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FRANCISCO DAS CHAGAS ALVES FILHO
DESCRIÇÃO DO EFEITO VASODILATADOR DO
EXTRATO ETANÓLICO DE Combretum leprosum
E CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA DO
MECANISMO DE AÇÃO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Farmacologia do Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina de
Ribeirão da Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Maria Cristina Oliveira
Salgado
RIBEIRÃO PRETO
2008
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ÍNDICE
Abreviaturas
Lista de Figuras
Resumo
Abstract
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................01
1.1 Plantas Medicinais..........................................................................................02
1.2 Combretum leprosum Mart.............................................................................03
1.3 Drogas que relaxam o músculo liso dos vasos sangüíneos...........................04
1.4 Relaxamentos dependentes de endotélio .....................................................05
1.5 A identificação química do EDRF...................................................................07
1.6 Relaxamentos Resistentes a Inibidores de NOS e Ciclooxigenase...............10
1.7 Cálcio, Síntese e Liberação de fatores relaxantes do endotélio....................12
1.8 Produtos de origem Vegetal e Relaxamentos mediados por endotélio.........14
1.9 Objetivo.........................................................................................................15
2. MÉTODOS.........................................................................................................16
2.1 Preparação do Extrato Etanólico de Combretum leprosum Mart.................17
2.2 Isolamento das Artérias e Sistema de Registro...........................................17
2.3 Protocolos experimentais.............................................................................18
2.4 Análise dos resultados.................................................................................19
2.5 Drogas ........................................................................................................19
3. Resultados.........................................................................................................20
3.1 EECL induz relaxamentos dependentes de endotélio.................................21
3.2 Atropina não reverte os relaxamentos induzidos por EECL........................21
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3.3 Demonstração de que os relaxamentos induzidos por EECL são..............26
devidos a liberação de fator(es) relaxante(s) do endotélio que se difunde(m)
para as células musculares lisas.
3.4 Os relaxamentos induzidos por EECL são devidos à liberação de............27
óxido nítrico do endotélio que se difunde para as células musculares lisas
3.5 EECL provoca relaxamentos resistentes ao diclofenaco e a L-NNA..........30
3.6 Relaxamentos provocados por EECL são dependentes de Cálcio............31
extracelular
3.7 Vermelho de rutênio (VR) reverte os relaxamentos induzidos por EECL ..35
3.8 O 4α-PDD provoca relaxamentos com o perfil farmacológico...................39
semelhante aos relaxamentos induzidos por EECL
4. Discussão.........................................................................................................43
5. Sumário e Conclusão.......................................................................................52
6. Referências Bibliográficas................................................................................54
Abreviaturas
2-APB = 2- aminoetoxidifenilborato
4α-PDD = 11,12- didecanoato de 4α- Forbol
B12 = vitamina B12 ou hidroxicobalamina
CPA = ácido ciclopiazônico
EDRF = Fator Relaxante Derivado de Endotélio
EDHF = Fator Hiperpolarizante Derivado de Endotélio
EECL = Extrato Etanólico das cascas de Combretum leprosum Mart.
ETYA = ácido 5,8,11,14- eicosatetrainóico
GC = Guanilato Ciclase
GMPc = guanosina- 3´, 5´- monofosfato cíclico
L-NNA = N
G
-nitro-L-arginina
NO = Óxido nítrico
NOS = Sintase de óxido nítrico
ODQ = [1,2,3] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalinone-1
SOD = Superóxido dismutase
TRPV4 = Potencial Transitório de Receptor Vanilóide do subtipo 4
VR = vermelho de rutênio
Lista de Figuras
Figura 1: Relaxamentos provocados pelo EECL em anéis de artérias de coelho
Figura 2: Relaxamentos provocados pelo EECL em anéis de aorta torácica de
rata (o), rata grávida e rata hipertensa.
Figura 3: Relaxamentos provocados pelo EECL em anéis de aorta torácica de
cobaia e de camundongo.
Figura 4: Atropina não afeta os relaxamentos provocados pelo EECL em anéis de
aorta torácica de rata e de coelho.
Figura 5: Em tiras de aorta torácica de coelho, os relaxamentos induzidos pelo
EECL são devidos à liberação de fator(es) relaxante(s) do endotélio.
Figura 6: Diclofenaco não afeta os relaxamentos provocados pelo EECL em anéis
de aorta torácica de rata e de coelho.
Figura 7: L-NNA reverte os relaxamentos provocados pelo EECL em anéis de
aorta torácica de rata e de coelho.
Figura 8: B12 e ODQ revertem os relaxamentos provocados pelo EECL em anéis
de aorta torácica de rata e de coelho.
Figura 9: EECL induz relaxamentos resistentes à combinação de diclofenaco
mais L-NNA em anéis de aorta abdominal, de artéria mesentérica superior e de
artéria carótida comum de coelho.
Figura 10: Os relaxamentos causados pelo EECL em anéis de aorta torácica de
rata e de coelho são reduzidos em soluções de Krebs sem cálcio.
Figura 11: VR reverte os relaxamentos induzidos pelo EECL em anéis de aorta
torácica de rata, de coelho e camundongo.
Figura 12: VR não reverte os relaxamentos induzidos por Ach e CPA em anéis
de aorta torácica de coelho e nem aqueles induzidos por Ach, CPA e A23187 em
anéis de aorta torácica de rata.
Figura 13: VR reverte os relaxamentos provocados pelo EECL em preparações
montadas em sanduíche de aorta torácica de coelho e em anéis de artéria
mesentérica superior de coelho na presença de diclofenaco mais L-NNA.
Figura 14: Efeitos resistentes ao VR da capsaicina e 2-APB em anéis de aorta
torácica de rata.
Figura 15: 4α-PDD induz relaxamentos em anéis de aorta torácica de rata que
são revertidos por L-NNA, B12 e ODQ.
Figura 16: VR reverte os relaxamentos causados pelo 4α-PDD em anéis de
aorta torácica de rata.
RESUMO
Recentemente, numa triagem farmacológica feita em preparações de músculo
liso, observamos que o extrato etanólico das cascas de Combretum leprosum
Mart. (EECL) foi capaz de antagonizar a contração provocada por noradrenalina
em tiras e anéis de aorta torácica de coelho. No presente trabalho caracterizamos
esse efeito relaxante em anéis de aorta torácica descendente de coelho, rato,
camundongo e cobaia, bem como aorta abdominal, artéria mesentérica e artéria
carótida de coelho e investigamos seu possível mecanismo de ação em aorta
torácica descendente de coelho e de rata.
Em todas as preparações testadas, pré-contraídas com fenilefrina (0,1-1µM),
o EECL (0,5-5 µM) induziu relaxamentos que foram dependentes de endotélio, de
concentração e inalterados pela atropina (0,1 µM). Em preparações do tipo
sanduíche com tiras de aorta torácica de coelho, o EECL também foi capaz de
provocar relaxamentos dependentes de endotélio; esses resultados sugerem que
o EECL, de mesma forma que acetilcolina, provoca liberação de substância(s) do
endotélio que relaxa(m) as células musculares lisas dessas artérias.
No intuito de inferir farmacologicamente qual(is) seria(m) a(s) substância(s)
liberadas EECL, usamos anéis de aorta torácica de coelho e de rata. Nesses
anéis pré-incubados com diclofenaco (10 µM), os relaxamentos provocados EECL
foram levemente diminuídos em aorta torácica de coelho, mas inalterados em
aorta torácica de rata. Os relaxamentos causados pelo EECL foram
completamente revertidos por L-NNA (100 µM), vitamina B12 (30-100 µM) e ODQ
(10 µM), inibidor de sintase de óxido nítrico, inativador químico de óxido nítrico
(NO) e inibidor de guanilato ciclase, respectivamente. Isso nos sugeriu
inicialmente, que o EECL estaria ativando a via L-arginina/NO/GMPc. Entretanto,
em anéis de aorta abdominal, artéria mesentérica superior e artéria carótida de
coelho; o EECL induziu relaxamentos mesmo na presença de L-NNA (100 µM) e
diclofenaco (10 µM), o que nos levou a reinterpretar os resultados iniciais com a
seguinte hipótese: O EECL está relaxando não simplesmente por ativar a via L-
arginina/NO/GMPc, mas sim por estimular o endotélio a liberar fatores relaxantes.
Um fator essencial para que o endotélio seja ativado a liberar substâncias
relaxantes é o aumento de cálcio livre no citosol; assim nosso próximo passo foi
verificar se os relaxamentos provocados pelo o EECL são afetados em solução
de Krebs isenta de cálcio. Nessas soluções, os relaxamentos provocados pelo
EECL foram fortemente deprimidos, sugerindo assim que o influxo de cálcio para
o endotélio seria uma etapa crucial nos relaxamentos provocados pelo EECL.
Se o cálcio é um fator primordial para os relaxamentos provocados pelo o
EECL, então por qual (is) canal(is) esse íon estaria adentrando as células
endoteliais? Testamos, então, alguns bloqueadores não seletivos de canais de
cátion endoteliais, como gadolínio, SK&F 96536, níquel e vermelho de rutênio
(VR). Em anéis de aorta torácica de coelho, rata e camundongo, artéria
mesentérica superior e carótida de coelho e preparações do tipo sanduíche de
tiras de aorta torácica de coelho os relaxamentos causados por EECL foram
revertidos apenas por VR (10-20 µM).
Desde que o VR pode bloquear uma variedade de canais catiônicos,
avaliamos farmacologicamente qual (is) deste(s) canal (is) seria(m) ativado(s)
pelo EECL. Examinamos três agonistas de canais TRPV (Transient Receptor
Potential Vanilloid): capsaicina (10-30 µM, agonista de TRPV1); 2-APB (10-30 µM,
agonista de TRPV1, TRPV2 e TRPV3), e 4α-PDD (3-10 µM, agonista de TRPV4).
Dentre essas substâncias, apenas o 4α-PDD provocou relaxamentos
dependentes do endotélio, que foram revertidos por L-NNA (100 µM), B12 (30
µM), ODQ (10 µM) e VR (1-20 µM), em anéis de aorta de rata.
Dada a semelhança farmacológica entre os relaxamentos provocados pelo
EECL e o 4α-PDD, concluímos que EECL contém substâncias(s) que ativaria(m)
os canais TRPV4 endoteliais, que levariam a um influxo de cálcio e conseqüente
estimulação do endotélio a liberar substâncias que relaxariam as células
musculares lisas.
ABSTRACT
In a preliminary study of the biological effects of the ethanolic extract of
Combretum leprosum (EECL) was observed a reduction of the magnitude of the
noradrenaline-induced contractions in isolated strips of rabbit thoracic aorta. In the
present study we investigated if the EECL is able to relax different types of pre-
contracted arteries and characterized the possible mechanisms involved in this
effect. Rings (3-4 mm, with or without endothelium) of rabbit, rat, mice and guinea
pig thoracic aorta, as well as rabbit abdominal aorta, mesenteric and carotid artery
were mounted in organ bath with Krebs solution, continuously gassed with
carbogenic mixture (95% O
2
/5% CO
2
), at 37ºC, for recordings of isometric
contractions. Some rings of rabbit thoracic aorta without endothelium were opened
and mounted with longitudinal strips with endothelium of same dimensions
(sandwich experiments). In phenylephrine (0.1-0.3 µM) pre-contracted rings, the
addiction of EECL (0.5-5 µg/ml) elicited endothelium-dependent relaxation in all
arteries tested. In rings of rabbit and rat thoracic aorta, neither atropine (0.1 µM) nor
diclofenac (10 µM) affected the endothelium-dependent relaxation stimulated by
EECL. In sandwich experiments, EECL also provoked endothelium-dependent
relaxations demonstrating the release of endothelium-derived relaxing substance(s).
In rings of rabbit and rat thoracic aorta; the NO-synthase inhibitors L-NNA or L-
NAME (100-300 µM), the guanylate cyclase inhibitor ODQ (10 µM), and the NO
inactivator vitamin B12 (10 µM) reverted the endothelium-dependent relaxation
stimulated by EECL. In rabbit abdominal aorta, mesenteric and carotid artery rings,
NO/prostanoid-independent relaxations to EECL were observed. In rings of rabbit
and rat thoracic aorta, EECL -induced relaxations were reduced in calcium-deficient
buffer and were reverted by ruthenium red (RR, 10-20 µM), a calcium-permeable
nonspecific cation channels blocker. In rings of rabbit and rat thoracic aorta; 4α -
PDD (1-30 µM), a TRPV4 agonist, induced endothelium-dependent relaxations
which were reverted by L-NNA or L-NAME (100-300 µM), ODQ (10 µM), vitamin
B12a (10 µM) and RR (1-10 µM). These observations suggest that the EECL
contains a compound (s) able to activate TRPV4 channels of rabbit and rat arterial
endothelial cells leading to an increase in calcium influx which results in the
production and release of substances that cause smooth muscle relaxation.
