( PDF ) Papel do estresse oxidativo induzido por glutamato na disfunção colinérgica no sistema nervoso central

Download PDF

ads:

CAMILA PINHEIRO DE ALMEIDA

PAPEL DO ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO POR

GLUTAMATO NA DISFUNÇÃO COLINÉRGICA NO

SISTEMA NERVOSO CENTRAL

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE

FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO

GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Almeida, Camila

Papel do Estresse Oxidativo Induzido por Glutamato na Disfunção

Colinérgica no Sistema Nervoso Central / Camila Pinheiro de Almeida. – Rio de

Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2008.

xvii, 128 f.: il. ; 31 cm

Orientadores: Fernando Garcia de Mello e Nilson Nunes Tavares

Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-graduação em

Ciências Biológicas (Biofísica), 2008.

Referências Bibliográfica: f. 110-128

1. Glutamato. 2. Estresse Oxidativo. 3. Colina Acetiltransferase. 5.

Espécies Reativas de Oxigênio. 4. Óxido Nítrico. 5. Óxido Nítrico Sintase. 6.

Biofísica – Tese. I. De Mello, Fernando Garcia. II. Nunes-Tavares, Nilson. III.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-graduação

em Ciências Biológicas, Biofísica. IV. Título.

ads:

UFRJ

Papel do Estresse Oxidativo Induzido por Glutamato na Disfunção Colinérgica no

Sistema Nervoso Central

CAMILA PINHEIRO DE ALMEIDA

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Biofísica), IBCCF, da

Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas (Biofísica).

Orientadores: Fernando Garcia de Mello

Nilson Nunes Tavares

Rio de Janeiro

Fevereiro/2008

iii

FOLHA DE APROVAÇÃO

CAMILA PINHEIRO DE ALMEIDA

Papel do Estresse Oxidativo Induzido por Glutamato na Disfunção Colinérgica no

Sistema Nervoso Central

Rio de Janeiro, 12 de Fevereiro de 2008

__________________________________________

(Dr. Fernando Garcia de Mello, IBCCF, UFRJ)

__________________________________________

(Dr. Marcus Fernandes de Oliveira, IBqM, UFRJ)

__________________________________________

(Dr

. Flávia Carvalho Alcântara Gomes, PCM, UFRJ)

__________________________________________

(Dr. Marcelo Felippe Santiago, IBCCF, UFRJ)

__________________________________________

(Dr

. Jennifer Lowe, IBCCF, UFRJ)

Projeto desenvolvido no Laboratório de Neuroquímica sob orientação do Prof. Dr.

Fernando Garcia de Mello e Prof. Dr. Nilson Nunes Tavares. O laboratório é integrante

do Programa de Neurobiologia do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, IBCCF, da

Universidade Federal do Rio de Janeiro. A bolsa de mestrado foi concedida pelo

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Além da

verba concedida pelo próprio CNPq, projeto contou com o apoio financeiro do Programa

de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX), Financiadora de Estudos e Projetos

(FINEP) e da Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio

de Janeiro (FAPERJ).

“Aprender sem pensar é tempo perdido.”

Confúcio

Dedico esse trabalho aos meus pais que foram os

primeiros a acreditar que eu era capaz. À eles que

primeiramente me fizeram crer que tudo seria possível

e proporcionaram tudo para que esse sonho se

realizasse: o amor, o carinho, o apoio e todo suporte

necessário. Deles também vieram o exemplo de que a

determinação faz planos se realizarem e as correções

que me transformaram no que sou hoje.

vii

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pela vida e por ao longo dela ter me dado oportunidades que me

fizeram chegar até aqui. Pela força nos momentos de fraqueza, pelo ânimo quando eu

achava que não seria possível dar mais um passo, por ter colocado ao meu lado as

pessoas certas nos momentos certos para me darem um abraço, um sorriso, uma

palavra, para me oferecerem oportunidades e me incentivarem. Por ter provido as

condições necessárias para a realização desse sonho.

A minha mãe e amiga Idenir pelo amor e pelas palavras sábias que souberam me

encorajar quando parecia que já não seria possível chegar até aqui. E claro, pela super

ajuda com as referências. Você é essencial na minha vida!

Ao meu pai José Carlos pelo exemplo sempre presente. Por achar que eu sou muito

mais do que eu realmente sou e acreditar que eu seria capaz. Por me ensinar tantas

coisas e também se deixar aprender comigo. E claro, pelo suporte financeiro! Amo

muito você!

A minha irmã e amiga Cássia. Você é a melhor irmã do mundo e seu amor, carinho e

admiração foram fundamentais para que tudo desse certo. Sua compreensão nos

momentos de maior tensão seguidos pela descontração ao som do violão me ajudaram

a recarregar minhas baterias. Obrigada por mesmo longe estar sempre tão presente em

todos os momentos e circunstâncias da minha vida. Te amo!

Ao Davi meu namorado. Não tenho dúvida de que por ter você ao meu lado tudo foi

infinitamente mais fácil e agradável. Obrigada por me ouvir treinando apresentação de

seminários, “posters”, conferência, prévia, etc. Por tão calmamente me ouvir falando

sobre retina, glutamato, ChAT, anti-corpo. Pelo incentivo e admiração. Pela paciência e

compreensão. Tudo foi fundamental!

Ao meu orientador Fernando Mello por acreditar em mim e proporcionar essa

oportunidade para que eu chegasse até aqui. Seu exemplo profissional e científico

contribuiu muito para minha formação.

Ao meu co-orientador Nilson pelo apoio, incentivo, discussão de resultados e

contribuição com novas idéias. Pelos puxões de orelha que me fizeram crescer e

amadurecer. Pelos muitos chocolates (nacionais e importados) que adoçaram esses

dois anos de mestrado.

Ao Luís, meu aluno de Iniciação Científica que muito me ajudou e continua ajudando

com a parte experimental desse trabalho. Muito obrigada!

Aos demais professores dos Laboratórios de Neurobiologia da Retina e Neuroquímica.

Paty, você ótima, divertida e alegre; e não posso deixar de agradecer pelas muitas

caronas de ida e de volta do Fundão. Muito obrigada! Maria Christina, suas

contribuições científicas com sugestões, críticas e discussões foram de grande proveito.

viii

E obrigada também pela ajuda na correção da algumas coisas na tese. Nora, mesmo

em processo de aposentadoria não poderia deixar de reconhecer que trabalhar com

alguém tão brilhante e inteligente como você contribuiu para meu crescimento e

amadurecimento científico. E Ricardo, obrigada pela admiração e apoio; e também por

ter me dado a oportunidade de me sentir pela primeira vez uma professora.

Aos professores que aceitaram compor a banca de avaliação. Muito obrigada!

A Profª Jennifer Lowe, pela revisão da tese.

Ao Profº Marcus Oliveira por tão gentilmente não só ter cedido as alíquotas de DHE,

mas também por ter me ajudado com a realização e discussão dos experimentos.

A inesquecível galera da IMR: Ju, Ronning, Anine, Gui, Bigo, Ângelo, Nathália, Valdô,

Diméia, Vasti, Bruno, Jê, Sol, Carine, Alessandro, Helen, Giselle, Marquim, Mylena,

Talita, Fernando, Dedé, Sarinha... vocês são minha segunda família. Amo vocês!

A minha amiga Bia por tudo! Você continua sendo essencial na minha vida e é muito

bom dividir cada conquista com você! Poucas pessoas estão na minha vida há tanto

tempo como você. E eu sei que você continuará do me lado sempre que eu precisar. Te

amo!

Ao amigo que ganhei por tabela Eliezer. Suas conversas muito me ajudaram! Haja

paciência pra me ouvir e sabedoria pra tentar me aconselhar. Obrigada também pelas

gargalhadas e momentos de descontração. Você veio sem ser encomendado mas eu

aprendi a te amar.

A minha grande e louca família. Cada momento com vocês é único, divertido e especial.

Muito obrigada ao meu vô Quim, vó Eny e a todos tios, tias e primos. Um obrigado

especial a vó Erodina que não viveu tempo suficiente para ver esse sonho se realizar,

mas que sempre torceu muito por ele... você faz muita falta!

Aos meus amigos dos Laboratórios de Neuroquímica e Neurobiologia da Retina pelos

momentos de alegria dentro e fora do laboratório, pela companhia, pela ajuda com

experimentos e metodologia, discussão de resultados, novas sugestões e apoio.

Isabela, Cristiano, Renatinha, Gisele, Mário, Pedrinho, Ana Cláudia, Rose, Márcia,

Lívia, Clara... vocês são ótimos!

A galera mais chegada um obrigado especial. Cris, pelas muitas caronas regadas a

muita música, gargalhadas, desabafos e “conversas vãs”. Renatinha pelos esporros,

pela admiração, pelas consultas informais e consultoria médica. Bela, pela amizade,

conselhos, divertidas histórias e conversas em alguns momentos difíceis. Gi pela força,

admiração, incentivo, por torcer pela minha felicidade e realização; e claro, pelos

momentos inesquecíveis na cidade do aço. Você é ótima! E a todos vocês pelos nossos

momentos fora do lab... rodízios, Outback, Boomerang, o boliche que nunca rolou. Amo

vocês!

Ao amigo Ronald pelo incentivo, pelo carinho, pela companhia, pelas horas de

conversas e experiências compartilhadas. Também pelos puxões de orelha e conselhos

que muito me ajudaram. Pelas figuras scanneadas, pelas aulas que me ajudou a

montar e pelos livros emprestados. Você me ajudou muito em tudo, obrigada!

A minha eterna turma Biomed 02. Em especial ao Eduardo que continua me aturando e

ouvindo e me incentivando a dar mais um passo. Obrigada por me dedicar tanto carinho

e atenção. E também a Lívia que dentre todos é a pessoa que mais diretamente

conviveu comigo me ajudando em muitos momentos sendo inclusive minha consultora

científica e pessoal.

A Nath por me aturar tão bem e conjugar a isso a sua amizade durante esse último ano.

Obrigada!

Aos demais amigos que fazem parte da minha vida e são inesquecíveis e

insubstituíveis. De longe ou de perto, de VR, Rio, BM, Palmas, Barbacena, Brasília,

EUA. Obrigada por estarem ao meu lado!

Por fim, a todos que conheço e que direta ou indiretamente contribuíram para a

realização desse trabalho e concretização dessa etapa. Aos funcionários da secretaria

de pós-graduação, colegas e amigos do IBCCF e aos professores do mestrado.

A todos, muito obrigada!

LISTA DE ABREVIATURAS

8-nitro-GMPc: 8-nitroguanosina 3´,5´-monofosfato cíclico

AAE: Aminoácido excitatório

ACh: Acetilcolina

AChE: Acetil colinesterase

AD: Doença de Alzheimer

ALS: Esclerose lateral amiotrófica

AMPA: Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazolepropiônico

AMPc: Monofosfato de adenosina cíclico

Aβ: Beta amilóide

CAMKII: Cálcio-calmodulina cinase II

ChAT: Colina acetiltransferase

CHT1: Transportador de colina 1

CMF: Salina livre de cálcio e de magnésio

DAG: Diacilglicerol

DHE: Di-hidro-etidina

DNA: Ácido desoxirribonucléico

EAAT: Transportador de aminoácido excitatório

EDTA: Ácido diaminotetra-acético etileno

EFA: Ácido graxo essencial

eNOS: Óxido nítrico sintase endotelial

FCCP: Carbonil cianida 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazone

GDH: Glutamato desidrogenase

GLAST: Transportador de glutamato e aspartato

GLU: Glatamato

GLT: Transportador de glutamato

GMPc: Monofosfato de guanosina cíclico

GSH: Glutationa reduzida

HEPES: Ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinoetanosulfônico

HIV: Vírus da imunodeficiência humana

iNOS: Óxido nítrico sintase induzível

: Inositol-1,4,5-trifosfato

KA: Cainato

L-NA: L-nitro-arginina

L-NAME: L-nitro-arginina-metil-éster

LTP: Potenciação de longa duração

MEM: Meio essencial mínimo

mGluR: Receptor metabotrópico glutamatérgico

NADPH: Nicotinamida adenina nucleotídeo fosfato

NMDA: N-metil-D-aspartato

nNOS: Óxido nítrico sintase neuronal

NO: Óxido nítrico

NOS: Óxido nítrico sintase

PD: Doença de Parkinson

PKA: Proteína cinase A

PKC: Proteína cinase C

PLC: Fosfolipase C

POPOP: 1,4-Bis(4-metil-5-fenil-2-oxazolil)benzeno

PPO: Óxido polipropileno

PUFA: Ácido graxo poliinsaturado

RNS: Espécies reativas de nitrogênio

ROS: Espécies reativas de oxigênio

SNC: Sistema nervoso central

VAChT: Transportador vesicular de acetilcolina

VGLUT: Transportador vesicular de glutamato

αKGDH: α-Cetoglutarato desidrogenase

xii

RESUMO

Glutamato (glu) é um aminoácido que age como principal neurotransmissor excitatório

no sistema nervoso central (SNC). Além de seu papel fisiológico, este pode exercer

efeitos prejudiciais sobre o sistema nervoso quando presente em quantidades elevadas,

levando a hiperexcitação do neurônio pós-sináptico. Esse processo conhecido como

excitotoxicidade tem sido associado a diversas doenças neurodegenerativas. Nesse

processo, o aumento da concentração intracelular de Ca

desencadeia a produção

exagerada de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela mitocôndria e aumento na

síntese de óxido nítrico (NO) pela enzima óxido nítrico sintase (NOS). Em neurônios

colinérgicos obtidos a partir de retina de embriões de ave de 9 dias e mantidos 4 dias

em cultura o tratamento crônico com glutamato 2 mM é capaz de induzir a produção de

ROS e também de inibir 60% da atividade da enzima colina acetiltransferase (ChAT).

Um outro aminoácido excitatório que age seletivamente sobre receptores do tipo

NMDA, o L-aspartato 100 μM, também foi capaz de promover a inibição da ChAT em

60%. Tanto a produção de radicais livres quanto a inibição da ChAT foram prevenidas

pelo tratamento com moléculas antioxidantes como a vitamina E 500 μM e a vitamina C

3 mM. O uso de inibidores da NOS (L-NAME (L-nitro-arginina-metil-ester) 5 mM e L-NA

(L-nitro-arginina) 10 mM) também foi capaz de prevenir a inibição da ChAT, sugerindo

envolvimento do NO no processo tóxico desencadeado pela hiperativação

glutamatérgica. Já a produção de ROS pela mitocôndria foi parcialmente prevenido pelo

uso do desacoplador mitocondrial FCCP 1 μM (Carbonil cianida 4-

(trifluorometoxi)fenilhidrazone), que exerceu efeito aditivo a proteção insuficiente de

uma concentração mais baixa de L-NAME (3 mM). A reação entre superóxido, uma das

espécies reativas de oxigênio, com o óxido nítrico leva à produção de peroxinitrito que

ao reagir com grupamentos SH de aminoácidos modifica-os e compromete o

funcionamento de proteínas e enzimas. O uso de uma molécula tiorredutora, a

glutationa reduzida (GSH) 10 mM também foi capaz de prevenir a inibição da ChAT. Em

conjunto, esses dados sugerem que esteja havendo a produção de ROS e NO que ao

reagirem levam à formação de peroxinitrito que age modificando a molécula da ChAT

inibindo sua capacidade catalítica. Por fim, observamos que ácidos graxos

poliinsaturados são capazes de exercer um efeito protetor sobre a inibição induzida pelo

glutamato. O ácido araquidônico 20 μM, ácido α-lonolênico 20 μM e o ácido linoleico 20

μM foram capazes de prevenir a perda da atividade da ChAT mantendo-a em níveis

semelhantes ao controle. Já os ácidos graxos monoinsaturados oléico 50 μM e

saturado esteárico 20 μM não foram capazes de exercer nenhum tipo de proteção.

Acredita-se que esse efeito seja devido à presença de duplas ligações na estrutura

desses ácidos graxos que agem como alvos moleculares para a ação de radicais livres,

protegendo assim a molécula da ChAT desses radicais reativos.

xiii

ABSTRACT

Glutamate (glu) is an amino acid that acts as the major excitatory neurotransmitter in the

central nervous system (CNS). In addition to its ubiquitous role, glutamate may exert

adverse effects on the functioning of the nervous system when present in excessive

amounts leading to a post-synaptic overstimulation. This process known as excitotoxicity

has been associated with several neurodegenerative diseases. One of the

consequences of glutamatergic receptors overactivation is an increase in the intracelular

concentration that triggers processes such as the increase in reactive oxygen

species in the mitochondria and nitric oxide (NO) synthesis by the nitric oxide synthase

(NOS). In cholinergic neurons from avian embryonic 9 day-old retinas kept in vitro for 4

days, the chronic treatment with glutamate 2 mM ROS production and choline

acetyltransferase (ChAT) inhibition in 60%. Another excitatory amino acid that acts

selectively on the NMDA type of glutamatergic receptors, L-aspartate 100 μM, was also

able to promote inhibition of ChAT in 60%. Both the production of free radicals and the

inhibition of ChAT were prevented by co-treatment with antioxidant molecules such as

vitamin E (tocopherol) 500 μM and vitamin C (ascorbic acid) 3 mM. Another target of

increased intracelular Ca

resulting from glutamatergic receptor overactivation is the

increased production of NO by the NOS enzyme. The use of NOS inhibitors (L-NAME

(L-nitro-arginina-metil-ester) 5 mM e L-NA (L-nitro-arginina) 10 mM) was also able to

prevent the inhibition of ChAT. The ROS production by mitochondria was partially

prevented by the mitochondrial uncoupling molecule FCCP 1 μM (Carbonil cianida 4-

(trifluorometoxi)fenilhidrazone), that exerts an addictive effect to the insufficient

protection of a lower L-NAME concentration (3 mM). The reaction of superoxide, one of

the reactive oxygen species, with nitric oxide leads to the production of peroxynitrite that

reacts with SH groups of amino acids modifying them and thus damaging the function of

proteins and enzymes. The use of a tiorreductant molecule, reduced glutathione (GSH)

10 mM was also able to act by preventing the inhibition of ChAT. Together, these data

suggest that there is the production of ROS and NO that react leading to formation of

peroxynitrite that acts modifying SH residues in the ChAT molecule inhibiting its catalytic

activity. Finally, we observed that polyunsaturated fatty acids are able to exert a

protective effect on the inhibition induced by glutamate. The arachdonic acid 20 μM, α-

linolenic acid 20 μM and linoleic acid 20 μM were able to prevent the loss of ChAT

activity, maintaining it in levels similar to control. In the other hand, the monounsaturated

oleic acid 50 μM and the saturated stearic acid 20 μM were not able to exert any kind of

protection to ChAT activity. It is believed that this effect is due to the presence of double

bonds in the structure of these fatty acids that act as molecular targets for the action of

free radicals, thereby protecting the ChAT molecule from these reactive radicals.

xiv

ÍNDICE

1.0 – INTRODUÇÃO.......................................................................................................18

1.1 – Glutamato..........................................................................................................18

1.2 – Receptores Glutamatérgicos.............................................................................23

1.2.1 – Receptores Metabotrópicos..............................................................23

1.2.2 – Receptores Ionotrópicos...................................................................25

1.2.2.1 – Receptores do tipo AMPA...........................................................26

1.2.2.2 – Receptores do tipo Cainato (KA)................................................28

1.2.2.3 – Receptores do tipo NMDA..........................................................28

1.3 – Acetilcolina........................................................................................................33

1.4 – Receptores Colinérgicos...................................................................................35

1.4.1 – Receptores Nicotínicos..........................................................................35

1.4.2 – Receptores Muscarínicos......................................................................36

1.5 – Glutamato e Excitotoxicidade............................................................................37

1.6 – Estresse Oxidativo e Radicais Livres................................................................40

1.6.1 – Radical Superóxido................................................................................42

1.6.2 – Peróxido de Hidrogênio.........................................................................43

1.6.3 – Radical Hidroxila....................................................................................43

1.6.4 – Óxido Nítrico..........................................................................................44

1.6.5 – Radical Peroxinitrito...............................................................................45

1.7 – Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas.........................................48

1.8 – Enzimas e Moléculas Antioxidantes..................................................................51

1.9 – Doença de Alzheimer e Disfunção Colinérgica.................................................55

1.10 – A Retina como modelo de estudo...................................................................57

1.10.1 – A Problemática.....................................................................................60

2.0 – OBJETIVOS...........................................................................................................64

3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................65

3.1 – Cultura de Neurônios Retinianos......................................................................65

3.1.1 – Animais utilizados..................................................................................65

3.1.2 – Preparo de culturas em monocamada...................................................65

3.1.3 – Manutenção das culturas em monocamada..........................................66

3.1.4 – Troca de meio........................................................................................66

3.1.5 – Incubação das culturas em monocamada com fármacos......................66

3.2 – Dosagem da atividade enzimática da Colina Acetiltransferase (ChAT)............67

3.2.1 – Obtenção da enzima ChAT....................................................................67

3.2.2 – Ensaio enzimático..................................................................................68

3.2.3 – Determinação da Atividade Específica da Enzima................................71

3.3 – Dosagem de Proteína.......................................................................................71

3.4 – Estatística..........................................................................................................71

3.5 – Detecção da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio..............................71

4.0 – RESULTADOS.......................................................................................................73

4.1 – Tratamento crônico com glutamato induz a produção de radicais livres..........73

xvi

4.2 – Agentes redutores são capazes de prevenir a inibição da ChAT induzida por

Glutamato..................................................................................................................75

4.3 – Desacopladores mitocondriais e inibidores da NOS protegem a ChAT da

inibição induzida pelo glutamato................................................................................81

4.4 – Efeito de Tiorredutores sobre a inibição enzimática da ChAT..........................85

4.5 – Efeito protetor de ácidos graxos polinsaturados (PUFAs)................................87

5.0 – DISCUSSÃO..........................................................................................................93

6.0 – CONCLUSÕES......................................................................................................91

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................110

xvii

1.0 – INTRODUÇÃO

1.1 – Glutamato

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central

(SNC) tendo uma ampla distribuição e estando presente nos mais diversos tipos

neuronais. A primeira evidência de que o glutamato pode agir como neurotransmissor

veio da observação de que em baixas concentrações, tanto a isoforma D- quanto a L-

era capaz de excitar neurônios do sistema nervoso central (Curtis e Watkins,1961;

Curtis e Johnston, 1974). Décadas de pesquisa demonstraram que sua ação está

relacionada a processos fisiológicos fundamentais para a sobrevivência, tais como

cognição (Zikopoulos e Barbas, 2007), memória, aprendizado (Miyamoto, 2006), dor

(Wu et al., 2007; Schkeryantz et al., 2007; Bleakman et al., 2006) e transdução do sinal

luminoso na retina (Kolb, 2003). Além de ser o neurotransmissor liberado pelos

fotorreceptores, também medeia a transmissão sináptica de células bipolares e de

ganglionares (Yang, 2004). Durante o desenvolvimento modula processos como

migração celular (Manent e Represa, 2007), formação e maturação sináptica (Craig e

Kang, 2007), proliferação, diferenciação e sobrevivência de células-tronco (Melchiorri et

al., 2007).

O glutamato é um aminoácido não essencial que não atravessa a barreira

hematoencefálica. Ele é sintetizado a partir de intermediários do metabolismo da glicose

e de outros precursores (Fonnun, 1984; Platt, 2007). Um de seus precursores é o α-

cetoglutarato. Este recebe um grupamento amino de um outro aminoácido como, por

exemplo, a alanina através da ação de transaminases gerando, assim, o glutamato.

Este, por sua vez, pode ser reconvertido a α-cetoglutarato pela ação da enzima

glutamato desidrogenase (GDH). Um outro precursor da síntese do ácido glutâmico é a

glutamina, sintetizada em células gliais a partir do próprio glutamato que foi recaptado

da fenda sináptica (Figura 1). (Hassel et al., 1997; Hassel et al., 2003; Hassel e

Dingledine, 2006).

Figura 1 – Vias de síntese do glutamato. Esse aminoácido pode ser sintetizado a partir do

cetoglutarato através da ação de aminotransferases. A enzima glutamato desidrogenase (GDH) é

responsável pela reconversão de glutamato a α-cetoglutarato. O glutamato captado por células

gliais é convertido a glutamina e esta ao ser devolvida ao neurônio por ação de transportadores

pode ser novamente convertida a glutamato. Além disso o glutamato é o aminoácido precursor

utilizado na síntese de GABA e de glutationa (Modificado de Hassel e Dingledine, 2006).

A exemplo de outros neurotransmissores, uma vez sintetizado, o glutamato é

armazenado em vesículas sinápticas, o que ocorre por meio de transportadores

vesiculares de glutamato (VGLUTs) em um processo dependente de gradiente

eletroquímico. (Moriyama e Yamamoto, 2004; Takamori, 2006).

Após ser armazenado em vesículas, o glutamato é liberado na fenda sináptica

através de uma exocitose dependente de Ca

. Quando estimuladas, as células

neuronais se despolarizam deflagrando um potencial de ação que se propaga ao longo

do axônio ate chegar ao terminal pré-sináptico. Nessa região há canais de Ca

dependentes de voltagem que se abrem diante de um estímulo despolarizante (Dietrich

et al., 2003). O influxo de Ca

permite o atracamento da vesícula com a membrana

plasmática e posterior fusão das mesmas. Abre-se, então, um poro pelo qual o

glutamato é liberado. (Wang e Tang, 2006; Platt, 2007).

