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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO ÁCIDO PERACÉTICO NA
ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS ODONTOLÓGICOS
RENAN ANTONIO CERETTA
CRICIÚMA (SC), FEVEREIRO DE 2008
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1
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO ÁCIDO PERACÉTICO NA
ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS ODONTOLÓGICOS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense,
para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientador: Elidio Angioletto
Co-orientador: Marcos M. da Silva Paula
CRICIÚMA (SC), FEVEREIRO DE 2008
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3
AGRADECIMENTOS
4
Ao professor dr. Elidio Angioletto que, com paciência, tolerância,
persistência e sabedoria, soube conduzir-me ao término do estudo. Muito obrigado
Professor Elídio.
Ao Professor dr. Marcos Marques Paula, cuja disponibilidade e disposição
incomparáveis, co-orientou este trabalho com muita competência e afinco.
Professor, você faz a diferença no ambiente acadêmico.
Ao Everton Angioletto, bolsista que auxiliou primorosamente no
desenvolvimento das pesquisas de laboratório, os meus agradecimentos especiais
pela compreensão de minhas ansiedades.
Ao colega MSc. Silvio Ávila Junior, que muito solidariamente desenvolveu
estudos valiosos auxiliando-me na finalização de minhas pesquisas.
Ao colega M.Sc. Claus Troger Pich pela disposição, companheirismo,
solidariedade e imensa disposição em colaborar. Obrigado pelas tuas intervenções
primorosas e ricas.
À Universidade do Extremo Sul Catarinense – instituição em que atuo
como docente, pelo seu crescimento e pelo investimento no conhecimento,
promovendo o Curso de Pós-Graduação – nível de mestrado, e aos professores
coordenadores e docentes do Curso de Mestrado.
À FGM – pelo interesse e pelas idéias que possibilitaram o
desenvolvimento deste estudo.
Às prefeituras municipais de Criciúma e de Içara, por acreditarem na
importância do aprimoramento profissional de seus trabalhadores e por cederem os
períodos necessários ao desenvolvimento dos estudos.
5
À Vitória Bisognin Ceretta, minha filha – pela compreensão diante das
ausências necessárias ao desenvolvimento dos estudos e por ser a força motivadora
de meus empreendimentos.
Aos meus pais Sílvio e Gema, por me apoiarem sempre em todos os
empreendimentos de minha vida.
À Luciane Bisognin Ceretta, minha esposa, por me estimular a cursar o
mestrado.
À Ana Paula Maciel, colega cirurgiã dentista e grande amiga, que tão
prestimosamente cedeu seu consultório para que as pesquisas fossem
desenvolvidas.
À Patrícia Duarte Simões Pires, colega cirurgiã dentista e grande amiga,
pelo auxílio com materiais, com estímulo e com o diálogo amigo.
6
“A razão cardeal de toda superioridade humana é, sem dúvida, a vontade. O
poder nasce do querer. Sempre que um homem aplica a veemência e a
perseverante energia de sua alma a um fim, ele vencerá os obstáculos e, se
não atinge o alvo, fará pelo menos coisas admiráveis.”
(JA)
7
RESUMO
Avaliou-se a eficiência do ácido peracético, nas concentrações de 800 ppm, 1500
ppm e 2500 ppm, na esterilização microbiológica de materiais odontológicos.
Determinou-se, para essas concentrações, se o ácido peracético causa corrosão na
instrumentação odontológica, se induz a mutagenicidade, avaliada através do teste
cometa e citotoxicidade celular. Verificou-se, ainda, a concentração inibitória mínima
(CIM), a concentração bactericida mínima (CBM) através da difusão em Ágar
utilizando o método dos poços. A taxa de corrosão, calculada a partir de ensaios
potenciodinâmicos, foi de 10
-6
cm/ano, indicando que o produto não danifica o
instrumental. Também se avaliou a capacidade de esterilização do ácido peracético
a 2500 ppm em materiais utilizados nos procedimentos clínicos, pelo período de
tempo de exposição de 20 minutos. Os materiais foram coletados em dois
consultórios odontológicos, sendo um público e outro privado. Os resultados deste
estudo demonstraram a eficiência do ácido peracético na esterilização de
equipamentos odontológicos, tornando-se mais uma alternativa para a prevenção
das infecções nos consultórios. O teste COMETA indicou atividade genotóxica, para
a concentração de 2500 ppm, inferior ao peróxido de hidrogênio. No entanto, o ácido
peracético tem um curto tempo de vida não permanecendo sobre o instrumental.
Apesar disso a atividade genotóxica indica a necessidade do usuário utilizar
equipamentos de proteção, como luvas e jaleco.
Palavras-chave: Ácido Peracético; Esterelização; Microorganismos; Odontologia;
Sanitizante; Contaminação.
8
ABSTRACT
The effectiveness of peracetic acid on the microbiological sterilization of dental
materials was evaluated at concentrations of 800ppm, 1500ppm, and 2500ppm. At
these concentrations, it was determined whether peracetic acid caused corrosion to
dental instruments and induced cellular mutagenicity and cytotoxicidity. The minimum
inhibitory concentration (MIC), the minimum bactericidal concentration (MBC) and
diffusion in Agar, using the well method, were also verified. The corrosion rate,
calculated from potentiodynamic assays was 10
-6
cm/year, indicating that the product
does not damage equipment. The sterilization capacity of peracetic acid at 2500ppm
for materials used in clinical procedures exposed for 20 minutes was also evaluated
using materials collected at two dental clinics, one public and the other private. The
results of this study demonstrated the effectiveness of peracetic acid for sterilizing
dental equipment, providing another alternative for the prevention of infections in
clinics. The COMET assay indicated genotoxic activity at 2500 ppm.
Key words: Peracetic Acid; Sterilization; Cytotoxicidity; Genotoxic activity; Chemical
agents.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Montagem do experimento do teste de corrosão......................................39
Figura 2 - Descrição simplificada do teste cometa. ..................................................42
Figura 3 - Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes
2 e 3; (c) dano classe 4.............................................................................................43
Figura 4 - Representação gráfica dos halos inibitórios no teste difusão em Agar. ...49
Figura 5 - Staphylococcus aureus concentração 800ppm........................................49
Figura 6 - Staphylococcus aureus concentração 2500ppm......................................50
Figura 7 - Observa-se a realização do teste da concentração inibitória mínima da
solução Peracet à 1500ppm para a bactéria Salmonella choleraesuis ....................51
Figura 8 - Perfis potenciodinâmicos de aço inox em ácido peracético. ...................56
Figura 9 - Média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A
comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH 7,0), sendo
*p<0,05 e **p<0,001...................................................................................................57
Figura 10 - Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A
comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH).....................59
Figura 11 - índice de dano ao DNA celular do Peracet nas concentrações de 800,
1500 e 2500ppm/mL em comparação aos controles negativos (água) e controle
positivo (próxido de hidrogênio).................................................................................60
Figura 12 - Representação gráfica do mínimo de células viáveis frente a diferentes
concentrações............................................................................................................62
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Proporção do pó gerador e neutralizador no preparo das soluções do
ácido peracético.........................................................................................................37
Tabela 2 - Quantidade do princípio ativo distribuído em cada tubo. .........................38
Tabela 3 -Teste de difusão em Agar.........................................................................47
Tabela 4 - Resultados referentes a Concentração Inibitória Mínima . ......................51
Tabela 5 - Concentração do princípio ativo após diluição seriada............................52
Tabela 6 - Resultados obtidos nos testes de concentração bactericida mínima.......53
Tabela 7 - Taxa de corrosão em cm.ano
-1
em eletrodos de aço inox nas
concentrações de Peracet de 800, 1500 e 2500 ppm/mL.........................................55
Tabela 8 - Absorbância do número de células viáveis após exposição ao ácido
peracético...................................................................................................................60
Tabela 9 - Contagem de colônias de MO antes e após esterilização em consultório
público. ......................................................................................................................64
Tabela 10 - Resultados das amostras recolhidas em BHI. .......................................66
Tabela 11 - Contagem das colônias de microrganismos antes e após a esterilização
no consultório particular. ...........................................................................................67
Tabela 12 - Resultados das amostras recolhidas em BHI. .......................................69
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA - Ácido Acético
ANVISA - Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC - American Type Culture Collection
CBM - Concentração Bactericida Mínima
CEO - Centro de Especialidades Odontológicas
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CRO - Conselho Regional de Odontologia
DMSO - dimetil sulfóxido
DNA - Ácido Desoxirribonucléico
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético
EPI - Equipamentos de Proteção Individual
HP - Peróxido de Hidrogênio
MO - Microrganismos
MTT - Sal de Tetrazolium
PAA - Peróxido de Ácido Acético
PBS - Cloreto de sódio / Cloreto de Potássio / Fosfato de Sódio Dibásico / Fosfato
de Sódio Monobásico
pH - Potencial Hidrogeniônico
PPM - Partes por Milhão
TBE - Tampão Tris / Borato / EDTA
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................13
2 OBJETIVOS............................................................................................................17
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................17
2.2 Objetivos Específicos...........................................................................................17
3 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................18
3.1. A importância da Esterilização e os Métodos Utilizados.....................................18
3.2 Ácido Peracético...................................................................................................27
3.2.1 Características Físico-Químicas........................................................................27
3.2.2 Atividade Antimicrobiana...................................................................................29
3.2.3 Modo de Ação...................................................................................................30
3.2.4 Subprodutos......................................................................................................30
4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................33
4.1 Etapa Laboratorial................................................................................................33
4.1.1 Microrganismos Utilizados.................................................................................33
4.1.2 Disponibilização do Biocida...............................................................................35
4.1.3 Teste de Difusão em Agar.................................................................................34
4.1.4 Meio de Crescimento e de Cultura....................................................................35
4.1.5 Inoculação dos Microorganismos......................................................................35
4.1.6 Preparação da Solução Teste...........................................................................35
4.1.7 Teste de Concentração Inibitória Mínima..........................................................36
4.1.8 Teste de Concentração Bactericida Mínima......................................................37
4.1.9 Estudo de Eletroquímica...................................................................................37
4.1.9.1 Condição Experimental..................................................................................37
13
4.1.10 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa.....................................................39
4.1.11 Estudos Citotóxidos do Ácido Peracético........................................................42
4.1.11.1 Citotoxicidade Mitocondrial (Ensaio com o Sal de Tetrazolium-MTT)..........42
4.2 Etapa Desenvolvida em Consultórios Odontológicos...........................................43
4.2.1 Unidade de Saúde 24h Próspera (Pública).......................................................44
4.2.2 Consultório Privado...........................................................................................45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................46
5.1 Teste de Difusão em Ágar....................................................................................46
5.2 Teste de Concentração Inibitória Mínima.............................................................49
5.3 Teste de Concentração Bactericida Mínima.........................................................51
5.4 Ensaios de Corrosão............................................................................................53
5.5 Teste de Genotoxicidade......................................................................................55
5.6 Freqüência de Dano ao DNA...............................................................................57
5.7 Estudo Citotóxico do Ácido Peracético.................................................................59
5.8 Etapa Realizada nos Consultórios Oodontológicos.............................................61
5.8.1 Testes de Esterilização Química com o Ácido Peracético na Concentração de
2500 ppm em Material Odontológico Contaminado...................................................61
6 CONCLUSÃO.........................................................................................................70
REFERÊNCIAS..........................................................................................................71
14
1 INTRODUÇÃO
A definição de saúde para a Organização Mundial de Saúde (OMS),
apresenta uma abrangência abstrata e muitas vezes inatingível, configurando-se
uma utopia uma vez que a condicionam os fatores sociais, culturais e psicológicos, e
não apenas a ausência de enfermidades. Tal conceito tem sido alvo de análises e
críticas por muitos estudiosos. No entanto, representa um avanço em relação a um
conceito anterior, que compreende a saúde, unicamente como a ausência de
doenças. Isso porque, o que pode ser definido como um bem estar para uns poderá
não ser para outros (Chaves, 1986). Dentre os fatores de bem estar ou de saúde
estão àqueles relacionados à odontologia e, portanto, à saúde bucal.
