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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
TESE
AVALIAÇÃO DO PAPEL DA MOSCA Stomoxys calcitrans
(LINNAEUS, 1758) NA VEICULAÇÃO DE
Escherichia coli CAUSADORA DE MASTITE BOVINA
E OUTROS AGENTES BACTERIANOS
Bruno Gomes de Castro
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO DO PAPEL DA MOSCA Stomoxys calcitrans
(LINNAEUS, 1758) NA VEICULAÇÃO DE Escherichia coli
CAUSADORA DE MASTITE BOVINA E OUTROS AGENTES
BACTERIANOS
BRUNO GOMES DE CASTRO
Sob a Orientação do Professor
Avelino José Bittencourt
e Co-orientação da Professora
Miliane Moreira Soares de Souza
Tese submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Doutor em Ciências, no Curso de
Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, Área de Concentração
Sanidade Animal
Seropédica, RJ
Abril de 2008
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636.208969
2
C346a
T
Castro, Bruno Gomes de, 1978-
Avaliação do papel da mosca
Stomoxys calcitrans (Linnaeus,
1758) na veiculação de Escherichia
coli causadora de mastite bovina e
outros agentes bacterianos/ Bruno
Gomes de Castro – 2008.
82f. : il.
Orientador: Avelino José
Bittencourt.
Tese (doutorado) – Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro,
Instituto de Veterinária.
Bibliografia: f. 65-82
1. Mastite – Teses. 2. Mastite -
Transmissão – Teses. 3. Bovino -
Doenças – Teses. 4. Mosca de
estábulos – Teses. 5. Mosca como
transmissora de doença - Teses I.
Bittencourt, Avelino José , 1961- .
II. Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro. Instituto de
Veterinária. III. Título.
“Dê-me Senhor,
agudeza para entender,
capacidade para reter
método e faculdade para aprender,
sutileza para interpretar,
graça e abundância para falar
Dê-me Senhor,
acerto ao começar,
direção ao progredir
e perfeição ao concluir”.
São Tomás de Aquino
Ofereço esta tese à minha
“Família Universidade Rural”.
AGRADECIMENTO
Agradeço inicialmente a Deus por me iluminar todos os dias nesta caminhada, por
colocar em meu caminho pessoas indescritíveis, e me dar oportunidade de ter aproveitado a
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, minha segunda casa.
Agradeço a meus pais pelo apoio irrestrito durante esta caminhada que já perduram 11
anos. Sem esse apoio, esta caminhada seria um tanto mais árdua; a aos familiares (irmãos,
primos, tios, etc.) que torceram por mim durante este tempo.
Agradeço ao PROFESSOR AVELINO JOSÉ BITTENCOURT pela orientação,
aconselhamentos, ajuda e amizade. Muito obrigado pela confiança durante estes 10 anos de
convivência e orientação. Espero ter correspondido à expectativa.
À PROFESSORA MILIANE MOREIRA SOARES DE SOUZA, agradeço pela
orientação, paciência, ensinamentos, confiança, amizade e aconselhamentos nestes seis anos
de orientação.
Agradeço à DOUTORA ADRIANA HAMOND RÉGUA-MANGIA por todo apoio na
fase final de meu estudo, que foi essencial na conclusão desta tese. Se hoje este estudo se
conclui, isto se deve a sua ajuda, orientação e, principalmente, paciência com este iniciante e
encantado pela Biologia Molecular. Juntamente venho agradecer à ROSE MARY e
CARMEN do Laboratório de Epidemiologia Molecular da ENSP-FIOCRUZ pela ajuda na
fase final do estudo.
Agradeço aos amigos MICHEL, JULIO, FELIPE, THAÍS, RAQUEL, CLARISSA,
HENRIQUE, UIRATAN, FERNANDO, ALEXANDRE, FRANCISCO, MARIANA, ANA
PAULA, PABLO e ANDRÉ pela amizade e ombro amigo que sempre esteve vago para me
ouvir em dias difíceis. Agradeço a convivência com tantas outras pessoas não listadas acima.
Agradeço a minha “Família Bacteriologia” composta por SHANA, INGRID,
LIDIANE, MARCELO, AMANDA, BRUNO, ISABELA e LORENA pela ajuda,
compreensão e amizade. Sem vocês este trabalho seria impossível.
Às PROFESSORAS LUCILA BARBERIS, CRISTINA PÁJARO, LILIANA
PASCUAL e ELINA REINOSO pela orientação e auxílio durante minha estada na
UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO (ARGENTINA). Aos amigos feitos
durante os três meses vividos na Argentina.
Agradeço a GILBERTO FLAUSINO e todos os funcionários do Hospital Veterinário
da UFRRJ, pela ajuda com a limpeza e esterilização do material utilizado neste estudo. Vocês
foram muito importantes durante todo esse caminhar.
Agradeço aos professores dos departamentos de Clínica e Cirurgia Veterinária,
Parasitologia Animal e Microbiologia e Imunologia Veterinária pela ajuda e pelas idéias
dadas a este trabalho.
Agradeço ao Dr. JOÃO RAMOS DA COSTA ANDRADE do Departamento de
Microbiologia e Imunologia da Universidade Estadual do Rio de Janeiro pela cessão de
amostras padrão para a realização do estudo.
Sou muito grato aos Produtores Rurais visitados, pois sem a boa vontade deles
confiança em nosso trabalho, este estudo não seria possível; bem como às pessoas que me
auxiliaram na coleta das amostras.
Ao Curso de Pós-Graduação em CIÊNCIAS VETERINÁRIAS, meu sincero
agradecimento. Agradeço-lhe pelo apoio que dispõe aos seus alunos pós-graduandos.
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela bolsa nos três primeiros anos de Doutorado e à Fundação Carlos Chagas Filho de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) por ter me agraciado com a Bolsa
Nota 10 neste meu último ano de curso.
Agradeço à ROBERTA pela companhia, paciência e carinho durante este ano e meio,
e que espero que seja eterna a sua companhia diária.
Por fim, gostaria de dizer que cada um dos citados aqui faz parte nestas linhas
seqüentes.
MUITO OBRIGADO!!!
BIOGRAFIA
Bruno Gomes de Castro, filho de Jayme de Almeida Castro e Gláucia Gomes de
Castro, nascido em 18 de agosto de 1978, no município do Rio de Janeiro, Estado do Rio de
Janeiro.
Cursou o primário, ensino fundamental e concluiu o ensino médio, em 1995, no
Colégio Marista São José localizado na cidade do Rio de Janeiro.
No ano de 1996 ingressou no Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).
Foi estagiário do Hospital Veterinário de Pequenos Animais nesta instituição no
período de abril a setembro de 1997. Também foi estagiário remunerado do Curral de
Apreensão (Convênio UFRRJ/Polícia Rodoviária Federal) no período de outubro de 1998 a
julho de 2000. Estagiou no Hospital Veterinário da UNESP/Jaboticabal de julho a agosto de
2000 e foi bolsista de Iniciação Científica do PIBIC/CNPq, no período de agosto de 2000 a
julho de 2001, com o estudo “Avaliação da capacidade de transmissão de bactérias causadoras
de mastite por Stomoxys calcitrans (L.) em bovinos leiteiros” sob orientação do Professor Dr.
Avelino José Bittencourt.
Foi aprovado no Processo de Seleção para o Curso de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias, Área de Concentração em Parasitologia Veterinária, do Instituto de Veterinária
da UFRRJ em 2002 e desenvolveu o estudo “Avaliação da Microbiota Bacteriana de
Segmentos da mosca Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Díptera: Muscidae) em
Propriedades Rurais de muncípios da Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense” sob
orientação do Professor Dr. Avelino José Bittencourt e como co-orientadores os Professores
Dr. Gonzalo Enfraín Moya Borja e Dra. Miliane Moreira Soares de Souza. Foi bolsita de pós-
graduação da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) no
período de março de 2002 a fevereiro de 2004.
Em 2004, foi aprovado no Processo de Seleção para o Curso de Pós-graduação em
Ciências Veterinárias, nível Doutorado, do Instituto de Veterinária da UFRRJ em sob
orientação do Professor Dr. Avelino José Bittencourt e como co-orientadora a Professora Dra.
Miliane Moreira Soares de Souza.
Durante os meses de abril a julho de 2006 foi estagiário na Universidad Nacional de
Rio Cuarto na Argentina pelo projeto CAPES/SPU, sob orientação das Dras. Lucila Barberis,
Liliana Pascual, Liliana Odierno e Elina Reinoso.
Foi bolsista de pós-graduação da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) no período de março de 2004 a janeiro de 2007.
Posteriormente foi bolsista da Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa
do Estado do Rio de Janeiro de fevereiro de 2007 a fevereiro de 2008.
RESUMO
CASTRO, Bruno Gomes. Avaliação do papel de Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) na
veiculação de Escherichia coli causadora de mastite bovina e outros agentes bacterianos.
2008. 82 p. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias). Instituto de Veterinária,
Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
Seropédica, RJ, 2008.
Este estudo teve o objetivo de avaliar a capacidade da mosca Stomoxys calcitrans em veicular
agentes bacterianos causadores de mastite bacteriana bovina, bem como avaliar a microbiota
enterobacteriana na superfície externa, aparelho bucal e trato digestório abdominal da mosca
dos estábulos; e fazer um levantamento da microbiota bacteriana nos casos de mastite bovina
das propriedades visitadas. Foram coletadas amostras de leite com mastite e 20 espécimes da
mosca dos estábulos em 10 propriedades visitadas nos municípios de Barra Mansa e Resende,
Estado do Rio de Janeiro. No Laboratório de Bacteriologia da UFRRJ foi realizado o
isolamento bacteriano do leite coletado em Agar MacConkey (MC), Agar Infuso Cérebro
Coração (BHI) e Manitol Vermelho de Fenol. As moscas foram lavadas individualmente em
Caldo BHI, esterilizadas e, sob a luz de um microscópio estereoscópio, tinham seu aparelho
bucal e conteúdo intestinal abdominal dissecado. Estas estruturas foram maceradas em Caldo
BHI e após 24 horas a 37 ºC repicados em Agar MC, Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) e
enriquecidos em Caldo Tetrationato de Sódio que após incubação, era repicado em Agar
Salmonella-Shigella. Após esta etapa, cada colônia isolada era avaliada quanto às suas
características morfo-tintoriais para serem identificadas através de testes bioquímicos
específicos. Também foi realizado o teste de resistência antimicrobiana, com a finalidade de
se verificar, as quais antibióticos as bactérias isoladas foram sensíveis. Quando havia
coincidência de espécies enterobacterianas no leite e nos segmentos avaliados das moscas, se
realizava a técnica de análise do polimorfismo dos segmentos de DNA obtidos por
amplificação randômica (RAPD-PCR) como instrumento de avaliação da diversidade genética
e das relações de clonalidade entre estas subpopulações bacterianas. De acordo com os
resultados obtidos, foi verificado que o leite com mastite, teve como principais agentes
etiológicos as espécies Staphylococcus aureus, Estafilococos Coagulase Negativa (ECN) e
Escherichia coli. Os antimicrobianos com menor taxa de resistência foram Amoxicilina/Ácido
Clavulânico e Norfloxacina. Com relação à microbiota enterobacteriana verificada nos
segmentos de S. calcitrans, foi observado que Escherichia coli, Enterobacter agglomerans,
Enterobacter cloacae e Salmonella spp foram as bactérias mais prevalentes. O segmento com
o maior número de isolados foi a superfície externa, onde foram isoladas 73 colônias distintas
(45,91%), seguida pelo aparelho bucal com 46 colônias (28,93%), e pelo trato digestório
abdominal com 40 colônias isoladas (25,16%). Houve clonalidade apenas de sub-populações
de E. coli entre as amostras de leite e de segmentos de S. calcitrans de uma mesma
propriedade. Desta forma, foi possível observar que as moscas não veiculavam nenhuma E.
coli causadora de mastite bovina. No que se refere às E. coli identificadas, foi verificado que
13,79% eram Shiga-Toxigênicos, sendo identificados os genes stx1, stx2 e eaeA. No presente
estudo, verificou-se que esta mosca tem a capacidade de veicular enterobactérias, tanto em
sua superfície externa como no interior de seu corpo. O controle da mosca dos estábulos
poderá contribuir para melhora na sanidade e produtividade animal.
Palavras-chave: Stomoxys calcitrans. Mastite bacteriana bovina. Escherichia coli
ABSTRACT
CASTRO, Bruno Gomes. Evaluation of the role of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758)
as a vehicle for bovine mastitis causative Escherichia coli and other bacteria agents.
2008. 82 p. Thesis (Doctor in Veterinary Science). Instituto de Veterinária, Departamento de
Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
This study had the objective of evaluating the capacity of Stomoxys calcitrans fly to vehicular
bacterial agents causing bovine mastitis. Just as evaluate the enterobacterian microbiota on the
external surface, mouth parts and abdominal digestive tract of the stable fly. And also realize
a survey of the bacterial microbiota of the cases of bovine mastitis on the visited properties.
There were taken mastitis milk samples and 20 specimens of stable flies on 10 visited
properties in the municipatility of Barra Mansa and Resende, Rio de Janeiro State. The
collected milk was submitted to bacterial isolation in the laboratory of Bacteriology UFRRJ.
Samples were subcultures on MacConkey (MC) agar, Brain-Heart Infusion agar (BHI) and
Manitol-Phenol Red agar. The flies were individually washed in BHI broth, sterilized and had
its mouth parts and abdominal intestinal content dissected under stereoscope microscope.
These structures were macerated in BHI broth and, after 24 hours at 37 ºC, subcultured at MC
agar, Agar Eosin Methilen Blue (EMB) and enriched in Sodium Tetrathionate Broth after
incubation, and were subcultured in Salmonella-Shigella agar. After this stage, each isolated
colony was observed for differences in morphology as size and pigment production
characteristics to be identified through biochemical specific tests. It was also realized an
antimicrobial resistance test to verify to which antibiotics the isolated bacteria were sensible.
When were coincidences between the enterobacterian species in the milk and on the flies
evaluated segments, was realized a Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) as
an instrument of evaluating the genetic diversity and the eletrophoretic profile similarity the
bacterial subpopulations. In agreement with the obtained results, was verified that the mastitis
milk had as etiological agents specially the species Staphylococcus aureus, coagulase-
negative staphylococci and Escherichia coli. The antimicrobials with less resistance rate were
Amoxilin-Clavulanic Acid and Norfloxacin. Regarding to the enterobacterian microbiota
verified on S. calcitrans segments, Escherichia coli, Enterobacter agglomerans, Enterobacter
cloacae e Salmonella spp were the most prevalent bacteria. The segment with the higher
number of isolations was the external surface, with 73 (45.91%) distinct colonies isolated.
The mouth parts had 46 (28.93%) colonies and the abdominal digestive tract 40 (25.16%)
isolated colonies. The eletrophoretic profile similarity happened just on E. coli subpopulations
on milk samples and S. calcitrans segments of the same property. This way, was possible to
observe that the flies do not act as a vehicle of any bovine mastitis causative E. coli.
Regarding to the identified E. coli, was verified that 13.79% were Shiga Toxin-Producing,
and the genes stx1, stx2 and eae were identified. On the present study, was verified that this
fly has the capacity to act as vehicle to enterobacterian, on its external surface as well as
inside its body. The stable fly control may contribute to the improvement on animal
productivity and sanity.
KEY WORD: Stable fly. Bovine Summer Mastitis. Escherichia coli.
LISTA DE TABELAS
Págs
Tabela 1.
Interpretação do “California Mastits Test” modificado por Fonseca &
Santos (2000)............................................................................................................
17
Tabela 2.
Sequenciamento dos iniciadores utilizados no estudo.............................
27
Tabela 3.
Dados sobre a produção leiteira das propriedades rurais visitadas no
município de Barra Mansa e Resende, RJ.................................................................
31
Tabela 4.
Perfil de resistência, frente aos antimicrobianos avaliados, dos agentes
bacterianos identificados (N=92) de leite com mastite nas amostras coletadas
(N=78) de propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.......
37
Tabela 5.
Prevalência da microbiota bacteriana isolada das amostras coletadas de
leite com mastite das 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e
Resende, RJ...............................................................................................................
38
Tabela 6.
Freqüência dos agentes isolados das amostras de leite com mastite
coletadas das cinco propriedades rurais do município de Barra Mansa, RJ.............
39
Tabela 7.
Freqüência dos agentes isolados das amostras de leite com mastite
coletadas das cinco propriedades rurais do município de Resende, RJ....................
39
Tabela 8.
Freqüência dos escores CMT das amostras de leite com mastite
coletadas das 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende,
RJ..............................................................................................................................
41
Tabela 9.
Freqüência dos quartos mamários CMT-positivos examinados nas 10
propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.........................
41
Tabela 10.
Freqüência de enterobactérias nos três segmentos avaliados das
moscas coletadas nas 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e
Resende, RJ...............................................................................................................
44
Tabela 11.
Freqüência de enterobactérias na superfície externa das moscas
coletadas nas 10 propriedades rurais visitadas nos municípios de Barra Mansa e
Resende, RJ...............................................................................................................
45
T
abela 12.
Freqüência de enterobactérias verificadas no aparelho bucal das
moscas coletadas nas 10 propriedades rurais visitadas nos municípios de Barra
Mansa e Resende, RJ................................................................................................
45
Tabela 13.
Freqüência de enterobactérias verificadas no trato digestório
abdominal das moscas coletadas nas 10 propriedades rurais visitadas nos
municípios de Barra Mansa e Resende, RJ...............................................................
46
Tabela 14.
Amostras de Escherichia coli identificadas de leite com mastite e das
moscas coletadas nas propriedades rurais visitadas dos municípios de Barra
Mansa e Resende, RJ................................................................................................
53
LISTA DE QUADROS
Págs
Quadro 1.
Dados referentes à identificação dos animais, propriedade visitada,
quarto mamário com mastite, escore no teste “California Mastitis Test” (CMT) e
agente identificado em amostras de leite com mastite, coletadas nas 10
propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.........................
35
LISTA DE FIGURAS
Págs
Figura 1.
Mapa geopolítico do estado do Rio de Janeiro, destacando-se os
municípios de Resende e Barra Mansa e a microrregião do Vale do Paraíba
Fluminense, visitados no presente estudo.................................................................
14
Figura 2.
Moscas sendo identificadas em microscópio estereoscópio próximo a
Bico de Bunsen em Capela de Exaustão...................................................................
16
Figura 3.
Instrumental para a dissecção das moscas coletadas, pinças retas lisas
de 10 centímetros (A), pinças modelo Graefe serrilhada reta de sete centímetros
(B), e tesoura modelo Castroviejo curva de 10 centímetros (C)...............................
18
Figura 4.
Abdome (vista ventral) separado do tórax das moscas dos estábulos
coletadas em municípios do vale do Paraíba Fluminense, onde estão destacados
com setas os pontos onde são feitas as incisões (entre os segmentos abdominais
quatro e cinco) com o auxílio de agulhas hipodérmicas...........................................
18
Figura 5.
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) com colônias características de
Escherichia coli, centro negro e brilho verde metálico............................................
20
Figura 6.
Resultados do Ágar Tríplice Açúcar e Ferro (TSI) nos isolados
bacterianos das amostras de mosca e leite coletadas em municípios da
Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, RJ....................................................
20
Figura 7.
Resultados do Teste SIM nos isolados bacterianos das amostras de
mosca e leite coletadas em municípios da Microrregião do Vale do Paraíba
Fluminense, RJ............................................................................................
21
Figura 8.
Prova da fermentação de açúcares realizada para identificação
bacteriana das colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletados em
municípios da Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa
resultado negativo (A) e resultado positivo (B)........................................................
21
Figura 9.
Prova de Voges Proskauer (VP) realizada para identificação bacteriana
das colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletados em municípios da
Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa resultado negativo
(A) e resultado positivo (B)......................................................................................
22
Figura 10.
Prova de Vermelho de Metila (VM) realizada para identificação
bacteriana das colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletados em
municípios da Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa
resultado positivo (A) e resultado negativo (B)........................................................
22
Figura 11.
Prova da produção de gelatinase, realizada para identificação de
colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletadas em municípios da
Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa resultado positivo
(A) e negativo (B).....................................................................................................
23
Figura 12
.
Prova da degradação do citrato, realizada para identificação de
colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletadas em municípios da
Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa resultado positivo
(A) e negativo (B).....................................................................................................
23
Figura 13.
Agar Infuso Cérebro Coração (BHI) (A); Agar MacConkey (MC) (B)
e Agar Manitol Vermelho de Fenol (MVF) (C) utilizados para isolamento
bacteriano das amostras de leite coletadas em municípios da Microrregião do
Vale do Paraíba Fluminense.....................................................................................
25
Figura 14.
Áreas de olericultura com irrigação artificial em propriedades rurais
no Distrito de Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ..............................................
