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Otacílio Luiz Chagas Júnior
A INTENSIDADE DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO AGUDO APÓS IRRADIAÇÃO
LASER DE BAIXA POTÊNCIA (InGaAlP – 685 nm)
Tese apresentada como parte dos
requisitos obrigatórios para obtenção do
título de DOUTOR em ODONTOLOGIA,
na área de concentração em Cirurgia e
Traumatologia Bucomaxilofacial, da
Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do
Sul.
Orientador:
Prof. Dr. Rogério Miranda Pagnoncelli
Consultores:
Prof. Dr. Vinícius Duval da Silva
Prof. Dr. Leão Pereira Pinto
Porto Alegre
2007
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Livros Grátis
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FOLHA DE APROVAÇÃO
FOLHA DE APROVAÇÃO FOLHA DE APROVAÇÃO
FOLHA DE APROVAÇÃO
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Otacílio Luiz Chagas Júnior
A INTENSIDADE DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO AGUDO APÓS IRRADIAÇÃO
LASER DE BAIXA POTÊNCIA (InGaAlP – 685 nm)
Tese apresentada como parte dos
requisitos obrigatórios para obtenção do
título de DOUTOR em ODONTOLOGIA,
na área de concentração em Cirurgia e
Traumatologia Bucomaxilofacial, da
Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do
Sul.
Aprovada em:
Porto Alegre, ____ de __________________ de 2007
Banca Examinadora
___________________________________________________
Orientador: Prof. Dr. Rogério Miranda Pagnoncelli - FO/PUCRS
___________________________________________________
Prof. Dr. Aurelício Novaes Silva Júnior - ULBRA
___________________________________________________
Profa. Dra. Denise Cantarelli Machado - IPB/PUCRS
___________________________________________________
Profa. Dra. Maria Martha Campos - FO/PUCRS
___________________________________________________
Prof. Dr. Vinícius Duval da Silva - FAMED/PUCRS
DEDICATÓRIA
DEDICATÓRIADEDICATÓRIA
DEDICATÓRIA
À minha família: Marianne, minha esposa, Sr.
Otacílio e Sra. Vera Márcia, meus pais, e meus
irmãos, Patrícia, Otávio e Olavo.
Por todo amor, carinho, compreensão, apoio e
força!
Obrigado!
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Prof. Dr. Rogério Miranda Pagnoncelli, meu prezado orientador, não só
de pós-graduação, mas da vida profissional e pessoal; amigo com quem pude contar
nestes 5 anos. Levarei seus ensinamentos comigo, principalmente a ética, a
paciência e a compreensão holística da vida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, através da Profa. Dra.
Nilza Pereira da Costa e do Prof. Dr. Manoel Sant’Ana Filho, pela oportunidade, e
pela confiança em mim depositada quando representante discente da Área de
Concentração em CTBMF.
Aos queridos Mestres das Faculdades de Odontologia e de Medicina da
PUCRS que participaram da minha formação técnico-científica como Cirurgião Buco-
Maxilo-Facial.
Ao Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, por mostrar-me o amor à Pesquisa e por
sua amizade e apoio incondicionais.
Ao Prof. Dr. Vinícius Duval, pela disponibilidade de sempre. Nesta
caminhada pelo saber, seus conselhos foram determinantes.
À CAPES, pelo financiamento da minha Pós-Graduação.
À minha família em Porto Alegre: Sr. Araújo, Dona Marli, Ricardo e Jô,
Matheus e Shay; obrigado por tudo.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para realização
deste trabalho.
À Família Mattis: tio Harlei, tia Rose, Leo, Fred e Pri; obrigado pela
amizade, atenção, carinho e apoio em todos os momentos, pela acolhida calorosa
ao Rio Grande do Sul.
Aos meus amigos e colegas de Doutorado em CTBMF: Ana Cláudia
Lustosa, Aírton Chaves Jr., Bruna Fronza, Henrique Ramos de Oliveira e Taís
Novaes Silva, com quem compartilho esta vitória; e aos demais amigos e colegas
de pós-graduação em Odontologia que aqui estiveram de 2003 a 2007,
especialmente a: José Luiz Pretto e Dubines Ramírez.
À minha amiga conterrânea, colega de Pós-Graduação, Dra. Dúcia Caldas
Cosme da Trindade, pela paciência em fazer a leitura da minha tese colaborando
para o seu término com importantes considerações.
Aos professores Dra. Daniela Nascimento Silva e Dr. Rogério Belle de
Oliveira pela grande contribuição na construção desta tese.
RESUMO
RESUMO RESUMO
RESUMO
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estudar a intensidade do infiltrado inflamatório
agudo presente em tecido conjuntivo perilesional do dorso de ratos submetidos à
irradiação laser de baixa potência (InGaAlP, λ 685 nm) após uma única aplicação.
Foram utilizados dezoito ratos machos, linhagem Wistar, pesando entre 250 e 300
gramas, nos quais foram realizadas feridas cirúrgicas padronizadas. Os animais foram
separados aleatoriamente em seis grupos, três experimentais e três controles, compostos
por quatro e dois ratos, cada grupo, respectivamente. Os grupos experimentais foram
irradiados em quatro pontos perilesionais eqüidistantes, com uma única dose de 0,5
J/cm
2
por ponto, com potência de 35 mW, freqüência de 35 pulsos por segundo e tempo
de aplicação por ponto de 17 s. Os grupos controles não foram irradiados. Os animais
foram mortos 6, 12 e 24 horas após a irradiação, sendo obtidas peças operatórias que
seguiram para processamento laboratorial de rotina, confeccionadas lâminas e coradas
pela técnica da hematoxilina e eosina. O estudo das lâminas foi realizado através da
descrição e contagem absoluta dos granulócitos pelo método esteriológico. Os resultados
obtidos demonstraram que há uma diminuição no número total de granulócitos, nos
grupos experimentais, não significante estatisticamente (p>0,05), quando comparados
aos grupos controles. Os resultados obtidos sugeriram que a luz laser é capaz de diminuir
a intensidade do infiltrado inflamatório agudo nas primeiras 24 horas após uma única
irradiação, no tecido conjuntivo perilesional.
Palavras-Chaves
1
: Irradiação a Laser de Baixa Potência. Inflamação. Granulócitos.
1
Bireme - Descritores em Ciências da Saúde. Disponível em http://decs.bvs.br .
ABSTRACT
ABSTRACT ABSTRACT
ABSTRACT
ABSTRACT
The aim of this work was study the intensity of acute inflammatory infiltrate in
connective tissue after low level laser therapy (InGaAlP, λ = 685 nm) irradiation.
Eighteen male Wistar rats (250 to 300 grams) with standardized surgical wounds
were randomly distributed into 6 groups - 3 study groups with 4 rats each, and 3
control groups with 2 rats each. In the study groups, four equidistant spots around
the standardized wound were irradiated (0.5 J/cm
2
, 35 mW, 35 Hz, 17 seconds). The
control groups were not irradiated. The animals were killed at 6, 12 and 24 hours
after laser therapy. Biological specimens were harvested and routinely processed;
slides were prepared and stained with hematoxiline and eosine. The total number of
granulocytes was counted using the stereological method. A non-statistically
significant decrease in the total number granulocytes was observed in the all study
groups. Our results suggested that one single irradiation with laser light reduced the
total number of graunulocytes in the animal model used in this study.
Key words
2
: Laser Therapy, Low level. Inflammation. Granulocytes.
2
MeSH: Medical Subject Headings; disponível em: www.nlm.nih.gov/mesh
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Equipamento Laser Theralase®, DMC Equipamentos Ltda., São
Carlos/SP ................................................................................................
51
Figura 2 - Procedimentos para confecção de ferida cirúrgica – Tricotomia (A);
Marcação com o punch (B); Incisão (C) e Ferida cirúrgica (D)
................................
53
Figura 3 - Desenho esquemático, modificado de Smith et al. (2000), mostrando
os pontos de irradiação laser ................................................................
.........................
54
Figura 4 - Desenho esquemático, modificado de Smith et al. (2000), mostrando
a elipse perilesional no dorso do rato ................................................................
.............
55
Figura 5 - Coloração HE mostrando os granulócitos no tecido conjuntivo no
grupo Controle 6 h, aumento de 400x ................................................................
............
59
Figura 6 - Coloração HE mostrando os granulócitos e edema no tecido
cojuntivo (setas) no grupo Experimental 6 h, aumento de 400x
................................
60
Figura 7 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Controle 12 h,
aumento de 400x ................................................................................................
............
61
Figura 8 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Experimental 12 h,
aumento de 400x ................................................................................................
............
61
Figura 9 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Controle 24 h,
aumento de 400x ................................................................................................
............
62
Figura 10 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Experimental 24
h, aumento de 400x ................................................................................................
........
63
Figura 11 - Média e Erro Padrão dos grupos ................................
................................
64
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição dos animais nos grupos ................................
............................
50
Tabela 2 - Quantidade de granulócitos encontrados em cada grupo
.............................
63
Tabela 3 - Sumário dos dados estatísticos ................................
................................
64
Tabela 4 - Comparação das diferenças das médias entre os grupos
............................
64
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ATPase Adenosina trifosfatase
cAMP Adenosina monofosfato cíclica
cm
2
Centímetro(s) quadrado(s)
cm
3
Centímetro(s) cúbico(s)
CNS Conselho Nacional de Saúde
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CO
2
Dióxido de carbono
DE Densidade de energia
DNA Ácido desoxirribonucleico
ECF Fator quimiotático para eosinófilos
Fig. Figura
g Grama(s)
h. Hora(s)
HE Hematoxilina e Eosina
HILT High-Intensity Laser Therapy
IgE Imunoglobulina E
IL-1β Interleucina 1 Beta
LILT Low-Intensity Laser Therapy
LTB
4
Leucotrieno B
4
LTC
4
Leucotrieno C
4
LTD
4
Leucotrieno D
4
LTE
4
Leucotrieno E
4
M Molar
ml Mililitro(s)
mW Miliwatt(s)
NCF Fator quimiotático para neutrófilos
mm Milímetro(s)
nm Nanômetro(s)
nº Número
pH Potencial hidrogeniônico
PAF Fator de ativação plaquetário
PCR Reação em cadeia da polimerase
PGD
2
Prostaglandina D
2
PMN
PUCRS
Polimorfonucleares
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
QTC-PCR
RNA
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Ácido ribonucleico
SLAT Selective Laser Treatment
SRS-A Substância de reação lenta de anafilaxia
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TXA
2
Tramboxano A
2
TXB
2
Tramboxano B
2
USA United States of America
λ
Comprimento de onda
µg Micrograma(s)
® Marca registrada
W/cm
2
Watt(s) por centímetro quadrado
ms Milisegundo(s)
Hz Hertz
mW/cm
2
Miliwatt(s) por centímetro quadrado
J/cm
2
Joule(s) por centímetro quadrado
J/m
-2
Joule(s) metro quadrado
Ca
+2
Cátodo de cálcio
Exp. Experimental
Contr. Controle
vs Versus
SUMÁRIO
SUMÁRIO SUMÁRIO
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................
