( PDF ) Papel da quimiocina MIP-1alpha e do receptor CCR2 em lesões periapicais osteolíticas experimentais

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

Papel da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em lesões

periapicais osteolíticas experimentais

THIAGO POMPERMAIER GARLET

RIBEIRÃO PRETO

2008

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Thiago Pompermaier Garlet

Papel da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em lesões

periapicais osteolíticas experimentais

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação

em Farmacologia da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, para a

obtenção do grau de Mestre em Ciências – Área de

Concentração: Farmacologia

Orientador : Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha

Ribeirão Preto

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Garlet, Thiago Pompermaier

Papel da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em lesões

periapicais osteolíticas experimentais. Ribeirão Preto,

2008.

72 p. il. 30cm

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração:

Farmacologia.

Orientador: Cunha, Fernando de Queiroz.

1. Lesão periapical 2. Quimiocinas 3. Osteoimunologia

4. Osteólise

FOLHA DE APROVAÇÃO

Papel da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em lesões periapicais osteolíticas

experimentais

Thiago Pompermaier Garlet

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação

em Farmacologia da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, para a

obtenção do grau de Mestre em Ciências – Área de

Concentração: Farmacologia

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Fernando de Queiróz Cunha

FMRP-USP

Orientador

Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos

FOB-USP

Prof. Dr. Adalberto Luiz Rosa

FORP-USP

Trabalho realizado no Laboratório de Dor e Inflamação, Departamento de

Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade

de São Paulo, com auxílio financeiro do CNPQ.

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Anselmo e Rosa...

...por tudo!

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha, pela orientação durante a realização deste trabalho,

pela competência e espírito científico, mas principalmente pela oportunidade e confiança.

Aos Profs. Dr. Adalberto Luiz Rosa (FORP-USP) e Dr. Carlos Ferreira dos Santos (FOB-

USP) pela atenção dispensada, comentários e sugestões na correção da proforma desta dissertação, e

pela participação na banca.

À Dr.ª Sandra Yasuyo Fukada, pela indispensável colaboração neste estudo, pela amizade e

disposição em ensinar (tanto ciência quanto nihongo!), e também à Isabella Francisco Saconato, pela

sua contribuição para a realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Mário Julio Ávila Campos, do Laboratório de Anaeróbios do ICB-USP, que vem

colaborando com nosso grupo, fornecendo as cepas de periodontopatógenos utilizadas no

desenvolvimento de nossos estudos.

Ao Prof. Dr. Ulisses Coelho (UEPG), pelos ensinamentos, colaboração, incentivo e amizade

ao longo dos anos.

Aos Profs. Dr. Marcos Rossi (FMRP-USP) e Dr. João Santana da Silva (FMRP-USP), pela

disponibilidade na utilização da infra-estrutura de seus laboratórios e pelo auxílio em diversos

experimentos.

Ao curso de Pós-Graduação em Farmacologia, representado por seus Professores, pelos

ensinamentos e pela dedicação que fez com que nosso curso atingisse o nível de excelência em que se

encontra.

A todos os funcionários e técnicos, que direta ou indiretamente contribuíram para este trabalho

e para o bom andamento do nosso dia a dia: Giuliana, Fabíola, Kátia, Diva, Eleni, Tadeu, Ramon,

Sônia, Fátima...

A todos os colegas do laboratório de dor e inflamação, Andressa, Fabrício, Renata, Henrique,

Daninha, Zeca, Spiller, Silvio, Michel, Flávia, Vanessa, Thiago, Betty, Ana Tereza, Paulo, Mani,

Waldiceu, Luiz Fernando, Celina, Guilherme, Dionéia, Cris, Djane, Marcos, que me receberam de

braços abertos e dispostos a ensinar, e aos que se juntaram ao grupo recentemente, Fabi, Marina,

Maria, Daniele, Paula, Larissa, Silvia, Rafaela, Mônica, Daniela, e também aos que não são do

laboratório, Daniel, Fernando, Heitor, Vanessa e mais uma galera, mas se eu tentar citar o nome de

todos certamente vou esquecer alguém (ou mais

alguém?)..... enfim, a todos os colegas de pós-

graduação, pelas discussões científicas e pelos momentos de descontração, seja nos churrascos, nos

games (esquadrão polimorfonuclear: Ala hu akbar!), no rock’n’roll (Vanys, Silvão, Guilherme,

Waldiceu:

VAMOS ENSAIAR!).......

Ao CNPQ, cujo auxílio na forma de minha bolsa de mestrado possibilitou a realização deste

trabalho.

...Muito obrigado a todos!

E finalmente ao Prof. Dr. Gustavo Pompermaier Garlet (FOB-USP), por indicar o caminho e

principalmente pelo exemplo a ser seguido. Este não é o fim, é só o começo...

…and we’re going down....... all the waaa-ay-aay…………

ÍNDICE

ABREVIATURAS.......................................................................................................ix

RESUMO....................................................................................................................xi

ABSTRACT...............................................................................................................xii

INTRODUÇÃO..........................................................................................................13

OBJETIVOS..............................................................................................................27

MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................28

Animais de experimentação...................................................................................28

Protocolo de indução da lesão periapical ..............................................................28

Análise histológica .................................................................................................29

Reação de detecção de osteoclastos ....................................................................29

RealTime-PCR.......................................................................................................30

Análise dos resultados...........................................................................................32

RESULTADOS..........................................................................................................33

Formação da lesão periapical................................................................................33

Presença de osteoclastos......................................................................................35

Expressão de RANKL e OPG................................................................................35

Expressão de citocinas pró-inflamatórias ..............................................................38

Expressão de quimiocinas.....................................................................................40

Expressão de proteases ........................................................................................45

DISCUSSÃO.............................................................................................................47

CONCLUSÃO ...........................................................................................................59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................60

ABREVIATURAS

CCR Receptor de quimiocina da família CC

CXCR Receptor de quimiocina da família CXC

DEPC Dietil-pirocarbonato (Diethyl pyrocarbonate)

IFN Interferon

IL Interleucina (Interleukin)

IP-10 Proteína induzida por INF-γ (10 kDa interferon-

gamma-induced protein)

KC Quimiocina derivada de queratinócitos

(Keratinocyte derived chemokine)

KO Animal geneticamente deficiente (Knock-out)

MCP Proteína quimiotáxica de monócitos (Monocyte

chemotatic protein)

M-CSF Fator estimulante de colônia de macrófagos

(Macrophage colony stimulatin factor)

MIP Proteína inflamatória de macrófagos

(Macrophage inflammatory protein)

MMP Metaloprotease de matriz (matrix

metalloproteinase)

mRNA Acido ribonucléico mensageiro

NFATc1 Fator nuclear de células T ativadas 1 (nuclear

factor of activated T cells)

NFkB Fator nuclear κ B (nuclear factor κ B)

NK Natural Killer

OPG Osteoprotegerina (Osteoprotegerin)

PEPI Pró-epitelina (proepithelin)

RANK Receptor ativador do NFkB (receptor activator

of NFkB)

RANKL Ligante do receptor ativador do NFkB

(receptor activator of NFkB ligand)

RANTES Regulada na ativação, expressada e

secretada por células T normais (Regulated

upon activation, normal T cell expressed and

secreted)

RNA Acido ribonucléico

SDF Fator derivado de células estromais (Stromal

cell derived factor)

SLPI Inibidor de proteases secretadas por

leucócitos (secretory leukocyte protease

inhibitor)

TIMP Inibidor tecidual de metaloprotease (tissue

inhibitor of metalloproteinase)

TNF Fator de necrose tumor (Tumor necrosis

factor)

TRAP Fosfatase ácida resistente ao tartarato (tartrate

resistant acid phosphatase)

WT Camundongo selvagem (Wild type)

RESUMO

GARLET, TP. Papel da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em lesões

periapicais osteolíticas experimentais. Dissertação de mestrado. Dept. de

Farmacologia, FMRP-USP

Lesões periapicais são alterações ósseas dos maxilares, decorrentes de processos

infecciosos da polpa dentária. Com a progressão do processo para o periápice

ocorre a liberação de mediadores e a migração de células inflamatórias,

desencadeando uma resposta inflamatória e destruição tecidual, com a reabsorção

dos tecidos mineralizados de suporte, comprometendo a sustentação do elemento

dental. Sabe-se que diferentes citocinas e quimiocinas participam do processo de

osteoclastogênese e reabsorção óssea em diferentes doenças, mas o papel destes

mediadores na patogênese das lesões periapicais não está bem definido. O objetivo

deste trabalho foi estudar o papel da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em um

modelo de lesão periapical em camundongos, utilizando animais geneticamente

deficientes para CCR2, o receptor de MCP-1, e de MIP-1α. A lesão periapical foi

induzida por meio de exposição pulpar cirúrgica com o auxilio de uma broca ¼ e

inoculação de bactérias patogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos de

0, 3, 7, 14 e 21 dias. Os animais MIP-1α KO apresentaram lesões semelhantes às

dos animais selvagens, enquanto os animais CCR2 KO apresentaram lesões de

maior extensão. Da mesma forma, os animais MIP-1α KO apresentaram uma

cinética de expressão de citocinas e quimiocinas similar aos animais selvagens,

enquanto os animais CCR2 KO apresentaram uma maior expressão de fatores

relacionados à diferenciação e atividade de osteoclastos, e de migração de

neutrófilos. Os resultados sugerem que nenhuma das quimiocinas estudadas é

indispensável na osteoclastogênese, e que o receptor CCR2, é importante na

proteção do hospedeiro frente à destruição óssea periapical.

xii

ABSTRACT

GARLET, TP. Role of chemokine MIP-1α and receptor CCR2 in experimental

osteolytic periapical diseases. Master dissertation. Dept. of Pharmacology,

FMRP-USP

Periapical lesions, are chronic inflammatory disorders of periradicular tissues caused

by etiological agents of endodontic origin. The osteolytic lesions are thought to be the

result of a local inflammatory response mediated by inflammatory cell infiltration and

production of inflammatory mediators. Although cytokines and chemokines are

strongly implicated in the migration and activation of leukocytes in different

inflammatory diseases and experimental models, little is known regarding the

expression of chemokines and their receptors in apical periodontitis. The objective of

this study was to evaluate the role of of chemokine MIP-1α and chemokine receptor

CCR2 in an experimental model CCR2 and MIP-1α knockout mice. Periapical lesions

were induced by surgical pulp exposure, performed with a ¼ carbide bur, followed by

bacterial infection. Animals were sacrificed at 0, 3, 7, 14 and 21 days after surgery, in

order to evaluate how the ostelytic lesios develop through time. MIP-1α KO mice

exhibited periapical lesions similar to that in wild type, whereas CCR2 KO mice

showed bigger lesions. CCR2 KO mice also expressed higher levels of

osteoclastogenic and osteolytic factors, RANKL, Cathepsin K and MMP1, and

neutrophil migration related chemokine, KC. MIP-1α KO mice cytokine and

chemokine expression was similar to wild type animals. These results suggest that

CCR2 and MCP-1 are important in host defense to periapical ostelysis and that these

proteins are not required to osteoclastogenesis.

