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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
IDENTIFICAÇÃO DE HEMOPARASITOS E CARRAPATOS DE
CÃES PROCEDENTES DO CENTRO DE CONTROLE DE
ZOONOSES DE CAMPO GRANDE ESTADO DE MATO
GROSSO DO SUL, BRASIL
FABIANA PESSOA SALGADO
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL - BRASIL
FEVEREIRO DE 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
IDENTIFICAÇÃO DE HEMOPARASITOS E CARRAPATOS DE
CÃES PROCEDENTES DO CENTRO DE CONTROLE DE
ZOONOSES DE CAMPO GRANDE ESTADO DE MATO
GROSSO DO SUL, BRASIL
FABIANA PESSOA SALGADO
Orientador: Prof. Dr. Michael Robin Honer
Co-orientadora: Dra. Márcia Mayumi Ishikawa
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul, como
requisito à obtenção do título de Mestre
em Ciência Animal. Área concentração:
Saúde Animal.
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL - BRASIL
FEVEREIRO DE 2006
... sábio não é aquele que proclama
palavras de sabedoria, mas sim aquele que
demonstra sabedoria em seus atos.
São Gregório
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por ser a luz do meu caminho.
Ao meu querido esposo Wendell, por todo o seu amor, companheirismo, sua
compreensão, cumplicidade, confiança e pelo apoio durante todos os dias e noites
dedicados à pesquisa científica.
Aos meus pais João e Floripes, pelo amor incondicional de vocês e por estarem
sempre ao meu lado nos momentos de alegria e angústia.
Aos meus sogros, Damasia e Marcio, pela força, pelo apoio e incentivo constante
para a concretização deste trabalho.
Às minhas irmãs, Jislene e Silvia, minha cunhada Karla, meus cunhados Décio,
José Roberto e Fernando, pelo companheirismo e apoio irrestrito.
À Marta e Otalina pelo carinho e pela atenção nas mais diferentes situações.
Ao Prof. Dr. Michael Robin Honer, que dividiu o seu profundo conhecimento e sua
sabedoria, transmitindo orientações adequadas para a realização deste trabalho.
À Dra. Márcia Mayumi Ishikawa, pelo incentivo constante desde o ingresso no
mestrado e pela confiança e amizade de todas as horas.
À Profa. M.Sc. Josephina Montanari Rosa Rangel, pelas horas dedicadas no
laboratório.
Ao Dr. Cleber Oliveira Soares, por sua importante colaboração.
Ao Dr. Leonardo Rigo, pelo seu tempo e sua dedicação.
À M.Sc. Cristina Pires de Araújo, pela amizade sincera de todos os momentos e
pelo apoio durante todo o mestrado.
À M.Sc. Renata Madureira, pelo apoio ao trabalho e pela forma amiga que me
recebeu.
iii
Aos médicos-veterinários do CCZ que gentilmente possibilitaram a coleta de
amostras necessárias para a realização deste trabalho.
À Marilete Otaño Peixoto Ferescz, pela paciência e amizade.
À Lúcia Terezinha Restel Silva, pela ajuda no laboratório.
À acadêmica Fabiana Aguena Sales Lapa, pelo auxílio na parte prática do trabalho.
À Profa. Dra. Maria da Graça Moraes, Coordenadora do Curso de Mestrado em
Ciência Animal, pela dedicação oferecida a este curso.
À Fundação de Apoio ao Desenvolvimento de Ensino, Ciência e Tecnologia do MS
(FUNDECT), pela concessão de apoio financeiro.
iv
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 6
1.1HEMOPARASITOS E CARRAPATOS .......................................................................... 7
1.1.1Babesia canis .................................................................................................................. 7
1.1.2Ehrlichia canis ................................................................................................................ 9
1.1.3Hepatozoon canis ......................................................................................................... 11
1.1.4Borrelia burgdorferi lato sensu ..................................................................................... 13
1.1.5Carrapatos .................................................................................................................... 16
PRIMEIRO ARTIGO ........................................................................................................... 18
SEGUNDO ARTIGO ........................................................................................................... 29
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 30
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 32
RESULTADOS .................................................................................................................... 34
DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 38
CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 41
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 41
2CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 44
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 45
ANEXOS .............................................................................................................................. 52
v
1 INTRODUÇÃO
As hemoparasitoses caninas são moléstias causadas por patógenos que são
transmitidos por vetores hematófagos (Hoskins 1991). Encontradas com grande freqüência
no cotidiano médico-veterinário (Almosny 1998), e são responsáveis por manifestações
clínicas variáveis, que podem determinar óbito (O’Dwyer 2000).
No Brasil, os hemoparasitos encontrados nos cães são Babesia canis (O´Dwyer
1996), Ehrlichia canis (Costa et al. 1973) e Hepatozoon canis (Massard 1979), e todos têm
como vetor o carrapato da espécie Rhipicephalus sanguineus (O´Dwyer 2000).
Outras espécies de carrapatos podem ser encontradas parasitando os cães, tais como
do grupo ovale (Amblyomma ovale, Amblyomma aureolatum e Amblyomma tigrinum) e
por Ambyomma cajennense (Rodrigues et al. 2001). No entanto, a ocorrência de diferentes
espécies em diversas localidades é resultante das características epidemiológicas
particulares de cada região (O’Dwyer et al. 2004).
Atualmente, algumas zoonoses emergentes têm sido diagnosticadas, e muitas destas
possuem sua transmissão relacionada com carrapatos, como a febre maculosa causada por
Rickettsia rickettsii, e a doença de Lyme causada pela espiroqueta Borrelia burgdorferi.
Portanto, a participação do cão na transmissão desses patógenos ainda não está muito bem
esclarecida e precisa ser melhor estudada (Figueiredo et al. 1999, Labruna & Pereira 2001).
O cão doméstico é o principal animal de estimação, convivendo em íntimo contato
com seres humanos, com isso a saúde desses animais deve ser avaliada para que não
sirvam de reservatórios de patógenos e ectoparasitos aos homens.
A cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, apresenta alguns fatores que
favorecem o aparecimento de hemoparasitoses e carrapatos nos cães, tais como: condições
climáticas favoráveis ao desenvolvimento de carrapatos, diversidade de espécies de vetores
e a proximidade de animais silvestres e domésticos com o homem.
Este trabalho teve como objetivos identificar os principais hemoparasitos e
carrapatos encontrados nos cães atendidos no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ),
relacionar a ocorrência de hemoparasitos com as espécies de carrapatos identificadas, obter
dados epidemiológicos de cada enfermidade e pesquisar a ocorrência de anticorpos anti-
Borrelia burgdorferi no soro desses cães, com a técnica do ensaio de imunoadsorção
enzimático (ELISA) indireto.
1.1 HEMOPARASITOS E CARRAPATOS
1.1.1 Babesia canis
Babesia canis pertence à ordem Piroplasmida, família Babesiidae e ao gênero
Babesia (Levine 1971). Encontra-se no interior de eritrócitos na forma de trofozoítos, que
na maioria das vezes são piriformes e podem apresentar um vacúolo no citoplasma da
célula. Também é freqüente o encontro de formas livres no plasma (O’Dwyer 1996).
Babesia canis é um protozoário que parasita eritrócitos (Irwin 2002, Matjila et al.
2004) e foi descrita pela primeira vez por Piana & Galli-Valerio, em 1895, na Itália. A
doença provocada nos cães era conhecida como Malignant jaundice e Malignant malarial
fever. A partir da primeira descrição, B. canis foi observada na Europa, África, Ásia, Índia,
América do Norte e América do Sul, sempre acometendo canídeos (O’Dwyer 1996).
Atualmente existem três subespécies reconhecidas desse hemoparasito, que variam
com base na distribuição geográfica, especificidade do vetor e propriedades antigênicas
(Uilenberg et al. 1989). Babesia canis canis é transmitido pelo carrapato Dermacentor
reticulatus, Babesia canis vogeli por Rhipicephalus sanguineus e a Babesia canis rossi por
Haemaphysalis leachi (Schetters et al. 1997, Matjila et al. 2004).
Apesar da ocorrência de diferentes subespécies, a espécie encontrada no Brasil
continua sendo chamada apenas de B. canis, pois inexistem estudos que a tenham
caracterizado geneticamente (Bicalho et al. 2002).
7
A transmissão da babesia dá-se pela inoculação de esporozoítos infectantes
(O’Dwyer & Massard 2002), que são inoculados no vertebrado durante o repasto
sanguíneo dos carrapatos (Mehlhorn et al. 1980). No hospedeiro vertebrado ocorre
reprodução assexuada por divisão binária no interior dos eritrócitos (Kakoma & Mehlhorn
1994).
No carrapato, após reprodução sexuada no intestino do vetor, são formados os
esporocinetos que se dirigem aos diversos órgãos do carrapato, inclusive ovário e glândula
salivar (O’Dwyer 2000). A capacidade de transmissão transestadial e transovariana do
agente permite a sua perpetuação que torna o carrapato infectante por várias gerações
(Taboada 1998).
A patogenia da doença causada por esse protozoário está relacionada com a
hemólise intravascular e extravascular (O’Dwyer 2000). A gravidade das manifestações
clínicas está associada à patogenicidade da cepa de Babesia, à intensidade da parasitemia,
à resposta imune e à idade do hospedeiro (Martinod et al. 1986).