................................
24
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................
..........................
27
2.1 INFLAMAÇÃO ................................................................
................................
27
2.1.1 Inflamação Aguda ................................................................
................................
29
2.1.2 Infiltrado inflamatório agudo ................................................................
.......................
31
2.2 LASER DE BAIXA POTÊNCIA ................................................................
.......................
33
2.2.1 Laser de Baixa Potência: Biomodulação Tecidual
................................
35
2.3 LASER DE BAIXA POTÊNCIA E INFLAMAÇÃO AGUDA
................................
40
3 OBJETIVO ................................................................................................
......................
46
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................
...............................
48
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ................................................................
...........................
48
4.2 DELINEAMENTO DA PESQUISA ................................
................................
48
4.2.1 Paradigma e Delineamento ................................................................
..........................
48
4.3 PROBLEMA ................................................................
................................
49
4.4 HIPÓTESE ................................................................................................
......................
49
4.5 AMOSTRA ................................................................................................
......................
49
4.5.1 Modelo Animal e Organização dos Grupos ................................
................................
50
4.6 LASER DE BAIXA POTÊNCIA ................................................................
.........................
50
4.7 INSTRUMENTAL CIRÚRGICO E MATERIAL DE CONSUMO
................................
51
4.8 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO ................................................................
......................
52
4.9 IRRADIAÇÃO LASER ................................................................
................................
54
4.10 MORTE DOS ANIMAIS ................................................................
................................
55
4.11 INSTRUMENTO E COLETA DOS DADOS ................................
................................
56
4.11.1 Obtenção dos Cortes Histológicos ................................
................................
56
4.11.2 Análise dos Cortes Histológicos ................................
................................
56
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS COLETADOS
................................
57
5 RESULTADOS ................................................................
................................
59
5.1 ANÁLISE DESCRITIVA ................................................................
................................
59
5.1.1 Grupos 6 horas ................................................................
................................
59
5.1.2 Grupos 12 horas ................................................................
................................
60
5.1.3 Grupos 24 horas ................................................................
................................
62
5.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................
................................
63
6 DISCUSSÃO ................................................................
................................
66
7 CONCLUSÃO ................................................................
................................
72
REFERÊNCIAS ................................................................
................................
74
ANEXO A – APROVAÇÃO DA COMISSÃO CIENTÍFICA E DE
ÉTICA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DA PUCRS
................................
80
23
INTRO
INTRO INTRO
INTRODUÇÃO
DUÇÃODUÇÃO
DUÇÃO
24
1 INTRODUÇÃO
A Cirurgia Buco-Maxilo-Facial lida diretamente com processos inflamatórios,
agudos ou crônicos, de origem infecciosa e traumática, ou originados pelas próprias
intervenções cirúrgicas. Dor e edema são as maiores queixas dos pacientes, e estas
ocorrem devido aos fenômenos fisiológicos da inflamação, principalmente durante a
fase aguda.
A inflamação é uma resposta fisiológica normal que tem função de combater o
agente agressor responsável pelo mecanismo de lesão tecidual e/ou celular,
podendo este ser de origem física, química e biológica. (CATANZARO, 1991;
COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000; PEREIRA; BURINI, 1991; PEREIRA-PINTO et al.,
1997).
Pode-se controlar a resposta inflamatória de forma farmacológica, através de
antiinflamatórios, ou com a utilização de medidas não-farmacológicas como
acupuntura, fisioterapia ultrassônica, laser de baixa potência, etc. Dentre as
intervenções não-farmacológicas para resolução de processos inflamatórios, o laser
de baixa de potência surgiu como uma alternativa promissora. (LOPES-MARTINS et
al., 2005).
O laser de baixa potência é uma técnica desenvolvida e aplicada à
Odontologia, utilizada há décadas em algumas partes do mundo por médicos,
dentistas, fisioterapeutas e veterinários. Esta tecnologia pode oferecer muitos
benefícios terapêuticos aos pacientes, como a aceleração da cicatrização e alívio da
dor. Há muito a ser aprendido sobre os mecanismos, reconhecimento da janela
terapêutica, e como usar apropriadamente este fenômeno celular para o alcance dos
objetivos do tratamento. (SUN; TUNÉR, 2004).
A palavra laser é um acrônimo para Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation (luz amplificada pela emissão de radiação estimulada), sendo
25
instrumento capaz de levar energia aos tecidos com grande precisão. Os princípios
que guiaram o seu desenvolvimento foram postulados em 1917 por Einstein. O
primeiro relato in vivo do uso da radiação laser em Odontologia foi feito por Goldman
em 1965, que utilizou um laser de rubi para irradiar um dente vital. (PINHEIRO;
FRAME, 1992).
A irradiação laser como uma modalidade fototerapêutica para indução ou
aceleração do processo de reparo foi introduzida por Mester e colaboradores na
década de 70 do século XX, mas ainda hoje não é uma terapia estabelecida.
(SCHINDL et al., 2000).
Os estudos sobre laser de baixa potência e inflamação são poucos e muito
recentes, principalmente quando se trata das células envolvidas na inflamação
aguda. Existem estudos que aplicam esta terapia em situações clínicas da
Odontologia, como Antunes et al. (2007), que usaram o laser de baixa potência
(InGaAlP, 660 nm) na prevenção de mucosite oral em pacientes transplantados.
Porém, é importante conhecer os fenômenos biológicos envolvidos no mecanismo
de ação da laserterapia para se indicar precisamente o seu uso.
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a intensidade do infiltrado
inflamatório agudo presente no dorso de ratos submetidos à irradiação laser de
baixa potência (InGaAlP, 685 nm).
26
REVISÃO DA LITERATURA
REVISÃO DA LITERATURA REVISÃO DA LITERATURA
REVISÃO DA LITERATURA
27
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 INFLAMAÇÃO
Uma ferida é uma quebra na integridade epitelial da pele e pode ser
acompanhada pela ruptura da estrutura e da função das subcamadas do tecido
normal. Pode resultar de uma incisão precisa pelo bisturi ou pelo dano comum ao
tecido (trauma – contusão, hematoma, laceração ou abrasão, e queimaduras). A
continuidade da pele deve ser restaurada porque ela exerce um papel crucial na
manutenção da homeostasia. (LEAPER; HARDING, 1998).
Vários estímulos exógenos ou endógenos podem causar lesão celular, e os
mesmos também provocam uma reação complexa, no tecido conjuntivo
vascularizado, incluindo o plasma, células circulantes, vasos sangüíneos, e
constituintes celulares e extracelulares do tecido conjuntivo, chamada de inflamação.
(COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000).
A inflamação é basicamente uma seqüência de reações ordenadas, que se
iniciam com uma atividade aguda, evoluindo para um processo crônico, alcançando
a resolução através da reparação tecidual. A inflamação seria a resposta orgânica
mais elementar dos seres vivos que têm sistema vascular, além de ser essencial à
continuidade da vida. A mesma pode ser caracterizada como um processo dinâmico,
que conduz à cura após a eliminação do agente flogístico. O resultado na rede
vascular, em resposta às agressões, provoca vasodilatação, aumento da
permeabilidade e possibilita transmigração celular. (CATANZARO, 1991; SIQUEIRA
JÚNIOR; DANTAS, 1996).
Inflamação ou flogose é classicamente definida como uma reação de defesa do
organismo, inespecífica, a princípio local, frente a agentes agressores de natureza física,
química ou biológica, e é considerada, fundamentalmente, uma resposta protetora cujo
objetivo final é livrar o organismo da causa inicial da lesão celular e das conseqüências
28
desta. O processo inflamatório pode ser dividido em duas fases: aguda e crônica. A
primeira é relativamente curta, durando minutos, horas ou alguns dias, e tem como
característica, exsudação de líquido e proteínas plasmáticas, causando edema, e a
migração de leucócitos, predominantemente neutrófilos. A segunda é mais longa e
está associada à presença de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos
sangüíneos, fibrose e necrose tecidual. Basicamente, seja a inflamação aguda ou
crônica, envolve a microcirculação, o sangue e o tecido conjuntivo. (CATANZARO,
1991; COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000; PEREIRA-PINTO et al., 1997; SIQUEIRA
JÚNIOR; DANTAS, 1996).
As células inflamatórias aparecem no local da lesão cerca de seis horas após
o desencadeamento inicial dessa, com as margens da ferida contendo fagócitos,
sendo que nas próximas 24 horas com predomínio de polimorfonucleares.
(PEREIRA; BURINI, 1991).
A inflamação pode ser dividida em fase inicial e tardia dependendo do tempo
e duração da resposta e do tipo de célula inflamatória envolvida. A fase inflamatória
inicial dura de 1 a 2 dias e inicia-se com a ativação do sistema imunológico pelas
vias clássica e alternativa da cascata do sistema complemento. Isso leva à infiltração
da ferida pelos neutrófilos granulócitos (leucócitos polimorfonucleares) que são
atraídos para o local da ferida dentro de 24 a 48 horas após a lesão por inúmeros
quimiotáxicos como:
• Fragmentos protéicos da matriz extracelular;
• Fator de crescimento transformador β (TGF-β);
• Componentes do sistema complemento (C3a e C5a);
• Peptídeos formil-metionina, produtos bacterianos.
Dentro de um curto tempo, os leucócitos polimorfonucleares aderem-se às
células endoteliais na periferia dos vasos sanguíneos (marginação) e começam a
moverem-se ativamente através da parede vascular (diapedese). Uma vez no sítio
inflamatório, eles fagocitam a bacteria e outras partículas estranhas ao organismo,
liberando enzimas degradantes e radicais livres derivados de oxigênio. A principal
29
função do leucócito polimorfonuclear é minimizar a contaminação bacteriana da
ferida, assim prevenindo a infecção, e participar do processo cicatricial nas próximas
fases. (LEAPER; HARDING, 1998).
