( PDF ) A composição corporal, resistência à leptina e função tireóidea são programadas em ratos cujas mães foram tratadas com leptina no início da lactação

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

POS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E

EXPERIMENTAL - CLINEX

Fernanda Pereira Toste

A COMPOSIÇÃO CORPORAL, RESISTÊNCIA À

LEPTINA E FUNÇÃO TIREÓIDEA SÃO

PROGRAMADAS EM RATOS CUJAS MÃES

FORAM TRATADAS COM LEPTINA NO INÍCIO DA

LACTAÇÃO

Rio de Janeiro

2008

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Fernanda Pereira Toste

A COMPOSIÇÃO CORPORAL, RESISTÊNCIA À

LEPTINA E FUNÇÃO TIREÓIDEA SÃO

PROGRAMADAS EM RATOS CUJAS MÃES

FORAM TRATADAS COM LEPTINA NO INÍCIO DA

LACTAÇÃO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Fisiopatologia Clinica e Experimental

da Faculdade de Ciências Médicas

da Universidade do Estado do Rio de Janeiro

para obtenção do grau de Mestre em Ciências

Orientadora: Profª Magna Cottini da Fonseca Passos

Co-orientadora: Profª Patrícia Cristina Lisboa

Rio de Janeiro

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Pereira Toste, F

A COMPOSIÇÃO CORPORAL, RESISTÊNCIA A LEPTINA E FUNÇÃO

TIREÓIDEA SÃO PROGRAMADAS EM RATOS CUJAS MÃES FORAM

TRATADAS COM LEPTINA NO INÍCIO DA LACTAÇÃO

/Fernanda Pereira

Toste - 2008.

Orientadores: Magna Cottini da Fonseca Passos e Patrícia

Cristina Lisboa .

Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de

Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas, Curso de Pós-

graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental.

1. Programação, leptina, resistência a leptina, função tireóidea, composição

corporal

Fernanda Pereira Toste

A COMPOSIÇÃO CORPORAL, RESISTÊNCIA A LEPTINA E FUNÇÃO

TIREÓIDEA SÃO PROGRAMADAS EM RATOS CUJAS MÃES FORAM

TRATADAS COM LEPTINA NO INÍCIO DA LACTAÇÃO

Aprovada em 27 de Março de 2008

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Fisiopatologia Clinica e

Experimental da Faculdade de Ciências Médicas

da Universidade do Estado do Rio de Janeiro

para obtenção do grau de Mestre em Ciências

Drª. Magna Cottini da Fonseca Passos

Dep. de Nutrição Aplicada do Instituto de Nutrição da UERJ (orientadora)

Drª. Patrícia Cristina Lisboa

Dep. de Ciências Fisiológicas do Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes

da UERJ (co-orientadora)

Banca Examinadora:

Profª Carmen Cabanelas Pazos de Moura

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ

Profª Célia Lopes da Costa

Instituto de Nutrição da UERJ

Prof. Egberto Gaspar de Moura

Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da UERJ

Suplentes:

Profa. Karen de Jesus Oliveira e Sanches

Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde da UEZO

Prof. Marco Aurélio Fonseca Passos

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da UERJ

Rio de Janeiro

2008

Dedicatória

Primeiramente a DEUS, por sentir sua presença em

todos os momentos.

Aos meus pais por sua dedicação, amor, incentivo e

orações.

Também à minha irmã pela amizade e por me auxiliar

sempre, principalmente em meus primeiros passos na

pesquisa.

E ao meu namorado pelo carinho, amor e força.

Agradecimentos

A professora Magna Cottini da Fonseca Passos por me aceitar como orientanda

e acreditar em mim, sem conhecer ainda meu trabalho, pela extrema dedicação e

orientação até nos momentos mais difíceis, pelas discussões científicas, pela paciência

e carinho, enfim, mais que uma orientadora: uma amiga;

A professora Patrícia Cristina Lisboa pela presença constante, pelo auxílio no

desenvolvimento da tese e estímulo a aprender cada vez mais, pela atenção sempre

prestada a mim, pela ajuda na dissertação e pela amizade, muito obrigada!

Ao professor Egberto Gaspar de Moura por me “abrir as portas” e permitir a

minha presença no laboratório, muito obrigada pela oportunidade! Por ser acima de

tudo um exemplo de dedicação e amor à pesquisa, refletindo em estímulos para seus

alunos e pela revisão da dissertação.

À Coordenação de Pós-Graduação em Fisiopatologia, pela oportunidade

concedida na realização deste trabalho.

A todos os alunos e ex-alunos do laboratório de fisiologia endócrina: Luciane,

José Ricardo, Sheila, Patrícia, Mabel, Regina, Simone, Gustavo, Gabriel, Stepham,

Márcia, Isis, Ananda, Nathália, Paula, Mariana, Carlos pela amizade e carinho. Em

especial às alunas Elaine, Isabela, Aline Fagundes, Ana Paula e Aline Troina por me

ajudarem sempre e pela amizade, que extrapola os domínios do laboratório.

Aos alunos e ex-alunos de iniciação científica, que foram imprescindíveis à

realização deste trabalho: Silvio, Ellen, Cíntia, Illana, Ândria, Ana Laura, Christina, Laila,

Aldir e Ulisses. Gostaria de agradecer especialmente a aluna Aline Rios pela sua

dedicação em meus experimentos.

Aos funcionários e técnicos Lauciene, Henrique e Andréa pela ajuda e

colaboração.

Ao bioterista Carlos Alberto pela atenção sempre prestada a mim, pelo cuidado

com os animais e organização do biotério.

A secretária do Clinex Amélia, por seu empenho e eficiência em todas as vezes

que foi solicitada por mim, obrigada!

Ao meu namorado Fabiano Izidoro Carneiro pelo amor, paciência, apoio,

amizade e presença, que foram fundamentais em todos os momentos.

A minha família e aos meus amigos que sempre torceram, acompanharam e me

incentivaram a sempre seguir em frente.

A DEUS por sua infinita bondade, amor e por me conceder essa vitória.

Melhor tentar e falhar, que preocupar-se a ver a vida

passar. É melhor tentar, ainda que em vão, que sentir-se

fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar,

que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz,

embora louco, que em conformidade viver.

Martin Luther King

RESUMO

PEREIRA TOSTE, Fernanda. A Composição corporal, resistência a leptina e

função tireóidea são programadas em ratos cujas mães foram tratadas com leptina no

início da lactação, 2008. Dissertação (Mestrado em ciências) - Faculdade de ciências

médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

O tratamento com leptina em ratos no início da lactação programa maior ingestão

alimentar (IA), massa corporal (MC) e massa magra (MM), disfunção tireóidea,

hiperleptinemia, resistência à sua ação central e menor expressão do receptor de

leptina (ObRb) aos 150 dias de vida. Comparado ao modelo de mães tratadas com

leptina nos 3 últimos dias da lactação, este

reproduziu parcialmente o fenótipo

metabólico da prole adulta, exceto pela maior massa de gordura visceral (MGV). Assim,

avaliamos o fenótipo metabólico da prole cujas mães receberam leptina no início da

lactação. Ao nascimento da prole, dividimos as ratas lactantes Wistar em: Leptina (LEP)

– tratada com leptina recombinante (8μg/100g, PC, sc) por 10 dias e Controle (C) –

tratada com salina nas mesmas condições. MC e IA de mães e filhotes foram

monitorados diariamente na lactação. No 21° dia da lactação, as mães foram

ordenhadas e sacrificadas. As mães LEP apresentaram menor MC (~6%, p<0,05) e

ingestão normal. A leptina de mães LEP foi normal em soro e leite, enquanto o T3 foi

normal no soro e maior no leite (+30%, p<0,05). Após o desmame, MC e IA da prole

foram acompanhados de 4 em 4 dias até os 180 dias. A prole LEP apresentou menor

MC na lactação (~5%, p<0,05) e maior MC (+10%, p<0,05) a partir do dia 69, enquanto

a IA foi maior (+17%, p<0,05) do dia 145 em diante. O teste do efeito anorexigênico da

leptina ocorreu aos 30 e 180 dias. Cada grupo foi subdividido em: CLEP e LEPLEP

tratados com leptina (0,5 mg/Kg/i.p. PC); CSAL e LEPSAL tratados com salina. O

sacrifício das proles ocorreu aos 21, 30 e 180 dias e obteve-se MGV, carcaça, sangue

(glicemia, leptina, T3, T4, TSH e insulina) e fígado (atividade GPDm). Os animais do

grupo LEP apresentaram maior T3 sérico aos 21 dias (p=0,06) e, já aos 30 dias de

idade, resistência ao efeito anorexigênico da leptina e menor T3 sérico (-20%, p<0,05).

Aos 180 dias apresentaram maior MGV (+57%, p<0,05) e gordura corporal (+40%,

p<0,05), resistência à leptina, maior T3 (+22%, p<0,05) e leptina séricos (+1,35 vezes,

p<0,05). Aos 30 e 180 dias, detectamos captação tireóidea de radioiodeto, T4 e TSH

séricos normais e menor atividade GPDm (-42% e -57%, p<0,05, respectivamente).

Assim, a hiperleptinemia materna no início da lactação programa a função tireóidea e

resistência a leptina aos 30 e 180 dias, bem como hiperleptinemia e o desenvolvimento

de obesidade na prole aos 180 dias, provavelmente devido a maior transferência de

leptina pelo leite. Portanto, os níveis de leptina no início da lactação parecem ser

determinantes da via fisiológica que regula o balanço energético na idade adulta. Ainda,

sugerimos que os efeitos da programação neonatal com leptina dependem da via pela

qual este hormônio alcança a prole. O modelo do presente estudo parece ser o mais

fisiológico e reproduz quase que completamente os efeitos da programação na vida

adulta pelo tratamento materno com leptina ao final da lactação e parcialmente os

efeitos do modelo de injeção de leptina diretamente nos filhotes.

Palavras chaves: Programação, leptina, resistência a leptina, função tireóidea,

composição corporal, lactação.

ABSTRACT

Pup´s leptin injection on the first 10 days of lactation programmes for higher food

intake (FI), body mass (BM), lean mass, thyroid function, hyperleptinemia and resistance

to its action and lower leptin receptor (ObRb) expression on 150 days-old rats. When

mothers were leptin-treated on the last 3 days of lactation, it seems to reproduce

partially this programming effect, except for higher visceral fat mass (VFM). So, we

evaluated the offspring metabolic phenotype when the mothers were treated with leptin

in the first 10 days of lactation. On birth, the lactating Wistar rats were divided into:

Leptin (LEP) – treated with recombinant leptin (8mg/100g, PC, sc) for the first 10 days of

lactation and Control (C) – saline-treated in the same conditions. The mothers´ BM and

FI were monitored daily and they were milked at the 21

day of lactation. LEP mothers

had lower BM during lactation (~6%, p <0.05) and normal FI. The mothers’ sacrifice

occurred to the end of lactation. The leptin concentration of LEP mothers was normal in

serum and milk, while T

was normal in serum and higher in milk (+30%, p <0.05). The

offspring BM and FI was monitored daily and accompanied by 4 on 4 days after weaning

until 180 days of age. The LEP offspring had lower BM during lactation (~5%, p<0.05)

and from the day 69 onward higher BM (+10%, p<0.05), while the FI was higher (+17%,

p<0.05) at day 145 onward. The leptin resistance test was performed at 30 and 180

days. Both group was subdivided into: CLEP and LEPLEP treated with leptin (0.5 mg /

kg / ip PC); CSAL and LEPSAL treated with saline. The animals were sacrificed at 21,

30 and 180 days. We collected the VFM, carcass, blood (glycemia, leptin, total T3 and

T4, TSH, insulin) and liver (GPDm activity). LEP offspring had higher T3 at 21 days, but

not significant (p = 0.06) and when they were 30 days-old they already present leptin

resistance and lower serum T3 (-20%,p<0.05). At 180 days they had higher VFM (+57%,

p<0.05), total body fat (+40%, p<0.05), leptin resistance, hyperleptinemia (+1,35x,

p<0.05) with normal

125

I thyroid uptake, serum T4 and TSH and lower GPDm activity at

30 and 180 day (-42% and -57%,p< 0.05 respectively). So, the mother's

hyperleptinaemia in the beginning of lactation programs as early as the 30 days-old

offspring: leptin resistance and hypothyroidism, probably by a higher leptin transfer

through the milk. We suggested that the levels of leptin in early lactation are

determinants of the physiological regulation of energy balance in adulthood. We suggest

that the programming effects are dependent on the way

that leptin reaches the offspring. The present study seems more physiological and

reproduces almost completely the programming effect in the adulthood when the

mothers were leptin-injected at the end of lactation and, partially reproduces the effects

when leptin was directally injected in the pups.

Keywords: Programming, leptin, leptin resistance, thyroid function, body composition.

Lista de Tabelas

Tabela

Página

1 Resumo dos dados das mães tratadas com leptina

nos 10 primeiros dias de lactação

2 Resumo dos Dados dos filhotes cujas mães foram tratadas

com leptina nos 10 primeiros dias de lactação, comparados

aos seus respectivos controles nas mesmas idades.