Os sinais clínicos variam de doenças subclínicas até hiperagudas, e os cães jovens
são mais sensíveis e freqüentemente apresentam as formas mais graves da doença
(Breitschwerdt 1993).
O diagnóstico dessa hemoparasitose pode ser feito pelo encontro dos parasitos
durante o exame de esfregaços sanguíneos (O’Dwyer & Massard 2002). A técnica do
esfregaço sanguíneo, obtido da ponta da orelha de cães e corado por colorações do tipo
Giemsa, aumenta a chance de evidenciar eritrócitos parasitados (Brandão & Hagiwara
2002). Nesse caso, a positividade ocorre nos casos agudos com parasitemia elevada. Já,
nos casos crônicos da doença são necessárias técnicas mais sensíveis como as
imunológicas para o seu diagnóstico (Yamane et al. 1993). Os testes sorológicos,
empregados para diagnóstico de anticorpos anti-Babesia canis, são o teste de
imunofluorescência indireta (IFI) e o ELISA (Ribeiro et al. 1990).
O emprego de técnicas de biologia molecular, como a reação de polimerase em
cadeia (PCR) tem sido empregada para detectar e caracterizar infecções por B. canis
(Caccio et al. 2002, Birkenheuer et al. 2003), pois permite a identificação do material
genético do parasita em praticamente qualquer material biológico (Brandão & Hagiwara 2002).
8
1.1.2 Ehrlichia canis
Ehrlichia canis pertence à ordem Rickettsiales, família Ehrlichiaceae e ao gênero
Ehrlichia (Levine 1971). Essa bactéria é encontrada no interior dos leucócitos circulantes,
formando aglomerados de corpúsculos elementares chamados de mórulas (Andereg &
Passos 1999).
Segundo Bulla et al. (2004), a bactéria poderá ser encontrada isolada, em colônias
compactas, formando mórulas em leucócitos mononucleares.
Ehrlichia canis é uma bactéria gram-negativa intracitoplasmática que infecta
leucócitos (Morais et al. 2004) e é responsável pela erlichiose monocítica canina
(Rodriguez-Vivas et al. 2005). Tem distribuição mundial (Dagnone et al. 2003), porém os
casos concentram-se mais nas regiões tropicais e subtropicais por causa da sua distribuição
geográfica estar relacionada com a distribuição de seu vetor, o carrapato Rhipicephalus
sanguineus (Andereg & Passos 1999).
A erlichiose canina foi descrita pela primeira vez na Algéria em 1935 por Donatien
& Lestoquard (Oliveira et al. 2000), que observaram organismos nas células
mononucleares circulantes de cães infestados por carrapatos e denominaram-na de
Rickettsia canis.
Em 1945, Moshkovski renomeou o organismo como Ehrlichia canis em
homenagem a Paul Ehrlich (McDade 1990). No final de 1968 e início de 1969, durante a
guerra do Vietnã, teve importância significativa quando cães militares da Inglaterra e dos
Estados Unidos foram acometidos de uma doença hemorrágica severa de princípio
inesperado e de etiologia desconhecida. Essa doença recebeu vários nomes, como febre
hemorrágica canina, síndrome hemorrágica idiopática, doença do cão rastejador e
pancitopenia tropical canina (Huxsoll 1976).
O papel de E. canis como Rickettsia significativamente patogênica veio à luz no
final da década de 1960, quando ficou estabelecido que ela era o agente etiológico da
pancitopenia tropical canina (Huxsoll et al. 1969). O surto de erlichiose entre os cães
militares estimulou novo interesse por E. canis e deu novo entusiasmo para mais profundas
investigações sobre o agente e a doença (Huxsoll 1976).
9
No Brasil, a doença foi relatada por Costa et al. em 1973 na cidade de Belo
Horizonte, Minas Gerais (Moreira et al. 2003) e posteriormente por Carrilo et al. em 1976
no Rio de Janeiro. Atualmente são diagnosticados casos por todo o território nacional
(Almosny 1998) e tem sido um achado freqüente em animais doentes, examinados em
clínicas e hospitais veterinários de vários estados (O’Dwyer 2000).
Por meio de um levantamento sorológico realizado em vários estados brasileiros,
foram encontrados aproximadamente 20% (2.551) dos cães apresentando anticorpos contra
E. canis (Labarthe et al. 2003).
Rhipicephalus sanguineus adquire E. canis quando se alimenta em cães infectados
principalmente durante a fase aguda da doença (Swango et al. 1989). Entre os carrapatos
ocorre a transmissão por via transestadial e intraestadial (Bremer et al. 2005), mas não
transovariana (Hoskins 1991), e são capazes de transmitir a bactéria principalmente nas
fases de ninfa e adulto durante 155 dias (Andereg & Passos 1999). Estudos recentes
demonstraram que os carrapatos machos de R. sanguineus podem adquirir e transmitir E.
canis na ausência dos carrapatos fêmeas (Bremer et al. 2005).
A infecção nos cães ocorre durante o repasto sanguíneo dos carrapatos infectados
(McDade 1990), onde os corpos elementares, que são formas individuais de E. canis,
penetram nos monócitos por fagocitose e a replicação ocorre por divisão binária. No
intervalo de três a cinco dias após a infecção, pequenos números de estruturas compactas
formadas por corpos elementares são observados como inclusões pleomórficas, que são os
corpúsculos iniciais. Durante os próximos sete a doze dias, esses corpúsculos se
desenvolvem no interior da inclusão madura e apresentam a forma de mórula, que é
característica desse gênero (Swango et al. 1989). Há relatos de transmissão da bactéria por
meio de transfusão sanguínea (Andereg & Passos 1999).
As manifestações clínicas ocorrem após o período de incubação de oito a vinte dias
e podem apresentar três distintas fases de infecção: aguda, subclínica e crônica (Moreira et
al. 2003). Na fase aguda, títulos negativos podem ocorrer durante a fase inicial da doença e
a gravidade dos sinais varia entre os animais (Almosny 1998). Atualmente, a maioria dos
cães sobrevive à fase aguda e ingressa na fase crônica (Almosny & Massard 2002).
Durante a fase subclínica, os sinais clínicos desaparecem e os cães apresentam-se
10
assintomáticos. Cães imunocompetentes podem eliminar a bactéria e não entrar na fase
crônica, enquanto aqueles sem resposta imune efetiva tornam-se doentes crônicos
(Andereg & Passos 1999). Já na fase crônica, ela apresenta características de doença
imunomediada (Harrus et al. 1998), com exposição a freqüentes infecções secundárias
(Moreira et al. 2003).
A erlichiose é uma doença de diagnóstico clínico difícil em virtude da
inespecificidade e variabilidade dos sinais que apresenta (Morais et al. 2004, Oriá et al.
2004) e requer um diagnóstico rápido, para iniciar uma terapia apropriada que favorecerá o
prognóstico (Skotarczak 2003).
A pesquisa de mórulas em esfregaços de sangue periférico ou em exame da capa
leucocitária é um meio de diagnóstico de baixo custo, rápido e que pode dar uma resposta
precoce no curso da doença (Bulla et al. 2004), a fim de se detectar a forma subclínica e
tratar os animais positivos antes da manifestação clínica (Munhóz & Babo 1998).
Também são utilizados testes sorológicos e moleculares (Almosny 1998), como a
imunofluorescência indireta (IFI), Dot-ELISA, ELISA, imunoblot e a reação de polimerase
em cadeia (PCR) (Babo-Terra 2004).
Existem alguns relatos na literatura de que E. canis causa infecção em humanos
(Rikihisa 2005), com casos de óbitos principalmente em crianças e idosos, e é considerada
uma zoonose.
1.1.3 Hepatozoon canis
Hepatozonn canis pertence à ordem Eucoccidiida, família Hepatozoidae e ao
gênero Hepatozoon (Levine 1971) e acomete principalmente os carnívoros domésticos
(Alencar et. al. 1997).
Hepatozoon canis é um protozoário que parasita leucócitos e tecidos
parenquimatosos (Baneth et al. 1998) e foi observado pela primeira vez por Bentley, em
1904, na Índia e descrito por James em 1905 (O’Dwyer 2000). A partir das primeiras
descrições, H. canis tem sido observado em várias regiões do mundo (Baneth et al. 1998)
11
como África, Europa, Estados Unidos e Ásia (Kiral et al. 2005).
No Brasil, H. canis foi diagnosticado em diversos estados, incluindo Espírito Santo
e Rio Grande do Sul (Massard 1979), Minas Gerais (Mundim et al. 1992), São Paulo
(Gondim et al. 1998) e Rio de Janeiro (O’Dwyer et al. 2001).
Os carrapatos R. sanguineus e Amblyomma spp. são os principais vetores da doença
dos cães na América do Sul (O’Dwyer & Massard 2001). Esses carrapatos infectam-se ao
ingerir sangue de cães contendo isogametas no interior de neutrófilos e monócitos. Ocorre
a formação do oocineto no tubo digestivo e posteriormente atravessa a parede intestinal,
caindo na hemocele do carrapato e se transformando em oocisto, onde não há migração
para a glândula salivar (Forlano 2005).
