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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Farmacologia
Juliana Alves Uzuelli
Alterações das concentrações plasmáticas de
troponina I e de metaloproteinases 2 e 9 da matriz
extracelular após embolia aguda em cães
RIBEIRÃO PRETO - SP
2008
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Juliana Alves Uzuelli
Alterações das concentrações plasmáticas de
troponina I e de metaloproteinases 2 e 9 da matriz
extracelular após embolia aguda em cães
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para a
obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de Concentração: Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos Santos
RIBEIRÃO PRETO – SP
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS
DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha Catalográfica
Uzuelli, Juliana Alves
Alterações das concentrações plasmáticas de troponina I e de
metaloproteinases 2 e 9 da matriz extracelular após embolia aguda em
cães/ Juliana Alves Uzuelli; orientador Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos
Santos. Ribeirão Preto, 2008
85 p.
Tese (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
Área de Concentração: Farmacologia) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Palavras-chaves: embolia pulmonar aguda, metaloproteinases da matriz
extracelular, zimografia, troponina, marcadores.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Juliana Alves Uzuelli
Alterações das concentrações plasmáticas de troponina I e de
metaloproteinases 2 e 9 da matriz extracelular após embolia aguda em cães
Aprovado em: 07 de fevereiro de 2008
Banca Examinadora:
Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos Santos
Instituição: FMRP-USP Assinatura:
Prof. Dr. José Antonio Baddini Martinez
Instituição: FMRP-USP Assinatura:
Prof. Dr. Sérgio Roberto Peres Line
Instituição: FOP-UNICAMP Assinatura:
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
a obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de Concentração: Farmacologia
Dedico este trabalho aos meus pais, Santo e Juvercina, e ao
meu marido Ricardo, pela compreensão, carinho, presença e
incansável apoio ao longo da execução deste trabalho.
Ao meu querido avô materno, Altino Idelfonso Alves, que
sempre acreditou na minha força de vontade em alcançar os
meus objetivos.
Meus sinceros agradecimentos,
A Deus, pois me concedeu saúde, paciência e persistência para que eu pudesse finalizar
esta importante etapa da minha vida.
A minha família por acreditar na minha dedicação aos estudos e sempre me ajudar no
que fosse necessário para que este momento se realizasse. Sem a base sólida de meus
pais, em especial o meu pai, eu não seria capaz de cumprir mais esta etapa na minha
vida.
Ao meu marido Ricardo pela compreensão nos momentos difíceis, sempre pronto para
me ajudar a resolver os mais diversos problemas. Sem a sua fé e amor incondicionais,
talvez eu não tivesse vencido várias barreiras.
Ao Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos Santos, pela orientação, amizade e paciência
dedicada a estes anos de trabalho. Seus ensinamentos contribuíram para meu
crescimento científico, intelectual e ético.
Aos membros da minha banca, Prof. Dr. Baddini e Prof. Dr. Sérgio Line por aceitarem o
convite para participar e contribuir para minha formação.
A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio
financeiro durante o mestrado.
A todos meus amigos do laboratório, que em algum momento conviveu comigo, seja na
execução de um trabalho ou no gesto de um simples bom dia, muito obrigado pela
amizade. Posso dizer, com certeza, que eles formam a minha segunda família. Com eles,
é possível trabalhar com responsabilidade, sem perder o humor!
A amiga Vânia, pelos conselhos e força nos momentos difíceis da pós-graduação.
A amiga Caroline, pelas lições de empenho em realizar um objetivo, pela maturidade nos
estudos e na vida e pela ajuda em vários trabalhos.
Ao amigo Carlos, grande ser humano e meu braço direito. Sem ele, não seria possível
este acontecimento.
Aos professores deste Departamento pelos ensinamentos e contribuição com a minha
formação acadêmica.
Ao Prof. Milton César Foss e seu funcionário Sebastião pela colaboração nas pesquisas.
Aos secretários, Sônia, Ramon e Fátima, pela disponibilidade e ajuda na execução dos
tramites administrativos e financeiros da Pós-graduação.
Aos funcionários do Biotério Central pelo cuidado e fornecimento dos nossos animais.
Concedei-nos Senhor, Serenidade necessária, para aceitar as coisas que
não podemos modificar, Coragem para modificar aquelas que podemos e
Sabedoria para distinguirmos umas das outras.
“ Reihold Niebuhr”
viii
RESUMO
Alterações das concentrações plasmáticas de troponina I e de
metaloproteinases 2 e 9 da matriz extracelular após embolia
aguda em cães
O diagnóstico da tromboembolia pulmonar aguda (EPA) e a avaliação da
gravidade desta condição é desafiador. Enquanto as concentrações de troponina I
cardíaca (TI) já estão bem estabelecidas quanto ao risco de estratificação, não há
estudos prévios que tenham examinado se há alguma relação linear entre as
concentrações de TI cardíaca e a gravidade da EPA. Além disso, as
metaloproteinases (MMPs) da matriz extracelular estão envolvidas na
fisiopatologia da EPA. Entretanto, é desconhecido se o aumento da atividade
gelatinolítica das MMPs após a EPA reflete a gravidade desta condição. Nós
examinamos se as concentrações circulantes destes biomarcadores aumentam
em proporção à gravidade da EPA experimental induzida em cães anestesiados. A
EPA foi induzida com coágulos de sangue autólogo (salina, 1, 3 ou 5 mL/Kg)
injetados no átrio direito. As avaliações hemodinâmicas foram realizadas no
momento basal e 120 minutos após a EPA. Da mesma forma, foram realizadas as
quantificações de troponina I no soro e a zimografia das MMPs 2 e 9 no plasma.
Nossos resultados sugerem não haver aumento significativo da atividade
gelatinolítica da pró-MMP-2 no plasma após a EPA, enquanto que a atividade da
ix
pró-MMP-9 aumenta em 80% apenas no grupo que recebeu 5 mL/Kg de coágulos.
A TI cardíaca no soro e a atividade da pró-MMP-9 no plasma tiveram uma
correlação positiva com o índice de resistência vascular pulmonar (p=0,007 e
rs=0,833 para a TI, e p=0,034 e rs=0,684 para a pró-MMP-9) e com a pressão
média na artéria pulmonar (p=0,005 e rs=0,610 para a TI, e p=0,022 e rs=0,720
para a pró-MMP-9). Concluímos que a TI cardíaca e a pró-MMP-9 circulantes
aumentam em proporção à gravidade da EPA, embora o aumento da pró-MMP-9
não seja muito evidente em graus menos severos da EPA. Estes achados podem
ser relevantes para a clínica da EPA.
Palavras chaves: embolia pulmonar aguda; marcadores; metaloproteinases da
matriz; troponina; zimografia
x
ABSTRACT
Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and
MMP-2 and 9 concentrations after experimental acute pulmonary
thromboembolism
Making the diagnosis of acute pulmonary thromboembolism (APT) and
assessing its severity is very challenging. While cardiac troponin I (CTI) levels are
promising in risk stratification, no previous study has examined whether there is a
linear relation between CTI levels and the severity of APT. Moreover, matrix
metalloproteinases (MMPs) are involved in the pathophysiology of APT. However,
it is unknown whether the increases in MMP levels after APT reflect the severity of
this condition. We examined whether the circulating levels of these biomarkers
increase in proportion to the severity of experimental APT induced in anesthetized
dogs. APT was induced with autologous blood clots (saline, 1, 3, or 5 mL/kg)
injected into the right atrium. Hemodynamic evaluations were carried out for 120
min. Gelatin zymography of MMP-2 and MMP-9 from plasma samples were
performed and serum CTI levels were determined at baseline and 120 min after
APT. Our results sugest that while no significant increases in pro-MMP-2 levels
were found after APT, pro-MMP-9 levels increased by 80% only after 5 mL/kg of
clot embolization. Serum CTI and plasma pro-MMP-9 levels correlated positively
with pulmonary vascular resistance (p=0.007 and rs=0.833 for troponin I, and
xi
p=0.034 and rs=0.684 for pro-MMP-9) and with pulmonary artery pressure
(p=0.005 and rs=0.610 for troponin I, and p=0.022 and rs=0.720 for pro-MMP-9).
We conclude that circulating CTI and pro-MMP-9 increase in proportion to the
severity of APT, although the increases in plasma pro-MMP-9 are less clear with
less severe APT. These findings may be relevant for clinical APT.
Keywords: acute pulmonary embolism; markers; matrix metalloproteinases;
troponin; zymography.
xii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES E TABELAS
FIGURAS
Figura 1: Desenho esquemático do protocolo experimental antes
e após a EPA…………………………………………………………..
41
Figura 2: Índice de resistência vascular pulmonar (IRVP)............. 48
Figura 3: Pressão média da artéria pulmonar (PMAP).................. 49
Figura 4: Pressão parcial do oxigênio no sangue arterial (PO
2
).... 50
Figura 5: Saturação do oxigênio (SaO
2
)........................................ 51
Figura 6: Pressão arterial média (PAM)......................................... 52
Figura 7: Freqüência cardíaca (FC)............................................... 53
Figura 8: Indice cardiaco (IC)......................................................... 54
Figura 9: Concentração de troponina I no soro.............................. 55
Figura 10: Correlação entre a concentração de troponina I e o
índice de resistência vascular pulmonar (IRVP)............................
56
Figura 11: Correlação entre a concentração de troponina I e a
média da pressão arterial pulmonar (PMAP).................................
56
Figura 12: Delta percentual em relação ao momento basal da
atividade gelatinolítica da pró-MMP-2............................................
57
Figura 13: Delta percentual em relação ao momento basal da
atividade gelatinolítica da pró-MMP-9............................................
58
Figura 14: Representação de um gel de zimografia...................... 58
Figura 15: Correlação entre a atividade da pró-MMP-9 e o índice
de resistência vascular pulmonar (IRVP).......................................
59
Figura 16: Correlação entre a atividade da pró-MMP-9 e a pressão
média da artéria pulmonar (PMAP)........................................................
