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REGIANE SZARGIKI
COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EM LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR AMERICANA
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Parasitologia, Curso de Pós-Graduação em
Microbiologia, Parasitologia e Patologia Geral
do Departamento de patologia Básica, Setor
de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Paraná.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Edilene Alcântara de
Castro
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Vanete Thomaz-
Soccol
CURITIBA
2005
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II
À minha família, pelo incentivo,
compreensão e paciência, em especial
aos meus pais, pois seu amor e
dedicação tornaram possível que eu
trilhasse esse caminho.
À minha querida filha Amanda que é
minha luz e minha força e a quem eu
dedico todo meu amor.
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III
AGRADECIMENTOS
À Professora Doutora Edilene Alcântara de Castro e Professora Doutora
Vanete Thomaz-Soccol, pela orientação, ensinamentos, críticas e sugestões.
À coordenação do curso de Mestrado em Microbiologia, Parasitologia e
Patologia, Universidade Federal do Paraná, em particular a Dra. Vanete
Thomaz-Soccol, por ter possibilitado o desenvolvimento deste trabalho.
Aos profissionais de saúde do Município de Prudentópolis que colheram
e nos enviaram as amostras biológicas para exame.
Aos profissionais do Hospital de Clínicas que nos enviaram amostras
biológicas para o diagnóstico da Leishmaniose tegumentar no laboratório de
Parasitologia Molecular.
Ao Professor Doutor Enio Luz e Professora Doutora Ana Lozovei pelos
valiosos ensinamentos e pelas palavras de incentivo.
Ao médico veterinário Doutor João Carlos Minozzo pelo auxílio e
assessoramento em algumas fases do trabalho e pelo apoio e amizade em
vários momentos.
À Direção Geral e Direção Técnica do Centro de Produção e Pesquisa
de Imunobiológicos pelo apoio e compreensão.
À bióloga (e amiga) Maria Inês de Pizzol Corrêa, pela amizade e
incentivo.
À bioquímica Wilma Rosi Guerra por fornecer as amostras sorológicas
de pacientes com Paracoccidioidomicose.
A todos os colegas do CPPI pela força e amizade.
A todo o pessoal do Laboratório de Parasitologia Molecular com os quais
eu pude compartilhar de muitos bons momentos (em especial a Rosangela
Paulino, Juliana e Luciane).
Aos colegas de Mestrado pela amizade.
A todos que direta ou indiretamente tornaram possível a realização deste
trabalho,
Meu muito obrigado.
IV
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES............................................................................................................. V
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................................... VI
RESUMO........................................................................................................................................ VII
ABSTRAT…………………………………………………………………………………………………...
VIII
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................................ 01
2. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................................... 05
2.1 POPULAÇÃO ESTUDADA...................................................................................................... 05
2.2 DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO....................................................................................... 05
2.3 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO............................................................................................... 05
2.4 CEPAS DE Leishmania UTILIZADAS NA PRODUÇÃO DE ANTÍGENO.............................. 06
2.5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO DAS CEPAS DE Leishmania...............................................
06
2.5.1 OBTENÇÃO DA BIOMASSSA............................................................................................... 06
2.5.2 CULTURAS PARA ESTUDO DE BIOMASSA....................................................................... 07
2.5.3 CONTAGEM DAS FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania........................................ 07
2.6 PRODUÇÃO DOS ANTÍGENOS.............................................................................................. 08
2.6.1 OBTENÇÃO DO ANTÍGENO BRUTO................................................................................... 08
2.6.2 PREPARO DO ANTÍGENO PARA A REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA. 08
2.6.3 PREPARO DO ANTÍGENO SOLÚVEL PARA O ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO................ 08
2.7 TÉCNICAS SOROLÓGICAS................................................................................................... 09
2.7.1 PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-Leishmania POR REAÇÃO DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA................................................................................. 09
2.7.1.1 Realização da técnica de IFI.............................................................................................. 09
2.7.2 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO……….................................................................................. 10
2.7.2.1 Padronização do Ensaio Imunoenzimático....................................................................... 10
2.7.2.2 Controle das placas............................................................................................................ 11
2.7.2.3 Nível de corte da reação Ensaio Imunoenzimático ("Cut-off")........................................... 11
2.7.2.4 Realização da técnica de Ensaio Imunoenzimático........................................................... 12
2.7.3 TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING.................................................................................. 12
2.7.3.1 Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida........................................................... 12
2.7.3.2 Transferência das proteínas.............................................................................................. 16
2.7.3.3 Imunodetecção................................................................................................................... 17
2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................................................... 18
3. RESULTADOS………………….................................................................................................. 19
3.1 POPULAÇÃO ESTUDADA..................................................................................................... 19
3.2 DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO...................................................................................... 19
3.3 CINÉTICA DE CRESCIMENTO DAS FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania...........
20
3.3.1 EM MEIO NNN (Novy-MacNeal-Nicolle)................................................................................ 20
3.3.2 EM MEIO CCS (Coração-Cérebro-Sangue).......................................................................... 20
3.4 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO.............................................................................................. 22
3.4.1 PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)................. 22
3.4.2. PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)..................... 22
3.4.3 ANÁLISE DOS SOROS PELAS TÉCNICAS DE IFI E ELISA............................................. 23
3.4.4 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DAS TÉCNICAS DE IFI E ELISA............................ 24
3.4.5 CONCORDÂNCIA ENTRE AS TÉCNICAS IFI E ELISA........................................................ 26
3.5 TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING..................................................................................... 27
3.5.1 ANÁLISE DOS SOROS DE PACIENTES FRENTE AO ANTÍGENO DE Leishmania
(Viannia) braziliensis.............................................................................................................
27
3.5.2 ANÁLISE DOS SOROS DE PACIENTES FRENTE AO ANTÍGENO DE Leishmania
(Leishmania) amazonensis...................................................................................................
30
4. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS......................................................................................... 34
5. CONCLUSÃO............................................................................................................................. 43
REFERÊNCIAS.............................................................................................................................. 45
ANEXOS......................................................................................................................................... 53
V
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 CINÉTICA DE CRESCIMENTO DAS FORMAS PROMASTIGOTAS DE
Leishmania amazonensis E Leishmania braziliensis EM MEIOS NNN E
CCS................................................................................................................. 21
FIGURA 2 EQUAÇÃO DA RETA OBTIDA PELA MOBILIDADE ELETROFORÉTICA
DAS PROTEÍNAS COM PADRÃO DE PESO MOLECULAR
CONHECIDO.................................................................................................. 27
TABELA 1 SOLUÇÕES PARA O PREPARO DO GEL DE SEPARAÇÃO A 15%........... 13
TABELA 2 SOLUÇÕES PARA O PREPARO DO GEL DE EMPILHAMENTO A 5%....... 13
TABELA 3 PADRÃO DE PESO MOLECULAR (SDS-7) DE PROTEÍNAS UTILIZADAS
NA ELETROFORESE E WESTERN BLOTTING............................................
14
TABELA 4 MATRIZ PARA CÁLCULO DOS INDICADORES PARA AS REAÇÕES
SOROLÓGICAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA E ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO.......................................................................................
18
TABELA 5 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO PELOS MÉTODOS IFI E ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO...................................................................................... 24
TABELA 6 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DAS TÉCNICAS DE IFI E ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO.......................................................................................
25
TABELA 7 COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS IFI E ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO CONTRA 60 SOROS DE PACIENTES
PORTADORES DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR................................... 26
TABELA 8 PERCENTUAL DA PREVALÊNCIA DAS PROTEÍNAS RECONHECIDAS
NA PESQUISA DE ANTICORPOS COM ANTÍGENO DE Leishmania
braziliensis NO SORO DE PESSOAS DOENTES, COMUNICANTES E
SADIOS PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING.................................... 29
TABELA 9 PROTEÍNAS RECONHECIDAS NA PESQUISA DE ANTICORPOS
CONTRA Leishmania COM ANTÍGENO DE Leishmania braziliensis NO
SORO DE PESSOAS COM LEISHMANIOSE, E NO POOL DE SOROS DE
PESSOAS COM OUTRAS PATOLOGIAS PELA TÉCNICA DE WESTERN
BLOTTING....................................................................................................... 30
TABELA 10 PERCENTUAL DA PREVALÊNCIA DAS PROTEÍNAS RECONHECIDAS
NA PESQUISA DE ANTICORPOS COM ANTÍGENO DE Leishmania
amazonensis NO SORO DE PESSOAS DOENTES, COMUNICANTES E
SADIOS PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING.................................... 32
TABELA 11 PROTEÍNAS RECONHECIDAS NA PESQUISA DE ANTICORPOS
CONTRA Leishmania COM ANTÍGENO DE Leishmania amazonensis NO
SORO DE PESSOAS COM LEISHMANIOSE E NO POOL DE SOROS DE
PESSOAS COM OUTRAS PATOLOGIAS PELA TÉCNICA DE WESTERN
BLOTTING...................................................................................................... 33
VI
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA - Soro Albumina Bovina
CCS - Coração-Cérebro-Sangue
CPPI - Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos
EDTA - “ Ethylenediaminetetracetic Acid”
ELISA - “Enzyme Linked Immunosorbent Assay”
FUNASA - Fundação Nacional de Saúde
IFI - Imunofluorescência Indireta
Kda - Kilodalton
L.a.
- Leishmania amazonensis
L.b.
- Leishmania braziliensis
LPM - Laboratório de Parasitologia Molecular
LTA - Leishmaniose Tegumentar Americana
MHtz - Megahertz
mL - mililitro
mm - milimetro
NNN - Novy-McNeal-Nicolle
OPD - Ortophenilenediamina
PBS - “Phosphate Buffer Solution”
PCM - Paracoccidioidomicose
SDS - “Sodiun Dodecyl Sulfate”
SESA - Secretaria de Estado da Saúde
UFPR - Universidade Federal do Paraná
WHO - “World Health Organization”
VII
RESUMO
A Leishmaniose Tegumentar Americana com 80 mil novos casos/ano no
mundo é um dos grandes desafios epidemiológicos da Organização Mundial da
Saúde. No Brasil as várias formas da doença (leishmaniose tegumentar e
leishmaniose visceral) estão presentes e o diagnóstico precoce nem sempre é
possível devido descentralização dos serviços de saúde, que recentemente
sofreu municipalização carecendo de pessoal treinado para o mesmo. Outro
aspecto que dificulta o diagnóstico precoce é o fato dos pacientes residirem em
zona rural distantes dos serviços disponíveis. A busca por antígenos de fração
específica e métodos diagnósticos mais sensíveis e específicos, têm sido uma
constante para muitos pesquisadores. No presente estudo a sensibilidade e a
especificidade dos métodos parasitológicos e dos métodos sorológicos
(Imunofluorescência indireta, Ensaio imunoenzimático e Western blotting)
foram comparados para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana.
Foram estudados cinco grupos clínicos: Grupo I: critério diagnóstico clínico;
Grupo II: critério diagnóstico parasitológico; Grupo III: pessoas sem
leishmaniose residentes em área de transmissão; Grupo IV: pessoas sem
histórico para leishmaniose e residentes em área indene para a doença; Grupo
V: pessoas com outras etiologias (Paracoccidioidomicose, Doença de Chagas
e Toxoplasmose). Antígenos foram produzidos com as formas promastigotas
de duas espécies causadoras de Leishmaniose tegumentar no Brasil:
Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis. Os
métodos parasitológicos individualmente confirmaram 70,1% do diagnóstico
clínico de pacientes da área em estudo (61/87). Analisando amostras
sorológicas do grupo II (N=60), 91,8 % foram reagentes na Imunofluorescência
indireta para o antígeno de Leishmania braziliensis e 75,0 % com antígeno de
Leishmania amazonensis. No Ensaio imunoenzimático quando usado antígeno
de Leishmania braziliensis a sensibilidade foi de 95,0% e quando usado
antígeno de Leishmania amazonensis obteve-se 71,7%. No Western blotting,
20 proteínas do antígeno de L. braziliensis, (de 16,6 a 218,8 Kda) foram
reconhecidas pelo grupo II, contra 26 proteínas (de 23,9 a 173,3 Kda) do
antígeno L. amazonensis. O antígeno de L. braziliensis mostrou-se mais
sensível e revelou maior número de proteínas específicas para a doença. Duas
proteínas de alto peso molecular (148,0 e 135,0 Kda) foram reveladas em
soros de pacientes com Doença de Chagas com esse antígeno. O antígeno de
Leishmania amazonensis mostrou baixa especificidade nas técnicas
sorológicas, sendo que pelo menos seis proteínas de alto peso molecular (63 a
144,5 Kda) foram reveladas também por outros grupos clínicos (grupo III, IV e
V). O presente estudo ressalta a importância da associação de dois ou mais
métodos diagnósticos específicos e de fazer o diagnóstico diferencial. E,
sobretudo demonstra que o uso de antígeno homólogo aumenta a sensibilidade
do diagnóstico.
VIII
ABSTRACT
Cutaneous leishmaniasis, with 80,000 cases/year worldwide, is one the greatest
epidemiological challenges faced by the World Health Organization. In Brazil,
the disease is present in its many forms and the early diagnose is not always
possible since the patients don’t have easy access to medical care. Many
researches have been constantly working on more accurate and specific
fraction antigens and diagnose methods. In the current study the sensibility and
particularity of the parasitologic and serologic methods (Indirect
Immunofluorescence, Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA and
Western blotting) were compared, in order to obtain the diagnose for cutaneous
leishmaniasis. Five groups of individuals were studied: Group I - clinical
diagnostic. Group II - parasitology diagnostic. Group III – people without
leishmaniasis residing in the transmission zone; Group IV – people without
leishmaniasis history and dwelling in areas where the disease is not present;
Group V – people with other etiological agents (Paracoccidioidomicose,
Chaga’s disease and Toxoplasmosis). Antigens were developed with
promastigotee forms of the two species that caused cutaneous leishmaniasis in
Brazil: Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania)
amazonensis. The parasitologic methods confirm 70, 1% of the clinical
diagnoses in patients within the study area (61/87). When analysing serologic
samples from clinical group II (N=60), 91, 8% reacted to the Indirect
Immunofluorescence. The sensitivity shown in the ELISA when using
Leishmania braziliensis antigen was 95,0% and when using Leishmania
amazonensis the sensitivity was 71,6%. When applying the Western blotting
method, 20 proteins of the L. braziliensis antigens (from 16,6 to 218,8 Kda)
were detected by the Group II against 26 proteins of the L.amazonensis
antigens (from 23,9 to 173,3 Kda). The L. braziliensis antigen appeared to be
more sensitive and revealed a greater number of specific proteins to the
disease. The Leishmania amazonensis antigen has shown low specificity for
the serologic techniques, being that at least six proteins of high molecular
weight (63 - 144,5 Kda) were revealed also by other clinical groups (groups III,
IV and V). The present study emphasizes the importance of the association of
two or more specific diagnose methods as well as doing the differential
diagnose. Above all, it demonstrates that the use of the homologue antigen
increases the diagnose sensibility.
1
1. INTRODUÇÃO
As leishmanioses são afecções causadas por protozoário digenético
pertencente ao gênero Leishmania Ross, 1909. Este protozoário possui dois
tipos de hospedeiros, um vertebrado que pode ser o homem, animais
selvagens e domésticos e, o outro, um inseto vetor pertencente à Família
Psychodidae, subfamília Phlebotominae. No Novo Mundo, os insetos capazes
de transmitir o parasito pertencem aos gêneros Lutzomyia, França, 1924 e
Psychodopygus, Mangabeira, 1941.
A leishmaniose pode apresentar-se clinicamente de duas formas:
cutânea e a visceral. O aspecto clínico e a evolução da doença dependem da
espécie do parasito em causa e da imunidade do hospedeiro. A forma cutânea
conhecida no Novo Mundo como leishmaniose tegumentar americana (LTA), é
causada por várias espécies de Leishmania.
O principal agente etiológico da LTA é Leishmania (Viannia)
braziliensis Vianna, 1911 devido a sua ampla distribuição geográfica. Em
pacientes imunocompetentes a forma simples da afecção começa com uma
pápula indolor sobre as partes do corpo expostas a picada do inseto vetor,
mais comumente membros inferiores, superiores e face. Esses nódulos
evoluem para ulceração característica circular de fundo crostoso e bordos
elevados e indurados. Após alguns meses, a cura pode ser espontânea
deixando uma cicatriz no lugar. Porém, em 5% dos pacientes pode evoluir
para forma mucosa. Esta forma da doença é grave, pois tem como resultado a
deformação facial por mutilação e em alguns casos pode evoluir para morte.
Começa com um edema pustuloso na boca e/ou narinas, podendo ulcerar-se
mais tarde estendendo-se a mucosa nasofaríngea. Ocorre posteriormente a
destruição da cartilagem nasal e do palato, em conseqüência da infecção
secundária, vasculite e reações tissulares severas (BRYCESON, 1986). Em
alguns casos a afecção pode atingir as regiões bronco-pulmonar e esofagiana,
levando o indivíduo a um estado de caquexia.
A espécie Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw,
1972, raramente afeta o homem. Pode também a doença evoluir sob a forma
2
cutânea com lesões únicas ou múltiplas e não curam espontaneamente. Em
pacientes anérgicos evolui sob a forma difusa de extrema gravidade. As lesões
nodulares não ulceram e são ricas em protozoários.
A espécie Leishmania guyanensis, Floch, 1954, caracteriza-se por
causar lesões múltiplas que geralmente atingem o sistema linfático. A afecção
responde mal ao tratamento e as recidivas são freqüentes.