A transmissão de H. canis para os cães ocorre após a ingestão de carrapatos
contendo oocistos esporulados na sua hemocele (Aguiar et al. 2004). Nos cães esse
protozoário apresenta uma fase sanguínea observada em neutrófilos e monócitos e uma
fase tecidual principalmente no baço, linfonodos, fígado, medula óssea, pulmões e
músculos (Baneth et al. 1998, Forlano 2002).
Os gamontes, que são as formas sexuadas mantenedoras do material genético
masculino e feminino, não mostram nenhum dimorfismo sexual aparente nem sofrem
mudança adicional até que estes sejam ingeridos pelos carrapatos; por isso são chamados
de isogametas (Forlano 2005).
Além da transmissão horizontal por carrapatos, Murata et al. (1993) no Japão
observaram a transmissão congênita desse protozoário em 79,3% (29) dos cães neonatos,
em que as cadelas eram portadoras de H. canis, e os filhotes, mesmo em condições livres
de carrapatos, apresentaram esse hemoparasito.
A patogenicidade de H. canis tem sido questionada por alguns autores que citam a
presença de isogametas em neutrófilos de cães aparentemente saudáveis (Baneth et al.
2003). Contudo, infecções severas têm sido descritas em cães e o nível de parasitemia
apresenta correlação com a severidade da doença (Baneth & Weigler 1997).
Fatores como a presença do agente, idade e imunossupressão induzem infecções
simultâneas (erlichioses, leishmanioses e parvovírus), que são importantes para o
12
desenvolvimento dos sintomas da doença (Baneth et al. 2003).
O diagnóstico de H. canis baseia-se no encontro de isogametas em esfregaços de
sangue periférico (O’Dwyer & Massard 2001). A sorologia tem sido realizada por meio de
testes como imunofluorescência indireta, Western blotting e ELISA, que são métodos
sensíveis e apresentam alta especificidade para detectar anticorpos de H. canis (Forlano
2005).
1.1.4 Borrelia burgdorferi lato sensu
Borrelia burgdorferi pertence ao membro da ordem Spirochaetales, família
Spirochaetaceae, gênero Borrelia (Pfister et al. 1994) e tem como vetores os carrapatos
ixodídeos (Alves et al. 2004). Essa bactéria se reproduz por divisão binária transversal e
são microaerófilas (Soares et al. 2000).
Borrelia burgdorferi lato sensu é uma espiroqueta responsável pela borreliose de
Lyme que acomete animais e seres humanos (Levy & Dreesen 1992), e é considerada uma
zoonose cosmopolita (Straubinger 2000, Costa et al. 2002, Alves et al. 2004).
O agente etiológico no Brasil ainda não foi isolado, e os prováveis carrapatos
responsáveis pelo ciclo silvestre pertencem ao gênero Ixodes, enquanto o gênero
Amblyomma estaria implicado na transmissão para animais domésticos e seres humanos
(Yoshinari et al. 2003).
A doença de Lyme foi inicialmente reconhecida em 1975 nos Estados Unidos em
crianças na comunidade de Lyme. Em 1982, Burgdorfer e Barbour isolaram espiroquetas
de carrapatos ixodídeos e o agente passou a se chamar Borrelia burgdorferi (Ishikawa
1996).
A doença de Lyme foi inicialmente reconhecida nos Estados Unidos em 1975, na
comunidade de Lyme, em um grupo de crianças apresentando sintomas similares à Artrite
Reumatóide Juvenil. O agente do gênero das Borrelias passou a se chamar Borrelia
burgdorferi em homenagem à Burgdorfer que primeiro descreveu o agente nos vetores
(Johnson et al. 1984).
13
No Brasil, Yoshinari et. al. (1989), publicaram o primeiro artigo sobre revisão da
borreliose de Lyme. Casos clínicos e epidemiológicos foram identificados, embora o
agente não tenha sido isolado (Costa et al. 2002). O primeiro caso de meningite de Lyme
noBrasil foi descrito em Campo Grande, Mato Grosso do Sul (Costa et.al., 1996).
O primeiro caso de meningite de Lyme no Brasil foi descrito em Mato Grosso do
Sul em 1996, assim como a descrição de outros casos da doença nessa região (Costa et al.
1996).
A primeira descrição da doença em cães foi feita por Lissman et al. (1984) nos
Estados Unidos em um cão da raça Dobermann que apresentava sinais de artrite severa e
claudicação. Posteriormente, Burgess (1986) isolou espiroquetas de cães clinicamente
sadios e sugeriu serem esses animais os potenciais reservatórios para B. burgdorferi.
Nos carrapatos pode ocorrer transmissão transovariana e transestadial (Soares et al.
2000). A transmissão para os cães ocorre pela picada de carrapatos infectados do gênero
Ixodes, principalmente as espécies Ixodes scapularis, Ixodes persulcatus, Ixodes pacificus
e Ixodes ricinus, porém Dermacentor variabilis e A. americanum também transmitem
(Mather et al. 1994).
A bactéria geralmente habita o terço médio do intestino do carrapato, migrando na
maioria das vezes para as suas glândulas coxais e é injetada juntamente com a saliva
quando este parasita um mamífero (Singh & Girschick 2004).
Na literatura são citados outros meios de transmissão, como pela urina entre
roedores, por transfusão sanguínea, transplante de tecido, por contato ou congenitamente
em cães (Burgess 1986).
Nos cães, a infecção é usualmente assintomática (Straubinger 2000), mas podem
ser observados sinais envolvendo o sistema músculoesquelético, com quadro de artrite
progressiva (Lissman et al. 1984, Kornblatt et al. 1985, Wiebe 1995). Ocorre raramente
lesão de pele com eritema no local da picada (Appel 1990).
Em humanos, a principal manifestação clínica é o eritema migratório recidivante.
Essa lesão está relacionada com a picada do carrapato vetor (Fonseca et al. 2005). Costa et
al. (2001) realizaram um estudo clínico e laboratorial em 16 pacientes sororreagentes para
14
B. burgdorferi no Estado de Mato Grosso do Sul, e apenas 25% deles afirmaram ter sido
picados por carrapatos, mas todos mantinham cães em casa, que já estiveram ou estavam
infestados por carrapatos.
Podem ocorrer também manifestações articulares, neurológicas e cardíacas
(Fonseca et al. 2005). Incluem as oligoartrites ou poliartrites de pequenas e grandes
articulações, queixas cardiológicas como bloqueio atrioventricular e as neurológicas como
meningite, polineurite e distúrbios cognitivos (Costa et al. 2001).
A infecção no Brasil deve ser referida como borreliose de Lyme simile, pois
existem diferenças etiológicas, clínicas e laboratoriais, quando comparada com a borreliose
de Lyme norte-americana ou européia (Fonseca et al. 2005).
Em 2005, Yoshinari et al. consideraram que as manifestações clínicas e sorológicas
até então descritas no Brasil constituíam uma síndrome clínica que exibiria aspectos
clínicos compatíveis aos de infecções e enfermidades reacionais, cujas manifestações
clínicas eram semelhantes ás encontradas na doença de Lyme. Seria transmitida por
carrapatos e causada por microorganismos “latentes” constituídos de Mycoplasmas,
Chlamídias e espiroquetas, observados laboratorialmente (Gauditano et al. 2005). Por esta
razão, propôs-se as denominações de Síndrome de Lyme símile ou Complexo infecto-
reacional do carrapato ou Síndrome de Baggio-Yoshinari (Eskow et al. 2003).
Estudos soroepidemiológicos têm sido conduzidos mundialmente para
determinação da prevalência de anticorpos contra B. burgdorferi lato sensu em cães e da
importância desses animais na epidemiologia dessa doença (O’Dwyer 2000).
Atualmente, cães podem atuar como sentinela epidemiológica, albergando a
espiroqueta, comportando-se como reservatório no ambiente domiciliar, favorecendo,
assim, ao carrapato veicular o patógeno até o homem e outros animais (Appel 1990,
Mather et al. 1994).
A borreliose de Lyme pode ser diagnosticada por meio de alguns fatores como a
sintomatologia clínica, epidemiologia e a sorologia (Madureira 2004).
O diagnóstico mais empregado e reconhecido para identificar anticorpos anti-
Borrelia sp. com segurança é o ELISA indireto (Gordillo et al. 1999). No entanto, os
15
ensaios devem ser estabelecidos para cada laboratório com os padrões de controle
adequados, com título mínimo e linha de corte (cut-off) seguros.
Reações cruzadas entre Borrelia sp. e Leptospira sp. têm sido relatadas embora não
significativas. Joppert et al. (2001) sugerem ausência de reatividade sorológica cruzada
entre essas duas enfermidades.
O Western Blotting tem sido usado secundarimente para definição do resultado, em
casos de dúvida no método ELISA. A dificuldade do imunoblotting é a obtenção do padrão
positivo ideal (“good standard”) pelos laboratórios (Tugwell et al. 1997).
A técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) tem sido muito utilizada para
identificação de Borrelia sp. nos animais e fragmentos de carrapatos (Madureira 2004),
entretanto é uma prova bastante onerosa.
1.1.5 Carrapatos
Muitas enfermidades transmitidas por carrapatos podem acometer animais
silvestres, domésticos e seres humanos (Massard & Fonseca 2004). Apresentam uma
diversidade de vírus, bactérias, protozoários, fungos e nematódeos que produzem uma ação
irritante e espoliativa sobre o hospedeiro (Torres et al. 2004).