1
1. INTRODUÇÃO
2
1.1 PLANTAS MEDICINAIS
A utilização de produtos vegetais para fins terapêuticos data desde épocas
remotas. Há registros de uso de matérias retiradas de plantas para combate de
diversos tipos de doenças por várias civilizações antigas, tais como a antiga Grécia,
Roma, China, e antigo Egito. Durante o período correspondente aos séculos XI a
XVII, a orientação para o uso terapêutico das plantas estava baseada na “Doutrina
das Assinaturas” (Norton, 2005) segundo a qual a cor, a forma, o habitat ou outras
características físicas das plantas indicavam seu possível valor terapêutico. Assim,
por exemplo, a forma de serpente das raízes das plantas do gênero Rauwolfia
indicaria que essa planta serviria para o tratamento de mordidas de cobra
(Farnsworth,1966).
Durante a idade média atribuía-se a propriedade “curativa” dessas plantas a
existência de substâncias presentes nelas, de acordo com o princípio dos cinco
elementos essenciais para a sobrevivência (água, terra, ar, fogo e a Quinta
Essência) (Norton, 2005). Com o advento da química orgânica tornou-se possível
purificar e isolar, a partir de extratos brutos, a(s) substância(s) responsável(eis) pelo
efeito biológico predominante as quais foram denominadas de “princípios ativos”.
Primariamente, estudiosos de produtos naturais sugeriram que essas substâncias
serviriam para proteção das plantas frente às diversas situações, como predadores
naturais; elas reagiriam quimicamente com as mais variadas formas de organismo
animal e, quando produzissem distúrbios de alguma função animal, seriam mais
precisamente denominadas venenos (Chesnut, 1902).
A disponibilidade de princípios ativos quimicamente puros, junto com os
avanços na fisiologia experimental no século XIX, permitiu a descrição precisa dos
efeitos e a investigação de seu mecanismo de ação, que foram essenciais para o
desenvolvimento de um ramo do conhecimento que posteriormente foi denominado
de Farmacodinâmica, uma das grandes subdivisões da Farmacologia. Por exemplo,
a atropina, princípio ativo isolado da planta Atropa belladona, contribuiu para a
fundamentação da neurotransmissão colinérgica e para a teoria dos receptores
farmacológicos; a reserpina, princípio ativo retirado da planta Rauwolfia serpentina,
foi alicerce para a fundamentação das neurotransmissão adrenérgica,
serotoninérgica e dopaminérgica. Outros princípios ativos que seguem a linha da
atropina e reserpina são: curare (Chondodendron tomentosum), nicotina (espécies
3
da Nicotiniana), ergotamina (espécies do Ergot), cocaína (espécies da
Erythroxylium), morfina (Papaver somniferum), glicosídios cardíacos (espécies da
Digitalis), efedrina (Ephedra sinica); além de uma diversidade de outros princípios
ativos isolados de plantas (Farnsworth, 1966).
1.2. Combretum Leprosum MART.
As plantas do gênero Combretum, pertencentes à família das Combretáceas,
estão amplamente distribuídas em todo mundo. No Brasil a espécie Combretum
leprosum Mart. foi catalogada sistematicamente em 1867, pelo botânico alemão
Carl Friedrich Philipp von Martius, como arbusto encontrado em alguns estados
nordestinos, sobretudo no Piauí (Flora Brasiliensis). Hoje a planta é vulgarmente
conhecida na região como mofumbo, pente de macaco ou mufumbo, e faz parte da
flora nativa dos estados da Bahia, Ceará e Piauí (Agra, 1996). Com as folhas e
entrecascas deste arbusto são preparados infusões e xaropes que são utilizados
pela população local com o intuito de produzir sedação, expectoração e alívio de
distúrbios gastrointestinais, como úlceras (Matos, 1997).
Recentemente, observamos que o extrato etanólico (70%) da Combretum
leprosum Mart. (EECL) provocava relaxamento de tiras isoladas da musculatura
longitudinal de fundus de estômago de rato sem mucosa e pré-contraídas com
cloreto de potássio ou carbacol (Amaral e cols., 2003). Também observamos que o
EECL era capaz de reduzir a magnitude das contrações induzidas por cloreto de
cálcio, em meio despolarizado com 125 mM de cloreto de potássio, ou por carbacol
em segmentos de útero isolado de rata (Alves Filho e cols., 2005), assim como de
diminuir as contrações isotônicas de tiras helicoidais de aorta torácica de coelho
induzidas por noradrenalina e de relaxar anéis de aorta torácica de coelho pré-
contraídos com fenilefrina (Alves Filho e cols., 2006). Entre estes efeitos, o mais
reproduzível e que foi observado em concentrações menores, foi o relaxamento de
anéis de aorta isolada de coelho. Assim, escolhemos preparações vasculares
isoladas para caracterizar esse efeito relaxante do EECL assim como para elucidar
os possíveis mecanismos de ação envolvidos.
4
1.3. DROGAS QUE RELAXAM O MÚSCULO LISO DOS VASOS SANGÜÍNEOS
As drogas vasodilatadoras provocam relaxamento do músculo liso por diversos
mecanismos. Para o entendimento de seus mecanismos é necessário saber quais
os elementos responsivos às drogas. Nos vasos há classicamente três tipos
celulares que podem ser ativados primariamente por drogas vasodilatadoras, a
saber: células endoteliais, células musculares lisas e nervos perivasculares. Assim,
as drogas podem esta exercendo uma ação vasodilatadora por interferir
primariamente com as células musculares lisas, entre elas podemos citar: (a)
substâncias vasodilatadoras endógenas que exerce seus efeitos por ativação de
receptores de membrana plasmática específicos (adrenalina); (b) bloqueadores de
canais de cálcio operados por voltagem como verapamil, nifedipina e flunarizina
(Fleckenstein, 1977 e Godfraind, 2005); (c) doadores de óxido nítrico (NO) como
nitroprussiato de sódio (NPS), trinitrato de glicerila e outros nitratos orgânicos
(Ignarro, 1999); (d) ativadores de canais de potássio como cromacalina, minoxidil e
diazóxido; e (d) inibidores de fosfodiesterases como papaverina, milrinona, zaprinast
ou M&B 22948 (Polson e Strada, 1996).
No final da década de sessenta, Théophile Godfraind observou que a cinazirina
(uma difenilpiperazina) era capaz de inibir de forma concentração dependente as
contrações provocadas por cálcio em preparações de artérias mesentéricas de
coelho despolarizadas por potássio (Godfraind, 2005). Em preparações de músculo
liso vascular de artérias coronárias, pulmonares e cerebrais foi facilmente
demonstrada uma inibição do acoplamento excitação-contração (relaxamento),
principalmente em tiras espirais despolarizadas com potássio, por verapamil e D600
(nifedipina) (Fleckenstein, 1977). Essas drogas, por esses efeitos, foram
inicialmente descritas como antagonistas de cálcio (Fleckenstein, 1977 e Godfraind,
2005). Uma vez que essas drogas também inibem o influxo de cálcio induzido por
noradrenalina ou potássio, em estudos radioquímicos, foram denominadas mais
recentemente de bloqueadores de canais de cálcio operados por voltagem
(Godfraind, 2005).
A ativação de nervos perivasculares é classicamente conhecida por induzir
vasoconstrição mediada por substâncias liberadas por nervos adrenérgicos. Em
5
determinadas espécies de animais e condições experimentais, ocorre liberação de
substâncias vasodilatadoras (acetilcolina, NO, e/ou peptídeo intestinal vasoativo)
quando os nervos não adrenérgicos são estimulados. Na vasculatura também há
nervos aferentes que enviam sinais para a medula espinhal, estes nervos são
conhecidos por serem sensíveis à capsaicina e por liberarem uma variedade de
peptídeos vasoativos (taquicininas, substância P, neuroquininas e peptídeo
relacionado ao gene de calcitonina) (Hill e cols., 2001). Drogas isoladas da maconha
(Cannabis sativa), como delta-9-tetrahidrocanabinol e canabinol, foram descritas
como capazes de ativar nervos sensoriais perivasculares sensíveis à capsaicina, em
preparações de artérias hepáticas e mesentéricas isoladas de rato, e essas
respostas não foram mediadas por nenhum dos dois receptores canabinóides
clássicos ou pelo receptor vanilóide do subtipo 1 (Zygmunt e cols., 2001).
Na década de setenta, observou-se que os relaxamentos devidos à estimulação
de nervos não-adrenérgicos não-colinérgicos, em artérias cerebrais isoladas de cão,
por nicotina são devidos à ativação de receptores nicotínicos, considerando que o
hexametônio abolia esta resposta (Toda, 1975). Estas respostas relaxantes para a
nicotina foram abolidas pela remoção de cálcio extracelular e por inibidores de
sintase de NO (NOS), sugerindo assim que o influxo de cálcio e a ativação da NOS
são essenciais para que a nicotina exerça seus efeitos relaxantes (Toda e cols.,
2003).
1.4. RELAXAMENTOS DEPENDENTES DE ENDOTÉLIO
Em 1980 Furchgott e Zawadzki, trabalhando no departamento de Farmacologia
da Universidade do Estado de New York, observaram que tanto anéis quanto tiras
de aorta torácica de coelho, quando pré-contraídos com noradrenalina, eram
relaxados pela adição de acetilcolina e que esses relaxamentos eram abolidos ou
mesmo convertidos em resposta contrátil quando essas mesmas preparações eram
destituídas de suas células endoteliais. Baseados nessa observação, estes autores
propuseram que a acetilcolina estimularia o endotélio a liberar substância(s) que
relaxariam as células musculares lisas adjacentes. Evidências experimentais que
corroboraram com essa hipótese vieram a partir da montagem de experimentos em
“Sanduíche”, nos quais uma tira transversal (anel aberto) com o endotélio destruído
6
era testada montada separadamente ou montada junta com uma tira longitudinal de
mesmas dimensões (superfície luminal contra superfície luminal) com ou sem as
células endoteliais intactas. Novamente, foram observados relaxamentos induzidos
por acetilcolina apenas nas preparações onde se tinha montado uma tira transversal
juntamente com uma tira longitudinal com endotélio. Neste mesmo artigo (Furchgott
e Zawadzki, 1980), foram apresentadas evidências farmacológicas sugerindo que
esta substância relaxante seria derivada do ácido araquidônico ou outro ácido graxo
insaturado liberado por fosfolipase A2 (sensível a mepacrina) e que depois seria
oxidado por lipoxigenases (sensíveis ao ácido 5,8,11,14–eicosatetraenóico, ETYA).
Depois que este fenômeno foi verificado para outros agonistas endógenos
(bradicinina, substância P, histamina, trombina, serotonina), bem como para
substâncias exógenas (A23187) e em várias preparações vasculares de diferentes
animais, Furchgott (1983) cunhou o termo EDRF (Fator Relaxante Derivado do
Endotélio).
Relaxamentos dependentes de endotélio foram depois caracterizados como
sendo mediados por EDRF numa diversidade de mamíferos, tais como: ratos, cães,
gatos, cobaias, porcos, camundongos, macacos e humanos. Além do mais, existem
diferenças quanto à espécie de animal estudada e ao estímulo farmacológico
aplicado. Van de Voorde e Leusen (1983) estudaram o efeito da histamina em cinco
espécies diferentes (camundongo, rato, cobaia, coelho e gato) e verificaram
relaxamentos dependentes de endotélio somente no rato e coelho, sendo que os
relaxamentos na aorta de rato foram inibidos por ETYA, mas não por quinacrina.
Cherry e colaboradores (1984) também estudaram as diferenças entre espécies
examinando a ação da bradicinina em anéis de artérias isoladas de cão, gato,
coelho e humano. Esses pesquisadores encontraram que apenas as artérias do cão
(esplênica, gástrica, celíaca, femoral, renal, coronária, pulmonar e mesentérica
superior) e humana (artérias mesentéricas) requeriam a presença das células
endoteliais para a ação vasodilatadora da bradicinina. Também nesse estudo,
verificou-se que os relaxamentos dependentes de endotélio induzidos por
bradicinina em artérias mesentéricas superior de cão foram parcialmente revertidos
por quinacrina e ETYA (Cherry e cols., 1984). Deste modo, fica claro uma
especificidade de animal, tipo de vaso e estímulo estudado para a observação de
relaxamentos dependentes de endotélio que seriam mediados por EDRF.