Muito do conhecimento sobre inflamação é baseado em estudos realizados
na pele, músculo e cavidade pleural. Há muitas evidências de que existem
diferenças importantes, nos diferentes órgãos, em relação aos fenômenos
vasculares. Aplicar os resultados de estudos sobre inflamação na pele para a
inflamação dos outros órgãos é questionável e pode não ser adequado. É razoável
assumir que os mediadores com um importante papel na pele também devem ter
importância em outros órgãos. (TROWBRIDGE; EMLING, 1996).
2.1.1 Inflamação Aguda
A resposta inflamatória aguda está estreitamente interligada ao processo de
reparo, servindo para destruir, diluir ou encerrar o agente lesivo, movimentando uma
série de eventos responsáveis pela cicatrização e reconstituição do tecido
danificado. (COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000).
Ela pode ocorrer sem o envolvimento evidente do sistema imune. Sua
duração e a intensidade devem ser cuidadosamente reguladas para controlar o dano
tissular e facilitar os mecanismos de reparo deste tecido necessários para a
cicatrização. (GOLDSBY; KINDT; OSBORNE, 2002).
Inflamação aguda refere-se à resposta que começa de maneira abrupta e em
pouco tempo. Assim uma inflamação aguda está associada à uma agressão súbita.
Aguda também se refere a um tipo específico de resposta, envolvendo reação
exsudativa durante a qual fluido, proteínas do soro e leucócitos deixam a corrente
sangüínea e dirigem-se para o local da agressão. (TROWBRIDGE; EMLING, 1996).
30
Macroscopicamente, a inflamação é manifestada pelo rubor, calor, edema, e
dor, os quais são o resultado da vasodilatação capilar e aumento da permeabilidade.
Essas mudanças vasculares “abrem os portões” entre os vasos sanguíneos e a
ferida e facilitam o extravasamento de proteínas séricas dentro da lesão. Em nível
celular, essas mudanças fisiológicas são complexas e um processo altamente
regulado envolve o sistema nervoso, citocinas, quimiocinas, e fatores de
crescimento. A vasodilatação capilar e o aumento da permeabilidade são
estimulados por vários fatores, e, em muitos casos, ambos os fenômenos são
influenciados pelo mesmo fator. O papel do sistema nervoso é demonstrado na
inflamação pela vasodilatação e o aumento da permeabilidade que seguem a
estimulação antidrômica dos nervos sensitivos. Os mastócitos produzem um número
de mediadores vasoativos, como a histamina e os leucotrienos C4 e D4, os quais
estimulam a vasodilatação. A histamina também estimula indiretamente a
vasodilatação pelo aumento da produção das prostaglandinas. As cininas, pela
produção da cascata da coagulação, também aumentam a permeabilidade capilar. A
trombina não só participa da hemostasia pela ativação plaquetária como também
contribui no processo inflamatório pela estimulação do aumento da permeabilidade.
Os fatores C3a e C5a do sistema complemento também têm um duplo papel pela
estimulação vasodilatadora e na quimiotaxia para células inflamatórias circulantes
que entram no local da lesão através da diapedese e perpetuam o processo
inflamatório. As células polimorfonucleares (PMNs) são as primeiras células
inflamatórias a chegarem no local da ferida cutânea. Muitos fatores de crescimento e
citocinas, como o PDGF, interleucina IL-8, entre outros, atraem os
polimorfonucleares para ferida. A presença dos PMNs em feridas não infectadas é
relativamente curta, com um pico populacional entre 24 e 48 horas. Os PMNs podem
produzir muitas citocinas proinflamatórias, como IL-1α, IL-1β, IL-6, e fator de necrose
tumoral (TNF). (BAUM; ARPEY, 2005).
Seqüência dos eventos da resposta inflamatória, segundo Gartner e Hiatt
(2003):
a) A histamina causa vasodilatação e aumenta a permeabilidade dos vasos
sangüíneos na vizinhança.
31
b) Componentes do complemento extravasam dos vasos sangüíneos e são
cindidos por proteases neutras formando agentes inflamatórios adicionais.
c) O fator quimiotáxico para eosinófilos atrai eosinófilos para o local da
inflamação. Estas células fagocitam complexos antígeno-anticorpo,
destroem quaisquer parasitos presentes e limitam a resposta inflamatória.
d) O fator quimiotáxico para neutrófilos atrai neutrófilos para o local da
inflamação. Estas células fagocitam e matam microorganismos, quando
presentes.
e) Os leucotrienos C
4
, D
4
e E
4
aumentam a permeabilidade vascular. Eles são
vários milhares de vezes mais potentes que a histamina, em seus efeitos
vasoativos.
f) O fator ativador de plaquetas aumenta a permeabilidade vascular.
g) O tromboxano A
2
é um poderoso mediador agregador de plaquetas e
também causa vasoconstricção. Ele é rapidamente transformado em
tromboxano V
2
, sua forma inativa.
h) A bradicinina é um poderoso dilatador vascular, que causa aumento da
permeabilidade vascular. Ela também é responsável pela sensação de dor.
2.1.2 Infiltrado inflamatório agudo
A resposta inflamatória a agentes nocivos tem estágios diferentes. Cada
estágio é distinguido pela composição característica das células constituintes do
infiltrado inflamatório. A maioria dos danos resulta em tecido lesivo levando à ativação
do Sistema Complemento pela via alternativa. Os eventos que aumentam a liberação
32
de diferentes proteases teciduais, os diferentes tipos de polissacarídeos ou processos
que promovam a coagulação sangüínea com geração de trombina e plasmina,
resultam na ativação do fator C3 complemento e sua clivagem em C3a e C3b. O
último ativa C5 que é dividido em C5a e C5b. O fator C5a tem mostrado ser um
potente liberador de grânulos contidos nos mastócitos. (PARWARESCH et al., 1985).
A degranulação dos mastócitos, desta maneira, segue imediatamente o tecido
lesivo não-específico e a ativação do Sistema Complemento em outros eventos
inflamatórios iniciais. A histamina liberada pelos mastócitos tem um papel decisivo
na hiperemia regularmente associada aos estágios iniciais da inflamação. Este
mecanismo ativo resulta em edema inflamatório. Enquanto essa fase da inflamação
é principalmente governada pelos transmissores não-celulares, durante o próximo
estágio, neutrófilos e monócitos atraídos posteriormente pelos leucotrienos
mastocitários, como fator quimiotático para neutrófilos (NCF), aparecem na área da
inflamação. (PARWARESCH et al., 1985; ZHONG; ZHEN, 1991).
O infiltrado inflamatório agudo é a população celular mais envolvida na fase
inicial da inflamação, sendo constituído por células leucocitárias oriundas do sangue:
neutrófilos, eosinófilos e basófilos, ditos granulócitos, por conterem grânulos
evidentes em seu citoplasma, ou ainda, polimorfonucleares, devido à forma de seus
núcleos. A intensidade do infiltrado inflamatório pode ser determinada pela
quantidade de granulócitos existente. (PEREIRA-PINTO et al., 1997).
Os granulócitos deixam a corrente sangüínea, entram nos tecidos, e
fagocitam e degradam as bactérias, imunocomplexos e tecido necrótico através das
etapas: marginação, adesão, migração, quimiotaxia, opsonização, fagocitose,
degranulação, degradação ou morte. Na inflamação aguda, os neutrófilos são os
primeiros que saem dos vasos em um número significante. A infiltração do neutrófilo
no tecido atinge o pico nas primeiras 6 horas de uma resposta inflamatória.
(GOLDSBY; KINDT; OSBORNE, 2002; TROWBRIDGE; EMLING, 1996).
Os neutrófilos atuam contra microorganismos, constituindo-se na maioria das
vezes, na primeira linha de defesa celular contra a invasão bacteriana no organismo.
33
O eosinófilos têm como funções fagocitar e destruir determinados complexos
antígeno-anticorpo e limitar e circunscrever o processo inflamatório. Estes também
fagocitam bactérias, porém mais lentamente que os neutrófilos. Os basófilos, assim
como os mastócitos, são degranulados pela formação do complexo antígeno-
anticorpo em sua superfície, o que sugere seu envolvimento nas reações alérgicas.
(SIQUEIRA JÚNIOR; DANTAS, 1996; TROWBRIDGE; EMLING, 1996).
A resposta celular da fase inflamatória é caracterizada pelo influxo de
leucócitos na área da lesão. No estágio inflamatório inicial, neutrófilos e monócitos
são as células predominantes. Logo após a lesão, neutrófilos e monócitos começam
a migrar dos capilares para o local agredido, sendo os PMNs os primeiros a chegar
e em grande número. Os PMNs são recrutados pelos fatores quimiotáticos liberados
durante a hemostasia e pelos mastócitos. Os fatores quimiotáticos gerados durante
o processo de coagulação, como a calicreína, fibrinopeptídeos liberados do
fibrinogênio, e produtos da degradação da fibrina, também servem para regular a
expressão de importantes moléculas de adesão intracelular. As substâncias
liberadas pelos mastócitos, como fator de necrose tumoral, histamina, proteases,
leucotrienos, e citocinas, representam fontes adicionais de sinais quimiotáticos para
o recrutamento de leucócitos. Os fatores de crescimento PDGF e TGF-β também
são potentes fatores quimiotáticos para leucócitos. Uma vez no local da ferida,
receptores de integrina encontrados na superfície celular dos neutrófilos aumentam
a interação da matriz extracelular. Isso permite aos PMNs realizarem suas funções
de matadores e fagócitos de bactérias e proteínas da matriz danificadas no leito da
ferida. (LI; CHEN; KIRSNER, 2007).
2.2 LASER DE BAIXA POTÊNCIA
Uma das mais significantes descobertas da ciência no século passado foi o
laser. Ele envolve novas e incalculáveis perspectivas no campo das pesquisas
biológicas e aplicações nos mais diversos campos da saúde. A laserterapia tornou-
34
se uma realidade em muitos países. Seu emprego, por profissionais da área
odontológica e médica, tem crescido constantemente. (MESTER; MESTER;
MESTER, 1985).
Os lasers são classificados de acordo com muitos critérios. A mais ampla
classificação é aquela que divide os lasers em dois grandes grupos, de acordo com a
sua ação terapêutica em lasers cirúrgicos e os lasers clínicos. Os lasers podem ser
também classificados de acordo com seu funcionamento, em contínuo ou pulsátil, e
ainda com a natureza do seu meio ativo em sólidos, gasosos, ou semicondutores.