INTRODUÇÃO

As lesões periapicais são alterações ósseas de natureza inflamatória, que

ocorrem como conseqüência da infecção bacteriana da polpa dentária, provocada

por cáries, traumas ou iatrogenias. A infecção da polpa resulta em destruição do

tecido conjuntivo que a constitui e induz resposta do hospedeiro na região periapical

dental [NAIR, PN, 1997]. Com a progressão do processo para a região periapical

ocorre a reabsorção de tecidos mineralizados, tais como cemento, dentina e osso

alveolar. Estas lesões podem progredir levando a destruições ósseas de grande

extensão e mesmo a abscessos [SIQUEIRA, JF, JR., 2002].

Uma característica importante das lesões periapicais é a persistente

migração de grande número de células imunocompetentes, tais como leucócitos

polimorfonucleares, macrófagos e linfócitos [KAWASHIMA, N et al., 1996;

STASHENKO, P et al., 1992]. Diversos trabalhos têm caracterizado o infiltrado

inflamatório presente em lesões periapicais. Considerando-se o curso da resposta

inflamatória, podemos esperar que elevado número de neutrófilos seja encontrado

durante a fase aguda da doença, e que linfócitos e macrófagos se acumulem

durante a fase crônica. No entanto, dados provenientes de diversos estudos são

contraditórios, e os padrões de descrição clássica de lesões crônicas e agudas não

se aplicam perfeitamente às lesões periapicais, o que pode ser atribuído a diferentes

agentes causadores de lesões periapicais, sua persistência crônica nos tecidos

dentais, bem como a fatores temporais e a fatores particulares do hospedeiro. De

forma geral, na lesão periapical os macrófagos apresentam uma distribuição

completa em toda a extensão da lesão, predominando em quase todos os estágios

de desenvolvimento [KAWASHIMA, N et al., 1996; NAIR, PN, 1997; STASHENKO, P

et al., 1992]. Por outro lado foi demonstrado também que neutrófilos participam

ativamente do desenvolvimento de lesões periapicais, uma vez que animais

neutropênicos desenvolvem lesões menos severas quando comparados a animais

normais [KOBAYASHI, Y, 2006; YAMASAKI, M et al., 1994]. Estas células são

importantes fontes de mediadores citotóxicos como enzimas proteolíticas e radicais

livres de oxigênio e nitrogênio, além de citocinas pró-inflamatórias, capazes de ativar

outras células e acentuar o caráter destrutivo da resposta [NATHAN, C, 2006;

WEISS, SJ, 1989].

Uma vez observada a presença de diversos tipos de leucócitos na lesão

periapical, a atenção voltou-se para os fatores envolvidos no recrutamento e

ativação destas células. De fato, os mediadores quimiotáxicos e inflamatórios têm

um papel muito importante no desenvolvimento da resposta imune e inflamatória,

visto que são os sinais químicos representados por essas citocinas que ativam as

células de defesa e as capacitam para a eliminação do agente infeccioso. Entre os

principais mediadores que regulam a migração e ativação de leucócitos podemos

citar IL-1 (Interleucina-1), TNF-α (fator de necrose tumoral alfa), MIP-1α (proteína

inflamatória de macrófagos 1 alfa), MCP-1 (proteína quimiotáxica de monócitos 1),

RANTES (regulada na ativação, expressada e secretada por células T normais), IL-8

e seu equivalente murino KC (quimiocina derivada de queratinócito) [BALTO, K et

al., 2001; KABASHIMA, H et al., 2001; KAWASHIMA, N et al., 1999; MARTON, IJ et

al., 2000; SHIMAUCHI, H et al., 2001; SUZUKI, T et al., 2002; WANG, CY et al.,

1993a; WANG, CY et al., 1993b]. Entretanto, tendo em vista a expressão crônica

destes mediadores em diversos processos inflamatórios, incluindo as lesões

periapicais, sua produção também pode levar ao dano tecidual, uma vez que vários

deles estão relacionados à osteoclastogênese [TAKAYANAGI, H, 2005].

Osteoclastos são células especializadas na reabsorção óssea. A ação

destas células é importante no turnover do tecido ósseo, responsável pela

manutenção da integridade estrutural do esqueleto, reabsorvendo regiões

danificadas e permitindo sua substituição por tecido novo, sintetizado por

osteoblastos [ALLISTON, T et al., 2002]. Osteoblastos são células especializadas,

responsáveis pela formação do tecido ósseo, e o equilíbrio entre a atividade destas

células e a reabsorção promovida por osteoclastos é fundamental para a

homeostasia do tecido [TANAKA, Y et al., 2005]. O processo de osteoclastogênese é

orquestrado por hormônios, citocinas produzidas localmente e fatores de

crescimento, compartilhando vários desses mediadores com o sistema imune

[TAKAYANAGI, H, 2007]. Logo, uma resposta inflamatória pode produzir os

mediadores necessários para desequilibrar o balanço entre as atividades anabólica

e catabólica do tecido ósseo, diferenciando e ativando mais osteoclastos, e por fim

resultando em uma lesão osteolítica [MANOLAGAS, SC, 1995; NAIR, PN, 1997;

TAKAYANAGI, H, 2005].

A evidência mais significativa da importância de sinais químicos para a

diferenciação de osteoclastos foi a identificação do fator osteoclastogênico RANKL

(ligante do receptor ativador de NFκB) [LACEY, DL et al., 1998; YASUDA, H et al.,

1998]. A ativação de osteoclastos é controlada principalmente pela ativação do

receptor RANK (receptor ativador de NFκB), um receptor da família dos receptores

de TNF, pela interação com seu ligante RANKL [KATAGIRI, T et al., 2002]. RANK é

expresso tanto por osteoclastos maduros como pelos seus precursores, enquanto

RANKL é expresso por osteoblastos, linfócitos T, células estromais da medula óssea

e outros tipos celulares [KATAGIRI, T et al., 2002]. Ainda que RANKL tenha sido

identificado como o fator principal na osteoclastogênese, várias citocinas envolvidas

em processos inflamatórios apresentam um papel fundamental no processo de

reabsorção óssea, uma vez que e expressão de RANKL é modulada por tais

mediadores [TAKAYANAGI, H, 2007; TANAKA, Y et al., 2005]. A terceira molécula

envolvida diretamente na osteoclastogênese é a osteoprotegerina (OPG), um

receptor solúvel secretado por osteoblastos capaz de ligar-se ao RANKL, impedindo

assim sua ligação ao RANK e conseqüente ativação da célula [TAKAYANAGI, H,

2007].

Além dos fatores envolvidos diretamente na diferenciação de osteoclastos, a

participação de diversas citocinas nesse processo tem sido descrita [TAKAYANAGI,

H, 2007]. IL-1 é uma citocina de caráter pró-inflamatório que regula diversas funções

em diferentes tecidos e tipos celulares, incluindo osteoclastos. Sabe-se atualmente

que ela está relacionada com a destruição de tecido ósseo em diferentes doenças,

como artrite e doenças periodontais, além das lesões periapicais [GRAVES, DT et

al., 2003; NAKAMURA, I et al., 2006; STASHENKO, P et al., 1998; WILLIAMS, RO,

2006]. Juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, a IL-1

contribui com a diferenciação e ativação de osteoclastos por meio da indução da

expressão de RANKL em osteoblastos [NAKAMURA, I et al., 2006; TANAKA, Y et

al., 2005; WILLIAMS, RO, 2006]. Durante algum tempo IL-1 e TNF-α foram

considerados os principais fatores responsáveis pela diferenciação e atividade deste

tipo celular. Enquanto novas pesquisas sugeriam a participação de outros

mediadores já conhecidos, como outras citocinas e fatores de crescimento,

continuava a busca pelo fator chave diretamente responsável pela

osteoclastogênese, até que o fator RANKL foi identificado no final da década de 90

[BAUD'HUIN, M et al., 2007; LACEY, DL et al., 1998].

Em contraste com a reabsorção óssea promovida por citocinas pró-

inflamatórias, citocinas de caráter anti-inflamatório, como IL-10 e IL-4, parecem

apresentar um papel protetor, diminuindo a destruição óssea [GARLET, GP et al.,

2003; SILVA, TA et al., 2007]. A expressão de IL-10 parece levar a uma regulação

negativa da expressão de RANKL e M-CSF (Fator estimulante de colônia de

macrófagos), além de um aumento na expressão de OPG (Osteoprotegerina) [LIU, D

et al., 2006]. Além da modulação dos sinalizadores disponíveis no microambiente, foi

demonstrado in vitro que a IL-10 tem a capacidade de inibir a expressão de fatores

de transcrição necessários à ativação dos osteoclastos, quando adicionada ao meio

de cultura destas células, por meio de receptores para IL-10 expressos

constitutivamente por estas células [MOHAMED, SG et al., 2007].

Outra citocina de ação pouco compreendida na remodelação óssea é o IFN-

γ (Interferon gama). Essa citocina tem sua expressão aumentada em tecidos

periodontais doentes [PRABHU, A et al., 1996], e parece contribuir para a

reabsorção óssea em modelos experimentais [BAKER, PJ et al., 1999]. Entretanto,

estudos in vitro sugerem que esta citocina tem a capacidade de inibir a formação e a

expressão gênica de osteoclastos, atuando diretamente sobre essas células

[KAMOLMATYAKUL, S et al., 2001]. Entretanto, IFN-γ pode estimular linfócitos T a

produzir fatores osteoclastogênicos como TNF-α e RANKL, de forma que estimularia

indiretamente a osteoclastogênese [GAO, Y et al., 2007]. Um estudo recente

empregou um modelo de movimentação ortodôntica em ratos e observou que

injeções de INF-γ reduziram a reabsorção óssea, sugerindo a possibilidade de

utilização clínica para inibição da movimentação em sítios de ancoragem [MERMUT,

S et al., 2007].

