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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS
NATHALIE KIRA TAMURA
Aderência, invasão e formação de biofilme de uma amostra de
Fusarium oxysporum isolada de úlcera de córnea
MARINGÁ – PR
2008
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NATHALIE KIRA TAMURA
Aderência, invasão e formação de biofilme de uma amostra de
Fusarium oxysporum isolada de úlcera de córnea
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Análises Clínicas da
Universidade Estadual de Maringá, como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Análises Clínicas.
Orientadora:
Profa. Dra. Terezinha Inez Estivalet Svidzinski
MARINGÁ – PR
2008
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CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
Os fungos do gênero Fusarium são encontrados em várias partes do mundo,
ocorrendo predominantemente em regiões de clima tropical. Essa ampla distribuição
geográfica pode ser atribuída a sua capacidade de adaptação em diferentes
ambientes e seu eficiente mecanismo de dispersão. Saprófitas de solo e plantas
vêm assumindo importância como causa de doenças em humanos (DIGNANI e
ANAISSIE, 2004).
São fungos filamentosos hialinos, apresentam micélio abundante e
cotonoso, freqüentemente colorido em rosa, púrpuro ou amarelo. Possuem hifas
hialinas septadas, conidióforos variáveis e conídios em duas formas: macroconídios
septados, fusiformes e encurvados apresentando as extremidades afiladas e
microconídios unicelulares ovóides ou oblongos, sendo comum a presença de
clamidoconídios (NELSON et al, 1994; LACAZ et al, 1998).
O gênero Fusarium apresenta mais de 30 espécies descritas, sendo F.
oxysporum, F. solani, F. moliniforme, F. proliferatum e F. dimerum as de maior
importância médica (LACAZ et al, 1998).
Espécies do gênero Fusarium são patógenos para um grande número de
plantas, invadem sementes e outros tecidos vegetais provocando uma série de
alterações e sintomas que afetam a produção, além disso, esses fungos são
capazes de produzir toxinas durante o seu metabolismo que contaminam cereais
como o milho, amendoim, trigo, entre outros, ocasionando importantes problemas
em quase todas as fases da comercialização dos produtos, causando prejuízos
econômicos ao setor agrícola (BHAT e VASANTHI, 1999). As micotoxicoses são
ocasionadas pela ingestão de alimentos ou ração contaminados com micotoxinas,
pela inalação destas em forma de partículas suspensas ou ainda pelo contato com a
pele constituindo um risco para a saúde humana e animal (BENNET et al, 2003;
BANDO et al, 2007).
Um significativo número de fungos do solo e parasitas de plantas possui
potencial de virulência latente, podendo causar infecções oportunistas em humanos
que se manifestam quando esses microrganismos são introduzidos em hospedeiros
imunologicamente comprometidos (LACAZ et al, 2002; NUCCI et al, 2003) ou não
(NUCCI e ANAISSIE, 2002). Fusarium, patógeno emergente em humanos,
representa o segundo fungo mais freqüente em infecções invasivas em pacientes
imunocomprometidos (WALSH e GROLL, 1999). Em indivíduos imunocompetentes
causam infecções localizadas, sendo citadas ceratites (DIGNANI e ANAISSIE,
2004), lesões cutâneas (NUCCI e ANAISSIE, 2002) e onicomicoses
(GUILHERMETTI et al, 2007). F. oxysporum, junto a F. solani e F. verticillioides são
as espécies mais freqüentemente relatadas como patógenas em humanos.
(DIGNANI e ANAISSIE, 2004).
1.2 Ceratites
Ceratite é uma lesão que acomete a córnea, importante componente do
sistema refrativo do olho que confere proteção as demais estruturas oculares, e é
considerada importante causa de morbidade em todo o mundo (SHARMA, 2001). Os
sintomas são dor e hiperemia ocular, lacrimejamento, fotofobia, visão reduzida,
enturvação e ulceração da córnea. É necessária a instituição de tratamento rápido e
adequado, pois a ceratite ulcerativa pode levar a diminuição ou perda total da visão
(THOMAS, 1994).