Como exemplo de meio ativo sólido cita-se o laser rubi; de meio gasoso, o CO
2
e o
He-Ne; meio líquido (laser com corante ou dye laser), o rodamina e o cumarina;
semi-sólidos, o YAG e os de neodímio. Os lasers semicondutores são os de
arseneto de gálio (AsGa), arseneto de gálio-alumínio (AsGaAl) e fosfeto arseneto de
gálio-índio (InGaAsP). Os lasers mais comuns são variações do gálio: arseneto de
gálio-alumínio ou alumínio-arsênio (AsGaAl), que emite um espectro na faixa do
infravermelho, ou o fosfeto arseneto de gálio-índio (InGaAsP), que emite espectro
visível de luz vermelha (λ=600-680 nm) com potência entre 10 e 50 mW.
(GENOVESE, 2000; WALSH, 1997).
Também é utilizada a seguinte classificação: os lasers cirúrgicos ou HILT
(High-Intensity Laser Therapy), os lasers não-cirúrgicos, terapêuticos, LILT (Low-
Intensity Laser Therapy), ou ainda, laser de baixa potência, em inglês LLLT (Low-
Level Laser Therapy), e os SLAT (Selective Laser Treatment). (PINHEIRO; FRAME,
1992).
Os parâmetros fundamentais do protocolo de irradiação laser essencial para
comparação dos dados são os seguintes: comprimento de onda, freqüência,
potência de saída, diâmetro do spot, tempo de irradiação, intensidade, dose, e
intervalos de tratamento. O tamanho do spot e o tempo de exposição são de
importância significante porque eles determinam a intensidade e a dose e, portanto,
as respostas celulares para a incidência da luz. Atermicidade e reações fotoquímicas
são a base do laser de baixa potência, ocorrendo com densidades de potência entre
35
10
-2
e 10
0
W/cm
2
e densidades de energia entre 10
-2
e 10
2
J/cm
2
. (SCHINDL et al.,
2000).
O comprimento de onda depende do meio ativo que também determina a
afinidade ou não do laser com o tecido-alvo (BRUGNERA JÚNIOR et al., 2003). A
escolha do comprimento de onda determina a profundidade de penetração do laser
nos diferentes tecidos (KNAPPE; FRANK; ROHDE, 2004).
2.2.1 Laser de Baixa Potência: Biomodulação Tecidual
As funções terapêuticas no campo da biomodulação do processo inflamatório
são geralmente desenvolvidas no espectro vermelho e infravermelho da luz, de λ
600 nm a λ 900 nm, aproximadamente. (TUNÉR; CHRISTENSEN, 2003).
A atuação do laser de baixa potência ocorre no campo da biomodulação,
descrita também como bioestimulação. Muitas vezes encontram-se as duas
terminologias na literatura desenvolvidas como sinônimos. Biomodulação seria a
nomenclatura mais apropriada, visto que, esta terapia poderia tanto estimular o
processo biológico, atrasar o processo de reparação, como suprimi-lo,
intencionalmente ou não, trabalhando na dependência do fenômeno biológico
desejado. (BASFORD, 1995; BELKIN, SCHWARTZ, 1989; SCHINDL et al., 2000;
TUNÉR; CHRISTENSEN, 2003).
À biomodulação atribui-se o aumento do alcance dos efeitos biológicos, desde
o crescimento epitelial e fibroblástico, estimulação da síntese de colágeno, aumento
da capacidade de fagocitose e de liberação de endorfina. (MESTER; MESTER;
MESTER, 1985).
Densidades de energia diminutas poderiam não provocar efeitos observáveis,
enquanto que altas doses eventualmente acarretariam na diminuição das funções
36
celulares. Foi estabelecido, em relação ao uso “in vivo” do laser, que potências
menores que 4 mW não proporcionariam, nos tecidos, efeitos biológicos,
independentemente do tempo total de irradiação. Em relação à quantidade de
energia, observou-se que, para a promoção de efeitos biológicos, deveriam ser
privilegiadas doses de no mínimo 1.10
4
J/m
-2
e no máximo 4.10
4
J/m
-2
, pois
dosimetrias mais elevadas poderiam acarretar na inibição da resposta celular.
(SOMMER et al., 2001).
A terapia com laser de baixa potência envolve a irradiação de 1 a 4 J/cm
2
no
local de tratamento, com potência estabelecida entre 10 mW a 90 mW. Felizmente, a
irradiação laser e a óptica tecidual foram estudadas extensivamente. As
características da irradiação laser – coerência, colimação, e monocromaticidade –
foram examinadas em detalhes. Em particular, a coerência e colimação não foram
cruciais já que elas foram rapidamente degradadas pelo espalhamento como um raio
passa através do tecido. Apoiando sua relativa falta de importância está o fato que
tanto os diodos laser quanto a luz não-coerente podem alterar os processos
biológicos. Monocromaticidade, contudo, pareceu ser uma característica importante.
Estudos laboratoriais suportaram o conceito que a irradiação laser pode modificar os
processos celulares na dependência do comprimento de onda, de comportamento
não-térmico. Outra hipótese é que a intensidade suficiente para produzir esses efeitos
nas células poderia ser distribuída para as uniões superficiais e tecidos tipicamente
tratados com laserterapia. (BASFORD, 1995).
Os mecanismos básicos da interação tecido – irradiação do laser de baixa
potência, ainda não estão esclarecidos. Os mecanismos de ação da irradiação
ultravioleta foram investigados intensivamente, e serviram de parâmetro para várias
hipóteses bem estabelecidas na indução de efeitos fotobiológicos nas células pela
luz visível e luz infravermelha de baixa intensidade. Basicamente, dois tipos de
reações podem ser distinguidos em fotobiologia: primárias (induzidas pela luz) e
secundárias (não-esclarecidas). Pelo menos quatro diferentes explanações têm sido
propostas para responder a questão de como a irradiação do laser não-cirúrgico
pode interagir com células vivas. A teoria de Olson afirma que a absorção primária
da luz pelas enzimas mitocondriais resultam no aquecimento local ocasionado pelo
37
aumento da vibração molecular; a teoria de Karu explica que a luz laser induz efeitos
estimulantes e inibitórios, respectivamente, sendo o resultado da absorção laser
pelas flavinas e citocromos na cadeia respiratória mitocondrial, principalmente para
alterações de transferência de elétrons na oxi-redução aí existente; a teoria de
Lubart relata que a existência de oxigênio simples fotoinduzido pelas porfirinas
endógenas é outro caminho provável; a teoria de Smith, uma modificação da teoria
de Karu, mostra que próximo à radiação infravermelha em um caminho adicional
poderia ativar diretamente os canais de Ca
2+
na membrana celular pelas
modificações fotofísicas, desta maneira induzindo o influxo de Ca
2+
e a proliferação
celular. Provavelmente, dois ou mais destes caminhos podem ser influenciados
simultaneamente pela irradiação laser e contribuir para as respostas biológicas
observadas. A alteração do pH intracelular, que é relatado para a ativação das
ATPases e seguido pelas mudanças nos níveis de cálcio intracelular, é o caminho
comum para o sinal de transdução e amplificação de todas as reações primárias.
Uma mudança no estado de oxi-redução em direção a oxidação leva ao aumento do
Ca
2+
intracelular e à estimulação do metabolismo celular, uma vez que a redução
leva ao esgotamento do Ca
2+
intracelular e, assim, a inibição do metabolismo. Altos
níveis de Ca
2+
intracelular são necessários para estimular vários processos
biológicos como a síntese de DNA e RNA, mitose celular, e secreção proteica.
Ainda, altos níveis de Ca
2+
podem levar a inibição do metabolismo celular.
(SCHINDL et al., 2000).
A estimulação mitocondrial foi proposta por Karu (1989). Fotorreceptores
podem fazer parte da cadeia respiratória mas a fotosensibilidade não é específica
para a luz laser. É possível que a luz monocromática possa modificar a proliferação
celular. A concentração de cAMP muda nas células após elas serem irradiadas em
638,8 e 760 nm. A autora propôs que a luz do laser de baixa potência, visível, pode
estimular as células para aumentarem sua proliferação. A fotorecepção, ocorrendo
em nível mitocondrial, pode intensificar o metabolismo respiratório e as
propriedades eletrofisiológicas da membrana, desta maneira, mudando a fisiologia
celular. Afirmou ainda que a biomodulação laser é um fenômeno fotobiológico e
que não é necessária a coerência da luz. Os fotoaceptores primários são
componentes da cadeia respiratória. Isto explica a universalidade dos efeitos do
laser de baixa potência. Os componentes da cadeia respiratória podem ser os
38
fotoaceptores no caso da estimulação do metabolismo celular, bem como
inibidores dependendo da dose de energia. Em baixas doses, a irradiação causa
regulação da oxi-redução do metabolismo celular; em altas doses o dano é
prevalente. O quantum de luz é somente um gatilho para a regulação do
metabolismo celular. Isto explica as baixas doses e intensidades necessárias. A
magnitude do efeito de bioestimulação depende do estado fisiológico da célula
antes da irradiação. Isto explica por que o efeito de bioestimulação não é sempre
possível. Os efeitos terapêuticos do laser de baixa potência podem ser explicados
pelo aumento da proliferação do G
0
e G
1
celular ou pelas mudanças na atividade
fisiológica das células ativadas.
Foram descritos alguns dos fenômenos que estão associados aos bioefeitos
da laserterapia de baixa potência:
a) Os efeitos requerem um limiar de exposição à irradiação. O limiar é
específico para qualquer combinação tecidual com o comprimento de onda;
b) Os efeitos apresentam estimulação ou inibição de atividades bioquímicas,
fisiológicas e proliferativas;
c) Altas energias, dentro de limites específicos para cada combinação laser-
tecido, ocasionam prejuízo;
d) Os efeitos são dose-dependentes. Esta relação não é simples, mas é
relatada para a maioria das irradiações e parâmetros teciduais;
e) Foi visto que a irradiação coerente não é requerida para obter esses efeitos
e uma pequena faixa de irradiação não-coerente apropriada é suficiente
para produzir a maioria ou todos eles;
f) A irradiação direta do tecido alvo não é sempre requerida. A irradiação
transcutânea penetra profundamente para produzir efeitos suficientes em
muitos casos;
39
g) A irradiação local pode ter efeitos sistêmicos.