Além das citocinas envolvidas no processo inflamatório, têm se estudado o

papel de quimiocinas na biologia da remodelação óssea [SILVA, TA et al., 2007]. As

quimiocinas são um grupo de citocinas caracterizadas originalmente pela sua

atividade quimiotáxica, embora atualmente outras funções tenham sido reconhecidas

[PROOST, P et al., 1996]. As quimiocinas compreendem uma grande família de

proteínas de pequeno peso molecular que exercem seus efeitos por meio da ligação

a uma classe de receptores expressos na superfície celular. As quimiocinas

apresentam quatro resíduos de cisteína conservados, formando duas pontes

dissulfeto essenciais, que conferem estabilidade à sua estrutura, e certa

especificidade de ligação [LUSTER, MI, 1998]. As quimiocinas são subdivididas nos

grupos CC, CXC, CX

C baseado no número de aminoácidos entre as duas primeiras

cisteínas. As quimiocinas CXC, como a IL-8 (representada pelo KC em

camundongos) ativam predominantemente células polimorfonucleares como

neutrófilos enquanto que as quimiocinas da classe CC como MCP-1, RANTES e

MIP-1α ativam macrófagos, eosinófilos, basófilos e linfócitos [LUSTER, MI, 1998;

OLSON, TS et al., 2002]. As quimiocinas são produzidas localmente no tecido

inflamado e a interação quimiocina-receptor regula espacialmente a infiltração de

células inflamatórias [PROOST, P et al., 1996].

Quimiocinas como MIP1-α, MCP-1 e RANTES têm atraído a atenção dos

pesquisadores por se relacionarem com macrófagos, células da mesma linhagem

dos osteoclastos. De fato, osteoclastos apresentam receptores para estas

quimiocinas e seus sinais parecem ser importantes para a osteoclastogênese. Essas

quimiocinas são capazes de diferenciar células similares a osteoclastos, mas não

são capazes de mediar sua ativação na ausência de RANKL [KIM, MS et al., 2006a;

KIM, MS et al., 2006b; OBA, Y et al., 2005]. Estudos indicam que estas quimiocinas

são produzidas tanto por osteoclastos, em um processo de estimulação autócrina

para amplificação da resposta, quando ativados por RANKL, quanto por

osteoblastos sob influência de citocinas pró-inflamatórias [GARLET, TP, 2007; YU, X

et al., 2004].

Para que seja possível a diferenciação de osteoclastos no sítio de

remodelação óssea, o primeiro evento necessário é o recrutamento de seus

precursores. Os osteoclastos são gerados a partir de células tronco hematopoiéticas,

presentes na medula óssea [CUMANO, A et al., 2007]. As células tronco

pluripotentes dão origem a células precursoras, que tem grande capacidade

proliferativa mas são comprometidas com determinada linhagem celular [NIJWEIDE,

PJ et al., 1986]. Como o desenvolvimento de osteoclastos é fenômeno bastante

específico, acredita-se que seus precursores sejam atraídos por fatores

quimiotáxicos originados dos componentes da matriz óssea e osteoblastos

[ROODMAN, GD, 1991]. Além das quimiocinas relacionadas à migração de células

da linhagem de monócitos, recentes estudos identificaram a quimiocina SDF-1 (fator

derivado de células estromais 1) como um quimioatraente para estas células

[WRIGHT, LM et al., 2005; YU, X et al., 2003].

Uma vez ativados, os osteoclastos desempenham sua função de reabsorção

por meio da produção de diferentes proteases, tais como metaloproteinases (MMPs)

e catepsinas [DELAISSE, JM et al., 2003; MURPHY, G et al., 2005; TROEN, BR,

2004]. A ativação das MMPs é regulada por um grupo de proteínas endógenas,

chamado de inibidores teciduais de metaloproteases (TIMPs), capazes de inibir

praticamente todos os membros da família das MMPs, de forma não específica

[BAKER, AH et al., 2002]. Em condições fisiológicas, os TIMPs estão em balanço

com as MMPs, sendo a matriz extracelular remodelada de forma extremamente

controlada [GEOFFROY, V et al., 2004]. A atividade dos inibidores de MMPs no

tecido normal é importante para evitar a destruição descontrolada do tecidos, e o

desequilíbrio na relação entre as metaloproteinases e seus inibidores resulta em

atividade exagerada ou reduzida da enzima [GEOFFROY, V et al., 2004;

WITTRANT, Y et al., 2003]. O osteoclasto produz pelo menos 8 diferentes

catepsinas, sendo a mais importante e específica a catepsina K [GOTO, T et al.,

2003; TROEN, BR, 2004]. A catepsina K é uma proteinase ativa em pH ácido,

secretada pelo osteoclasto no microambiente selado pela sua borda ondulada,

juntamente com íons H+ liberados por suas bombas de prótons. O baixo pH mantido

pela ação das bombas de prótons tem a finalidade de decompor a parte mineral do

tecido ósseo, e acaba também mantendo um ambiente favorável para a ação da

catepsina K [GOTO, T et al., 2003]. A deficiência dessa protease em humanos está

relacionada com a picnodisostose, uma rara doença genética caracterizada por

nanismo e osteoesclerose [TROEN, BR, 2004]. Experimentos in vitro demonstraram

que osteoclastos isolados de diferentes ossos (calvária e ossos longos)

apresentaram diferentes padrões de expressão de proteases.

Os osteoclastos isolados de ossos longos demonstraram menor expressão

de Catepsina K e maior expressão de MMPs quando comparados aos osteoclastos

isolados de calvária. Da mesma forma, os osteoclastos isolados de ossos longos

demonstraram atividade de reabsorção sensível à inibição de MMPs, enquanto

osteoclastos isolados de calvária apresentaram atividade mais sensível à inibição de

Catepsinas, sugerindo que ambas as enzimas são importantes, e que a importância

pode variar de acordo com a origem e características das células em questão

[EVERTS, V et al., 2006].

Desta forma, diversos mediadores estão potencialmente envolvidos no

processo de osteoclastogênese da lesão periapical osteolítica, desde a atração de

precursores, sua diferenciação e ativação, e posteriormente na regulação de sua

atividade. Alterações nesse processo podem levar a diferenças no desenvolvimento

da patologia, reduzindo ou agravando sua severidade.

A lesão periapical é caracterizada pela osteólise, observada clinicamente

como uma área radiolúcida, decorrente da resposta inflamatória desencadeada na

região do periápice. Diversos mediadores inflamatórios foram detectados em lesões

periapicais. Apesar de serem detectados em tecidos pulpares e periapicais

inflamados e de seu efeito direto na diferenciação e atividade osteoclástica in vitro e

in vivo [MANOLAGAS, SC, 1995] a depleção de IL-1β, TNF-α [CHEN, CP et al.,

1999], IL-6 [HUANG, GT et al., 2001] ou IL-4 [SASAKI, H et al., 2000] não preveniu a

reabsorção óssea e dentária associada às lesões periapicais, sugerindo que tais

mediadores inflamatórios podem apresentar papéis análogos na progressão das

lesões, ou ainda que outros fatores estão envolvidos no processo. Por outro lado, a

depleção de IL-10 resultou em aumento da reabsorção óssea periapical [SASAKI, H

et al., 2000] assim como animais deficientes dos receptores p55 e p75 do TNF-α

apresentaram maior suscetibilidade à infecção.

Recentemente, inúmeros pesquisadores têm demonstrado interesse em

estudar as quimiocinas, mediadores inflamatórios que apresentam um importante

papel na infiltração seletiva de leucócitos para o sítio de inflamação [KABASHIMA, H

et al., 2001; PROUDFOOT, AE et al., 2003]. Antígenos bacterianos e endotoxinas

provenientes do canal radicular, além de mediadores inflamatórios tais como IL-1 e

TNF-α podem estimular a expressão de quimiocinas, que por sua vez atraem células

inflamatórias [LUSTER, MI, 1998; SAFAVI, KE et al., 1991]. Além disso, na lesão

periapical, as quimiocinas podem contribuir para o dano tecidual e manutenção do

processo ao estimularem a liberação de mediadores inflamatórios pelas células

presentes nestes sítios [TAKAHASHI, K, 1998].

Em lesões periapicais humanas foram detectadas as quimiocinas IL-8,

MCP-1, RANTES, MIP-1-α e MIP-1β, IP-10 (proteína induzida por IFN-γ) e

receptores de quimiocinas tais como CCR5, CXCR3, CCR3 e CCR2 [KABASHIMA,

H et al., 2001; MARTON, IJ et al., 2000; SILVA, TA et al., 2005]. Entretanto, a

análise funcional destas quimiocinas durante o desenvolvimento da lesão periapical

não é totalmente esclarecida.

A participação da quimiocina MIP-1α na modulação da resposta inflamatória

para um padrão Th1 também tem sido observada [KAWASHIMA, N et al., 1996].

MIP-1α foi a primeira quimiocina identificada de uma família que hoje possui mais

três integrantes. As proteínas MIP-1 são produzidas por diversas células, como

macrófagos, células dendríticas e linfócitos. Na inflamação, destaca-se a produção

de MIP-1α por macrófagos ativados. As proteínas MIP-1 apresentam uma alta

especificidade de receptores, interagindo com receptores da família CC

especialmente CCR1, CCR3 e CCR5. A ativação dos receptores CCR1, 3 e 5 pelas

MIP-1 desencadeia a liberação de Ca

e mediadores pró-inflamatórios, como

leucotrienos, ácido araquidônico e histamina. O papel chave desempenhado por

essas quimiocinas na resposta inflamatória deve-se à capacidade de modulação da

resposta no hospedeiro. MIP-1α e seu receptor CCR5 estão associadas ao

desenvolvimento de uma resposta de característica Th1, enquanto animais

deficientes do receptor CCR5 apresentam um padrão de resposta Th2 [MAURER, M

et al., 2004]. Esse padrão de resposta sugere a importância dessa quimiocina no

processo de reabsorção óssea observado nas lesões periapicais, pois se sabe do

caráter mais destrutivo da resposta Th1 sobre a Th2. Visto que a quimiocina MIP-1α

exibe atividade quimiotáxica e de ativação celular por meio da ligação aos

receptores CCR1, expressos em eosinófilos, monócitos e células dendríticas, e

CCR5, expressos por monócitos, células dendríticas, células NK (natural killer) e