7
Antes que fosse identificada a natureza química do EDRF, estudos iniciais
focaram no mecanismo de relaxamento provocado por este fator. Assim, Rapoport e
Murad (1983), baseados nas informações sobre o mecanismo pelo qual os
compostos com o grupo nitro (nitroglicerina e NPS) causam relaxamentos,
sugeriram que o mecanismo do relaxamento provocado por EDRF seria semelhante
àquele provocado por compostos com o grupo nitro. Como o mecanismo de
relaxamento induzido por estes compostos estava relacionado à ativação da
guanilato ciclase (GC) e a formação de guanosina-3´,5´-monofosfato cíclico (GMPc),
estes pesquisadores examinaram em tiras de aorta de rato se os relaxamentos
provocados pelo EDRF seriam acompanhados de aumentos nas concentrações de
GMPc, medidas por radioimunoensaio. Eles verificaram que os relaxamentos
dependentes de endotélio induzidos por acetilcolina, histamina e A23187 foram
acompanhados por aumentos nas concentrações de GMPc, assim como foi o
relaxamento independente de endotélio induzido por NPS. Além do mais, tanto o
relaxamento quanto os aumentos nas quantidades de GMPc induzidos por
acetilcolina, mas não aqueles por NPS, foram parcialmente antagonizados por
quinacrina e completamente prevenidos por ETYA (Rapoport e Murad, 1983).
Também foram realizados estudos em aorta de coelho com resultados semelhantes
aos encontrados em aorta de rata (Furchgott e cols., 1989). Nesse caso, anéis de
aorta de coelho foram montados para permitir o registro de tensão e, em
determinado momento de contração ou relaxamento, foram rapidamente congelados
com nitrogênio liquido, para depois serem ensaiados para sua quantidade de GMPc.
De maneira semelhante aos resultados em aorta de rato, os relaxamentos
dependentes de endotélio induzidos por acetilcolina e A23187 foram precedidos de
aumentos nas concentrações de GMPc (Furchgott e cols., 1984).
1.5. A IDENTIFICAÇÃO QUÍMICA DO EDRF
Experimentos realizados em forma de cascata ajudaram na identificação
química do EDRF. Griffith e cols (1984) utilizando uma abordagem experimental da
perfusão em cascata, onde se monitorava a pressão de perfusão duma preparação
de artéria coronária esquerda de coelho sem endotélio (detectora), que era
perfundida com líquido proveniente de um segmento de aorta torácica descendente
8
de coelho com endotélio (doadora), observaram que: a) acetilcolina diminuiu a
pressão de perfusão da detectora apenas quando aplicada na doadora; b) variando
o comprimento do trajeto do perfusato entre e doadora e detectora foi possível
determinar o tempo de trânsito do EDRF e assim calcular a meia vida em cerca de 6
segundos; c) ditiotreitol, fenidone ou ácido nordihidroguaiarético, drogas com
atividade “varredora de radicais livres”, quando aplicadas no trajeto entre
doadora/receptora aboliram o efeito do EDRF liberado.
A mesma abordagem foi utilizada por Gryglewski e cols. (1986) utilizando tiras
de aorta torácica de coelho montadas em cascata, todas funcionalmente
desprovidas de endotélio, como tecido detector e células endoteliais da aorta de
porco em cultura, aderidas em microesferas e empacotadas em colunas
cromatográficas, como doador. Nesse sistema experimental, os autores observaram
relaxamentos das tiras detectoras provocados por bradicinina e A23187, mas não
para a acetilcolina, quando adicionados na cultura de células endoteliais doadoras,
e que esse efeito era diminuído à medida que o líquido de perfusão era passado
para as tiras mais distais às células endoteliais, permitindo assim calcular a meia
vida do EDRF ao redor de 4 a 7 segundos (Gryglewski e cols., 1986). Em outra série
de experimentos, pesquisadores do mesmo grupo fizeram as seguintes
observações: (1) a tira detectora relaxava com a adição de NPS ou trinitrato de
glicerila; (2) uma solução NO, assim como o EDRF liberado após estimulação da
doadora com bradicinina, relaxava as tiras detectoras com uma velocidade de
declínio semelhante, com meia vida de aproximadamente 4 segundos; (3) havia
uma correlação da faixa de concentração de NO que provocava relaxamento e a
quantidade de NO, medida por quimioluminescência, liberada por bradicinina; (4)
hemoglobina, que reage tanto com EDRF como NO, abolia os relaxamentos
induzidos por EDRF e NO; (5) superóxido dismutase (SOD), enzima que inativa o
íon superóxido (O۟
2
), aumentava a meia vida tanto do NO como os relaxamentos
provocados por bradicinina (Palmer e cols., 1987).
Também usando o método de perfusão em cascata ou preparações isoladas de
anel de aorta de coelho, Furchgott obteve evidência conclusiva de que o EDRF é
quimicamente semelhante ao NO. Em seu bioensaio, Furchgott utilizou um
segmento de aorta torácica descendente de coelho, com endotélio, como doadora
para um anel da mesma artéria sem endotélio (detector). Dessa forma, quando a
acetilcolina era adicionada na aorta doadora, ocorria relaxamento na detectora, que
9
estava contraída com fenilefrina. As observações experimentais de Furchgott podem
ser sumarizadas como: (1) o anel detector relaxava com a adição de uma solução
de NO; (2) a solução de NO, assim como o EDRF liberado após estimulação da tira
doadora com acetilcolina, relaxavam o anel detector com uma velocidade de
declínio semelhante, com meia vida de aproximadamente 2 segundos; (3)
hemoglobina e azul de metileno, aboliram os relaxamentos induzidos pela
acetilcolina perfundida ou pelo NO gerado a partir de uma solução acidificada de
nitrito; (4) hidroquinona, fenidona e sulfato ferroso, que geram superoxido (O۟
2
),
inibiram os relaxamentos provocados pela acetilcolina perfundida ou por adição no
detector de uma solução de NO; (5) SOD aumentava os relaxamentos provocado
pela solução de NO, mas intrigantemente não alterava os relaxamentos provocados
por acetilcolina em preparações de anéis com endotélio intacto (Furchgott, 1989).
Estabelecida a identidade química do EDRF como sendo o NO, as pesquisas
se direcionaram para responder à seguinte questão: quais são as vias que as
células endoteliais utilizam para sintetizar NO? Palmer e cols. (1988), utilizando o
bioensaio já descrito acima, observaram que L-arginina aumentava os relaxamentos
provocados pela bradicinina quando infundida numa cultura de células endoteliais
de aorta de suína. Esse efeito foi isomérica e estruturalmente específico, uma vez
que não foi observado com D-arginina, L-ornitina, L-homoarginina e outros análogos
estruturais da L-arginina. L-arginina também aumentou a quantidade de NO (medido
por quimioluminescência) liberado por bradicinina e A23187 em culturas de células
endoteliais de aorta suína. Nessas mesmas células, usando L-arginina marcada
com o isótopo 15 do nitrogênio (
15
N), medida de espectrômetria de massa indicou
que
15
N é captado para formar NO (Palmer e cols., 1988). Esse experimento sugeriu
a existência de enzimas sintetizadoras de NO, que utilizam L-arginina como
substrato. Posteriormente, foi estabelecido que essa reação era catalisada por
enzimas denominadas sintases de NO (NOS), dependentes de cálcio-calmodulina, e
que são competitivamente inibidas por análogos da L-arginina, tais como a N
G
-
monometil-L-arginina (L-NMMA), que abole a liberação de NO induzida por
acetilcolina em aorta de coelho (Rees e cols., 1988).
10
1.6. RELAXAMENTOS RESISTENTES A INIBIDORES DE SÍNTASE DE NO E
CICLOOXIGENASES
No final da década de setenta, Kuriyama e Suzuki (1978) observaram que a
acetilcolina provoca hiperpolarização de segmentos de artéria mesentérica superior
de coelho e que estas mesmas eram abolidas por aumento da concentração de
potássio. Eles também observaram que a acetilcolina induz relaxamentos em tiras
pré-contraídos com potássio de artéria mesentérica superior de coelho (Kuriyama e
Suzuki, 1978). No final da década de oitenta, Feletou e Vanhoutte (1988) com a
proposta de verificar no bioensaio se o(s) produto(s) liberado(s) do endotélio de
segmentos de artéria femoral (doadora) seriam capazes de provocar mudanças na
tensão e no potencial de membrana do músculo liso de tiras de artéria coronária
descendente anterior esquerda e de artéria epicárdica de cão, respectivamente
(detectoras), observaram que: (1) a acetilcolina relaxa a coronária descendente
apenas se a doadora tiver endotélio, (2) a acetilcolina hiperpolariza a artéria
epicárdica apenas se a doadora tiver endotélio, (3) ouabaína, quando colocada nas
detectoras, bloqueava as hiperpolarizações mas não os relaxamentos provocados
pela acetilcolina, e (4) indometacina não afetava nem as hiperpolarizações nem os
relaxamentos provocados pela acetilcolina (Feletou e Vanhoutte, 1988). Essas
observações sugeriram que os dois fenômenos (relaxamentos e hiperpolarizações)
são devidos a diferentes fatores derivados do endotélio.
Na mesma época, Chen e cols. (1988) observaram que em artéria pulmonar
principal isolada de rato, os relaxamentos e as hiperpolarizações eram dependentes
de endotélio, mas apenas os relaxamentos eram reduzidos pela hemoglobina e pelo
o azul de metileno, substâncias que inibem as respostas mediadas por EDRF.
Essas observações fizeram os autores sugerir a existência de Fator(es)
Hiperpolarizante(s) Derivado(s) do Endotélio (EDHF) e que este não era o EDRF e
nem um produto derivado da ciclooxigenase, uma vez que a indometacina não
afetava essas hiperpolarizações (Chen e cols. 1988).
Esse fenômeno depende do leito vascular estudado e parece ser predominante
em vasos de resistência (Shimokawa e cols., 1996). Essa hiperpolarização persiste
na presença de inibidores da síntese de NO e da síntese de prostaglandinas
derivadas de ciclooxigenases (COX) e pode corresponder aos relaxamentos
descritos também em vários leitos vasculares e artérias isoladas que são resistentes
11
à inibição da COX e da NOS. Por exemplo, na aorta torácica de rato a acetilcolina
induz relaxamento dependente do endotélio que é abolido pelo inibidor de NOS N
G
-
nitro-L-arginina (L-NNA), enquanto que na artéria mesentérica superior de rato a
acetilcolina provoca relaxamentos dependentes do endotélio mesmo na presença de
indometacina (inibidor de COX) e de L-NNA, sugerindo que estes relaxamentos
seriam mediados por EDHF (Nagao e cols., 1992). Esses relaxamentos, porém, são
abolidos pela elevação da concentração extracelular de potássio ou pela
combinação de caribdotoxina e apamina, bloqueadores de canais de potássio
ativados por cálcio. Estes relaxamentos mediados por EDHF também foram
descritos em preparações de artérias de coelho, tais como aorta abdominal,
carótida, ilíaca, femoral, mesentérica superior e renal (Cowan e cols., 1993; Chaytor
e cols., 2003; Hutcheson e cols., 1999; Kagota e cols., 1999).
Uma diversidade de mecanismos tem sido proposta para explicar estes
relaxamentos bem como a hiperpolarização das células musculares lisas
dependentes de endotélio; assim, há evidências de o EDHF possa ser: (a) os íons
potássio, que em baixas concentrações relaxam e hiperpolarizam artérias hepáticas
de rato por mecanismos sensíveis ao bário e à ouabaína e são liberados durante a
hiperpolarização induzida por acetilcolina das células endoteliais (Edwards e cols.
1998); (b) ácidos epoxieicosatrienóicos, que são produtos derivados do ácido
araquidônico e sintetizados por uma família de enzimas do citocromo P450
(epoxigenases), e parecem mediar os relaxamentos e a hiperpolarizações induzidas
por bradicinina em artérias coronárias suínas (Hecker e cols. 1994; Fisslthaler e
cols. 1999); (c) peróxido de hidrogênio, que em artérias mesentéricas de
camundongo parecem mediar os relaxamentos e as hiperpolarizações dependente
de endotélio causados pela acetilcolina (Matoba e cols. 2000); (d) ácidos
trihidroxiecosatrienóicos derivados do ácido araquidônico por ação da lipoxigenases
e hidroperóxido isomerase; há evidências experimentais de que o ácido 11,12,15 –
trihidroxiecosatrienóico é o EDHF liberado pela a acetilcolina em aorta de coelho
(Campbell e cols. 2003); (e) peptídeo natriurético C, que além de relaxar artérias
mesentéricas de rato, é liberado durante a hiperpolarização induzida por acetilcolina
das células endoteliais e de hiperpolarizar as células musculares lisas por
mecanismos sensíveis ao bário e a ouabaína (Chauchan e cols. 2003). Um fato
interessante é que na artéria carótida de coelho as características farmacológicas e
12
químicas do EDHF se assemelham ao próprio NO, que nesse caso seria derivado
de outras fontes além da NOS (Cohen e cols., 1997).