Concebemos que saúde e doença são determinadas por fatores sociais,
econômicos e culturais e, também, influenciadas por serviços odontológicos, ou
mesmo por medidas efetivas de controle e prevenção de doenças. Assim, é
fundamental a implementação de políticas, tanto em nível individual quanto
macroestruturais, e dentre elas estão àquelas relacionados ao controle de infecções,
tanto nos serviços odontológicos da rede pública, quanto nos consultórios e clínicas
particulares. Para Gonçalves, (2001), quatro normas são estabelecidas na rotina
diária dentro de um consultório odontológico: 1. anti-sepsia das mãos; 2. limpeza,
desinfecção e esterilização; 3. medidas de proteção do paciente e profissional.
4.manutenção e monitoramento.
Dentre as tantas causas de doenças, estão aquelas que podem ser de
natureza infecciosa (Hardie, 1996). A infecção é um fenômeno microbiano,
caracterizado por uma resposta inflamatória frente à presença de microorganismos
ou a invasão destes nos tecidos (Bone et al, 1992).
15
O objetivo prático da microbiologia é controlar os microrganismos, para
utilizar ou estimular aqueles com atividades úteis e inibir ou destruir os que são
nocivos.
Os microrganismos são capazes de sobreviver em ambientes diversos,
existindo, entretanto, limitações da capacidade de sobrevivência de determinados
microrganismos em um meio ambiente desfavorável, as quais foram aproveitadas
pelo homem como recurso para controle dos mesmos. O ambiente de trabalho
odontológico é um local de alto risco de contaminação devido ao tipo de trabalho
que é realizado e aos materiais utilizados nos diferentes procedimentos (Cellini et al,
2001).
As principais razões para se desenvolver o controle de microrganismos
nos consultórios odontológicos são:
a. Prevenir a transmissão de doenças e infecções;
b. Prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos;
c. Prevenir a deterioração e dano de materiais causados por
microrganismos.
A preocupação do homem em tornar os materiais isentos de
microrganismos data de muito tempo. Ainda anterior a esta preocupação, foi o fato
do homem reconhecer a importância de se proteger de fontes de infecção.
O Processo de esterilização compreende a eliminação de todos os
organismos viáveis, incluindo esporos. Este termo não pode ser usado com sentido
relativo: um objeto ou substância estão ou não esterilizados; jamais poderão estar
meio ou quase esterilizados. Entretanto, deve ser salientado que determinados
instrumentos não podem ser esterilizados utilizando calor, que é um dos métodos
mais indicados também em odontologia. Entre eles podemos citar as canetas de alta
16
rotação, cones de guta percha para obturação de canais radiculares, lençóis de
borracha para isolamento absoluto, posicionadores intra-orais para tomadas
radiográficas, dentre outros. Nesses casos, a esterilização química faz-se
necessária. Essa esterilização vem provocando muitas dúvidas nos profissionais,
pacientes e comunidade acadêmica, quanto à eficiência do processo, danos
corrosivos causados no equipamento, e possíveis efeitos colaterais causados pela
presença de resíduos nos equipamentos.
No atendimento ao paciente, geralmente é o cirurgião-dentista e seu
auxiliar que fazem todo o trabalho no consultório: atendem o paciente, limpam e
esterilizam os instrumentos, desinfetam os equipamentos e as dependências do
consultório, agendando consultas e outras atividades. É nesse ambiente que podem
originar-se cadeias e rotas de contaminação de doenças infecciosas.
Os profissionais da saúde estão expostos a uma grande variedade de
microrganismos presentes na saliva e no sangue. Nas clínicas e consultórios
odontológicos a maior concentração de microrganismos encontra-se na boca do
paciente. Diante dessa realidade, as questões relativas ao controle de infecções e
às normas de biossegurança passam a ter um novo enfoque. Procedimentos como
pegar materiais das gavetas, antes considerados inofensivos, devem ser revistos e
corrigidos (Russo e Russo, 2001).
As infecções que podem ocorrer no consultório são semelhantes às
infecções hospitalares, hoje tão estudadas, que representam sérios riscos aos
pacientes em tratamento. O cirurgião-dentista deve obrigatoriamente controlar as
infecções dentro do consultório odontológico com o maior rigor, para que não venha
descobrir, mais tarde, que foi negligente, colocando em risco sua vida, de seus
17
pacientes, de seus auxiliares e de seus próprios familiares. Isso porque muitas
doenças podem ser contraídas no consultório dentário.
Neste contexto, torna-se necessário à realização de novas pesquisas que
possam validar a utilização do ácido peracético como esterilizante/desinfetante
químico de instrumentos odontológicos, laboratoriais e médico-hospitalares.
Contudo, seu emprego como agente sanitizante exige que o mesmo seja
eficiente na esterilização, não provoque danos celulares residuais e não cause
corrosão nos diversos materiais metálicos com que possa entrar em contato. Assim,
avaliar a eficiência da esterilização química em equipamentos odontológicos
contaminados, através do àcido peracético se constitui no escopo principal do
presente trabalho.
18
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Realizar estudo experimental sobre a eficiência do ácido peracético, na
esterilização microbiológica de equipamentos odontológicos.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar em que concentração (800 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm) o ácido
peracético é eficiente na esterilização de materiais odontológicos
contaminados;
Verificar se as concentrações do ácido peracético utilizados (800 ppm,
1500 ppm e 2500 ppm) podem causar ataque corrosivo nos
equipamentos;
Verificar se o ácido peracético é citotóxico e se seus resíduos que
porventura permanecerem sobre os instrumentais odontológicos,
podem induzir a mutagenicidade celular.
19
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1. A Importância da Esterilização e os Métodos Utilizados
O controle das infecções nunca foi tão necessário quanto é hoje, não
somente nos ambientes hospitalares, mas também em outros ambientes
profissionais, como os consultórios odontológicos, clínicas médicas e veterinárias,
cabeleireiros, atelier de tatuagem, laboratórios de indústrias alimentícias e
farmacêuticas entre outros (Kuriki, 1997). O controle da infecção deve ser praticado
onde e sempre que existir um potencial para exposição a vírus, bactérias, fungos ou
outros microrganismos, não bastando somente utilizar o instrumental esterilizado,
mas a conscientização dos profissionais pelo uso de técnicas assépticas e
procedimentos que garantam tanto ao profissional, quanto ao paciente e ao
ambiente um tratamento sem risco de contaminação.
A preocupação do homem em tornar os materiais isentos de
microrganismos data de muito tempo. Ainda anterior a esta preocupação foi o fato
do homem reconhecer a importância de se proteger de fontes de infecção. Assim,
por exemplo, o exército de Alexandre o Grande, fervia a água para beber. Muitas
outras civilizações antigas preservavam os gêneros alimentícios com sal, pela
secagem e por aquecimento.
Lister, (1864 apud Kuriki, 1997), jovem cirurgião inglês, impressionado
com os trabalhos de Pasteur, desenvolveu métodos para impedir o acesso de
microrganismos aos ferimentos cirúrgicos, com a finalidade de evitar infecção
microbiana (sepsia) nos tecidos após cirurgia. Realizando a esterilização
escrupulosa dos instrumentos cirúrgicos, utilização de bandagens com anti-sépticos
20
(iodo) e conduzindo a cirurgia sob vaporização de desinfetante para impedir a
infecção pelo ar, conseguiu reduzir grandemente a sepsia cirúrgica.
Lister, (1864 apud Kuriki, 1997), há mais de 100 anos, recomendava aos
cirurgiões: “a contaminação deve obrigatoriamente ser vista com seus olhos mentais
de maneira distinta do que podem fazer seus olhos corporais”.
Para Cottone e colaboradores, (1991), o controle de infecção é uma
filosofia de trabalho e não uma receita ou fórmula a ser seguida, sendo inserida
dentro de um critério de racionalização onde é necessário verificar a eficácia dos
equipamentos utilizados na esterilização, os agentes químicos escolhidos, o controle
e eficácia da esterilização, a qualidade da água, o armazenamento do material
esterilizado, o uso de EPI, o destino do lixo contaminado e a constante capacitação
dos profissionais envolvidos no processo. A cada dia enfrenta-se uma realidade
diferente, e a mudanças freqüentes nos protocolos de atendimento, juntamente com
evolução dos produtos e equipamentos, obrigam os profissionais da área da saúde a
atualizarem-se e transformar suas práticas diárias, restabelecendo normas de
conduta e procedimentos que garantam um tratamento sem riscos de contaminação.
Para Vieira, (2005), a descontaminação é o resultado dos processos de
limpeza, desinfecção e esterilização usados em objetos, superfícies ou pacientes,
utilizando métodos físicos e químicos. Conceituando esterilização, esta é a
destruição ou remoção total de microorganismos e desinfecção é a destruição ou
remoção de microorganismos indesejáveis não incluindo necessariamente os
esporos. Desta forma, considerando as maneiras convencionais de assepsias
existentes nos consultórios e clínicas odontológicas, a esterilização por calor úmido
na autoclave e o calor seco em forno Pasteur (estufa) são as formas mais
difundidas. Uma alternativa para esterilização por calor é a utilização de agentes
21
químicos (Tortora, Funke e Case 2000).
A prática odontológica abrange uma variabilidade de procedimentos,
desde simples profilaxias até cirurgias mais complexas, nas quais há contato com
secreções da cavidade oral e com sangue; Somando-se a isso, equipamentos e
instrumentais contaminados (Konkewicz, 1999). Esses procedimentos geralmente
implicam em contato com secreções da cavidade oral, algumas vezes representados
simplesmente pelo contato com saliva, outras vezes pelo contato com sangue,
secreções orais, secreções respiratórias e aerossóis. Isso tudo acaba resultando em
risco de transmissão de infecções, tanto de paciente para paciente, como dos
profissionais para pacientes ou dos pacientes para os profissionais.
É de fundamental importância que os procedimentos estabelecidos pelas
normas de Biossegurança sejam rigorosamente seguidos e, que a limpeza e
sanitização, tanto do local quanto dos equipamentos e superfícies de trabalho,
devam atender às exigências legais (Veneranda, 2004).