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 Representação esquemática das ações da leptina 23

Figura 2 Ingestão e peso corporal das ratas lactantes tratadas com

leptina nos 10 primeiros dias da lactação;

Figura 3 Concentrações de leptina no soro e leite de ratas lactantes

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias de lactação;

Figura 4 Concentrações de T3 no soro e no leite de ratas lactantes

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias de lactação;

Figura 5 Ingestão e peso corporal da prole de mães tratadas com leptina

nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 6 Quantidade de MGV da prole aos 21,30 e 180 dias de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 7 Quantidade total de gordura da prole aos 21,30 e 180 dias de

mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 8 Quantidade total de proteína da prole aos 21,30 e 180 dias de

mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 9 Quantidade total de água da prole aos 21,30 e 180 dias de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 10 Quantidade total de cinzas da prole aos 21,30 e 180 dias de

mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 11 Leptinemia da prole aos 21,30 e 180 dias de mães tratadas com

leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 12 Insulinemia da prole aos 21,30 e 180 dias de mães tratadas com

leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 13 Glicemia da prole aos 21,30 e 180 dias de mães tratadas com

leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 14 Índice de resistência a insulina da prole, aos 180 dias, de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 15 Ingestão de ração ajustada por 100g de peso corporal da prole 61

aos 30 dias após administração de leptina ou salina, de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 16 Ingestão de ração ajustada por 100g de peso corporal da prole

aos 180 dias após administração de leptina ou salina, de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 17 Captação de

125

I pela tireóide da prole, aos 180 dias, de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 18 Concentração sérica de T3 total da prole aos 21,30 e 180 dias

de mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 19 Concentração sérica de T4 total da prole aos 21,30 e 180 dias

de mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 20 Concentração sérica de TSH da prole aos 21,30 e 180 dias de

mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

Figura 21 Atividade da enzima GPDm da prole aos 21,30 e 180 dias de

mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AgRP Proteína relacionada à agouti

AMPc adenosina monofosfato cíclico

α-MSH Hormônio α-melanócito estimulante (melanocyte stimulating

hormone)

BSA albumina bovina sérica (bovine serum albumin)

BPK Tampão fosfato de potássio (Buffer Phosphate K)

C Controle

CART Fator transcrito regulado por cocaína e anfetamina (cocaine-

anphetamine regulate transcript)

CLEP Controle Leptina

CRH Hormônio liberador de corticotropina (corticotropin releasing

hormone)

CSAL Controle salina

DIT Diiodotirosina

D1 Iodotironina desiodase tipo 1

D2 Iodotironina desiodase tipo 2

D3 Iodotironina desiodase tipo 3

EPM Erro Padrão da Média

GLUT4 Transportador de glicose tipo 4

GLUT8 Transportador de glicose tipo 8

α GPDm

α-glicerol fosfato desidrogenase mitocondrial

HTs Hormônios tireoideanos

i.c.v Intracerebroventricular

IMC índice de massa corporal

i.p. intra-peritoneal

JAK tirosina kinase janus kinase

Kda Kilodaltons

LEP LEPTINA

LEPLEP Grupo LEP que recebeu leptina

LEPSAL Grupo LEP que recebeu salina

MCH Hormônio concentrador de melanina (melanocyte concentration

hormone)

MC4R receptores de melanocortina 4

MGV massa de gordura visceral

MIT Monoiodotirosina

NIS co-transportador de Na

NPY neuropeptídeo Y

Ob gene da obesidade

Ob-R Receptor de leptina

PBS tampão fosfato em salina (phosphate buffer saline)

POMC Pró-opiomelanocortina

PTU 6-propil-2-tiouracil

RIE Radioimunoensaio

RNAm ácido ribonucléico mensageiro

Rpm Rotações por minuto

3-3’-5´- triiodotironina reversa

s.c. subcutânea

SNC sistema nervoso central

SOCS-3 supressores de sinalização de citocinas 3 (supressors of cytocine

signaling 3)

STAT Signal Transducers and Activators of Transcription

3,5,3’- triiodotironina

3,5,3’,5’- tetraiodotironina (tiroxina)

TAM tecido adiposo marrom

TBG globulina ligadora de tiroxina (thyroxine binding globulin)

TCA ácido tricloroacético

Tg Tireoglobulina

TNF-α fator de necrose tumoral α (tumor necrose factor)

TOX oxidase tireoideana (thyroid oxidase)

TPO Tireoperoxidase (thyoid peroxidase)

TRH hormônio liberador de tireotrofina (thyroid releasing hormone)

TSH Tireotrofina (thyroid stimulating hormone)

TTR Transtirretina

Sumário

Página

INTRODUÇÃO 16

1- PROGRAMAÇÃO METABÓLICA 19

1.1-Programação nutricional 19

1.2 - Leptina e programação do peso corporal 20

2-LEPTINA 22

2.1-Mediadores da ação da leptina 24

2.2 - Resistência à leptina 26

3- INSULINA E LEPTINA 27

4- LEPTINA E LACTAÇÃO 30

5-FUNÇÃO TIREÓIDEA E LEPTINA 32

MATERIAIS E MÉTODOS 39

1-ANIMAIS 40

2- AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL 40

3- TESTE DO EFEITO ANOREXIGÊNICO DA LEPTINA 42

4- DETERMINAÇÃO HORMONAL E GLICEMIA 42

5 CAPTAÇÃO DE RADIOIODO TIREÓIDEO 43

6- ATIVIDADE GPDm HEPÁTICA 43

ANÁLISE ESTATÍSTICA 44

RESULTADOS 45

DISCUSSÃO 71

CONCLUSÕES 80

REFERÊNCIAS 82

Introdução

A obesidade é o principal fator de risco para o desenvolvimento de hipertensão

e doenças cardiovasculares em seres humanos (Friedman, 2000; Kopelman, 2000). A

obesidade e as doenças metabólicas têm se tornado o maior problema de saúde

pública na sociedade moderna e são comumente atribuídas ao estilo de vida e fatores

dietéticos. Segundo pesquisa realizada pelo IBGE, de análise da disponibilidade

domiciliar de alimentos e do estado nutricional no Brasil de 2002 a 2003, cerca de 40%

dos adultos brasileiros de ambos os sexos apresentam sobrepeso (IMC igual ou maior

que 25 kg/m

As doenças metabólicas, que se manifestam na vida adulta, podem ter suas

origens antes do nascimento. A hipótese da “origem fetal” baseia-se em estudos

epidemiológicos, nos quais o peso ao nascer foi relacionado a desordens metabólicas

ou cardiovasculares na idade adulta (Moura & Passos, 2005). A gestação e a lactação

são períodos de intenso crescimento, replicação e diferenciação celular (Simmons,

2005). Estes processos são sensíveis a alterações do meio na vida intrauterina e

neonatal, resultando em distúrbios estruturais e funcionais que podem se tornar

permanentes na idade adulta. O período em que o organismo é susceptível a

intervenções nutricionais, hormonais ou ambientais é denominado período crítico de

programação (Lucas, 1994).

Têm sido realizados vários estudos com animais experimentais para testar a

hipótese da “origem fetal” ou “programação”, perturbações tais como desnutrição

materna moderada ou severa ou exposição hormonal na gestação e/ou lactação têm

sido impostas. A grande maioria destes estudos confirma que estas perturbações

levam ao desenvolvimento

de excesso de peso (Passos et al., 2000), diminuição da

sensibilidade a insulina (Holemans et al., 1996), aumento da pressão arterial (Langley-

Evans et al., 1996; Woodall et al., 1996; Tonkiss et al. 1998) disfunções no eixo

hipotálamo-hipófise tireóide (Moura et al., 2008) e resistência à ação anorexigênica da

leptina (Passos et al., 2002, Passos et al., 2004, Vicente et al, 2004, Lins et al., 2005,

Toste et al., 2006 a, Bonomo et al., 2007).

A leptina é um hormônio, de ação central e periférica, secretado principalmente

pelo tecido adiposo, mas também em outros tecidos, como o músculo esquelético

(Wang et al., 1998), envolvido com o metabolismo energético, regulação do apetite e

peso corporal, além de exercer função trófica sobre alguns tecidos (Bouret et al., 2004;

Ahima, 2005). Em camundongos e em seres humanos, a ausência total de leptina

causa hiperfagia persistente e gasto energético diminuído, resultando em obesidade

severa (Friedman & Halaas, 1998). Além disso, a leptina tem sido relacionada à

regulação da reprodução, função tireóidea e adrenal e crescimento (Ahima et al., 2000).

Desenvolvemos diversos modelos experimentais de programação com o

objetivo de elucidar os mecanismos pelo qual uma determinada prole, que sofre

interferência nutricional ou hormonal na lactação, desenvolve mecanismos

adaptativos para garantir sua sobrevivência até a idade adulta. A desnutrição

materna na lactação programa o peso corporal, função tireóidea e resistência à ação

anorexigênica da leptina da prole na idade adulta (Passos et al., 2000, Passos et al.,

2002, Dutra et al., 2003, Passos et al., 2004). A programação é diferente de acordo

com o tipo de desnutrição em que a mãe é submetida, pois os animais cujas mães

sofreram restrição protéica (RP) na lactação apresentaram baixo peso corporal do

desmame aos 6 meses de idade. Enquanto, o peso corporal da prole de ratas

lactantes em restrição calórica (RC) ultrapassa o peso corporal dos controles aos 3

meses de idade, permanecendo acima do peso até os 6 meses de idade. Além disto,

esses animais não respondem à ação anorexigênica da leptina, ou seja, são

resistentes à ação central deste hormônio (Passos et al., 2004).

Os filhotes de mães desnutridas, RC ou RP

, apresentaram menores

concentrações de leptina sérica no início e meados da lactação e maior ao desmame

(Teixeira et al., 2002). A leptina está presente no leite humano, e suas concentrações

estão relacionadas com a circulação e com a adiposidade materna (Casabiell et al.,

1997; Houseknecht et al., 1997). Então, surgiu a hipótese de que a hiperleptinemia

destes filhotes ao desmame poderia programar a regulação do peso corporal e

ingestão alimentar. Baseado nestes achados, desenvolvemos um outro modelo

experimental onde os filhotes foram injetados com leptina no período neonatal (de

Oliveira Cravo et al., 2002). Neste estudo, a hiperleptinemia, tanto nos 10 primeiros

quanto nos 10 últimos dias de lactação, está associada com maior concentração de

leptina sérica aos 150 dias de idade e, paradoxalmente, um aumento da ingestão

alimentar e peso corporal.

Utilizando este modelo, demonstramos recentemente que o tratamento com

leptina no início da lactação (dez primeiros dias) programa para maior ingestão e

sobrepeso, inclusive com aumento de massa magra, aumento da leptina sérica e

resistência à sua ação anorexigênica, devido à redução da expressão dos receptores

hipotalâmicos para leptina (Toste et al., 2006a) e também para disfunção tireóidea

(Toste et al., 2006b). Demonstramos também em um outro modelo onde as mães foram

tratadas com leptina nos três últimos dias da lactação, que

sua prole apresenta o

fenótipo metabólico parecido na idade adulta, exceto pela composição corporal, em que

o primeiro tem um maior ganho de proteína e este último, maior ganho de gordura (Lins

et al., 2005). Porém, não conhecemos ainda o fenótipo metabólico apresentado pela

prole cujas mães são tratadas com leptina no início da lactação. Assim, desenvolvemos,

no presente estudo, um outro modelo de hiperleptinemia neonatal, onde as ratas

lactantes serão tratadas com leptina nos 10 primeiros dias de lactação e a avaliação

dos parâmetros metabólicos da prole serão analisados aos 21, 30 e 180 dias de idade.

Nossa hipótese é de que a leptina no início da lactação seja determinante da via

fisiológica que regula o balanço energético na idade adulta.

Os dados obtidos neste estudo poderão fornecer importantes explicações para

os efeitos em longo prazo da hiperleptinemia na lactação, além de reforçar o fenômeno

da programação metabólica. Poderá ainda ser de grande importância na compreensão

da obesidade e desenvolvimento da Síndrome Metabólica que tem sido um grande

problema de saúde pública em nosso país.

1-PROGRAMAÇÃO METABÓLICA

A programação baseia-se na observação de que alterações ambientais, assim

como nutricionais e hormonais (de Oliveira Cravo et al., 2002; Passos et al., 2002; Dutra

et al., 2003; Teixeira et al., 2003; Passos et al., 2004; Moura & Passos, 2005; Lins et al.,

2005; Toste et al., 2006a; Toste et al., 2006b) em períodos críticos da vida, são fatores

que redefinem o desenvolvimento, quando os tecidos ainda têm alguma plasticidade e

estão na fase de maior proliferação e diferenciação (Moura e Passos, 2005).

1.1- Programação Nutricional

Baker (1993) propôs a hipótese da “origem fetal”, que aponta a nutrição fetal

deficiente como causa de adaptações que programam a propensão futura à

obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares. A nutrição pós-natal também tem

sido relacionada à programação de doenças na vida adulta (Martorell et al., 2001).

Foram demonstradas disfunções endócrinas em animais adultos cujas mães

foram submetidas à desnutrição protéica na lactação e/ ou gestação. A desnutrição

protéica materna nos primeiros dias de lactação está associada com diminuição na

secreção e tolerância à glicose (Bertin et al., 1999; Ozanne & Hales, 2002). Animais

adultos cujas mães foram submetidas à desnutrição protéica na gestação apresentaram

um aumento da gliconeogênese (Burns et al., 1997) e redução de insulina pancreática e

de células β pancreáticas. Este menor desenvolvimento das células β pancreáticas

pode causar intolerância à glicose (Bertin et al., 1999).

Foi demonstrado em estudo recente, programação por deficiência de vitaminas.

As proles de ratas que sofreram restrição de vitaminas (mix de vitaminas: ácido

nicotínico, piridoxina, tiamina, riboflavina, ácido fólico, biotina, vitaminas B12, E, A, D3,

K1) na gestação e lactação apresentaram, aos 6 meses de idade, aumento de gordura

corporal e de adiposidade abdominal, com menor adiponectina e maior leptina sérica

(Lagishetty et al., 2007).

Foi demonstrado, em nosso laboratório, que o estado nutricional materno na

lactação programa também a função tireóidea da prole adulta. A prole de mães

submetidas à restrição protéica (RP) na lactação apresentou elevada captação tireóidea

de iodo e maior concentração de T3 sérico na idade adulta (180 dias), enquanto a prole,

de mães submetidas à restrição calórica, apresentou apenas maior T3 sérico (Passos et

al., 2002). Estas alterações podem estar associadas às profundas modificações na

função tireóidea materna na lactação, tais como maior secreção de iodeto pelo leite nas

mães desnutridas ao final da lactação (Passos et al, 2001) e maior quantidade de T3 no

leite de mães RP (Passos et al., 2001), desde o quarto dia da lactação. Estes achados

sugerem uma adaptação materna no sentido de normalizar o T3 sérico dos filhotes no

início da lactação.

1.2- Leptina e programação do peso corporal

Estudos com injeção de leptina, no início ou final da lactação, mostraram estar

associados com hiperleptinemia na idade adulta, maior peso corporal e maior ingestão

alimentar (de Oliveira Cravo et al., 2002). Encontramos em ratos tratados com leptina

nos 10 primeiros dias da lactação, uma resistência à ação anorexigênica da leptina e

menor expressão de seu receptor hipotalâmico, explicando o aumento de peso e

ingestão, mesmo na presença de hiperleptinemia (Toste et al., 2006a). No estudo onde

as mães receberam leptina nos três últimos dias da lactação, encontramos resultados

semelhantes aos 180 dias de idade, sugerindo que a leptina é transferida via leite

materno e programa maior peso corporal e hiperfagia (Lins et al., 2005). No estudo de

Toste et al. (2006 a) o ganho de peso foi mais tardio que no de Lins et al. (2005), além

disso, o maior peso corporal encontrado no tratamento realizado em ratos no início da

lactação foi acompanhado de maior massa magra (Toste et al., 2006 a), diferente de

quando o tratamento foi feito nas mães ao final da lactação, em que o maior peso foi

devido ao maior conteúdo de gordura corporal (Lins et al., 2005). Demonstrando que os

efeitos da leptina transferida via leite materno são mais deletérios, quando comparados

ao tratamento com leptina diretamente nos filhotes.