De acordo com SHARMA (2001) as ceratites podem ser classificadas em
Não ulcerativas, podendo apresentar caráter superficial ou estromal e Ulcerativas
que podem ser de causa infecciosa ou não infecciosa. A ceratite ulcerativa
infecciosa pode ser causada por fungos, bactérias, vírus ou parasitas.
Mais de 70 espécies de fungos, representando 40 gêneros já foram
reportadas como causa de infecções da córnea (THOMAS, 1994). Uma vez
considerada uma doença rara, nas últimas décadas vêm crescendo em importância
e freqüência, a incidência mundial de ceratites fúngicas varia de 6 a 53% de todas
as ceratites ulcerativas de acordo com a região (THOMAS, 1994). Alguns fatores
podem estar associados com esse aumento tais como uso freqüente de antibióticos,
corticosteróides e imunossupressores; aumento do número de acidentes envolvendo
o globo ocular, doenças e cirurgias oculares; doenças imunossupressoras e avanços
nas técnicas de diagnóstico (BELFORT JÚNIOR e KARA-JOSÉ,1996).
A freqüência de determinada espécie de fungo é bastante variável e sofre
influência das condições climáticas da região. As ceratites causadas por fungos
filamentosos parecem ocorrer mais comumente em regiões tropicais, com clima
quente (GOPINATHAN et al, 2002) em contraste com regiões de clima temperado
onde os relatos são escassos (TANURE et al, 2000; DOCZI et al, 2004). A atividade
econômica da população também exerce importante papel, há relatos de maior
ocorrência da doença em homens jovens e saudáveis que executam atividades
agrícolas (XIE et al, 2001; GOPINATHAN et al, 2002), pois estes estariam mais
expostos a traumas causados por plantas ou material orgânico proveniente do solo,
podendo nesta situação ocorrer a introdução do fungo dentro da córnea e/ou tecidos
adjacentes resultando na úlcera.
Espécies do gênero Fusarium destacam-se como as mais frequentes causas
de ceratites fúngicas em humanos em várias partes do mundo (ROSA et al, 1994;
XIE et al, 2001; BHARATHI et al, 2002; GOPINATHAN et al, 2002). No Brasil, país
com grande extensão territorial e que tem na agricultura uma de suas maiores fontes
de riqueza, o número de casos de infecções oculares fúngicas vem crescendo,
embora não haja estatísticas disponíveis a respeito (LACAZ et al, 2002).
CARVALHO et al (2001) estudando a ceratite fúngica no Paraná-Brasil, analisaram
49 pacientes entre 1983 e 1997 e verificaram que os agentes mais freqüentes foram
Fusarium sp (32%), Aspergillus sp (16%), Penicillium sp (10%) e Candida sp (4%).
Estudos realizados em outras regiões do país encontraram resultados semelhantes
(SALERA et al, 2002; Höfling-Lima et al, 2005).
1.3 Patogênese
A infecção ocular fúngica ocorre pela interação entre a virulência do fungo, a
capacidade de reação do hospedeiro e outros fatores.
1.3.1 Fatores relacionados ao fungo
A patogenicidade ou virulência de um microrganismo está relacionada com a
sua capacidade de causar a doença, sendo esta mediada por um conjunto de
fatores que estimulam diferentes respostas do hospedeiro (VERONESI e
FOCACCIA, 2004). Apesar de certos aspectos da virulência serem determinados
geneticamente, em princípio são expressos pelos microrganismos em situação de
desafio ou quando expostos a condições favoráveis (teor nutricional, atmosfera de
O
2
e temperatura).
Vários fatores estão envolvidos nesse sentido:
Aderência
A capacidade dos microrganismos em aderir a células, tecidos ou outras
superfícies é um pré-requisito para o inicio do processo de colonização e
subseqüente infecção, desta forma a adesão assume um papel fundamental no
início do processo de infecção (SEGAL et al, 1988; PANAGODA e
SAMARANAYAKE, 1998). Microrganismos não invasivos permanecem aderidos a
superfície celular do hospedeiro, enquanto outros utilizam esta adesão como a
primeira etapa para a invasão tecidual. A aderência representa o primeiro contato na
interação parasita-hospedeiro e compreende um conjunto de mecanismos
envolvendo vários componentes do microrganismo e as características da superfície
na qual ocorre a adesão (GHANNOUM e RADWAN, 1990).