30
Figura 15.
Animais apresentando área de alopecia nas extremidades dos
membros (A) e sacos com cama de frango na entrada do curral (B) em
propriedade rural no Distrito de Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ ................
33
Figura 16.
Propriedade rural onde foi verificado acúmulo de fezes no curral e
baixo nível de higiene na ordenha em Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ........
33
Figura 17.
Número de colônias isoladas nos três segmentos estudados das
moscas coletadas nas 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e
Resende, RJ...............................................................................................................
43
Figura 18.
Freqüência de isolamento de enterobactérias entre os segmentos da
mosca dos estábulos capturadas nas 10 propriedades rurais dos municípios de
Barra Mansa e Resende, RJ......................................................................................
43
Figura 19.
Perfil eletroforético das amostras de Escherichia coli identificadas
obtidas com o iniciador A04. As colunas PM representam o peso molecular (1
Kb), as setas apontam para fragmentos de 3,054 bp (superior) e 396 bp (inferior)..
54
Figura 20.
Perfil eletroforético das amostras de Escherichia coli identificadas
obtidas com o iniciador 1254. As colunas 1, 18, 27 e 47 representam o peso
molecular (1 Kb).......................................................................................................
56
Figura 21.
Perfil eletroforético das amostras de Escherichia coli identificadas
obtidas com o iniciador M13. As colunas PM representam o peso molecular (1
Kb) e as setas apontam para fragmentos de 3,054 bp (superior) e 396 bp
(inferior)....................................................................................................................
57
Figura 22.
Perfil eletroforético organizado por grau de similaridade genética de
todas as amostras de Escherichia coli obtidas pelo iniciador A04...........................
58
Figura 23
.
Dendrograma
das
amostras de Escherichia coli isoladas de leite das
propriedades visitadas, frente aos diferentes iniciadores, sendo a amostra 19 a
única referente à mastite clínica................................................................................
59
Figura 24.
Gel de Agarose com as amostras STEC positivas, onde a coluna 1
representa o Peso Molecular (100 bp); 2: amostra padrão E40705 (stx1 e eae +);
3: amostra padrão E30121 (stx2 e eae +); 4: Amostra 5.14; 5: Amostra 5.17; 6:
Amostra 6.28; 7: Amostra 6.29; 8: Amostra 6.30; 9: Amostra 7.31; 10: Amostra
7.32; 11: Amostra 7.40..............................................................................................
61
LISTA DE ABREVIAÇÕES
STEC: Escherichia coli Shiga-Toxigênicas
BHI: Infuso Cérebro Coração
MC: Agar MacConkey
MVF: Agar Manitol Vermelho de Fenol
EMB: Agar Eosina Azul de Metileno
SS: Agar Salmonella Shigella
Sup. Externa: Superfície Externa das moscas dos estábulos coletadas no estudo
Ap. Bucal: Aparelho bucal dissecado das moscas dos estábulos coletadas no estudo
CMT: California Mastitis Test
ECN: Estafilococos Coagulase Negativos
PCR: Reação de Polimerase em Cadeia
RAPD-PCR: Amplificação Randômica do DNA Polimórfico - Reação de Polimerase em
Cadeia
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO...........................................................................................
1
2.
REVISÃO DE LITERATURA..................................................................
3
2.1 Transmissão de Microrganismos por Dípteros Muscóides.........................
3
2.2. Transmissão de Agentes Patogênicos por Stomoxys calcitrans..................
4
2.3. Transmissão de agentes bacterianos............................................................
6
2.4. Associação da Mastite Bacteriana Bovina com Dípteros Muscídeos......... 9
2.5. Mastite Bacteriana Bovina.......................................................................... 9
2.5.1. Importância da mastite no Brasil..............................................................
11
2.6. Associação de Escherichia coli e Mastite Bacteriana Bovina.....................
12
2.7. Importância da Escherichia coli na Saúde Pública e Veterinária................
13
2.7.1. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)...............................................
14
2.7.2. Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC)...............................................
14
2.7.3. Escherichia coli enteroinvasora (EIEC)...................................................
14
2.7.4. Escherichia coli com aderência difusa (DAEC).......................................
15
2.7.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)...............................................
15
2.7.6. Escherichia coli Produtora de Toxina Shiga (STEC)...............................
15
2.8. Uso de Ferramentas Moleculares no Estudo de Escherichia coli................
17
3.
MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................
19
3.1. Seleção dos Municípios............................................................................... 19
3.2. Município de Barra Mansa...........................................................................
19
3.3. Município de Resende..................................................................................
19
3.4. Seleção das Propriedades.............................................................................
21
3.5. Coleta das Moscas........................................................................................
21
3.6. Procedimento Laboratorial...........................................................................
21
3.7. Coleta do Leite.............................................................................................
23
3.8. Isolamento Bacteriano..................................................................................
25
3.8.1. Moscas coletadas.......................................................................................
25
3.8.2. Leite coletado............................................................................................
30
3.8.2.1. Avaliação do teste da sensibilidade antimicrobiana..............................
30
8.3. Extração de DNA para a Amplificação Randômica de DNA Polimórfico
32
(RAPD)...............................................................................................................
3.8.4. Análise RAPD..........................................................................................
32
3.8.5. Detecção dos genes de virulência stx 1, stx2 e eaeA................................
33
3.9. Análise Estatística........................................................................................
34
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................
35
4.1. Propriedades utilizadas no estudo................................................................
35
4.1.1. Caracterização das propriedades rurais visitadas .....................................
35
4.2. Avaliação da Mastite Bovina e Sensibilidade Antimicrobiana nas
Propriedades Visitadas .......................................................................................
40
4.3. Avaliação da Microbiota Enterobacteriana em Stomoxys calcitrans...........
49
4.3.1. Microbiota enterobacteriana em Stomoxys calcitrans no município de
Resende...............................................................................................................
54
4.3.2. Microbiota enterobacteriana em Stomoxys calcitrans no município de
Barra Mansa........................................................................................................
55
4.4. Observações da Microbiota Enterobacteriana Identificada.........................
55
4.5. Associação das Enterobactérias Identificadas nas Moscas Coletadas e no
Leite com Mastite................................................................................................
60
4.6. Avaliação da Variabilidade Genética das Amostras de Escherichia coli
Isoladas................................................................................................................
61
4.7. Incidência de Escherichia coli Shiga-Toxigênica (STEC) em Stomoxys
calcitrans e leite com mastite..............................................................................
71
4.8. Considerações Finais....................................................................................
74
5.
CONCLUSÕES...........................................................................................
76
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................
77
1
1 INTRODUÇÃO
Desde a Idade Antiga, as moscas são descritas em citações, como perturbadoras e
propagadoras de doenças pelo fato de viverem sempre associadas ao homem e animais e
principalmente aos seus dejetos, excrementos, secreções e materiais orgânicos em
decomposição, ou seja, substratos com grande potencial de albergar agentes patogênicos.
Muitos pesquisadores já vêm estudando o impacto e a capacidade dos dípteros
muscídeos na veiculação e até mesmo na transmissão de patógenos, sejam eles bactérias,
fungos, vírus, protozoários, ovos e larvas infectantes de helmintos.
Em decorrência destes fatores, que implicam na possibilidade de transmissão de
agentes patogênicos pelas moscas, Greenberg concentrou em dois livros, publicados nos anos
de 1971 e 1973, um grande número de trabalhos nos quais foram estudadas e avaliadas a
veiculação e transmissão de microrganismos por dípteros muscóides, principalmente as
moscas sinantrópicas, ou seja, moscas que têm um ciclo de vida próximo ao homem.
Dentre as moscas sinantrópicas de distribuição cosmopolita, Stomoxys calcitrans
(Linnaeus, 1758), que também é conhecida como mosca dos estábulos, parasita bovinos,
eqüinos, caprinos, ovinos, cães e até mesmo o homem. Sua importância está relacionada ao
hematofagismo e pelos danos causados aos animais parasitados, que se traduzem em prejuízos
econômicos.
Os animais parasitados pela mosca dos estábulos, destacando-se os bovinos, tendem
ao emagrecimento e, consequentemente, à diminuição da imunidade inata, proporcionando
assim uma maior exposição à ação de agentes patogênicos.
A mastite bacteriana bovina recebe destaque em estudos relacionados com os agentes
transmitidos por S. calcitrans, visto que a freqüência desta enfermidade é maior quando há
um aumento populacional desta mosca (STORK, 1979). As enterobactérias recebem grande
destaque na literatura, devido a sua capacidade de produzir doenças em humanos e em
animais, principalmente em locais com baixo nível de higiene e saneamento.
Com base nestas observações, levantou-se a hipótese de que a mosca dos estábulos
seria capaz de albergar enterobactérias em todos os seus segmentos, bem como possuir a
capacidade de carrear agentes enterobacterianos causadores de mastite bovina, em especial,
amostras de Escherichia coli.
Este estudo teve como objetivo determinar a prevalência de enterobactérias isoladas de
segmentos distintos de S. calcitrans (superfície externa, aparelho bucal e trato digestório
abdominal) e da microbiota do leite coletado de vacas positivas frente ao teste “California
Mastitis Test” (CMT), a sensibilidade antimicrobiana destes agentes, assim como investigar
características bio-genético-epidemiológicas relacionadas à diversidade e virulência em
amostras de E.coli isoladas de fontes diversas.
Os resultados obtidos neste estudo poderão contribuir para ampliar o conhecimento do
papel da mosca dos estábulos na veiculação e transmissão de agentes bacterianos com
potencial patogênico.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Transmissão de Microrganismos por Dípteros Muscóides
As moscas sinantrópicas das famílias Sarcophagidae, Calliphoridae e principalmente
da família Muscidae são consideradas como potenciais veiculadoras de patógenos (OLSEN,
1998). O tropismo destas moscas por fezes, lixo e matéria orgânica em decomposição, para
alimentação e reprodução faz com que elas se tornem vetores de diversos agentes patogênicos
(GRACZYK et al., 2001).
Greenberg, em 1971 e 1973, realizou um amplo levantamento bibliográfico, onde
listou diversas espécies de moscas e os agentes nelas isolados e seu potencial biótico como
transmissor ou simplesmente veiculador de agentes.
Dentre as moscas, a família Muscidae foi a mais estudada por diversos autores, destas,
a espécie Musca domestica (Linnaeus, 1758) foi a mais estudada em decorrência de seu maior
sinantropismo e, na maioria das vezes, maior população nos mais variados ambientes. Além
deste fator, sua ecologia e biologia fazem com que ela se torne vetor mecânico de diversos
patógenos humanos e animais (HEDGES, 1990).
As moscas sinantrópicas são responsáveis pela disseminação de enfermidades,
principalmente nos países em desenvolvimento e na transmissão de infecções nosocomiais em
ambientes hospitalares (GRACZYK et al., 2001).
Estruturalmente, as moscas são adaptadas para a veiculação de agentes patogênicos.
As probóscides são providas de uma grande quantidade de cerdas que prontamente coletam os
detritos ambientais. Além disso, apresentam cerdas nas patas e nas extremidades das patas é
produzida uma secreção viscosa, que facilita aderência de agentes microbianos (NAZNI et al.,
2005).
Nazni et al. (2005) também comentam que as moscas podem ingerir alimentos
líquidos e que geralmente regurgitam o material ingerido para liquefazer materiais sólidos a
fim de facilitar a digestão. Além disso, tendem a defecar durante a sua alimentação, o que
aumenta seu potencial de transmissão de agentes patogênicos.
Esten e Mason (1908) descreveram que cada mosca pode albergar até 6 x 10
6
bactérias. Posteriormente, Richard (1961) verificou que algumas espécies de bactérias
persistem viáveis por longo tempo nessas moscas.
Dentre as espécies desta família, Stomoxys calcitrans apresenta importância médica e
principalmente veterinária, devido ao íntimo contato que mantêm com os animais e em
conseqüência do hematofagismo, representa uma real ameaça à saúde de seus hospedeiros. Ao
realizar o repasto sanguíneo, esta mosca pode carrear diversos agentes patogênicos e
disseminá-los para outros indivíduos do rebanho (SCHOFIELD; TORR, 2002).
2.2 Transmissão de Agentes Patogênicos por Stomoxys calcitrans
A mosca dos estábulos, segundo diversos autores, é responsável pela veiculação e
transmissão de diversos agentes causadores de enfermidades ao homem e animais. De acordo
com Greenberg (1971), foi relatada a presença de nove diferentes espécies de vírus, 47 de
bactérias, 23 de protozoários e oito de helmintos, sejam esses microrganismos observados
como transmitidos ou carreados pela referida mosca.
No que se refere à transmissão e/ou transporte de microrganismos por S. calcitrans,
desde o início do século XX diversos autores realizaram estudos acerca deste assunto. O
estudo mais antigo com relato na literatura foi o de Hecker (1899), onde no final do século IX
3
constatou que as moscas tinham sua superfície externa contaminada pelo vírus da Febre
Aftosa quando a mesma se alimentava em animais enfermos.
Em 1912, alguns autores descreveram a capacidade de veiculação do vírus da
poliomielite pela mosca dos estábulos e, segundo os mesmos, esta mosca também teria a
capacidade de transmissão do referido vírus (ROSENAU; BRUES, 1912; ANDERSON;
FROST, 1912).
No mesmo ano, Mitzmain obteve sucesso na transmissão de Trypanosoma evansi por
S. calcitrans. Posteriormente, o estudo foi refeito por outros autores, que concordaram com os
dados relatados por Mitzmain (DIEBEN, 1928; MIHOK et al., 1995; LEUNITA-SUMBA et
al., 1998).
Scott (1915) em seu estudo com o vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (AIE) verificou
que a mosca dos estábulos teria a capacidade de transmissão deste agente. Fato concluído
posteriormente em outros estudos, como os realizados por Stein et al. (1942), Cupp e Kemen
(1980) e Foil et al. (1983).
Berberian (1938) relatou que a mosca dos estábulos nos EUA foi capaz de transmitir a
leishmaniose cutânea do velho mundo (Leishmania tropica). Greenberg (1973) confirmou o
observado no experimento anterior, obtendo novamente sucesso na transmissão do agente
pelo mesmo muscídeo em três tentativas. Este estudo foi corroborado posteriormente por
Laison e Southgate (1965).
Em 1950, Blanc et al. estudaram a transmissão de Toxoplasma gondii por S.
calcitrans. Os autores relataram que houve a morte de ratos inoculados com macerados destas
moscas. Posteriormente Laarman (1956) observou formas de T. gondii no tubo digestório da
mosca dos estábulos em até 22 horas após alimentação em animal positivo.
Em 1971, Greenberg observou que esta mosca foi descrita veiculando oito espécies de
helmintos, porém outra espécie da família Muscidae, Musca domestica, tem sido a espécie
com maior número de citações na literatura científica, relatando 39 diferentes espécies de
ovos de helmintos. Outros estudos indicaram a presença de ovos de helmintos na superfície
externa, como também no tubo digestório de outras moscas dissecadas, tais como
Ancylostoma duodenale, Vampirolepsis nana, Ascaris lumbricoides, Taeniarhynchus
saginatum, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Ancylostoma caninum,
Entamoeba histolytica, Entamoeba coli (SCHIRCORE, 1916 apud GREEBERG, 1973;
HARADA, 1954; GUPTA, 1972; LAWSON; GEMMEL, 1983; JOURDAN et al., 1989;
OLIVEIRA et al., 2002).
Potgieter et al. (1981) avaliaram a possibilidade de Hippobosca rufipes e de S.
calcitrans de transmitir Anaplasma marginale na África do Sul. Nesse estudo, os autores
relataram que não conseguiram transmitir a rickétsia por H. rufipes. Enquanto que, foi obtido
sucesso na transmissão pela mosca dos estábulos, com período pré-patente de 27 dias.
Lawson e Gemmel (1983) citam Nadzhafov (1967) quanto à capacidade de S.
calcitrans carrear Taeniarhynchus saginata. Estes autores observaram que a mosca dos
estábulos conseguia carrear ovos deste helminto aderidos a sua superfície externa. A mosca S.
calcitrans também é citada como hospedeiro intermediário de Habronema, onde larvas de
primeiro estágio (L1) são ingeridas por formas larvares da mosca, desenvolvendo-se até larvas
infectantes de último estágio (L3), saindo de suas probóscidas quando os adultos pousam no
hospedeiro definitivo (SOULSBY, 1982; URQUHART et al., 1998; MARCONDES, 2001).
Em outro estudo sobre a transmissão de patógenos virais por dípteros muscídeos,
Tarry et al. (1991) tentaram isolar o agente da diarréia viral bovina de três muscídeos (S.
calcitrans, Haematopota pluvialis e Hydrotaea irritans). De acordo com os resultados
obtidos, todas as espécies de moscas estudadas foram capazes de se contaminar com o agente
patogênico, indicando que os mesmos têm potencial de transmitir o vírus mecanicamente.
4
Outra rickétsia com capacidade de ser veiculada pela S. calcitrans é Ehrlichia risticii,
agente da febre do Rio Potomac em eqüinos. Estudada por Burg et al. em 1994, nos EUA, a
mosca dos estábulos teria a capacidade de carrear formas viáveis de E. risticii por no máximo
três horas.
2.3 Transmissão de agentes bacterianos
Greenberg (1971) reportou a existência de 38 espécies diferentes de bactérias na
mosca dos estábulos; um número relativamente pequeno, comparando-se com os estudos na
mosca doméstica, onde foram verificadas cerca de 200 espécies e subespécies distintas de
bactérias; isto se explica pela maior população e sinantropismo de M. domestica em relação a
S. calcitrans. Enquanto que
Harwood e James (1979) descreveram mais de 100 espécies
bacterianas em um estudo com M. domestica.
Em um estudo mais recente, Castro (2004) avaliou a microbiota bacteriana em três
segmentos da mosca dos estábulos em alguns municípios do estado do Rio de Janeiro. Dentre
a microbiota isolada e identificada, foi verificado que 18 espécies bacterianas foram isoladas
em exemplares de S. calcitrans pela primeira vez, fato que demonstra a importância desses
estudos sobre este muscídeo no país.
Outro muscídeo de grande importância para a pecuária nacional é a Haematobia
irritans, também conhecida como mosca dos chifres. Esta mosca também foi pouco estudada
quanto à transmissão de agentes bacterianos como descrito por Greenberg (1971). Segundo o
autor, foram observadas 16 espécies bacterianas nesta mosca, sendo principalmente estudadas
as enterobactérias. A mosca dos chifres, assim como a mosca dos estábulos, tem um
importante papel no que se refere à transmissão de patógenos devido ao hematofagismo.
Os estudos sobre a veiculação bacteriana por parte destes muscídeos se referem
principalmente à transmissão de agentes enteropatogênicos e também sobre a microbiota
causadora de patologias em homens e animais, como a mastite bacteriana bovina, que gera um
grande prejuízo a economia nacional e que está intimamente relacionada com a diarréia
humana (BÉJAR et al., 2006).
Ao estudar a presença de bactérias associadas à mosca dos estábulos, Bramley et al.
(1985) conseguiram isolar Staphylococcus aureus, confirmado experimentalmente por
Madsen et al. (1991) que avaliaram a capacidade de transmissão de bactérias por moscas
infectadas artificialmente.
Na tentativa de isolar Corynebacterium pseudotuberculosis de S. calcitrans,
Braverman et al. (1999) afirmaram que a mesma não era importante no transporte e na
transmissão desta bactéria. Por outro lado, alguns autores isolaram esta bactéria em M.
domestica e Haematobia irritans (YERUMAN et al., 1996; OWENS et al., 1998;
BRAVERMAN et al., 1999 e EDWARDS et al., 2000)
Outro ponto de estudo, como anteriormente citado, é a transmissão de agentes
enteropatogênicos de diferentes famílias, dentre elas as famílias Enterobacteriaceae e
Micrococcaceae. Enterobacteriaceae é uma família de bactérias Gram negativas muito ampla,
que inclui uma grande variedade de bactérias patogênicas. Algumas espécies desta família, tal
como E. coli, fazem parte da microbiota normal do intestino de seres humanos e animais.
Outras espécies habitam o solo ou a água e estão implicados em processos patogênicos,
incluindo, por exemplo, os gêneros Salmonella, Shigella e Yersinia (KONEMAN et al.,
2001).
As espécies da família Enterobacteriaceae são as maiores causadoras da diarréia
humana e animal (BROOKS et al., 2000). Em relação a esta família, Greenberg (1971) relata
a existência de 14 diferentes espécies e subespécies bacterianas presentes na mosca dos
5
estábulos, sendo elas, E. coli, E. coli communior, E. coli colicommunis, E. coli neapolitana,
E. freundii, E. intermedia, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Serratia marcescens,
Proteus vulgaris, Salmonella blockley, S. paratyphi, S. typhy e Shigella dysenteriae.