Outros autores também têm estudado o efeito da leptina na programação do

peso corporal. Stocker et al. (2004) verificaram que a administração de leptina a partir

do 14º dia de gestação e na lactação em ratas submetidas à restrição protéica, reduz a

suscetibilidade ao ganho de peso e a resistência à insulina induzido por dieta

hiperlipídica na prole adulta. Usando este mesmo protocolo de tratamento com leptina

em mães com estado nutricional normal, Stocker et al. (2007), também observaram

menor ganho de peso, menor peso da gordura retroperitoneal e intraperitoneal e maior

tolerância à glicose e à insulina na prole adulta que recebeu dieta hiperlipídica.

Também observaram que o gasto energético foi maior aos três meses de idade na prole

fêmea cujas mães receberam leptina na gestação e lactação. Assim, estes dados

indicam que a leptina na gestação e lactação podem afetar o desenvolvimento dos

sistemas que regulam a homeostase energética.

Resultados semelhantes foram encontrados por Vickers et al. (2005), que

observaram que a administração de leptina, do 3º ao 13º dia, na prole fêmea de ratas

submetidas à restrição calórica na gestação, normalizou o ganho de peso, a ingestão

calórica, bem como a quantidade de gordura corporal desses animais na idade adulta,

quando comparado à prole das mães desnutridas que recebeu salina. Neste estudo, o

tratamento neonatal com leptina não produziu alterações na prole adulta das mães que

não foram desnutridas na gestação.

Recentemente, Vickers et al. (2008) mostraram que o tratamento com leptina,

no mesmo período do estudo anterior, em ratos machos cujas mães receberam dieta

normal na gestação programou para maior peso corporal, hiperinsulinemia e aumento

da adiposidade corporal total, em comparação aos controles tratados com salina. Estes

dados reforçam ainda mais a importância da leptina na determinação da homeostase

energética a longo prazo e sugerem que os efeitos da leptina podem ser modulados por

sexo e estado nutricional pré e pós-natal. Ao contrário, Picó et al. (2007) demonstraram

que a suplementação oral de leptina em ratos machos na lactação, promove na idade

adulta, menor peso corporal, menor conteúdo de gordura corporal, menor consumo

calórico e hipoleptinemia em animais que receberam dieta normal ou dieta hiperlipídica,

sugerindo ser a via de administração, também importante para o imprinting causado

pela leptina.

Apesar de contraditórios, estes resultados reforçam o importante papel da

leptina no estágio precoce da vida neonatal na regulação do peso corporal e na

prevenção ou gênese da obesidade na idade adulta.

2-LEPTINA

A leptina (do grego leptos, que significa magro) é um polipeptídio de 16 KDa e

167 aminoácidos, produzido pelo gene da obesidade (ob) e sintetizado principalmente

pelo adipócito. Também foi detectada sua expressão em placenta (Senaris et al., 1997),

estômago (Bado et al., 1998), músculo esquelético (Wang et al.,1998), epitélio mamário

(Smith-Kirwin et al., 1998) e hipófise (Morash et al.,1999; Jin et al., 2000) de ratos

normais.

A leptina é um importante sinalizador do estado nutricional, interagindo com

receptores hipotalâmicos para manutenção da homeostase do peso corporal e balanço

energético (Camplield et al., 1995; Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995;

Weigle et al., 1995; Friedman et al., 1998). Está envolvida em várias funções

fisiológicas, incluindo ingestão de alimentos e regulação do peso corporal, reprodução,

formação óssea e angiogênese (Sahu, 2004) e função tireóidea (Zimmermann-Belsing,

2003). A ausência total de leptina, tanto em camundongos quanto em seres humanos,

causa hiperfagia persistente e gasto energético diminuído, resultando em obesidade

severa (Friedman & Halaas, 1998).

Figura 1: Representação esquemática das ações da leptina: Leptina atua diretamente ou

ativando centros específicos no sistema nervoso central para diminuir a ingestão alimentar,

aumentar gasto energético, influenciar no metabolismo da glicose e da gordura, e alterar função

neuroendócrina (Adaptado de Mantzoros,1999).

As concentrações séricas de leptina aumentam exponencialmente com o

aumento do tecido adiposo e refletem estados de desequilíbrio energético; no jejum

prolongado ocorre diminuição significativa da leptina plasmática, enquanto na

superalimentação ocorre aumento (Lee et al., 2002). Face a estas alterações na

leptinemia em resposta ao jejum e superalimentação, tem sido sugerido que a leptina

possa servir como um sinal para informar ao cérebro, o estado do balanço energético

(Ahima et al., 2000).

A leptina, após atravessar a barreira hemato-encefálica, se liga ao seu receptor

(ObRb) no hipotálamo e desencadeia mecanismos de sinalização intracelular

dependentes principalmente da ativação da via JAK-STAT (Myers, 2004).

O receptor de leptina (OB-R) é um membro da família da classe 1 dos

receptores de citocinas (Tartaglia, 1997). Foi primeiramente isolado por clonagem, no

plexus coróide em ratos (Tartaglia et al., 1995). Já foram identificadas seis isoformas

desse receptor para leptina, Ob-Ra, Ob-Rb, Ob-Rc, Ob-Rd, Ob-Re e Ob-Rf (Chua et al.,

1996; Lee et al., 1996; Wang et al., 1998). Cinco dessas isoformas descritas até agora

(Ob-Ra; Ob-Rb; Ob-Rc; Ob-Rd; Ob-Rf) têm domínios transmembranas. Entretanto,

apenas a isoforma longa (Ob-Rb), altamente expressa em regiões hipotalâmicas que

expressam um ou mais neuropeptídeos e neurotransmissores que regulam a ingestão

alimentar e/ou peso corporal, balanço energético e função neuroendócrina, contêm

todos os sítios intracelulares necessários para a ativação da via de transdução

sinalizada por JAK-STAT (Vaisse et al., 1996; Ghilardi et al., 1996; Bjorbaek et al.,

1997). O Ob-Rb tem o mais longo domínio citoplasmático (302 aminoácidos). Foi

observado em vários locais do hipotálamo, incluindo núcleo arqueado, ventromedial,

paraventricular, dorsomedial e hipotálamo lateral, que são conhecidos por regular a

ingestão de alimentos e a homeostase energética (Trayhurn et al., 1999).

2.1- Mediadores da ação da leptina

O hipotálamo é o centro primário da ação da leptina, o qual produz uma série

de neuropeptídeos constituintes do circuito neural responsáveis pela regulação do

comportamento alimentar e peso corporal. Estes neuropepídeos se classificam em 2

tipos: orexigênicos, que estimulam a ingestão alimentar e são inibidos pela leptina, e

anorexigênicos, que inibem a ingestão alimentar e são estimulados pela leptina. Os

orexigênicos mais bem descritos são: neuropeptídeo Y (NPY), proteína agouti (AgRP),

hormônio concentrador de melanina (MCH), grelina, orexina. Enquanto, os

anorexigênicos mais conhecidos são: pró-ópiomelanocortina (POMC), α-melancortina

(α-MSH), neurotensina (NT), hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e o transcrito

regulado por anfetamina e cocaína (CART) (Sahu, 2004).

O NPY, por ser o sinal orexigênico endógeno mais potente em mamíferos,

parece ser o principal mediador da ação da leptina no hipotálamo (Kalra et al., 1991;

Sahu et al., 1993; Sahu et al., 1998; Woods et al., 1998; Kalra et al., 1999). A leptina

reduz a secreção e expressão de NPY por explantes hipotalâmicos (Stephens et al.,

1995; Schwartz et al., 1996; Sahu et al., 1998) e tem ação oposta ao NPY sobre

ingestão alimentar, este agindo como um antagonista à ação anorexigênica da leptina

(Erickson et al., 1996; Baskin et al., 1998). Camundongos ob/ob knockout para NPY,

reduzem a hiperfagia e obesidade, indicando que a resposta à deficiência de leptina

requer sinalização pelo NPY (Erickson et al., 1996). Camundongos com deficiência de

NPY não apresentaram anormalidade no controle da ingestão alimentar e peso

corporal, indicando que na ausência de NPY, outros hormônios orexigênicos substituem

sua ação, inclusive na regulação por leptina (Erickson et al., 1996).

Os neurônios NPY co-expressam AgRP (Broberger et al., 1998); sua super

expressão resulta em obesidade (Graham et al., 1997) e causa hiperfagia, quando

administrada por via intracerebroventricular. A AgRP é um antagonista endógeno do α-

MSH, inibindo seu efeito nos receptores de melanocortina 4 (MC4R). A leptina diminui o

mRNA de AgRP no hipotálamo, sugerindo que esta inibição seja um dos mecanismos

pelo qual a leptina exerce seu efeito anorexigênico no hipotálamo (Ollmann et al.,

1997).

A grelina é um peptídeo gástrico regulado negativamente pela leptina e IL-1β,

produzida principalmente no estômago (Nakazaro et al., 2001), mas também por

neurônios hipotalâmicos, demonstrando um possível papel sobre o circuito neural que

controla a homeostase energética. A injeção central ou periférica de grelina induz a

alimentação (Wren et al., 2000; Nakazaro et al., 2001). A grelina bloqueia a ação da

leptina sobre a alimentação e a administração prévia de leptina atenua este efeito da

grelina, sugerindo uma interação funcional entre ambos.

O MCH é expresso principalmente no hipotálamo lateral e sua aplicação central

estimula a alimentação (Rossi et al., 1997). Sua síntese aumenta na restrição

energética e na deficiência de leptina (Qu et al., 1996). Camundongos MCH-knockout

são hipofágicos, hipermetabólicos e excessivamente magros (Shimada et al., 1998). A

super expressão hipotalâmica de MCH causa obesidade (Ludwig et al., 2001) e

camundongos ob/ob MCH-knockout apresentam menor peso corporal sem alterar a

ingestão alimentar (Segal-Lieberman et al., 2003). A leptina diminui a expressão gênica

do MCH, diminuindo também a ingestão alimentar induzida pelo MCH em ratos (Sahu,

1998).

A expressão e secreção hipotalâmica do α-MSH é aumentada pela leptina (Gee

et al.,1983). O α-MSH aumenta o AMPc em células que apresentam MC4R. Postula-se

que neurônios que contém MC4R inibem neurônios do hipotálamo lateral, que

normalmente estimulam o apetite. O α-MSH é regulado pela ingestão alimentar (Brady

et al., 1990), mediada, pelo menos em parte, pela ativação dos neurônios que

expressam o mRNA de POMC pela leptina (Mobbs & Mizuno, 2000).

O CRH é um potente anorexigênico e sua administração central inibe a ingestão

alimentar (Arase et al., 1988; Krahn et al., 1988). A leptina aumenta a liberação e

expressão do CRH (Huang et al., 1998); a ação da leptina é atenuada pelo pré-

tratamento com α-CRH (antagonista específico do CRH) ou pelo anticorpo anti-CRH

(Gardner et al., 1998; Uehara et al., 1998; Okamoto et al., 2001). O tratamento com α-

CRH inibiu a expressão da UCP1 induzida pela leptina no tecido adiposo marrom

(Masaki et al., 2003), sugerindo que o CRH é um importante mediador da sinalização da

leptina sobre o hipotálamo na regulação de ingestão alimentar e metabolismo.

2.2 - Resistência à leptina

O potencial da leptina em inibir a fome, reduzir o peso corporal e a massa de

adipócitos tem contribuído para que este hormônio seja visto como um fator anti-

obesidade. Ratos e seres humanos com deficiência ou anormalidades no receptor de

leptina apresentam hiperfagia e obesidade mórbida. A hiperleptinemia associada à

hiperfagia e obesidade indica resistência à leptina, podendo ter papel na patogênese da

obesidade (Maffei et al., 1995; Considine et al., 1996; Ahima & Hileman, 2000; Ahima &

Osei, 2004). Os prováveis mecanismos responsáveis desta resistência podem ser:

prejuízo no transporte de leptina pela barreira hemato-encefálica e anormalidades nos

receptores de leptina e/ou na sinalização pós-receptor (Jéquier, 2002).

Esses resultados podem ser confirmados por Hallas et al. (1997) que

demonstraram que camundongos obesos são resistentes à administração periférica de

leptina, mas respondem à injeção via i.c.v., o que sugere que a resistência à leptina

pode ser mediada pelo seu transporte prejudicado pela barreira hemato-encefálica.

Este transporte é unidirecional do sangue para o cérebro e ocorre por um processo de

saturação via receptores de leptina de forma curta (Caro et al., 1996; Banks et al.,

1996). Talvez em resposta ao desenvolvimento da hiperleptinemia, o aumento do peso

se explique pela baixa expressão desses receptores de leptina (Caro et al., 1996).

Outras formas de resistência à leptina podem ocorrer; dietas com alto teor de

lipídeos, podem levar a resistência à leptina através de vários mecanismos, dentre eles

a presença de um antagonista circulante ou uma proteína acoplada, aumento na

depuração de leptina, alteração no transporte no cérebro, baixa regulação do receptor

de leptina, inibição da via JAK-STAT ou ativação de proteínas supressoras da

sinalização (SOCS-3) ou citocinas inibitórias (Friedman & Halaas, 1998). Ratos

alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram menor incremento nas concentrações

séricas de leptina após injeção intraperitoneal de leptina, quando comparados com

aqueles que receberam dieta com baixo teor de lipídeos, sugerindo um aumento da

depuração da leptina (Lin e cols, 2001).

Outros tipos de resistência à leptina ocorrem como resultado da mutação do

receptor de leptina. Existem vários tipos de mutação em receptores de leptina que

podem resultar em obesidade nos ratos (Flier & Elmquist, 1997) e em seres humanos

(Clement et al.,1998). Outro exemplo é a resistência que pode ocorrer de maneira

farmacocinética, como por problema na distribuição, liberação, no metabolismo e/ou

eliminação (Halaas et al., 1997).