1.7. CÁLCIO, SÍNTESE E LIBERAÇÃO DE FATORES RELAXANTES DO
ENDOTÉLIO
A observação de que os relaxamentos dependentes de endotélio causados por
acetilcolina e A23187, em anéis de aorta torácica de coelho e rato (Winquist e
cols.,1985; Singer e Peach, 1982), e que a liberação de EDRF provocada por
acetilcolina, em experimentos de bioensaio (aorta torácica de coelho como doadora
e artéria coronária de coelho como detectora, Griffith e cols., 1986), eram abolidos
quando não se adicionava cálcio à solução nutritiva, levaram à sugestão de que o
influxo de cálcio do meio extracelular para o endotélio é um fator necessário para
estes relaxamentos. Relaxamentos dependentes de endotélio resistentes a
inibidores de NOS e COX também são dependentes da presença de cálcio
extracelular (Feletou e cols., 2006).
Uma vez estabelecida a necessidade de aumento da concentração de cálcio
intracelular para que as células endoteliais sejam estimuladas a liberar fatores
relaxantes, as atenções foram voltadas para as vias responsáveis por este aumento.
As substâncias capazes de provocar relaxamentos dependentes de endotélio
podem aumentar a concentração citosólica livre de cálcio por diversas maneiras.
Uma forma de aumentar a concentração intracelular livre cálcio é o uso de drogas
com atividade inibitória da bomba que transporta o cálcio para retículo
sarcoplasmático (ATPase de cálcio), como o ácido ciclopiazônico (CPA) e a
tapsigargina. Em experimentos em cascata com preparações de artérias de coelho
(segmento de aorta abdominal como doador e anéis de aorta torácica como
detectora); a adição de CPA e de tapsigargina no doador provocou relaxamentos
transitórios da detectora, que foram abolidos pelo éster metílico da L-NNA (L-
NAME), um inibidor da NOS. Por outro lado, os relaxamentos na detectora induzidos
por acetilcolina infundida no doador são reduzidos pelo prévio tratamento da
doadora com CPA e tapsigargina (Hutcheson e cols., 1997). Em anéis de aorta
torácica de rato pré-contraídos com fenilefrina, tapsigargina tanto inibe os
13
relaxamentos provocados por acetilcolina e A23187 quanto provoca relaxamentos
dependentes de endotélio que são abolidos por L-NAME (Huang e cols., 2000).
Em experimentos de medida da concentração de cálcio intracelular em células
endoteliais isoladas de aorta de coelho, mediante indicadores fluorescentes, a
acetilcolina aumentou a concentração citosólica de cálcio e esse aumento foi
dependente tanto do cálcio extracelular como do cálcio presente em estoques
intracelulares. Assim, nessas preparações sem cálcio na solução de perfusão,
acetilcolina e CPA provocavam aumentos transitórios nas concentrações citosólicas
de cálcio e os aumentos induzidos por acetilcolina eram reduzidos CPA (Li e van
Breemen, 1996; Sasajima e cols., 1997). Já nessas preparações com cálcio na
solução de perfusão, acetilcolina e CPA provocavam aumentos nas concentrações
citosólicas de cálcio e os aumentos provocados pela acetilcolina eram bloqueados
por CPA (Li e van Breemen, 1996). Em preparações pressurizadas de artéria
mesentérica superior de rato, a acetilcolina provocava elevações nas concentrações
intracelulares de cálcio nas células endoteliais e esses aumentos envolviam dois
componentes: o primeiro componente transitório não foi afetado por remoção de
cálcio extracelular e foi inibido por CPA e o segundo componente mantido,
subseqüente, foi abolido pela remoção de cálcio extracelular, pelo CPA e pelo
SKF96365, um bloqueador não seletivo de canais de cátions (McSherry e cols.
2005). Todas essas observações sugerem que o aumento na concentração de
cálcio provocado pela acetilcolina seja mediado por 2 mecanismos: o primeiro
depende da liberação de cálcio de estoques intracelulares (retículo endoplasmático)
cuja depleção promove o influxo de cálcio a partir do meio extracelular,
classicamente denominado influxo capacitivo ou influxo de cálcio operado por
estoque (Putney, 1986 e Nillius, 2003). O segundo mecanismo, que não requer a
depleção dos estoques intracelulares de cálcio, envolve a ativação de canais
permeáveis ao cálcio localizados na membrana plasmática, seja por via indireta
(ativação mediada por receptores) ou direta (ativação do próprio canal iônico),
(Nilius e Droogmans, 2001).
14
1.8. PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL E RELAXAMENTOS MEDIADOS POR
ENDOTÉLIO
Em recente revisão, McNeill e Jurgens (2006) catalogaram 128 espécies de
plantas com atividade vasodilatadora, das quais foram isolados 67 compostos
químicos com esta atividade. Esses autores selecionaram nessa revisão apenas os
trabalhos nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação. Destes
estudos, cerca de 62% descreveram relaxamentos dependentes de endotélio; 26%
descreveram relaxamentos independentes de endotélio e cerca de 12%
descreveram relaxamentos dependentes e independentes de endotélio (McNeill e
Jurgens, 2006). Assim, os mecanismos de relaxamento de preparações vasculares
induzidos por produtos derivados de plantas parecem ser de uma diversidade
semelhante à sua própria diversidade química.
A observação de que baixa incidência de doenças cardiovasculares em
populações da França e outros países do Mediterrâneo, apesar da alta dieta de
gordura saturada (Paradoxo Francês), foi correlacionada com a alta freqüência de
consumo de vinho tinto e impulsionou pesquisas nos mecanismos da atividade
biológica tanto de extratos feitos de vinho tinto como de compostos químicos
(flavonóides) isolados destes. Inicialmente, foram verificados relaxamentos
dependentes de endotélio mediados por EDRF provocados por extratos de alguns
vinhos, em anéis de aorta de rato, que foram tanto revertidos como prevenidos por
inibidores de NOS, além de serem acompanhados por um aumento nas quantidades
de GMPc (Flitzpatrick e cols., 1993). Posteriormente, foram observados
relaxamentos dependentes de endotélio por uma variedade de extratos vegetais
(frutas, nozes, chás e ervas) que foram acompanhados por elevações nas
quantidades de GMPc em preparações de aorta de rato (Flitzpatrick e cols., 1995).
O efeito relaxante de extratos de vinho foi atribuído ao seu conteúdo de compostos
polifenólicos e a fração mais ativa tem uma alta quantidade de taninos condensados
oligoméricos; dessa fração foi isolado o composto com maior potência relaxante,
delfinidina (Andriambeloson e cols., 1998). O fato de que os compostos polifenóis do
extrato de vinho tinto também eram capazes de induzir relaxamentos dependentes
de endotélio na presença de inibidores de NOS e COX em artérias mesentéricas de
rato, descarta estas enzimas como o alvo primário de ação desses compostos.
15
Também foi encontrado que os polifenóis do extrato de vinho tinto são capazes de
induzir elevações tanto na concentração intracelular de cálcio como extracelular do
íon superóxido em células endoteliais de aorta de boi (Duarte e cols.,2004).
1.9. OBJETIVOS
No presente estudo, foram realizados experimentos para caracterizar o efeito
relaxante do EECL no músculo liso vascular e investigar o(s) possível(eis)
mecanismo(s) envolvido (s) nesse efeito.
Especificamente, foram concebidos experimentos para responder as seguintes
questões:
1. Em aorta de coelho esse relaxamento é dependente da presença do
endotélio?
2. Esse efeito relaxante ocorre em outras artérias de coelho e na aorta torácica
de outros animais?
3. Finalmente, para identificar o possível mecanismo de ação do EECL, foram
realizados experimentos em aorta de coelho e de rata para responder as
seguintes questões:
3.1- O relaxamento por EECL é devido à liberação de substâncias relaxantes
a partir do endotélio?
3.2- Quais são os fatores endoteliais liberados pelo EECL?
3.3- Qual o mecanismo pelo qual o EECL estimula o endotélio?
16
2. MÉTODOS
17
2.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE COMBRETUM LEPROSUM
MART.
Foram coletadas cascas de Combretum leprosum durante o período das 9:30
às 10:30 h da manhã do dia 15 de julho de 2005, no setor de caprinocultura do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí, em Teresina.
Exsicatas (n° 10667) foram depositadas no Herbário Graziela Barroso da mesma
instituição. As cascas foram deixadas secar durante dois dias a aproximadamente
40°C e o pó das mesmas foi obtido por meio de moagem em moinho elétrico. O
extrato foi preparado por percolação com uma solução aquosa de etanol 70% em
temperatura ambiente e depois concentrada em rota-evaporador a 50°C para gerar
o extrato seco, obtendo-se, assim, um rendimento de cerca de 20% de pó seco. O
extrato foi livremente diluído em água destilada para experimentos farmacológicos.
2.2. ISOLAMENTO DAS ARTÉRIAS E SISTEMA DE REGISTRO
Foram utilizados coelhos neozelandeses (2,5–3,5 Kg), ratos Wistar (300–350
g), cobaias inglesas (250-300 g) e camundongos suíços (25-30 g); machos ou
fêmeas obtidos do biotério central do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo. Uma linhagem de ratas com hipertensão arterial espontânea e ratas
Wistar entre o vigésimo e vigésimo segundo dia de gestação também foram
utilizadas em alguns experimentos. Os protocolos experimentais utilizados estavam
de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotado pelo Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão
de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo.
Os animais foram sacrificados por secção dos vasos cervicais, após anestesia
com pentobarbital sódico (50 mg/Kg, i.p.). Após abertura da cavidade torácica, a
aorta torácica descendente foi rapidamente removida e colocada numa placa de
Petri contendo solução de Krebs (composição em mM: NaCl 116, KCl 4,5, NaH
2
PO
4
1,14, MgCl
2
.6H
2
O 1,16, CaCl
2
.2H
2
O 2,5, NaHCO
3
25 e glicose 11,1), onde foi
dissecada de tecidos aderentes e gordura. Em alguns coelhos, além da aorta
torácica, foram retiradas as artérias aorta abdominal, carótida comum e mesentérica
superior. As artérias foram seccionadas em anéis (3-4 mm). Alguns anéis tiveram o
18
endotélio danificado por meio de um leve deslizamento feito com uma superfície
metálica, de diâmetro compatível, no lúmen do anel. Os anéis foram suspensos
entre finos suportes metálicos e montados em cubas para órgão isolado (5-10 mL)
contendo solução de Krebs a 37
o
C e borbulhada continuamente com mistura
carbogênica contendo 5% CO
2
– 95% O
2
. Os anéis de aorta de rato, camundongo e
cobaia foram montados dentro de uma tensão de repouso de 2, 1 e 3 g,
respectivamente, enquanto os anéis de artérias de coelho numa tensão de 3-4 g. A
tensão de cada anel foi continuamente registrada por meio de um transdutor de
força isométrico conectado a um polígrafo.
Alguns experimentos foram realizados para demonstrar a liberação de
substâncias pelo endotélio. Nesses experimentos, conhecidos como preparações
em “Sanduíche”, descritos por Furchgott e Zawadzki (1980), foram utilizadas tiras
isoladas de aorta torácica de coelho. Uma tira foi cortada num eixo paralelo ao do
fluxo sangüíneo na aorta, essa tira foi desprovida de endotélio por meio de um leve
deslizamento de sua superfície luminal num papel de filtro, sendo denominada tira
longitudinal ou tira “detectora”. Outra tira foi confeccionada a partir de um anel que
foi aberto e sua superfície luminal foi preservada ou não de endotélio; essa tira foi
denominada tira transversal ou tira “doadora”. As duas tiras foram cortadas com a
mesma dimensão e montadas em cubas para órgão isolado com o auxilio de
“grampos cirúrgicos” das seguintes formas: (I) Uma tira detectora junto com uma tira
doadora sem endotélio; (II) uma tira detectora junto com uma tira doadora com
endotélio; (III) uma tira detectora na ausência de tira doadora; e (IV) uma tira
doadora na ausência de tira detectora. Nas preparações em que se montaram tiras
juntas, foi sempre registrada a tensão da tira detectora.