59
xiii
TABELAS
Tabela 1: Índice de resistência vascular pulmonar (IRVP)............ 48
Tabela 2: Pressão média da artéria pulmonar (PMAP)................. 49
Tabela 3: Pressão parcial do oxigênio (PO
2
)................................. 50
Tabela 4: Saturação do oxigênio (SaO
2
)....................................... 51
Tabela 5: Pressão arterial média (PAM)........................................ 52
Tabela 6: Freqüência cardíaca (FC).............................................. 53
Tabela 7: Índice cardíaco (IC)........................................................ 54
Tabela 8: Concentração de troponina I no soro............................. 55
Tabela 9: Atividade gelatinolítica de pró-MMP-2 no plasma.......... 57
Tabela 10: Atividade gelatinolítica de pró-MMP-9 no plasma........ 58
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA: análise de variância de uma via
APMA: acetato de 4-aminofenilmercúrico
ASC: área de superfície corpórea
B: Basal
BNP: peptídeo natriurético do tipo B
CaCl
2
: cloreto de cálcio
CETEA-FMRP: Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto
CGRP: peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CV: coeficiente de variação
DC: débito cardíaco
E 120: 120 minutos após a embolia
ECG: eletrocardiograma
EDTA: ácido etilenodiamino tetracético
EPA: embolia pulmonar aguda
EPM: erro padrão da média
ET: endotelina
ET-1: endotelina 1
FC: freqüência cardíaca
5-HT: 5-hidroxitriptamina
IC: índice cardíaco
ICAM: molécula de adesão intercelular 1
IRVP: índice de resistência vascular pulmonar
MMPs: metaloproteinases da matriz
NO: óxido nítrico
NS: não significativo
PAF: fator ativador de plaquetas
xv
PAM: pressão arterial média
PaCO
2
: pressão arterial do gás carbônico
PaO
2
: pressão arterial do oxigênio
PG: prostaglandina
PGI
2
: prostaciclina
PMAP: pressão média artéria pulmonar
Poap: pressão de oclusão da artéria pulmonar
PSAP: pressão sistólica da artéria pulmonar
ROS: espécies reativas do oxigênio
RVP: resistência vascular pulmonar
SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS/PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida com o uso de SDS
SH: sulfidril
T1: grupo experimental trombo 1 mL de coágulo/Kg
T3: grupo experimental trombo 3 mL de coágulo/Kg
T5: grupo experimental trombo 5 mL de coágulo/Kg
TIMPs: inibidores teciduais das MMPs
cTnI: troponina I
cTnT: troponina T
TXA
2
: tromboxano A
2
VCAM: molécula de adesão vascular
xvi
SUMÁRIO
RESUMO ..............................................................................................................viii
ABSTRACT .............................................................................................................x
1.INTRODUÇÃO....................................................................................................18
1.1- A importância clínica da Embolia Pulmonar Aguda ........................................ 19
1.2- A fisiologia da circulação pulmonar................................................................. 20
1.3- A fisiopatologia da hipertensão pulmonar durante a EPA............................... 22
1.4-Alguns marcadores associados com a gravidade da EPA............................... 24
1.5-Metaloproteinases da matriz extracelular......................................................... 27
1.6-Possível relevância das MMPs na EPA ........................................................... 30
2. HIPÓTESE.........................................................................................................32
3. OBJETIVOS ......................................................................................................34
4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................36
4.1-Preparo e monitorização dos animais.................................................... ..........37
4.2-Cálculo do Índice de Resistência Vascular Pulmonar (IRVP) .......................... 39
4.3-Protocolo experimental .................................................................................... 40
4.4-Zimografia para MMP-2 e MMP-9 das amostras de plasma dos cães.............42
4.5-Dosagem de troponina I................................................................................... 43
4.6–Análises estatísticas........................................................................................ 44
5. RESULTADOS ..................................................................................................46
5.1- Resultados Hemodinâmicos ........................................................................... 47
5.2- Resultados da dosagem de troponina I .......................................................... 55
xvii
5.3-Resultados da atividade gelatinolítica (zimografia) das metaloproteinases 2
e 9 da matriz extracelular....................................................................................... 57
6. DISCUSSÃO......................................................................................................60
6.1- As alterações hemodinâmicas ........................................................................ 61
6.2- A troponina I.................................................................................................... 62
6.3- As metaloproteinases 2 e 9 da matriz extracelular ......................................... 63
7. CONCLUSÕES..................................................................................................67
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................69
9. APÊNDICE.........................................................................................................79
Artigo publicado (Clin Chim Acta, 2007, no prelo)
1. INTRODUÇÃO
19
1.1. Importância clínica da embolia pulmonar aguda
A embolia pulmonar aguda (EPA) é uma emergência médica comum, de
complicado diagnóstico, pois apresenta sintomas não específicos, sendo
potencialmente letal, e que resultam da obstrução vascular pulmonar após
migração de êmbolos para os pulmões. Apesar de existirem algumas fontes de
êmbolos pulmonares, a principal são os trombos oriundos de veias profundas dos
membros inferiores (tromboembolia) (Riedel 2001a; Riedel 2001c; Sadosty et al.
2003a; Wood 2002b)
Aproximadamente 33% de todos os pacientes que apresentam
sintomatologia de trombose venosa profunda manifestam a EPA. Estima-se que
ocorram nos EUA, a cada ano, 237.000 casos não fatais e 294.000 casos fatais de
EPA (Almahameed et al. 2007). Embora não tenhamos estatísticas, podemos
imaginar um número pouco menor para o Brasil.
A EPA pode levar à morte nas primeiras horas após sua instalação, tendo
sido relatada uma taxa de mortalidade de até 30% em casos de EPA acompanhada
de hipotensão arterial. Curiosamente, 2/3 dos pacientes pertencentes aos casos
fatais acabam morrendo na primeira hora de EPA (Bailen et al. 2001)
A EPA pode ser classificada em maciça e não maciça. Os pacientes com
manifestações de EPA maciça têm um prognóstico pobre, associado com
instabilidade hemodinâmica acentuada e risco de morte precoce. Já os pacientes
com EPA não maciça têm um prognóstico melhor, não associado com instabilidade
20
hemodinâmica, podendo serem assintomáticos e apresentarem um risco de morte
< 5% (Douketis 2001; Wood 2002b).
Desta forma, a EPA representa uma síndrome clínica grave, que necessita
de diagnóstico rápido e eficaz.
1.2. Fisiologia da circulação pulmonar
A circulação pulmonar caracteriza-se por ser, em condições normais, um
circuito de baixa pressão, alta capacitância e baixa resistência ao fluxo sanguíneo.
O leito vascular pulmonar pode acomodar grandes volumes sanguíneos com
pequenos aumentos na sua pressão arterial, fundamentalmente através do
recrutamento de capilares e arteríolas (West 2006). Além disto, as artérias
pulmonares e seus ramos apresentam constituição histológica que os tornam mais
complacentes do que as artérias sistêmicas (Reeves et al. 1998).
Na camada íntima dos vasos pulmonares encontram-se células endoteliais
que são capazes de regular o tônus vasomotor, a síntese de substâncias
fibrinolíticas, além de regular a permeabilidade vascular (Elliot 1992). O endotélio é
responsável por diversos compostos vasoativos, alguns com função vasodilatadora
como o óxido nítrico e as prostaciclinas, outros com função vasoconstritora como a
endotelina, a angiotensina II e os endoperóxidos. Anormalidades na produção ou
degradação destes mediadores responsáveis por complexos mecanismos
21
reguladores da circulação pulmonar podem resultar em aumento da resistência
vascular pulmonar (RVP), gerando a hipertensão pulmonar (Riedel 2001b).
Quantitativamente, temos que, em indivíduos sadios e ao nível do mar, a
pressão sistólica da artéria pulmonar (PSAP) é de 18 a 25 milímetros de mercúrio
(mmHg) e a pressão média da artéria pulmonar (PMAP) de 12 a 16 mmHg (Elliot
1992; Wood 2002a). Quando a pressão arterial pulmonar aumenta acima destes
valores normais, temos hipertensão pulmonar, caracterizada por PMAP superior a
25 mmHg em repouso, ou 30 mmHg durante esforço (Wood 2002a).
O fluxo sanguíneo dos pulmões é, essencialmente, igual ao débito cardíaco.
Logo, os fatores que controlam o débito cardíaco – principalmente fatores
periféricos, também controlam o fluxo sanguíneo pulmonar. Para que ocorra
aeração adequada do sangue, é importante que este seja distribuído para os
segmentos dos pulmões onde os alvéolos são mais oxigenados. Isso é realizado
pelo seguinte mecanismo: quando a concentração de oxigênio nos alvéolos diminui
abaixo da normal (pressão arterial de oxigênio (PaO
2
) abaixo de 73 mmHg), os
vasos sanguíneos adjacentes aos alvéolos com baixas pressões de oxigênio se
contraem. Isto pode levar a aumentos da resistência vascular pulmonar (RVP)
(Voelkel et al. 2000) que, por conta da hipóxia é denominado vasoconstrição
pulmonar hipóxica. Acredita-se que a baixa concentração de oxigênio determine a
liberação de alguma substância vasoconstritora, ainda desconhecida, do tecido
pulmonar (Dantzker et al. 1978).
22
1.3. Fisiopatologia da hipertensão pulmonar durante EPA
Vários mecanismos participam do desenvolvimento da hipertensão
pulmonar durante a EPA (Lualdi et al. 1995; Smulders 2001; Smulders 2000b).
Seguem abaixo, alguns deles:
1.3.1. Obstrução mecânica
Um primeiro mecanismo é a obstrução física do leito vascular pulmonar por
êmbolos, aumentando significativamente a RVP, levando ao aumento da pós-
carga do ventrículo direito. Isto pode levar à isquemia, depressão miocárdica e
abaulamento do septo interventricular em direção ao ventrículo esquerdo (Lualdi &
Goldhaber 1995). Entretanto, a disfunção miocárdica que se estabelece durante a
EPA parece não se restringir somente ao ventrículo direito, pois já foi descrita
disfunção miocárdica biventricular durante a embolia pulmonar (Sullivan et al.
2001).
1.3.2. Vasoconstrição pulmonar mediada por fatores humorais
A vasoconstrição e a liberação de alguns fatores humorais também agravam
a EPA. Estes vasoconstritores pulmonares incluem: tromboxano A
2
, serotonina,
endotelina-1, PAF (fator ativador de plaquetas), histamina e algumas
prostaglandinas (Wood 2002a). A liberação destes vasoconstritores pulmonares
23
durante a EPA, somada à obstrução física do leito vascular pulmonar, agrava as
alterações hemodinâmicas, aumentando ainda mais a chance de levar à morte.
Dentre eles o mais potente vasoconstritor pulmonar conhecido é a
serotonina (5-hidroxitriptamina – 5HT). A 5HT é produzida pelas células
enterocromafins gastrintestinais, neurônios serotoninérgicos, células neuro-
endócrinas pulmonares e por plaquetas ativadas. A 5HT causa vasodilatação
sistêmica e apresenta propriedade inotrópica positiva (Liras et al. 2000),
(Egermayer et al. 1999).
O tromboxano A
2
(TxA
2
) também é um potente vasoconstritor pulmonar e
sistêmico, derivado do metabolismo do ácido araquidônico, podendo ser liberado
em quantidades importantes pelas plaquetas ativadas após a EPA. Outra fonte de
TxA
2
é o endotélio vascular e os monócitos circulantes (Smulders 2001).
Um outro importante fator humoral produzida pelo endotélio vascular que
causa intensa e sustentada vasoconstrição pulmonar sustentada vasoconstrição
pulmonar é a endotelina (ET). Há vários subtipos de endotelina, tais como a
endotelina-1 (ET-1), conhecida por sua capacidade de causar hipertensão
pulmonar, e também seu precursor a big-endotelina. A ET-1 ainda causa a
vasoconstrição coronariana. (Battistini 2003; Lee et al. 2001a).