3- INSULINA E LEPTINA

A insulina, produzida pelas células β pancreáticas, é o mais potente hormônio

anabólico conhecido, sendo essencial para crescimento, desenvolvimento, controle da

homeostase glicêmica e regulação do metabolismo dos carboidratos, lipídeos e

proteínas. Este hormônio promove a síntese e estoque dos carboidratos, lipídeos e

proteínas, inibindo a degradação e a liberação destes na circulação. Além disso, a

insulina estimula a captação de glicose, aminoácidos e ácidos graxos pelas células,

aumenta a expressão e/ou atividade de enzimas que catalisam a síntese de glicogênio,

lipídeos e proteínas, enquanto inibe a atividade e/ou expressão daquelas que catalisam

a degradação (Le Roith & Zick, 2001).

As funções e mecanismos de ação da insulina têm sido amplamente estudados,

principalmente pelo fato desse hormônio estar associado, não só a diabetes, mas

também a várias outras doenças como obesidade, hipertensão, infecções crônicas e

doenças cardiovasculares (Taylor, 1999).

O controle da homeostase glicêmica é feito através do balanço entre a absorção

de glicose pelo intestino, produção pelo fígado, captação e metabolismo pelos tecidos

periféricos. A insulina aumenta a captação de glicose pelo músculo e pelo tecido

adiposo, inibe a produção de glicose hepática, servindo como o principal regulador da

glicemia, além de estimular a diferenciação e o crescimento celular. A resistência à

insulina, ou a sua deficiência, resulta na desregulação destes processos, levando ao

desenvolvimento de doenças como diabetes, que pode ter como conseqüências a

hipertensão, dislipidemia e aterosclerose, além das alterações microangioapáticas e

neuropáticas (Saltiel & Kahn, 2001).

Os transportadores de glicose são expressos em tecidos de mamíferos e são

responsáveis pela captação de glicose do sangue para o interior das células,

fornecendo glicose para produção de ATP e para uma variedade de reações

anabólicas. Já foram descritos mais de 8 tipos de transportadores de glicose e somente

o GLUT-4 e o GLUT-8 têm sua ação dependente da insulina. Os transportadores de

glicose são tecido-específico e em certos tecidos, como o adiposo e o muscular,

desenvolvem um papel crucial na homeostase glicêmica (Mueckler, 2001).

Mais de 75% da captação de glicose dependente de insulina ocorre no músculo

esquelético, enquanto que o tecido adiposo capta somente uma pequena fração (Klip &

Paquet, 1990). A insulina promove a captação de glicose pelas células destes tecidos

estimulando a translocação do GLUT-4 do meio intracelular para a membrana

plasmática. Estima-se que de 3% a 10% do GLUT-4 é localizado na superfície celular,

enquanto mais de 90% está localizado em compartimentos intracelulares (Thong et al.,

2005).

Na obesidade, a resistência à insulina se caracteriza por redução do transporte e

metabolismo de glicose em adipócitos, músculo esquelético e músculo liso vascular,

comprometendo também a supressão da secreção de glicose pelo fígado (Reaven et

al., 1995). Estes defeitos funcionais resultam da sinalização deficiente da insulina nos

três tecidos alvos. Ainda, parece haver nos adipócitos de obesos, importante

comprometimento da regulação do principal transportador de glicose, o GLUT-4. A

ligação da insulina ao seu receptor, a fosforilação do receptor, a atividade da tirosina-

quinase e a fosforilação dos substratos de receptores de insulina, também estariam

diminuídas (Goldstein et al., 1998).

A presença de um receptor funcional para leptina nas células β pancreáticas

(Kieffer et al. 1996, Fehmann et al. 1997) e a observação de que a leptina inibe a

secreção de insulina (Emilsson et al. 1997, Ishida et al. 1997), evidenciam uma relação

entre insulina e leptina sob o controle de um sistema de feedback negativo (Kieffer &

Habener, 2000). Assim, a insulina estimula a leptina nos adipócitos, enquanto a leptina

inibe a insulina nas células β pancreáticas. Quando aumenta o estoque de gordura, a

hiperleptinemia reduz a insulinemia, direcionando menos energia para a formação de

tecido adiposo. Por outro lado, quando o estoque de tecido adiposo diminui, a queda da

leptina aumenta a produção de insulina, levando ao aumento dos estoques de gordura.

O feedback negativo da leptina sobre a produção e secreção de insulina nas ilhotas

pancreáticas já é bem estabelecido (Ceddia et al., 1999, Lupi et al., 1999, Seufert et al.,

1999a). Porém, evidências sugerem que um defeito no receptor de leptina nas células β

pancreáticas pode ser o mecanismo chave da obesidade associada ao hiperinsulinismo

(Seufert et al., 1999b; Kieffer & Habener 2000).

A insulina compartilha com a leptina, alvos neuroquímicos e anatômicos no

hipotálamo medial, sendo considerado um sinal endógeno que induz a redução no

consumo alimentar (Schwartz et al., 2000). Ambos circulam na corrente sanguínea

proporcionalmente à massa de gordura corporal e regulam a atividade dos neurônios

das regiões cerebrais associadas com a regulação do peso corporal. Neurônios do

núcleo arqueado hipotalâmicos expressam receptores para

insulina e leptina e são

alvos bem caracterizados de ambos. Neurônios NPY/AgRP são inibidos pelo aumento

de leptina e insulina, enquanto neurônios POMC são ativados. Essa dupla regulação

coordenada sobre neurônios com ações opostas regula respostas complexas, tais

como as alterações na ingestão e gasto energético para manter os estoques corporais

(Marks et al., 1990; Schwartz et al., 1996).

4- LEPTINA E LACTAÇÃO

Na lactação ocorre aumento dos requerimentos energéticos, que pode ser

alcançado, primeiramente, através do aumento da ingestão alimentar, além de ocorrer

mobilização das reservas, especialmente lipídios do tecido adiposo, e adaptação de

certos processos metabólicos (lipogênese) para favorecer o uso preferencial de

nutrientes pela glândula mamária. Alguns autores observaram aumento do consumo

alimentar em ratos, de 15-20g/dia para 60-70g/dia, na lactação (Barber et al., 1997;

Vermon & Pond, 1997) e 80% desse aumento da ingestão ocorre no período noturno

(Pickavance et al., 1996). Uma explicação para esta hiperfagia na lactação seria a

redução da leptinemia, em torno de 45%, voltando ao normal logo após o desmame

(Pickavance et al., 1998).

Segundo Vernon et al (2002), na lactação, a leptina sérica está reduzida em

ratos como resultado do balanço energético negativo e também devido ao aumento no

“clearance” da leptina. Não se conhecem quais os sinais associados com o início da

produção de leite que são responsáveis pela supressão da secreção de leptina. Li et al

(1998) associaram a sucção ao aumento da expressão do NPY no hipotálamo,

levantando a hipótese de que este tenha um papel modulador na regulação

hipotalâmica de secreção hormonal e na ingestão alimentar. Porém, Brogan et al (1998)

mostraram que o estímulo de sucção diminui a leptina somente quando há necessidade

de substratos energéticos para a produção de leite.

A hipoleptinemia não é o principal fator que causa hiperfagia em ratos, mas

provavelmente facilita a hiperfagia (Vernon et al, 2002). Alem da diminuição da leptina,

outros hormônios orexigênicos podem estar envolvidos (Denis et al., 2003), como o

NPY e AgRP (Sandoval & Davis, 2003). Desde 1998, Li et al já haviam demonstrado

que o NPY está aumentado em ratos na lactação

No entanto, os estudos sobre as concentrações séricas de leptina na gestação

e lactação são ainda contraditórios. Mukherjea et al (1999) observaram, em seres

humanos, que a leptina sérica na lactação é menor que na gestação, porém no 4

e 28

dias após o parto, há um aumento deste hormônio, cuja concentração ainda é menor

que em mulheres não grávidas. Já segundo Herrera et al (2000) e Amico et al (1998), o

perfil da leptina sérica em ratas normais está aumentado nos dias 12º e 20º de

gestação e declina no 21

de gestação, mantendo-se baixo durante toda a lactação.

Demonstramos recentemente em nosso laboratório que a leptina sérica em ratas

controles se mantém constante na lactação, porém está aumentada a partir do 4

dia de

lactação em ratas que sofreram restrição protéica. (Lisboa et al, 2006).

A concentração de leptina em neonatos independe dos níveis séricos maternos

e parece estar relacionada com a leptina veiculada através dos glóbulos de gordura do

leite materno, que é produzida pela glândula mamária e cuja concentração varia de

acordo com o período da lactação. A retirada da gordura do leite mantém a

concentração de leptina constantemente reduzida na lactação e reflete a concentração

plasmática de leptina da mãe (Aoki et al., 1999; Smith-Kirwin, 1998). Esta relação

corrobora dados de Mantzoros et al (1997a), que observaram que fatores que elevem a

concentração de gordura no leite poderiam também estar associados ao aumento de

leptina sérica nos filhotes.

A presença da leptina no leite (Casabiell et a., 1997; Smith-Kirwin et al., 1998;

Aoki et al., 1999) levantou a possibilidade de que este hormônio possa exercer um

efeito biológico no lactente, pois neste período tanto o tecido adiposo quanto o sistema

de regulação do apetite estão imaturos (Smas et al., 1995). A leptina no leite de ratas

normais está alta no inicio da lactação (2

dia), cai pela metade por volta do 8

dia e

volta a aumentar ao final da lactação (19

dia) (Aoki et al., 1999). Cobaias (guinea pigs)

que receberam dieta hipocalórica na segunda metade da gestação apresentaram

menor concentração de leptina no leite no 1

dia de lactação e maior no 14

dia em

relação a cobaias que receberam dieta hipercalórica (Estienne et al., 2003).

Casabiell et al (1997), para testar se a leptina é transferida da circulação

materna via leite para o estômago e corrente sanguínea da prole, injetaram leptina

marcada com

125

I, i.p. em ratas lactantes normais e observaram sua presença no

estômago dos filhotes de 4 dias de idade, cujos níveis sanguíneos aumentaram

principalmente entre 4 e 8 h após a injeção. Em outra experiência adicionaram leptina

ao leite desnatado e administraram a filhotes de 9 dias de idade e observaram a

presença de leptina na corrente sanguínea dos filhotes em torno de 4 h após sua

ingestão. Com isto não só provaram que a leptina passa pelo leite, mas que é absorvida

pelo trato gastrointestinal do filhote de forma íntegra.

Anteriormente, caracterizamos a

secreção de leptina endógena em ratos no período neonatal. Contrário ao observado

em camundongos por Ahima et al (1998), não observamos um pico no 10

dia de

lactação. Os níveis séricos de leptina dos filhotes caem do 4

dia de lactação até após o

desmame, por volta do 30

dia de vida (Teixeira et al, 2002). É possível que os ratos

não apresentem este pico, já que Herrera et al (2000), também mostraram que a leptina

sérica de ratos está aumentada no 1

dia de vida, e diminui a partir do 4

dia de

amamentação, mantendo-se estável até o 20

dia de vida. Como o tecido adiposo

marrom (TAM) é a primeira forma de tecido adiposo que aparece durante o

desenvolvimento do rato, tem sido proposto que ele seja responsável pela maioria das

mudanças nas concentrações de leptina plasmática que são observadas no período

neonatal (Vernon et al., 2002). Este dado, também ajudaria a explicar uma possível

interrelação entre leptina e hormônios tireóideos neste período, já que os hormônios

tireóideos têm um papel importante na termogênese facultativa do tecido adiposo

marrom e, poderia estar regulando a produção de leptina por este tecido, no período

neonatal.

Na desnutrição protéica ou calórica na lactação, ocorre alteração da leptina

sérica dos filhotes, com diminuição aos 4º e 12° dias e aumento ao 21º dia (Teixeira et

al., 2002). Segundo Estienne et al (2003), cobais (guinea pigs) que receberam dieta

hipocalórica na segunda metade da gestação apresentaram concentrações séricas de

leptina reduzidas no início e aumentadas em meados da lactação comparados aos

animais cujas mães receberam dieta hipercalórica. Já Chisari et al (2001) mostrou que

a desnutrição de ratas na gestação e lactação induz os filhotes a apresentarem

hipoleptinemia e baixo peso corporal ao desmame.

5- FUNÇÃO TIREÓIDEA E LEPTINA

A glândula tireóide é composta por uma série de folículos de tamanhos

variáveis, que são formados por uma única camada de células epiteliais que circundam

o colóide, um material glicoprotéico onde os hormônios tireóideos (HTs) ficam

armazenados. Estas células exibem uma superfície basolateral voltada para membrana

basal, espaço intersticial e leito capilar, e uma superfície apical voltada para o colóide

conhecida como interface célula/colóide (De Groot et al., 1996).

Os HTs, T4 e T3, são derivados iodados do aminoácido tirosina, sendo

sintetizados e secretados sob estímulo da tireotrofina ou TSH (Pazos-Moura et

al.,2003). A biossíntese dos HTs depende fundamentalmente, da entrada de iodo na

glândula, da presença da peroxidase tireóidea (TPO), de cofatores para produção de

peróxido de hidrogênio e da proteína aceptora do iodo, denominada tireoglobulina

(Moura et al.,1989; Moura et al., 1990; Carvalho et al., 1996).

A biossíntese dos HTs na célula folicular baseiam-se no transporte ativo de iodo

pela membrana plasmática basolateral para dentro da célula, na migração deste em

direção à membrana apical, onde é transportado pela pendrina e pelo AIT

(transportador apical de iodeto) para o colóide; oxidação e organificação do iodeto nos

resíduos de tirosinas da Tg,

formando os radicais mono e diiodotirosina (MIT e DIT),

que se acoplam formando os HTs. Estas etapas são catalizadas pela TPO, enzima

localizada na membrana apical, que usa como co-fator o H

(Moura et al.,1987;

Moura et al., 1989), gerado pela enzima NADPH-oxidase, também conhecida como

ThOX ou DuOX (Carvalho et al., 1996; De Deken et al., 2000; Cardoso et al., 2002;

Morand et al., 2003). A TG iodada é endocitada, seguida de proteólise e secreção dos

HTs.

Em condições normais a proporção da secreção tireóidea diária de T4 e T3, em

humanos é de aproximadamente 14:1 e em ratos de 5,7:1, sugerindo que em murinos,

contribuição tireóidea para a taxa de produção diária de T3 é mais importante do que

no homem (Larsen & Ingbar, 1992; Chopra, 1996; Escobar-Morreale et al., 1996).