linfócitos Th1, e que MIP-1β e RANTES também exercem suas funções

quimiotáticas pela ligação ao receptor CCR5, a importância deste receptor na

quimiotaxia e imunomodulação da resposta inflamatória é bastante relevante

[LUTHER, SA et al., 2001; MANTOVANI, A, 1999; ROSSI, D et al., 2000]. Em

tecidos periodontais inflamados, diversas quimiocinas, como MIP-1α, MIP-1β e

RANTES, e receptores relacionados, como CCR1 e CCR5, têm sido identificados,

enquanto sua expressão em condições de saúde periodontal é mínima ou

inexistente [GAMONAL, J et al., 2001; GAMONAL, J et al., 2000; GEMMELL, E et

al., 2001; TONETTI, MS et al., 1994]. Recentemente foi demonstrado por reações de

imunohistoquímica que células T, macrófagos e células dendríticas no tecido

gengival inflamado expressam CCR5 [JOTWANI, R et al., 2004]. Também foi

demonstrado que pacientes com periodontite agressiva apresentam uma intensa

expressão das quimiocinas MIP1-α, MIP1-β e RANTES e de seu receptor CCR5,

associada a maior expressão local de IFN-γ. Por outro lado, em pacientes com

periodontite crônica, menos destrutiva, observa-se uma maior expressão de

quimiocinas do tipo Th2, associada à uma expressão predominante de citocinas

antiinflamatórias, como IL-10 [GARLET, GP et al., 2003], sugerindo que a expressão

diferencial de tais mediadores poderia ser relevante também para o desenvolvimento

de lesões periapicais. De fato, quimiocinas e seus receptores têm sido implicados

em outras patologias relacionadas à reabsorção de tecido ósseo, com destaque para

MIP-1α e CCR5, que têm sido claramente demonstrado na artrite reumatóide, assim

como diversas outras condições patológicas como encefalomielite autoimune

experimental, doença de Chagas, entre outras [LINDELL, DM et al., 2001; SATO, N

et al., 1999; TEIXEIRA, MM et al., 2002]. A expressão de MIP-1α e CCR5 se mostra

aumentada no tecido sinovial inflamado, assim como o número de células positivas

para CCR5 nas lesões artríticas é elevado [WANG, CR et al., 2003; WEDDERBURN,

LR et al., 2000; YUAN, GH et al., 2001].

Além de seu papel na quimiotaxia de leucócitos, MIP-1α tem sido descrita

como indutora da expressão de MMPs e como fator quimiotáxico e de diferenciação

de osteoclastos [LEE, JE et al., 2007; ROBINSON, SC et al., 2002; ROODMAN, GD

et al., 2004; SCHEVEN, BA et al., 1999]. Os efeitos de MIP-1α sobre os osteoclastos

parecem ser mediados pelos receptores CCR5 e/ou CCR1 [OBA, Y et al., 2005],

reforçando a idéia que tais fatores podem estar diretamente relacionados à atividade

de reabsorção óssea. Estudos demonstram que a utilização de anticorpos

neutralizantes anti-MIP1α, de animais geneticamente deficientes de MIP-1α, com

deleção ou mutações no receptor CCR5, leva à atenuação da severidade da artrite

experimental (e em diversos outros modelos experimentais, como a encefalomielite

autoimune experimental), demonstrando claramente seu papel na patogênese da

doença [MAURER, M et al., 2004; PROUDFOOT, AE et al., 2003; YANG, YF et al.,

2002; YUAN, GH et al., 2001]. Essas observações sugerem que o desenvolvimento

de estratégias terapêuticas visando à inibição das funções de MIP-1α e CCR5 pode

ser promissor.

A quimiocina MCP-1 foi primeiramente descrita como quimiotáxica para

monócitos, mas também desempenha função efetora na diferenciação de células T.

Seu receptor CCR2, expresso por monócitos, foi observado também em linfócitos

tipo T ativados e de memória [LUTHER, SA et al., 2001]. Essa função foi

comprovada com a geração e estudo de camundongos deficientes de MCP-1 e do

receptor CCR2. Ambas as linhagens mostraram deficiência no recrutamento de

monócitos, mas diferiram quanto a alterações na diferenciação de células T. Animais

deficientes para MCP-1 apresentam respostas de células T diminuídas,

principalmente em respostas de padrão Th2 [GU, L et al., 2000; LU, B et al., 1998].

Entretanto, além da deficiência no recrutamento de monócitos, animais deficientes

para o receptor CCR2 apresentaram redução na produção de IFN-γ, levando a

defeitos em respostas do tipo Th1 [BORING, L et al., 1997], diminuição na

capacidade de eliminação de patógenos intracelulares [KURIHARA, T et al., 1997] e

aumento da resistência à encefalomielite autoimune experimental [IZIKSON, L et al.,

2000]. Em um modelo de artrite experimental, animais CCR2 KO não apresentaram

diferenças em relação aos animais selvagens [BROWN, CR et al., 2003]. Estudos in

vitro têm demonstrado uma participação importante da quimiocina MCP-1 e do

receptor CCR2 na diferenciação de osteoclastos [KIM, MS et al., 2006b], sendo que

as células diferenciadas sob estímulo de MCP-1 apresentam os principais

marcadores fenotípicos característicos de osteoclastos (TRAP – fosfatase ácida

resistente ao tartarato; receptor de calcitonina; NFATc1 – fator nuclear de células T

ativadas 1), mas requerem estímulo de RANKL para ativar os mecanismos de

reabsorção óssea [KIM, MS et al., 2006a].

Dada a importância dos linfócitos T na modulação da resposta inflamatória,

podemos crer que uma alteração na eficiência dessas células tende a influenciar o

curso das lesões periapicais. De fato, já foi constatada a presença de MCP-1 em

granulomas periapicais humanos [KABASHIMA, H et al., 2001; MARTON, IJ et al.,

2000]. Em modelos experimentais, a quimiocina MCP-1 também se mostrou

importante na proteção do hospedeiro durante a progressão de lesões periapicais.

Animais geneticamente deficientes para esta quimiocina apresentaram redução no

recrutamento de monócitos e conseqüente deficiência no controle da infecção,

resultando em maior necrose tecidual e aumento da lesão osteolítica [CHAE, P et al.,

2002]. Cabe agora uma investigação mais detalhada do seu papel no

desenvolvimento das doenças periapicais.

Embora já esteja estabelecido o papel da quimiocina MIP-1α e do receptore

CCR5 no recrutamento de leucócitos em diferentes modelos de inflamação [BRUHL,

H et al., 2005; WANG, CY et al., 1993a; WANG, CY et al., 1993b], o papel desta

quimiocinas e de deste receptores na progressão de lesões periapicais não foi

esclarecido. Um modelo experimental de periodontite apical nos permite

acompanhar a cinética de progressão da doença, analisando as possíveis mudanças

entre os fatores envolvidos na osteoclastogênese e controle da infecção no decorrer

do tempo, levando a um melhor entendimento do processo patológico, necessário

para o desenvolvimento de novas terapias.

OBJETIVOS

Com base nos aspectos expostos, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel

da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 nos eventos inflamatórios associados às

lesões da região periapical.

Objetivos específicos:

- Analisar a cinética de desenvolvimento das lesões periapicais osteolíticas

em animais normais e geneticamente deficientes (KO) para a quimiocina MIP-1α e

para o receptor CCR2;

- Verificar a diferenciação de osteoclastos durante a progressão das lesões

periapicais, e avaliar o impacto da deleção genética da quimiocina MIP-1α e do

receptor CCR2 neste processo;

- Analisar a cinética de expressão de diferentes citocinas e quimiocinas

potencialmente envolvidas na destruição tecidual da região do periápice nos animais

estudados;

- Analisar a atividade de osteoclastos na lesão periapical, por meio da

expressão de proteases necessárias para a reabsorção óssea.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais de experimentação

De acordo com as normas institucionais para animais de experimentação,

foram utilizados camundongos C57BL6 e camundongos deficientes para a

quimiocina MIP-1α (MIP-1α KO) e receptores CCR2 (CCR2 KO). Os animais

deficientes foram adquiridos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) e foram

mantidos no Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto. Os demais animais são provenientes e foram mantidos no mesmo biotério.

Foram empregados animais com idade entre 6 e 8 semanas e pesando

aproximadamente 22 gramas, utilizando-se pelo menos cinco animais por grupo

(n=5).

Protocolo de indução da lesão periapical

O modelo de lesão periapical induzida experimentalmente foi baseado no

protocolo descrito por Wang e Stashenko [WANG, CY et al., 1991]. Os animais

foram anestesiados por injeção intraperitoneal de tribromoetanol. Em seguida foram

posicionados na mesa operatória, de modo a proporcionar uma abertura bucal

adequada, e a superfície oclusal dos molares foi limpa com algodão e água. Com o

auxílio de uma pinça os tecidos moles foram afastados do campo operatório, e com

uma broca esférica ¼ acoplada a um micro-motor de baixa-rotação foi realizada a

exposição pulpar do primeiro molar inferior direito. O lado esquerdo, sem exposição

pulpar, constituiu o grupo controle. Sobre a polpa exposta era inoculada a solução

contendo quatro diferentes espécies de bactérias periodontopatogênicas:

Porphyromonas gingivalis, Prevotella nigrescens, Actinomyces viscosus e

Fusobacterium nucleatum. Depois de recuperados da anestesia, os animais eram

devolvidos ao biotério, onde permaneciam até os tempos de 3, 7, 14 ou 21 dias,

constituindo os diferentes grupos analisados, quando eram então sacrificados. Os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e as mandíbulas dissecadas

para a retirada das amostras destinadas à análise histológica ou bioquímica.

Análise histológica

As peças foram fixadas em formalina 10% durante 24h e desmineralizadas

em EDTA (4%) durante 15 dias. Em seguida foram desidratadas em álcool,

diafanizadas em xilol e incluídas em parafina conforme o protocolo padrão do

laboratório. As amostras foram submetidas a cortes seriados da mandíbula a fim de

localizar a lesão apical do primeiro molar, sendo selecionados os cortes nos quais

era possível identificar o primeiro molar cortado transversalmente, possibilitando a

visualização da câmara pulpar e do conduto radicular, com o ápice radicular aberto.

As lâminas selecionadas foram submetidas à coloração pela técnica de hematoxilina

e eosina. A histomorfometria da área da lesão e extensão das reabsorções óssea e

dentária foi realizada com o auxílio do software ImageJ 1.34 (NIH).