2.3. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
Os anéis ou tiras foram deixados em equilíbrio por um período entre 3 (coelho)
a 2 h (rato, camundongo e cobaia), sendo trocada a solução de Krebs a cada 20
minutos. Após a primeira hora, para testar a viabilidade das preparações, foi
induzido uma contração com fenilefrina (0,1-1 μM). Depois da segunda hora de
lavagem, adicionou-se novamente fenilefrina e no platô de sua contração, a
integridade do endotélio foi verificada pelo relaxamento induzido pela a adição de
19
acetilcolina (0,1-0,3 μM). Foram considerados anéis com endotélio intacto aqueles
em que acetilcolina reduziu pelo menos 60% da contração induzida por fenilefrina.
Depois de lavagem da preparação, induziu-se novamente contração com fenilefrina
e foram adicionadas, no platô da contração, concentrações cumulativas de EECL
(0,5, 1,5 e 5 μg/mL) ou concentrações isoladas de acetilcolina. Em aorta torácica de
rata pré-contraídas com fenilefrina também foram investigados os efeitos de 11,12-
didecanoato de 4-alfa-forbol (4α-PDD, 1-30 μM), capsaicina (10-30 μM), 2-difenil-
boraniloxetanamina (2-APB,1 μM) ou A23187 (1 μM), ou ácido ciclopazônico (CPA,
1 μM).
Após a adição das drogas supracitadas em anéis contraídos com fenilefrina,
esperou-se um tempo para o qual a resposta (se essa ocorresse) atingisse um nível
estável. Em seguida, foram adicionados atropina (1 μM), N
G
-nitro-L-arginina ( L-
NNA, 100-200 μM ), vitamina B12 (30-100 μM ), ODQ (10 μM), ou vermelho de
rutênio (1-30 μM). Em algumas preparações os efeitos de acetilcolina e de EECL
foram examinados na presença de diclofenaco (10 μM), um inibidor da COX.
2.4. ANÁLISES DOS RESULTADOS
Os resultados foram expressos como percentagem de alteração da tensão
induzida por fenilefrina após a adição das drogas. Estes valores foram apresentados
como média ± erro padrão da média (EPM).
2.5. DROGAS
Acetilcolina, atropina, capsaicina, fenilefrina e vitamina B12 foram obtidos da
Sigma. CPA e ODQ foram obtidos de Tocris. A23187, 2-APB, 4α-PDD e diclofenaco
foram obtidos de Calbiochem. L-NNA foi obtido de Research Biochemicals
International. Vermelho de rutênio foi obtido de LC Laboratories.
20
3. RESULTADOS
21
3.1. EECL INDUZ RELAXAMENTOS DEPENDENTES DE ENDOTÉLIO
Em anéis de aorta torácica descendente, de aorta abdominal e de artéria
mesentérica superior de coelho, o EECL (0,5, 1,5 e 5 μg/mL) induziu
relaxamentos dependentes de concentração apenas em preparações com
endotélio intacto (Figura 1A-C). Qualitativamente, em dois experimentos
realizados com anéis de artéria carótida comum de coelho, o EECL também
provocou relaxamentos dependentes de concentração e de endotélio (Figura 1D).
O EECL também induziu relaxamentos de forma dependente da concentração e
do endotélio em anéis de aorta torácica de rata e rato (n=2), de rata com 20-22
dias de gestação e de rata com hipertensão arterial (n=2) (Figura 2). O EECL
também induziu relaxamentos de forma dependente da concentração e de
endotélio em anéis de aorta torácica de camundongo (n=2) e cobaia (n=2) (Figura
3).
3.2. ATROPINA NÃO REVERTE OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR EECL
O relaxamento induzido por acetilcolina é devido à ativação de receptores
muscarínicos presentes nas células endoteliais, assim questionamos se os
relaxamentos induzidos por EECL poderiam envolver ativação destes receptores.
A atropina (0,1 μM) reverteu os relaxamentos induzidos por acetilcolina em cerca
de 95±4% (n=7) em anéis de aorta de coelho e cerca de 109±5% (n=3) em anéis
de aorta de rata, mas não provocou efeitos significantes nos relaxamentos
provocados por EECL (Figura 4 e 5).
22
A
B
C
D
Figura 1: Efeitos provocados por EECL (µg/mL) em anéis, pré-contraídos com
fenilefrina (Fen, 10
-7
M para aortas e 10
-6
M para mesentérica e carótida), de artérias
com (+E) e sem endotélio (-E) de (A) aorta torácica, (B) aorta abdominal, (C) artéria
mesentérica superior e (D) artéria carótida comum de coelho. À esquerda, registros
representativos e, à direita, representação gráfica das médias±EPM, com o número
de experimentos entre parênteses.
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
EECL, μg/mL
(13)
(4)
+E
-E
Tensão (%)
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
(4)
(4)
-E
+E
EECL μg/mL
Tensão (%)
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
(13)
(3)
+E
-E
EECL μg/mL
(%) Tensão
+E -E
Fen Fen
0,5 1,5 5,0
EECL
0,5 1,5 5,0
EECL
2g
5min
+E
-E
0,5 1,5 5,0
Fen
Fen
EECL
0,5 1,5 5,0
EECL
2g
5min
0,5 1,5 5,0
+E
-E
Fen Fen
EECL
0,5 1,5 5,0
EECL
2g
5min
0,5 1,5 5,00,5 1,5 5,0
+E
-E
Fen Fen
EECL EECL
2g
5min
23
A
B
C
D
Figura 2: Efeitos provocados por EECL (µg/mL) em anéis, pré-contraídos com
fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica com (+E) e sem endotélio (-E) de (A) rata
normotensa, (B) rata grávida, (C) rato e (D) rata com hipertensão arterial. À
esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das
médias±EPM, com o número de experimentos entre parênteses.
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
EECL, μg/mL
(5)
(6)
-E
+E
Tensão (%)
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
(2)
(4)
+E
-E
EECL (μg/mL)
Tensão (%)
Fen Fen5,0
EECL
5,0
EECL
+E
+E -E
5min
1g
0,5 1,5 5,0
Fen Fen
0,5 1,5 5,0
EECL
EECL
5min
1g
+E
- E
0,5 1,5 5,0
Fen
Fen
0,5 1,5 5,0
EECL EECL
+E
- E
5min
1g
0,5 1,5 5,00,5 1,5 5,0
Fen
Fen
EECLEECL
+E
-E
5min
0,5g
24
A
B
Figura 3: Registros representativos dos efeitos provocados por EECL (µg/mL) em
anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10-
6,5
-10
-6
M), de aorta torácica com (+E)
e sem (-E) endotélio de (A) cobaia e de (B) camundongo.
Fen
-6
0,5 1,5
EECL
-E+E
Fen
-6
0,5 1,5
EECL
1g
5min
Fen
-6.5
3,0
EECL
-E
0.25g
Fen
-6.5
+E
5min
3,0
EECL
0, 2g
25
A
B
Figura 4: Atropina (Atr, 10
-7
) reverte os relaxamentos dependentes de endotélio
provocados por acetilcolina (Ach, 10
-6
), mas não aqueles provocados por EECL
(µg/mL) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
) de aorta torácica de
coelho (A) e rata (B). À esquerda, registros representativos e, à direita,
representação gráfica das médias±EPM, com o número de experimentos entre
parênteses. L=Lavagem.
Ach
Ach + Atr
EECL
EECL + Atr
0
50
100
(8)
(7)
(7)
(2)
Tensão (%)
Fen
Ach
Atr
L
Atr
Fen 0,5 1,5 5,0
EECL
5min
2g
Fen
Fen Ach
Atr
Atr
5,0
EECL
5min
1g
Ach
Ach + Atr
EECL
EECL + Atr
0
40
80
120
(3)
(3)
(3) (3)
Tensão (%)
26
3.3. DEMONSTRAÇÃO DE QUE OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR EECL
SÃO DEVIDOS À LIBERAÇÃO DE FATOR(ES) RELAXANTE(S) DO
ENDOTÉLIO QUE SE DIFUNDE(M) PARA AS CÉLULAS MUSCULARES
LISAS.
Em dois experimentos em “sanduíche” com tiras de aorta torácica
descendente de coelho (ver métodos), observamos relaxamentos induzidos por
acetilcolina e EECL apenas nas tiras sem endotélio (detectora) que foram
montadas juntas com tiras com endotélio (doadoras) (Figura 5). Assim, de forma
semelhante ao fenômeno descrito para a a, o EECL provoca liberação de EDRF.
Figura 5: Registro representativo dos efeitos provocados por EECL (µg/mL) e
acetilcolina (Ach) em preparações de tiras montadas em sanduíche, pré-contraídas
com fenilefrina (Fen), de aorta torácica descendente de coelho com a tira doadora
com (+E) e sem (-E) endotélio (ver métodos).
Tira Transversal (-E)
Tira Longitudinal (-E)
Tira Transversal (-E)
Tira Longitudinal (+E)
Tira Longitudinal (+E)
Fen -6.7
Fen -7 Fen -7Ach -6
1.,5 3,0
EECL
1g
5min
27
3.4. OS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR EECL SÃO DEVIDOS A LIBERAÇÃO
DE ÓXIDO NÍTRICO DO ENDOTÉLIO QUE SE DIFUNDE PARA AS CÉLULAS
MUSCULARES LISAS.
Existe um grande corpo de evidências de que relaxamentos dependentes do
endotélio induzidos por acetilcolina em várias espécies animais e leitos vasculares são
mediados por mecanismos dependentes de produção de prostaciclina (PGI
2
), NO e/ou
EDHF (Moncada, 1977; Furchgott e Zawadzki, 1980; Feletou, 2006). Assim,
verificamos o efeito do diclofenaco, um inibidor de COX, nos relaxamentos
dependentes do endotélio induzidos por EECL. Em anéis de aorta torácica de coelho, a
pré-incubação com diclofenaco (10 μM) não afetou significativamente os relaxamentos
provocados por acetilcolina (1,0 μM) e por EECL (1,5 μg/mL) (Figura 6A). O mesmo foi
verificado em anéis de aorta torácica de rata (n=2), onde diclofenaco não alterou os
relaxamentos provocados por acetilcolina (1,0 μM) ou EECL (5,0 μg/mL), como
representado no experimento da Figura 6B. Esses dados sugerem que a liberação de
prostaglandinas derivadas de COX não seria um fator de primordial importância nos
relaxamentos induzidos por EECL na aorta torácica de coelho e de rata.
Como já enfatizado na introdução, há evidências experimentais de que o EDRF é o
próprio NO em aorta de coelho e que sua formação no endotélio se daria a partir da L-
arginina, uma reação catalisada por NOS. Como já demonstramos a liberação de
EDRF pelo EECL, testamos se seus relaxamentos são afetados pela L-NNA, um
análogo da L-arginina e inibidor da NOS. Em anéis de aorta torácica de coelho ou rata
(Figura 7) os relaxamentos provocados por EECL (5,0 µg/mL) foram completamente
revertidos por L-NNA (100 µM). Além disso, L-NNA aumentou as contrações induzidas
por fenilefrina em cerca de 10% (n=5) em aorta de coelho e 45% (n=8) em aorta de
rata.
28
A
B
Figura 6: Efeito da pré-incubação com diclofenaco (Di, 10
-5
M) nos relaxamentos
provocados por EECL (µg/mL) e acetilcolina (Ach, 10
-6
M) em anéis, pré-contraídos
com fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica de (A) coelho e (B) e rata. À esquerda,
registros representativos e, à direita, representação gráfica das médias±EPM, com o
número de experimentos entre parênteses.
Ach
Ach+Di
EECL
EECL + Di
0
30
60
90
(5)
(8)
(11)
(11)
Tensão (%)
Fen Ach
1,5
EECL
1g
2min
Fen
Sem Di
Fen
Ach
1,5
EECL
Fen
Com Di
Fen
5,0
EECL
Fen
Ach
Sem Di
1,5 3,0 5,0
EEC L
5min
1g
Fen
Fen Ach
Com Di
29
A
B
Figura 7: L-NNA (10
-4
M) reverte os relaxamentos provocados por EECL (µg/mL) em
anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica de (A) coelho e
de (A) rata. À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica
das médias ± EPM, com o número de experimentos entre parênteses.
EECL
EECL+ L-NNA
0
40
80
120
(5)
(5)
Tensão (%)
EECL
EECL + L-NNA
0
40
80
120
160
(8)
Tensão (%)
(8)
Fen
L-NNA
0,5 1,5 5,0
EECL
2g
5min
L-NNA Fen 0,5 1,5 5,0
EECL
5min
0.5g
30
Como a L-NNA reverteu completamente o relaxamento causado por EECL, é
plausível sugerir que o EDRF liberado por EECL em anéis de aorta torácica de
coelho e rata é o NO sintetizado a partir da NOS. Portanto, nessas preparações,
se o NO for realmente o EDRF é de se esperar que hidroxicobalamina (B12) e
ODQ, respectivamente um seqüestrador químico do NO e um inibidor de GC,
também revertam os relaxamentos provocados por NO.