O processo de exocitose do glutamato na fenda sináptica é controlado por uma

série de receptores presentes na membrana do terminal pré-sináptico (Sanchez-Pietro

et al., 1996; Anderson e Swanson, 2000). Esses receptores não são somente os

glutamatérgicos (metabotrópicos do Grupo II e III), mas também os colinérgicos

(nicotínicos e muscarínicos), receptores de adenosina (A1), k-opióides, receptores

gabaérgicos (GABA

), receptores para colecistocinina e neuropeptídeo Y (Y2)

(Sanchez-Pietro et al.; 1996 Platt, 2007).

Além da liberação sináptica clássica por exocitose, acredita-se que o glutamato

possa ser liberado através de heterotrocadores e transportadores de cistina (sistema X

) (Baker et al., 2002a e b) ou ainda por reversão de transporte que ocorre em situações

de despolarização característica de condições patológicas, como na isquemia cerebral

(Choi e Rothman, 1990; Camacho e Massieu, 2006).

Não são somente os neurônios, mas as células gliais também são capazes de

liberar glutamato tanto em condições fisiológicas quanto patológicas (Attwell, 1994;

Vesce et al., 2007; Malarkey e Parpura, 2007). Essas células se utilizam de diferentes

mecanismos para promover essa liberação. 1. Realizam, assim como os neurônios,

exocitose dependente de Ca

(Parpura et al., 1994; Parpura et al., 2004); 2. Liberam

glutamato por operação reversa de transportadores presentes na membrana plasmática

(Parpura et al., 2004). Esse processo é característico de condições patológicas, como

por exemplo, a isquemia (Szatkowski et al., 1990); 3. Antiporte de cistina – glutamato no

sistema X

(Warr et al., 1999); 4. Liberação através de receptores purinérgicos

ionotrópicos (Duan et al., 2003); 5. Através da abertura de canais iônicos induzida pela

turgência do astrócito quando em meio hipotônico (Kimelberg et al., 1990); 6. Através

de conexons funcionais não pareados (hemicanais) presentes na superfície celular (Ye

et al., 2003).

Após ser liberado na fenda sináptica o glutamato irá agir em receptores

presentes na membrana plasmática dos terminais pós-sinápticos (Dingledine et al.,

1999a; Platt, 2007) A ação do glutamato na fenda sináptica é interrompida

principalmente pela sua recaptação mediada por transportadores presentes nas

terminações nervosas e astrócitos vizinhos (Platt, 2007). Essa recaptação é mediada

por transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs 1 – 5) e é dependente de Na

(Shigeri et al., 2004). Desses cinco transportadores de aminoácidos excitatórios dois

estão presentes em células da glia: EAAT-1 (GLAST) e EAAT-2 (GLT-1). Os outros três

tipos de transportadores são expressos em células neuronais, sendo que o EAAT-5 se

encontra no terminal pré-sináptico e os EAAT-3 e EAAT-4 se encontram no terminal

pós-sináptico (Shigeri et al., 2004).

O glutamato captado pelos astrócitos pode seguir duas diferentes vias

metabólicas. Ele pode ser convertido em glutamina pela ação da glutamina sintase, ou

ser metabolisado a α-cetoglutarato pela glutamato oxaloacetato transaminase ou pela

glutamato desidrogenase (Platt, 2007). Tanto a glutamina quanto o α-cetoglutarato são

transportados para fora das células gliais e reciclados de volta aos neurônios, que os

reconvertem a glutamato (Platt, 2007; Shigeri et al., 2004). A glutamina e o α-

cetoglutarato atuam, portanto, como reservatório de transmissor inativo sob o controle

regulador dos astrócitos, que atuam devolvendo o glutamato numa forma inócua para

reabastecer os neurônios (Figura 2) (Attwell, 1994; Hertz, 2006).

Figura 2 – Metabolismo do glutamato. O glutamato é sintetizado e estocado em vesículas

sinápticas nas terminações nervosas. A conversão de glutamina a glutamato envolve a

ação enzimática da glutaminase (3) presente na mitocôndria. O glutamato é também

formado por um processo de transaminação (1). Após sintetizado, o glutamato é

armazenado em altas concentrações dentro de vesículas sinápticas. Em seguida, ele é,

então, liberado na fenda sináptica. Sua recaptação para dentro de células glias ocorre

através de transportadores de glutamato 1 (GLT-1) e transportadores de glutamato e

aspartato (GLAST). Uma vez internalizado em células gliais, ele é interconvertido a

glutamina (2). A glutamina é então devolvida ao terminal nervoso, onde irá participar da

reposição dos estoques de glutamato. Alguns terminais glutamatérgicos possuem o

carreador de aminoácidos excitatórios 1 (EAAT-1) que recapta glutamato diretamente.

(Modificado de Dingledine e McBain, 1999b)

1.2 – Receptores Glutamatérgicos

Os receptores glutamatérgicos estão divididos em duas grandes classes:

receptores metabotrópicos e receptores ionotrópicos. De maneira geral, os

metabotrópicos são aqueles acoplados a uma proteína G intracelular cuja atividade

desencadeia a ativação de uma cascata de sinalização intracelular. Já os ionotrópicos

são proteínas transmembranas que formam canais e, uma vez ativados, se abrem

permitindo a entrada de íons. Um pouco da estrutura e função desses receptores será

detalhado a seguir.

1.2.1 – Receptores Metabotrópicos

Receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluRs) compõem uma classe de

receptores acoplados, através de proteína G, à enzimas citoplasmáticas. Os genes para

esses receptores codificam proteínas que atravessam sete vezes a membrana e

possuem a porção N-terminal exposta para o meio extracelular (Platt, 2007). Oito

diferentes tipos desse receptor já foram clonados e nomeados de mGluR1 a mGluR8.

Estes são agrupados em três classes funcionais baseando-se na homologia da

seqüência de aminoácidos que os compõem, no agonista farmacológico e na via de

transdução de sinal à qual ele está acoplado. O grupo I abriga os receptores mGluR1 e

mGluR5, o Grupo II é composto pelos receptores mGluR2 e mGluR3 e o Grupo III

agrega os receptores mGluR4, mGluR6, mGluR7 e mGluR8 (Figura 3) (Kew e Kemp,

2005).

Figura 3 – Famílias das subunidades moleculares dos receptores glutamatérgicos

(Modificado de Hassel e Dingledine, 2006)

A classificação de receptores glutamatérgicos metabotrópicos em três grupos

está diretamente ligado ao mecanismo de transdução de sinal ao qual ele está

acoplado. Receptores do Grupo I estão ligados via proteína G a fosfolipase C (PLC) que

quebra fosfatidilinositol-4,5-bifosfato em diacilglicerol (DAG) e inositol-1,4,5-trifosfato

(IP3). Esse aumento tem como conseqüência direta à liberação de Ca

a partir de

estoques intracelulares como o retículo, aumentando assim, a concentração intracelular

desse íon. Uma outra conseqüência da ativação da PLC é a síntese de diacilglicerol

(DAG), um ativador da Proteína Cinase C (PKC). Já os receptores do Grupo II e III

quando ativados, promovem via proteína G a inibição da adenilato ciclase, responsável

pela síntese de AMPc; ou seja, a ativação desses receptores diminui a concentração

intracelular de AMPc (Kew e Kemp, 2005). Receptores do Grupo III podem ainda inibir a

atividade da guanilato ciclase, diminuindo a concentração de GMPc (para revisão ver

Coutinho e Knöpfel, 2002).

Os receptores metabotrópicos podem também modular o funcionamento de uma

variedade de canais iônicos presentes tanto no terminal pré-sináptico quanto pós-

sináptico. Isso ocorre através da interação direta da subunidade βγ da proteína G com

porções intracelulares dos canais iônicos. A ativação das três classes de receptores

inibe canais de Ca

dependente de voltagem do tipo L, enquanto a ativação dos

receptores dos Grupos I e II inibe canais de Ca

dependente de voltagem do tipo N.

Dessa forma, os receptores metabotrópicos também atuam modulando a excitação

neuronal (Kew e Kemp, 2005). A ativação de receptores metabotrópicos no terminal

pré-sináptico pode ainda regular a liberação de glutamato na fenda sináptica (Sánchez-

Pietro et al., 1996; Platt, 2007).

Com exceção do mGluR6, que é específico da retina, todos os receptores

metabotrópicos são expressos nas demais regiões do SNC de mamíferos, tanto em

células gliais quanto neuronais com alguns membros apresentando um padrão de

expressão espacial e temporal particulares (Kew e Kemp, 2005). Os mGluRs também

estão expressos na periferia modulando a resposta do sistema nociceptivo (Bhave et

al., 2001; Walker et al., 2001). Em geral os receptores do grupo I estão localizados pos-

sinapticamente, enquanto os receptores do Grupo II e III são predominantemente pre-

sinápticos (Kew e Kemp, 2005).

1.2.2 – Receptores Ionotrópicos

Receptores ionotrópicos são proteínas transmembranas que formam canais

iônicos e possuem um sítio de ligação a agonistas específicos. São estruturas tetra ou

pentaméricas formadas a partir de mais de um tipo de subunidade funcional (Platt,

2007).

A abertura dos canais iônicos ocorre mediante a interação de um agonista

específico com seu sítio de ligação no receptor ionotrópico. Essa ligação promove uma

alteração conformacional na estrutura do receptor levando a uma abertura do poro do

canal. Uma vez aberto, ocorre a passagem de íons a favor do gradiente de

concentração (Dingledine et al., 1999a; Koles, et al., 2001).

Os receptores glutamatérgicos ionotrópicos são classificados em três grupos,

nomeados de acordo com o agonista específico ao qual se ligam para promover a

abertura do canal: N-metil-D-aspartato (NMDA), α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxasol

(AMPA) e cainato (KA) (Platt, 2007). Cada um dos tipos de receptores é formado por

subunidades pertencentes a diferentes famílias. A clonagem desses receptores revelou

em mamíferos a existência de mais de 16 genes responsáveis pela codificação das

subunidades de um receptor ionotrópico. Estas subunidades estão agrupadas em seis

famílias que estão diretamente envolvidas com a formação dos receptores funcionais,

conforme mostrado na Figura 3 (Dingledine et al., 1999a; Kew e Kemp, 2005).

1.2.2.1 – Receptores do tipo AMPA

Os receptores do tipo AMPA são formados por diferentes combinações das

subunidades GluR1-4, os quais se reúnem para formar estruturas tetraméricas (Kew e

Kemp, 2005). Eles estão amplamente distribuídos ao longo do sistema nervoso central,

entretanto, apresentam diferentes densidades nas diversas regiões do cérebro (Platt,

2007).

Cada receptor possui dois sítios de ligação para o agonista e sua ativação está

envolvida com a geração de um potencial pós sináptico excitatório rápido.

Fisiologicamente ele é ativado por glutamato e de maneira geral é permeável aos íons

e Ca

(Köles, et al., 2001). Entretanto, sabe-se que receptores do tipo AMPA, que

carecem da subunidade GluR2 exibem permeabilidade muito maior ao Ca

(Kew e

Kemp, 2005). Essa característica da subunidade GluR2 de ser impermeável ao Ca

devida a presença de um resíduo de arginina em um sítio crítico no poro do receptor.

Nas outras subunidades esse mesmo sítio é ocupado por uma glutamina (Seeburg e

Hartner, 2003).

Não é somente a presença da subunidade GluR2 que é capaz de regular a

função do receptor; suas subunidades podem sofrer alterações pos-transcricionais tanto

de cinases quanto de fosfatases (Dingledine et al., 1999a). Os dados relacionando os

efeitos dessas enzimas sobre o nível de ativação do receptor são contraditórios. Alguns

trabalhos mostram que a função do receptor do tipo AMPA pode ser potencializada pela

PKA, PKC e calcio-calmodulina cinase II (CAMKII) (Moss e Smart, 1996; Greengard, et

al., 1991; Wang at al., 1994). Entretanto, outros autores mostram que a fosforilação por

PKC reduz o tempo de abertura do canal enquanto outros observam que a mesma não

é alterada por atividade dessa cinase (Sigel e Baur, 1988). Outros dados mostram ainda

que a inibição de fosfatases também aumenta a corrente induzida por AMPA (Köles et

al., 2001).

1.2.2.2 – Receptores do tipo Cainato (KA)

Os receptores do tipo cainato são formados pela combinação das subunidades

GluR5 a GluR7 com as KA-1 e 2 que se agrupam em tetrâmeros formando, assim,

diversos tipos de receptores funcionalmente diferentes. O arranjo das diferentes

subunidades pode dar origem tanto a estruturas homoméricas quanto heteroméricas

(Kew e Kemp, 2005). Assim como os receptores do tipo AMPA, cada receptor KA

possui dois sítios de ligação para o agonista e também estão envolvidos na geração de

um potencial pós-sinaptico excitatório rápido e apresentam ampla distribuição no

sistema nervoso central (Dingledine et al., 1999a).

Alterações pós-transcricionais decorrentes da atividade de cinases (CAMKII) e

fosfatases (calcineurina) também são capazes de modular a função dos receptores do

tipo cainato. A estimulação de receptores do tipo NMDA em baixas freqüências é capaz

de induzir uma diminuição na atividade dos receptores cainato dependente de

calcineurina. Após o término do estímulo, a função do canal é recuperada em um

processo dependente de CAMKII (Ghetti e Heinemann, 2000). Esses dados

demonstram como em um curto período de tempo a atividade do canal pode ser

modulada em resposta a um estímulo externo.

1.2.2.3 – Receptores do tipo NMDA

Os receptores NMDA são os mais detalhadamente estudados. Estes exibem

propriedades farmacológicas e estruturais, que se acredita, possam desempenhar um

papel em mecanismos fisiológicos como, por exemplo, formação de LTP (Miyamoto,

2006). Os receptores NMDA são formados pelas subunidades NR1, NR2A, NR2B,

NR2C, NR2D, NR3A e NR3B, que são distintas das subunidades dos outros receptores

e se reúnem formando estruturas pentaméricas (Dingledine et al., 1999a; Kew e Kemp,

2005). Assim como os outros receptores, diferentes combinações de subunidades

produzem receptores funcionalmente diferentes. Para a formação de receptores

funcionais, é indispensável a presença da subunidade NR1, enquanto que, a inclusão

das subunidades NR2A-D e NR3A-B é capaz de regular a função do canal (Dingledine

et al., 1999a; Köles et al., 2001). A inclusão da subunidade NR3 reduz o tempo de

abertura e a condutância do canal e também diminui a densidade de espinhas em

neurônios corticais (Kew e Kemp, 2005).

Os receptores NMDA podem ser considerados os mais bem regulados de todos

os receptores ionotrópicos glutamatérgicos. Existem nada menos do que seis sítios

para ligantes endógenos que influenciam a probabilidade de abertura do canal. Desses,

os dois mais importantes são os sítios de ligação do agonista glutamato e do co-

agonista glicina. Esses sítios estão presentes respectivamente nas subunidades NR2 e

NR1 (Hirai et al., 1996; Laube et al., 1997). Portanto, o mínimo necessário para a

formação de um receptor NMDA funcional é um tetrâmero de subunidades NR1 e NR2.

A concentração de glicina necessária é baixa em relação à concentração geralmente

presente no cérebro, sugerindo que ela pode atuar como constante fator permissivo

para os efeitos do glutamato mediado pelo receptor de NMDA, mais do que como

mecanismo regulador (Dingledine et al., 1999a). No entanto, estudos mostraram que

um outro ligante pode ocupar o sítio da glicina promovendo a abertura do receptor

NMDA. Este ligante é a D-serina, que se mostrou três vezes mais potente que a glicina

no processo de ativação do canal (Matsui et al., 1995). Há também um sítio regulatório

ao qual se ligam poliaminas que também está envolvido na ativação do receptor (Bowie

e Mayer, 1995; Mori e Mishina 1995).

Existem também sítios inibitórios que reconhecem íons Mg

, Zn

e H

envolvidos no bloqueio do influxo iônico (Köles, 2001). Uma grande variedade de

antagonistas competitivos é capaz de inibir completamente a ativação do canal, ao

passo que antagonistas competitivos no sítio da glicina inibem indiretamente a ação do

glutamato. (Kew e Kemp, 2005).

Um importante mecanismo de inibição de receptores NMDA é mediado pelo Mg

extracelular. Esse cátion encontra-se bloqueando o poro do receptor quando a

membrana apresenta potencial de repouso. Para sua liberação é necessário que haja

uma pré-despolarização que ocorre através do influxo de íons pelos outros tipos de

receptores glutamatérgicos ionotrópicos. Mediante a essa variação de voltagem ocorre

uma pequena mudança conformacional na estrutura do canal e assim o íon Mg

pode

ser liberado (Dingledine et al., 1999a; Köles et al., 2001).

Outro fator de importante inibição alostérica da ativação do receptor de NMDA é

o pH. A freqüência de abertura do canal é reduzida pelo aumento da concentração de

prótons no meio extracelular além de um limiar fisiológico até o limite de pH 6.0. Abaixo

desse pH a ativação de receptores NMDA é suprimida quase completamente. A

ocupação de sítios de ligação de poliaminas atenua o bloqueio causado por prótons,

potencializando a ativação de receptores NMDA em condições de pH ácido. Entretanto,

em grandes concentrações, as poliaminas atuam em um sítio extracelular para produzir

um bloqueio dependente de voltagem do canal iônico, inibindo assim, a ativação do

receptor (Dingledine et al., 1999a).

Além desses mecanismos de regulação apresentados acima, os receptores

NMDA também são sensíveis a modulações por cinases e fosfatases. Uma dessas

enzimas moduladoras é CAMKII, capaz de interagir com o domínio C-terminal da

subunidade NR1. Essa interação causa inativação do receptor, levando a uma redução

da freqüência, assim como do tempo de abertura do canal. (Dingledine et al.,1999a;

Köles et al., 2001). A fosforilação do receptor NMDA por PKA e PKC geram dados

controversos que variam de nenhum efeito observado a uma potencialização da

atividade do canal. Entretanto, a maioria dos estudos revela que a atividade dessas

cinases está relacionada com aumento do tempo de abertura do receptor e diminuição

da afinidade do poro do canal pelo Mg

(Dingledine et al.,1999a; Köles et al., 2001).

Além disso, tanto fosfatases serina/treonina (calcineurina) quanto fosfatases de tirosina

são capazes de inativar receptores NMDA (Dingledine et al.,1999a; Köles et al., 2001).

Isso sugere que o balanço entre a atividade de cinases e fosfatases regulam a função

do receptor NMDA.

Por fim, a Figura 4 resume a função e a resposta intracelular gerada mediante a

ativação das 6 diferentes classes de receptores glutamatérgicos. Dentro da classe de

receptores ionotrópicos está representado os receptores do tipo NMDA, permeável a

e Ca

e cuja ativação requer a ligação do agonista glutamato e co-agonista glicina

assim como a liberação do íon Mg

que se encontra bloqueando o canal. Já os

receptores não-NMDA englobam os receptores do tipo AMPA e KA permeáveis ao Na

e em menor escala ao Ca

. Esses receptores são ativados pelo glutamato e seus

agonistas específicos, não sendo necessária a ligação de um co-agonista. A Figura

mostra, ainda, os receptores metabotrópicos, que, apesar de serem classificados em

três grupos foram representados esquematicamente em apenas dois. O grupo I que se

encontra acoplado a proteína G que ativa fosfolipase C e levando ao aumento dos

níveis de IP3 e DAG. E o grupo II, que no esquema esta representando os receptores

dos grupos II e III que se acoplam a proteína G inibitória diminuindo a atividade da

enzima adenilato ciclase. Dessa forma, a ativção dessa classe de receptores leva a

redução dos níveis intracelulares de AMPc.

Figura 4 – Esquema dos quatro tipos de receptores glutamatérgicos, seus principais

antagonistas e reguladores e seus mecanismos de ação. (Dingledine e McBain, 1999b).

1.3 – Acetilcolina

O sisitema colinérgico é um dos mais importantes sistemas de

neurotransmissores modulatórios não somente no cérebro mas em todo sistema

nervoso. A acetilcolina (ACh) foi o primeiro neurotransmissor a ser descrito em 1921 por

Loewi (ver Bennett, 2000) e desde então vem sendo atribuída a diversas funções como

sinalização na junção neuro-muscular, mediação das ações do sistema nervoso

autônomo parassimpático (Racké, et al., 2006), além de ser importante no controle do

fluxo sanguíneo cerebral, atividade cortical, ciclo sono-vigília (Schliebs e Arendt, 2006),

memória, aprendizado e diversos processos cognitivos no sistema nervoso central

(Sarter e Bruno, 2000). Na retina está presente em células do tipo amácrinas

controlando respostas seletivas para direção do movimento do sinal luminoso (Spira et

al., 1987).

A síntese de acetilcolina se dá a partir de colina e acetil-coenzima A (Acetil-CoA)

numa reação catalisada pela enzima colina-acetiltransferase (ChAT), segundo o

esquema da Figura 5 (Wu e Hersh, 1994). O acetil CoA utilizado na síntese de

acetilcolina provém do piruvato formado a partir da glicose na reação de glicólise e pelo

menos metade da colina utilizada no processo de síntese provém da reciclagem da ACh

que foi liberada e hidrolisada a colina pela ação de colinesterases. Uma outra fonte de

colina é a quebra da fosfatidilcolina, que pode ser estimulada pela ACh liberada

localmente. A captação dessa colina ocorre rapidamente através de transportadores

(CHT1), presentes na terminal pré-sináptico (Racke et al., 2006). O plasma sanguíneo

também é um importante fornecedor de colina; todos os tecidos são capazes de captá-

la a partir do plasma, entretanto, esse processo ocorre com maior afinidade nos

neurônios colinérgicos periféricos. Já os neurônios centrais não são capazes de captar

a colina plasmática, uma vez que esta não atravessa a barreira hematoencefálica

(Taylor e Brown, 2006). Sabe-se, porém, que a capacidade de captação de colina do

meio extracelular é limitante na síntese de acetilcolina (Racke et al., 2006).

Acetil CoA + Colina Acetilcolina + Coenzima A

Figura 5 – Esquema de síntese da acetilcolina (ACh)

catalisada pela enzima Colina Acetiltransferase (ChAT).

ChAT

Uma vez sintetizada, a ACh é armazenada em vesículas sinápticas para, então,

ser liberada por exocitose. Essa internalização ocorre através de transportadores

específicos denominados transportadores vesiculares de acetilcolina (VAChT). O

transporte de ACh para dentro das vesículas é dependente de uma bomba de H

ATPase. O contra-transporte de próton permite que a vesícula permaneça isosmótica e

eletricamente neutra (Sarter e Parikh, 2005).

A liberação de acetilcolina, assim como de outros neurotransmissores, é

dependente da despolarização do terminal pré-sináptico. O desencadeamento de um

potencial de ação no soma do neurônio e propagação do mesmo pelo axônio, chega ao

terminal pré-sináptico abrindo canais de Ca

dependentes de voltagem. A entrada de

permite a fusão da vesícula sináptica com a membrana e conseqüente exocitose

da acetilcolina (Sarter e Parikh, 2005). A liberação de ACh é regulada por mediadores,

que incluem a própria ACh liberada que atua sobre receptores pré-sinápticos. Uma vez

liberada, a ACh ira agir também sobre receptores colinérgicos presentes no terminal

pós-sináptico. O que limita a ação da acetilcolina na fenda sináptica é ação de enzimas

acetilcolinesterases (AChE), que hidrolisam a acetilcolina a acetato e colina,

disponibilizando assim, substrato para re-síntese do transmissor (Sarter e Parikh, 2005).

1.4 – Receptores Colinérgicos

1.4.1 – Receptores Nicotínicos

Os receptores nicotínicos são canais iônicos ativados por ligantes e sua ativação

causa o influxo de íons positivos, resultando na despolarização da membrana. Eles são

formados por cinco subunidades que se agrupam compondo estruturas homoméricas

ou heteroméricas (Racke et al., 2006). Já foram clonados e identificados 17 membros

das quatro diferentes famílias de subunidades. A família da subunidade α com 10

membros (α

1-10

), da subunidade β com 4 (β

1-4

) e as famílias γ, ε e δ com apenas um

membro cada (Cordero-Euraskin et al., 2000; Sgard et al, 2002). Para a formação de

um receptor funcional é necessário que haja pelo menos duas subunidades α e uma

subunidade β, ou então, cinco subunidades α

, caracterizando um receptor homomérico

(Racke et al., 2006). Os diferentes receptores nicotínicos formados a partir de

combinações das diversas subunidades possuem diferentes propriedades

farmacológicas e biofísicas, e podem ser divididos em três classes: muscular,

ganglionar e do sistema nervoso central. Como o próprio nome já diz, os receptores

musculares estão localizados na junção neuromuscular esquelética; os ganglionares

nos gânglios autônomos do sistema nervoso parassimpático; e os do SNC em diversas

regiões do cérebro. Todos eles de maneira geral são permeáveis aos íons Na

e K

com exceção da estrutura (α

)

que permite o influxo de Ca

. Esse receptor é expresso

exclusivamente no sistema nervoso central (Cordero-Euraskin et al., 2000).

1.4.2 – Receptores Muscarínicos

Receptores colinérgicos muscarínicos são receptores que se encontram

acoplados, via proteína G, a enzimas efetoras de uma cascata de sinalização

intracelular. A clonagem gênica revelou a existência de cinco diferentes tipos de

receptores muscarínicos, classificados de M

a M

(Racke et al., 2006; Caulfield e

Birdsall, 1998). Esses receptores estão distribuídos ao longo do sistema nervoso

central, músculos esqueléticos, lisos e órgãos inervados pelo sistema nervoso

parassimpático. O único que não é expresso no SNC é o receptor do tipo M

, este é

exclusivo de glândulas e músculo liso (Rang et al., 2003). Os receptores muscarínicos

de número ímpar estão acopladas a Fosfolipase C (PLC), ou seja, sua ativação

aumenta os níveis de IP3 e DAG no meio intracelular. Já os receptores de número par

estão acoplados via proteína G inibitória a enzima adenilato ciclase, ou seja, sua

ativação diminui os níveis intracelulares de AMP

. Além disso, a subunidade βγ da

proteína G pode modular a abertura de canais de K

a fim de controlar a excitabilidade

da célula (Racke et al., 2006).