A maior parte dos HTs circula acoplada a proteínas transportadoras, que são: a

TBG (globulina ligadora de tiroxina), a TTR (transtirretina) e a albumina. No homem

aproximadamente 70% de T4 e T3 estão ligados a TBG, 10% do T4 é ligado à TTR e

15% são carreados pela albumina. Enquanto uma pequena fração de T3 plasmático

encontra-se ligado à TTR e cerca 25% à albumina (Utiger, 1996). Em ratos, a TTR é a

principal carreadora de HTs, sendo responsável por 55% do transporte de T4; já a TBG

garante o transporte de 18% e a albumina de 15% (Davis, 1970).

Todas as etapas de biossíntese dos HTs são estimuladas pelo TSH,

hormônio glicoprotéico secretado pelas células tireóficas da adeno-hipófise. Este

promove importantes efeitos no crescimento, morfologia e vascularização da tireóide,

além de aumentar a captação de I-, a atividade TPO, a síntese de tireoglobulina, a

geração de

H2O2, a captação de glicose, lipídeos e aminoácidos, o metabolismo

energético, a síntese de DNA, RNA e proteínas estruturais tireóideas. O TSH é

regulado principalmente pela interação do controle neural exercido pelo hipotálamo,

via TRH (hormônio liberador de tireotrofina) e pela retroalimentação (feedback)

negativa, realizada pelos HTs (Pazos-Moura et al.,2004)

O feedback negativo dos HTs sobre a secreção de TSH é exercido de várias

formas: bloqueio da produção de TRH ou redução da expressão de seus receptores de

membrana no tireotrofo (Reichlin, 1992; Kakucska, 1992), estímulo da secreção de

outras substâncias hipotalâmicas inibidoras do TSH, como a somatostatina (Scalon,

1991) e, a mais importante, inibição da secreção de TSH por ação direta de T3 no

tireotrofo (Shupnik et al., 1986), sendo este proveniente principalmente da desiodação

intra-hipofisária do T4 circulante. Além disso, existe um efeito inibitório indireto através

da neuromedina B ou do GRP, que tem sua importância fisiológica comprovada através

de estudos que utilizaram inibidores da ação destes peptídeos (Moura et al., 2001;

Santos et al., 1995; Pazos-Moura et al.,1995).

A tireóide secreta primariamente T4, que deve ser convertido na sua forma

ativa, o T3, pelas enzimas iodotironinas desiodases (D1 e D2). Estas enzimas têm

características bioquímicas e distribuição tecidual distintas e podem ser divididas em 5’-

desiodases ou 5-desiodases (Brent, 1997).

A D1 é responsável pela 5’ monodesiodação de T4, fonte primária de T3 nos

tecidos periféricos e 5 desiodação, responsável T3 nunca pode ser transformado em

rT3, só T4 pode, dependendo, fundamentalmente do grau de sulfatação do T4 (Rutgers

et al., 1991). É encontrada principalmente na tireóide, fígado e rim. TSH e T3 aumentam

a sua expressão e o PTU (6n-propil 2-tiouracil), a inibe. O hipertireoidismo aumenta a

atividade desta enzima, ao passo que o hipotireoidismo diminui.

A D2 regula principalmente os níveis intracelulares de T3. É encontrada em

hipófise, cérebro e TAM. Esta isoforma está aumentada pelo hipotireoidismo,

aparentemente para manter os níveis de T3 em tecidos onde sua atuação é crítica, tais

como o cérebro.

A D3, que inativa os HTs, é encontrada no cérebro, placenta e pele. Do mesmo

modo que a D1, também é ativada pela concentração de HTs.

Diversos estudos têm mostrado a relação entre leptina e função tireóidea. A

ação da leptina pode ocorrer em todo o eixo hipotálamo-hipófise-tireóide, assim como

sobre a conversão de T4 a T3.

A leptina pode regular a função tireóidea direta e indiretamente. Foi

demonstrado que a leptina estimula a secreção de TSH por estimular a expressão do

gene do pró-TRH (Ahima et al., 1996; Legradi et al. 1997, 1998; Orban et al.,1998; Nillni

et al., 2000). Já foi evidenciada a presença de ObR na hipófise, além de síntese local

de leptina (Jin at al., 1999; Jin et al., 2000; Lloyd et al., 2001; Sone et al, 2001; Vicente

et al, 2004), sugerindo-se um efeito direto deste hormônio sobre a secreção de TSH.

Ortiga-Carvalho et al (2002) mostraram que a leptina “in vivo” tem um efeito

estimulatório sobre a liberação de TSH, enquanto que “in vitro” inibe a secreção de

TSH, sugerindo uma inibição autócrina/parácrina local.

No jejum, o mecanismo de regulação da secreção de HTs está alterado, de tal

forma que os baixos níveis destes estão associados a uma resposta sub-normal de

TRH e TSH (Sims & Horton, 1968;Campbell et al., 1977; Harris et al., 1978; Hermus et

al., 1992;). A diminuição da leptinemia é um mediador dessa adaptação do eixo

hipotálamo-hipófise-tireóide

no jejum, pois o tratamento com leptina reduz a diminuição

na tiroxinemia observada no jejum (Ahima et al., 1996; Orban et al., 1998; Nillni et al.,

2000). Legradi et al (1997) demonstraram que o RNAm para o pro-TRH, que diminui no

jejum, é restaurado com a administração de leptina.

Seoane et al (2000) demonstraram haver um estímulo da leptina, administrada

via i.c.v., na restauração da secreção de TSH, inibida pelo jejum. Esse estímulo da

leptina parece ser exercido sobre o hipotálamo, porém, o mesmo efeito não foi

observado quando a administração de leptina ocorre em animais hipotireóideos,

indicando que esse efeito é dependente da função tireóidea (Seoane et al., 2000). A

análise de todos esses dados sugere que, a hipoleptinemia induzida pelo jejum leva à

menor produção de TRH que reduz, conseqüentemente, a secreção de TSH e de HTs.

Nowak et al. (2002) revelaram a expressão do ObRb em tireóide de ratas

adultas eutireoidéas, sugerindo um papel direto da leptina sobre a tireóide, não apenas

modulando a liberação do eixo hipotálamo-hipófise

. Isozaki et al. (2004) também

observaram o Ob-Rb em cultura de células FRTL5. Ainda nesta hipótese do efeito direto

da leptina no tirócito, De Oliveira et al (2007) observaram que a hiperleptinemia in vivo

estimula e in vitro inibe a captação tireoideana de radioiodeto (atividade do co-

transportador iodo/sódio) de ratos machos adultos. Recentemente, nosso grupo

detectou a presença de ObRb em tireóides de ratos machos programados pela

hiperleptinemia neonatal (Dutra et al, 2007).

Em estudos anteriores do nosso laboratório, verificamos que ratas lactantes

submetidas à restrição protéica apresentaram disfunção tireóidea (Lisboa et al., 2003b)

e hiperleptinemia (Lisboa et al, 2006) e ainda, demonstramos que ratos adultos

programados pela hiperleptinemia no início da lactação, apresentam na idade adulta,

aumento sérico de T3 e T4 totais e livres (Teixeira et al., 2003, Toste et al., 2006b).

Assim, evidenciamos uma relação entre leptina e função tireóidea durante o período de

lactação, que pode estabelecer um imprinting programando alterações na função

destes dois hormônios na idade adulta.

O presente trabalho busca investigar a relação entre a hiperleptinemia materna

nos 10 primeiros dias da lactação e a programação da função tireoideana de sua prole

em curto e longo prazos.

Objetivos

GERAL

Avaliar os efeitos do tratamento materno com leptina durante os 10 primeiros

dias de lactação sobre sobre a composição corporal, o metabolismo glicídico e a função

tireoideana da prole em curto e longo prazo.

ESPECÍFICOS

Nas mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação, avaliar:

• A Ingestão alimentar e o peso corporal durante o tratamento até o

desmame;

• As concentrações séricas de leptina e T

ao final da lactação;

• O conteúdo de leptina e T

no leite;

Na prole das mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação,

avaliar:

• A ingestão alimentar pós natal até aos 180 dias de idade;

• O peso corporal durante o tratamento e pos natal até os 180 dias de

idade;

• A composição corporal e a massa de gordura visceral aos 21, 30 e 180

dias de idade ;

• A resistência ao efeito anorético da leptina aos 30 e 180 dias de idade;

• As concentrações séricas de leptina, insulina, T

, T

, TSH e glicose aos

21, 30 e 180 dias de idade;

• A captação de radioiodeto pela tireóide aos 180 dias;

• A atividade hepática da α-glicerol fosfato desidrogenase mitocondrial

(GPDm) aos 21, 30 e 180 dias de idade;

Materiais e Métodos

1-ANIMAIS

Ratas Wistar fêmeas, nulíparas, de 3 meses de idade, foram mantidas em

biotério com temperatura (25±1°C) e ciclo claro-escuro (7:00-19:00 h) controlados.

Estes animais foram acasalados (2 fêmeas/1 macho) e receberam ração comercial (23

% de proteína), e água ad libitum. Nosso modelo experimental foi aprovado pelo Comitê

de Ética para o cuidado e uso de Animais Experimentais do Instituto de Biologia

Roberto Alcantara Gomes da Universidade do Estado de Rio de Janeiro

(CEA/183/2007).

No dia do nascimento da prole, as mães foram divididas em dois grupos:

1- Controle (C): injetadas com NaCl 0,9 %, via subcutânea (s.c.), nos 10

primeiros dias da lactação.

2- Leptina (LEP): injetadas com de leptina (8 μg/100g de peso corporal (p.c.),

s.c., nos 10 primeiros dias da lactação. recombinant mouse Leptin - National Hormone

and Pituitary Program, Harbon-UCLA, Medical Center, CA, E.U.A.).

Ao nascimento dos filhotes, definido como dia 0 (d0), a ninhada foi ajustada em 6

filhotes machos, pois este número de animais confere o maior potencial lactotrófico

(Fishbeck & Rasmussen,1987).

Aos 21 dias da lactação (desmame) as mães foram ordenhadas para a obtenção

do leite. Logo após, as mães foram anestesiadas com Thiopentax a 5% (0,10 ml/100g

p.c., i.p.) e em seguida foram coletadas amostras de sangue por punção cardíaca. Soro

e leite foram armazenados a -20ºC para posterior dosagem de T3 e leptina.

O sacrifício da prole se deu aos 21, 30 e 180 dias de idade, quando os animais

foram anestesiados com Thiopentax a 5% (0,10 ml/100g p.c., i.p.) e, em seguida,

coletamos sangue por punção cardíaca, sendo o soro armazenado a -20ºC para

posterior dosagem de leptina, insulina, TSH, T4 e T3. A carcaça foi obtida para análise

da composição corporal. O fígado foi coletado e armazenado a -70ºC para

determinação da atividade GPDm.

2- AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL

Os parâmetros utilizados para avaliação do estado nutricional das mães na

lactação e das proles após o desmame, foram:

Ingestão de ração: o consumo materno foi monitorado diariamente na lactação. A

ingestão da prole foi acompanhada de 4 em 4 dias após o desmame até os 180 dias de

idade. A quantidade de ração ingerida é igual à diferença entre o peso da ração que

restou na gaiola (Rf) e a quantidade total colocada 4 dias antes (Ri). Esses dados foram

usados para calcular a ingestão diária de ração, de acordo com a fórmula:

Ingestão de ração (g) = (Ri-Rf) n / 4

Onde, n corresponde ao número de ratos por gaiola, e 4 é o número de dias.

Peso corporal: peso corporal das mães e filhotes foi acompanhado diariamente

na lactação. Após o desmame, o peso da prole foi monitorado de 4 em 4 dias até os

180 dias de idade, obedecendo sempre o mesmo horário de pesagem para todos os

dias analisados.

Composição corporal

Aos 21, 30 e 180 dias de idade, os ratos C e LEP foram completamente

eviscerados e as carcaças amolecidas em autoclave por 1h, com posterior

homogeneização em água destilada na proporção 1:1.

Conteúdo lipídico total:

cerca de 3g do homogeneizado foram utilizadas para

determinação do conteúdo de gordura por método gravimétrico (Stansbie et al, 1976).

As alíquotas foram hidrolisadas em banho-maria a 70ºC por 2h em presença de KOH

30% e etanol absoluto. Após acidificação com ácido sulfúrico 6M, os ácidos graxos

totais e o colesterol livre foram extraídos mediante 3 lavagens sucessivas com éter de

petróleo. O material foi transferido para um recipiente previamente pesado, e levado à

capela de exaustão até ficar bem seco, quando se procedeu à pesagem diária até seu

valor tornar-se constante. As pesagens foram corrigidas pelas diluições feitas nas

etapas anteriores. Os resultados foram expressos em gramas de gordura por 100

gramas de carcaça.

Conteúdo protéico total:

Alíquotas com cerca de 1g do homogeneizado, foram

aquecidas a 37ºC por 1h em KOH 0,6N, sob agitação. Após centrifugação a 1.000 g por

10 minutos. A concentração de proteínas totais foi determinada colorimetricamente no

sobrenadante (Lowry et al, 1951), utilizando BSA para construção da curva padrão. Os

resultados foram expressos em gramas de proteína por 100 gramas de carcaça.

Água corporal total:

colocamos cerca de 1g do homogeneizado de carcaça em

estufa à temperatura de 90°C, mantendo esta temperatura até que o peso da amostra

desidratada ficasse estável (Pase et al., 1945), o que levou 6 dias, sendo realizadas as

pesagens de 2 em 2 dias. Os resultados foram expressos em gramas de água corporal

total.

Minerais

: Cerca de 1g do homogeneizado de carcaça foi colocada em mufla

(Fornitec Temp 1200) à temperatura de 600 °C, mantendo esta temperatura até que o

peso da amostra se mantivesse constante (Pace et al., 1945). Os resultados foram

expressos em gramas de cinzas por 100 gramas de carcaça.

Massa de gordura visceral (MGV):

foi retirada e pesada a fim de avaliar a

quantidade de gordura central. Foram retiradas as gorduras retroperitoneal, epididimal e

mesentérica.

3- TESTE DO EFEITO ANOREXIGÊNICO DA LEPTINA

A prole aos 30 e 180 dias de idade ficaram em jejum 24 h antes do teste com

livre acesso à água. Os grupos C e LEP foram subdivididos em 02 grupos:

Leptina (CLEP, LEPLEP): injetados com leptina recombinante (0,5 mg/kg p.c,

PeproTech, USA), via i.p.

