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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental
Análise da mutagenicidade e
antimutagenicidade da Ilex paraguariensis
(erva-mate) e seu efeito sobre o metabolismo de
carcinógenos no esôfago de ratos Wistar
Andréa Kaezer
Rio de Janeiro
2008
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Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental
Análise da mutagenicidade e
antimutagenicidade da Ilex paraguariensis
(erva-mate) e seu efeito sobre o metabolismo de
carcinógenos no esôfago de ratos Wistar
Andréa Kaezer
Rio de Janeiro
2008
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade do Estado do Rio
de Janeiro para obtenção de grau de
Mestre em Fisiopatolgia Clínica e
Experimental
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Ficha Catalográfica
Kaezer, Andréa da Rocha
Análise da mutagenicidade e antimutagenicidade da Ilex paraguariensis (erva-mate) e
seu efeito sobre o metabolismo de carcinógenos no esôfago de ratos Wistar / Andréa da
Rocha Kaezer – Rio de Janeiro, 2008
Xviii, 119 f. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de
Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental
Orientador: Prof. Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto
Co-Orientadora: Prof. Dra. Claudia Alessandra Fortes Aiub
1. Câncer de esôfago 2. Ilex paraguariensis 3. Antimutagenicidade
4. CYP
I. Título
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental
Análise da mutagenicidade e antimutagenicidade da
Ilex paraguariensis (erva-mate) e seu efeito sobre o
metabolismo de carcinógenos no esôfago de ratos
Wistar
Andréa Kaezer
Orientação: Prof. Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto
Co-Orientação: Prof. Dra. Claudia Alessandra Fortes Aiub
Dissertação defendida em 19 de fevereiro de 2006
Banca examinadora:
Prof.
Dr.
Prof.
Dr.
Prof.
Dr.
Suplentes
Prof.
Dr.
Prof.
Dr.
Rio de Janeiro
2008
Á Deus, que nos
permite realizar.
Agradecimentos
Ë Ao Prof. Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto por ter sido sempre um excelente
ORIENTADOR e um exemplo de competência e ética. Muito obrigada pela
atenção, pelos ensinamentos, pelo respeito e pelo incentivo profissional e
pessoal.
Ë À Dra. Cláudia Alessandra Fortes Aiub pela revisão cuidadosa desta
dissertação, pela orientação e pelas palavras de incentivo. Obrigada por tudo,
você foi fundamental para realização deste trabalho!
Ë Aos meus queridos pais, Ângela e Joel, pelo carinho, pela amizade e apoio
incondicionais
. Admiro muito vocês! Obrigada por tudo!
Ë Aos meus queridos avós, Elza e Alcides, pelo constante incentivo e pela
participação na minha formação. Vocês são pessoas essenciais na minha vida!
Ë Ao meu irmão, Alexandre, por ser um grande amigo, pelos conselhos e
pelos momentos de total descontração. Me orgulho muito de você!
Ë Ao meu namorado, Felipe, por todo amor, carinho, respeito, amizade e
compreensão. Você é especial demais!
Ë À minha amiga, Liana pelo companheirismo, incentivo, carinho, confiança e
amizade. Adoro você!
Ë À Silvia e Natália por me ensinarem grande parte das técnicas utilizadas
neste trabalho, por me orientarem e ajudarem na bancada, e esclarecerem
minhas dúvidas. Muito obrigada, meninas!
Ë Aos companheiros de trabalho David, Sheila, Tatiana, Suelen, Raphael e
Isabela pelas sugestões, orientações e pelos momentos de descontração.
Ë Aos amigos do LABMUT, Alessandra, Claudinha, Andréia, Luiza, Felipe,
Chico e Mazzei pela grande ajuda na bancada e por tornarem meus dias de
trabalho tão leves e descontraídos.
Ë A todos do laboratório do Prof. Jayme, por serem sempre tão agradáveis e
solícitos.
Ë Ao Prof. Dr. Cláudio Canneti, pelo empenho em solicitar todos os animais
utilizados neste estudo.
Ë A todos do laboratório do Prof. Rodolpho pelo incentivo e bom humor.
Ë Aos professores Israel Felzenszwalb, Francisco Paumgartten, Marsen
Coelho, Marcos Pereira e Ana Rossini pela participação na banca.
Ë Às minhas amigas do coração: Mônica, Cinara, Luciana, Ananda, Leilane, Lu,
Cássia, Cris e Mari. Meninas, queridas, vocês tornam meus dias muito mais
felizes. Adoro vocês!
Ë À família Silvestre, pelo exemplo de perseverança, de alegria e de
simplicidade. Obrigada pelo acolhimento, pela amizade e pelo carinho.
A todos que direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste
trabalho.
Lista de Abreviaturas
Ada: adenina metiltransferase.
AS: azida sódica.
APS: persulfato de amônia.
BSA: albumina bovina sérica.
cDNA: ácido desoxirribonucléico complementar.
CYP: citocromo P450.
COH: hidroxilação da cumarina na posição 7.
DEPC: dietilpirocarbonato.
DMSO: dimetilsulfóxido.
DNA: ácido desoxirribonucléico.
dNTP: desoxirribonucleotídeos.
ECOD: etoxicumarina O-desetilase.
EDTA: ácido etileno-diamino tetracético.
et al.: e colaboradores.
F.I.: fator de indução.
g: grama.
GAPDH: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase.
HPA: hidrocarboneto policíclico aromático.
IIp: infusão de Ilex paraguariensis.
IARC: Agência Internacional de Pesquisa em câncer.
I.M.: índice de mutagenicidade.
IgG: imunoglobulina tipo G
kDa: kilodalton.
L: litro.
mg: miligrama.
MS-INCA: Ministério da Saúde – Instituto Nacional do Câncer.
RT-MMLV: reverse transcriptase -moloney murine leukemia virus
MNNG: 1-metil 3-nitroso-1-nitrosoguanidina.
NADP: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato – forma reduzida.
NAT: N-acetiltransferase.
NDEA: N-nitrosodietilamina.
4-NQO: 4-nitroquinolina N-óxido.
NNK: 4-(metilnitrosamino)-1-(3piridil)-1-butanona.
Ogt: O
6
-metilguanina-transferase.
ONPP: O-nitrofenil β-D-galactopiranosideo.
OPM: orbitações por minuto.
pb: pares de base.
PCR: reação em cadeia da polimerase.
pH: potencial hidrogeniônico.
PhIP: 2-amino-1-metil-6-fenilmidazo[4,5-b]piridina
PNPP: p-nitrofenil fosfatase.
Ptn: proteína
p/v: peso por volume.
RNA: ácido ribonucléico.
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro.
rpm: rotações por minuto.
REN: reparo por excisão de nucleotídeos
RT: transcrição reversa.
SDS: duodecil sulfato de sódio.
TA: temperatura ambiente.
TBE: tampão Tris-borato.
TBS: tampão Tris-fosfato.
TTBS: tampão tween-TBS.
TCA: ácido tricloroacético.
TCDD: 2, 3, 7, 8-tetraclorodibenzo-p-dioxina.
TEMED: N’ N’ N’ N’ - tetrametilenodiamina
Tris: trihidroximetilaminometano.
v/v: volume por volume.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 : Representação espacial das taxas brutas de incidência de câncer de
esôfago por 100.000 homens (A) e 100.000 mulheres (B), segundo a região
continental.
Pág.: 4
Figura 2 : Representação espacial das taxas brutas de incidência de câncer de
esôfago por 100.000 homens (A) e 100.000 mulheres (B), estimadas para 2008,
segundo Unidade da Federação.
Pág.: 6
Figura 3 : Figura representativa de planta adulta de Ilex paraguariensis e detalhe
de suas folhas.
Pág.: 7
Figura 4 : Estrutura do grupo prostético heme do citocromo P450.
Pág.: 18
Figura 5 : Ciclo catalítico do citocromo P450.
Pág.: 20
Figura 6 : Consumo médio de infusão de Ilex paraguariensis ( IIp ) de animais
controle e tratados por diferentes intervalos de tempo (dias).
Pág.: 37
Figura 7 : Variação do peso dos animais controle e tratados com infusão de Ilex
paraguariensis por diferentes intervalos de tempo (dias).
Pág.: 38
Figura 8 : Esquema de ultracentrifugação diferencial para obtenção de
microssomos de esôfago.
Pág.: 45
Figura 9 : Figura representativa da análise por RT-PCR da expressão do RNAm
do GAPDH no esôfago de ratos controle (C) e tratados com IIp por 2, 4, 7,14, 21
dias.
Pág.: 62
Figura 10 : Figura representativa da análise por RT-PCR da expressão do RNAm
do CYP2A3 no esôfago de ratos controle e tratados com IIp por 2, 4, 7, 14 e 21
dias.
Pág.: 63
Figura 11 : Valores de média e desvio padrão da expressão do RNAm do
CYP2A3 em ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias
Pág.: 64
Figura 12 : Figura representativa da análise por Western blotting da expressão
da apoproteína CYP2A3 no esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10% por
2, 4, 7, 14 e 21 dias.
Pág.: 65
Figura 13 : Valores de média e desvio padrão da expressão da apoproteína
CYP2A3 em ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias.
Pág.: 66
Figura 14 : Atividade de Hidroxilação da cumarina (COH)
em microssomos de
esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias.
Pág.: 68
Figura 15 : Atividade de desetilação da N-nitrosodietilamina (NDEAd) em
microssomos de esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4,
7, 14 e 21 dias.
Pág.: 70
Figura 16 : Atividade de O-desetilação da etoxicumarina (ECOD) em
microssomos de esôfago de ratos controle e tratados com IIp por 2, 4, 7,
14 e 21 dias.
Pág.: 72
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 : Sistema de nomenclatura de citocromos P450.
Pág.: 21
Quadro 2 : Relação dos genes SOS, induzíveis por lesão ao DNA.
Pág.: 28
Quadro 3 : Seqüências específicas de oligonucleotídeos senso e anti-senso,
tamanho dos fragmentos amplificados e condições de PCR para os genes
analisados.
Pág.: 42
Quadro 4 : Relação das linhagens utilizadas nos testes de mutagenicidade e
antimutagenicidade e suas respectivas características genotípicas.
Pág.: 53
Quadro 5 : Relação das drogas usadas como controle positvo dos experimentos.
Pág.: 56
Tabela 1 : Composição química do extrato aquoso à quente de erva-mate.
Pág.: 10
Tabela 2 : Subgrupos de flavonóides presentes no chá verde e chimarrão..
Pág.: 12
Tabela 3 : Valores referentes à análise densitométrica dos produtos de
amplificação do GAPDH no esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10%, em
diferentes períodos de tratamento.
Pág.: 62
Tabela 4 : Valores de média e desvio padrão da expressão do RNAm do
CYP2A3 em ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias.
Pág.: 64
Tabela 5 : Valores de média e desvio padrão da expressão da apoproteína
CYP2A3 em ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias.
Pág.: 66
Tabela 6 : Atividade de hidroxilação da cumarina (COH) em microssomos de
esôfago de ratos controle (C) e tratados com IIp 10% por diferentes períodos de
tratamento (2, 4, 7, 14 e 21 dias).
Pág.: 68
Tabela 7 : Atividade de destilação da N-nitrosodietilamina (NDEAd) em
microssomos de esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10% em diferentes
períodos (2, 4, 7, 14 e 21 dias).
Pág.: 70
Tabela 8 :. Atividade de O-desetilação da etoxicumarina (ECOD) em
microssomos de esôfago de ratos controle (C) e tratados com IIp em diferentes
períodos (2, 4, 7, 14 e 21 dias).
Pág.: 72
Tabela 9 : Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%,
1%, e 10%, utilizando a linhagem TA97 de S. typhimurium.
Pág.: 74
Tabela 10 : Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%,
1% e 10%, utilizando a linhagem TA98 de S. typhimurium.
Pág.: 74
Tabela 11 : Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%,
1% e 10%, utilizando a linhagem TA100 de S. typhimurium.
Pág.: 75
Tabela 12 : Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%,
1% e 10%, utilizando a linhagem TA102 de S. typhimurium.
Pág.: 75
Tabela 13 : Teste de mutagenicidade com IIp 10%, utilizando as linhagens
TA1535, YG7104 e YG7108 de S. typhimurium.
Pág.: 77
Tabela 14 : Teste de mutagenicidade com IIp 10% utilizando as linhagens
YG1021, YG1024, YG1041, TA98NR e TA98DNP-6 de S. typhimurium.