Enfatizaram que embora o fenômeno associado ao laser de baixa potência,
os seus bioefeitos estão longe de ser esclarecidos, apesar de existir. Por razões
médicas, científicas e de segurança, e também para evitar charlatanismo, esses
bioefeitos deveriam ser investigados por equipes multidisciplinares de físicos,
biólogos e cirurgiões. (BELKIN; SCHWARTZ, 1989)
Rochkind et al. (1989) estudaram o efeito sistêmico do laser de baixa potência
em ratos. Para tal fim utilizaram um laser de comprimento de onda de 632,8 nm com
potência útil de 16 mW e diferentes densidades de energia por um período de 21
dias. Afirmaram que os efeitos sistêmicos encontrados são relevantes nos termos de
aplicação de irradiação do laser de baixa potência, tanto na clínica quanto em
pesquisas. Concluíram que a irradiação do laser de baixa potência exerce
pronunciados efeitos sistêmicos na pele e nos tecidos subjacentes, e que esses
efeitos persistem muito tempo depois de uma única aplicação.
Kolárová, Ditrichová e Wagner (1999) afirmaram que o conhecimento dos
parâmetros ópticos da pele é importante para todas as espécies de fototerapia.
Analisaram a penetração da luz laser e provaram diferentes propriedades ópticas de
espécimes in vitro de pele normal e tecido granular de úlceras da pele de humanos.
Os resultados demonstraram percentagem de incidência de luz penetrando as
camadas individuais em diferentes localizações na superfície da pele, que é um fator
decisivo para a seleção da dose de irradiação.
Melo et al. (2001) estudaram as propriedades ópticas de diferentes tecidos de
ratos com respeito a variação da intensidade e distribuição espacial da luz. Testaram
principalmente o comprimento de onda de 630 nm, mas também os de 514nm e
670nm. Os valores obtidos proveram bons dados sobre a distribuição de luz nos
tecidos, quando irradiados com laser não difuso. Para todos os tecidos, foi
observada uma distribuição esférica da luz e decomposição exponencial. Estes
resultados são úteis para várias aplicações do laser para bioestimulação
fototerapêutica.
40
Lucas et al. (2002) investigaram se a evidência dos estudos celulares e em
animais com respeito ao processo cicatricial não foi equivocadamente a favor do
laser de baixa potência, o que implicaria que esses modelos deveriam ser
adequados para predizer a resposta do tratamento em pacientes, ou que os dados
dos experimentos celulares e animais foram inconclusivos, o que significaria que
os estudos clínicos foram baseados em evidências insuficientes. Realizaram uma
revisão sistemática sobre estudos celulares e animais que utilizaram o laser de
baixa potência no processo cicatricial através de artigos que foram identificados
pela busca no Medline, Embase, e SPIE (Sociedade Internacional de Engenharia
Óptica). Avaliaram se os estudos mostraram efeito benéfico no tratamento ativo ou
não. Trinta e seis estudos foram incluídos e continham 49 parâmetros de
resultados dos quais 30 reportaram um efeito positivo da irradiação laser e 19 não.
Onze estudos apresentaram dados exatos sobre o efeito do tratamento ativo e dos
controles. O efeito do tamanho da amostra sobre 22 resultados avaliados destes
estudos foi -1,05 (95% Intervalo de confiança: -1.67 to -0.43) a favor do laser de
baixa potência. A qualidade metodológica dos estudos foi pobre. A análise
profunda dos resultados mostrou que o tamanho da amostra não foi significante em
estudos com altos escores de qualidade metodológica [0.06 (95% Intervalo de
confiança: -0.42 to 0.53)]. Resumindo, os dados dos estudos celulares e
experimentais em animais revisados por esses autores falharam ao não mostrar
evidência para substanciar a decisão de realizar estudos com laser de baixa
potência em um grande número de pacientes. Concluíram que este tipo de
fototerapia não deve ser considerada um tratamento adjuvante para o proposto.
2.3 LASER DE BAIXA POTÊNCIA E INFLAMAÇÃO AGUDA
Albertini et al. (2007) investigaram histologicamente os efeitos da irradiação
do laser vermelho com dois diferentes comprimentos de onda (660 nm – modelo
Laser Unit
®
, Kondortech, e 684 nm – modelo Theralase
®
, DMC) em edema de pata
de rato induzido pela carragenina. Foram utilizados 32 ratos machos Wistar
distribuídos aleatoriamente em 4 grupos. Um grupo recebeu injeção de solução
41
salina estéril, enquanto que a inflamação foi induzida pela injeção de carragenina
subplantar (1 mg/pata) nos outros três grupos. Foram utilizados lasers vermelhos de
aplicação contínua com comprimentos de onda 660 e 684 nm, respectivamente, com
potência média de saída de 30 mW, e doses de irradiação de 7,5 J/cm
2
. Os grupos
lasers 660 e 684 nm desenvolveram menor edema, estatisticamente significante
(p<0,01), quando comparados ao grupo controle 4 horas após a indução da
inflamação. Similarmente, ambos os grupos apresentaram um número de células
inflamatórias significantemente menor nos tecidos conjuntivo e muscular
subplantares em relação ao grupo controle. Concluíram que ambos comprimentos
de onda (660 e 684 nm) de laser vermelho de baixa potência foram efetivos na
redução do edema e na migração de células inflamatórias quando a dose de 7,5
J/cm
2
foi utilizada.
Markovic e Todorovic (2007) compararam a efetividade do laser de baixa
potência e dexametasona após extração de terceiros molares inferiores impactados
sob anestesia local. Utilizaram 120 pacientes saudáveis divididos em 4 grupos com
30 indivíduos cada. O grupo 1 recebeu irradiação de laser de baixa potência
(GaAlAs, 637 nm) imediatamente após a cirurgia (densidade de energia de 4 J/cm
2
com aplicação contínua, potência de 50 mW, e comprimento de onda de 637 nm); o
grupo 2 também foi irradiado e recebeu injeção intramuscular de 4 mg de
dexametasona no músculo pterigóide medial; o grupo 3 recebeu irradiação laser de
baixa potência complementada pela injeção de 4 mg de dexametasona no músculo
deltóide, seguida pela injeção da mesma dose intraoralmente 6 horas após a
cirurgia, e o grupo 4 (controle) recebeu somente as recomendações usuais pós-
operatórias (bolsas de gelo, dieta macia, etc.). Os resultados demonstraram que a
irradiação laser de baixa potência com o uso local de dexametasona (grupo 2)
obteve uma redução do edema pós-operatório, estatisticamente significante, quando
comparado aos outros grupos. Não foram observados efeitos adversos tanto da
irradiação laser quanto do uso da medicação. Concluíram que a irradiação laser de
baixa potência após extrações de terceiros molares inferiores inclusos pode ser
recomendada para minimizar o edema e seu efeito é aumentado pela injeção
simultânea intramuscular de dexametasona.
42
Aimbire et al. (2006) availaram a ação do laser de baixa potência (GaAsIAl,
650 nm, modelo Theralase
®
, DMC) sobre a redução dos níveis dose-dependentes de
TNFα na inflamação aguda. Utilizaram dois estudos controlados com 35 ratos Wistar
randomicamente divididos em 5 grupos com 7 animais cada. Instilaram
intrabronquialmente, em um dos lobos pulmonares de cada rato, anti-soro de coelho
para ovalbumina seguida por injeção intravenosa de 10 mg de ovalbumina em 0,5 ml
para indução de lesão pulmonar aguda. O primeiro estudo serviu para definir o perfil
de tempo da atividade do TNFα para as primeiras 4 horas, enquanto que o segundo
estudo comparou 3 diferentes doses para um grupo controle e um grupo
clorpromazina no tempo onde a atividade do TNFα estava aumentada. Os ratos nos
grupos laser de baixa potência foram irradiados durante 5 minutos no local da lesão
por um laser de Arseneto de Gálio-Alumínio (Ga-Al-As) de 650 ηm. Encontraram que
houve um tempo de atraso antes do aumento da atividade do TNFα após a injeção
de ovalbumina. Os níveis de TNFα aumentaram de ≤ 6,9 unidades/ml nas primeiras
3 horas para 62,1 unidades/ml em 4 horas. Uma dose de laser de baixa potência de
0,11 Joules administrada com uma densidade de potência de 31,3 mW/cm
2
em 42
segundos reduziu significantemente o nível de TNFα de 50,2 unidades/ml, p<0,001,
quando comparado ao controle. Concluíram que o laser de baixa potência pode
reduzir a expressão de TNFα após lesão pulmonar imunocomplexa aguda em ratos,
mas a dose de irradiação parece ser crítica para redução da liberação do TNFα.
Lopes-Martins et al. (2005) investigaram o efeito do laser de baixa potência
(InGaAlP, modelo Dermolaser
®
AD2040), de comprimento de onda de 650 ηm, na
pleurisia inflamatória aguda. Um modelo experimental clássico de pleurisia foi
utilizado numa amostra de 40 ratos Balb, randomicamente divididos em 5 grupos. A
inflamação foi induzida pela carragenina (0,5 g/cavidade) administrada através de
injeções intratorácicas. Quatro grupos receberam o agente inflamatório, e um
recebeu injeções de solução salina estéril. Em 1, 2, e 3 horas após as injeções, a
irradiação laser foi realizada, com a mesma potência (2,5 mW), mas diferentes
tempos de irradiação. As densidades de energia em cada sessão de tratamento
foram 0 J/cm
2
(placebo), 3 J/cm
2
, 7,5 J/cm
2
, 15 J/cm
2
, respectivamente. A análise
celular total e diferencial após 4 horas da indução da pleurisia mostrou uma redução
significante da migração celular inflamatória para todos os grupos tratados com laser
ativo. Entretanto, 4 horas após a injeção, a mais significante (p<0,001) redução da
43
migração de leucócitos foi vista no grupo 7,5 J/cm
2
, com 2,7 x 10
6
leucócitos,
enquanto que no grupo controle 7,9 x 10
6
leucócitos. Concluíram que o laser de
baixa potência administrado de 1 a 3 horas após a indução de pleurisia inflamatória
reduz significantemente a mensuração da migração celular inflamatória.