Salina (CSAL, LEPSAL): injetados com salina nas mesmas condições.

Todos os animais retornaram às gaiolas com ração previamente pesada. O efeito

anorexigênico da leptina foi estabelecido pela diferença do consumo de ração entre o

grupo injetado com leptina e o grupo injetado com diluente em 2, 4, 6 e 24 h (Martin et

al, 2000, Passos et al., 2004; Lins et al., 2005, Toste et al., 2006).

4- DETERMINAÇÃO HORMONAL E GLICEMIA

O sangue dos ratos foi centrifugado (4°C/20 min/1500 g) para a obtenção do

soro.

A leptina em soro e leite foi avaliada por radioimunoensaio (RIE), através de Kit

comercial para dosagem de leptina em ratos (LINCO Research, Inc., Missouri, E.U.A.).

As amostras de leite do 21º dia da lactação foram sonicadas por 3-10 seg sob gelo e

diluídas na proporção 1:10 (Hassink et al., 1997). Os valores de leptina foram expressos

em ng/ml. O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 6,9 %.

A insulinemia foi dosada por RIE comercial (ImmuChemTM

125

I, tubo r, ICN

Biomedicals, Inc, E.U.A). Os coeficientes de variação intra-ensaio foi de 4,22%.

A dosagem de T4 e T3 totais séricos e T3 no leite foram realizadas por RIE

comercial (ICN Pharmaceulticals Inc., NY, EUA). Os coeficientes de variação intra-

ensaio do T4 foi de 3,3 – 8,1 % e do T3 foi de 5,6 %. Os valores de T4 foram expressos

em µg/dl e os de T3 foram expressos em ng/dl.

O TSH sérico foi medido por RIE de duplo anticorpo (Moura et al., 2001),

utilizando reagentes fornecidos pelo National Institute of Diabetes and Digestive and

Kidney Diseases (Bethesda, USA, rp-3).Os valores foram expressos em ng/ml .

A glicemia foi medida no momento do sacrifício com auxílio de um medidor

automático (ACCU CHECK-Active, Roche®), baseado na reação glicose-glicose

oxidase.

5- CAPTAÇÃO DE RADIOIODO TIREÓIDEO

A prole de mães tratadas com leptina foi submetida à avaliação da captação de

radioiodeto pela tireóide aos 180 dias de idade. Duas horas antes do sacrifício,

administramos dose traçadora de

125

I, i.p. (2.22 x 104 Bq) (Moura et al., 1987). As

tireóides foram excisadas, pesadas e a radiação determinada em contador Gama

(Cobra Auto-Gamma, Packard Instrument Co, Downers Grove, E.U.A.). Os valores

foram normalizados pela massa tireóidea.

6- ATIVIDADE GPDm HEPÁTICA

A medida da atividade GPDm (α-glicerol fosfato desidrogenase mitocondrial)

hepática baseia-se na técnica colorimétrica descrita previamente (Lee & Lardy, 1965;

Oliveira et al.,2007), cujo princípio é o uso do metasulfato de fenacina (PMS) como

transportador eletrônico entre a enzima reduzida e o cloreto de violeta-

iodonitrotetrazólio (INT).

Cerca de 250mg de fígado foi homogeneizado em 20 volumes de solução SM

(sacarose 0,32 M e cloreto de magnésio 1mM) em Ultra-Turrax e centrifugado

(1.000xg/10min/4

C) para separar o precipitado nuclear (descartado) e utilizar o

sobrenadante, que foi centrifugado (8.500xg/10 min/4

C). O precipitado desta segunda

centrifugação foi ressuspenso em 3ml de tampão fosfato 0,125M pH 7,5 (BPK) sob

agitação, seguido de nova centrifugação (8.500xg/10 min/4

C). Descartamos o

sobrenadante, obtém-se a fração mitocondrial (precipitado), sendo esta ressuspensa

em 1ml de BPK no momento do ensaio enzimático. Para este, 100μl da fração

mitocondrial foi pipetado em 4 tubos (2 brancos e 2 problemas). Nos tubos problemas,

pipetamos 50μl de DL-α-glicerofosfato hexahidratado sal sódica (α-GP - 32,4 mg/ml)

diluído em KCN (cianeto de potássio - 0,32mg/ml em tampão BKP pH7,5-0,125M) e nos

tubos brancos, apenas 50μl de KCN. Incubamos por 10 min a 30

C, seguido de um

banho frio. Iniciamos a reação adicionando 100μl da solução INT-PMS por 15 minutos,

a temperatura ambiente, no escuro. Precipitamos as amostras com 50μL de TCA 10%.

Então a luz foi acesa e acrescentamos 1ml de etanol absoluto, sob agitação e posterior

centrifugação (1.000xg/5 min.) A leitura da absorbância do sobrenadante foi realizada a

500nm e os dados expressos como A/min/mg de proteína.

Análise Estatística

Os dados foram expressos como média±erro padrão da média (EPM). Para

comparação entre os grupos utilizamos o teste t de Student não pareado, exceto para o

TSH e a captação de

125

I, para os quais utilizamos o teste não paramétrico de Mann-

Whitney. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

Resultados

Avaliação do estado nutricional das ratas lactantes tratadas com leptina

nos 10 primeiros dias da lactação

As ratas lactantes que receberam injeção de leptina no início da lactação não

apresentaram diferença na ingestão alimentar (figura 2A). Com relação ao peso

corporal, observamos uma redução nas ratas do grupo LEP a partir do segundo dia de

tratamento até o final da lactação (6% p<0,05, gráfico 2B).

Figura 2:

Ingestão de ração (A) e peso corporal (B) das ratas lactantes dos grupos - C e LEP. Grupo C

- livre acesso à água e ração, recebendo injeção de solução salina durante os 10 primeiros dias da

lactação. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, recebendo injeção de 8μg de leptina/100g de peso

corporal, durante 10 primeiros dias de lactação. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de

08 ratas lactantes por grupo.

0 5 10 15 20 25

LEP

(A)

Dias

Ingestão (g/dia)

0 5 10 15 20 25

200

225

250

275

LEP

(B)

Dias

Peso g

Leptina e T3 ao desmame no soro e no leite de ratas lactantes tratadas

com leptina nos 10 primeiros dias de lactação.

A figura 3 mostra as concentrações de leptina no soro (gráfico 3A) e no leite

(gráfico 3B) de mães injetadas com leptina no início da lactação. Não houve diferença

de leptina entre os grupos, tanto no soro quanto no leite.

Na figura 4, mostramos as concentrações de T3 no soro (gráfico 4A) e no leite

(gráfico 4B) destas mães. Não detectamos diferença de T3 sérico entre os grupos,

porém as mães LEP exibiram maior conteúdo deste hormônio no leite (30%, p<0,05).

Figura 3

: Concentração de Leptina no soro (A) e no leite (B) das ratas lactantes dos grupos - C e LEP.

Grupo C - livre acesso à água e ração, recebendo injeção de solução salina durante os 10 primeiros dias

da lactação. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, recebendo injeção de 8μg de leptina /100g de

peso corporal, durante 10 primeiros dias de lactação. Os dados estão expressos como média ± erro

padrão de 06 ratas lactantes por grupo.

C LEP

( A )

Lepina sérica (ng/ml)

C LEP

( B )

Leptina no leite (ng/ml)

Figura 4: Concentração de T3 no soro (A) e no leite (B) das ratas lactantes dos grupos - C e LEP.

Grupo C - livre acesso à água e ração, recebendo injeção de solução salina durante os 10 primeiros dias

da lactação. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, recebendo injeção de 8μg de leptina /100g de

peso corporal, durante 10 primeiros dias de lactação. Os dados estão expressos como média ± erro

padrão de 06 ratas lactantes por grupo. * (p<0,05) vs C

Avaliação do estado nutricional da prole de mães tratadas com leptina nos

10 primeiros dias da lactação

A evolução da ingestão alimentar e do peso corporal da prole de mães LEP é

mostrada na figura 5.

A ingestão de ração da prole de mães LEP foi maior que a do grupo controle

(17%, p< 0,05), nos dias 29, 37, 53, 69,105 e 113 e do dia 145 em diante (10%, p<

0,05) (gráfico 5A).

No gráfico 5B, observa-se a evolução do ganho de peso corporal das proles,

desde o nascimento até os 180 dias de vida. O intervalo entre o dia 0 e o dia 10 de

idade corresponde ao período de tratamento materno com leptina, onde o grupo de

filhotes de mães LEP apresentou menor ganho de peso (5%, p<0,05) desde o primeiro

dia de injeção de leptina. Do dia 69 em diante, a prole de mães LEP apresentou maior

ganho de peso (10%, p<0,05) em comparação ao grupo controle.

C LEP

140

210

( B )

TT3 ng/dl

C LEP

( A )

TT3 ng/dl

Figura 5

: Ingestão de ração (A) dos grupos C e LEP do desmame aos 180 dias de idade e peso

corporal (B) do nascimento até aos 180 dias de idade. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas

mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação;

Grupo C livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de solução salina, nos 10 primeiros

dias de lactação. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de 10 animais controles e 13

animais do grupo LEP. A seta indica que houve diferença significativa entre os grupos do dia 145 em

diante na ingestão e do dia 69 em diante no peso. * (p<0,05) vs C

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

120

150

LEP

P<0,05

( A )

Dias

Ingestão (g/dia)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5

LEP

P<0,05

Dias

Peso Corporal (g)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

100

200

300

400

500

LEP

P<0,05

( B )

Dias

Peso Corporal(g)

Avaliação da massa de gordura visceral (MGV) e do conteúdo total de

gordura, proteína, água e cinzas da prole de mães tratadas com leptina nos 10

primeiros dias da lactação.

A figura 6 mostra que os animais do grupo LEP não apresentam alteração de

MGV aos 21 (gráfico 6A) e 30 (gráfico 6B) dias de idade, enquanto aos 180 dias

(gráfico 6C), estes animais apresentam aumento de aproximadamente 57% (p<0,05)

comparado ao grupo controle. O mesmo foi observado com relação à gordura corporal

total, que apresentou-se maior (40%, p<0,05) somente aos 180 dias de vida na prole

LEP (figura 7). Não houve diferença significativa entre os grupos quanto a quantidade

total de proteínas (figura 8), água (figura 9) e cinzas (figura 10) na carcaça.

Figura 6:

Quantidade total de MGV dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e180 dias de

idade (C). Grupo Lep - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias de lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 10 animais em cada grupo. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

( A )

21 dias

MGV g/100 g

peso corporal

C LEP

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

( B )

30 dias

MGV g/100g

peso corporal

C LEP

( C )

180 dias

MGV g/100g

peso corporal

Figura 7:

Quantidade total de gordura (g/100 g peso corporal) dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e

180 dias de idade (C). Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg

de leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e

ração, suas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro

padrão de 10 animais em cada grupo. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

( A )

21 dias

g de gordura/100g

de peso corporal

C LEP

( B )

30 dias

g de gordura/100g

de peso corporal

C LEP

( C )

180 dias

g de gordura/100g

de peso corporal

Figura 8

: Quantidade total de proteína dos animais dos grupos C e LEP aos 21 ( A), aos 30 (B) e 180

dias de idade (C). Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 10 animais em cada grupo aos 21, 30 e 180 dias.

C LEP

( A )

21 dias

g de ptn/100g de

peso corporal

C LEP

( B )

30 dias

g de ptn/100g de

peso corporal

C LEP

( C )

180 dias

g de ptn/100g de

peso corporal

Figura 9

: Quantidade total de água dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e 180 (C) dias

de idade. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 10 animais em cada grupo aos 21, 30 e 180 dias.

C LEP

( A )

21 dias

Água (g/100g de

peso corporal)

C LEP

( B )

30 dias

Água (g/100g

de peso corporal )

C LEP

( C )

180 dias

Água (g/100g

de peso corporal)

Figura 10:

Quantidade total de cinzas dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e 180 (C)

dias de idade. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 10 animais por grupo aos 21, 30 e 180 dias.

C LEP

( B )

30 dias

Cinzas (g/100g

de peso corporal)

C LEP

( C )

180 dias

Cinzas (g/100g

de peso corporal)

C LEP

( A )

21 dias

Cinzas (g/100g

de peso corporal)

Avaliação da leptinemia da prole de mães tratadas com leptina nos 10

primeiros dias da lactação

Na figura 11, observamos as concentrações séricas de leptina aos 21 (gráfico

11A), 30 (gráfico 11B) e 180 (gráfico 11C) dias de idade. Os animais do grupo LEP

apresentaram hiperleptinemia somente aos 180 dias de idade (135%, p<0,02)

comparado ao grupo controle.

Figura 11:

Concentrações séricas de leptina dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e 180 dias de

idade (C). Grupo leptina - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 8 animais por grupo aos 21, 30 e 180 dias. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

( A )

21 dias

Lepina sérica (ng/ml)

C LEP

( B )

30 dias

Lepina sérica (ng/ml)

C LEP

( C )

180 dias

Lepina sérica (ng/ml)

Insulinemia, glicemia e índice de resistência à insulina (IRI) da prole de

mães tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

A figura 12 mostra as concentrações séricas de insulina aos 21 (gráfico12A), 30

(gráfico 12B) e 180 (gráfico 12C) dias de idade. A prole do grupo LEP não exibiu

alteração de insulinemia em nenhum dos momentos estudados, quando comparado ao

grupo controle.

A glicemia, mostrada na figura 13, também não diferiu entre as prole aos 21

(gráfico 13A), 30 (gráfico 13B) dias, contudo foi maior aos 180 dias de vida ( 10%

p<0,05,gráfico 13C).

A figura 14 mostra que não detectamos diferença significativa do IRI entre os

grupos aos 180 dias.

Figura 12

: Concentrações séricas de insulina dos grupos controle e LEP aos 21, 30 e 180 dias de

idade. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g

de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração, cujas mães

receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de 8 animais

por grupo aos 21, 30 e 180 dias.