O Ministério da Saúde, no Manual de Controle de Infecção Hospitalar
(Brasil, 1994), recomendou a classificação de Spaulding para objetos inanimados,
conforme o risco potencial de transmissão de infecção que apresentam. Esta
classificação tem sido utilizada rotineiramente também na Odontologia, já que no
consultório odontológico o contato entre o instrumental e o paciente é constante.
Na classificação de Spaulding, os materiais são considerados como
artigos críticos, semi-críticos e não-críticos. Artigos críticos são todos aqueles que
penetram nos tecidos subepiteliais, no sistema vascular e em outros órgãos isentos
de microbiota própria, bem como todos àqueles que estejam conectados com eles.
Instrumentos que tocam em pele e mucosa não íntegra também são
considerados críticos. Estes artigos devem estar obrigatoriamente esterilizados ao
22
serem utilizados. Artigos semi-críticos são todos aqueles que entram em contato
apenas com mucosa íntegra, capaz de impedir a invasão dos tecidos subepiteliais.
Estes artigos também devem estar esterilizados. Para artigos semi-críticos se aceita
desinfecção apenas para àqueles itens que não podem ser esterilizados por
procedimentos físicos. Artigos não-críticos são todos aqueles que entram em contato
com pele íntegra e ainda os que não entram em contato direto com o paciente. Estes
artigos devem sofrer procedimentos de desinfecção (Guimarães Jr., 2001).
Muitos microrganismos presentes na cavidade bucal podem sobreviver por
longos períodos de tempo fora da mesma, representando um risco de contaminação
tanto nos procedimentos realizados diretamente no paciente, como nos
procedimentos realizados em laboratório, pela manipulação ou contato de objetos
contaminados. A exposição ao sangue e a saliva de pacientes durante a realização
de procedimentos odontológicos, leva a possibilidade de aquisição de doenças como
herpes, gripe comum, tuberculose, pneumonia, hepatites B e C, AIDS entre outras.
O vírus da AIDS é viável em plasma seco pelo período de 72 horas,
enquanto o vírus da hepatite B pode sobreviver por uma semana sobre superfícies e
o Mycobacterium tuberculosis pode representar risco de contaminação por semanas
(Golegã et al, 2000).
Como não é possível a percepção de todos os pacientes portadores de
doenças infecciosas, deve-se considerar todo e qualquer paciente como
potencialmente infectado durante a realização dos procedimentos odontológicos.
Fungos, esporos, vírus, microrganismos bacterianos, causadores de doenças
infecciosas, muitas vezes estão presentes em materiais para moldagem bem como
em impressões e peças protéticas e, quando não são devidamente desinfetados
passam a ser a principal via de transmissão de doenças. (Fonseca et al, 1998). Nos
23
laboratórios de prótese dentária e clínicas odontológicas, são manuseados materiais
que foram contaminados pelo contato direto com tecidos orais de pacientes
tornando-se potencialmente transmissores de doenças infecciosas.
Guimarães (1992), constatou a sobrevivência de microrganismos em
bancadas e superfícies contaminadas justificando a necessidade da adoção de
medidas de biossegurança, ressaltando o uso de equipamentos de proteção
individual, métodos de desinfecção e esterilização de materiais e instrumentais; fato
este ratificado por Golegã e colaboradores (2000), que mencionam que o uso de IPI
durante os procedimentos odontológicos reduz significativamente a transmissão de
microrganismos conseqüentemente o risco de contaminação e transmissão de
doenças.
As práticas eficazes de controle de infecção devem incluir técnicas
completas de lavagem das mãos com anti-sépticos adequados e outras barreiras
apropriadas como o uso de luvas descartáveis, avental, máscara, proteção para os
olhos inclusive dos pacientes, gorro, em qualquer consulta ao paciente que possa
envolver exposição à saliva, muco ou sangue. A desinfecção dos instrumentos
odontológicos deve iniciar com limpeza vigorosa, secagem e esterilização em calor
úmido, seco, gás ou processo químico. O uso de sanitizantes deve fazer parte de
um protocolo sanitário geral que inclui boa higiene do consultório, desinfecção de
rotina do campo cirúrgico e as superfícies devem ser tratadas com desinfetantes
apropriados (Tortamano, 1997).
Isto é justificável, pois se sabe que 1 mL de saliva pode conter mais de
200 milhões de microrganismos de aproximadamente 250 espécies (Thylstrup;
Fejerskov, 1995), sendo que a cavidade oral é considerada uma fonte primária de
microrganismos potencialmente patogênicos (Cochran; Miller; Sheldrake,1989;
24
Medina; Merino e Gorodner, 2002). Juntamente com os procedimentos realizados
nos consultórios odontológicos, existe um contato muito próximo entre paciente e
profissional, podendo estabelecer desta forma uma relação de infecção cruzada,
disseminando agentes patológicos podendo desencadear possíveis doenças entre
indivíduos presentes no local e em outros meios quando os pacientes retornam as
suas atividades de rotina (Pires, 2005).
Recomendações para métodos de esterilização e desinfecção de
instrumentos odontológicos vêm sendo descritos na literatura. Entretanto, existem
muitas variáveis que podem ser encontradas quando da aplicação de tais métodos.
Dessa forma faz-se necessário verificar a eficiência do processo de esterilização de
maneira a levar o profissional de odontologia a escolher os métodos que melhor
cumprem a tarefa sem colocar em risco a saúde dos pacientes, dos profissionais e a
durabilidade dos equipamentos (Conselho Federal de Odontologia, 1999).
Existe assim a necessidade de verificação de eficácia dos processos de
esterilização efetuada nos consultórios dentários. Dentre as variáveis que
influenciam a esterilização torna-se imprescindível verificar se as exigências de
tempo, temperatura e concentração estão sendo cumpridas de forma a garantir que
as bactérias e os esporos bacterianos sejam destruídos.
Em alguns consultórios dentários desinfetantes indicados para
desinfecção de ambientes hospitalares podem ser utilizados erroneamente na
esterilização de equipamentos usados em tratamentos odontológicos.
Em hospitais existem profissionais médicos, enfermeiros e bioquímicos
que têm, dentre as funções desempenhadas, o controle de infecção. Eles estão
encarregados de vigiar as políticas e materiais usados pelo pessoal operacional e
pessoal das centrais de serviços. Nos consultórios dentários esse controle não
25
ocorre com a mesma eficácia e o profissional, às vezes, possui dúvidas na eficiência
do controle que está utilizando. Outra dúvida que surge é se o processo de
esterilização não estará danificando o equipamento que o mesmo vem utilizando.
Outra preocupação comum é se esses produtos que esterilizam não prejudicam os
pacientes (efeitos colaterais), causados por possíveis resíduos que permanecem no
equipamento.
Embora esterilização e desinfecção possam parecer procedimentos
simples e diretos, são, entretanto complexos. Assim, torna-se relevante levar aos
dentistas que atuam em clínicas públicas e privadas e não dispõem de pessoas para
controle de infecção, uma avaliação criteriosa dos problemas de esterilização e
desinfecção de instrumentos e dispositivos, para que possam optar pelos métodos
mais seguros.
Os Centros para Controle e Prevenção de Doenças recomendam a
esterilização para todos os artigos críticos reutilizáveis, esses que penetram os
tecidos macios ou os ossos e entram no sistema vascular. Também se inclui nesta
recomendação os equipamentos manuais de alta velocidade e eletrodomésticos
reutilizáveis, ainda que estes não penetrem tecidos.
A ANVISA (2005), classifica os agentes antimicrobianos de acordo com o
nível de descontaminação proporcionado pelos mesmos em: anti-sépticos,
desinfetantes, sanitizantes e esterilizantes. Anti-séptico é um agente químico que
inibe ou elimina o crescimento de microrganismos não sendo tóxico quando utilizado
nos tecidos, para lavar as mãos ou em ferimentos. Os desinfetantes são agentes
físicos ou químicos que destroem ou inativam irreversivelmente a maioria ou todos
os microrganismos patogênicos, mas não inativam esporos ou vírus.
Sanitizante é um agente químico que reduz, mas não elimina os
26
microrganismos de um material ou superfície inanimada. Os esterilizantes químicos
devem eliminar todas as formas de vida microbiana, incluindo os esporos, sendo
agentes utilizados para desinfecção em alto nível. Existem três diferentes níveis de
desinfecção dependendo da efetividade microbiana esperada: De baixo nível, menos
efetiva, reduzindo parcialmente os microrganismos e ineficaz contra Mycobacterium
tuberculosis e esporos; de nível intermediário, eliminando o Mycobacterium
tuberculosis e a maioria dos vírus, excluindo os esporos; e de alto nível capaz de
eliminar fungos, bactérias e vírus, podendo ser esterilizante.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária, (ANVISA), através da portaria
Nº 15, de 23 de Agosto de 1988 define, classifica, regulamenta e estabelece os
parâmetros de emprego dos sanitizantes com finalidade antimicrobiana:
a. Desinfetantes - formulações que possuem na sua composição
substâncias microbiocidas e apresentam efeito letal para
microrganismos não esporulados (Staphylococcus aureus, Salmonella
choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Tricophyton mentagrophytes,
Mycobacterium amegmatis e Myctobacterium bovis).
b. Esterilizantes - formulações que possuem na sua composição
substâncias microbicidas com efeito letal para microrganismos
esporulados Bacillus subtilis (esporo) e Clostridium sporogenes
(esporo).
Para Guandalini e colaboradores (1997), um desinfetante químico ideal
deve preencher certos requisitos como ter ação rápida, alta atividade biocida, ser
efetivo na presença de matéria orgânica, biodegradável, fácil uso, ser econômico,
não tóxico e não corrosivo, entre outros; porém, os produtos disponíveis no mercado
não preenchem esses critérios. Pires (1998), aponta que os agentes químicos mais
27
utilizados para desinfecção são o glutaraldeído a 2% e o hipoclorito de sódio a 1%,
que são produtos com alto poder germicida, porém a manipulação inadequada ou a
hipersensibilidade do usuário podem causar intoxicação, dermatite de contato,
despigmentação da pele e problemas respiratórios.
Rutala e Weber (1999), abordaram sobre os esterilizantes químicos
utilizados para desinfecção em alto nível com o objetivo de facilitar a escolha dos
mesmos; Os autores concluíram que alguns desinfetantes podem até ser
esterilizantes, dependendo do tempo de exposição, como o glutaraldeído, peróxido
de hidrogênio e o ácido peracético.
Dentre os métodos químicos de descontaminação encontram-se os fenóis
e os compostos fenólicos, as biguanidas, os halogênios, os álcoois, os metais
pesados, os ácidos orgânicos, os aldeídos, os esterilizantes gasosos e ainda os
peroxigênios, os quais em sua grande maioria contribuem para o controle de
microrganismos nos serviços de saúde (Williams et al, 2001).
Cabe destacar mais especificamente a classe dos peroxigênios, que são
compostos de ação de largo espectro, possuindo como exemplo clássico o peróxido
de hidrogênio, um antimicrobiano potencial. Além desse, utiliza-se outras formas,
resultados de associações químicas, como o caso do ácido peracético. (Kitis, 2004).