A leishmaniose visceral, causada por Leishmania infantum, Nicolle,
1908 é extremamente grave por afetar órgãos importantes como fígado, baço,
medula óssea e linfonodos. Quando não tratada a tempo, a doença é
usualmente fatal (WHO, 1991).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é endêmica na
América Latina estando presente em 21 países. No Brasil ocorre em 17 dos 27
estados da federação onde estão presentes as duas formas, tegumentar e
visceral, que acometem pessoas de todas as faixas etárias e de ambos os
sexos (LAISON & SHAW, 1987). A LTA tem mostrado uma tendência de
expansão geográfica nos últimos anos. Em 1994, segundo a Fundação
Nacional de Saúde, 1.861 municípios brasileiros registraram casos autóctones
da doença. No ano de 2001 casos autóctones foram registrados em 2.268
municípios.
O maior número de casos de LTA ocorre na região Nordeste do
Brasil, e a região Norte que até então apresentava baixos coeficientes, tem
notificado vários surtos em áreas de desmatamento e colonização antiga
(FUNASA, 2001). No Sul, o Paraná detém 98% dos casos, onde a LTA está
presente em vários municípios (SILVEIRA et al., 1996; SILVEIRA et al., 1999;
THOMAZ-SOCCOL et al., 2001; CASTRO, 2001; CASTRO et al., 2002;
CASTRO et al., 2004). De acordo com registros da Secretaria Estadual de
Saúde do Paraná, em 2001 foram confirmados 247 casos dos 611 notificados
até a 52ª. semana epidemiológica. Em 2003, até a 45ª. semana
epidemiológica, dos 1028 casos suspeitos, foram confirmados 726.
O diagnóstico precoce da doença é uma das principais medidas
preventivas, e com o aumento do número de casos clínicos da leishmaniose a
cada ano no Brasil, é primordial que os métodos de diagnóstico sejam
eficientes, de baixo custo e possam ser realizados nas áreas endêmicas
(GUIMARÃES, 1987).
3
O diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana em seres
humanos pode ser clínico, parasitológico e/ou imunológico. O exame
parasitológico de lesão deve ser sempre o método de escolha primário para
confirmar o diagnóstico clínico, pois consiste no método de certeza. Entretanto,
em estudos epidemiológicos que visam o controle em áreas endêmicas, as
técnicas sorológicas são as mais adequadas, pois possibilitam a análise de
maior número de pacientes.
Existem várias técnicas sorológicas utilizadas para detecção de
anticorpos contra-Leishmania há muito citadas e comparadas na literatura,
cada qual apresentando vantagens e desvantagens conforme o princípio de
cada método (MENEZES et al., 1972; HOMMEL et al., 1978; EDRISSIAN &
DARABIAN, 1979; MARZOCHI et al., 1980; DYE et al., 1993).
Contudo, a grande dificuldade, tanto no que se refere ao controle
das várias formas da doença, quanto no diagnóstico preciso e tratamento
adequado, está na grande diversidade antigênica das formas etiológicas. Estas
diferenças moleculares e bioquímicas são hoje caracterizadas graças aos
avanços da Biologia Molecular (RIOUX et al., 1990; ANDRADE et al., 1998;
THOMAZ-SOCCOL et al., 2001; TURCO et al., 2001).
A proposta para isolamento de uma fração antigênica seja ela
protéica ou polissacarídica vem sendo estudada há vários anos (FURTADO &
PELLEGRINO, 1956; LA PLACA et al., 1975; MONROY-OSTRIA et al., 1997;
ANDRADE et al., 1998; HOLZMULLER et al., 2002). Todavia, as pesquisas
com identificação e isolamento de proteínas, têm sido direcionadas para a
padronização de candidatos vacinais e pouco vem sendo aplicado ao
diagnóstico em larga escala. E mesmo as vacinas patenteadas e existentes no
mercado, não atingem boa sensibilidade ou proteção eficaz (MAYRINK et al.,
1979; ILG et al., 1999; CARDOSO et al., 2003).
A despeito dos avanços em pesquisa, o método diagnóstico deve
estar adequado a possibilidades e realidades da Rede de Saúde Pública. A
escolha do método mais acessível e eficaz deve ser considerada, uma vez que
dele depende a precocidade no início do tratamento do doente.
O presente trabalho tem por objetivo comparar três métodos
sorológicos: imunofluorescência indireta, ensaio imunoenzimático e Western
4
blotting, como auxiliares ao método parasitológico no diagnóstico da
leishmaniose tegumentar americana.
O uso destas metodologias justifica-se pelo fato de não serem
invasivas, podem ser usadas em grande escala e melhorar a qualidade do
diagnóstico desta doença. Embora o diagnóstico de certeza da LTA seja o
parasitológico, este método pode ser limitado, pois à medida que a lesão evolui
a probabilidade de encontro do parasito no local diminui. As culturas têm a
desvantagem na contaminação bacteriana que normalmente acompanham a
biopsia da lesão e na demora do desenvolvimento do protozoário.
Atualmente, o único método sorológico implantado nos laboratórios
de imunodiagnóstico da Secretaria de Estado da Saúde do Paraná como
auxiliar no diagnóstico da leishmaniose é a reação de Imunofluorescência
indireta (IFI). Porém, a característica do antígeno usado leva a uma reação
grupo-específica. O ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando antígeno
homólogo apresenta alta sensibilidade e especificidade, além de ser um
método prático, relativamente seguro e pouco oneroso, pois apresenta a
vantagem de analisar várias amostras simultaneamente com rápida leitura.
Quanto ao método de Western blotting, a grande vantagem está na alta
especificidade podendo distinguir a LTA de outras patologias que normalmente
compartilham da mesma área de transmissão. Este método ainda possibilita a
identificação de proteína antigênica específica que, uma vez isolada, poderia
ser avaliada para o desenvolvimento ou aperfeiçoamento de produto a ser
usado para o diagnóstico rápido e seguro.
5
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. POPULAÇÃO ESTUDADA
A coleta de soros e biopsia de lesões foi realizada em pacientes do
Município de Prudentópolis, onde os primeiros casos clínicos foram
confirmados em 2002, e do Hospital de Clínicas da UFPR, provenientes de
vários municípios do Estado do Paraná. As amostras foram coletadas entre os
anos de 2002 e 2004.
2.2. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
Os pacientes com diagnóstico clínico e portadores de lesões
compatíveis com leishmaniose foram submetidos à aspiração ou biopsia do
bordo da lesão. Também do bordo da lesão foi colhido material para exame
direto por aposição corado com May-Grunwald - Giemsa e observado em
Microscópio óptico a 1000X. O material de biopsia ou aspiração após assepsia
era inoculado em meio de cultura (NNN, Novy-McNeal-Nicolle e Tobbie &
Evans).
2.3. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Após a coleta de sangue, por punção venosa, as amostras foram
colocadas em banho-maria a 37°C por duas horas e o soro separado foi
centrifugado a 800 g por três minutos. As amostras de soro foram divididas em
alíquotas em volumes de 300 µL, identificadas e armazenadas a -20°C. O
conjunto de amostras foi dividido em cinco grupos:
Grupo I: amostras sorológicas de pacientes cujo critério
diagnóstico de leishmaniose tenha sido clínico;
Grupo II: amostras sorológicas de pacientes com diagnóstico
clínico comprovado por exame parasitológico (Grupo controle positivo);
6
Grupo III: amostras sorológicas de indivíduos sem leishmaniose
oriundos da área de transmissão;
Grupo IV: amostras sorológicas de pessoas sem histórico para
leishmaniose e residentes em área indene para a doença;
Grupo V: amostras sorológicas de indivíduos com outras
etiologias (Paracoccidioidomicose, Doença de Chagas e Toxoplasmose).
2.4. CEPAS DE Leishmania UTILIZADAS NA PRODUÇÃO DE
ANTÍGENO
Os antígenos foram preparados a partir de formas promastigotas em
cultura, das cepas de referência segundo recomendação da Organização
Mundial da Saúde: Leishmania (Leishmania) amazonensis, MHOM/BR/78/PH8
e Leishmania (Viannia) braziliensis, MHOM/BR/75/M2903. As cepas
identificadas por isoenzimas, provinham do criobanco do Laboratório de
Parasitologia Molecular do Departamento de Patologia Básica da UFPR.
2.5. CINÉTICA DE CRESCIMENTO DAS CEPAS DE Leishmania
Para avaliar a evolução morfológica e o rendimento das cepas de
Leishmania na preparação do antígeno, foram usados comparativamente dois
meios de cultivo bifásicos: NNN (Novy-McNeal-Nicolle) e CCS (Coração-
Cérebro- Sangue) (Anexo 1).
2.5.1. OBTENÇÃO DA BIOMASSSA
As cepas descongeladas e reativadas eram mantidas em tubos com
meio de Tobbie & Evans e repicadas a cada sete dias até obter biomassa para
a preparação do antígeno. Foram preparados quatro frascos de Erlenmeyer
contendo 25 mililitros do meio sólido de Tobbie & Evans (sendo dois frascos
para cada cepa), em cada qual foi inoculado oito mililitros da fase líquida das
culturas em manutenção e 12 mililitros de solução fisiológica a 0,85% estéril.
7
Após incubação a 24ºC por sete dias, as culturas ampliadas serviram como
inoculo para as culturas do estudo de biomassa.
2.5.2. CULTURAS PARA ESTUDO DE BIOMASSA
Para a quantificação da biomassa das espécies de Leishmania em
questão, foram preparados para cada uma, nove frascos tipo Erlenmeyer
contendo meio NNN e outros nove frascos com o meio CCS. Em cada frasco
foi inoculado um mililitro da fase líquida da cultura de ampliação e nove
mililitros de solução salina fisiológica a 0,85% esterilizada e incubado a 24ºC.
O crescimento de cada cultura controle foi recolhido por
centrifugação, após filtragem com gaze e solução fisiológica a 0,85%.
Sucessivas lavagens (solução fisiológica 0,85%; 0,3%; 0,85% e PBS pH 7,2) e
centrifugações com rotações crescentes (275, 350, 530 e 735 g) foram
realizadas até a lise das hemácias e remoção da hemoglobina de coelho. O
sedimento da última lavagem foi suspenso com solução PBS pH 7,2 com 2%
de formol. Depois de verificada a imobilidade das formas promastigotas, foi
realizado a contagem dos parasitos.
2.5.3. CONTAGEM DAS FORMAS PROMASTIGOTAS DE
Leishmania
Após diluição a 1/10 da concentração, uma gota foi colocada entre
lâmina e lamínula especial ultra plana numa Câmara de Thoma. A lâmina foi
observada ao microscópio ótico com aumento de 400 vezes, e contadas as 16
fileiras maiores, calculando a média por fileira. Para a obtenção do número de
parasitas por mililitro de antígeno, a média foi multiplicada pelas medidas da
lâmina (250 mm X 103 mm) e pelo fator de diluição.
A curva da cinética de crescimento das cepas foi estabelecida a
partir do segundo dia de incubação.
8
2.6. PRODUÇÃO DOS ANTÍGENOS
2.6.1.OBTENÇÃO DO ANTÍGENO BRUTO
Os parâmetros para a produção dos antígenos foram definidos após
análise da curva de crescimento de cada espécie de Leishmania.
Formas promastigotas de Leishmania amazonensis e de Leishmania
braziliensis foram inoculadas em meio nutritivo CCS e cultivadas a 24ºC por
cinco dias. Após a fase exponencial, a fase líquida de cada cultivo foi recolhida
e processada conforme descrito para o estudo da cinética de crescimento dos
protozoários (item 2.5.2.). O sedimento final foi diluído em solução PBS pH 7,2.
2.6.2. PREPARO DO ANTÍGENO PARA A REAÇÃO DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
O preparo dos antígenos seguiu os protocolos conforme Castro
2001, com adaptações (Anexo 2). Para inativação dos protozoários contidos na
solução reconstituída e conservação do antígeno, o produto foi mergulhado em
banho-maria a 55°C por oito minutos (adaptação baseada em Pessoa, 1988).
Procedeu-se em seguida a contagem das formas promastigotas
(como descrito no item 2.5.3.), para o cálculo da diluição final do produto. Uma
vez estabelecida a diluição ótima do antígeno, o mesmo foi dividido em
alíquotas e armazenado a 4°C.
2.6.3. PREPARO DO ANTÍGENO SOLÚVEL PARA O ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Para a extração de antígenos solúveis, doze estoques de
concentrados de antígeno bruto foram produzidos de cada espécie de
Leishmania (protocolo no Anexo 3).
Após a última centrifugação, os sedimentos de Leishmania
braziliensis e de Leishmania amazonensis foram armazenados em freezer a -
20°C, até a utilização, quando então eram descongelados e centrifugados a
9
800 g por 15 minutos a 4°C. O sedimento foi diluído em água destilada
esterilizada num volume igual à metade do volume desse sedimento. As
células em suspensão foram submetidas à criorruptura por choque térmico (-
196ºC e 37ºC por cinco minutos alternados) e as partículas resultantes foram
submetidas ao ultra-som por seis aplicações a 30 watts. A solução com o
extrato bruto foi centrifugada por 60 minutos a 14.000 g e 4°C. O sobrenadante
foi recuperado e filtrado em sistema de filtração esterilizante. Após a dosagem
de proteínas pelo Método de Bradford (Anexo 4), o antígeno foi distribuído em
alíquotas de pequenos volumes e acondicionados a - 20°C.
2.7. TÉCNICAS SOROLÓGICAS
2.7.1. PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania PELA
TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI),
SEGUNDO CHIARI, 1973.
O princípio da técnica de Imunofluorescência indireta (IFI) é uma
reação antígeno-anticorpo, visualizada pela adição de um anti-anticorpo
(conjugado) acoplado à fluoresceína. Esta absorve luz azul (comprimento de
onda de 490nm) e emite uma intensa fluorescência amarelo-esverdeada. A
reação será tanto mais intensa quanto maior a quantidade de anticorpos
específicos no soro avaliado.
2.7.1.1. REALIZAÇÃO DA TÉCNICA DE IFI
O teste foi realizado utilizando-se lâminas de vidro marcadas,
previamente tratadas e sensibilizadas com o antígeno, conforme protocolo no
anexo 5.
A triagem das amostras foi feita com as diluições de 1:20 e 1:40. Os
soros testes que apresentaram reação na maior diluição foram utilizados em
diluição seriada até 1:640 para a titulação. Cada série de soros foi
acompanhada de um controle negativo e um controle positivo.
O conjugado utilizado no presente trabalho foi o anti-Imunoglobulina
10
G humano marcado com fluoresceína, padronizado pela Fundação Oswaldo
Cruz – FIOCRUZ (Bio-Manguinhos). Conforme padronização prévia o
conjugado foi utilizado na diluição de 1:150 em solução Azul de Evans.
A leitura do teste foi realizada em microscópio para
imunofluorescência fotomicroscópio (lâmpada HBO 200 e filtro BG 12) em
aumento de 400x.
2.7.2. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA), SEGUNDO ENGVAL
& PERLAMANN, 1972.
O método é baseado na leitura do espectro de cor resultante da
reação antígeno-anticorpo e conjugado com peroxidase. A gradação de cores
gerada pela reação da peroxidase varia de amarelo pálido a amarelo intenso
ou laranja. Assim sendo, quanto mais alto o nível de anticorpos presentes na
amostra sorológica, mais intensa será a cor.
Foi realizada pesquisa de anticorpos por ensaio imunoenzimático em
amostras de soro humano contra antígenos de Leishmania braziliensis e
Leishmania amazonensis.
2.7.2.1. Padronização do Ensaio imunoenzimático
Na padronização do ensaio imunoenzimático foram utilizadas placas
esterilizadas de 96 cavidades, marca CORNIG. Foi empregado conjugado anti-
imunoglobulina G humano com peroxidase, marca Sigma, código A-170 e o
cromógeno OPD (ortho-phenylenediamine dihidrochloride) marca Sigma a 0,38
mg/mL de tampão citrato. O substrato para cromógeno foi o peróxido de
hidrogênio a 30% (4µL para 10,5 mL de tampão citrato) (ver anexo 7).
Numa mesma placa, constituída por 96 pocinhos (distribuídos em 12
colunas e oito linhas), foram analisadas duas concentrações dos antígenos
(500 e 1000 ng/pocinho), frente a três diluições (1:25, 1:50 e 1:100) de duas
amostras de soros-controle positivos e um controle negativo e duas diluições
do conjugado (1:500 e 1:1000). A coluna um não recebeu soro, antígeno ou
conjugado. A coluna 12 não recebeu antígenos.
11
Foram considerados os títulos, cujos valores de absorbância,
reuniam as diluições do conjugado e concentração dos antígenos capazes de
melhor discriminar entre controles positivos e negativos.
2.7.2.2. Controle das placas
Em todos os testes foram utilizados soros controles positivo e
negativo (com e sem antígeno, última coluna da placa). A eficácia do bloqueio
de placa era verificada deixando-se a primeira coluna da placa sem adição de
antígeno, soro ou conjugado. Foi analisado soro controle positivo com e sem
conjugado para avaliar a reatividade deste.
Os soros testes eram sempre colocados em duplicata e as médias
entre as densidades ópticas, calculadas em seguida.