A distribuição geográfica dos carrapatos é bastante ampla e pode estar presente nos
animais domésticos, nos gramados das residências, bem como em regiões de florestas ou
matas, nos animais silvestres ou domesticados, como bovinos e eqüinos (Costa et al. 2001).
A intensa atividade agropecuária no Brasil, o convívio do homem com animais
domésticos e a valorização de atividades ao ar livre favorecem a disseminação de agentes
infecciosos transmitidos por carrapatos, propicia o surgimento e o ressurgimento de
diferentes agentes etiológicos (Massard & Fonseca 2004).
No Brasil, há relatos de várias espécies de carrapatos que parasitam os cães
(Labruna & Pereira 2001). Esse parasitismo tem grande importância médica e veterinária,
pois pode transmitir uma variedade de agentes patogênicos tanto para o homem como para
os animais (Ribeiro et al. 1997).
16
A espécie mais associada ao cão principalmente em áreas urbanas e periurbanas é o
carrapato R. sanguineus (Flechtmann 1990). Em áreas rurais, os cães são parasitados
principalmente por carrapatos do grupo ovale (A. ovale, A. aureolatum e A. tigrinum.) e
por A. cajennense (Ribeiro et al. 1997).
Amblyomma cajennense pode desempenhar um papel importante na transmissão do
agente causador da doença de Lyme para cães e também para seres humanos (Massard et
al. 1981).
Harrison et al. (1997) demonstraram que R. sanguineus, principalmente as suas
formas imaturas, alimentam-se em humanos mais freqüentemente do que previamente se
supunha. Assim, por se desenvolver em ambientes sinantrópicos, de várias cidades do
Brasil, onde ocorrem altas densidades e prevalências, esse carrapato poderá vir a causar um
aumento na incidência de erlichiose, babesiose e febre maculosa, como antropozoonoses
emergentes (Fernandes 2000).
17
PRIMEIRO ARTIGO
HEMOPARASITOS E CARRAPATOS EM CÃES PROCEDENTES DO CENTRO DE
CONTROLE DE ZOONOSES DE CAMPO GRANDE, ESTADO DE MATO GROSSO
DO SUL, BRASIL
HEMOPARASITES AND TICKS OF DOGS ORIGINATE FROM THE CENTER FOR
ZOONOSIS CONTROL OF CAMPO GRANDE IN MATO GROSSO DO SUL STATE,
BRAZIL
Fabiana Pessoa Salgado
1
, Michael Robin Honer
2
, Márcia Mayumi Ishikawa
3
, Cleber Oliveira
Soares
4
, Josephina Montanari Rosa Rangel
5
, Leonardo Rigo
6
e Fabiana Aguena Sales Lapa
7
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo identificar hemoparasitos e carrapatos de cães
atendidos no Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do
Sul. Foram realizados esfregaços de sangue periférico e venoso de 167 cães procedentes de
várias regiões desse município. Do total de animais examinados, 62,28% apresentaram
resultados positivos para hemoparasitos, e Babesia canis foi encontrada em 10,78% das
amostras, Ehrlichia canis em 60,48% e Hepatozoon canis em 2,40%. Dentre os animais
avaliados, 23,95% estavam infestados apenas por carrapatos da espécie Rhipicephalus
sanguineus, onde não houve correlação entre a presença dos hemoparasitos e o parasitismo
por carrapatos. Os resultados indicaram que os cães do Centro de Controle de Zoonoses
foram acometidos por B. canis, E. canis e H. canis, onde foram encontradas coinfecções
entre esses hemoparasitos, que podem dificultar o diagnóstico clínico e laboratorial e
também agravar as manifestações clínicas dessas hemoparasitoses caninas.
Palavras-chave: cães, Babesia canis, Ehrlichia canis, Hepatozoon canis, Rhipicephalus
sanguineus.
ABSTRACT
The objective of the present study was to identify hemoparasites and ticks of dogs attended to
at the Center for Zoonosis Control, Campo Grande in Mato Grosso do Sul State. Smears of
peripherical and venous blood of one hundred and sixty seven dogs originating from many
regions of the municipality of Campo Grande were realized. Of the total examined, 62.28%
presented a positive result for hemoparasites, Babesia canis was found in 10.78% of samples,
Ehrlichia canis in 60.48%, Hepatozoon canis in 2.40%. Among the animals evaluated,
1
Mestranda do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul (UFMS). Bolsista da FUNDECT.
2
Docente do CCBS da UFMS, Campo Grande, MS.
3
Pesquisadora da Embrapa CPAO, Dourados, MS.
4
Pesquisador da Embrapa Gado de Corte, Campo Grande, MS.
5
Docente de Patologia Clínica da UFMS, Campo Grande, MS.
6
Médico-Veterinário da Secretaria Municipal de Saúde, Campo Grande, MS.
7
Discente do Curso de Medicina Veterinária da UFMS, Campo Grande, MS.
23.95% was infested only by ticks of the species Rhipicephalus sanguineus, where there was
no correlation between the presence of hemoparasites and tick parasitism. The results
indicated that the dogs of the CCZ were attacked by B. canis, E. canis and H. canis, where
coinfections among these hemoparasites were found, that may hinder clinical and
laboratorial diagnosis and also worsen the clinical manifestations of these canine
hemoparasitoses.
Key words: dogs, Babesia canis, Ehrlichia canis, Hepatozoon canis, Rhipicephalus
sanguineus.
INTRODUÇÃO
Os carrapatos que parasitam os cães têm grande importância na Medicina Veterinária e
na Saúde Pública, pois são responsáveis pela transmissão de hemoparasitoses aos animais
domésticos e podem atuar como vetores de doenças que apresentam potencial zoonótico e são
pouco conhecidas (RIBEIRO et al., 1997).
No Brasil, os cães são altamente acometidos pelos hemoparasitos Babesia canis,
Ehrlichia canis e Hepatozoon canis, que são parasitos intracitoplasmáticos de leucócitos e
eritrócitos presentes no sangue circulante desses animais (ALMOSNY & MASSARD, 2002), e
que são transmitidos biologicamente pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus (O’DWYER, 2000).
Tais agentes podem acometer os cães e não causar sintomatologia clínica ou
desenvolver sintomas com quadros clínicos graves e pode levar esses animais a óbito
(LABARTHE et al., 2003).
O diagnóstico mais utilizado para a pesquisa dos hemoparasitos em cães é o
parasitológico, que é realizado por meio da observação de formas parasitárias em esfregaços
de sangue periférico. Podem ser utilizadas outras técnicas, como a imunofluorescência
indireta (IFI), ELISA e a reação em cadeia de polimerase (PCR) (ALMOSNY, 1998).
O objetivo deste trabalho foi identificar os hemoparasitos e carrapatos dos cães
procedentes do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande, MS.
MATERIAL E MÉTODOS
Localização geográfica
O município de Campo Grande possui 8.096 km
2
, está localizado geograficamente na
posição central do Estado de Mato Grosso do Sul, e ocupa 2,26% da área total do Estado. A
sede do município localiza-se nas imediações do divisor de águas das bacias dos rios Paraná e
19
Paraguai, definida pelas coordenadas geográficas de 20º26’34” latitude Sul e 54º38’47”
longitude Oeste, e sua altitude é de 532 metros.
Coleta do material
Foram examinados 167 cães no Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande,
Estado de Mato Grosso do Sul.
Foi realizada a punção de vasos de pequeno calibre, bem como da veia cefálica desses
animais e foram confeccionados esfregaços sanguíneos no Laboratório de Bacteriologia da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.
Os cães foram inspecionados, principalmente nas orelhas e coxins palmares e
plantares, para detecção da presença de carrapatos. Os exemplares encontrados foram
removidos manualmente do corpo do hospedeiro, acondicionados em frascos individuais
contendo álcool etílico a 70 GL.
Exame parasitológico
Os esfregaços sanguíneos foram fixados em metanol por três minutos e corados com
Giemsa a 10% durante 30 minutos. Em seguida, encaminhados para o Laboratório de
Patologia Clínica e Anatomia Patológica, onde foram examinados por toda a extensão da
lâmina, principalmente na região da franja do esfregaço.
Identificação dos carrapatos
Os exemplares de carrapatos foram encaminhados para o Laboratório de Parasitologia
da Embrapa Gado de Corte e identificados, segundo a chave de ARAGÃO & FONSECA
(1961), com o auxílio de microscópio estereoscópio. Os carrapatos não foram identificados
quanto aos seus instares.
Avaliação epidemiológica
Todos os cães que participaram desse estudo foram levados até o CCZ pelos próprios
proprietários, onde tivemos acesso a algumas informações por meio dos telefones fornecidos
nas fichas de triagem desses cães. Os proprietários dos cães responderam a um questionário
20
previamente elaborado, contendo aspectos epidemiológicos como sexo, raça, idade, hábitos
alimentares e restrição domiciliar.
Os animais foram separados em cinco faixas etárias: cães com menos de 1 ano de
idade, cães variando de 1,1 a 3 anos de idade, cães com 3,1 a 6 anos de idade, cães com 6,1 a
9 anos e cães com idade superior a 9,1 anos.