1.5 – Glutamato e Excitotoxicidade

O glutamato e outros aminoácidos excitatórios podem agir como excitotoxinas,

especialmente quando o metabolismo energético está comprometido. Esse papel tóxico

dos aminoácidos excitatórios foi primeiramente descrito na década de 1970, quando

esses agentes eram administrados oralmente a animais em desenvolvimento.

Observou-se então, uma aguda neurodegeneração em áreas não protegidas pela

barreira hematoencefálica, principalmente no núcleo arqueado do hipotálamo (Burde et

al., 1971). Os mecanismos que induzem essa neurodegeneração são divergentes, e a

ativação de todas as classes de receptores ionotrópicos glutamatérgicos estão

envolvidos nesse processo (Michaelis, 2008; Halliwell, 2006).

A neurotoxicidade glutamatérgica ou excitotoxicidade, como é conhecida, está

diretamente ligada a hiperativação dos receptores ionotrópicos, e consequente,

aumento do influxo de Ca

. O principal receptor envolvido nesse processo é o NMDA,

embora os receptores não-NMDA e canais de Ca

dependentes de voltagem também

tenham participação na excitotoxicidade (Loureiro-dos-Santos et al., 2001; Camacho e

Massieu, 2006) que está relacionada com diversas condições patológicas. (Halliwell,

2006; Camacho e Massieu, 2006; Malarkey e Parpura, 2007).

Uma das patologias caracterizadas pela excitotoxicidade é a isquemia cerebral.

Para o bom funcionamento do cérebro é necessário o constante suprimento de oxigênio

e de sangue. Quando a demanda energética cerebral não é completamente satisfeita,

devido a uma interrupção total ou parcial do fluxo sanguíneo, ocorre a isquemia

cerebral. Ela é caracterizada por uma lesão focal e por uma perda neuronal ao redor da

área da lesão (Camacho e Massieu, 2006; Malarkey e Parpura, 2007). Diversos

modelos animais de isquemia cerebral têm sido utilizados para investigar a causa da

morte neuronal, que ocorre em duas etapas. Primeiro, quando o fluxo sanguíneo é

interrompido, neurônios sem suprimento de oxigênio sofrem necrose. O rompimento

dessas células leva ao extravasamento do conteúdo intracelular que inclui, dentre

outras substâncias, íons K

e glutamato (Camacho e Massieu, 2006; Malarkey e

Parpura, 2007). O aumento da concentração extracelular de K

faz os transportadores

de aminoácidos excitatórios gliais operarem de forma inversa liberando, assim, ainda

mais glutamato (Malarkey e Parpura, 2007). É consenso na literatura que a

excitotoxicidade glutamatérgica é a principal causa de morte na isquemia e em outras

patologias (Halliwell, 2006; Camacho e Massieu, 2006; Malarkey e Parpura, 2007).

O aumento da concentração do Ca

intracelular leva a um completo desbalanço

da homeostase celular. Ele ativa diversas vias enzimáticas envolvidas na morte celular,

tais como lipases, proteases, fosfatases e nucleases. Diversos mecanismos se somam

a esse processo, incluindo a produção e liberação de espécies reativas de oxigênio (do

inglês Reactive Oxygen Species (ROS)) a partir da mitocôndria (Atlante et al., 2001;

Anatoly et al., 2004; Da-Silva et al., 2004). Paralelamente, a cadeia transportadora de

elétrons é inibida pelo aumento do potencial de membrana mitocondrial e a célula entra

em acidose láctica (Halliwell, 2006; Camacho e Massieu, 2006). O Ca

também ativa a

enzima óxido nítrico sintase, responsável pela síntese de óxido nítrico. Este é um gás

que se difunde facilmente pela membrana e além de ter um papel fisiológico como

neurotransmissor e vasodilatador, é considerado um radical livre. (Dawson et al., 1991;

para revisão Miersch e Mutus, 2005). A reação de ROS, especialmente superóxido,

com óxido nítrico forma peroxinitrito uma outra molécula altamente reativa. Um terceiro

alvo do Ca

é a fosfolipase A

. Essa enzima tem como alvo fosfolipídeos de membrana

e o produto de sua catálise é o ácido araquidônico capaz de iniciar uma reação em

cadeia de peroxidação lipídica que pode também ser inicializada por outros radicais

livres. Isso resulta em perda da fluidez da membrana e de sua capacidade de impedir a

livre passagem de substâncias hidrofóbicas entre os meios intra e extracelular (Haliwell,

2006). Juntas, todas essas alterações caracterizam um estado de estresse oxidativo

onde há ou uma super produção de radicais livres ou uma depleção dos mecanismos

antioxidantes intrínsecos a célula. O estresse oxidativo induzido por glutamato é

demonstrado na Figura 6.

Figura 6 – Excitoxidade glutamatérgica. Hiperativação de receptores glutamatérgicos

induzindo estresse oxidativo. (Modificado de Dingledine e McBain, 1999b).

1.6 – Estresse Oxidativo e Radicais Livres

Um dos processos mais destrutivos do sistema nervoso central é uma

conseqüência direta de um dos aspectos do ambiente onde a maioria das espécies

vive. Este meio cria uma atmosfera constituída de 20% de oxigênio (O

), que é

altamente destrutivo devido ao potencial oxidativo dessas moléculas. Como,

obviamente, organismos aeróbicos não podem sobreviver na ausência de O

, o seu uso

inevitável muitas vezes leva a uma lenta degeneração celular (Reiter et al, 1995). Essa

necessidade de oxigênio conjugada ao seu poder oxidativo deram origem ao paradoxo

do oxigênio (Halliwell and Gutteridge, 1984), uma vez que as propriedades destrutivas

do O

e seus derivados podem ser responsáveis por muitos aspectos no processo do

envelhecimento (Harman, 1980, 1991; Poeggeler et al., 1993; Reiter et al, 1997a),

assim como por uma variedade de aspectos clínicos relatados durante a senescência

(Freeman e Crapo, 1982; Kehrer, 1993; Klaunig et al., 1997), incluindo muitas doenças

do SNC relacionadas à idade (Halliwell, 2006).

Para sobreviver em um ambiente oxidativo, o que ocorre com a maioria das

espécies, elas precisam estar equipadas com ferramentas moleculares necessárias ao

combate de pelo menos alguns dos efeitos destrutivos de um ambiente rico em O

Felizmente, os organismos possuem e tem a sua disposição moléculas conhecidas

como antioxidantes, que os ajudam a resistir a oxidação (Reiter, 1995; Halliwell, 2006).

Entretanto, com o avançar da idade ou quando os organismos são expostos a toxinas

e/ou agentes geradores de radicais livres, esse complexo sistema de defesa

antioxidante pode não estar apto a cumprir com seu objetivo, gerando assim doenças e

sinais do envelhecimento (Abramov et al., 2004a; Canevari et al., 2004b; Halliwell,

2006; Reynolds et al., 2007).

Cerca de 90% do oxigênio que entra nas células humanas é utilizado para

produção de energia pela citocromo oxidase mitocondrial. Durante esse processo, 4

eletrons (e

) são adicionados a cada molécula de O

resultando na formação de duas

moléculas de água.

+ 4H

+ 4e

→ 2H

O problema é que esses elétrons são adicionados um de cada vez e entre a redução

total do O

a H

O formam-se espécies intermediárias que são altamente reativas. Essas

são as chamadas espécies reativas de oxigênio (ROS). (Halliwell, 1992; Halliwell,

2006). Uma parte de todo oxigênio internalizado pela célula, forma espécies de O

parcialmente reduzidas; isso em condições normais (Reiter, 1995). Algumas dessas

espécies contêm um elétron não pareado sendo conhecidos como radicais livres. A

própria molécula de oxigênio diatômico, O

, é caracterizada como um radical livre, uma

vez que ela possui dois elétrons não pareados, cada um localizado em um orbital

diferente, mas ambos possuindo um mesmo número de spin. Devido a esse spin

paralelo dos elétrons não pareados, O

por si só possui uma baixa reatividade, em

contraste com outros radicais livres que podem ser altamente reativos. Portanto, a

reação do oxigênio com espécies não radicais é altamente limitada pelo fator de

restrição do spin (Halliwell, 2006).

Dentro de um sistema biológico, a acepção de elétrons um de cada vez pelo O

resulta nos seguintes intermediários:

→ radical anion superóxido (O

)

→ peróxido de hidrogênio (H

)

→ radical hidroxila (

•

OH)

•

OH +

→ água (H

Esses intermediários possuem diferentes graus de reatividade com espécies não

radicais e uma de suas fontes é a cadeia transportadora de elétrons na mitocôndria

além de enzimas como a NDPH oxidase e também o retículo endoplasmático (Nohl e

Hegner, 1978; Sohal, 1997). Alguns dos principais radicais serão descritos a seguir,

entretanto, esses não são os únicos radicais livres produzidos intracelularmente

(Halliwell, 2006).

1.6.1 – Radical Superóxido

A adição de um único elétron ao O

gera O

que possui um único elétron não

pareado. Em ambiente aquoso, O

não reage facilmente com alvos biológicos; ele é

capaz de inativar poucas enzimas diretamente (Halliwell, 1992). Em solução, O

geralmente existe em equilíbrio com o radical hidroperoxila (HO

). Em condições de

acidose tecidual esse equilíbrio tende a ser deslocado favorecendo a formação de HO

Este é muito mais lipossolúvel e é de longe um agente oxidante mais poderoso que o

(Halliwell, 1992).

Uma importante enzima antioxidante presente em tecidos humanos é a

Superóxido Dismutase (SOD). Esta age convertendo O

à H

. Além dela, outras

enzimas agem gerando H

, incluindo L-aminoácido oxidase, glicolato oxidase e

monoamino oxidase (Halliwell, 1992).

1.6.2 – Peróxido de Hidrogênio

Peróxido de hidrogênio (H

), por si só, não é um radical (não possui um elétron

desemparelhado) e por isso não é especialmente tóxico, a menos que se encontre em

altas concentrações dentro da célula. Essa molécula se difunde facilmente pelas

membranas celulares e pode, portanto, se distribuir para sítios distantes de onde foi

gerada (Reiter, 1995). Essas moléculas podem ser removidas das células humanas por

diversos tipos de enzimas: catalases, glutationa-peroxidases, peroxidases, tiorredoxinas

peroxidases e perirredoxinas, sendo que no cérebro a ação da segunda é mais

importante. A catálise da reação de H

com a glutationa reduzida (GSH) gera duas

glutationas ligadas por uma ponte dissulfeto. Essa molécula pode ser reconvertida a

GSH pela ação da enzima glutationa redutase (Halliwell, 2006). Recentemente, uma

outra classe de enzimas, as peroxiredoxinas, foi descrita como importante no processo

de remoção de H

e de peróxidos orgânicos. (Rhee et al., 2005).

1.6.3 – Radical Hidroxila

O peróxido de hidrogênio pode também ser reduzido a radicais hidroxilas (°OH)

quando na presença de metais como o Fe

e Cu

, em processo conhecido como

reação de Fenton (Imlay et al., 1988; Halliwell e Gutteridge, 1990; Yamasaki e Piette,

1991).

O radical hidroxila provavelmente não é a única espécie destrutiva formada

durante a reação de Fenton (Bielski, 1991), mas a sua formação é bem documentada

assim como a sua habilidade em oxidar moléculas adjacentes. (Halliwell e Gutteridge,

1989). Uma vez produzido,

•

OH é capaz de reagir com qualquer molécula localizada

poucos ângstroms do lugar onde este é formado.

•

OH rapidamente danifica DNA

nuclear e mitocondrial, lipídeos de membrana e também carboidratos. Dentre esses

processos oxidativos, a peroxidação de lipídeos, que pode ser iniciada por

•

OH assim

como por outros radicais (Reiter, 1995). Este processo consiste na oxidação de lipídeos

de membranas com a conseqüente formação de radicais peroxilas. Uma vez inicializado

ele se autopropaga ao longo de cadeias de ácidos graxos. Durante o processo de

decomposição de lipídeos, uma série de produtos tóxicos é gerada. Isso inclui

hidroperóxido de lipídeos e radicais peroxilas (Halliwell, 2006).

1.6.4 – Óxido Nítrico

O óxido nítrico (NO) é uma molécula com papel ambíguo. Em condições

fisiológicas normais ele possui um importante papel como molécula mensageira

neuronal (Dawson et al., 1992). Entretanto, quando sua concentração intracelular

aumenta, atingindo níveis anormais, ele inicia uma cascata tóxica de eventos que levam

a morte neuronal (Richter e Schweizer, 2002; Boje, 2004; Miersch e Mutus, 2005). Seus

papeis fisiológicos podem ser observados nos sistemas: imunológico, renal, endócrino,

respiratório e reprodutor (Boje, 2004). No SNC ele exerce um importante papel como

mensageiro retrógrado durante a formação de LTP (potenciação de longa duração) (Qiu

e Knopfel, 2007). Alguns trabalhos defendem o papel protetor do óxido nítrico durante o

estresse oxidativo, entretanto, a grande maioria dos resultados apontam para essa

molécula como um agente tóxico (Boje, 2004).

O óxido nítrico é sintetizado a partir de L-arginina pela enzima óxido nítrico

sintase (NOS) que apresenta três isoformas diferentes: a endotelial (eNOS) e a

neuronal (nNOS), que são as isoformas constitutivas e, também, a isoforma induzível

(iNOS). As isoformas constitutivas possuem atividade dependente de Ca

, logo,

respondem positivamente ao aumento do Ca

intracelular. Já a isoforma induzível

depende de um agente estressor externo como, por exemplo, a inflamação, para ser

expressa (Boje, 2004).

A toxicidade do óxido nítrico durante o estresse oxidativo é devida tanto a sua

capacidade de oxidar resíduos tióis (SH) de proteínas e enzimas quanto à possibilidade

de formar outras espécies reativas, conhecidas como espécies reativas de nitrogênio

(do inglês “Reactive Nitrogen Species” (RNS)). O óxido nítrico reage tanto com o

oxigênio quanto com o radical superóxido no processo de formação das RNS que,

também, oxidam resíduos SH dos aminoácidos que constituem as proteínas (Miersch e

Mutus, 2005).

Um outro alvo do óxido nítrico enquanto molécula reativa é o monofosfato de

guanosina cíclica (GMPc). Essa molécula é nitrada pelo óxido nítrico formando o

composto 8-nitroguanosina 3´,5´-monofosfato cíclico (8-nitro-GMPc) que é capaz de

reagir com grupamentos SH presentes em aminoácidos de proteínas e enzimas numa

reação caracterizada como S-guanilação que foi identificada como uma nova

modificação pós-traducional. Moléculas protéicas e enzimáticas que sofrem essa

reação têm o seu funcionamento fisiológico comprometido (Sawa et al., 2007).

1.6.5 – Peroxinitrito

Uma das RNS mais bem estudadas é o peroxinitrito (ONOO

), formado a partir

da reação do óxido nítrico com o radical superóxido. Mesmo sendo uma molécula

simples, ONOO

é extremamente reativa. Sua toxicidade se deve a sua habilidade em

diretamente nitrar e hidroxilar anéis aromáticos de resíduos de aminoácidos, reagir com

sulfidrilas, com resíduos zinco-tiolatos assim como com lipídeos de membrana,

proteínas e DNA (Radi et al., 1999a e b; Trujilo e Radi, 2002; Radi, et al., 2002; Boje,

2004; Reynolds et al., 2007). Essa atividade ubíqua faz do peroxinitrito uma molécula

que pode ter efeitos devastadores na fisiologia e viabilidade neuronal.

Alguns estudos revelam que o peroxinitrito é uma molécula altamente reativa

capaz de induzir mudanças em proteínas, através da oxidação de resíduos de cisteína,

metionina e triptofano, assim como através da nitração ou nitrosação desses mesmos

resíduos (Pryor e Squadrito, 1995; Radi et al., 2001; Reynolds et al., 2007). Na reação

de nitração um grupamento -NO

é transferido para resíduos de aminoácidos

específicos, assim como ocorre na conversão de tirosina em 3-nitrotirosina (Bertelett et

al., 1997). Os radicais peroxinitrito são responsáveis também pela reação de S-

nitrosação, capaz de interconverter resíduos de cisteína em S-nitrosocisteína. A

formação da ligação S-nitrosocisteína é geralmente reversível, enquanto, a ligação 3-

nitrotirosina é bastante estável (Kluge et al., 1997). Não é somente o peroxinitrito que é

capaz de nitrar ou nitrosar moléculas protéicas, acredita-se que o próprio óxido nítrico

seja capaz de reagir com resíduos -SH de aminoácidos específicos. (Miersch e Mutus,

2005).

A interação de radicais peroxinitrito com diversas enzimas é capaz de inativá-las

ou de reduzir a sua atividade enzimática. Essa alteração se deve possivelmente à

formação de resíduos 3-nitrotirosina e S-nitrosocisteína principalmente no sítio catalítico

da enzima ou em algum domínio de regulação alostérica.

A inativação da NOS por peroxinitrito pode significar um feedback negativo de

regulação vital (Huhmer et al., 1996; Huhmer et al., 1997). O radical peroxinitrito pode

também inativar uma série de outras enzimas, tais como colina acetiltransferase

(Gaudry-Talarmain et al., 1997) α1-antiproteinase (Whiteman and Halliwell, 1997),

caspase (Smutzer, 2001), succinato desidrogenase (Balabandi et al., 1999), glutamina

sintetase (Berlett et al., 1997), gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (Souza e Radi,

1998), Ca

-ATPase do retículo sarcoplasmático (Viner et al., 1996), creatina cinase

mitocondrial (Stachowiak et al., 1998), tirosina hidroxilase (Ara et al., 1998), Mn

superóxido dismutase (Yamakura et al., 1998), glutationa redutase (Francescutti et al.,

1996), complexo I da respiração mitocondrial (Brown e Borutaite, 2004) e citocromo

oxidase (Heales et al., 1999; Cassina e Radi, 1996). Surpreendentemente, modificações

causadas por peroxinitrito podem levar a ativação de algumas enzimas, tais como

ciclooxigenase (Salvemini, 1997) e poli ADP sintetase (Szabados et al., 1999). Tanto a

ativação quanto a inativação de enzimas se deve provavelmente a formação de 3-

nitrotirosina.

Entretanto, a formação de S-nitrosocisteína, muito menos estável que 3-

nitrocisteína, por S-nitrosação, pode também apresentar um efeito inibitório na atividade

de certas enzimas, incluindo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Molina et al., 1993)

e caspase-3 (Haendeler et al., 1997). S-nitrosação pode também afetar proteínas como

albumina, glutationa e hemoglobina (Lander, 1997), mostrando assim a importância

fisiológica desse processo.

1.7 – Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas

As várias doenças neurodegenerativas possuem diferentes sintomas e

acometem áreas distintas do cérebro. Tais patologias não serão abordadas com

detalhe, entretanto, será focado o que elas possuem em comum: disfunção

mitocondrial, aumento do dano oxidativo, presença de agregados protéicos e

envolvimento da excitotoxicidade como mediador de morte neuronal (Beal, 1995;

Bartlett e Stadtman; 1997).

O aumento da produção de radicais livres está relacionado com os efeitos

deletérios e sintomatologia de diversas patologias neurodegenerativas: Doença de

Parkinson (PD), Doença de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrófica (ALS),

demência associada ao HIV (Reynolds et al. 2007), isquemia cerebral (Camacho e

Massieu, 2006; Malarkey e Parpura, 2007), Doença de Huntington (Browne et al.,

1999), ataxia de Freidreich (Trushina e McMurray, 2007) e Doença do Prion

(Unterberger et al., 2005). O mecanismo exato como o estresse oxidativo se inicia em

cada uma dessas patologias ainda é incerto, mas sabe-se que em algumas delas como,

por exemplo, isquemia cerebral e Alzheimer, o mesmo está associado a

excitotoxicidade glutamatérgica (Malarkey e Parpura, 2007; De Felice et al., 2007).

Outra característica em comum entre essas doenças é o aumento da produção de ROS

e NO e também a presença de proteínas oxidadas e nitradas (Halliwell, 2006). Algumas

condições patológicas podem também estar sendo mediadas pela formação de

peroxinitrito. Essa relação foi observada em patologias como Mal de Parkinson, Mal de

Alzheimer, Doença de Huntington, hipertensão, esclerose múltipla e miocardite

autoimune (Hensley et al., 1998; Pacher et al., 2007). A patogenicidade dessas doenças

pode, no mínimo, estar parcialmente ligada a formação de 3-nitrotirosina, que tem sido

usada como um marcador do efeito do estresse oxidativo mediado por peroxinitrito

sobre enzimas e proteínas. Algumas das principais características relacionadas ao

estresse oxidativo de algumas patologias estão resumidas na Tabela 1.

Doença de Parkinson Doença de Alzheimer ALS

Disfunção Mitocondrial

Inibição do Complexo I

e da αKGDH (α-

cetoglutarato

desidrogenase)

Inibição do Complexo

IV, da αKGDH e da

piruvato

desidrogenase.

Hiperfosforilação da

tau prejudica a

mitocôndria.

Inibição do Complexo I

e do Complrexo IV

Agregação Protéica

Anormal

Corpúsculo de Lewy Placas amilóides,

depósitos de

oligômeros de

amilóides,

emaranhados

neurofibrilares

Agregados contendo

ubiquitina,

neurofilamentos,

dorfina. Agregados de

SOD causados por

mutações nessa

enzima.

Mudanças Metabólicas

Mais ferro na

substância nigra

Acúmulo de ferro nas

placas

Depósito de ferro nos

neurônios em

degeneração

Dano Oxidativo e

Nitrativo

Substância nigra revela

níves reduzidos de

GSH e aumento dos

níveis de peróxido de

lipídeos, dano de

ácidos ribonucléicos,

proteínas carboniladas,

3-nitrotirosina, cisteinil-

DOPA e cisteinil-

dopamina.

Aumento do dano de

ácidos nucléicos e

ribonucléicos, dos

níveis de proteínas

carboniladas, 3-

nitrotirosina. Placas

contem proteínas

glicosiladas, oxidadas

e nitradas.

Aumento do dano em

ácidos ribonucléicos,

presença de proteínas

carboniladas, produtos

de glicoxidação e 3-

nitrotirosina na medula

espinhal.

Ataxia de Freidreich

Doença de

Huntington

Doença do Príon

Disfunção Mitocondrial

Frataxina é uma

proteína Fe-S

mitocondrial. Inibição

do Complexo I, II, III e

aconitase.

Inibição do Complexo II

e III. Huntingtina

mutada pode se ligar a

mitocondria

Inibição mitocondrial

Agregação Protéica

Anormal

Frataxina agrega no

núcleo

Agregados contendo

huntingtina, ubiquitina,

Hsps e subunidadas

proteasomicas.

Agregação anormal de

proteínas príon.

Mudanças Metabólicas

Acredita-se que o ‘Fe

catalítico’ esteja

aumentado.

Depósito de ferro nas

lesões.

Aumento do ferro nas

áreas afetadas.

Dano Oxidativo e

Nitrativo

Dano a ácidos

nucléicos e

ribonucléicos.

Dano a ácidos

ribonucléicos. Aumento

da peroxidação e

formação de

nitrotirosina

Aumento da formação

de nitrotirosina.

Tabela 1 – Algumas doenças neurodegenerativas e suas relações com o estresse oxidativo.

(Adaptado de Halliwell, 2006)

1.8 – Enzimas e Moléculas Antioxidantes

A produção de radicais livres é um resultado do metabolismo celular e ocorre

mesmo em células jovens e sadias. Sabe-se que uma fração todo oxigênio que entra na

célula é parcialmente reduzida a ROS durante a fosforilação oxidativa (Reiter, 1995). A

fim de limitar o potencial oxidativo dessas moléculas a célula dispõe de mecanimos

antioxidantes, enzimáticos ou não, intrínsecos a ela. Uma das enzimas envolvidas no

processo de redução de radicais livres é a superóxido dismutase (SOD). Esta age

reduzindo a molécula de superóxido (O

) a peróxido de hidrogênio (H

). Apesar de

ser menos reativo que o superóxido, o peróxido de hidrogênio também oferece dano

oxidativo a célula uma vez que pode ser espontaneamente convertido a radical hidroxila

(

•

OH), que é uma molécula altamente reativa. O peróxido de hidrogênio, portanto, pode

ser removido das células através da ação de duas enzimas. A catalase, que promove a

quebra de H

a H

O e O

e a glutationa-peroxidase, que ao reagir com o H

gera

duas glutationas ligadas por uma ponte dissulfeto que é novamente reduzida pela ação

da glutationa redutase. (Figura 7) (Halliwell, 1992; Halliwell, 2006).

Figura 7 – Esquema do mecanismo de ação das principais enzimas antioxidantes celulares

que agem limitando o potencial oxidativo de ROS.