2.7.2.3. Nível de corte da reação do Ensaio imunoenzimático (Cut-
off)
Para estabelecer o nível de corte do teste, 11 amostras de soros
humanos provenientes de zona indene para Leishmaniose no Estado do
Paraná, foram analisadas contra os antígenos Leishmania braziliensis e
Leishmania amazonensis. Com a leitura das densidades ópticas foram
realizados os cálculos (segundo a equação a seguir, conforme SPIEGEL, 1976,
p.111) para que fosse estabelecido o nível de corte (cut-off) e sensibilidade do
teste.
S=[(2-)²]/n
s = desvio padrão da amostra
= somatória
2= densidade óptica de cada amostra
= média das densidades
n= número de amostras
12
Foram respeitadas as mesmas condições estabelecidas na
padronização do teste.
2.7.2.4. Realização da técnica de Ensaio imunoenzimático
As soluções utilizadas para o ensaio imunoenzimático e o protocolo
de execução da técnica estão descritos nos anexos 6 e 7.
2.7.3. Técnica de Western blotting, segundo Towbin et al., 1979.
A técnica de Western blotting é bastante usada para identificação e
quantificação de proteínas específicas em misturas complexas como os
antígenos. Na imunodetecção, biomoléculas separadas eletroforeticamente são
transferidas do gel de SDS-poliacrilamida para um suporte inerte (membrana
de nitrocelulose). Em seguida são avaliadas com anticorpos que reagem
especificamente com os epitopos antigênicos presentes na proteína alvo ligada
ao suporte.
No presente trabalho, a técnica de Western blotting foi adotada
segundo Towbin et al., 1979, porém com modificações quanto à escolha dos
corantes, períodos de incubação de soro e conjugado (anexos 9 e 10).
2.7.3.1. Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida
O método de eletroforese é baseado no deslocamento de
biomoléculas de qualquer carga elétrica através da aplicação de um campo
elétrico numa matriz que normalmente é um gel. A velocidade de migração da
partícula depende do seu número de carga, do seu peso molecular e da
intensidade do campo aplicada. Quanto maior a razão entre a carga e a massa
da partícula, mais rápida será sua migração. As condições físico-químicas do
meio são mantidas em função do sistema tampão utilizado.
13
2.7.3.1.1. Procedimentos da eletroforese
O preparo das soluções para utilização na eletroforese está
detalhado no anexo 8, enquanto que o protocolo de execução da técnica de
eletroforese está descrito no anexo 9.
• Montagem do molde de gel
A malha do gel é escolhida dependendo do perfil da proteína. O
tamanho dos poros varia com a concentração de acrilamida utilizada na
polimerização. A proporção de bisacrilamida é mantida constante e faz-se
variar a acrilamida entre cinco e 20%, dependendo do tamanho dos poros que
se deseja para separar moléculas menores ou maiores. Para o presente
trabalho foi escolhido gel de separação a 15% (Tabela 1) e a espessura da
malha foi de um milímetro. O gel de empilhamento teve concentração fixa de
5% (Tabela 2).
TABELA 1 - SOLUÇÕES PARA O PREPARO DO GEL DE SEPARAÇÃO A 15%.
COMPONENTES VOLUME (ml)
H
2
O 4,6
Acrilamida 30% 10,0
TRIS 1,5M (pH8,8) 5,0
SDS 10% 0,2
Persulfato de amônio 10% 0,2
TEMED 0,016
TABELA 2 - SOLUÇÕES PARA O PREPARO DO GEL DE EMPILHAMENTO A 5%.
COMPONENTES VOLUME (ml)
H
2
O 4,1
Acrilamida 30% 1,0
TRIS 1,0M (pH6,8) 0,75
SDS 10% 0,06
Persulfato de amônio 10% 0,06
TEMED 0,012
14
• Preparo das amostras:
Amostras dos antígenos de Leishmania (Leishmania) amazonensis e
Leishmania (Viannia) braziliensis foram diluídas em igual volume de tampão de
amostra (Tris pH 6,8, SDS 10%, Glicerol, EDTA 0,1M, Azul de Bromofenol). As
amostras foram tratadas com agente redutor (2-mercaptoetanol) e
desnaturadas por calor (100°C).
• Preparo dos padrões:
Foi utilizado padrão de peso molecular de proteínas SDS-7 para a
corrida eletroforética e Western blotting (Tabela 3).
TABELA 3 - PADRÕES DE PESO MOLECULAR (SDS-7) DE PROTEÍNAS
UTILIZADAS NA ELETROFORESE E WESTERN BLOTTING
COMPONENTE ORIGEM PESO MOLECULAR(Da)
Albumina bovina 66,000
Ovoalbumina galinha 45,000
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase coelho 36,000
Anidrase carbônica bovina 29,000
Tripsinogênio (PMSF tratado) bovina 24,000
Inibidor de tripsina soja 20,100
Alfa-lactoalbumina bovina 14,200
As proteínas marcadoras (padrões) foram tratadas de modo idêntico às
amostras, conforme orientação do laboratório fabricante. O padrão pode ser
armazenado em freezer e não é necessário ferver novamente quando da
reutilização (a não ser quando diluído novamente).
O padrão de peso molecular de proteínas foi utilizado para estabelecer
a função da reta correlacionando logaritmo de peso molecular das
biomoléculas e a sua migração eletroforética.
15
• Aplicação das amostras e padrão
Para a padronização foi escolhido pente de Teflon com 15 dentes,
com cinco mm de largura, um mm de espessura e 10 mm de profundidade. O
volume máximo da amostra a ser aplicado foi calculado através da
profundidade do poço X largura do pente X espessura do gel, resultando em 50
µl. Após a padronização, foi utilizado pente contínuo para aplicação de amostra
única, na concentração ótima determinada observada na coloração do gel. Foi
usado o mesmo volume em todos os poços. O volume aplicado dependeu da
concentração protéica do antígeno a ser analisado e do número de proteínas
existentes na solução antigênica.
• Migração
As cubas do tanque do sistema foram preenchidas com tampão de
corrida pH 8,3 até os eletrodos estarem totalmente cobertos. Conectados os
eletrodos à fonte e aplicada amperagem constante (30 mA), deu-se início a
corrida eletroforética até que o corante indicador (azul de bromofenol) fosse
observado como uma linha ao fundo do gel.
• Revelação
Após a corrida eletroforética, o sistema de placas foi desmontado, o
gel removido delicadamente e mergulhado em solução corante Coomassie
Brilhante por 30 minutos (ou procedida transferência). O gel foi então retirado
dessa solução e mergulhado em solução descorante por 12 horas até a
completa revelação das proteínas (a solução foi renovada quando percebida a
saturação). O gel assim corado foi armazenado com uma solução esterilizada
de glicerol a 20% em água destilada e selado em plástico resistente.
• Interpretação do perfil eletroforético
As “bandas” de proteínas formadas no gel foram analisadas
conforme a sua mobilidade eletroforética, utilizando como parâmetro, um
padrão de massa molecular conhecido, corrido pareado às amostras. A
mobilidade eletroforética (Rf) é a razão entre a distância percorrida pela
16
proteína no gel e a distância total da corrida (tamanho do gel) e é inversamente
proporcional ao logaritmo de massa molecular.
Para a determinação do peso molecular de uma amostra é
construída uma curva de calibração, com o logaritmo do peso molecular das
proteínas do padrão na ordenada e a mobilidade eletroforética das mesmas na
abscissa. A partir de uma reta traçada é determinada uma equação (programa
Excel) de ajuste para o cálculo de peso molecular das proteínas analisadas,
pelo antilogaritmo do resultado da equação.
2.7.3.2. Transferência das proteínas
Pouco antes do final da corrida eletroforética, eram preparados os
aparatos para a transferência das proteínas resolvidas no gel:
o Corte das duas folhas de papel filtro Whatmann nº 3 (espessura
três mm), com largura e comprimento pouco maiores que as medidas do gel;
o Corte da membrana de nitrocelulose suporte (Hybond ECL –
código rpn 303D/ Amersham);
o A membrana e as folhas de papel filtro eram colocadas em
imersão em cuba contendo tampão de transferência, juntamente com as
esponjas e as placas perfuradas;
o Desmontagem do sistema de eletroforese com a retirada
cuidadosa da placa de vidro sobre o gel;
o Marcada a orientação de corrida no gel, lavagem do mesmo com
tampão de transferência;
o Montagem do sistema de transferência:
Sobre o gel, era colocada uma das folhas de papel filtro
umedecida e passava-se sobre este, um bastão de vidro para retirada das
bolhas.
Sobre a placa do sistema de transferência com indicação de
polaridade negativa era colocada uma das esponjas e sobre a esponja, o papel
filtro com o gel voltado para cima;
Sobre o gel, era colocada a membrana de nitrocelulose e
passado novamente sobre este, o bastão de vidro para remoção das bolhas;
17
Sobre a membrana, era colocada a segunda folha de papel filtro
umedecida;
Hidratava-se novamente com tampão de transferência e passava-
se o bastão de vidro mais uma vez;
Colocava-se a outra esponja e sobre esta, a outra placa de
transferência (pólo positivo).
Fechava-se o sistema montando o “sanduíche” que foi encaixado
na cuba preenchida com tampão de transferência;
A cuba foi colocada em geladeira e, conectados os eletrodos
(negativo-negativo positivo-positivo). O aparelho foi programado para
transferência de proteínas em voltagem constante a 24 volts e amperagem
variável, por 14 horas. Em seguida, a voltagem foi alterada para 48 volts por 60
minutos.
Ao final da transferência, o aparelho foi desligado e o sistema
desmontado. A membrana foi marcada na orientação da corrida e mergulhada
em solução corante Ponceau’S por 30 minutos com agitação leve.
Para remoção do corante em excesso, a membrana foi lavada com
água destilada até as “bandas” de proteínas estarem nítidas. Após secagem
em temperatura ambiente, a membrana foi cortada em tiras (blots) no sentido
da corrida eletroforética.
2.7.3.3. Imunodetecção
A partir do momento que a proteína encontra-se adsorvida na
membrana, a imunodetecção pode ser visualizada e executada como um
ensaio de imunoadsorção enzimática.
Do mesmo modo como foi feito para o ensaio imunoenzimático, a
padronização da imunodetecção por Western blotting, foi realizada com
diluições diferentes de soro (1/50, 1/75 e 1/100). O conjugado foi mantido em
diluição fixa de 1:1000, como a diluição usada para o ensaio imunoenzimático.
Como cromógeno e substrato foram utilizados aminoetilcarbazole + peróxido
de hidrogênio. O preparo das soluções e procedimento da técnica de Western
blotting está no anexo 10.
18
2.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para o cálculo dos índices que atestam a validade dos resultados
obtidos por sorologia, o diagnóstico de positividade foi estabelecido por
comparação com o diagnóstico de certeza dado pelo exame parasitológico -
esfregaço por aposição e/ou cultivo.
O cálculo de sensibilidade e especificidade dos testes sorológicos foi
obtido considerando a matriz para cálculo de indicadores (GUIMARÂES et al.,
1987) (Tabela 4).
TABELA 4 - MATRIZ PARA CÁLCULO DOS INDICADORES PARA AS REAÇÕES
SOROLÓGICAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA E ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO.
TESTE DOENTES
SADIOS
TOTAL
REAGENTE A C A+C
NÃO REAGENTE B D B+D
TOTAL A+B C+D A+B+C+D
Onde: SENSIBILIDADE = A/A+B
ESPECIFICIDADE = D/C+D
Foi estabelecido ainda o índice de concordância (IC) entre as
técnicas de diagnóstico de Imunofluorescência indireta e ensaio
imunoenzimático, para cada antígeno, conforme a equação abaixo:
IC
=
n° soros positivos nos dois testes + n° soros negativos para ambos
Total de soros analisados
19
3. RESULTADOS
3.1. POPULAÇÃO ESTUDADA
Foram analisadas 113 pessoas, 66 (58,4%) homens e 47 (41,6%)
mulheres. Destas, 87 (76,3%) eram portadores de lesões compatíveis com
leishmaniose (grupo I). Neste grupo, 87,4% pacientes (76/87) eram
provenientes do Município de Prudentópolis distribuídos pelas localidades de
Inferninho (02), Jaciaba (19), Postinho (10), Ligação (24), Vitorino (03), São
Francisco (03), São Francisquinho (01), Macacos (05), Ivaí Boa Vista (02),
Cachoeirinha (03), Moreiras (01), Rio Preto (01), Herval Grande (01),
indeterminado (01). Onze (12,6%) pacientes eram provenientes de outros
municípios, encaminhados pelo Hospital de Clínicas da UFPR. Destes, dois
(02) eram oriundos do Município de Turvo, um (01) do Município de Pinhão,
dois (02) do Município de Castro, um (01) do Município de Ibaiti e cinco (05) de
procedência ignorada.
Em 26 (23,0%) pessoas provenientes do Município de Prudentópolis
nas localidades de Postinho (03), Ligação (10), Jaciaba (05), Serra Esperança
(05), Cachoeirinha (01), São Francisquinho (01), Macacos (01) foram
realizados exames sorológicos (IFI, ensaio imunoenzimático e Western
blotting).
3.2. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
De um total de 87 pacientes com diagnóstico clínico, 61 (70,1%)
apresentaram diagnóstico positivo pela presença de formas amastigotas nas
células parasitadas (esfregaço e/ou in print) (Grupo II). Na cultura, 61 (70,1%)
pacientes foram positivos pelo desenvolvimento de formas promastigotas após
07, 14 ou 21 dias de repiques sucessivos em meio de cultivo. Considerando os
dois métodos, o número de pacientes com diagnóstico positivo foi de 69
(79,3%).
20
3.3. CINÉTICA DE CRESCIMENTO DAS FORMAS
PROMASTIGOTAS DE Leishmania sp.
3.3.1. Em meio NNN (Novy-MccNeal-Nicolle)
Do segundo ao décimo dia de incubação foi observada variação
morfológica dos parasitos dentre os cultivos para as duas espécies: formas
alongadas (fusiforme), em divisão e as globosas (em degeneração). Estas
últimas apresentam pouca mobilidade enquanto as duas primeiras
correspondem às formas móveis. Além da variação morfológica foi observado
que o rendimento de promastigotas variou em relação à espécie e
componentes nutritivos presentes no meio (Figura 1).
As formas promastigotas de Leishmania cultivadas em meio NNN
apresentaram um crescimento regular e uma sobrevida de dez dias. O meio é
menos enriquecido e os nutrientes disponíveis podem ser utilizados totalmente
pelos parasitos. De um modo geral predominaram as formas alongadas até o
décimo dia, quando também as formas globosas começam a ser observadas
devido ao declínio das condições nutricionais. As formas em divisão estavam
presentes no meio, porém, em proporção menor.
O comportamento das espécies L. amazonensis e L. braziliensis,
cultivadas em meio NNN foi bastante semelhante (Figura 1).
3.3.2. Em meio CCS (Coração-Cérebro-Sangue)
A taxa de multiplicação foi mais elevada entre o quinto e o sexto dias
tanto para L. braziliensis como para L. amazonensis (Figura 1). A partir do nono
e décimo dias, mais de 50% das culturas são de formas em degeneração.
21
FIGURA 1 – CINÉTICA DE CRESCIMENTO DAS FORMAS PROMASTIGOTAS DE
Leishmania amazonensis E Leishmania braziliensis EM MEIO NNN E EM MEIO CCS
MEIO NNN
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2 3 4 5 6 7 8 9 10
dias
promastigotas/ml (X10
6
)
L.amazonensis
L.braziliensis
.
MEIO CCS
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
2 3 4 5 6 7 8 9 10
dias
promastigotas/ml (X10
6
)
L.amazonensis
L.braziliensis
22
3.4. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
3.4.1. Padronização da Técnica de Imunofluorescência indireta (IFI)
Foi estabelecido o período ótimo do cultivo para produção dos
antígenos de Leishmania sp com meio CCS e retirada no período de seis dias.
O antígeno foi diluído em solução de PBS pH 7,2. Após análise de leitura em
outras diluições, obteve-se a concentração ideal do antígeno em torno de 3x10
6
promastigotas/mL. As amostras de soros humanos foram avaliadas em diluição
1:20 e 1:40 para triagem. Aqueles soros que apresentaram títulos positivos
nestas duas diluições foram titulados até 1/640. Todos os testes foram
realizados em triplicata e acompanhados de controles negativo e positivo.
Quanto ao conjugado, anti-Imunoglobulina G humana, foi utilizado na diluição
de 1:150 (conforme padronização prévia) em solução Azul de Evans a 0,1%.
3.4.2. Padronização da Técnica de Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
A combinação ideal de concentração de antígeno, diluição de soro e
de conjugado, permitindo a melhor diferenciação entre positivo e negativo foi
escolhida para uso no teste. Desta forma, padronizou-se a concentração de
500ng/pocinho para os antígenos, diluição do conjugado a 1:1000 e diluição
dos soros a 1:50.
O nível de corte da reação entre reagentes e não reagentes foi
calculado com base na média das densidades ópticas () dos soros de
pessoas procedentes de região indene para a doença, acrescido três vezes o
valor de desvio padrão (s). Os valores obtidos foram 0,22 para L. (L.)
amazonensis e 0,11 para L. (V.) braziliensis.
23
3.4.3. Análise dos soros pelas técnicas de Imunofluorescência (IFI) e
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
De 87 pacientes com diagnóstico clínico e portadores de LTA (Grupo
I), foram realizados 81 exames sorológicos pelas reações de
Imunofluorescência indireta (IFI) e ensaio imunoenzimático (ELISA).
