFT122
WD050 hypothetical protein, conserved
TcAtg16
WD052 hypothetical protein, conserved
TcPrp4.
WD056 hypothetical protein, conserved
TcUtp13
WD059 hypothetical protein, conserved
TcRsa4
WD060 hypothetical protein, conserved
TcYtm1
WD063 hypothetical protein, conserved
TcPrp19
WD068 hypothetical protein, conserved
TcDip2/Utp5
WD071 hypothetical protein, conserved
Prp46p
WD072 hypothetical protein, conserved
TcStrap
WD073 hypothetical protein, conserved Sofp
WD074 hypothetical protein, conserved
TcDmx-like
WD075 hypothetical protein, conserved
TcBop1
WD081 hypothetical protein, conserved TcCdc20
WD082 hypothetical protein, conserved TcIft172
WD085 hypothetical protein, conserved TcPwp1
WD088 hypothetical protein, conserved TcAip1
WD090 hypothetical protein, conserved TcGrwd1
WD097 hypothetical protein, conserved TcSpag16
WD102 hypothetical protein, conserved TcPfs2
62
Tabela 4-7 Função geral provável das proteínas WD após reanotação IBMP
Gene Descrição Função
WD001 activated protein kinase C receptor sinalização proteína quinase C
WD002 ARP2/3 complex subunit polimerização actina
WD003 beta prime COP protein transporte
WD004 beta propeller protein biogênese do ribossomo
WD005 chromatin assembly factor 1 subunit B cromatina
WD006 coatomer alpha subunit transporte
WD007 coronin polimerização actina
WD008 dynein intermediate chain motora
WD009 dynein intermediate chain motora
WD010 eIF3 subunit tradução
WD017 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD018 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD019 hypothetical protein, conserved resposta inflamatória
WD020 hypothetical protein, conserved montagem proteica
WD021 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD022 hypothetical protein, conserved splicing do mRNA
WD027 hypothetical protein, conserved sinalização
WD032 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD033 hypothetical protein, conserved flagelo
WD043 hypothetical protein, conserved flagelo
WD044 hypothetical protein, conserved flagelo
WD048 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD049 hypothetical protein, conserved flagelo
WD050 hypothetical protein, conserved autofagia
WD052 hypothetical protein, conserved splicing do mRNA
WD056 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD059 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD060 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD063 hypothetical protein, conserved splicing do mRNA
WD068 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD071 hypothetical protein, conserved splicing do mRNA
WD072 hypothetical protein, conserved sinalização
WD073 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD075 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD076 hypothetical protein, conserved splicing do mRNA
WD081 hypothetical protein, conserved ciclo celular
WD082 hypothetical protein, conserved flagelo
WD085 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD088 hypothetical protein, conserved polimerização actina
WD090 hypothetical protein, conserved biogênese do ribossomo
WD097 hypothetical protein, conserved flagelo
WD102 hypothetical protein, conserved splicing do mRNA
WD107 katanin, putative citoesqueleto
WD108 neurobeachin/beige-like protein, putative sinalização por quinases A
WD109 notchless homolog, putative biogênese do ribossomo
WD110 periodic tryptophan protein 2, putative biogênese do ribossomo
WD111
peroxisomal targeting signal type 2 receptor,
putative peroxissomo
WD112 poly(A) export protein, putative exportação mRNA
WD113 protein kinase, putative fosforilação de proteinas
WD114 protein transport protein sec13, putative transporte
WD115 protein transport protein sec13, putative transporte
WD116 protein transport protein sec31, putative transporte
WD117 telomerase component (pseudogene), putative telômeros
63
4.11
Atribuição funcional
A partir da anotação funcional realizada pelo consórcio de seqüenciamento do genoma de
T. cruzi, associada à anotação funcional realizada por nós e descrita na tabela anterior, foi possível
identificar as funções nas quais os 117 genes WD estariam envolvidos, conforme pode ser visto na
Tabela 4-7. Um total de 64 genes (54,7%) não apresentou anotação funcional, 16 (13,7%) foram
anotados como biogênese do ribossomo, 6 (5,1%) como sendo flagelares, 6 (5,1%) processamento
de RNA, 5 (4,2%) transporte, 4 (3,4%) sinalização, 3 (2,6%) polimerização actina, 2 (1,7%) de
função motora e 10 (8,5%) foram anotados em funções individuais: ciclo celular, citoesqueleto,
cromatina, exportação de mRNA, fosforilação de proteínas, montagem protéica, peroxissomo,
resposta inflamatória, telômeros e tradução.
4.12
Descrição das características bioinformáticas e de expressão diferencial
Passaremos agora a fazer uma descrição sucinta das características peculiares dos 117 su-
pra-genes WD, com ênfase especial para os dados de microarranjo e de proteômica, quando hou-
ver. Essa descrição é composta de uma descrição da localização dos módulos WD, do grau de
similaridade com outros organismos e com os dados relativos à expressão diferencial, quando
houver. Dessa forma, será uma descrição repetitiva, cujo objetivo principal é permitir, aos futuros
pesquisadores envolvidos com os genes dessa via, um acesso rápido a essas informações.
4.12.1 WD001 - Activated protein kinase C receptor
Esse gene, também denominado RACK1 (em mamíferos), TRACK (em Trypanosoma brucei)
e LACK (em Leishmania), contém sete domínios WD, que constituem praticamente toda a seqüên-
cia protéica. Os dois modelos gênicos identificados (8621.t00012 e 8621.t00013) representam na
verdade parálogos, pois estão justapostos em tandem no mesmo fragmento genômico de T. cruzi,
situação que ocorre também nos outros dois tripanossomatídeos seqüenciados. Portanto, a origem
desse evento de duplicação deve ter ocorrido antes da separação das linhas evolutivas que deram
origem aos TriTryps. Esse gene foi selecionado para a produção de um clone recombinante con-
tendo toda a sua região codificadora, dentro do projeto de validação biológica dos resultados da
análise genômica funcional da metaciclogênese de T. cruzi (PROBST et al., em preparação)
A variação do nível de mRNA polissomal desse gene está representado na Figura 4.14.
Conforme podemos observar, a expressão desse gene diminui durante a metaciclogênese, alcan-
çando um valor máximo de redução de aproximadamente 200% em epimastigotas aderidos, em
12h de diferenciação, sendo que após esse período, os níveis de expressão sobem, mas não che-
gam aos mesmos níveis de epimastigotas, chegando a aproximadamente 50% de diminuição na
amostra de tripomastigota metacíclicos. Esse mesmo padrão pode ser observado nas réplicas de
64
tripomastigotas metacíclicos do ciclo de vida, no qual três amostras apresentam um perfil próximo
a 50% de redução e somente uma apresenta um perfil próximo a nenhuma mudança. A compara-
ção da expressão desse gene entre epimastigota e amastigota mostra uma pequena oscilação ao
redor do valor zero, compatível com a inalteração dos níveis de mRNA polissomal desse gene
entre essas duas amostras.
Figura 4.14 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD001 na metaciclogênese
e no ciclo de vida.
À esquerda, metaciclogênese. Eixo Y=log
2
da razão entre a amostra e epimastigosta. Amostras: Stress (es-
tresse nutricional), 3h, 12h e 24h (epimastigota aderido, em diferenciação por 3, 12 e 24 horas, Meta (metací-
clicos). À direita, comparação entre formas do ciclo de vida de
T. cruzi
. Em azul, amostras de metacíclicos;
em verde amostras de amastigota; eixo Y= log
2
da razão entre a amostra e epimastigosta.
Esse mesmo gene apresentou uma segunda sonda, que possui um perfil semelhante, espe-
cialmente com relação à metaciclogênese, o qual está demonstrando na Figura 4.15. A principal
discrepância diz respeito ao perfil das amostras de metacíclico no ciclo de vida, sem, no entanto,
mudar o padrão geral dessa amostra, isto é, diminuição em tripomastigota metacíclico, porém em
menor intensidade do que o pico de diminuição em aderido 12 horas, e inalteração entre epimasti-
gotas e amastigotas.
65
Figura 4.15 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD001 na metaciclogênese
e no ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
Esse gene também foi identificado na análise proteômica do estudo de ATWOOD et al.
(2005), conforme o esquema representa na Figura 4.16.
Figura 4.16 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD001 no ciclo de vida por
proteômica.
Dados de Atwood
et al.
(2005). Á esquerda, contagem de peptídeos que passaram o critério de seleção
inicial . À direita, contagem de peptídeos identificados que passaram em um critério mais estringente de
seleção.
É possível verificar que os dados da proteômica são perfeitamente compatíveis com os do
microarranjo, no tocante à diminuição da expressão entre epimastigotas e metacíclicos (de 9 pep-
tídeos em epimastigotas para 3 em metacíclicos, nos dados gerais; e de 8 para 3, nos dados de alta
qualidade). No entanto, na proteômica também foi evidenciado uma diminuição do número de
peptídeos identificados entre epimastigotas e amastigotas, enquanto que nos dados de microarran-
jo, a expressão entre essas duas amostras estava inalterada.
66
Na comparação dos dados de similaridade, observa-se que essa proteína é extremamente
conservada, tendo sido descrita em diversos tripanossomatídeos (T. cruzi, T. brucei, L. major, L.
donovani, L. amazonensis, L. infantum, C. fasciculata). À parte dos tripanossomatídeos (entre 74 e 92%
de positividade, isto é, de aminoácidos funcionalmente equivalentes), os ortólogos mais similares
são os de fungos como Aspergillus nidulans (69% de positividade), embora organismos mais distan-
tes como Xenopus tropicalis, Mus musculus, Danio rerio e Homo sapiens apresentem regiões amplas com
até 70% de positividade.
Em mamíferos, essa proteína conservada serve como arcabouço para diversas proteínas
envolvidas na ativação da proteína quinase C, mediando a ativação da via Akt, cujas atividades
incluem o crescimento celular, forma e tradução protéica, podendo estar envolvida no contato
com a matriz extra-celular (HERMANTO et al., 2002), morte celular (KIELY et al., 2002) e regula-
ção da progressão da fase G1 para a fase S (MAMIDIPUDI et al., 2004). Ela pode mediar isso por
servir como uma proteína de arcabouço (scaffold) para o receptor de interferon (IFN), STAT1, Ja-
nus quinase 1 e tirosina quinase 2 (USACHEVA et al., 2003).
Em tripanossomatídeos, a função dessa proteína é menos caracterizada. Em epimastigotas
de T. cruzi foi isolada a isoforma alfa da proteína-quinase C (PKC) e determinada sua atividade
quinase (GOMEZ, et al 1999), demonstrando a existência dessa via central de regulação nesse pa-
rasita.
Em Trypanosoma brucei, a expressão do gene TRACK está aumentada na forma sanguínea,
sendo um dos dois primeiros genes endógenos identificados com expressão aumentada em morte
celular programada em um organismo unicelular (WELBURN & MURPHY, 1998). Recentemen-
te, ROTHBERG et al. (2006) demonstraram a importância dessa proteína na citocinese de T. bru-
cei, através do uso da técnica de interferência de RNA (RNAi). Nesse mesmo trabalho, eles evi-
denciaram a inibição do crescimento, sendo que em formas sangüíneas, isso é devido a um atraso
no início da citocinese, enquanto que em formas procíclicas, a citocinese é iniciada, mas essa é
interrompida no meio do processo, durante a clivagem celular. A alteração fenotípica causada pelo
RNAi também foi evidenciado in vivo, em camundongos infectados com as formas alteradas de T.
brucei, nos quais os parasitas são eliminados do sangue periférico no período de três dias pós-
infecção. Esses resultados sugerem que essa proteína é utilizada em T. brucei para regular os está-
gios finais da mitose. Essa proteína pode complementar os mutantes nulos de cpc2, a homóloga
de RACK1 em Schizosaccharomyces pombe.
Em Leishmania, o gene LACK, também denominado antígeno p36, é muito estudado em
relação a sua função como um antígeno protetivo com relação à infecção (PRINA et al., 1996). Ele
contém um epítopo imunodominante entre os aminoácidos 156 e 173, o qual se supõe que nucleia
a resposta patológica do tipo Th2 em camundongos susceptíveis da linhagem BALB/C (KELLY
& LOCKSLEY, 2004).
67
Muito pouco é conhecido sobre sua função biológica em Leishmania: KELLY et al. (2003), usando
a técnica de nocaute gênico, demonstraram que parasitas contendo somente um único gene
LACK crescem de forma equivalente ao tipo selvagem, embora não consigam parasitar camun-
dongos BALB/c eficientemente, demonstrando sua importância no processo infeccioso de Leish-
mania. Mutantes nulos desse gene não foram obtidos, sugerindo que a ausência desse gene é letal
em Leishmania.
4.12.2 WD002 - ARP2/3 complex subunit, putative
Este gene contém cinco módulos WD, dispersos por sua região codificadora. O ortólogo
em T. brucei apresenta 75% de positividade; embora a anotação do genoma de T. cruzi feito pela
equipe do Sanger Centre, disponível no banco de dados GeneDB (http://www.genedb.org) indi-
que que Leishmania também tenha um ortólogo para esse gene (LmjF18.0920), aparentemente isso
não está correto. A comparação do gene de T. cruzi com o de Leishmania major demonstra positivi-
dade de 43%, em uma HSP (high-scoring segment pair, isto é, uma região de alta similaridade entre
duas seqüências) relativa somente a metade da proteína. Há diversos possíveis ortólogos de orga-
nismos mais distantes que possuem positividade e HSPs maiores, indicando que embora funcio-
nalmente relacionado, esse gene em Leishmania não é um ortólogo.
Ela apresenta similaridade alta com proteínas de diversos outros organismos, as quais estão
anotadas como Actin-related protein 2/3 complex subunit 1B. Este gene codifica uma das sete subuni-
dades do complexo protéico Arp2/3 humano; esta subunidade é um membro da família SOP2 e é
sugerido que ele possa atuar como a subunidade p41 do complexo Arp2/3 que está implicado no
controle da polimerização de actina nas células. É possível que a subunidade p41 esteja envolvida
na montagem e manutenção da estrutura do complexo Arp2/3 (WELCH et al., 1997).
De forma mais detalha, esse complexo é formado por sete polipeptídeos: ARP2 e ARP3,
relacionados diretamente à actina, e 5 subunidades do complexo que são denominadas
(ARPC1)p41, (ARPC2)p34, (ARPC3)p21, (ARPC3)p20 e (ARPC3)p16.
Em humanos, ARPC5 (subunidade 5 p16) contém duas isoformas, sendo que a isoforma
A é fosforilada pela proteína-quinase 2, ativada na via de MAPK (MAPKAPK2) e sugerindo que
esta fosforilação é um mecanismo possível pelo qual a p38-MAPK regula a remodelação do cito-
esqueleto de actina (SINGH et al., 2003).
O complexo protéico em camundongo interage transientemente com a vinculina, uma
proteína associada à integrina, e o recrutamento do complexo para vinculina pode ser um meca-
nismo pelo qual a polimerização de actina e projeções de membrana estão acopladas à adesão me-
diada por integrina nos processos de mobilidade celular (DeMALI, 2002).
68
A variação do nível de mRNA polissomal desse gene está representado na Figura 4.17.
Conforme podemos observar, a expressão desse gene aumenta durante a metaciclogênese, alcan-
çando um valor máximo de aumento de aproximadamente 75% em epimastigotas aderidos, em 12
horas de diferenciação, sendo que após esse período, os níveis de expressão descem, não chegan-
do aos mesmos níveis de epimastigotas, mas em um nível que pode ser considerado como ausên-
cia de mudança significativa, o que é corroborado por três das réplicas de ciclo de vida, com exce-
ção da réplica Meta02, que apresenta um aumento de aproximadamente 100% com relação a epi-
mastigota. Na comparação entre epimastigotas e amastigotas, o padrão é de ausência de alterações
significativas.
Figura 4.17 Avaliação da expressão diferencial de WD002 na metaciclogênese e no ciclo de
vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.3 WD003- beta prime COP protein.