Pág.: 79
Tabela 15 : Atividade de β-galactosidase e fosfatase alcalina mensuradas em
unidades Miller, na presença de IIp 10% nas cepas PQ35 e PQ37 de E. coli.
Pág.: 80
Tabela 16 : Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações
0.1%, 1%, e 10% utilizando a linhagem TA97 de S. typhimurium.
Pág.: 82
Tabela 17 : Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações
0.1%, 1%, e 10% utilizando a linhagem TA98 de S. typhimurium.
Pág.: 83
Tabela 18 : Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações
0.1%, 1%, e 10% utilizando a linhagem TA100 de S. typhimurium.
Pág.: 84
Tabela 19 : Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações
0.1%, 1%, e 10% utilizando a linhagem TA102 de S. typhimurium.
Pág.: 85
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS viii
LISTA DE FIGURAS xi
LISTA DE QUADROS E TABELAS xiii
RESUMO xvii
ABSTRACT
xviii
I. INTRODUÇÃO
1
1. Câncer de Esôfago
2
2. Erva-Mate (Ilex paraguariensis Saint Hilaire)
7
2.1 Aspectos Gerais 7
2.2 Histórico 8
2.3 Beneficiamento e industrialização da erva-mate 9
2.4 Componentes químicos e terapêuticos presentes na erva mate 10
3. Erva-mate e câncer de esôfago
13
4. Mecanismo de carcinogênese química
15
5. Enzimas citocromo P450 e seu envolvimento na carcinogênese esofágica
17
5.1 Características gerais 17
5.2 Ciclo catalítico 18
5.3 Nomenclatura 20
5.4 Subfamília 2A 21
6. Testes utilizados na detecção de compostos mutagênicos e genotóxicos
24
6.1 Teste de mutação reversa com Salmonella typhimurium (Teste de ames) 24
6.1.1 Caracterísitcas das linhagens utilizadas 25
6.1.2 Ativação metabólica 27
6.2 SOS Cromoteste 27
7. Possíveis mecanismos de carcinogênese no sul do Brasil
29
II. OBJETIVOS
30
III. MATERIAIS E MÉTODOS
32
IV. RESULTADOS
60
1. Avaliação da expressão e atividade do CYP2A3 em esôfago de ratos
tratados com infusão de Ilex paraguariensis.
61
2. Avaliação da mutagenicidade da infusão de Ilex paraguariensis.
73
3. Avaliação da antimutagenicidade da infusão de Ilex paraguariensis pelo do
Teste de Mutação reversa com Salmonella thyphimurium.
81
V. DISCUSSÃO
86
VI. CONCLUSÃO
99
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
101
RESUMO
Os tumores de esôfago ocupam oitavo lugar em incidência e sexto em mortalidade,
ocorrendo principalmente em países em desenvolvimento. Cerca de 93% são
classificados como carcinoma epidermóide e parecem ser essencialmente causados por
fatores ambientais. No sul do Brasil, sua incidência está relacionada, dentre outros
fatores, ao consumo de chimarrão, bebida ingerida a altas temperaturas e feita a partir de
folhas de Ilex paraguariensis. Existem, pelo menos, três possíveis mecanismos pelo qual
a infusão de Ilex paraguariensis (IIp) poderia elevar o risco de câncer de esôfago: (i) a
presença de substâncias carcinogênicas na erva-mate, (ii) aumento do metabolismo de
carcinógenos pelo esôfago através da indução de citocromo P450 neste tecido e (iii)
através da injúria térmica crônica. Nesta dissertação foram analisados os dois primeiros
pontos. Para isto, avaliamos a expressão gênica (RT-PCR), protéica (Western blotting) e
atividades enzimáticas (COH e NDEAd) associadas a CYP2A3 no esôfago de ratos
Wistar tratados por 2, 4, 7, 14 e 21 dias, com IIp a 10% (p/v). Utilizando-se o Teste de
Ames e SOS cromoteste foi verificada a mutagenicidade da IIp a 0.1% (p/v), 1% (p/v) e
10% (p/v), em sistemas bacterianos. Não foram observadas diferenças na expressão do
RNAm e da apoproteína do CYP2A3 em relação ao grupo controle, bem como nas
atividades enzimáticas, sugerindo que a IIp a 10% (p/v) não interfere no metabolismo de
carcinógenos no esôfago, portanto não atua por esta via em sua suposta participação na
carcinogênese esofágica. De forma complementar, nenhum efeito mutagênico
significativo (I.M. > 2 ou p < 0.05) foi observado nas cepas padrões (TA97, TA98, TA100,
TA102), assim como nas linhagens mais sensíveis (TA1535, YG7104, YG7108, YG1021,
YG1024, YG1041, TA98NR, TA98DNP-6) para a detecção de compostos N-nitrosos,
como as nitrosaminas, independentemente de ativação metabólica. No entanto,
verificamos um efeito antimutagênico significativo (p < 0.05) da IIp 10% (p/v) nas
linhagens TA97 e TA98. Esses resultados sugerem que a erva-mate não apresenta
mutagenicidade nas concentrações avaliadas (semelhantes àquelas consumidas por
humanos), e que seus compostos antioxidantes podem ser responsáveis pela
antimutagênicidade em linhagens que detectam mutações por adição e/ou deleção de
pares de bases. Observamos, dessa forma, que o risco da IIp na patogênese do câncer
de esôfago no sul do Brasil não envolve a modulação de enzimas CYP esofágicas nem a
presença de substâncias mutagênicas na erva-mate.
ABSTRACT
Esophageal cancer is the eighth most common cancer worldwide and sixth in cause of
death from cancer, occurring mainly in developing countries. Approximately 93% of
them are epidermoid carcinoma type and seems to be primarily caused by
environmental factors. In southern Brazil, the incidence is related to the consumption of
chimarrão, beverage ingested at high temperatures and made from the leaves of Ilex
paraguariensis. There are, at least, three possible mechanisms which the infusion of
Ilex paraguariensis (IIp) could increase the risk of esophageal cancer: (i) the presence
of carcinogenic substances in yerba maté, (ii) the increase of carcinogens esophagus
metabolism through the cytochrome P450 induction in this tissue, and (iii) chronic
thermal injury. In this study, we analyzed first two points. For this, we evaluated the
gene expression (RT-PCR), protein (Western blotting) and enzyme activities (COH and
NDEAd) associated with CYP2A3 in rats oesophagus treated during 2, 4, 7, 14 and 21
days, with IIp 10% (w/v). Using the Ames test and SOS cromotest was verified the
mutagenicity of IIp 0.1% (w/v), 1% (w/v) and 10% (w/v) in bacterial systems. No
differences were observed in the expression of mRNA and apoprotein of CYP2A3
related to the control group, as well as on enzyme activities, suggesting that IIp 10%
(w/v) does not interfere on the metabolism of carcinogens in the esophagus. Besides,
no significant mutagenic effect (MI > 2 or p < 0.05) was observed on the standards
strains (TA97, TA98, TA100, TA102) as well as on the more sensitive strains (TA1535,
YG7104, YG7108, YG1021, YG1024, YG1041, TA98NR, TA98DNP-6) to detect nitro-
compounds such as nitrosamines, regardless of metabolic activation. Interestingly, we
verified a significant antimutagenic effect (p < 0.05) of IIp 10% (w/v) among strains
TA97 and TA98. These results suggest that IIp 10% does not present mutagenicity, in
concentrations measured (similar to those consumed by humans), and that the
antioxidant compounds might be responsible for antimutagenic response avoiding the
addition and / or deletion of base pairs. Thus, we observed that the risk of IIp in the
patogenesis of esophagus cancer in southern Brazil does not involve the modulation of
esophageal CYP enzyme or the presence of mutagenic compounds present in yerba
maté.
I. Introdução
1- CANCER DE ESÔFAGO
O câncer é a segunda principal causa de óbito no mundo, sendo responsável
por mais de 60 milhões de mortes anualmente (Parkin, et al, 2005). Os tumores de
esôfago estão entre os que causam as maiores taxas de mortalidade, ocupando o
oitavo lugar em incidência e sexto em mortalidade entre os demais tipos de câncer
(Parkin, et al, 2005). De acordo com os dados referentes à mortalidade e incidência
por câncer no mundo, o tumor de esôfago é o quinto responsável por óbitos em
homens e o sexto em mulheres (GLOBOCAN, 2002). A alta taxa de mortalidade
relativa a este tipo de tumor está relacionada ao diagnóstico tardio da doença,
somente sintomática e detectada em estágio avançado. A taxa de sobrevivência para
o câncer de esôfago após cinco anos de diagnóstico é de somente 16% nos Estados
Unidos e 10% na Europa (Parkin et al., 2005). Por esta razão, diversos estudos vêm
buscando identificar os agentes etiológicos relacionados ao desenvolvimento dos
tumores esofágicos, bem como investigar seu mecanismo de ação, para traçar
estratégias de prevenção cabíveis.
Os tipos de câncer de esôfago de maior incidência são histologicamente
classificados como carcinoma epidermóide e adenocarcinoma. O carcinoma
epidermóide aparece como um dos tipos mais freqüentes de câncer no mundo,
enquanto que as taxas de incidência de adenocarcinoma têm crescido nos últimos
anos, sobretudo nos países desenvolvidos (Parkin, et al, 2005).
A incidência do câncer de esôfago apresenta uma acentuada variação entre
regiões do mundo, sendo possível encontrar áreas de alto e baixo risco, localizadas
em regiões próximas (Pisani, et al, 2002; Smeds et al., 2002). Em torno de 80% dos
tumores esofágicos ocorrem em países em desenvolvimento e mais de 93% deles são
do tipo carcinoma epidermóide. As regiões de maior prevalência estão localizadas no
chamado cinturão asiático, que se estende do Norte da China ao Nordeste do Irã,
incluindo o Japão e a Índia. No ocidente, a França e a região sul da América do Sul
apresentam o maior número de casos. Países como Argentina e Uruguai, também
apresentam altas taxas de incidência da doença (GLOBOCAN, 2002). Dentro destas
grandes áreas são identificadas regiões bem delimitadas, nas quais a incidência de
carcinoma epidermóide pode ser 10 a 50 vezes maior, como regiões que incluem o
centro e o norte da China, sul da Tailândia, norte da Itália, regiões montanhosas do
Japão, parte do Irã, certas províncias da França e região sul do Brasil (Corley &
Buffler, 2001), como ilustrado na figura 1
A
B
Incidência bruta de câncer de esôfago em homens, por
100 000 homens
Incidência bruta de câncer de esôfago em mulheres, por 100.000
mulheres
No Brasil, aproximadamente 95% dos tumores esofágicos é do tipo carcinoma
epidermóide e a maior freqüência destes tumores está localizada na região sul do
país, principalmente no Rio Grande do Sul (MS-INCA, 2007). De acordo com a
estimativa de Incidência de Câncer no Brasil para 2008, devem ocorrer cerca de
10.550 novos casos de câncer de esôfago, sendo 7.900 entre homens e 2.650 entre
as mulheres (MS-INCA, 2007). Segundo estes dados, o câncer de esôfago aparece
como o sexto tipo de câncer mais freqüente em homens e o nono em mulheres (MS-
INCA, 2007). As taxas brutas de incidência do câncer de esôfago são maiores na
região sul (19,73/100.000 homens e 7,58/100.000 mulheres) seguida da região
sudeste do país (figura 2).
Entre os principais fatores etiológicos associados ao câncer esofágico estão o
consumo de alimentos contaminados com nitrosaminas e micotoxinas na Ásia, e um
elevado etilismo associado ao tabagismo no Ocidente. Uma característica comum
desta doença nas diferentes áreas geográficas é uma história de baixo consumo de
vitaminas, minerais e antioxidantes, ou indiretamente associada ao alcoolismo
(Craddock, 1993). Além disso, outro fator de risco associado é a condição sócio-
econômica; quanto menor a renda per capta anual, maior o risco de desenvolvimento
desta doença (Pickens & Orringer, 2003).
No estado do Rio Grande do Sul, na Argentina e no Uruguai, o consumo da
infusão de Ilex paraguariensis é considerado um importante fator de risco,
relacionando-se a alta incidência de câncer de esôfago nestas áreas. A infusão é
ingerida a alta temperatura (~ 70Cº) (Castelsagué et al., 2000) e o volumes diário
consumido podem variar de 1.5 L a 6 L (Bastos et al., 2006).