Reação de detecção de osteoclastos

Um grupo de lâminas foi submetido a reação de marcação de TRAP (KIT

387-A, Sigma-Adrich, St. Louis, MO, USA). As lâminas foram desparafinizadas e em

seguida incubadas por 60 minutos a 37º na solução corante contendo tartaratos, ao

abrigo da luz, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida as lâminas

foram contra coradas com hematoxilina, e os osteoclastos na área da lesão foram

quantificados ao microscópio óptico.

RealTime-PCR

As amostras destinadas à análise bioquímica foram congeladas

imediatamente em nitrogênio líqüido, e mantidas a -70°C até a realização dos

ensaios. Para a extração do RNA total, as amostras foram trituradas, com o auxilio

de gral e pistilo autoclavados e tratados com água DEPC (Dietil-pirocarbonato) para

evitar a ação de RNAses, seguindo-se então as recomendações do fabricante.

Brevemente, para cada amostra, em um tubo tipo “eppendorf”, foi adicionado o

reagente Trizol (1 mL para 1 mg de tecido), sendo agitado por 30 segundos e

deixadas em temperatura ambiente por 5 minutos. Para cada 1mL da suspensão

foram adicionados 200µL de clorofórmio (Sigma-Adrich, St. Louis, MO, USA), e

centrifugadas a 12000g por 15 minutos a 4°C. A fase aquosa foi transferida para um

tubo novo, ao qual foi adicionado o mesmo volume de isopropanol, sofrendo

agitação em “vortex” e incubado por 20 minutos a -20°C para precipitar o RNA da

fase aquosa. Novamente os tubos foram centrifugados a 12000g por 15 minutos a

4°C. O precipitado foi lavado em etanol 100%, sendo então seco em temperatura

ambiente, com o tubo invertido sobre um papel de filtro. As amostras de RNA foram

suspensas em 50µL de água deionizada e livre de Rnase, sendo então as amostras

armazenadas a –70°C. Uma alíquota de 5µL foi utilizada para a quantificação da

concentração de RNA/µL nas amostras, determinada usando o aparelho GeneQuant

(Pharmacia, USA) . Uma amostra de 5µg de RNA foi utilizada para a produção do

DNA complementar, de acordo com as instruções do fabricante.

A expressão quantitativa de genes de citocinas e quimiocinas foi analisada

por meio de reações de RealTimePCR, utilizando-se o sistema SYBR Green em um

aparelho Applied Biosystems 7500 RealTime PCR System. Primers adequados para

a maioria das reações estão em uso rotineiro em nosso laboratório, e os demais

foram criados a partir do programa Primer Express, específico para tal tarefa (Tabela

1).

Tabela 1. Seqüências dos primers, propriedades da reação e do produto da amplificação.

Seqüência primer sense

Seqüência primer anti-sense

tA (°C) tM (°C) bp

IL-1β

GGAAGATTCTGAAGAAGAGACGG

TGAGATTTTTAGAGTAACAGG

0,15 58 79 329

TNF-α

AAGCCTGTAGCCCATGTTGT

CAGATAGATGGGCTCATACC

0,15 56 79 330

ATTGTATGGTCAACACGCACG

TTTGAACGTCTCTGTCCCGAG

0,1 58 79 134

MIP1-α

TTCTGCTGACAAGCTCACCCT

ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT

0,1 60 79 322

RANTES

TTCCCTGTCATCGCTTGCTCT

CGGATGGAGATGCCGATTTT

0,15 60 81 433

MCP-1

AGGAAGATCTCAGTG CAGAG

AGTCTTCGGAGTTTGCCTTTG

0,15 62 82 177

MMP-1

TGGACCTGGAGGAAATCTTGC

AGAGTCCAAGAGAATGGCCGA

0,1 58 79 155

RANKL

CAGAAGATGGCACTCACTGCA

CACCATCGCTTTCTCTGCTCT

0,1 60 73 203

OPG

GGAACCCCAGAGCGAAATACA

CCTGAAGAATGCCTCCTCACA

0,1 58 77 225

Catepsina K

CTCCCTCTCGATCCTACAGTAATGA

TCAGAGTCAATGCCTCCGTTC

0,2 58 80 307

β-actina

ATGTTTGAGACCTTCAACA

CACGTCAGACTTCATGATGG

0,15 56 75 495

CP: concentração de primer em µg; tA: Temperatura de annealing; tM: Temperatura de

Melting; bp: pares de base do produto de amplificação

Esse sistema realiza as reações de amplificação e detecção e quantifica as

amostras (ABI Prism Software) por meio de nucleases fluorogênicas utilizadas na

reação, sendo tal expressão normalizada com base em controles endógenos. O

DNA complementar sintetizado a partir do RNA mensageiro foi utilizado juntamente

com reagentes SYBR Green, como determinado pelo fabricante. A reação

compreende 2 minutos a 50ºC, 10 minutos a 95ºC, e quarenta ciclos de 15 segundos

a 95ºC e 1 minuto a 60ºC. Nas reações com o SYBR Green, um ciclo final de vinte

minutos com temperatura crescente de 60 a 95ºC foi empregado para a obtenção de

uma curva de dissociação dos produtos da reação, utilizada para a análise da

especificidade de amplificação. Os resultados foram analisados com base no valor

de TC (threshold cycle) ou linha de corte, definido após a reação, sendo este o ponto

correspondente ao número de ciclos em que a amplificação atinge um dado limiar,

que permite a análise quantitativa da expressão do fator avaliado.

Análise dos resultados

Aos dados experimentais obtidos foram aplicados testes estatísticos para a

determinação da significância entre os grupos experimentais. Para análise da curva

temporal de cada linhagem foi utilizada a Análise de Variância (ANOVA) seguida

pelo teste de Bonferroni; para a comparação entre duas linhagens em um

determinado tempo, foi empregado o teste T de Student, sendo que as diferenças

foram consideradas significativas para valores de P<0.05.

RESULTADOS

Formação da lesão periapical

O primeiro passo deste trabalho foi analisar a cinética de desenvolvimento

da lesão osteolítica periapical nos diferentes animais estudados. Para tanto, os

animais submetidos à exposição pulpar e inoculação de bactérias foram sacrificados

em diferentes tempos, possibilitando analisar a lesão em diferentes estágios de

progressão. Constatamos com os animais WT que o padrão normal de

desenvolvimento da lesão periapical era de uma tendência de aumento de volume

do dia 0 ao dia 3, e do dia 3 ao dia 7, atingindo um volume estatisticamente diferente

no 14º dia (P<0.05), mantendo-se então constante até o 21º dia após a inoculação.

Os animais MIP-1α KO apresentaram uma cinética de desenvolvimento da lesão

similar a de seus congêneres selvagens, o que não aconteceu com os animais

CCR2 KO.

03 7 14 21

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Papel de CCR2 e MIP1alfa na lesão periapical

CCR2 KO

MIP1α KO

Tempo pós inoculação (dias)

Area da lesão (mm²)

Fig.1. Análise da cinética de desenvolvimento da lesão periapical. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados e a dimensão

das lesões quantificada histologicamente. Foram observadas diferenças significativas entre os grupos

WT e CCR2 KO nos tempos de 7 e 21 dias. ( * WT x CCR2, P<0.05) Dados apresentados como

média ± erro padrão.

Fig. 2. Cortes histológicos da região periapical. A. Animal WT, grupo controle. B. Animal WT, grupo

14 dias. C. Animal CCR2 KO, grupo 14 dias. D. Animal MIP-1α KO, grupo 14 dias. A área

demarcada corresponde ao ligamento periodontal normal na figura 2A e à lesão periapical nas

figuras 2B, 2C e 2D. Coloração HE, aumento de 100x.

Fig. 3. Cortes histológicos da região periapical, ensaio para detecção de células TRAP+. Seta 1,

células TRAP+. Seta 2. Área de reabsorção óssea no osso alveolar. Seta 3. Raiz distal do primeiro

molar. Figura 3A, aumento de 200x, figura 3B, aumento de 400x.

Nestes animais observamos lesões de maiores dimensões, estatisticamente

diferentes já no 7º dia após a inoculação (P<0.05). A lesão continuou progredindo

até o 14º dia (P>0.001), permanecendo então estável até o dia 21.

Presença de osteoclastos

O passo seguinte foi avaliar a presença de células compatíveis com

osteoclastos, positivas para TRAP, na área da lesão periapical. Nos animais WT

observamos um pequeno aumento no numero de células TRAP+ no 3º dia, seguido

por um grande aumento no 7º dia (P<0.001 vs dia 0), representando o pico. No 14º

dia o número de osteoclastos apresenta uma pequena diminuição (P>0.05 x dia 7 e

P<0.01 x dia 0), mantendo-se estável até o 21º dia. Os animais MIP-1α KO

apresentaram o mesmo padrão, com uma tendência a um menor número de células

(P<0.01 x WT no dia 21, P>0.05 x WT nos dias 3, 7 e 14). Os animais CCR2 KO

apresentaram um padrão semelhante aos animais WT até o 7º dia após a incubação

(P<0.01 x dia 0). Ao contrário dos demais grupos, no 14º dia os animais CCR2 KO

apresentaram um aumento ainda maior no número de osteoclastos (P<0.001 x dia 0,

P<0.01 x WT), mantendo-se então constante até o dia 21.

Expressão de RANKL e OPG

Uma vez constatas diferenças na reabsorção óssea causada pela lesão

periapical e no número de osteoclastos encontrados nas lesões dos diferentes

animais, o próximo passo foi analisar a cinética de expressão do principal fator de

diferenciação de osteoclastos, RANKL, e seu inibidor, OPG. Foram considerados os

tempos de 0 dias (grupo controle), 7 dias (período de reabsorção ativa, número mais

elevado de osteoclastos nos animais selvagens) e 14 dias (período em que a

atividade osteolítica cessa, a lesão já se encontra em seu tamanho máximo).

Presença de células TRAP+ na lesão periapical

3 7 14 21

CCR2 KO

MIP1α KO

Tempo pós inoculação (dias)

Número de células

Fig.4. Análise da cinética de expressão de osteoclastos em lesões periapicais. Lesões

periapicais experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e

inoculação de bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados e

os osteoclastos detectados com auxílio de um kit específico. Foram observadas diferenças

significativas dias 14 e 21. ( * WT x MIP1α KO, P<0.05. ** WT x CCR2 KO, P<0.05). Dados

apresentados como média ± erro padrão.