(http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/5942/Superoxide-Dismutase.gif)

Além dos mecanismos intrínsecos a célula, o uso de compostos antioxidantes

exógenos tem sido uma excelente ferramenta de combate à produção de radicais livres

e ao estresse oxidativo, sendo utilizados inclusive como suplemento alimentar, embora

a suplementação seja controversa. Duas dessas moléculas são de especial interesse

para esse estudo: vitamina E (tocoferol) e vitamina C (ácido ascórbico). A vitamina E é

uma molécula hidrofóbica e, portanto, atravessa facilmente a membrana das células

assim como a barreia hematoencefálica. Devido a sua natureza lipídica, a ação dessa

molécula é restrita a regiões próximas a membrana plasmática e em domínios

lipoprotéicos. Ela é conhecida por ser um excelente redutor do radical peroxila

bloqueando reações de peroxidação em cadeia. De maneira geral ela aumenta o

potencial redutor da célula diminuindo, assim, os danos do estresse oxidativo (Traber e

Atkinson, 2007; Azzi, 2007).

A vitamina C é uma molécula hidrofílica e está presente em grande quantidade

em diversos alimentos, principalmente naqueles de origem vegetal. Sua absorção e

entrada nas células ocorrem através de transportadores específicos em um processo

dependente de energia. Uma vez dentro da célula a vitamina C age como um redutor de

espécies oxidadas diminuindo seu poder de reação. Uma vez oxidada, ela pode ser

novamente reduzida e reciclada a sua conformação inicial através da ação de enzimas

celulares. Portanto, a vitamina C tem sido largamente utilizada em estudos na tentativa

de reduzir os efeitos deletérios do estresse oxidativo (Linster et al., 2007).

Além da vitamina C e da vitamina E outras moléculas com ação antioxidante tem

sido utilizadas até mesmo como suplemento alimentar na tentativa de melhorar e até

mesmo prevenir quadros patológicos. Estudos recentes mostraram um papel

neuroprotetor e antioxidativo para ácidos graxos essenciais (EFAs) (Lauritzen et al.,

2000; Kawasaki et al, 2002, Wang et al, 2006, Ahmad et al, 2006). Essas moléculas não

são sintetizadas no organismo e, portanto precisam ser ingeridas na alimentação.

Essas podem ser classificadas de acordo com o nível de insaturação em sua estrutura:

1. poliinsaturadas, mais de uma dupla ligação. 2. monoinsaturada, uma única dupla

ligação. 3. saturada, ausência de dupla ligação. A maior parte dos estudos da literatura

relata que os ácidos graxos capazes de conferir neuroproteção são os poliinsaturados.

Ainda não se sabe exatamente qual o mecanismo responsável por essa neuroproteção,

mas acredita-se que as duplas ligações presentes na estrutura desses ácidos graxos

atuem como alvo para os radicais livres, protegendo assim as moléculas de enzimas e

proteínas do ataque desses radicais (Chen e Bazan, 2005; King et al., 2006; Bazan,

2007). Outros dados revelam que um dos ácidos graxos poliinsaturados, o ácido

araquidônico, é capaz de impedir a elevação do Ca

intracelular (Sergeeva et al., 2005)

e ativar canais de K

(Lauritizen et al., 2000). Entretanto, a despeito do mecanismo de

ação dessas moléculas, cada vez mais o número de insaturações em sua estrutura vem

sendo correlacionado com sua capacidade de conferir neuroproteção.

A seguir, na Figura 8 alguns dos principais ácidos graxos utilizados neste estudo.

Oleic

Oleico

Linoléico

-Linolênico

raquidônico

Esteárico

Figura 8 – Alguns dos principais ácidos graxos utilizados neste estudo.

1.9 – Doença de Alzheimer e Disfunção Colinérgica

A patologia de Alzheimer é uma doença que se caracteriza histopatologicamente

pelo acúmulo de placas senis no meio extracelular e pela formação de emaranhados

neurofibrilares no meio intracelular. A formação das placas senis é o resultado da

agregação de peptídeos beta-amilóides (Aβ

1-40

e Aβ

1-42

). Esses peptídeos são formados

a partir do processamento incorreto da proteína precursora do amilóide (APP), que se

encontra inserida na membrana de várias células do organismo, e quando processada

corretamente forma peptídeos solúveis (APP

) que não oferecem risco à saúde. Em

contraste, os peptídeos Aβ se agregam formando fibrilas e se depositando nos

neurônios (Pearce, 2000). Ainda não se sabe ao certo o que leva ao aumento do

processamento incorreto da APP, entretanto, acredita-se que existam duas

possibilidades para explicação desse fato. Uma seria a de que as enzimas envolvidas

no processamento do APP (secretases) passariam a gerar, de forma anômala, maior

teor de Aβ

1-42.

A outra seria que, devido a um aumento da expressão de APP em

células cerebrais, o próprio processamento natural de APP geraria teores aumentados

de Aβ que se depositariam no tecido (Selkoe, 1999, Harper e Landsbury,1997). Durante

muito tempo acreditou-se que a forma fibrilar dos peptídeos Aβ era a responsável pela

toxicidade e morte neuronal. Entretanto, estudos recentes demonstram que a forma

oligomérica desses peptídeos é a real causa da morte celular (De Felice et al., 2007;

Ferreira et al., 2007; Walsh e Selkoe, 2007).

Uma outra característica da doença de Alzheimer é a formação de emaranhados

neurofibrilares devido a uma hiperfosforilação da proteína tau. Tau é uma proteína

associada a microtúbulos e sua fosforilação leva a desestabilização da rede de

filamentos protéicos que compõem o citoesqueleto. Como conseqüência, essas

proteínas se agregam caracterizando assim os emaranhados intracelulares (Pearce,

2000). Essas duas características histopatológicas da Doença de Alzheimer foram

observadas nos estudos pioneiros de Alois Alzheimer de 1907 (ver Pearce, 2000).

Funcionalmente, a patologia de Alzheimer é caracterizada, inicialmente, por uma

degeneração de neurônios colinérgicos, principalmente daqueles localizados no núcleo

basal de Meynert. Associada a essa neurodegeneração observa-se também uma perda

de atividade da enzima colina acetiltransferase (ChAT) e redução dos ensaios de

ligação a receptores nicotínicos e muscarínicos. Esses dados sugerem uma associação

entre hipofunção colinérgica e o déficit cognitivo e alterações de memória observadas

em pacientes acometidos por essa doença (Cummings e Back, 1998; Schliebs e Arendt,

2006). Em conjunto, essas observações deram origem a hipótese colinérgica da

disfunção de memória na senescência e na doença de Alzheimer (ver Bartus, 2000).

A degeneração principalmente de neurônios colinérgicos na doença de

Alzheimer é um fato. Mas o que estaria causando essa neurodegeneração? Décadas

de pesquisas se dedicaram a responder essa questão que ainda não foi totalmente

elucidada. Dados recentes revelam que oligômeros do peptídeo Aβ são capazes de

interagir com receptores do tipo NMDA induzindo a produção de radicais livres e

conseqüente morte de neurônios corticais em cultura (De Felice et al, 2007). Como já

foi descrito anteriormente a hiperativação de receptores NMDA levam ao grande influxo

de Ca

e conseqüente produção de ROS e RNS que causam grandes danos à célula.

Um outro trabalho mostra esse mesmo tipo de receptor mediando o efeito de Aβ sobre

a perda de sinapses (Shankar et al, 2007). Esses dados apontam para a ativação de

receptores do tipo NMDA por Aβ como a causa dos efeitos deletérios da doença de

Alzheimer. Além disso, os peptídeos Aβ são capazes de induzir a liberação excessiva

de glutamato (Noda et al., 1999).

1.10 – A Retina como modelo de estudo

A retina é uma das partes do sistema nervoso central responsável pela

informação visual. É um tecido de pouca espessura que forma a camada mais interna

de olho (Figura 9). Esta estrutura possui a mesma origem embrionária que o cérebro,

sendo, portanto, parte integrante do Sistema Nervoso Central (SNC), possuindo,

inclusive, barreira hematoencefálica. (Kolb, 2003).

Figura 9 - Diagrama do olho humano mostrando suas diferentes estruturas. Sua camada mais

importante, a retina, está esquematizada mostrando suas diferentes camadas e tipos celulares.

(Modificado de Kolb, 2003)

O tecido retiniano se apresenta estratificado em diferentes camadas, sendo três

de corpos celulares intercaladas por duas de contatos sinápticos ou plexos. A camada

mais externa é a camada de fotorreceptores ou camada nuclear externa (CNE), que

como o próprio nome já diz, abriga o segmento externo dos fotorreceptores e seus

corpos celulares. Abaixo da camada nuclear externa se encontra a camada plexiforme

externa (CPE), formada pelos contatos sinápticos entre fotorreceptores e as células que

formam a camada nuclear interna (CNI). A terceira e última camada de corpos celulares

é formada pelas células ganglionares (camada de células ganglionares – CCG), cujos

contatos sinápticos com axônios provenientes da CNI compreendem a camada

plexiforme externa (Kolb, 1994). Nessa camada há também a presença de células

amácrinas deslocadas. Diferentes tipos de células estão inseridos nos diversos estratos

da retina: foterreceptores na CNE, bipolares, interplexiformes, horizontais e amácrinas

na CNI e na CCG, células ganglionares na CCG e células de Müller (gliais) ao longo

das diferentes camadas. Estas foram descritas no trabalho pioneiro de Ramón y Cajal

em 1893.

As células amácrinas são os neurônios retinianos que apresentam a maior

diversidade morfológica e de neurotransmissores expressos, sendo por essa razão as

células mais estudadas da retina (Morgan, 1991; McNeil e Masland, 1998). Recebem

aferências de células bipolares e de outras células amácrinas e passam esta

informação para outras células amácrinas, bipolares e para células ganglionares.

Apesar de simples, se comparado às demais estruturas do SNC, a retina

expressa a maquinaria de síntese, armazenamento e liberação dos mais diversos

neurotransmissores, assim como os receptores aos quais estes se ligam. (Morgan,

1991; McNeil, e Massland, 1998; Yang, 2004; Shen, 2006). Essa riqueza de sistemas

de neurotransmissores faz da retina um tecido interessante para estudo das interações

sinápticas (Figura 10). Além disso, é um tecido de localização anatômica favorável. Na

galinha, em particular, possui fácil acesso durante todos os estágios de

desenvolvimento, garantindo uma preparação rápida e livre de contaminação por outras

estruturas.

CCG

CNE

CPI

CPE

Glutamato As

artato

Taurina

Melatonina

GABA Dopamina

Glutamato

CNI

Nos últimos anos o nosso grupo tem utilizado neurônios colinérgicos

provenientes de retina de ave em cultura como instrumento de estudo da diferenciação

desse fenótipo neuronal (De Mello et al., 1990). A retina possui entre as células

amácrinas uma subpopulação de células colinérgicas (Loureiro-dos-Santos, 2002) que

Glicina

Dopamina

Serotonina

Adrenalina

NPY

Encefalina

VIP

LHRH

Glucagon

CCK

Taurina

Substância P

Óxido Nítrico

Aspartato

Neurotensina

GABA

Somatostatina

Figura 10 - Esquema de neurotransmissores nas diferentes camadas da retina de aves.

Destaque para as células glutamatérgicas e colinérgicas de especial interesse para nosso estudo.

EP: epitélio pigmentado; CNE: camada muclear externa; CPE: camada plexiforme externa; CNI:

camada nuclear interna; CPI: camada plexiforme interna; CCG: camada de células ganglionares.

Desenhado por Guimarães, M.Z.P.

representam cerca de 5% da população total dos neurônios retinianos (Puro et al.,

1977). Em trabalhos anteriores esse mesmo modelo foi utilizado para estudos

envolvendo a dinâmica de formação de sinapses colinérgicas neuro-muscular (Puro et

al., 1977).

1.10.1 – A Problemática

Vários modelos experimentais têm sido procurados para auxiliar no entendimento

da biologia celular de disfunções envolvendo neurônios colinérgicos semelhantes às

observadas em pacientes com doença de Alzheimer. Estudos prévios revelaram que os

neurônios colinérgicos retinianos são sensíveis à ação excitotóxica do glutamato.

Avaliar o efeito do glutamato no sistema colinérgico se torna interessante, uma vez que

Aβ é capaz de induzir a liberação desse neurotransmissor tanto por células neuronais

quanto por células glias interferindo com a sua homeostase no meio extracelular

(Arrieta e Tapia, 1995; Reiter et al., 1995; Louzada et. al. 2001; Bobich et al., 2004;

Vesce et al., 2007). Em 2001, Loureiro-dos-Santos mostrou que o tratamento de

neurônios em cultura com aminoácidos excitatórios era capaz de inibir a atividade

ChAT, e que, quanto maior o tempo de incubação, maior é a inibição enzimática. Essa

perda de atividade não era devida a uma degradação da molécula da enzima, uma vez

que dados de western blot não revelaram alterações nos níveis da molécula da enzima,

nem a morte de neurônios colinérgicos em cultura, já que a captação de colina in vitro

pelas células tratadas com glutamato permanecia inalterada. Portanto, o tratamento

crônico com glutamato era capaz de inibir a atividade da ChAT sem promover a morte

dos neurônios em cultura. Uma vez inibida a atividade catalítica dessa enzima não era

possível reverter esse efeito com a adição de nenhum tipo de molécula antioxidante.

Somente após nove dias após a retirada do agente excitotóxico a ChAT desses

neurônios colinérgicos voltavam a apresentar atividade catalítica em níveis semelhantes

ao controle, sugerindo que seria necessário a síntese de novo da molécula da enzima.

Esses dados indicam que alterações pós-traducionais irreversíveis estejam ocorrendo

na molécula da enzima causando sua inativação. (Loureiro-dos-Santos et al., 2001).

Os estudos realizados por Loureiro-dos-Santos (2001) revelaram que todas as

classes de receptores glutamatérgicos capazes de comprometer a homeostase do Ca

estão envolvidos com o processo de inibição da ChAT, inclusive receptores

metabotrópicos do grupo I. O efeito de inibição só era completamente bloqueado

quando o experimento era realizado na presença de antagonistas específicos para

receptores do tipo NMDA, não-NMDA e metabotrópicos do grupo I. Embora o efeito de

inibição fosse mediado majoritariamente pelos receptores ionotrópicos, a participação

do receptor metabotrópico não pode ser excluída. Outro dado interessante revela que

quando o tratamento era feito na ausência de Ca

ou na presença de um quelante

desse íon a inibição da ChAT era completamente prevenida. Portanto, esses dados

sugerem que independente do tipo de receptor glutamatérgico ativado, para que ocorra

inibição da ChAT é necessário que haja aumento da concentração intracelular de Ca

Uma vez que foi demonstrado que o tratamento crônico com glutamato é capaz

de inibir irreversivelmente a ChAT tornou-se interessante verificar se peptídoes

análogos ao Aβ, produzido na doença de Alzheimer, eram capazes de promover uma

disfunção colinérgica nesses neurônios retinianos em cultura. Observou-se, então, que

a incubação com o peptídeo Aβ

25-35

(análogo sintético ao produzido na patologia de

Alzheimer) também era capaz de promover a inibição da ChAT e que esse efeito é

dependente da ativação de todas as classes de receptores glutamatérgicos. Esses

resultados corroboram com dados da literatura que, conforme já foi descrito, relatam

não somente o aumento induzido por Aβ da liberação de glutamato pelo terminal pré-

sináptico como também a ativação de receptores do tipo NMDA diretamente por esses

peptídeos amiloidogênicos (Ferreira et al.,2007), fortalecendo ainda mais a correlação

entre ativação de receptores NMDA e os efeitos deletérios da doença de Alzheimer.

Nas condições de cultivo utilizadas nesses experimentos, os neurônios

retinianos, por razões ainda desconhecidas, são refratários aos efeitos tóxicos de

glutamato e seus agonistas, no que diz respeito à morte celular (Loureiro dos Santos

2000). Portanto, estamos utilizando essa propriedade de resistência neuronal ao

glutamato e seus agonistas para tentar identificar quais os mecanismos que levam à

diminuição da atividade da ChAT por aminoácidos excitatórios (AAEs), uma vez que

este efeito não é devido a uma destruição de neurônios colinérgicos.

Acredita-se que a ativação crônica de receptores glutamatérgicos, aumento do

intracelular e conseqüente geração de radicais livres sejam os principais

responsáveis pela inativação da ChAT. É provável que esses radicais livres estejam

oxidando resíduos de aminoácidos importantes para a atividade catalítica da enzima.

Alguns trabalhos na literatura descrevem claramente o efeito do radical peroxinitrito e

conseqüente formação de 3-nitrotirosina na modulação da atividade da ChAT (Morot et

al., 1997 e Guermonprez et al., 2001). Como a ativação crônica de receptores

glutamatérgicos leva a produção de radicais livres diversos, incluindo peroxinitrito,

torna-se interessante investigar se essas espécies reativas são responsáveis pela

inativação da ChAT em neurônios colinérgicos retinianos induzida por glutamato.

2.0 – OBJETIVOS

O presente trabalho tem como objetivo verificar se o tratamento crônico de

neurônios retinianos com o neurotransmissor glutamato é capaz de induzir um estado

de estresse oxidativo nessas células, e se a conseqüente produção de radicais livres é

a responsável pela perda de atividade enzimática da colina acetiltransferase. Para isso,

propomos os seguintes objetivos específicos:

• Aferir a produção de radicais livres durante o tratamento com glutamato,

utilizando-se de sondas fluorescentes.

• Verificar se o tratamento com compostos antioxidantes tais como, (vitamina E e

vitamina C) é capaz de proteger a molécula da ChAT da inibição induzida pelo

glutamato e outros aminoácidos excitatórios.

• Observar se uso de desacopladores mitocondriais e inibidores da enzima óxido

nítrico sintase são capazes de prevenir o efeito inibitório do glutamato sobre a

atividade da ChAT.

• Verificar se tiorredutores são capazes de exercer um efeito protetor sobre a

excitotoxicidade glutamatérgica.

• Testar se ácidos graxos poliinsaturados possuem um efeito neuroprotetor.

3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Cultura de Neurônios Retinianos

3.1.1 – Animais utilizados

Foram utilizados ovos de galinha da raça White Leghorn obtidos de uma granja

local (Rio de Janeiro) em diferentes idades, os embriões foram estagiados de acordo

com Hambúrguer e Hamilton (1951). Os protocolos experimentais de obtenção de

retinas foram aprovados pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa

(CAUAP) do IBCCFº.

3.1.2 – Preparo de culturas em monocamada

Os embriões de galinha de nove dias (E9) eram sacrificados por decapitação,

seus olhos eram retirados e suas retinas dissecadas, na presença de meio livre de

cálcio e magnésio (CMF), em ambiente estéril. O tecido era então incubado a 37°C na

presença de tripsina 0,05% por dez minutos. Após este período, realizava-se uma

rápida centrifugação (500 g. 1 min.) para a retirada do excesso de tripsina. O

sobrenadante era descartado e procedia-se à dissociação mecânica das células em 5

mL de meio de cultura MEM comercial da GIBCO acrescido de soro fetal bovino 5% e

bicarbonato de sódio 20 mM. Acrescentava-se MEM para um volume final de maneira

que a suspensão de células apresentasse a diluição de aproximadamente 10 x 10

células/mL.

3.1.3 - Manutenção das culturas em monocamadas

As placas eram incubadas a 37°C em atmosfera umidificada contendo 95% de ar

e 5% de CO

3.1.4 – Troca de Meio

O meio da cultura era totalmente trocado no dia seguinte e novamente trocado

após dois dias. A cada troca utilizava-se o mesmo meio e a mesma concentração de

soro (MEM + 5% soro fetal bovino).

3.1.5 – Incubação das culturas em monocamada com fármacos

Todos os agentes utilizados eram adicionados após a manutenção das células

três dias em cultura, em concentrações finais de acordo com o quadro que se segue. A

incubação com os fármacos era feita em meio MEM acrescidos de bicarbonato de sódio

a 20 mM, HEPES a 30 mM e sem a adição de soro. Durante a incubação as células

eram mantidas em estufa umidificada a 37ºC contendo 95% de ar e 5% de CO

durante

17 horas. As soluções de vitamina C e vitamina E eram preparadas no dia, sendo que o

primeiro em água e o segundo em DMSO.

Fármaco Função Concentração Final

Glutamato Aminoácido Excitatório

1 mM / 2 mM

L-Aspartato Aminoácido Excitatório

200 – 250

L-nitro-arginina-metil-ester

(L-NAME)

Inibidor do Oxido Nítrico

Sintase

3 mM / 5 mM

L-nitro-arginina (L-NA)

Inibidor do Oxido Nítrico

Sintase

10 mM

Vitamina C Agente Redutor

1 – 3 mM

Vitamina E Agente Redutor

100 – 500

Carbonil cianida ρ-

trifluorometoxifenilhidrazone

(FCCP)

Desacoplador

Mitocondrial

Glutationa Reduzida (GSH) Agente Tioredutor

10 mM

Ácido Linoléico

Ácido Graxo

Polinsaturado

Ácido α-Linolênico

Ácido Graxo

Polinsaturado

Ácido Aracdônico

Ácido Graxo

Polinsaturado

Ácido Oléico

Ácido Graxo

Monoinsaturado

20 e 50

Ácido Esteárico Ácido Graxo Saturado

Ácido Laurico Ácido Graxo Saturado

3.2 – Dosagem da atividade enzimática da Colina

Acetiltransferase (ChAT)

3.2.1 – Obtenção da enzima ChAT

Ao término da incubação as células da cultura em monocamada eram lavadas

três vezes com CMF a 37ºC e, logo após, a cada poço era adicionado 100 μL da

solução de extração. As placas de cultura eram mantidas sob agitação durante 30

minutos. Após esse período, cada poço era raspado com o auxílio de uma ponteira e o

homogenato das células era transferido para tubos de ensaio previamente siliconizados

e mantido em gelo. Em seguida o conteúdo desse tubo era usado para determinação da

atividade enzimática da ChAT.

3.2.2 – Ensaio enzimático

Soluções Utilizadas:

Solução de Extração

Soluto Concentração

EDTA 10 mM

Eserina

200 μM

Triton X-100 0,5%

Cloreto de Sódio (NaCl) 7 mM

Fosfato de Sódio (NaPO

) 1 mM

Solução Substrato

Soluto Concentração

EDTA 40 mM

Eserina

200 μM

Acetil CoA 2 mM

Colina 40mM

NaCl 1 M

NaPO

160 mM

Solução Branco

Soluto Concentração

EDTA 10 mM

Eserina

200 μM

Triton X-100 0,5%

Solução Kalignost

Reagente Concentração

Tetrafenilborato de Sódio 5 mg/mL

Acetonitrila 1 L

Solução Cintiladora

Reagente Quantidade

PPO 4,0 g

POPOP 0,1 g

Tolueno 1 L

A dosagem da atividade ChAT era realizada segundo o método de Fonnun

(1975), utilizando [

H]-Acetil CoA comercial da Amersham (0,1 μCi/tubo) como

substrato. A atividade enzimática era medida em pH 7,4 a 37ºC. Em cada tubo de

dosagem era adicionado 10 μL de solução substratro, 0,1 μCi de [

H]-Acetil CoA e 20

μL da amostra homogeneizada em solução de extração, contendo aproximadamente 30

μg de proteína. Procurava-se manter o intervalo de 15 segundos entre um tubo e outro

durante a adição de cada amostra. Ao final da adição de todas as soluções cada tubo

continha os seguintes reagentes, nas concentrações finais: Cloreto de Sódio (NaCl),

250 mM; Tampão Fosfato de Sódio (NaPO

), 40 mM; Cloreto de Colina, 10 mM; EDTA,

10 mM, Sulfato de Eserina 50 μM, Triton X-100, 0,125% e 0,1 μCi de [

H]-Acetil CoA.

Como controle da reação (solução-branco), utlizava-se somente EDTA 10 mM com

Triton X-100 0,125% e eserina 50 μM.

O ensaio enzimático era realizado em banho-maria a 37ºC durante 15 minutos.

Após esse período, a reação era com 5 mL de EDTA a 10 mM respeitando-se os

intervalos de 30 seg. O conteúdo era, então, transferido para outro tudo previamente

siliconizado. Em seguida, colocava-se 2 mL de solução Kalignost, agitando-se

levemente por 20 segundos. A seguir, o conteúdo do tubo era vertido para um “vial”

contendo 10 ml de solução cintiladora. Agitava-se novamente e esperava-se até que se

formassem duas fases. A solução Kalignost separava o [

H]-AcCoA da [

H]-ACh

formada permitindo que somente esta última fosse contada na leitura de radioatividade.

Dessa forma, somente a radioatividade da [

H] ACh formada seria contada. Os “vials”

eram, então, levados ao aparelho de cintilação líquida Packard (Modelo 1600 TR) para

contagem da [

H] ACh.

3.2.3 – Determinação da Atividade Específica da Enzima

As contagens do branco eram descontadas das contagens das amostras. Em

seguida, esse valor era dividido pela atividade específica do substrato radioativo usado,

pela quantidade de minutos que durou a reação (15) e pela quantidade de proteína

contida em cada tubo (pelo método descrito a seguir). Dessa maneira se obtinha a

atividade específica da enzima em pmoles por minuto por miligrama de proteína que

variava entre 1.500 e 2.000 pmoles de ACh/min/mg de proteína.

3.3 – Dosagem de Proteína

A dosagem de proteína foi realizada segundo método de Lowry e colaboradores

(1951) utilizando albumina bovina 0,1% como padrão.

3.4 - Estatística

Todos os experimentos eram realizados utilizando de 4 – 6 culturas (n)

independentes e o ensaio em cada experimento era realizado em duplicata. As análises

estatísticas dos gráficos eram realizadas utilizando o “software” GraphPad Prism 4.0.

Os testes One-way ANOVA e Bonferroni eram utilizados para comparar a média dos

resultados obtidos em cada tratamento. Os dados são apresentados como porcentagem

da média de (n) experimentos mais ou menos erro padrão (SEM). As diferenças

encontradas eram consideradas negativas quando p>0,05.