Essa proteína apresenta seis domínios WD em sua extremidade amino-terminal, sendo que
o restante do gene codifica o domínio de coatâmero associado a WD (PF04053). Os ortólogos em
T. brucei e L. major apresentam, respectivamente, 86% e 79% de positividade. Apresenta similari-
dade com diversas outras proteínas de outros organismos, sendo muito similar a uma proteína de
Mus musculus denominada Coatomer protein complex, subunit beta 2, com 61% de positividade em uma
HSP praticamente completa.
O complexo coatômero do Golgi constitue a cobertura de vesículas que não contém cla-
trina. É composto de sete subunidades, incluindo a COPB2. Em células eucarióticas, o transporte
de proteínas entre o retículo endoplasmático e o Golgi é mediado em parte por proteínas de co-
bertura (coating) vesiculares não-clatrina (COPs). Sete subunidades foram descritas e representam
componentes de um complexo conhecido como coatômero, ou COPI. Essas subunidades são
69
denominadas α-COP, β-COP, β´-COP, γ-COP, δ-COP, ε-COP e ζ-COP, com pesos moleculares
entre 58 e 160 kDa (STENBECK. et al., 1993). Proteínas COP existem no citosol como um com-
plexo pré-formado, o coatamero Esse complexo é recrutado para as membranas por ARF1, uma
proteína ligadora de GTP (PRESLEY et al., 2002).
COP1 em Arabidopsis thaliana é um repressor da fotomorfogênese, capaz de interagir com
o fator HY5, o qual é importante para a indução da fotomorfogênese. Essa interação resulta na
degradação do fator HY5 mediada pelo proteosoma 26S (HOLM et al., 2001).
Em T. cruzi, dois genes distintos codificam para duas subunidades do coatômero, apha e
beta (WD003 e WD006).
A variação do nível de mRNA polissomal desse gene está representado na Figura 4.18.
Conforme podemos observar, a expressão desse gene diminui de forma consistente durante a me-
taciclogênese, alcançando um valor de diminuição de aproximadamente 130% em 3 e 12 horas
aderido, e de aproximadamente 280% de diminuição em 24 horas e metacíclico. Essa diminuição
em metacíclico é confirmada nas amostras do ciclo de vida (entre 100% e 270% de diminuição,
com exceção da amostra Meta04). Há também uma diminuição, menos acentuada, entre epimasti-
gotas e amastigotas, variando entre 50% e 100%, sendo invariavelmente diminuído nas quatro
réplicas de amastigotas.
Figura 4.18 Avaliação da expressão diferencial do WD003 na metaciclogênese e no ciclo
de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.4 WD004- beta propeller protein.
Essa proteína apresenta uma anotação genérica, por analogia a subunidade β da proteina
G, sem anotação funcional específica em tripanosomatídeos. Apresenta três módulos WD, locali-
zados no meio da região codificadora. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentam, respecti-
70
vamente, 81% e 73% de positividade. Apresenta similaridade com outras proteínas de outros or-
ganismos, anotadas como Src-associated protein SAW, também denominada utp15, com aproxima-
damente 50% de positividade. A proteína utp15 faz parte do snoRNP U3, estando potencialmente
envolvida na maturação do rRNA 18S (TERNS & TERNS, 2002). Com base nesses resultados,
sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “TcUTP7”.
4.12.5 WD005- chromatin assembly factor 1 subunit B
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, quatro localizados em um bloco
próximo à extremidade amino-terminal e um isolado, mais próximo à extremidade carbóxi-
terminal os quais correspondem praticamente a toda proteína. Os ortólogos em T. brucei e L. major
apresentaram aproximadamente 62% e 53% de positividade, respectivamente.
O fator de montagem da cromatina I (CAF-I) é necessário para a montagem dos octâme-
ros de histona no DNA recém-replicado. CAF-I é composto de três subunidades protéicas, p50,
p60 e p150. A subunidade beta geralmente é fosforilada de maneira dependente do ciclo celular e
é normalmente encontrada no núcleo, com exceção da mitose, na qual é liberada no citoplasma.
Esta proteína também pode estar envolvida em reparo de DNA. Em Trypanosoma cruzi, a princípio
só foi encontrada essa subunidade do complexo.
4.12.6 WD006 - Coatomer alpha subunit
Essa proteína apresenta seis módulos WD dispersos por toda sua região codificadora. Ela
está truncada, pois não apresenta códon de parada, e provavelmente deve ter o restante de sua
região codificadora representada pelo gene 8467.t00001, o qual está anotado como um pseudo-
gene subunidade alfa do coatômero. A idéia de que são fragmentos é ainda mais reforçada porque
WD006 apresenta somente os módulos WD, em praticamente toda sua extensão, enquanto que
esse “pseudogene” representa o restante da proteína, com o módulo Coatomer (COPI) alpha subunit
C-terminus.
Uma descrição da função desse gene está descrita acima, na descrição da WD003.
4.12.7 WD007 - Coronin
Essa proteína apresenta três módulos WD, justapostos em sua extremidade amino-
terminal. Seus ortólogos em T. brucei e L. major apresentam 73% e 59% de positividade, respecti-
vamente.
71
As coroninas são reguladores altamente conservados do citoesqueleto de actina que foram
inicialmente descritas em Dictyostelium discoideum, no qual elas se localizam em estruturas semelhan-
tes a coroas ricas em actina, na superfície dorsal das células (DE HOSTOS et al., 1991). Um com-
ponente crucial da regulação da polimerização da actina é o complexo Arp2/3, conforme visto
acima. A polimerização ocorre através da formação de redes de actina, em um processo altamente
regulado, sendo que as coroninas seriam um desses fatores de regulação (UETRECHT & BEAR,
2006).
A variação do nível de mRNA polissomal desse gene está representado na Figura 4.19.
Conforme podemos observar, a expressão desse gene aumenta de forma gradativa até aderido 12
horas (aproximadamente 100% de aumento), decaindo posteriormente a níveis próximos ao de
epimastigota. Nas amostras de ciclo de vida, o padrão apresenta uma amostra discrepante tanto
para metacíclicos quanto para amastigotas, mas o padrão geral é bem consistente, de ausência de
mudança na comparação entre epimastigotas e metacíclicos e de aumento próximo a 75% em a-
mastigotas, com relação a epimastigotas.
Figura 4.19 Avaliação da expressão diferencial de WD007 na metaciclogênese e no ciclo de
vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.8 WD008 dynein intermediate chain
Essa proteína apresenta cinco módulos WD, próximos entre si, localizados em sua extre-
midade amino-terminal. Seus ortólogos em T. brucei e L. major apresentam 85% e 76% de positivi-
dade, respectivamente.
72
Dineína é um complexo molecular extremamente pesado (de 1 a 2 MDa) que atua como
um motor molecular. Ela pode atuar como transportadora de vesículas, na mitose e no batimento
ciliar/flagelar.
No caso do transporte de vesículas, ela atua movimentando sua carga para a extremidade
“minus” do microtúbulo. A função de motor é uma propriedade das cadeias pesadas de dineína,
enquanto que as cadeias leves estão envolvidas na ligação à carga propriamente dita (HARRISON
& KING, 2000).
Na Figura 4.20, é possível ver a identificação de peptídeos pela análise proteômica de
ATWOOD et al. (2005). Foi identificado um peptídeo em epimastigota quantidade insuficiente
para a análise de expressão diferencial, evidenciando, porém que essa proteína é expressa.
Figura 4.20 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD008 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16.
4.12.9 WD009. dynein intermediate chain
Conforme visto anteriormente, tanto o supra-gene WD008 quanto WD009 foram anota-
dos como cadeia intermediária da dineína. Conforme pode ser visto na Tabela 4-2 e no anexo I, na
grande maioria das vezes, modelos gênicos com nomes iguais representam, na verdade, o mesmo
gene. Contudo, a análise de agregação dos modelos gênicos em supra-genes já foi realizado, e o
fato de que dois supra-genes terem a mesma anotação provavelmente significa que são dois ele-
mentos codificantes muito diferentes, isto é, que podem ser facilmente discrimináveis pelo uso de
microarranjos de DNA, metodologia para a qual foi criada a análise de supra-genes. A constatação
de que esses dois supra-genes, WD008 e WD009, realmente representam elementos codificadores
distintos está na Figura 4.21, no qual as barras pretas significam regiões de completa similaridade
entre as proteínas codificadas pelos dois supra-genes e as barras em amarelo representam regiões
de identidade entre as duas seqüências. É facilmente observável de que, embora tenham algumas
regiões de identidade e, em menor grau, de similaridade, em geral as seqüências protéicas (menos
variáveis que as nucleotídicas) são relativamente divergentes, havendo muitas regiões, geralmente
73
de inserções/deleções, entre os dois supragenes. Dessa forma, é possível evidenciar que o critério
de classificação de supragenes permanece válido.
Figura 4.21 Alinhamento entre os supra-genes WD008 e WD009, ambos codificando para a
cadeia intermediária da dineína.
Outro dado que demonstra as diferenças entre os supragenes WD008 e WD009 é o fato
de que, para o primeiro, não havia uma sonda complementar, porém dados de proteômica, en-
quanto que para o segundo, havia dados oriundos do microarranjo, porém sem proteômica, de-
monstrando as diferenças tanto na seqüência nucleotídica quanto aminoacídica.
A variação do nível de mRNA polissomal do supragene WD009 está representado na Fi-
gura 4.22. Embora haja a tendência de um pequeno aumento, durante a metaciclogênese, os valo-
res são tão baixos (sempre abaixo de 30%) que se pode considerar que não há expressão diferenci-
al durante esse processo, o que é corroborado pela ausência de expressão diferencial na compara-
ção entre epimastigotas e metacíclicos, para as quatro réplicas amostrais. Na comparação entre
epimastigotas e amastigotas, há uma tendência forte para a diminuição, a qual, porém, é relativa-
mente pequena, variando entre 50 e 75%.
74
Figura 4.22 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD009 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.10 WD010- Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit
Essa proteína apresenta cinco domínios WD, dispersos por sua região codificadora. Seus
ortólogos em T. brucei e L. major apresentam 93% e 70% de positividade, respectivamente.
O fator 3 de início da tradução em mamíferos é um complexo multi-protéico composto
por 8 subunidades, tendo a maior subunidade um tamanho aproximado de 180 kDa, que participa
na ligação do tRNA-metionil iniciador e o mRNA à subunidade 40S para formar o complexo de
iniciação 40S (PESTOVA et al., 2001).
A variação do nível de mRNA polissomal do supragene WD010 está representado na Fi-
gura 4.23. É evidente uma diminuição em etapas, durante a metaciclogênese, alcançando cerca de
200% de diminuição em metacíclico. Por esse motivo, esse gene foi selecionado para a produção
de um clone contendo toda a sua região codificadora, dentro do projeto de validação biológica dos
resultados da análise genômica funcional da metaciclogênese de T. cruzi (PROBST et al., em prepa-
ração). No entanto, nas amostras avaliadas durante o ciclo de vida, o padrão é mais complexo,
tendendo à diminuição em metacíclico e amastigotas, no entanto com grande variabilidade entre as
amostras, especialmente entre amastigotas.
75
Figura 4.23 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD010 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.11 WD011- GTP-binding protein beta subunit-like protein
A anotação dessa proteína representa uma função muito genérica, sendo equivalente a
anotá-la como “WD containing protein”, a qual seria correta para todas as proteínas descritas nesse
trabalho. Outra informação que reforça a idéia de que sua anotação é muito genérica e, portanto,
pouco informativa, é o fato de que apresenta somente ortólogos com tripanossomatídeos (84% de
positividade com T. brucei e 68% com L. major).
Não havia sondas para esse supra-gene no microarranjo de T. cruzi, mas foram identifica-
dos peptídeos no trabalho de ATWOOD et al. (2005) na forma tripomastigota metacíclica, com
alta qualidade (Figura 4.24). Porém, esse tipo de perfil, com somente um peptídeo identificado, é
muito fraco para podermos considerá-la uma proteína aumentada ou específica em metacíclicos.
No entanto, esses resultados fortalecem a hipótese de que essa proteína seja expressa e, portanto,
deixe de ser anotada como hipotética, passando a proteína de função desconhecida.
Figura 4.24 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD011 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
76
4.12.12 WD012- Hypothetical protein
Essa proteína foi identificada somente em Trypanosoma cruzi, apresentando dois domínios
WD, com uma probabilidade de predição errada muito alta (p=0,2%). O fato de ser uma proteína
somente identificada em T. cruzi e de ter somente dois domínios WD preditos favorece a hipótese
de haver um problema de montagem do genoma, embora isso não seja comprovável pelos dados
disponíveis. Seria necessário o resseqüenciamento desse gene, preferivelmente a partir de seu
mRNA.
4.12.13 WD013- Hypothetical protein
Essa proteína também foi somente identificada em Trypanosoma cruzi, porém contém qua-
tro domínios WD com uma baixa probabilidade de predição errada (p=7x10
-4
). Esse supra-gene
apresentou uma sonda complementar no microarranjo de T. cruzi (Figura 4.25), apresentando uma
pequena diminuição durante o estresse nutricional (~35%), com um aumento posterior (~100%)
em epimastigotas aderidos em diferenciação por 12 horas, retornando o nível equivalente ao dos
epimastigotas na forma metacíclica. Seu perfil na comparação do ciclo de vida é mais complexo,
não apresentando uma expressão estágio específica, mas mostrando-se muito modulada. Isso pode
indicar que essa o nível de mRNA dessa proteína seja modulado por outros sinais diferentes dos
que caracterizam as formas tripomastigotas metacíclicas ou amastigotas.
Figura 4.25 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD013 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
77
4.12.14 WD014- Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco domínios WD, distribuídos em seus primeiros 300 aminoá-
cidos, contendo aproximadamente 900 aminoácidos da sua extremidade carbóxi-terminal sem a
predição de nenhum domínio. Essa região é extremamente rica em resíduos de ácido glutâmico
(~12,5%).
Os dois modelos gênicos desse supra-gene (4598.t00004 e 7118.t00019) apresentam dife-
renças em duas regiões de aproximadamente 100 e 65 aminoácidos que se encontram ausentes em
7118.t00019. Ao se comparar esses dois genes com seus ortólogos em T. brucei e L. major, é possí-
vel verificar que a região presente em 4598.t00004 também está presente nesses outros organis-
mos. A positividade entre os TriTryps na região contendo os domínios WD é de aproximadamen-
te 65%, caindo para 48% no restante da proteína, com diversas regiões de inserção e deleção.
É possível que esses dois modelos gênicos codifiquem duas proteínas distintas, e portanto,
representem dois supra-genes diferentes. Porém, excluindo-se essa regiões de inserção/deleção,
ambos genes apresentam uma similaridade nucleotídica muito grande e são a princípio, uma mes-
ma entidade biológica com relação à avaliação por microarranjo de DNA. Desta forma, eles ainda
foram incluídos em um único supra-gene, e a determinação da ocorrência dessa deleção em
7118.t00019 necessita de experimentação laboratorial.
Esse supra-gene apresenta similaridade baixa com proteínas de outros organismos, sempre
na região que não contém os domínios WD, a qual conforme visto acima é rica em resíduos de
ácido glutâmico, o qual é o maior responsável pela similaridade. Essa similaridade não parece sig-
nificar homologia.
4.12.15 WD015- Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco domínios WD, distribuídos em seus primeiros 300 aminoá-
cidos, contendo aproximadamente 1000 aminoácidos da sua extremidade carbóxi-terminal sem a
predição de nenhum outro domínio com alta probabilidade. No entanto, foram identificados qua-
tro pequenos segmentos de aminoácidos, nas posições 461-481, 767-787, 841-861 e 915-935, que
são fracamente similares com o módulo “M protein repeat” (PFAM PF02370), uma repetição
encontrada em múltiplas cópias nas proteínas bacterianas M dos estreptococos, nos quais se pos-
tula que seja um fator de virulência pela sua participação na resistência bacteriana à opsonização e
fagocitose.
Embora essa a proteína M não tenha sido encontrada em outros organismos e a probabili-
dade de predição errônea seja relativamente alta, esses módulos foram encontrados repetidos nes-
sa proteína de T. cruzi, o que é um dado interessante e diminui a probabilidade desse padrão ser
algo espúrio. Além disso, com exceção do primeiro motivo, eles apresentam uma mesma seqüên-
78
cia (AAKAKAEAERDDARQKLRGAE). Fazendo uma análise para encontrar seqüências repeti-
tivas nessa proteína, foi evidenciado que essa repetição na verdade se estende, de forma descontí-
nua, por aproximadamente 70 aminoácidos, sendo praticamente idêntica (somente dois aminoáci-
dos distintos na primeira repetição).