Viegas (2005) avaliou a ação do laser de baixa potência, com dois diferentes
comprimentos de onda, na modulação das reações de inflamação tecidual, quando
aplicado durante a fase inflamatória do reparo de lesões de tecidos moles, e a
qualidade histológica do processo cicatricial ao final de 7 dias. Grupos tratados com
o antiinflamatório meloxicam e grupos sem tratamento foram utilizados como
parâmetros de comparação neste trabalho. Feridas de 8 mm de diâmetro foram
confeccionadas na região dorsal de 64 ratos (Wistar), com auxílio de um punch. Os
animais foram separados aleatoriamente em quatro grupos, de acordo com a terapia pós-
operatória instituída. O grupo A constituiu o controle. O grupo B recebeu tratamento com
meloxicam (1 mg/ 0,1 ml), no pós-operatório imediato e em 48 horas. O grupo C foi
irradiado com laser vermelho de InGaAlP (λ685 nm) e o grupo D, com laser
infravermelho de GaAlAs (λ830 nm), nos mesmos períodos da aplicação do
meloxicam. As irradiações foram realizadas em quatro pontos perilesionais
eqüidistantes, no modo contínuo, pontual, potência de 35 mW, totalizando a energia de 4
J por sessão. Os animais foram mortos em 12, 36, 72 horas e 7 dias após o
procedimento cirúrgico. A análise microscópica deste trabalho, realizada por estudo
de lâminas coradas por hematoxilina e eosina não indicou um efeito antiinflamatório
do laser não ablativo. Os resultados obtidos nos grupos irradiados com diferentes
comprimentos de onda foram semelhantes. Pequenas diferenças foram constatadas.
A análise dos níveis do mRNA de IL-1β não indicou uma diminuição das reações
inflamatórias nos grupos irradiados, quando comparados aos animais tratados com
meloxicam e ao controle. Afirmou que o laser de baixa potência não minimiza as
reações de inflamação tecidual, porém apresenta efeitos que favorecem o reparo
dos tecidos lesados.
Albertini et al. (2004) investigaram o efeito do laser de baixa potência no processo
inflamatório agudo em ratos. Induziram edema na pata dos ratos com injeção subplantar
de carragenina, medindo o volume da pata antes da aplicação e 1, 2, 3 e 4 horas após a
44
injeção utilizando um hidropletismômetro. Para investigar o mecanismo de ação do laser
de Ga-Al-As (modelo Dermolaser
®
AD2040, 650 nm) no edema inflamatório, estudos
paralelos foram realizados usando ratos adrenalectomizados ou ratos tratados com
diclofenaco sódico. Diferentes protocolos de irradiação foram empregados para
densidades de energia, tempo de exposição e repetição de aplicação específicos. Os
ratos foram irradiados com o laser de Ga-Al-As durante 80 segundos por hora. A
densidade de energia que produziu um efeito antiinflamatório foi 1 e 2,5 J/cm
2
, reduzindo
o edema em 27% (P < 0,05) e 45,4% (P < 0,01), respectivamente. A densidade de
energia de 2,5 J/cm
2
produziu efeitos antiinflamatórios similares aos do diclofenaco sódico
em uma dose de 1 mg/kg. Nos animais adrenalectomizados, a irradiação laser falhou em
inibir o edema. Os resultados encontrados sugeriram que a irradiação laser de baixa
potência possivelmente exerce efeitos antiinflamatórios pela estimulação da liberação dos
hormônios corticosteróides adrenais.
Chagas Júnior (2004) avaliou, por meio de contagem absoluta utilizando o método
esteriológico, a quantidade de mastócitos após irradiação do laser de baixa potência
(InGaAlP, λ 685 nm, modelo Theralase
®
, DMC) no dorso de ratos. Os resultados obtidos
demonstraram que nas primeiras 6 e 12 horas após a irradiação laser, houve uma
diminuição no número total de mastócitos, estatisticamente significante, quando
comparados aos grupos controles, porém, após 24 horas não existiram diferenças no
número de mastócitos entre os grupos experimental e controle. Baseados nos resultados
obtidos com a aplicação da luz laser λ 685 nm, concluiu que a luz laser é capaz de
diminuir o número total de mastócitos após uma única irradiação.
Pugliese et al. (2003) realizaram ferimentos cutâneos padronizados no dorso
de 72 ratos Wistar e, em seguida, aplicação pontual do raio laser de baixa potência
do tipo Arseneto de Gálio-Alumínio (Ga-Al-As, 670 nm, potência de 9 mW) com
diferentes densidades de energia. Os animais foram sacrificados com 24, 48 e 72
horas e aos 5, 7 e 14 dias. Procederam à análise das secções teciduais coradas por
hematoxilina-eosina, sírius vermelho e orceína. Observaram, que nos grupos
submetidos à terapia a laser, houve maior redução do edema e infiltrado
inflamatório.
45
OBJETIVO
OBJETIVO OBJETIVO
OBJETIVO
46
3 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi estudar a intensidade do infiltrado inflamatório
agudo presente em tecido conjuntivo perilesional do dorso de ratos submetidos à
irradiação laser de baixa potência após uma única aplicação, através da descrição
do processo inflamatório agudo, quantificação dos granulócitos e comparação dos
resultados dos grupos experimentais com os dos grupos controles.
47
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS
48
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Esta pesquisa seguiu os princípios éticos estabelecidos de acordo com o
capítulo XIV, art. 94-99, das Normas de Pesquisa em Saúde da PUCRS e do
Conselho Nacional de Saúde – Resolução n° 01, de 13 de Junho de 1998, e em
observância da Lei 6688, de 08 de Maio de 1979. Foi submetida à análise pela
Comissão Científica e de Ética da Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul e aprovada em 29 de Junho de 2007
sob o protocolo n
o
0094/05 (ANEXO A).
4.2 DELINEAMENTO DA PESQUISA
4.2.1 Paradigma e Delineamento
Esta pesquisa foi realizada junto ao Programa de Pós-graduação em
Odontologia, Área de Concentração em Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial,
da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do
Sul (PUCRS), como parte integrante da linha de pesquisa “Laser em Odontologia”.
Foi desenvolvida dentro do paradigma tradicional, no delineamento de estudo
experimental verdadeiro, pós-teste com grupo controle (CAMPBELL, 1979).
49
4.3 PROBLEMA
Há alterações na intensidade do infiltrado inflamatório agudo no tecido
conjuntivo perilesional do dorso de ratos quando submetidos à irradiação laser de
baixa potência após uma única aplicação?
4.4 HIPÓTESE
A irradiação laser de baixa potência aumenta a intensidade do infiltrado
inflamatório agudo no tecido conjuntivo perilesional do dorso de ratos após uma única
aplicação.
4.5 AMOSTRA
A amostra foi do tipo probabilística, obtida de forma aleatória simples. O
experimento foi realizado no Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CDCT, da Coordenação de Produção e Experimentação Animal da Fundação
Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde – FEPPS, no ano de 2007.
A seleção da amostra obedeceu a alguns critérios de exclusão, não sendo
incluídos animais:
a) fêmeas, com o intuito de não gerar uma variável em relação ao gênero;
b) com massa corpórea menor que 250g e maior que 400g;
50
c) com idade superior ou inferior a três meses de vida, pois a idade poderia
interferir na capacidade de resposta biológica.
4.5.1 Modelo Animal e Organização dos Grupos
Foram utilizados 18 ratos machos pesando entre 250 e 300 gramas da
espécie Rattus norvegicus, ordem Rodentia, linhagem Wistar, os quais foram
escolhidos de forma aleatória simples dentre 100 animais, e distribuídos
aleatoriamente em seis grupos, três experimentais e três controles. Cada grupo
experimental foi composto por quatro ratos, e cada controle por dois (tab. 1).
Tabela 1 - Distribuição dos animais nos grupos
GRUPOS ANIMAIS
Controle 6 h. 2
Experimental 6 h. 4
Controle 12 h. 2
Experimental 12 h. 4
Controle 24 h. 2
Experimental 24 h. 4
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
4.6 LASER DE BAIXA POTÊNCIA
Foi utilizado o aparelho laser de modelo Theralase
, fabricado pela DMC
Equipamentos – São Carlos – SP/Brasil, de meio ativo InGaIP (Índio – Gálio – Iodo –
Fósforo), emissor laser visível, com λ= 685 ηm, área do feixe de 2 mm
2
, divergência de
1,5°, cedido pelo fabricante.
51
Figura 1 - Equipamento Laser Theralase
®
, DMC Equipamentos
Ltda., São Carlos/SP
Fonte: DMC Equipamentos (2007)
4.7 INSTRUMENTAL CIRÚRGICO E MATERIAL DE CONSUMO
Os instrumentais cirúrgicos utilizados foram:
- Cabo de bisturi n.º 3 (Duflex);
- Pinça Adson Brown (Quinelato
®
);
- Pinça hemostática (Quinelato
®
);
- Punch de Panarello
3
.
Os materiais de consumo utilizados no experimento foram:
- Agulhas estéreis;
- Campo cirúrgico estéril descartável de TNT (tecido não tecido);
3
Punch metálico de 8 mm de diâmetro, milimetrado e demarcado sua superfície externa em 1, 2, e 3
mm de altura, confeccionado para o experimento de Panarello (2003).
52
- Formol 10% tamponado;
- Gaze estéril;
- Lâminas de bisturi (BD
®
) número 15;
- Lâminas e lamínulas para microscopia.
- Luvas de procedimento médias (Satari
®
);
- Luvas Cirúrgicas n.° 7,5 (Madeitex
®
);
- Seringa estéril descartável de 10ml (Injex
®
);
- Solução de digluconato de clorexidina a 2%;
- Soro fisiológico/Solução de cloreto de sódio 0,9% (Texon
®
).
4.8 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
O procedimento cirúrgico foi realizado sob anestesia geral, conduzida por Médico
Veterinário
4
responsável, disponibilizado pela Coordenação de Produção e
Experimentação Animal da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde –
FEPPS. Após a pesagem em balança de precisão, os animais foram anestesiados
com Cloridrato de Ketamina
5
50mg/Kg (0,05ml/100g) e Cloridrato de Xilazina
6
5mg/Kg (0,025ml/100g), via intraperitoneal.
Após a confirmação da anestesia dos animais, os animais foram
tricotomizados na porção superior de dorso, com auxílio de aparador elétrico de
pelos
7
, sendo lavados com solução fisiológica 0,9% e secos com gaze estéril. Foi
realizada anti-sepsia da região com solução de digluconato de clorexidina a 2%,
seguida pela colocação de um campo cirúrgico de TNT, fenestrado, estéril, com
dimensões de 20 X 20cm, utilizado como barreira para controle de infecção.
4
Dra. Luisa Maria Gomes de Macedo Braga- Médica Veterinária, inscrita no Conselho Regional de
Medicina Veterinária/Sessão Rio Grande do Sul pelo número RS02393VP.