O fator de ativação das plaquetas (PAF) é produzido e liberado pela
maioria das células inflamatórias e pelas plaquetas, quando estimuladas; e
também participa de uma das etapas da síntese de TxA
2
plaquetário (Smulders
2001). Estudos revelaram que o PAF causa hipotensão sistêmica, hipertensão e
24
edema pulmonar, além de induzir a vasoconstrição pulmonar quando o tônus
vascular está reduzido (Barnes et al. 1995).
A histamina é encontrada em vários tecidos do corpo, porém está presente
em altas concentrações nos pulmões e na pele. Ela causa vasoconstrição nos
vasos pulmonares, um efeito oposto ao observado na circulação sistêmica. (Barnes
& Liu 1995).
Após a instalação da EPA são liberadas prostaglandinas (PG). Algumas
apresentam atividade vasoconstritora pulmonar e outras, atividade vasodilatadora
(Broeders et al. 2001). Um exemplo de prostaglandina com atividade
vasodilatadora pulmonar é a prostaciclina (PGI
2
) (Hill et al. 1999; Liu et al. 1999).
Outro vasodilatador é o óxido nítrico (NO), o qual, administrado por via inalatória,
produziu dilatação seletiva dos vasos pulmonares em condições de hipertensão
arterial pulmonar induzida experimentalmente (Bottiger et al. 1996; Tanus-Santos et
al. 1999a; Tanus-Santos et al. 1999b; Tanus-Santos et al. 2002; Weimann et al.
1999).
1.4 Alguns marcadores associados com a gravidade da EPA
Marcadores bioquímicos têm sido usados na avaliação da gravidade de
síndromes cardíacas que levam à lesão miocárdica.
Um destes marcadores são as troponinas T (cTnT) e I (cTnI) cardíacas. Tais
troponinas são componentes do aparato contrátil miofibrilar do músculo cardíaco.
25
Em indivíduos saudáveis, geralmente não são detectadas no sangue. Estas
proteínas de baixo peso molecular são liberadas na circulação após uma lesão nos
miócitos por isquemia, lesão tóxica, infarto, trauma ou inflamação (Apple 1999;
Imazio et al. 2003). O uso diagnóstico das concentrações circulantes de troponinas
como indicadores de lesão cardíaca está bem estabelecido em pacientes com
infarto agudo do miocárdio (Katus et al. 1991). Em pacientes com EPA, apesar dos
níveis elevados de troponinas no sangue, as razões para tal não estão
completamente definidas, mas as troponinas permanecem aumentadas por 2 a 3
dias (Muller-Bardorff et al. 2002). A lesão no miocárdio resultante da embolia
pulmonar provavelmente ocorre por redução do débito cardíaco e do fluxo
sanguíneo coronário, ambos associados a aumentos da pós-carga no ventrículo
direito (Hamm et al. 2002).
Aumentos das concentrações de troponinas cardíacas ocorrem em, pelo
menos, um terço dos pacientes com embolia pulmonar severa. Mas como são
altamente sensíveis em caso de lesão do miócito, é possível que elas também
estejam aumentadas em quadros menos graves de embolia. Assim, um estudo com
24 pacientes com EPA de grau brando, sem histórico de doença cardíaca, mostrou
que a cTnI aumentou em 20,8% destes pacientes (0,4 µg/L) (Douketis et al. 2002).
Em outro estudo, com 64 pacientes com EPA de gravidade branda, a cTnT
(> 0,1 µg.L
-1
) ocorreu em 50% dos pacientes e também foi associada com risco
aumentado de morte (Konstantinides et al. 2002). Ainda, Mehta et al (2003),
estudaram 38 pacientes com EPA, dos quais 47% (18) apresentaram níveis
elevados de TnI. Destes 18 pacientes, 12 apresentaram pressão sistólica do
26
ventrículo direito alterada comparado ao grupo controle, o que aumenta em 33% a
chance de desenvolvimento de um choque cardiogênico (Mehta et al. 2003).
As troponinas cardíacas são consideradas marcadores bem sensíveis em
síndromes cardíacas que levam à lesão miocárdica. Tanto a troponina T quanto a
troponia I são codificadas por três genes diferentes, que resultam nas duas
isoformas do músculo esquelético e na isoforma cardíaca. Ainda, a TnI é
unicamente específica para o coração, apresentando uma seqüência de 31
aminoácidos na porção N-terminal, que a difere das formas do músculo esquelético
(Apple, 1999).
Ainda, alguns trabalhos enfocam que a TnI não está tão fortemente ligada
aos filamentos finos dentro das células cardíacas, sendo assim, poderiam ser
extraídas dos miócitos bem antes de outras proteínas (Strauss et al 1992; Shiraishi
et al 1992). Isto sugere que durante uma lesão cardíaca, a TnI pode ser a proteína
inicialmente liberada na corrente sanguínea. Dessa forma, a TnI pode ser
considerada um marcador superior à TnT (Mullen et al 2002).
Outro marcador associado com a gravidade da EPA é o peptídeo natriurético
do tipo B (BNP). O BNP é sintetizado na forma de um precursor, o pré-pró-BNP,
que é clivado a pró-BNP, que após algumas reações forma o BNP, um
neurohormônio secretado principalmente pelos ventrículos cardíacos em resposta a
um aumento de pressão. Apresenta potente ação diurética e propriedade
vasorelaxante sistêmica (Aubert 2005).
Um estudo avaliou os níveis de BNP em pacientes com lesão pulmonar
aguda e demonstrou uma correlação do BNP com o índice de resistência vascular
27
sistêmica (R=0,708) e o índice de resistência vascular pulmonar (0,573) (Mitaka et
al. 1997). Outro estudo, demonstrou-se que os níveis do BNP estão aumentados
proporcionalmente ao grau de disfunção do ventrículo direito em pacientes com
EPA e que, quando administrou-se uma terapia vasodilatora por um tempo
prolongado, os níveis de BNP caíram de 315 pg/mL para 144 pg/mL (Nagaya et al.
1998).
Pelos achados obtidos até então, tanto o BNP quanto as TnT e TnI
apresentam importância clínica como um apoio suplementar na triagem e avaliação
do risco de gravidade em pacientes com EPA. No entanto, as troponinas cardíacas,
em especial a TnI, parece-nos atuar como marcadores mais sensíveis.
1.5. Metaloproteinases da matriz extracelular
A matriz extracelular tem uma composição estrutural biologicamente ativa e
dinâmica, com proteínas fibrosas embebidas em um meio hidratado por
proteoglicanas e glicosaminoglicanas. A habilidade das células detectarem
pequenas diferenças na combinação específica, concentração e componentes da
matriz sugere que perturbações na homeostase da matriz possam permitir a
remodelagem da parede vascular. Isso ocorre após uma lesão vascular em várias
condições patológicas (Coats et al. 1997).
28
Enzimas proteolíticas únicas e específicas, as metaloproteinases (MMPs),
regulam a integridade da matriz extracelular. Consistem, atualmente, de uma
família com mais de 20 tipos que apresentam diferentes substratos. As MMPs são
enzimas zinco-dependentes que degradam várias proteínas da matriz extracelular
(colágeno, elastina, proteoglicanas) e têm importantes papéis em vários processos
fisiológicos (desenvolvimento embrionário, morfogênese, reprodução, reabsorção
e remodelagem tecidual) e patológicos (destruição de cartilagem em artrite,
ruptura de placa aterosclerótica, reestenose miocárdica, desenvolvimento de
aneurismas, metástase tumoral, degeneração macular, entre outros) (Corbel et al.
2000).
Entre as MMPs, incluem-se: colagenases (MMP-1, MMP-8 e MMP-13),
gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-10 e MMP-11) e as
MMPs tipo membrana (MT1-MMP). A maioria é secretada livremente no espaço
extracelular, mas algumas são estocadas dentro de células, como a MMP-9, que
se acumula em grânulos de neutrófilos. Outras MMPs são ancoradas à superfície
celular, como a MT1-MMP (Corbel et al. 2000; Hobeika et al. 2007; Nagase et al.
2006)
As MMPs são organizadas em uma estrutura principal que compreende três
domínios básicos e bem conservados: um domínio pro-peptídeo no sítio
aminoterminal da cadeia polipeptídica, um domínio catalítico e um domínio
hemopexina-like na porção carboxiterminal da cadeia polipeptídica, o qual possui
29
similaridades estruturais com a hemopexina e com a vitronectina (Massova et al.
1998).
As MMPs são secretadas na forma de precursores inativos (zimogênios)
cuja latência é mantida através da interação entre o resíduo de cisteína presente
no domínio pró-peptídico com o zinco presente no domínio catalítico, bloqueando
o acesso deste ao substrato. São ativadas no tecido por clivagem do domínio pró-
peptídico que vai deixar o sítio catalítico livre para interação com o substrato
(Visse et al. 2003). A exposição do sítio catalítico também permite a lise de
substrato por pró-MMPs e é o fundamento para a detecção de ambas MMPs,
latentes e ativadas, na presença de SDS por zimografia (Galis et al. 2002).
Enzimas, como a plasmina, e algumas MMPs podem ativar as próprias
MMPs. Porém, num ambiente com lesão vascular, as pró-MMPs podem ser
ativadas por agentes não proteolíticos, com grupamentos SH, como sais de
mercúrio (APMA), ácido hipocloroso e glutationa oxidada, agentes desnaturantes,
como o SDS e a uréia, e espécies reativas do oxigênio (ROS) (Nagase et al.
1999).
As MMPs têm suas atividades reguladas em vários níveis: transcrição
gênica, síntese de zimogênios inativos, ativação dos zimogênios (pró-enzima)
após tradução e interação das MMPs com inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs). Na realidade, o microambiente vascular providencia
modos específicos de regulação das MMPs. A regulação inibitória da atividade das
MMPs é realizada por um inibidor não específico (α
2
-macroglobulina) ou por
30
inibidores específicos (os TIMPs). Os TIMPs regulam a atividade das MMPs nos
tecidos, enquanto a α
2
-macroglobulina regula no plasma. Os TIMPs compreendem
4 proteínas: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e o TIMP 4, os quais inibem a atividade das
MMPs por ligação não covalente ao domínio catalítico das mesmas. Formam-se,
assim, complexos de alta afinidade 1:1 (Kranzhofer et al. 1999; Sang 1998;
Willenbrock et al. 1993). Isso implica que os processos biológicos envolvidos com
as MMPs são sempre dependentes do balanço entre proteinases e seus inibidores
naturais. Assim, o desequilíbrio desse balanço resulta em doenças associadas
com proteólise descontrolada do tecido conectivo, como em doenças crônicas
degenerativas, em tumores e na inflamação (Gomez et al. 1997).