Esse gene não apresentou um ortólogo em L. major, sendo que o ortólogo em T. brucei
apresenta uma positividade de 66% na região contendo os módulos WD, enquanto que o restante
da proteína apresenta uma positividade de 50%. A seqüência repetitiva identificada em T. cruzi não
foi encontrada em T. brucei, nem foram identificados módulos “M protein repeat” na proteína
ortóloga desse organismo. No entanto, na região equivalente às três repetições de T. cruzi há tam-
bém uma seqüência repetitiva em T. brucei, a qual divergiu da identificada em T. cruzi. Essas repeti-
ções em T. brucei são mais divergentes entre si do que as de T. cruzi. Em comum, essas repetições
contêm uma quantidade muito grande de resíduos básicos (lisina e arginina) e acídicos (principal-
mente ácido glutâmico). Portanto, esses módulos potencialmente representam uma estrutura pro-
téica repetitiva ainda não bem caracterizada, que apresenta uma semelhança baixa com a encon-
trada na proteína M de estafilococos.
Essa proteína foi identificada na análise proteômica de ATWOOD et al. (2005) e os dados
referentes estão na Figura 4.26. Nela, é possível ver que embora tenham sido identificados dois
peptídeos em metacíclicos, esses apresentam uma confiabilidade menor. Os peptídeos encontra-
dos em tripomastigotas sangüíneos e amastigotas são mais confiáveis. De qualquer forma, o nú-
mero pequeno de peptídeos identificados não permite uma determinação confiável de expressão
diferencial, servindo para definir essa proteína como sendo de “função desconhecida”, ao invés de
hipotética.
Figura 4.26 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD015 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
4.12.16 WD016- Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta 4 módulos WD, entre os aminoácidos 311 e 638. Apresenta ortó-
logos definidos em T. brucei (80% de positividade) e L. major (62% de positividade). Apresenta uma
79
similaridade relativamente grande (43% de positividade, e-value de 1x10
-45
) com uma proteína hu-
mana, denominada WDR63 (WD repeat domain 63), também denominada NYD-SP29 (proteína
de desenvolvimento testicular). Essa similaridade se estende aos 230 aminoácidos anteriores e aos
100 aminoácidos posteriores à região contendo os módulos WD. Com base nesses resultados,
sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “TcWDR63, putativa”.
Embora ela possua essa anotação funcional em Homo sapiens, não foi possível encontrar na
literatura alguma referência a essa proteína.
Conforme pode ser visto na Figura 4.27. Essa proteína foi identificada na análise proteô-
mica de ATWOOD et al. (2005), mas, conforme o que ocorre com a maioria das proteínas anali-
sadas até o momento, a quantidade de peptídeos identificados é suficiente somente para mudar o
estado da proteína de hipotética para “de função desconhecida”, sem permitir uma inferência de
expressão diferencial confiável.
Figura 4.27 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD016 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16.
4.12.17 WD017- Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresentou cinco módulos WD, entre os aminoácidos 214 e 605. Apresenta
ortólogos definidos em T. brucei (80% de positividade) e L. major (72% de positividade). Apresenta
uma similaridade relativamente grande com uma proteína de Arabdopsis thaliana (43% de positivi-
dade, e-value de 2x10
-71
), anotada como “nucleotide binding”; no entanto, não foi encontrado ne-
nhum módulo de ligação a ácidos nucléicos nessa proteína quando fizemos uma busca no banco
de dados PFAM. Essa proteína de T. cruzi também apresenta similaridade alta com proteínas de
outros organismos, como Anopheles gambiae, Mus musculus, Homo sapiens, entre outros, geralmente
anotada como “WD repeat domain 36”. Essa proteína é também denominada TA-WDRP (T-cell
activation WD repeat protein) em Homo sapiens e UTP21 em S. cerevisiae.
Em todos esses organismos, essa proteína apresenta um módulo denominado UTP21
(PFAM PF04192), sendo que sua confiabilidade de predição é alta nas seqüências de H. sapiens, S.
cerevisiae e A. thaliana (e-values de 1x10
-40
, 3x10
-70
e 1x10
-157
, respectivamente); em tripanossomatí-
80
deos, a confiabilidade da predição desse módulo é menor (e-values de 5x10
-6
, 1x10
-7
e 1x10
-6
para T.
cruzi, T. brucei e L. major, respectivamente). Apesar dessa menor confiabilidade, todos os dados em
conjunto permitem classificar temporariamente o supra-gene WD017 como sendo uma
“TcUTP21, putative”: presença de domínios WD, similaridade alta com UTP21 de outros orga-
nismos e presença do módulo UTP21, mesmo com menor confiabilidade. A proteína utp21 faz
parte do snoRNP U3, estando potencialmente envolvida na maturação do rRNA 18S (TERNS &
TERNS, 2002).
4.12.18 WD018- Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta somente dois módulos WD identificados, entre os aminoácidos
231 e 310 (estão justapostos). Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram aproximadamente
82% de positividade; apresenta similaridade alta com proteínas de diversos outros organismos, as
quais são denominadas, muitas vezes, de “WD repeat domain 46” ou “Bing4”, cuja função em
humanos é desconhecida. Embora na anotação de módulos protéicos realizados pelo TSK não
apareça nenhum outro módulo além dos WD, em nossa re-análise com o banco de dados PFAM,
foi identificado um módulo BING4CT (NUC141) (PFAM PF08149) com um e-value de 2x10
-51
,
não sendo encontrando mais nenhum módulo WD, nem com baixa confiabilidade. Essas proteí-
nas são muito similares à utp7 de S. cerevisiae, a qual também está envolvida na maturação do rR-
NA 18S, sendo que todas elas apresentam o módulo BING4CT. Com base nesses resultados, su-
gerimos mudar a nomenclatura para “TcUTP7”.
Na Figura 4.28 está representado o padrão de expressão diferencial desse supra-gene. É
possível evidenciar que, durante a metaciclogênese, ele apresenta um perfil de oscilação sem alterar
de forma importante sua expressão, sendo que em metacíclicos há um aumento de cerca de 100%
em relação aos epimastigotas. Esse aumento é confirmado nos dados de ciclo de vida, no qual três
das quatro réplicas apresentam um aumento, entre 75% e 100%. Na comparação entre epimasti-
gotas e amastigotas é evidente a ausência de expressão diferencial.
81
Figura 4.28 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD018 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.19 WD019- Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, todos localizados justapostos na
extremidade amino-terminal, entre os aminoácidos 10 e 317, sendo que a região carbóxi-terminal
apresenta aproximadamente 550 aminoácidos sem módulos funcionais preditos. Os ortólogos em
T. brucei e L. major apresentaram aproximadamente 65% de positividade; apresenta similaridade
alta com proteínas de diversos outros organismos, denominadas de “phospholipase A2, activating
protein”. Em mamíferos, essa proteína é importante na regulação da resposta inflamatória através
da ativação da fosfolipase A2, a qual catalisa a liberação de ácido araquidônico. Embora esse tipo
de resposta não esteja presente em T. cruzi, foram identificados dois genes distintos anotados
como fosfolipase A2-like (8457.t00025/8481.t00006; 8457.t00035/8481.t00005) que estão repeti-
dos em tandem no genoma dos tripanossomatídeos, mas são suficientemente divergentes em se-
qüência nucleotídica para serem classificados em dois supra-genes. Desta forma, sugerimos a mu-
dança da anotação funcional desse gene para “phospholipase A2, activating protein like”.
Na Figura 4.29 está representada a expressão diferencial desse supra-gene na metaciclogê-
nese e no ciclo de vida, na qual é possível evidenciar a ausência de expressão diferencial, corrobo-
rada pelo padrão de expressão de duas sondas distintas.
82
Figura 4.29 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD018 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.20 WD020 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, os quais correspondem pratica-
mente a toda proteína. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram aproximadamente 65%
de positividade; essa proteína apresenta similaridade alta com proteínas de diversos outros orga-
nismos, denominadas em geral de “WD repeat domain 39”, também conhecida como “Ciao1”. Essa
proteína, em mamíferos, está associada à regulação transcricional do fator transcricional WT1; o
seu ortólogo em S. cerevisiae foi identificado como um gene essencial para a viabilidade (JOHNS-
TONE et al., 1998), estando envolvido na montagem de proteínas nucleares e citosólicas contendo
ferro e enxofre. Com base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene
para “Ciao1-like protein”.
83
4.12.21 WD021 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, entre os aminoácidos 192 e
454, sendo que os três primeiros estão justapostos. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresenta-
ram respectivamente 67% e 55% de positividade; apresenta similaridade alta com proteínas de
diversos outros organismos, as quais são denominadas geralmente de “U3 small nucleolar RNA-
interacting protein 2” ou Rrp9p em S. cerevisiae. Esta é outra proteína do complexo U3 snoRNP
(TERNS & TERNS, 2002). Com base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse
supra-gene para “TcRRP9”.
Na Figura 4.30 está representado o perfil de expressão de seu mRNA durante a metaciclo-
gênese e ciclo de vida. De maneira geral, ela apresenta uma diminuição de aproximadamente 75%
em estresse (relativamente, uma diminuição grande, pois a maioria dos eventos de expressão dife-
rencial em estresse são menos pronunciados), recuperando os seus níveis já após 3 horas de dife-
renciação. Na comparação entre epimastigotas, tripomastigotas metacíclicos e amastigotas, ela
apresenta um perfil bem consistente de ausência de expressão diferencial.
Figura 4.30 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD021 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.22 WD022 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, na sua região carbóxi-terminal,
entre os aminoácidos 165 e 469. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamen-
te 72% e 63% de positividade; apresenta similaridade alta com proteínas de diversos outros orga-
nismos, as quais são denominadas geralmente de “cell division cycle 40”, “EHB3” ou “PRP17”,
84
em S. cerevisiae. Essa proteína, nesses organismos, está envolvida na reação de splicing do mRNA e
também na progressão do ciclo celular e na síntese de DNA na mitose e meiose, em S. cerevisiae
(BOGER-NADJAR et al., 1998; BEN-YESHUDA et al., 2000). Com base nesses resultados, su-
gerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “TcCDC40, putative”.
Na Figura 4.31, é possível avaliar o perfil de expressão diferencial dessa proteína, a qual
apresenta um aumento consistente de cerca de 75% durante a fase de adesão durante a metaciclo-
gênese, culimando com um aumento próximo a 200% em metacíclicos. Esse aumento em metací-
clicos em relação a epimastigotas é corroborado pelas réplicas do ciclo de vida, enquanto que a
expressão entre epimastigota e amastigota é semelhante.
Figura 4.31 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD022 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.23 WD023 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, todos na sua região amino-
terminal, justapostos, entre os aminoácidos 33 e 375. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresen-
taram respectivamente 68% e 57% de positividade, apresentando similaridade alta com proteínas
de diversos outros organismos. Porém, a região de similaridade em todos os outros organismos,
incluindo os tripanossomatídeos, se restringe a porção contendo os módulos WD, sendo que o
restante da proteína, cerca de 400 aminoácidos, é muito divergente. Esse gene está anotado em
outros organismos como “WDR51A”, sem função conhecida; no entanto, pela sua similaridade se
restringir à região contendo os módulos WD, com aproximadamente 50% da proteína sendo mui-
to divergente, optamos por não classificar essa proteína como sendo um homólogo putativo de
WDR51. Com base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para
“TcWDR51A, putative”.
85
Na Figura 4.32 está representado o perfil de expressão diferencial, no qual é possível evi-
denciar uma diminuição entre 12 e 24 horas de diferenciação em parasitas aderidos (100% de di-
minuição), culminando com cerca de 200% de diminuição em tripomastigotas metacíclicos. Na
análise do ciclo de vida, o perfil de diminuição em metacíclicos é menos consistente, mas de ma-
neira geral é compatível com a diminuição, variando entre 50% e 200%. Na comparação entre
epimastigotas e a amastigotas, o perfil das diferentes réplicas é mais contraditório, sendo que duas
apresentam ausência de modulação, enquanto que as outras duas apresentam uma diminuição de
aproximadamente 100%. Portanto, é necessário avaliar com maior cuidado o perfil de diminuição
na comparação entre epimastigotas e amastigotas.
Figura 4.32 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD023 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.24 WD024 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, todos na sua região amino-
terminal, justapostos, entre os aminoácidos 33 e 375. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresen-
taram respectivamente 68% e 57% de positividade, apresentando similaridade alta com proteínas
de diversos outros organismos. Porém, a região de similaridade em todos os outros organismos,
incluindo os tripanossomatídeos, se restringe a porção contendo os módulos WD, sendo que o
restante da proteína, cerca de 400 aminoácidos, é muito divergente. Esse gene está anotado em
outros organismos como “WDR51B”, sem função conhecida; no entanto, pela sua similaridade se
restringir à região contendo os módulos WD, com aproximadamente 50% da proteína sendo mui-
to divergente, optamos por não classificar essa proteína como sendo um homólogo putativo de
WDR51. Com base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para
“TcWDR51B, putative”.
86
Conforme pode ser observado, os supra-genes WD023 e WD024 são muito semelhantes
entre si, apresentando resultados parecidos. A análise de expressão diferencial também é seme-
lhante e não foi repetida.
4.12.25 WD025 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados entre os aminoácidos 402 e 610.
Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 54% e 50% de positividade.
Não apresenta similaridade com mais nenhuma proteína presente no Genbank e não foram en-
contrados módulos minimamente conservados, presentes nos três ortólogos.
Na Figura 4.33, temos o perfil de expressão diferencial desse supra-gene durante a metaci-
clogênese, na qual ele apresenta uma redução drástica já no estresse, de aproximadamente 100%,
mantendo-se em níveis entre 120 e 150% de redução durante a diferenciação, culminando com
mais de 200% de diminuição em metacíclicos. Essa diminuição é corroborada pelas réplicas de
tripomastigotas metacíclicos do ciclo de vida, sendo que também está diminuído consistentemente
em amastigotas, em relação aos epimastigotas.
Figura 4.33 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD025 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.26 WD026 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, na sua região carbóxi-terminal,
entre os aminoácidos 491 e 754. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamen-
te 60% e 54% de positividade. Não apresenta similaridade com mais nenhuma proteína de outro
organismo depositada no Genbank, nem outros módulos protéicos identificados.
87
4.12.27 WD027 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados, na sua região carbóxi-terminal,
entre os aminoácidos 140 e 309. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamen-
te 90% e 73% de positividade; apresenta similaridade alta com proteínas de diversos outros orga-
nismos, as quais são denominadas geralmente de “WD repeat domain 68”, também denominado
“An11”. Com base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para
“TcWDR68, putative”.
Os genes An1, An2 e An11 controlam a pigmentação de petúnias pela estimulação da
transcrição de genes de antocianina. Conforme visto acima, esse gene é conservado (por exemplo,
em humanos, helmintos e leveduras), os quais não produzem antocianinas. A análise funcional
mostrou que a proteína humana An11 pode parcialmente complementar a proteína An11 mutante
de petúnia, sendo que a conclusão final é que esse gene está envolvido na transdução de sinais
(DE VETTEN et al., 1997).
4.12.28 WD028 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, na sua região carbóxi-terminal,
entre os aminoácidos 488 e 811. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamen-
te 67% e 40% de positividade; apresenta similaridade relativamente alta, na região contendo os
módulos WD, com proteínas de alguns organismos, como Canis familiaris, Homo sapiens, Mus muscu-
lus, Schistosoma japonicum e Aspergillus fumigatus, porém não foram encontrados ortólogos em outros
organismos modelos, como C. elegans e S. cerevisiae. O ortólogo nesses organismos está anotado
como “WD repeat domain 27”, a qual não apresenta informações na literatura. Com base nesses
resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “TcWDR27, putative”.
4.12.29 WD029 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, na sua região carbóxi-terminal,
entre os aminoácidos 121 e 357. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamen-
te 76% e 68% de positividade. Não foram encontradas outras proteínas similares no banco de
dados Genbank.