Pela técnica de IFI com antígeno de Leishmania braziliensis, 65/81
(80,2%) pacientes foram sororreagentes com títulos iguais ou superiores a 1/40
(Tabela 05), sendo 28 soros com título 1/40, 23 com título 1/80, onze (11) com
título 1/160, três (02) com título 1/320 e um (01) com título 1/640. Quando
utilizado antígeno de Leishmania amazonensis, 27 amostras foram reagentes
(77,1%) de 35 testes realizados, sendo 16 soros com título 1/40 e onze com
título 1/80.
No ensaio imunoenzimático de 81 pacientes, 72 (88,9%) foram
reagentes somente para o antígeno de Leishmania braziliensis e 57 (70,4%)
somente para o antígeno de Leishmania amazonensis (Tabela 05).
No Grupo III, 13 pessoas sem sinais clínicos de leishmaniose
tegumentar, todas da mesma região de transmissão e sujeitos às mesmas
condições que pessoas portadoras de leishmaniose, foram analisadas pelo
ensaio imunoenzimático para os antígenos de Leishmania amazonensis e
Leishmania braziliensis (Tabela 05). Deste grupo, três pessoas foram
sororreagentes para essa técnica para os dois antígenos: Leishmania
amazonensis e Leishmania braziliensis. Somente um foi soro negativo para os
dois antígenos e outros nove soros negativos contra o antígeno de Leishmania
amazonensis e outro soro negativo somente para Leishmania braziliensis. Dez
pacientes foram sororreagentes apenas para o antígeno de Leishmania
braziliensis. O mesmo grupo analisado pela técnica de IFI, dois soros foram
reagentes para o antígeno de Leishmania amazonensis e quatro foram
reagentes para o antígeno de Leishmania braziliensis.
Na pesquisa de anticorpos no soro de 13 pessoas sem sinais
clínicos de leishmaniose tegumentar provenientes de área indene (Grupo IV),
não houve reação a qualquer dos antígenos pela técnica de IFI. Um soro reagiu
aos antígenos pelo ensaio imunoenzimático (Tabela 05), entretanto, este soro
reagente (pessoa do sexo feminino, 26 anos de idade) apresentou-se no bord
24
line para o antígeno de Leishmania amazonensis e para o antígeno de
Leishmania braziliensis.
Foram analisados pacientes portadores de outras etiologias
confirmadas por biópsia ou isolamento do agente etiológico em cultivo (Grupo
V): 30 pacientes com Paracoccidioidomicose (Grupo V a), 10 pacientes com
Doença de Chagas (Grupo V b) e 08 pacientes com Toxoplasmose (Grupo V c)
(Tabela 05).
TABELA 05 - DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO PELOS MÉTODOS DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFI) E ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
(ELISA) DOS GRUPOS ESTUDADOS.
AMOSTRAGEM
METODOLOGIA
Grupos clínicos
IFI L.a IFI L.b ELISA L.a ELISA L.b
n R NR R NR R NR R NR
I 81 27** 08 65 16 57 24 72 09
II 60 21** 07 55 05 43 17 57 03
III 13 02 11 04 09 03 10 11 02
IV 13 00 13 00 13 02 11 01 12
V a 30 01** 23 01** 23 21 09 13 17
V b 10 07 03 08 02 09 01 08 02
V c 08 08 00 01 07 01 07 04 04
Grupos: Pessoas com lesões compatíveis com leishmaniose tegumentar (LT) (I); Pessoas com
leishmaniose (LT) confirmada parasitologicamente (II); Moradores da região de transmissão e
sem sinais clínicos de LT (III); Pessoas de região indene/população saudável (IV); Portadores
de: Paracoccidioidomicose (V a); Doença de Chagas (V b) e Toxoplasmose (V c). IFI:
Imunofluorescência Indireta; ELISA: ensaio imunoenzimático; L.a. Leishmania amazonensis;
L.b.: Leishmania braziliensis.
**Amostragem parcial para os testes, n=35 (GI) e n=28 (GII).
3.4.4. Sensibilidade e especificidade das técnicas de
Imunofluorescência indireta e Ensaio imunoenzimático.
Para cálculo de sensibilidade, foram considerados 60 soros de
pacientes cujo diagnóstico para leishmaniose tegumentar foi comprovado por
exame parasitológico direto e/ou indireto. O cálculo de especificidade foi
realizado com base na análise sorológica de pessoas provenientes da região
de Curitiba (n=13). Por ensaio imunoenzimático, 57/60 soros de pacientes
foram reagentes para o antígeno de Leishmania braziliensis (sensibilidade de
25
95,0%). Para o antígeno de Leishmania amazonensis 43/60 foram reagentes
(sensibilidade de 71,7%) (Tabela 06).
A especificidade da técnica de IFI foi de 100,0% (00/13) para o
antígeno de Leishmania. braziliensis e 100,0% (00/13) para o antígeno de
Leishmania amazonensis. Pela técnica de ensaio imunoenzimático, a
especificidade foi de 92,3% (01/13) para o antígeno Leishmania braziliensis e
84,6% (02/13) para o antígeno de Leishmania amazonensis (Tabela 06).
TABELA 06 – SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DAS TÉCNICAS DE
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFI) E ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
(ELISA) PARA 60 SOROS DE PACIENTES CUJO DIAGNÓSTICO
PARA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR (LT) FOI COMPROVADO
PELO EXAME PARASITOLÓGICO E FRENTE A 13 SOROS DE
PESSOAS DE ÁREA INDENE.
IMUNOFLUORESCÊNCIA ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO
L.amazonensis
L.braziliensis
L.amazonensis
L.braziliensis
R NR R NR R NR R NR
DOENTES N=60 21** 07 55 05 43 17 57 03
SADIOS N=13 00 13 00 13 02 11 01 12
SENSIBILIDADE 75,0% 91,7% 71,7% 95,0%
ESPECIFICIDADE
100,0% 100,0% 84,6% 92,3%
**Teste realizado com amostragem parcial
Comparando os resultados da sorologia dos pacientes com
diagnóstico clínico àqueles com diagnóstico parasitológico, observa-se que o
percentual de soros positivos aumentou pelas técnicas de IFI, de 80,2% para
91,7% e no ensaio imunoenzimático de 88,9% para 95,0%, respectivamente
usando o antígeno de Leishmania braziliensis. Para o ensaio imunoenzimático
utilizando o antígeno de Leishmania amazonensis, o percentual manteve-se
muito próximo de 70,4% para 71,7%. Na reação de IFI, a sensibilidade foi de
75,0% para este antígeno.
Daqueles pacientes cujo diagnóstico não foi confirmado por exame
parasitológico (18/84), dois apresentaram contaminação bacteriana ou
leveduriforme na amostra, impossibilitando a análise. Entretanto, mostraram-se
sororeagentes na Imunofluorescência indireta e ensaio imunoenzimático (para
os antígenos Leishmania amazonensis e Leishmania braziliensis). Outros cinco
26
pacientes foram igualmente sororeagentes para IFI e ensaio imunoenzimático.
Apenas três pacientes foram soros negativos em IFI e ensaio imunoenzimático,
confirmando o resultado no exame parasitológico. Um paciente foi soro
reagente apenas para IFI e outros sete pacientes foram sororeagentes apenas
para o ensaio imunoenzimático, sendo cinco para os dois antígenos e dois
somente para o antígeno de Leishmania amazonensis. Um paciente foi soro
reagente para antígenos de Leishmania braziliensis, por Imunofluorescência
indireta e ensaio imunoenzimático (Anexo11).
3.4.5. Concordância entre as técnicas de Imunofluorescência indireta
e Ensaio imunoenzimático
O índice de concordância entre as técnicas foi calculado
considerando os 60 soros de pacientes comprovadamente portadores de
leishmaniose tegumentar. A comparação de resultados das duas técnicas para
esta amostragem é mostrada na tabela 07. A amostragem analisada com
antígeno de Leishmania amazonensis foi parcial e o resultado obtido,
proporcional a esta.
TABELA 07 - COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS IFI E
ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO
COM ANTÍGENO DE L. amazonensis E L.
braziliensis CONTRA 60 SOROS DE PACIENTES PORTADORES DE
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
L. amazonensis L. braziliensis
R NR R NR
IFI
R 17 04 52 03
NR 04 03 03 02
TOTAL 28 60
R: reagente; NR: não reagente
A concordância entre as técnicas de IFI e ensaio imunoenzimático
para o antígeno de Leishmania braziliensis foi de 0,90 e 0,71
proporcionalmente para o antígeno de Leishmania amazonensis.
27
3.5. TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING
As análises pela técnica de Western blotting foram feitas utilizando
os antígenos Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania)
amazonensis. O cálculo do peso molecular das proteínas reveladas foi
realizado com base na equação da reta obtida conforme a mobilidade
eletroforética das proteínas padrão de peso molecular conhecido (Figura 2).
FIGURA 2 - MOBILIDADE ELETROFORÉTICA DAS PROTEÍNAS COM PESO
MOLECULAR CONHECIDO PARA OBTENÇÃO DA EQUAÇÃO DA
RETA PADRÃO.
3.5.1. Análise dos soros de pacientes contra antígeno de Leishmania
braziliensis.
A análise de Western blotting dos soros de pacientes portadores de
leishmaniose com o antígeno de Leishmania (Viannia) braziliensis revelou 20
proteínas de peso molecular entre 16,6 Kda a 218,8 Kda (Anexo 14). Dos 60
y = -1,2381x + 2,3536
R
2
= 0,9932
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00
Mobilidade eletroforética relativa
Logarítmo de peso molecular
Valores observados Valores projetados
28
soros estudados, as proteínas com peso molecular de 177,8 Kda e 169,8 Kda
foram as mais prevalentes sendo reconhecidas por 58 (96,6%) e 57 (95,0%)
soros, respectivamente, seguidas pelas proteínas de peso molecular 112; 61,6;
120 e 134 8 Kda (Tabela 8).
No soro das 13 pessoas sem sinais clínicos de leishmaniose
tegumentar da região de Prudentópolis e com algum nível de parentesco com
os doentes (indivíduos comunicantes) (Anexo 15) não foram detectadas
proteínas de peso molecular 218,8; 85; 70,8; 56; 53,7 e 17,4 Kda (Tabela 8).
Das 16 proteínas reveladas, 14 foram detectadas em apenas um soro
(LPM100). As proteínas de peso molecular 177,8 Kda (oito soros), 169,8 Kda
(sete soros) e 199,5 Kda (três soros) foram as mais prevalentes. As proteínas
de peso molecular 48,9 e 46,6 Kda só estão presentes neste grupo. Em
apenas um soro (LPM100) foram reveladas 14 proteínas entre 46,6 e 177,8
Kda. Em três soros (LPM104, LPM107 e LPM108) não foram detectadas
bandas. Em soro de pessoas sem sinais clínicos de leishmaniose tegumentar
provenientes de área indene (indivíduos sadios), as proteínas reveladas foram
diferentes daquelas detectadas nos pacientes com leishmaniose tegumentar
(Tabela 8).
Quatro proteínas foram reveladas, todas de proteínas de alto peso molecular
(194,9 a 162,2 Kda). A proteína com peso molecular de 173,8 Kda foi reagente
para seis soros, sendo que um destes soros revelou também banda para a
proteína de 162,2 Kda. Dois soros reagiram com a proteína de 184,5 Kda,
sendo que um destes soros reagiu também com a proteína de 173,8 Kda.
Apenas um soro revelou a banda de 194,9 Kda (Anexo16).
29
TABELA 08 – PERCENTUAL DA PREVALÊNCIA DAS PROTEÍNAS
RECONHECIDAS NA PESQUISA DE ANTICORPOS COM ANTÍGENO
DE Leishmania braziliensis NO SORO DE PESSOAS DOENTES,
COMUNICANTES E SADIAS PELA TÉCNICA DE WESTERN
BLOTTING.
% DE RECONHECIMENTO PROTEÍNAS
DOENTES COMUNICANTES SADIOS
218,8 8,3 0,0 0,0
199,5 3,3 23,1 0,0
177,8 96,6 61,5 0,0
169,8 95,0 53,8 0,0
158,5 8,3 7,7 0,0
154,9 3,3 7,7 0,0
148,0 3,3 7,7 0,0
135,0 20,0 7,7 0,0
125,9 1,7 7,7 0,0
120,0 30,0 7,7 0,0
112,0 38,3 7,7 0,0
104,7 13,3 7,7 0,0
95,5 1,7 7,7 0,0
85,0 1,7 7,7 0,0
70,8 1,7 0,0 0,0
61,6 30,0 0,0 0,0
56,0 1,7 0,0 0,0
53,7 3,3 0,0 0,0
48,9 0,0 7,7 0,0
46,8 0,0 7,7 0,0
17,4 10,0 0,0 0,0
16,6 15,0 7,7 0,0
N=60 N=13 N=13
A análise de Western blotting dos soros de pacientes portadores de
outras etiologias revelou nove proteínas de peso molecular entre 58,9 e 151,0
Kda (Tabela 09). Os soros de pacientes com Doença de Chagas reconheceram
as proteínas de peso molecular 93,3; 135; 141; 148 e 151Kda. Duas proteínas
de peso molecular 135,0 e 148,0 Kda são reconhecidas nos soros de pacientes
com Doença de Chagas e soro de pacientes com leishmaniose. As proteínas
de peso molecular 58,9; 63,0; 70,8 e 81,3 Kda foram detectadas nos soros dos
pacientes com PCM. Uma proteína de peso molecular 70,8 Kda foi reconhecida
em soro de pacientes com PCM e leishmaniose. As demais proteínas não
foram detectadas pelo soro de pacientes com leishmaniose, indicando que há
pouca reação cruzada entre as proteínas destes diferentes antígenos.
Nenhuma banda foi detectada nos soros dos pacientes com toxoplasmose
(Tabela 09).
30
TABELA 09 - PROTEÍNAS RECONHECIDAS NA PESQUISA DE ANTICORPOS
CONTRA Leishmania COM ANTÍGENO DE Leishmania braziliensis NO
SORO DE PESSOAS COM LEISHMANIOSE, E NO POOL DE SOROS
DE PESSOAS COM OUTRAS PATOLOGIAS PELA TÉCNICA DE
WESTERN BLOTTING
GRUPOS CLÍNICOS
PROTEÍNAS
PM (Kda)
LEISHMANIOSE
PARACOCCIDIOIDO
MICOSE
DOENÇA DE
CHAGAS
TOXOPLASMOSE
218,8 X - - -
199,5 X - - -
177,8 X - - -
169,8 X - - -
158,5 X - - -
154,9 X - - -
151,0 - - X -
148,0 X - X -
141,0 - - X -
135,0 X - X -
125,9 X - - -
120,0 X - - -
112,0 X - - -
104,7 X - - -
95,5 X - - -
93,3 - - X -
85,0 X - - -
81,3 - X - -
70,8 X X - -
63,0 - X - -
61,6 X - - -
58,9 - X - -
56,0 X - - -
53,7 X - - -
17,4 X - - -
16,6 X - - -
3.5.2. Análise dos soros de pacientes contra antígeno de Leishmania
(Leishmania) amazonensis
A análise de Western blotting dos 60 soros de pacientes com
diagnóstico parasitológico direto e/ou indireto de leishmaniose com o antígeno
de Leishmania (Leishmania) amazonensis revelou 26 proteínas de peso
molecular entre 23,9 Kda a 173,7 Kda (Anexo 17).
Dos 60 soros estudados, as proteínas com peso molecular de
83,1Kda e 79,4 Kda tiveram maior prevalência sendo reconhecidas por 50
31
soros (83,3%), seguidas pelas proteínas de peso molecular 75,8; 74,1; 33,9;
33,1; 30,9 e 29,5 Kda (Tabela 10). Observa-se que apesar de um grande
número de proteínas reveladas por este antígeno, as proteínas detectadas
formam dois grupos bem homogêneos de peso molecular entre 29,5 a 33,9
Kda em um grupo de proteínas de peso molecular 74,1 a 83,1Kda.
No soro dos 13 pessoas sem sinais clínicos de leishmaniose
tegumentar da região de Prudentópolis (grupo comunicante), não foram
detectadas proteínas de peso molecular 89,1; 69,1; 63; 46,7; 40,7 e 23,9 Kda
(Anexo 18). Das 20 proteínas reveladas, as de peso molecular 74,1; 75,8; 79,4
e 83,1Kda tiveram maior prevalência (10/20). Um outro grupo foi formado pelas
proteínas de peso molecular 33,9; 33,1; 30,9 e 29,5 Kda (Tabela 10).
Em 13 soros de pessoas residentes em área indene (Anexo 19)
foram reveladas cinco proteínas iguais às detectadas nos pacientes com
leishmaniose tegumentar. As proteínas prevalentes foram as de peso molecular
30,9; 33,9 e 74,1. Em seguida as proteínas de 75,8 e 173,7 Kda.
A análise de Western blotting dos soros de pacientes portadores de
outras etiologias revelou 18 proteínas de peso molecular entre 19,0 e 170,0
Kda. As proteínas de peso molecular 63,0; 100,0; 123,0 e 138,0 Kda foram
iguais àquelas reveladas pelos soros de pacientes com leishmaniose
tegumentar. Os soros de pacientes com Doença de Chagas revelaram as
mesmas proteínas mostrando elevada taxa de reação cruzada entre os
antígenos. As proteínas de peso molecular 56,0; 63,0; 145,0 e 170,0 Kda foram
detectadas nos soros dos pacientes com PCM. As proteínas de peso molecular
63,0 e 144,5 Kda foram comuns aos soros dos pacientes de LTA. Uma proteína
foi detectada nos soros dos pacientes com toxoplasmose, mas não se trata de
proteína encontrada nos soro dos pacientes com LTA (Tabela 11).