Quanto às enfermidades causadas por enterobactérias, as gastroenterites agudas com
diarréia severa, causadas por Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp. e diversas
categorias e/ou grupos e/ou classes de E. coli, são observadas predominantemente em países
em desenvolvimento, onde se verifica uma alta taxa de morbidade e mortalidade entre
humanos. A ocorrência de enfermidades diarréicas está relacionada a altas temperaturas, que
favorecem o aumento tanto das populações bacterianas como também no número de moscas
(GRACZYK et al., 2001). De acordo com Khalil et al. (1994), nas áreas rurais dos países
onde as moscas estão presentes em grande número e as condições de higiene são precárias,
existe uma influência significativa na incidência das enfermidades gastroentéricas. Neste
estudo foi observado que o controle populacional das moscas sinantrópicas coincidiu com
uma redução na casuística destas enfermidades entre neonatos e crianças.
E. coli é uma das espécies desta família mais estudada devido a seu alto potencial
patogênico. Diversos estudos visavam avaliar o papel de dípteros muscídeos na veiculação e
transmissão deste agente a alimentos de consumo humano e animal. Diversos autores
detectaram E. coli produtoras de toxina Shiga na mosca doméstica (IWASA et al., 1999;
KOBAYASHI et al., 1999; SASAKI et al., 2000). Em seu estudo, Buma (1999) avaliou a
presença de bactérias patogênicas em moscas coletadas em propriedades rurais e observou a
presença de desta linhagem de E. coli em moscas dos estábulos. Em estudo semelhante
realizado no município de Barra Mansa, estado do Rio de Janeiro, Castro et al. (2001)
avaliaram a similaridade da microbiota de leite com mastite e de espécimes de S. calcitrans
coletadas das vacas enfermas, e observaram a presença de E. coli, dentre as espécies isoladas
no macerado destas moscas.
Em relação a outras enterobactérias, Hamilton et al. (2003), em estudo no Reino
Unido, isolaram do tubo digestório de larvas da mosca dos estábulos Enterobacter sakazakii,
bactéria causadora de meningite, septicemia e enterocolite necrosante em humanos neonatos,
principalmente os prematuros e os imunocomprometidos. Desta forma os autores sugeriram
que as larvas da mosca dos estábulos serviriam de reservatório ambiental deste patógeno.
Como citado anteriormente, Castro (2004) observou agentes bacterianos isolados em
indivíduos de S. calcitrans. Neste estudo espécies bacterianas de diversas famílias foram
verificadas, com maior destaque para as famílias Bacillaceae, Micrococcaceae e
Enterobacteriaceae. Dentre os agentes isolados do referido estudo, foram identificados
agentes com grande capacidade patogênica além de agentes com nenhum potencial
patogênico descrito pela literatura.
De acordo com Turell et al. (1987), nos EUA, a mosca dos estábulos, assim como os
mosquitos Aedes aegypti e A. taeniorhynchus também foram capazes de transmitir
experimentalmente Bacillus anthracis, causador do Anthrax, confirmando desta forma a
capacidade destes dípteros em transmitir mecanicamente o referido patógeno, sendo
necessária a proposição de medidas visando a diminuição da população destes vetores como
parte integrante do programa de controle desta enfermidade.
Diversos autores afirmam que medidas de controle da população de moscas, além de
outros vetores são fundamentais no controle e profilaxia de diversas enfermidades tais como a
mastite, a diarréia humana e animal, além de outras enfermidades (THOMAS et al., 1985;
HILLERTON et al., 1990; NICKERSON et al., 1995; BARNETT et al., 1999; BERRY;
BOOTH, 1999; GRACZYK et al., 2001).
6
2.4 Associação da Mastite Bacteriana Bovina com Dípteros Muscídeos
Stork (1979) correlacionou o pico de aparecimento de moscas no verão com o
aumento de casos de mastite em rebanhos leiteiros, que foi confirmado pelo isolamento de
Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes nas moscas coletadas. O autor verificou também,
que após a adoção de medidas para controlar S. calcitrans, os casos de mastite diminuíram.
Ao avaliarem a capacidade da transmissão de mastite por moscas, Yeruman et al.
(1996) e Braverman et al. (1999) isolaram Corynebacterium pseudotuberculosis de M.
domestica em seus experimentos. Da mesma forma, Owens et al. (1998) e Edwards et al.
(2000) também isolaram outros agentes causadores desta enfermidade em H. irritans.
A mosca da cabeça da ovelha, Hydrotaea irritans, é o muscídeo com o maior número
de citações na literatura no que tange a transmissão de bactérias responsáveis pela mastite
bovina (CHIRICO et al., 1997; BRAMLEY, 1985; HILLERTON; BRAMLEY et al., 1985;
THOMAS et al., 1985; SOL, 1990; HILLERTON et al., 1990). Segundo Bramley et al.
(1985) e Tarry et al. (1988), a transmissão destes agentes patogênicos ocorre principalmente
pelas fêmeas da mosca H. irritans, que possuem a capacidade de carrear microrganismos
causadores de mastite. Segundo os mesmos autores, a transmissão ocorre por contato, já que a
mesma não tem a capacidade de perfurar a pele dos bovinos.
Além dos prejuízos decorrentes da queda na produção leiteira, o leite com mastite
deve ser descartado para o consumo humano, pois o mesmo pode conter microrganismos
produtores de enterotoxinas, que podem causar intoxicação alimentar, levando a graves
conseqüências à saúde humana (SMITH, 1994).
2.5 Mastite Bacteriana Bovina
A mastite bovina é uma doença de grande importância, sobre a qual muito se tem
estudado. A maior parte dos casos de mastite se apresenta sem sinais físicos de processo
inflamatório agudo, sendo crônicas ou incipientes e, apesar do aspecto inofensivo, causam
sérios prejuízos econômicos. A mastite ocorre normalmente em resposta à infecção
intramamária, principalmente bacteriana, podendo também ser causada por fungos, vírus ou
algas. No entanto, a maioria das mastites é de origem bacteriana (RADOSTITS et al., 2002;
DIAS, 2007).
A mastite bacteriana bovina possui etiologia diversa, e bactérias como o
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Arcanobacterium (Actinomyces)
pyogenes, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis,
Streptococcus bovis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter
aerogenes, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, se destacam como agentes desta
enfermidade (MADSEN et al., 1991; LANGONI et al., 1998; FISHER, 1999; FONSECA;
SANTOS, 2000).
A mastite bovina é considerada a doença que acarreta os maiores prejuízos
econômicos à produção leiteira, sendo observada redução da quantidade produzida, alteração
da qualidade do leite, podendo haver perda total da capacidade secretora do quarto mamário.
Esta enfermidade é caracterizada por uma inflamação da glândula mamária e pode ser
classificada como clínica ou subclínica. A mastite clínica apresenta sinais evidentes, tais
como edema, aumento de temperatura, endurecimento, dor na glândula mamária, grumos, pus
ou qualquer alteração das características do leite (FONSECA; SANTOS, 2000).
7
Na forma subclínica não se observam alterações macroscópicas e sim alterações na
composição do leite. Portanto, não apresenta sinais visíveis de inflamação da glândula
mamária (CULLOR et al., 1994). A mastite infecciosa subclínica é aquela que apresenta
resultado positivo ao “California Mastitis Test” (CMT), ou outros testes indicativos, sendo
confirmada pelo crescimento microbiano. A mastite subclínica pode ser detectada pela
contagem direta ou indireta de células somáticas no leite. Estas são compostas basicamente
por dois tipos de células principais: células de descamação do epitélio secretor e leucócitos de
origem do sangue, sendo que estas se apresentam com elevadas concentrações nos casos de
mastite (DIAS, 2007).
No Brasil, segundo Brant e Figueiredo (1994), a mastite subclínica caracteriza-se pela
alta incidência, com índices variando de 44,88% a 97,0%, e a redução da produção de leite
situa-se entre 25,4% e 43,0%. Machado (2003) relatou que a prevalência de mastite sub-
clínica nos rebanhos era de aproximadamente 40% e que as taxas de novas infecções e
infecções crônicas eram de 22% e 68%, respectivamente. Estes números mostram que os
animais ficam infectados facilmente e que na sua grande maioria permanecem infectados,
resultando em uma alta prevalência da doença.
O CMT é um dos testes mais usuais para o diagnóstico da mastite subclínica, sendo
um indicador indireto da contagem de células somáticas no leite. Este teste consiste na coleta
de leite dos quartos mamários, individualmente, em uma bandeja apropriada, um detergente
aniônico neutro é adicionado, que atua rompendo a membrana das células e liberando o
material nucléico (DNA), que irá apresentar determinada viscosidade. De acordo com a
intensidade da reação, o resultado do teste é classificado como negativa (0), reação leve (+),
moderada (++) e intensa (+++) (FONSECA; SANTOS, 2000).
A identificação dos microrganismos causadores da infecção da glândula mamária é de
grande importância tanto para o controle e prevenção, quanto, também, para o monitoramento
de rebanhos. Para isso, o diagnóstico bacteriológico é decisivo, porém caro e mais demorado,
sendo pouco aplicável a rebanhos com grande número de animais (Brito et al., 1999).
Segundo Brito et al. (1999), o exame microbiológico é considerado o método padrão
para o diagnóstico da mastite bovina, sendo que o seu principal objetivo é oferecer resultados
seguros ao veterinário, para que ele possa identificar e tratar a enfermidade. Os antibióticos
mais utilizados para o tratamento da mastite bovina têm sido a penicilinas, cefalosporinas e
tetraciclinas (Zwald et al., 2004). Deste modo, medidas específicas de controle direcionadas
para o ambiente, ou para a higiene da ordenha, podem ser indicadas de acordo com o padrão
de infecção encontrado.
Em seu estudo, Langenegger et al. (1981) concluíram que os quartos mamários com
mastite subclínica diagnosticada pelo CMT, produziam 25,4% menos leite do que os quartos
normais. A reação positiva ao CMT foi relacionada com o exame bacteriológico, onde foi
constatado que a intensidade com que a mastite subclínica afeta a produção de leite, em
quantidade e qualidade, variou de acordo com a natureza dos agentes etiológicos envolvidos,
com duração das infecções e propagação da infecção no rebanho.
2.5.1 Importância da mastite no Brasil
A produção do leite do Brasil segue em crescente expansão ao longo dos anos.
Segundo o IBGE, em 2005, o país produziu 25 bilhões de litros de leite, classificando o Brasil
como o sexto maior produtor de leite do mundo. No Brasil, a pecuária leiteira, devido a sua
enorme importância social, é uma das atividades mais significantes ligadas ao agro-negócio
do país, visto que é praticada em mais de um milhão de propriedades rurais e, somente na
produção primária, gera mais de três milhões de empregos e agrega mais de seis bilhões de
reais ao valor da produção agropecuária nacional (FAGUNDES, 2007).
8
Nesse contexto, a qualidade da matéria prima tornou-se um dos maiores requisitos
para o desenvolvimento e consolidação da indústria de laticínios do Brasil. De acordo com
Fagundes (2007), o controle da qualidade do leite nas últimas décadas havia sido restrito a
prevenção de adulterações do produto in natura como, por exemplo, a determinação da
acidez, índice crioscópico e da densidade do produto. A contagem global de microrganismos
aeróbios mesófilos e a contagem de células somáticas, que indica a higiene do processo de
obtenção do leite e a presença de mastite nos animais, respectivamente, só foi exigido após a
implementação da Instrução Normativa 51 em 2002 pelo Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA). Esta norma é constituída pelos regulamentos técnicos sobre a
produção, intensidade e qualidade dos diversos tipos de leite no país, bem como a coleta e o
transporte a granel do leite cru refrigerado.
O número de doenças associadas ao consumo de leite não tratado termicamente e o
risco de transmissão de agentes patogênicos e seus metabólitos são fatores bastante
importantes de vigilância pública de saúde, tendo em vista que 40% da comercialização do
leite no país é de origem informal (FARIA, 1998).
O número crescente e a gravidade das doenças transmitidas por alimentos em todo o
mundo têm aumentado consideravelmente o interesse público em relação à segurança
alimentar. Assim, considerando o leite como alimento básico na dieta humana, principalmente
para crianças e idosos, sua qualidade torna-se muito importante (FAGUNDES, 2007).
Além do problema em saúde pública, a mastite é considerada a enfermidade que
proporciona as maiores perdas econômicas na produção bovina. Estima-se que haja um
prejuízo de cerca de US$ 1,8 bilhões por ano nos EUA, em função da ocorrência da mastite
no rebanho norte americano (National Mastitis Concil, 1996). No Brasil, estima-se que em
função da alta prevalência da mastite nos rebanhos, possa ocorrer uma perda de produção
entre 12 e 15%, o que significaria um total de 3,64 bilhões de litros por ano em relação à
produção anual média de 20 bilhões de litros (FONSECA; SANTOS, 2000).
2.6 Associação de Escherichia coli e Mastite Bacteriana Bovina
Um dos mais prevalentes microrganismos de origem ambiental da mastite bovina é E.
coli. As infecções mamárias determinadas por esta bactéria ocorrem sob a forma clínica, de
maneira hiperaguda ou aguda, nas primeiras semanas pós-parto, caracterizada pela difícil
resolução terapêutica, nos casos com comprometimento sistêmico, e morte ocasional de
animais por toxemia (JONES, 1990; RADOSTITS et al., 2000; RIBEIRO et al., 2006). O
microrganismo também tem sido investigado em casos de mastite subclínica bovina
(DÖPFER et al., 1999; RIBEIRO, 2001).
Mastite causada por E. coli acarreta em consideráveis perdas econômicas na produção
leiteira, como indicado pela baixa produção, baixa qualidade do produto, alto custo com
tratamento dos animais e, ocasionalmente, perda do teto e até mesmo morte ou descarte do
animal (SANCHEZ-CARLO et al., 1984; WENZ et al., 2006). A razão da importância de
mastite bovina por E. coli está no aumento da incidência e nos danos causados ao animal
(FANG; PYORALA, 1996).
Estudos epidemiológicos relacionam os casos de doença humana por linhagens de E.
coli com o consumo de leite bovino e derivados submetidos ou não à pasteurização
(RIBEIRO et al., 2006). Em São Paulo, Fagundes (2007) observou a presença deste agente em
amostras de leite. Apesar de ser um agente com grande potencial patogênico, no Brasil são
limitados os estudos sobre fatores de virulência especialmente aqueles destinados que
abordam aspectos da diversidade genética em estirpes de E. coli isoladas de mastite bovina
(LIRA et al., 2004).
9
2.7 Importância de Escherichia coli na Saúde Pública e Veterinária
A bactéria E. coli é o bacilo gram negativo anaeróbio facultativo predominante da
microbiota intestinal dos humanos e dos animais, possuindo linhagens não patogênicas,
enquanto que determinadas estirpes são reconhecidamente patogênicas e podem provocar
várias doenças nos humanos e animais, como a diarréia, meningite, septicemia e infecções do
trato urinário (NATARO; KAPER, 1998).
As estirpes de E. coli capazes de provocar doença são classificadas como patógenos
intestinais e extraintestinais, segundo o local de isolamento (ORSKOV; ORSKOV, 1985;
LIOR, 1994; KAPER et al. 2004).
As bactérias que causam infecções em sítios extra-intestinais (ExPEC) podem ser
classificadas como: MENEC - E. coli que causam meningite neonatal; UPEC –E .coli
uropatogênica, agentes de infecções do trato urinário de humanos e dos cães e SEPEC- E. coli
septicêmica, agente de sepse em humanos, leitões e bezerros (FARAH, 2005).
Estirpes de E. coli causadoras da síndrome diarréia são classificadas em seis
categorias, de acordo com as propriedades de virulência como a produção de toxina,
capacidade de invasão e a adesão às células do hospedeiro (KAPER, et al. 2004):
2.7.1 Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)
A E. coli enteropatogênica (EPEC) é um importante agente etiológico da diarréia
infantil de muitos países em desenvolvimento acometendo, principalmente, crianças menores
de seis meses de idade. EPEC está associada com a expressão de um padrão de aderência
localizada (LA) e com a formação de uma lesão histopatológica (lesão “attaching and
effacing” A/E) caracterizada pela destruição das microvilosidades, formação de uma estrutura
em forma de pedestal e concentração de proteínas do cito esqueleto, principalmente, de actina.
Genes cromossômicos e plasmidiais estão envolvidos na expressão destes fenótipos e sua
detecção é empregada na caracterização destes microrganismos. (McDANIEL et al. 1995;
KAPER et al. 2004).
2.7.2 Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC)
A E. coli enterotoxigênica (ETEC) está associada com a doença diarréica de crianças
em países em desenvolvimento e é um dos agentes etiológicos mais comuns na diarréia entre
adultos provenientes de regiões desenvolvidas, caracterizando a diarréia dos viajantes. Os
fatores de virulência de ETEC estão associados com a expressão de adesinas específicas e
com produção de enterotoxinas termo-lábeis e/ou termo-estáveis codificadas por genes
plasmidiais e cromossômicos (FARAH, 2005).
2.7.3 Escherichia coli enteroinvasora (EIEC)
A E. coli enteroinvasora (EIEC) é agente de diarréia aquosa, distinta da induzida por
ETEC e que pode preceder a um quadro disentérico. Amostras de E.coli enteroinvasora
invadem as células epiteliais do cólon e em seguida provocam a lise do vacúolo endocítico.
Os genes requeridos nesse processo estão localizados em um plasmídeo de virulência
(SABRÁ, 2002).
10
2.7.4 Escherichia coli com aderência difusa (DAEC)
A E. coli que adere difusamente (DAEC) tem um papel bastante controverso na
etiologia da síndrome diarréica. Esta categoria é caracterizada pela expressão da aderência
difusa, na qual são observadas bactérias cobrindo uniformemente toda a superfície da célula
epitelial em cultura. (YANO et al., 1996).
2.7.5 Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)
A E. coli enteroagregativa (EAEC) tem como característica principal expressar o
padrão de aderência agregativa onde é observada a formação de agregados bacterianos nas
superfícies epiteliais assim como na lamínula de suporte, em regiões livres de células,
formando um arranjo semelhante a tijolos empilhados. O crescente envolvimento da EAEC
com a doença diarréica, especialmente, em países em desenvolvimento e comumente
associada a um quadro persistente, tem possibilitado o seu reconhecimento como um
enteropatógeno emergente. Os mecanismos de virulência estão sendo investigados e diversas
toxinas e adesinas têm sido descritas (BUERIS et al., 2007).
2.7.6 Escherichia coli produtora da Toxina de Shiga (“Shiga-like toxin”)
A E. coli Shiga-Toxigênica (STEC), também denominada E. coli Vero-Toxigência, é
caracterizada pela produção de um ou mais tipos de citotoxinas que podem causar destruição
tissular em humanos e animais (PATON; PATON, 1998; VERWEYEN et al., 2000).
Humanos infectados com STEC apresentam sintomas como dor abdominal, diarréia aquosa, e
inúmeros pacientes desenvolvem doenças para toda a vida como colite hemorrágica (HC) e
síndrome urêmica hemolítica (HUS) (VERWEYEN et al., 2000).
As STEC são encontradas no intestino de animais sadios, sendo o principal
reservatório o gado bovino, e também no meio ambiente onde os animais são mantidos
(FENG, 1995). Nos bovinos, os receptores Gb3 estão presentes apenas no cérebro e no rim, e
a falta destes receptores no intestino explicaria a ausência da doença intestinal nestes animais
(PRUIMBOOM-BREES et al. 2000).
A excreção de STEC nos bovinos parece estar relacionada à alimentação do animal. A
influência da dieta está baseada na habilidade de E. coli em desenvolver resistência ao pH
ácido, aumentando o risco de doenças de origem alimentar no homem. O uso de ração rica em
grãos na alimentação do gado é responsável por baixar o pH do cólon devido aos ácidos
produzidos na fermentação. Nesses animais as STEC acabam adquirindo resistência aos
ácidos além de serem encontradas em maior quantidade (DIEZ-GONZALEZ et al., 1998).
A acidez estomacal é considerada uma barreira à infecção pelos enteropatógenos, mas
devido à adaptação ocorrida no rúmen do bovino, as STEC tornaram-se capazes de resistir a
este mecanismo de defesa (CRAY et al., 1995). A resistência ao pH ácido do estômago
também é uma característica importante para a virulência das STEC, pois permite que estes
organismos sejam capazes de desencadear doença mesmo quando presentes em baixo número
no alimento contaminado (PATON; PATON, 1998).
Embora o bovino seja considerado o principal reservatório da doença provocada por
STEC, estirpes de STEC têm sido isoladas de vários animais domésticos e selvagens
(HANCOCK et al., 1998).
De acordo com Paton e Paton (1998), o consumo de carne e leite cru foi confirmado
como sendo uma das fontes mais importantes de infecção em surtos que ocorreram durante a
última década, principalmente no Canadá, Estados Unidos da América, Reino Unido e Japão.