A portaria da ANVISA n° 122/DNT, de 29 de novembro de 1993 inclui na
portaria n° 15 de 23/08/88, sub anexo 1 , alínea l, o princípio ativo do ácido
peracético (peróxido orgânico, fórmula química bruta C
2
H
4
O
3
), para uso nas
formulações de desinfetantes/esterilizantes.
28
3.2 Ácido Peracético
3.2.1 Características Físico-Químicas
O ácido Peracético, também denominado ácido peroxiacético (PAA), é o
peróxido de ácido acético (AA), e é considerado um forte agente oxidante e
desinfetante. PAA está comercialmente disponível na forma de uma mistura de
equilíbrio quaternário, que contém AA, peróxido de hidrogênio (HP), PAA, e água,
como mostrado pela equação seguinte:
CH
3
CO
2
H + H
2
O
2
CH
3
CO
3
H + H
2
O
Onde:
CH
3
CO
2
H = ácido acético
CH
3
CO
3
H = ácido peracético H
2
O
2
= peróxido de hidrogênio.
Embora o HP também seja um agente antimicrobiano contribuindo para a
desinfecção, o PAA é um agente antimicrobiano mais potente que o HP, sendo
rapidamente ativo a baixas concentrações contra um espectro grande de
microorganismos. Constatou-se que o HP requer doses muito maiores que o PAA
para o mesmo nível de desinfecção (Wagner et al, 2002).
O PAA combina as características de oxigênio ativo de um peróxido dentro
de uma molécula de ácido acético e pertence à classe de peróxidos orgânicos que
são substâncias químicas artificiais. Peróxidos orgânicos podem conter os radicais
de peróxido (ligação oxigênio-oxigênio), servindo como uma fonte de oxigênio. O
radical de peróxido também promove instabilidade e combustão.
29
O PAA é um líquido claro e incolor sem capacidade de espumar. Tem um
forte odor de ácido acético pungente (ácido acético é o componente principal de
vinagre) e tem um pH ácido menor que dois. Para uma solução contendo 5% PAA,
20% a 24% HP, e 10% a 12% de AA, a massa específica é 1,10 (Solvay Interox ,
2002a). Para uma solução de 12 % de PAA, o ponto de congelamento é de - 40.3 a -
42.0ºC, e a massa específica é 1,11 (Solvay Interox, 2002b). PAA é solúvel em água
em todas as proporções e em solventes orgânicos polares, sendo, entretanto,
ligeiramente solúvel em solventes aromáticos (Solvay Interox, 2002a).
Solução de PAA é produzida da reação de ácido acético ou anidrido
acético com peróxido de hidrogênio na presença de ácido sulfúrico que age como
um catalisador (Block, 1991). Além disso, um estabilizador ou um agente isolado é
empregado durante sua produção.
PAA é consideravelmente menos estável que o HP. Uma solução de 40%
de PAA perde 1% a 2% de seus ingredientes ativos por mês, enquanto o HP (para
uma solução de 30% a 90%) perde menos de 1% ao ano. Soluções diluídas de PAA
são ainda mais instáveis: uma solução de 1% perde metade de sua força por
hidrólise em 6 dias (Block, 1991). Porém, soluções de PAA comercialmente
disponíveis (10% a 15%), como usado na indústria, são muito mais estáveis quando
comparados à soluções com concentrações mais altas e mais baixas.
Para manter a estabilidade, o PAA pode ser armazenado de forma
comum, preferivelmente em local fresco e em recipientes originais. Não é afetado
por vidro e pela maioria dos plásticos. Pode extrair componentes de algumas
formulações de vinil usadas como aditivos, possibilitando o ataque a borrachas
naturais e sintéticas (Dychdala, 1988). Alumínio puro e o aço inoxidável são
30
resistentes ao PAA; mas aço simples, ferro galvanizado, cobre metálico e o bronze
são suscetíveis à reação e corrosão (Schroder, 1984; Fraser et al, 1984).
Soluções de PAA que excedem 15% começam a exibir algum grau de
explosividade, instabilidade e reatividade (Block, 1991). Dessa forma, muitas
aplicações industriais usam soluções de PAA entre 10% e 15% (principalmente
12%). O uso de soluções concentradas de PAA em consultório odontológico
representa risco para o usuário. Isto provavelmente ocorre devido à concentração
reduzida de reagentes e adição de estabilizadores com propriedades para reduzir os
riscos. Os riscos de saúde associados com PAA de 12% são semelhantes aos riscos
de saúde a 50% de peróxido de hidrogênio.
3.2.2 Atividade Antimicrobiana
As propriedades germicidas do PAA foram primeiramente reportadas por
Freer e Novy (1902). Hutchings e Xezones (1949) demostraram que o PAA é o mais
ativo de 23 germicidas testados contra esporos de Bacillus thermoacidurans.
Greenspan e MacKellar (1951) descobriram ser este bactericida a 0,001%, fungicida
a 0,003%, e esporicida a 0,3%.
O PAA também era usado como um desinfetante na produção de animais
livres de germes. (REYNIERS, 1946). Até mesmo na fase de vapor, o PAA
demonstrou possuir a taxa de morte mais alta a uma concentração mais baixa
quando comparado com uma bateria larga de outros desinfetantes disponíveis
(Baldry, 1983). A eficiência de desinfecção utilizando o PAA para microorganismos
pode ser classificada de maneira geral: Bactérias > vírus > Esporos bacterianos >
cistos protozoários. (Liberti e Notarnicola, 1999; Rudd e Hopkinson, 1989).
31
3.2.3 Modo de Ação
Embora poucos trabalhos foram desenvolvidos para pesquisar o modo de
ação de PAA como um agente antimicrobiano, sugere-se que esse funcione como
outros peróxidos e agentes oxidantes. (Block, 1991). Sua atividade de desinfetante
está baseada na liberação de oxigênio ativo (Liberti e Notarnicola, 1999), é provável
que sulfidrilas sensíveis e enxofre unem-se em proteínas ou enzimas. Foi sugerido
que o PAA interfira na função seletiva da membrana citoplásmica lipoprotéica e
ocorra ruptura das paredes das células (Baldry, 1988; Leaper, 1984). Assim, pode
ser que é igualmente efetivo contra a membrana de lipoproteínas, facilitando sua
ação contra células de microrganismos Gram-negativos (Leaper, 1984).
Sua ação na quebra de uma proteína pode ajudar a explicar suas
características como um esporicida e ovicida (Block, 1991). Além disso, PAA
intracelular também pode oxidar enzimas essenciais; assim os caminhos
bioquímicos vitais, ativam transporte por membranas, e níveis intracelulares solúveis
são prejudicados (Fraser et al, 1984). Foi demonstrado que o PAA age nas bases da
molécula de DNA (Tutumi et al, 1973). Uma vantagem importante do PAA é que
pode inativar a catálise de uma enzima conhecida para desintoxicar os radicais livres
de hidroxilas (Block, 1991).
3.1.4 Subprodutos
Os produtos de decomposição de PAA são ácido acético, peróxido de
hidrogênio, oxigênio, e água (Gehr et al, 2002; Wagner et al, 2002). Existem três
32
reações nas quais PAA é consumido em uma solução aquosa: decomposição
espontânea, hidrólise e decomposição transição-metal-catalisada (Gehr et al, 2002).
O pH varia de 5,5 a 8,2 e resulta principalmente em decomposição
espontânea para ácido acético e oxigênio.
Tem sido mostrado que PAA não produz subprodutos tóxicos ou
mutagênicos depois de reação com material orgânico (Monarca et al, 2002). Ácidos
carboxílicos são formados pela oxidação de matéria orgânica natural na água por
PAA. Nenhuma desinfecção de subproduto contendo halogênio (DBPs) foi
observada para água PAA tratada. Desinfetantes à base de cloro resultam na
formação de subprodutos tóxicos e mutagênicos halogenados (clorados e/ou
bromados) depois da reação de cloro com o material orgânico.
Embora PAA na decomposição forme produtos inofensivos e, pouco ou
nenhum subproduto que seja tóxico ou mutagênico, a possibilidade que possa
formar DBPs não pode ser completamente ignorada (Crathorne et al, 1991). Foi
demonstrado que PAA não pôde oxidar cloreto a ácido hipocloroso. Então, foi
proposto que a transformação de fenol para clorofenol ocorra através da geração de
radicais halógenos livres (de cloreto, se presente em quantidades altas como
acontece na água do mar). A eletroquímica do PAA é suficiente para oxidar o
brometo a ácido hipobromoso, subseqüentemente formando orgânicos bromados
(Booth e Lester, 1995).
Embora poucos estudos sugerem a formação de alguns DBPs (com
alguma toxidade) a partir do PAA, a quantidade e espectro destes DBPs são muito
menores que aqueles formados por cloro ou ozônio. Além disso, outros oxidantes,
tais como cloro ou ozônio, também formam os radicais halógenos livres do cloreto
de fundo ou íons de brometo.
33
O PAA, sendo produto final da reação do peróxido de hidrogênio com o
ácido acético, é considerado a forma mais eficaz de esterilização utilizando uma
baixa concentração ativa contra um amplo espectro de microrganismos. Foi
observada ainda ausência de toxicidade ou resíduos persistentes, potencial
mutagênico, pequena dependência do pH no espectro de atuação, exigência de
tempo de contato curto e eficiência para efluentes (Pelkzar et al, 1998).
Uma correta anti-sepsia pré-cirúrgica ou pré-tratamento é altamente
satisfatório, caracterizando uma medida muita eficiente no controle da infecção
cruzada no consultório odontológico. Na anti-sepsia podem ser utilizados: solução
de clorexidina (de 0,12 a 0,2 %), compostos de iodo (povidona- Iodine, PVP-I, de 1 a
1,5 %) e água oxigenada a 10 volumes (Jorge, 2001).
Nos biocidas químicos está a chave da preservação dos produtos tão
diversos quanto alimentos e bebidas, cosméticos e formulações farmacêuticas. Os
biocidas são ainda utilizados em larga escala de aplicações industriais, ambientais e
centros hospitalares, sendo que muitos foram incorporados ao uso comum com um
histórico longo de experimentação. Os estudos sistemáticos de mecanismos de ação
auxiliam em novos projetos e desenvolvimentos futuros, propiciando conhecimento
para ampliação de novos agentes que minimizam os mecanismos da resistência e
os problemas toxicológicos (Denyer e Stewart, 1995).
34
4 MATERIAIS E MÉTODOS
O desenvolvimento da pesquisa foi efetuado em duas etapas: a primeira
etapa foi desenvolvida em laboratório buscando verificar qual das concentrações
testadas o ácido peracético apresenta maior poder inibitório; qual o dano corrosivo
causado pelo produto nos materiais odontológicos e a possível citotoxicidade e
mutagenicidade provocada por uma ação residual. Esses resultados serviram como
base para a realização da segunda etapa dos testes do ácido peracético nos
consultórios odontológicos.