Em anéis de aorta torácica de coelho e de rata os relaxamentos provocados
por EECL (1,5-5,0 µg/mL) foram completamente revertidos pela B12 (10-100 µM)
(Figura 8 A e C). Também em anéis de aorta torácica de coelho, os relaxamentos
provocados por EECL (1,5-5,0 µg/mL) foram completamente revertidos por ODQ
(10 µM) (Figura 8 B). Da mesma forma como para a L-NNA, tanto B12 quanto
ODQ aumentaram as contrações induzidas por fenilefrina; estes aumentos foram,
respectivamente, de cerca de 30% (n=5) e 36% (n=6) em anéis de aorta torácica
de coelho. Já em anéis de aorta torácica de rata, B12 (10 µM) aumentou as
contrações causadas por fenilefrina (10
-7
M) em cerca de 38% (n=6).
3.5. EECL PROVOCA RELAXAMENTOS RESISTENTES AO DICLOFENACO E A
L-NNA
Em preparações onde foram descritos relaxamentos dependentes de
endotélio induzidos por drogas mesmo na presença de inibidores de COX e NOS,
tais como na aorta abdominal e artéria mesentérica de coelho, testamos se EECL
é capaz de relaxar essas artérias nessas condições. Em anéis de artérias
abdominais em solução de Krebs contendo diclofenaco (10 μM) e pré-incubados
(20 min) com L-NNA (100 μM), observamos que: (1) ocorrem aumentos de
contrações provocadas por fenilefrina; (2) os relaxamentos causados por EECL
são apenas reduzidos (Figura 9).
Nessas condições experimentais, também observamos relaxamentos
dependentes de endotélio induzidos por EECL em anéis de aorta mesentérica
superior (n=2) e de artéria carótida comum (n=2) de coelho (Figura 9).
Uma vez que nessas condições, estes relaxamentos têm sido atribuídos à
liberação de EDHF e que este necessita de cálcio, que funciona como um fator
31
chave nesse processo e também nos relaxamentos mediados por EDRF (NO),
sugerimos que o EECL possa estar estimulando o influxo de cálcio endotelial.
3.6. RELAXAMENTOS PROVOCADOS PELO EECL SÃO DEPENDENTES DE
CÁLCIO EXTRACELULAR
Realizamos alguns experimentos, com o intuito de examinar se a
concentração extracelular de cálcio é um fator determinante para os relaxamentos
provocados por EECL. Na ausência de cálcio na solução de Krebs necessitamos
adicionar uma concentração maior de fenilefrina para induzir contrações
significativas; isso é consistente com a necessidade de influxo de cálcio para que
haja contrações do músculo liso vascular provocadas por agonistas dos
receptores alfa-adrenérgicos do subtipo 1 (Hill, 2000). Tanto em anéis de aorta
torácica de coelho (n=2) como de rata (n=2), observamos uma redução nos
relaxamentos para o EECL (1.5 µg/mL) (Figura 10). Esses resultados sugerem
que o influxo de cálcio para células endoteliais é uma etapa limitante para os
relaxamentos provocados por EECL.
32
A
B
C
Figura 8: Vitamina B12 (B12, 10
-4
M) e ODQ (10
-5
M) reverteram os relaxamentos
provocados por EECL (µg/mL) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica de coelho (A e B). B12 (10
-5
M) reverte o relaxamento induzido
por EECL (µg/mL) em anéis, pré-contraídos com Fen (10
-7
M), de aorta torácica de
rata (C). À esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica
das médias±EPM, com o número de experimentos entre parênteses.
EECL
EECL +B12
0
40
80
120
160
(6)
(6)
Tensão (%)
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen
B12
5min
1g
Fen
2g
5min
B12
0,5 1,5 5,0
EECL
EECL
EECL +B12
0
40
80
120
160
(4)
(5)
Tensão (%)
EECL
EECL + ODQ
0
40
80
120
160
(5)
Tensão (%)
(5)
Fen ODQ
0,5 1,5 5,0
EECL
2g
5min
33
Figura 9: Efeito de diclofenaco (Di, 10
-5
M) + L-NNA (10
-4
M) nos relaxamentos
provocados por EECL (µg/mL) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen), de (A)
aorta abdominal, (B) artéria mesentérica superior e (C) artéria carótida de coelho. À
esquerda, registros representativos e, à direita, representação gráfica das
médias±EPM, com o número de experimentos entre parênteses.
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen-7
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen -7
Diclofenaco
-
+L-NNA
5 min
2g
Diclofenaco
Diclofenaco
-
+L
-
NNA
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen -5,7
Fen -6,0
0,5 1,5 5,0
EECL
5min
2g
Fen-6
0,5 1,5 3,0
EECL
5 min
2g
Fen-6
Diclofenaco
0,5 1,5 3,0
EECL
+L-NNA
A
B
C
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
*
*
EECL μ
g/mL
(%)Tensão
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen-7
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen -7
Diclofenaco
-
+L-NNA
5 min
2g
Diclofenaco
Diclofenaco
-
+L
-
NNA
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen -5,7
Fen -6,0
0,5 1,5 5,0
EECL
5min
2g
Fen-6
0,5 1,5 3,0
EECL
5 min
2g
Fen-6
Diclofenaco
0,5 1,5 3,0
EECL
+L-NNA
A
B
C
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen-7
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen -7
Diclofenaco
-
+L-NNA
5 min
2g
Diclofenaco
Diclofenaco
-
+L
-
NNA
0,5 1,5 5,0
EECL
Fen -5,7
Fen -6,0
0,5 1,5 5,0
EECL
5min
2g
Fen-6
0,5 1,5 3,0
EECL
5 min
2g
Fen-6
Diclofenaco
0,5 1,5 3,0
EECL
+L-NNA
A
B
C
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0
0
40
80
120
*
*
EECL μ
g/mL
(%)Tensão
34
Figura 10: Registro representativo do efeito da solução de Krebs sem (0 Ca++) ou
com cálcio (Ca++) nos relaxamentos provocados por EECL (µg/mL) em anéis, pré-
contraídos com fenilefrina (Fen) de aorta torácica de (A) coelho e (B) rata .
Fen
-6.5
1,5
EECL
0 Ca++
Fen
-7
1,5
EECL
5min
1g
Ca++
Fen
-6.5
Fen
-7
1,5
EECL
1,5
EECL
0,5g
5min
0 Ca++
Ca++
A
B
Fen
-6.5
1,5
EECL
0 Ca++
Fen
-7
1,5
EECL
5min
1g
Ca++
Fen
-6.5
Fen
-7
1,5
EECL
1,5
EECL
0,5g
5min
0 Ca++
Ca++
A
B
35
3.7. VERMELHO DE RUTÊNIO (VR) REVERTE OS RELAXAMENTOS
INDUZIDOS POR EECL
Uma vez verificado que os relaxamentos provocados pelo EECL são
reduzidos quando se incuba a preparação em solução de Krebs sem cálcio,
nossa próxima etapa foi testar se alguns bloqueadores de influxo de cátions para
o endotélio afetam estes relaxamentos. Numa triagem preliminar, adicionamos no
platô dos relaxamentos induzidos por EECL: gadolínio, SKF96365, níquel e
vermelho de rutênio (VR) em concentrações variadas entre 1-30 µM.
Apenas o VR reverteu significativamente os relaxamentos induzidos por
EECL, em anéis de aorta torácica de coelho, rata e camundongo (Figura 11).
Esses relaxamentos foram revertidos em cerca de 88±5 % (n=8) (aorta torácica
de rata), 81±5% (n=5) (aorta torácica de coelho) e 77±13% (n=4) (aorta torácica
de camundongo). Em um experimento controle em aorta torácica de coelho o VR
não reverteu os relaxamentos provocados pela acetilcolina (10
-6
M) e CPA (10
-5
M); e em aorta torácica de rata o VR também não reverteu os relaxamentos
causados por acetilcolina (10
-6
M), A23187(10
-6
M) e CPA (10
-6
M) (Figura 12).
Assim, sugerimos um determinado grau de especificidade de ação do VR versus
EECL.
Corroborando com a hipótese de que os relaxamentos provocados por EECL
são (1) devidos à liberação tanto de EDRF quanto de EDHF; (2) dependentes de
influxo cálcio e (3) são sensíveis ao VR, um bloqueador de canais não seletivos
para cátions, nosso próximo passo foi examinar se o VR seria capaz de reverter
os relaxamentos induzidos por EECL em experimentos do tipo “sanduíche” e em
experimentos com diclofenaco e L-NNA pré-incubados. Como observado na
Figura 13, o VR também é capaz de reverter os relaxamentos provocados por
EECL em experimentos sanduíche com tiras de aorta torácica de coelho (n=2) e
em experimentos em artérias mesentéricas superiores (n=2) na presença de
diclofenaco (10
-5
M) e L-NNA (10
-4
M)
36
A
B
C
Figura 11: O vermelho de rutênio (VR, 20 μM) reverte os relaxamentos provocados
por EECL (µg/mL) em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen), de aorta torácica
descendente de (A) coelho de (B) rata e de (C) camundongo. À esquerda, registros
representativos e, à direita, representação gráfica das médias±EPM, com o número
de experimentos entre parênteses.
Fen
-7.0
VR
1,5
EECL
2g
5min
Fen
-7.0
VR
5,0
EECL
1g
5min
-4.7
VR
L
3,0
EECL
VR
Fen
-6
0.25g
5min
EECL 1,5
ECL 1,5 + VR
0
50
100
Tensão (%)
(5)
(5)
EECL 5,0
EECL 5,0 + VR
0
50
100
(8)
(8)
Tensão (%)
EECL 3,0
E
CL 3,0 + VR
0
50
100
Tensão (%)
(4)
(4)
37
A
B
Figura 12: VR não reverte os relaxamentos provocados por (A) acetilcolina (Ach, 10
-6
M) e CPA (10
-5
M) em anéis pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
M) de aorta
torácica de coelho ou (B) por Ach (10
-6
), CPA e A23187 (10
-6
M) em anéis de aorta
torácica de rata. Registros representativos de experimentos únicos.
VR
-5,5
Ach
Fen
VR
-5
Ach
Fen
VR
-4,7
Ach
Fen
5min
1g
VR
-4,5
Ach
Fen
VR
-4.7
1,5
EECL
VR
-5
Fen
A23187
-6
VR
-5
CPA
Fen
-7 -6,5 -6
Fen
Ach
VR
-4,7
5min
2g
Fen
5,0
EECL
VR
-4,7
VR
-4,7
CPA
Fen
38
A
B
Figura 13: Vermelho de rutênio (VR, 10
-4,7
M) reverte os relaxamentos provocados por
EECL (µg/mL) em experimentos “sanduíche” de (A) tiras de aorta torácica e (B) em
anéis de artéria mesentérica de coelho na presença de diclofenaco (10 µM) e L-NNA
(100 µM), pré-contraídos com fenilefrina (Fen).
2g
5min
1,5 3,0
EECL
Fen -7
VR -4,7
Fen
-6
VR
-4,7
0,5 1,5 5,0
EECL
5min
2g
39
3.8. O 4α-PDD PROVOCA RELAXAMENTOS COM PERFIL FARMACOLÓGICO
SEMELHANTE AOS RELAXAMENTOS INDUZIDOS POR EECL
Vermelho de rutênio é uma droga que é capaz de bloquear de uma maneira
não seletiva canais de cátions. No endotélio, a natureza molecular de uma
diversidade de canais de cátions sensíveis ao VR tem sido identificada. Dentre
estes canais podemos citar os da família TRPV (Transient Receptor Potential
Vanilloid, em português Potencial Transitório de Receptor da família Vanilóide)
(TRPV1, TRPV2, TRPV3 e TRPV4). Assim, examinamos os efeitos de capsaicina
(10-30 µM); 2-difenil- boraniloxetanamina (2- APB, 1-30 µM); 11,12-didecanoato
de 4α-forbol (4α-PDD, 1-30 µM), respectivamente agonistas de TRPV1,
TRPV1/2/3 e TRPV4, em anéis de aorta de rata pré-contraídos com fenilefrina.
Em anéis de aorta torácica de rata, capsaicina (n=2) induziu um discreto
relaxamento que foi independente de endotélio, enquanto 2-APB (n=2) provocou
relaxamento dependente e independente de endotélio. Estes relaxamentos não
foram revertidos pelo VR, como mostrado em um experimento controle (Figura
14).