(Figura adaptada da fonte: http://www-dep.iarc.fr/GLOBOCAN – The GLOBOCAN 2002 database)
Figura 1: Representação espacial das taxas brutas de incidência de câncer de esôfago por 100.000
homens (A) e 100.000 mulheres (B), segundo The GLOBOCAN 2002 database.
(Figura adaptada da fonte: http://www.inca.gov.br – Estimativa 2008 – Incidência de câncer no Brasil)
A
B
Figura 2: Representação espacial das taxas brutas de incidência de câncer de esôfago por 100.000
homens (A) e 100.000 mulheres (B), estimadas para 2008, segundo Unidade da Federação.
2- ERVA-MATE (Ilex paraguariensis Saint Hilaire, ano 1822)
2.1- Aspectos gerais
A erva-mate (Ilex paraguariensis), descrita pelo naturalista francês August de Saint
Hilaire (1822), pertence à família Aquifoliaceae que possui cerca de 600 espécies, a
maioria do gênero Ilex. No Brasil, de acordo com Gilberti (1994), existem 68 espécies
pertencentes a esse gênero, mas destas, apenas cinco se prestariam à fabricação da
erva-mate beneficiada. A planta da erva-mate possui características semelhantes à
laranjeira, com caule de cor cinza, geralmente com 20 a 25 cm de diâmetro (mas pode
atingir até 50 cm) (figura 3). A altura da árvore também é variável, sendo influenciada
pelas condições do solo, pelo manejo e pela idade da planta (Gilberti, citado por
Maccari-Junior, 2005). Braganolo e colaboradores (1980) afirmam que a altura pode
chegar aos 15 metros em locais de mata fechada, mas, quando a planta é podada,
não passa dos sete metros (Braganolo et al., citado por Maccari-Junior, 2005).
Figura 3: Planta adulta de Ilex paraguariensis e detalhe de suas folhas.
(Figura adaptada da fonte: www.clubedoterere.org.br)
2.2- Histórico
Originalmente utilizada pelos índios guaranis, a erva-mate ficou conhecida no
início do século XVI, quando os conquistadores espanhóis chegaram ao sul do Brasil e
América do Sul (Corrêa, citado por Maccari-Junior, 2005). Transformando-se em
objeto de pesquisa de padres jesuítas, por apresentar propriedades estimulantes, com
o tempo passou também a ser explorada comercialmente. Com o fim das missões
jesuítas, e a expulsão dos espanhóis do Brasil, houve uma queda na produção local e
interrupção dos progressos realizados nas pesquisas do cultivo e utilização da erva-
mate.
O setor foi novamente revigorado somente a partir da década de 80, com a
expansão do cultivo e com a tradição do folclore gaúcho de consumo da erva
(Andrade, 1999). Atualmente, a erva-mate é produzida em escala industrial e
consumida basicamente sob três formas: (i) o chimarrão preparado a partir da erva
fresca misturada com água quente (~ 70 ºC); (ii) chá mate preparado a partir das
folhas torradas, consumido (quente ou frio) em várias regiões do país, como no
sudeste; (iii) e o tereré que é semelhante ao chimarrão, porém a erva é ligeiramente
torrada e deixada em repouso por 8 meses em local seco para então ser consumida
com água fria (www.clubedoterere.com.br
). Além da produção de bebidas, a erva
mate também pode ser utilizada como corante natural, conservante alimentar e
cosméticos, por exemplo (Andrade, 1999).
2.3- Beneficiamento e industrialização da erva-mate
A tecnologia empregada para processar a erva-mate sofreu poucas alterações
nos últimos anos se comparada à evolução observada em outros setores
agroindustriais. O beneficiamento da erva-mate está dividido em duas etapas bem
distintas: o ciclo do cancheamento e o beneficiamento. O ciclo do cancheamento é a
primeira fase do processo, que inclui o corte da erva, o sapeco, a secagem, a
trituração e a peneiração. Após passar por estas etapas, a erva-mate obtida é
denominada de cancheada. A erva cancheada é a matéria-prima dos engenhos ou
moinhos, nos quais é realizada a segunda fase do processo, denominada de
beneficiamento. Ao ser beneficiada, a erva-mate cancheada passa pelas operações de
retificação da secagem, limpeza, trituração, e peneiramento. A industrialização da
erva-mate se restringe às folhas e ramos, pois estas dão origem aos principais
produtos da erva-mate, o chá mate torrado e o chimarrão (Valduga, 1995).
O sistema de processamento industrial da erva-mate contribui
significativamente para a qualidade sensorial do produto final. Cabe salientar que os
fatores edafoclímáticos, método de cultivo, condições de crescimento e poda, idade da
planta, época de colheita e aspectos sazonais interferem diretamente na composição
química e nas características sensoriais da erva-mate (Esmerelindo et al., 2004).
2.4- Componentes químicos e terapêuticos presentes na erva
mate
As investigações relativas à composição da erva-mate iniciaram-se por volta de
1836, quando foi constatada a presença de diversos compostos bioativos (Valduga,
1995). Foi verificada através de análises químicas, a presença de alcalóides, como a
cafeína (Mazzafera, 1997); compostos fenólicos, como ácido caféico e ácido
clorogênico (Filip et al., 2001) e flavonóides (Coelho et al., 2001). Na tabela 1, estão
listados os principais compostos encontrados em extratos aquosos de Ilex
paraguariensis.
Composição química
Exemplos de cada grupo de substâncias
Alcalóides
Cafeína, teofilina, teobromina
Ácidos fenólicos
Ácido clorogênico, ácido 3,4 dicafeoilquínico,
ácido 3,5 dicafeoilquínico, ácido 4,5
dicafeoilquínico, ácido 4- cafeoilquínico, ácido
5- cafeoilquínico
Carotenóides
β-caroteno, luteína, zeaxantina, violaxantina
Flavonóides
Quercetina, caempferol, rutina, mirecetina
Aminoácidos
Ácido aspárgico, ácido glutâmico, glicina,
alaninina, triptofano, arginina, histidina, lisina,
tirosina, valina, leucina, isoleucina, treonina,
metionina, asparagina
Vitaminas
Vitamina B1, vitamina B2, riboflavina, ácido
pantotênico, vitamina C, vitamina E
Minerais
Potássio, cálcio, ferro, fósforo, magnésio
Tabela 1: Composição química do extrato aquoso à quente de erva-mate (Filip et al.,
2000; Bracesco et al., 2003; Esmelindro et al., 2004; Bastos et al., 2006; Giulian et al.,
2007).
A cafeína, a teofilina e a teobromina são três alcalóides associados às
propriedades estimulantes atribuídas a erva-mate. Bastos e colaboradores (2005)
avaliaram por cromatrografia o conteúdo de ácido clorogênico e de cafeína presentes
em uma infusão de erva-mate (feito sob a forma de chimarrão). Foram observados
valores médios de 135 mg de cafeína e 226 mg de ácido clorogênico nesta infusão,
sendo suficiente para considerar a erva-mate uma excelente fonte de metilxantinas e
compostos fenólicos. A erva-mate é rica em compostos fenólicos hidrossolúveis, tais
como ácido caféico e ácido clorogênico, os quais apresentam alta capacidade
antioxidante conferindo as infusões um papel hepatoprotetor e antiinflamatório
(Mazzafera, 1997).
Ricco et al (1991) verificaram a composição de flavonóides em diferentes
espécies de Ilex e detectaram a presença de caempferol livre e na forma glicosídica,
quercetina livre e rutina no extrato aquoso de I. paraguariensis. O percentual de
compostos fenólicos (principalmente ácido clorogênico) é significativamente maior que
os flavonóides presentes na bebida durante o processo de infusão da erva (Clifford e
Ramirez-Martinez, 1990; Filip et al., 2001). Além disso, vários fatores determinam a
concentração dessas substâncias na infusão, tais como o tempo e a temperatura de
infusão, relação massa de erva / volume de água e composição da erva (porcentagem
de talos e de folhas). Lima e Melo (2004) demonstraram que quanto maior o tempo de
infusão, melhor é a extração à quente de compostos fenólicos de diferentes tipos de
chás (inclusive de erva-mate).
A presença de compostos antioxidantes na erva-mate está associado às suas
propriedades terapêuticas, tais como capacidade hipocolesterolêmica, colerética e
lipolítica (Filip et al., 2001). Alguns destes efeitos protetores são atribuídos aos
constituintes químicos presentes na erva-mate, destacando-se os compostos fenólicos
e os flavonóides (Esmelindro et al., 2004). Schinella e colaboradores (2000)
verificaram uma redução da peroxidação lipídica em fígado de ratos, sugerindo que a
ingestão do extrato aquoso de Ilex paraguariensis pode aumentar a defesa
antioxidante contra radicais livres. O subgrupo de flavonóides presente na erva-mate é
diferente daqueles presentes no chá verde (tabela 2), contudo, foi observado que o
extrato aquoso de Ilex paraguariensis (50 g/L) promoveu a maior inibição do estresse
oxidativo em linhagem de células de camundongo RWA264.7 quando comparada ao
chá verde (25 g/L) (Bixby et al., 2005). Segundo Bracesco et al (2003) a IIp a 5% (p/v)
apresenta três vezes mais polifenóis que o chá verde a 5% (p/v) sendo a captação de
radicais livres promovida pela erva-mate, superior quando comparado ao chá verde.
Chimarão Chá verde
Quercetina Epigalocatequina-galato
Rutina Epigalocatequina
Flavonols
a
Caempferol
Flavanols
b
Epicatequina
Mirecetina Epicatequino galato
Tabela 2 : Subgrupos de flavonóides presentes no chá verde e chimarão (
a
Bixby et al,
2005;
b
Filip et al, 2001).
3- ERVA-MATE E CÂNCER DE ESÔFAGO
Apesar da identificação de diversos efeitos benéficos relacionados à infusão de
erva-mate, outros trabalhos associam o consumo da erva ao risco de desenvolvimento
de carcinoma epidermóide de esôfago, principalmente em regiões localizadas no sul
da América do Sul (De Stefani et al., 1990; Castellsagué et al., 2000; Sewram et al.,
2003).
No Brasil, a área geográfica de alta incidência de câncer de esôfago localiza-se
principalmente na região sul do país (Pisani et al., 2002) onde ocorre também um
elevado consumo de erva-mate sob a forma de chimarrão. Nesta região, a infusão de
erva-mate é colocada em uma cuia, feita a partir do fruto da árvore Legionária vulgaris,
e é ingerida através de um tubo metálico (bomba) que traz o líquido quente (~70ºC)
diretamente à parte posterior da língua e orofaringe, de onde é prontamente deglutida.
O coeficiente padronizado de mortalidade por tumores esofágicos no Rio Grande do
Sul é de 14,3/100.000 habitantes entre os homens e 4,2/100.000 habitantes entre as
mulheres (Prolla et al., 1993). Segundo Pinto e colaboradores (1994) o consumo de
chimarrão, independente de outros fatores de risco, como o alto consumo de álcool e
fumo, responde por cerca de 20% dos casos de câncer de esôfago ocorridos na região
sul da América do Sul. Castellsagué et al (2000) verificaram uma correlação positiva
entre a quantidade de mate consumida e o risco de desenvolver carcinoma
epidermóide de esôfago, particularmente naqueles indivíduos que consomem um
volume acima de 1L de chimarrão por dia. Outro estudo (Victora et al., 1987), mostrou
um risco relativo de 12.2 vezes maior para os que consomem mais de 2.5 litros de
mate por dia, quando ajustado para os demais fatores.
Alguns estudos sugerem que a alta temperatura em que a bebida é ingerida
(~70ºC) seria o verdadeiro fator de risco associado ao consumo de erva-mate (Munoz
et al., 1987; Barros et al., 2000). Victora et al. (1987) avaliaram a associação entre a
incidência de câncer de esôfago e o consumo de chimarrão no sul do Brasil. Foram
analisados 171 casos de indivíduos que apresentavam esta enfermidade contra 342
controles pareados por sexo e idade. Variáveis de risco como o consumo de álcool,
hábito de fumar, ingestão de outras bebidas quentes e hábitos alimentares foram
considerados. Verificou-se que existe associação entre a ingestão de chimarrão
(expressa como freqüência, quantidade diária e tempo de exposição) e câncer de
esôfago. Os autores sugerem que a temperatura de ingestão do chimarrão representa
importante fator de risco e, especulativamente, descartam a hipótese de que o mate
contenha substâncias carcinogênicas. O mate consumido frio no Paraguai, não parece
ser um fator de risco para esta doença, independente do volume ingerido, o que
reforça a hipótese de que a alta temperatura esteja associada a sua incidência (Rolón
et al., 1995; Castellsagué et al., 2000).