4.1 Etapa Laboratorial
Foram utilizados nesta etapa os seguintes procedimentos e métodos: teste
de difusão em ágar, teste de concentração inibitória mínima, teste de concentração
bactericída mínima, estudo de eletroquímica, estudo de possível mutagenicidade
causada pelo produto (Teste Cometa), estudo de possível citotoxicidade causada
pelo produto (Citotoxicidade mitocondrial _ensaio com o sal de tetrazolium-MTT):
4.1.1 Microrganismos Utilizados
Foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis ATCC
6633, Escherichia coli ATCC 8739, Mycobacterium smegatis ATCC 700044,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 14028,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 e
35
Candida albicans sp ATCC 10231. Os mesmos foram adquiridos junto a fundação
André Toselo. pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda (Joinville/ SC).
4.1.2 Disponibilização do Biocida
O biocida (àcido peracético) foi disponibilizado pela empresa FGM
Produtos Odontológicos Ltda (Joinville/ SC). O mesmo foi fornecido na forma de pó
gerador e pó neutralizador.
4.1.3 Teste de Difusão em Agar
Para o teste de difusão em ágar modificado, as placas de Petri continham
na sua parte interna dois discos de papel filtro, com o objetivo de absorver a
umidade proveniente da atividade microbiológica tendo em vista a impossibilidade
de virar a placa, quando utilizado o método dos poços.
4.1.4 Meio de Crescimento e de Cultura
Em função do número de amostras, foram preparados os meios de cultura
Ágar Plate Count para as bactérias e, para as leveduras, Ágar Sabouraud com o
objetivo de crescimento dos microrganismos.
36
4.1.5 Inoculação dos Microorganismos
A inoculação foi realizada utilizando a concentração equivalente à
turvação 0,5 da escala Mac-Farland (Pelkzar et al, 1998), ajustou-se através das
diluições seriadas, para uma concentração inicial de 10
6
colônias por mL, apanhou-
se um “swab” e mergulhou-se no tubo com as bactérias, impregnou-se bem o
algodão, fazendo a haste girar nos dois sentidos. Retirou-se o excesso,
pressionando o “swab“ levemente contra o frasco e então se inoculou por toda a
placa cobrindo a superfície da mesma de maneira uniforme girando a placa 45 graus
toda vez que chegou-se ao final da mesma. Repetiu-se o procedimento por três
vezes.
4.1.6 Preparação da Solução Teste
Na preparação do biocida ácido peracético utilizou-se um pó gerador e um
pó neutralizador diluídos em água destilada, conforme descritos na Tabela 1, para
se atingir as concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm. Primeiramente
mediu-se a água destilada, na qual foi adicionado o pó gerador e com um bastão de
vidro agitou-se por cinco minutos, após essa diluição a solução apresentou-se de cor
rosa; posteriormente se adicionou o pó neutralizador e novamente se agitou com o
bastão de vidro até sua completa diluição, completando a reação formadora do ácido
peracético, que tornou-se incolor.
37
Tabela 1: Proporção do pó gerador e neutralizador no preparo das soluções do
ácido peracético
Concentração da
solução.
Pó gerador em
gramas.
Pó neutralizador em
gramas.
800 ppm 0,17g 0,095g 40 ml
1500 ppm 0,425g 0,2075g 50 ml
2500 ppm 0,52 O,3048 40 ml
Fonte: Medidas fornecidas pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda de Joinvile, S/C.
4.1.7 Teste de Concentração Inibitória Mínima
Para análise da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram utilizados 10
tubos contendo 10 mL de BHI (Pelkzar et al, 1998). No trabalho foi utilizado
inicialmente 5,77 mL do princípio ativo. Para os tubos subseqüentes essa
quantidade foi dividida por raiz de três (10 mL divididos por raiz de três), conforme
pode ser observada na Tabela 2, a quantidade do princípio ativo utilizado para cada
tubo.
O tubo 10 não contém o princípio ativo e serve como um controle de
crescimento. Os meios, após serem inoculados com os microrganismos, foram
incubados a 35°C durante 24 horas. No final deste período os meios foram
examinados visualmente para comprovar a presença de turvação. A turvação indica
que houve crescimento dos microrganismos, e o primeiro tubo a não turvar indica a
concentração inibitória mínima.
38
Tabela 2: Quantidade do princípio ativo distribuído em cada tubo.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Quantidade
em (mL)
5,77 3,33 1,92 1,11 0,644 0,370 0,213 0,123 0,071 Branco
4.1.8 Teste de Concentração Bactericida Mínima
A concentração bactericida mínima (CBM), em comparação com a CIM, é
a menor concentração em µg/mL, que mata o microrganismo em estudo (Pelkzar et
al, 1998). A solução (meio de crescimento + PAA) após 24h deve ser semeada em
placas (uma placa correspondente a cada tubo). Após as placas devem permanecer
por 24 horas em estufa a 35°C. Depois desse tempo deve ser observado o
crescimento ou não das colônias, sendo que, caso ocorra crescimento, conta-se as
colônias com um contador de colônias. A placa onde não crescem nenhuma colônia
é a correspondente à concentração bactericida mínima.
4.1.9 Estudo de Eletroquímica
4.1.9.1 Condição Experimental
Corpos de prova foram confeccionados a partir de aço inox de
instrumentos odontológicos. Os mesmos foram cortados, embutidos em baquelite e
polidos mecanicamente até grau metalográfico. Ensaios acelerados de corrosão
eletroquímica empregando as técnicas de E
corr
vs. Tempo e Potenciodinâmico foram
39
conduzidos num Potenciostato&Galvanostato EGG&Par 283 em soluções recém
preparadas. Estas técnicas permitem avaliar eventuais danos corrosivos causados
pelo ácido peracético nas concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm. As
medidas foram efetuadas numa célula a três eletrodos típica, conforme ilustrado na
Figura 1. O perfil potenciodinâmico de um eletrodo de área geométrica 0,198 cm
2
, foi
registrado a uma velocidade de variação de potencial de 1,0 mV.s
-1
, iniciando num
potencial E
i
de -0,5V vs OC (open circuit) até um potencial final E
f
de 1,6V. O
programa usado para adquirir e tratar os dados foi o 352 Softcorr lll Corrosin
Measurement software for windows versão 3.05 elaborado pela empresa EG & G
Instruments Inc.
Figura 1: Arranjo experimental para o teste de corrosão
40
4.1.10 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa
Entre os efeitos residuais que sanitizantes podem causar estão a
genotoxicidade e conseqüentemente a mutagênese celular. Foram avaliados os
possíveis danos ao DNA impostos pelo produto em sangue total, em função das
concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm de ácido peracético. O estudo de
genotoxicidade celular foi realizado através do teste Cometa, que é um teste com a
finalidade de detectar possíveis danos ao DNA.
O Teste Cometa ou SCGE (Single Cell Gel Assay), tem sido cada vez
mais utilizado, pois permite a avaliação de danos causados no DNA. O reparo do
mesmo e o potencial genotóxico de substâncias variadas pode ser avaliado pelo
teste Cometa. (Guecheva, Henriques e Erdtmann, 2001). Pode-se realizar o teste
em qualquer organismo vivo ou tipo celular, apresentando algumas vantagens
quando comparado a outros testes para detecção de substâncias que promovem
dano ao DNA. Porém, não é utilizado para detectar mutação, mas sim lesões
genômicas que, após serem processadas podem resultar nesta.
Este método pode ser realizado em tempo que varia de horas a dias,
além de poder ser aplicado a qualquer célula de organismo vivo, tornando-o um
excelente método para avaliações ambientais, de fármacos e produtos químicos
(Silva et al, 2000). Também pode ser avaliado o número de células que tiveram ou
não o seu DNA afetado e este valor, chamado de “freqüência de dano ao DNA”, é
expresso como porcentagem de células que tiveram algum dano mensurável ao seu
código genético.
O teste Cometa em pH alcalino está representado na Figura 2. Para
realização do teste foram coletados 5 mL de sangue de 06 doadores: Após a coleta,
41
o sangue foi colocado em ependorf com 40 µl de eparina. Posteriormente se
preparou as soluções de ácido peracético nas concentrações de 800, 1500 e 2500
ppm; Para cada amostra foram colocados em outro ependorf 100 µl de sangue com
10 µl de solução de ácido peracético pelo período de 20 minutos. As células foram
colhidas e dissolvidas em agarose low-melting point (0,75%) e então plaqueadas
sobre uma lâmina de microscopia com pré-cobertura de agarose (1,5%). As lâminas
foram feitas em duplicata para cada tratamento. As células foram lisadas com uma
solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM de Tris, 1% Triton X-100 e 10%
DMSO pH 10) por no mínimo duas horas. Após a lise celular, as lâminas foram
colocadas em uma cuba de eletroforese horizontal contendo uma solução tampão
(300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH 13,00-13,50 a 4°C) que permite o
desenrolamento do DNA. Então, as laminas foram incubadas por 20 minutos nessa
solução alcalina feito na hora do uso. Uma corrente elétrica de 300 mA e 25 V foi
aplicada por 15 minutos a 4 °C. As lâminas foram então neutralizadas com 0.4 M
Tris, pH 7.5. Após estarem secas, as lâminas foram fixadas por uma solução
contendo ácido tricloroacético 15%, sulfato de zinco 5% e glicerol 5% e então
coradas com solução de coloração contendo carbonato de sódio 5% mais nitrato de
amônio 0,1%, nitrato de prata 0,1%, ácido tungstosilicico 0,25% e formaldeído
0,15%. A reação foi parada com acido acético 1% (Hartmann e Speit, 1997).
42
Figura 2: Descrição simplificada do teste cometa.
Fonte: Silva, Erdtmann e Henriques, (2003). Modificada.
Foram analisados, num total de 100 células para cada grupo teste, 50 por
lâmina, em microscópio óptico NIKON
®
, com aumento de 400x, onde se observaram
os núcleos contendo DNA intacto, que se apresentam redondos. Nas células
lesadas observa-se migração de DNA para fora do núcleo, apresentando forma
similar a um “cometa”, de onde se origina a nomenclatura do teste (Figura 3). As
células são classificadas visualmente em cinco classes, de acordo com o tamanho
da cauda, sem danos (classe 0), até danos máximos (classe 4). Assim, o índice de
danos de cada grupo estudado pode ir do zero (100x0; 100 células observadas
completamente sem danos) a 400 (100x4; 100 células observadas com dano
máximo) (Erdtmann e Henriques, 2003).
43
Figura 3: Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos
classes 2 e 3; (c) dano classe 4.
Fonte: Silva, Erdtmann e Henriques, (2003). Modificada.
4.1.11 Estudos Citotóxidos do Ácido Peracético
4.1.11.1 Citotoxicidade Mitocondrial (Ensaio com o Sal de Tetrazolium-MTT)
Em placa de 96 poços, foi adicionado 1 X 10
6
macrófagos, que foram
expostos às três diferentes concentrações de Ácido peracético (800 ppm, 1500 ppm
e 2500 ppm). Após a adição das células, a placa foi centrifugada por 10 min a 1.500
RPM. Retirou-se com cuidado de 90-95% do meio e desprezadas as células
aderidas, sendo descartado o sobrenadante. Após este procedimento, foram
adicionados 100 µl de meio RPMI em todos os poços, e 100 µl de Ácido peracético
nas concentrações acima citadas.