Expressão de mRNA para RANKL na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para RANKL

normalizada por

-actina

Fig.5. Análise quantitativa da expressão de RANKL em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de bactérias

peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das amostras

coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para RANKL quantificado por RealTime-PCR. Os resultados

apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de β-actina.

A expressão de RANKL foi baixa em todos os animais do grupo controle. No

tempo de 7 dias, todos os animais apresentaram aumento significativo nos níveis de

RANKL (P<0.001), enquanto que entre os tempos de 7 e 14 dias não foi verificada

diferença significativa. Entre as diferentes linhagens, foi registrada uma maior

expressão de RANKL pelos animais CCR2 KO nos tempos de 7 dias (P<0.05 x WT).

Não houve diferença entre os animais MIP-1α KO e os animais WT.

A expressão de OPG também foi baixa nos animais controle, verificando-se

uma diferença significativa no dia 7 (P<0.001 x dia 0). Nenhuma linhagem

apresentou diferenças significativas entre o dia 7 e o dia 14. Foi constatada nos dias

7 e 14 uma menor expressão de OPG pelos animais CCR2 KO em comparação com

o grupo WT (dia 7 P<0.001, e dia 14 P<0.05).

Expressão de mRNA para OPG na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para OPG

normalizada por

-actina

Fig.6. Análise quantitativa da expressão de OPG em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para OPG quantificado por RealTime-PCR. Os

resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de β-

actina.

Expressão de citocinas pró-inflamatórias

O processo de reabsorção óssea nas lesões periapicais é um processo

inflamatório. O próximo passo do trabalho foi analisar a expressão de IL-1β e TNF-α,

as principais citocinas pró-inflamatórias. Todos os grupos analisados apresentaram

nos dias 7 e 14 níveis elevados de TNF-α quando comparados ao dia 0 (P<0.001).

Não houve diferença entre os dias 7 e 14 (P>0.05). Os animais CCR2 KO

apresentaram maior expressão de TNF-α quando comparados aos animais WT nos

dias 7 (P<0.05) e 14 (P<0.01). Os animais MIP-1α KO não apresentaram diferenças

quando comparados aos animais WT.

Expressão de mRNA para TNF-α na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA TNF-

normalizada por

-actina

Fig.7. Análise quantitativa da expressão de TNF-α em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para TNF-α quantificado por RealTime-PCR.

Os resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de

β-actina.

Os níveis de IL-1β também apresentaram aumento no dia 7 quando

comparados aos níveis no dia 0 (P<0.001 para WT e MIP-1α KO e P<0.05 para

CCR2 KO). Não houve diferença entre o dia 7 e o dia 14. No dia 7 e no dia 14 os

animais CCR2 KO apresentaram níveis de IL-1 inferiores aos observados nos

animais WT (P<0.05 e P<0.01, respectivamente). Não houve diferença estatística

entre os animais MIP-1α e WT.

Esses resultados indicam que os animais MIP-1α apresentaram níveis de IL-

1β e TNF-α semelhantes aos níveis dos animais WT, enquanto os animais CCR2 KO

apresentaram níveis menores de IL-1β e maiores de TNF-α.

Expressão de mRNA para IL-1β na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para IL-1

normalizada por

-actina

Fig.8. Análise quantitativa da expressão de IL-1b em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para IL-1β quantificado por RealTime-PCR. Os

resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de β-

actina.

Expressão de quimiocinas

Com o objetivo de identificar os estímulos de migração celular para a lesão

periapical, o próximo passo do estudo foi analisar a expressão das quimiocinas

MCP-1, MIP1-α, RANTES e KC. Os níveis de MCP-1 de todos os animais estudados

apresentaram um aumento significativo após a exposição pulpar (P<0.001 7 dias x 0

dias). Não houve diferença significativa entre o dia 7 e o dia 14. Também não foi

observada nenhuma diferença significativa entre os animais WT e MIP KO. Os

animais CCR2 KO apresentaram menor expressão de MCP-1 nos dias 7 e 14 em

relação aos animais WT (P<0.05).

Expressão de mRNA para MCP-1 na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para MCP-1

normalizada por

-actina

Fig.9. Análise quantitativa da expressão de MCP-1 em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para MCP-1 quantificado por RealTime-PCR.

Os resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de

β-actina.

A expressão de MIP-1α foi avaliada também nos animais WT e CCR2. Como

as demais quimiocinas, os níveis de MIP-1α após a exposição pulpar foram

superiores aos níveis observados em animais controle (P<0.001). Não houve

alterações significativas entre os dias 7 e 14 e entre os animais CCR2 KO e WT. Os

animais MIP-1α KO, geneticamente deficientes, não apresentaram essa quimiocina.

Expressão de mRNA para MIP1-α na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para MIP1-

normalizada por

-actina

Fig.10. Análise quantitativa da expressão de MIP-1α em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para MIP-1α quantificado por RealTime-PCR.

Os resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de

β-actina.

A cinética de expressão de RANTES (Fig. 11) apresentou o mesmo padrão

da expressão de MCP-1, a única diferença significativa observada foi a menor

expressão no dia 14 pelos animais CCR2 em relação aos animais WT (P<0.05).

Expressão de mRNA para RANTES na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para RANTES

normalizada por

-actina

Fig.11. Análise quantitativa da expressão de RANTES em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para RANTES quantificado por RealTime-PCR.

Os resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de

β-actina.

Por fim, analisamos a cinética de expressão de KC. Como as demais

quimiocinas analisadas, ocorreu um aumento significativo (P<0.001) entre o dia 0 e o

dia 7. Os animais WT e MIP-1α KO não apresentaram diferenças entre o 7º e do 14º

dias. Os animais CCR2 KO apresentaram uma diminuição na expressão de KC entre

os mesmos períodos (P<0.05). Mesmo com essa diminuição, os animais CCR2 KO

apresentaram níveis mais elevados de KC que os animais WT nos dias 7 (P<0.01) e

14 (P<0.05). Não houve diferença significativa entre os níveis de KC dos animais WT

e MIP1-α.

Expressão de mRNA para KC na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para KC

normalizada por

-actina

Fig.12. Análise quantitativa da expressão de KC em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para KC quantificado por RealTime-PCR. Os

resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de β-

actina.

Esses resultados demonstram que os animais MIP-1α KO apresentaram um

padrão de expressão de quimiocinas semelhante ao dos animais WT, enquanto os

animais CCR2 KO apresentaram menor exempressão de quimiocinas da família CC

e nível mais elevado de KC.

Fig. 13. Corte histológico da região periapical. Animal WT, grupo 14 dias. Coloração HE, Aumento de

400x.

Fig. 14. Corte histológico da região periapical. Animal CCR2 KO, grupo 14 dias. Coloração HE.

Aumento de 400x.

Expressão de proteases

O próximo passo foi a análise da cinética de expressão de proteases

importantes na reabsorção óssea, MMP1 e Catepsina K.

Os animais WT apresentaram um aumento significativo na expressão de

Catepsina K do dia 0 ao dia 7 (P<0.001), e esse nível se manteve constante até o

dia 14. Os animais MIP-1α KO apresentaram um padrão semelhante, e não houve

diferença nos níveis de Catepsina K entre esses animais e os animais WT. Os

animais CCR2 KO apresentaram também um aumento significativo do dia 0 ao dia 7

(P<0.001) e uma tendência a diminuição no dia 14, sem significância estatística

(P>0.05). No dia 7, os animais CCR2 KO apresentaram uma expressão

significativamente maior em comparação aos animais WT (P<0.01).

Expressão de mRNA para Catepsina K na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para Catepsina K

normalizada por

-actina

Fig.15. Análise quantitativa da expressão de Catepsina K em lesões periapicais. Lesões

periapicais experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e

inoculação de bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o

RNA total das amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para Catepsina K quantificado

por RealTime-PCR. Os resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo

normalizados pela expressão de β-actina.

A expressão de MMP1 apresentou um padrão semelhante. Não houve

diferença estatística entre a expressão de MMP1 pelos animais WT e MIP-1α KO, e

ambos apresentaram um aumento no dia 7 em relação ao dia 0, e então mantiveram

níveis estáveis. Os animais CCR2 KO apresentaram níveis elevados de MMP1 no

dia 7 (P<0.001 x WT), e esses níveis diminuíram no dia 14 (P<0.05 x 7d).

Esses resultados mostram que os animais CCR2 KO apresentaram níveis

mais elevados de proteinases que seus congêneres selvagens no dia 7.

Expressão de mRNA para MMP1 na lesão periapical

WT CCR2 MIP1-

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

dia 0 dia 7 dia 14

Expressão de mRNA para MMP1 normalizada por

-actina

Fig.16. Análise quantitativa da expressão de MMP1 em lesões periapicais. Lesões periapicais

experimentais foram induzidas em camundongos por meio de exposição pulpar e inoculação de

bactérias peridontopatogênicas. Os animais foram sacrificados nos tempos indicados, o RNA total das

amostras coletadas foi extraído, e os níveis de mRNA para MMP1 quantificado por RealTime-PCR.

Os resultados apresentados são os níveis de RNA da molécula alvo normalizados pela expressão de

β-actina.

DISCUSSÃO

As lesões periapicais osteolíticas são desencadeadas por processos

inflamatórios originados na polpa dental. Esses processos inflamatórios podem ter

origens diversas, como processos cariosos e iatrogenias [NAIR, PN, 1997]. As

condições enfrentadas pelo organismo ao realizar uma resposta inflamatória no

interior do elemento dental, como a pouca irrigação do tecido conjuntivo da polpa e o

fato deste estar confinado a uma cavidade inextensível no interior de um tecido

mineralizado, são adversas. Caso esse estímulo persista, a necrose do tecido pulpar

é um resultado freqüente. A infecção iniciada na câmara pulpar pode se disseminar

atingindo a região do ápice da raiz, provocando a migração de células

imunocompetentes e levando à reabsorção dos tecidos mineralizados dessa região

[STASHENKO, P et al., 1992; WANG, CY et al., 1991]. O objetivo deste trabalho é

investigar o envolvimento da quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2, aos quais tem

sido atribuído papel no processo de osteoclastogênese.

Os primeiros resultados indicaram que a lesão periapical começa a

apresentar um aumento significativo no 7º dia após a exposição pulpar, progredindo

até o 14º dia, mantendo-se então constante até o 21º dia (Fig.1). Os animais MIP-1α

KO apresentaram a mesma cinética de desenvolvimento da lesão periapical, e não

apresentaram diferenças quando comparados nos determinados períodos aos

animais selvagens. Os animais CCR2 KO, geneticamente deficientes para o principal

receptor da quimiocina MCP-1, apresentaram também uma cinética de

desenvolvimento semelhante no início da doença. Não houve diferença até o dia 3;

no dia 7 observou-se aumento da lesão, e esse aumento progrediu até o dia 14,

mantendo-se estável até o dia 21.