4.12.30 WD030 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados entre os aminoácidos 78 e 279. Os
ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 75% e 58% de positividade .Não
foram encontradas outras proteínas similares no banco de dados Genbank.
88
Na Figura 4.34 temos a avaliação da expressão diferencial desse supra-gene na metaciclo-
gênese, no qual apresenta uma diminuição de aproximadamente 90% em metacíclicos, corrobora-
da de forma parcial nas quatro réplicas do ciclo de vida. Não foi observada alteração entre amasti-
gota e epimastigota.
Figura 4.34 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD030 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.31 WD031 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta seis módulos WD identificados entre os aminoácidos 92 e 413,
sendo praticamente constituída desses módulos. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram
respectivamente 66% e 61% de positividade; apresenta similaridade relativamente média com pro-
teínas de diversos organismos, anotadas geralmente como “WD repeat domain 31”, cuja função é
desconhecida. Apresenta também uma similaridade mais baixa com uma proteína alfa-COP de S.
cerevisiae, porém sem apresentar módulos funcionais que a caracterizem como tal.
4.12.32 WD032 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta somente um módulo WD localizado entre os aminoácidos 416 e
453. Uma reanálise dos módulos PFAM identificados nessa proteína corroborou a existência de
somente um módulo WD; porém, foi identificado um módulo acessório denominado BOP1NT
(PFAM PF08145), o qual é o módulo N-terminal das proteínas WD40 BOP1-like. Os ortólogos
em T. brucei e L. major apresentaram aproximadamente 78% de positividade; apresentando alta
similaridade com proteínas de diversos organismos, anotadas como “BOP1” (block of proliferation) a
89
qual está localizada no nucléolo e atua no processamento dos rRNAs 28S e 5.8S (STREZOSKA et
al., 2000), sendo que mutantes desse gene levam ao bloqueio da progressão do ciclo celular. Com
base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “TcBOP1, putati-
ve”.
4.12.33 WD033 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta oito módulos WD identificados entre os aminoácidos 86 e 418,
todos justapostos, cobrindo praticamente toda a seqüência protéica. Os ortólogos em T. brucei e L.
major apresentaram respectivamente 91% e 82% de positividade; apresenta similaridade alta com
proteínas de diversos organismos, sendo que o ortólogo em humanos está anotado como “W-
DR69 protein”. Essa proteína também foi descrita em Chlamydomonas, denominada ODA16p, es-
tando envolvida no movimento flagelar (AHMED & MITCHELL, 2005). Interessantemente,
esses autores observaram que ortólogos dessa proteína foram identificados em mamíferos e inse-
tos, mas não em leveduras e nematódeos, implicando no fato de que essa proteína é somente ne-
cessária em organismos com cílios ou flagelos móveis, como é o caso do T. cruzi. Com base nesses
resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “TcODA16, putative”.
4.12.34 WD034 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, apresentando um peso molecu-
lar predito de 314 kDa. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram 51% de positividade,
não tendo sido encontrado outras proteínas similares dentre as depositadas no Genbank. Embora
tenha um tamanho tão grande, essa proteína não apresentou outros módulos funcionais.
4.12.35 WD035 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, distribuídos entre os aminoá-
cidos 70 e 732, apresentando um peso molecular de 156 kDa. Os ortólogos em T. brucei e L. major
apresentaram respectivamente 58% e 54% de positividade, não tendo sido encontrado outras pro-
teínas similares dentre as depositadas no Genbank. Embora tenha um tamanho tão grande, essa
proteína não apresentou outros módulos funcionais.
4.12.36 WD036 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, distribuídos entre os aminoáci-
dos 155 e 552. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 77% e 57% de
positividade, sendo similar a outras proteínas do Genbank, anotadas como “WD repeat domain
90
52”. Com base nesses resultados, sugerimos mudar a nomenclatura desse supra-gene para “W-
DR52-like, putative”.
4.12.37 WD037 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados, distribuídos entre os aminoácidos
42 e 204. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 66% e 39% de positi-
vidade, não apresentando similaridades com outras proteínas do Genbank. Uma observação im-
portante é sobre a alta taxa evolutiva dessa proteína, pois seu ortólogo em Leishmania apresenta-se
muito divergente. Esse gene foi selecionado para a produção de um clone recombinante contendo
toda a sua região codificadora, dentro do projeto de validação biológica dos resultados da análise
genômica funcional da metaciclogênese de T. cruzi (PROBST et al., em preparação)
Na Figura 4.35 está representado o perfil de expressão diferencial desse supra-gene na
metaciclogênese, na qual ele mostra um aumento de cerca de 75% em metacíclicos, o que é corro-
borado pelas réplicas do ciclo de vida. Na comparação entre amastigotas e epimastigotas, esse
gene se apresenta fortemente diminuído.
Figura 4.35 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD037 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.38 WD038 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados, justapostos, localizados na extre-
midade amino-terminal, entre os aminoácidos 144 e 306. Os ortólogos em T. brucei e L. major apre-
sentaram respectivamente 67% e 54% de positividade, não apresentando similaridades com outras
proteínas do Genbank. Não foram encontrados outros módulos funcionais nessa proteína.
9
1
4.12.39 WD039 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, localizados na extremidade
amino-terminal, entre os aminoácidos 148 e 575. Além disso, apresentou um módulo funcional
acessório, denominado PDZ (PFAM PF00595), o qual é encontrado em diversas proteínas ded
sinalização. No entanto, a confiabilidade da predição desse módulo é baixa (e-value de 7,5%). Os
ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 54% e 46% de positividade, não
apresentando similaridades com outras proteínas do Genbank.
Na Figura 4.36, está representado o padrão de expressão durante a metaciclogênese, no
qual não houve modulação. Na comparação entre epimastigota e amastigota há um aumento pe-
queno da expressão em amastigota, variando entre 50% e 100%. Na Figura 4.37 podemos ver os
peptídeos dessa proteína identificados em ATWOOD et al. (2005), no qual não é possível eviden-
ciar a expressão diferencial, sendo que não foram identificados peptídeos com alta qualidade dessa
proteína.
Figura 4.36 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD039 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
Figura 4.37 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD039 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
92
4.12.40 WD040 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, justapostos entre os aminoáci-
dos 211 e 375. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram 42% de positividade, não apre-
sentando similaridades com outras proteínas do Genbank. A anotação do TSK não registra a exis-
tência de ortólogos para esse supra-gene em L. major e T. brucei.
Na Figura 4.38 estão representados os padrões de expressão de três sondas que são com-
plementares a esse supra-gene. Elas apresentam padrões que são relativamente distintos com rela-
ção a sua forma, mas que podem ser resumidos a uma síntese final comum: diminuição da expres-
são em tripomastigotas metacíclicos e amastigotas quando comparados com epimastigotas.
As diferenças nos padrões das sondas podem ter muitas causas: hibridação cruzada com
genes modulados durante os processos estudados, qualidade da sonda, posição no mRNA, entre
outros. É interessante notar que esse gene apresenta alguns indícios de erro de montagem, como
por exemplo, um trato de poli-Isoleucina em seu início, uma diferença muito grande dos seus “or-
tólogos” em T. brucei e L. major, sendo possível que na verdade esse supra-gene seja representado
por dois ou mais genes distintos, os quais apresentariam expressão diferencial geral relativamente
semelhante, mas pontual diferente.
Essas possibilidades serão avaliadas através do uso de métodos mais precisos de quantifi-
cação, como por exemplo, PCR em tempo real.
4.12.41 WD041 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, em sua extremidade carboxi-
terminal, entre os aminoácidos 1049 e 1394, com um peso molecular relativamente grande (171
kDa). Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 59% e 47% de positivi-
dade, não apresentando similaridades com outras proteínas do Genbank.
4.12.42 WD042 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, distribuídos esparsamente,
entre os aminoácidos 283 e 1065, sendo uma proteína relativamente grande (162 kDa). Os ortólo-
gos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 59% e 46% de positividade, não apresen-
tando similaridades com outras proteínas do Genbank.
93
Figura 4.38 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD040 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.43 WD043 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, justapostos em sua extremida-
de amino-terminal, entre os aminoácidos 4 e 267, apresentando 550 aminoácidos no restante da
proteína sem módulos identificados. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respecti-
vamente 90% e 81% de positividade, apresentando similaridades com outras proteínas do Gen-
94
bank anotadas geralmente como “WD repeat domain 56” ou “intraflagellar transport 80 homolog
(Chlamydomonas)”. Essas proteínas mediam a montagem e manutenção dos cílios e flagelos euca-
rióticos, sendo que o complexo IFT (intraflagellar transport) é um sistema de transporte bidirecional
baseado em microtúbulos (PEDERSEN et al., 2006).
Na Figura 4.39 é possível ver a identificação de peptídeos pela análise proteômica de AT-
WOOD et al. (2005). Foi identificado um peptídeo em metacíclicos, quantidade insuficiente para a
análise de expressão diferencial, evidenciando, porém que essa proteína é expressa. Com base nos
resultados da análise de homologia, sugerimos a alteração da anotação funcional dessa proteína
para TcIFP80.
Figura 4.39 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD043 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
4.12.44 WD044 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados, em sua extremidade amino-
terminal, entre os aminoácidos 53 e 335, sendo uma proteína relativamente grande (177 kDa). Os
ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram respectivamente 70% e 61% de positividade, apre-
sentando similaridades com outras proteínas do Genbank anotadas geralmente como “intraflagel-
lar transport particle protein 140”. Essas proteínas mediam a montagem e manutenção dos cílios e
flagelos eucarióticos, sendo que o complexo IFT (intraflagellar transport) é um sistema de transporte
bidirecional baseado em microtúbulos (PEDERSEN et al., 2006). Com base nesses achados, suge-
rimos que a anotação funcional dessa proteína seja TcIFT140.
4.12.45 WD045 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, justapostos aproximadamente
no meio da seqüência, entre os aminoácidos 227 e 431. Os ortólogos em T. brucei e L. major apre-
95
sentaram 66% de positividade, apresentando similaridades com outras proteínas do Genbank, sem
anotação, de fungos ou ciano-bactérias.
4.12.46 WD046 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta seis módulos WD identificados, dispersos entre os aminoácidos
299 e 1241, sendo uma proteína relativamente grande (156 kDa). Foi encontrado somente o ortó-
logo em T. brucei, com 49% de positividade, o que pode explicar a ausência de similaridade com
Leishmania e outros organismos. Portanto, essa é uma proteína que evolui rapidamente.
4.12.47 WD047 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, justapostos entre os aminoáci-
dos 107 e 308. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram 53% e 40% de positividade, res-
pectivamente, apresentando similaridade baixa com outras proteínas do Genbank. Essa é outra
proteína com taxa de evolução rápida.
4.12.48 WD048 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta dez módulos WD identificados, sendo uma das proteínas com
maior número de motivos. Estes se encontram dispersos entre os aminoácidos 149 e 833. Entre
os aminoácidos 843 e 1068 está presente o módulo funcional Dip2/Utp12 (PFAM PF04003), o
qual está presente nas proteínas Utp12 ou Dip2, a qual faz parte do complexo ribonucleoprotéico
U3, da mesma forma que diversas outras proteínas já caracterizadas. Os ortólogos em T. brucei e L.
major apresentaram 53% e 40% de positividade, respectivamente, apresentando similaridade com
outras proteínas do Genbank, muitas vezes anotadas como “WD repeat protein 3”, a provável
ortóloga em mamíferos de Utp12. Com base nesses achados, sugerimos que a anotação funcional
dessa proteína seja TcUtp12.
Na Figura 4.40, é possível evidenciar o padrão de expressão diferencial desse supra-gene
durante a metaciclogênese, na qual ela apresenta um aumento de 200% em 12 horas de diferencia-
ção, retornando em metacíclicos a valores semelhantes aos de epimastigotas. Na análise das amos-
tras do ciclo de vida, é possível evidenciar a ausência de expressão diferencial entre as formas de
T. cruzi, com exceção de uma amostra de metacíclico, que apresentou uma diminuição de aproxi-
madamente 100%.
96
Figura 4.40 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD048 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.49 WD049 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, todos justapostos na extremida-
de amino-terminal, entre os aminoácidos 50 e 292, sendo uma proteína de tamanho relativamente
grande (140 kDa), sem apresentar outros módulos funcionais. Os ortólogos em T. brucei e L. major
apresentaram 80% e 72% de positividade, respectivamente, apresentando similaridade com outras
proteínas do Genbank, muitas vezes anotadas como “WD repeat protein 10” ou “intraflagellar
transport 122 homolog”. Essas proteínas mediam a montagem e manutenção dos cílios e flagelos
eucarióticos, sendo que o complexo IFT (intraflagellar transport) é um sistema de transporte bidire-
cional baseado em microtúbulos (PEDERSEN et al., 2006). Com base nesses achados, sugerimos
que a anotação funcional dessa proteína seja TcIFT122.
4.12.50 WD050 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta seis módulos WD identificados, justapostos na extremidade car-
bóxi-terminal, entre os aminoácidos 252 e 547. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram
65% e 55% de positividade, respectivamente, apresentando similaridade com diversas proteínas do
Genbank anotadas geralmente como “Apg16 – Autophagy protein 16”, a qual está envolvida, em
conjunto com Apg12 e Apg5, na membrana autofágica de isolamento (MIZUSHIMA et al., 2003).
Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modificada
para TcAtg16.
97
4.12.51 WD051 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, um na extremidade amino-
terminal, entre os aminoácidos 8 e 48, e os outros três justapostos na extremidade carbóxi-
terminal, entre os aminoácidos 251 e 416. Os ortólogos em T. brucei e L. major apresentaram 68% e
47% de positividade, não sendo encontradas outras proteínas similares dentre as disponíveis no
Genbank.
Na Figura 4.41 é possível verificar que essa proteína não apresenta expressão diferencial
nos processos biológicos estudados, apresentando uma diminuição de aproximadamente 75%
somente em uma das quatro réplicas de metacíclicos.
Figura 4.41 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD051 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.52 WD052 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta seis módulos WD identificados, todos muito próximos entre si,
entre os aminoácidos 169 e 472, sendo que a proteína apresenta 597 aminoácidos. Os ortólogos
em T. brucei e L. major apresentaram 59% e 54% de positividade, tendo similaridade alta com a
proteína Prp4p de Saccharomyces cerevisiae (38% de positividade em uma HSP de 477 aminoácidos
(97% do tamanho da proteína da levedura). Essa proteína é um fator de splicing de RNA, partici-
pando do snRNP U4/U6.U5 em leveduras (GOTTSCHALK et al., 1999). Com bases nesses a-
chados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modificada para TcPrp4.
Na Figura 4.42, é possível verificar a expressão diferencial desse gene para três sondas
distintas presentes no microarranjo de cDNA. Elas apresentam um perfil muito similar na metaci-
clogênese, com um pico de sobre-expressão em epimastigotas aderidos por 12 horas (aproxima-
damente 90% de aumento). O aspecto na análise por genômica funcional do ciclo de vida é mais
heterogêneo, embora o padrão entre amostras seja relativamente mantido para cada uma das três
98
sondas. As diferenças entre as três sondas podem ser relativas a eventos de hibridação cruzada
com outros genes diferencialmente expressos nesse experimento. No entanto, é evidente que a
comparação entre metacíclicos e amastigotas é diferente, sendo essa proteína mais expressa nos
primeiros do que nos últimos.
Figura 4.42 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD052 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
99
4.12.53 WD053 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, dispersos ao longo da molécula,
desde a posição 141 até a 802. Um dos módulos se estende por 74 aminoácidos e é possível que
na verdade represente dois módulos justapostos, o que aumentaria para seis o número de módulos
WD nessa proteína. Foi encontrado ortólogo somente com T. brucei, com 58% de positividade.
Na Figura 4.43 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Durante a metaciclogênese, esse gene não é modulado, diminuindo sua expressão em cer-
ca de 100% somente em metacíclicos. No entanto, essa diminuição em metacíclicos ocorre so-
mente nessa amostra (Meta 03) no ciclo de vida. No entanto, a diminuição em amastigota é bem
evidente, sendo que somente uma das réplicas (Ama 02) não a demonstrou.