Um microrganismo pode expressar um ou mais tipos de adesinas que são
responsáveis pelo reconhecimento e ligação aos receptores específicos localizados
na superfície das células do hospedeiro contribuindo no processo de adesão (SOTO
e HULTGREN, 1999). Outros fatores que estariam envolvidos na adesão são a
hidrofobicidade e interações eletrostáticas (DOYLE e ROSENBERG, 1990;
GHANNOUM e RADWAN, 1990).
Devido à importância da aderência, alguns estudos têm sido desenvolvidos
para quantificar e caracterizar a aderência de espécies de fungos a superfícies
celulares e inanimadas (SIONOV et al, 2001, JABRA-RIZKI et al, 2001; TAMURA et
al, 2003; TAMURA et al, 2007; CAMACHO et al, 2007). A habilidade de espécies de
Fusarium em aderir também tem sido estudada, MACNEELY et al (1981) foram os
primeiros a demonstrar, por microscopia eletrônica, que espécies de Fusarium
invadem a parede de cateteres de diálise peritoneal. Outros estudos em laboratório
têm confirmado a habilidade deste fungo em aderir, penetrar e proliferar no interior
de lentes de contato (SIMMONS et al, 1986; AHEARN et al, 2007).
Biofilme
A aderência de um microrganismo pode ser avaliada pelo estudo da sua
capacidade de formar biofilme. Segundo DONLAN e COSTERTON (2002), biofilme
pode ser definido como uma comunidade microbiana organizada, caracterizada por
células que formam microcolônias que estão irreversivelmente aderidas entre si e a
um substrato e embebidas em uma matriz de substâncias extracelulares.
Estudos sugerem que nos biofilmes ocorre uma comunicação dos
microrganismos entre si e com as células dos hospedeiros através da liberação de
moléculas sinalizadoras conhecidas como “quorum-sensing”, as quais são
essenciais para sua formação e manutenção (RAMAGE et al, 2002).
Os microrganismos organizados em biofilme expressam propriedades
distintas daqueles na forma planctônica (MAH e O’TOOLE, 2001). A natureza
estrutural do biofilme e as características fisiológicas das células que o constituem
conferem uma maior resistência aos agentes antimicrobianos (DONLAN e
COSTERTON, 2002). Os mecanismos responsáveis pela resistência aos
antimicrobianos podem estar relacionados à limitação da difusão do agente pela
matriz extracelular, alteração na taxa de crescimento do microrganismo e alterações
genéticas (MAH e O’TOOLE, 2001; DONLAN e COSTERTON, 2002; DUNNE, 2002).
A formação de biofilme sobre os dispositivos médicos invasivos tem sido
motivo de preocupação, pois uma vez estabelecido o biofilme há o aumento do risco
de desenvolvimento de infecções, já que ele funciona como um reservatório de
microrganismos e está associado a altos níveis de resistência aos agentes
antimicrobianos (DUNNE, 2002).
Capacidade de invasão
A habilidade do fungo em invadir tecidos humanos é um fator determinante
na sua virulência. Essa capacidade é auxiliada por certas propriedades tais como
aderência, produção de enzimas, sobrevivência em ambientes com elevada
temperatura e baixa tensão de oxigênio e evasão dos mecanismos de defesa do
hospedeiro (THOMAS, 1994). VEMUGANTI et al (2002) realizaram um estudo
histológico de botões corneanos obtidos de pacientes com ceratite fúngica
submetidos a transplante. Os resultados demonstraram marcada invasão tecidual
por hifas fúngicas com reduzida reação inflamatória nas fases iniciais da doença
sendo que, os principais agentes envolvidos eram Fusarium spp. e Aspergillus spp.
Espécies de Fusarium têm sido associadas com a ocorrência de complicações nos
casos de ceratites, enfatizando a virulência deste fungo sobre a córnea. O fungo
pode invadir a câmara anterior e crescer de forma a interferir na drenagem do humor
aquoso resultando no aumento da pressão intraocular (KURIAKOSE e THOMAS,
1991).