5
Dopalen
®
, Agribrands Brasil Ltda, www.vetbrands.com.br/bulas/Bula_Dopalen.pdf
6
Anasedan
®
, Agribrands Brasil Ltda, www.vetbrands.com.br/bulas/Bula_Anasedan_Pet.pdf
7
Aparador Elétrico de Barba e Bigode. Panasonic® - ER389K
53
A confecção da ferida cirúrgica seguiu o protocolo estabelecido por Panarello
(2003): o punch foi posicionado perpendicularmente à superfície da pele da região
tricotomizada, promovendo assim movimentos giratórios para facilitar penetração da
lâmina de bisturi a uma profundidade de 1 mm. Após isso, a área demarcada pelo
punch foi dissecada, com auxílio de lâmina de bisturi nº 15, mentado em cabo de
bisturi n° 3, e pinça de Adson Brown, removendo delicadamente a pele, resultando
em uma lesão com 1 mm de profundidade e 8 mm de diâmetro, que proporcionou
uma área cruenta de aproximadamente 0,5 cm
2
e com volume de 0,05 cm
3
. O
sangramento não foi interrompido ou removido, permitindo a hemostasia espontânea
das feridas (fig. 2).
Figura 2 - Procedimentos para confecção de ferida cirúrgica – Tricotomia (A); Marcação com o punch
(B); Incisão (C) e Ferida cirúrgica (D)
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
54
4.9 IRRADIAÇÃO LASER
Antes de cada aplicação, a ponteira do laser foi calibrada no próprio aparelho,
seguindo as instruções do fabricante. Todos os ratos dos grupos experimentais foram
irradiados com o mesmo protocolo de irradiação, estabelecido por Panarello (2003) que
correspondeu a uma única aplicação de forma pontual, pulsátil, com freqüência de 35
pulsos por segundo, potência de 35 mW e DE= 0,5 J/cm
2
por ponto, tempo de 17
segundos, totalizando uma dose total de 2 J/cm
2
e tempo total de 68 segundos por
animal. A aplicação foi realizada imediatamente após a realização da lesão,
transcutaneamente nas bordas da ferida em quatro pontos eqüidistantes demarcados
(fig. 3). Os ratos dos grupos controle não foram irradiados, mas foram manipulados.
Figura 3 - Desenho esquemático,
modificado de Smith et al. (2000),
mostrando os pontos de irradiação laser
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
Após os procedimentos cirúrgicos e aplicação laser os animais foram
recolocados em gaiolas individuais, mantendo-se o isolamento prévio, evitando o
canibalismo típico após procedimentos desta natureza. Os ratos foram mantidos em
ambiente ventilado, aquecido e longe de estímulos auditivos, com água “ad libidum” e
dieta padrão (ração específica, Nuvilab
®
), além da rotina de limpeza das gaiolas
diariamente.
55
4.10 MORTE DOS ANIMAIS
A morte dos animais seguiu a distribuição por grupos: 6, 12 e 24 horas após o
procedimento cirúrgico. Os animais foram submetidos à inalação continuada de
dióxido de carbono (CO2), dentro de câmara plástica, disponível no laboratório da
FEPPS, ocasionando morte por parada cardiorespiratória, respeitando a Declaração
dos Direitos dos Animais. (GOLDIN, 1995). Após a morte de cada animal, foi retirada
uma peça elíptica com margem de segurança envolvendo a lesão (fig. 4).
Figura 4 - Desenho esquemático,
modificado de Smith et al. (2000),
mostrando a elipse perilesional no
dorso do rato
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
As peças foram fixadas em solução de formol a 10% tamponado, por um
período de 24 horas, em frascos individualizados e separados por grupos. Após
fixação, o processamento histológico foi realizado no Laboratório de Patologia Buco-
Dental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul. As peças foram seccionadas ao meio e
incluídas na superfície de corte em parafina, confeccionando-se os blocos.
56
4.11 INSTRUMENTO E COLETA DOS DADOS
4.11.1 Obtenção dos Cortes Histológicos
Dos blocos de parafina foram obtidos cortes histológicos com 5µm de
espessura, e em seguida montados em lâminas histológicas. Para cada lâmina
foram obtidas as duas partes da lesão que seguiram para coloração pela técnica da
hematoxilina e eosina (HE), no Laboratório de Patologia Buco-Dental da Faculdade
de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
4.11.2 Análise dos Cortes Histológicos
Para a análise dos cortes histológicos foi utilizada a microscopia óptica de luz,
objetivando a contagem celular dos granulócitos e descrição do infiltrado inflamatório
agudo, através do método esteriológico (GUNDERSEN et al., 1988), utilizando um
sistema composto por microscópio Axioskop 40
®
(Carl Zeiss
®
, Oberkochen,
Alemanha). A eleição das regiões perilesionais seguiu a orientação de Weidner
(1995), atribuindo “hot spots”, ou seja, elegendo-se áreas de maior expressividade
das células inflamatórias. Foram capturadas imagens de 3 “hot spots” por lâmina
com objetiva de 400x através da câmera CoolSnapPro color
®
(Media Cybernetics
®
inc, Silver Spring, USA) acoplada ao microscópio óptico e conectada a um
computador Pentium IV (Dell
®
Computer Corporation, Boston, USA) que continha o
sistema computadorizado de captura de imagens Image-Pro
®
Plus, versão 4.5.1.22
(Media Cybernetics
®
Inc, Silver Spring, USA), do laboratório do Serviço de Patologia
do Hospital São Lucas da PUCRS, totalizando 54 imagens capturadas. As células
foram contadas através da ferramenta “Measure”, opção Count/Size, modo manual
57
do Image-Pro
®
Plus, por um examinador previamente calibrado por patologista
experiente
8
. Para cada lâmina foi realizada a média aritmética dos “hot spots”.
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS COLETADOS
Tendo como variável independente a irradiação laser de baixa potência, e
como variável dependente o infiltrado inflamatório agudo, os dados coletados foram
tabulados e submetidos à análise de variância método paramétrico (One-way
ANOVA), com pós-teste de Tukey-Kramer, através do software GrafPad InStat
®9
.
8
Prof. Dr. Vinícius Duval da Silva, Médico Patologista, Professor de Patologia Médica da Faculdade
de Medicina da PUCRS.
9
Versão 3.05, 32 bit para Windows 95/NT, criado em 27 de Setembro de 2000 pela GrafPad
Software, Inc., San Diego, CA, USA.
58
RESULTADOS
RESULTADOS RESULTADOS
RESULTADOS
59
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE DESCRITIVA
5.1.1 Grupos 6 horas
Observou-se à microscopia óptica de luz um maior número de granulócitos
perilesionais presentes no tecido conjuntivo no grupo controle quando comparado ao
grupo experimental. Notou-se também presença de edema no tecido conjuntivo,
principalmente no grupo irradiado. Os granulócitos estavam dispersos no tecido
conjuntivo sem sinais de concentração celular em áreas específicas. (figuras 5 e 6).
Figura 5 - Coloração HE mostrando os granulócitos no tecido conjuntivo no
grupo Controle 6 h, aumento de 400x
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
60
Figura 6 - Coloração HE mostrando os granulócitos e edema no tecido
conjuntivo (setas) no grupo Experimental 6 h, aumento de 400x
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
5.1.2 Grupos 12 horas
Percebeu-se um aumento progressivo da disponibilidade dos granulócitos no
grupo controle quando comparado ao grupo irradiado e comparando também com os
grupos 6 horas. A presença de vasos sanguíneos dilatados não foi observada.
(figuras 7 e 8).
61
Figura 7 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Controle 12 h,
aumento de 400x
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
Figura 8 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Experimental
12 h, aumento de 400x
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
62
5.1.3 Grupos 24 horas
Assim como nos grupos 6 e 12 horas, os granulócitos, do grupo controle 24
horas, continuaram aumentando em número quando comparados aos do grupo
experimental. No grupo irradiado, os granulócitos apresentam-se em meio a cordões
de fibras colágenas. (figuras 9 e 10).
Figura 9 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Controle 24 h,
aumento de 400x
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
63
Figura 10 - Coloração HE mostrando os granulócitos no grupo Experimental
24 h, aumento de 400x
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
5.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Tabela 2 - Quantidade de granulócitos encontrados em cada grupo
Controle 6 h.
Exp. 6 h.
Controle 12 h.
Exp. 12 h.
Controle 24 h.
Exp. 24 h.
44 21 111 77 104 52
113 23 126 78 191 88
36 84 102
109 151 129
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
Análise de Variância (ANOVA One-way): O valor de p foi 0,1371, considerado
não significante. A variação entre as médias das colunas não foi estatisticamente
significantemente para um índice de significância de 95%, p≤0,05. (tabela 3).
64
Teste de Tukey-Kramer para comparações múltiplas: se o valor de q fosse
maior que 4,751 então o valor de p seria menor que 0,05. (tabela 4).
Tabela 3 - Sumário dos dados estatísticos
Grupo N° de
Animais
Média
Desvio
Padrão
Exp. 6h 4 47,250
41,700
Contr. 6h. 2 78,500
48,790
Exp. 12h. 4 97,500
35,800
Contr. 12h.
2 118,50
10,607
Exp. 24h. 4 92,750
32,056
Contr. 24h.
2 147,50
61,518
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
Tabela 4 - Comparação das diferenças das médias entre os grupos
Comparação
Diferença das médias q Valor de p
Exp. 6h. vs Contr. 6h. - 31,250 1,302 p>0,05
Exp. 12h. vs Contr. 12h. - 21,000 0,8752
p>0,05
Exp. 24h. vs Contr. 24h. - 54,750 2,282 p>0,05
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
Figura 11 - Média e Erro Padrão dos grupos
Fonte: Dados da Pesquisa (2007)
65
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
66
6 DISCUSSÃO
Dentre as intervenções não-farmacológicas para resolução de processos
inflamatórios e álgicos, o laser de baixa de potência surgiu como uma alternativa
promissora. Dois possíveis mecanismos têm sido propostos para explicar os efeitos
benéficos vistos nos estudos clínicos com laser de baixa potência. O primeiro
possível mecanismo para ação do laser de baixa potência é um efeito modulatório
dose-dependente no metabolismo fibroblástico e deposição colágena. O segundo
possível mecanismo tem sido pouco estudado, o efeito específico do comprimento
de onda, mas ainda conhece-se pouco sobre esta questão para se fazer afirmações.
(Lopes-Martins et al., 2005).