Figura 4.43 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD053 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.54 WD054 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, presentes em sua extremidade
carbóxi, sendo que três desses domínios estão justapostos. Esse gene apresenta ortólogos somente
em T. brucei e L. major, com 74% e 67% de positividade, respectivamente. Essa proteína tem uma
similaridade com a WD026, com 46% de positividade.
4.12.55 WD055 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, dispostos em sua extremidade
carbóxi, justapostos em dois blocos, um de quatro e outro de três módulos. Esse gene apresenta
100
ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 81% e 59% de positividade, respectivamente. Essa
proteína apresenta positividade entre 40 e 50% com proteínas sem anotação funcional de diversos
organismos mais primitivos, como um protozoário do filo Ciliophora (Tetrahymena thermophila),
uma bactéria fototrópica (Chlorobium phaeobacteroides), uma cianobactéria (Gloeobacter violaceus), um
fungo filamentoso (Podospora anserina) e um equinodermo (Strongylocentrotus purpuratus). O primeiro
ortólogo putativo com anotação funcional foi o gene sel-10 (Suppressor / Enhancer of Lin-12 family
member), de C. elegans, com uma HSP se estendendo por 317 aminoácidos (71,1% da região codifi-
cadora da WD055) e com 27% de identidade e 44% de positividade. O gene lin-12 em Caenorhabdi-
tis elegans potencialmente codifica um receptor que medeia interações célula-célula, importantes
para certos destinos do desenvolvimento celular, atuando através da via de sinalização por Notch,
sendo que sel-10 seria um supressor do funcionamento desse gene (SUNDARAM et al., 1993).
Essa proteína pertence à classe das F-box, cuja função é sinalizar a degradação proteassômica me-
diada por ubiquitina (JAGER et al., 2004). A WD055 não apresenta o domínio F-box e o T. cruzi
não possui a via de sinalização por Notch (por exemplo, a análise realizada por nós procurando o
módulo protéico funcional Notch, representado na base de dados PFAM, não identificou nenhu-
ma proteína em T. cruzi que o contenha. Por esses motivos, preferimos não utilizar a anotação
funcional do gene de C. elegans como um indicativo potencial de qual seria a função de WD055.
4.12.56 WD056 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta nove módulos WD identificados, dispostos em dois blocos: um
entre os aminoácidos 225 e 347, contendo 3 módulos; e outro entre os aminoácidos 515 e 796,
contendo os seis módulos restantes. A proteína é relativamente grande, com um peso molecular
de 109,8 kDa. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 74% e 65% de positivi-
dade, respectivamente. Embora na anotação do consórcio do seqüenciamento de T. cruzi os úni-
cos módulos PFAM identificados são os WD40, foi identificado o módulo UTP13, com um e-value
de 3x10
-71
, quando essa mesma anotação com o PFAM foi realizada por nós. A proteína ortóloga
anotada mais semelhante à WD056 é a transducina beta-like 3 de mamíferos, com 46% de positi-
vidade, tendo 44% de positividade com a proteína Utp13p de S. cerevisiae. A proteína Utp13p faz
parte do snoRNP U3, estando potencialmente envolvida na maturação do rRNA 18S (TERNS &
TERNS, 2002). Com base nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja
TcUtp13.
Na Figura 4.44, é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Durante a metaciclogênese, esse gene aumenta sua expressão em cerca de 100% em epi-
mastigotas aderidos por 12 horas, apresentando uma diminuição até chegar a metacíclicos, sem no
entanto retornar aos valores basais, o que é corroborado pelos resultados do ciclo de vida. Há uma
101
tendência de que os níveis de expressão estejam aumentados em metacíclicos e em amastigotas,
em comparação com epimastigotas, mas os valores são relativamente baixos (em média, 40 a 50%)
Figura 4.44 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD056 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.57 WD057 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta somente dois módulos WD, justapostos entre os aminoácidos 452
e 539. O gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 59% e 50% de positivida-
de, respectivamente. Esses módulos WD apresentam um padrão de conservação fraco, sendo que
o e-value é em geral maior que um. Portanto, a identificação dessa proteína como contendo módu-
los WD ainda é uma afirmação potencialmente errônea.
4.12.58 WD058 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta somente quatro módulos WD, três justapostos entre os aminoáci-
dos 123 e 257 e outro mais próximo à extremidade carbóxi-terminal. O gene apresenta ortólogos
em T. brucei e L. major, com 80% de positividade em ambos. Interessantemente, esse gene apresen-
ta ortólogos claramente identificados em Bos taurus, Mus musculus, Homo sapiens, Canis familiaris, Xe-
nopus laevis, Tetraodon nigroviridis, Anopheles gambie, Drosophila sp.(isto é, eucariotos “superiores”) e em
Plasmodium sp., Dictyostelium discoideum e Giárdia lamblia (eucariotos “inferiores”), mas não em fungos
conhecidos, como S. cerevisiae, S. pombe e N. crassa. O possível ortólogo em humanos codifica para
uma proteína denominada Monad, que recentemente foi evidenciada como uma moduladora de
apoptose (SAEKI et al., 2006).
102
Na Figura 4.45, é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA a partir dos dados de duas sondas (CTG_2292 e MG_24H_11_F01). Durante a metaciclo-
gênese, os dados referentes a essas duas sondas divergem com relação à fase no qual a diminuição
já ocorre, mas o resultado final é o mesmo, o qual é corroborado pelos dados do ciclo de vida:
diminuída cerca de 100% em metacíclico quando comparado com epimastigota. Geralmente, essas
diferenças são ocasionadas pela localização diferencial das sondas no mRNA, sendo que sondas
mais distantes da extremidade 3´UTR do gene apresentam uma tendência a serem mais homogê-
neas, exceto em condições extremas de expressão diferencial, conforme pode ser visto na Figura
4.46.
Devido a seu padrão de expressão e a características moleculares intrínsecas da proteína,
esta foi selecionada para ter sua estrutura tri-dimensional caracterizada, dentro do projeto de Ge-
nômica Estrutural de T. cruzi, liderado pela equipe científica do IBMP.
Figura 4.45 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD058 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
103
Figura 4.46 Representação da localização das sondas que hibridam com o gene WD058.
Em amarelo, a representação da região codificadora do gene e em azul, a representação das duas sondas,
demonstrando que CTG_2292 está na extremidade 5´do gene, enquanto que MG_24H_11_F01 está no meio
da CDS.
4.12.59 WD059 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, todos justapostos em sua extre-
midade carbóxi-terminal, entre os aminoácidos 405 e 694 (a proteína tem 698 aminoácidos). Esse
gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 72% e 61% de positividade, respec-
tivamente. O ortólogo putativo em S. cerevisiae (47% de positividade) é denominado Rsa4p, tam-
bém envolvido em biogênese de ribossomo, estando seu produto geralmente localizado no nu-
cléolo (DE LA CRUZ et al., 2005). Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcio-
nal dessa proteína seja modificada para TcRsa4 putativa.
4.12.60 WD060 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, todos justapostos em sua extre-
midade carbóxi-terminal, entre os aminoácidos 108 e 448, constituindo, portanto, praticamente
toda a CDS dessa proteína. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com
78% e 75% de positividade, respectivamente. O ortólogo putativo em S. cerevisiae (42% de positi-
vidade) é denominado Ytm1p, também envolvido em biogênese de ribossomo, estando seu pro-
duto geralmente localizado no nucléolo e no núcleo (WADE et al., 2006). Com bases nesses acha-
dos, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modificada para TcYtm1 putativa.
Na Figura 4.47 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Ele apresenta sucintamente um padrão de diminuição durante a metaciclogênese, na fase
de estresse nutricional (aproximadamente 75% de diminuição), retornando os valores idênticos
aos de epimastigotas logo depois e não mostrando outras alterações.
104
Figura 4.47 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD060 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.61 WD061 - Hypothetical protein, conserved
A composição específica dessa proteína não está bem caracterizada, pois na versão atual
do genoma de T. cruzi ela se encontra com suas regiões codificadoras fragmentadas. Seria impor-
tante realizar seu sequenciamento a partir do mRNA, para identificar corretamente a região codifi-
cadora. De qualquer forma, essa proteína tem forte similaridade com a proteína neurobea-
chin/beige, e uma descrição mais detalhada dessa proteína pode ser encontrada em WD108.
4.12.62 WD062 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, justapostos em dois blocos, um
com dois módulos e o outro com os três módulos restantes, todos na sua extremidade carbóxi-
terminal. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 77% e 66% de posi-
tividade, respectivamente. O ortólogo putativo em mamíferos é denominado WDR34, isto é, pro-
teína WD número 34, não se conhecendo sua função.
4.12.63 WD063 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD identificados, relativamente dispersos em sua
extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 55% e
43% de positividade, respectivamente. O ortólogo putativo em mamíferos é denominado prp19,
uma proteína envolvida na montagem do spliceossomo (CHENG et al., 1993). Diferentemente da
análise de módulos por PFAM feito pelo consórcio do seqüenciamento de T. cruzi, na qual não
105
foram identificados outros módulos exceto WD40, em nossa análise foi possível identificar o mó-
dulo PRP19 (PF08606), com um e-value de 7x10
-38
. Com bases nesses achados, sugerimos que a
anotação funcional dessa proteína seja modificada para TcPrp19 putativa.
Na Figura 4.48 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. De forma geral, ele apresenta um aumento de expressão, bem consistente, de cerca de
130% quando comparamos metacíclicos com epimastigotas, amastigotas e fases intermediárias do
processo de metaciclogênese.
Figura 4.48 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD063 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.64 WD064 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta oito módulos WD identificados, justapostos, na porção intermedi-
ária de sua região codificadora. É uma proteína com um peso molecular grande, de 145,5 kDa.
Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 61% e 57% de positividade, respecti-
vamente. O ortólogo putativo em mamíferos é denominado WDR17, isto é, proteína WD número
17, não se conhecendo sua função, sabendo-se somente que é expressa na retina e testículos, em
humanos (STOHR et al., 2002).
4.12.65 WD065 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, dois relativamente dispersos no
meio de sua região codificadora, e três justapostos em sua extremidade carbóxi-terminal. Esse
gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 75% e 71% de positividade, respectivamente.
106
Os outros genes similares apresentam valores fracos para uma determinação de ortologia e, por-
tanto, não foram considerados.
4.12.66 WD066 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta somente dois módulos WD identificados, relativamente dispersos,
mais próximos de sua extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e
L. major, com 61% e 45% de positividade, respectivamente, sendo que as HSPs são progressiva-
mente menores: 344 aminoácidos em T. brucei (tamanho da proteína nesse organismo é de 349
aminoácidos) e 251 aminoácidos em L. major (tamanho da proteína é de 329 aminoácidos nesse
organismo). Não foram encontrados genes similares nos outros organismos.
4.12.67 WD067 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD identificados, relativamente próximos em sua
extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 70% e
55% de positividade, respectivamente. Apresenta uma similaridade menor com um gene de Dict-
yostelium discoideum (44% de positividade em uma HSP de 565 aminoácidos) e outro gene de Gloeo-
bacter violaceus (40% de positividade em uma HSP de 306 aminoácidos), sendo que em ambos orga-
nismos o gene é relativamente bem maior que as HSPs.
Na Figura 4.49 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDA. De forma geral, ele apresenta um aumento de expressão somente em estresse nutricional
(~75%), sendo que há um dado diametralmente oposto nas duas primeiras comparações entre
epimastigotas e metacíclicos no ciclo de vida, demonstrando que tal expressão diferencial deve ser
causada por fatores extrínsecos à diferenciação de metacíclicos.
Figura 4.49 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD067 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
107
4.12.68 WD068 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta nove módulos WD identificados, três justapostos e mais próxi-
mos à extremidade amino-terminal (entre os aminoácidos 54 a 182) e seis relativamente justapos-
tos e mais próximos à extremidade carbóxi-terminal (entre os aminoácidos 318 e 621). Esse gene
apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 88% e 81% de positividade, respectivamente. O
ortólogo putativo em S. cerevisiae (42% de positividade) é denominado Dip2p, também denomina-
da Utp5, que está também envolvido em biogênese de ribossomo, estando seu produto geralmen-
te localizado no nucléolo (WADE et al., 2006). Com bases nesses achados, sugerimos que a anota-
ção funcional dessa proteína seja modificada para TcDip2 putativa.
Na Figura 4.50, está representado o padrão de expressão durante a metaciclogênese, no
qual se observa um aumento em estresse de cerca de 50% e uma diminuição intensa, de cerca de
200% durante a diferenciação. As réplicas da comparação entre epimastigotas e metacíclicos no
ciclo de vida não mostram um perfil tão claro, mas ainda sim é indicativo de diminuição. A dimi-
nuição da expressão quando se compara epimastigotas e amastigotas é mais clara, variando entre
100% e 300% quando foi evidenciado modulação. Na Figura 4.51 podemos ver os peptídeos des-
sa proteína identificados em ATWOOD et al. (2005), no qual é possível identificar uma contagem
de peptídeos, com qualidade média ou alta, somente em tripomastigotas, sangüíneos ou metacícli-
cos. Esse resultado é o oposto ao resultado do microarranjo.
Figura 4.50 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD068 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
108
Figura 4.51 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD068 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
4.12.69 WD069 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta somente um módulo WD identificado, o que é estranho, embora
os ortólogos em T. brucei e L. major também possuam poucos domínios WD identificados. Esse
gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 65% e 52% de positividade, respec-
tivamente, em HSPs de tamanho praticamente cobrindo todo o gene. A proteína nos três tripa-
nossomatídeos é grande, pesando cerca de 140 kDa.
4.12.70 WD070 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, distribuídos na porção interme-
diária da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei, com 72% de positivdade
em uma HSP se estendendo por todo o gene, e em L. major, com duas HSPs, uma com 73% de
positividade e se estendendo por boa parte do gene, e outra com 91% de positividade, se esten-
dendo por 45 aminoácidos da extremidade carbóxi-terminal de ambos genes. A região que divide
essas duas HSPs se estende por 65 aminoácidos na proteína de Leishmania. A similaridade com os
outros organismos é baixa e, portanto, não foram selecionados como possíveis genes ortólogos.
4.12.71 WD071 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, justapostos e localizados em sua
extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 78% e
62% de positividade, respectivamente. O ortólogo putativo em S. cerevisiae (59% de positividade) é
denominado Prp46p, também denominada prp5 e prl1 (pleiotropic regulator 1), encontrado no spli-
109
ceossomo (OHI et al 2002). Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa
proteína seja modificada para TcPrp46 putativa.
Na Figura 4.52 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. De forma geral, ele apresenta um aumento de expressão durante o processo de diferencia-
ção, com um ápice em 12 horas, de aproximadamente 100%. Durante o ciclo de vida, os resulta-
dos não demonstram expressão diferencial consistente.
4.12.72 WD072 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD identificados, distribuídos em dois blocos:
um, mais próximo à extremidade amino-terminal, contém três módulos; o outro, mais próximo à
extremidade carbóxi-terminal, contém os dois módulos restantes. Esse gene apresenta ortólogos
em T. brucei e L. major, com 90% e 87% de positividade, respectivamente. Apresenta similaridade
com uma proteína humana denominada Strap (serine/threonine kinase receptor associated protein), de
cerca de 57% de positividade. Essa proteína estaria envolvida em vias de sinalização e um cofator
transcricional de p53 (COUTTS & LA THANGUE, 2006). ). Com bases nesses achados, sugeri-
mos que a anotação funcional dessa proteína seja modificada para TcStrap putativa.
Na Figura 4.53 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Ele apresenta uma diminuição da expressão durante o processo de diferenciação, cerca de
100% em 3 horas. Posteriormente, os níveis vão aumentando até que em metacíclicos há um au-
mento de 80% aproximadamente, com relação a epimastigota, e 180% com relação a epimastigo-
tas aderidos em diferenciação por 3 horas. Mais interessantemente, a comparação entre metacícli-
cos e amastigotas revela um padrão em espelho muito confiável.
110
Figura 4.52 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD071 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
Figura 4.53 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD072 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
111
Figura 4.54 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD072 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
Na Figura 4.54 podemos ver os peptídeos dessa proteína identificados em ATWOOD et
al. (2005), no qual é possível identificar uma diminuição do número de peptídeos entre epimasti-
gotas e metacíclicos, o qual, considerando a defasagem entre modificações em mRNA e em prote-
ínas, é compatível com os dados de microarranjo.