1.6. Possível relevância das MMPs na EPA
Estudos têm demonstrado que a ativação da MMP-2 e/ou MMP-9 pode atuar
de modo a aumentar a ação de peptídeos vasoativos constritores como a
endotelina, ou diminuir a ação vasodilatadora pulmonar de outros peptídeos como
o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e a adrenomedulina.
Fernandez-Patron et al demonstraram que a MMP-2 vascular pode clivar big
endotelina-1 (1-38) em endotelina-1 (1-32), que é um potente vasoconstritor
pulmonar. Este mesmo autor também demonstrou que esta mesma enzima foi
capaz de clivar o CGRP em peptídeos com ações vasodilatadoras menos potentes
31
(Fernandez-Patron et al. 1999; Fernandez-Patron et al. 2000; Fernandez-Patron et
al. 2001).
Recentemente, nosso grupo demonstrou que as MMPs, especificamente a
MMP-9 e talvez a MMP-2, podem participar da hipertensão arterial pulmonar
associada à EPA. Em um dos trabalhos, a EPA foi associada com o aumento da
atividade da MMP-9 e MMP-2 no pulmão. A L-arginina, nas concentrações de 3 e
10 mmol/L, atenuou este aumento de MMPs após a embolia (Souza-Costa et al.
2005b). Ainda, em outro estudo, demonstrou-se que a inibição da MMP-9 atenuou
os efeitos hemodinâmicos provocados na EPA em modelos experimentais
diferentes (Fortuna et al. 2006; Palei et al. 2005).
Estas evidências sugerem que as MMPs estejam envolvidas na hipertensão
pulmonar associada à EPA. Entretanto, nenhum estudo avaliou, até o presente
momento, a existência de uma possível correlação entre a gravidade dos
distúrbios hemodinâmicos e o aumento de MMP-2 e MMP-9 plasmáticas durante
EPA experimental. Parece-nos importante examinar esta hipótese, tendo em vista
que a existência de tal correlação daria maior sustentação à participação das
MMPs na fisiopatologia da hipertensão pulmonar associada à EPA. Além disso,
havendo tal correlação, o uso de drogas inibidoras das MMPs poderiam ser
usadas como terapia farmacológica no sentido de melhorar a condição do
paciente com hipertensão pulmonar associada a EPA.
32
2. HIPÓTESE
33
Baseados em estudos prévios nos quais as troponinas cardíacas e as MMPs
estão aumentadas na hipertensão pulmonar associada a EPA, pretendemos
avaliar se as concentrações plasmáticas de troponina I e de MMPs 2 e 9, além dos
distúrbios hemodinâmicos, aumentam em proporção a gravidade da embolia
pulmonar aguda experimental em cães.
34
3. OBJETIVOS
35
a. Verificar alterações nas concentrações plasmáticas de troponina I de cães
submetidos a diferentes graus de embolia;
b. Verificar alterações nas concentrações plasmáticas de MMP-9 da matriz
extracelular de cães submetidos a diferentes graus de embolia;
c. Verificar também, possíveis alterações de MMP-2 da matriz extracelular
de cães submetidos a diferentes graus de embolia.
d. Verificar se há correlação entre os parâmetros acima mencionados.
36
4. MATERIAIS E MÉTODOS
37
4.1 Preparo e monitorização dos animais
Os protocolos e procedimentos cirúrgicos empregados neste estudo foram
aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (CETEA-FMRP) em sua 12º Reunião Ordinária
realizada em 26 de abril de 2004 (Protocolo Nº 002/2004).
Vinte e seis cães mestiços de ambos os sexos (peso médio ± desvio
padrão = 10,4 ± 2,4 kg) foram obtidos do Biotério Central – Campus da USP de
Ribeirão Preto, e anestesiados com Cetamina (25 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg)
via intramuscular. A manutenção da anestesia foi feita com injeções intramuscular
repetidas a cada hora de Cetamina (10 mg/kg) e Xilazina (5 mg/kg). Após a
entubação traqueal, os animais foram ventilados mecanicamente com um
ventilador (Ventilador EFRA ROAD C.F., Palmer SWZ Ltda, London, UK),
utilizando-se ar ambiente e volume corrente de 15 ml/kg. A ventilação mecânica
foi realizada com o auxilio do bloqueador neuromuscular (pancurônio - 0,10
mg/kg) administrado em dose única por via intravenosa, na veia femoral
esquerda. A freqüência respiratória foi ajustada de modo a se obter níveis
fisiológicos de PaCO
2
(30 a 40 mmHg), verificados através da análise
gasométrica.
Para a monitorização hemodinâmica, foi inicialmente introduzido um cateter
em uma das artérias femorais, cuja extremidade ficou posicionada na artéria
aorta, visando-se obter medida direta da pressão arterial média (PAM). A veia
38
femoral direita foi isolada e introduzido um cateter de Swan-Ganz 7,5-F (Edwards
Lifesciences, USA), cuja extremidade distal ficou posicionada num dos ramos da
artéria pulmonar, objetivando-se medir os seguintes parâmetros hemodinâmicos:
pressão média da artéria pulmonar (PMAP) e pressão de oclusão da artéria
pulmonar (Poap). Cada registro apresentou curvas de pressão com características
típicas de cada localização anatômica, ou seja, de cada vaso sanguíneo ou
câmara cardíaca. Todos os cateteres de pressão foram acoplados aos
transdutores de pressão do monitor hemodinâmico (Dixtal modelo DX2010, Dixtal
do Brasil, Manaus, Brasil).
O débito cardíaco (DC) foi avaliado em triplicata pelo método da
termodiluição, que consiste no seguinte: esse método usa a temperatura de salina
resfriada e a quantidade de temperatura perdida ao atravessar o cateter, ou seja,
após a injeção de 3 ml de salina resfriada, a queda de temperatura é registrada
inicialmente pelo termistor proximal incorporado no cateter de Swan-Ganz.
Imediatamente após a injeção de salina resfriada, o tempo necessário para o
retorno à temperatura fisiológica (38ºC de um cão saudável) é determinado pelo
volume de sangue bombeado pelo coração por minuto, o débito cardíaco (DC).
Desta forma, o termistor distal do cateter de Swan-Ganz registra o momento em
que o sangue retorna a 38ºC. Essas medidas de débito cardíaco apresentaram
um coeficiente de variação menor que 5 por cento (CV <5%).
A diferença de temperatura foi, então, calculada “automaticamente” e a
temperatura corporal central foi determinada pelo monitor, pois o termistor denota
39
a temperatura específica conforme designada por sua resistência elétrica e
calcula a área da curva da temperatura em função do tempo.
As gasometrias arteriais foram executadas no gasômetro (Stat Profile 5
Analyser; Biomedical, Waltham, MA) do Laboratório Central de Patologia Clínica
do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto.
Os animais foram sacrificados no final de cada experimento por meio da
injeção endovenosa de cloreto de potássio.
4.2. Cálculo do índice de Resistência Vascular Pulmonar (IRVP)
IRVP= PMAP - Poap x 80
IC
onde 80 é uma constante que converte mmHg/l/min em dyn.s/cm
-5
e IC é o índice
cardíaco que foi calculado conforme a fórmula a seguir:
IC = DC
ASC
onde ASC é a área de superfície corpórea calculada de acordo com a fórmula
abaixo:
ASC = [peso(kg)]
0,425
x [comprimento(m)]
0,007184
(Wood 2002b), sendo que o
comprimento do cão foi medido do focinho ao ânus.
A freqüência cardíaca (FC) foi avaliada através do eletrocardiograma de
superfície (ECG de derivação DII).
40
4.3. Protocolo experimental
Antes do início do experimento propriamente dito, foi colhido 5 mL de
sangue venoso/kg do animal com agulha e seringa estéreis. Este sangue foi
acondicionado adaquadamente em placa de vidro por 1 hora para que
coagulasse. Então, o coágulo foi cortado grosseiramente e passado através de
uma peneira (tamis), de poros iguais a 3 mm. Assim, conseguimos coágulos de
2-3 mm de diâmetro. Tais coágulos foram misturados a 10 mL de salina 0,9%, 5
minutos antes da indução da embolia (todos os materiais utilizados neste
procedimento foram lavados com água, detergente neutro e álcool).
Após anestesia, monitorização e estabilização hemodinâmica por 20
minutos, foi feita a avaliação hemodinâmica inicial (Basal). Foi coletado 1 mL de
sangue arterial (em seringa estéril heparinizada) para análise gasométrica, bem
como 4 mL de sangue arterial adicionados a tubos contendo solução de EDTA
(1 mg/mL de sangue) para a separação do plasma por centrifugação (1000 g por
10 minutos) e armazenamento a -70ºC para posteriores análises bioquímicas.
Também foram coletados mais 5 mL de sangue e colocado em tubo estéril para
que, após a retração do coágulo, o mesmo fosse centrifugado (1000 g por 10
minutos) para a separação do soro. Após, foram feitas alíquotas de 1 mL e
acondicionadas a -70ºC para posteriores análises bioquímicas.
A embolia foi induzida por infusão dos coágulos autólogos por 5-10 minutos
com o auxílio de uma seringa estéril conectada à cânula de calibre espesso
41
inserida no átrio direito (Lee et al. 2001b). O estudo foi composto por 4 grupos
experimentais:
* o grupo Sham (n=6): recebeu apenas a infusão de salina durante o período
experimental;
* Trombo 1 (T
1
, n=6): infusão de 1 mL de coágulo/Kg
* Trombo 3 (T
3
, n=6): infusão de 3 mL de coágulo/Kg
* Trombo 5 (T
5
, n=8): infusão de 5 mL de coágulo/Kg
Foram avaliados as medidas hemodinâmicas e colhidas amostras de
sangue arterial, de cada grupo, nos momentos basal e 120 minutos após a
embolia. O esquema a seguir (figura 1) ilustra o procedimento experimental
explicado acima:
Figura 1. Desenho esquemático do protocolo experimental antes e após a EPA
Basal
E120
A
nestesia e
monitoriza
ç
ão
Embolia pulmonar aguda (EPA)
Infusão de salina ou
L-
NAME
(10
mg
/
kg+4mg/kg/hora)
ou
Aminoguanidina
(10
mg
/kg+2mg/kg/hora)
Basal
E120
A
nestesia e
monitoriza
ç
ão
Infusão de coágulo autólogo (1 mL/Kg
ou 3 mL/Kg ou 5 mL/Kg)
20 minutos de
estabilização
42
4.4. Zimografia para MMP-2 e MMP-9 das amostras de plasma dos cães
A atividade da MMP-2 e MMP-9 no plasma foi determinada pelo método da
zimografia, que consiste em uma eletroforese das amostras em um sistema
SDS/PAGE que inclui o substrato da enzima (gelatina) no gel de separação, de
modo a permitir a evidenciação e quantificação da atividade da MMP-2 e MMP-9.