Análise estatística
O estudo das associações entre as variáveis de interesse foi realizado por meio do teste
quiquadrado (χ
2
) e a análise de correlação de Pearson.
RESULTADOS
O índice de positividade geral para hemoparasitos foi de 62,28%.
Babesia canis (figura 1) foi encontrado em 10,78% dos cães examinados, no
diagnóstico parasitológico por esfregaço sanguíneo. Em 8,98% dos animais, encontrou-se
associação de B. canis e E. canis.
Figura 1 - Trofozoítos de Babesia canis identificados, pelo método de esfregaço sanguíneo, em
eritrócito de cão procedente do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande,
MS (Aumento de 1000X).
Ehrlichia canis (figura 2) foi identificado em 60,48% dos cães examinados.
21
Figura 2 - Mórulas de Ehrlichia canis, identificadas pelo método de esfregaço sanguíneo, em
monócito de cão procedente do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande,
MS (Aumento de 1000X).
Hepatozoon canis (figura 3) foi diagnosticado em apenas 2,40% dos cães avaliados e
foi encontrada associação com E. canis em todos os casos.
Figura 3 - Isogameta de Hepatozoon canis, identificado pelo método de esfregaço
sanguíneo, em monócito de cão procedente do Centro de Controle de Zoonoses
de Campo Grande, MS (Aumento de 1000X).
Os carrapatos foram retirados de 23,95% (40) dos cães examinados, e estes estavam
infestados apenas pela espécie Rhipicephalus sanguineus.
O índice de correlação de Pearson entre as faixas etárias e a presença de carrapatos (r
= 0,0844), B. canis (r = 0,0298), E. canis (r = 0,0346), H. canis (r = 0,0989) foi muito fraco,
22
mas foi encontrada diferença significativa (p < 0,05) entre a presença de E. canis em animais
das faixas etárias de 1,1 a 3 anos e 6,1 a 9 anos de idade (tabela 1).
As variáveis raça, sexo e restrição domiciliar não apresentaram diferença significativa.
Já a variável faixa etária apresentou diferença significativa nos cães de 1,1 a 3 anos e 6,1 a 9
anos quanto à presença de E. canis.
Tabela 1 - Freqüência de hemoparasitos e carrapatos em cães do Centro de Controle de Zoonoses de Campo
Grande, MS, 2004
Variáveis Carrapatos Babesia canis Ehrlichia canis Hepatozoon canis
Raça
SRD (108) 24,07% (26) 9,25% (10) 59,26 % (64) 0,93% (1)
CRD (59) 23,73% (14) 13,56% (8) 62,71 % (37) 5,08% (3)
Sexo
Fêmea (82) 24,39% (20) 8,54% (7) 62,20% (51) 3,67% (3)
Macho (85) 23,53% (20) 12,94% (11) 58,82% (50) 1,18% (1)
Faixa etária (anos)
0 – 1 (31) 25,81% (8) 9,68% (3) 38,71% (12) 3,23% (1)
1,1 – 3 (69) 17,39% (12) 13,04% (9) 63,77% (44)
a
1,45% (1)
3,1 – 6 (35) 25,71% (9) 11,43% (4) 68,57% (24) 2,86% (1)
6,1 – 9 (20) 40,00% (8) 5,00% (1) 8,00% (16)
a
5,00% (1)
9,1 e mais (12) 25,00% (3) 8,33% (1) 41,67% (5) -
Restrição domiciliar
Com (84) 25,00% (21) 11,90% (10) 57,14% (48) 3,57% (3)
Sem (83) 22,89% (19) 9,64% (8) 63,86% (53) 1,20% (1)
SRD – sem raça definida; CRD – com raça definida; ( ) valores absolutos.
a
diferença estatística p< 0,05.
Não foi encontrada diferença significativa (p < 0,05) entre a presença de R.
sanguineus e dos hemoparasitos estudados (tabela 2).
Tabela 2 - Relação entre a ocorrência de hemoparasitos, diagnosticados pelo método do esfregaço sanguíneo, e a
presença de carrapatos coletados em cães do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande, MS,
2004
Hemoparasitos Babesia canis Ehrlichia canis Hepatozoon canis
Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo
Com carrapato 5 35 27 13 0 40
Sem carrapato 13 114 74 53 4 123
Na freqüência encontrada de hemoparasitos no sangue periférico (tabela 3) e
circulante dos cães (tabela 4), não houve diferença estatística significativa (p < 0,05) entre
23
eles.
Tabela 3 - Positividade para hemoparasitos em sangue de vasos periféricos de pequeno calibre de cães do Centro
de Controle de Zoonoses de Campo Grande, MS, 2004
Hemoparasitos Positivo Negativo
Babesia canis 16 151
Ehrlichia canis 85 82
Hepatozoon canis 2 165
Tabela 4. Positividade para hemoparasitos em sangue da veia cefálica de cães do Centro de Controle de
Zoonoses de Campo Grande, MS, 2004
Hemoparasitos Positivo Negativo
Babesia canis 11 156
Ehrlichia canis 69 98
Hepatozoon canis 2 165
DISCUSSÃO
O Centro de Controle de Zoonoses (CCZ), de Campo Grande realiza um programa de
controle da população urbana de animais de pequeno, médio e grande porte, onde capturam os
animais soltos em vias públicas, com o intuito de prevenir agressões e diminuir o risco de
disseminação de zoonoses. Os cães são alojados em suas dependências, recolhidos nas ruas ou
levados pelo proprietário, onde são mantidos em canis coletivos.
O método de diagnóstico por esfregaço sanguíneo é específico, embora pouco sensível
(ALMOSNY & MASSARD, 2002). Mesmo assim, o índice de positividade geral para
hemoparasitos foi alto (62,28%). Tal freqüência alta pode ser justificada pelo fato de os cães
avaliados serem procedentes do CCZ, onde existe uma elevada aglomeração de animais, dos
quais uma grande parte apresenta-se com um grau de debilidade acentuado. Com isso, esse
local torna-se propício a maior infestação de carrapatos e também aumenta a chance de
adquirir e manifestar as hemoparasitoses.
Com o mesmo método de diagnóstico, O’DWYER (2000) encontrou valores de 45,2%
a 71,8% de cães infectados com os mesmos hemoparasitos no município de Piraí no Estado
do Rio de Janeiro.
Babesia canis foi encontrada em apenas 10,78% dos cães examinados de Campo
Grande. Essa freqüência baixa, provavelmente, foi em função de se ter trabalhado com cães
sem sintomatologia clínica, e isso pode explicar a baixa prevalência, já que a parasitemia em
cães assintomáticos é muito baixa para ser detectada nos esfregaços sanguíneos.
24
Da mesma forma, DELL’PORTO et al. (1993) encontraram em esfregaços sanguíneos
de cães errantes da cidade de São Paulo, 10,3% de animais infectados com esse protozoário, e
PARAENSE & VIANNA (1949) obtiveram freqüência de 14% de positividade em cães de
rua da cidade do Rio de janeiro. Entretanto, O’DWYER (2000) encontrou apenas 5,2% de
positividade, provavelmente porque os animais eram provenientes de áreas rurais, onde a
infestação dos cães por R. sanguineus é pequena.
A alta positividade observada para Ehrlichia canis (60,48%) neste estudo difere dos
achados de outros autores. O’DWYER (2000) observou apenas 4,8% e MOREIRA et al.
(2003) encontraram 16% de presença desse hemoparasito em áreas rurais do Rio de Janeiro e
Belo Horizonte, respectivamente. Essa diferença de freqüência ocorreu provavelmente por
causa da procedência dos animais, ou seja, eram todos de áreas urbanas e também pela
presença exclusiva do carrapato Rhipicephalus sanguineus, que é o principal transmissor
dessa bactéria.
A freqüência alta encontrada neste trabalho pode ser justificada, provavelmente
porque esses cães estavam confinados em um ambiente diferente do seu habitual, o que eleva
o nível de estresse e propicia a queda de imunidade. E como E. canis manifesta-se com mais
facilidade, acaba aumentando a parasitemia e facilitando a sua identificação nos esfregaços
sanguíneos, independente das manifestações clínicas.
Cães imunocompetentes são capazes de eliminar a infecção por E. canis, caso
contrário pode ocorrer à fase crônica da infecção que pode persistir por um período de cinco
anos.
RODRIGUEZ-VIVAS et al. (2005) encontraram também uma freqüência muito baixa
da bactéria, apenas 5% em cães de áreas urbanas em Yucatan no México. Uma possível
explicação, para esse resultado, é que os cães estavam na fase crônica da doença, já que
44,1% deles foram soropositivos no teste de ELISA.
Neste estudo, foi encontrada diferença significativa quanto à presença de E. canis e as
faixas etárias de 1,1 a 3 anos e 6,1 a 9 anos. Uma possível explicação na faixa etária de 1,1 a 3
anos é que eram animais novos e que possivelmente apresentavam uma infecção aguda. Já no
caso da faixa etária de 6,1 a 9 anos apresentaram uma maior infestação de carrapatos e
conseqüentemente uma maior chance de entrar em contato com E. canis, apesar de não ter
encontrado diferença significativa entre a presença de R. sanguineus e dos hemoparasitos
estudados.