4.12.73 WD073 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD identificados, justapostos, localizados no meio
da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 93% e 87% de
positividade, respectivamente. Apresenta similaridade com diversas proteínas, anotadas geralmente
como Sof1. Na Figura 4.55 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo
de cDNA. Ele apresenta um padrão muito consistente de aumento durante a metaciclogênese,
com valores próximos a 200% entre 3 e 24 horas e próximos a 300% em metacíclicos, quando
comparados com epimastigotas.
No ciclo de vida, há um padrão confiável de aumento em metacíclico em relação a epi-
mastigotas, enquanto que o padrão na comparação entre epimastigotas e amastigotas é menos
claro, com duas réplicas mostrando um aumento de 300% e outras duas mostrando um aumento
de apenas 50%.
112
Figura 4.55 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD073 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.74 WD074 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é muito grande, com aproximadamente 260 kDa, e apresenta somente dois
módulos WD, em sua extremidade carbóxi-terminal, relativamente distantes (200 aminoácidos).
Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei, em uma única HSP, com 48% de positividade e 2519
aminoávidos; e em L. major, com três HSPs: uma, com 39% de positividade e 959 aminoácidos,
outra com 55% de positividade e 220 aminoácidos e a últma, com 60% de positividade e 141 ami-
noácidos, sendo que a distância média entre as três HSPs é de 200 aminoácidos. Apresenta simila-
ridade com proteínas de outros organismos denominadas Dmx-like, a qual não se conhece a fun-
ção. Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modifica-
da para TcDmx-like putativa.
4.12.75 WD075 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente pequena (17,4 kDa) e contém dois módulos WD identifica-
dos, mais próximos à extremidade amino-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L.
major, com 98% e 93% de positividade, respectivamente. Apresenta similaridade com uma proteína
de mamíferos denominada Bop1 (block of proliferation 1), de cerca de 60% de positividade. Essa
proteína estaria envolvida no processamento de rRNA e biogênese do ribossomo (STREZOSKA
et al., 2000). Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja
modificada para TcBop1 putativa.
Na Figura 4.56, é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Ele apresenta um padrão muito consistente de diminuição nas comparações com epimas-
113
tigotas, seja durante a metaciclogênese (~100%), metacíclicos (entre 80% e 200%) e amastigotas
(entre 60% e 100%).
Figura 4.56 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD075 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.76 WD076 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína contém três módulos WD identificados, dois próximos à extremidade ami-
no-terminal e um mais a no meio da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos em T.
brucei e L. major, com 64% e 48% de positividade, respectivamente. Apresenta similaridade com
uma proteína de S. pombe, denominada cwf17, de cerca de 45% de positividade e com uma HSP
representando 78% de ambos genes. Essa proteína estaria envolvida no splicing de RNA (OHI et
al., 2002). Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja mo-
dificada para TcCwf17 putativa.
4.12.77 WD077 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande, com 138 kDa, e contém quatro módulos WD identi-
ficados, muito próximos entre si, no meio da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos
em T. brucei e L. major, com 83% e 70% de positividade, respectivamente. Não apresenta similari-
dade com outros genes que permita uma identificação de ortologia e imputação funcional.
Na Figura 4.57, é possível verificar a expressão diferencial desse gene, que apresenta uma
diminução de aproximadamente 100% em epimastigotas aderidos por 12 horas, em comparação a
epimastigotas em fase exponencial de crescimento. Além disso, apresenta a tendência de estar
114
diminuído em amastigotas, em relação a epimastigotas e metacíclicos, especialmente se conside-
rarmos os resultados das réplicas Ama03 e Ama04, que são sabidamente mais confiáveis.
Figura 4.57 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD077 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.78 WD078 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD, justapostos, em sua extremidade carbóxi-
terminal, além de um módulo WWE (PF02825), na extremidade amino-terminal. Esse módulo
está potencialmente envolvido também em interações proteína-proteína em sistemas de conjuga-
ção de ubiquitina e ADP-ribose (ARAVIND, 2001). Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e
L. major, com 55% e 47% de positividade, respectivamente. Não apresenta similaridade com ou-
tros genes que permita uma identificação de ortologia e imputação funcional.
4.12.79 WD079 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD, dispersos, mais concentrados em sua extre-
midade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 75% e 62% e
similaridade (cerca de 40% de positividade) com genes de mamíferos anotados como CSTF1 (clea-
vage stimulation factor subunit 1), o qual está envolvido em clivagem e poliadenilação de mRNA (TA-
KAGAKI & MANLEY, 1992). Com bases nesses achados, sugerimos que a anotação funcional
dessa proteína seja modificada para TcCstf1 putativa.
115
4.12.80 WD080 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, próximos entre si, localizados na extremida-
de amino-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 79% e 61% de posi-
tividade. Na análise de similaridade com genes de outros organismos, apresenta resultados positi-
vos com aproximadamente 46% de positividade para proteínas anotadas com Sec13. Para uma
discussão mais aprofundada, veja a descrição dos genes WD114 e WD115.
Na Figura 4.58 é possível verificar a expressão diferencial desse gene, que apresenta um
aumento durante a metaciclogênese de aproximadamente 75%, o que é corroborado pelo experi-
mento de ciclo de vida, no qual um aumento de 80% da expressão, na comparação de metacíclicos
com epimastigotas, foi visto em três das réplicas experimentais.
4.12.81 WD081 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína contém somente dois módulos WD identificados, justapostos, mais próxi-
mos à extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com
67% e 57% de positividade, respectivamente. Os genes similares que apresentam anotação são
identificados como cdc20, uma proteína envolvida na transição da metáfase para a anáfase, possi-
velmente atuando pelo direcionamento de ubiquitinação de ciclinas mitóticas e outros inibidores
de anáfase (VISINTIN et al., 1997; SCHOTT & HOYT, 1998; ZACHARIE & NASMYTH,
1999). Com base nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modifi-
cada para TcCdc20 putativa.
Figura 4.58 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD080 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
116
4.12.82 WD082 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande, com 197 kDa, e contém quatro módulos WD identi-
ficados, muito próximos entre si, na extremidade amino-terminal, entre os aminoácidos 8 e 317.
Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 90% e 79% de positividade, respecti-
vamente. Apresenta uma similaridade com proteínas de outros organismos anotadas como intrafla-
gellar transport 172, com um índice de positividade por volta de 60% em uma HSP cobrindo todo o
gene. Esse gene está envolvido em determinação de simetria esquerda-direita e formação do pa-
drão dorso-ventral, estando presente no flagelo e no núcleo, fazendo parte da via de sinalização da
proteína Hedgehog (HUANGFU et al., 2003; GARCIA-GARCIA et al., 2005; HUANGFU &
ANDERSON, 2005). Com base nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa prote-
ína seja modificada para TcIft172 putativa.
Na Figura 4.59 podemos ver os peptídeos dessa proteína identificados em ATWOOD et
al. (2005), sendo que para essa proteína somente um peptídeo foi identificado, em metacíclicos.
Figura 4.59 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD082 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
4.12.83 WD083 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande, com 141 kDa, e contém somente dois módulos WD
identificados, muito próximos entre si, na extremidade amino-terminal. Esse gene apresenta ortó-
logos em T. brucei e L. major, com 76% e 69% de positividade, respectivamente. Apresenta simila-
ridade com proteínas de mamíferos anotadas como WD repeat domain 35, da qual não se conhece a
função.
4.12.84 WD084 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína contém sete módulos WD identificados, justapostos, na extremidade carbó-
xi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 69% e 67% de positividade,
117
respectivamente. Apresenta similaridade com proteínas de outros organismos, mas sem possibili-
dade de se poder inferir uma função putativa.
4.12.85 WD085 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, próximos entre si, localizados na extremida-
de carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 80% e 66% de
positividade. Na análise de similaridade com genes de outros organismos, apresenta resultados
positivos com cerca de 50-55% de positividade para proteínas anotadas como Pwp1 (periodic trypto-
phan protein 1), a qual está envolvida no processamento de rRNA (TERNS & TERNS, 2002). Com
base nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modificada para
TcPwp1 putativa.
Na Figura 4.60 é possível verificar que não há expressão diferencial confiável para esse
gene.
4.12.86 WD086 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD, relativamente dispersos, localizados no meio e
na extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major,
com 65% e 45% de positividade.
4.12.87 WD087 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande (119 kDa) e apresenta dois módulos WD, próximos
entre si, localizados no terço proximal da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos so-
mente em T. brucei e L. major, com 58% e 50% de positividade.
Figura 4.60 Avaliação da expressão diferencial supra-gene WD085 na metaciclogênese e
ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
118
4.12.88 WD088 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta oito módulos WD, dispersos por toda região codificadora. Esse
gene apresenta ortólogos em T. brucei, com 76% de positividade, sendo encontrado possíveis ortó-
logos em outros organismos como Physarum polycephalum, Dictyostelium discoideum, Gibberella zeae,
Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Xenopus laevis. Em mamíferos, os possíveis ortólogos, com apro-
ximadamente 50% de positividade, estão anotados como AIP1 (actin-interacting protein 1). Em S.
cerevisiae, é sabido que essa proteína interage com o fator de despolimerização de actina denomina-
do cofilina e é necessária para restringir a localização da cofilina nas áreas corticais da actina (RO-
DAL et al., 1999). Com base nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína
seja modificada para TcAip1 putativa.
4.12.89 WD089 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande (115 kDa), apresentando sete módulos WD, localiza-
dos no meio da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com
80% e 62% de positividade. Apresenta similaridade com proteínas de outros organismos, com um
índice de positividade ao redor de 50%, anotadas como WD repeat domain 66, cuja função é desco-
nhecida.
4.12.90 WD090 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD, justapostos, localizados mais próximos à ex-
tremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 81% e 71%
de positividade. Apresenta similaridade com proteínas de outros organismos, com um índice de
positividade ao redor de 45%, anotadas como Glutamate-rich WD-repeat protein 1, que é homólogo
ao gene regulator of ribosome biogenesis 1, o qual está envolvido no processamento de rRNA, sendo
que se liga à proteína ribossomal L11 e é requerido para o exporte nuclear da subunidade 60S
(TSUNO et al., 2000; MORITA et al., 2002). Com base nesses achados, sugerimos que a anotação
funcional dessa proteína seja modificada para TcGrwd1 putativa.
4.12.91 WD091 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande, com 108 kDa, apresentando somente dois módulos
WD, bem distantes entre si: um entre os aminoácidos 451 e 489, e o outro entre os aminoácidos
119
841 e 880. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 49% e 39% de po-
sitividade.
4.12.92 WD092 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é relativamente grande, com 150 kDa, apresentando somente quatro módu-
los WD, distantes entre si, na porção central da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos
somente em T. brucei e L. major, com 53% e 43% de positividade, sendo que em L. major a HSP
representa somente metade do gene.
4.12.93 WD093 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD, localizados na região amino-terminal. Esse
gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 67% e 57% de positividade, apresentando
possíveis ortólogos identificáveis somente em protistas, como Giardia lamblia, Tetrahymena thermo-
phila e Paramecium tetraurelia, com 46% de positividade e uma HSP que se estende por aproxima-
damente 80% do gene em T. cruzi.
4.12.94 WD094 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, localizados em dois blocos, um entre os
aminoácidos 108 e 189, e outro entre os aminoácidos 374 e 453. Esse gene apresenta ortólogo
somente em T. brucei, em duas HSPs com positividade média de 50% e com 200 aminoácidos en-
tre as HSPs. Não apresentou ortólogo em Leishmania..
4.12.95 WD095 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta cinco módulos WD, dispersos em sua região codificadora. Esse
gene apresenta ortólogo somente em T. brucei e L. major, com 77% e 60% de positividade, e com
um gene de Dictyostelium discoideum, com 41% de positividade.
120
Na Figura 4.61 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Com relação à metaciclogênese e à comparação entre epimastigotas e metacíclico, não há
diferenças significativas. Existe um aumento leve de expressão quando comparamos amastigocom
epimastigotas, de cerca de 50%.
Figura 4.61 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD095 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.96 WD096 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é grande, com um peso molecular de 234 kDa e apresenta nove módulos
WD, dispersos por sua região codificadora em três blocos de três módulos: entre os aminoácidos
252 e 431, 719 e 955 e 1330 e 1526. Esse gene apresenta ortólogo somente em T. brucei, com 48%
de positividade. Há uma proteína de L. major que também é identificada como similar, mas muito
mais distante: a HSP é de somente 261 aminoácidos (~10% das proteínas) e com 45% de positivi-
dade. Embora essa proteína seja o melhor resultado recíproco (reciprocal best hit), é muito diferente
da proteína de T. cruzi e, portanto, pode-se considerar esse gene como sendo Trypanosoma sp. espe-
cífico.
Embora na anotação do consórcio de seqüenciamento de T. cruzi haja somente módulos
WD pelo PFAM, em nossa análise local foi identificado um módulo EF hand (PF00036), o qual se
liga a cálcio e que está presente em proteínas que podem ser divididas em duas classes: as proteí-
nas de sinalização, as quais usualmente sofrem uma mudança conformacional cálcio-dependente
(por exemplo, calmodulina, troponina C, S100B); e proteínas de transporte e tamponamento, as
quais não sofrem mudanças de conformação (exemplo, calbindina D9k).
121
4.12.97 WD097 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta sete módulos WD, justapostos e localizados em sua extremidade
carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogo em T. brucei e L. major, com 78% e 61% de positi-
vidade. Apresenta similaridade com positividade de aproximadamente 50-55% com proteínas de
mamíferos denominadas Spag16 (sperm associated antigen 16), a qual é importante para a motilidade
do flagelo, sendo um componente do aparato central flagelar (ZHANG et al., 2002). Com base
nesses achados, sugerimos que a anotação funcional dessa proteína seja modificada para TcSpag16
putativa.
Na Figura 4.62 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Com relação à metaciclogênese, há um padrão de aumento leve em metacíclicos, quando
comparado com epimastigotas (~75%), mas cuja curva de ascendência é bem confiável. Esse pa-
drão de leve aumento de expressão é visto também na comparação entre metacíclicos e epimasti-
gotas, e entre amastigotas e epimastigotas.
Figura 4.62 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD097 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.98 WD098 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, distribuídos ao longo da região codificadora.
Esse gene apresenta ortólogo somente em T. brucei e L. major, com 55% e 46% de positividade e
em Coccidioides immitis, um fungo ascomicota, com positividade de 37% em uma HSP representan-
do aproximadamente 30% do gene (e-value de 2x10
-11
).
122
Na Figura 4.63 é possível verificar a expressão diferencial desse gene no microarranjo de
cDNA. Com relação à metaciclogênese, há um padrão de aumento principalmente em metacícli-
cos, o que é corroborado pelo experimento de ciclo de vida (entre 200% e 300%). Na comparação
entre epimastigotas e amastigotas, o aumento é menos confiável e quando ocorre, é em menor
grau (~90%).
Figura 4.63 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD098 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.99 WD099 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, três justapostos em um bloco e outro mais
afastado, mas todos no meio da região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e
L. major, com 62% e 51% de positividade. Apresenta similaridade com proteínas de mamíferos
denominadas WD repeat domain 18, para a qual não se conhece função.
4.12.100 WD100 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD, localizados na extremidade amino-terminal,
próximos entre si. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 55% e 60% de posi-
tividade. Não apresenta similaridade com outras proteínas.
Na Figura 4.64 é possível verificar que esse gene não apresenta uma expressão diferencial
importante e/ou confiável nos experimentos realizados.
123
Figura 4.64 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD100 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.101 WD101 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD, justapostos, localizados no meio da região co-
dificadora. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 66% e 48% de
positividade. Não apresenta similaridade com outras proteínas.
4.12.102 WD102 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta seis módulos WD, justapostos, localizados na região carbóxi-
terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 93% e 76% de positividade.