11
A associação com alimentos industrializados sugere que os avanços tecnológicos na
indústria de processamento de alimentos eventualmente acabam contribuindo para a
disseminação da doença, como ocorre na produção em massa de hambúrgueres, sucos, e
outros alimentos, onde pequenas quantidades de alimentos contendo STEC acabam
contaminando porções maiores do produto final (BERKELMAN, 1997).
STEC altamente virulentas para o homem, capazes de causar HC e HUS também são
denominadas E. coli entero-hemorrágicas (EHEC), e amostras típicas desta linhagem possuem
virulência especial que são aqueles que carreiam o “locus of enterocyte effacement” (LEE).
Um dos genes localizados no LEE é o eae (“E. coli attaching and effacing”), que codifica a
intimina, uma membrana protéica externa envolvida na aderência da bactéria nas células
intestinais do hospedeiro (BEUTIN et al., 2007). O fator que pode também afetar a virulência
das STEC é a enterohemolisina (hly), também denominada EHEC-hemolisina (EHEC-HlyA),
que é codificado pelo gene hly (SCHMIDT et al., 1995).
Para STEC, os dois principais tipos de toxina Shiga são denominados Stx1 e Stx2,
onde variantes genéticas destas toxinas já vêem sendo descritas pela literatura (BEUTIN et al.,
2007). No que se refere à toxicidade das toxinas Shiga, Aktories e Just (2000) relatam que a
toxina Stx2 e suas variantes são mais tóxicas que as toxinas da família Stx1, provavelmente
pela melhor capacidade da Stx2 ser transportada dentro das células e sistemicamente.
Informações sobre a ocorrência e os aspectos genético-epidemiológicos destes
microrganismos em nosso meio, ainda são bastante limitadas. No Brasil, os estudos sobre
STEC ainda são incipientes. Cepas produtoras de toxina Shiga, codificada pelo gene stx foram
isoladas de rebanho bovino aparentemente saudável (CERQUEIRA et al. 1999; SILVA,
2002), com alta prevalência desta linhagem e aparentemente há predomínio de STEC não
O157 (CERQUEIRA et al. 1999; IRINO et al. 2005; PIGATTO, 2004). Ainda não houve
relatos de surtos associados com STEC no país e as estirpes isoladas de infecções em
humanos têm sido relatadas de casos esporádicos de diarréia e raros casos de diarréia
hemorrágica e de HUS (IRINO et al. 2002; GUTH et al., 2002a, 2002b, 2005; VAZ et al.,
2004; DE TONI, 2004).
2.8 Uso de Ferramentas Moleculares no Estudo de Escherichia coli
Nas últimas décadas, o desenvolvimento e o uso extensivo de sistemas de diagnóstico
e de tipagem, baseados na análise direta ou indireta do polimorfismo genômico, tem
possibilitado elucidar mecanismos de virulência bem como estudar a diversidade e a estrutura
genética de populações de E. coli, contribuindo com informações sobre os seus aspectos
biológicos e epidemiológicos (GÜRTLER; MAYALL, 2001;
REGUA-MANGIA et al., 2004;
REGUA-MANGIA et al., in press).
O grande avanço na área de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em
1990, com a idéia de se utilizar iniciadores curtos e de seqüência arbitrária para dirigir a
reação de amplificação, não se fazendo necessário o conhecimento prévio de seqüência. Esta
técnica foi desenvolvida independentemente por dois grupos nos EUA. Williams et al. (1990)
patentearam a tecnologia com o nome mais comumente utilizado, RAPD (“Random
Amplified Polymorphic DNA”), DNA polimórfico amplificado ao acaso. Welsh e
McCleallend (1990) propuseram a denominação AP-PCR (“Arbitrary Primed – Polymerase
Chain Reaction”) uma vez que os iniciadores possuem seqüência arbitrária, mas a
amplificação tecnicamente não ocorre ao acaso e sim em lugares específicos do genoma. O
experimento deste grupo foi essencialmente a geração de impressões digitais genômicos
simples e reprodutíveis para identificação de linhagens.
As técnicas moleculares baseadas na amplificação de seqüências genéticas específicas
têm sido instrumentos importantes para a detecção de uma grande variedade de
12
microrganismos, incluindo subpopulações de E. coli (YAMAMOTO et al., 1995;
PERSSON
et al., 2007). Além de fornecerem resultados rápidos, estas metodologias têm se mostrado
altamente sensíveis e específicas atendendo também aos critérios elaborados para a avaliação
de sistemas de tipagem como a estabilidade e a reprodutibilidade.
Para a tipagem genética de patógenos bacterianos, a amplificação randômica do DNA
polimórfico, conhecida pela sigla RAPD-PCR (“Random Amplification of Polymorphic
DNA-Polymerase Chain Reaction”) tem sido utilizada como um importante instrumento de
investigação da variabilidade genética (BELKUM et al., 2001). O RAPD-PCR, em condições
experimentais padronizadas, é rápido, sensível, flexível, tecnicamente simples, com reduzido
custo operacional e apresenta boa correlação com sistemas de tipagem de referência
internacional, como a eletroforese em campo pulsado (REGUA-MANGIA et al, 2004). Esta
técnica consiste da utilização de um iniciador arbitrário em uma reação da polimerase em
cadeia que ocorre em condições de baixa restringência.
Outros métodos moleculares também têm sido utilizados como sistemas de tipagens
moleculares como “Pulsed-Field Gel Electrophoresis” (PFGE) e “Multilocus Enzyme
Electrophoresis” (MLEE). Porém estes métodos têm sido relatados como muito laboriosos,
demorados e relativamente caros (PACHECO et al., 1997; REGUA-MANGIA et al, 2004)
Particularmente para populações de E. coli, o RAPD-PCR tem se tornado um método
alternativo de tipagem com elevado potencial discriminatório, possibilitando detectar a
diversidade genética e a ocorrência de padrões eletroforéticos grupo-específicos entre
amostras epidemiologicamente relacionadas (PACHECO et al., 1997; ASAKURA et al.,
2001; KIM et al., 2005; REGUA-MANGIA et al., 2004).
13
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção dos Municípios
Foram visitados os municípios de Barra Mansa e Resende, durante os meses de
novembro de 2005 a março de 2007 (Figura 1). Estes municípios foram selecionados em
decorrência da presença da mosca S. calcitrans em propriedades leiteiras nestas localidades
que se situam na Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, onde se localiza a maior bacia
leiteira do Estado do Rio de Janeiro, no que se refere à produtividade leiteira (IBGE, 2006).
Nestes municípios também foi verificada em estudos anteriores, similaridade entre os isolados
bacterianos da microbiota do macerado de moscas e do leite positivo para mastite sem, no
entanto, ter sido confirmado geneticamente que se tratava da mesma bactéria (CASTRO et al.,
2001; MORAES et al., 2004).
3.1.1 Município de Barra Mansa
O Município de Barra Mansa possui uma área territorial de 548 km
2
, tendo o Distrito
Sede uma latitude de 22,54417º Sul e longitude 44,17139º Oeste, contando com 175.315
habitantes distribuídos pela área urbana e rural. A altitude de Distrito Sede é de 382 metros
acima do nível do mar (IBGE, 2007).
Segundo dados do IBGE (2005), Barra Mansa contava com um rebanho de 28.500
bovinos e 1.515 eqüídeos. Dentre estes bovinos, 6.800 eram de vacas ordenhadas, com
produção anual total de 24.000.000 litros de leite.
3.1.2 Município de Resende
No município de Resende, o Distrito Sede (latitude de 22,46º Sul e longitude 44,45º
Oeste) está a 407 metros acima do nível do mar. A população municipal é de 118.547
habitantes (IBGE, 2007).
De acordo com a Pesquisa Pecuária Municipal do IBGE (2005), o município em
questão possuía um rebanho de 32.000 bovinos, sendo destes 7.800 vacas ordenhadas que
produziram um total de 20.204.000 litros de leite no respectivo ano, ou seja, o maior
município da referida microrregião em produção leiteira; contanto também com 2.950
eqüídeos.
3.4. Seleção das Propriedades
Foram selecionadas cinco propriedades rurais produtoras de leite por município, onde havia
presença de moscas dos estábulos. A posição geográfica (latitude-S e longitude-W) de cada
ponto de coleta foi obtida através de coordenadas planas, pelo sistema UTM (Universal
Transverse Mercator), com auxílio de um aparelho GPS (Global Position System) (Garmin -
Etrex Vista®, EUA).
14
Figura 1. Mapa geopolítico do estado do Rio de Janeiro, destacando-se os municípios de
Resende e Barra Mansa e a microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, visitados no
presente estudo.
Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense
Resende
Barra
Mansa
15
3.5. Coleta das Moscas
Foram coletadas 20 moscas por propriedade, utilizando-se puçá entomológico, dando-
se preferência por aquelas que estavam alimentando-se ou voando a uma distância máxima de
meio metro dos animais (BRAMLEY et al., 1985). Cada mosca coletada foi acondicionada
em um tubo de ensaio estéril, mantidas sob refrigeração e em seguida encaminhadas ao
laboratório.
Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados em capela de exaustão e
próximo ao bico de Bunsen (Figura 2). No laboratório, as moscas foram identificadas de
acordo com Furman e Catts (1982), onde somente espécimes de S. calcitrans foram mortos
por congelamento a –10ºC. Dentre as 20 moscas coletadas e armazenadas individualmente,
cada tubo contendo uma mosca representou um exemplar. A partir desta etapa, cada mosca foi
então colocada em tubo de ensaio contendo caldo enriquecido Infuso de Cérebro Coração
(BHI). Em seguida, as moscas foram agitadas neste caldo, de onde foram transferidas para
outro tubo de ensaio com álcool 70% por 2 minutos, para esterilização de sua superfície
externa, como descrito por Hillerton e Bramley (1985) e Castro (2004).
Após o procedimento supracitado, e sob a luz de um microscópio estereoscópio, cada
mosca foi retirada do tubo com caldo BHI e colocada em uma placa de Petri estéril invertida
para retirada das cabeças, utilizando-se pinças estéreis modelo Graefe serrilhada reta de sete
centímetros (Figura 3). Após separar a cabeça do tórax, se observou basicamente três
estruturas unidas, cabeça, probóscida e as glândulas salivares. Esse conjunto foi levado a um
outro tubo contendo caldo BHI e macerado com auxílio de um tubo de vidro estéril de menor
diâmetro que o anterior.
Em seguida, cada mosca foi colocada em outra placa de Petri invertida. Nela, separou-
se o abdome do tórax através do uso de uma tesoura estéril, modelo Castroviejo curva (Figura
3), quando então, foi feita uma incisão bilateral entre o quarto e quinto segmentos do abdome
usando agulhas hipodérmicas estéreis. O último segmento abdominal foi tracionado, usando
pinças retas estéreis, lisas de 10 centímetros (Figura 3). Após esse procedimento, coletou-se a
porção abdominal do tubo digestório (Figura 4). Os segmentos dissecados foram transferidos
novamente para outro tubo contendo caldo BHI. Ao final desta etapa, o caldo utilizado no
lavado externo das moscas coletadas, como também o caldo contendo o macerado do aparelho
bucal e do macerado das porções abdominais do tubo digestório foram identificados e
colocados em estufa bacteriológica a 37 ºC por 24 horas para incubação.
16
Figura 2. Moscas sendo identificadas em microscópio estereoscópio próximo a Bico de
Bunsen em Capela de Exaustão.
17
3.6. Coleta do Leite
No procedimento da coleta de leite foi realizada a limpeza dos tetos, sendo lavados
com água e sabão neutro, em seguida, enxugados e desinfetados com álcool iodado para
realização do “California Mastitis Test” (SCHALM; NORLANDER, 1957). Após a
realização do CMT, foram coletadas as amostras de leite em frascos estéreis dos quartos
mamários positivos, mantidas sob refrigeração e encaminhadas ao laboratório para isolamento
bacteriano.
O resultado do teste CMT foi avaliado de acordo com o grau de gelatinização da
mistura em partes iguais de leite e reagente. Os resultados estão relacionados à contagem de
células somáticas (FONSECA; SANTOS, 2000), sendo expresso em cinco escores (Tabela 1).
Tabela 1. Interpretação do “California Mastits Test” modificado por Fonseca e Santos (2000).
Escore Viscosidade
0 Ausente
- Leve
+ Leve/Moderada
++ Moderada
+++ Intensa
18
Figura 3. Instrumental para a dissecção das moscas coletadas, pinças retas lisas de 10
centímetros (A), pinças modelo Graefe serrilhada reta de sete centímetros (B), e tesoura
modelo Castroviejo curva de 10 centímetros (C).
Figura 4. Vista ventral do abdome de Stomoxys calcitrans coletadas em municípios do vale
do Paraíba Fluminense, onde estão destacados com setas os pontos onde são feitas as incisões
(entre os segmentos abdominais quatro e cinco) com o auxílio de agulhas hipodérmicas.
A
B
C
19
3.7 Isolamento Bacteriano e Caracterização Fisiológica
O isolamento e identificação bacteriana, a partir das amostras de moscas e de leite,
foram realizados adaptando-se a metodologia descrita por Koneman et al. (2001).
3.7.1 Moscas coletadas
Após o período de incubação em Caldo BHI, as amostras foram repicadas nos
seguintes meios: Agar MacConkey e Agar EMB (Eosina Azul de Metileno) (Figura 5). Para
isolamento dos gêneros Salmonella spp e Shigella spp, após o enriquecimento seletivo em
caldo Tetrationato de Sódio, efetuou-se o repique no Ágar Salmonella-Shigella (SS). Em
seguida as colônias foram observadas quanto a sua forma, cor, bordas, dentre outras
características fenotípicas. Após diferenciação prévia das colônias, estas foram submetidas às
provas de identificação preliminar: Coloração de Gram para observação das características
morfológicas e tintoriais, teste de hidrólise ao KOH a 3% para confirmação do Gram e prova
da catalase. Posteriormente, foram realizadas as seguintes provas de identificação:
comportamento em ágar tríplice açúcar-ferro (Figura 6), comportamento em Agar SIM
(Figura 7), produção de ácidos a partir da glicose, fermentação de açúcares (Figura 8), teste
Voges Proskauer (VP) (Figura 9), teste do Vermelho de Metila (VM) (Figura 10), redução do
nitrato, produção de gelatinase (Figura 11), degradação de citrato (Figura 12) e malonato, e
outros diferenciais de acordo com o microrganismo envolvido.
Ao final do processo de isolamento e identificação, foi avaliada a prevalência das
espécies enterobacterianas em cada segmento estudado, nas cinco propriedades rurais
visitadas em cada município, assim como taxa de infecção que foi calculada pela razão do
número de moscas contaminadas por enterobactérias pelo total de moscas coletadas (N=200).
20
Figura 5. Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) com colônias características de Escherichia
coli, centro negro e brilho verde metálico.
Figura 6. Diferentes resultados do Ágar Tríplice Açúcar e Ferro (TSI) nos isolados
bacterianos das amostras de mosca e leite coletadas em municípios da Microrregião do Vale
do Paraíba Fluminense, RJ.
21
Figura 7. Diferentes resultados do Teste SIM nos isolados bacterianos das amostras de mosca
e leite coletadas em municípios da Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense, RJ.
Figura 8. Prova da fermentação de açúcares realizada para identificação bacteriana das
colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletados em municípios da Microrregião do
Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa resultado negativo (A) e resultado positivo (B).
A B
22
Figura 9. Prova de Voges Proskauer (VP) realizada para identificação bacteriana das colônias
isoladas das amostras de mosca e leite coletados em municípios da Microrregião do Vale do
Paraíba Fluminense, onde se observa resultado negativo (A) e resultado positivo (B).
Figura 10. Prova de Vermelho de Metila (VM) realizada para identificação bacteriana das
colônias isoladas das amostras de mosca e leite coletados em municípios da Microrregião do
Vale do Paraíba Fluminense, onde se observa resultado positivo (A) e resultado negativo (B).
A B
A B
23
Figura 11. Prova da produção de gelatinase, realizada para identificação de colônias isoladas
das amostras de mosca e leite coletadas em municípios da Microrregião do Vale do Paraíba
Fluminense, onde se observa resultado positivo (A) e negativo (B).
Figura 12. Prova da degradação do citrato, realizada para identificação de colônias isoladas
das amostras de mosca e leite coletadas em municípios da Microrregião do Vale do Paraíba
Fluminense, onde se observa resultado positivo (A) e negativo (B).
A
B
A B
24
3.7.2 Leite coletado
Após o período de incubação, essas amostras foram repicadas nos seguintes meios:
Agar BHI, Agar MacConkey e Agar Manitol Vermelho de Fenol (Figura 13). Em seguida, as
colônias foram observadas quanto a sua forma, cor, bordas, dentre outras características
fenotípicas. Após diferenciação inicial das colônias, estas foram submetidas às provas de
identificação preliminar: Coloração de Gram, para observação das características
morfológicas e tintoriais; teste de hidrólise ao KOH a 3%, para confirmação do Gram; e prova
da catalase. Toda a etapa de identificação será realizada de acordo com o gênero isolado,
utilizando-se provas bioquímicas específicas como recomendado por Koneman et al. (2001).
Ao final do processo de isolamento e identificação foi avaliada a prevalência das
espécies bacterianas causadoras da mastite bovina no leite coletados das vacas nas cinco
propriedades rurais visitadas de cada município.
3.7.2.1 Avaliação do teste da sensibilidade antimicrobiana
Todas as espécies isoladas nas amostras de leite com mastite foram submetidas ao
teste da sensibilidade antimicrobiana (antibiograma) de acordo com as normas internacionais
(CLSI, 2005). Foram empregados os seguintes antibióticos: Ampicilina (Amp, 10 mcg),
Gentamicina (Gen, 10 mcg), Cloranfenicol (Clo, 30 mcg), Vancomicina (Van, 30 mcg),
Norfloxacino (Nor, 10 mcg), Oxacilina (Oxa, 1 mcg), Amoxicilina associado com Ácido
Clavulânico (Amc, 30 mcg) e Nitrofurantoína (Nit, 30 mcg). Para tanto, foram utilizadas as
amostras padrões Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Staphylococcus aureus ATCC
29213 para padronização do ensaio. O resultado dos antibiogramas de cada propriedade era
fornecido aos respectivos produtores rurais, onde eles eram orientados sobre os antibióticos
específicos para cada vaca, assim como no uso correto dos medicamentos.
25
Figura 13. Agar Infuso Cérebro Coração (BHI) (A); Agar MacConkey (MC) (B) e Agar
Manitol Vermelho de Fenol (MVF) (C) utilizados para isolamento bacteriano das amostras de
leite coletadas em municípios da Microrregião do Vale do Paraíba Fluminense.
A
B
C
26
3.8 Caracterização Genotípica por Ensaios de Amplificação pela Reação da Polimerase
em Cadeia (PCR)
Foram utilizadas todas as amostras de E. coli isoladas e identificadas a partir das
moscas e amostras de leite com mastite coletadas nas 10 propriedades rurais visitadas dos
municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
3.8.1 Análise do polimorfismo dos segmentos de DNA obtidos por amplificação
randômica (RAPD-PCR - “Random Amplification of Polymorphic DNA”)
As etapas de extração do DNA bacteriano, da reação dos ensaios de amplificação
randômica do DNA polimórfico e da análise dos produtos da amplificação foram realizadas
de acordo com a metodologia proposta por Pacheco et al. (1997).
3.8.1.1 Extração de DNA para a Amplificação Randômica de DNA Polimórfico (RAPD)
Para o ajuste da concentração das células bacterianas, uma alíquota de 20 µl do
crescimento bacteriano em caldo de tripticaseína de soja (TSB-BBL) a 37
o
C/18-24hs foi
diluída a 1:10 em água destilada ou salina para determinação da densidade ótica (D.O.) em
600nm. Para a D.O. de 0.4 de absorvância, uma alíquota de 200 µl foi centrifugada e
ressuspendida em 900µl de água destilada estéril. A suspensão foi submetida à fervura por 10
minutos e o lisado bacteriano foi rapidamente centrifugada (spin) e utilizada como fonte de
DNA nas reações de amplificação.