A literatura sugere que tanto a quimiocina MIP-1α [LEE, JE et al., 2007;

SCHEVEN, BA et al., 1999] quanto MCP-1 [KIM, MS et al., 2006a; KIM, MS et al.,

2006b] estimulam positivamente a diferenciação de osteoclastos in vitro. In vivo,

existem evidências da importância destas quimiocinas na destruição óssea causada

por mielomas, através da estimulação da osteoclastogênese [AGGARWAL, R et al.,

2006]. De fato, a reabsorção óssea observada em diferentes patologias está

diretamente relacionada à atividade de osteoclastos [TAKAYANAGI, H, 2005]. Estas

células especializadas têm a função de reabsorver o tecido mineralizado no

processo fisiológico da remodelação óssea, e o equilíbrio entre a atividade de

osteoclastos e osteoblastos tem papel importante em diversas doenças nas quais se

observam alterações ósseas. Um aumento na atividade de osteoclastos quebra o

equilíbrio em favor da reabsorção óssea, e resulta em um quadro de osteopenia,

como na osteoporose [TEITELBAUM, SL, 2000]. A situação inversa, uma redução na

atividade de reabsorção óssea, resulta em osteopetrose, como na rara doença

Picnodisostose, caracterizada pela deficiência de Catepsina K [RUSSELL, G et al.,

2001]. Considerando então que a ação direta das quimiocinas estudadas sobre os

osteoclastos gera um estímulo positivo para a sua diferenciação e atividade, poderia

ser esperado que a ausência destas moléculas de sinalização prejudicasse a

reabsorção óssea, culminado em lesões periapicais menos extensas, o que não foi

observado.

Entretanto, devemos considerar que estudos in vitro são bastante

controlados e não representam a complexidade dos sistemas vivos, e que

mediadores podem ter diferentes papéis em diferentes patologias. O papel da

quimiocina MCP-1 como estímulo positivo da osteoclastogênese foi descrito apenas

recentemente [KIM, MS et al., 2006a], enquanto seu importante papel como potente

quimioatraente de monócitos já foi identificado há quase duas décadas [LEONARD,

EJ et al., 1990]. Mais especificamente, foi descrita também a importância desta

quimiocina em estimular a quimiotaxia de células mononucleares em granulomas

[CONTI, P et al., 1999]. Logo, nosso próximo passo para elucidar o papel da

quimiocina MIP-1α e do receptor CCR2 em lesões periapicais foi avaliar o efeito

destes mediadores na diferenciação de osteoclastos.

Os animais WT apresentaram um número crescente de osteoclastos até o

dia 7; do dia 7 ao dia 21 o número de osteoclastos apresentou uma tendência a

diminuir, sem significância estatística. Os animais MIP-1α KO apresentaram um

padrão semelhante, com números de osteoclastos inferiores no 21, enquanto os

animais CCR2 KO apresentaram mais osteoclastos nos dias 14 e 21 (Fig.2).

Tanto o número de osteoclastos quanto as dimensões das lesões

apresentaram uma tendência a diminuição nos animais MIP1-α, um resultado

compatível. Entretanto, o resultado observado nos animais CCR2 KO é mais

intrigante: no caso de uma relação direta, seria esperado observar um aumento na

destruição óssea concomitante a um aumento no número de osteoclastos [TANAKA,

Y et al., 2005], fato que não foi inteiramente comprovado. O maior número de

osteoclastos pode ser correlacionado às maiores dimensões da lesão periapical

verificadas a partir do 14º dia, mas não com a expressiva diferença observada no 7º

dia, período no qual o número do osteoclastos não foi diferente.

Apesar da atividade pró-osteoclastogênica das quimiocinas MIP-1α e MCP-

1 in vitro [KIM, MS et al., 2006a; LEE, JE et al., 2007], frente aos dados

apresentados é plausível acreditar que a ausência destes fatores nos animais KO

não altera de forma marcante o desenvolvimento de osteoclastos, dada a

complexidade dos mecanismos reguladores da osteoclastogênese e o vasto número

de mediadores envolvidos neste processo [ASAGIRI, M et al., 2007; KATAGIRI, T et

al., 2002]. No complexo ambiente de um organismo vivo, o número de estímulos aos

quais uma célula está sujeita é muito maior do que em um experimento controlado

de cultura de células, e fatores de ação similar podem reduzir, ou até mesmo anular,

o impacto da remoção artificial de determinadas citocinas. Em conjunto, esses

resultados demonstram que o potencial osteolítico da lesão periapical não depende

somente do número de osteoclastos presentes na lesão, e sugerem também que

neste modelo a quimiocina MIP-1α não interfere significativamente na

osteoclastogênse, enquanto o receptor CCR2 modula negativamente diferenciação

destas células.

Os primeiros mediadores avaliados foram o fator osteoclastogênico RANKL

e seu receptor solúvel OPG. É importante observar que esses mediadores devem

ser avaliados conjuntamente para a obtenção de um resultado preciso, uma vez que

o equilíbrio entre eles é o fator determinante [GARLET, GP et al., 2004;

KOSTENUIK, PJ, 2005]. Esta situação é bem representada durante o processo de

remodelação óssea em movimentação ortodôntica: são formados dois

microambientes distintos, predominando reabsorção óssea em um deles, e formação

de novo tecido ósseo no outro. Em ambos ocorre aumento da expressão de RANKL,

e esta informação isolada poderia gerar conclusões imprecisas; no microambiente

de formação óssea, entretanto, ocorre um aumento ainda mais significativo na

expressão de OPG, de forma que o relação RANKL/OPG resultante acaba por

favorecer a aposição óssea [GARLET, TP et al., 2007].

Nossos resultados demonstraram que os animais MIP-1α KO apresentaram

níveis de RANKL e OPG semelhantes aos apresentados pelos animais WT nos

períodos analisados, de 7 e 14 dias (figura X). Esses dados são compatíveis com o

número de osteoclastos observado nestes períodos, também semelhante ao

apresentado pelos animais WT (figura X). Os animais CCR2 KO, entretanto,

apresentaram maior expressão de RANKL e menor expressão de OPG quando

comparados aos animais controle. Este resultado parece compatível com o aumento

no número de osteoclastos na lesão; com um aumento relativo da expressão de

RANKL seria esperado um aumento no número de osteoclastos [HADJIDAKIS, DJ et

al., 2006; WADA, T et al., 2006]. No período de 7 dias, contudo, não foi observado

aumento na quantidade de osteoclastos da lesão. Neste caso específico, devemos

considerar duas questões: o momento em que a expressão de RANKL começou a

apresentar diferenças entre os animais KO e WT, e a possibilidade de outros fatores

limitantes na diferenciação de osteoclastos interferirem, como o número de células

precursoras disponíveis.

Considerando-se que em experimentos in vitro a diferenciação de

osteoclastos é efetivamente observada após alguns dias depois da adição de todos

os fatores necessários ao meio [KIM, MS et al., 2006b], podemos sugerir que neste

caso o tempo decorrido após o início do estímulo ainda não foi suficiente para

permitir o processo de diferenciação das células. Os precursores são células da

linhagem monocítica dependem também de outros estímulos para deixar a medula

óssea e migrar até o sítio de reabsorção [BRUZZANITI, A et al., 2006]; se todos os

precursores disponíveis no sítio foram diferenciados e novas células não foram

recrutadas, será impossível aumentar o número de osteoclastos. Por outro lado, a

estimulação com RANKL não somente desencadeia a diferenciação celular, mas

também a ativação dos osteoclastos e sua atividade reabsortiva [TEITELBAUM, SL,

2000]. De fato, a diferenciação pode ser observada in vitro na ausência de RANKL,

mas a presença desta citocina se faz necessária para a ativação das células [KIM,

MS et al., 2006a]. Desta forma, podemos sugerir que a maior expressão relativa de

RANKL não somente contribui para o aumento quantitativo de osteoclastos na lesão,

mas também pode contribuir para uma maior ativação das células já diferenciadas

presentes neste sítio. Logo, uma maior atividade individual de cada osteoclasto

determinaria um maior resultado final, ou seja, maior destruição tecidual, sem a

necessidade de aumentar a quantidade de células.

A seguir buscamos analisar a expressão de outros fatores relacionados com

a reabsorção óssea, as citocinas IL-1β e TNF-α. A literatura suporta que estas

citocinas contribuem para a destruição óssea [GRAVES, DT et al., 2003], e a

natureza inflamatória da periodontite apical sugere sua participação nesse processo

[STASHENKO, P et al., 1992]. Nossos resultados mostram que ambas as citocinas

pró-inflamatórias estão presentes nas lesões dos animais WT, e que os animais

MIP-1α KO apresentam níveis semelhantes aos dos animais selvagens (Figs. 7 e 8).

Esse resultado sugere que a resposta inflamatória gerada pelos animais MIP-1α KO

é semelhante à resposta dos animais WT corroborando com dados já apresentados,

como as dimensões semelhantes da lesão (fig 1). Entretanto, os animais CCR2 KO

apresentaram diferenças significantes quando comparados aos animais controle,

tanto no dia 7 quanto no dia 14, exibindo maior expressão de TNF-α e menor

expressão de IL-1β. Após verificado o aumento nas dimensões das lesões nestes

animais, o aumento de TNF-α pode ser considerado um resultado esperado, uma

vez que o potencial destrutivo desta citocina foi relatado em diferentes situações,

como na doença periodontal [GRAVES, DT et al., 2003] e na artrite, levando à

concepção de terapias anti-TNF para o tratamento desta patologia [PALEOLOG, E,

2003]. Podemos, portanto, sugerir que aumento na expressão de TNF-α está

relacionado positivamente com o aumento na diferenciação e ativação de

osteoclastos, colaborando para a maior destruição óssea.