Por outro lado, outros trabalhos sugerem que substâncias presentes na infusão
de erva-mate são potencialmente carcinogênicas ou potencializam a ação da lesão
causada pelo consumo freqüente de grandes volumes de chimarrão quente (Barros et
al., 2000). Vassalo et al (1985) estudaram a associação do hábito da população em
consumir chimarrão com a incidência de câncer de esôfago no Uruguai entre os anos
de 1979-1984. Observou-se que o consumo de chimarrão (em quantidade e
freqüência) apresentou efeito significativo de forma independente, com razão de
chances de 6,5 e 34,6. Os autores sugerem que substâncias presentes na erva-mate
e/ou produtos do processamento seriam responsáveis pelo desenvolvimento do
câncer, aliado ao efeito da alta temperatura de ingestão da bebida. Em trabalhos mais
recentes, verificou-se a presença de compostos carcinogênicos, os hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos, que podem contaminar a erva-mate durante o seu
processamento, em que se utiliza a queima de madeira nas etapas de sapeco e
secagem (Camargo e Toledo, 2002; Zuin et al., 2005).
Através da análise destes estudos podemos observar que a possível
relação entre o consumo de erva-mate e o desenvolvimento do carcinoma de esôfago
ainda é controverso e, portanto, inconclusivo. Sendo assim, torna-se necessário
investigar o efeito da erva-mate sobre enzimas envolvidas na gênese do câncer de
esôfago em animais experimentais; assim como avaliar se o chimarrão pode produzir
ou impedir danos ao DNA, causados por agentes genotóxicos conhecidos. Para
compreendermos os mecanismos de carcinogênese esofágica é essencial
identificarmos e definirmos os fatores de risco e de prevenção envolvidos neste
processo.
4- MECANISMO DE CARCINOGÊNESE QUÍMICA
A carcinogênese é caracterizada por eventos complexos que envolvem o acúmulo
de múltiplas mutações e alterações em vias de sinalização celular (Suhr, 1999). A
partir de estudos realizados em roedores, foi determinado que o desenvolvimento dos
tumores pode ocorrer em três etapas distintas: a iniciação, a promoção e a progressão
(Gescher et al., 2001).
A iniciação é um evento irreversível que ocorre no momento em que as células
de tecidos normais são expostas a carcinógenos e seu DNA genômico sofre danos
que não são reparados (Gescher et al., 2001). A promoção geralmente é reversível e
ocorre quando promotores de tumores induzem as células iniciadas a proliferarem,
formando assim uma população de células tumorais pré-malignas (Suhr, 1999). A
progressão é também um processo irreversível, no qual as células fenotipicamente e
genotipicamente alteradas desenvolvem mudanças microscópicas, macroscópicas e
funcionais (Gescher et al., 2001). Nesta fase o clone de células tumorais aumenta a
sua capacidade proliferativa e invasiva, assim como o seu potencial metastático (Suhr,
1999).
O processo de iniciação tumoral é ocasionado por uma mutação gênica. A
mutação pontual consiste na substituição de uma base do DNA por outra, ocasionando
a substituição de um aminoácido por outro na proteína codificada, e a mutação por
inserção ou deleção de bases consiste no deslocamento do quadro de leitura,
alterando a seqüência de códons e, conseqüentemente, a seqüência de aminoácidos.
Para o surgimento de um tumor é necessário que estas mutações ocorram em
determinadas regiões do genoma, assim, após um determinado número de alterações,
a célula torna-se neoplásica (Frieberg et al., 1985).
O evento mutagênico, responsável pela iniciação, pode sofrer uma série de
interações ou modificações induzidas por agentes químicos (Gescher et al., 2001).
Alguns trabalhos na área de quimioprevenção têm identificado novos agentes que
parecem modular o processo de carcinogênese em qualquer de suas etapas
(iniciação, promoção e progressão) (Wattenberg, 1985; Stoner et al., 1997).
Wattenberg (1985) desenvolveu uma classificação padronizada pela comunidade
científica para os agentes quimiopreventivos baseado nas etapas de carcinogênse.
Sendo assim, estes compostos foram classificados em agentes inibidores da formação
de carcinógenos (inibem formação endógena de carcinógenos), agentes bloqueadores
(inibidores da iniciação tumoral) e agentes supressores (inibidores das etapas de
promoção e progressão tumoral).
O possível evento quimiopreventivo relaciona-se também ao tipo de carcinógeno
no qual o indivíduo é exposto. Existem diversas substâncias químicas relacionadas à
carcinogênese ambiental dentre elas, o benzo[A]pireno e nitrosaminas (presente na
fumaça do cigarro) e a aflatoxina B1, por exemplo. A maioria dos carcinógenos
ambientais que causam tumores em seres humanos é considerada pré-carcinógenos,
ou seja, são compostos estáveis em pH fisiológico e, portanto, incapazes de interagir
com o DNA (Craddock, 1993). Esses carcinógenos são metabolizados por diversas
enzimas, dentre elas, os citocromo P450 (CYP). Através do processo de
biotransformação, os CYPs catalisam reações em que um composto lipofílico, de
natureza exógena (xenobiótico) torna-se hidrofílico sendo mais facilmente excretado
do organismo. Entretanto, algumas vezes, essa reação transforma compostos inócuos
em produtos com maior potencial farmacológico ou tóxico. Nesse caso, a
biotransformação é denominada ativação metabólica (Carddock, 1993).
Quando ocorre a ativação metabólica de pré-carcinógenos, os produtos
formados geralmente se transformam em agentes eletrofílicos, podendo reagir então
com o DNA e causar mutações (Ribeiro et al., 2003).
5- ENZIMAS CITOCROMOS P450 E SEU ENVOLVIMENTO NA
CARCINOGÊNESE ESOFÁGICA
5.1- Características gerais
Os citocromos P450 (CYP) fazem parte de uma superfamília de hemoproteínas
que catalisam a biotransformação oxidativa de substratos lipofílicos a metabólitos mais
polares (Parkinson, 1996). Os CYPs são os componentes mais importantes do sistema
de monooxigenase, que é responsável pela fase 1 da biotranformação (Lewis, 2001).
Estas enzimas são encontradas em diferentes espécies e na maioria dos tecidos,
como fígado, rim, pulmão, gônadas, adrenal, cérebro, epitélio nasal, trato
gastrointestinal e pele. Cada tecido possui um conjunto de isoenzimas e cada
isoenzima possui padrões distintos de distribuição e regulação (Maliakal &
Wanwimolruk, 2001).
Os CYPs estão presentes em alguns organismos procariontes e em todos os
organismos eucariontes, sendo encontrados na membrana do retículo endoplasmático
ou mitocôndria. Em mamíferos têm sido encontrados CYPs em diversos tecidos,
porém eles são mais abundantes no fígado (Omura, 1999; Porter & Coon, 1991).
5.2- Ciclo catalítico
As enzimas CYP são oxidases que apresentam em seu sítio catalítico um
grupamento prostético heme ou ferro-protoporfirina IX localizado numa fenda
hidrofóbica da apoproteína que é acessível ao substrato (figura 4). Como o átomo de
ferro é hexavalente, quatro ligações são feitas com átomos de nitrogênio dos anéis
pirrólicos e o quinto ligante é um ânion tiolato proveniente de um resíduo de cisteína
situado próximo à região C-terminal da apoproteína.
O ferro do grupo heme no citocromo P450 está usualmente no estado férrico
(Fe
3+
). Quando este íon é reduzido ao estado ferroso (Fe
2+
) o citocromo P450 pode se
ligar ao oxigênio molecular ou ao monóxido de carbono sendo estes, então, os sextos
ligantes (Parkinson, 1996).
CH
CH
2
COOHCH
2
CH
2
COOHCH
2
CH
2
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
CH
2
N
Fe
+3
N
N
N
Figura 4: Estrutura do grupo prostético heme do citocromo
P450 (Parkinson, 1996).
Os citocromos P450 são enzimas do tipo monooxigenases, pois na reação
básica por eles catalisada apenas um átomo de oxigênio é incorporado ao substrato
(RH) e o outro é reduzido à água, sendo os equivalentes redutores prioritariamente
derivados do NADPH, conforme a equação abaixo:
Substrato (RH) + NAD(P)H + O
2
+ H
+ CYP
Produto (ROH) + NAD(P
+
)
+ H
2
O
A primeira parte do ciclo envolve a ativação do oxigênio e a parte final do ciclo
envolve a oxidação do substrato (Figura 5). Após a ligação do substrato à enzima
CYP, o ferro do heme é reduzido do estado férrico (Fe
3+
) ao ferroso (Fe
2+
) pela adição
de um elétron proveniente da NADPH-citocromo P450 redutase. A introdução do
segundo elétron que pode vir da NADPH-citocromo P450 redutase ou do citocromo b5,
cliva o complexo Fe
2+
OOH produzindo água e o produto monooxigenado. A liberação
do substrato oxidado retorna o CYP ao seu estado inicial.
Se o ciclo catalítico for interrompido após a introdução do primeiro elétron,
oxigênio é liberado como ânion superóxido (O
2
-
). Se o ciclo for interrompido após a
introdução do segundo elétron, oxigênio é liberado como peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) (Parkinson, 1996).
Figura 5: Ciclo catalítico do citocromo P450. Adaptado de Parkinson (1996).
5.3- Nomenclatura
A análise das seqüências gênicas que codificam os CYPs facilitaram o sistema
de classificação baseado na seqüência de aminoácidos, critérios filogenéticos e
organização gênica (Porter & Coon, 1991). O sistema de classificação utiliza a sigla
CYP para abreviar citocromo P450, seguida por uma designação alfanumérica para
famílias, subfamílias e isoformas individuais (Nerbert et al., 1991). A nomenclatura dos
CYPs é determinada pela percentagem de similaridade de suas seqüências de
aminoácidos (Gonzalez, 1989), como observado no quadro 1.
Quadro 1: Sistema de nomenclatura de citocromos P450. Adaptado de Gibson e Skett (1994).
Classificação
Grupo % Homologia entre os
membros
Superfamília
CYP
10%
Família
CYP2
45%
Subfamília
CYP2A
64%
Membros
CYP2A3
-
5.4- Subfamília CYP2A
Os citocromos P450 da subfamília CYP2A estão presentes em diversos tecidos
de animais experimentais e em humanos. O rato expressa os CYP2A1 e CYP2A2 no
fígado, sendo responsáveis pela hidroxilação da testosterona na posição 15-α
(Matsunaga et al., 1988). O CYP2A3 foi primeiramente identificado no pulmão de ratos
por Kimura et al. (1989) que também detectou a atividade de hidroxilação da cumarina
neste tecido. Posteriormente, esta enzima também foi identificada no epitélio nasal em
níveis mais elevados do que no pulmão (Su et al., 1996), porém não foi detectada sua
expressão em fígado de ratos (Béréziat et al., 1995). Em experimentos realizados em
nosso laboratório, verificou-se que o CYP2A3 também é expresso no esôfago de ratos
e está envolvido no metabolismo de nitrosaminas neste tecido, participando, portanto,
do processo de carcinogênese no esôfago destes animais (Ribeiro-Pinto et al., 2001).
As nitrosaminas estão presentes em alimentos (principalmente nos defumados)
e no tabaco, além de serem formadas endogenamente no estômago (Ribeiro-Pinto et
al., 2003). Muitas nitrosaminas como a N-nitrosodietilamina (NDEA), são
cancerígenas para o esôfago, e para muitas delas, o esôfago é o único órgão-alvo,
independente da via de administração (Craddock, 1993). O rato é a espécie mais
susceptível à indução de tumores por nitrosaminas, exclusivamente ou
preferencialmente no esôfago, devido à presença do CYP2A3 neste tecido (Lijinsky,
1992). Ribeiro Pinto e colaboradores (2000) mostraram que a administração
concomitante de etanol e nitrosaminas produzem um aumento do dano ao DNA no
esôfago de ratos. Isso se deve à inibição do metabolismo das nitrosaminas em outros
tecidos, mas não no esôfago, levando, assim, a um aumento da concentração destes
carcinógenos neste tecido-alvo (Ribeiro Pinto et al., 2000).