3.5 – Detecção da Produção de Espécies Reativas

A produção de espécies reativas era detectada utilizando-se a sonda

fluorescente Dihidroetidina (DHE). Ao fim do período de 17 horas de incubação o meio

das culturas era aspirado e um novo meio (MEM, Na

HCO

20 mM, HEPES 30 mM)

acrescido de DHE 10 μM era adicionado. As células eram novamente incubadas em

estufa umidificada a 37ºC, 95% de ar e 5% de CO

por 30 minutos. Após esse período,

o meio contende DHE era aspirado e adicionava-se meio novo as células (MEM,

HCO

20 mM, HEPES 30 mM). As células eram, então, observadas em um

microscópio de fluorescência; excitação 535 nm e emissão 610 nm. As imagens eram

adquiridas utilizando-se o “software” FluoView.

4.0 – RESULTADOS

4.1 – Tratamento crônico com glutamato induz a produção de

espécies reativas

O aumento da produção de radicais livres como resultado da ativação de

receptores glutamatérgicos com conseqüente aumento do Ca

intracelular, desbalanço

da homeostase mitocondrial e ativação de enzimas pró-oxidativas é algo muito bem

caracterizado na literatura (Kahlert et al, 2005; Halliwell, 2006 Malarkey e Parpura,

2007; Platt, 2007). Nosso primeiro objetivo foi, portanto, caracterizar se o tratamento

crônico com glutamato é capaz de induzir a produção de radicais livres em culturas

primárias de retina de galinha em monocamada. Para isso, usamos dihidroetidina

(DHE), uma sonda fluorescente que permeia facilmente células vivas. Essa sonda é

reduzida principalmente pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) transformando-se

em etidina que se intercala no DNA e fluoresce quando excitada pelo comprimento de

535 nm. Após 17 horas na presença de glutamato 2 mM as células foram incubadas por

30 minutos com DHE 10 μM. Em seguida o meio contendo DHE foi trocado e as células

foram analisadas em microscópio de fluorescência. Primeiramente analisamos a

produção de radicais livres induzida pelo glutamato 2 mM e a capacidade de um agente

redutor, vitamina E 500 μM, em prevenir esse efeito. O efeito antioxidante da vitamina

E tem sido amplamente divulgado na literatura e por isso o testamos em nosso sistema

(Traber e Atkinson, 2007). As fotos foram obtidas de campos aleatórios em cada

condição experimental (Figura 11).

A´

B´

C´

D´

Figura 11 – Produção de ROS induzida por Glu 2 mM. A. Controle; B. Células tratadas com

Glu por 16 horas; C. Efeito do vitamina E 500 μM na produção de ROS; D. Efeito protetor

do vitamina E 500μM sobre a produção de ROS induzida por Glu 2 mM. A’, B’, C’ e D’ –

imagens em campo claro dos campos correspondentes.

O tratamento crônico com glutamato 2 mM por 17 horas induziu um aumento na

produção de ROS (Figura 11 B) quando comparado com o controle (Figura 11 A).

Apesar da sonda DHE ser sensível principalmente à ação de ROS, não podemos

excluir a possibilidade de outros tipos de radicais livres estarem sendo produzidos a

partir da superativação de receptores glutamatérgicos. A exposição das culturas a

vitamina E na concentração de 500 μM reduziu, quase que completamente, a produção

de ROS (Figura 11 D). Os dados sugerem que esse agente antioxidante está sendo

oxidado no lugar da DHE, impedindo sua incorporação ao DNA da célula. É possível

que, assim como a vitamina E protegeu a molécula de DHE, ela aja também protegendo

biomoléculas do dano oxidativo provocado pelos radicais livres.

4.2 – Agentes redutores são capazes de prevenir a inibição da

ChAT induzida por glutamato

Estudar o efeito tóxico do glutamato sobre o sistema colinérgico se torna muito

interessante uma vez que a excitotoxicidade tem sido revelada como a principal causa

da morte de neurônios colinérgicos na doença de Alzheimer (Schliebs e Arendt, 2006).

Entretanto, no cérebro, os neurônios colinérgicos se resumem a interneurônios e

neurônios de projeção, o que dificulta muito o seu estudo. Diante disso, o uso da retina

como modelo não somente do sistema colinérgico, mas também dos demais sistemas

de neurotransmissores, se torna interessante. Na retina, os únicos neurônios de

projeção são as células ganglionares, cujos axônios formam o nervo óptico (Kolb,

2003). Os neurônios colinérgicos são uma subpopulação de células amácrinas e seus

contatos sinápticos estão restritos a outros neurônios retinianos (Spira et al., 1987).

Além disso, culturas primárias de neurônios retinianos desenvolvem muitas

propriedades do tecido intacto, incluindo o fenótipo colinérgico (De Mello et al., 1990).

Estudos preliminares do nosso laboratório (Loureiro-dos-Santos, dados não publicados)

mostraram que a atividade da ChAT de neurônios em cultura apresentam um pico por

volta do 13º dia embrionário (E13) e que após esse período ela decai atingindo valores

muito baixos. Por essa razão, para os experimentos com ChAT, as culturas foram

preparadas com embriões de 9 dias (E9) e mantidas 4 dias em cultura. Dessa forma, no

dia da experiência elas tinham a idade correspondente a 13 dias.

Primeiramente fomos verificar se substâncias antioxidantes eram capazes de

prevenir a inibição da ChAT induzida pelo glutamato e outros agonistas glutamatérgicos

(Loureiro-dos-Santos, 2001). O primeiro agente redutor a ser testado foi a Vitamina E

que já havia sido demonstrado ser um bom antioxidante nos experimentos anteriores

(vide Fig. 11). A vitamina E, 500 μM, foi adicionada 30 minutos antes da adição do

glutamato 2 mM e, então, as células permaneceram 17 horas na presença de ambos os

reagentes. Após esse período elas foram submetidas ao protocolo de dosagem da

atividade da ChAT. Conforme observamos na Figura 12, assim como preveniu a

formação de ROS, a vitamina E foi capaz de proteger a atividade da ChAT da inibição

induzida pelo glutamato.

Vit E

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 12 - Efeito da Vitamina E 500

M sobre a ação do Glutamato 2 mM. A vitamina E foi

adicionado à cultura 30 min antes do início do tratamento com o glutamato e se mostrou

eficiente em prevenir o efeito de inibição da ChAT induzida por glutamato. (n = 4).*p < 0,001

entre Glu 2 mM e as outras condi

ões.

Em seguida testamos um segundo agente antioxidante, o vitamina C, cujo efeito

redutor é amplamente estudado e utilizado em biossistemas (Tariq, 2007). Embora

tenha apresentado um efeito menor do que o da vitamina E, o vitamina C 3mM

promoveu proteção significativa da inibição da enzima provocada pelo tratamento

crônico com glutamato. (Figura 13)

Con

Glu

Asc

3 mM

+ Ac

Asc

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 13 - Efeito da vitamina C 3 mM sobre a ação do Glutamato 2 mM. Vitamina C

adicionado à cultura 30 min antes do início do tratamento com o glutamato. (n = 4). *p <

0,001 entre Glu 2 mM e as demais condições.

Em 1998, Kubrusly et al. demonstraram que tanto L quanto D-aspartato eram

igualmente capazes de ativar receptores do tipo NMDA, mas não outros tipos de

receptores ionotrópicos de glutamato, em culturas de retina de galinha. Assim,

decidimos verificar se o tratamento crônico com esse aminoácido excitatório (L-

aspartato somente) mimetizaria o efeito inibitório do glutamato na atividade da ChAT.

Fizemos, então, uma curva dose resposta mostrando a ação do L-aspartato na

atividade catalítica dessa enzima (Figura 14). Em concentrações micromolares (a partir

de 100 μM), o L-aspartato foi capaz de promover uma inibição da ChAT tão significativa

quanto a causada pelo glutamato, evidenciando assim, que embora a ativação de todas

as classes de receptores glutamatérgicos esteja envolvida na indução do estresse

oxidativo e inibição enzimática, receptores ionotrópicos do tipo NMDA desempenham

um papel majoritário nesse processo.

Atividade da ChAT

10 100 1000

100

150

200

250

[L-aspartato] (μM)

pmols ACh / min / mg ptn

Figura 14 – Curva dose resposta do efeito do L-Aspartato na atividade da ChAT

Se a ativação de uma mesma classe de receptores (NMDA) por diferentes

aminoácidos é capaz de causar um mesmo efeito inibitório, então mecanismos de

proteção semelhantes podem ser usados para prevenir a perda de atividade enzimática.

Portanto, testamos se os mesmos agentes antioxidantes, que já haviam sido utilizados

contra o efeito do glutamato, eram capazes de proteger contra a ação inibitória do L-

aspartato. Utilizamos primeiramente o vitamina C (Figura 15) e em seguida a vitamina E

(Figura 16).

tro

L-

+ Ac

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 15 – Efeito do Ácido Ascórbico 3 mM sobre a ação do L-aspartato 100

M. As

culturas foram expostas ao ácido ascórbico 30 min antes da adição do L-aspartato. (n

= 4). *p<0,001 entre L-Asp 100

M e as demais condições.

trole

L-A

p.250

Vit

E 500

-Asp.

Vit

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 16 - Efeito da vitamina E sobre a ação do L-aspartato 250

M. Vitamina E

foi adicionada 30 min antes do início da incubação com L-aspartato. (n = 6).

*p<0,001 entre L-Asp 250

M e as demais condições.

O tratamento com agentes redutores (vitamina C e vitamina E), protegeu a

atividade catalítica da ChAT da inibição causada pelos aminoácidos excitatórios

glutamato e L-aspartato assim como também protegeu contra o efeito prejudicial do

glutamato. Esses dados sugerem que o tratamento crônico com aminoácidos

excitatórios leva ao aumento dos níveis intracelulares de ROS e possivelmente de

outros radicais livres. Estes são reduzidos pelos agentes antioxidantes adicionados ao

sistema e uma vez reduzidos são incapazes de oxidar aminoácidos de proteínas e

enzimas.

4.3 – Desacopladores mitocondriais e inibidores da NOS

protegem a ChAT da inibição induzida pelo glutamato

O uso de compostos antioxidantes foi capaz de proteger a molécula da ChAT da

ação de radicais livres, entretanto não foi possível detectar quais são essas espécies

reativas. Sabemos que duas grandes fontes de radicais livres durante o estresse

oxidativo são a mitocôndria e a enzima óxido nítrico sintase (NOS) (Halliwell, 2006). A

mitocôndria é responsável pela geração das espécies reativas de oxigênio (ROS) que

“vazam” ao longo da cadeia transportadora de elétrons. O uso de substâncias que

formam poros na membrana interna da mitocôndria e desfazem o gradiente de prótons

formado no espaço intermembranar reduz o fluxo de elétrons ao longo da cadeia

transportadora de elétrons e a conseqüente formação de ROS (Cannon et al., 2006).

Uma das substâncias amplamente usada com esse objetivo é o FCCP. Testamos,

portanto, essa substância no nosso sistema a fim de verificar se ela teria algum efeito

protetor na inibição da ChAT, uma vez que ela é capaz de dispersar o gradiente

eletroquímico de prótons e por conseguinte prevenir a formação de ROS. O FCCP foi

usado na concentração de 1 μM e embora seu efeito protetor na inibição do glutamato

não tenha sido significativa, podemos observar que ele tende a diminuir o dano

excitotóxico sobre a ChAT (Figura 17). Concentrações maiores do que a usada nos

experimentos mostrados nas figuras levaram à morte neuronal.

lu 2 mM

FCCP + Glu

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 17 – Efeito do FCCP 1

M sobre a ação do glutamato na atividade

catalítica da ChAT. O FCCP foi adicionado à cultura 30 min antes do início do

tratamento com o glutamato. (n = 4). *p<0,05 entre Glu 2 mM e Controle e

FCCP 1

M. Não há diferença significativa entre Glu 2 mM e FCCP + Glu.

Uma outra fonte de radicais livres é a enzima NOS que sintetiza óxido nítrico

(NO) uma molécula altamente reativa. A atividade das isoformas constitutivas da NOS

(eNOS e nNOS) é diretamente influenciada por Ca

, enquanto que a síntese da

isoforma induzível (iNOS) depende de um agente estressor externo como, por exemplo,

a inflamação (Boje, 2004). Para verificar se a ativação de receptores glutamatérgicos

está induzindo a síntese de NO em nosso sistema, utilizamos compostos análogos à

arginina (L-NAME e L-NA) que competem pelo sítio catalítico da NOS e assim inibem a

produção de óxido nítrico. Verificamos o efeito dessas substâncias na inibição da ChAT

começando pelo L-NAME e verificamos que a partir de 3 mM, este composto exerce

uma proteção que ainda não é total. Aumentando sua concentração para 5 mM o L-

NAME passou a exercer uma proteção bem próxima de 100% (Figura 18). Testamos

um outro inibidor da NOS, a L-nitro-arginina (L-NA) na concentração de 10 mM. De

modo semelhante ao L-NAME, esse outro análogo da arginina também protegeu a

atividade catalítica da ChAT da inibição glutamatérgica (Figura 19). Esses dados

sugerem que a ativação de NOS é um processo crítico na inibição da ChAT induzida

pela excitotoxidade glutamatérgica.

ntrole

Glu 1 mM

L-NA

3 mM

5 mM

-NAM

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 18 – Efeito do L-NAME 3mM e 5mM sobre a ação do glutamato na

atividade catalítica da ChAT. As culturas foram incubadas com L-NAME 30

min antes da adição do glutamato. Na concentração de 5mM o L-NAME foi

capaz de prevenir a inibição da ChAT induzida por glutamato. (n = 8).

*p<0,001 entre Glu 1 mM e Controle, Glu + L-NAME 5 mM e L-NAME 5 mM.

Não há diferença significativa entre Glu 1 mM e Glu + L-NAME 3 mM.

**p<0,05 entre Glu + L-NAME 3 mM e Controle, Glu + L-NAME 5 mM e L-

NAME 5 mM.

trol

NA 1

+ L-

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 19 – Efeito da L-NA 10mM sobre a ação do glutamato na atividade

catalítica da ChAT. A L-NA foi adicionada 30 min antes do início da

incubação com o glutamato. (n = 6). *p<0,001 entre Glu 1 mM e todas as

demais condições.

Conforme já mostramos, os tratamentos com FCCP 1 μM e L-NAME 3 mM não

possuem um efeito significativo na proteção da ChAT. Nos perguntamos, então, se

adicionando um efeito ao outro conseguiríamos uma proteção significativa. Com esse

experimento, observamos que os efeitos incompletos do FCCP e de uma baixa

concentração de L-NAME (3 mM) se somam exercendo a proteção esperada (Figura

20). Assim, demonstramos que tanto a produção de ROS quanto a produção de NO

estão envolvidas com perda de atividade da ChAT.

Controle

2 m

Glu

FCC

LU +

L-N

AME 3 m

Glu +

FCCP +

AME 3 mM

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 20 – Efeito do L-NAME 3mM e do FCCP 1

M sobre a ação do

glutamato na atividade catalítica da ChAT. O L-NAME e o FCCP foram

adicionados 30 min antes do início da incubação com o glutamato e foram

eficientes em prevenir a inibição da ChAT. (n = 4 ). *p<0,001 entre Glu 2 mM

e Controle e Glu + FCCP + L-NAME 3 mM. **p<0,05 entre Glu + FCCP 1

e Controle e Glu + FCCP + L-NAME 3mM. **p<0,05 entre Glu + L-NAME 3

mM e Controle e Glu + FCCP + L-NAME 3 mM. Não há diferença significativa

entre Glu 2 mM e Glu + FCCP 1

M e Glu + L-NAME 3 mM

4.4 – Efeito de Tiorredutores sobre a inibição enzimática da

ChAT

A reação de superóxido, uma das espécies reativas de oxigênio, com o óxido

nítrico é a responsável pela formação de um outro radical livre, o peroxinitrito. Essa

espécie reativa é capaz de nitrar ou nitrosar resíduos SH de aminoácidos presentes em

proteínas e enzimas. Reações de nitração ou nitrosação causam alterações

conformacionais capazes muitas vezes de inativar ou reduzir a atividade catalítica de

enzimas. Alguns agentes conhecidos como tiorredutores reduzem especificamente

esses grupamentos SH, protegendo-os da ação de peroxinitritos. Para verificar se uma

possível formação de peroxinitrito a partir de superóxido e óxido nítrico estaria

interagindo com a molécula da ChAT, inativando-a, utilizamos a glutationa reduzida

(GSH) como tiorredutor. Essa substância é formada pelos aminoácidos cisteína-

glutamato-glicina e é produzido endogenamente na célula. Entretanto, em condições de

estresse oxidativo a concentração de glutationa intracelular se encontra diminuída

(Halliwell, 2006). O uso de uma concentração elevada de GSH (10 mM) protegeu

totalmente a molécula da ChAT contra o efeito inibitório do glutamato (Figura 21)

sugerindo que os radicais livres formados estão de alguma forma oxidando os

grupamentos SH da molécula da ChAT ainda que não seja o peroxinitrito o responsável

por esse efeito.

Glu 2 mM

Glu

100

Atividade ChAT

% Controle

Figura 21 – Efeito do GSH 10mM sobre a ação do glutamato na atividade

catalítica da ChAT. A glutationa foi adicionada à cultura 30 min antes do

início da incubação com o glutamato e foi eficiente em prevenir a inibição da

ChAT. (n = 6). *p<0,01 entre Glu 2 mM e as demais condições.

4.5 – Efeito protetor de ácidos graxos polinsaturados (PUFAs)

Estudos recentes tem atribuído aos ácidos graxos um papel neuroprotetor e

antioxidante (Lauritzen et al., 2000; Kawasaki et al, 2002, Wang et al, 2006, Ahmad et

al, 2006). Embora ainda não se saiba exatamente qual o mecanismo envolvido nessa

proteção, cada vez mais esse efeito tem sido correlacionado ao nível de insaturação da

molécula de ácido graxo. Com base nos dados apresentados na literatura (Chen e

Bazan, 2005; King et al., 2006; Bazan, 2007), resolvemos verificar se ácidos graxos

essenciais exerciam no nosso sistema uma proteção dependente da presença de

insaturações. Portanto, utilizamos pelo menos um de cada grupo de ácidos graxos.

Primeiramente testamos os ácidos graxos polinsaturados, começando pelo ácido

araquidônico que possui em sua estrutura quatro insaturações. Fizemos inicialmente

uma curva dose-resposta para verificar se o ácido araquidônico exercia efeito protetor

na inibição da ChAT e em qual concentração esse efeito era melhor observado.

Utilizamos três concentrações diferentes (5μM, 10μM e 20μM) e vimos que a 20μM

esse ácido graxo exercia um efeito de proteção total sobre a perda de atividade

catalítica induzida pelo glutamato (Figura 22 e Figura 23). A partir de então, 20μM

passou a ser a concentração utilizada nos testes com os demais ácidos graxos.

0 5 10 15 20 25

100

Controle

Glu 2 mM

AA + Glu

[AA] μM + Glu 2 mM

Atividade da ChAT

% do Controle

Figura 22 – Efeito dose-dependente do AA na inibição da ChAT induzida por glutamato. As

células foram expostas a diferentes concentrações de AA por 30 minutos antes do tratamento

com glutamato 1mM. As células foram incubadas durante 17 horas. Tratamento com AA

20μM foi capaz de prevenir totalmente a inibição induzida por glutamato. (n = 6)

Control

Ac.

raqu

dô

raq

100

Atividade ChAT

% Controle

Figure 23 – Efeito do ácido araquidônico (20 µM) na inibição da ChAT. Culturas mistas foram

expostas ao ácido araquidônico por 30 min antes da adição do glutamato e foi eficiente em

prevenir a inibição da atividade da ChAT induzida por glutamato. (n = 4). *p<0,001entre Glu 1

mM e as demais condições.

Um outro ácido graxo polinsaturado contendo três insaturações em sua estrutura,

o ácido α-linolênico 20 μM também foi utilizado. De maneira semelhante ao que foi

observado com o ácido araquidônico, o α-linolênico também exerceu o efeito protetor

esperado (Figura 24). Um terceiro ácido graxo polinsaturado contendo duas

insaturações, o ácido linoléico, exerceu o mesmo efeito de proteção no nosso sistema

(Figura 25).

Figura 24 - Efeito do ácido α-linolênico (20 µM) na inibição da ChAT. Culturas mistas foram expostas

ao ácido α-linolênico por 30 min antes da adição do glutamato e foi eficiente em prevenir a inibição da

atividade da ChAT induzida por glutamato. (n = 5). *p<0,001 entre Glu 1 mM e as outras condições.

Control

Glu 1 mM

nol

nico 20

µM

-Linol

o +

100

Atividade ChAT

% Controle

Linoleic

nol + Glu

100

Atividade ChAT

% Controle

Diante do efeito protetor apresentado pelos ácidos graxos polinsaturados

resolvemos verificar qual seria a ação de ácidos graxos monoinsaturados (ácido oléico)

e ácidos graxos saturados (ácido esteárico). Nos experimentos com o ácido oleico,

testamos concentrações de 20 μM (dado não mostrado) e 50 μM e não observamos

qualquer efeito protetor para este ácido monoinsaturado. Para o ácido esteárico

utilizamos a concentração de 20 μM e conforme podemos observar, este não exerceu

efeito algum sobre a perda da atividade catalítica da ChAT induzida pelo glutamato

(figuras 26 e 27).

Figura 25 - Efeito do ácido linoléico (20 µM) na inibição da ChAT. Culturas mistas foram expostas ao

ácido linoleico por 30 min antes da adição do glutamate e foi eficiente em prevenir a inibição da

atividade da ChAT induzida por glutamato. (n = 5). *p<0,001 entre Glu 1mM e todas as outras

condições.

trole

Olei

o 50 µM

Ac. Olei

o + Glu

100

Atividade ChAT

% Controle

Figure 26 - Efeito do ácido oleico (20 µM) na inibição da ChAT. Culturas mistas foram expostas ao

ácido oleico por 30 min antes da adição do glutamato e não foi eficiente em prevenir a inibição da

atividade da ChAT induzida por glutamato. (n = 5). *p<0,001 entre Glu 1 mM e as demais condições.

tro

Ácido Esteárico 20 µM

Ácido Es

ico

+ Glu

100

Atividade ChAT

% Controle

Figure 27 - Efeito do Ácido Esteárico (20 µM) na inibição da ChAT. Culturas mistas foram expostas

ao Ácido Esteárico por 30 min antes da adição do glutamato e não foi eficiente em prevenir a inibição

da atividade da ChAT induzida por glutamato. (n = 5). *p<0,001entre Glu 1 mM e Controle e Ácido

Esteárico 20

M. Não há diferen

a si

nificativa entre Glu 1 mM e Ácido Esteárico.

Os nossos dados mostram um efeito protetor de ácidos graxos essenciais

dependente da presença de insaturações em suas estruturas. Com o que foi

apresentado nesse estudo não podemos afirmar nada sobre o mecanismo de ação

exercido por ácidos graxos polinsaturados na proteção contra o estresse oxidativo. Há

possibilidade dos ácidos graxos poliinsaturados estarem agindo diretamente como

moléculas antioxidantes, ou seja, reduzindo os radicais livres produzidos na célula, esta

capacidade seria conferida a eles pela presença de duplas ligações em sua estrutura,

pois somente observamos que a presença de duas ou mais insaturações na estrutura

do ácido graxo é importante para que essa proteção ocorra.

5.0 – DISCUSSÃO

A ativação de receptores glutamatérgicos em um terminal pós sináptico gera uma

série de respostas intracelulares, como a ativação de vias de segundos mensageiros e

a passagem de íons do meio extra para o intracelular. A mudança conformacional de

receptores ionotrópicos, especificamente do tipo NMDA, permite a entrada dentre

outros íons do cátion Ca

. A ativação prolongada desses receptores resulta em um

influxo exacerbado de Ca

, o que é altamente prejudicial para a homeostase celular,

levando à produção de radicais livres caracterizando um estado de estresse oxidativo.

O Ca

é capaz de ativar diretamente lípases, proteases, fosfatases e nucleases assim

como de comprometer o funcionamento mitocondrial levando à produção de espécies

reativas de oxigênio. Dentre as enzimas pró-oxidativas de maior relevância ativadas

pelo Ca

podemos citar a óxido nítrico sintase e a fosfolipase A

. Respectivamente,

essas enzimas estão envolvidas na produção de óxido nítrico e no processo de

peroxidação lipídica (Camacho e Massieu, 2006). O aumento dos níveis de radicais

livres está diretamente relacionado a sinais de envelhecimento, senescência e perda

neuronal. Eles agem danificando ácidos nucléicos, proteínas, enzimas e lipídeos e em

geral seus efeitos são irreversíveis. Esse aumento exacerbado tem sido intimamente

correlacionado com condições patológicas não só no sistema nervoso (Halliwell, 2006 e

Reynolds et al., 2007), mas também no sistema cardiovascular (Pennathur e Heinecke,

2007; Schnabel e Blankenberg, 2007), em câncer (Laviano et al., 2007; Martinez-

Sanchez e Giuliani, 2007).