Houve associação de B. canis e E. canis em 8,98% dos cães avaliados, que muitas
vezes dificulta o diagnóstico e favorece agravamento do quadro clínico. Tal associação foi
25
relatada em proporções superiores por PRICE et al. (1987) em 20,1% (373) dos cães da
Universidade de Nairobi no Kenya e por SALES et al. (2005) em 61,1% (18) dos casos
confirmados no hospital veterinário de Cuiabá no Mato Grosso.
Hepatozoon canis foi identificado em apenas 2,40% dos cães, concordando com os
dados de MYLONASKIS et al. (2005) que encontraram 2,90 % de isogametas no interior de
neutrófilos.
Esse hemoparasito foi menos freqüente provavelmente por causa de sua via de
transmissão que é a ingestão do carrapato e também por apresentar uma baixa parasitemia, ou
seja, poucas formas de isogametas circulantes.
MASSARD (1979) demonstrou segundo a mesma técnica, que o parasitismo por H.
canis foi mais freqüente em cães de áreas rurais (31,58%) do que em cães de áreas urbanas
(4,48%), o que confirma a freqüência de 39,2 % encontrada em cães de áreas rurais do Rio de
Janeiro, relatada nos trabalhos de O’DWYER (2000) e FORLANO (2002).
As coinfecções encontradas entre H. canis e B. canis e também E. canis foi
confirmada também por outros pesquisadores, como O’DWYER et al. (1997) e GAVAZZA et
al. (2003). Essas coinfecções dificultam sobremaneira a caracterização clínico-laboratorial das
hemoparasitoses caninas (O’DWYER & MASSARD, 2001; AGUIAR et al., 2004).
A única espécie de carrapato identificada nos cães do CCZ foi Rhipicephalus
sanguineus, onde foi encontrada em 23,95% (40) dos animais examinados, e isto ocorreu pelo
fato de essa espécie estar mais adaptada nas áreas urbanas e periurbanas, principalmente por
apresentar hábitos nidícolas.
CONCLUSÃO
Existe coinfecção entre os hemoparasitos identificados, principalmente de B. canis
com E. canis e H. canis com E. canis, o que pode dificultar o diagnóstico clínico e
laboratorial. Além disso, os cães provenientes do CCZ podem adquirir e manifestar as
hemoparasitoses com mais facilidade, já que estes animais estão expostos a uma maior
infestação de carrapatos e também a condições de estresse ocasionadas principalmente pela
grande aglomeração de animais no local, que contribuem para a disseminação dos
hemoparasitos.
26
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ANIMAIS, 2., 2005, Campo Grande, MS. Anais... Campo Grande, MS, 2005. 1 CD-ROM.
28
SEGUNDO ARTIGO
Detecção de anticorpos contra Borrelia burgdorferi em cães procedentes do Centro de
Controle de Zoonoses de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil
Detection of antibodies against Borrelia burgdorferi in dogs originating from the Center of
Zoonosis Control of Campo Grande in Mato Grosso do Sul State, Brazil.
Fabiana Pessoa Salgado
1
, Michael Robin Honer
2
, Márcia Mayumi Ishikawa
3
, Renata
Cunha Madureira
4
, Cleber Oliveira Soares
5
, Leonardo Rigo
6
, Adivaldo Henrique da
Fonseca
7
ABSTRACT
Canine borreliosis has as its etiological agent Borrelia burgdorferi lato sensu, which is
transmitted by ixodídeos ticks and can attack human and animals. A total of 180 blood
samples was collected from dogs originating from the Center of Zoonosis Control of
Campo Grande in Mato Grosso do Sul State. The serums analysed through the indirect
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) revealed 73.3% (132) of animals
seropositives, with titres that varied from 1:400 (46.1%) to 1:3200 (0.5%). All dogs were
examined in relation to the presence of ticks and only the species Rhipicephalus
sanguineus was found in 15.6% (28) of the dogs. The large number of dogs detected as
seropositive suggests the hypothesis of Borrelia sp as the possible agent of borreliose de
Lyme simile and in this way the relevance of this as an emerging zoonosis.
Key words: dogs, Borrelia burgdorferi, Rhipicephalus sanguineus, zoonosis.
1
Mestranda do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciência Animal da Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul (UFMS) Bolsista da FUNDECT. 79070-900 Campo Grande, MS, Brasil. Endereço
eletrônico: [email protected].
2
Docente do CCBS da UFMS, Campo Grande, MS.
3
Pesquisadora da Embrapa Agropecuária Oeste, Dourados, MS.
4
Discente de Doutorado em Ciências Veterinárias da UFRRJ, RJ.
5
Pesquisador da Embrapa Gado de Corte, Campo Grande, MS.
6
Médico-Veterinário da Secretaria Municipal de Saúde, Campo Grande, MS.
7
Docente da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, RJ.
RESUMO
A borreliose canina tem como agente etiológico Borrelia burgdorferi lato sensu, que é
transmitida por carrapatos ixodídeos e pode acometer seres humanos e animais. Foram
coletadas 180 amostras sanguíneas de cães procedentes do Centro de Controle de Zoonoses
de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul. Os soros analisados por meio do ensaio
imunoadsorção enzimático (ELISA) indireto revelaram 73,3% (132) de animais
soropositivos, com títulos que variaram de 1:400 (46,1%) a 1:3200 (0,5%). Todos os cães
foram examinados quanto à presença de carrapatos e foi encontrada apenas a espécie
Rhipicephalus sanguineus em 15,6% (28) dos cães avaliados. O grande número de cães
soropositivos detectados demonstra a hipótese da ocorrência de Borrelia sp. como possível
agente da borreliose de Lyme simile e desta forma a sua relevância como zoonose
emergente.
Palavras-chave: cães, Borrelia burgdorferi, Rhipicephalus sanguineus, zoonoses.
INTRODUÇÃO
Borreliose de Lyme é uma zoonose cosmopolita, causada por Borrelia burgdorferi
lato sensu e transmitida por carrapatos ixodídeos (Johnson et al. 1984, Alves et al. 2004).
Cães servem como hospedeiros para ninfas e adultos de carrapatos do gênero Ixodes, bem
como outras espécies de carrapatos (Bushmich 1994).
A infecção no Brasil deve ser referida como borreliose de Lyme simile, e a sua
principal manifestação clínica em humanos é o eritema migratório recidivante (Fonseca et
al. 2005).
Nos cães é determinada por uma síndrome musculoesquelética caracterizada pelo
comprometimento das articulações, principalmente carpiana e tarsiana, com quadro de
artrite severa (Lissman et al. 1984). Raramente ocorre lesão de pele e eritema no sítio do
local da picada (Appel 1990). Outros sintomas, como meningite, uveíte, glomerulonefrite e
cardiopatias, têm sido relatados (Bushmich 1994, McKenna et al. 1995).
30
O primeiro caso de meningite de Lyme no Brasil e a ocorrência de três casos clínicos
da doença de Lyme no Estado de Mato Grosso do Sul, identificados por critérios clínicos e
laboratoriais, foram relatados por Costa et al. (1996).
No Brasil, estudos soroepidemiológicos para borrelioses, por meio da técnica de
ELISA indireto, foram realizados em humanos (Yoshinari et al. 1997); em cães (Joppert
1995) e em bovinos (Fonseca et al. 1996, Ishikawa 1996), e a soroprevalência nesses
estudos apresentou valores próximos reportados em áreas endêmicas da América do Norte
(Soares et al. 1999a).
Casos clínicos com confirmação sorológica foram identificados, embora o agente
não tenha sido isolado (Yoshinari et al. 1991 and 1993; Costa et al. 2002). O primeiro caso
de meningite de Lyme no Brasil foi descrito em Campo Grande, Mato Grosso do Sul
(Costa et al. 1996).
O ensaio de imunoadsorção enzimático (ELISA) indireto tem sido o método de
diagnóstico mais empregado para verificar a presença de anticorpos contra Borrelia
burgdorferi lato sensu em animais e no homem (Magnarelli et al. 1984, Gordillo et al.
1999).
O Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande (CCZ) atende a população,
recebendo animais com suspeita de zoonoses, onde são coletados materiais para realização
de exames confirmatórios. Esses animais possuem, portanto um perfil diferente dos cães
que são capturados ou abandonados pelos proprietários. Possuem procedência conhecida e
acessível e foram utilizados em sua maioria neste trabalho pelo fato da época da coleta de
amostras que coincidiu com o período da campanha de controle da leishmaniose. O CCZ
foi escolhido por se tratar de um local de concentração dos mais diversificados cães (raça,
idade, condição sócio-econômica) em um curto período de tempo.
O presente trabalho teve por objetivo verificar a presença de anticorpos contra
Borrelia burgdorferi em cães provenientes do Centro de Controle de Zoonoses de Campo
Grande, Estado de Mato Grosso do Sul.
31
MATERIAL E MÉTODOS
Localização geográfica
O município de Campo Grande possui 8.096 km
2
, está localizado geograficamente
na posição central do Estado de Mato Grosso do Sul, e ocupa 2,26% da área total do
Estado. A sede do município está localizado nas imediações do divisor de águas das bacias
dos rios Paraná e Paraguai, e definida pelas coordenadas geográficas de 20º26’34” latitude
Sul e 54º38’47” longitude Oeste, e sua altitude é de 532 metros.