Em humanos os CYP2A estão presentes no fígado (CYP2A6 e CYP2A13) e
esôfago (CYP2A6). O CYP2A6 presente em humanos foi seqüenciado por Yamano et
al. (1990) e apresenta uma similaridade de 86% com o CYP2A3 de ratos. Além disso,
o CYP2A6 também apresenta atividade de hidroxilação da cumarina e metaboliza pré-
cancerígenos como NDEA, 4-(metilnitrosoamino)-1-(3piridil)-1-butanona (NNK)
presente no tabaco e aflatoxina B1 (Koskela et al., 1999).
Os membros da subfamília CYP2A possuem propriedades peculiares quanto a
sua regulação, uma vez que são induzidos por um grande número de compostos e
não possuem indutores clássicos (Pelkonen et al., 1995). Além disso, uma mesma
isoforma pode sofrer regulação, tanto por mecanismos transcricionais, quanto pós-
transcricionais (Pelkonen et al., 1995).
O CYP2A6 apresenta uma acentuada variabilidade interindividual de sua
expressão no esôfago humano. Um estudo de nosso grupo mostrou a expressão do
CYP2A6, ortólogo ao CYP2A3, no esôfago de 61% de 50 pacientes brasileiros.
Somente no paciente que apresentou a maior expressão do CYP2A6 fomos capazes
de detectar a ativação da NDEA, em taxas semelhantes às do rato. O motivo da
variação na expressão do CYP2A6 observada não é conhecido, mas pode estar
relacionado à exposição dos indivíduos a diferentes compostos capazes de induzir as
enzimas CYP2A. Nossos estudos sugerem que parece haver uma associação entre a
expressão de enzimas CYP2A no esôfago e a susceptibilidade à indução de tumores
pelas nitrosaminas (Godoy et al., 2002). Os indutores específicos do CYP2A6 humano
não são conhecidos, no entanto, devido a sua similaridade com o CYP2A3 de ratos, é
possível que ambas as enzimas possam ser induzidas pelos mesmos compostos.
Nesse sentido, quaisquer substâncias naturais ou agentes sintéticos que
modulem a expressão destas enzimas podem interferir na formação de carcinógenos
finais no tecido esofágico. Os estudos que buscam avaliar a expressão e atividade de
CYP2A em ratos podem refletir o comportamento destas enzimas presentes no
esôfago humano, considerando a homologia existente entre elas e metabolização dos
mesmos substratos (Koskela et al., 1999).
6- TESTES UTILIZADOS NA DETECÇÃO DE COMPOSTOS
MUTAGÊNICOS E/OU GENOTÓXICOS
As mutações gênicas atuam em etapas do processo de carcinogênese (Suhr,
1999). A alteração na seqüência do DNA pode ser causada por agentes físicos, como
radições ionizantes, biológicos, como alguns vírus, e por agentes químicos, chamados
geralmente de carcinógenos. Estes agentes lesivos podem levar a uma alteração nos
processos de sobrevivência e de proliferação celular (Suhr, 1999). Os danos genéticos
podem ser induzidos tanto por agentes mutagênicos naturais como por agentes
mutagênicos sintéticos (Gescher et al., 2001). Alguns mutágenos necessitam, ainda,
de um sistema de metabolização para tornarem-se ativos e induzirem as mutações
(Maron & Ames, 1983). Para identificar os agentes mutagênicos foram desenvolvidos
alguns testes, os quais são capazes de detectar substâncias com risco potencial à
saúde humana (Maron & Ames, 1983).
6.1- Teste de mutação reversa com Salmonella typhimurium
(Teste de Ames)
O Teste de Ames é a metodologia de triagem mais utilizada e validada para a
identificação de substâncias carcinogênicas genotóxicas (Maron & Ames, 1983). Esta
técnica tem como objetivo avaliar o potencial mutagênico de substâncias químicas
bem como associar essas taxas de mutagênese, a viabilidade celular (Maron & Ames,
1983).
Bruce Ames e colaboradores (1973) publicaram os princípios do teste
empregando mutantes de Salmonella typhimurium derivadas da parental LT2,
deficientes na síntese do aminoácido histidina, apresentando diferentes mutações no
operon deste aminoácido. Após o tratamento das linhagens com a substância teste, as
células podem sofrer mutação, passando para a prototrofia em relação ao aminoácido
(Ames et al., 1973). Sendo assim, o teste baseia-se na contagem do número de
revertentes produzidos em uma cultura bacteriana, pela incubação das células com o
composto em estudo (Maron & Ames, 1983).
Estudos realizados por Ames et al. (1973) e McCann et al. (1975)
demonstraram uma correlação qualitativa entre os resultados obtidos no teste de
Ames e respostas a ensaios de avaliação de atividade carcinogênica. O consenso
atual indica este ensaio como uma ferramenta no conjunto de testes que definem a
potencialidade de ação para compostos cancerígenos genotóxicos (Claxton, 1997).
6.1.1- Características das linhagens utilizadas
Cada linhagem possui, além de uma mutação no operon histidina, modificações
genéticas adicionais, que são as mutações rfa e uvrB, além do fator de resistência a
ampicilina e a tetraciclina (Maron & Ames, 1983). A mutação rfa elimina a parte
lipopolissacarídica (LPS) da parede bacteriana, tornando as bactérias mais
permeáveis e não patogênicas (Maron & Ames, 1983). A mutação uvrB consiste na
deleção do gene uvrB que codifica o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos.
Quando o gene está inativado, um aduto não pode ser retirado do DNA (Maron &
Ames, 1983). Os plasmídios pKM101 e o pAQ1 conferem resistência à ampicilina e
tetraciclina, respectivamente (Maron & Ames, 1983).
Como mencionado anteriormente, as linhagens empregadas no teste de Ames são
incapazes de crescer em meio de cultura mínimo, sem histidina, a menos que ocorram
mutações que restaurem a sua capacidade de síntese (Ames et al., 1973). As cepas
padrões utilizadas para os ensaios iniciais de triagem são TA97, TA98, TA100 e
TA102 de Salmonella typhimurium (Maron & Ames, 1983). A linhagem TA97 de S.
typhimurium detecta mutação por adição ou deleção no locus hisD6610 e hisO1242; a
linhagem TA98 detecta mutação por adição no locus hisD3052; a linhagem TA100
detecta mutação pontual de G-C para T-A no locus hisG46 e a linhagem TA102
detecta mutação pontual de T-A para G-C. As cepas TA98 e TA100 são utilizadas para
estudar, principalmente, o metabolismo de compostos N-nitrosos e a TA102 detecta
uma grande variedade de compostos que causam danos oxidativos (Maron & Ames,
1983).
Algumas linhagens, com sensibilidade específica a determinadas classes de
substâncias, têm sido desenvolvidas. As cepas YG7104 (ogt
ST
-) e YG7108 (ogt
ST
e ada
ST
-) são derivadas da linhagem de Salmonella typhimurium TA1535, e possuem
deleções nos genes ogt
ST
e ada
ST
. Os genes ogt
ST
e ada
ST
codificam O-metilguanina
DNA-metiltransferases que estão envolvidas no reparo de danos ao DNA na posição
O
6
da guanina, causados por agentes alquilantes (Yamada et al., 1997).
As cepas YG1021, YG1024, YG1041, TA98DNP-6 e TA98NR são derivadas da
linhagem de Salmonella typhimurium TA98 (Aiub et al., 2006). A linhgem YG1021
contém um plasmídeo (pYG216) que apresenta um gene que codifica nitroredutases
sendo sensível, portanto, a compostos N-nitrosos; a linhagem YG1024 possui um
plasmídeo (pYG219) que apresenta um gene que codifica N-acetiltransferases (NATs)
sendo extremamente sensível a aminas aromáticas. A linhagem YG1041 expressa
genes que codificam nitroredutase e acetiltransferase, enquanto que as linhagens
TA98DNP-6 e TA98NR são deficientes em acetiltransfeases e nitroredutases,
respectivamente. As enzimas NATs transferem um grupo acetila para o átomo de
nitrogênio de aminas aromáticas e hidrazina ou para o átomo de oxigênio de
arilaminas hidroxiladas. Dessa forma, elas catalisam tanto reações de detoxificação,
tais como a N-acetilação, quanto reações de ativação, produzindo metabólitos reativos
com o DNA, como a O-acetilação da N-hidroxiarilamina (Kadlubar et al., 1992). Assim,
sabe-se que as NATs contribuem para a carcinogênese química (Kadlubar et al.,
1992). As nitroredutases também participam da formação de nitrosaminas e estão
presentes, por exemplo, na microflora intestinal humana, sendo responsáveis pela
ativação metabólica endógena de compostos N-nitrosos (Einistro, 1991)
6.1.2- Ativação metabólica
Com a finalidade de tornar o teste mais consistente e aplicável a mamíferos, o
ensaio tornou-se dependente de um passo fundamental, que é a mimetização de um
sistema de metabolização. A mistura de ativação enzimática exógena (S9 mix)
corresponde ao sobrenadante, obtido após a centrifugação a 9000 g, de um
homogenato preparado a partir de fígado de ratos previamente tratados com um
indutor de enzimas microssomais de metabatolização de xenobiótocos, o Aroclor 1254
(Maron & Ames, 1983). O Aroclor 1254 induz principalmente a síntese de CYP2B e
CYP1A. A indução enzimática pelo Aroclor 1254 pode levar, tanto a um aumento da
desintoxicação, quanto a um aumento da ativação dos xenobiótocos, o que dependerá
da substância estudada (Zeiger et al., 1979).
6.2- SOS cromoteste
O SOS cromoteste é um ensaio quantitativo colorimétrico que mede a
expressão de genes induzidos por agentes genotóxicos, utilizando-se linhagens de
Escherichia coli (Quillardet et al.,1985).
O reparo por excisão de nucleotídeos (REN) em E.coli está sob o controle do
sistema SOS, que permite uma expressão constitutiva basal de um grande número de
genes do sistema REN em condições normais e uma forte indução quando a bactéria
é submetida a várias lesões em seu DNA. O funcionamento do sistema de reparo SOS
ocorre quando a forquilha de replicação encontra um dímero. A síntese do DNA é
interrompida e somente reiniciada a uma distância além do dímero. No espaço onde a
síntese é interrompida a enzima RecA se liga e ativa outras proteínas que destroem,
através de clivagem proteolítica, o repressor dos genes SOS (repressor LexA)
(Quillardet et al.,1985). Desta maneira, a proteína RecA promove o reparo do DNA de
ambas as formas, por recombinação e através da indução de cerca de 15 genes SOS
(quadro 4) (Quillardet et al.,1985). Assim, a resposta SOS faz parte de uma resposta
central de Escherichia coli a agentes genotóxicos podendo ser mensurada, indicando
eventos de lesão no DNA. A metodologia está relacionada ao monitoramento da
expressão de genes SOS ligados a LacZ, um gene estrutural de Escherichia coli para
β-galactosidase (Quillardet et al.,1985).
Quadro 2 : Relação dos genes SOS, induzíveis por lesão no DNA.
Nome do gene Papel no reparo do DNA
uvrA, uvrB Codificam endonucleases de excisão.
umuD, umuC Codificam proteínas requeridas para o
reparo sujeito a erro e mutagênese.
sulA Codifica proteína que inibe a divisão
celular, permitindo que o reparo do DNA
ocorra.
ssb Codifica a proteína SSB
uvrD Codifica helicase II
himA Codifica a subunidade do fator de
interação ao hospedeiro, envolvido na
recombinação sítio-específica.
recN Envolvido no reparo por recombinação
dinA, dinB, dinC, dinF Genes com funções desconhecidas
Adaptado de Quillardet et al.,1985
7- POSSÍVEIS MECANISMOS DE CARCINOGÊNESE NO SUL DO
BRASIL
Como explanado anteriormente, a etiologia do carcinoma epidermóide de
esôfago na região sul do Brasil parece estar associada, dentre outros fatores, ao
consumo do chimarrão a altas temperaturas. Há três possíveis mecanismos pelo qual
a erva-mate pode elevar o risco de câncer de esôfago. O extrato da planta a quente
pode conter substâncias carcinogênicas. A outra possibilidade é que enzimas que
metabolizam pré-carcinógenos, como o CYP presente no tecido esofágico, por
exemplo, sejam induzidos pela infusão de erva-mate, aumentando assim a ativação
metabólica de carcinógenos no esôfago. E, por fim, o fato de que a injúria térmica
crônica poderia causar danos à mucosa esofágica levando a tumorigênese ou
potencializando a ação de outros carcinógenos ingeridos (Victora et al., 1987). Vários
estudos epidemiológicos foram realizados no Japão (Segi et al., 1975), no Irã (IARC,
1997), na extinta União Soviética (Kolycheva et al., 1980) e em Porto Rico (Martinez,
1969), sugerindo uma associação entre a ingestão de bebidas quentes e o
desenvolvimento de câncer esofágico (Victora et al., 1987). Além disso, nosso grupo
vem investigando também este aspecto em modelo experimental.