C LEP

( A )

21 dias

Insulina (

Ui/mL)

C LEP

( B )

30 dias

Insulina (

Ui/mL)

C Lep

100

( C )

180 dias

Insulina (

Ui/mL)

Figura 13: Glicemia dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e 180 dias de idade (C). Grupo LEP - livre

acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g de peso corporal, nos 10

primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de

solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de 8 animais por grupo aos 21, 30 e

180 dias. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

110

( A )

21 dias

Glicemia (mg/dl)

C LEP

( B )

30 dias

Glicemia (mg/dl)

C LEP

( C )

180 dias

Glicemia (mg/dl)

Figura 14

: Índice de resistência a insulina aos 180 dias de idade. Grupo LEP - livre acesso à água e

ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da

lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de solução salina. Os

dados estão expressos como média ± erro padrão de 8 animais por grupo.

Teste do efeito anorexigênico da leptina na prole aos 30 dias de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

A figura 15 (gráficos 15 A e B) mostra o teste do efeito anorexigênico da

leptina nos grupos C e LEP aos 30 dias. A efetividade deste teste está demonstrada

pelo resultado do grupo controle que recebeu leptina (CLEP), cuja ingestão de ração

destes animais, quando ajustada por 100g de peso corporal foi menor as 2 e as 4

horas (39% e 17%p<0,05,respectivamente) e o grupo LEPLEP não respondeu à

injeção aguda de leptina com a esperada redução de ingestão alimentar nos

períodos estudados (gráfico 15 B).

C LEP

160

240

320

400

Índice de Resistência à insulina

Insulina x glicose

(

Ui/mL x mmol/l)

Figura 15

: Ingestão de ração ajustada por 100g de peso corporal de animais aos 30 dias após

administração de leptina ou salina no grupo Controle ( A ) e no grupo LEP ( B ).Grupo LEP - livre acesso

à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros

dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de solução

salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de 6 animais por grupo * (p<0,05) vs CLEP.

Teste do efeito anorexigênico da leptina na prole aos 180 dias de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias da lactação

A figura 16 (gráficos 16A e B) mostra o teste do efeito anorexigênico da

leptina nos grupos C e LEP aos 180 dias. Como já mencionado, a efetividade deste

teste é comprovada pelo resultado do grupo CLEP que apresentou menor consumo

de ração quando ajustada por 100g de peso corporal após 2 (28%p<0,05), 4

(12%p<0,05) e 6 horas (5%p<0,05) da injeção aguda de leptina comparada ao grupo

CSAL,gráfico 16A. O grupo LEPLEP não respondeu à injeção aguda de leptina com

a esperada redução de ingestão alimentar nos períodos estudados, gráfico 16 B.

2.0 4.0 6.0 24.0

CSAL

CLEP

( A )

horas

ingestão ração

(g/100g

de peso corpora)

2.0 4.0 6.0 24.0

LEPSAL

LEPLEP

( B )

horas

ingestão ração

(g/100g de peso corporal)

Figura 16

: Ingestão de ração ajustada por 100g de peso corporal de animais aos 180 dias após

administração de leptina ou salina no grupo controle ( A ) e no grupo LEP ( B ). Grupo LEP - livre acesso

à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros

dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de solução

salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão de 6 animais por grupo * (p<0,05) vs CLEP

2.0 4.0 6.0 24.0

CSAL

CLEP

( A )

horas

ingestão ração

(g/100g

de peso corporal)

2.0 4.0 6.0 24.0

LEPSAL

LEPLEP

( B )

horas

ingestão ração

(g/100g

de peso corporal)

Captação de

125

I pela tireóide da prole aos 180 dias de mães tratadas com

leptina nos 10 primeiros dias da lactação

A figura 17 mostra que não houve diferença na captação de 2 horas de

radioiodeto pela tireóide aos 180 dias de vida.

Figura 17: Captação tireoideana de

125

I nos filhotes aos 180 dias. Grupo LEP - livre acesso à água e

ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da

lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de solução salina. Os

dados estão expressos como média ± erro padrão de 10 animais em cada grupo. * (p<0,05) vs C

C LEP

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Captação de

125

tireóide

( % mg )

Função tireoideana da prole de mães tratadas com leptina nos 10 primeiro

dias da lactação

As figuras 18, 19 e 20 mostram as concentrações séricas de T3, T4 e de TSH,

respectivamente.

O T3 total (figura 18) foi maior aos 21 dias (p=0,06, gráfico 18A), menor aos 30

dias (20% p<0,05 gráfico 18B) e maior aos 180 dias (22% p<0,05 gráfico 18C) no grupo

LEP comparado ao grupo controle. Não houve diferença de T4 total (figura 19) entre os

grupos estudados em nenhuma das idades.

Na figura 20, podemos observar que o TSH sérico não foi diferente entre os

grupos.

Na figura 21, observamos menor atividade GPDm hepática aos 30 dias (58%;

p<0,01) e 180 dias (43%; p<0,05), gráficos 21 B e C, respectivamente.

Figura 18:

Concentração sérica de T3 total dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e

180dias (C) de idade. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 8 animais por grupo aos 21, 30 e 180 dias. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

( B )

30 dias

TT3 ng/dl

C LEP

180 dias

(C)

TT3 ng/dl

C LEP

(A)

21 dias

TT3 ng/dl

Figura 19: Concentração sérica de T4 total dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e

180dias (C) de idade. Grupo LEP - livre acesso à água e ração, cujas mães receberam injeção de 8μg de

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 8 animais por grupo aos 21, 30 e 180 dias.

C LEP

( B )

30 dias

TT4 (

g/dl)

C LEP

( C )

180 dias

TT4 (

g/dl)

C LEP

( A )

21 dias

TT4

(μ

g/ dl)

Figura 20:

Concentração sérica de TSH dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e 180 dias

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 8 animais por grupo aos 21, 30 e 180 dias. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

( A )

21 dias

TSH (ng/ml)

C LEP

( B )

30 dias

TSH (ng/ml)

C LEP

( C )

180 dias

TSH (ng/ml)

Figura 21:

Atividade da enzima GPDm dos animais dos grupos C e LEP aos 21 (A), 30 (B) e 180 dias

leptina/100g de peso corporal, nos 10 primeiros dias da lactação; Grupo C - livre acesso à água e ração,

cujas mães receberam injeção de solução salina. Os dados estão expressos como média ± erro padrão

de 8 animais por grupo aos 21, 30 e 180 dias. LEP* (p<0,05) vs C

C LEP

0.0

0.1

0.2

0.3

( A )

21 dias

abs/min/mg ptn

C LEP

0.00

0.04

0.08

0.12

( B )

30 dias

abs/min/mg ptn

C LEP

( C )

180 dias

abs/min/mg ptn

Resumo dos resultados

Tabela 1: Dados das mães injetadas com leptina nos 10 primeiros dias de lactação.

Parâmetros 21 dias

Ingestão alimentar N

Peso corporal ↓

Leptina sérica N

T3 Total sérico N

Leptina no leite N

T3 total no leite ↑

Tabela 2

: Dados dos filhotes cujas mães foram injetadas com leptina nos 10 primeiros dias de

lactação.

Parâmetros 21 dias 30 dias 180 dias

Peso Corporal N N

↑

MGV N N ↑

Gordura Corporal N N

↑

Proteína Corporal N N N

Água Corporal N N N

Cinzas N N N

Leptina N N ↑

Insulina N N N

Glicemia N N ↑

IRI - - N

Sensibilidade à leptina - ↓ ↓

Captação tireóidea de

125

I - - N

T3 Total ↑ ↓ ↑

T4 Total N N N

TSH N N N

GPDm hepática N ↓ ↓

N – Normal ↑ - Aumentado ↓ - Diminuído

Discussão

No presente trabalho, estamos demonstrando pela primeira vez o fenótipo

metabólico das proles cujas mães foram tratadas com leptina no início da lactação, em

períodos distintos de desenvolvimento.

As concentrações séricas de leptina das ratas lactantes no último dia de

tratamento com leptina (10º dia) não foram dosadas, justamente, porque essas mães

não podiam ser sacrificadas neste período, uma vez que seus filhotes foram

amamentados até os 21 dias de vida. Entretanto, em estudo anterior, onde as ratas

foram injetadas com leptina ao final da lactação, encontramos aumento da leptina

sérica no último dia de tratamento (Lins et al., 2005). Além disso, a observação de

menor peso corporal das mães durante o período de administração de leptina parece

confirmar o efeito do tratamento.

Alguns autores justificam uma hipoleptinemia na lactação em função do aumento

clearance de leptina sérica (Vernon et al., 2002) ou do estímulo da sucção (Brogan

et al., 1998). Sendo que este último agiria como um sinal diante da maior necessidade

de substratos energéticos para produção de leite. Assim, esta hipoleptinemia facilitaria

o aumento da ingestão alimentar da lactante.

Os filhotes de mães LEP também apresentam menor ganho de peso corporal

na lactação, mas que é revertido no pós-desmame a partir do dia 69 em diante, onde

esses animais passam a ter maior peso comparado ao controle, assim como a ingestão

alimentar que é consistentemente maior a partir dos 145 dias de vida.

A leptina está presente no leite tendo sido relatada em camundongos (Aoki et al.,

1999) e seres humanos (Smith-Kirwin et al., 1998; Casabiell et al., 1997), e suas

concentrações estão relacionadas tanto com as da circulação quanto com a

adiposidade materna (Casabiell et al., 1997; Houseknecht et al., 1997). Estes autores

sugerem que a leptina seja secretada pelas células epiteliais da glândula mamária para

os glóbulos de gordura do leite. Não estão bem estabelecidos os fatores reguladores da

secreção de leptina pelo leite.

Em alguns de nossos modelos de programação, também constatamos maior

passagem de leptina pelo leite. Lins et al. (2005) trataram as mães com leptina nos três

últimos dias da lactação e reproduziu alguns dos efeitos observados por Oliveira-Cravo

et al. (2002), que tratou os filhotes diretamente, nos 10 primeiros ou 10 últimos dias de

lactação. Em ambas as experiências, os filhotes foram programados para um maior

ganho de massa corporal e hiperfagia. Entretanto, algumas diferenças importantes se

fizeram notar quanto à programação, tais como uma maior massa de gordura visceral

quando as mães foram tratadas (Lins et al.,2005), contrastando com maior ganho de

massa protéica, quando a prole era tratada (Toste et al. 2006).

Em outro modelo de programação (Bonomo et al., 2005), constatamos também a

maior passagem de leptina pelo leite, quando as mães foram tratadas com

bromocriptina, um agonista dopaminérgico, inibidor da prolactina. Sugerindo ser a

prolactina um dos fatores reguladores da passagem de leptina pelo leite. Estes animais

foram programados para maior peso corporal e maior massa de gordura visceral

(Bonomo et al., 2007) e total .

Apesar de não termos detectado maiores concentrações de leptina no leite de

mães LEP ao desmame, isto pode ter sido devido a problemas na sensibilidade do

método ou ao período em que foi feita a coleta, que pode não ter coincidido com o pico

da passagem. Porém, como estes animais ganharam menos peso, durante a lactação,

é possível que a leptina tenha passado em maior quantidade pelo leite das mães

tratadas e, sido absorvida pelo trato gastrointestinal dos filhotes, indo atuar sobre os

seus receptores hipotalâmicos, induzindo saciedade, reduzindo o consumo de leite e,

conseqüentemente, retardando o ganho de peso destes animais.

Receptores de leptina já foram identificados em células epiteliais gástricas em

ratos e seres humanos neonatos (Barrenetxe et al., 2002), sugerindo que a leptina

materna possa atuar no filhote.

Não podemos descartar que a leptina possa estar atuando indiretamente,

induzindo algum fator no leite que causaria a impressão na prole. Esta hipótese se

justifica pelas diferenças encontradas na programação, quando a leptina é administrada

na mãe ou no filhote (Lins et al., 2005; de Oliveira-Cravo et al., 2002; Toste et al.,

2006).

A grelina é um peptídeo secretado pelo hipotálamo, estômago (Morash et

al.,1999; Jin et al.,1999; Smith-Kirwin et al., 1998) e placenta (Pelleymounter et

al.,1995) em roedores e seres humanos. Ela regula a liberação do hormônio do

crescimento (GH) e tem propriedades orexígenas (Bado et al.,1998; Senaris et al.,1997;

Schwartz et al.,1996). Savino et al. (2005) encontrou uma correlação negativa entre a

concentração de grelina e o peso de lactentes saudáveis, sugerindo que a grelina

também desempenhe um papel importante na regulação do peso corporal em crianças

saudáveis. Seus efeitos são

mediados através do receptor GHS, localizado na hipófise

e hipotálamo (Wang et al.,1998). Hayashida et al (2002) demonstraram em ratos,

através de imunohistoquímica, que a grelina é expressa no estômago fetal a partir do

dia 18 da gestação e ainda que a quantidade de grelina na parte glandular do estômago

aumenta de acordo com a idade, do período neonatal à idade adulta. O mecanismo de

regulação da síntese e secreção deste hormônio parece não estar ainda bem

estabelecido. Entretanto, Toshinai et al. (2001) demonstraram que a expressão do

RNAm da grelina no estômago está aumentada após administração de insulina e

leptina. Isto levanta a possibilidade de que a leptina transferida pelo leite possa

estimular a grelina na prole e esta contribuir para as alterações de comportamento

alimentar em longo prazo observado no presente estudo. A curto prazo prepondera o

efeito anorexígeno da leptina.

Dietas ricas em lipídeos aumentam a leptinemia (Devaskar et al., 1997; Ahren et

al., 1997). Trottier et al. (1998) demonstraram que o aumento da gordura no leite

aumenta a concentração de leptina em ratos lactentes. Em estudo anterior, observamos

que a desnutrição calórica na lactação aumenta a concentração de lipídeos no leite,

havendo aumento no peso corporal da prole quando adulta (Passos et al. 2000). É

provável que a hiperleptinemia materna também leve a alterações de composição e/ou

quantidade do leite, programando a regulação da

ingestão e do peso corporal.

Através do método da carcaça quantificamos o conteúdo de gordura e proteínas

corporais totais e medindo a massa de gordura visceral avaliamos a adiposidade

central. Recentemente, verificamos que ratos tratados com leptina nos 10 primeiros dias

de vida apresentaram maior peso corporal, quantidades normais de gordura total e

central, associado a maior proporção de proteína na carcaça quando adultos,

evidenciando que o aumento de peso corporal deve-se à maior quantidade de tecido

muscular e não de tecido adiposo (Toste et al., 2006a). Ao contrário, no presente

estudo, ambas as gorduras (total e visceral) foram maiores aos 180 dias, confirmando

que o aumento de peso encontrado deve-se a massa adiposa, reforçando o estudo de

Lins et al. (2005), onde as mães receberam injeção de leptina, nos três últimos dias de

lactação. Em estudo recente, Vickers et al. (2008) trataram com leptina, do 3º ao 13º

dia de vida, ratos machos cujas mães receberam dieta normal na gestação e

observaram uma programação para maior peso corporal e aumento da adiposidade

corporal total. A diferença deste estudo de Vickers e o de Toste et al. (2006ª) reside na

dose muitas vezes mais elevada no estudo de Vickers (250 µg/100g pc/dia vs. 8

µg/100g pc/dia). Assim, a injeção na mãe parece potencializar o efeito adipogênico da

leptina.