3.8.1.2 Reação RAPD-PCR
Um volume de 3µl do lisado bacteriano foi utilizado nas reações de amplificação
juntamente com outros reagentes: 20mM Tris-HCl (pH 8.4) (Fermentas, Burlington, Canadá),
50mM HCl, 4mM de MgCl
2
(Fermentas, Burlington, Canadá) , 250µM (cada) dNTP
(ABgene, Epsom, Reino Unido), 30 pmol de iniciador e 1U Taq polimerase (Fermentas,
Burlington, Canadá). Foram utilizados os seguintes iniciadores: 1247 (5'-AAGAGCCCGT-
3'), 1253 (5´-GTTTCCGCCC-3´), 1281 (5´-AACGCGCAAC-3´), 1254 (5´ CCGCAGCCAA
3´), M13 (5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′), e A04 (5´-AATCGGGCTG-3´) com a finalidade
de se escolher três iniciadores que apresentarem maior número de bandas, intensidade e alta
reprodutibilidade das bandas. A reação foi programada para desnaturação inicial de 94
o
C por
1 minuto; seguida de 4 ciclos de 94
o
C por 5 minutos; 37
o
C por 5 minutos e 72
o
C por 5
minutos; 30 ciclos de 94
o
C por 1 minuto, 37
o
C por 1 minuto e 72
o
C por 2 minutos e,
extensão final de 72
o
C por 10 minutos.
3.8.1.3 Análise dos produtos de amplificação obtidos a partir do RAPD
Os produtos da reação de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose a 1,5%. Os perfis eletroforéticos detectados foram definidos pela intensidade, presença e
ausência de bandas e, considerados diferentes quando, pelo menos, uma banda polimórfica fosse
detectada. Foi utilizada marcadores de Peso Molecular de 1 kb.
27
Os perfis de amplificação foram submetidos à análise visual e automatizada com
auxílio do software UVI soft image acquisition and analysis software empregando o programa
UVIPro bandmap versão 11.9 (UVItec, Cambridge, Reino Unido).
3.8.2 Amplificação simultânea dos genes stx 1, stx2 e eae (PCR-multiplex)
As etapas de extração do DNA bacteriano, da reação dos ensaios de reação de
polimerase em cadeia e da análise dos produtos da amplificação foram realizadas de acordo
com a metodologia proposta por China et al. (1996).
3.8.2.1 Extração do DNA para PCR-Multiplex
As amostras de E. coli foram semeadas em 5 mL de Caldo Müeller Hinton (MERCK)
a 37 ºC por 18 a 24 horas. Após o período de incubação, 300 µL da cultura foram
centrifugados por 30 segundos em microcentrífuga e o sobrenadante descartado. O sedimento
foi ressuspenso em 50 µL de água destilada estéril, submetido a fervura por 10 minutos. O
lisado bacteriano foi centrifugado por 30 segundos em microcentrífuga e o sobrenadante
coletado e usado como fonte de DNA.
3.8.2.2. Reação PCR-Multiplex
A detecção dos genes stx1, stx2 e eae foi realizada por meio de ensaios de
amplificação simultânea (PCR-Multiplex) conforme descrito por China et al. (1996).
Para a reação de PCR foi utilizado 1 U de Taq Polimerase (Fermentas, Burlington,
Canadá), 5 µL de 2 mM deoxinucleotídeo trifosfato- DNTP (ABgene, Epsom, Reino Unido),
5 mL de tampão 10X buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.8], 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 1%
Triton X-100) (Fermentas, Burlington, Canadá), 0.5 mL de cada iniciador (40 mM) (Bioneer,
Seul, Coréia do Sul) (Tabela 2), e 5 µL de DNA para um volume final de 50 µL. As reações
foram realizadas em um termociclador Eppendorf Master Cycler programado para 94 ºC por 5
minutos, seguido de 30 ciclos por 94 ºC por 30 segundos, 50 ºC por 30 segundos e 72 ºC por
30 segundos. As amostras de E. coli E40705 (stx1 e eae positivos) e E30121 (stx2 e eae
positivos) foram incluídas no estudo como controle de reação.
Tabela 2. Seqüência dos iniciadores empregados na detecção dos genes stx1, stx2 e eae.
Gene
Iniciador
Seqüência Tamanho dos “amplicons”
eae
B52 5´ AGGCTTCGTCACAGTTG 3´
570 bp
B53 5´ CCATCGTCACCAGAGGA 3´
stx1
B54 5´ AGAGCGATGTTACGGTTTG 3´
388 bp
B55 5´ TTGCCCCCAGAGTGGATG 3´
stx2
B56 5´ TGGGTTTTTCTTCGGTATC 3´
807 bp
B57 5´ GACATTCTGGTTGACTCTCTT 3´
28
3.8.2.3 Análise dos produtos de amplificação obtidos a partir do PCR-Multiplex
Os “amplicons” foram analisados por meio da eletroforese em gel de agarose a 2%,
seguido por coloração em brometo de etídeo (0,5 mg/mL), sendo utilizados marcadores de
Peso Molecular de 100 kb para auxiliar a observadção dos genes com tamanho pré-definidos,
e visualizados em transiluminador ultravioleta e documentados pelo programa UVI PRO
(UVI tec, Cambridge, Reino Unido).
3.9 Análise Estatística
Este estudo foi avaliado de forma quantitativa, onde foram mensurados, as médias e
desvios padrões de colônias isoladas por segmento, além da freqüência das espécies
bacterianas identificadas.
Foi utilizado o teste do Qui-quadrado, ao final deste estudo, para comparação da taxa
de infecção dos segmentos em relação ao isolamento de colônias (SAMPAIO, 2002).
29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Propriedades Utilizadas no Estudo
Foram visitadas dez propriedades rurais, escolhidas por conveniência, sendo cinco
situadas no município de Barra Mansa e outras cinco situadas no município de Resende. As
visitas foram realizadas entre os meses de dezembro de 2005 e abril de 2007. Previamente às
visitas, foram contatados extensionistas da EMATER-RJ, a fim de se coletar informações
acerca das propriedades rurais e conhecimento acerca da presença da mosca dos estábulos. A
partir deste conhecimento, foram visitadas as propriedades onde se produzia leite de vacas e,
principalmente, onde as moscas dos estábulos se faziam presentes. As condições climáticas
nesses municípios encontram-se na faixa que favorece o desenvolvimento da mosca dos
estábulos, como verificado por Mello (1989) em condições de laboratório. Segundo este autor,
à temperatura de 27ºC e umidade relativa oscilando entre 70 e 80%, o desenvolvimento de S.
calcitrans foi bastante favorável. Da mesma forma, Valgode (1990) verificou que a
temperatura de 25 ºC foi adequada para o desenvolvimento desta mosca.
4.1.1. Caracterização das propriedades rurais visitadas
As cinco primeiras propriedades foram visitadas no município de Barra Mansa,
durante os meses de dezembro de 2005 e outubro de 2006 e as cinco últimas no município de
Resende, durante os meses de novembro de 2006 e abril de 2007, juntamente com um
extensionista da EMATER-RJ. Os nomes das propriedades e dos responsáveis não serão
mencionados a fim de se preservar a identidade dos mesmos.
Em Barra Mansa foi selecionado o distrito de Santa Rita de Cássia, onde se concentra a
produção olerícola do município em conjunto com a criação de bovinos. Nestas propriedades
se utiliza cama de frango para adubação, que é um meio favorável ao desenvolvimento da
mosca dos estábulos (GUIMARÃES, 1984). Apesar da produção de verduras se concentrar
nos meses mais frios e secos do ano (maio a outubro), se utiliza nesta época irrigação artificial
(Figura 14), aumentando a umidade no local, favorecendo o desenvolvimento da mosca dos
estábulos (JULIASSE; BITTENCOURT, 2000). Na maioria das propriedades também se
criam bovinos e eqüídeos, nos quais esta mosca se alimenta com freqüência
(BITTENCOURT, 1998).
As informações referentes à produção leiteira das fazendas visitadas no município de
Barra Mansa e Resende, segundo seus responsáveis, podem ser verificadas na Tabela 3.
30
Figura 14. Áreas de olericultura com irrigação artificial em propriedades rurais no Distrito de
Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ.
31
Tabela 3. Dados sobre a produção leiteira das propriedades rurais visitadas no município de
Barra Mansa e Resende, RJ.
PROPRIEDADE
Litros/dia Vacas lactação Tipo de ordenha Nº de ordenhas/dia
Barra Mansa
I 300 24 Manual 2
II 280 37 Manual 1
III 400 32 Manual 2
IV 250 24 Manual 2
V 100 15 Manual 1
Resende
VI 1000 49 Mecânica 2
VII 100 12 Manual 1
VIII 160 21 Manual 1
IX 200 32 Manual 1
X 280 27 Manual 2
A primeira propriedade (P1) visitada, em Barra Mansa, situava-se nas coordenadas
0588833 leste e 7529607 norte, possuía piso cimentado no curral e apresentava-se
relativamente limpo; os animais recebiam suplementação após a ordenha e a mosca dos
estábulos se fazia presente.
Na segunda propriedade (P2), situada nas coordenadas 0586945 leste e 7519583 norte,
foi observado acúmulo de esterco no piso de pedra do curral, os animais não recebiam
nenhum tipo de suplementação após a ordenha e foram observados exemplares de mosca dos
estábulos nos animais.
Na terceira propriedade visitada (P3), localizada nas coordenadas 0586491 leste e
7517674 norte, cujo piso do curral era de chão batido, com esterco espalhado pelo curral; os
animais não recebiam nenhum tipo de suplementação após a ordenha e a mosca dos estábulos
se fazia presente em grande número, devido à proximidade com áreas de olericultura, que
eram adubadas com cama de frango, que é um dos meios mais favoráveis ao desenvolvimento
desta mosca.
Na quarta propriedade (P4), que se situava nas coordenadas 0586904 leste e 7519868
norte, foi observado um curral com piso de pedra, onde se acumulava grande quantidade de
esterco, sacos de cama de frango na entrada do curral, que segundo o reiteiro não eram usados
na alimentação animal. Os animais desta propriedade recebiam suplementação mineral após a
ordenha, estando presentes em grande número a mosca dos estábulos e outras moscas,
provavelmente devido à proximidade com áreas de olericultura, como já discutido
anteriormente, sacos contendo cama de frango e a um depósito de cevada ao lado do curral
(Figura 15).
A quinta propriedade (P5), situada nas coordenadas 0586491 leste e 7518248 norte, foi
a propriedade com o menor índice de higiene dentre as visitadas, onde foi observado grande
quantidade de lama e esterco acumulado no curral com piso de chão batido. Os animais não
32
recebiam nenhum tipo de suplementação após a ordenha e a mosca dos estábulos se fazia
presente (Figura 16).
A sexta propriedade visitada (P6), primeira no município de Resende, e que se situava
nas coordenadas 0570459 leste e 7531933 norte, foi a única das dez propriedades visitadas
onde foi observada a limpeza prévia dos tetos, assim como um correto manejo higiênico-
sanitário dos animais. Nessa propriedade foi observado um curral com piso emborrachado,
com constante limpeza do esterco e da área de ordenha. Os animais desta propriedade
recebiam concentrado após a ordenha. A mosca dos estábulos se fazia presente em grande
número, provavelmente devido ao acúmulo ao lado do curral de palha de café proveniente da
propriedade, que também é um dos substratos de desenvolvimento desta mosca.
Na sétima propriedade (P7) (0570625 leste e 7532479 norte) foi observado um curral
com grande quantidade de esterco e os animais não recebiam nenhum tipo de suplementação
após a ordenha e a mosca dos estábulos se fazia presente, provavelmente devido a
proximidade com a anterior.
Na oitava propriedade visitada (P8), situada nas coordenadas 0570884 leste e 7532776
norte, que possuía um curral com piso de terra, com algumas áreas alagadas, devido à chuva
recente que havia caído, e com acúmulo de esterco por todo o curral. Os animais não
recebiam nenhum tipo de suplementação após a ordenha e a mosca dos estábulos se fazia
presente, visto que também era próxima à primeira fazenda visitada de Resende.
A nona propriedade visitada (P9), situava-se nas coordenadas 0571220 leste e
7534167 norte. Nessa propriedade foi verificado um curral com esterco acumulado, os
33
Figura 15. Animais apresentando área de alopecia nas extremidades dos membros (A) e sacos
com cama de frango na entrada do curral (B) em propriedade rural no Distrito de Santa Rita
de Cássia, Barra Mansa, RJ.
Figura 16. Propriedade rural onde foi verificado acúmulo de fezes no curral e baixo nível de
higiene na ordenha em Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ.
A B
34
animais não recebiam nenhum tipo de suplementação após a ordenha e a mosca dos estábulos
se fazia presente.
A décima propriedade (P10) localizava-se nas coordenadas 0570207 leste e 7537543
norte, onde foi observado acúmulo de esterco por todo o curral e cujo piso cimentado não
recebia uma limpeza correta, os animais recebiam suplementação mineral após a ordenha e a
mosca dos estábulos se fazia presente.
4.2 Avaliação da Mastite Bovina e Sensibilidade Antimicrobiana nas Propriedades
Visitadas
Em todas as propriedades visitadas, após a realização do “California Mastitis Test”
(CMT), constatou-se mastite em todos os rebanhos testados. Os resultados referentes à
identificação dos animais, quartos positivos, escore do CMT, isolamento e identificação dos
agentes nas propriedades estudadas estão dispostos no Quadro 1. A distribuição da resistência
in vitro dos isolados das amostras de leite de vacas com mastite das 10 propriedades rurais
visitadas, frente aos antibióticos estudados, pode ser verificada na Tabela 4.
Na primeira propriedade visitada, 25% das vacas examinadas (N=24) apresentavam 10
quartos afetados, cujos agentes mais freqüentes foram: estafilococos coagulase negativo
(ECN), verificado em 50% dos quartos positivos; Staphylococcus aureus aureus (20%) e E.
coli (20%). Nesta propriedade, dentre os antibióticos testados, os agentes isolados
apresentaram maior resistência à ampicilina (90%); seguido pela gentamina (80%);
cloranfenicol (70%); amoxicilina associada com ácido clavulânico (50%); ciprofloxacino e
norfloxacino (40%); oxacilina, vancomicina e ampilicina (30%) respectivamente.
Na segunda propriedade, 16,22% dos animais em lactação (N=37) apresentaram
mastite. Nos animais afetados foram observados sete quartos mamários positivos, sendo
isolado, principalmente, S. aureus aureus (42,86%) e ECN (28,57%). No que se refere à
resistência aos antibióticos avaliados, foi verificado que 54,55% dos agentes isolados
apresentaram resistência à vancomicina, nitrofurantoína, ampicilina e gentamicina,
respectivamente; 45,45% ao cloranfenicol; 18,18% ao ciprofloxacino e norfloxacino,
respectivamente; e 9,09% à amoxicilina com ácido clavulânico. No entanto, nenhum dos
agentes isolados na P2 se mostrou resistente à oxacilina.
A terceira propriedade apresentava prevalência de 37,5% (N=32) de vacas com
mastite. Nesta propriedade foram verificados 14 quartos mamários afetados, sendo S. aureus
aureus (30,77%) o microrganismo mais freqüente, seguido por Staphylococcus intermedius e
ECN (23,08% cada um). Dos agentes isolados, 84,62% foram resistentes à ampicilina;
46,15% à gentamicina; 30,77% ao ciprofloxacino; 23,08% à oxacilina e vancomicina,
simultaneamente; 15,38% ao norfloxacino; e 7,69% a cada um dos antibióticos a seguir, isto
é, amoxicilina com ácido clavulânico, nitrofurantoína e cloranfenicol.
35
Quadro 1. Dados referentes à identificação dos animais, propriedade visitada, quarto
mamário com mastite, escore no teste “California Mastitis Test” (CMT) e agente identificado
em amostras de leite com mastite, coletadas nas 10 propriedades rurais dos municípios de
Barra Mansa e Resende, RJ. (Continua)
Animal Propriedade Quarto Mamário* CMT** Agente Identificado
1 I PD ++ Staphylococcus aureus aureus
2 I
PE - Bacilo Gram Positivo
PD +++ ECN***
3 I PE + Escherichia coli
4 I
PE + ECN
AD ++ ECN
PD +++ ECN
AE ++ ECN
5 I AD +++ Escherichia coli
6 I PE - Staphylococcus aureus aureus
7 II AD +++
Streptococcus spp
Staphylococcus aureus aureus
8 II AE ++
ECN
Staphylococcus aureus aureus
Staphylococcus intermedius
9 II
AE + Staphylococcus aureus aureus
AD ++ ECN
10 II AE +++
Staphylococcus intermedius
Staphylococcus aureus aureus
ECN
11 II PD ++
ECN
Staphylococcus aureus aureus
12 II PE ++
Escherichia coli
Staphylococcus aureus aureus
13 III AE ++ Staphylococcus aureus aureus
14 III PD + ECN
15 III
AD ++ Staphylococcus aureus aureus
PE + Staphylococcus aureus aureus
16 III PD ++ Escherichia coli
17 III PD ++ ECN
18 III AD + Streptococcus spp
19 III AE +++ Pseudomonas spp
20 III AE + Staphylococcus intermedius
21 III AD + ECN
22 III
AD ++ Staphylococcus intermedius
PD ++ Staphylococcus intermedius
23 III AD +++ Staphylococcus aureus aureus
24 IV
AD ++
Escherichia coli
ECN
PD ++
Escherichia coli
ECN
25 IV
AD +++ Bacilo Gram Positivo
AE ++
Staphylococcus aureus aureus
Staphylococcus intermedius
26 IV PE - Escherichia coli
27 IV AE ++
Staphylococcus aureus aureus
Escherichia coli
28 IV PD + Escherichia coli
29 V
AD +++ Streptococcus spp
PD + ECN
30 V PE +++ Streptococcus spp.
31 V PE +++ Staphylococcus aureus aureus
* Quartos mamários Anteriores Direito (AD) e Esquerdo (AE), e Posteriores Direito (PD) e Esquerdo (PE);
** Classificação CMT segundo Fonseca; Santos (2000), *** Estafilococos Coagulase Negativo
36
Quadro 1. Continuação.
Animal Propriedade Quarto Mamário* CMT** Agente Identificado
32 VI
AE ++ Staphylococcus aureus aureus
PD ++ Staphylococcus aureus aureus
PE +++
Staphylococcus aureus aureus
ECN***
33 VI PE ++ Staphylococcus intermedius
34 VI
PD + Staphylococcus schleiferi
PE ++ Staphylococcus schleiferi
35 VII PD ++
Staphylococcus aureus aureus
Streptococcus spp.
36 VII
AD ++ Escherichia coli
PE + Escherichia coli
37 VII PE ++
Staphylococcus aureus aureus
ECN
38 VIII PE ++ Streptococcus spp
39 VIII
PE ++ ECN
AE ++ ECN
40 IX PD - Proteus mirabilis
41 IX AD ++ Bacilo Gram Positivo
42 IX
AE ++ Staphylococcus aureus aureus
PD ++ Staphylococcus intermedius
AD ++ Staphylococcus aureus aureus
43 IX
AE + Escherichia coli
AD ++ Escherichia coli
44 IX PD - Staphylococcus aureus aureus
45 IX
PE ++ Streptococcus spp
PD ++ ECN
AD +++ ECN
46 X PD +++ Streptococcus spp
47 X
AD +++ Staphylococcus aureus aureus
AE ++ Staphylococcus aureus aureus
PD ++ Staphylococcus aureus aureus
PE ++ Staphylococcus aureus aureus
48 X
AE ++ ECN
AD ++ ECN
49 X AE +++ Escherichia coli
50 X PE + ECN
51 X AD ++ Klebsiella oxytoca
52 XX PE ++ Streptococcus spp
53 X PE +++ Staphylococcus aureus aureus
54 X AD ++ ECN
* Quartos mamários Anteriores Direito (AD) e Esquerdo (AE), e Posteriores Direito (PD) e Esquerdo (PE);
** Classificação CMT segundo Fonseca; Santos (2000), *** Estafilococos Coagulase Negativo
37
Tabela 4. Perfil de resistência, frente aos antimicrobianos avaliados, dos agentes bacterianos
identificados (N=92) de leite com mastite nas amostras coletadas (N=78) de propriedades
rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
Antimicrobiano Nº de Resistentes %
Ampicilina 59 64,13
Gentamicina 52 56,52
Cloranfenicol 34 36,96
Vancomicina 30 32,61
Ciprofloxacina 27 29,35
Nitrofurantoína 24 26,09
Oxacilina 22 23,91
Amoxicilina / Ác. Clavulânico 21 22,83
Norfloxacina 18 19,57
Na quarta fazenda visitada 20,83% das vacas lactantes (N=24) apresentavam mastite,
diagnosticada em sete quartos mamários. Sendo os agentes etiológicos mais isolados E. coli
em 45,45% dos casos; e ECN e S. aureus aureus, que foram isoladas em 18,18% das
amostras, respectivamente. Destes agentes identificados, 54,55% foram resistentes a
vancomicina e nitrofurantoína, respectivamente; 36,36% à ampicilina e oxacilina,
simultaneamente; 27,27% à gentamicina; e 9,09% à ciprofloxacino e amoxicilina com ácido
clavulânico. No entanto, nenhum agente isolado apresentou resistência ao cloranfenicol e
norfloxacino.