Adicionou-se 10 µl de MTT (10% do volume, isto é, 10 µl de MTT para
cada 100 µl de meio em todos os poços) e misturou-se com muito cuidado. Incubou-
se por 3 horas em estufa a 37° (com CO
2
), esperando a precipitação das células
que ficam caracterizadas pela opacidade do fundo do poço.
Centrifugou-se por 10 min a 1.500 rpm, retirou-se o sobrenadante que foi
desprezado. Posteriormente adicionou-se o mesmo volume de álcool isopropílico; a
44
seguir agitou-se vigorosamente com uma pipeta poço por poço para o MTT se
dissolver no álcool; posteriormente centrifugou-se por 5 min a 2000 rpm, retirou-se o
sobrenadante e transferiu-se para outra placa e procedeu-se a leitura. A leitura foi
realizada a 540 nm em leitor de placa ELISA automático.
4.1 Etapa Desenvolvida em Consultórios Odontológicos
Foram avaliados materiais e equipamentos contaminados de dois
consultórios odontológicos, sendo um público e o outro privado.
As soluções de ácido peracético foram preparadas para formar 1000 mL
de solução na concentração de 2500 ppm. Foram utilizados “saches” previamente
pesado pela FGM e misturados a um litro de água, adicionando primeiramente o pó
gerador e após o pó neutralizador.
O preparo da solução foi conduzido por diferentes pessoas (dentistas e
auxiliares), após breve explanação sobre as recomendações do fabricante para a
utilização do produto. A preparação da solução ocorreu antes da primeira
esterilização do dia e as coletas foram realizadas após o primeiro, terceiro e sexto
atendimento, independentemente do procedimento clínico a ser realizado.
A coleta foi realizada da seguinte forma: Utilizaram-se quatro tubos de
ensaio, onde três continham 5 mL de solução salina e um 5 mL de BHI, devidamente
esterilizados. Após o atendimento odontológico o material utilizado foi lavado de
maneira convencional com água e sabão e seco em toalhas de tecido.
Posteriormente com um swab estéril friccionou-se por trinta segundos o material.
Após, este swab era imerso no meio (salina ou BHI) e vedado. Findo o sexto
atendimento, os tubos foram levados ao laboratório, onde foram incubados na estufa
45
a 35 graus Celsius por 24 horas. Das amostras com solução salina foram retirados
100 microlitros e semeados em uma placa contendo plate count agar utilizando uma
alça de Drigalski.
Para comprovar a contaminação do material utilizado nos consultórios
odontológicos, procedeu-se da seguinte forma. Os materiais foram totalmente
submersos em uma solução de ácido peracético na concentração de 2500 ppm por
vinte minutos. Decorrido este tempo, com uma pinça estéril o material foi removido
da solução e secado com gase estéril. O procedimento de coleta e condução
laboratorial das amostras foi semelhante aos descritos antes da esterilização. Após
24 hs foi feita a contagem nas placas. As datas das coletas estão na Tabela 1.
Vale destacar que os instrumentais utilizados nos testes foram submetidos
ao procedimento habitual de esterilização do consultório após a coleta prevista no
experimento.
4.2.1 Unidade de Saúde 24h Próspera (Pública)
A unidade de saúde 24 hs Próspera está localizada no bairro Próspera
onde se localiza o CEO ( Centro de Especialidades Odontológicas) que conta com o
apoio de serviços odontológicos clínicos gerais com um consultório, dois cirurgiões
dentistas e um assistente de consultório dentário, realizando atendimento clínico de
três horas, no período matutino (08:00h às 11:00h) e vespertino (13:00h às 16:00h).
Nesta unidade são realizados atendimentos clínicos de ordem geral (exames para
diagnóstico, tartarectomias, restaurações, extrações, drenagem de abscessos e
46
atividades preventivas (profilaxias, aplicações tópicas de flúor e orientações quanto
à higiene oral).
4.2.2 Consultório Privado
O consultório odontológico que foi avaliado está localizado na rua Coronel
Pedro Benedet, nº 225, sala 306, Ed. Galeria Becker, Criciúma-Centro; o referido
consultório pertence à Cirurgiã Dentista Ana Paula Maciel que concordou com o
experimento. Nesse consultório são realizados os procedimentos de rotina de um
cirurgião dentista com destaque para os procedimentos cirúrgicos de endodontia
(tratamento de canal), pois a mesma é especialista nesta área de atuação
odontológica. O atendimento clínico é realizado no período das 14hs às 20hs de
segunda a sexta-feira; atuam nesse consultório um cirurgião dentista e uma auxiliar
de consultório dentário.
47
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo serão apresentados e discutidos os resultados obtidos no
desenvolvimento deste trabalho.
5.1 Teste de Difusão em Ágar
Nos testes laboratoriais os resultados obtidos nos testes de difusão em
ágar são apresentados na Tabela 3. Os resultados representam as médias
aritméticas.
Tabela 3: Teste de difusão em Agar
TESTE DIFUSÃO EM ÀGAR
Primeira
Amostra
Segunda
Amostra
Terceira
Amostra
Bactérias
800
1500
2 500
800
1500
2500
800
1500
2500
S.a 22,5mm
25,5mm
32,5mm
25mm 25,5mm 30mm 20mm 20mm 22mm
E.c 11 mm 14mm 14,5mm
12,5mm 13,5mm 18mm 11,5mm
14,5mm 22mm
T.m 14,5mm
17mm 21mm 12mm 17mm 17,5mm
13mm 15mm 18,5mm
S.c 8,5mm 14mm 20mm 12,5mm 15,5mm 21mm 11,5mm
14mm 19mm
B.s 10mm 14mm 21,5mm
9,5mm 13mm 24,5mm
8mm 13,5 17mm
P.a 6mm 10mm 14,5mm
6,5mm 11,5mm 14mm 7,5mm 14,5mm 14,5mm
M.s 12,5mm
16,5mm
24mm 11,5mm 15mm 20,5mm
13mm 15mm 19mm
C.a 22,5mm
25mm 23mm 19,5mm 22,5mm 30mm 23mm 22mm 23mm
48
Conforme pode ser visualizado na Tabela 3 e na Figura 4, os halos
inibitórios mantiveram para todos os microrganismos, uma escala crescente de
acordo com o aumento na concentração do agente antimicrobiano.
Observa-se que para o microrganismo, Pseudomonas aeruginosa, mesmo
na concentração de 2500 ppm, o halo de inibição médio foi menor entre todos os
microrganismos testados. Já para o Staphylococcus aureus o teste apresentou o
maior halo de inibição. Essa diferença possivelmente seja decorrente das diferenças
fisiológicas dos microrganismos. O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram
positiva enquanto a Pseudomonas aeruginosa, é uma bactéria gram negativa que
possui uma camada adicional de proteína em sua membrana celular, dificultando a
ação do ácido peracético, tornando o microrganismo menos susceptível.
Podemos observar que para todos os microrganismos testados o ácido
peracético apresentou ação bactericida, sendo mais eficiente na concentração de
2500 ppm.
A figura 4 apresenta os valores dos halos de inibição ao crescimento
bacteriano frente a três concentrações diferentes do ácido peracético (Teste de
difusão em ágar).
49
S a E c T m S c B s P a M s C a
0
5
10
15
20
25
30
Halo de inibição em mm
C o n c e n tra çã o à c id o p e rac é tico
80 0 p p m
15 0 0 p pm
25 0 0 p pm
Figura 4: Representação gráfica dos halos inibitórios no teste difusão
em Agar.
As figuras 5 e 6 exemplificam a diferença visual e significativa da inibição
do crescimento existente entre duas concentrações do ácido peracético frente a
mesma espécie de microrganismo (Staphylococcus aureus).
Figura 5: Halos de inibição de Staphylococcus aureus, àcido
peracéticonas concentrações 800ppm.
50
Figura 6: Halos de inibição de Staphylococcus aureus, àcido
peracético nas concentrações 2500 ppm.
Os dados analisados apresentam significância estatística entre as
concentrações à nível de significância de 5%- ANOVA.
5.2 Teste de Concentração Inibitória Mínima
Conforme pode ser visualizado na Figura 7, a Concentração Inibitória
Mínima ocorre no tubo N
o
01, que se apresenta límpido. Nos demais tubos
observam-se que ocorreu turvação indicando o crescimento dos microrganismos.
51
Figura 7: Teste da concentração inibitória mínima da solução Peracet
à 1500 ppm para a bactéria Salmonella choleraesuis .
Na Tabela 4 apresentam-se os resultados referentes à concentração
Inibitória mínima.
Tabela 4: Respostas de crescimento dos microrganismos em diferentes concentrações de
àcido peracético
10
^
-1 10
^
-2 10
^
-3 10
^
-4 10
^
-5 10
^
-6 10
^
-7 10
^
-8 10
^
-9 10
^
-10
S.a (Gram +)
800
1500
2500
N
N
N
N
N
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
S
S
S
E.c (Gram -)
800
1500
2500
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
T.m (levedura)
800
1500
2500
N
N
N
N
N
N
S
N
N
S
N
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
S.c (Gram -)
800
1500
2500
S
N
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
B.s (Gram +)
800
1500
2500
N
N
N
N
N
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
P.a (Gram -)
800
1500
2500
S
N
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
M.s (levedura)
800
1500
2500
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
S
C.a (levedura
800
1500
2500
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
S
S
N
N
S
N
N
S
N
N
S
N
N
S
N
S
S
S
Legenda: N – Não turvou e não cresceu S – Turvou e cresceu
52
As concentrações indicadas na Tabela 4 não correspondem às
concentrações finais obtidas após a diluição. Estas são apresentadas na Tabela 5.
Observa-se que para concentração inicial de 2500 ppm nenhuma espécie de
bactéria sobreviveu, indicando que esta concentração nos garante o efeito
bactericida.
Conforme pode ser observado na Tabela 5 a concentração inicial que
correspondia a 2500 ppm após a diluição corresponde a 897,5 ppm. Isso é um
indicativo de que o PAA 800 ppm será eficiente como bactericida para todos os
microrganismos testados. Salienta-se que a concentração inicial que era 800 ppm
após a diluição passou para 287 ppm. Esta concentração mostrou-se ineficiente
para três dos microrganismos que foram testados.
Tabela 5: Concentração do princípio ativo após diluição seriada.
Concentração Concentração Concentração
Diluição VL (ml) Relação 800 ppm 1500 ppm 2500 ppm
10
-1
5,77 0,359 287 538,5 897,5
10
-2
3,33 0,249 200 373,5 622,5
10
-3
1,92 0,161 128,8 241,5 402,5
10
-4
1,11 0,099 79,2 148,5 247,5
10
-5
0,644 6,05 x 10
-2
48,4 90,7 151,2
10
-6
0,370 3,567 x 10
-2
28,5 53,5 89,17
10
-7
0,213 2,08 x 10
-2
16,64 31,2 52,0
10
-8
0,123 1,215 x 10
-2
9,72 18,22 30,4
10
-9
0,071 7,049 x 10
-3
05,63 10,573 17,6
10
-10
branco 0 0 0 0
5.3 Teste de Concentração Bactericida Mínima
Observando os resultados apresentados na Tabela 6 percebe-se que,
para Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e a Salmonella choleraesuis ATCC
53
14028, nas concentrações de 800 ppm e 1500 ppm quando semeados os mesmos
ainda desenvolveram colônias.