A redução na expressão de IL-1β verificada nas lesões dos animais CCR2

KO (Fig.8), contudo, pode ser considerada como um resultado inesperado. Da

mesma maneira que o TNF-α, a IL-1β é uma citocina constantemente relacionada a

destruição tecidual em diferentes patologias [GRAVES, DT et al., 2003; JACQUES,

C et al., 2006] e na regulação da gênese e ativação de osteoclastos [NAKAMURA, I

et al., 2006], logo uma diminuição na expressão desta citocina não seria esperada

em um quadro de agravamento da lesão, e uma relação direta de causa e efeito

entre estes eventos é pouco provável. Por outro lado, estudos in vivo demonstraram

que animais geneticamente deficientes para estas citocinas apresentavam lesões

osteolíticas induzidas por infecções multi-bacterianas maiores do que as lesões de

mesma natureza desenvolvidas por animais selvagens [CHEN, CP et al., 1999].

Estas evidências indicam que estas citocinas não são indispensáveis para a

osteólise decorrente de infecção bacteriana, apesar da grande importância para o

controle da infecção [CHEN, CP et al., 1999]. Desta forma, e cientes de que as

citocinas IL-1 e TNF-α apresentam papéis similares, freqüentemente sinérgicos, e

que podem até mesmo atuar via mecanismos intracelular similares [EDER, J, 1997],

podemos sugerir que a redução na expressão de IL-1β não foi capaz de atenuar a

destruição tecidual em virtude da exacerbação da expressão de TNF-α.

A seguir, analisamos outros fatores potencialmente envolvidos no processo

de reabsorção óssea da periodontite apical: quimiocinas da família CC, às quais vêm

se atribuindo papel na osteoclastogênese [YUAN, GH et al., 2001]. Foi avaliada a

expressão das quimiocinas MIP1-α, MCP-1 e RANTES.

Todas as quimiocinas da família CC analisadas (RANTES, MCP-1 e MIP1-

α) estavam presentes nas lesões dos animais WT, sendo a expressão nas lesões

bastante aumentada em relação ao grupo controle (Figs 9, 10 e 11). Entre os

animais MIP-1α KO e WT, não houve diferenças significativas na expressão de

MCP-1 e de RANTES (fig X e X). Considerando-se que o padrão de destruição

tecidual e osteoclastogênese destes animais foi similar, diferenças bastante

significativas na expressão de quimiocinas relacionadas a estes fatores seriam

pouco prováveis. Da mesma forma, a expressão destas quimiocinas parece estar

relacionada, ao menos parcialmente, à expressão de IL-1β e TNF-α [YUAN, GH et

al., 2001]. A expressão destas citocinas também foi semelhante em animais MIP-1α

KO e WT, possivelmente contribuindo também para a expressão similar das

quimiocinas.

Os animais CCR2 KO apresentaram níveis de MIP-1α semelhantes aos

apresentados pelos animais WT (Fig 10). Os níveis de MCP-1 apresentados pelos

animais CCR2 KO nos dias 7 e 14 foram inferiores aos apresentados pelos animais

WT. Todavia, é importante lembrar que a quimiocina MCP-1 atua via receptor CCR2

[OLSON, TS et al., 2002], logo é pouco provável que essa variação na expressão da

quimiocina tenha algum valor biológico para o animal geneticamente modificado. A

expressão da quimiocina RANTES também foi significativamente reduzida no animal

CCR2 KO ao 14º dia após a inoculação bacteriana, quando comparado ao animal

selvagem; os níveis desta citocina foram semelhantes nas duas linhagens ao 7º dia

(Fig 11). Observando que o aumento na expressão relativa de RANKL a partir do 7º

dia não resultou em um maior número de osteoclastos neste período, sugerimos que

a migração de mais células precursoras seria necessária para a formação de mais

osteoclastos. O aumento no número de osteoclastos na lesão destes animais a partir

do 14º dia poderia então indicar que esta migração ocorreu. Entretanto, não foi

constatado aumento na expressão das quimiocinas CC, potencialmente envolvidas

na migração de células da linhagem monocítica, precursoras de osteoclastos. De

fato, a ausência dos receptores CCR2 até o momento não parece prejudicar a

osteoclastogênese.

É importante considerarmos que existem outras quimiocinas que poderiam

mediar a migração de precursores de osteoclastos [XING, L et al., 2005], talvez

sendo o SDF-1 a mais importante delas [YU, X et al., 2003]. Um aumento após o 7º

dia na expressão destas quimiocinas, combinado à maior expressão de RANKL e à

menor expressão de OPG observados nos animais CCR2 KO, poderia explicar

satisfatoriamente o aumento no número de osteoclastos diferenciados nas lesões

periapicais destes animais. Caso essa modulação na migração de células

precursoras não ocorra na realidade, outra hipótese pode ser levantada, relacionada

com o tempo de viabilidade destas células. Podemos sugerir que a alta expressão

de RANKL seja importante não somente para a diferenciação e atividade de

osteoclastos, mas também para sua viabilidade. Desta forma, ampliando a sobrevida

das células maduras, um número maior delas seria atingido após um determinado

período de tempo; sendo o número de precursores semelhante para ambas as

linhagens animais estudadas, em um primeiro momento no qual os osteoclastos dos

animais WT sofrem apoptose e são conseqüentemente substituídos por novas

células, o possível aumento na sobrevida destas células permite que estes

osteclastos coexistam com aqueles que os substituiriam.

Além da participação sugerida na osteoclastogênese, as quimiocinas MCP-1

e MIP-1α têm um importante papel como quimioatraentes de macrófagos, função já

consagrada na literatura [CONTI, P et al., 1999]. Tratando-se de uma lesão

desencadeada por múltiplas espécies de bactérias, o papel das quimiocinas CC no

controle da infecção pode ser mais importante que sua atuação direta sobre

osteoclastos e precursores [WANG, CY et al., 1993a]. Desta forma, nossos

resultados sugerem que o recrutamento de macrófagos via MCP-1 Æ CCR2, mas

não via MIP-1α Æ CCR1/CCR5, é importante no controle da infecção periapical e na

proteção do hospedeiro. A literatura relata resultados semelhantes, enfatizando a

importância dos macrófagos no controle da infecção odontogênica [RAHIMI, P et al.,

1995], e, apesar de dificuldades em quantificar precisamente as células encontradas

na lesão, o exame histológico sugere que o número de mononucleares é

relativamente menor nos animais CCR2 (Figs 13 e 14).

Seguindo esta hipótese, analisamos também a expressão da quimiocina

KC, importante na migração de neutrófilos polimorfonucleares [KOBAYASHI, Y,

2006]. A expressão desta quimiocina foi bastante acentuada nos animais CCR2 KO

quando comparada aos animais WT, enquanto não foi observada alteração nos

animais MIP-1α KO (figura 12). Corroborando este dado, a observação histológica

das lesões sugere que o número de neutrófilos é muito superior nos animais CCR2

KO, quando comparados aos animais selvagens (Figs 13 e 14).

O maior número de neutrófilos na lesão osteolítica pode ser mais um fator

no agravamento da lesão tecidual; estas células são relacionadas com destruição

tecidual há décadas [WEISS, SJ, 1989]. Neutrófilos secretam diversos produtos

destrutivos, como espécies reativas de oxigênio e metaloproteinases, e sabe-se que

essas células estão envolvidas em doenças auto-imunes e são responsáveis por

destruição tecidual [NATHAN, C, 2006]. Os próprios neutrófilos apresentam

mecanismos para controlar a destruição desencadeada por seus produtos, entre os

quais podemos citar a liberação de sinais bioquímicos para recrutamentar e

programar macrófagos a parar a destruição e orquestrar o reparo [NATHAN, C,

2006]. Considerando esta hipótese podemos também suportar a hipótese de que a

menor migração de macrófagos foi importante para a maior destruição tecidual, uma

vez que macrófagos liberam produtos como SLPI (inibidor de proteases secretadas

por leucócitos) e PEPI (Pró-epitelina) capazes de bloquear a liberação de proteases

e espécies reativas de oxigênio por neutrófilos [NATHAN, C, 2006]. Neste caso

teríamos o seguinte ciclo: a menor migração de macrófagos leva a um prejuízo no

controle da infecção; o maior número de bactérias resulta em maior estímulo para

resposta do organismo; com reduzida capacidade de migração de macrófagos, as

células predominantes na resposta são os neutrófilos, que não possuem a mesma

capacidade de conter essa infecção e também contribuem para a destruição

tecidual. O aumento na expressão de MMP1, considerado a seguir, corrobora o

envolvimento de neutrófilos na destruição periapical.

Por fim, avaliamos a expressão de duas proteases importantes na

reabsorção óssea, MMP1 e catepsina K [EVERTS, V et al., 2006]. Os níveis de

catepsina K apresentados pelos animais MIP-1α KO não apresentaram diferenças

estatísticas em relação aos animais WT (Fig 15). Os níveis de MMP1 nestes animais

também não apresentaram diferenças estatísticas quando comparados aos animais

selvagens (Fig 16). Essa protease é produzida por osteoclastos [EVERTS, V et al.,

2006] e outros tipos celulares, incluindo neutrófilos [WEISS, SJ, 1989].

Os animais CCR2 KO, como esperado, apresentaram níveis mais elevados

de ambas as proteases no dia 7, e tendência a aumento também no dia 14 (Figs 15

e 16). O aumento de catepsina K pode ser relacionado com o aumento da expressão

relativa de RANKL, que apesar de não aumentar o número de osteoclastos neste

período, parece ter contribuído para o aumento da atividade das células já

diferenciadas. Desta forma, o aumento dos níveis de catepsina K desencadeado

pela maior expressão de RANKL foi importante no aumento da lesão observada

nestes animais. Da mesma forma, os níveis de MMP1 também podem representar,

ao menos parcialmente, aumento da atividade de osteoclastos [GARLET, GP et al.,

2004]; contudo, a produção desta protease não é exclusiva de osteoclastos. Assim,

podemos sugerir que o elevado número de neutrófilos no sítio, recrutados com o

auxílio do aumento dos níveis de KC, contribuiu positivamente para a destruição

tecidual, através da produção de MMP1. Por si só, neutrófilos não são capazes de

promover a reabsorção óssea, mas estes dados sugerem que estas células podem

colaborar com osteoclastos, facilitando e acelerando a reabsorção do tecido

mineralizado. Entretanto, novos estudos são necessários para elucidar essa possível

colaboração.

CONCLUSÃO

Baseando-se nos resultados obtidos, podemos concluir que a quimiocina

MCP-1 é importante na proteção do hospedeiro frente à destruição tecidual causada

por lesões periapicais, e que a ausência desta quimiocina não prejudica a

osteoclastogênese. Concluímos também que a quimiocina MIP-1α não apresenta a

mesma importância na proteção do hospedeiro, e que sua ausência pode ser mais

significante para a diferenciação de osteoclastos.

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