Como o câncer de esôfago é o interesse principal de nosso laboratório,
começamos a analisar o efeito da Ilex paraguariensis sobre sistemas biológicos,
incluindo a monooxigenase esofágica; bem como, verificar se a erva-mate apresenta
mutagenicidade em modelos bacterianos sensíveis na detecção de compostos
mutagênicos.
II. Objetivos
Investigar se a infusão de Ilex paraguariensis pode aumentar a ativação
metabólica de nitrosaminas no esôfago de ratos
x Analisar o efeito da infusão de Ilex paraguariensis sobre a expressão do RNAm
do CYP2A3 em esôfago de ratos tratados por diferentes intervalos de tempo.
x Identificar a influência da infusão de Ilex paraguariensis sobre a expressão
protéica do CYP2A3 em esôfago de ratos tratados por diferentes intervalos de
tempo.
x Caracterizar o efeito da infusão de Ilex paraguariensis sobre a atividade
relacionada à enzima CYP2A3 (COH) e da NDEAd em esôfago de ratos tratados
por diferentes intervalos de tempo.
Investigar se a infusão de Ilex paraguariensis apresenta compostos
mutagênicos e/ou antimutagênicos.
x Avaliar a mutagenicidade e a toxicidade da infusão de Ilex paraguariensis em
linhagens bacterianas de S. typhimurium e E. coli na presença e na ausência de
ativação metabólica.
x Verificar se a infusão de Ilex paraguariensis apresenta antimutagenicidade
utilizando linhagens bacterianas de S. typhimurium na presença e na ausência de
ativação metabólica.
II- Materiais e Métodos
1- EQUIPAMENTOS
Agitador tipo Vortex modelo AP56, Phoenix (Brasil);
Autoclave Phoenix (Brasil);
Balança de precisão modelo AL500, Marte (Brasil);
Banho-maria modelo 1051, Biomatic (Brasil);
Banho-maria modelo TB-85, Shimadzu (Japão);
Câmara de fluxo laminar vertical, TROX (Brasil);
Centrífuga modelo 16, RDE Equipamentos Científicos LTDA (Brasil);
Cuba vertical de eletroforese modelo Mini-Protean II, Bio-Rad (EUA);
Cuba de transferência modelo Mini-V8.10 com Trans-Blot Module, Gibco BRL
(EUA);
Espectrofotômetro modelo UV- 160, Shimadzu (Japão);
Espectrofluorímetro modelo F 3010 Hitachi (Japão);
Fonte para eletroforese modelo 250, Life Technologies (EUA);
Freezer –85º C Modelo U41085, New Brunswick Scientific (Alemanha);
Homogeneizador de teflon Potter-Elvehjem (30 mL), Wheaton (EUA);
Homogeneizador de teflon Potter-Elvehjem (2 mL), Wheaton (EUA);
Homogeneizador de vidro, Kontes Glass CO., (20 mL);
HPLC Analisys System, Shimadzu, acoplado a coluna Novapak C
18
5 M (4,6 x
250 mm);
Incubadora bacteriológica equipada com termostato (estufa) Precision Scientific
Co. modelo 4, Thelco (Canadá);
Mesa agitadora rotatória (shaker) modelo TE-420, Tecnal (Brasil);
Microcomputador Pentium III 542MB / 80GB;
Micro-pipetas Finnpipette
4500, Labsystems (EUA);
Micropipetas Gilson (EUA);
Potenciômetro modelo Analyser pH 300, BioCristal (Brasil);
Termociclador modelo I cycler, Bio-Rad (EUA);
Transiluminador de luz ultravioleta Modelo TM-20, UVP (EUA);
Ultracentrífuga refrigerada modelo Himac CP70G / Rotor RP50AT4 / tubos 4.7
PC thick-walled tubes-3,2 mL, Hitachi (Japão);
Scanner HP 1315;
Software LabImage versão 2.
2- REAGENTES
Acrilamida/bis-acrilamida (29:1), Kit de revelação da fosfatase alcalina (n
o
de
catálogo: 1706432), Bio-Rad, CA, USA;
Ácido tricloroacético (TCA), ácido clorídrico (HCl), ampicilina trihidratada,
albumina sérica bovina (BSA), amido-black, anticorpo secundário Anti-Rabbit IgG
Alkaline Phosphatase Conjugate, dimetilsulfóxido (DMSO), D-Biotina, 2,4-
dinitrofenilhidrazina, etoxicumarina, gelatina, hidróxido de bário (Ba(OH)
2), L-
histidina, mitomicina C, 4-nitroquinolina N-óxido (4NQO), N-nitrosodietilamina
(NDEA), nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato – forma reduzida (NADPH),
oxalato de tetrametilamônia, O-nitrofenil β-D-galactopiranosideo (ONPP), p-
Nitrophenyl Phosphate (PNPP), reativo de Folin-Ciocalteau, tetraciclina,
trihidroximetil aminometano (Tris), trealose, sulfato de zinco (ZnSO
4),
umbeliferona, Sigma Chemical Company, MO, USA;
Acetaldeído, acetonitrila, 2-aminofluoreno, cloreto de magnésio (MgCl
2
), cloreto
de potássio (KCl), cloreto de sódio (NaCl), clorofórmio, dodecil sulfato de sódio
(SDS), etanol, etilenodiamina tetracetato dihidratado (EDTA), fosfato de sódio e
amônio tetrahidratado PA (NaHNH
4PO4. 4H2O), formaldeído, formamida, glicina,
hexano, hidróxido de sódio (NaOH), isopropanol, 2-mercaptoetanol, metanol,
nitrato de prata (AgNO
3
), persulfato de amônia, Merck, NY, USA;
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP), Amresco, Ohio, EUA
Ácido acético, carbonato de sódio (NaCO
3
), cloreto de magnésio (MgCl2), sulfato
de cobre (CuSO
4
), tartarato de sódio / potássio, glicerol, Reagen, RJ, BRA;
Ácido cítrico monohidratado PA, cristal violeta, D-glucose anidra P.A., fosfato de
potássio dibásico PA (K
2HPO4), fosfato de sódio dibásico PA (NaH2PO4. H2O),
fosfato de sódio monobásico (Na
2HPO4), sulfato de magnésio (MgSO4. 7H2O),
VETEC, RJ, BRA;
Azida sódica, β-D-Glicose-6-fosfato monossódica, 1-metil 3-nitroso-1-
nitrosoguanidina (MNNG), Aldrich Chemical Company Inc., EUA;
Fração S9: MOLTOX (Molecular Toxicology, Incorporated), Annapolis, USA;
Top Agar, bacto yeast extract, Himedia, Mumbai, India;
Bacto triptona, Becton Dickinson and company (BD), França;
Dietilpirocarbonato (DEPC), N,N,N’,N’- tetrametiletilenodiamina (TEMED), USB,
OH, USA;
Marcador de peso molecular (pBluescript-Sk+) digerido com a enzima Hinf I,
Stoffel DNA polimerase produzida em nosso laboratório pelo Dr. Rodolpho
Mattos Albano;
Seqüências de oligonucleotídeos específicos para cDNA do CYP2A3 e GAPDH,
Reagente Trizol, Transcriptase reversa (M.MLVRT), Invitrogen, SP, BRA;
Seqüências de oligonucleotídeos randômicos (Random Primer)
Desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs), RNAguard inibidor de RNase
(RNAsina), Amersham Pharmacia Biotech, SP, BRA;
O kit de Western blot Mini-V módulo 8.10 foi adquirido da Amersham Life
Science. O kit de revelação fosfatase alcalina (nº 170-6432) e a membrana de
nitrocellulose 0,45 micron (nº 1620116) foram adquiridos da BIORAD.
O anticorpo produzido em coelho anti-P450 2A5 foi doado pelo Dr. Matti Lang, do
Departamento de Bioquímica, Universidade de Uppsala, Suécia.
Oligonucleotídeo que inibe a enzima stoffel a temperatura ambiente
(oligonucleotídeo bloqueador), Imprint, SP, BRA.
3- ANIMAIS
Foram utilizados 180 ratos Wistar machos com idade média de 8 semanas (1)
e peso médio de 221 g ( 26 g), mantendo-se 5 animais por caixa. Os animais foram
doados pelo biotério central da Fundação Oswaldo Cruz e durante o trabalho foram
mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica da Universidade do Estado do
Rio de Janeiro, onde foram acondicionados em caixas plásticas apropriadas, com
grade de aço inoxidável. O ambiente foi mantido sob temperatura controlada (~25 ºC),
com ciclo de luminosidade de 12 h e com água e ração Nuvilab (Nuvital, BR) ad
libitum.
4- ERVA-MATE
A erva mate (Ilex paraguariensis) foi adquirida na forma comercial de erva seca
e verde (própria para chimarrão) fabricada por: BARÃO Comércio e Indústria de Erva-
Mate LTDA, RS – BR, lote 25A.
5- PREPARO DA INFUSÃO DE Ilex paraguariensis (IIp)
A infusão de Ilex paraguariensis (IIp) foi preparada adicionando-se 1 litro de
água filtrada a 70 ºC a 100 g de erva mate seca (10% p/v). Esta solução foi deixada
em infusão por 1 h protegida da luz, filtrada em papel de filtro e oferecida aos animais
do grupo experimental em recipiente protegido da luminosidade. Esta infusão foi
renovada a cada dia de tratamento, sempre no mesmo horário, verificando-se o
volume consumido a cada troca.
6- TRATAMENTO DOS ANIMAIS COM IIp
Os ratos foram divididos em 5 grupos experimentais, com 30 animais cada, e a
infusão na concentração de 10% (p/v) foi fornecida (ad libitum). Como demonstrado na
figura 6, o consumo diário de IIp foi de aproximadamente 30 ml por animal, ou seja, 3g
de erva/dia ou 13 g/kg/dia . A escolha da dose foi baseada no consumo médio de
chimarrão descrito na região sul do país (Castellsagué et al., 2000). Os ratos foram
tratados por 2, 4, 7, 14 e 21 dias consecutivos. O grupo controle recebeu água filtrada
ao invés de IIp. O peso dos animais foi verificado ao longo do tratamento, não
havendo alteração (ganho ou perda) de peso significativa entre os grupos tratados e
controle (figura 7).
0 7 14 21
100
150
200
250
300
350
400
2 dias
4 dias
7 dias
14 dias
Controle
Variação do peso
21 dias
Dias
peso (g
)
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo (dias)
Consumo de IIp
Controle 2 dias 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias
ml de IIp/animal/dia
Figura 6: Consumo médio de infusão de Ilex paraguariensis
de animais controle e tratados por diferentes intervalos de
tempo (dias).
Figura 7: Variação do peso dos animais controle e tratados com a
infusão de Ilex paraguariensis por diferentes intervalos de tempo (dias).
7- SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E COLETA DO ÓRGÃO
Os animais (tratados e controle) foram mantidos em jejum por cerca de 18
horas, e sacrificados por asfixia em câmara de CO
2
. O epitélio esofágico de todos os
animais foi retirado e imediatamente congelado em freezer -70 ºC. Amostras de cinco
esôfagos foram colocadas em 1 mL de Trizol para extração do RNA total.
8- EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO RIBONUCLÉICO (RNA)
TOTAL
O RNA total foi extraído do tecido utilizando-se o reagente Trizol
, seguindo o
protocolo descrito pelo seu fabricante (Invitrogen, SP, BRA) :
Homogeneização: Cada fragmento de 50-100 mg de tecido esofágico foi
homogeneizado em um tubo eppendorf contendo 1 mL de Trizol e incubado por 5
minutos a temperatura ambiente (TA).
Separação e precipitação: Foi acrescentado 0.2 mL de clorofórmio a cada tubo.