Amostras de soros sanguíneos
Foi efetuada a coleta de sangue de 180 cães provenientes do Centro de Controle de
Zoonoses, de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul.
Foram levantados dados referentes a sexo, idade, raça, presença de carrapatos e
restrição domiciliar (Anexo 1). As amostras foram obtidas por punção da veia cefálica em
seringas de 5 ml e transferidas para frascos sem anticoagulante. O sangue foi centrifugado,
os soros obtidos acondicionados em frascos tipo eppendorf e mantidos até o momento da
análise sorológica.
Antígeno e controles positivo e negativo
O antígeno de Borrelia burgdorferi cepa G39/40 origem americana e também os
soros controles positivos (1) e negativos (8) foram cedidos pelo Laboratório de Doenças
Parasitárias da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
Ensaio de imunoadsorção enzimático (ELISA) indireto
As 180 amostras de soros foram coletadas e analisadas por meio do ELISA indireto
padronizado por Soares et al. (1999b).
Realizou-se o ensaio para detectar anticorpos da classe IgG homólogos contra B.
burgdorferi lato sensu, com o antígeno de B. burgdorferi stricto sensu cepa G39/40 diluído
a 15 µg/mL em tampão carbonato pH 9,6, com sensibilização de microplacas de
poliestireno com 96 orifícios (M-4043, Sigma Chemical), incubadas em câmara úmida a
32
4°C overnight.
Após a sensibilização, as placas foram lavadas três vezes com PBS tween 20 0,05%
pH 7,4 (PBS T 20) e bloqueadas com soro de coelho diluído a 1% no PBS T20, por uma
hora em câmara úmida à temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram lavadas
como já descrito.
Os oito soros controles negativos bem como os soros testes foram diluídos a 1:400
e o soro controle positivo foi diluído em série, a partir de 1:400 até 1:51.200, todos com
PBS T 20; essa etapa do ensaio foi incubada e lavada como a anterior. Adicionou-se às
placas conjugado IgG de coelho anti-IgG canina ligado à fosfatase alcalina (Sigma
Chemical) na diluição de 1:1000 em PBS T 20. A incubação e lavagem seguiram a fase
anterior.
As placas foram forradas com a solução reveladora composta por substrato para-
nitro-fenil-fosfato de sódio (PNPP) (Sigma Chemical) diluído em tampão glicina pH 10,5
na concentração de 1mg/mL. Estas permaneceram à temperatura ambiente até a revelação
e momento de leitura em espectrofotômetro para microplacas de 96 orifícios (Microplate
Reader model 550, Bio-Rad Laboratories), e utilizou filtro para comprimento de onda de
405ηm. Em todas as fases do ensaio utilizaram-se 200µL de solução por orifício. A linha
de corte do ensaio foi estabelecida pela média aritmética dos valores de densidade óptica
dos soros controles negativos mais três vezes o desvio-padrão destes (Anexo 2).
Avaliação epidemiológica
Foi realizado um estudo espacial por meio de mapas temáticos da cidade de Campo
Grande, Mato Grosso do Sul, a partir do endereço completo dos proprietários dos cães.
Também foram coletados os seguintes dados dos cães: sexo, idade, raça e restrição
domiciliar.
Análise estatística
Foi utilizado o teste não paramétrico Quiquadrado χ
2
, por meio do programa
Microstat, para observação de possíveis diferenças significativas entre as freqüências
encontradas nos grupos de animais de acordo com raça, sexo e idade. Foi adotado o nível
de significância de 95%.
33
RESULTADOS
Dos 180 animais estudados, 132 (73,3%) foram reagentes ao ELISA indireto, com
títulos de 1: 400 (62,9%), 1:800 (28%), 1:1600 (8,3%) e 1:3200 (0,8%), enquanto 26,7%
foram negativos (Tabela 1).
Tabela 1 - Freqüência sorológica de anticorpos anti-Borrelia burgdorferi em cães (n=180)
provenientes do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do
Sul, determinada pelo ELISA indireto
Título Positivos (n)
Freqüência
Relativa Absoluta
Negativos (n)
1:400 83 62,9% 46,1% -
1:800 37 28,0% 20,6% -
1:1600 11 8,3% 6,1% -
1:3200 1 0,8% 0,5% -
Total positivos 132 100%
(132/132)
73,3% (132/180) -
Total negativos - - 26,7% (48/180) 48
Os dados obtidos a partir do questionário epidemiológico revelaram que os cães
sem raça definida (SRD) apresentaram a freqüência de 74,36% de soropositividade para
anticorpos IgG contra B. burgdorferi, enquanto aqueles que tinham raça definida (CRD)
apresentaram 71,43%. Não houve diferença significativa entre os cães com e sem raça
definida (p < 0,05) (Tabela 2).
Em relação ao sexo foram detectados 70% das fêmeas e 76,67% dos machos
positivos e não apresentou diferença significativa (p < 0,05).
Já a presença de B. burgdorferi nas faixas etárias estudadas nos cinco grupos
revelou a freqüência de soropositividade de: 47,06% dos cães de 0 até 1 ano; 73,33% dos
cães entre 1,1 a 3 anos; 91,43% entre 3,1 a 6 anos; 86,36% entre 6,1 a 9 anos e 71,43% dos
animais acima de 9 anos. A análise estatística constatou diferença significativa (p < 0,05)
entre as faixas de 3,1 a 6 anos e os animais com idade superior a essa faixa.
A análise quanto à restrição domiciliar revelou que 70,79% dos cães que eram
restritos ao ambiente domiciliar foram positivos, já para os cães que tinham acesso à rua, a
34
positividade foi de 75,82%. Não houve diferença significativa entre a soropositividade
observada nos cães com e sem restrição domiciliar.
Tabela 2 - Freqüência de Borrelia burgdorferi em cães do Centro de Controle de Zoonoses de
Campo Grande, MS, 2004
Variáveis Positivo Negativo
Raça
SRD (117) 74,36% (87) 25,64% (30)
CRD (63) 71,43% (45) 28,57% (18)
Sexo
Fêmea (90) 70,00% (63) 30,00% (27)
Macho (90) 76,67% (69) 23,33% (21)
Faixa etária (anos)
0 – 1 (34)
a
47,06% (16) 52,94% (18)
1,1 – 3 (75)
a
73,33% (55) 26,67% (20)
3,1 – 6 (35)
a,b
91,43% (32) 8,57% (3)
6,1 – 9 (22)
a,b
86,36% (19) 13,64% (3)
9,1 e mais (14)
a,b
71,43% (10) 28,57% (4)
Restrição domiciliar
Com (89) 70,79% (63) 29,21% (26)
Sem (91) 75,82% (69) 24,18% (22)
SRD – sem raça definida; CRD – com raça definida; ( ) valores absolutos.
a,b
diferença significativa p < 0,05
O carrapato Rhipicephalus sanguineus foi a única espécie encontrada (15,6%) nos
cães procedentes do Centro de Controle de Zoonoses.
Foram mapeados os endereços dos proprietários dos 180 cães, e destes, 132 foram
soropositivos para B. burgdorferi (Figura 1) e 48 soronegativos (Figura 2).
35
Universidade
Itamaraca
Aeroporto
Moreninhas
Los Angeles
Pq dos Poderes
Nascente Segredo
Área Militar
Anhanduizinho
Bandeira
Prosa
Segredo
Imbirussu
Lagoa
Penfigo
Centro
Títulos de positividade
para B
burgdorferi
1:400
1:800
1:1600
1:3200
Área verde
CCZ
Figura 1 - Distribuição espacial de cães soropositivos para Borrelia burgdorferi
procedentes do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande, MS.
36
Universidade
Nascente Segredo
Aeroporto
Área Militar
Moreninhas
Itamaraca
Los Angeles
Pq dos Poderes
Segredo
Imbirussu
Lagoa
Bandeira
Anhanduizinho
Prosa
Penfigo
Centro
Animais negativos
para B
burgdorferi
N
CCZ
Área verde
Figura 2 - Distribuição espacial de cães soronegativos para Borrelia burgdorferi
procedentes do Centro de Controle de Zoonoses de Campo Grande, MS.
Observou-se uma maior concentração dos cães na região Sul e parte da Oeste de
Campo Grande tanto daqueles que apresentaram na sorologia anticorpos contra B.
burgdorferi como para os negativos. E essa concentração ocorreu nas regiões próximas ao
CCZ, campus da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, base aérea, aeroporto
internacional e também próximo ao Hospital do Pênfigo.
37
DISCUSSÃO
Campo Grande é uma cidade onde se encontram áreas periféricas formadas por
cerrados, ainda em ocupação, e duas reservas florestais integradas à cidade, onde habitam
animais silvestres que podem ser os potenciais reservatórios de borrelias causadoras de
doenças aos animais e ao homem (Costa et al. 2001).
A freqüência de 73,3% (132/180) de cães soropositivos para B. burgdorferi, obtida
neste trabalho, corrobora com os dados encontrados nas áreas endêmicas para borreliose de
Lyme nos EUA, onde apresentam prevalência sorológica que varia de 40% a 89% de
soropositividade nos cães (Burgess 1986, Fikrig et al. 1993, O’Dwyer et al. 2004). No
Japão, Azuma et al. (1994) encontraram 76,19% de cães soropositivos no método ELISA.