A última propriedade visitada (P5) no município de Barra Mansa possuía 20% (N=15)
das vacas em ordenha com mastite, sendo diagnosticado em quatro quartos mamários. Os
agentes mais isolados foram Streptococcus spp em 50% das amostras; seguido por ECN e S.
aureus aureus (25%) simultaneamente. No que tange a resistência aos antimicrobianos
testados, 75% das amostras apresentaram resistência ao cloranfenicol e gentamicina,
respectivamente; 50% à ampicilina; e 25% ao mesmo tempo à oxacilina, amoxicilina com
ácido clavulânico e vancomicina. No entanto, nenhum agente isolado nas amostras apresentou
resistência à nitrofurantoína, ciprofloxacino e norfloxacino.
Na primeira propriedade visitada em Resende, que apresentava melhores índices de
higiene do ambiente e da ordenha, observou-se que apenas 6,12% das vacas examinadas
(N=49) apresentavam mastite, ou seja, menor prevalência desta enfermidade dentre todas as
propriedades visitadas. Os agentes isolados, nos seis quartos mamários, mais prevalentes
foram: S. aureus aureus (42,86%); e Staphylococcus schleiferi (28,57%). Dos agentes
identificados, 83,33% apresentaram resistência à ampicilina; 66,67% à oxacilina, vancomicina
e ciprofloxacino, simultaneamente; e 33,33% demonstraram ser resistentes à amoxicilina com
ácido clavulânico, cloranfenicol, gentamicina e norfloxacino, respectivamente. No entanto,
nenhum agente isolado foi resistente a nitrofurantoína.
Na sétima propriedade foi diagnosticada mastite em quatro quartos mamários de 25%
das vacas em linha de ordenha (N=12), nas quais, os agentes mais prevalentes foram: S.
aureus aureus e E. coli (33,33%) respectivamente; e ECN e Streptococcus spp. (16,67%)
respectivamente. No que se refere à resistência destes agentes frente aos antibióticos
avaliados, todos eles foram resistentes à ampicilina; 75% à ciprofloxacina; 50% foram
resistentes, respectivamente, à nitrofurantoína, gentamicina e norfloxacina; e 25% à oxacilina,
amoxicilina com ácido clavulânico, vancomicina e cloranfenicol, simultaneamente.
38
Verificou-se na oitava propriedade, 9,52% das vacas em lactação (N=21) com teste
CMT positivo (três quartos afetados). Os agentes isolados das amostras de mastite foram ECN
(66,66%) e Streptococcus spp (33,33%). Destes agentes, todos foram resistentes à
gentamicina; 66,66% foram resistentes à ampicilina, ciprofloxacina e cloranfenicol,
respectivamente; e 33,33% dos agentes à oxacilina, amoxicilina com ácido clavulânico e
vancomicina. Os antibióticos nitrofurantoína e norfloxacina seriam eficazes no tratamento,
visto que nenhum agente isolado foi resistente aos mesmos.
Na penúltima propriedade visitada (P9), 21,88% do rebanho leiteiro em lactação
positivo para o CMT (N=32) apresentou 11 quartos mamários com mastite. Os agentes
etiológicos mais freqüentes foram S. aureus aureus (27,27%); E. coli e ECN (18,18%)
respectivamente. Destes agentes, verificou-se que 81,82% foram resistentes à gentamicina;
63,64% à cloranfenicol e ampicilina, respectivamente; 27,27% à amoxicilina com ácido
clavulânico, vancomicina, ciprofloxacina e norfloxacina, respectivamente; e 18,18% à
oxacilina e nitrofurantoína, simultaneamente.
Na última propriedade visitada, foi observada a prevalência de 33,33% de mastite no
rebanho em lactação, diagnosticado em 13 quartos mamários. Os agentes etiológicos mais
observados foram S. aureus aureus (38,46%); seguido pelos ECN (30,77%). Quando foi
avaliada a resistência destes agentes aos antimicrobianos testados, foi verificada maior
resistência à gentamicina (76,92%); seguida pela ampicilina com 69,23% de resistência;
cloranfenicol (46,15%); amoxicilina com ácido clavulânico (38,46%); nitrofurantoína
(30,77%); norfloxacina e oxacilina (23,08%) respectivamente e 15,38% dos agentes
apresentaram resistência à vancomicina.
De uma forma geral, verificou-se que os microrganismos mais freqüentes,
identificados a partir das amostras coletadas, pertenciam à família Micrococcaceae (68,48%),
sendo mais freqüentes S. aureus aureus e ECN. A segunda família mais verificada foi a
Enterobacteriaceae (17,40%), onde a espécie mais observada foi E. coli (Tabela 5).
Tabela 5. Prevalência da microbiota bacteriana isolada das amostras coletadas de leite com
mastite das 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
Agente Etiológico
Amostras
N %
Staphylococcus aureus aureus 28 30,43
Estafilococo Coagulase Negativo 25 27,17
Escherichia coli 14 15,22
Streptococcus spp 9 9,78
Staphylococcus intermedius 8 8,70
Bacilo Gram Positivo 3 3,26
Staphylococcus schleiferi 2 2,17
Pseudomonas spp 1 1,09
Proteus mirabilis 1 1,09
Klebsiella oxytoca 1 1,09
TOTAL 92 100
Os dados observados neste estudo coincidem com o observado por outros autores, a
exemplo dos resultados verificados por Moraes et al. (2004), na mesma microrregião do
presente estudo, em que as famílias Micrococcaceae e Enterobacteriaceae foram as mais
freqüentes. Em estudos realizados nos estados de Pernambuco e Piauí por Barbalho e Mota
(2001) e Ferreira et al. (2007), verificou-se, a exemplo do presente estudo, que as espécies da
39
família Micrococcaceae apresentaram maior freqüência, sendo responsáveis pelo maior
número de casos de mastite bovina nas propriedades visitadas.
No levantamento realizado por Barbalho e Mota (2001), as espécies do grupo dos
Staphylococcus coagulase positivo (20,16%) foram as mais observadas, enquanto que Ferreira
et al. (2007) verificaram Staphylococcus spp em 74,60% dos casos no Piauí. Apesar dos
autores não terem realizado a identificação até espécie, estes estudos corroboram os
verificados no presente estudo e por Zecconi e Hahn (2000) e Fagundes (2007), cujo agente
mais freqüente foi S. aureus aureus, espécie do gênero Staphylococcus, que também é
coagulase positiva.
Outro grupo da família Micrococcaceae, os estafilococos coagulase-negativos se
destacaram como agentes etiológicos das mastites na região estudada, corroborando os
resultados obtidos por Pardo et al. (1998), Costa et al. (1999) e Laffranchi et al. (2001).
No que se refere à freqüência de E. coli como agente etiológico das mastites
bacterianas bovinas, os resultados deste estudo se assemelham àqueles obtidos por Bexiga et
al. (2005) e Ferreira et al. (2007) que verificaram prevalências de 7,9% e 10,71%,
respectivamente. No entanto, resultados de outros autores diferem do observado neste
trabalho, onde Barbalho e Motta (2001) não identificaram nenhum caso de mastite em
Pernambuco causado por E. coli. Por outro lado, Shpigel et al. (1998) relataram que 60% dos
casos de mastite em Israel eram causados por E. coli, cuja elevada freqüência pode estar
relacionada a maior concentração de animais, decorrente do manejo adotado neste país, onde
se utiliza principalmente o sistema de livre estabulação (“free stall”).
No presente estudo, foi verificada uma prevalência de apenas 9,78% de casos de
mastite causados por espécies de Streptococcus. Este resultado difere dos estudos de Bexiga
et al. (2005) e Bradley et al. (2007) que observaram uma prevalência de 31,5% e 23,5% de
casos de mastite causados por espécies de Streptococcus em Portugal e no Reino Unido,
respectivamente. Este fato possivelmente ocorre devido a diferenças ecológicas nas regiões
estudadas como também nas características imunológicas nos rebanhos estudados.
Na comparação dos resultados verificados em cada município, observou-se que as
mesmas cinco espécies bacterianas apresentaram maior prevalência. No entanto, como se
pode observar nas Tabelas 6 e 7, a microbiota bacteriana identificada nos referidos municípios
apresenta diferença relacionada às espécies menos freqüentes.
Dentre os agentes com menor prevalência identificados neste estudo, foram
verificadas espécies que eventualmente são isoladas de casos de mastite em bovinos, como
Pseudomonas spp e alguns coliformes, que são agentes oportunistas e têm potencial de causar
mastite, principalmente, em animais imunocomprometidos, como relatado por Jasper et al.
(1975), Todhunter et al. (1990) e Barkema et al. (1998).
Tabela 6. Freqüência dos agentes isolados das amostras de leite com mastite coletadas das
cinco propriedades rurais do município de Barra Mansa, RJ.
Espécie Identificada N %
Staphylococcus aureus aureus 15 28,85
ECN 15 28,85
Escherichia coli 9 17,31
Staphylococcus intermedius 6 11,54
Streptococcus spp 4 7,69
Bacilo Gram Positivo 2 3,85
Pseudomonas spp 1 1,92
TOTAL 52 100
40
Tabela 7. Freqüência dos agentes isolados das amostras de leite com mastite coletadas das
cinco propriedades rurais do município de Resende, RJ.
Espécie Identificada N %
Staphylococcus aureus aureus 13 32,5
ECN 10 25
Escherichia coli 5 12,5
Streptococcus spp 5 12,5
Staphylococcus intermedius 2 5
Staphylococcus schleiferi 2 5
Bacilo Gram Positivo 1 2,5
Klebsiella oxytoca 1 2,5
Proteus mirabilis 1 2,5
TOTAL 40 100
A taxa de infecção por mastite no rebanho leiteiro das propriedades rurais visitadas em
ambos os municípios foi de 20,63%. Quando os municípios foram avaliados separadamente,
foi observado em Barra Mansa que 24,24% dos animais apresentavam mastite bacteriana
bovina, enquanto que em Resende, 17,02% dos animais foram diagnosticados com a
enfermidade. A taxa de infecção observada nos municípios está um pouco abaixo daquela
verificada por outros autores. Ribeiro et al. (2003) observaram 37,69% de vacas com mastite
bacteriana em propriedades localizadas no sul do estado do Rio Grande do Sul. Ferreira et al.
(2007), em Teresina (PI), verificaram que 41,10% dos animais avaliados apresentaram a
enfermidade. Já Laranja e Machado (1994) relataram que em granjas leiteiras do estado de
São Paulo foi observada uma taxa de 50,97% de animais com mastite bacteriana. Esta
diferença possivelmente se deve ao fato das propriedades visitadas no presente estudo
possuírem rebanho de animais sem padrão racial definido e que geralmente são mais rústicos
e resistentes aos agentes causadores de mastite bacteriana bovina, explicando assim uma
menor prevalência nesses municípios (ALMEIDA et al., 2005).
As propriedades que apresentaram mais casos de mastite foram a primeira, terceira,
sétima e décima, nas quais verificaram-se taxas de infecção, nos animais em lactação, iguais
ou superiores a 25%. Nestas propriedades não foi observado um correto manejo higiênico
sanitário na ordenha e a limpeza dos respectivos currais era precária, fatores que contribuem
para que a enfermidade esteja presente numa grande parte do rebanho destas fazendas. Estes
fatores acarretam em prejuízos aos produtores rurais, visto que a mastite acarreta em
diminuição na produção leiteira, gasto para o tratamento e o leite não deve ser utilizado para
consumo humano (BUENO et al., 2002).
A propriedade que apresentou menor índice de mastite no seu rebanho foi a sexta
fazenda visitada, onde se verificou que apenas 6,12% dos animais foram positivos para o teste
CMT. Este fato pode ser explicado pela maior higiene na ordenha e a preocupação do referido
produtor na limpeza do curral, bem como o fornecimento de concentrado após a ordenha
fazendo com que as vacas não deitassem no chão após a mesma. Demonstrando assim que
cuidados higiênico-sanitários são eficazes na prevenção desta enfermidade (DIAS, 2007).
Quando avaliado o número de vacas em lactação e com mastite por propriedade,
verificou-se no município de Barra Mansa que as fazendas possuíam 26,4 vacas lactantes (S=
8,44) e 6,4 animais com mastite em média. Enquanto que as propriedades de Resende
apresentavam 28,2 animais (S=13,81) e 4,8 vacas com mastite em média, ou seja, foi
verificada maior prevalência de mastite no rebanho leiteiro das propriedades visitadas em
Barra Mansa, mesmo possuindo menos animais em lactação, fato que pode ser explicado
pelos menores cuidados com a higiene das instalações nestas propriedades.
41
No que se refere aos escores do teste CMT verificados no presente estudo (Tabela 8),
foi verificado que a maioria dos quartos apresentou escore dois (++) no critério de julgamento
estipulado por Fonseca e Santos (2000). Apesar de autores de outros estudos (LARANJA;
MACHADO, 1994; BEXIGA et al., 1994; FERREIRA et al., 2007) utilizarem metodologia
distinta da utilizada neste estudo, os mesmos também observaram predomínio de mastite
subclínica de grau médio (++), que favorece a disseminação e identificação desta enfermidade
nos rebanhos, pois a produção leiteira não apresenta um decréscimo tão intenso, como
verificado nos escores superiores.
Tabela 8. Freqüência dos escores California Mastit Test das amostras de leite com mastite
coletadas das 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
Escore CMT Quartos Mamários %
- 5 6,41
+ 14 17,95
++ 42 53,85
+++ 17 21,79
TOTAL 78 100
Os quartos mamários mais afetados nos rebanhos estudados foram o anterior direito e
posterior esquerdo, sem, no entanto, ter sido observada grande diferença frente aos demais.
Estes resultados coincidem com aqueles citados por Souto (2006), que verificou distribuição
uniforme de mastite em todos quartos mamários.
Tabela 9. Freqüência dos quartos mamários California Mastit Test-positivos examinados nas
10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
Quarto Mamário com Mastite n %
Anterior Esquerdo 17 21,79
Anterior Direito 21 26,92
Posterior Esquerdo 21 26,92
Posterior Direito 19 24,35
TOTAL 78 100
De acordo com Bueno et al. (2002), o prejuízo com a diminuição da produção leiteira
varia de acordo com o escore do teste CMT. Onde, adaptando-se a metodologia utilizada por
Costa (2000), os escores – ou + (negativo ou uma cruz) representava uma perda na produção
em torno de 14%, o escore ++ (duas cruzes) representavam uma perda de 22% e o escore +++
(três cruzes) representava uma perda aproximada de 36% na produção diária de leite por vaca.
4.3 Avaliação da Microbiota Enterobacteriana em Stomoxys calcitrans
Após o isolamento e identificação das colônias, foi verificado um total de 159 agentes
nos três segmentos das 200 moscas coletadas. Destes, 46 foram isolados a partir do aparelho
bucal, 73 foram observados de culturas da superfície externa e 40 foram verificadas nos
macerados do trato digestório abdominal. Os dados referentes às colônias identificadas a
partir dos três segmentos avaliados e o número de colônias observadas em cada segmento
estão dispostos nas Tabelas 10, 11, 12 e 13 e Figuras 17 e 18, respectivamente.
42
De acordo com os resultados gerais observados, a superfície externa foi o segmento
onde as enterobactérias foram mais freqüentes (45,91%). Em segundo lugar, o aparelho bucal
apresentou 28,93% do total de colônias isoladas, seguido pelo trato digestório abdominal com
25,16% (Figura 18). No que se refere à prevalência de agentes enterobacterianos nos três
segmentos estudados, verificou se que houve diferença significativa entre os mesmos
(p<0,01). Neste estudo, a taxa de infecção das moscas por enterobactérias foi de 56%, onde
112 moscas coletadas apresentaram agentes desta família em algum dos segmentos avaliados.
Estes resultados condizem com o verificado por Castro et al. (2007), confirmando que
a superfície externa é o segmento mais sujeito a apresentar agentes bacterianos devido ao
contato direto com ambientes potencialmente contaminados. Os outros segmentos
possivelmente apresentaram menor quantidade de microrganismos isolados devido a presença
de substâncias secretadas que reduziriam a microbiota nestes segmentos (NAZNI et al., 2005).
43
Figura 17. Número de colônias isoladas nos três segmentos estudados das moscas coletadas
nas 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
Figura 18. Freqüência de isolamento de enterobactérias entre os segmentos da mosca dos
estábulos capturadas nas 10 propriedades rurais dos municípios de Barra Mansa e Resende,
RJ.
45,91%
28,93%
25,16%
Sup. Externa Ap. Bucal Trato Digestório
AP. BUCAL
SUPERFÍCIE
EXTERNA
TRATO
DIGESTÓRIO
28
23
43
18
17
30
0
10
20
30
40
50
BARRA MANSA
RESENDE
44
Tabela 10. Freqüência de enterobactérias nos três segmentos avaliados das moscas coletadas
nos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
AGENTE N FREQÜÊNCIA
Escherichia coli 44 27,67%
Enterobacter agglomerans 20 12,58%
Enterobacter cloacae 18 11,32%
Salmonella spp 12 7,55%
Shigella spp 7 4,40%
Enterobacter amnigenus 5 3,14%
Klebsiella oxytoca 5 3,14%
Serratia odorifera 5 3,14%
Edwardsiella ictaluri 4 2,52%
Morganella morganii 4 2,52%
Proteus mirabilis 4 2,52%
Cedecea lapagei 3 1,89%
Citrobacter diversus 3 1,89%
Enterobacter aerogenes 3 1,89%
Enterobacter sakazakii 3 1,89%
Hafnia alvei 3 1,89%
Proteus spp 2 1,26%
Serratia entomophila 2 1,26%
Serratia ficaria 2 1,26%
Serratia marcescens 2 1,26%
Edwardsiella hoshinae 1 0,63%
Enterobacter spp 1 0,63%
Proteus vulgaris 1 0,63%
Erwinia quercina 1 0,63%
Erwinia stewartii 1 0,63%
Kluyvera spp 1 0,63%
Serratia liquefaciens 1 0,63%
Serratia spp 1 0,63%
TOTAL 159 100%
45
Tabela 11. Freqüência de enterobactérias na superfície externa das moscas coletadas nos
municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
AGENTE N FREQÜÊNCIA
Escherichia coli 23 31,51%
Salmonella spp 9 12,33%
Enterobacter agglomerans 7 9,59%
Enterobacter cloacae 6 8,22%
Klebsiella oxytoca 4 5,48%
Enterobacter aerogenes 3 4,11%
Morganella morganii 3 4,11%
Edwardsiella ictaluri 2 2,74%
Enterobacter sakazakii 2 2,74%
Proteus mirabilis 2 2,74%
Serratia odorifera 2 2,74%
Shiegella spp 2 2,74%
Cedecea lapagei 1 1,37%
Citrobacter diversus 1 1,37%
Enterobacter amnigenus 1 1,37%
Kluyvera spp 1 1,37%
Proteus spp 1 1,37%
Serratia entomophila 1 1,37%
Serratia marcescens 1 1,37%
Serratia spp 1 1,37%
TOTAL 73 100%
Tabela 12. Freqüência de enterobactérias verificadas no aparelho bucal das moscas coletadas
nos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
AGENTE N FREQÜÊNCIA
Escherichia coli 14 30,43%
Enterobacter agglomerans 6 13,04%
Enterobacter cloacae 4 8,70%
Shigella spp 4 8,70%
Proteus mirabilis 2 4,35%
Serratia ficaria 2 4,35%
Serratia odorifera 2 4,35%
Cedecea lapagei 1 2,17%
Citrobacter diversus 1 2,17%
Edwardsiella hoshinae 1 2,17%
Enterobacter spp 1 2,17%
Enterobacter amnigenus 1 2,17%
Enterobacter sakazakii 1 2,17%
Erwinia stewartii 1 2,17%
Hafnia alvei 1 2,17%
Morganella morganii 1 2,17%
Salmonella spp 1 2,17%
Serratia liquefaciens 1 2,17%
Serratia marcescens 1 2,17%
TOTAL 46 100%
46
Tabela 13. Freqüência de enterobactérias verificadas no trato digestório abdominal das
moscas coletadas nos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
AGENTE N FREQÜÊNCIA
Enterobacter cloacae 8 20,00%
Enterobacter agglomerans 7 17,50%
Escherichia coli 7 17,50%
Salmonella spp 3 7,50%
Enterobacter amnigenus 2 5,00%
Edwardsiella ictaluri 2 5,00%
Hafnia alvei 2 5,00%
Cedecea lapagei 1 2,50%
Citrobacter diversus 1 2,50%
Proteus vulgaris 1 2,50%
Erwinia quercina 1 2,50%
Klebsiella oxytoca 1 2,50%
Proteus spp 1 2,50%
Serratia entomophila 1 2,50%
Serratia odorifera 1 2,50%
Shigella spp 1 2,50%
TOTAL 40 100%
4.3.1 Microbiota enterobacteriana em Stomoxys calcitrans no município de Resende
Foi observada uma média de 31,33 (S=10,40) colônias por segmento avaliado, onde a
superfície externa das moscas coletadas nas propriedades rurais visitadas no município
Resende, foi o segmento com o maior número de colônias e também com o maior número de
diferentes espécies de enterobactérias, sendo mais freqüente E. coli (32,56%), seguida por
Salmonella spp (13,95%) e Enterobacter cloacae, Morganella morganii e Klebsiella oxytoca
(6,98%) cada.