Estes foram agitados por 15 segundos, incubados por 2 minutos a TA e
centrifugados a 12.000 rpm por 15 minutos. A fase aquosa (sobrenadante) foi
transferida para tubos novos, e o restante do material foi descartado. Um volume
de 0.5 mL de isopropanol foi acrescentado à fase aquosa e os tubos foram
agitados, incubados por 10 minutos a TA e centrifugados a 12.000 rpm por 10
minutos.
Lavagem: O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado duas vezes
com 1mL de etanol 75% (v/v) por centrifugação por 5 minutos a 10.000 rpm. O
RNA foi ressuspendido em 20 L de água contendo 0.1% (v/v) de
dietilpirocarbonato (H
2
O DEPC).
Quantificação do RNA total: Para a quantificação do RNA total, 1 L de solução
final contendo RNA foi diluído 1:100 em água DEPC, e sua absorbância foi
determinada por espectrofotometria no comprimento de onda de 260 nm, contra
um branco contendo 150 L de água DEPC. Uma unidade de absorbância
corresponde a uma concentração de 40 g/ mL de RNA.
9 - REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT) COM A ENZIMA MMLV
A partir do RNA total, o cDNA foi sintetizado através de uma reação de
transcrição reversa com a enzima MMLV-RT, seguindo o protocolo de Robottom-
Ferreira et al. (2003). Cada tubo de reação continha 2.5 g de RNA total de tecido,
250 ng de primer randômico e água DEPC suficiente para 15 L. Após incubação a
70ºC por 10 minutos, os tubos foram transferidos para o gelo, sendo, então,
adicionados em cada tubo 10 L de tampão de RT 5X (fornecido pelo fabricante,
Invitrogen, SP, BRA), 2.5 L de cada desoxiribonucleotídeo a 10 mM, 2 L de
RNAsina, 1 L de MMLV-RT contendo 200 U, e 20 L de trealose 1.5 M. Os tubos
foram então incubados a 37 ºC por 1 hora, e posteriormente a 70 ºC por 15 minutos.
Cada tubo foi armazenado a –20 ºC até a sua utilização.
10- REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
O protocolo utilizado foi otimizado a partir do descrito por Robottom-Ferreira et
al. (2003). Cada tubo de reação de 0.2 mL continha 2.5 L de tampão da enzima Taq
polimerase (stoffel) concentrado 10X (Tris 200 mM, pH 8.5 / (NH
4
)
2
SO
4
100 mM / 1
mg/mL gelatina), 1.0 L da enzima stoffel, 1 L de uma solução contendo 5 mM de
cada desoxiribonucleotídeo, 1 L de MgCl
2
a 50 mM, 1 L de oligonucleotídeo
bloqueador a 50 ng/L (5’-
GCCGGCCAATGTACAGTATTGGCCGGCTTTTGGCGGAGCGATCATCTCAGAGCAT
TCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGA-3’), 1 L de oxalato de tetrametilamônia a 50
mM, 14 L de água MilliQ, 1 L de primer senso a 100 ng/L , 1 L de primer anti-
senso a 100 ng/ L e 1.5 L de cDNA, em um volume final de reação de 25 L .
A técnica foi utilizada para analisar a expressão do mRNA do CYP2A3. Como
controle positivo da reação de RT-PCR foi utilizado o gene que codifica a enzima
gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), como “house keeping gene”. As
seqüências de oligonucleotídeos específicos, assim como a temperatura de
anelamento e o número de ciclos utilizado para cada reação de PCR estão descritos
no quadro 2. Para realização da análise do gene foram realizadas padronizações para
que fosse possível uma comparação entre a amostra do grupo controle e as amostras
dos grupos tratados com infusão de I. paraguariensis. Essas padronizações
correspondem a curva de concentração de cDNA e curva de ciclos. Desta forma, a
reação apresentou as etapas abaixo, sendo o valor de X específico para cada gene
analisado.
Pré-desnaturação: 94 ºC - 2 minutos
Desnaturação: 94 ºC – 45 segundos
X ciclos Anelamento: X ºC – 1 minuto
Extensão: 72 ºC – 1 minuto
Ciclo adicional: 72 ºC - 15 minutos
Quadro 3: Seqüências específicas de oligonucleotídeos senso e anti-senso, tamanho dos
fragmentos amplificados e condições de PCR para os genes analisados.
a
Robottom-Ferreira et
al., 2003
b
Sabath et al., 1990.
11- ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
Os produtos amplificados a partir da PCR foram visualizados por eletroforese
em gel de poliacrilamida (6%). O gel foi preparado seguindo o protocolo de Sambrook
et al. (1989) adicionando-se 2 mL de tampão TBE 5X (0.45 M Tris-borato / 0.01 M
EDTA), 2 mL de solução acrilamida/bisacrilamida (29:1), 0.1 mL de persulfato de
cDNA Ciclos
T°
anelamento
pb Senso Anti-senso
CYP2A3
a
45
59 ºC
398
CAGCTCTATGAGATGTTCTC
CATCTTCATTCGGTCCTCATA
GAPDH
b
30
57 ºC
220
TGTGAACGGATTTGGCCGTA
TCGCTCCTGGAAGATGGTGA
amônia a 10% (p/v), 0.01 mL de TEMED e 5.9 mL de água destilada. As amostras
foram preparadas na proporção de 9 L do produto de PCR para 1 L de corante
(glicerol a 50% (v/v); xileno cianol a 0.05% (p/v) e azul de bromofenol a 0.05% (p/v). A
amostra foi submetida a 80 V até a saída do primeiro corante (azul de bromofenol) e o
gel fixado em ácido acético a 10% (v/v), durante 20 minutos. Após a fixação, o gel foi
lavado duas vezes, durante 2 minutos com água destilada e tratado com uma
solução
de nitrato de prata (0.1 % de nitrato de prata (p/v) e 0.15% de formaldeído (v/v), por 30
minutos. O gel foi lavado com água destilada por 10 segundos e revelado com uma
solução a 3% de Na
2
CO
3
(p/v), 0.15% de formaldeído (v/v) e 0.02% de tiossulfato de
sódio (p/v) até o aparecimento das bandas. A revelação foi paralisada com ácido
acético a 10% e o gel foi seco entre 2 folhas de papel
celofane (Bassam et al., 1991).
Análise Semi-Quantitativa do RT-PCR
A análise semi-quantitativa do RT-PCR foi realizada com o objetivo de
comparar a expressão do RNAm do CYP2A3 nas diferentes amostras estudadas. Para
isso, a quantidade de cDNA aplicada no gel foi normalizada através da análise
densitométrica (Software LabImage), do gel de poliacrilamida referente ao RT-PCR do
gene GAPDH. Posteriormente foi realizada a densitometria do produto amplificado do
cDNA do CYP2A3 possibilitando a comparação da expressão de RNAm entre as
amostras. É importante ressaltar que para o gene analisado (CYP2A3) foram
realizadas padronizações (curva de concentração de cDNA e curva de ciclos). A
padronização foi realizada para que a amplificação do gene de interesse ocorresse na
faixa de linearidade, possibilitando uma comparação entre as diferentes amostras.
As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o programa GraphPad Prism
(GraphPad Software Inc., CA, USA)
.
12- OBTENÇÃO DA FRAÇÃO MICROSSOMAL DE EPITÉLIO ESOFÁGICO
As frações microssomais foram preparadas a partir de epitélio esofágico de 30
ratos (pool) de um mesmo grupo por ultracentrifugação diferencial, segundo o
protocolo de Ribeiro-Pinto et al. (2001). Todas as etapas foram realizadas a 4
o
C
(Figura 7).
Para a preparação dos microssomos, as mucosas esofágicas foram cortadas
em pequenos pedaços e homogeneizadas em 10 volumes de tampão Tris 50 mM / KCl
1.15%, pH 7.4, com 30 passagens (cada passagem correspondendo a ciclos de
subida ou descida com duração de 30 segundos, com um intervalo de 20 segundos
entre elas, para evitar o aquecimento), utilizando-se um potter e um homogeneizador
de vidro, a 1000 rpm. O homogeneizado foi transferido para tubos de centrifugação em
volumes aproximados de 3 mL / tubo, equilibrados e centrifugados a 9.000 X g por 20
minutos em ultracentrífuga Hitachi. O sobrenadante foi salvo, mantido em banho de
gelo e o precipitado foi ressuspenso em 3 volumes de tampão Tris 50 mM / KCl 1.15%,
pH 7.4, utilizando-se um homogeneizador de teflon, com 5 passagens e, então, a
suspensão foi centrifugada a 9000 X g por 20 min. O sobrenadante proveniente da
segunda centrifugação foi adicionado ao primeiro sobrenadante e posteriormente
centrifugados a 105.000 X g por 60 minutos. O sobrenadante foi descartado e a fração
microssomal ressuspendida em 1 volume de tampão Tris 50 mM / glicerol a 20%, pH
7.4. Foi utilizado um homogeneizador de teflon manual para formação de uma
suspensão uniforme. Os microssomos foram divididos em alíquotas de 50 L / tubo,
sendo imediatamente estocados no freezer – 70
o
C.
Figura 8 : Ultracentrifugação diferencial para obtenção de microssomos de esôfago.
13- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
A concentração de proteínas foi determinada segundo o método de Lowry et
al. (1951). A um tubo de ensaio, foram adicionados 10 L de suspensão microssomal
e o volume foi completado para 200 L com H
2
O destilada. Foi adicionado 500 L de
sulfato de cobre a 1% (p/v) + 500 L
tartarato de sódio e potássio a 2% (p/v)
adicionados em 50 mL de solução de carbonato de sódio a 2% (p/v) diluído em 0.1 N
NaOH, sob agitação em vórtex. Os tubos foram então incubados à temperatura
ambiente (~30 ºC) por 20 minutos. Adicionou-se 0.1 mL de reativo de Folin-Ciocalteau,
misturando-se bem. Após 45 minutos de incubação à temperatura ambiente, a
SOBRENADANTE
9000 X g / 20 minutos
PRECIPITADO
PRECIPITADO SOBRENADANTE
FRAÇÃO SOLÚVEL
MICROSSOMO
105.000 X g / 60 minutos
HOMOGENEIZADO
9000 X g / 20 minutos
absorbância da solução foi lida em espectrofotômetro a 700 nm. A curva padrão foi
feita substituindo-se a solução microssomal por albumina de soro bovino (BSA) em
concentrações crescentes de 20, 40 e 80 μg de proteína. Todos os ensaios foram
realizados em
triplicata.
14 - WESTERN BLOTTING
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
A eletroforese foi baseada no método original de Laemmli (1970) e
modificado por Phillips et al. (1981). As proteínas microssomais foram separadas em
um gel de poliacrilamida a 8% (v/v) preparado a partir de uma solução estoque de
acrilamida/ bis-acrilamida a 30% (29:1). Foi utilizado um volume de 8.2 mL da solução
estoque de acrilamida/ bis-acrilamida, 7.5 mL de tampão Tris 1.5 M pH 8.8, 0.4 mL de
persulfato de amônio (APS) a 10% (p/v), 46 μL de TEMED e 15 mL de água destilada.
Esta solução foi vertida entre placas de vidro e imediatamente recoberta por 1 mL de
SDS a 0.1% (p/v). Após a polimerização, retirou-se o SDS e adicionou-se a solução do
gel de empacotamento de poliacrilamida a 3%, preparada com 3 mL de acrilamida a
30% (29:1), 7.5 mL de Tris 0.5 M SDS a 0.4% pH 6.8, 60 μL de TEMED, 0.4 mL de
APS a 10 % e 18 mL de água destilada.
As amostras microssomais foram preparadas numa proporção de 4 volumes
de amostra para 1 volume de tampão de amostra (azul de bromofenol a 4% (p/v), SDS
a 40% (p/v), glicerol a 40% (v/v) e Tris-HCl 2 mM pH 6.8), de maneira que a
quantidade de proteína fosse de 50 μg de fração microssomal esofágica para o CYP
analisado. Adicionou-se 1 μL de mercaptoetanol às amostras, que foram aquecidas
por cinco minutos à 95º C, seguindo-se a adição de mais 2
μL de β-mercaptoetanol e
centrifugação a 1000 X g durante 1 minuto. A eletroforese foi realizada após a
aplicação das amostras, com uma corrente de 15 mA até a saída do corante. O
tampão de corrida consiste em Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS a 0.1%, pH 8.3.