1.3.2 Fatores predisponentes do hospedeiro
O resultado da relação entre o parasita e o hospedeiro depende do balanço
entre a virulência do microrganismo e as defesas do hospedeiro. Defeitos pré-
existentes nos mecanismos de defesa, de natureza local ou sistêmica podem ser
considerados fatores predisponentes ao desenvolvimento de ceratites fúngicas. O
epitélio corneano intacto constitui uma eficiente barreira para a maioria das
infecções oculares fúngicas, porém algumas situações tais como, síndrome dos
olhos secos, ulcerações crônicas, cirurgias oculares entre outros, levam a alterações
da superfície ocular permitindo o acesso do fungo aos tecidos corneanos (THOMAS,
1994; KLOTZ et al, 2000; GOPINATHAN et al, 2002; THOMAS, 2003) principalmente
por leveduras e fungos filamentosos de baixa virulência (THOMAS, 1994).
Doenças sistêmicas como Diabetes mellitus, hanseníase e outras condições
que levam a imunossupressão também são consideradas fatores de risco (ROSA et
al, 1994; GOPINATHAN et al, 2002). Em um estudo na Tanzania foi demonstrado
que de 32 pacientes apresentando ceratite fúngica, 26 (81,25%) eram HIV positivo
comparado a 33% no grupo de pacientes com ceratite não-fúngica (MSELLE, 1999).
1.3.3 Outros fatores
O trauma ocular tem sido relatado como o mais comum fator predisponente
para ceratite fúngica, principalmente aquelas envolvendo fungos filamentosos
(ROSA et al, 1994; XIE et al, 2001; GOPINATHAN et al, 2002). A injúria pode ser
causada por vários agentes traumatizantes incluindo materiais provenientes de
vegetais, animais ou solo, vidro, objetos metálicos, pedras, entre outros (DOCZI et
al, 2004).
O uso de corticosteróides e antibacterianos vem contribuindo para o
aumento das ceratites fúngicas nas últimas décadas. Os corticosteróides e
imunossupressores diminuem os mecanismos imunológicos de defesa e a reação
inflamatória podendo mascarar a gravidade da doença (THOMAS, 1994;
WEISSMAN e MONDINO, 2002).
1.4 Lentes de contato (CL)
CL de vidro foram descritas em 1888 por Adolf Eugen Fick, físico de Zurich,
que foi o primeiro a usar CL para corrigir astigmatismo irregular (VAUGHAN e
ASBURY, 1990). Desde esta época avanços tecnológicos têm produzido diferentes
variedades de lentes de contato, as quais são basicamente divididas em dois tipos:
lentes rígidas e lentes hidrofílicas.
Estas lentes podem apresentar esquemas de uso diário, descartáveis ou
não-descartáveis, uso prolongado e uso contínuo (WILLCOX e HOLDEN, 2001).
As CL hidrofílicas são consideravelmente mais confortáveis, mais caras e de
manutenção mais difícil que as rígidas. A permeabilidade ao oxigênio e os valores
de hidratação e ionicidade variam entre os diferentes tipos de polímeros que as
constituem. As complicações também são mais comuns e incluem ceratite ulcerativa,
reações imunológicas corneanas a depósitos na CL, conjuntivite papilar, reações as
soluções de assepsia, edema e vascularização da córnea (VAUGHAN et al, 2003). É
de importância que todos os usuários sejam informados a respeito dos riscos
associados ao uso de CL, principalmente aqueles que optam por tipos considerados
de alto risco, como as de uso prolongado ou descartáveis para correção da visão
apenas por razões estéticas.
1.5 Ceratites em usuários de lentes de contato
O número de usuários de CL terapêuticas ou cosméticas vem aumentando
nas últimas décadas. Em 1995 a estimativa era de 22 a 28 milhões de usuários
somente nos Estados Unidos (BARR, 1996) com um aumento para
aproximadamente 32 milhões em 2002 (BARR, 2003). Este fato gera preocupação
considerando que o uso de CL tem sido identificado como um fator de risco para o
desenvolvimento de infecções na córnea (KLOTZ et al, 2000; WILLCOX e HOLDEN,
2001; WEISSMAN e MONDINO, 2002, THOMAS, 2003). Em um estudo (MAH-
SADORRA et al, 2005) realizado no Cornea Service of Wills Eye Hospital, das 376
úlceras de córnea diagnosticadas entre os anos de 1999 e 2002, 113 (30%) estavam
relacionadas ao uso de CL.