Tabela 6: Resultados obtidos nos testes de concentração bactericida mínima
5,77µl
3,33µl 1,92µl 1,11µl
0,644µl 0,370µl
0,213µl 0,123µl 0,071µl
Branco
800
A A C C C C C C C C
S.a 1500
A A C C C C C C C C
2500
A A A A A A A A C C
800
A A A A C C C C C C
E.c 1500
A C C C C C C C C C
2500
A A A A A A C C C C
800
A A C C C C C C C C
T.m
1500
A A A A A A C C C C
2500
A A A A A A A A A C
800
C C C C C C C C C C
S.c 1500
C C C C C C C C C C
2500
A A A A C C C C C C
800
A A A C C C C C C C
B.s 1500
A A A A C C C C C C
2500
A A A A C C C C C C
800
C C C C C C C C C C
P.a 1500
C C C C C C C C C C
2500
A A A A C C C C C C
800
A A A A C C C C C C
M.s
1500
A A A C C C C C C C
2500
A A A A A A A A C C
800
C C C C C C C C C C
C.a
1500
A A A A A C C C C C
2500
A A A A A A A C C C
54
Os resultados obtidos no teste da concentração bactericida mínimo, em
concordância com os resultados obtidos no teste de concentração inibitória mínima,
levam a concluir que as concentrações menores (800 e 1500 ppm) possibilitaram o
crescimento de alguns dos microrganismos testados. Em função destes resultados
a concentração de 2500 ppm tornou-se a mais indicada para os testes nos
consultórios odontológicos.
5.4 Ensaios de Corrosão
Um aspecto importante que deve ser levado em consideração na
esterilização química é a degradação corrosiva dos equipamentos, decorrente do
emprego de agentes físicos e/ou químicos. Diversos produtos, embora eficientes no
aspecto microbiológico, apresentam forte ação corrosiva, inviabilizando seu
emprego. O ácido peracético, um agente oxidante in-natura apresenta
características corrosivas, como esperado. No sentido de minimizar este efeito foi
adicionado um agente neutralizante.
Antes de cada ensaio potenciodinâmico, registrou-se o potencial de
circuito aberto (OC) durante 30 minutos, a fim de estabilizar a interface substrato //
meio. As curvas de E
corr
vs. Tempo não são apresentadas. A Tabela 7 sumariza os
principais resultados obtidos a partir dos perfis potenciodinâmicos de substratos de
aço inox de instrumentos odontológicos, cobre e platina, registrada em diferentes
concentrações de ácido peracético pode ser visualizada os principais resultados do
ensaio potenciodinâmico. Verifica-se que a taxa de corrosão do aço inox, calculada
a partir das inclinações de Tafel, cresce com o aumento da concentração de ácido
peracético. Entretanto, os valores são muito baixos, isto é, 21,58 x 10
-6
cm.ano
-1
, XX
55
e YY, para as concentrações de 800, 1500 e 2500 ppm, respectivamente. Estes
valores representam taxas muito baixa, indicando que o produto pode ser usado
com segurança, no que tange a resistência à corrosão.
Tabela 7: Taxa de corrosão em cm.ano
-1
em eletrodos de aço inox nas
concentrações de Peracet de 800,1500 e 2500 ppm/mL.
Concentração (ppm)
Eletrodos Parâmetro
I
CORR
(nA)
800
22,27
1500
180,5
2500
256,70
E
CORR
(mV) -99,70 -113,5 -196,70
Aço Inox
Tx
CORR
(cm/ano)
I
CORR
(µA)
21,58 x 10
-6
88,4
183,24 x 10
-6
52,15
248,82 x 10
-6
46,95
Cobre E
CORR
(mV) -128,13 -18,22 -108,4
I
CORR
(µA) 10,98 12,16 15,42
Platina
E
CORR
(mV) -51,9 123,32 -195,7
A Figura 8 corresponde à sobreposição dos perfis potenciodinâmicos para
corpos de prova de aço inox em ácido peracético nas concentrações de 800, 1500 e
2500 ppm, registrados a uma velocidade de varredura de 1 mV.s
-1
. Observa-se que
abaixo de E
corr
todos os perfis são similares, com diminuição gradual na densidade
de corrente, a medida que o potencial varia da região catódica para anódica.
Entretanto, o E
corr
torna-se mais negativo, a medida que a concentração do ácido
peracético aumenta em ocorre uma taxa de corrosão muito baixa com os eletrodos
em estudo (aço inox). Acima de E
corr
, não se verifica tendência a passivação, em
toda a faixa de potencial investigada. Adicionalmente, as densidades de corrente
são progressivamente superiores em função do aumento de concentração, o que
está de acordo com as taxas de corrosão calculadas.
56
- 1 4 - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4
- 2
- 1 0 0 0
- 5 0 0
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
E ( m V )
l o g ( I ) ( l o g ( A ) )
8 0 0 p p m
1 5 0 0 p p m
2 5 0 0 p p m
Figura 8: Perfis potenciodinâmicos do aço inox em ácido peracético.
O produto, portanto, pode ser utilizado com segurança para assepsia de
instrumentos fabricados com material similar ao testado, sem ocasionar dano
corrosivo considerável.
5.5 Teste de Genotoxicidade
Na Figura 9 são apresentados os resultados de 06 amostras em duplicata
do teste Cometa, onde estão representados os possíveis danos ao DNA em
comparação aos controles positivo e negativos.
Nessa figura observa-se a média do índice de dano ao DNA causado pelo
Ácido Peracético em varias concentrações, quando incubado com sangue total
periférico de seis (6) indivíduos humanos em cultura por 90 minutos.
57
85,167
78,667
67,667
50,000
32,667
0
20
40
60
80
100
120
Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2
Tratamento
ìndice de dano ao DNA
*
**
85,167
78,667
67,667
50,000
32,667
0
20
40
60
80
100
120
Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2
Tratamento
ìndice de dano ao DNA
*
**
Figura 9: Média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A
comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH
7,0), sendo *p<0,05 e **p<0,001.
Na concentração de 800 ppm o índice de dano foi de 50,00±16,50; na
concentração de 1500ppm foi de 67,667±29,12; na concentração de 2500 ppm o
índice de dano ao DNA foi de 78,667±25,74; e na incubação com Peróxido de
Hidrogênio (H
2
O
2
) o índice observado foi de 85,167±15,38.
É importante salientar que a incubação com H
2
O
2
, é realizado para
verificar a funcionalidade do teste, onde se utiliza 150 µM de H
2
O
2
para indução do
dano ao DNA.
A diferença estatística é notada na concentração de 1500 ppm com
p<0,05 e na concentração de 2500 ppm com p<0, 01, tendo como referência para
comparação o controle negativo contendo Tampão PBS pH 7,0.
O índice de dano ao DNA varia de 0 (0, classificação de dano ao DNA) x
100 (Referente ao número de células observadas) a 400 (100 (quantidade de células
observadas) x 4(Dano ao DNA).
58
5.6 Freqüência de Dano ao DNA
A figura 10 representa a média da freqüência de dano ao DNA causado
pelo Ácido Peracético em varias concentrações, quando incubado com sangue total
periférico de seis (6) indivíduos humanos em cultura por 90 minutos.
Na concentração de 800ppm foi observado uma freqüência de
37,167±13,14; na concentração de 1500ppm a freqüência observada foi de
44,167±11,65; na concentração de 2500ppm 51,667±11,98 foi a freqüência
observada e 55,167±7,22; foi freqüência observada para o tratamento com 150 µM
de H
2
O
2
.
A diferença estatística é notada na concentração de 2500ppm com p<0,
05, tendo como referência para comparação o controle negativo contendo Tampão
PBS pH 7,0.
É importante salientar que a freqüência de dano ao DNA é observada
pela soma de células danificadas no teste cometa. Esta descrição varia de 0 a 100,
0 é dado quando todas as células observadas não apresentam dano ao DNA e 100
é o número dado quando todas as células observadas pelo teste cometa são
lesadas, independente se o índice de dano é classificado de 1, 2, 3 ou 4.
59
55,167
51,667
44,167
37,167
29,333
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2
Tratamento
% de dano ao DNA
*
55,167
51,667
44,167
37,167
29,333
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2
Tratamento
% de dano ao DNA
*
Figura 10: Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético.
A comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS
pH).
Observa-se na figura 11 que o ácido peracético em contato direto com as
células pode causar danos no DNA; salientamos que como esterilizante químico não
entra em contato direto como as células dos tecidos. Em concentração menor 800
ppm/mL o seu efeito é menor do que na concentração de 2500 ppm/mL. Salienta-se
que possíveis resíduos que entrarem em contato com o tecido após o enxágüe do
material estarão diluídos diminuindo consideravelmente seu efeito de dano ao DNA.
Além disso, o produto sofre rápida degradação gerando H
2
O
2
e ácido acético.
Portanto, a possibilidade do produto entrar em contato com as células da cavidade
bucal são muito baixas.
60
85,167
78,667
67,667
50,000
32,667
0
20
40
60
80
100
120
Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2
Tratamento
ìndice de dano ao DNA
*
**
85,167
78,667
67,667
50,000
32,667
0
20
40
60
80
100
120
Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2
Tratamento
ìndice de dano ao DNA
*
**
Figura 11: Índice de dano ao DNA celular do Peracet nas concentrações de 800,
1500 e 2500ppm/mL em comparação aos controles negativos (água)
e controle positivo (próxido de hidrogênio).
5.7 Estudo Citotóxico do Ácido Peracético
O teste de citotoxicidade foi realizado com intuito de aproximar os
resultados às condições operacionais na esterilização de material odontológico
utilizando o ácido peracético. A principal diferença quando comparado ao teste de
genotoxicidade está no fato do material nuclear estar protegido pela membrana
celular.
Na Tabela 8 são apresentados o número de células viáveis após a
exposição ao ácido peracético nas diferentes concentrações e contagem realizada
em leitor de ELISA automático. A absorbância do controle positivo foi de 0,589.
61
Tabela 8: Absorbância do número de células viáveis
após exposição ao ácido peracético.
Concentração 800 ppm 1500 ppm 2500 ppm
Leitura 1 0,624 0,526 0,420
Leitura 2 0,497 0,469 0,403
Leitura 3 0,607 0,445 0,411
Leitura 4 0,444 0,400 0,340
Média 0,543 0,460 0,3935
Variança 0,00752 0,00275 0,00132
A análise estatística do teste T com nível de significância de 0,5% obteve-
se os valores t= -1,63734 e p= 0,15267. A conclusão é que a comparação entre as
concentrações de 800 ppm e 1500 ppm não apresentam diferença significativa.
O teste T entre as concentrações de 1500 ppm e 2500 ppm apresenta t= -
2,08364 e p= 0,08232. A conclusão é que para um nível de significância de 0,5%
não apresenta diferença significativa.