Tal freqüência muito alta pode ser justificada em parte pelo fato de os cães serem
procedentes do CCZ, onde há uma aglomeração de animais oriundos de regiões diversas. O
CCZ está muito próximo de áreas de mata verde, onde existe uma considerável presença de
animais silvestres e vetores, que aumenta a possibilidade de maiores infestações por
carrapatos transmissores dessa borreliose.
Esta freqüência foi maior nos títulos mais baixos como 1:400 e 1:800, o que pode
ser justificado com possíveis reações cruzadas com outros antígenos próximos ao utilizado
no teste, como por exemplo, outras espécies de borrélias.
A utilização do teste ELISA padronizado em outra região e antígeno bruto ao invés
de recombinante podem também justificar a alta freqüência obtida neste trabalho, no
entanto, esta metodologia tem sido utilizada em outros estudos similares no Brasil. A
associação dos resultados com os dados epidemiológicos e os casos clínicos em humanos
tem viabilizado e reforçado a importância deste tipo de pesquisa.
No trabalho de Naka (2005) foi encontrada a freqüência de 29% de anticorpos anti-
B. burgdorferi em 100 crianças que apresentavam manifestações clínicas e epidemiologia
compatíveis com a síndrome de Lyme-simile no Estado de Mato Grosso do Sul. A maioria
das crianças era procedente da zona urbana da cidade de Campo Grande, e todos possuíam
cães de estimação, que são competentes reservatórios de Borrelia sp. no ambiente
domiciliar (Goossens et al. 2001).
A maior freqüência de cães soropositivos e soronegativos encontrada na região Sul
38
e parte da Oeste de Campo Grande, pode ser justificada principalmente pela grande
densidade populacional canina que existe nessas áreas próximas do CCZ, onde propicia
maiores infestações principalmente por carrapatos da espécie Rhipicephalus sanguineus.
A proximidade com uma reserva florestal urbana localizada no campus da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul e áreas de mata verde na região da base
aérea, do aeroporto internacional e próximo ao Hospital do Pênfigo, também justificam a
freqüência encontrada nesta região.
A freqüência de anticorpos contra B. burgdorferi encontrada em cães varia de
acordo com a região fisiográfica (Azuma et al. 1994, Wright et al. 1997, Soares et al.
1999a, Joppert et al. 2001), e se torna mais freqüente em áreas endêmicas para a borreliose
humana (Lindenmayer 1991).
O estudo epidemiológico da borreliose de Lyme tem como principal ferramenta
imunológica o ensaio imunoenzimático ELISA indireto, por causa de suas características
confiáveis de sensibilidade e especificidade (Magnarelli & Anderson 1988). Soares et al.
(1999b) padronizaram o ELISA indireto para detecção de anticorpos da classe IgG anti B.
burgdorferi em cães e o ensaio garantiu confiança de 99,99%.
O resultado observado no presente estudo revela um valor superior em relação à
freqüência encontrada no trabalho de Joppert et al. (2001) onde encontraram apenas 9,7%
de soropositividade nos cães provenientes de Cotia na região de São Paulo. Nessa mesma
região foi relatada a soroprevalência de 7,5% em humanos, também pelo ELISA indireto
(Yoshinari et al. 1997).
Em estudo soroepidemiológico da ocorrência de anticorpos da classe IgG anti-B.
burgdorferi na região da Baixada Fluminense no Rio de Janeiro, foi demonstrada pelo
ELISA indireto a freqüência de 20% de cães positivos em uma amostra de 150 soros
(Soares et al. (1999b). Já Alves et al. (2004) detectaram 48,25% de presença de anticorpos
contra B.burgdorferi em cães da região metropolitana do Rio de Janeiro.
Os animais SRD apresentaram um acesso maior à rua e, conseqüentemente maior
probabilidade de contato com o carrapato vetor, onde foi encontrada somente a espécie R.
sanguineus (15,6%), provavelmente pelo seu comportamento nidícola, que utiliza somente
cães como hospedeiros para os estágios de larva, ninfa e adulto.
39
Da mesma forma, Guerra & Brito (2004) e Torrence et al. (1990) também
observaram essa espécie de carrapatos nos cães estudados, e isto ocorreu possivelmente
porque cães que têm acesso à rua apresentam uma maior exposição aos carrapatos
principalmente pela falta de controle parasitário.
O’Dwyer et al. (2004) observaram em cães de áreas rurais do Estado do Rio de
Janeiro, a relação entre a presença de anticorpos contra B. burgdorferi e os carrapatos da
espécie A. cajennense detectados em 38,7% dos cães soropositivos e R. sanguineus em 22,6%.
O carrapato R. sanguineus pode ser sugerido como possível vetor responsável pela
transmissão da B. burgdorferi nos cães, a sua confirmação utilizando o cultivo desses
carrapatos no meio específico para B. burgdorferi (BSK), não foi avaliada neste trabalho.
Espécimes de carrapatos foram coletados de animais selvagens e domésticos nas
regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil e foram encontradas infestações por R.
sanguineus em marsupiais e roedores, o que demonstra seu parasitismo em outras espécies
de animais além dos caninos (Figueiredo et al. 1999).
Houve diferença significativa entre a ocorrência de anticorpos anti-B. burgdorferi e
as faixas etárias a partir de três anos de idade. Isto se deve provavelmente porque esses
animais têm mais acesso à rua e, em conseqüência, uma maior exposição ao agente. Assim
como Magnarelli et al. (1984) que observaram maior número de casos positivos, na IFI,
nos cães de rua com idade superior a quatro anos de idade, e O’Dwyer (2000) relata que
cães com idade superior a cinco anos apresentaram maior positividade. Greene et al.
(1988) encontraram cães positivos pelo método da IFI, em todas as faixas etárias, com
maior prevalência em animais de um a cinco anos.
No Brasil, ainda não foi isolado o agente etiológico da doença de Lyme. Entretanto,
os resultados das pesquisas realizadas mostraram a existência de um agente patogênico
relacionado com carrapatos capaz de estimular o sistema imune do hospedeiro a produzir
anticorpos contra a cepa americana G 39/40 de B. burgdorferi stricto sensu (Naka 2005).
Na epidemiologia, os títulos de anticorpos pesquisados neste trabalho não indicam
doença, mas sim exposição ao agente. Entretanto, cães com sorologia positiva são
considerados como indicadores do risco de transmissão do agente ao homem, já que são
reservatórios para Borrelia sp. no ambiente domiciliar.
40
CONCLUSÃO
A alta freqüência de anticorpos contra Borrelia burgdorferi encontrada em cães
procedentes do Centro de Controle de Zoonoses na cidade de Campo Grande, Mato Grosso
do Sul, corrobora a hipótese da presença de Borrelia sp. nessa região, já que existem casos
clínicos confirmados da doença em crianças e adultos que demonstram a importância da
doença de Lyme simile como uma zoonose emergente.
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43
2 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados da identificação dos hemoparasitos e carrapatos pelo exame
parasitológico, e também da presença de anticorpos contra Borrelia burgdorferi por meio
do ELISA indireto, permitiram considerar a importância dos hemoparasitos e carrapatos
como causadores de doenças aos animais e ao homem.
A espécie canina possui anticorpos da classe IgG homólogos contra B. burgdorferi
e também demonstram um bom reconhecimento antigênico para B. burgdorferi cepa G
39/40. Com isso, a freqüência de cães soropositivos corrobora com a hipótese da
ocorrência de Borrelia sp. na região estudada.
No que diz respeito à doença de Lyme simile como zoonose, é necessário que
desenvolvam mais pesquisas com animais domésticos, silvestres e seus vetores nas
diversas regiões do Brasil, para que dessa maneira possam ser isolados o agente etiológico
e o carrapato vetor transmissor dessa borreliose de Lyme, tanto nos animais como nos
seres humanos.
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51
ANEXOS
ANEXO 1
Questionário para Coleta dos Dados Caninos
UFMS
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
1) Registro no CCZ: ..............................................................................................................
2) Data ........../ ........../..................
3) Proprietário ........................................................................................................................
4) Endereço ............................................................................................................................
Bairro .................................................................................................................................
Cidade ................................................................................................................................
Estado ................................................................................................................................
5) Telefone .............................................................................................................................
6) Nome do Animal ...............................................................................................................
7) Raça....................................................................................................................................
8) Sexo....................................................................................................................................
9) Idade...................................................................................................................................
10) Sinais clínicos.....................................................................................................................
11) Tratamento? sim ( ) não ( )
Quais: .................................................................................................................................
12) Área? urbana ( ) rural ( )
13) Possui ectoparasito? carrapatos ( ) pulgas ( ) outros ( )
14) Alimentação? ração ( ) comida caseira ( )
15) Contato com outros animais? sim ( ) não ( )
cão ( ) gato ( ) bovino ( ) eqüino ( )
outros .................................................................................................................................
16) Hábito de sair na rua? sim ( ) não ( )
53
ANEXO 2
Mapa para o acompanhamento imunoadsorção enzimático ELISA
UFMS – CPGCA - Fabiana Pessoa Salgado
Data:
Cont. posit.
Cont. neg.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Obs.:
D.O. Título
ANÁLISE
Média =
Desvio-padrão =
Cut-off =
54
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