Um microlitro de plasma foi utilizado para a visualização das bandas das MMPs no
gel de eletroforese, diluídas em tampão de amostra não-redutor (solução aquosa
de Tris/Cl pH 6,8 - 0,1 mol/L, 20% de glicerol, 1% de SDS e 0,001% de azul de
bromofenol), na proporção 1:1. As amostras assim preparadas, bem como um
padrão interno de soro fetal bovino (LGC BIO), foram separadas através de
eletroforese em um sistema descontínuo de tampões, em géis de poliacrilamida
preparados no laboratório a uma concentração de 7% e co-polimerizados com
gelatina a 1% (SIGMA). Antes da aplicação no gel, as amostras e o padrão de
soro fetal bovino foram submetidos por 15 minutos a um banho maria a 40°C.
Após a corrida de aproximadamente 5 horas, os géis foram submetidos a
dois banhos de 30 minutos cada (temperatura ambiente) em solução de Triton X-
100 2,0% para renaturar as enzimas e, em seguida, incubados durante 16 horas
em tampão Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4, contendo CaCl
2
a 10 mM, à temperatura de
37
0
C. Após, os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue G-250 0,05% por
3 horas, para logo em seguida serem descorados por 15, 30 e 60 minutos em
43
metanol 30% e ácido acético 10% até a visualização das bandas características
da atividade gelatinolítica das MMPs: bandas claras contra um fundo azul escuro.
A semi-quantificação da atividade das gelatinases foi realizada através de
densitometria das bandas usando o sistema de fotodocumentação Kodak
Electrophoresis Documentation and Analysis System (EDAS) 290 (Kodak,
Rochester, NY). A pró-MMP-2 e a pró-MMP-9 foram identificadas como bandas de
67 KDa e 92 KDa, respectivamente.
4.5. Dosagem da troponina I
A troponina I cardíaca foi dosada em amostras de soro. Tratou-se de um
imunoensaio enzimático (tipo sanduíche) quimioluminescente com dois sítios em
que foi usado o Kit Immulite (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA,
USA).
A fase sólida, uma pérola de poliestireno encapsulada dentro da unidade
teste IMMULITE é recoberta com anticorpo monoclonal específico a troponina I de
murino. Enquanto o soro do paciente e a fosfatase alcalina conjugada a anticorpo
policlonal específico a troponina I de cabra são incubados por 30 minutos a 37ºC
na unidade teste, com agitação intermitente, a troponina I da amostra é ligada de
maneira a formar um complexo de anticorpos tipo "sanduíche". O conjugado não
ligado é então removido pela lavagem por centrifugação, o substrato é adicionado
44
e a unidade teste é incubada por mais 10 minutos. O substrato quimiluminescente
usado na reação enzimática é um éster de adamantil fosfato dioxetano, o qual é
submetido a hidrólise na presença da fosfatase alcalina gerando um intermediário
instável. A produção contínua deste intermediário resulta na emissão de luz
ininterrupta aumentando assim a precisão por prover uma janela para múltiplas
leituras. O complexo ligado, assim como sua emissão de fótons são medidos pelo
luminômetro, no analisador Immulite (Diagnostic Products Corporation, Los
Angeles, CA, USA), sendo proporcional a concentração de troponina I existente na
amostra. A concentração mínima detectável pelo ensaio é de 0,35 ng de
troponina I/mL.
4.6. Análise Estatística
Os resultados pertinentes às medidas hemodinâmicas bem como os
resultados da troponina I foram apresentados como média e seus respectivos erro
padrão da média (média +
EPM). Os resultados relacionados à dosagem das
MMPs 2 e 9 foram expressos como delta %.
A comparação entre os grupos experimentais foi feita por uma análise de
variância de uma via (ANOVA), a cada momento experimental, seguido do teste
de Student-Newman-Keuls (Stat View for Windows, Cary, NC). As mudanças nos
45
marcadores bioquímicos foram analisadas por um teste T de Student, seguido do
teste pareado de Wilcoxon.
A correlação de Spearman foi calculada para as associações entre os
parâmetros hemodinâmicos e os marcadores bioquímicos. Foi considerado
estatisticamente significativo o valor mínimo de probabilidade < 0,05 (*= p < 0,05).
46
5. RESULTADOS
47
5.1. Resultados hemodinâmicos
Os resultados pertinentes aos parâmetros respiratórios e hemodinâmicos
basais foram similares em todos os grupos experimentais, conforme apresentados
a seguir. A embolização do pulmão levou a uma tendência de aumento do IRVP e
a PMAP proporcionalmente à gravidade da EPA (todos * p<0,05; figura 2 e tabela
1, figura 3 e tabela 2, respectivamente).
48
Figura 2 – Índice de resistência vascular pulmonar (IRVP) nos momentos basal e 120
minutos após a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os
valores são as médias ± E.P.M. (E120 versus medidas do momento basal).
Tabela 1. Índice de resistência vascular pulmonar em dinas.cm
-5
.m
-2
IRVP (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal 199 ± 23 231 ± 17 246 ± 30 219 ± 30
E 120
266 ± 37 *522 ± 117 *642 ± 126 *957 ± 159
Grupos T1, T3 e T5, todos no momento E120, versus medidas do momento basal
S
ham
B
T1 B T3 B T5 B
S
ham 12
0
T
1 120
T
3 120
T
5 120
0
250
500
750
1000
1250
Sham (n= 6)
T1 (n= 6)
T3 (n= 6)
T5 (n= 8)
Basal
E120
*
*
*
IRVP
(dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
49
Figura 3 – Pressão média da artéria pulmonar (PMAP) nos momentos basal e 120
minutos após a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os
valores são as médias ± E.P.M. (E120 versus medidas do momento basal).
Tabela 2. Pressão média da artéria pulmonar em mmHg
PMAP (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal 14 ± 1,7 9,8 ± 1,2 11 ± 1,7 12 ± 0,84
E 120
15 ± 1,5 *20 ± 2,5 *23 ± 2,2 *29 ± 2,4
Grupos T1, T3 e T5, todos no momento E120, versus medidas do momento basal
S
HAM
B
T1 B T3 B T5 B
S
HAM 120
T
1 120
T
3 120
T
5 120
0
10
20
30
40
Basal E120
*
*
*
PMAP (mmHg)
50
A hipertensão pulmonar induzida pela EPA foi associada com hipoxemia
significante apenas no grupo T5, como é observado nas figuras 4 (seguida da
tabela 3) e 5 (seguida da tabela 4):
Figura 4 – Pressão parcial do oxigênio no sangue arterial (PO
2
) em mmHg nos momentos
basal e 120 minutos após a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1,
T3 e T5. Os valores são as médias ± E.P.M. (E120 versus medidas do momento basal).
Tabela 3. Pressão parcial do oxigênio em mmHg, no sangue arterial
PO
2
(média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal 86 ± 4,3 90 ± 2,8 91 ± 3,2 85 ± 8
E 120
82 ± 6 80 ± 2,8 73 ± 3,4 *59 ± 11
Grupo T5, no momento E120, versus medidas do momento basal
S
HAM
B
T1 B T3 B T5 B SHAM 12
0
T
1 120
T
3 120
T
5 120
0
25
50
75
100
Basal
E120
*
PO
2
(mmHg)
51
Sham
B
T1 B T3 B T5 B Sham
1
T
1 120
T
3 120
T
5 120
0
25
50
75
100
Baseline
E120
*
SaO
2
(%)
Figura 5 – Saturação do oxigênio (SaO
2
) em % nos momentos basal e 120 minutos após
a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os valores são
as médias ± E.P.M. (E120 versus medidas do momento basal).
Tabela 4. Saturação do oxigênio em percentual (%)
SaO
2
(média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal 100 100 100 100
E 120
95 ± 1,1 91 ± 2,5 89 ± 1.8 *86 ± 4,4
Grupo T5, no momento E120, versus medidas do momento basal
Basal
52
Conforme apresentado abaixo na figura 6 e tabela 5, respectivamente, a
pressão arterial média não apresentou diferença estatística entre os grupos. Os
grupos experimentais apresentaram comportamento similar tanto no momento
basal quanto no momento 120 minutos após embolia (E120).
Figura 6 – Pressão arterial média (PAM) em mmHg nos momentos basal e 120 minutos
após a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os valores
são as médias ± E.P.M.
Tabela 5. Pressão arterial média em mmHg
PAM (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal
114 ± 4,1 102 ± 5,7 109 ± 4,5 101 ± 4,9
E 120
118 ± 4,5 102 ± 2,0 112 ± 7,5 98 ± 5,2
S
HAM
B
T1 B T3 B T5 B SHAM 12
0
T1 120T3 120T5 120
0
25
50
75
100
125
150
Basal
E120
PAM (mmHg)
53
Os resultados hemodinâmicos de freqüência cardíaca e índice cardíaco
apresentados na figura 7 e tabela 6, e figura 8 e tabela 7, respectivamente, não
apresentaram diferença significativa entre os grupos experimentais. Os grupos
experimentais apresentaram comportamento similar tanto no momento basal
quanto no momento 120 minutos após embolia (E120).
Figura 7 – Freqüência cardíaca (FC) em batimentos/minutos (bat/min) nos momentos
basal e 120 minutos após a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1,
T3 e T5. Os valores são as médias ± E.P.M.
Tabela 6. Freqüência cardíaca em batimentos/minutos
FC (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal
88 ± 4,7
94 ± 7,4 88 ± 5,0 96 ± 3,4
E 120
95 ± 8,3 103 ± 7,6 96 ± 4,6 109 ± 6,7
S
HAM
B
T1 B T3 B T5 B SHAM 12
0
T1 120T3 120T5 120
0
25
50
75
100
125
Basal
E120
FC (bat/min)
54
Figura 8 – Indice cardiaco (IC) em l.min
-1
.m
-2
nos momentos basal e 120 minutos
após a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os
valores são as médias ± S.E.M.
Tabela 7. Índice cardíaco em l.min
-1
.m
-2
IC (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal
2,2 ± 0,16
2,1 ± 0,27 2,5 ± 0,09 2,3 ± 0,19
E 120
1,9 ± 0,11 2,1 ± 0,7 2,3 ± 0,26 1,9 ± 0,11
S
HAM
B
T1 B T3 B T5 B SHAM 12
0
T1 120T3 120T5 120
0
1
2
3
Basal
E120
IC (l.min
-1
.m
2
)
55
5.2. Resultado da dosagem de troponina I
Com relação ao ensaio da troponina I, os animais Sham não apresentaram
mudanças significativas, enquanto a embolização no pulmão foi associada com
aumento significativo da troponina I no soro, nos grupos T1, T3 e T5, conforme
sugere a figura 9, cujos dados numéricos são expressos na tabela 8.
Figura 9 – Concentração de troponina I no soro nos momentos basal e 120 minutos após
a tromboembolia pulmonar aguda (E120) nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os valores são
as médias ± E.P.M. (E120 versus medidas do momento basal).