Em anéis de aorta torácica de rata, 4α-PDD induziu relaxamentos que se
assemelharam farmacologicamente aos relaxamentos produzidos pelo EECL,
uma vez que foram dependentes de endotélio e de concentração e, em um
experimento controle, foram revertidos por L-NNA (100 µM), B12 (30 µM) e ODQ
(10 µM) (Figura 15). Os relaxamentos provocados pelo 4α-PDD também foram
revertidos pelo VR (3 µM) (Figura 16). Uma diferença entre os relaxamentos por
4α-PDD e EECL foi a dessensibilização provocada por adição de concentrações
cumulativas de 4α-PDD. Por este motivo as adições dessa droga foram
realizadas de forma não cumulativa.
40
A
B
C
Figura 14: Registros representativos dos efeitos da (A) capsaicina e de (B) 2-APB em
anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica de rata com (+E)
ou sem (-E) endotélio e de vermelho de rutênio (VR, 10
-5
M) nos relaxamentos
provocados por capsaicina e 2-APB em anéis com endotélio.
2-APB
Fen
-5,0 -4,5
2-APB
Fen
-5,0
-4,5
5min
1g
-E+E
VR
-5,5
2-APB
Fen
-5,0
Capsaicina
- 5,0 - 5,5
Fen
VR
5min
1g
Capsaicina
Capsaicina
- 5,0 - 5,5
Fen
-E
+E
-5,0 -5,5
Fen
5min
1g
41
A
B
Figura 15: (A) Efeitos do 4α-PDD em anéis, pré-contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica de rata. À esquerda, registro representativo e, à direita, gráfico
das médias±EPM, com o número de experimentos representados entre parênteses. (B)
Registros representativos da reversão dos relaxamentos induzidos por 4α-PDD por L-
NNA, B12 e ODQ.
M
μ
-PDD 3,0
α
4
M
μ
-PDD 10
α
4
M
μ
-PDD 3,0
α
4
M
μ
-PDD 10
α
4
0
50
100
+E
+E
-E
-E
(5)
(5)
(4) (3)
Tensão (%)
Fen
Fen
Fen
4αPDD
-6,0
4αPDD
-6,0
4αPDD
-6,0
L-NNA
-4,0
B12
-4,5
ODQ
-5,0
1g
5 min
-E
-E
Fen
Fen
4αPDD
-5,5
4αPDD
-5,0
+E +E
PDD
α
α
4
PDD
Fen
4
-5,5
Fen
-5,0
42
A
B
Figura 16: Reversão dos relaxamentos provocados por 4α-PDD em anéis, pré-
contraídos com fenilefrina (Fen, 10
-7
M), de aorta torácica de rata. (A) Registros
representativos. (B) Gráfico das médias±EPM, com o número de experimentos entre
parênteses.
4 α -PDD
10 µM
Fen
VR
3,0 µM
1 g
5 min
Fen
4αPDD
3,0µM
VR
3,0µM
Fen
4αPDD
10µM
VR
3,0µM
M
μ
-PDD 3
α
4
M+ VR
μ
-PDD 3
α
4
M
μ
-PDD 10
α
4
M+VR
μ
-PDD 10
α
4
0
25
50
75
100
125
(5)
(4)
(5)
(4)
Tensão (%)
43
4. DISCUSSÃO
44
Durante muitos anos, o fato da acetilcolina ser capaz de provocar queda
aguda da pressão arterial em animais intactos e provocar contração em
preparações isoladas de vasos, intrigou tanto farmacologistas como fisiologistas. A
descoberta acidental feita por Furchgott de que os relaxamentos provocados pela
acetilcolina em anéis de aorta torácica descendente de coelho dependiam da
presença de células endoteliais intactas (Furchgott e Zawadski, 1980), foi um
grande marco não só na biologia vascular, mas também de forma geral em todas as
ciências médicas. Desde então têm sido descritas diversas substâncias que,
semelhantemente à acetilcolina, relaxam de forma dependente de endotélio. Neste
trabalho descrevemos os possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos
vasorelaxantes do extrato bruto de origem vegetal (Combretum leprosum).
O EECL (0.5-15 µg/mL) foi capaz de relaxar de forma dependente de endotélio
todas as preparações testadas. Esse relaxamento foi observado independente do
tipo de vaso testado (aorta torácica, aorta abdominal, artéria mesentérica e carótida
de coelho) ou da espécie de animal utilizada (aorta torácica de coelho, de rato, de
camundongo e de cobaia), não foi específico de gênero (rato ou rata e coelho ou
coelha) e também persistiu em situações fisiológicas e patológicas específicas (rata
gestante e rata hipertensa). Assim, diferenças quanto à espécie e tipo de vaso
estudado, como são observadas para outras drogas que relaxam de forma
dependente de endotélio (Cherry e cols., 1984), não estão envolvidas nas
preparações testadas, nos relaxamentos induzidos por EECL.
A resposta relaxante provocada por acetilcolina é antagonizada por atropina
(Furchgott e Zawadski, 1980), isso sugere que esse efeito é dependente da ativação
de receptores muscarínicos. Posteriormente; este receptor foi caracterizado
farmacologicamente como sendo o receptor muscarínico do tipo 3 no endotélio da
aorta de coelho (Jaiswal e cols. 1991). Assim, nos questionamos se a ativação dos
receptores muscarínicos estaria mediando os relaxamentos induzidos por EECL.
Essa hipótese foi descartada pelo fato de que a atropina reverteu apenas os
relaxamentos provocados por acetilcolina. Além do mais, tanto em anéis como em
tiras de aorta torácica de coelho sem endotélio a acetilcolina provoca contrações em
concentrações de ordem de micromolar (Furchgott e Zawadski, 1980), essas
contrações foram caracterizadas farmacologicamente como sendo mediadas por
45
receptor muscarínico do tipo 2 localizados no músculo liso (Jaiswal e cols., 1991);
como esse fenômeno não ocorre para o EECL, excluímos que a ativação de
receptores muscarínicos seja responsável pelo o mecanismo de ação vasorelaxante
provocado pelo EECL.
Embora não utilizamos antagonistas para receptores de histamina,
descartamos uma ação mediada por receptores para a histamina no extrato a partir
das respostas em diferentes preparações. Como os relaxamentos dependentes de
endotélio descritos para histamina foram observados apenas em aorta de rato, mas
não em coelho, cobaia e camundongo (van de Voorde e Leusen, 1984), e uma vez
que observamos que os relaxamentos causados pelo EECL em anéis de aorta
torácica de rato, de coelho, de cobaia e de camundongo; excluímos também que a
ativação de receptores de histamina seja responsável pelo o mecanismo de ação
vasorelaxante provocado pelo EECL. Também descartamos a presença de uma
ação mediada por receptores de bradicinina, uma vez que já foi verificado que a
bradicinina não induz relaxamento dependente de endotélio em aorta torácica de
coelho e nem de rato (Cherry e cols., 1984).
Uma vez observado que os relaxamentos induzidos por EECL dependiam do
endotélio, verificamos se esses relaxamentos eram realmente mediados por
substâncias liberados pelo o endotélio. Para isso, como descrito inicialmente para a
acetilcolina (Furchgott e Zawadski, 1980), utilizando experimentos do tipo
“sanduíche”, observamos que o EECL, da mesma forma que a acetilcolina, relaxou
as tiras sem endotélio quando montadas com uma tira com endotélio. Isso
claramente demonstra que o EECL promove relaxamento via liberação de
substância(s) relaxante(s) a partir do endotélio.
Os relaxamentos provocados pelo EECL, semelhantemente aos da acetilcolina,
não parecem ser mediados por produtos da COX, uma vez que não foram afetados
por diclofenaco, um inibidor desta enzima, em aorta torácica de coelho e de rata.
Assim, descartamos a hipótese de que algum produto derivado de COX seja a
substância primordial liberada pelo endotélio em resposta ao EECL.
O modo de ação dos inibidores da sintase de NO (NOS) na vasculatura tem
sido estudado amplamente e o consenso é que essas drogas agem como inibidores
competitivos. Há basicamente três isoformas de NOS: endotelial (eNOS ou NOS-3),
neuronial (nNOS ou NOS-1) e induzível (iNOS ou NOS-2) (MONCADA e cols.,
1997). A eNOS é uma enzima contendo o grupamento heme em sua estrutura,
46
localizada tanto na membrana plasmática quanto no citosol das células endoteliais
e é dependente do complexo cálcio/calmodulina. O N
w
-monometil-L-arginina (L-
NMMA) foi o primeiro análogo do L-arginina, com atividade inibidora da NOS, a ser
identificado. A partir deste, outros análogos com a mesma atividade inibitória foram
desenvolvidos (Moncada e cols.,1997). Em nossos estudos usamos um análogo da
L-arginina, N
w
-nitro-L-arginina (L-NNA), e na maioria dos experimentos onde
observamos reversão por L-NNA dos relaxamentos induzidos por EECL, 4α-PDD e
acetilcolina, essa reversão foi além da tensão inicial induzida pela fenilefrina, isso é
consistente com uma liberação basal de NO a partir de uma NOS. Esse fenômeno
já tem sido descrito em anéis de aorta de rata com endotélio funcional, não só para
estes análogos de L-arginina (Frew, 1993), mas também para outras drogas que
interferem com a via L-arginina/NO/GMPc, como hemoglobina (“varredor” de NO)
(Martin e cols.,1989) e ODQ (inibidor da guanilato ciclase) (Feelisch e cols., 1999).
A capacidade da hemoglobina em reverter os relaxamentos mediados por
EDRF se deve à alta afinidade do NO pelo grupo heme presente na estrutura da
hemoglobina (Kim e cols. 2000). Nesse estudo, utilizamos soluções aquosas de
vitamina B12 (hidroxicobalamina) para reverter os relaxamentos mediados por NO.
Tem sido descrito que esta substância reage avidamente com NO e quando o
cobalto contido na molécula da mesma se encontra com um número de oxidação
+2, essa ligação se torna mais forte (Sharma e cols., 2003). De mesma forma como
observado com os inibidores da NOS, a adição de vitamina B12 reverteu os
relaxamentos causados por EECL e acetilcolina acima da linha de contração inicial
induzida por fenilefrina.
Com a descoberta de um inibidor com maior seletividade para a guanilato
ciclase, o ODQ (Garthwaite e cols., 1995), a pesquisa da via L-arginina/NO/GMPc
ganhou impulso. Essa droga tem sido descrita como inibidora dos relaxamentos
provocados por acetilcolina, NO e por drogas doadoras de NO, como nitroprussiato
de sódio, em aorta torácica de rato (Feelisch e cols., 1999). De forma semelhante
aos inibidores da NOS e a vitamina B12, em todos os experimentos realizados com
ODQ, os relaxamentos induzidos por EECL ou acetilcolina foram revertidos acima
da linha de contração inicial induzida pela fenilefrina.
Como já enfatizado, a substância relaxante principal liberada pela acetilcolina
em aorta torácica de coelho e rato tem sido identificada como sendo o NO. Assim,
47
como os inibidores da NOS (L-NNA ou L-NAME), o inativador químico do NO
(vitamina B12) e o inibidor da guanilato ciclase (ODQ) reverteram completamente
os relaxamentos induzidos por EECL em aorta torácica de coelho e rata, sugerimos
que o extrato está ativando a via L-arginina/NO/GMPc.