O segundo segmento com maior número de colônias e de espécies identificadas foi o
aparelho bucal. Neste segmento foram verificadas 28 colônias que representavam 12
diferentes espécies. As três espécies mais freqüentes foram E. coli (32,14%), seguida por
Enterobacter agglomerans (14,29%) e Shigella spp (10,71%).
O segmento com menor número de colônias e espécies identificadas, foi o trato
digestório abdominal. Nesta região foram observadas 23 colônias, que representavam 10
diferentes espécies de enterobactérias, sendo que as três mais freqüentes foram: E. coli
(26,09%); Enterobacter agglomerans (21,74%); e Enterobacter cloacae (17,39%).
4.3.2 Microbiota enterobacteriana em Stomoxys calcitrans no município de Barra Mansa
De acordo com os dados obtidos, os segmentos avaliados neste município, obtiveram
uma média de 21,66 (S=7,23) colônias. A distribuição da freqüência de enterobactérias nos
segmentos foi semelhante à observada no município de Resende, onde a superfície externa foi
o segmento com maior quantidade de colônias e de espécies identificadas, seguida pelo
aparelho bucal e tubo digestivo abdominal das moscas coletadas, ambas com o mesmo
número de espécies isoladas.
47
Na superfície externa foram isoladas 30 colônias, relacionadas com 13 diferentes
espécies. Neste segmento as três espécies mais freqüentes foram E. coli (30%), Enterobacter
agglomerans (16,67%); Enterobacter cloacae e Salmonella spp. (10%) cada espécie.
Foi verificado o mesmo número de espécies identificadas (11) no aparelho bucal e o
trato digestório abdominal das moscas coletadas nas fazendas visitadas de Barra Mansa. No
entanto, foram isoladas 18 colônias no segmento aparelho bucal, enquanto que no trato
digestório abdominal, foram isoladas 17 colônias.
No aparelho bucal, a espécie mais freqüente foi E. coli (27,78%), seguida por
Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae e Serratia ficaria (11,11%) cada espécie.
Enquanto que no trato digestório abdominal, a espécie mais freqüente foi E. cloacae
(23,53%), Enterobacter amnigenus (17,65%) e E. agglomerans (11,76%).
4.4 Observações da Microbiota Enterobacteriana Identificada
De acordo com os resultados obtidos, foi verificado um total de 28 diferentes espécies
enterobacterianas. Dentre elas, algumas se destacam pelo seu alto potencial patogênico
(KONEMAN et al., 2001), apesar de não terem sido realizadas estudos acerca de sua
patogenicidade no presente estudo. A espécie Escherichia coli, dependendo da linhagem é
capaz de produzir um grande número de enfermidades em humanos e animais, como
distúrbios gastroentéricos, urinários, mastite, dentre outras. Esta espécie já foi anteriormente
descrita em S. calcitrans por diversos autores (CASTRO et al., 2001; ROCHON et al., 2005;
FÖRSTER et al., 2007; CASTRO et al., 2007).
No presente estudo, 52,27% das amostras de E. coli identificadas foram isoladas da
superfície externa das moscas coletadas, 31,82% do aparelho bucal e 15,91% do trato
digestório abdominal. Em algumas situações este agente foi isolado em mais de um segmento
de uma mesma mosca, como observado na Propriedade 8, em que o agente foi isolado nos três
segmentos estudados de uma mesma mosca. De acordo com os resultados, a taxa de infecção
de S. calcitrans por E. coli foi de 19,5% (N=39). Este fato possivelmente se deve à freqüente
presença deste agente em locais onde todas as formas evolutivas da mosca dos estábulos se
fazem presente.
De acordo com Rochon et al. (2004; 2005), E. coli parece ter um papel importante no
desenvolvimento das fases não parasitárias da mosca dos estábulos. De acordo com os
autores, em criações laboratoriais da mosca dos estábulos, meios enriquecidos com E. coli
apresentaram um maior número de adultos emergidos do que naquelas gaiolas entomológicas,
sem meios enriquecidos com E. coli. Os mesmos autores relataram que as moscas emergidas
possuíam o agente em seu tubo digestivo e que o mesmo permanecia vivo. Ainda segundo os
referidos autores, E. coli faz parte da microbiota das formas imaturas da mosca dos estábulos,
favorecendo o desenvolvimento destas formas. Esta observação destaca o papel das moscas
como disseminadora de E. coli para o ambiente.
Outro agente verificado no estudo, E. agglomerans já foi anteriormente isolado na
mosca dos estábulos como relatado por Castro et al. (2007), sendo também isolado por outros
autores em outras moscas (MARCHINI et al., 2002). Algumas estirpes deste agente possuem
potencial patogênico principalmente para plantas, podendo também acometer homens e
animais imunodeprimidos (GONÇALVES et al., 2000).
A espécie E. cloacae observada no presente estudo já foi relatada por Castro et al.
(2007) em seu estudo realizado na mesma microrregião. Oliveira et al. (2000) destacaram que
o referido agente tem sido descrito como causador de doenças nosocomiais e presentes surtos
de infecções hospitalares, apesar de fazer parte da microbiota indígena do tubo digestivo de
aves (MENEZES et al., 2005). Neste estudo o referido agente foi observado em 18 (11,32%)
das 159 colônias isoladas.
48
O gênero Salmonella, observado em 7,55% dos isolados recebe grande destaque na
literatura como agente com grande potencial patogênico (SANTOS et al., 2000; LEE; LEE,
2007). Este gênero foi isolado nos três segmentos avaliados, porém com maior freqüência
(83,33%) na superfície externa. Outros autores também o isolaram em Musca domestica e em
S. calcitrans sem descrever as alterações fisiológicas causadas (STORK, 1979; CASTRO, et
al., 2007; VANSELOW et al., 2007).
Outro agente com destacado potencial patogênico, Shigella spp, foi observado em
7,4% do total de colônias isoladas. Este agente é tido como potencial causador de
enfermidades gastroentéricas, síndromes urêmicas e septicemia (PENATTI et al., 2007;
GAYNOR et al., 2008). No presente estudo, este agente ao contrário do observado com
Salmonella spp, foi mais freqüente (57,14%) no aparelho bucal das moscas coletadas, apesar
de ter sido também isolado na superfície externa e no trato digestório abdominal.
Shigella spp já havia sido observada por Castro et al. (2007) na mosca dos estábulos
do referido estudo. No entanto, alguns autores já haviam descrito o agente em outros
muscídeos (ECHEVERRIA et al., 1983; LEVINE, LEVINE, 1991; KHALIL et al., 1994),
sendo assim, foi demonstrado que as moscas têm importante papel na disseminação deste
agente. Sendo necessário um maior cuidado sanitários nas propriedades a fim de se evitar
enfermidades, principalmente as gastroentéricas, causadas por esta bactéria.
Outro agente observado no estudo, que também é descrito como potencial patógeno, a
espécie Enterobacter amnigenus, que foi identificada em cinco colônias, sendo observado
principalmente no trato digestório abdominal das moscas. Esta bactéria já foi isolada em casos
de mastite bacteriana bovina, infecções hospitalares, sendo considerada muitas vezes como
um agente oportunista (CAPDEVILA et al., 1998; KAGKIL et al., 2007; KORAH et al.,
2007). De acordo com a literatura, esta foi a primeira oportunidade em que E. amnigenus foi
isolado em S. calcitrans. Até então este agente havia sido relatado anteriormente no intestino
de larvas de mosquitos do gênero Anopheles spp (KHAMPANG et al., 1999).
A espécie Klebsiella oxytoca foi verificada no presente estudo em 3,14% das colônias
isoladas, sendo observada na superfície externa (80%) e no tubo digestivo dissecado (20%).
Este agente já foi isolado em casos de mastite bacteriana bovina, otite média, colites
hemorrágica dentre outros (BERTHELOT et al., 2001). Esta bactéria já havia sido descrito em
S. calcitrans anteriormente por Castro et al. (2007). Em outras moscas sinantrópicas, este
agente foi relatado por Sulaiman et al. (2000).
Outro agente verificado em cinco colônias foi Serratia odorifera, que é um agente
comensal observado em plantas e alimentos, porém com relatos de causar pneumonia,
infecções urinárias e septicemia em humanos (MENEZES et al., 2004; LEE et al., 2006). No
presente estudo, este agente foi isolado nos três segmentos estudados, sendo a Propriedade 6
com o maior número de isolamentos (3). Esta espécie ainda não havia sido isolada em S.
calcitrans, apesar de ter sido observada no estudo de Perrucci e Rossi (2002) em Psoroptes
cuniculi, onde o agente foi isolado da superfície externa do ácaro.
Foram identificadas quatro colônias de Edwardsiella ictaluri em duas propriedades do
município de Resende, sendo descrita como patogênica em criações de peixes de água doce,
onde causa septicemia entérica e morte dos peixes, sem muita importância em saúde humana
e para animais domésticos (MCGINNIS et al., 2003). No presente estudo, o agente foi isolado
duas vezes na superfície externa da mosca dos estábulos e duas vezes no trato intestinal
abdominal. O isolamento deste agente nas moscas coletadas possivelmente se deve a presença
de pisciculturas próximas às propriedades visitadas.
A espécie Morganella morganii é encontrado comumente no trato intestinal de
homens e animais e foi descrito como causador de infecções urinarias e oculares, mas sempre
sendo relacionado a infecções hospitalares (FALAGAS et al., 2006). No presente estudo, esta
enterobactéria foi isolada da superfície externa e no aparelho bucal em quatro moscas
49
distintas. Este agente foi descrito no intestino da larva do díptero Helaeomyia petrolei, onde
Kadavy et al. (2000) descreveram o agente em macerado destas moscas. No entanto, nenhum
relato desta espécie em mosca dos estábulos havia sido verificado.
Proteus mirabilis foi identificado em quatro moscas distintas, sendo que em duas em
suas superfícies externas e outras duas no aparelho bucal. No que se refere ao seu potencial
patogênico, esta espécie é descrita causando infecções urinárias, gastro-entéricas e septicemia
e pneumonias em pacientes imunocomprometidos (COHN et al., 2003). Este agente já havia
sido descrito na mosca dos estábulos por Greenberg e Klowden (1972) e Castro et al. (2007),
bem como por outros autores em outras moscas como Lucilla cuprina, Dermatobia hominis,
Cochliomyia hominivorax, dentre outras (ERDMANN et al., 1986; SANCHO et al., 1996;
MORRIS et al., 1997).
Cedecea lapagei, outro agente isolado no estudo não possui potencial patogênico,
como citado por Koneman et al. (2001). Existem poucos relatos na literatura acerca desta
espécie. Brum e Teixeira (1999) relataram alterações patológicas em teleógenas de Boophilus
microplus, em estudos de controle biológico deste ácaro. Hérnandez et al. (2003) descreveram
um caso na Costa Rica de paciente humano com ventriculite causada por este agente. Davis e
Wall (2006) relataram caso de peritonite em paciente humano pós-transplante hepático.
Nenhum infecção por C. lapagei em animais havia sido descrio na literatura. No presente
estudo, C. lapagei foi observado nos três segmentos estudados de três moscas distintas.
A espécie Citrobacter diversus, observada em três isolamentos, foi observada uma vez
em cada segmento avaliado. Este agente é relatado como causador de enteropatias em
humanos e animais e em meningites em humanos neonatos (SORIANO et al., 1991;
KONEMAN et al., 2001). No entanto, este agente é tido como um contaminante ambiental,
estando presente em solos, fezes de aves e mamíferos, dentre outros locais (KONEMAN et
al., 2001). Os únicos relatos desta espécie em muscídeos foram o de Oliveira et al. (2006), que
observaram este agente na superfície externa de M. domestica; e de Castro et al. (2007) que
verificaram o referido agente no aparelho bucal e trato digestório da mosca dos estábulos.
Em outros três isolamentos foi verificada a espécie Enterobacter aerogenes. No
entanto, este agente só foi observado na superfície externa das moscas coletadas. De acordo
com Brooks et al. (2000), este agente é usualmente encontrado no trato intestinal do homem e
de outros mamíferos, não sendo patogênico em indivíduos sadios. No entanto, de acordo com
outros autores o referido agente já foi observado em infecções nosocomiais, infecções
respiratórias e urinárias (KONEMAN et al., 2001). Este agente já foi isolado de alguns outros
dípteros como Lutzomyia longipalpis, M. domestica dentre outros (OLIVEIRA et al., 2001;
NASCIMENTO et al., 2003; FÖRSTERS et al., 2007).
A espécie Enterobacter sakazakii foi isolado em duas oportunidades na superfície
externa e uma vez no aparelho bucal de moscas coletadas. Ray et al. (2007) descreveram o
agente como sendo um importante patógeno para crianças e neonatos. São comuns os estudos
de E. sakazakii em leite e produtos em pó para crianças devido a sua termorresistência (RAY
et al., 2007; ASAKURA et al., 2007). Em medicina veterinária, este agente já foi destacado
como agente causador de mastite bovina (BREEUWER et al., 2003).
Hafnia alvei foi identificado neste estudo em três moscas distintas, sendo que em duas
ocasiões o agente foi isolado do trato digestório abdominal e uma no aparelho bucal. Este
agente faz parte da microbiota indígena do intestino de mamíferos e não tem grande potencial
patogênico, apesar de ter sido citado na literatura como um potencial causador de mastite
bovina (JANDA; ABBOTT, 2006). Este agente já foi isolado em muscídeos, abelhas e
coleópteros (NASCIMENTO et al., 2003; JANDA; ABBOTT, 2006; LUNDGREN et al.,
2007).
Dentre as espécies observadas apenas em dois isolamentos, duas são citadas como
tendo potencial entomopatogênico como Serratia entomophila e S. marcescens (GRIMONT;
50
GRIMONT 1978). O´Callaghan et al. (1996) descreveram o potencial patogênico destas
espécies em Lucilia sericata. No que se refere ao isolamento deste agente em S. calcitrans,
Castro et al. (2007) observaram S. marcescens em macerado de moscas coletadas em um
município vizinho aos visitados neste estudo. Serratia marcescens foi isolado, no presente
estudo, no aparelho bucal e na superfície externa de duas moscas distintas. Romero et al.
(2006) verificaram em seu estudo que as formas imaturas da mosca dos estábulos se
desenvolveram melhor em um meio com S. marcescens do que em um meio estéril,
destacando sua importância no desenvolvimento da mosca dos estábulos, visto que as formas
imaturas dependem deste agente no ambiente para seu desenvolvimento. No presente estudo,
S. entomophila foi observado na superfície externa e no trato digestório abdominal.
Dentre os agentes verificados em apenas um isolamento, apenas Proteus vulgaris tem
potencial patogênico. Brooks et al. (2000) relatam que o referido agente faz parte da
microbiota normal de humanos e animais, solo e carnes cruas, porém pode ser isolado em
infecções urinárias, entéricas e em feridas cortantes. Este agente já foi verificado em alguns
muscídeos como M. domestica e S. calcitrans (NASCIMENTO et al., 2003; MORAES et al.,
2004; CASTRO et al., 2007).
Dos outros agentes observados em apenas um isolamento, todos são considerados
agentes ambientais não patogênicos ou oportunistas para humanos e animais. No entanto,
estes agentes recebem citação como agentes entomopatogênicos, como é o caso de Serratia
liquefaciens, ou fito-patógenos como Erwinia quercina e E. stewartii (DEBOUIX et al., 2005;
YOUNG et al., 2007). Nenhuma descrição destes agentes foi realizada em S. calcitrans, no
entanto, alguns autores os relataram em M. domestica e Lucilia sericata (O´CALLAGHAN et
al., 1996; NAYDUCH et al., 2005).
Algumas espécies observadas no presente estudo não possuem patogenicidade
descrita, como Edwardsiella hoshinae e Kluyvera spp (JANDA et al., 1991; CARTER;
EVANS, 2005), de acordo com estes autores estas espécies são comumente encontradas em
diversos ambientes.
De uma forma geral, uma grande parte das espécies identificadas neste estudo faz
parte da microbiota indígena do tubo digestivo de alguns mamíferos, aves, ou são agentes que
são comumente observados no ambiente. Por outro lado, algumas espécies também possuem
potencial para causar enfermidades em humanos, animais, plantas e insetos, apesar de também
serem observados na natureza. Desta forma, a mosca dos estábulos teria potencial de veicular
estes agentes em decorrência dos hábitos biológicos das formas não parasitárias e dos adultos
ou simplesmente pelo contato com estes agentes no ambiente ou nos indivíduos parasitadas.
Outro fato observado neste estudo foi o isolamento de alguns agentes bacterianos nos três
segmentos avaliados, destacando assim, o papel da mosca dos estábulos como potencial vetor
para algumas espécies de bactérias.
4.5 Associação das Enterobactérias Identificadas nas Moscas Coletadas e no Leite com
Mastite.
De acordo com os resultados obtidos, a única coincidência entre a microbiota de leite e
de moscas foi da espécie E. coli, sendo verificada esta associação nas Propriedades 1, 2, 3 4,
7, 9 e 10, um total de 58 colônias de E. coli. Nenhuma outra espécie enterobacteriana foi
observada simultaneamente na mosca dos estábulos ou nas amostras de leite coletadas de uma
mesma propriedade. Isto possivelmente se deve ao fato de E. coli ser a espécie
enterobacteriana mais importante na mastite bacteriana bovina, como destacado em diversos
estudos (TODHUNTER et al., 1990; LEHTOLAINEN, 2004).
51
A observação de E. coli como sendo a única espécie isolada tanto em leite como em
mosca pode ser explicada pelo fato de ser o agente bacteriano mais comumente presente em
episódios de mastite ambiental bovina.
4.6.Avaliação da Variabilidade Genética das Amostras de Escherichia coli Isoladas.
Para a realização desta etapa do estudo, foram analisados seis iniciadores randômicos
(M13, 1247, 1254, 1253, 1281 e A04) anteriormente utilizados em estudos populacionais de
E. coli (PACHECO et al., 1997; GRIF et al., 1998; REGUA-MANGIA et al., 2004). Após
uma reação para teste dos iniciadores, três destes iniciadores foram selecionados para a
análise de Amplificação Randômica de DNA Polimórfico (RAPD) devido aos perfis
apresentarem poder discriminatório, maior número de bandas, intensidade e alta
reprodutibilidade das bandas, sendo eles os iniciadores A04, 1254 e M13.
Os iniciadores 1247, 1253 e 1281 não se mostraram apropriados para a investigação
da variabilidade genética, apresentando um baixo poder discriminatório, baixo poder de
tipagem, fornecendo produtos de amplificação compostos por um número reduzido de bandas
ou mesmo não detectáveis.
Após o processo de reação de RAPD-PCR e eletroforese em gel de agarose, os perfis
das amostras foram definidos pela intensidade, presença e ausência de bandas. Sendo
considerados diferentes quando, pelo menos, uma banda polimórfica era detectada. Desta
forma, os perfis foram analisados de acordo com os três iniciadores utilizados. A Figura 19
ilustra os perfis eletroforéticos obtidos com os iniciadores selecionados de amostras de E. coli
(Propriedades 1, 2 e 3).
Após análise visual e automatizada (UVIPro bandmap versão 11.9) os perfis foram
organizados de acordo com a diversidade genética e relações de clonalidade entre sub-
populações bacterianas de E. coli.
As reações de amplificação geraram perfis que variaram de quatro a 21 bandas. O
iniciador A 04 gerou perfis que variaram de cinco a 19 bandas, enquanto que o iniciador 1254
apresentou perfis de quatro até 17 bandas e por fim, os perfis gerados pelo iniciador M13
variaram de sete a 21 bandas.
No que se refere ao peso máximo e mínimo das bandas, os iniciadores geraram bandas
de aproximadamente 320 bp até 3500 bp. Não houve correlação entre o conteúdo de C + G
dos iniciadores e a capacidade de detectar perfis polimórficos. As reações com os “primers”
A04 (60%), 1254 (70%) e M13 (66%) geraram respectivamente 49, 49 e 50 perfis distintos
(Tabela 15).
De acordo com os resultados obtidos, o RAPD-PCR foi capaz de realizar a tipificação
de todas as amostras em teste, visto que todas as amostras de E. coli apresentaram bandas nas
reações em que se utilizaram os três iniciadores testados. Sendo assim, o RAPD-PCR
demonstrou possuir efetivo poder discriminatório em relação à E. coli.