Apresenta similaridade com uma proteína de S. cerevisiae denominada pfs2p, com positividade de
48%. Essa proteína é uma subunidade integral do complexo de clivagem do pré-mRNA e fator de
poliadenilação (CPF), tendo um papel importante na formação da extremidade 3´ do mRNA atra-
vés da promoção da montagem do complexo de processamento, pela ligação a diferentes fatores
de processamento (NEDEA et al., 2003). Com base nesses achados, sugerimos que a anotação
funcional dessa proteína seja modificada para TcPfs2 putativa.
Na Figura 4.65 é possível verificar que esse gene apresenta um aumento de expressão du-
rante a metaciclogênese, culminando com 200% de aumento em 12 horas. No ciclo de vida, o
quadro é mais complexo, mostrando a variabilidade de sua expressão em T. cruzi.
124
Figura 4.65 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD102 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.103 WD103 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, dispersos em sua região codificadora. Esse
gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 76% e 67% de positividade. Não
apresenta similaridade com outras proteínas.
4.12.104 WD104 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína é grande, com um peso molecular de 151 kDa, apresentando seis módulos
WD, dispersos em sua região codificadora. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major,
com 75% e 57% de positividade. Apresenta similaridade com proteínas de outros organismos, mas
sem anotação funcional.
4.12.105 WD105 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta três módulos WD, dispersos em sua região codificadora. Esse
gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 66% e 40% de positividade. Não
apresenta similaridade com proteínas de outros organismos.
Na Figura 4.66, é possível verificar que esse gene apresenta um aumento pequeno de ex-
pressão durante a metaciclogênese, culminando com~75% de aumento em 3 horas, se mantendo
em 50% pelo resto do processo. No ciclo de vida, há uma tendência de aumento quando compa-
125
rando metacíclico e epimastigotas, mas é bem mais evidente o padrão de aumento na comparação
entre amastigotas e epimastigotas.
Figura 4.66 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD105 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.106 WD0106 - Hypothetical protein, conserved
Essa proteína apresenta seis módulos WD, dispersos por praticamente toda sua região
codificadora. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 75% e 65% de
positividade, e com proteínas de um número restrito de outros organismos, em um grau de positi-
vidade por volta de 40%: Nostoc punctiforme, Chaetomium globosum, Aspergillus fumigatus, Streptomyces
coelicolor e Anabaena variabilis.
4.12.107 WD107- katanin
Essa proteína apresenta cinco módulos WD, justapostos, localizados em sua extremidade
amino-terminal. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 67% e 55%
de positividade.
Microtúbulos são formados pelas tubulinas alfa e beta e formam diversas estruturas, como
o fuso mitótico. A Katanina é um heterodímero consistindo de uma unidade ATPase de 60 kDa
(p60 subunidade 1) e uma proteína acessória de 80 kDa (p80 subunidade B1). A subunidade p60
atua para juntar e desmontar microtúbulos, enquanto que a subunidade p80 direciona a enzima
para o centrossomo. A subunidade de 80kDa qual apresenta em sua região N-terminal domínios
WDs que interagem com microtúbulos (McNALLY et al., 2000).
126
Na Figura 4.67 é possível verificar que esse gene apresenta um aumento pequeno de ex-
pressão durante a metaciclogênese, culminando com aproximadamente 85% de aumento em 12
horas, se mantendo em 50% pelo resto do processo. No ciclo de vida, há um claro aumento em
amastigotas, de aproximadamente 150%, quando comparados com epimastigotas.
Figura 4.67 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD107 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.108 WD108- neurobeachin/beige-like protein
Essa proteína é extremamente grande, com cerca de 340 kDa, apresentando dois módulos
WD, próximos entre si, localizados em sua extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta
ortólogos em T. brucei com 56% de positividade, mas não em L. major.
O alvo de ação da proteína-quinase A para locais subcelulares específicos é mediada em
parte por proteínas ancoradas a proteínas kinase A, denominadas AKAPs, um grupo grande e
diverso de proteínas que incluem a neurobeachin. Essas proteínas grandes formam uma espécie de
”transdussomo” por agir como um scaffold multivalente o qual integra sinais derivados de múltiplas
vias. O transdussomo amplifica sinais oriundos do cAMP e outros elementos, por estabilizar e
127
reduzir a atividade basal de PKA exercendo também efeitos a longas distancias (FELICIELLO et
al., 2001).
O gene NBEA codifica para uma proteína citosolica a qual contém uma série de repetições
WD precedida precedidas por uma região de aproximadamente 280 aminoácidos que correspon-
dem ao domínio BEACH originalmente descrito por (NAGLE et al., 1996).
Neurobeachin é uma proteína multidomínio que interage com alta afinidade para subuni-
dade regulatória de proteína kinase A (PKA RII). A isoforma BGL (beige-like) é expressa em mui-
tos tecidos. Neuribeachin, BGL e outros 10 produtos gênicos de mamíferos compartilham um
módulo de seqüência comum C terminal, BEACH-WD40, o qual é presente também em proteínas
de invertebrados, plantas, protozoas e leveduras definindo uma nova família de proteínas. O pro-
tótipo desta família de proteínas com domínio BENCH é LYST, um regulador de tráfego lisos-
somal (NAGLE et al., 1996).
Na Figura 4.68 é possível verificar que esse gene apresenta um padrão de expressão dife-
rencial não-conclusivo, portanto considerado não diferencialmente expresso.
Figura 4.68 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD108 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.109 WD109- notchless homolog
Essa proteína apresenta oito módulos WD, justapostos, localizados em sua extremidade
carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 87% e 84%
de positividade.
Notchless foi identificado inicialmente como envolvido na regulação da via de sinalização
Notch em Drosophila (ROYET et al., 1998); no entanto, seu ortólogo em leveduras, Rsa4p, foi de-
monstrado como envolvido na biogênese da subunidade 60S (BASSLER et al., 2001). Além disso,
128
em plantas foi evidenciado que o homólogo em Solanum chacoense, ScNLE, estava envolvido no
desenvolvimento da semente e sua sub-expressão causava mudanças pleiotrópicas na planta, como
redução no tamanho do órgão aéreo, redução no número de órgãos, florescimento retardado, e
um aumento no índice estomatal (CHANTHA & MATTON, 2006).
4.12.110 WD110 – periodic tryptophan protein 2, putative
Essa proteína apresenta nove módulos WD, em dois blocos: um com quatro repetições
entre os aminoácidos 45 e 225, na extremidade amino-terminal; o outro entre os aminoácidos 393
e 670, com os cinco módulos restantes. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L.
major, com 88% e 81% de positividade.
Essa proteína em S. cerevisiae é um componente da subunidade pré-ribossomal 90S essenci-
al para a clivagem do precursor 35S nos sítios A0, A1 e A2 (DOSIL & BUSTELO, 2004).
Na Figura 4.69 é possível verificar que esse gene apresenta um aumento de expressão du-
rante a metaciclogênese, culminando com aproximadamente 100% de aumento em 12 horas. No
ciclo de vida, há um claro padrão de ausência de expressão diferencial.
Figura 4.69 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD110 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.111 WD111- peroxisomal targeting signal type 2 receptor
Essa proteína apresenta cinco módulos WD, justapostos, mais próximos à extremidade
carbóxi-terminal. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 85% e 78%
de positividade. Esse gene também é denominado Pex7 (peroxisomal biogenesis factor 7).
129
Pex7p foi inicialmente descrita em S. cerevisae e é também encontrada em fungos, plantas e
mamíferos, interagindo com PST2, uma seqüência sinal presente em proteínas marcadas para irem
ao peroxisomo. Análises de duplo híbrido revelaram a interação de Pex7p com receptor PST2 in
vitro (GHYS et al., 2000).
Na Figura 4.70 é possível verificar que esse gene não apresenta um padrão consistente de
expressão diferencial.
Figura 4.70 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD111 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
4.12.112 WD112- poly(A) export protein
Essa proteína apresenta quatro módulos WD, três justapostos em um bloco na extremida-
de amino-terminal, e outro mais próximo à extremidade carbóxi-terminal. Esse gene apresenta
ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 82% e 71% de positividade. Esse gene em S. cerevi-
siae é denominado Gle2p.
Essa proteína está envolvida no mecanismo de exportação do núcleo dos mRNAs transcri-
tos (FABRE & HURT, 1997), estando localizada no poro nuclear.
4.12.113 WD113 - protein kinase, putative
Essa proteína é relativamente grande, com 148,6 kDa, com dois domínios esparsos locali-
zados na extremidade carbóxi-terminal, sendo que o domínio de proteína-quinase está na extremi-
dade amino-terminal. Esse gene apresenta ortólogos somente em T. brucei e L. major, com 60% e
51% de positividade. Apresenta similaridade com outras proteína-quinases, mas provavelmente
são similaridades somente com o módulo quinase, não representado evidência de ortologia.
130
4.12.114 WD114 protein transport protein sec13
Essa proteína é apresenta seis módulos WD, dispersos por toda região codificadora. Esse
gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 79% e 61% de positividade, respectivamente.
Apresenta similaridade com outras proteínas de outros organismos.
O transporte bidirecional de macromoléculas entre citoplasma e núcleo ocorre através de
complexo de poro nuclear (NPCs) acoplado ao envelope nuclear. NPC são compostos de sub-
complexos e SEC13L1 é parte do subcomplexo Nup 107-160, composto por seis diferentes nu-
cleoporinas. (LOIODICE et al., 2004). A proteína SEC13L1, em humanos, mostra alta similarida-
de com a proteína SEC13 de levedura, a qual é requerida para biogênese vesicular do retículo en-
doplasmático durante o transporte de proteínas. (SWAROOP et al., 1994).
O subcomplexo SEC13 e SEC31 integram o complexo COPII de exportação de proteínas
do retículo endoplasmático desempenhando um papel estrutural (KIRCHHAUSEN, 2000;
STAGG et al., 2006). No genoma de T. cruzi foram anotados dois genes para SEC13 putativas.
Estes dois genes são unidades distintas, não apresentando similaridade na comparação nucleotídi-
ca e apresentado similaridade protéica baixa (27% de identidade, 39% de positividade e um e-value
de 2x10
-10
).
131
Figura 4.71 Alinhamento entre sequências SEC13 (WD114 e WD115) anotadas no genoma
de
T. cruzi
.
Seqüência consenso e posições conservadas são mostradas.
Na Figura 4.72 podemos ver os peptídeos dessa proteína identificados em ATWOOD et
al. (2005), sendo que para essa proteína foi identificada praticamente em todas as fases do ciclo.
Figura 4.72 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD114 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
132
4.12.115 WD115 protein transport protein sec13
Essa proteína é apresenta seis módulos WD, dispersos por toda região codificadora. Esse
gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 73% e 60% de positividade, respectivamente.
Apresenta similaridade com outras proteínas de outros organismos. A descrição de sua função
encontra-se no tópico anterior.
4.12.116 WD116 – Protein transport protein sec31, putative
Essa proteína é apresenta quatro módulos WD, presentes na sua extremidade amino-
terminal. Esse gene apresenta ortólogos em T. brucei e L. major, com 79% e 66% de positividade,
respectivamente. Apresenta similaridade com outras proteínas de outros organismos.
A descrição de sua função encontra-se no tópico da proteína WD114.
Na Figura 4.73, é possível verificar que esse gene não apresenta um padrão consistente de
expressão diferencial.
Figura 4.73 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD116 na metaciclogênese
e ciclo de vida.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.14
133
Figura 4.74 Avaliação da expressão diferencial do supra-gene WD116 no ciclo de vida por
proteômica.
Descrição dos gráficos, vide Figura 4.16
4.12.117 WD117 – telomerase component (pseudogene), putative
Esse gene está anotado como pseudo-gene, possuindo uma região codificadora de 8618
nucleotídeos, sem códon de parada identificado. Esse gene apresenta possivelmente problemas de
montagem e fica difícil fazer sua descrição. Em T. brucei, foi identificado um possível ortólogo,
com região codificadora intacta, que codifica para uma proteína de 308 kDa, com sete módulos
WD e um módulo TROVE (PF05731) que interage com o RNA. Essa proteína em outros orga-
nismos é denominada TEP1 (telomerase-associated protein 1) e é responsável pela atividade de telome-
rase, pela adição de novos telômeros nas extremidades dos cromossomos (CHANG et al., 2002).
134
5 Discussão
O presente trabalho teve como objetivo aprofundar a anotação funcional das proteínas de
T. cruzi contendo módulos WD. Além disso, obter dados de expressão gênica diferencial através
do uso de técnicas modernas, como microarranjos de DNA e proteômica. Todos esses dados, em
conjunto, permite que sejam selecionados dentre os genes dessa família, aqueles que apresentam
um maior potencial de elucidar aspectos chaves dos fenômenos biológicos estudados.
Para tanto, uma análise descritiva geral, feita gene a gene, foi realizada, visando principal-
mente a identificação de elementos moleculares de interesse, relações de similaridade com outros
organismos, atribuição de função por homologia e identificação de genes diferencialmente expres-
sos em processos biológicos de T. cruzi.
Um dos primeiros resultados alcançado foi uma determinação mais precisa do número de
genes contendo módulos WD, já que o genoma seqüenciado de T. cruzi se apresenta fragmentado
e com erros de anotação, ocorrendo principalmente redundância de elementos codificantes. Dessa
forma, de um total inicial de 211 modelos gênicos, reduzimos esse número para 117 genes distin-
tos, denominados supra-genes, por incorporam os “genes” atualmente predito pelo consórcio de
seqüenciamento de T. cruzi e que são, em sua maioria, alelos entre si.
Após a determinação do número total de genes de T. cruzi contendo módulos WD, proce-
deu-se à identificação das características gerais dos mesmos. A princípio, um total de 95 genes
(81,2%) estava anotado como proteínas hipotéticas. Esse é um número relativamente alto, pois em
média, 50% dos genes de T. cruzi apresentam essa anotação, o que por si só é um número alto, e a
quantidade de proteínas hipotéticas contendo módulos WD era muito superior a esse número já
grande. No entanto, com a realização de uma análise de similaridade por BLASTp, foi possível
anotar 37 proteínas hipotéticas (38,9% dos 95 genes sem anotação funcional), e o número de pro-
teínas hipotéticas caiu para 49,5%, mais próximo ao número geral do genoma de T. cruzi.
É interessante notar, conforme pode ser visto no material anexado contendo o resultado
dos BLASTp, que o grau de similaridade encontrado é alto o suficiente para que essa atribuição
funcional já tivesse sido feita pelo consórcio de seqüenciamento de T. cruzi, pois é semelhante
àquele que foi utilizado para nomear os 22 genes restantes. Portanto, a utilização do termo “hypo-
thetical protein, conserved” para esses genes parece ser uma falha no processo de anotação de
alguns desses genes.
Dessa forma, foi possível sugerir funções conhecidas para os genes de T. cruzi contendo
módulos WD, conforme pode ser visto na Figura 5.1.
135
Figura 5.1 Representação das funções principais atribuidas aos genes WD de T. cruzi.
A Anotação mais comum aos supra-genes WD é a biogênese do ribossomo. Isso não é de
todo inesperado, por dois motivos. Em primeiro lugar, conforme visto na Introdução, é conheci-
do que diversos genes relacionados ao U3 processomo e à biogênese dos ribossomos contém mó-
dulos WD. Em segundo lugar, esse componente biológico é altamente conservado em organismos
eucarióticos, tendo até sido denominado regulon, pela sua correlação funcional de regulação da
expressão gênica. Portanto, esses genes teriam um grau de conservação de seqüência grande, por
pressão seletiva funcional e maior probabilidade de terem seus ortólogos identificados quando
comparados com T. cruzi, que é um eucarioto filogeneticamente distante dos modelos mais estu-
dados.
Os outros processos mais comuns, constituição flagelar, processamento do mRNA e
transporte, também são esperados pois se sabe que contêm diversas proteínas com módulos WD.
Uma menção especial deve ser feita com relação aos processos associados ao flagelo, pois essa é
uma estrutura especial de T. cruzi que não está presente em algums outros eucariotos.
Mesmo com a melhoria da anotação funcional de T. cruzi, ainda cerca de metade das prote-
ínas de T. cruzi contendo módulos WD não têm função putativa atribuível. Além disso, mesmo os
genes que tem indicação funcional, essa ainda é baseada em similaridade com proteínas de orga-
nismos distantes evolutivamente, o que reforça a necessidade de que seja feita a caracterização
biológica dessas proteínas em T. cruzi.