32
TABELA 10 – PERCENTUAL DA PREVALÊNCIA DAS PROTEÍNAS
RECONHECIDAS NA PESQUISA DE ANTICORPOS COM ANTÍGENO
DE LEISHMANIA AMAZONENSIS NO SORO DE PESSOAS DOENTES,
COMUNICANTES E SADIOS PELA TÉCNICA DE WESTERN
BLOTTING.
% DE RECONHECIMENTO PROTEÍNAS
PM (Kda)
DOENTES COMUNICANTES SADIOS
173,7 53,3 15,4 7,7
154,9 21,6 7,7 0,0
151,3 51,6 15,4 0,0
144,5 46,6 23,1 0,0
141,2 50,0 23,1 0,0
138,0 48,3 7,7 0,0
123,0 20,0 23,1 0,0
114,8 25,0 15,4 0,0
112,2 46,6 46,1 0,0
109,6 50,0 46,1 0,0
104,7 25,0 7,7 0,0
100,0 13,3 7,7 0,0
89,1 25,0 0,0 0,0
83,1 83,3 76,9 0,0
79,4 83,3 76,9 0,0
75,8 81,6 76,9 38,0
74,1 81,6 76,9 61,5
69,1 10,0 0,0 0,0
63,0 5,0 0,0 0,0
46,7 40,0 0,0 0,0
40,7 6,6 0,0 0,0
33,9 80,0 53,8 46,1
33,1 80,0 53,8 0,0
30,9 80,0 53,8 46,1
29,5 80,0 53,8 0,0
23,9 6,6 0,0 0,0
N=60 N=13 N=13
33
TABELA 11 − PROTEÍNAS RECONHECIDAS NA PESQUISA DE ANTICORPOS
CONTRA Leishmania COM ANTÍGENO DE Leishmania amazonensis
NO SORO DE PESSOAS COM LEISHMANIOSE E NO POOL DE
SOROS DE PESSOAS COM OUTRAS PATOLOGIAS PELA TÉCNICA
DE WESTERN BLOTTING
GRUPOS CLÍNICOS
PROTEÍNAS
PM (Kda)
LEISHMANIOSE
PARACOCCIDIOIDO
MICOSE
DOENÇA DE
CHAGAS
TOXOPLASMOSE
173,7 X - - -
170,0 - X - -
158,0 - - X -
154,9 X - - -
151,3 X - - -
144,5 X X - -
141,2 X - - -
138,0 X - X -
135,0 - - X -
126,0 - - X X
123,0 X - X -
114,8 X - - -
112,2 X - - -
109,6 X - - -
104,7 X - - -
100,0 X - X -
89,1 X - - -
85,0 - - X -
83,1 X - - -
79,4 X - - -
75,8 X - - -
74,1 X - - -
70,8 - - X -
69,1 X - - -
63,0 X X X -
56,0 - X X -
52,5 - X X -
47,8 - X - -
46,7 X - - -
40,7 X - - -
33,9 X - - -
33,1 X - - -
30,9 X - - -
29,5 X - - -
25,0 - - X -
23,9 X - - -
22,9 - - X -
21,8 - - X -
19,0 - - X -
34
4. DISCUSSÃO
O diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA) em
áreas endêmicas e epidêmicas freqüentemente é baseado no diagnóstico
clínico, algumas vezes combinado com exames parasitológicos e/ou
imunológicos, nem sempre eficazes. A busca por métodos diagnósticos que
sejam de fácil execução, rápidos, sensíveis e específicos poderia melhorar o
diagnóstico diminuindo a ocorrência de falso-negativos e o tempo de obtenção
de resultados.
Os métodos tradicionais de diagnóstico envolvem a detecção de
amastigotas nos exames de esfregaço e histopatológico de tecidos e cultura de
promastigotas (parasitológico).
Neste trabalho um total de 113 pacientes com diagnóstico clínico e
portadores de lesões compatíveis com leishmaniose, 87 foram examinados e
70,1% apresentaram-se positivos por um dos dois métodos - esfregaço e
cultura. Estas metodologias são de grande valor por identificarem a presença
do parasito, embora este último método possa levar uma semana ou mais para
obtenção de resultados (REED, 1996). Faber et al., 2003, em estudo
prospectivo, consideram os métodos tradicionais de diagnóstico como nem
sempre conclusivos em pacientes com diagnóstico clínico de LT e avaliam ser
a cultura mais sensível que os demais métodos diretos.
Outros métodos diretos seriam a prova de hibridização de DNA e
uso de anticorpo monoclonal que não foram utilizados neste trabalho.
Os métodos indiretos de diagnóstico são os imunológicos que
incluem a sorologia e o teste intradérmico. Estes testes são realizados com a
utilização de parasitas íntegros ou extratos e constituem valiosa ferramenta no
diagnóstico da LT. As técnicas empregadas para diagnóstico sorológico das
amostras neste trabalho foram a técnica de Imunofluorescência indireta – IFI,
ensaio imunoenzimático – ELISA e Western blotting. Enquanto que a primeira
técnica utiliza antígenos íntegros, o ensaio imunoenzimático e o Western
blotting utilizam extratos do parasito. Entretanto, no ensaio imunoenzimático o
antígeno é aplicado em solução bruta e na análise por Western blotting as
35
proteínas do antígeno são separadas eletroforeticamente. A reação final é
capaz de identificar quais as proteínas mais imunogênicas.
Neste trabalho foram utilizadas duas espécies de Leishmania
empregadas na produção dos antígenos para diagnóstico sorológico da
leishmaniose tegumentar - Leishmania (Leishmania) amazonensis e
Leishmania (Viannia) braziliensis - pertencem a subgêneros distintos e
apresentam especificidades morfológicas, bioquímicas e, sobretudo, nas
formas clínicas (LAINSON & SHAW, 1987). Enquanto Leishmania (L)
amazonensis é responsável pela manifestação cutânea e cutâneo-difusa da
doença, a segunda espécie é causadora das formas cutânea e cutâneo-
mucosa da leishmaniose tegumentar.
Com a finalidade de padronizar a produção dos antígenos de
Leishmania, o comportamento in vitro de ambas as espécies na sua forma
promastigota, foi avaliado cultivando-as em dois meios de cultivo bifásicos
distintos: meio de Novy-McNeal e Nicolle – NNN e meio Coração-Cérebro-
Sangue – CCS, com períodos de incubação entre dois e dez dias.
O meio CCS, mais rico em nutrientes, proporcionou uma elevada
taxa de multiplicação dos promastigotas já no segundo dia de cultivo das
cepas. O meio NNN, pouco nutritivo proporcionou uma biomassa menos
exuberante, embora a sobrevida dos protozoários fosse mais longa. Quanto ao
rendimento dos antígenos produzidos, a espécie Leishmania amazonensis foi
significativamente maior quando comparado aos antígenos produzidos com
Leishmania braziliensis. A primeira espécie é maior em tamanho e possui
metabolismo mais acelerado.
A razão de escolha do meio bifásico CCS para a produção dos
antígenos de Leishmania sp foi a possibilidade de obtenção de biomassa em
menor tempo com maior rendimento, importante, sobretudo para os antígenos
solúveis.
Amostras de soro de 81 pacientes (com diagnóstico clínico) foram
submetidas à Imunofluorescência indireta com antígeno de L. braziliensis, 65
(80,2%) pacientes foram soro reagentes com títulos iguais ou superiores a 1/40
e com o antígeno de L. amazonensis, 77,1% (27/35). Romero et al., 2005
obtiveram 79,6% de sensibilidade no teste utilizando antígeno de L.
36
amazonensis, quando analisados soros de pacientes infectados com L.
braziliensis e 71,7% em pacientes infectados com L. guyanensis. Britto et al.,
2000, encontraram 52% de sensibilidade e 79% de especificidade, em um
grupo de pessoas com diagnóstico clínico para leishmaniose.
Pelo ensaio imunoenzimático, 72/81 pacientes (88,9%) foram
reagentes para o antígeno de L. braziliensis e 57/81 (70,4%) para o antígeno
de L. amazonensis (níveis de corte para o ensaio de 0,11 e 0, 22,
respectivamente).
Considerando 60 pacientes que tiveram o diagnóstico para
Leishmaniose tegumentar confirmado por exame parasitológico, quando
analisadas as amostras sorológicas por Imunofluorescência indireta com
antígeno de Leishmania braziliensis, 55 pacientes foram sororreagentes (91,7%
de sensibilidade) com títulos de 1/40 (36,4%), 1/80 (40,0%), 1/160 (20,0%) e
1/320 (3,6%). Diferentes fases da doença em que se encontrariam os pacientes
no momento do diagnóstico clínico podem ser fatores determinantes para
diferentes títulos de anticorpos. É sabido que na fase inicial da leishmaniose
(um a quatro meses), anticorpos circulantes são pouco detectados por IFI
(janela imunológica). Esta técnica foi empregada no estudo da soroprevalência
da leishmaniose tegumentar em vários trabalhos no Brasil (MARZOCHI et al.,
1980; PASSOS, 1999; SILVEIRA et al. 1996). No estado do Paraná, é a
metodologia padrão para a pesquisa sorológica da LTA. A sensibilidade da
técnica quando utilizado antígeno de Leishmania amazonensis foi de 75%
(proporcionalmente ao número de soros avaliados).
Quando analisada a sensibilidade do ensaio imunoenzimático
individualmente para os antígenos, 71,7% (43/60) foram reagentes pela técnica
contra o antígeno de Leishmania amazonensis e contra o antígeno de
Leishmania braziliensis, 95,0% (57/60) reagiram para o teste.
Os índices de concordância entre os resultados do teste de IFI e
ensaio imunoenzimático (Tabela 07) neste grupo de pessoas com
leishmaniose, mostraram resultados 0,90 para L.braziliensis e 0,71 para
L.amazonensis. Outros autores tendo comparado as técnicas de IFI e ensaio
imunoenzimático também verificaram boa concordância entre os resultados
(EDRISSIAN e DARABIAN, 1979; GARCIA et al., 1990).
37
As 13 amostras do grupo comunicante pertencem a pacientes sem
sinais clínicos para Leishmaniose, porém residentes na mesma região e sob as
mesmas condições que os pacientes portadores da leishmaniose tegumentar.
A reatividade sorológica destes pacientes contra antígeno de Leishmania
braziliensis foi de 30,7% para a reação de IFI e 84,6% para o ensaio
imunoenzimático. Estes resultados seriam sugestivos de contato prévio dessas
pessoas com o antígeno sem que a doença fosse desenvolvida. A discrepância
entre os resultados de IFI e ensaio imunoenzimático neste grupo, pode estar
relacionada aos diferentes antígenos envolvidos nas reações, uma vez que os
extratos de Leishmania sp envolvem antígenos não só de superfície, como
também de núcleo, vacúolo, cinetoplasto e possivelmente outros, o que torna o
teste mais sensível à detecção de anticorpos. Utilizando antígeno de
Leishmania amazonensis, 15,3% (02/13) foram reagentes para IFI e 23%
(03/13) para o ensaio imunoenzimático.
Para o cálculo de especificidade foram analisados soros de
indivíduos sadios (n=13) todos residentes em área livre de Leishmaniose ou
Doença de Chagas. Nenhum dos indivíduos apresentava histórico para essas
doenças ou qualquer lesão compatível, ou estiveram em regiões endêmicas
para as mesmas. Para o teste de Imunofluorescência Indireta, a especificidade
foi de 100,0%, 92,3% para o ensaio imunoenzimático com antígeno de L.
braziliensis e 84,6% com antígeno de L. amazonensis.
No presente estudo foi possível constatar maior sensibilidade no
ensaio imunoenzimático em relação ao teste de Imunofluorescência Indireta.
Entretanto, a determinação de anticorpos não pode ser usada isoladamente
para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar em áreas endêmicas. Soros de
pacientes em fases diferentes de tratamento reagem de modo distinto para as
técnicas sorológicas (CHIARI et al., 1973a, b; MENDONÇA et al., 1988).
Monroy-Ostria et al., 1997, relata que em torno de 30% dos pacientes tem
títulos similares àqueles dos sadios na área endêmica.
Pacientes portadores de outras patologias, com diagnóstico
confirmado para: Paracoccidioidomicose (n=30); portadores de Doença de
Chagas (n=10) de diversas localidades do Paraná e Toxoplasmose (n=08) da
região de Curitiba foram submetidos ao ensaio imunoenzimático e
38
Imunofluorescência Indireta para ambos os antígenos. Estes grupos clínicos
foram escolhidos para avaliação de reatividade ante as técnicas sorológicas do
presente trabalho, em razão de serem patologias de alguma forma
relacionadas à leishmaniose: Leishmania, Toxoplasma gondii e
Paracoccidioides brasiliensis são patógenos intracelulares e embora
pertencentes a grupos distintos (os dois primeiros são protozoários e o último,
um fungo dimórfico), poderia haver semelhanças quanto à resposta
imunológica do hospedeiro à presença de qualquer destes parasitos. Alguns
trabalhos mostram reatividade cruzada entre antígeno de Leishmania sp e
anticorpos de pacientes portadores de micoses profundas como a
esporotricose (BARROS et al. 2005) e paracoccidioidomicose (SCHUBACK et
al., 2001) onde estas doenças compartilham da mesma região de transmissão.
Trypanosoma cruzi e Leishmania são protozoários pertencentes à mesma
família (Trypanosomatidae) e, apesar de apresentarem manifestações clínicas
distintas, apresentam alta reatividade cruzada, classicamente referida em
vários trabalhos (CAMARGO & REBONATO, 1969; CHILLER et al., 1990;
MALCHIODI et al., 1994). Possivelmente os tripanosomatídeos detêm
proteínas antigênicas comuns ao grupo o que dificultaria a diferenciação no
simples diagnóstico sorológico. Alguns autores ainda referem-se a ocorrências
de infecções mistas em áreas onde esses protozoários coexistem (CHILLER et
al., 1990; MALCHIODI et al., 1994).
Dos 30 pacientes com paracoccidioidomicose, 70,0% apresentaram
soro reatividade para o antígeno de L. amazonensis contra 43,0% para o
antígeno de L. braziliensis. Na reação de IFI, somente um soro foi reagente
com título 1/40 com qualquer dos antígenos. Outros sete soros foram reativos a
1/20. De dez soros de pacientes com diagnóstico de certeza para Doença de
Chagas, apenas um não reagiu ao antígeno de L. amazonensis e dois não
reagiram a L. braziliensis para o ensaio imunoenzimático, sete soros foram
reagentes para Leishmania amazonensis e seis para Leishmania braziliensis.
De oito soros de pacientes com diagnóstico de Toxoplasmose da região de
Curitiba, zona indene para LTA, um soro foi reagente ao antígeno de L.
amazonensis e quatro soros foram reagentes ao antígeno de L. braziliensis,
39
Porém, os valores de absorbância para estes soros estavam muito próximos ao
valor do ponto de corte para o teste.
A técnica de Western blotting foi realizada com os mesmos
antígenos de extratos solúveis de Leishmania utilizados no ensaio
imunoenzimático. O princípio das duas técnicas é basicamente o mesmo,
entretanto, a vantagem do Western blotting está na capacidade de detectar
especificamente as proteínas mais antigênicas dos extratos solúveis quando
confrontados com soros de pacientes.
Na análise de Western blotting, foram utilizadas 60 amostras de
soros de pacientes portadores de LTA com diagnóstico parasitológico. Os
mesmos soros de pacientes foram também analisados por Imunofluorescência
Indireta e ensaio imunoenzimático.
Com antígeno de Leishmania braziliensis, das 20 proteínas de peso
molecular entre 16,6 e 218,8 Kda, as de maior prevalência foram as de alto
peso molecular (tabela 08), sobretudo as de 177,8 (96,6%) e 169,8 (95,0%).
Em seguida estão as proteínas de 112,0 Kda (38,0%), 120,0 e a de 61,6 Kda
(ambas com 30% de ocorrência) e a de 134,8 Kda (20,0%).
A maior prevalência das proteínas reveladas de alto peso molecular
poderia incluir reações inespecíficas. Reed et al., 1986 sugerem que as
glicoproteínas de alto peso molecular seriam encontradas, sobretudo no flagelo
de Leishmania sp.
Quando analisado o grupo de comunicantes, novamente as
proteínas 177,8 e 169,8 Kda foram prevalentes (08 e 07 soros
respectivamente), coincidindo com o que foi observado no grupo de portadores
de LTA. Este fato poderia indicar contato destas pessoas com o antígeno sem
desenvolver sintomatologia (portadores assintomáticos). Uma amostra de soro
do grupo assintomático cuja reação sorológica revelou 14 proteínas, entre 46,6
e 177,8 Kda, poderia estar num estágio que antecede o desenvolvimento da
doença, uma vez que foram reveladas proteínas que só apareceram no grupo
de portadores da doença. Este caso mereceria maior atenção, sendo
necessária análise de novas amostras em diferentes períodos.
40
Nenhuma das proteínas reconhecidas nos soros do grupo de área
indene, coincide com as proteínas reveladas nos outros dois grupos acima.
Quatro proteínas de alto peso molecular foram reveladas (194,9 a 162,2 Kda).
A proteína de 173,8 Kda foi reagente para seis soros e a mesma proteína
aparece como reativa nos três grupos (doentes, comunicantes e sadios) para o
antígeno de L. amazonensis.