Tabela 8. Concentração de troponina I em ng/mL no soro
Troponina I (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal
0,22 ± 0,02
0,34 ± 0,09 0,42 ± 0,1 0,38 ± 0,11
E 120
0,31 ± 0,11 0,67 ± 0,17 0,86 ± 0,30 1,2 ± 0,40
Grupos T1, T3 e T5, todos no momento E120, versus medidas do momento basal
Sham
B
T1 B T3 B T5 B Sham T1 12
0
T3 12
0
T5 12
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Sham (n= 6)
T1 (n= 6)
T3 (n= 6)
T5 (n= 8)
Basal
E120
*
*
*
Troponina I (ng/mL)
56
0 250 500 750 1000 1250
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Sham (n=6)
T1 (n=6)
T3 (n=6)
T5 (n=8)
rs= 0.833
P= 0.007
IRVP (dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
Troponina I (ng .mL
-1
)
0 250 500 750 1000 1250
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
PRVI (dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
Serum Troponin I (ng.mL
-1
)
0 10 20 30 40
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
PRVI (dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
Serum Troponin I (ng.mL
-1
)
A troponina I no soro correlacionou-se positivamente com o IRVP (p=0,007
e rs=0,833) e com a PMAP (p=0,005 e rs=0,610), conforme é mostrado pelas
figuras 10 e 11, respectivamente:
Figura 10 – Correlação entre a concentração de troponina I e o índice de resistência
vascular pulmonar (IRVP). Linha de regressão, intervalo de confiança de 95% e
coeficiente de correlação de Spearman (rs), foram plotados.
Figura 11– Correlação entre a concentração de troponina I e a média da pressão arterial
pulmonar (PMAP). Linha de regressão, intervalo de confiança de 95% e coeficiente de
correlação de Spearman (rs), foram plotados.
0 10 20 30 40
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
rs= 0.610
P= 0.005
PMAP (mmHg)
Troponina I (ng .mL
-1
)
57
5.3. Resultados da atividade gelatinolítica (zimografia) das
metaloproteinases 2 e 9
Com relação ao ensaio da zimografia nas amostras de plasma, enquanto a
atividade da pró-MMP-2 não aumentou significativamente após a EPA (figura 12 e
tabela 9, respectivamente), a pró-MMP-9 aumentou aproximadamente 80% no
grupo T5 (figura 13 e tabela 10, respectivamente), enquanto nos grupos T1 e T3
não ocorreram aumentos significativos.
Figura 12 – Delta percentual em relação ao momento basal (100%) da atividade
gelatinolítica da pró-MMP-2 nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os valores são o delta % ±
E.P.M.
Tabela 9. Atividade gelatinolítica de pró-MMP-2 em delta %, no plasma
pró-MMP-2 (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal 100 100 100 100
E 120
103 ± 13 121 ± 5.2 113 ± 17 115 ± 11
S
ham
B
T1 B T3 B T5 B
S
ham 12
0
T
1 120
T
3 120
T
5 120
0
50
100
150
Basal
E120
Atividade gelatinolítica da
pro-MMP-2 (Delta%)
58
Figura 13 – Delta percentual em relação ao momento basal (100%) da atividade
gelatinolítica da pró-MMP-9 nos grupos Sham, T1, T3 e T5. Os valores são o delta % ±
E.P.M. (T5 no momento E120 versus medidas do momento basal)
Tabela 10. Atividade gelatinolítica de pró-MMP-9 em delta %, no plasma
Pró-MMP-9 (média ± erro padrão)
Momentos Grupos
SHAM T1 T3 T5
Basal 100 100 100 100
E 120
98 ± 5,2 129 ± 17 134 ± 29 *187 ± 32
Grupo T5 no momento E120, versus medidas do momento basal
A figura 14 abaixo ilustra um gel de zimografia, enfatizando as bandas
características de pró-MMP-2 e da pró-MMP-9:
Sham
B
T1 B T3 B T5 B Sham T1 12
0
T3 12
0
T5 12
0
0
50
100
150
200
250
Basal
E120
*
Atividade gelatinolítica da
pró-MMP-9 (Delta %)
BL E120 BL E120 BL E120 BL E120
Sham T3 T5 T1
pro-MMP-9
pro-MMP-2
59
0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
250
PRVI (dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
% of baseline
MMP-9 levels
A atividade da pró-MMP-9 correlacionou-se positivamente com o IRVP
(p=0,034 e rs=0,684) e com a PMAP (p=0,022 e rs=0,720), observado nas figuras
15 e 16, respectivamente, abaixo:
0 250 500 750 1000 1250
0
50
100
150
200
250
PRVI (dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
% of baseline
MMP-9 levels
Figura 15 - Correlação entre a atividade da pró-MMP-9 e o índice de resistência vascular
pulmonar (IRVP). Linha de regressão, intervalo de confiança de 95% e coeficiente de
correlação de Spearman (rs) foram plotados.
Figura 16 - Correlação entre a atividade da pró-MMP-9 e a pressão média da artéria
pulmonar (PMAP). Linha de regressão, intervalo de confiança de 95% e coeficiente de
correlação de Spearman (rs) foram plotados.
0 250 500 750 1000 1250
0
50
100
150
200
250
rs= 0.684
P= 0.034
Sham (n=6)
T1 (n=6)
T3 (n=6)
T5 (n=8)
IRVP (dyn.s.cm
-5
.m
-2
)
pro-MMP-9 (Delta%)
0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
250
rs= 0.720
P= 0.022
PMAP (mmHg)
pro-MMP-9 (Delta %)
60
6. DISCUSSÃO
61
6.1. As alterações hemodinâmicas
A trombose venosa profunda é a causa principal da migração de êmbolos
para o s pulmões com conseqüente obstrução dos vasos pulmonares (Sadosty et
al. 2003a). Assim sendo, o modelo de EPA em cães escolhido por nosso grupo,
buscou aproximar-se da realidade, como forma de obter resultados mais
fidedignos com a fisiopatologia da doença, diferentemente de estudos prévios nos
quais trombos exógenos ou outros materiais são injetados na circulação pulmonar
(Clozel et al. 1988) (Stassen et al. 1991).
As alterações hemodinâmicas envolvidas em um quadro de EPA foram bem
caracterizadas em nossos experimentos. A tendência ao aumento do IRVP (figura
2) e da PMAP (figura 3) proporcionalmente à gravidade da doença foi bem
pronunciado. O aumento da PMAP causado pela obstrução dos vasos pulmonares
pelos trombos, e o aumento do IRVP, possivelmente explicado não só pela
obstrução dos vasos pulmonares, mas também pela liberação de fatores
constritores e conseqüente constrição arteriolar neurogênica (Smulders 2000a);
(Lualdi et al. 2001), culminaram com um quadro de hipoxemia grave nos animais
que receberam 5 mL de coágulo/Kg (figura 4).
A hipoxemia é consistentemente demonstrada em EPA, mas o mecanismo
nem sempre é claro. Pode envolver desde anormalidades na relação
perfusão/ventilação até shunts intrapulmonares e intracardíacos (Huet et al. 1985)
(Santolicandro et al. 1995).
62
Ainda foi testado em nosso trabalho, a dose de coágulo de 7 mL/Kg (n=3),
mas os animais não resistiam até o final do protocolo, assim sendo, a maior dose
em que os animais conseguiam sobreviver foi a de 5 mL/Kg.
Mediante a tudo o que foi exposto, cada vez torna-se mais relevante o uso
de biomarcadores em EPA, como forma de um prognóstico rápido e eficiente de
uma patologia grave, além de atuar como possíveis alvos farmacológicos.
6.2. A troponina I
Trabalhos recentes têm mostrado a importância da troponina como
biomarcador na EPA, seguido de exames ecocardiográficos do ventrículo direito,
direcionando o tratamento e prognóstico em pacientes com embolia pulmonar
(Konstantinides 2005).O papel da troponina torna-se mais relevante naqueles
pacientes estáveis do ponto de vista hemodinâmico, nos quais fica difícil o
prognóstico somente pelo exame clínico (Logeart et al. 2007).
Um dos achados do nosso trabalho foi a tendência do aumento da troponina I
no soro, que pode ser explicado pela lesão miocárdica microscópica induzida pela
EPA, o que permitiu a degradação de miofibrilas e danos às células do miocárdio
(Kucher et al. 2003b). Embora essa tendência ao aumento da concentração de
troponina I após a EPA seja mais moderado do que aqueles achados em
pacientes com síndromes coronárias agudas, é possível que também possa refletir
disfunção ventricular direita induzida pela EPA, até mesmo em pacientes com EPA
63
submaciça (Horlander et al. 2003; Konstantinides et al. 2002; Pacouret et al.
1998b; Punukollu et al. 2005).
Nós verificamos que a concentração de troponina I no soro correlaciona-se
positivamente com IRVP e PMAP. Nosso estudo é o primeiro mostrando que a
troponina I aumenta após a EPA em proporção a PMAP e ao IRVP, que é o
principal determinante do trabalho do ventrículo direito. Ou seja, ocorreu um
aumento da concentração de troponina de acordo com a gravidade da doença.
Talvez o uso de terapias farmacológicas que providenciem um suporte vasodilator
pulmonar (Souza-Costa et al. 2005b; Souza-Silva et al. 2005; Tanus-Santos et al.
2000) poderiam atenuar o aumento da troponina I após a EPA e melhorar as
condições do paciente.
6.3. As metaloproteinases 2 e 9 da matriz extracelular
Estudos recentes têm implicado as MMPs (principalmente a MMP-2 e a
MMP-9) no desenvolvimento de hipertensão pulmonar aguda associada com EPA
(Fortuna et al. 2006; Palei et al. 2005; Souza-Costa et al. 2007a). O mecanismo
preciso envolvido no aumento das MMPs circulantes após a EPA não está claro.
Diferentemente do trabalho de Souza-Costa et al (2005b), em nossos
resultados não verificamos um aumento significativo da pró-MMP-2 no plasma
circulante. A administração de doses crescentes de L-arginina em perfusato de
pulmão de ratos com EPA induzida por microesferas de Sephadex, atenuou o
64
quadro da hipertensão pulmonar bem como a atividade gelatinolítica das MMPs 2
e 9. Em nosso estudo, a zimografia foi realizada em amostras de plasma,
enquanto no trabalho citado anteriormente, a mesma foi realizada em amostras de
extrato de pulmão, em que a concentração de enzimas possivelmente é maior em
relação ao plasma. Além disso, em se tratando de MMP-2, que é uma enzima
constitutiva, presente na maioria dos tecidos em uma concentração basal (Hu et al
2007) talvez, fosse necessário um tempo maior de experimento, possibilitando o
aumento da produção e expressão das MMP-2.