Para o estudo tanto do processo inflamatório quanto o de reparo, muitos tipos
de laser de baixa potência (HeNe; GaAlAs, InGaAlP) com diferentes comprimentos
de onda e regimes terapêuticos foram utilizados, bem como o modelo animal
estudado, o tipo de inflamação induzida e o período de morte dos animais pós-
irradiação, o que levam à dificuldade em comparar os resultados e na formulação de
uma teoria do seu mecanismo de ação.
Na tentativa de minimizar estes aspectos, este trabalhou seguiu o modelo
animal e de indução inflamatória já estabelecidos dentro da linha de pesquisa “Laser
em Odontologia”, nesta Faculdade, os quais foram utilizados por Panarello (2003),
Chagas Júnior (2004) e Viegas (2005). Da mesma forma, os critérios de irradiação
laser propostos por Schindl et al. (2000): comprimento de onda, freqüência, potência
de saída, diâmetro do spot, tempo de irradiação, intensidade, dose, e intervalos de
tratamento foram bem descritos, o que foi observado também nos trabalhos de
Albertini et al. (2007), Aimbire et al. (2006), Lopes-Martins et al. (2005) e Albertini et
al. (2004). A dosimetria e a potência empregadas encontraram-se na faixa
recomendada por Basford (1995) para se obter efeitos biomoduladores com o laser
de baixa potência.
67
Trowbridge e Emling (1996) afirmaram que existem diferenças importantes,
nos diferentes órgãos, em relação aos fenômenos vasculares e que aplicar os
resultados de estudos sobre inflamação na pele para a inflamação dos outros órgãos
seria questionável e não seria adequado. Viegas (2005), Chagas Júnior (2004) e
Pugliese et al. (2003) trabalharam com pele de rato, tendo os dois primeiros autores
induzido inflamação de forma mecânica (punch), e o último de forma química
(carragenina). Já Aimbire et al. (2006) e Lopes-Martins et al. (2005) trabalharam com
pulmão de rato, e Albertini et al. (2007 e 2004) com pata de rato. Isto demonstrou a
dificuldade ao se comparar os resultados obtidos. Aimbire et al. (2006) avaliaram
mediadores químicos da inflamação, Albertini et al. (2007) usaram método de
avaliação volumétrica do edema e HE, e Albertini et al. (2004) usaram o método de
avaliação volumétrica do edema.
Apesar de Markovic e Todorovic (2007) terem trabalhado com irradiação laser
de baixa potência em humanos após procedimento de cirurgia bucal, concorda-se
com Lucas et al. (2002), o qual recomendou estudos seqüenciais para confirmação
dos resultados obtidos com os estudos celulares e em animais, como por exemplo o
aumento e pareamento da amostra a ser estudada para obtenção de uma estatística
mais fundamentada, antes da extrapolação para o uso desta terapia em humanos.
Chagas Júnior (2004) encontrou uma maior degranulação mastocitária nas
primeiras 12 horas após aplicação laser de baixa potência (InGaAlP, 685 nm, 2
J/cm
2
, 35 mW, 35 p.p.s), o que acarretaria em um maior recrutamento das células
leucocitárias, devido ao conteúdo dos grânulos dos mastócitos, mediadores
químicos da inflamação, tais como a histamina, um potente vasodilatador, fator
quimiotático para eosinófilos (ECF) e fator quimiotático para neutrófilos (NCF), como
propuseram Gartner e Hiatt (2003). Porém, a hipótese aqui formulada, baseada nos
achados de Chagas Júnior (2004), de que a irradiação laser de baixa potência
aumentaria a intensidade do infiltrado inflamatório agudo no tecido conjuntivo
perilesional do dorso de ratos após uma única aplicação, não foi confirmada, pois o
fenômeno esperado para os granulócitos não ocorreu, existindo diminuição em
número absoluto, como observado na tabela 2, para o mesmo protocolo de
irradiação laser (InGaAlP, 685 nm, 2 J/cm
2
, 35 mW, 35 p.p.s). A presença do edema
68
(figura 6) corroborou os resultados de Chagas Júnior (2004) comprovando a
existência da histamina no interstício, bem como, em Viegas (2005) nas primeiras 12
horas após a irradiação laser. O estudo de Viegas (2005) também concluiu que a
irradiação laser de baixa potência não minimiza as reações de inflamação tecidual.
Assim como Pugliese et al. (2003) que obtiveram uma diminuição no infiltrado
inflamatório quando trabalharam com um laser de baixa potência (GaAlAs, 670 nm,
potência de 9 mW) com densidades de energia de 4 J/cm
2
e 8 J/cm
2
em feridas
padronizadas em dorsos de ratos, os resultados aqui obtidos sugerem a atuação do
laser sobre estas células.
Ainda Pugliese et al. (2003) encontraram um menor edema nos grupos
irradiados quando comparados aos controles, discordando indiretamente dos
achados de Viegas (2005) e Chagas Júnior (2004). Isso talvez se deva ao tempo de
observação após indução da lesão, que em Chagas Júnior (2004), como no corrente
trabalho, foi de 6, 12 e 24 horas, em Pugliese et al. (2003) foi de 24, 48 e 72 horas e
5, 7 e 14 dias, e em Viegas (2005) de 12, 36, 72 horas e 7 dias após o procedimento
cirúrgico.
Viegas (2005) e Chagas Júnior (2004), trabalharam com o mesmo
equipamento laser de baixa potência de emissão de luz vermelha, o Theralase
®
, de
meio ativo InGaAlP, de comprimento de onda de 685 nm, com potência útil de 35
mW, e densidades de energia de 4 J/cm
2
e 2 J/cm
2
, respectivamente, obtendo
resultados semelhantes do ponto de vista inflamatório em dorso de ratos, na
observação de 12 horas após procedimento cirúrgico. Albertini et al. (2007) também
utilizaram o equipamento citado anteriormente, porém com uma dose de irradiação
de 7,5 J/cm
2
e potência de 30 mW, encontrando diminuição de edema e de infiltrado
celular em patas de rato, 4 horas após da indução inflamatória. Sítios e induções
inflamatórias diferentes, dorso de ratos e patas de ratos, respectivamente, diferentes
protocolos para o mesmo aparelho laser, indicam a dificuldade de controle de
variáveis ao se trabalhar com irradiação laser de baixa potência. Deve-se observar
além disso, as considerações de Rochkind et al. (1989) onde afirmaram que a
irradiação do laser de baixa potência exerce pronunciados efeitos sistêmicos na pele
69
e nos tecidos subjacentes, e que esses efeitos persistem muito tempo depois de
uma única aplicação.
Ao analisar os resultados (figura 11), nota-se que nos grupos experimentais
existiu uma tendência de curva normal de Gauss, apesar de não terem sido
estatisticamente significantes. Comparando com o progressivo aumento celular dos
grupos controles (figura 11), sugere-se uma antecipação do processo inflamatório
agudo total, corroborando os achados da literatura vigente, que o laser acelera o
processo cicatricial. E ainda o menor erro padrão obtido nos grupos 12 horas, sugere
uma característica de comportamento celular mais homogenia, aproximando-se dos
resultados de Chagas Júnior (2004), onde obteve uma maior degranulação
mastocitária no grupo experimental 12 horas, com diferença extremamente
significante (p<0,001) quando comparado ao grupo controle. Seria necessário o
aumento e pareamento da amostra para confirmação desta tendência, bem como
outros períodos de observações. Neste caso, pode-se aproveitar os resultados de
Viegas (2005) para observação de 36 horas, onde encontrou o infiltrado inflamatório
do grupo irradiado semelhante ao do grupo controle, confirmando a antecipação da
fase inflamatória celular.
Apesar de os resultados não terem sido estatisticamente significantes, pôde-
se observar a diferença do comportamento do infiltrado inflamatório nos grupos
experimental e controle (tabela 2, figura 11). A observação deste dado confrontando
com os resultados de Chagas Júnior (2004) sugere que para um mesmo protocolo
de irradiação, no mesmo modelo animal, ocorreram fenômenos biológicos celulares
distintos. Analisando a tabela 3, percebe-se que mesmo a amostra não estando
pareada, as médias de granulócitos encontradas nos grupos irradiados foi menor do
que a encontrada nos grupos controle, mostrando o efeito do laser sobre estas
células. Comparando com os resultados de Chagas Júnior (2004), obtidos com
mastócitos, pode-se inferir que para cada tipo celular a irradiação laser tem um
efeito, o que dificulta ainda mais o conhecimento do mecanismo de ação desta
terapia, concordando com a afirmação de Belkin e Schwartz (1989), onde relataram
que os efeitos do laser de baixa potência são dose-dependentes e que seu
entendimento está longe de ser esclarecido.
70
A teoria de Karu (1989), até o momento, é a mais aceita pela literatura
vigente, na tentativa de explicar o mecanismo de ação da luz laser de baixa potência
em nível celular. A fotorrecepção ocorrendo nas mitocôndrias pode intensificar o
metabolismo respiratório e as propriedades eletrofisiológicas da membrana,
mudando a fisiologia celular. Partindo desta premissa, infere-se que a luz laser
agindo nos granulócitos altera seu processo de diapedese, ou muda a conformação
do exoesqueleto da membrana celular impedindo o mecanismo de adesão, ou
acarreta o mesmo que os mastócitos – degranulação, ou ainda atua diretamente na
matriz extracelular o que poderia explicar a menor presença do infiltrado inflamatório
mesmo com maior disponibilidade de mediadores químicos, os subprodutos da
degranulação mastocitária.
A partir deste trabalho, poder-se-á aprofundar os estudos de inflamação
dentro da linha de pesquisa “Laser em Odontologia”, aplicando outras colorações
para cada tipo celular ou mediador químico envolvido, como técnicas do tipo
imunohistoquímica, biologia molecular (PCR, QTC-PCR, etc), etc.
71
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
72
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos com a aplicação da luz laser de baixa
potência (InGaAlP, λ 685 nm), no protocolo de irradiação utilizado, para este modelo
animal, sugere-se que:
a) A luz laser é capaz de diminuir o número total de granulócitos, após uma
única irradiação.
73
REFERÊNCIAS
REFERÊNCIAS REFERÊNCIAS
REFERÊNCIAS
74
REFERÊNCIAS
AIMBIRE, F. et al. Low-level laser therapy induces dose-dependent reduction of
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79
ANEXO
ANEXOANEXO
ANEXO
80
ANEXO A – APROVAÇÃO DA COMISSÃO CIENTÍFICA E DE ÉTICA DA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DA PUCRS
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