A análise de Western blotting com antígeno de L. braziliensis em
amostras de soros de pacientes portadores de outras etiologias revelou
proteínas com peso molecular entre 58,9 e 151,0 Kda. Proteínas de alto peso
molecular foram reconhecidas por pacientes com Doença de Chagas: 93,3;
135,0; 141,0; 148,0 e 151,0 Kda. As proteínas de 135,0 e 148,0 Kda são
reconhecidas no soro de pacientes com LTA. Proteínas de 58,9; 63,0; 70,8 e
81,3 Kda foram reconhecidas por soros de pacientes com
paracoccidioidomicose e somente a de 70,8 Kda foi reconhecida também por
soros de pacientes portadores de leishmaniose. Proteínas 70-72 Kda têm sido
identificadas como membros das famílias de proteínas de regiões de DNA
altamente conservadas, sendo reconhecidas também por soros de pacientes
com leishmaniose visceral além de outras doenças como tuberculose,
toxoplasmose e hidatidose (AISA et al., 1998). Em outros trabalhos, esta
proteína foi reportada como um grande componente antigênico de superfície
(LEGRAND et al., 1987; KUTNER et al., 1988; CUBA-CUBA et al., 2001).
Kutner et al., 1991 e Legrand et al., 1987, consideram esta proteína como
antigenicamente específica de L. braziliensis, embora essa especificidade não
tenha sido observada no presente estudo. Nenhuma banda protéica foi
revelada por soros de pacientes com Toxoplasmose.
A análise de Western blotting para o antígeno de Leishmania
amazonensis, revelou 26 proteínas de peso molecular entre 23,9 e 173,7 Kda.
Os dois grupos de proteínas prevalentes: 74,1-83,1 Kda e 29,5-33,9 Kda que
aparecem homogeneamente nos pacientes portadores de leishmaniose
tegumentar americana, foram reveladas também no soro de pessoas
assintomáticas. Essas proteínas não seriam exatamente indicativas de doença,
mas sim de contato prévio dessas pessoas com os antígenos. Entretanto, no
grupo de pessoas de região indene para Leishmaniose, dezoito proteínas
41
foram reveladas de igual peso molecular que as detectadas no grupo de
pessoas com LTA. As proteínas de 29,5; 30,9; 33,1; 33,9; 74,1 e 75,8 Kda
mostraram alta prevalência nos três grupos: doentes, comunicantes e sadios.
Os soros de pacientes portadores de outras etiologias revelaram
dezoito proteínas entre 19,0 e 170,0 Kda das quais, mostraram-se reativas com
soro de pacientes portadores de leishmaniose, as de 63,0; 100,0; 123,0 e 138,0
Kda. Altas taxas de reação cruzada foram detectadas entre o antígeno de
Leishmania amazonensis e soros de pacientes com Doença de Chagas. A
glicoproteína de 63,0 Kda, considerada uma importante proteína de superfície e
comum a todas as espécies de Leishmania em ambas as formas, amastigota e
promastigota, (HANDMANN e GODING, 1985; RUSSEL e WILHELM, 1986;
FROMMEL et al. 1990) apesar de ser considerada específica para a espécie,
reagiu também contra soros de pacientes com Paracoccidioidomicose.
Dos grupos clínicos analisados por Western blotting, as proteínas
de: 218,8; 61,6; 56; 53,7 e 17,7 Kda mostraram especificidade para o antígeno
de Leishmania braziliensis. As proteínas de 89,1; 69,1; 46,7; 40,7 e 23,9 Kda
mostraram-se específicas para o antígeno de Leishmania amazonensis. Essas
proteínas específicas poderiam ser isoladas e analisadas contra anti-soro
específico para avaliação da sua reatividade.
Seis soros de pacientes cujo diagnóstico para LTA não se confirmou
por exame parasitológico, mas foram reagentes para IFI e/ou ensaio
imunoenzimático nos antígenos de L. braziliensis e L. amazonensis, foram
submetidos à análise por Western blotting (dados não mostrados). Para o
antígeno de L. braziliensis, as seis amostras reagiram contra as proteínas de
177,8 e 169,8 Kda, quatro reagiram também para a proteína de 112,0 Kda e
duas para a proteína de 61,6 Kda. Duas amostras não foram reagentes para o
ensaio imunoenzimático e Western blotting para o antígeno de L. amazonensis.
As demais reagiram combinando algumas das proteínas prevalentes para este
antígeno: 141,2 (02); 138,0 (02); 114,8 (02); 112,2 (02); 109,6 (02); 104,7 (02);
89,1 (01); 83,3 (03); 79,4 Kda (03). As proteínas de 75,8; 74,1; 33,9; 33,1; 30,9
e 29,5 Kda combinadas apareceram nas quatro amostras reagentes e duas
ainda apresentaram reação contra a proteína de 23,9 Kda. As proteínas
reveladas no antígeno de L. braziliensis são as mesmas que foram reveladas
42
com maior freqüência no grupo de portadores de LTA e aquelas reveladas no
soro de portadores assintomáticos (comunicantes) (Tabela 08). Algumas
proteínas reveladas no soro de pessoas sem leishmaniose vivendo em regiões
de transmissão, sugerem que algumas proteínas de maior peso molecular
possam estar relacionadas ao prévio contato com o parasito (MARY et al.,
1992).
Finalmente, a análise comparativa das metodologias adotadas no
presente estudo, nos mostra o que muitos pesquisadores vêm reforçando há
vários anos em termos de diagnóstico da Leishmaniose tegumentar americana:
a importância do diagnóstico diferencial; a adoção do diagnóstico parasitológico
como padrão ouro (quando possível); a associação de metodologias e a busca
por métodos mais sensíveis, específicos e, sobretudo factíveis a Rede de
Saúde Pública.
43
5. CONCLUSÃO
A análise comparativa dos métodos diagnósticos usados no
presente estudo nos permitiu concluir que:
1. As técnicas parasitológicas de diagnóstico (esfregaço/in print e
isolamento por cultivo) mostraram-se igualmente sensíveis (70,1%) e
quando associadas, há um aumento de sensibilidade (79,3%).
2. Na produção de antígenos (figurado e solúvel) para diagnóstico
da Leishmaniose, a escolha da espécie, o tempo de cultivo, o meio de
cultivo, a taxa de inoculo, pode garantir a reprodutibilidade dos testes e
qualidade nos resultados.
3. No diagnóstico sorológico da Leishmaniose, o antígeno homólogo
proporciona maior reatividade que o antígeno heterólogo, pois este
apresentou altas taxas de reações cruzadas com as outras patologias.
4. O método de Imunofluorescência Indireta apresentou
sensibilidade 91,6% com antígeno de Leishmania braziliensis e 75,0%
contra o antígeno de Leshmania amazonensis. A especificidade foi de
(100,0%) para os dois antígenos;
5. No ensaio imunoenzimático, o antígeno de L. braziliensis mostrou-
se mais sensível com 95,0% de reatividade nos soros de pacientes com
diagnóstico confirmado parasitologicamente, contra 71,7% para o
antígeno de L. amazonensis. A especificidade na técnica para os
antígenos foi de 92,3% contra 84,6% respectivamente.
6. A análise de Western blotting, conferiu 100,0% de sensibilidade
(Grupo II) e mostrou-se útil na determinação de portadores
assintomáticos bem como para estabelecer diagnóstico diferencial entre
a LTA e outras doenças freqüentemente reportadas como responsáveis
por reações cruzadas.
7. Das proteínas de Leishmania braziliensis que foram reconhecidas
pelos grupos clínicos analisados, cinco foram reconhecidas
exclusivamente por pacientes com LTA: 218,8; 61,6; 56; 53,7 e 17,4 Kda
(freqüência de 8,3; 30,0; 1,7; 3,3 e 10,0% respectivamente). A proteína
de 61,6 Kda foi reconhecida também por dois soros de pacientes que
44
não tiveram o diagnóstico para leishmaniose, comprovado por exame
parasitológico, mas que foram reativos nas outras técnicas sorológicas.
8. As proteínas de L. amazonensis exclusivamente reconhecidas na
análise sorológica de pacientes portadores de leishmaniose: 89,1; 69,1;
46,7; 40,7 e 23,9 Kda com prevalência de 25,0; 10,0; 40,0; 6,6 e 6,6%
respectivamente, duas foram reconhecidas por pacientes com clínica
mas sem a comprovação da doença por exame parasitológico: 89,1 Kda
(um paciente) e 23,9 Kda (quatro pacientes).
9. Os dados obtidos ressaltam a importância de conhecer o agente
etiológico causador da doença, pois de posse do conhecimento da
espécie circulante é possível fazer uso de antígeno homólogo
aumentando a sensibilidade do diagnóstico da Leishmaniose tegumentar
americana.
10. Poder-se-ia propor para a Secretaria da Saúde do Paraná, a
produção e validação de métodos diagnósticos visando melhorar os
resultados finais, com aumento de sensibilidade e especificidade das
técnicas.
11. Como perspectivas futuras, a implantação do ensaio
imunoenzimático como um segundo método para o diagnóstico da LTA
nos laboratórios da Rede Pública de Saúde, associado ao método de
Imunofluorescência indireta e ainda, avançar nas pesquisas com
proteínas específicas para o diagnóstico (intradermorreação ou ensaio
imunoenzimático com antígeno homólogo), visando proporcionar
agilidade nos resultados dos testes e segurança no diagnóstico.
45
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53
ANEXO 1
PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO:
a) Meio NNN (Novy-McNeal-Nicolle):
Bacto agar 6,25 g
NaCl 3,75 g
Água destilada 1000mL
Sangue de coelho 10 %
Preparo: Diluir o sal e o agar em água destilada e aquecer em banho-
maria, manter em ebulição durante cinco minutos, sob agitação. Distribuir em
frascos erlenmeyer, fechados e autoclavar por 15 minutos a 121 ºC. Em cabine
de fluxo laminar adicionar o sangue de coelho (10%) ao meio resfriado a 50ºC,
homogeneizar. Deixar solidificar em temperatura ambiente por duas horas.
O sangue de coelho é obtido por punção cardíaca e colocado em frasco
erlenmeyer cotendo citrato de sódio a 10% (como conservante e
anticoagulante).
b) Meio CCS (Coração-Cérebro-Sangue):
Brain Heart Infusion Agar 52 g
Água destilada 1000mL
Sangue de coelho 10%
Preparo: Em um recipiente de vidro o meio seco é diluído em água
destilada e levado ao fogo em banho-maria. Os passos seguintes são idênticos
aos descritos no preparo do meio NNN.
54
c) Solução tampão fosfato (PBS-Phosphate Buffered Solution)
NaCl 8,77g
Na
2
H PO
4
. 2H
2
O 1,92g
Na H
2
PO
4
0,39g
Água destilada 1000mL.
Preparo: Hidratar os sais e homogeneizar a solução em agitador
magnético até a sua completa dissolução. Ajustar o pH para 7,2 e esterilizar
por filtração.
55
ANEXO 2
PROTOCOLO DE PRODUÇÃO DE ANTÍGENO PARA
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
O preparo dos antígenos seguiu os protocolos conforme Castro 2001,
com adaptações.
Formas promastigota de L. braziliensis foram cultivadas a 24ºC por cinco dias
em meio nutritivo CCS.
a) Recolher a fase líquida do cultivo e filtrar em gaze estéril lavando com
solução salina fisiológica a 0,85%, para eliminar restos de meio. Centrifugar
por 20 minutos em centrífuga refrigerada a 4°C e 300 g.
b) Desprezar o sobrenadante e lavar com solução salina (sucessivamente
0,3% e 0,85%) e centrifugações com rotações crescentes (350 e 530 g.) até
a lise das hemáceas e remoção da hemoglobina de coelho.
c) Lavar duas vezes com Solução PBS pH 7,2 e centrifugar a 750 g em
centrífuga refrigerada por 20 minutos.
d) Acrescentar ao sedimento, 10 mL de PBS pH 7,2.
Para inativação dos protozoários e como forma de conservação, a
ressuspensão foi mergulhada em banho-maria a 55°C por oito minutos.
Adaptação baseada em Pessoa, 1988.
e) Contagem de promastigotas:
- De uma alíquota do concentrado, foi preparada uma diluição 1/10 com
solução PBS pH 7,2. Em lâmina reticulada especial para contagem de
partículas (Câmara de Thoma), depositou-se 10 µL da diluição entre lâmina e
lamínula e então contada em microscópio ótico com aumento de 400 vezes.
- Para a obtenção do número de parasitas por mililitro de antígeno, foram
contadas as 16 fileiras maiores do retículo, calculada a média por fileira e esta
multiplicada pelas medidas da lâmina (250 X 103 mm) e pelo fator de diluição
(10). A diluição final foi ajustada de modo a obter-se um número ideal de
promastigotas, em torno de 3X10
6
/mL.
56
ANEXO 3
PROTOCOLO DE PREPARO DOS ANTÍGENOS DE Leishmania PARA
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
a) Cultivar as formas promastigota de Leishmania em garrafas de Roux
com meio CCS e solução salina fisiológica esterilizada por seis dias a 24°C.
b) Recolher o sobrenadante das garrafas e remover as formas
promastigotas, filtrando conteúdo líquido. A seguir, lavar com solução salina
fisiológica e centrifugar a 4˚C por 15 minutos a 750 g por duas vezes.
c) Armazenar o sedimento obtido de Leishmania em freezer a -20°C até o
preparo final do antígeno.
d) Obtido estoque satisfatório, descongelar as formas promastigota a 4°C.
e) Centrifugar a 750 g em centrífuga refrigerada por 15 minutos.
f) Ressuspender o sedimento com água destilada esterilizada num volume
igual à metade do volume desse sedimento.
g) Romper as células por congelamento súbito, imergindo os tubos em
nitrogênio líquido (por 5 minutos) e imediato descongelamento em estufa a
37°C. O Repetir o processo seis vezes.
h) Mantendo os antígenos conservados em banho de gelo aplicar a ação
de ultra-som 5.0 MHtz efetuando seis séries de 30 segundos com intervalos
de 1 minuto.
i) Centrifugar o produto resultante por 60 minutos em ultra centrífuga, a
4°C e 14.000 g.
j) Recuperar o sobrenadante, filtrar em sistema esterilizante (membrana
0,22µ) e após a dosagem de proteínas alicotar em volumes de 500µL.
k) Armazenar em temperatura de - 20°C.
57
ANEXO 4
DOSAGEM PROTÉICA PELO MÉTODO DE BRADFORD
Foi utilizado reagente de Bradford comercial, Bioagency.
Procedimento
1. A solução concentrada do reagente de Bradford foi diluída em água destilada
e filtrada em filtro tipo Whatmann n°1, conforme indicação do fabricante.
2. Preparadas seis diluições da solução padrão de Soroalbumina Bovina (BSA),
de concentração conhecida (1mg/mL).
3. Adição da água destilada em cada tubo e a seguir o padrão BSA e as
amostras
4. Homogeneizar em agitador tipo vortex
5. Adicionar o reagente diluído, homogeneizar em agitador tipo vortex.
6. Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente
7. Proceder à leitura em espectrofotômetro em 595 nm, imediatamente.
8. Anotar as absorbâncias em protocolo.
9. Obter a curva de concentração e calcular as concentrações dos antígenos
Quadro 1 - Dosagem protéica segundo o Método de Bradford
TUBOS Ag.(µl) PADRÃO(µg/m) H
2
O(µL) REAGENTE
ABSORBÂNCIA
1 branco - - 500 5mL 0.0
2 - 10 490 5mL 0,036
3 - 10 490 5mL 0,040
4 - 20 480 5mL 0,130
5 - 20 480 5mL 0,129
6 - 40 460 5mL 0,189
7 - 40 460 5mL 0,199
8 - 60 440 5mL 0,263
9 - 60 440 5mL 0,260
10 - 80 420 5mL 0,292
11 - 80 420 5mL 0,299
12 - 100 400 5mL 0,343
13 - 100 400 5mL 0,342
14 L.a. 40 - 460 5mL 0,112
15 L.a 40 - 460 5mL 0,120
16 L.a 40 - 460 5mL 0,132
17 L.b 40 - 460 5mL 0,080
18 L.b 40 - 460 5mL 0,071
19 L.b. 40 - 460 5mL 0,075
58
ANEXO 5
PROTOCOLO DO TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA
PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO DE
PACIENTES
Preparo das lâminas:
Sensibilizar a lâmina com antígeno (20µL/spot);
Deixar sedimentar por 15 min;
Armazenar a lâmina em estufa a 37
o
C por 1 a 2h;
Guardar as lâminas prontas em caixas de vidro apropriadas e envolvê-las em
papel de alumínio. Armazenar em freezer (-20
º
C) até sua utilização.
Procedimento:
a) Retirar as lâminas do freezer; e secar com auxílio de ventilador;
b) Diluir os soros em solução PBS pH 7,2;
c) Depositar 20µL de cada diluição dos soros, e dos controles, na lâmina;
d) Colocar a lâmina em câmara úmida e incubar a 37
o
C por 30 min;
e) Depositar as lâminas, em posição vertical, em banho de PBS por 10 min;
f) Enxaguar com água destilada;
g) Secar com auxílio de ventilador;
h) Diluir o conjugado em solução PBS pH 7,2;
i) Colocar 20µL do conjugado em cada “spot”;
j) Repetir os passos d, e, f, g;
k) Depositar solução de glicerina 10% entre as fileiras da lâmina;
l) Cobrir com lamínula;
Leitura em microscópio para imunofluorescência fotomicroscópio (lâmpada
HBO 200 e filtro BG 12) em aumento de 400x.