A análise ANOVA por uma via apresenta os valores de f= 5,80421 e p=
0,02404. A um nível de significância de 0,5% os resultados mostram diferença
significativa.
Para uma melhor visualização apresenta-se na figura 12 os dados obtidos.
62
Figura 12: Representação gráfica da absorbância de células viáveis
frente a diferentes concentrações.
A comparação de redução celular na concentração de 800 ppm pra o
controle positivo foi de 7,8%. Quando comparado à concentração de 1500 ppm a
redução foi de 21,9%. A concentração de 2500 ppm apresentou uma redução de
33,28%. Dados da literatura apontam que uma redução de até 10% não é
considerada citotóxico. Acima deste valor passa a ser significativo.
5.8 Etapa Realizada nos Consultórios Odontológicos
5.8.1 Testes de Esterilização Química com o Ácido Peracético na Concentração
de 2500 ppm em Material Odontológico Contaminado
Os testes de verificação da eficácia de esterilização do ácido peracético
foram realizados na concentração de 2500 ppm, pois nesta concentração os
resultados na etapa laboratorial mostraram-se mais eficientes.
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Absorbância de células viáveis
Concentração de Ácido Peracético
C2500
C1500
C800
63
Na Tabela 9 são transcritos o número de colônias de microrganismos das
72 amostras em solução salina antes e após a esterilização com o ácido peracético
na concentração de 2500 ppm; a semeadura foi realizada em PCA. Observa-se
ainda, que após o atendimento odontológico o material utilizado se apresenta
contaminado e que a imersão deste material em solução de ácido peracético na
concentração de 2500 ppm por 20 minutos promoveu sua completa esterilização em
todas as coletas efetuadas, comprovando sua eficácia na esterilização desses
materiais. Pode ser observado, ainda, que em uma coleta o material antes da
esterilização não apresentou microrganismos, sendo desconhecido o fator que
causou tal resultado. Possivelmente a lavagem prévia do material tenha sido
efetuada de maneira eficiente, retirando o biofilme formado e demais sujidades,
deixando o material com alto nível de limpeza.
64
Tabela 9: Contagem de colônias de MO antes e após esterilização em consultório
público.
Coleta 1
09/05/06
Nº
colônias
antes
Nº
colônias
depois
Coleta 2
09/05/06
Nº
colônias
antes
Nº
colônias
depois
Coleta 3
09/05/06
Nº
colônias
antes
Nº
colônias
depois
Amostra1 10 00 07 00 06 00
Amostra 2 03 00 02 00 05 00
Amostra 3 06 00 05 00 07 00
Coleta 1
12/05/06
Coleta 2
12/05/06
Coleta 3
12/05/06
Amostra1 03 00 10 00 22 00
Amostra2 05 00 07 00 07 00
Amostra3 00 00 15 00 12 00
Coleta 1
16/05/06
Coleta 2
16/05/06
Coleta 3
16/05/06
Amostra1 02 00 02 00 00 00
Amostra2 01 00 05 00 01 00
Amostra3 00 00 10 00 03 00
Coleta 1
18/05/06
Coleta 2
18/05/06
Coleta 3
18/05/06
Amostra1 02 00 17 00 07 00
Amostra2 05 00 13 00 05 00
Amostra3 00 00 08 00 11 00
Coleta 1
22/05/06
Coleta 2
22/05/06
Coleta 3
22/05/06
Amostra1 10 00 10 00 02 00
Amostra2 18 00 00 00 01 00
Amostra3 15 00 05 00 05 00
Coleta 1
25/05/06
Coleta 2
25/05/06
Coleta 3
25/05/06
Amostra1 33 00 25 00 14 00
Continua =>
65
Amostra2 17 00 10 00 12 00
Amostra3 11 00 15 00 07 00
Coleta 1
31/05/06
Coleta 2
31/05/06
Coleta 3
31/05/06
Amostra1 23 00 09 00 14 00
Amostra2 40 00 00 00 21 00
Amostra3 18 00 12 00 06 00
Coleta 1
02/06/06
Coleta 2
02/06/06
Coleta 3
02/06/06
Amostra1 00 00 03 00 12 00
Amostra2 00 00 15 00 17 00
Amostra3 00 00 09 00 07 00
Na Tabela 10 são apresentados os resultados de 24 amostras em BHI
antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm
em material odontológico contaminado na unidade de saúde 24 hs Próspera-
Criciúma S/C.
Continuação
66
Tabela 10: Resultados do crescimento microbiano das amostras em BHI.
Coleta 1
09/05/06
Turvou Não
turvou
Coleta 2
09/05/06
Turvou Não
turvou
Coleta 3
09/05/06
Turvou
Não
turvou
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
12/05/06
Coleta 2
12/05/06
Coleta 3
12/05/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
16/05/06
Coleta 2
16/05/06
Coleta 3
16/05/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
18/05/06
Coleta 2
18/05/06
Coleta 3
18/05/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
22/05/06
Coleta 2
22/05/06
Coleta 3
22/05/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
25/05/06
Coleta 2
25/05/06
Coleta 3
25/05/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
31/05/06
Coleta 2
31/05/06
Coleta 3
31/05/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
02/06/06
Coleta 2
02/06/06
Coleta 3
02/06/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
67
Na Tabela 10 observa-se claramente que o material, antes da exposição
ao ácido peracético na concentração de 2500 ppm, estava contaminado. Os dados
contidos na tabela 10 ratificam os resultados apresentados na tabela 09 mostrando a
eficácia da esterilização do ácido peracético na concentração de 2500 ppm nas
amostras coletadas em BHI, onde se verifica a ausência total de crescimento
bacteriano após a esterilização do material.
Na Tabela 11 observa-se a ação bactericida do ácido peracético na
concentração de 2500 ppm no consultório odontológico localizado na rua Coronel
Pedro Bennedet 226/306 - Criciúma S/C. O tempo de exposição ao produto foi de 20
minutos. Os resultados da análise bactericida no consultório odontológico particular
são semelhantes aos do consultório público comprovando a efetividade da
esterilização do ácido peracético, obtendo-se um resultado absoluto de esterilização.
Tabela 11: Contagem das colônias de microrganismos antes e após a esterilização
no consultório particular.
Coleta 1
27/06/06
Nº
colônias
antes
Nº
colônias
depois
Coleta 2
27/06/06
Nº
colônias
antes
Nº
colônias
depois
Coleta 3
27/06/06
Nº
colônias
antes
Nº
colônias
depois
Amostra 1 03 00 03 00 05 00
Amostra 2 02 00 01 00 03 00
Amostra 3 01 00 02 00 07 00
Coleta 1
03/07/06
Coleta 2
03/07/06
Coleta 3
03/07/06
Amostra 1 07 00 03 00 04 00
Amostra 2 12 00 00 00 03 00
Amostra 3 05 00 05 00 03 00
Coleta 1
05/07/06
Coleta 2
05/07/06
Coleta 3
05/07/06
Amostra 1 00 00 05 00 12 00
Continua =>
68
Amostra 2 00 00 07 00 23 00
Amostra 3 00 00 00 00 17 00
Coleta 1
10/07/06
Coleta 2
10/07/06
Coleta 3
10/07/06
Amostra 1 22 00 13 00 22 00
Amostra 2 14 00 16 00 17 00
Amostra 3 03 00 11 00 05 00
Coleta 1
13/07/06
Coleta 2
13/07/06
Coleta 3
13/07/06
Amostra 1 00 00 09 00 17 00
Amostra 2 05 00 12 00 21 00
Amostra 3 02 00 17 00 15 00
Coleta 1
20/07/06
Coleta 2
20/07/06
Coleta 3
20/07/06
Amostra 1 30 00 00 00 13 00
Amostra 2 22 00 00 00 22 00
Amostra 3 17 00 00 00 09 00
Coleta 1
27/07/06
Coleta 2
27/07/06
Coleta 3
27/07/06
Amostra 1 07 00 32 00 19 00
Amostra 2 15 00 34 00 05 01
Amostra 3 31 00 45 00 08 00
Coleta 1
13/09/06
Coleta 2
13/09/06
Coleta 3
13/09/06
Amostra 1 44 00 21 00 08 00
Amostra 2 32 00 13 00 09 00
Amostra 3 23 00 17 00 06 00
No dia 27/07/06 houve o crescimento de uma colônia bacteriana após a
esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500ppm, que pode ter
Continuação
69
ocorrido por contaminação durante o experimento, portanto essa amostra foi
desprezada.
Na Tabela 12 são apresentados os resultados de 24 amostras em BHI
antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm
em material odontológico contaminado localizado na Rua Coronel Pedro Bennedet
226/306.
Tabela 12: Resultados das amostras recolhidas em BHI
Coleta 1
27/06/06
Turvou
Não
Turvou
Coleta 2
27/06/06
Turvou
Não
Turvou
Coleta 3
27/06/06
Turvou
Não
Turvou
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
03/07/06
Coleta 2
03/07/06
Coleta 3
03/07/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
05/07/06
Coleta 2
05/07/06
Coleta 3
05/07/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
10/07/06
Coleta 2
10/07/06
Coleta 3
10/07/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
13/07/06
Coleta 2
13/07/06
Coleta 3
13/07/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 2
20/07/06
Coleta 2
20/07/06
Coleta 2
20/07/06
Antes x Antes x Antes x
Continua =>
70
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
27/07/06
Coleta 2
27/07/06
Coleta 3
27/07/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
Coleta 1
13/09/06
Coleta 2
13/09/06
Coleta 3
13/09/06
Antes x Antes x Antes x
Depois x Depois x Depois x
A Tabela 12 ratifica os resultados observados na tabela 11, demonstrando
a eficiência na esterilização do ácido peracético na concentração de 2500 ppm em
materiais odontológicos contaminados, após o atendimento clínico. Na coleta
efetuada no dia 20/07/2006 não houve turvamento da segunda amostra (antes e
após a esterilização).
Continuação
71
6 CONCLUSÃO
Durante os testes efetuados a esterilização foi efetiva em todas as
amostras utilizando o ácido peracético na concentração de 2500 ppm/ml.
A técnica de preparo da solução de PAA é simples e não surgiram
dificuldades durante o manuseio; Um ponto negativo observado durante o preparo é
o tempo de diluição de cinco minutos do pó gerador.
Uma vantagem a ser apontada neste processo é a esterilização de
materiais termo-sensíveis.
O tempo de esterilização é inferior ao da estufa e de autoclave. Em 20
minutos observou-se ausência total de crescimento de microrganismos nos materiais
odontológicos contaminados.
As pessoas que usaram o ácido peracético 2500 ppm na esterilização do
material observaram que o mesmo apresentava manchas escuras que são
características de corrosão.
O teste de citotoxicidade apresentou alterações significativas nas
concentrações de 1500 ppm e 2500 ppm. No entanto, os resíduos do PAA que
podem permanecer sobre instrumentais esterilizados são o H
2
O
2
e ácido acético,
portanto, não representam risco.
O resultado de citotoxididade e genotoxicidade indicam a necessidade do
uso de EPI (equipamentos de proteção individual) por parte do usuário.
Procedimento que inclusive já faz parte dos procedimentos habituais em consultórios
odontológicos.
72
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