As proles de mães LEP apresentam normoinsulinemia e hiperglicemia aos 180

dias. Porém, o IRI (índice de resistência à insulina) da prole LEP é normal,

demonstrando que estes animais ainda não apresentam resistência à insulina. Como a

leptina inibe a produção de insulina, através da sua ação na célula

β (Kieffer &

Habener, 2000), é provável que os níveis normais de insulina na idade adulta sejam

devidos à hiperleptinemia apresentada por estes animais e, não conseguem reverter a

intolerância a glicose nas condições basais, ou seja são inapropriadamente normais.

Nossos achados são aparentemente contraditórios aos de alguns autores

(Stocker et al. 2004; Stocker et al., 2007; Vickers et al. 2005). Stocker et al. (2004)

demonstraram que a administração de leptina a partir do 14º. dia de gestação e na

lactação em ratas submetidas à restrição protéica, reduz a suscetibilidade ao ganho de

peso e a resistência à insulina induzidos por dieta hiperlipídica nos filhotes adultos. Este

mesmo grupo administrou leptina em mães com estado nutricional normal e

observaram os mesmos resultados na prole adulta que recebeu dieta hiperlipídica

(Stocker et al.,2007). Porém, estes autores não avaliaram o efeito do tratamento

materno com leptina sobre o ganho de peso da prole associando mães com estado

nutricional normal e prole recebendo ração normal do desmame a idade adulta, como

em no nosso modelo experimental.

Vickers et al. (2005) também observaram que a administração de leptina, do 3º

ao 13º dia, na prole fêmea de mães submetidas à restrição calórica na gestação,

normalizou o ganho de peso, a ingestão calórica, bem como a quantidade de gordura

corporal destas ratas na idade adulta, quando comparado à prole das mães desnutridas

que recebeu salina. Vale ressaltar que neste estudo, o tratamento neonatal com leptina

não alterou a prole adulta das mães que não foram desnutridas na gestação.

Resultados semelhantes foram encontrados por Picó et al. (2007), onde a ingestão oral

de doses fisiológicas de leptina em ratos machos durante a lactação não causou

obesidade na idade adulta nos animais que receberam dieta hiperlipídica.

Assim, os resultados dos demais estudos citados acima diferem dos nossos,

provavelmente, devido a várias diferenças na metodologia, tais como dose de leptina,

via de administração, período de injeção (gestação e/ou lactação), sexo da prole,

estado nutricional materno e dieta da prole após-desmame.

Embora contraditórios esses resultados reforçam o importante papel da leptina

no estágio precoce da vida neonatal na regulação do peso corporal. Além disso,

reforçam ainda mais a importância da leptina na determinação da homeostase

energética em longo prazo e sugerem que os efeitos deste hormônio podem ser

modulados por sexo e estado nutricional pré e pós-natal.

A hiperleptinemia resulta em menor expressão do ObRb no hipotálamo, bem

como prejudica a sinalização da leptina (Toste et al., 2006; Zhang e Scarpace, 2006).

Assim, a hiperleptinemia, aos 180 dias, causaria resistência a leptina e, posteriormente,

participa da patogênese da obesidade (Considine et al., 1996). Alguns dos mecanismos

propostos para a resistência à leptina incluem a limitação no sistema de transporte da

barreira hemato-encefálica, anormalidades dos receptores de leptina, quanto ao seu

número ou afinidade ou anormalidades na sinalização pós-receptor, tais como: inibição

da via JAK-STAT, ativação do SOCS-3 ou aumento de outras citocinas inibitórias

(Jéquier, 2002; Friedman & Halaas, 1998).

Os resultados do presente estudo mostram que os animais cujas mães foram

tratadas com leptina na lactação não responderam à injeção aguda de leptina pela

redução da ingestão alimentar, demonstrando uma resistência à ação anorexigênica da

leptina tanto aos 30 dias

como aos 180 dias de vida. Geralmente, o consumo alimentar

é inibido agudamente pelo tratamento com leptina, entre 2 e 4h. Isto foi observado

apenas no grupo controle onde o consumo alimentar foi inibido aos 30 dias e aos 180

dias principalmente às 6 h. Os animais de mães LEP aos 30 dias de idade apresentam

resistência à leptina apesar da leptina sérica e peso corporal estarem normais,

confirmando uma resistência central a leptina, que antecede a hiperleptinemia. Esta

resistência à leptina hipotalâmica ocorre em animais magros, indicativo de leptina

central aumentada como um dos fatores responsáveis pela resistência à leptina. De

fato, o animal mais jovem apresenta uma maior ação central da leptina que o animal

mais velho (Zhang & Scarpace, 2006). Porém, o animal cuja mãe foi tratada com

leptina, já começa a apresentar resistência, antes até de desenvolver maior massa de

tecido adiposo e hiperleptinemia. A dieta hiperlipidica aumenta a leptinemia e reduz a

expressão do ObRb (Zhang & Scarpace, 2006), assim lactantes obesas ou que ingerem

altas concentrações de lipídeos, ou desnutridas com alta concentração de gordura no

leite, são caracterizadas por mobilizar a gordura corporal e serem hiperleptinemicas e,

essa hiperleptinemia pode reduzir a expressão dos receptores de leptina em seus

filhotes, da mesma forma que no nosso modelo.

Estes achados reforçam a teoria de programação para resistência à leptina

causada pela hiperleptinemia na lactação, como nos estudos anteriores com animais

que foram tratados diretamente com leptina na lactação (Toste et al., 2006a) ou que

receberam leptina através do leite materno (Lins et al., 2005). Além disso, as proles do

presente modelo apresentam hiperleptinemia na idade adulta, corroborando estudos

com diferentes modelos de hiperleptinemia (Toste et al., 2006a, Lin et al., 2001; Martin

et al., 2000; Pelleymonter et al., 1995), e também contribuindo para a resistência à

leptina. Outro modelo, estudado por nosso grupo, de inibição da prolactina nos 3

últimos dias de lactação, também levou à resistência à leptina na idade adulta (Bonomo

et al., 2007).

Os mecanismos que levam a resistência à leptina nestes animais podem ser os

mesmos já descritos acima. A fim de dar continuidade ao estudo deste modelo

experimental, analisaremos a expressão do ObRb hipotalâmico e das proteínas JAK2

(tirosina kinase janus kinase 2), STAT3 (proteína de sinal de transdução e transcrição) e

SOCS-3 (proteínas supressoras da sinalização).

Com relação à função tireóidea, a hiperleptinemia materna não alterou o T3 no

soro das mães, porém elevou o conteúdo de T3 no leite e no soro de seus filhotes ao

desmame. Estes achados sugerem uma maior transferência de T3 para os filhotes pelo

leite, modulada pela leptina, garantindo que o fornecimento de T3 neste período

extremamente crítico para o desenvolvimento do SNC, seja mais eficiente, a fim de

minimizar os efeitos deletérios do hipotireoidismo neonatal. De fato, o T3 sérico dos

filhotes encontra-se ligeiramente aumentado aos 21 dias, assim como o TSH. Portanto,

é possível que a maior passagem de leptina para o filhote possa alterar a função

tireóidea pelo seu conhecido efeito estimulatório sobre o TSH (Ortiga-Carvalho et al.,

2006).

Entretanto, aos 30 dias de idade encontramos menor T3 e menor atividade

GPDm hepática e uma discreta diminuição no TSH na prole LEP, que sugere o

desenvolvimento de um hipotireoidismo pós-natal. Os HTs são conhecidos por sua ação

estimuladora do metabolismo e da termogênese (Jameson, 2001). Além disso, baixas

concentrações de HTs estão associadas a menor atividade de GPDm, uma vez que

esta enzima mitocondrial relaciona-se diretamente com o estado tireoideano (Coleoni et

al., 1983; Brown et al, 2002). Esta diminuição pode ser devido ao feed-back causado

pela elevação de T3 aos 21 dias, ou mais provavelmente, a comprovada resistência

central a leptina, visto que esta estimula o TRH (Legradi et al., 1997).

No presente estudo os animais cujas mães foram injetadas com leptina nos 10

primeiros dias da lactação apresentam aos 180 dias de idade, aumento de T3 e leptina

circulantes, com captação tireóidea de radioiodeto, T4 e TSH séricos normais. Estes

resultados corroboram os achados de Passos et al., (2007) em que a hiperleptinemia

materna, ao fim da lactação, programou aos 150 dias de idade, aumento de T3 com T4,

TSH e captação tireóidea de radioiodeto normais, provavelmente devido a maior

transferência de leptina através do leite materno, o que mais uma vez demonstra que

este efeito independe do período de tratamento. Além disso, este modelo se

assemelha aos resultados obtidos na prole de mães que sofreram restrição calórica na

lactação (Passos et al., 2002).

A captação tireóidea de radioiodeto depende basicamente da atividade do NIS,

que é estimulado principalmente por TSH (Carrasco, 1993). Desta forma, os dados de

captação tireóidea de radioiodeto normais nestes animais poderiam ser explicados

pelas concentrações normais de TSH. O mesmo aplica-se para as concentrações

inalteradas de T4, pois este hormônio se correlaciona melhor com as concentrações de

TSH (Pazos-Moura et al, 2003; Thorner et al., 1998).

Não descartamos a hipótese de que a hiperleptinemia na idade adulta estimule

diretamente a secreção de T3 ou a sua maior conversão de T4 a T3, já que foi

mostrado que a leptina estimula a D1 hepática e tireóidea (Cusin et al., 2000; Lisboa et

al., 2003a). Como o T4 está normal é possível que esta tireóide esteja sendo mais

estimulada a produzir T4, visto que com a maior desiodação sua concentração sérica

deveria estar menor, o que caracterizaria o efeito direto da leptina sobre a tireóide

(Nowak et al., 2002; Oliveira et al., 2007b).

A prole LEP aos 180 dias de idade exibiu menor atividade GPDm hepática,

mesmo em vigência de alto T3 sérico. Oliveira et al (2007a) demonstraram que a

hiperleptinemia crônica suprime a atividade GPDm. Assim, a hiperleptinemia detectada

nos ratos aos 180 dias pode levar à menor atividade GPDm, que parece ser regulada,

neste caso, preferencialmente pela leptina do que pelo T3, provavelmente porque o

aumento do T3 é relativamente menor do que o aumento de leptina. Este resultado é

semelhante ao encontrado por Toste et al. (2006b).

Os dados do presente estudo mostram que o tratamento materno com leptina

nos 10 primeiros dias de lactação causa um hipotireoidismo nos filhotes já aos 30 dias

de idade programando um hipertiroidismo na idade adulta, o mesmo tendo sido

encontrado por Toste et al. (2006b) em modelo de injeção de leptina diretamente nos

filhotes. A sugestão de que a diminuição precoce de HTs programa o hipertireodismo

na idade adulta é reforçada por estudos anteriores (Pracyck et al.,1992), já que foi

demonstrado por diversos autores que o hipertireoidismo neonatal programa para

hipotireoidismo na idade adulta (Moura et al., 2008.; Walker & Courtain, 1985).

No presente modelo sugerimos que a programação tenha ocorrido em função

da passagem de leptina pelo leite e que este modelo reproduziu a maior parte dos

efeitos observados por Lins et al. (2005), que trataram as mães com leptina nos três

últimos dias da lactação, como maior peso corporal e maior massa de gordura visceral,

contrastando com maior ganho de massa protéica, quando a prole foi tratada

diretamente com leptina (Toste et al. 2006).

O presente estudo também mostra um diferencial em relação aos estudos

anteriores por termos avaliado períodos mais precoces da vida do animal, o que muito

contribui para compreendermos os mecanismos da programação. Os filhotes de mães

tratadas com leptina nos 10 primeiros dias de lactação apresentam um hipotireoidismo

já aos 30 dias de idade que programa um hipertiroidismo na idade adulta. Além disso,

apresentam também aos 30 dias resistência à leptina apesar de apresentarem leptina

sérica e peso corporal normais, confirmando uma resistência central a leptina.

Os resultados sugerem que os níveis de leptina no início da lactação parecem ser

determinantes da via fisiológica que regula o balanço energético na idade adulta. Os

dados mostram ainda que os efeitos da programação neonatal com leptina dependem

da via pela qual este hormônio alcança a prole. Finalmente, o modelo do presente

estudo parece ser o mais fisiológico e reproduz quase que completamente os efeitos da

programação na idade adulta pelo tratamento materno com leptina ao final da lactação

e parcialmente os efeitos do modelo de injeção de leptina diretamente nos filhotes,

sugerindo que ao se administrar leptina na mãe, haveria a indução de fatores

intermediários neste

imprinting, potencializando este efeito da leptina na gênese da

obesidade.

Conclusões

As mães tratadas com leptina nos primeiros 10 dias da lactação apresentaram

menor peso corporal durante o período e aumento do conteúdo de T3 no leite ao

desmame.

A hiperleptinemia materna no início da lactação causa resistência à ação

anorexigênica da leptina e hipotireoidismo aos 30 dias de vida, e programa para maior

massa corporal, maior adiposidade total e central, acompanhada de resistência à

leptina e hiperleptinemia aos 180 dias, que contribui para a gênese da obesidade.

A prole de mães LEP exibe resistência à leptina aos 30 dias de idade, apesar da

leptina sérica e do peso corporal estarem normais, evidenciando assim uma resistência

central à leptina, que antecede a hiperleptinemia.

A hiperleptinemia materna na lactação causa um hipotireoidismo nos filhotes aos

30 dias de idade que pode ter programado um hipertireoidismo na idade adulta.

Neste modelo, o fenótipo metabólico apresentado pela prole parece ter ocorrido

em função da passagem de leptina pelo leite. Assim, as concentrações de leptina no

início da lactação parecem ser determinantes da via fisiológica que regula o balanço

energético na idade adulta.

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