59
ANEXO 6
PREPARO DAS SOLUÇÕES PARA TÉCNICA DO ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO
Preparo dos reativos:
a) Coating Buffer (tampão carbonato 0,005M)
Solução A:
Na
2
CO
3
1,1 g
água deionizada 200 mL
Solução B:
Na HCO
3
4,2 g
água deionizada 1000 mL
Acertar pH para 9,6 adicionando a solução A em B
b) Solução de Lavagem
NaCl 9 g
Tween 20 0,5 mL
água destilada 1000 mL
c) Solução de Bloqueio da placa
Caseína 2% em PBS* (dissolver com aquecimento)
0,05% de Tween 20
d) PBS 0,05M com 0,15M de NaCl, pH 7,4*
Solução A:
Na
2
HPO
4
.H
2
0 7,1 g
NaCl 8,8 g
água destilada 1000 mL
Solução B:
NaH
2
PO
4
1,4 g
NaCl 1,88 g
água destilada 200 mL
60
Acertar o pH para 7,4 adicionando a solução B em A.
e)Tampão de incubação (à partir da solução de Bloqueio)
solução de bloqueio 62,5 mL
Tween 20 0,25 mL
PBS pH 7,4 500 mL
Alicotar em volumes de 10 mL e congelar.
f) Tampão citrato pH 5,0
Na
2
HPO
4
(
ou 13,4g Na
2
HPO
4
.7H
2
O
) 7,10 g
ácido cítrico 5,19 g
água destilada 1000 mL
h) Solução de ácido sulfúrico a 2%
H
2
SO
4
19 mL
água destilada 41 mL
61
ANEXO 7
PROTOCOLO DO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA PESQUISA DE
ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENO DE Leishmania NO SORO DE
PACIENTES
Procedimento:
a) Sensibilização da placa:
Aplicar 100 µL do antígeno/pocinho na diluição padronizada;
Incubar em estufa a 37°C por uma hora. (Este procedimento é uma
adaptação do protocolo adotado por constatarmos uma melhora significativa na
sensibilização da placa).
Em seguida, incubação por 12 horas em geladeira.
b) Bloqueio:
Lavar a placa duas vezes com solução de lavagem para remoção do
antígeno não fixado.
Aplicar a solução de bloqueio em toda a placa
Incubar por uma hora a 37°C;
Lavar duas vezes com a solução de lavagem para retirada da proteína
que não fixou.
c) Adição dos soros:
As amostras de soros são descongeladas e diluídas em solução tampão
de incubação à temperatura ambiente;
Adicionar à placa 100µL, conforme padronização;
Incubar em estufa a 37°C por uma hora.
Retirada da estufa, lavar a placa seis vezes em solução de lavagem.
d) Adição do Conjugado:
Diluir o conjugado em solução tampão de incubação em temperatura
ambiente.
Adicionar em toda a placa (exceto a coluna controle),
62
Levar à estufa a 37°C por uma hora.
Em seguida, lavar seis vezes com a solução de lavagem para remoção
das partículas não ligadas.
e) Substrato:
As pastilhas de OPD são diluídas em tampão citrato, no momento do
uso e ao abrigo da luz.
Em seguida adiciona-se 4µL de peróxido de hidrogênio a 30%.
O substrato é aplicado na placa toda;
Incubar em estufa a 25°C, ao abrigo da luz por 25 minutos.
f) Interrupção da reação:
Adicionar cuidadosamente 50 µL/pocinho de uma solução de ácido
sulfúrico a 2%, em toda a placa.
h) Leitura
A placa é imediatamente levada ao Leitor de ELISA, onde é feita a
leitura do espectro de cor, com ajuste para comprimento de onda de 492 mm.
Os resultados são anotados em protocolo para posterior análise.
63
ANEXO 8
PREPARO DE REAGENTES UTILIZADOS NA ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRIOLAMIDA-SDS
Preparo dos reagentes:
a) Tampão de corrida pH 8,3:
Tris 3,0g
Glicina 14,4g
SDS 1,0g
Completar o volume para 1000 mL. Ajustar o pH da solução com ácido
clorídrico. Armazenar a 4°C.
b) Tampão de amostra com Mercaptoetanol:
solução Tris pH 6,8 2,5 mL
solução SDS 10% 5,0 mL
Glicerol 2,0 mL
EDTA 0,1M 0,1 mL
Azul de Bromofenol 0,2 mg
Completar o volume para 20 mL com água destilada. No momento do uso,
adicionar 5µL de Mercaptoetanol em cada 195µL do tampão de amostra.
c) Solução corante:
0,25% (m/v) de Coomasie Brilliant Blue R 250
Metanol 50 mL
ácido acético 10 mL
Completar o volume para 100mL com água destilada. Armazenar protegido da
luz.
d) Solução descorante/conservante:
40 % metanol
10 % ácido acético
50% água destilada
64
Soluções para o preparo do gel:
e) Solução A (usar luvas e máscara para o preparo desta solução):
Acrilamida 30,0g
Bisacrilamida 0,8 g
Completar o volume para 100mL de água destilada. Filtrar e guardar em
frasco escuro a 4°C.
f) Solução B (Tampão do gel de corrida):
Tris 18,15g
Ajustar o pH para 8,8 com HCl a 50% e completar o volume para 100 mL
com água destilada. A solução pode ser armazenada por até duas semanas a
4°C.
g) Solução C (SDS 10%):
SDS 5,0 g
Completar o volume para 100 ml de água destilada. Armazenar em
temperatura ambiente. Pode precipitar em baixas temperaturas. Neste caso,
aquecer a 25°C.
h) Solução D (Tampão do gel de Empilhamento – Spacer)
Tris 3,0 g
Completar o volume com água destilada para 50 ml e ajustar o pH para
6,8 com HCl. A solução pode ser armazenada por até duas semanas a 4°C.
i) Persulfato de amônia a 10%
Persulfato de amônio 0,5g
Completar o volume para cinco ml de água destilada. Deve ser
preparado no dia do uso ou alicotado e conservado a -20°C.
65
ANEXO 9
PROTOCOLO DE ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA-SDS
Procedimento para a montagem do sistema:
a) Montagem das placas/molde
Limpar cuidadosamente as placas de vidro em solução álcool-éter (v/v) e
secá-las bem.
Montar as placas numa superfície limpa e seca. Colocar o vidro maior
numa superfície imóvel, distribuir os espaçadores de um mm de espessura ao
longo das extremidades da placa;
Colocar sobre estes, a placa menor;
Prender as placas com presilhas antes da vedação com fita de silicone;
Posicionar verticalmente o sistema de placas e nivelar o suporte.
b) Preparo do gel:
• Gel de separação a 15% (o gel deve ser preparado na ordem
apresentada):
Água destilada 4,6 mL.
Solução A 10,0 mL.
Solução B 5,0 mL.
Solução C 0,2 mL.
Persulfato de amônio 10% 0,2 mL.
TEMED 0,016 mL.
o Aplicar o gel com auxílio de micropipeta (7,2 mL), no vão entre as duas
placas de vidro.
o Sobre o gel devem ser adicionados rapidamente 400 µL de álcool
amílico.
o Aguardar a polimerização em temperatura ambiente.
66
o Após polimerização, retirar o álcool amílico lavando a superfície com
água destilada e retirando o líquido com papel de filtro.
Gel de empilhamento a 5%:
Água destilada 4,1 mL.
Solução A 1,0 mL.
Solução D 0,75 mL.
Solução C 0,06 mL.
Persulfato de amônio 10% 0,06 mL.
TEMED 0,012 mL.
o Aplicar 1,4 mL de gel de empilhamento, colocando em seguida o pente
de Teflon para deposição das amostras, no gel ainda líquido.
o Após polimerização o molde deve ser cuidadosamente removido.
o Preencher a cuba com tampão de corrida.
c) Preparo das amostras:
Diluir as soluções de antígeno em um mesmo volume de tampão de
amostra. A mistura é desnaturada por calor a 100°C na presença de excesso
de SDS e 2-mercaptoetanol (para clivagem das ligações dissulfeto).
Colocar em microtubos vedados com parafilme e ferver durante três
minutos.
d) Preparo dos padrões:
As proteínas marcadoras (padrões) são desnaturadas e dissociadas de
modo idêntico às amostras.
Ferver durante 60 segundos, conforme orientação do laboratório
fabricante.
O padrão pode ser armazenado em freezer e não é necessário ser
novamente fervido quando da reutilização (a não ser que deva ser diluído
novamente).
e) Aplicação das amostras e padrões:
67
Retirar o pente de Teflon do gel polimerizado, lavar os poços com
tampão de corrida no topo do gel usando micropipeta. Retirar o excesso.
Encher os poços do gel com o tampão de corrida usando micropipeta e
aplicar cuidadosamente no fundo de cada cavidade, uma amostra. Em uma das
cavidades deve ser aplicado o padrão. A capacidade máxima de cada poço é
de 80µl, se for usado pente de 10 mm de profundidade, oito mm de largura e
um mm de espessura. O volume máximo é calculado através da profundidade
do poço X largura do pente X espessura do gel.
f) Migração:
As cubas do tanque do sistema devem estar preenchidas com tampão
de corrida até que os eletrodos estejam totalmente cobertos.
Conectar os eletrodos na fonte e correr o gel a 30mA, até que o corante
indicador (azul de bromofenol) chegue ao fundo do gel.
g) Revelação:
Após a corrida, retirar os espaçadores, separar as placas de vidro,
remover o gel e mergulhá-lo por 30 minutos em solução corante (ou proceder à
transferência).
Retirar da solução corante e mergulhar em solução descorante. Trocar a
solução após 15 minutos e então deixar o gel nesta solução por mais 12 horas.
h) Montagem e conservação do gel:
O gel depois de corado pode ser armazenado em uma solução de
glicerol a 20% e selado em plástico transparente. Dessa forma o gel conserva-
se bem em geladeira por longo tempo.
68
ANEXO 10
PROTOCOLO PARA PROCEDIMENTO DE WESTERN BLOTTING, segundo
Towbin et al., 1979:
Preparo das soluções:
a) Tampão de transferência
TRIS 3,0 g.
Glicina 14,4 g.
Metanol 200 mL.
Completar com água destilada até o volume de 1000 mililitros.
Filtrar em papel de filtro e armazenar em geladeira.
b) Corante vermelho Ponceau’S
Ponceau’S 0,5 g.
Acido acético glacial 01 mL.
Completar com água destilada até o volume de 100 mililitros.
Filtrar em papel filtro e armazenar em temperatura ambiente.
c) Solução estoque para substrato
3-amino-9-ethilcarbazole 0,4 g.
Dimethylformamida 100 mL.
Armazenar em temperatura ambiente ao abrigo da luz.
d) Substrato
Acetato de sódio 0,1M, pH 5,2 10 mL.
Sol. estoque aminoethilcarbazole 0,67 mL.
Preparar no momento do uso. Filtrar em papel de filtro Whatman n. 1 e
adicionar 10µl de peróxido de hidrogênio a 30%.
69
Procedimentos da técnica de Western blotting:
A técnica de Western blotting consiste na transferência eletroforética de
proteínas separadas por peso molecular em um gel de SDS-PAGE, para uma
membrana de nitrocelulose. O procedimento passa pelas seguintes etapas:
• eletroforese do antígeno em gel de poliacrilamida;
• transferência eletroforética das proteínas para membrana de
nitrocelulose;
• coloração das proteínas transferidas em corante Ponceau’s,
• corte da membrana em tiras (blots), segundo a orientação da
transferência.
As etapas subseqüentes assemelham-se a um teste ELISA indireto:
a) Lavagem das tiras em água destilada para remoção do corante, sob
lenta agitação por três minutos (agitador de Kline);
b) Bloqueio com uma solução PBS pH 7,4 com 3% de leite em pó bovino
desnatado (Molico®). Incubação por 60 minutos em agitador de Kline;
c) Lavagem três vezes sob lenta agitação por cinco minutos cada lavagem.
Duas vezes com PBS pH 7,4 e uma vez com a solução de bloqueio;
d) Incubação com os soros de pacientes (diluídos em solução de bloqueio).
Incubação “overnight”, sob lenta agitação em agitador tipo gangorra;
e) Lavagem seis vezes (cinco vezes com PBS e uma vez com solução de
bloqueio) por cinco minutos sob agitação lenta em agitador de Kline;
f) Incubação com o conjugado anti-IgG humano com peroxidase (Sigma
A-0170), diluído em solução de bloqueio. Incubação sob lenta agitação por
120 minutos em agitador tipo gangorra;
g) Lavagem por seis vezes durante cinco minutos sob agitação. Lavar
cinco vezes com PBS pH 7,4 uma vez com tampão de substrato e
cromógeno;
h) Adicionar substrato e cromógeno. Deixar agir até completa reação;
i) Interromper a reação lavando as tiras com solução PBS pH 7,4.
j) Deixar as tiras secarem em temperatura ambiente ao abrigo da luz.
70
ANEXO 11
TABELA 1 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO
DE PACIENTES COM DIAGNÓSTICO CLÍNICO E
PARASITOLÓGICO PARA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR.
Parasitológico IFI ELISA
título absorbância
Amostra
Procedência Esfregaço
Cultivo
L.a L.b L.a.
L.b.
LPM001
Inferninho pos pos NR 1/320
NR 0,280
LPM002
Inferninho pos pos NR 1/640
NR 0,650
LPM004
Jaciaba pos neg NR 1/80 0,057 0,229
LPM005
Jaciaba pos pos NR 1/40 0,216 0,517
LPM006
Jaciaba pos pos NR neg 0,122 0,502
LPM007
Jaciaba pos neg NR 1/160
0,349 0,869
LPM008
Jaciaba pos pos NR 1/160
0,081 0,715
LPM009
Jaciaba pos pos NR 1/40 0,075 0,282
LPM012
Postinho pos pos NR 1/160
0,369 0,884
LPM013
Postinho pos pos NR 1/160
0,405 0,558
LPM015
Postinho pos pos NR 1/40 0,231 0,369
LPM016
Postinho leved. NR NR 1/40 0,786 0,347
LPM017
Postinho pos pos NR 1/40 0,162 0,526
LPM018
Postinho pos pos NR 1/40 0,269 0,534
LPM019
Postinho pos pos NR 1/160
0,516 0,834
LPM020
Postinho pos pos NR 1/320
0,283 0,685
LPM021
Ligação pos pos NR 1/160
0,144 0,183
LPM022
Ligação pos pos NR 1/160
0,588 0,459
LPM023
Ligação pos pos NR 1/160
0,250 0,838
LPM024
Ligação pos pos NR 1/80 0,345 0,518
LPM025
Ligação pos pos NR 1/160
0,249 0,807
LPM026
Ligação pos pos 1/80
1/320
1,611 0,650
LPM027
Ligação pos pos NR 1/80 0,182 0,509
LPM028
Ligação pos pos 1/80
1/160
0,270 0,550
LPM029
Ligação pos pos NR 1/80 0,147 0,669
LPM030
Ligação pos pos NR 1/80 0,293 0,689
LPM031
Ligação pos pos NR 1/160
0,178 0,409
LPM032
Ligação pos pos NR 1/40 0,380 0,726
LPM034
Vitorino pos contam. NR 1/40 0,226 0,375
LPM038
São Francisco pos pos NR 1/40 0,046 0,188
LPM039
S.Francisquinho
pos pos NR 1/80 0,216 0,363
LPM040
Jaciaba neg neg NR 1/40 0,032 0,007
LPM041
Jaciaba pos pos NR 1/80 0,262 0,370
LPM043
Vitorino pos pos NR 1/80 0,522 0,645
LPM044
Jaciaba pos contam. NR neg 0,018 0,020
LPM047
Vitorino pos pos NR 1/80 0,840 0,039
LPM048
Macacos pos pos NR 1/80 0,804 0,045
LPM049
Ivaí Boa Vista pos pos NR 1/80 1,289 0,077
LPM050
Cachoeirinha pos pos 1/80
1/40 0,468 0,998
LPM051
Cachoeirinha pos pos 1/40
1/40 0,432 1,000
71
TABELA 1 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO
DE PACIENTES COM DIAGNÓSTICO CLÍNICO E
PARASITOLÓGICO PARA LEISHMANIOSE CUTÂNEA
(continuação).
Parasitológico IFI
ELISA
título absorbância
Amostra
Procedência Esfregaço
Cultivo
L.a L.b. L.a. L.b.