Nesse sentido, agregamos os dados de genômica funcional, visando elencar, dentre os 117
genes WD de T. cruzi, aqueles que já demonstram expressão gênica diferencial e, portanto, teriam
136
uma maior probabilidade de estarem sendo modulados por desempenharem funções importantes
para a determinação dos fenômenos biológicos estudados. Para tanto, foram utilizados dados pro-
duzidos no IBMP, contendo experimentos de microarranjo de cDNA da metaciclogênese de T.
cruzi (PROBST, 2005) e ciclo de vida (PROBST & KRIEGER, em preparação; PAVONI, 2005).
Além disso, agregamos os resultados de proteômica em larga escala das formas principais de T.
cruzi (ATWOOD et al., 2005), visando obter informações sobre outro nível de avaliação de expres-
são diferencial.
Os dados de microarranjo de cDNA versão 4.0 acima citados, para os genes WD avaliados
e de interesse a este trabalho, apresentam genes modulados durante a metaciclogênese e o ciclo de
vida in vitro, para os quais amostras de mRNA fração total e mRNA fração polissomal, em um
número significante de hibridações comparativas (n=94) e que permitiram, a partir daquele micro-
arranjo, com uma cobertura gênica de aproximadamente 6000 sondas, produzir padrões de ex-
pressão apresentados neste trabalho.
Para os 117 genes WD identificados após alinhamentos e re-análise das seqüências produ-
zidas pelo TSK, um total de 44 genes (37,60%) apresentam-se modulados entre as comparações
realizadas durante os processos biológicos estudados. Os padrões de expressão diferencial mos-
trados graficamente no item 4.12 são heterogêneos e produzem informações relevantes com as
quais será possível selecionar genes WD para caracterização molecular futuras.
Os dados de proteômica em larga escala produzidos por ATWOOD et al., 2005, são váli-
dos para 9 supra-genes, WD001, WD008, WD011, WD015, WD016, WD068, WD072, WD083,
WD114, sendo os peptídeos identificados para estes genes WD apenas indícios de expressão dife-
rencial, passíveis de validação experimental, uma vez que, com exceção a proteína
WD001(RACK1) envolvida com controle do ciclo celular, para a qual um número superior a 3
peptídeos foram conservados nas quatro formas evolutivas de T. cruzi e confirmados na etapa de
refinamento da anotação, as demais proteínas WD apresentaram em média, um número igual ou
inferior a 3 peptídeos identificados. Receptor para proteína kinase C (RACKs) foi identificado
previamente em análises proteômicas em T. cruzi (PABA et al., 2004) por metodologia de marcação
peptídica ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) seguida por cromatografia líquida e espectrometria de
massa (LC-MS/MS), sugerindo pela primeira vez a presença de um elemento de transdução de
sinal no parasita.
Análise do proteoma em larga escala é inerentemente incompleta uma vez que as metodologi-
as válidas não apresentam escala dinâmica suficiente para identificar e quantificar todas as poteínas
expressas em um organismo (ATWOOD et al., 2005). Neste cenário, proteínas expressas em níveis
maiores em determinado momento celular tornam a identificação facilitada, em detrimento das
proteínas pouco expressas, como por exemplo, pode ser o caso da grande maioria das proteínas
WD.
137
Outos estudos de proteômica comparativa em T. cruzi identificam proteínas conservadas nos
diferentes estágios de desenvolvimento. Os resultados sugerem que as características de cada for-
ma de vida de T. cruzi são conseqüências da expressão diferencial de um número limitado de pro-
teínas (PABA et al., 2004).
A aplicação destas metodologias em tripanossomas é particularmente importante devido ao fa-
to que, estes organismos não utilizam o início da transcrição como etapa de regulação para contro-
lar a expressão gênica. Todos os genes que codificam proteínas em tripanossomatídeos são orga-
nizados em grandes unidades policistrônicas as quais geram RNAs precursores e que são proces-
sados para originar RNA mensageiros monocistrônicos, por mecanismos de trans splicing. Regula-
ção gênica ocorre por controlar estabilidade e ou a tradução dos mRNA específicos (VANHAM-
ME AND PAYS,1995).
Com o intuito de aprofundar a caracterização do transcriptoma dos genes WD em T. cruzi, de-
senvolvemos um microarranjo de oligonucleotídeos, o qual permite uma melhor avaliação da ex-
pressão diferencial, por diversos motivos:
• Pelo fato de ser sintetizado comercialmente, a qualidade das sondas é mais uniforme e a
concentração final das mesmas no microarranjo pode ser mais precisa e controlada;
• É possível desenhar sondas com maior precisão, evitando a ocorrência de hibridação cru-
zada, mais comum em microarranjos contendo sondas de produtos de PCR;
• A menor manipulação das sondas, por já virem prontas, diminui a probabilidade de erros
de endereçamento.
Embora o microarranjo de oligonucleotídeos tenha todas essas vantagens, o resultado que ob-
tivemos com a presente versão foi relativamente pior do que a obtida com o microarranjo anteri-
or, de produtos de PCR, conforme pode ser visto na Figura 5.3 e 5.4.
De maneira geral, o resultado do microarranjo de oligonucleotídeo está mais fraco, com
uma maior intensidade da fluorescência basal da lâmina (background), o que leva a uma diminuição
da relação entre sinal e ruído. Esse maior sinal do background pode ser evidenciado pela observação
de que no microarranjo de produto de PCR a coloração da lâmina é preta (ausência de sinal ou
baixíssima intensidade), com um sinal médio de 172 (painel à direita da Figura 5.3) enquanto que
no microarranjo de oligonucleotídeos a coloração da lâmina é azulada, em uma intensidade relati-
vamente forte, com um sinal médio de 984 (painel à direita da Figura 5.4 isto é, cerca de seis vezes
mais forte do que o background do microarranjo de produto de PCR. Com relação ao sinal mais
fraco das sondas, isso é evidenciado pela ocorrência de diversos spots com colorações esverdeadas,
amareladas e avermelhadas no microarranjo de produto de PCR, enquanto que a ocorrência dos
mesmos no microarranjo de oligonucleotídeos é muito baixa.
138
De qualquer forma, foi possível utilizar os dados do microarranjo de oligonucleotídeo,
através da análise criteriosa dos resultados, principalmente se levarmos em conta que o microar-
ranjo de produto de PCR não cobre todos os genes WD de T. cruzi.
A tabela 5.2 sumariza os dados obtidos com o microarranjo de oligonucleotídeo v 1.0, para
todas as 137 sondas. Os melhores valores de intensidade expressos pelos genes WD, ou seja, a-
queles que apresentaram em escala logarítimica na base 2, valores acima de 9.32 (Média + 2SD),
foram a princípio considerados como sendo mais confiáveis para este trabalho.
Tabela 5.2 Valores de intensidade relativa das sondas no microarranjo de oligonucleotí-
deos v.1.0
Segundo critérios subjetivos de FC 75% e critério estatístico de FDR 5%, genes diferenci-
almente expressos foram aqueles com valores de intensidade acima do threshold (9.32) em ambas as
replicatas biológicas. Identificou-se 41 genes (29,92%) WD modulados durante a metaciclogênese
e ciclo de vida. Deste total, 17 genes WD também apresentaram expressão diferencial quando
avaliados pelo microarranjo de cDNA (WD009, WD022, WD040, WD048, WD053, WD058,
WD063, WD068, WD072, WD085, WD097, WD102, WD105, WD107, WD108, WD110,
WD111). Além desta correlação também foi possível sugerir uma reanotação funcional para os
genes WD022 (TcCDC40), WD048 (TcUTP12), WD063 (TcPrp19), WD068 (TcDip2/UTP5),
WD072 (TcStrap1), WD085 (TcPwp1), WD097 (TcSpag16), WD102 (TcPsf2). Contudo não se
objetivou uma comparação criteriosa e detalhada dos padrões de expressão correlatos pelos dois
microarranjos, considerando as particularidades e variações inerentes a cada metodologia.
Dados de expressão diferencial inéditos para genes WD puderam ser obtidos com o mi-
croarranjo de oligonucleotídeos. Os genes WD004, WD016, WD044, WD054, WD062, WD069,
WD82, WD091, WD104, WD114 estão modulados segundo item 4.4. Os genes WD004, WD044,
WD062, WD069, WD104 apresentam-se diferencialmente expressos em apenas uma hibridação
comparativa realizada, estando os demais genes WD modulados em duas ou mais hibridações
139
comparativas. A priore estes foi os melhores resultados obtidos de expressão diferencial para estes
genes, sendo todas as proteínas anotadas como hipotéticas.
Devido à maior qualidade teórica do microarranjo de oligonucleotídeo, iremos ajustar as
condições de hibridação para tentar, no futuro, melhorar a relação sinal/ruído do mesmo.
Figura 5.3 Padrão do microarranjo de produto de PCR (TcBc4.2) utilizado no IBMP
140
A partir de todos esses resultados de expressão gênica e anotação funcional, é possível
identificar os melhores candidatos dentre os supra-genes WD para a realização de caracterização
molecular. Para tanto, estamos desenvolvendo e implementando no IBMP diversos vetores de
genética reversa, dentro da plataforma Gateway®, para podermos obter dados como: localização
celular, co-localização, identificação de complexos protéicos (extremamente importante e perti-
nente para as proteínas WD), superexpressão induzida e produção de anticorpos.
Figura 5.4 Padrão do microarranjo de oligonucleotídeos (v1.0) utilizado para este trabalho
Nesse sentido, estamos atualmente clonando os genes WD em vetores de entrada da plata-
forma Gateway®, sendo que temos atualmente cinco proteínas clonadas (WD001 activated protein
kinase C receptor, WD010 eIF3 subunit, WD037 hypothetical protein, conserved, WD058 hypothetical protein,
conserved, WD073 TcSof1).
O gene TcSof1 é um componente do proceassomo SSU (U3snoRNP), com expressão
regulada nas formas tripomastigotas metacíclicos. Resultados sugerem que a expressão de TcSof1p
é regulada em níveis de elongação ou término da tradução durante a diferenciação de T. cruzi
(NARDELLI et al., 2006).
141
O objetivo é clonar, a princípio, todas as 117 proteínas WD identificadas nesse trabalho e
começar a caracterização molecular gradativamente, de acordo com o grau de modulação e impor-
tância funcional dos genes, de acordo com os resultados do presente trabalho.
Resultados de expressão diferencial apresentados em ambos os microarranjos realizados
por nossa equipe no IBMP, remete-nos a uma relação inicial de 27 supra-genes WD os quais serão
de imediato caracterizados: WD009 dynein intermediate chain, WD022 hypothetical protein conserved
TcCDC4, WD040 hypothetical protein conserved, WD048 hypothetical protein conserved TcUTP12, WD053
hypothetical protein conserved WD058 hypothetical protein conserved, WD063 hypothetical protein conserved,
TcPrp19, WD068 hypothetical protein conserved TcDip2/UTP5, WD072 hypothetical protein conserved
TcStrap 1, WD085 hypothetical protein conserved TcPwp1, WD097 hypothetical protein conserved TcS-
pag16, WD102 hypothetical protein conserved TcPsf2, WD105 hypothetical protein conserved, WD107 kata-
nin, WD108 neurobeachin/beige-like protein, WD110 periodic tryptophan protein 2, WD111 peroxisomal
targeting signal type 2 receptor, WD004 beta propeller protein, WD016 hypothetical protein conserved
TcWDR63, WD044 hypothetical protein conserved TcIFT140, WD054 hypothetical protein conserved ,
WD062 hypothetical protein conserved, WD063 hypothetical protein conserved (TcPrp19), WD069 hypothetical
protein conserved, WD82 hypothetical protein conserved TcIFT140, WD091 hypothetical protein conserved,
WD104 hypothetical protein conserved , WD114 hypothetical protein conserved.
A expressão diferencial destes supra-genes em T. cruzi leva-nos a investigar experimental-
mente o envolvimento dos mesmos em processos celulares importantes, como processamento de
RNA e processos relacionados ao flagelo, ainda não completamente elucidados no contexto da
biologia básica do parasita.
Somando-se aos genes WD acima citados outros 4 genes WD são de interesse imediato a
caracterização: WD052 reanotado para TcPrp4, WD071 (TcPrp46), WD076 (TcCwf17), WD079
(TcCstf1 putativa). Com base nas descrições bioinformáticas e dados da literatura os mesmos são
genes WD potencialmente envolvidos em complexos protéicos relacionados ao processamento de
RNA, ciclo celular e trans-splicing.
O gene WD079 apresenta uma similaridade de aproximadamente 40% com o fator Cstf1
de mamífero. Brevemente, o fator Cstf1 (cleavage stimulation factor 1) é um dos múltiplos fatores
necessários a clivagem da extremidade 3’ do pré mRNA em mamíferos.
O fator Cstf1 de humanos foi purificado e compõem-se de três subunidades com massa
molecular de 77, 64 e 50 kDa, sendo a subunidade de 64 kDa capaz de interagir in vitro com a se-
qüência sinal AAUAA de poliadenilação (TAKAGAKI et al., 1992). A busca no GenBank por
proteínas homólogas a subunidade 50 kDa revela homologia entre os resíduos 160-425 da região
carbóxi-terminal e entre um pequeno segmento de 93-136 resíduos da região amino-terminal com
a subunidade B da proteína G de bovinos e humanos, exibindo uma identidade de aproximada-
mente 19,8% e similaridade de aproximadamente 34,4% (TAKAGAKI & MANLEY, 1992).
142
Com a caracterização molecular destes genes poderemos obter dados importantes sobre a
biologia de T. cruzi, sobretudo a partir da identificação dos complexos moleculares em que estão
envolvidas, através de técnicas como TAP-tagging (RIGAUT et al., 1999) já empregadas na purifi-
cação do exosomo de T. brucei (ESTÉVEZ et al., 2001), e multi complexos do editossomo (PA-
NIGRAHI et al., 2003). Outras técnicas como imunoprecipitação e pull-down serão empregadas
para produzir um mapa do interatoma de T. cruzi de forma mais direcionada, ao se priorizar as
proteínas envolvidas em interações protéicas.
143
6 Conclusão
A partir do presente trabalho foi possível ressaltar as seguintes conclusões:
• As proteínas WD de T. cruzi compõem uma família numerosa, apresentam-se como proteí-
nas multi-domínios e são sobretudo alvos potenciais para identificar e compreender complexos
multi-protéicos no parasita.
• Os genes WD avaliados por microarranjo de cDNA e oligonucleotídeos, durante o processo
de metaciclogênese in vitro e ciclo de vida de T. cruzi, apresentam padrões de expressão heterogê-
neos com indícios de modulação estágio-específica.
• Considerando os padrões de expressão, genes WD foram selecionados como sendo alvos
para caracterização molecular e funcional, por metodologias de clonagem e expressão de proteínas
em larga escala e genética reversa, através de vetores de tranfecção para T. cruzi, os quais estão em
desenvolvimento no IBMP.
144
7 Perspectivas
As perspectivas para o presente trabalho se dividem em duas partes, uma relacionada à
abordagem aqui utilizada e a outra, relacionada ao uso dessas informações.
Com relação à abordagem aqui utilizada:
• Ampliar a classificação das proteínas WD, através da utilização de ferramentas bioinformá-
ticas como Tribe-MCL que permitirá a divisão das proteínas sem anotação funcional em
grupos funcionais potenciais;
• Utilização de metodologias mais refinadas de procura de módulos, como PSI-BLAST e
HMMbuild, utilizando os padrões observados para as proteínas de tripanossomatídeos, vi-
sando identificar proteínas contendo módulos WD menos conservados.
• Aprimorar o sinal do microarranjo de oligonucleotídeos, visando identificar mais precisa-
mente os padrões de expressão das proteínas WD.
Com relação ao uso dessas informações:
• Clonar todos os genes WD em vetores de entrada da plataforma Gateway.
• Caracterizar molecularmente esses genes, utilizando-se as informações aqui obtidas, para
hierarquizá-los de acordo com sua possível importância biológica
• Definir o interatoma das proteínas WD através do uso de técnicas informativas sobre
complexos protéicos.
145
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