Ainda, os processos biológicos envolvidos com as MMPs são sempre
dependentes do balanço entre proteinases e seus inibidores naturais, os TIMPS
(Gomez et al, 1997). Em nosso estudo não dosamos os TIMPS. Dessa forma, não
sabemos se há um equilíbrio/desequilíbrio entre as MMPs e os seus inibidores nas
amostras dosadas neste trabalho.
Uma resposta inflamatória com um influxo precoce de neutrófilos e
macrófagos dentro da artéria pulmonar foi demonstrado em EPA experimental em
ratos (Eagleton et al. 2002). Assim, é possível que estas células inflamatórias
possam rapidamente liberar grânulos contendo grandes quantidades de MMP-9
(Van den Steen et al. 2002) (Kolaczkowska et al. 2007), o que poderia explicar a
tendência ao aumento da pró-MMP-9 circulante achado em nosso estudo. Além
disso, os próprios neutrófilos ativados são capazes de liberarem superóxido e
outras espécies reativas do oxigênio, possíveis de ativarem as MMPs (Galis &
Khatri 2002).
65
Ainda, alguns fatores presentes no meio, em se tratando de um processo
inflamatório, como fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento
epitelial, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento de
fibroblastos, moléculas de adesão (ICAM, VCAM) (Yakubenko et al. 2000) (Aoudjit
et al. 1998), interleucina 1, fator de necrose tumoral, CD-40 e NFkappa-β
(Schonbeck et al. 1997), podem estimular a produção das MMPs no ambiente
inflamatório.
A tendência ao aumento encontrado na pró-MMP-9 nos grupos T1 e T3 não
foram estatisticamente diferente daqueles achados nos cães não embolizados,
embora um aumento significativo foi achado no grupo com embolia severa (grupo
T5). Esses achados sugerem que a atividade da pró-MMP-9 provavelmente não
reflete com precisão a gravidade da EPA, pelo menos nas condições
experimentais reportadas no presente estudo. É possível que a variabilidade
biológica possa limitar as medidas das concentrações de pró-MMP-9 circulantes
como marcador de gravidade em EPA e em outras doenças. Neste caso, a
amostragem de pacientes em mais de uma ocasião poderia melhorar a
probabilidade de se obter uma estimativa mais próxima da realidade no caso de
biomarcadores (Vasan 2006).
O presente estudo tem algumas limitações que devem ser levadas em
consideração. Nós focamos os efeitos precoces da EPA sobre as concentrações
de troponina I e MMPs. Resultados diferentes poderiam ser achados se esses
marcadores bioquímicos fossem averiguados algumas horas após a EPA.
Também seria interessante examinar se o uso de drogas inibidoras das MMPs
66
associadas com uma possível melhora hemodinâmica após a EPA produziriam os
mesmos efeitos nesses biomarcadores.
Ainda, a dosagem das MMPs foi feita por zimografia, uma técnica que
apesar de ser semiquantitativa, apresenta um custo baixo e uma boa
especificidade e sensibilidade. Além disso, permite a identificação de uma enzima
em uma mistura de proteinases, e o uso de padrões de diferentes pesos
moleculares fornece uma estimativa das MMPs latentes e ativas (Quesada et al
1997). No entanto, há kits comerciais de medida da atividade das MMPS, seja por
um ELISA convencional ou fluorimetria, que apresentam uma alta sensibilidade,
sendo capazes de dosar amostras na faixa de ng/mL com uma quantidade mínima
de amostra, sem diluições. Talvez, o uso de uma metodologia mais sensível do
que a zimografia, poderia melhorar os resultados obtidos em nosso trabalho.
Mesmo com tais limitações, os achados deste trabalho podem ser
relevantes para a clínica da EPA.
67
7. CONCLUSÕES
68
7.1. A TnI cardíaca no soro e a pró-MMP-9 no plasma apresentam uma
tendência em aumentar em proporção à gravidade da EPA, embora o aumento da
pró-MMP-9 não seja muito evidente em graus menos severos da EPA;
7.2. Não há aumentos da pró-MMP-2 no plasma.
69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS*
*
Referências citadas conforme as normas de Vancouver
70
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9. APÊNDICE
Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and MMP-9
concentrations after experimental acute pulmonary thromboembolism
Juliana A. Uzuelli, Carlos A.C. Dias-Junior, Jose E. Tanus- Santos
⁎
Department of Pharmacology, Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirao Preto, SP, Brazil
Received 3 August 2007; received in revised form 28 September 2007; accepted 4 November 2007
Abstract
Background: Making the diagnosis of acute pulmonary thromboembolism (APT) and assessing its severity is very challenging. While cardiac
troponin I (cTnI) concentrations are promising in risk stratification, no previous study has examined whether there is a linear relation between cTnI
concentrations and the severity of APT. Moreover, matrix metalloproteinases (MMPs) are involved in the pathophysiology of APT. However, it is
unknown whether the increases in MMP concentrations after APT reflect the severity of this condition. We examined whether the circulating
concentrations of these biomarkers increase in proportion to the severity of experimental APT induced in anesthetized dogs.
Methods: APT was induced with autologous blood clots (saline, 1, 3, or 5 ml/kg) injected into the right atrium. Hemodynamic evaluations were
carried out for 120 min. Gelatin zymography of MMP-2 and MMP-9 from plasma samples were performed and serum cTnI concentrations were
determined at baseline and 120 min after APT.
Results: While no significant increases in pro-MMP-2 concentrations were found after APT, pro-MMP-9 concentrations increased by 80% only
after 5 ml/kg of clot embolization. Serum cTnI and plasma pro-MMP-9 concentrations correlated positively with pulmonary vascular resistance
(P = 0.007 and rs = 0.833 for troponin I, and P = 0.034 and rs = 0.684 for pro-MMP-9) and with pulmonary artery pressure (P = 0.005 and rs = 0.610
for troponin I, and P = 0.022 and rs = 0.720 for pro-MMP-9).
Conclusions: Circulating cTnI and pro-MMP-9 increase in proportion to the severity of APT, although the increases in plasma pro-MMP-9 are less
clear with less severe APT. These findings may be relevant for clinical APT.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Acute pulmonary embolism; Markers; Matrix metalloproteinases; Troponin; Zymography
1. Introduction
Acute pulmonary thromboembolism (APT) is an important
disease and a major cause of acute pulmonary hypertension
leading to high cardiovascular morbidity and mortality [1,2].
This condition most commonly results from the migration of
deep venous thrombi to the lungs, thus obstructing the pulmonary
vessels and leading to acute right heart failure and circulatory
shock [3]. Although the clinical setting is very helpful in
suggesting the diagnosis of APT, the differential diagnosis is
broad, thus making the specific diagnosis of APT very chal-
lenging [1,2]. While the gold standard test for establishing the
definitive diagnosis of APT is selective pulmonary angiography
[2], this examination in inconvenient and risky. Therefore a
number of studies have been carried out to identify additional
tools (markers) to aid clinical assessment, especially of high-risk
patients [4]. In this regard, it is usually expected that an ideal
biomarker improves the ability of the clinician to optimally
manage the patient. To accomplish this, one of the desirable fea-
tures for a biomarker is a linear relation between change in bio-
marker and disease severity [4].
Troponin concentration has emerged as a very promising bio-
marker for the risk stratification of patients with APT [5]. In-
deed, the serum concentrations of cardiac troponin I increase in
up to 50% of patients with moder ate to large APE [6–11]. Im-
portantly, increased troponin I concentration is a reliable marker
of right ventricular dysfunction associated with adverse prog-
nosis and increased risk of all-cause death [9] , even in patients
with submassive APT [12]. However, no previous experimental
A
vailable online at www.sciencedirect.com
Clinica Chimica Acta xx (2007) xxx – xxx
+ MODEL
CCA-10878; No of Pages 5
www.elsevier.com/locate/clinchim
⁎
Corresponding author. Tel.: +55 16 3602 3163; fax: +55 16 3633 2301.
0009-8981/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cca.2007.11.001
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Uzuelli JA, et al, Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and MMP-9 concentrations after experimental acute
pulmonary thromboembolism, Clin Chim Acta (2007), doi:10.1016/j.cca.2007.11.001
study has examined whether there is a linear relation between
the increases in troponin concent rations and the severity of
APT.
Matrix metalloproteinases (MMPs) form a group of enzymes
involved in the degradation of compo nents of the extracellular
matrix. It has been shown that MMPs play a role in the path-
ophysiology of chronic pulmonary hypertension [13]. Moreover,
recent studies sugges t that MMPs (especially MMP-2 and -9) are
also involved in the development of acute pulmonary hyperten-
sion associated with APT [14–17 ]. However, there is no infor-
mation regarding the possible relation be tween the increases in
the circulating concentrations of MMPs after APT and the
severity of APT-induced pulmonary hypertension. We hypothe-
sized that the increases in serum cTnI and plasma MMP-9
concentrations after APT are dependen t on the severity of this
disease. Therefore, the main purpose of the present study was to
test this hypothesis in the setting of experimental APT.
2. Materials and methods
2.1. Animal model and hemodynamic measurements
All animals received humane care and study protocols complied with the
guidelines of the ethics committee for the use of experimental animals at the
Faculty of Medicine of Ribeirao Preto. We used a whole animal model of APT
[18] to study whether biochemical markers serve as indicators of the severity of
APT. Twenty-six mongrel dogs (10.5 to 15.5 kg) of either sex were anesthetized
with ketamine (10–15 mg/kg, i.m.) and xylazine (1.5 mg/kg, i.m.), and relaxed
with pancuronium (0.1 mg/kg, i.v.). Following tracheal intubation, they were
mechanically ventilated with room air using a volume-cycled ventilator (C.F.
Palmer, London, UK). The tidal volume was set at 15 ml/kg and the respiratory
rate was adjusted to maintain physiologic arterial carbon dioxide tensions.
Anesthesia was maintained with an intramuscular injection of ketamine (3 mg/
kg) and xylazine (0.3 mg/kg) every 30 min [19]. Fluid-filled catheters were
placed into the left femoral artery and right femoral vein for mean arterial
pressu re monitoring via a pressure transducer and fluid administration,
respectively. A 7.5 F balloon-tipped pulmonary artery thermodilution catheter
was placed into the pulmonary artery via the left femoral vein. The catheter was
connected to pressure transducers to allow the monitoring of mean pulmonary
artery pressure (MPAP), central venous pressure, and pulmonary capillary
wedge pressure [20]. Thermodilution cardiac output measurements were
determined in triplicate by injecting 3 ml of saline and the results recorded
(DX2010 Dixtal Monitor Dixtal, Dixtal do Brasil, Manaus, Brazil) [21]. The
coefficient of variation for cardiac output measurements was below 5%. The
heart rate was measured using a surface electrocardiogram (lead I). A venous
blood sample (5 ml/kg) was collected and allowed to clot for at least 60 min,
then cut into 2- to 3-mm cubes. After 20-min stabilization, baseline
hemodynamics were measured. Then APT was induced by infusing the clots
for 5–10 min via a large-bore cannula placed in the right atrium.