LPM052
Jaciaba pos contam
1/40 1/40 0,640
0,834
LPM053
Jaciaba pos pos 1/80 1/40 0,101
0,354
LPM054
Macacos pos pos 1/80 1/40 0,913
0,954
LPM055
Macacos pos pos 1/80 1/40 0,624
1,439
LPM057
Macacos pos neg neg 1/40 0,351
0,978
LPM058
Moreiras pos pos 1/40 1/80 1,058
1,280
LPM061
Jaciaba pos pos NR 1/40 0,343
0,697
LPM062
Jaciaba pos pos NR 1/40 0,511
0,952
LPM063
Jaciaba pos pos NR 1/40 0,373
0,892
LPM064
Ligação neg neg neg neg 0,172
0,161
LPM065
Ligação pos neg 1/40 1/40 0,553
1,040
LPM066
Ligação neg neg NR neg 0,204
0,237
LPM067
Ligação neg pos NR neg 0,595
1,230
LPM068
Macacos pos pos 1/40 1/40 0,788
1,025
LPM069
Rio Preto neg neg NR neg 0,219
0,137
LPM070
Ligação neg neg NR neg 0,317
0,047
LPM071
Jaciaba neg neg NR neg 0,216
0,043
LPM072
Jaciaba neg neg NR neg 0,234
0,139
LPM073
Jaciaba neg neg NR neg 0,268
0,859
LPM074
Jaciaba pos pos neg neg 0,367
0,647
LPM077
Ligação pos pos 1/80 1/80 0,297
0,842
LPM078
Ligação pos pos neg 1/80 0,069
0,150
LPM079
Ligação pos pos 1/80 1/80 0,485
1,850
LPM080
Ligação pos pos 1/40 1/80 0,078
0,611
LPM081
Turvo neg neg neg 1/80 0,066
0,117
LPM082
Prudentópolis
neg neg 1/40 1/40 0,479
1,463
LPM083
Prudentópolis
pos pos 1/80 1/80 0,667
1,953
LPM084
Hospital de
Clínicas pos pos NR NR NR NR
LPM085
Pinhalão pos neg 1/40 1/40 0,160
0,865
LPM086
Castro neg pos neg neg 0,146
0,320
LPM087
Castro neg pos neg neg 0,099
0,193
LPM088
Hospital de
Clínicas neg pos 1/40 1/80 0,095
0,468
LPM089
Erval Grande
neg pos 1/40 1/80 1,489
0,628
LPM090
Ligação neg neg 1/40 1/80 0,381
0,543
72
TABELA 1 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO
DE PACIENTES COM DIAGNÓSTICO CLÍNICO E
PARASITOLÓGICO PARA LEISHMANIOSE CUTÂNEA
(continuação).
Parasitológico IFI
ELISA
título
absorbância
Amostra
Procedência Esfregaço
Cultivo
L. a
L. b L.a. L.b.
LPM091
Postinho neg neg 1/40
1/40 0,850
0,500
LPM092
Ivai Boa Vista neg neg 1/40
1/40 1,039
0,531
LPM093
Linha S.Franco. neg neg 1/40
1/40 1,459
0,792
LPM094
Linha S.Franco. neg pos 1/80
1/80 0,598
0,334
LPM095
Ibaiti neg pos neg
1/80 0,381
0,500
LPM096
Cachoeirinha neg pos neg
1/80 0,359
0,357
LPM097
Prudentópolis neg neg neg
neg 0,152
0,078
LPM098
Prudentópolis neg neg neg
neg 0,174
0,080
LPM113
Hospital de
Clínicas neg neg 1/40
1/40 0,650
1,146
LPM114
Hospital de
Clínicas pos pos 1/80
1/40 0,550
1,141
TOTAL= 84
NR: não realizado; pos: positivo; neg: negativo.
73
ANEXO 12
TABELA 2 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania sp NO
SORO DE PACIENTES COM CICATRIZAÇÃO COMPATÍVEL
COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA SEM DIAGNÓSTICO
PARASITOLÓGICO.
IFI ELISA
título absorbância
Amostra
Procedência Diagnóstico
L.a L. b L.a L.b
LPM010
Postinho sorol.
NR 1/20 0,257 0,410
LPM011
Postinho sorol NR 1/20 0,197 0,400
LPM033
Ligação sorol. 1/40
1/40 0,046 0,053
LPM046
Jaciaba sorol. neg
neg 0,017 0,035
LPM056
Postinho sorol NR 1/20 0,393 0,675
LPM059
Cachoeirinha
sorol NR neg 0,446 0,734
LPM075
Ligação sorol. NR 1/80 0,786 1,498
LPM076
Ligação sorol. NR 1/40 0,311 0,181
TOTAL= 08
74
TABELA 3 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania sp NO
SORO DE INDIVÍDUOS SEM LEISHMANIOSE CUTÂNEA VIVENDO NAS
MESMAS CONDIÇÕES (E RESIDÊNCIA) DAQUELES PORTADORES DA
DOENÇA.
IFI
ELISA
título
absorbância
Amostra
Procedência Diagnóstico
L.a. L.b. L.a. L.b.
LPM100
Jaciaba sorol.famil. 1/40
neg 0,084 0,791
LPM101
Ligação sorol.famil. 1/40
1/80 0,296 0,218
LPM102
Ligação sorol.famil. neg neg 0,067 0,498
LPM103
Ligação sorol.famil. neg neg 0,040 0,340
LPM104
Jaciaba sorol.famil. neg neg 0,158 0,417
LPM105
Ligação sorol.famil. neg 1/40 0,155 0,093
LPM106
S.Francisquinho
sorol.famil. neg neg 0,082 0,390
LPM107
Jaciaba sorol.famil. neg neg 0,085 0,117
LPM108
Jaciaba sorol.famil. neg neg 0,067 0,058
LPM109
Ligação sorol.famil. neg neg 0,060 0,370
LPM110
Macacos sorol.famil. neg 1/40 0,486 0,671
LPM111
Ligação sorol.famil. neg
1/80 0,481 0,639
LPM112
Ligação sorol.famil. neg
neg
0,052 0,321
TOTAL = 13
75
ANEXO 13
TABELA 4 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO
DE PACIENTES COM OUTRAS ETIOLOGIAS
(Paracoccidioidomicose)
IFI ELISA
La Lb
La Lb
Amostra
Paciente
Idade
Procedência Sexo
Título Absorbância
PCM04 S.R.
40
Prudentópolis
M neg
neg 0,341
0,081
PCM05 J.P.
59
Almirante Tamandare
M 1/20
1/20
0,631
0,200
PCM06 A.G.C.
46
Gamironga
F Neg
Neg
0,181
0,075
PCM07 A.A.S.
44
Curitiba
M Neg
Neg
0,143
0,074
PCM08 M.S.
58
Mallet
M Neg
Neg
0,141
0,077
PCM09 A.J.C
61
Fazenda R.Grande
M Neg
Neg
0,207
0,092
PCM10 A.F.S.
53
CIC
M 1/20
Neg
0,791
0,121
PCM12 A.F.J.
41
Irati
M Neg
1/20
0,292
0,323
PCM13 A.M.R.
40
N/c
M Neg
Neg
0,233
0,081
PCM14 P.M.G.
55
Candido de Abreu
M Neg
Neg
0,260
0,082
PCM15 A.L.F.
49
São José dos Pinhais
M Neg
1/20
0,282
0,111
PCM16 L.C.A.
19
S. Ant. do Sudoeste
M Neg
Neg
0,122
0,080
PCM17 A.G.S.
45
Curitiba
M Neg
Neg
0,353
0,135
PCM18 H.R.E.
43
S. Ant. da Platina
F Neg
Neg
0,265
0,150
PCM19 B.P.
61
Mafra
M Neg
Neg
0,481
0,257
PCM20 J.W.
39
Paranavaí
F Neg
Neg
0,101
0,111
PCM21 A.V.
56
Curitiba
M 1/20
Neg
0,320
0,075
PCM24 J.R.
21
Marialva
F Neg
Neg
0,371
0,072
PCM25 M.A.
49
Agudos do Sul
M Neg
Neg
0,332
0,063
PCM27 T.R.
67
Santa Catarina
M 1/40
1/40
0,290
0,144
PCM28 J.L.
48
Piraquara
M 1/20
1/20
0,401
0,108
PCM30 A.D.V.
N/c
Adrianópolis
M Neg
Neg
0,264
0,069
PCM32 D.R.
N/c
Curitiba
M Neg
1/20
0,183
0,181
PCM34 A.G.S.
51
Irati
F Neg
Neg
0,103
0,072
PCM36 W.S.
37
Curitiba
M NR NR 0,441
0,101
PCM39 A.J.C.
61
Fazenda R. Grande
M NR NR 0,409
0,109
PCM40 J.T.
N/c
N/c
M NR NR 0,462
0,122
PCM42 A.A.P.
48
N/c
M NR NR 0,408
0,280
PCM43 M.A.P.
N/c
N/c
M NR NR 0,356
0,114
PCM44 R.R.S.
N/c
N/c
M NR NR 0,182
0,086
TOTAL = 30
N/c: Dado não conhecido
76
TABELA 5 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO
DE PACIENTES COM OUTRAS ETIOLOGIAS (Doença de Chagas)
IFI ELISA
La Lb La Lb
Amostra
Idade Sexo Título Absorbancia
07 42 M 1/80 1/80 1,160 0,631
12 56 M 1/80 1/20 0,312 0,421
15 48 F Neg Neg 0,181 0,500
17 44 M Neg Neg 0,051 0,112
10 52 M 1/40 1/80 0,830 1,275
14 60 M 1/40 1/40 0,721 0,632
16 53 M 1/80 1/40 1,154 0,973
18 43 F 1/40 1/40 0,582 0,933
19 40 M 1/20 Neg 0,333 0,301
20 55 F 1/40 1/40 0,691 0,480
TOTAL = 10
77
TABELA 6 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania NO SORO
DE PACIENTES COM OUTRAS ETIOLOGIAS (Toxoplasmose)
IFI ELISA
La Lb La Lb
Amostra
Idade Sexo Título Absorbância
5050 N/c F Neg Neg 0,121 0,049
5080 N/c F Neg Neg 0,033 0,012
5104 N/c F Neg Neg 0,047 0,064
652 N/c F Neg Neg 0,035 0,025
5036 N/c F Neg Neg 0,135 0,112
5064 N/c F 1’/20 1/40 0,771 0,175
5107 N/c F Neg Neg 0,126 0,110
653 N/c F Neg 1/20 0,083 0,145
TOTAL = 08
N/c: dado não conhecido
78
ANEXO 14
TABELA 7 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
braziliensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING EM
AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE
CUTÂNEA.
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania braziliensis (Kda)
218,8
199,5
177,8
169,8
158,5
154,9
148,0
135,0
125,9
120,0
112,0
104,7
95,5
85,0
70,8
61,6
56,0
53,7
17,4
16,6
AMOSTRA
LPM004
x x
LPM005
x x x x x
LPM006
x x x x x x x x x x x x x x
LPM007
x x x x x
LPM008
x x x x
LPM009
x x
LPM012
x x x x x x x
LPM013
x x x
LPM015
x x x x x
LPM017
x x x x
LPM018
x x x x
LPM019
x x x x x x
LPM020
x x x x
LPM021
x x x x x x
LPM022
x x x
LPM023
x x x x
LPM024
x x x x
LPM025
x x x x x
LPM026
x x x x x
LPM027
x x
LPM028
x x
LPM029
x x x x x
LPM030
x x x x x x
LPM031
x x x
LPM032
x x x x
LPM034
x x x x
LPM038
x x
LPM039
x
x x x
LPM041
x x
LPM043
x x x x x
LPM047
x x x x x
LPM048
x x
LPM049
x x x x x x x
LPM051
x x x x
LPM052
x
LPM053
x x
LPM054
x x x
79
TABELA 7 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
braziliensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING EM AMOSTRAS DE
SORO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA (continuação).
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania braziliensis (Kda)
218,8
199,5
177,8
169,8
158,5
154,9
148,0
135,0
125,9
120,0
112,0
104,7
95,5
85,0
70,8
61,6
56,0
53,7
17,4
16,6
AMOSTRA
LPM055
x x x x x
LPM057
x x x x
LPM058
x x x x
LPM061
x x
LPM062
x x
LPM065
x x x
LPM068
x x
LPM074
x x x x
LPM077
x x
LPM078
x x
LPM079
x x x x
LPM080
x x x x
LPM082
x x x x x x x x x
LPM083
x x x x x x x
LPM085
x x x x
LPM086
x x
LPM087
x x
LPM088
x x
LPM089
x x
LPM094
x x
LPM095
LPM096
x x x
LPM114
x x x x
TOTAL=60
5 2 58
57
6 2 2 12
1 18
23
8 1 1 1 18
1 2 6 9
80
ANEXO 15
TABELA 8 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
braziliensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING NO
SORO DE PESSOAS SEM LEISHMANIOSE CUTÂNEA
VIVENDO EM ÁREA DE TRANSMISSÃO DA DOENÇA
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania braziliensis (Kda)
AMOSTRA
199,5
177,8
169,8
158,5
154,9
148,0
135,0
125,9
120,0
112,0
104,7
95,5
61,6
48,9
46,6
16,6
LPM100
x x x x x x x x x x x x x x
LPM101
x x
LPM102
x x
LPM103
x
LPM104
LPM105
x
LPM106
x
LPM107
LPM108
LPM109
x x
LPM110
x x
LPM111
x x x
LPM112
x x x
TOTAL= 13 3 8 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
81
ANEXO 16
TABELA 9 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
braziliensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING NO
SORO DE PESSOAS SEM LEISHMANIOSE CUTÂNEA DE
ÁREA INDENE PARA A DOENÇA.
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania amazonensis
(Kda
)
AMOSTRA
194,9 184,5 173,8 162,2
LPMn01
LPMn02
x
LPMn03
LPMn04
x
LPMn05
x
LPMn06
x
LPMn07
x x
LPMn08
LPMn09
LPMn10
x
LPMn11
x x
LPMn12
TOTAL
= 13 1 2 5 1
82
ANEXO 17
TABELA 10 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
amazonensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING NO
SORO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTANEA
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania amazonensis (Kda)
173,7
154,9
151,3
144,5
141,2
138
123
114,8
112
109,6
104,7
100
89,1
83,1
79,4
75,8
74,1
69,1
63
46,7
40,7
33,9
33,1
30,9
29,5
23,9
AMOSTRA
LPM004
x x
LPM005
x x x x x x x x
LPM006
x x x x x x x x x
LPM007
x x x x x x x x x x x x x
LPM008
x x x x x x x
LPM009
x x x x x x
LPM012
x x x x x x x x x x x x x x x
LPM013
x x x x x x x x x x x x x x x
LPM015
x x x x x x x x x
LPM017
x x x x
LPM018
x x x x x x x x x x x x x x x
LPM019
x x x x x x x x x x x x x
LPM020
x x x x x x x x
LPM021
x x x
LPM022
x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM023
x x x x x x x x x x x x x x
LPM024
x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM025
x x x x x x x x x x x x x x
LPM026
x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM027
x x x x x x x x x x x x x x
LPM028
x x x x x x x x
LPM029
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM030
x x x x x x x x x x x x x x
LPM031
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM032
x x x x x x x x x x
LPM034
x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM038
x x x x x
LPM039
x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM041
x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM043
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM047
x x x x x x x x x x x x
LPM048
x x x x x x x x x x x x
LPM049
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
83
TABELA 10 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
amazonensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING NO
SORO DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTANEA
(continuação)
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania amazonensis (Kda)
AMOSTRA
173,7
154,9
151,3
144,5
141,2
138
123
114,8
112
109,6
104,7
100
89,1
83,1
79,4
75,8
74,1
69,1
63
46,7
40,7
33,9
33,1
30,9
29,5
23,9
LPM051
x x x x x x
LPM052
x x x x x x x x x x x x x x x
LPM053
x x x x x x x x x
LPM054
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM055
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM057
x x x x x x x
LPM058
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM061
x x x x x x x x x x x x
LPM062
x x x x x x x x
LPM065
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM068
x x x x x x x x x
LPM074
x x x x x x x x
LPM077
x x x x x x x x x
LPM078
LPM079
x x x x x x x x x x
LPM080
x x x x x x x x x
LPM082
x x x x x x x x x x
LPM083
x x x x x x x x x x
LPM085
x x x x x x x x x x x x x
LPM086
x x x x x x x x x x x x
LPM087
x x x x x x x x x x
LPM088
x x x x x x x x x x x x x x
LPM089
x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM094
x x x x x x x x
LPM095
x x x x x x x x x x
LPM096
x x x x x x x x x x x x x
LPM114
x x
TOTAL=60
32
13
31
28
30
29
12
15
28
30
14
8
15
50
50
49
49
6
3
24
4
48
48
48
48
3
84
ANEXO 18
TABELA 11 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
amazonensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING NO
SORO DE PESSOAS SEM LEISHMANIOSE CUTANEA EM
ÁREA DE TRANSMISSÃO PARA A DOENÇA.
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania amazonensis (Kda)
AMOSTRA
173,7
154,9
151,3
144,5
141,2
138
123
114,8
112
109,6
104,7
100
83,1
79,4
75,8
74,1
33,9
33,1
31
29,5
LPM100
x x x x x x x x x x x x x x x
LPM101
x x x x x x x x x x
LPM102
x
LPM103
x
LPM104
x x x x x x x x
LPM105
x x x x x x x x x x x
LPM106
x x x x x x x x
LPM107
x x x x
LPM108
x x x x
LPM109
x x x x x x
LPM110
x x x x x x x x x x x x x
LPM111
x x x x x x x x x x x x x x x x
LPM112
x x
TOTAL
13
2
1 2 3 3 1 3 2 6 6 1 1 10
10
10
10
7 7 7 7
85
ANEXO 19
TABELA 12 - PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA Leishmania
amazonensis PELA TÉCNICA DE WESTERN BLOTTING NO
SORO DE PESSOAS SEM LEISHMANIOSE CUTANEA DE
ÁREA INDENE PARA A DOENÇA
Peso molecular das proteínas do antígeno de Leishmania amazonensis (Kda
)
AMOSTRA
173,7
162,2
128,8
91,2
81,2
75,8
74,1
33,9
30,9
LPMn01
LPMn02
LPMn03 x x x x x x x
LPMn04 x
LPMn05 x x x
LPMn06 x
LPMn07
LPMn08 x x x x x
LPMn09 x x x x x x
LPMn10 x x x x
LPMn11 x x x x x
LPMn12 x x x
TOTAL
=
13
1 4 1 3 1 5 8 6 6
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