Alterações no epitélio corneano induzidas pelas CL são eventos importantes
que antecedem o estabelecimento da infecção. A ceratite pode ocorrer como
resultado do uso prolongado da CL, microtraumas, hipóxia e situações que levam a
imunossupressão local ou sistêmica. Procedimentos deficientes de limpeza e
desinfecção das CL e dos estojos para armazenamento ou a contaminação das
soluções higienização também são considerados fatores de riscos (WEISSMAN e
MONDINO, 2002).
Em geral as ceratites associadas ao uso de CL são causadas por bactérias.
As fúngicas são consideradas pouco comuns (WILLCOX e HOLDEN, 2001; MAH-
SADORRA et al, 2005), entretanto são graves e a maioria dos antifúngicos
disponíveis apresenta várias limitações como espectro de ação limitado,
instabilidade e penetração insatisfatória na córnea, além de toxicidade ocular e
sistêmica (BELFORT JÚNIOR e KARA-JOSÉ, 1996) o que dificulta o controle da
doença.
A ceratite causada por Fusarium é, em geral, resultado de trauma da córnea
com material vegetal ou com objetos contaminados com produtos provenientes do
solo (KLOTZ et al, 2000; CARVALHO et al, 2001; GOPINATHAN et al, 2002;
THOMAS, 2003). Porém, um estudo realizado entre os anos de 2004 e 2006 no
Bascom Palmer Eye Institut em Miami identificou 34 pacientes usuários de CL
cosméticas apresentando úlcera de córnea causada por espécies do gênero
Fusarium (ALFONSO et al, 2006).
A CL pode atuar como um vetor, transferindo o fungo dos estojos de
armazenamento ou soluções de limpeza contaminados diretamente para a superfície
ocular (WEISSMAN e MONDINO, 2002). Outra forma do fungo atingir a CL é durante
o seu uso, com conídios veiculados pelo vento (NELSON et al, 1994, DIGNANI e
ANAISSIE, 2004). Aderido à superfície da CL, o fungo pode invadir a matriz,
atravessá-la até a face posterior e atingir o epitélio corneano, resultando na infecção
(SIMMONS et al, 1986).
2. JUSTIFICATIVA
A ceratite fúngica é um problema oftalmológico importante em várias partes
do mundo e até hoje representa um desafio para os oftalmologistas. É uma infecção
que não oferece riscos a vida do paciente, porém se não for instituído o tratamento
rápido e adequado pode levar a marcada redução na visão ou a perda total em
casos mais severos, caracterizando a gravidade da doença. Atualmente observa-se
um aumento crescente do número de usuários de CL e, apesar dos benefícios
oferecidos pelo seu uso, as CL já foram identificadas como fator de risco para o
desenvolvimento de ceratites.
Até o presente momento, são escassos os estudos que avaliam os aspectos
da virulência de F. oxysporum utilizando CL. Essa espécie, classicamente
reconhecida como fitopatógena e geofílica, tem sido freqüentemente identificada
como agente causal de infecções fúngicas em humanos na região de Maringá
(GUILHERMETTI et al, 2007). Embora não haja estatísticas disponíveis que relatam
dados relacionados às ceratites nessa região, o clima quente e as características da
economia baseada na atividade agrícola somado aos freqüentes relatos de
infecções por Fusarium nos leva a acreditar no potencial deste fungo como agente
etiológico dessas micoses oculares.
Com essas considerações, a proposta do estudo foi avaliar o perfil de
virulência de uma amostra de F. oxysporum isolado de úlcera de córnea, analisando
a capacidade de aderência sobre superfícies e invasão em lentes de contato,
associando-o aos riscos de desenvolvimento de ceratites.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivos gerais
O presente estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de aderência,
invasão e formação de biofilme de uma amostra de F. oxysporum recém- isolada de
úlcera da córnea humana.