The animals were randomly assigned to one of four experimental groups: a
group of Sham operated animals (n = 6) received only saline infusions; the dogs
in T1, T3, and T5 groups (n =6, 6, and 8, respectively) were embolized with
Fig. 1. Pulmonary vascular resistance index (PVRI) and mean pulmonary
arterial pressure (MPAP) at baseline and 120 min after acute pulmonary
thromboembolism (E120) in Sham, T1, T3, and T5 groups. Values are the
means ± S.E.M.
⁎
P b 0.05 versus measurements at baseline.
Fig. 2. Arterial O
2
pressure (PaO
2
) and arterial O
2
saturation (SaO
2
) at baseline
and 120 min after acute pulmonary thromboembolism (E120) in Sham, T1, T3,
and T5 groups. Values are the means ± S.E.M.
⁎
P b 0.05 versus measurements at
baseline.
Fig. 3. Serum troponin I concentrations at baseline and 120 min after acute
pulmonary thromboembolism (E120) in Sham, T1, T3, and T5 groups. Values
are the means ±S.E.M.
⁎
P b 0.05 versus measurements at baseline.
2 J.A. Uzuelli et al. / Clinica Chimica Acta xx (2007) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Uzuelli JA, et al, Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and MMP-9 concentrations after experimental acute
pulmonary thromboembolism, Clin Chim Acta (2007), doi:10.1016/j.cca.2007.11.001
clots produced from 1, 3, and 5 ml/kg autologous blood respectively. Thereafter,
hemodynamic evaluations were performed every 30 min after APT for up to
120 min (E120 time point). The cardiac index and pulmonary vascular resistance
index (PVRI) were calculated by standard formulae. Arterial blood samples
were drawn at baseline and at E120 time points for blood gas analysis with a
blood gas analyser (Stat Profile 5 Analyser; Biomedical, Waltham, MA). Venous
blood samples were collected into tubes containing EDTA at baseline and at
E120 time points, and serum and plasma samples were stored at − 70 °C until
assayed for the biochemical markers as detailed below.
2.2. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gelatin zymography
of MMP-2 and MMP-9
Gelatin zymography of MMP-2 and MMP-9 from plasma was performed as
previously described [22–24]. Briefly, plasma samples were subjected to elec-
trophoresis on 7% SDS-PAGE co-polymerized with gelatin (1%) as the
substrate. After electrophoresis was complete, the gel was incubated for 1 h at
room temperature in a 2% Triton X-100 solution, and incubated at 37 °C for 16 h
in Tris–HCl buffer, pH 7.4, containing 10 mmol/l CaCl
2
. The gels were stained
with 0.05% Coomassie Brilliant Blue G-250, and then destained with 30%
methanol and 10% acetic acid. Gelatinolytic activities were detected as
unstained bands against the background of Coomassie blue-stained gelatin.
Enzyme activity was assayed by densitometry using a Kodak Electrophoresis
Documentation and Analysis System (EDAS) 290 (Kodak, Rochester, NY). The
pro-MMP-2 and pro-MMP-9 forms were identified as bands at 72 kDa and
92 kDa, respectively, by the relation of log Mr to the relative mobility of Sigma
SDS-PAGE LMW marker proteins.
2.3. Measurement of serum troponin I concentrations
Cardiac troponin I was measured in serum samples by the Stratus II
fluorometric enzyme immunoassay (DPC Immulite, Dade, Miami, USA) [25].
This assay is a sandwich immunoassay that uses a monoclonal antibody
immobilized on beads and a goat polyclonal antibody labeled with alkaline
phosphatase as a tracer. Both antibodies recognize epitopes localized in the N-
terminal part (residues 33–110) of the protein. The chemiluminescent substrate
used for the enzymatic reaction is an ester of adamantyl dioxetane phosphate.
The minimal concentration detectable by the assay was 0.35 ng/ml of cardiac
troponin I and the interassay imprecision was b 10%.
2.4. Statistical analysis
The results are expressed as means± S.E.M. Comparisons among groups
were analysed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the
Student–Newman–Keuls test (StatView for Windows, Cary, NC). ANOVA on
Fig. 5. Positive correlations between serum troponin I or plasma pro-MMP-9 concentrations and pulmonary vascular resistance index (PVRI) or mean pulmonary
arterial pressure (MPAP). The regression lines and the 95% confidence intervals were plotted; rs: Spearman's correlation coefficient.
Fig. 4. A representative zymogram of plasma samples (baseline and 120 min
after acute pulmonary thromboembolism) showing the pro forms of both MMP-
2 and MMP-9, which were identified as bands at 67 kDa and 92 kDa,
respectively, in Sham, T1, T3, and T5 groups. The bar figures show the
percentages of baseline pro-MMP-9 and pro-MMP-2 concentrations in Sham,
T1, T3, and T5 groups. Values are the means± S.E.M.
⁎
P b 0.05 versus
measurements at baseline.
3J.A. Uzuelli et al. / Clinica Chimica Acta xx (2007) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article as: Uzuelli JA, et al, Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and MMP-9 concentrations after experimental acute
pulmonary thromboembolism, Clin Chim Acta (2007), doi:10.1016/j.cca.2007.11.001
ranks was used when normality test failed. Wilcoxon matched pairs test was
used to determine the changes in the biochemical markers. The Spearman's
correlation (rs, P) was calculated for associations between hemodynamic
parameters and biochemical markers. A P b 0.05 was considered the minimum
concentration of statistical significance.
3. Results
Baseline hemodynamic and respiratory parameters were
similar in all experimental groups (Figs. 1 and 2). Although
baseline MPAP is apparently higher in Sham group, the
difference is not statistically significant and we have no clear
explanation for this stat istically non-signi ficant difference.
We found no significant hemodynamic and respiratory in
Sham operated animals throughout the study period (Figs. 1 and
2). Conversely, lung embolization increased MPAP and PVRI
proportionally to the severity of APT (all P b 0.05; Fig. 1). In
pilot studies, we found that lung embolization with clots
produced from 7 ml/kg autologous blood led to death 100% of
dogs (n = 3). Therefore we decided to limit lung embolization to
5 ml/kg autologous blood. APT-induced pulmonary hyperten-
sion was associated with significant hypoxemia only in T5
group (Pb 0.05; Fig. 2). While troponin I concentrations
showed no significant changes in Sham operated animals,
lung embolization was associated with significant increases in
serum troponin I concentrations in T1, T3, and T5 groups (all
P b 0.05; Fig. 3).
Fig. 4 shows a representative zymogram of plasma samples.
While no significant increases in pro-MMP-2 concentrations
were found after APT, pro-MMP-9 increased by approximately
80% in T5 group (Fig. 4 ; P b 0.05), even though no significant
increases in pro-MMP-9 were found in T1 and T3 groups (Fig.
4). Interestingly, both serum troponin I and plasma pro-MMP-9
concentrations correlated positively with PVRI (Fig. 5;
P = 0.007 and rs = 0.833 for troponin I, and P = 0.034 and
rs = 0.684 for pro-MMP-9) and with MPAP (Fig. 5 ; P = 0.005
and rs = 0.610 for troponin I, and P = 0.022 and rs = 0.720 for
pro-MMP-9).
4. Discussion
The main findings of this study were that (i) serum cardiac
troponin I increases in proportion to the severity of APT; (ii)
plasma pro-MMP-9 concentrations increase significantly in
severe APT; (iii) there is positive correlation between these
biomarkers and the severity of APT, although the increases in
plasma pro-M MP-9 are less clear with less severe APT.
The increases in serum troponin I that we found in the
present study may be explained by APT-induced microscopic
myocardial injury leading to myocardial cell damage and
degradation of myofibrils [26]. In fact, although the increases
in troponin concentrations after APT are milder than those
found in patients with acute coronary syndromes [27], they
predict adverse outco mes and refl ect APT-induce d right
ventricular dysfunction, even in patients with submassive
APT [9,12 ,25,28]. Consistent with these previous clinical
findings showing that tropo nin I offers important risk
stratification information, we found that serum troponin I
concentrations correlated positively with PVRI and MPAP. To
our knowledge, this is the first study showing that serum
troponin I increases after APT in proportion to MPAP and
PVRI, which is a major determinant of right ventricle work-
load. It remains to be elucidated, however, whether pharmaco-
logic approaches designed to improve right ventricular
performance [29] or to provide pulmonary vasodilatory sup-
port [30,31] could attenuate the increases in serum troponin I
after APT.
Recent studies have implicated MMPs (especially MMP-9
and MMP-2) in the development of acute pulmonary hyperten-
sion associated with APT [14–17]. The precise mechanisms
involved in the increases in circulating MMPs after APT,
however, remain obscure. An inflammatory response with an
early influx of neutrophils and macrophages within the pul-
monary artery wall has been demonstrated in experimental APT
[32]. Therefore, it is possible that these inflammatory cells can
rapidly release granules containing large amounts of MMP-9
[33], thus explaining the increases in circulating pro-MMP-9
that we found in the present study.
Curiously, the increases in pro-MMP-9 that we found in T1
and T3 groups were not statistically different from those found
in non-embolized dogs, although significant increases were
found in the group with severe lung embolization (T5 group).
These findings suggest that pro-MMP-9 concentrations prob-
ably do not accurat ely reflect the severity of APT, at least in the
experimental condition s reported in the present study. It is
possible that significant biological variability may limit the
performance of circulating pro-MMP-9 as a biomarker of
severity in APT or other diseases. In this case, sampling patients
on more than one occasion may improve the probability of
obtaining a true estimate of this biomarker [4].
The present study has some limitations that should be taken
into consideration. For example, patients with acute pulmonary
embolism are sometimes managed several hours after the onset
of symptoms [25]. In the present study, we focused on the very
early effects of APT on the circulating concentrations of
troponin I and MMPs. Different results could be found if these
biochemical markers were assessed many hours after APT. It
would also be interesting to examine whether pharmacologic
interventions associated with improved hemodynamics after
APT produce any effects on these biomarkers. In conclusion,
we found that circulating cTnI and pro-MMP-9 increase in
proportion to the severity of APT, although the increases in
plasma pro-MMP-9 are less clear with less severe APT. These
findings may be relevant for patients with APT.
Acknowledgments
This study was supported by Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and
Coordenadoria de Ape rfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES). The authors would like to acknowledge
the assistance of Dr. Milton C. Foss and Sebastiao Lazaro
Brandao in measuring troponin I concentrations.
4 J.A. Uzuelli et al. / Clinica Chimica Acta xx (2007) xxx–xxx
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Please cite this article as: Uzuelli JA, et al, Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and MMP-9 concentrations after experimental acute
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Please cite this article as: Uzuelli JA, et al, Severity dependent increases in circulating cardiac troponin I and MMP-9 concentrations after experimental acute
pulmonary thromboembolism, Clin Chim Acta (2007), doi:10.1016/j.cca.2007.11.001
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