Foram observadas similaridade entre os perfis eletroforéticos entre alguns isolados
(Tabela 14). As amostras geneticamente mais relacionadas foram identificadas dos casos de
mastite bacteriana bovina. Os grupos clonais 1.02 e 1.03 representam E. coli isoladas na
Propriedade 1, de duas vacas distintas, o mesmo ocorrendo com a amostra 4.22 que mostrou
perfil eletroforético idêntico das amostras 4.20 e 4.21, que foram isoladas de quartos
mamários diferentes de uma mesma vaca. Além destas amostras, foi observada similaridade
entre as amostras 7.31 e 7.32 (P7); 9.42 e 9.43 (P9). Estas amostras também foram isoladas a
partir de quartos mamários distintos de uma mesma vaca.
A observação de padrões eletroforéticos iguais entre si de amostras bacterianas
isoladas de vacas de uma mesma propriedade sugere a disseminação do referido agente
52
bacteriano no rebanho, fato que possivelmente pode ser explicado pelo precário nível
higiênico-sanitário nas fazendas visitadas. Nestas propriedades era comumente observada a
falta de cuidados na ordenha, não sendo realizada rotina de limpeza prévia dos tetos e
lavagem das mãos dos ordenhadores, o que favorecia a veiculação de agentes. Também não
foi verificada a adoção da estratégia de oferecimento de alimento pós-ordenha com o objetivo
de evitar que os animais se deitem, antes que haja o fechamento do canal galactóforo,
dificultando a ascensão de agentes causadores de mastite aos quartos mamários.
53
Tabela 14. Amostras de Escherichia coli identificadas de leite com mastite e das moscas
coletadas nas propriedades rurais visitadas dos municípios de Barra Mansa e Resende, RJ.
(Continua).
Amostra
Propriedade
Fonte
Local
Perfis eletroforéticos
Vaca Mosca
1254 A04 M13
2 I 3 Posterior Esquerdo 1 1 1
3 I 5 Anterior Direito 1 1 1
4 I 4 Superfície Externa 2 2 2
5 I 18 Superfície Externa 3 3 3
6 II 12 Posterior Esquerdo 4 4 4
7 II 3 Superfície Externa 5 5 5
8 II 9 Superfície Externa 6 6 6
9 II 16 Aparelho Bucal 7 7 7
10 III 16 Posterior Direito 8 8 8
11 III 10 Superfície Externa 9 9 9
12 III 12 Superfície Externa 10 10 10
13 V 2 Aparelho Bucal 11 11 11
14 V 13 Superfície Externa 12 12 12
15 V 13 Aparelho Bucal 13 13 13
16 V 19 Trato Digestório Abdominal 13 13 13
17 V 19 Aparelho Bucal 14 14 14
19 IV 24 Anterior Direito 15 15 15
20 IV 24 Posterior Direito 16 16 16
21 IV 26 Posterior Esquerdo 16 16 16
22 IV 27 Anterior Esquerdo 16 16 16
23 IV 28 Posterior Direito 17 17 17
24 IV 1 Superfície Externa 18 18 18
25 IV 8 Aparelho Bucal 19 19 19
26 IV 16 Superfície Externa 20 20 20
28 VI 2 Trato Digestório Abdominal 21 21 21
29 VI 7 Trato Digestório Abdominal 22 22 22
30 VI 14 Superfície Externa 23 23 23
31 VII 37 Anterior Direito 24 24 24
32 VII 37 Posterior Esquerdo 24 24 24
33 VII 10 Superfície Externa 25 25 25
34 VII 12 Aparelho Bucal 26 26 26
35 VII 14 Superfície Externa 27 27 27
36 VII 19 Aparelho Bucal 28 28 28
37 VII 19 Superfície Externa 28 28 29
38 VIII 14 Superfície Externa 29 29 30
39 VIII 14 Aparelho Bucal 29 30 31
40 VIII 14 Trato Digestório Abdominal 30 30 31
41 VIII 20 Superfície Externa 30 30 31
42 IX 43 Anterior Esquerdo 31 31 32
43 IX 43 Anterior Direito 31 31 32
44 IX 4 Superfície Externa 32 32 33
45 IX 14 Aparelho Bucal 33 33 34
46 IX 20 Aparelho Bucal 34 34 35
54
Tabela 14. Continuação
Amostra
Propriedade
Fonte
Local
Perfis eletroforéticos
Vaca Mosca
1254 A04 M13
48 1X 49 Anterior Esquerdo 35 35 36
49 X 2 Trato Digestório Abdominal 36 36 37
50 X 3 Aparelho Bucal 37 37 38
51 X 5 Superfície Externa 38 38 39
52 X 6 Aparelho Bucal 39 39 40
53 X 7 Aparelho Bucal 40 40 41
54 X 7 Trato Digestório Abdominal 41 41 42
55 X 9 Aparelho Bucal 42 42 43
56 X 10 Superfície Externa 43 43 44
57 X 11 Superfície Externa 44 44 45
58 X 13 Superfície Externa 45 45 46
59 X 15 Superfície Externa 46 46 47
60 X 17 Superfície Externa 47 47 48
61 X 19 Trato Digestório Abdominal 48 48 49
62 X 20 Superfície Externa 49 49 50
Iniciador 1254 Iniciador M13 Iniciador A04
Figura 19. Perfis eletroforéticos de amostras de Escherichia coli identificadas no estudo,
obtidos pelos iniciadores 1254, M13 e A04 pela Amplificação Randômica de DNA
Polimórfica (RAPD-PCR); onde PM se localiza o peso molecular de 1 Kb; colunas 2-5
amostras coletadas na Propriedade 1; colunas 6-9 amostras da Propriedade 2; colunas 10-12
amostras Propriedade 3. No lado esquerdo, peso dos fragmentos do Peso Molecular.
PM 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PM 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PM
2
3 4 5 6 7 8 9
10
11
12
PM
(pb)
3.054
2.086
500
55
Também foram observados perfis eletroforéticos iguais entre si em amostras isoladas
de diferentes segmentos de uma mesma de moscas e de moscas distintas Tabela 14.
Apenas ao utilizar o iniciador 1254, foi possível obter perfis eletroforéticos iguais
entre si de isolados de moscas distintas, onde neste caso, as colônias foram isoladas da
superfície externa. Isto possivelmente se deve a presença do agente nos ambientes utilizados
pela mosca dos estábulos para o desenvolvimento de suas formas não parasitárias.
As Figuras 20, 21 e 22 representam os dendrogramas obtidos com os iniciadores 1254,
A04 e M13, fazendo referência à tabela 14. Os referidos dendrogramas foram obtidos com
base na análise de agrupamento (UPGMA) de estimativa de similaridade genética
(Coeficiente de Jaccard) por RAPD entre os as amostras de E. coli isoladas dos segmentos da
mosca dos estábulos e leite com mastite.
De acordo com os resultados, foi verificado que, dentre as amostras de E. coli obtidas
de leite, todas que possuíam perfis eletroforéticos iguais entre si eram provenientes de
propriedades rurais que compartilhavam determinadas características, tais como ordenha
manual, manejo higiênico-sanitário precário e na maioria das vezes a ordenha era realizada
em currais com piso de terra batida. Desta forma, os resultados sugerem que ambientes e
manejos de ordenha com níveis precários de higiene predispõe à disseminação de agentes
entre os animais do rebanho.
Por outro lado, alguns outros fatores não influenciaram na distribuição do perfil
eletroforético, tais como presença de substratos que favorecem o desenvolvimento da mosca
dos estábulos; suplementação alimentar pós-ordenha e atipia bioquímica.
Com relação aos perfis eletroforéticos verificados, foi observado que amostras obtidas
de casos de mastite sub-clínica eram geneticamente mais relacionadas comparado com a única
amostra de mastite clínica causada por E. coli, sugerindo assim, uma diferença genética dentre
as E. coli causadoras de mastite clínica e sub-clínica (Figura 23).
No que se refere às amostras obtidas de segmentos da mosca dos estábulos, foi
verificada uma grande diversidade de perfis eletroforéticos, sugerindo que tratavam-se de
amostras adquiridas do ambiente, e não de situações patogênicas, visto que as amostras
geneticamente mais relacionadas foram detectadas em propriedades rurais sem nenhuma
característica especial, apenas fazendas sem um manejo higiênico-sanitário ideal.
De acordo com os resultados, a diversidade genética detectada na população estudada,
sugere que as amostras de E. coli, isoladas de amostras de leite com mastite e de segmentos da
56
Dendrograma com coeficiente de homologia 1,0% (UPGMA)
Figura 20. Dendrograma gerado pelo iniciador 1254 das amostras de Escherichia coli
isoladas de amostras de mosca dos estábulos e de leite com mastite.
57
Dendrograma com coeficiente de homologia 1,0% (UPGMA)
Figura 21. Dendrograma gerado pelo iniciador A04 das amostras de Escherichia coli isoladas
de amostras de mosca dos estábulos e de leite com mastite.
58
Dendrograma com coeficiente de homologia 1,0% (UPGMA)
Figura 22. Dendrograma gerado pelo iniciador M13 das amostras de Escherichia coli
isoladas de amostras de mosca dos estábulos e de leite com mastite.
59
1254
A04
M13
2
3
6
10
20
21
22
23
20
21
23
42
43
19
48
31
32
22
2
3
10
48
6
42
43
31
32
19
2
3
10
31
32
42
43
6
21
22
23
20
48
19
Figura 23. Dendrograma das amostras de Escherichia coli isoladas de leite das propriedades
visitadas, frente aos diferentes iniciadores, sendo a amostra 19 a única referente à mastite
clínica.
60
mosca dos estábulos, constituem uma população bacteriana de origem não clonal. Esta
diversidade foi esperada, uma vez que dispersos na comunidade, estes microrganismos são
submetidos a condições adversas e não a situações epidemiológicas particulares, visto que não
houve compartilhamento de perfis eletroforéticos entre as propriedades rurais, e tampouco
entre os municípios visitados.
Este é o primeiro estudo em que é feito uma avaliação da correlação entre sub-
populações de E. coli isoladas de leite com mastite e moscas. Em estudos similares, alguns
autores relatavam que os muscídeos eram vetores de determinado agente patogênico quando
observava similaridade nos isolados da mosca e do leite. No entanto, não foi realizado
nenhum estudo onde ferramentas moleculares eram utilizadas para averiguação da real
clonalidade destas subpopulações. Sendo desta forma, premeditado afirmar que a mosca dos
estábulos, ou outro muscídeo, foi responsável pela transmissão de algum agente patogênico.
4.7 Incidência de Escherichia coli Shiga-Toxigênica (STEC) em Stomoxys calcitrans e
Leite com Mastite.
Todos os isolados de E. coli foram submetidos à Reação de Polimerase em Cadeia –
Multiplex (Multiplex-PCR) para detectar os genes stx1, stx2 e eae. Com relação aos casos de
mastite causados por E. coli, 14,28% eram STEC, enquanto que nas colônias de E. coli
isoladas das moscas dos estábulos coletadas, 13,63% eram STEC.
Das STEC isoladas do leite, só foram observadas amostras stx1 positivos. Enquanto
que das STEC observadas em S. calcitrans uma amostra (16,66%) era stx1 positiva, quatro
(66,66%) eram stx1 e stx2 positiva, e apenas uma (16,66%) apresentava os genes stx 1, stx 2 e
eae (Figura 24).
61
Figura 24. Gel de Agarose com as amostras STEC positivas, onde a coluna 1 representa o
Peso Molecular (100 bp); 2: amostra padrão E40705 (stx1 e eae +); 3: amostra padrão E30121
(stx2 e eae +); 4: Amostra 5.14; 5: Amostra 5.17; 6: Amostra 6.28; 7: Amostra 6.29; 8:
Amostra 6.30; 9: Amostra 7.31; 10: Amostra 7.32; 11: Amostra 7.40.
1
2
4
3
5
6
7
8
9
10
11
PM
(pb)
800
600
400
300
stx2
eae
stx1
62
Os resultados obtidos nas amostras de leite confirmam o observado por Lira et al.
(2004), onde estes autores verificaram uma incidência de 12,08% de STEC nas amostras de
leite com mastite cujo agente etiológico era E. coli. No entanto, os mesmos autores relataram
uma ocorrência maior de genes associados às STEC, onde metade de suas amostras
apresentaram o gene eae, enquanto que no presente estudo nenhumas das duas amostras
apresentaram o referido gene. Este fato pode ser explicado pela maior quantidade de amostras
de E. coli avaliadas por Lira et al. (2004), pois a taxa de incidência de STEC nas amostras de
leite foi similar. As STEC observadas no presente estudo, que foram obtidos de quartos
mamários distintos de uma mesma vaca, de acordo com o estudo molecular, são organismos
com mesmo perfil eletroforético.
Das seis amostras onde foram detectados os genes de virulência na mosca dos
estábulos, 50% destas foram observadas na superfície externa das moscas coletadas, 33,33%
do conteúdo intestinal e apenas uma amostra (16,67%) foi isolada do aparelho bucal. Desta
forma, pode-se constatar que a mosca dos estábulos tem a capacidade de veicular STEC nos
três segmentos avaliados, visto que foram obtidas colônias viáveis da superfície externa,
principalmente, do aparelho bucal e do trato digestório abdominal. Keen et al. (2006) já
haviam relatado a presença de STEC em diversos muscídeos, inclusive S. calcitrans. No
entanto, ainda não havia sido descrito a capacidade da referida mosca na veiculação deste tipo
de E. coli no Brasil.
De acordo com os resultados, foi verificado que a maior parte das amostras carreava o
gene stx2, fato que aumenta a importância das políticas de vigilância epidemiológica, devido
ao seu alto potencial patogênico como descrito por Aktories e Just (2000).
Sendo assim, pode-se destacar a capacidade da mosca dos estábulos na possibilidade
de contaminação de alimentos utilizados por homens e animais por este agente, visto que este
muscídeo utiliza compostos orgânicos para oviposição, bem como os cochos e baias, para
descanso entre as alimentações, utilizadas pelos animais, onde geralmente a mosca defeca.
Outro fato observado neste estudo foi o isolamento de STEC no aparelho bucal de uma
das moscas coletadas. Este fato destaca o potencial da mosca dos estábulos na possibilidade
de transmissão deste agente ao picar seus hospedeiros, transferindo o agente no momento da
picada ou na regurgitação durante a sua alimentação.
Estes resultados são importantes para ressaltar o papel da mosca dos estábulos na
veiculação de agentes com grande potencial patogênico e ressaltar a importância no seu
controle, a fim de se diminuir a possibilidade de transmissão de E. coli diarreiogênicas à
população em locais com baixos níveis sanitários, como nas localidades visitadas. Sendo
importante ressaltar que as doenças intestinais foram a maior causa de mortes no Brasil em
2005 (MS, 2005).
4.8. Considerações Finais
De acordo com os resultados observados neste estudo, foi possível verificar que a
mastite bacteriana bovina é prevalente em propriedades rurais leiteiras da Microrregião do
Vale do Paraíba Fluminense, onde a taxa de infecção média foi de 20,63%. Este fato é
preocupante, visto que nesta região se concentra a maior bacia leiteira do estado, que abastece
de leite o estado do Rio de Janeiro.
Outro ponto de que deve ser destacado foi a resistência antimicrobiana verificada nas
espécies isoladas das amostras de leite. Foi verificado que os produtores rurais faziam o
tratamento de forma equivocada, muitas vezes usando subdoses de antibióticos e não
63
observando o tempo correto de administração para o tratamento das vacas. Este fato poderia
ser corrigido com assistência médico-veterinária.
A mosca dos estábulos estava presente nos dois municípios visitados, e
provavelmente devido a sua similaridade com M. domestica, alguns produtores não percebiam
a presença de S. calcitrans em suas propriedades. Em algumas propriedades esta mosca se
fazia presente em grande número em decorrência do uso de substratos que favoreciam seu
desenvolvimento e de outras moscas, como cama de frango, palha de café, cevada, dentre
outros.
No presente estudo, foram isolados agentes bacterianos potencialmente patogênicos
nos três segmentos dos exemplares de S. calcitrans, onde se destacam Salmonella spp,
Shigella spp e Escherichia coli. No que se refere a E. coli, foi verificado nas moscas coletadas
a presença de E. coli Shiga-Toxigênicas.
Este estudo tem grande importância, principalmente, no que se refere à Vigilância
Sanitária de produtos alimentícios, visto que é de certa forma comum o consumo de leite
recém ordenhado pelos trabalhadores rurais, bem como a venda informal do leite de algumas
das propriedades visitadas em mercados vizinhos a essas fazendas, aumentando a
possibilidade de ingestão de agentes patogênicos no consumo destes produtos sem o prévio
tratamento térmico.
Em uma das propriedades visitadas, a primeira no município de Resende, foi
verificado um manejo higiênico-sanitário correto na ordenha e limpeza constante das
instalações. Apesar disso, foi observado acúmulo de palha de café ao lado do curral. Este fato
foi relatado ao proprietário que solicitou sua retirada. Na ocasião da entrega do relatório ao
produtor, foi verificado que após a retirada da palha de café, o número de moscas nesta
fazenda diminuiu consideravelmente.
Neste estudo, foram identificadas espécies bacterianas com potencial
entomopatogênico nos três segmentos das moscas avaliadas. Sendo assim, faz-se necessário a
realização de estudos sobre o real potencial patogênico destes agentes para S. calcitrans, bem
como estudos que visem o controle biológico da mosca dos estábulos com o uso destas
bactérias entomopatogênicas.
Nas propriedades visitadas dos dois municípios, o apoio técnico era feito de forma
precária, onde a maioria destas propriedades não recebia assistência médico-veterinária
constante, sendo assistida eventualmente pelos extensionistas da EMATER-RIO. Uma melhor
assistência técnica poderia orientar os produtores quanto ao correto manejo higiênico-
sanitário nas propriedades, tratamento criterioso dos animais e retirada de substratos que
favorecem o desenvolvimento de ecto e endoparasitos; o que auxiliaria os produtores no
controle da mastite bovina, como também de outras enfermidades do rebanho, bem como no
controle de parasitoses. Com a aplicação destas medidas a produtividade dos rebanhos
aumentaria, bem como a renda do produtor rural que cada vez mais seria estimulado a
produzir alimentos seguros e de melhor qualidade à população de uma forma geral.
Os resultados obtidos contribuem para o esclarecimento dos aspectos bio-genéticos-
epidemiológicos dos patógenos em estudo e são importantes para subsidiar ações de
monitoramento e controle destas infecções no âmbito da economia e da saúde pública.
64
5 CONCLUSÕES
1. Os resultados obtidos a partir do estudo da prevalência de mastite bovina e a
microbiota bacteriana são compatíveis com investigações prévias em outras regiões do
país e são de relevância e aplicabilidade, considerando, a limitação destas
informações.
2. A atividade produtora leiteira no rebanho bovino da Microrregião do Vale do Paraíba
Fluminense carece de intensificação de melhores práticas de manejo, higiene e
profissionalização de pessoal envolvido, por meio de um programa de controle da
enfermidade mais eficiente.
3. A mosca dos estábulos possui a capacidade de carrear agentes enterobacterianos nos
três segmentos avaliados, sendo a superfície externa o segmento com o maior número
de espécies identificadas.
4. A espécie Escherichia coli foi a mais freqüente dentre a microbiota identificada nos
segmentos avaliados da mosca dos estábulos, sendo a única espécie em que foi
observada coincidência de isolamento entre as amostras de leite e de mosca.
5. A investigação das relações de clonalidade entre subpopulações de E. coli permitiu
detectar uma identidade genética mais estreita entre amostras epidemiologicamente
mais relacionadas, sugerindo que a mosca dos estábulos não tem a capacidade de
disseminação de E. coli causadores de mastite bovina entre propriedades e vacas de
um mesmo rebanho.
6. A detecção de amostras de Escherichia coli carreadoras dos marcadores genéticos
codificadores dos genes stx e eae a partir do leite com mastite e nos três segmentos da
mosca dos estábulos, possibilitou confirmar a potencialidade destes vetores na
disseminação agentes bacterianos com reconhecida virulência, circulantes no
ambiente, alertando para a necessidade de vigilância sanitária e epidemiológica
efetivas.
65
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AKTORIES, K.; JUST, F. Bacterial Protein Toxins. Springer, 2000. 7000 p.
ALMEIDA, L.A.B.; BRITO, M.A.V.P.; BRITO, J.R.F.; PIRES, M.F.A.; BENITES, N.R.
Tratamento de mastite clínica experimental por meio de ordenhas múltiplas em vacas leiteiras
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ANDERSON, J. F.; FROST, W. H. Transmission of poliomyelitis by mean of the stable fly
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GREENBERG, B. Flies and diseases. Vol II: Biology and diseases transmission. Princeton:
Princeton University Press, 1973, 447 p.
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