Em 2001, Loureiro-dos-Santos demonstrou que a ativação de receptores

ionotrópicos glutamatérgicos, tanto pelo próprio glutamato quanto pelo agonista seletivo

cainato, inibe a atividade da enzima colina acetiltransferase (ChAT). Dados

complementares revelaram que essa perda de atividade catalítica não é devido à

degradação da molécula enzimática e nem à morte de neurônios colinérgicos durante o

tratamento. Por outro lado, observou-se que uma vez que a ChAT encontrava-se inibida

eram necessários cerca de nove dias para que os neurônios colinérgicos mantidos em

cultura recuperassem a atividade catalítica inicial da ChAT. Em conjunto, esses dados

sugerem que embora os neurônios retinianos colinérgicos em cultura sejam refratários à

morte induzida por excitotoxicidade, esse processo é capaz de causar alterações pós-

traducionais ainda não detectadas na molécula da ChAT que são incapazes de serem

revertidas por mecanismos intrínsecos à célula. Portanto, para que haja recuperação da

atividade enzimática é necessária a síntese de novo da molécula. Esse efeito deletério

da ativação de receptores ionotrópicos glutamatérgicos sobre a ChAT pode ser

correlacionado com a doença de Alzheimer, onde há uma estreita relação entre a

excitotoxicidade dos peptídeos Aβ e uma inicial disfunção de neurônios colinérgicos

seguida pela sua morte (Obrenovitch et al., 2000; Doraiswamy, 2003; De Felice, 2007).

Essa perda é a grande responsável pelos quadros de demência apresentados na

patologia de Alzheimer (Schliebs e Arendt, 2006). Apesar da neurodegenaração

colinérgica acometer principalmente neurônios corticais e os experimentos realizados

por Loureiro-dos-Santos em 2001 terem sido feitos em neurônios retinianos, esse

trabalho nos permite observar os mecanismos intracelulares e bioquímicos envolvidos

na inativação da ChAT a partir de estimulação glutamatérgica. Primeiramente, foi

observado que essa inativação é dependente de todas as classes de receptores

glutamatérgicos; já que a proteção total contra o efeito inibitório do glutamato só era

obtida na presença de antagonistas tanto ionotrópicos quanto metabotrópicos. Foi

demonstrado também que a captação de colina encontra-se inalterada assim como os

níveis protéicos da molécula da ChAT. Esses dados somam-se ao fato de que eram

necessários nove dias para que os neurônios colinérgicos em cultura recuperassem

100% da atividade da ChAT após a retirada do cainato, sugerindo que a perda de

atividade da ChAT é devido a alterações pos-traducionais irreversíveis, possivelmente

nitração, ocorridas na molécula da enzima (Loureiro-dos-Santos et al., 2001).

Com o objetivo de investigar os efeitos intracelulares do tratamento crônico com

glutamato e uma possível causa para a inativação da ChAT, primeiramente estudamos

a produção de espécies reativas com o auxílio de uma sonda fluorescente, a

dihidroetidina (DHE). Essa sonda é oxidada por ROS, principalmente peróxido, se

transformando em etidina, podendo assim se intercalar no DNA e fluorescer quando

estimuladas por luz em um comprimento de onda específico (535 nm) (Budd et al.,

1997). A produção de ROS a partir da ativação de receptores glutamatérgicos,

principalmente do tipo NMDA, já é bem documenta na literatura (Obrenovitch et al.,

2000, Doraiswamy, 2003; Camacho e Massieu, 2006; De Felice et al., 2007). Sabe-se

que esse efeito é dependente da elevação do Ca

intracelular que age na mitocôndria

(Camacho e Massieu, 2006; Monsalve et al., 2007). Corroborando diversos dados da

literatura, nossos resultados mostram que a ativação de receptores glutamatérgicos é

capaz de induzir o aumento da produção de ROS. É interessante notar que o

antioxidante vitamina E reduziu a intensidade da fluorescência para níveis semelhantes

ao controle. Esse antioxidante, por ser lipofílico, é descrito na literatura como tendo

ação preferencial nas proximidades da membrana plasmática reduzindo radicais livres

resultantes da peroxidação lipídica (Traber e Atkinson, 2007; Azzi, 2007). Entretanto,

através dos experimentos com DHE, nossos dados revelaram que ação da vitamina E

foi capaz de reduzir espécies reativas de oxigênio. Com base nos resultados obtidos,

não podemos afirmar, mas acreditamos que a vitamina E, como molécula antioxidante,

é oxidada pelos radicais livres protegendo a molécula de DHE da ação dos ROS. Dessa

forma esta não é convertida em etidina e por isso não pode se intercalar no DNA e ser

detectada por fluorescência. Se a vitamina E exerce esse efeito protetor sobre a DHE,

nos perguntamos se ele e outros compostos antioxidantes não apresentariam o mesmo

efeito protetor sobre a molécula da ChAT.

Dois compostos antioxidantes têm sido usados, sobretudo como suplemento

alimentar, no combate ao estresse oxidativo característico de algumas doenças: a

vitamina E (tocoferel) e o vitamina C (ácido ascórbico) (Duarte e Lunec, 2005; Linster,

Van Schaftingen, 2007; Mustacich et al., 2007). A vitamina C é o principal antioxidante

solúvel em água e está presente em alimentos de origem vegetal. Ela é transportada

através de co-transportadores dependentes de Na

presentes na membrana plasmática

e uma vez dentro da célula age como um potente antioxiante reduzindo espécies

reativas em geral (Linster, Van Schaftingen, 2007). Conforme demonstrado por

Loureiro-dos-Santos (2001) o tratamento crônico com glutamato inibe a atividade da

ChAT de neurônios retinianos em cultura. Nossos dados demonstraram que o uso tanto

de vitamina C quanto de vitamina E foi eficiente em prevenir esse efeito inibitório,

sugerindo que a perda de atividade da ChAT seja devida à ação de radicais livres que

oxidam a molécula da enzima, inibindo-a. Os diferentes tecidos humanos possuem

diversos mecanismos antioxidantes que podem ser enzimáticos ou não (Halliwell,

2006). O exacerbamento de radicais livres dentro da célula está diretamente ligado à

depleção desses mecanismos. Portanto, a adição de substâncias antioxidantes pode

ser importante no combate aos efeitos do estresse oxidativo. Esses antioxidantes,

vitamina C e vitamina E, quando em contato com radicais livres, são capazes de reduzi-

los, tornando-os menos reativos. Dessa forma, esse efeito redutor de determinadas

substâncias protege a célula e seus componentes das agressões provocadas pela ação

de radicais livres. Esse efeito protetor tornou-se evidente quando neurônios em cultura

foram tratados simultaneamente com aminoácidos excitatórios e um agente

antioxidante (acido ascórbico ou vitamina E). Neste caso, a atividade da ChAT foi

mantida próxima aos níveis controle. Um outro aminoácido excitatório, D- e L-aspartato,

é capaz de ativar seletivamente receptores do tipo NMDA (Kubrusly et al., 1998). O uso

deste aminoácido se mostrou eficiente em induzir a inibição enzimática da ChAT,

sugerindo que a ativação do receptor NMDA tem uma importante participação no

processo de inibição da ChAT induzida por glutamato. Loureiro-dos-Santos et al.

demonstrou que todas as classes de receptores glutamatérgicos estão envolvidas

nesse processo. Entretanto, na presença de um quelante de Ca

a inibição da ChAT

não ocorre independente de qual seja o agonista glutamatérgico usado. Portanto, a

inativação da ChAT induzida por glutamato depende mais do desbalanço da

homeostase do Ca

do que propriamente qual tipo de receptor ionotrópico está sendo

ativado.

Em decorrência da hiperativação de receptores NMDA e aumento da

concentração de Ca

, diversos eventos intracelulares pró-oxidativos podem ser

observados. Um deles é o comprometimento da função mitocondrial, levando ao

aumento da produção de ROS. Promover o desacoplamento mitocondrial tem sido uma

das tentativas de prevenir a formação dessas espécies reativas (Cannon et al, 2006)

sendo que existem proteínas responsáveis por este processo. Entretanto, durante o

estresse oxidativo esse desacoplamento se mostra ineficaz. Um desacoplador exógeno

largamente utilizado é o FCCP (Carbonil cianida p-trifluorometoxifenilhidrazone) (Da-

Silva et al, 2004). Esse composto, assim como outros desacopladores, forma poros na

membrana interna da mitocôndria desfazendo o gradiente de prótons fisiologicamente

formado no espaço intermembranar. Esse gradiente é o resultado da passagem de

elétrons ao longo da cadeia transportadora de elétrons e é a força motriz para a síntese

de ATP pelo complexo F1-F0 ATP Sintase. Portanto o uso de desacopladores, ao

impedir o funcionamento da ATP Sintase, paralisa toda a fosforilação oxidativa. Como a

produção de ROS ocorre a partir de moléculas de oxigênio parcialmente reduzidas que

“vazam” durante a fosforilação oxidativa, o desacoplamento mitocodrial leva também a

uma redução da produção desses radicais livres. Entretanto, como a produção de ATP

fica comprometida, o uso do FCCP não é indicado para tratamentos prolongados de

neurônios em cultura. Em nosso estudo o tratamento com esse reagente foi realizado

durante 6 horas de incubação. Acima da concentração utilizada nos nossos

experimentos foi observado que os neurônios em cultura morriam (dados não

mostrados). Durante 6 horas de tratamento na concentração de 1 μM o FCCP não

induziu a morte das células. Entretanto, apesar de apresentar um pequeno efeito

protetor o mesmo não foi significativo. Provavelmente a concentração de 1 μM não foi

suficiente para induzir a morte nem o total desacoplamento mitocondrial.

Uma outra fonte de radicais livres é a enzima óxido nítrico sintase (NOS).

Existem três diferentes isoformas dessa enzima: as isoformas neuronal (nNOS) e

endotelial (eNOS), constitutivamente expressas nas células e ativadas em resposta ao

aumento do Ca

intracelular e uma terceira (iNOS) cuja expressão é induzida por

agressores externos e cuja atividade é independente de Ca

(Barger e Basile, 2001).

No processo de ativação das isoformas constitutivas, o Ca

se liga a calmodulina

formando o complexo Ca

/calmodulina que por sua vez promove a ativação de enzima.

A presença de eNOS e nNOS já foi detectada nos mais diversos tipos neuronais e na

retina elas estão expressas em células horizontais, amácrinas, ganglionares,

fotorreceptores e também em células de Müller (Cudeiro e Rivadulla, 1999). A isoforma

nNOS se encontra funcionalmente acoplada ao receptor NMDA através da proteína de

densidade pós-sináptica PSD-95 (Aarts e Tymianski, 2003). O bloqueio dessa interação

entre nNOS (isoforma neuronal) e PSD-95 é capaz de reduzir a produção de óxido

nítrico ativada por Ca

. Ou seja, mesmo que a concentração intracelular desse íon

esteja elevada, nNOS não será ativada levando à produção excessiva de NO

(Jaffrey et

al., 1998; Sattler et al., 1999). Essa enzima ainda pode ser regulada negativamente por

ação da cinase dependente de Ca

/calmodulina (CaMKII) também ancorada a PSD-95

(Rameau et al., 2004; Yan et al., 2004). Assim sendo, em condições fisiológicas, a

toxicidade mediada por NO é controlada pelo balanço entre a ativação da nNOS

induzida pelo Ca

e sua inibição dependente da CaMKII. Por ser um gás e se difundir

facilmente pela membrana das células, em geral o seu papel fisiológico é agir como

mensageiro entre células diferentes sem a necessidade de ativação de um receptor.

Em condições patológicas a produção excessiva de NO tem sido associada a

danos no DNA, disfunção mitocondrial, oxidação e modificação de proteínas,

peroxidação lipídica dentre outras características comuns a doenças

neurodegenerativas como, por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, Alzheimer,

Huntington, Parkinson e isquemia cerebral (Boje, 2004). Além de causar a morte

neuronal, o aumento da produção de NO após injeções de glutamato e cainato

intrahipocampais também é capaz de levar à quebra da barreira hematoencefálica

(Parathath et al., 2006; Parathath et al., 2007). Na retina, experimentos com ratos

mantidos sob iluminação contínua resultaram em uma intensa degeneração de

fotorreceptores dependente do NO. Interessante é que a isoforma responsável pelo

aumento do NO nessa condição não foi a isoforma neuronal, mas sim a induzível, cuja

síntese em geral ocorre em resposta a citocinas e estímulos pro-inflamatórios externos

(Piehl et al.,2007). Desde a descoberta do óxido nítrico, estudos vêm tentando

determinar se há uma diferença funcional entre o óxido nítrico produzido pelas

isoformas constitutivas e aquele produzido pela isoforma induzível. Os resultados

sugerem que tanto a nNOS quanto a eNOS são capazes de produzir somente

quantidades pmolares de óxido nítrico que está envolvido unicamente em processos de

100

sinalização celular. Já o óxido nítrico produzido pela isoforma induzível atinge

concentrações μmolares e sua ação está relacionada a processos citotóxicos (Moncada

et al., 1997).

No sistema nervoso central a expressão da isoforma induzível é bem

caracterizada em células gliais, tanto astrócitos quanto microglia. Em ambos tipos

celulares a indução de iNOS ocorre em resposta a sinais inflamatórios com IL-1β, LPS e

IFNγ + TNFα. Esses fatores são liberados como conseqüência da morte neuronal

característica de doenças como esclerose múltipla, Parkinson e Alzheimer e são

ativadores de células do sistema imune que agem no processo da inflamação. Na

doença de Alzheimer o acúmlo de Aβ por si só é capaz de induzir a expressão de iNOS

na microglia (Vincent et al., 1998), ou seja, não é necessária a liberação de fatores pro-

inflamatórios. Em astrócitos a indução de iNOS também está associada a citocinas pró-

inflamatórias, produtos virais e bacterianos e toxinas como, por exemplo, o peptídeo Aβ.

Diferentes vias de sinalização intracelular tem sido associadas à ativação de fatores de

transcrição envolvidos com a expressão de iNOS. A primeira delas é a via da JAK-

STAT, cujos diferentes tipos de receptores JAK são diretamente ativados por citocinas.

Nessa via, a ativação do receptor leva à fosforilação e dimerização de STAT que se liga

à região promotora do gene de iNOS levando à sua transcrição. Um outra via envolvida

na indução da expressão da iNOS é a via das MAP cinases (ERK1/2, p38 e JNK), que

também estão envolvidas com a ativação de fatores de transcrição que promovem a

síntese de iNOS. Uma terceira possibilidade é uma via envolvida com a ativação da

enzima pro-oxidativa NADPH oxidase e conseqüente geração de ROS. Essa enzima

está presente na membrana das células e quando ativada por Ca

leva à formação de

101

superóxido e peróxido de hidrogênio. Acredita-se que as espécies reativas de oxigênio

geradas a partir da NADPH oxidase estejam envolvidas com a ativação de uma via de

sinalização intracelular que leva à síntese de iNOS (Saha e Pahan, 2006a; Saha e

Pahan 2006b). Em neurônios a expressão induzida de iNOS também foi detectada

associada a citocinas pró-inflamatórias como LPS, IFNγ, TNF-α, IL1-β (Heneka e

Feinstein, 2001). Análises de cérebros acometidos pela doença de Alzheimer também

apresentaram imonureatividade para iNOS em células neuronais (Lee et al., 1999). Em

cérebros de pacientes acometidos por esclerose múltipla também foi possível detectar a

presença de iNOS em células gliais (Olezak et al., 1998). Portanto, a expressão de

iNOS é um processo correlacionado a doenças neurodegenerativas e inflamações no

sistema nervoso, sendo encontrada em diversos tipo de células neurais: microglia,

astrócitos e neurônios.

Em nossos estudos, a inibição da ChAT como conseqüência do tratamento

crônico de neurônios retinianos com glutamato mostrou-se ser dependente da ativação

da NOS. O óxido nítrico é sintetizado por essa enzima a partir do aminoácido arginina.

Portanto, o uso de análogos da arginina como, por exemplo, L-nitro-arginina (L-NA) ou

L-nitro-arginina-metil-ester (L-NAME) é capaz de inibir a síntese de NO. Em nossos

experimentos o uso dessas substâncias foi capaz de proteger totalmente a atividade de

ChAT da inibição induzida por glutamato, sugerindo que o óxido nítrico é um mediador

importante desse processo. A ativação de receptores glutamatérgicos leva à síntese de

NO e este por sua vez age como um radical livre participando da inibição da ChAT.

Dados preliminares e ainda não conclusivos e, por isso não apresentados nesse

trabalho, revelam que o tratamento crônico com glutamato é capaz de induzir o

102

aumento da produção de NO em cultura mista de retina. O ensaio da atividade

enzimática revela um aumento de cinco vezes na atividade independente de Ca

após

o tratamento com glutamato. Já a atividade dependente de Ca

permanece inalterada.

Esses dados sugerem que no nosso sistema de estudo durante o estresse oxidativo

induzido pelo glutamato esteja havendo indução da expressão de iNOS. Entretanto,

não podemos afirmar em qual tipo celular esta síntese de iNOS está ocorrendo.

Em nosso estudo, o tratamento com o desacoplador mitocondrial FCCP não foi

suficiente para proteger a ChAT da inibição induzida pelo glutamato. Porém, o uso

concomitante de L-NAME 3 mM e FCCP 1 μM, que sozinhos não preveniram

completamente a inibição da ChAT, revelou um efeito de proteção total. Esse dado

sugere que tanto ROS quanto NO são responsáveis pela inibição enzimática

observada.

A reação de NO com superóxido, uma das espécies reativas de oxigênio, forma

um radical livre altamente reativo, o peroxinitrito (Halliwell, 2006). Como o óxido nítrico é

um gás que atravessa facilmente membranas biológicas, acredita-se que o principal

local de formação de peroxinitrito seja a mitocôndria. O óxido nítrico atravessa a

membrana mitocondrial, reage com o superóxido, forma peroxinitrito e este por também

se difundir facilmente através de membranas agiria modificando tanto proteínas e

enzimas mitocondriais quanto aquelas presentes no citoplasma (Radi et al., 2002a; Radi

et al., 2002b). Entretanto, há estudos revelando a formação de peroxinitrito a partir da

reação do superóxido proveniente da NADPH oxidase com óxido nítrico sintetizado pela

iNOS (Li et al., 2005). Esses radicais peroxinitrito podem agir nitrando e hidroxilando

anéis aromáticos de resíduos de aminoácidos, reagindo com sulfidrilas, com resíduos

103

zinco-tiolatos assim como também lipídeos, proteínas e DNA. Duas reações específicas

são conhecidas na literatura por inativar enzimas: nitração e S-nitrosação. A nitração

adiciona de forma irreversível um grupamento nitro a alguns aminoácidos específicos

formando, por exemplo, 3-nitrotirosina. Já a S-nitrosação tem como conseqüência a

formação de S-nitrocisteína que pode ser revertida por agentes tioredutores, ou seja,

que reduzem especificamente grupamentos SH dos aminoácidos. Essas reações de

nitração e nitrosação causam alterações conformacionais em proteínas e enzimas que

muitas vezes tem como conseqüência a sua inativação (Reynolds et al, 2007). Dentre

os diversos alvos moleculares do peroxinitrito podemos citar enzimas da cadeia

transportadoras de elétrons na mitocôndria (Brown e Borutaite, 2004) e a própria

molécula da ChAT (Guermonprez et al., 2001).

A glutationa reduzida (GSH) é uma molécula antioxidante endógena importante

que age reduzindo especificamente resíduos tióis. Ela é formada pelos aminoácidos

glutamato, cisteína e glicina em uma reação em cadeia envolvendo as enzimas γ-

glutamilcisteína-sintetase que promove a reação do glutamato com a cisteína, e a

glutationa sintetase que adiciona ao composto um resíduo de glicina. Uma vez oxidada,

a glutationa se liga a outra glutationa oxidada formando o composto GSSG, ligado por

uma ponte dissulfeto. O composto GSSG pode ser reconvertido a GSH pela ação da

enzima glutationa redutase (Halliwell, 2006). Ou seja, mesmo quando se encontra na

forma oxidada a glutationa não oferece riscos oxidativos para a célula. Além de ser

sintetizada na célula a administração exógena de GSH se mostra eficiente contra os

danos das espécies reativas de nitrogênio, uma vez que existem na membrana das

células transportadores de oligopeptídeos conhecidos com OATPs ou OPTs que

carream GSH (Ballatori et al., 2005; Tsay et al., 2007). Portanto, é possível afirmar que

104

a glutationa reduzida adicionada ao nosso sistema durante o tratamento crônico com

glutamato está agindo intracelularmente reduzindo os resíduos SH de proteínas e

enzimas, protegendo-os da ação de peroxinitrito e outras espécies reativas de

nitrogênio. Em nosso estudo não analisamos a produção de peroxinitrito, mas podemos

afirmar que, de alguma maneira, o aumento da produção de NO e ROS está envolvido

com a nitração ou nitrosação de grupamentos SH na molécula da ChAT, já que o

tratamento com GSH preveniu a inibição desta enzima induzida pelo glutamato.

Até o presente momento, nossos dados indicam que a ativação crônica de

receptores ionotrópicos glutamatérgicos, principalmente do tipo NMDA, permite um

influxo de Ca

que age na mitocôndria levando ao aumento da produção de ROS e

ativando a enzima óxido nítrico sintase elevando a produção de NO. Juntos, NO e ROS

agem inibindo a enzima ChAT, sugerindo formação de peroxinitrito. A interação deste

ou de outras espécies reativas de nitrogênio com resíduos SH da ChAT seria, então, a

responsável por sua inibição através da formação de 3-nitrotirosina ou S-nitrosocisteína.

Uma nova classe de moléculas tem mostrado eficiente neuroproteção contra o

estresse oxidativo e morte celular característicos de doenças neurodegenerativas.

Estas são os ácidos graxos essenciais (EFAs), principalmente os poliinsaturados

(PUFAs). Essas moléculas são importantes na função e estrutura cerebral e como o

organismo não é capaz de sintetizá-las elas necessitam ser supridas através da

ingestão alimentar, com a vantagem de cruzarem facilmente a barreira

hematoencefálica. Os ácidos graxos podem classificados de acordo com a presença de

insaturações, ou seja, duplas ligações entre carbonos em sua estrutura. Eles podem ser

saturados, não possuindo insaturações, monoinsaturados, possuindo uma única

insaturação e poliinsaturados possuindo duas ou mais duplas ligações ao longo de sua

105

cadeia de carbonos (Yehuda et al., 2005). Há estudos revelando que uma dieta rica em

ácidos graxos poliinsaturados pode estar associada a benefícios para a memória (Frais,

2007; Kotani et al., 2006), com o tratamento de desordens psiquiátricas como

depressão e ansiedade (Severus, 2006) e também com a melhora das funções

cognitivas em indivíduos normais (Fontani et al., 2005). Ainda não se sabe de que

maneira os ácidos graxos são capazes de promover essas melhoras, mas acredita-se

que seus efeitos estejam relacionados à presença de insaturações em suas estruturas.

Dois trabalhos mostram claramente a diferença entre o uso de ácidos graxos

poliinsaturados e saturados. O primeiro deles revela o efeito benéfico de PUFAs (ácido

docosahexaenóico e ácido docosapentaenóico) tanto sobre a toxicidade do peptídeo

Aβ quanto sobre o nível de fosforilação da proteína tau, que são duas características da

doença de Alzheimer (Green et al., 2007). O segundo, mostra que o tratamento com

ácidos graxos saturados (ácido palmítico e ácido esteárico) é capaz de induzir a

fosforilação da tau em culturas de neurônios corticais de rato (Patil e Chan, 2005). Um

outro PUFA, o ácido araquidônico teve um efeito neuroprotetor contra o estresse

oxidativo em fatias de hipocampo de rato (Wang et al., 2006) e também contra a

neurotoxicidade glutamatérgica em células ganglionares da retina (Kawasaki et al.,

2002). O ácido α-linolênico também tem se mostrado eficiente na proteção contra o

estresse oxidativo e morte neuronal em cérebros isquêmicos (Heurteaux et al., 2006)

assim como contra a excitotoxicidade induzida por NMDA em cultura de neurônios

corticiais (Joo e Park, 2003).

O mecanismo através do qual PUFAs conferem neuroproteção contra estresse

oxidativo e morte neuronal ainda não está bem elucidado. Experimentos mostram que o

106

tratamento com ácido araquidônico é capaz de impedir uma elevação excessiva da

concentração intracelular do Ca

em astrócitos evitando, assim, as conseqüências

deletérias desse aumento (Sergeeva et al., 2005). Entretanto, ainda não foi

caracterizado como o ácido araquidônico é capaz de bloquear essa variação. Outros

dados mostram que esse ácido graxo é capaz de ativar canais de K

bloqueando, dessa

forma, a excitabilidade da transmissão glutamatérgica em células granulares (Lauritizen

et al., 2000). Há ainda a possibilidade dos ácidos graxos poliinsaturados estarem

agindo diretamente como moléculas antioxidantes, ou seja, reduzindo os radicais livres

produzidos na célula, capacidade que seria conferida a eles pela presença de duplas

ligações em sua estrutura (Sarsilmaz et al., 2003). Estudos recentes mostram ainda que

uma molécula sintética derivada do ácido docosahexaenóico (DHA), a neuroprotectina

D1 é capaz de promover neuroproteção bloqueando enzimas e a síntese de genes pró-

apoptóticos e induzindo a expressão de genes envolvidos com a sobrevida celular

(Bazan, 2006).

Corroborando o que é apresentado na literatura, nossos dados demonstram mais

uma vez o efeito protetor de ácidos graxos poliinsaturados. Cinco diferentes ácidos

graxos foram testados e somente aqueles com duas ou mais insaturações (ácido

araquidônico, ácido α-linolênico, ácido linoléico) foram capazes de conferir proteção

contra a inibição da atividade da ChAT induzida por glutamato. Os ácidos graxos

monoinsaturado e saturado (ácido oléico e ácido esteárico) não foram capazes de

reproduzir esse efeito. Apesar de não termos investigado o mecanismo de ação dos

ácidos graxos poliinsaturados, os nossos experimentos revelam claramente que o efeito

protetor dessas moléculas está na presença de duplas ligações em suas estruturas.