Há um grande número de trabalhos demonstrando que outras substâncias
além de NO derivado de NOS e prostanóides derivados de COX (Feletou, 2006),
são responsáveis por mediar relaxamentos dependentes de endotélio; essa(s)
substância(s) corresponde(m) ao Fator(e) Hiperpolarizante(s) Derivado(s) Endotélio
(EDHF). Para o EECL, observamos estes relaxamentos em anéis de aorta
abdominal, artéria mesentérica e carótida de coelho; preparações que exibem
relaxamentos não mediados por produtos de NOS/COX. Em anéis de aorta
abdominal, artéria mesentérica e carótida de coelho, esse tipo de relaxamento
também tem sido descrito para acetilcolina na presença de indometacina (inibidor
de COX) e L-NAME (Cowan e cols.,1993 e Cohen e cols.,1997). Em anéis de
artéria carótida de coelho pré-contraidas com fenilefrina, os relaxamentos ou
hiperpolarizações provocados por acetilcolina se correlacionam com as
quantidades de NO medidos por microssensores químicos; tendo sido proposto que
o EDHF nessa preparação seja o próprio NO (Cohen e cols,,1997). Já em anéis de
artéria mesentérica de coelho, há evidências experimentais mostrando a
especificidade para o agonista empregado para induzir relaxamentos não mediados
por produtos de NOS e COX. Por exemplo, em preparações de anéis isolados, para
acetilcolina e A23187 esses relaxamentos são sensíveis aos inibidores de
fosfolipase A2 dependente de cálcio (AACOCF3 e ONO-RS-082) e potencializados
por timerosal, um inibidor de reacilação de ácidos graxos. Mas, em preparações de
artéria mesentérica montada em sanduíche, os relaxamentos provocados por
acetilcolina são abolidos L-NAME, enquanto aqueles provocados por A23187 não
são afetados (Hutcheson e cols., 1999). Ainda em anéis de artéria mesentérica de
coelho, o peptídeo Gap 27 (SRPTEKTIFII) inibe os relaxamentos não mediados por
produtos de NOS e COX provocados por acetilcolina, mas não aqueles provocados
pelo A23187. Por outro lado, em preparações em sanduíche de artéria mesentérica
de coelho esse peptídeo não inibe os relaxamentos resistentes aos inibidores de
NOS e COX induzidos por acetilcolina e A23187, (Hutcheson e cols., 1999). Assim,
tem sido sugerido que nessa artéria os relaxamentos resistentes a inibição de NOS
e COX induzidos por acetilcolina envolveriam um mecanismo via junções do tipo
48
Gap, enquanto que aqueles provocados por A23187 envolveriam a liberação de um
fator difusível a partir do endotélio. Se um ou outro destes mecanismos está
envolvido nos relaxamentos provocados pelo EECL em artérias mesentérica de
coelho precisa ser ainda investigado.
As observações acima nos sugerem que o mecanismo de ação primário do
EECL não é simplesmente por ativar a via L-arginina/NO/GMPc, mas sim por
estimular o endotélio a liberar fatores relaxantes. Um fenômeno comum às drogas
vasodilatadoras dependentes de endotélio é um aumento na concentração
intracelular de cálcio endotelial, que precede a liberação de tais substâncias
relaxantes (Adams e cols.,1989; Nilius e Droogmans, 2001). A observação de que
os relaxamentos provocados pelo EECL são reduzidos em solução sem cálcio,
sugere que o efeito relaxante do EECL requer o influxo de cálcio nas células
endoteliais.
Com o objetivo de caracterizar o(s) canal(is) responsáveis pelo suposto influxo
de cálcio, examinamos o efeito de algumas drogas que bloqueiam canais não
seletivos para cátions como vermelho de rutênio (VR), gadolinium (Clapham e
cols., 2005), SK&F96356 (Fukao e cols., 2001) e níquel (Tomioka e cols., 2001) nos
relaxamentos provocados por EECL. Em anéis de aorta torácica de rata, apenas o
VR foi capaz de reverter significativamente os relaxamentos provocados por EECL,
mas não àqueles provocados pela acetilcolina, A23187 e CPA. Quando testados
em artérias coronárias suínas, SK&F96356 e níquel bloquearam os relaxamentos,
os influxos de cálcio endoteliais e a hiperpolarização das células musculares lisas
provocados por bradicinina e CPA (Fukao e cols., 2001 e Tomioka e cols., 2001).
Em aorta de cobaia, SK&F96356 e níquel também inibiram os relaxamentos não
mediados por produtos de NOS/COX provocados pelo A23187 (Taniguchi e cols.,
1999). Assim, descartamos participação de canais para cátions sensíveis a
gadolinium, SK&F96356 e níquel nos relaxamentos provocados por EECL.
O VR é um corante policatiônico, bloqueador não seletivo de canais para
cátions (Amann e Maggi, 1991). Recentemente, a identificação molecular de uma
variedade de canais permeáveis ao cálcio e sensíveis ao VR tem sido desvendada,
dentre eles podemos destacar membros da família TRPV (Clapham, 2007). No
endotélio de variadas preparações vasculares tem sido descrita a presença de
ácido ribonucléico (RNA) mensageiro ou de proteína correspondente aos TRPV1,
TRPV2, TRPV3 e TRPV4 (Yao e cols., 2005). Assim, tornou-se plausível a hipótese
49
de que algum(ns) destes canais iônicos estariam envolvidos nos relaxamentos
induzidos por EECL. Para testar essa hipótese utilizamos três agonistas de TRPVs
sensíveis ao VR em preparações de aorta torácica de rata e comparamos seus
efeitos com os do EECL. Utilizando capsaicina (agonista TRPV1), 2-APB (agonista
TRPV1, TRPV2 e TRPV3) (Chung e cols., 2004; Hu e cols., 2004 e Clapham 2007)
e 12,13-didecanoato de 4α-forbol (4α-PDD; agonista TRPV4) (Watanabe,2002)
verificamos que apenas o 4α-PDD provocou relaxamentos com perfil farmacológico
semelhante aos relaxamentos induzidos por EECL. Ou seja, em aorta de rata os
relaxamentos provocados por 4α-PDD, da mesma forma que para o EECL, foram
revertidos por L-NNA, B12, ODQ e VR. Esses achados sugerem fortemente que o
EECL esteja exercendo seu efeito relaxante por um mecanismo semelhante ao do
4α-PDD.
O 4α-PDD é um derivado do forbol, uma classe química de compostos isolados
do óleo das sementes de Croton (Croton tiglium ), uma planta do gênero Euphorbia.
O 12,13-didecanoato de forbol (PDD) foi sintetizado inicialmente como um agente
promotor de tumor em pele de camundongo (Tucker 1974 e cols., Baird e cols.,
1971). Recentemente foi observado que um composto derivado do PDD, o 4α-PDD
era capaz de induzir correntes catiônicas e aumentar a concentração intracelular de
cálcio em células endoteliais isoladas de aorta de camundongo e que estes efeitos
foram mediados pela ativação de canais TRPV4 (Watanabe e cols., 2002). Os
mecanismos de ativação de TRPV4 são diversos; quimicamente, pode ser ativado
tanto por agonistas endógenos (ácido 5',6'-epoxieicosatrienóico) quanto por
exógenos (4α-PDD); estímulos físicos, tais como alterações de volume celular
(hiposmolaridade) e mudanças de temperatura (27-37°C) também ativam este
canal (Nilius e cols., 2003). O composto bisandrografolideo, isolado da planta
Andrographis paniculata, é capaz de induzir correntes catiônicas em cultura de
células expressando TRPV4, mas não em cultura de células expressando TRPV1,
TRPV2 ou TRPV3 e, da mesma forma que o 4α-PDD, também induz correntes
catiônicas em queratinócitos de camundongo (Smith e cols., 2006). Assim, não ė
improvável que o EECL contenha compostos com atividade agonista dos canais
TRPV4 .
Recentemente, Koehler e colaboradores observaram a expressão de RNA
mensageiro para TRPV4 em células endoteliais isoladas de artéria carótida e de
aorta de rato (Koehler e cols., 2006); e Hartmannsgruber e colaboradores
50
detectaram por imunohistoquímica e por Western blotting a presença de canais
TRPV4 em células endoteliais de artéria carótida de camundongo
(Hartmannsgruber e cols., 2007). Em nosso laboratório, experimentos preliminares
demonstraram a presença de canais TRPV4 em aorta de rata por
imunohistoquímica e por Western blotting.
Uma vasta informação com respeito à participação do endotélio no controle do
tônus vascular vem se acumulando desde a descoberta de Furchgott e os
mecanismos envolvidos nos efeitos vasorelaxantes de uma variedade de drogas
vem se somando a essa informação. Neste contexto, os canais TRPV4
representam uma nova classe de molécula com um papel essencial, tendo como
propriedade a capacidade de ser ativada por uma variedade de estímulos.
Corroborando com os efeitos de indução de correntes de cátions e elevações nas
concentrações intracelulares de cálcio provocados por 4α- PDD, foram verificado
relaxamentos dependentes de endotélio em artérias carótidas e artérias de
resistência do músculo gracilis de rato. Em artérias carótidas, estes relaxamentos
foram reduzidos por L-NNA; enquanto aqueles em artérias do músculo gracilis não
foram afetados por L-NNA e indometacina. Além do mais, em ambas preparações
esses relaxamentos foram inibidos por VR (Koehler e cols., 2006). Portanto,
semelhantemente ao que encontramos para o EECL em preparações de artérias de
coelho, o 4α- PDD provoca relaxamentos mediados por NO em artéria carótida de
rato, enquanto que em artérias de resistência do músculo gracilis de rato estes
relaxamentos são mediados plenamente por EDHF (Koehler e cols., 2006).
Uma prova mais contundente para a participação do TRPV4 nos relaxamentos
dependentes de endotélio provocados por 4α-PDD vem de estudos em
camundongos em que o gene para essa proteína foi deletado (animais knockout).
Nesses animais, os relaxamentos provocados por 4α-PDD em artérias carótida na
ausência ou presença de L-NNA e indometacina são abolidos (Hartmannsgruber e
cols., 2007). Além do mais, tanto as correntes catiônicas em células endoteliais da
artéria carótida quanto aumentos nas concentrações intracelulares de cálcio em
células endoteliais da aorta de camundongo, provocadas pelo 4α-PDD são abolidos
em animais knockout (Hartmannsgruber e cols., 2007 e Vriens e cols. 2005). Uma
vez que, em aorta de camundongo, observamos relaxamentos dependentes de
endotélio tanto para o EECL quanto para o 4α-PDD e ambos foram revertidos por
51
VR, a hipótese de que o canal TRPV4 endotelial esteja sendo ativado pelo EECL
se fortalece.
Endogenamente os canais TRPV4 endoteliais podem ser ativados por
derivados do ácido araquidônico via epoxigenases (ácidos epoxieicosatrienóicos)
(Vriens e cols. 2005); no entanto, se essa via estar sendo ativada pelo o EECL,
ainda permanece por ser estudada. Em experimentos preliminares realizados em
aorta de coelho, visando examinar a possível função dos metabólitos do ácido
araquidônico nos relaxamentos provocados por EECL, não observamos reversões
com ETYA (10-100 µM), inibidor de lipoxigenase e epoxigenase, ou com ácido 17-
octadecinóico (10-100 µM), inibidor de epoxigenase. Embora essas drogas possam
está exercendo seus efeitos inibitórios em enzimas presentes nas células
musculares lisas e assim mascarando seu efeito inibitório nos relaxamentos, não é
muito provável que o efeito relaxante do EECL seja devido à ativação dessas vias.
Além do mais, os efeitos do ácido araquidônico em anéis pré-contraídos de aorta
torácica de coelho com endotélio são contração e os relaxamentos só são
observados em presença de indometacina (Singer e Peach, 1983); e em anéis de
aorta de rata tem sido observado que ácido araquidônico provoca relaxamentos
dependentes de endotélio, mas sensíveis ao ETYA (Davies e Willians, 1984).
52
5. SUMÁRIO E CONCLUSÃO
53
Sumarizando nossos resultados, verificamos que o EECL é capaz de relaxar
artérias pré-contraídas com fenilefrina independente do tipo de vaso (aorta torácica
descendente, aorta abdominal, artéria carótida comum e artéria mesentérica
superior de coelho); preparações de aorta torácica de diferentes animais (coelho,
rato, cobaia e camundongo); independente de gênero (rato ou rata) e em diferentes
condições fisiológicas (rata normotensa e rata grávida) e patológicas (rata
espontaneamente hipertensa). Em todas essas preparações testadas, estes
relaxamentos foram abolidos pela não funcionalidade das células endoteliais e que
os mesmos foram revertidos por inibidores de NOS (L-NNA), pelo inativador químico
de NO (vitamina B12) e pelo inibidor da guanilato ciclase (ODQ). Esses achados
inicialmente nos levaram à interpretação de que os relaxamentos provocados por
EECL são mediados pela ativação da via L-arginina/NO/GMPc. A observação de
relaxamentos residuais provocados por EECL em preparações de aorta abdominal,
artéria mesentérica e artéria carótida de coelho na presença de diclofenaco e L-
NNA, levou-nos a reinterpretar os dados iniciais, já que o EECL poderia estar
simplesmente estimulando o endotélio para liberar fatores relaxantes. Desde que a
retirada de cálcio da solução de Krebs e o vermelho de rutênio deprimiram
fortemente os relaxamentos provocados pelo EECL, sugerimos que o influxo de
cálcio seria etapa crucial. Como o 4α-PDD mimetizou os efeitos do EECL,
sugerimos que os relaxamentos provocados pelo EECL seriam mediados pela
ativação de canais TRPV4 endoteliais. Assim, podemos inferir que o EECL possui
composto(s) que ativa(m) os canais TRPV4 endoteliais, levando a um aumento na
concentração intracelular de cálcio que, por sua vez, ativa a NOS e outros
mecanismos, com conseqüente produção de NO e EDHF, que seriam responsáveis
pelos relaxamentos causados por EECL.
54
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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