3.2 Objetivos específicos
1. Avaliar a capacidade de aderência de F. oxysporum através da formação de
biofilme sobre a superfície de microplacas de poliestireno.
2. Demonstrar a cinética da formação de biofilme por F. oxysporum sobre
superfície de microplacas de poliestireno através da técnica de redução de
sais de tetrazolium.
3. Demonstrar a viabilidade e atividade metabólica das células fúngicas
envolvidas na adesão e formação de biofilme em superfície de vidro pela
coloração LIVE/DEAD e visualização em microscopia de fluorescência.
4. Avaliar a capacidade de aderência de F. oxysporum em lentes de contato
hidrofílicas em 1 hora de incubação, pelo método de contagem de colônias
em placas.
5. Avaliar a capacidade de invasão de F. oxysporum em lentes de contato
hidrofílicas através da visualização em microscopia eletrônica de varredura.
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CAPÍTULO II
Artigo “ADERÊNCIA, INVASÃO E FORMAÇÃO DE BIOFILME DE UMA
AMOSTRA DE Fusarium oxysporum ISOLADA DE ÚLCERA DE CÓRNEA, pág.
20 – 40, submetido para publicação, aguardando resultado.
Address correspondence:
Dra Terezinha Inez Estivalet Svidzinski
Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Análises Clínicas
Av. Colombo, 5790; Maringá – PR – Brasil; 87020-900
Telefone (+55 44) 3261-4809 / FAX: (+55 44) 3261-4860
E-mail: tiesvidzinski@uem.br
CAPÍTULO III
CONCLUSÕES
1. A amostra de F. oxysporum isolada de úlcera de córnea estudada demonstrou
importante capacidade de aderência comprovada pela formação de biofilme
em superfície de poliestireno.
2. Com o conhecimento da cinética da formação do biofilme, obtida pela técnica
da redução de sais de tetrazolium, foi possível sugerir que a fase de
estabilização do biofilme produzido por F. oxysporum aconteça em tempo
superior a 48 horas.
3. Através da coloração fluorescente LIVE/DEAD foi demonstrado que, depois
de aderido, o fungo mantém a viabilidade e atividade metabólica e, portanto
encontra-se em condições de causar infecções.
4. A capacidade de aderência de F. oxysporum foi demonstrada também sobre
lentes de contato hidrofílicas, tanto pela técnica de contagem de colônias
como pela microscopia eletrônica de varredura. Ainda foi possível observar a
capacidade do fungo em invadir e atravessar a matriz da lente de contato,
confirmando o alto potencial de virulência e a importância dessa espécie na
patogênese da infecção da córnea.
5. A aderência, invasão e formação de biofilme por F. oxysporum sobre as
lentes de contato confirmam a importância deste dispositivo como fator de
risco para o desenvolvimento de ceratites entre os usuários.
6. F. oxysporum aderiu sobre as diferentes superfícies estudadas inferindo uma
alta capacidade de aderência.
7. A MEV evidenciou também um biofilme bem organizado e fortemente aderido
o que sugere que, após a invasão da matriz da CL, não seja mais possível a
completa remoção do fungo.
8. Este estudo contribui para a conscientização dos usuários de CL quanto à
importância das boas práticas de higiene e da troca regular das CL que
reduzem o risco de contaminação.
9. Este trabalho abre caminho para novos estudos que contribuam para
compreensão dos mecanismos de ação e virulência de Fusarium spp como
agentes causadores de ceratites.
PERSPECTIVAS FUTURAS
1. Determinar a capacidade de aderência e formação de biofilme das demais
amostras fúngicas isoladas no estudo e estabelecer análises comparativas
entre as espécies.
2. Realizar estudos para avaliar a influência que o uso de soluções oftálmicas
(corticosteróides, antibacterianos e lubrificantes) exerce sobre a aderência e
formação de biofilme por fungos isolados de úlcera de córnea.
3. Verificar a capacidade de produção de micotoxinas de espécies do gênero
Fusarium isoladas de úlcera de córnea.
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