107

Perspectivas futuras visam investigar se o mecanismo de ação dos ácidos graxos

consiste em prevenir a formação de radicais livres na célula, através de experimentos

com a sonda fluorescente para radicais livres DHE. Pretendemos ainda verificar se há

formação de nitro-tirosina na molécula da ChAT e se essa é a alteração responsável

pela perda de atividade enzimática. É interessante também investigar se há alteração

na atividade da NOS, se há indução da expressão de iNOS e qual tipo celular é

responsável majoritariamente pelo aumento da produção do NO.

108

6.0 - CONCLUSÕES

Com os dados apresentados até então podemos concluir que o tratamento

crônico com glutamato é capaz de induzir o aumento da produção de radicais livres;

efeito que é prevenido com o tratamento com o antioxidante vitamina E. O tratamento

com glutamato também é responsável pelo aumento da produção de NO pela óxido

nítrico sintase e de ROS pela mitocôndria (Figuras 18, 19 e 20), caracterizando um

estado de estresse oxidativo. Mostramos também que os efeitos inibitórios da

hiperativação de receptores glutamatérgicos sobre a inativação da ChAT são

bloqueados por substâncias antioxidantes como a vitamina C e a vitamina E e também

por ácidos graxos poliinsaturados. Diante dos resultados obtidos concluímos nosso

trabalho propondo um mecanismo de ação para o glutamato conforme o ilustrado na

Figura 28. O aumento do Ca

intracelular leva ao aumento da produção de ROS pela

mitocôndria e da síntese de NO pela NOS. A reação de superóxido com NO leva a

formação de peroxinitrito que age inibindo a atividade da ChAT através de nitração ou

nitrosação da molécula da enzima.

109

Figura 28 – Modelo proposto para o mecanismo de inibição da ChAT induzido pela ativação crônica

de receptores glutamtérgicos. A entrada de grande quantidade de Ca

compromete a homeostase

celular levando ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela mitocôndria e

de óxido nítrico pela enzima óxido nítrico sintase. A possível reação de superóxido com óxido nítrico

leva a formação de peroxinitrito que pode estar agindo nitrando ou nitrosando a ChAT e assim

comprometendo a sua atividade catalítica. A Figura mostra ainda os pontos de proteção discutidos ao

longo desse trabalho: 1. Desacoplador mitocondrial diminuindo a produção de ROS. 2. Antioxidantes

reuzindo radicais livres em geral. 3. Análogos de L-arginina bloquenado a síntese de NO. 4. GSH

reduzindo o peroxinitrito.

110

Referências Bibliográficas

Aarts, M.M.; Tymianski, M. (2003) Novel treatment of excitotoxicity: targeted disruption

of intracellular signalling from glutamate receptors. Biochem Pharmacol. 66(6):877-

886.

Abramov, A.Y.; Canevari, L.; Duchen, M.R. (2004) Calcium signals induced by amyloid

beta peptide and their consequences in neurons and astrocytes in culture. Biochim

Biophys Acta. 1742(1-3):81-87.

Ahmad, S.; Yousuf, S.; Ishrat, T.; Khan, M.B.; Bhatia, K.; Fazli, I.S.; Khan, J.S.; Ansari,

N.H.; Islam, F. (2006) Effect of dietary sesame oil as antioxidant on brain

hippocampus of rat in focal cerebral ischemia. Life Sci. 79(20):1921-1928

Alzheimer, A. (1907) Uber eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde Allg Z Psychiatr.

Anatoly, A.; Starkov, C.C.; Gary, F. (2004) Mitochondrial calcium and oxidative stress as

mediators of ischemic brain injury. Cell Calcium 36, 257-264

Anderson, C.M.; Swanson, R.A. (2000) Astrocyte glutamate transport: review of

properties, regulation, and physiological functions. Glia. 32(1):1-14.

Ara J.; Przedborski S.; Naini, A.B.; Jackson-Lewis, V.; Trifiletti, R.R.; Horwitz J.;

Ischiropoulus, H. (1998) Inactivation of tyrosine hydroxylase by nitration following

exposure to peroxynitrite and 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP).

Proc Natl Acad Sci USA 95, 7659–7663.

Arrieta, I.A.C. e Tapia, R.J. (1995) beta-Amyloid peptide fragment 25-35 potentiates the

calcium-dependent release of excitatory amino acids from depolarized hippocampal

slices. Neurosci Res 41(4):561-566.

Atlante, A.; Calissano, P.; Bobba, A.; Giannattasio, S.; Marra, E.; Passarela, S. (2001)

Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Letters 497, 1-5

Attwell, D. (1994) Glia and neurons in dialogue. Nature. 369(6483):707-708.

Azzi, A. (2007) Molecular mechanism of alpha-tocopherol action. Free Radic Biol Med.

43(1):16-21.

Baker, D.A.; Shen, H.; Kalivas, P.W. (2002a) Cystine/glutamate exchange serves as the

source for extracellular glutamate: modifications by repeated cocaine administration.

Amino Acids, 23, 161-162

111

Baker, D.A.; Xi, Z.; Shen, H.; Swanson, C.J.; Kalivas, P.W. (2002b) The origin and

neuronal function of in vivo nonsynaptic glutamate. J. Neurosci. 22, 9134-9141

Balabanli, B.; Kamisaki, Y.; Martin, E.; Murad, F. (1999) Requirements for heme and

thiols for the nonenzymatic modification of nitrotyrosine. PNAS 96, 13136–13141

Ballatori, N.; Hammond, C.L.; Cunningham, J.B.; Krance, S.M.; Marchan, R. (2005)

Molecular mechanisms of reduced glutathione transport: role of the

MRP/CFTR/ABCC and OATP/SLC21A families of membrane proteins. Toxicol Appl

Pharmacol. 204(3):238-255.

Barger, S.W.; Basile, A.S. (2001) Activation of microglia by secreted amyloid precursor

protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic

function. J Neurochem 76, 846-854

Bartus, R.T. (2000) On neurodegenerative diseases, models, and treatment strategies:

lessons learned and lessons forgotten a generation following the cholinergic

hypothesis. Exp Neurol. 163(2):495-529.

Bazan, N.G. (2006) Cell survival matters: docosahexaenoic acid signaling,

neuroprotection and photoreceptors. Trends Neurosci. 29(5):263-271.

Bazan, N.G. (2007) Omega-3 fatty acids, pro-inflammatory signaling and

neuroprotection. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 10(2):136-141.

Beal, M.F. (1995) Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases.

Ann. Neurol. 38, 357-366.

Bennett, M.R. (2000) The concept of transmitter receptors: 100 years on.

Neuropharmacology. 39(4):523-546.

Bertlett, B.S.; Levine, R.L.; Stadtman, E.R. (1997) Carbon dioxide stimulates

peroxynitrite-mediated nitration of tyrosine residues and inhibits oxidation of

methionine residues of glutamine synthetase: Both modifications mimic effects of

adenylylation. Proc Natl Acad Sci USA 95: 2784– 2789

Bertlett, B.S.; Stadtman, E.R. (1997) Protein oxidation in aging, disease, and oxidative

stress. J Biol Chem 272, 20313–20316

Bhave, G.; Karim, F.; Carlton, S.M.; Gereau, R.W. (2001) Peripheral group I

metabotropic glutamate receptors modulate nociception in mice. Nat Neurosci.

4(4):417-423.

Bielski, B.H.J. (1991) Studies of hypervalent iron. Free Radical Biol. Med. 12, 69-477.

112

Bleakman, D.; Alt, A.; Nisembaum, E.S. (2006) Glutamate receptors and pain.

Semin Cell Dev Biol, 17(5):592-604.

Bobich, J.A.; Zheng, Q.; Campbell, A. (2004) Incubation of nerve endings with a

physiological concentration of Abeta1-42 activates CaV2.2(N-Type)-voltage operated

calcium channels and acutely increases glutamate and noradrenaline release. J

Alzheimers Dis. 6(3), 243-255

Boje, K.M. (2004) Nitric oxide neurotoxicity in neurodegenerative diseases.

Front Biosci. 9:763-776.

Bowie, D.; Mayer, M.L. (1995) Inward rectification of both AMPA and kainate subtype

glutamate receptors generated by polyamine-mediated ion channel block.

Neuron. 15(2):453-462.

Brown, G.C.; Borutaite, V. (2004) Inhibition of mitochondrial respiratory complex I by

nitric oxide, peroxynitrite and S-nitrosothiols. Biochim Biophys Acta. 1658(1-2):44-49.

Browne, S.E.; Ferrante, R.J.; Beal, M.F. (1999) Oxidative stress in Huntington’s disease.

Brain Pathol 9, 147–163.

Budd, S.L.; Castilho, R.F.; Nicholls, D.G. (1997) Mitochondrial membrane potential and

hydroethidine-monitored superoxide generation in cultured cerebellar granule cells.

FEBS Lett. 415(1):21-24.

Burde, R.M.; Schainker, B.; Kayes, J. (1971) Acute effect of oral and subcutaneous

administration of monosodium glutamate on the arcuate nucleus of the hypothalamus

in mice and rats. Nature 233(5314): 58-60

Camacho, A.; Massieu, L. (2006) Role of glutamate transporters in the clearance and

release of glutamate during ischemia and its relation to neuronal death.

Arch Med Res. 37(1):11-18.

Canevari, L.; Abramov, A.Y.; Duchen, M.R. (2004) Toxicity of amyloid beta peptide: tales

of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochem Res. 29(3):637-650.

Cannon, B.; Shabalina, I.G.; Kramarova, T.V.; Petrovic, N.; Nedergaard, J. (2006)

Uncoupling proteins: a role in protection against reactive oxygen species--or not?

Biochim Biophys Acta. 1757(5-6):449-458.

Cassina, A.; Radi, R. (1996) Differential inhibitory action of nitric oxide and peroxynitrite

on mitochondrial electron transport. Arch Biochem Biophys 328: 309–316

Caulfield, M.P.; Birdsall, N.J. (1998) International Union of Pharmacology. XVII.

Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50(2):279-290.

113

Chen, C.; Bazan, N.G.; (2005) Lipid signaling: sleep, synaptic plasticity, and

neuroprotection. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 77(1-4):65-76.

Choi, D.W.; Rothman, S.M.. (1990) The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-

ischemic neuronal death. Annu Rev Neurosci. 13:171-182.

Cordero-Erausquin, M.; Marubio, L.M.; Klink, R.; Changeux, J.P. (2000) Nicotinic

receptor function: new perspectives from knockout mice. Trends Pharmacol Sci.

21(6):211-217.

Coutinho, V.; Knopfel, T. (2002) Metabotropic glutamate receptors: electrical and

chemical signaling properties. Neuroscientist. 8(6):551-561.

Craig, A.M.; Kang, Y. (2007) Neurexin-neuroligin signaling in synapse development.

Curr Opin Neurobiol, 17(1):43-52.

Cudeiro, J.; Rivadulla, C. (1999) Sight and insight--on the physiological role of nitric

oxide in the visual system. Trends Neurosci. 22(3):109-116.

Cummings, J.L.; Back, C. (1998) The cholinergic hypothesis of neuropsychiatric

symptoms in Alzheimer's disease. The American Journal of Geriatric Psychiatry.

6(2): S64-S78.

Curtis, C.R.; Johnston, G.A.R. (1974) Amino acid transmitters in the mammalian central

nervous system. Ergebn. Physiol, 69, 94-188.

Curtis, D.R.; Watkins, J.C. (1961) The Chemical excitation of spinal neurons by certain

amino acids. J. Physiol, 166, 1-14.

Da-Silva, W.S.; Gomez-Puyou, A.; Gomez-Puyou, M.T.; Moreno-Sanchez, R.; De

Felice, F.G.; de Meis, L.; Oliveira, M.F.; Galina, A. (2004) Mitochondrial bound

hexokinase activity as a preventive antioxidant defense: steady-state ADP formation

as a regulatory mechanism of membrane potential and reactive oxygen species

generation in mitochondria. J Biol Chem. 279(38):39846-39855.

Daw, N.W.; Jensen, R.J.; Brunken, W.J. (1990). Rod pathways in mammalian retinas.

Trends Neurosci. 13(3): 110-115.

Dawson, T.M.; Dawson, V.L.; Snyder, S.H. (1992) A novel neuronal messenger

molecule in the brain: the free radical nitric oxide. Ann. Neurol. 32, 297-311.

Dawson, V.L.; Dawson, T.M.; London, E.D.; Bredt, D.S.; Snyder, S.H. (1991) Nitric oxide

mediates glutamate toxicity in primary cortical cultures. Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A.

88, 6371-6388.

114

De Felice, F.G.; Velasco, P.T.; Lambert, M.P.; Viola, K.; Fernandez, S.J.; Ferreira, S.T.;

Klein, W.L. (2007) Abeta oligomers induce neuronal oxidative stress through an N-

methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism that is blocked by the Alzheimer

drug memantine. J Biol Chem. 282(15):11590-11601.

De Felice, F.G.; Velasco, P.T.; Lambert, M.P.; Viola, K.; Fernandez, S.J.; Ferreira, S.T.;

Klein, W.L.; (2007) Abeta oligomers induce neuronal oxidative stress through an N-

methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism that is blocked by the Alzheimer

drug memantine. J Biol Chem. 282(15):11590-11601.

De Mello, F.G.; De Mello, M.C.F.; Hudson, R.; Klein, W.L. (1990) Selective expression of

factors preventing cholinergic dedifferentiation. J. Neurochem. 54, 886-892

Dietrich, D.; Kirschstein, T.; Kukley, M.; Pereverzev, A.; von der Brelie, C.; Schneider,

T.; Beck, H. (2003) Functional specialization of presynaptic Cav2.3 Ca

channels.

Neuron. 39(3):483-496.

Dingledine, R.; Borges, K.; Bowie, D.; Traynelis, S.F. (1999a) The glutamate receptor

ion channels. Pharmacol Rev. 51(1):7-61

Dingledine, R.; McBain, C.J. (1999b) In: Siegel, G.J.; Agranoff, B.W.; Albers, R.W.;

Fisher, S.K.; Uhler, M.D. (Eds). Basic Neurochemistry. Molecular, Cellular and

Medical aspects. Sexta edição. Lippincott Williams and Wilkins.

Doraiswamy, P.M. (2003) Alzheimer's disease and the glutamate NMDA receptor.

Psychopharmacol Bull. 37(2):41-49.

Duan, S.; Anderson, C.M.; Keung, E.C.; Chen, Y.; Chen, Y.; Swanson, R.A.; (2003)

P2X7 receptor-mediated release of excitatory amino acids from astrocytes. J

Neurosci. 23(4):1320-1328

Duarte, T.L.; Lunec, J. (2005) Review: When is an antioxidant not an antioxidant? A

review of novel actions and reactions of vitamin C. Free Radic Res. 39(7):671-686.

Ferreira, S.T.; Vieira, M.N.; De Felice, F.G. (2007) Soluble protein oligomers as

emerging toxins in Alzheimer's and other amyloid diseases. IUBMB Life. 59(4-5):332-

345.

Fonnum, F. (1975) A rapid radiochemical method for the determination of choline

acetyltransferase. J Neurochem. 24(2):407-409.

Fonnun, F. (1984) Glutamate: A neurotransmitter in mammalian brain. J. Neurochem,

42(1):1-11.

115

Fontani G.; Corradeschi, F.; Felici, A.; Alfatti, F.; Migliorini, S.; Lodi, L. (2005) Cognitive

and physiological effects of Omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementation in

healthy subjects. Eur J Clin Invest. 35(11):691-699.

Frais, A.T. (2007) Depression and the causal role of specific memory system

degenerations: link may be supported by reported therapeutic benefits of Omega 3

fatty acids. Med Hypotheses. 69(1):67-69.

Francescutti, D.; Baldwin, J.; Lee, L.; Mutus, B. (1996) Peroxynitrite modification of

glutathione reductase: Modeling studies and kinetic evidence suggest the

modification of tyrosines at the glutathione disulfide binding site. Prot Eng 9, 189–

194.

Freeman, B.A.; Crapo, J.D. (1982) Biology of disease: free radicals and tissue injury.

Lab. Invest. 47, 412-426.

Gaudry-Talarmain, Y.M.; Moulian, N.; Meunier, F.A.; Blanchard, B.; Angaut-Petit, D.;

Faille, L.; Ducroq, C. (1997) Nitric Oxide and peroxynitrite affect differently

acetilcholine release, choline acetyltransferase activity, synthesis and

compartimentation of newly formed acetylcholine in Torpedo marmorata

Synaptosomes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry 1,(4): 330-345

Ghetti, A.; Heinemann, S.F. (2000) NMDA-Dependent modulation of hippocampal

kainate receptors by calcineurin and Ca

/calmodulin-dependent protein kinase. J

Neurosci. 20(8):2766-2773.

Green, K.N.; Martinez-Coria, H.; Khashwji, H.; Hall, E.B.; Yurko-Mauro, K.A.; Ellis, L.;

LaFerla, F.M. (2007) Dietary docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid

ameliorate amyloid-beta and tau pathology via a mechanism involving presenilin 1

levels. J Neurosci. 27(16):4385-4395.

Greengard, P.; Jen, J.; Nairn, A.C.; Stevens, C.F. (1991) Enhancement of the glutamate

response by cAMP-dependent protein kinase in hippocampal neurons.

Science. 253(5024):1135-1138.

Guermonprez, L.; Ducrocq, C.; Gaudry-Talarmain, Y.M. (2001) Inhibition of acetylcholine

synthesis and tyrosine nitration induced by peroxynitrite are differentially prevented

by antioxidants. Mol Pharmacol. 60(4):838-846.

Guermonprez. L.; Ducrocq, C.; Gaudry-Talarmain, Y.M. (2001) Inhibition of

Acetylcholine Synthesis and Tyrosine Nitration Induced by Peroxynitrite Are

Differentially Prevented by Antioxidants. Mol. Pharmacol. 60, 638-846

Haendeler, J.; Weiland, U.; Zeiher, A.M.; Dimmeler, S. (1997) Effects of redoxrelated

congeners of NO on apoptosis and caspase-3 activity. J Nitric Oxide 4: 282–293

116

Halliwell, B. (1992) Reactive oxygen species and the central nervous system.

J Neurochem. 59(5):1609-1623.

Halliwell, B. (2006) Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J.

Neurochem. 97:1634-1658.

Halliwell, B. (2006) Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now?

J Neurochem. 97(6):1634-1658.

Halliwell, B.; Gutteridge, J.M.C. (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition

metals and disease. Biochem. J. 219, 1-14.

Halliwell, B.; Gutteridge, J.M.C. (1990) Role of free radicals and catalytic metal ions in

human disease: a review. Meth. Enzym. 186, 1-85.

Hamburger, V.; Hamilton, H.L. (1951) A serial of normal stages in the development of

the chick embryo. J. Morphol. 88:49-92.

Harman, D. (1980) Free radical theory of aging: origin of life, evolution, and aging. Age

3, 100-102.

Harman, D. (1991) The aging process: major risk factor for disease and death. Proc.

natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5360-5633.

Harper, J.D.; Lansbury, P.T.Jr. (1997) Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease

and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-

dependent solubility of amyloid proteins. Annu Rev Biochem 66:385-407.

Hassel, B.; Bachelard, H.; Jones, P.; Fonnum, F.; Sonnewald, U. (1997) Trafficking of

amino acids between neurons and glia in vivo. Effects of inhibition of glial metabolism

by fluoroacetate. J Cereb Blood Flow Metab. 17(11):1230-1238.

Hassel, B.; Boldingh, K.A.; Narvesen, C.; Iversen, E.G.; Skrede, K.K. (2003) Glutamate

transport, glutamine synthetase and phosphate-activated glutaminase in rat CNS

white matter. A quantitative study. J Neurochem. 87(1):230-237.

Hassel, B.; Dingledine, R. (2006) In: Siegel, G.J.; Albers, R.W.; Brandy, S.T.; Price, D.L.

(Eds). Basic Neurochemistry. Molecular, Cellular and Medical aspects. Sétima

edição. Elsevier. p. 267-290.

Heales, S.J.R.; Bolanos, J.P.; Stewart, V.C.; Brookes, P.S.; Land, J.M.; Clark, J.B.

(1999) Nitric oxide, mitochondria and neurological disease. Biochem Biophys Acta

1410, 215–228.

Heneka, M.T.; Feinstein, D.L. (2001) Expression and function of inducible nitric oxide

synthase in neurons. J Neuroimmunol. 114(1-2):8-18.

117

Hensley, K.; Maidt, M.L.; Yu, Z.; Sang, H.; Markesbery, W.R.; Floyd, R.A. (1998)

Electrochemical analysis of protein nitrotyrosine and dityrosine in the Alzheimer brain

indicates region-specific accumulation. J. Neuroscience 18, 8126–8132.

Hertz, L. (2006) Glutamate, a neurotransmitter--and so much more. A synopsis of

Wierzba III. Neurochem Int. 48(6-7):416-425.

Heurteaux, C.; Laigle, C.; Blondeau, N.; Jarretou, G.; Lazdunski, M. (2006) Alpha-

linolenic acid and riluzole treatment confer cerebral protection and improve survival

after focal brain ischemia. Neuroscience. 137(1):241-251.

Hirai, H.; Kirsch, J.; Laube, B.; Betz, H.; Kuhse, J. (1996) The glycine binding site of the

N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR1: identification of novel determinants of

co-agonist potentiation in the extracellular M3-M4 loop region. Proc Natl Acad Sci

USA. 93(12):6031-6036.

Huhmer, A.F.; Gerber, N.C.; deMontellano, P.R.; Schoneich, C. (1996) Peroxynitrite

reduction of calmodulin stimulation of neuronal nitric oxide synthase. Chem Res

Toxicol 9: 484–491

Huhmer, A.F.; Nishida, C.R.; Ortiz-de-Montellano, P.R.; Schoneich, C. (1997)

Inactivation of the inducible nitric oxide synthase by peroxynitrite. Chem Res Toxicol

10: 618–626

Imlay, J.A.; Chin, S.M.; Linn, S. (1988) Toxic DNA damage by hydrogen peroxide

through the Fenton reaction in vivo and in vitro. Science 240, 1302-1309.

Jaffrey, S.R.; Snowman, A.M.; Eliasson, M.J.; Cohen, N.A.; Snyder, S.H. (1998)

CAPON: a protein associated with neuronal nitric oxide synthase that regulates its

interactions with PSD95. Neuron. 20(1):115-124.

Jaskot, R.H.; Charlet, E.G.; Grose, E.C.; Grady, M.A. (1983) An automated analysis of

glutathione peroxidase, S-transferase, and reductase activity in animal tissue. J.

Anal. Toxic. 7, 86-88.

Joo, N.E.; Park, C.S. (2003) Inhibition of excitotoxicity in cultured rat cortical neurons by

a mixture of conjugated linoleic acid isomers. Pharmacol Res. 47(4):305-310.

Kahlert, S.; Zündorf, G.; Reiser, G. (2005) Glutamate-Mediated influx of extracellular

is coupled with reactive oxygen species generation in cultured hippocampla

neurons but not in astrocytes. J. Neurosc. Res. 79:262-271.

Kawasaki, A.; Han, M.H.; Wei, J.Y.; Hirata, K.; Otori, Y.; Barnstable, C.J. (2002)

Protective effect of arachidonic acid on glutamate neurotoxicity in rat retinal ganglion

cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43(6):1835-1842.

118

Kehrer, J.P. (1993) Free radicals, mediators of tissue injury and disease. Crit. Rev.

Toxic. 23, 21-48.

Kew, J.N.; Kemp, J.A. (2005) Ionotropic and metabotropic glutamate receptor structure

and pharmacology. Psychopharmacology 179(1):4-29. Erratum in:

Psychopharmacology 182(2):320.

Kimelberg, H.K.; Goderie, S.K.; Higman, S.; Pang, S.; Waniewski, R.A. (1990) Swelling-

induced release of glutamate, aspartate, and taurine from astrocyte cultures.

J Neurosci. 10(5):1583-1591.

King Von, R.; Huang, W.L.; Dyall, S.C.; Curran, O.E.; Priestley, J.V.; Michael-Titus, A.T.

(2006) Omega-3 Fatty Acids Improve Recovery, whereas Omega-6 Fatty Acids

Worsen Outcome, after Spinal Cord Injury in the Adult Rat. J. Neurosci.

26(17):4672– 4680.

Klaunig, J.E.; Xu, Y.; Bachowski, S.; Jiang, J. (1997) Free-radical oxygen-induced

changes in chemical carcinogenesis. Free Radical Toxicology, pp. 375-400. Ed. K. B.

Wallace. Taylor and Frances, Washington.

Kluge, I.; Gutteck-Amsler, U.; Zollinger, M.; Do, K.Q. (1997) S-ntrosoglutathione in rat

cerebellum: identification and quantification by liquid chromatography-mass

spectrometry. J Neurochem 69: 2599–2607

Kolb, H. (1994). The architecture of functional neural circuits in the vertebrate retina

(The Proctor Lecture). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35 (5): 2385-2404.

Kolb, H. (2003) How the retina works. American Scientist 91, 28-35.

Köles, L.; Wirkner, K.; Illes, P. (2001) Modulation of ionotropic glutamate receptor

channels. Neurochem Res. 26(8-9):925-932.

Kotani, S.; Sakaguchi, E.; Warashina, S.; Matsukawa, N.; Ishikura, Y.; Kiso, Y.;

Sakakibara, M.; Yoshimoto, T.; Guo, J.; Yamashima, T. (2006) Dietary

supplementation of arachidonic and docosahexaenoic acids improves cognitive

dysfunction. Neurosci Res. 56(2):159-164.

Kubrusly, R.C.; de Mello, M.C.; de Mello, F.G. (1998) Aspartate as a selective NMDA

receptor agonist in cultured cells from the avian retina. Neurochem Int. 32(1):47-52.

Lander, H.M. (1997) An essential role for free radicals and derived species in signal

transduction. FASEB J 2: 118–124

119

Laube, B.; Hirai, H.; Sturgess, M.; Betz, H.; Kuhse, J. (1997) Molecular determinants of

agonist discrimination by NMDA receptor subunits: analysis of the glutamate binding

site on the NR2B subunit. Neuron. 18(3):493-503.

Lauritzen, I.; Blondeau, N.; Heurteaux, C.; Widmann, C.; Romey, G.; Lazdunski, M.;

(2000) Polyunsaturated fatty acids are potent neuroprotectors. EMBO J. 19(8):1784-

1793.

Laviano, A; Meguid, M.M.; Preziosa, I.; Fanelli, F.R. (2007) Oxidative stress and wasting

in cancer. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 10(4):449-456.

Lee, S.C.; Zhao, M.L.; Hirano, A.; Dickson, D.W. (1999) Inducible nitric oxide synthase

immunoreactivity in the Alzheimer disease hippocampus: association with Hirano

bodies, neurofibrillary tangles, and senile plaques.

J Neuropathol Exp Neurol. 58(11):1163-1169.

Li, J.; Baud, O.; Vartanian, T.; Volpe, J.J.; Rosenberg, P.A. (2005) Peroxynitrite

generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial

toxicity to oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci. 102(28):9936-9941.

Linster, C.L.; Van Schaftingen, E. (2007) Vitamin C. Biosynthesis, recycling and

degradation in mammals. FEBS J. 274(1):1-22.

Loewi, O. (1921) Uber humorale ubertragbarkeit der hirzenwickung. Pflugers Arch. 189:

239-242.

Loureiro-dos-Santos, N.E. (2000) Regulação da expressão e da atividade funcional de

marcadores colinérgicos no sistema nervoso central. Possíveis alvos de ação de

peptídeos amiloidogênicos. Tese de doutorado.

Loureiro-dos-Santos, N.E.; Prado, M.A.; Reis, R.A.; Gardino, P.F.; De Mello, M.C.; De

Mello, F.G. (2002) Regulation of vesicular acetylcholine transporter by the activation

of excitatory amino acid receptors in the avian retina. Cell Mol Neurobiol. 22(5-

6):727-740

Loureiro-Dos-Santos, N.E.; Reis, R.A.; Kubrusly, R.C.; de Almeida, O.M.; Gardino, P.F.;

De Mello, M.C.; De Mello, F.G. (2001) Inhibition of choline acetyltransferase by

excitatory amino acids as a possible mechanism for cholinergic dysfunction in the

central nervous system.

J Neurochem. 77(4):1136-1144.

Louzada, Jr.P.R.; Lima, A.C.P.; de Mello F.G.; Ferreira S.T. (2001) Dual role of

glutamatergic neurotransmission on amyloid beta(1-42) aggregation and

neurotoxicity in embryonic avian retina. Neuroscience Letters, 301: 59-63

Malarkey, E.B.; Parpura, V. (2007) Mechanisms of glutamate release from astrocytes.

Neurochem Int. 26:1-13

120

Manent, J.B.; Represa, A. (2007) Neurotransmitters and brain maturation: early

paracrine actions of GABA and glutamate modulate neuronal migration.

Neuroscientist, 13(3):268-279.

Martinez-Sanchez, G.; Giuliani, A. (2007) Cellular redox status regulates hypoxia

inducible factor-1 activity. Role in tumour development. J Exp Clin Cancer Res.

26(1):39-50.

Matsui, T.; Sekiguchi, M.; Hashimoto, A.; Tomita, U.; Nishikawa, T.; Wada, K. (1995)

Functional comparison of D-serine and glycine in rodents: the effect on cloned

NMDA receptors and the extracellular concentration. J Neurochem. 65(1):454-458.

Mcneil, M.A.; Masland, R.H. (1998). Extreme diversity among amacrine cells:

implications for function. Neuron 20: 971-982.

Melchiorri, D.; Cappuccio, I.; Ciceroni, C.; Spinsanti, P.; Mosillo, P.; Sarichelou, I.; Sale,

P.; Nicoletti. F. (2007) Metabotropic glutamate receptors in stem/progenitor cells.

Neuropharmacology, 53(4):473-480.

Michaelis, E.K. (1998) Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous

system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Prog Neurobiol

54(4):369-415.

Miersch, S.; Mutus, B. (2005) Protein S-nitrosation: biochemistry and characterization of

protein thiol-NO interactions as cellular signals. Clin Biochem. 38(9):777-791.

Miyamoto, E. (2006) Molecular mechanism of neuronal plasticity: induction and

maintenance of long-term potentiation in the hippocampus.

J Pharmacol Sci. 100(5):433-442.

Miyamoto, E. (2006) Molecular mechanism of neuronal plasticity: induction and

maintenance of long-term potentiation in the hippocampus. J Pharmacol Sci,

100(5):433-442.

Moncada, S.; Higgs, A. Furchgott, R. (1997) International Union of Pharmacology

Nomenclature in Nitric Oxide Research. Pharmacol Rev.

49(2):137-142.

Monsalve, M.; Borniquel, S.; Valle, I.; Lamas, S. (2007) Mitochondrial dysfunction in

human pathologies. Front Biosci.12:1131-1153.

Morgan, I.G. (1991). What do amacrine cells do? Progress in Retinal Research 11(8):

193-214.

Mori, H.; Mishina, M. (1995) Structure and function of the NMDA receptor channel.

Neuropharmacology. 34(10):1219-1237.

121

Moriyama, Y.; Yamamoto, A. (2004) Glutamatergic Chemical Transmission: Look! Here,

there and anywhere. J. Biochem. 135, 155-163.

Morot Gaudry-Talarmain Y.; Moulian, N.; Meunier, F.A.; Blanchard, B.; Angaut-Petit, D.;

Faille, L.; Ducrocq, C. (1997) Nitric oxide and peroxynitrite affect differently

acetylcholine release, choline acetyltransferase activity, synthesis, and

compartmentation of newly formed acetylcholine in Torpedo marmorata

synaptosomes. Nitric Oxide. 1(4):330-345

Moss, S.J.; Smart, T.G. (1996) Modulation of amino acid-gated ion channels by protein

phosphorylation. Int Rev Neurobiol. 39:1-52.

Mustacich, D.J.; Bruno, R.S.; Traber, M.G. (2007) Vitamin E. Vitam Horm. 76:1-21.

Noda, M.; Nakanishi, H.; Akaike, N. (1999) Glutamate release from microglia via

glutamate transporter is enhanced by amyloid-beta peptide. Neuroscience. 92, 1465-

1474

Nohl, H.; Hegner, D. (1978) Do mitochondria produce oxygen free radicals in vivo?. Eur.

J. Biochem. 82, 563-567.

Obrenovitch, T.P.; Urenjak, J.; Zilkha, E.; Jay, T.M. (2000) Excitotoxicity in neurological

disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18(2-3):281-287.

Olezak, E.L.; Zaczynska, E.; Bhattacharjee, M.; Butunoi, C.; Legido, A.; Katsetos, C.D.

(1998) Inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine are found in

monocytes/macrophages and/or astrocytes in acute, but not in chronic, multiple

sclerosis. Clin Diag Lab Immunol. 5, 438–445

Pacher, P.; Beckman, J.S.; Liaudet, L. (2007) Nitric oxide and peroxynitrite in health and

disease. Physiol Rev. 87(1):315-424.

Parathath, S.R.; Gravanis, I.; Tsirka, S.E. (2007) Nitric oxide synthase isoforms

undertake unique roles during excitotoxicity. Stroke. 38(6):1938-1945.

Parathath, S.R.; Parathath, S.; Tsirka, S.E. (2006) Nitric oxide mediates

neurodegeneration and breakdown of the blood-brain barrier in tPA-dependent

excitotoxic injury in mice. J Cell Sci. 119(Pt 2):339-249.

Parpura, V.; Basarsky, T.A.; Liu, F.; Jeftinija, K.; Jeftinija, S.; Haydon, P.G. (1994)

Glutamate-mediated astrocyte-neuron signalling. Nature. 369(6483):744-747.

Parpura, V.; Scemes, E.; Spray, D.C. (2004) Mechanisms of glutamate release from

astrocytes: gap junction "hemichannels", purinergic receptors and exocytotic release.

Neurochem Int. 45(2-3):259-264

122

Patil, S.; Chan, C. (2005) Palmitic and stearic fatty acids induce Alzheimer-like

hyperphosphorylation of tau in primary rat cortical neurons. Neurosci Lett.

384(3):288-293.

Pearce, J.M. (2000) Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 68(3):348.

Pennathur, S.; Heinecke, J.W. (2007) Oxidative stress and endothelial dysfunction in

vascular disease. Curr Diab Rep. 7(4):257-264.

Piehl, L.; Capani, F.; Facorro, G.; Lopez, E.M.; de Celis, E.R.; Pustovrh, C.; Hager, A.;

Coirini, H.; Lopez-Costa, J.J. (2007) Nitric oxide increases in the rat retina after

continuous illumination. Brain Res. 1156:112-119.

Platt, S.R. (2007) The Role of glutamate in central nervous system health and disease –

A review. Vet. J. 173, 278-286.

Poeggeler, B.; Reiter, R.J.; Tan, D.X.; Chen, L.D.; Manchester, L.C. (1993) Melatonin,

hydroxyl radical-mediated oxidative damage, and aging: a hypothesis. J. Pineal Res.

14, 151-168.

Pryor, W.A.; Squadrito, G. (1995) The chemistry of peroxynitrite: a product from the

reaction of nitric oxide with superoxide. Am J Physiol. 268(5):699-722.

Puro, D.G.; De Mello, F.G.; Nirenberg, M. (1977) Synapse turnover: the formation and

termination of transient synapses. Proc Natl Acad Sci USA. 74(11):4977-4981.

Qiu, D.L.; Knopfel, T. (2007) An NMDA receptor/nitric oxide cascade in presynaptic

parallel fiber-Purkinje neuron long-term potentiation. J Neurosci. 27(13):3408-3415.

Racke, K.; Juergens, U.R.; Matthiesen, S. (2006) Control by cholinergic mechanisms.

Eur J Pharmacol. 533(1-3):57-68.

Radi, R.; Beckman, J.S.; Bush, K.M.; Freeman, B.A. (1991a) Peroxynitrite oxidation of

sulfhydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. J. Biol. Chem. 266,

4244-4250.

Radi, R.; Beckman, J.S.; Bush, K.M.; Freeman, B.A. (1991b) Peroxynitrite induced

membrane lipid peroxidation. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide.

Arch. Biochem. Biophys. 288, 481-487.

Radi, R.; Cassina, A.; Hodara, R. (2002b) Nitric oxide and peroxynitrite interactions with

mitochondria. Biol Chem. 383(3-4):401-409.

Radi, R.; Cassina, A.; Hodara, R.; Quijano, C..; Castro, L. (2002a) Peroxynitrite

reactions and formation in mitochondria. Free Radic Biol Med. 33(11):1451-1464.

123

Radi, R.; Peluffo, G.; Alvarez, M.N.; Naviliat, M.; Cayota, A. (2001) Unraveling

peroxynitrite formation in biological systems. Free Radic Biol Med. 30(5):463-488.

Rameau, G.A.; Chiu, L.Y.; Ziff, E.B. (2004) Bidirectional regulation of neuronal nitric-

oxide synthase phosphorylation at serine 847 by the N-methyl-D-aspartate receptor.

J Biol Chem. 279(14):14307-14314.

Ramon y Cajal, S. (1893). The Vertebrate Retina. W. H. Freeman.

Rang, H.P.; Dale, M.M.; Ritter, J.M.; Moore, P.K. (2004) Farmacologia. 5ª edição.

Artmed, Porto Alegre,

Reiter, R.J.; Melchiorri, D.; Sewerynek, E.; Poeggeler, B.; Barlow-Walden, L.R.; Chuang,

J.I.; Ortiz, G.G.; AcunÄ a-Castroviejo, D. (1995) A review of the evidence supporting

melatonin's role as an antioxidant. J. Pineal Res. 18, 1-11.

Reiter, R.J.; Tang, L.; Garcia, J.J.; MunÄ oz-Hoyos, A. (1997) Pharmacological actions

of melatonin in oxygen radical pathophysiology. Life Sci. 60, 2255-2271.

Reynolds, A.; Laurie, C.; Lee Mosley, R.; Gendelman, H.E. (2007) Oxidative stress and

the pathogenesis of neurodegenerative disorders. Int Rev Neurobiol. 82:297-325.

Reynolds, M.R.; Berry, R.W.; Binder, L.I. (2007) Nitration in neurodegeneration:

deciphering the "Hows" "nYs". Biochemistry. 46(25):7325-7336.

Rhee, S.G.; Chae, H.Z.; Kim, K. (2005) Peroxiredoxins: a historical overview and

speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling.

Free Radic Biol Med. 38(12):1543-1552.

Richter, C.; Schweizer, M. (2002) Introduction to serial reviews on nitric oxide in

mitochondria.

Free Radic Biol Med. 33(11):1439

Saha, R.N.; Pahan, K. (2006a) Regulation of inducible nitric oxide synthase gene in glial

cells. Antioxid Redox Signal. 8(5-6):929-947.

Saha, R.N.; Pahan, K. (2006b) Signals for the induction of nitric oxide synthase in

astrocytes. Neurochem Int. 49(2):154-163.

Salvemini, D. (1997) Regulation of cyclooxygenase enzymes by nitric oxide. Cell Mol

Life Sci 53: 576–582

Sanchez-Prieto, J.; Budd, D.C.; Herrero, I.; Vazquez, E.; Nicholls, D.G.; (1996)

Presynaptic receptors and the control of glutamate exocytosis. Trends Neurosci.

19(6):235-239.

Sarsilmaz, M.; Songur, A.; Ozyurt, H.; Kus, I.; Ozen, O.A.; Ozyurt, B.; Sogut, S.; Akyol,

O. (2003) Potential role of dietary omega-3 essential fatty acids on some

124

oxidant/antioxidant parameters in rats' corpus striatum. Prostaglandins Leukot

Essent Fatty Acids. 69(4):253-259.

Sarter, M.; Bruno, J.P. (2000) Cortical cholinergic inputs mediating arousal, attentional

processing and dreaming: differential afferent regulation of the basal forebrain by

telencephalic and brainstem afferents. Neuroscience. 95(4):933-952.

Sarter, M.; Parikh, V. (2005) Choline transporters, cholinergic transmission and

cognition. Nat Rev Neurosci. 6(1):48-56.

Sattler, R.; Xiong, Z.; Lu, W.Y.; Hafner, M.; MacDonald, J.F.; Tymianski, M. (1999)

Specific coupling of NMDA receptor activation to nitric oxide neurotoxicity by PSD-95

protein.

Science. 284(5421):1845-1848

Sawa, T.; Zaki, M.H.; Okamoto, T.; Akuta, T.; Tokutomi, Y.; Kim-Mitsuyama, S.; Ihara,

H.; Kobayashi, A.; Yamamoto, M.; Fujii, S.; Arimoto, H.; Akaike, T. (2007) Protein S-

guanylation by the biological signal 8-nitroguanosine 3',5'-cyclic monophosphate. Nat

Chem Biol. 3(11):727-735.

Schkeryantz, J.M.; Kingston, A.E.; Jonhson, M.P. (2007) Prospects for metabotropic

glutamate 1 receptor antagonists in the treatment of neuropathic pain, J Med Chem,

50(11):2563-2568

Schliebs, R.; Arendt, T. (2006) The significance of the cholinergic system in the brain

during aging and in Alzheimer's disease.

J Neural Transm. 113(11):1625-1644.

Schnabel, R.; Blankenberg, S. (2007) Oxidative stress in cardiovascular disease:

successful translation from bench to bedside? Circulation. 18;116(12):1338-1340.

Seeburg, P.H.; Hartner, J. (2003) Regulation of ion channel/neurotransmitter receptor

function by RNA editing. Curr Opin Neurobiol. 13(3):279-283.

Selkoe, D.J. (1999) Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's

disease. Nature. 399(supl.): A23-A31.

Sergeeva, M.; Strokin, M.; Reiser, G. (2005) Regulation of intracellular calcium levels by

polyunsaturated fatty acids, arachidonic acid and docosahexaenoic acid, in

astrocytes: possible involvement of phospholipase A2. Reprod Nutr Dev. 45(5):633-

646.

Severus, W.E. (2006) Effects of omega-3 polyunsaturated fatty acids on depression.

Herz. 31 Suppl 3:69-74.

Sgard, F.; Charpantier, E.; Bertrand, S.; Walker, N.; Caput, D.; Graham, D.; Bertrand,

D.; Besnard, F. (2002) A novel human nicotinic receptor subunit, alpha10, that

confers functionality to the alpha9-subunit. Mol Pharmacol. 61(1):150-159.

125

Shankar, G.M.; Bloodgood, B.L.; Townsend, M.; Walsh, D.M.; Selkoe, D.J.; Sabatini,

B.L. (2007) Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce

reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent

signaling pathway. J Neurosci. 27(11):2866-2875.

Shen, Y. (2006) N-methyl-D-aspartate receptors in the retina. Mol Neurobiol, 34(3), 163-

179.

Shen, Y. (2006) N-methyl-D-aspartate receptors in the retina. Mol Neurobiol, 34(3), 163-

179.

Shigeri, Y.; Seal, R.P.; Shimamoto, K. (2004) Molecular pharmacology of glutamate

transporters, EAATs and VGLUTs. Brain Res Rev. 45(3):250-265.

Siegel, G.J.; Agranoff, B.W.; Albers, R.W.; Fisher, S.K.; Uhler, M.D. (1999) Basic

Neurochemistry, Molecular, Cellular and Medical Aspects, 6ª ed, editors

Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins;

Sigel, E.; Baur, R. (1988) Activation of protein kinase C differentially modulates neuronal

, Ca

, and gamma-aminobutyrate type A channels. Proc Natl Acad Sci USA.

85(16):6192-6196.

Smutzer, G. (2001) Research tools for nitric oxide. The Scientist. 19:23–28.

Sohal, R.S. (1997) Mitochondria generate superoxide anion radicals and hydrogen

peroxide. FASEB J. 11, 1309-1315.

Souza, J.M.; Radi, R. (1998) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase inactivation

by peroxynitrite. Arch Biochem Biophys. 360:187–194

Spira, A.W.; Millar, T.J.; Ishimoto, I.; Epstein, M.L.; Johnson, C.D.; Dahl, J.L.; Morgan,

I.G. (1987) Localization of choline acetyltransferase-like immunoreactivity in the

embryonic chick retina.

J Comp Neurol. 260(4):526-538.

Stachowiak, O.; Dolder, M.; Wallimann, T.; Richter, C. (1998) Mitochondrial creatine

kinase is a prime target of peroxynitrite-induced modification and inactivation. J Biol

Chem 273, 16694–16699

Szabados, E.; Fischer, G.M.; Toth, K.; Csete, B.; Nemeti, B.; Trombitas, K.; Habon, T.;

Endrei, D.; Sumega, B. (1999) Role of reactive oxygen species and poly-ADP-ribose

polymerase in the development of the AZT-induced cardiomyopathy in rat. Free

Radic Biol Med 26:309–317

Szatkowski, M.; Barbour, B.; Attwell, D. (1990) Non-vesicular release of glutamate from

glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake. Nature. 348(6300):443-446.

126

Takamori, S. (2006) VGLUTs: ‘Exciting’ times for glutamatergic research? Neurosc. Res.

55:343-351.

Tariq, S.A. (2003) Role of ascorbic acid in scavenging free radicals and lead toxicity

from biosystems. Mol Biotechnol. 37(1):62-5.

Taylor, P.; Brown, J.H. (2006) In: Siegel, G.J.; Albers, R.W.; Brandy, S.T.; Price, D.L.

(Eds). Basic Neurochemistry. Molecular, Cellular and Medical aspects. Sétima

edição. Elsevier. p. 187-209.

Traber, M.G.; Atkinson, J. (2007) Vitamin E, antioxidant and nothing more. Free Radic

Biol Med. 43(1):4-15.

Trujilo, M.; Radi, R. (2002) Peroxynitrite Reactioon with the Reduced and the Oxidized

Forms of Lipoic Acid: New Insights into the Reaction of Peroxynitrite with Thiols.

Arch. Biochem. Biophys. 397(1), 91-98

Trushina, E.; McMurray, C.T. (2007) Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in

neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145(4):1233-1248.

Tsay, Y.F.; Chiu, C.C.; Tsai, C.B.; Ho, C.H.; Hsu, P.K. (2007) Nitrate transporters and

peptide transporters. FEBS Lett. 581(12):2290-2300.

Unterberger, U.; Voigtlander, T.; Budka, H. (2005) Pathogenesis of prion diseases.

Acta Neuropathol 109(1):32-48.

Vesce, S.; Rossi, D.; Brambilla, L.; Volterra, A. (2007) Glutamate release from

astrocytes in physiological conditions and in neurodegenerative disorders

characterized by neuroinflammation. Int Rev Neurobiol. 82:57-71.

Vincent, V.A.; Löwik, C.W.; Verheijen, J.H.; de Bart, A.C.; Tilders, F.J.; Van Dam, A.M.;

(1998) Role of astrocyte-derived tissue-type plasminogen activator in the regulation

of endotoxin-stimulated nitric oxide production by microglial cells.

Glia. 22(2):130-

137.

Viner, R.I.; Huhmer, A.F.; Bigelow, D.J.; Schoneich, C. (1996) The oxidative inactivation

of sarcoplasmic reticulum Ca

-ATPase by peroxynitrite. Free Radic Res 24, 243–

259.

Walker, K.; Reeve, A.; Bowes, M.; Winter, J.; Wotherspoon, G.; Davis, A.; Schmid, P.;

Gasparini, F.; Kuhn, R.; Urban, L. (2001) mGlu5 receptors and nociceptive function

II. mGlu5 receptors functionally expressed on peripheral sensory neurones mediate

inflammatory hyperalgesia. Neuropharmacology. 40(1):10-9.

Walsh, D.M., Selkoe, D.J. (2007) A beta oligomers - a decade of discovery. J

Neurochem. 101(5):1172-1184.

127

Wang, L.Y.; Dudek, E.M.; Browning, M.D.; MacDonald, J.F. (1994) Modulation of

AMPA/kainate receptors in cultured murine hippocampal neurones by protein kinase

C. J Physiol. 475(3):431-437.

Wang, Y.; Tang, B.L. (2006) SNAREs in neurons--beyond synaptic vesicle exocytosis.

Mol Membr Biol. 23(5):377-384.

Wang, Z.J.; Liang, C.L.; Li, G.M.; Yu, C.Y.; Yin, M. (2006) Neuroprotective effects of

arachidonic acid against oxidative stress on rat hippocampal slices. Chem Biol

Interact. 163(3):207-217.

Warr, O.; Takahashi, M.; Attwell, D. (1999) Modulation of extracellular glutamate

concentration in rat brain slices by cystine-glutamate exchange.

J Physiol. 514 ( Pt 3):783-793.

Whiteman, M.; Halliwell, B. (1997) Thiols and disulphides can aggravate peroxynitrite-

dependent inactivation of alpha 1-antiproteinase. FEBS Lett 414: 497–500

Wu, D.; Hersh, L.B. (1994) Choline acetyltransferase: celebrating its fiftieth year.

J Neurochem. 62(5):1653-1663.

Wu, L.J.; Ko, S.W.; Zhuo, M. (2007) Kainate receptors and pain: from dorsal root

ganglion to the anterior cingulate cortex. Curr Pharm Des, 13(15):1597-1605.

Yamakura, F.; Taka, H.; Fujimura, T.; Murayama, K. (1998) Inactivation of human

manganese-superoxide dismutase by peroxynitrite is caused by exclusive nitration of

tyrosine 34 to 3-nitrotyrosine. J Biol Chem 273, 14085–14089.

Yamasaki, I.; Piette, L.H. (1991) EPR spin trapping study on the oxidizing species

formed in the reaction of the ferrous ion with hydrogen peroxide. J. Am. Chem. Soc.

113, 7588-7593.

Yan, X.B.; Song, B. ; Zhang, G.Y. (2004) Postsynaptic density protein 95 mediates

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-activated serine phosphorylation of

neuronal nitric oxide synthase during brain ischemia in rat hippocampus. Neurosci

Lett. 355(3):197-200.

Yang, X.L. (2004) Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal

neurons. Prog Neurobiol. 73(2):127-150.

Yang, X.L. (2004) Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal

neurons. Prog Neurobiol, 73(2), 127-150.

Ye, Z.C.; Wyeth, M.S.; Baltan-Tekkok, S.; Ransom, B.R.; (2003) Functional

hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.

J Neurosci.

23(9):3588-3596.

128

Yehuda, S.; Rabinovitz, S.; Mostofsky, D.I. (2005) Essential fatty acids and the brain:

from infancy to aging. Neurobiol Aging. 1:98-102.

Zikopoulos, B.; Barbas, H. (2007) Parallel driving and modulatory pathways link the

prefrontal cortex and thalamus. PLoS ONE. 2(9):1-19.

129

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 