Transferência para a Membrana de Nitrocelulose
A transferência foi realizada por 14 horas, com tampão de transferência (Tris 25
mM, glicina 192 mM e metanol a 20% v/v) a 25 mA. Após este tempo a transferência
continuou por mais uma hora a 100 mA.
Revelação da Membrana de Nitrocelulose
A revelação da membrana seguiu os procedimentos recomendados pelo manual
do Kit de revelação do substrato conjugado a fosfatase alcalina (Bio-Rad
,
CA, USA)
utilizando-se o anticorpo primário contra o CYP2A5, na proporção de 1:500 (Lang,
1989). O anticorpo secundário (Anti-rabbit IgG, Sigma, MO, USA), conjugado a
fosfatase alcalina, foi diluído na proporção de 1:10.000.
Os procedimentos são descritos com detalhes a seguir:
As membranas foram retiradas, cortando-se o padrão de peso molecular e corada
com Amido Black a 0.05% (p/v) em uma solução de ácido acético a 10% (v/v) e
isopropanol a 25% (v/v), sendo posteriormente descorado em uma solução de ácido
acético a 10% (v/v) e isopropanol a 25% (v/v), protegido da luz. O restante da
membrana foi lavado em tampão TBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7.5) por 5
minutos. As membranas foram então incubadas com a solução bloqueadora (gelatina
a 3% p/v diluída em TBS) por 1 hora e 30 minutos, sob agitação constante, sendo
posteriormente lavadas com TTBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, Tween-20 a 0.05% v/v
pH 7.5), 2 vezes por 10 minutos. As membranas foram incubadas com o anticorpo
primário durante 3 horas, e depois foram lavadas com TTBS 2 vezes por 10 minutos.
Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário (2.5 μL do
anticorpo secundário em 25 mL de solução de 1% de gelatina (p/v) em TTBS), durante
2 horas e depois foram lavadas com TTBS 2 vezes por 10 minutos e 1 vez por 5
minutos. As membranas foram então incubadas com a solução reveladora : Kit AP –
tampão de revelação = (1 mL do tampão 25X +
24 mL de água) + (250 μL AP
Reagente A + 250 μL AP Reagente B) até o aparecimento das bandas. A revelação foi
paralisada colocando a membrana em água destilada por 10 minutos, trocando pelo
menos uma vez.
Análise Semi-Quantitativa do Western Blotting
Para comparar a expressão das proteínas do CYP2A3 de maneira semi-
quantitativa foi realizada uma análise densitométrica (Softaware LabImage) de modo a
relacionar a intensidade das bandas com a proporção de proteína presente em cada
amostra estudada (pool). As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o programa
GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA, USA).
15- ENSAIOS ENZIMÁTICOS
Dosagem da atividade de 7-hidroxilação da cumarina (COH)
A atividade de 7-hidroxilação da cumarina (COH) foi determinada segundo
Aitio (1978), com algumas modificações. A reação foi feita em tubos de centrífuga (de
vidro) e continha tampão Tris-HCl 50 mM pH 7.4; MgCl
2
10 mM; NADPH 0.2 mM,
cumarina 100 M diluída em metanol e adicionada sempre num volume de 5 L (este
volume foi previamente testado, não interferindo na atividade enzimática). O volume
total de incubação foi de 0.5 mL, ajustado com água destilada.
Os tubos foram pré-incubados por três minutos em banho-maria a 37º C. A
reação foi iniciada pela adição de NADPH 0.2 mM em intervalos de 15 segundos, para
cada tubo. Após a incubação, a reação foi paralisada com 0.5 mL de ácido
tricloroacético (TCA) 0.31 M. Os tubos foram centrifugados por 15 minutos a 1000 X g.
Foi então adicionado 0.5 mL do sobrenadante a 2 mL de tampão glicina-NaOH 1.6 M
pH 10.3, imediatamente antes da leitura da fluorescência das amostras.
Em pH alcalino (entre 10 e 11) a umbeliferona emite fluorescência máxima
com excitação a 390 nm e emissão a 440 nm. A leitura fluorimétrica foi feita em cubeta
de quartzo, utilizando-se espectrofluorímetro Hitachi F-3010 com o feixe de luz a 5
nm.
A curva-padrão foi feita utilizando-se diferentes quantidades de umbeliferona (5, 10, 20
pmol) preparada na hora, a partir de uma solução estoque de 1 M em etanol. Aos
padrões não foi adicionado o NADPH. O branco continha todos os componentes, com
exceção do produto e do NADPH. As condições ótimas de dosagem de COH com
microssomos de esôfago foram testadas e as condições utilizadas foram: 0.1 mg de
proteína microssomal de epitélio de esôfago de ratos, 100 μM de cumarina e 15
minutos de incubação a 37ºC.
Dosagem da atividade de desetilação da N-nitrosodietilamina
(NDEAd)
A atividade de desetilação da N-Nitrosodietilamina (NDEA) foi determinada
segundo o método original descrito por Farrely (1980), com algumas adaptações
(Ribeiro-Pinto et al., 2001).
A reação foi feita em tubos de microcentrífuga de 0.5 mL contendo tampão
Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl
2
10 mM, KCl 150 mM, 25 μg proteína microssomal,
NDEA 100 μM e NADPH 6 mM, ajustando-se o volume com água destilada. O volume
total de reação foi de 0.1 mL. O tempo ótimo de incubação foi testado e a condição
utilizada foi 15 minutos.
Os tubos foram incubados por três minutos em banho-maria a 37 ºC e a reação
começou adicionando-se NADPH 6 mM em intervalos de quinze segundos para cada
ensaio. A reação foi paralisada com 20 μL de ZnSO
4
a 25 % (p/v) e 20 μL de Ba(OH)
2
saturado e os tubos foram centrifugados por quinze minutos a 10.000 X g . Retirou-se
70 μL do sobrenadante, colocando-o num outro tubo com 20 μL de 2,4-
dinitrofenilhidrazina a 0.25% em HCl 6 N, em banho de gelo. A seguir foi adicionado
300 μL de hexano e 200 μL de água, previamente saturados. Agitou-se em vórtex por
dois minutos. Foi retirado 200 μL da camada superior (hexano) que foi colocada em
outro tubo contendo 70 μL de acetonitrila previamente saturada com hexano. Agitou-
se em vórtex por trinta segundos, e 50 μL da camada de acetonitrila (inferior) foram
analisadas por HPLC, utilizando-se a coluna de fase reversa Novapak C
18
5 μM (4,6 x
250 mm), com eluição isocrática com uma solução de acetonitrila 65 % e fluxo de 1.1
mL / minuto. A eluição foi monitorada por absorvância a 340 nm, contra os brancos, os
quais, não continham NADPH 6 mM nem acetaldeído. Para a curva-padrão, foi
utilizado diferentes concentrções de acetaldeído (0.25; 0.5; 1.0 nmol).
As áreas dos picos da 2,4-dinitrofenilhidrazona em cada ensaio foram
calculadas usando-se o programa Star Chromatography Workstation (Palo Alto, CA,
USA) e foram comparadas com as áreas obtidas nos padrões.
As análises estatísticas das atividades enzimáticas foram feitas utilizando-se o
programa GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA, USA).
Dosagem da atividade de desetilação da etoxicumarina (ECOD)
A atividade de O-desetilação da 7-etoxicumarina (ECOD) foi determinada
utilizando-se o método descrito acima para COH (Aitio, 1978), com uma modificação.
Utilizou-se 300 M de etoxicumarina diluída em DMSO que foi adicionada à reação em
um volume de 5 L.
16 -TESTE DE MUTAÇÃO REVERSA COM Salmonella typhimurium
(TESTE DE AMES)
Linhagens bacterianas
As linhagens de Salmonella typhimurium utilizadas foram fornecidas pelo Dr. B. N.
Ames, Universidade da California, Berkeley, CA (USA) e Dr. Takehiko Nohmi,
National Institute of Hygienic Sciences, Division of Genetics and Mutagenesis, Toquio
(Japão). As linhagens de Escherichia coli utilizadas no SOS cromosteste também
foram fornecidas pelo Dr. B. N. Ames, Universidade da California, Berkeley, CA (USA).
As características genéticas relevantes de cada linhagem estão listadas no quadro 3.
Designação Genótipo Características
S. typhimurium
TA97
a
hisD6610 hisO1242 rfa ΔuvrB chl
bio R
+
Detecta mutação do tipo
frameshift, por adição de bases
Quadro 4: Relação das linhagens utilizadas nos testes de mutagenicidade e
antimutagencidade e suas respectivas características genotípicas.
a
Maron & Ames et al.,
1983;
b
Yamada et al., 1997;
c
Aiub et al., 2006;
d
Quillardet, 1985
S. typhimurium
TA98
a
hisC207 hisD3052 rfa ΔuvrB chl bio
R
+
Detecta mutação do tipo
frameshift, por adição ou
deleção de bases
S. typhimurium
TA100
a
hisC207 hisG46 rfa ΔuvrB chl bio R
+
Detecta mutação pontual de
G-C para T-A
S. typhimurium
TA102
a
hisC207 hisG46 rfa UVR R
+
Tc
r
Detecta mutação pontual de
T-A para G-C
S. typhimurium
TA1535
b
hisG46 gal
U
(chl, uvrB, bio) rfa
Selvagem para YG7104
YG7108. Possui atividade de
ada e ogt (metiltransferases)
S. typhimurium
YG7104
b
TA1535
U
ogtST Cm
r
Não transcreve ogt
S. typhimurium
YG7108
b
TA1535
U
ogtST
U
adaST Cm
r
Km
r
Não transcreve ogt e ada
S. typhimurium
YG1021
c
TA98 (pYG216) Apr Tc
r
Superexpressa nitroredutase
S. typhimurium
YG1024
c
TA98 (pYG219) Ap
r
Tc
r
OAT Superexpressa acetiltransferase
S. typhimurium
YG1041
c
TA98 (pKG216) Ap
r
Superexpressa acetiltransferase
e nitroredutase
S. typhimurium
TA98NR
c
TA98 (pKM101) Cn
r
Não transcreve nitroredutase
S. typhimurium
TA98DNP-6
c
TA98 (pKM101) Ap
r
Não transcreve acetiltransferase
E. coli PQ35
d
sfiA::Mud(Ap lac) cts, lacDU169,
mal1, galE, galY, PhoC, rfa, F_,
thr, leu, his, pyrD, thi, trp::MUC1,
srl300::Tn10, rpoB, uvrA1
Sistema de reparo por excisão
de nucleotídeos funcionante
(Selvagem para PQ37)
E. coli PQ37
d
PQ35 uvrA-
Sistema de reparo por excisão
de nucleotídeos, uvrA não
funcionante
Presença de metabolização
A fração S9 utilizada foi adquirida do laboratório Molecular Toxicology Inc.
(Moltox
TM
, USA) e preparada a partir de fígados de ratos machos Sprague-Dawley pré-
induzidos por bifenil-policlorinato (Aroclor 1254).
A preparação da solução de S9 mix (4%), foi realizada de acordo com Maron &
Ames (1983) em condições de esterilidade total e em banho de gelo. Para 50 mL de
S9 mix (10%) utilizou-se 5.0 mL de S9 reconstituído com 2.1 mL de água estéril (40
mg/mL de proteínas totais), 1.0 mL de sais MgCl
2
-KCl, 0.25 mL de glicose-6-fosfato
1M, 2.0 mL de NADP 0.1M, 25.0 mL de tampão fosfato-sódio 0.2 M pH7.4, e 16.75 mL
de água destilada estéril.
Controle de Linhagens
A confirmação do genótipo das cepas foi baseada na verificação da mutação rfa;
uvrB; pKM101, pAQ1, dependência a histidina e determinação da taxa de reversão
espontânea (Maron & Ames, 1983).
Teste quantitativo de Mutagenicidade
A mutagenicidade foi determinada segundo Maron & Ames (1983) com as
linhagens de S. typhimurium listadas no quadro 3 . As cepas TA97, TA98, TA100 e
TA102 após 16 h de crescimento em meio Louria Bertani (10 g/L bacto triptona, 5 g/L
extrato de levedura, 10 g/L NaCl) , foram pré-incubadas com diferentes concentrações
(0.1% p/v, 1% p/v e 10% p/v) de IIp na presença e na ausência de S9 mix. As cepas
TA1535, YG7104, YG7108, YG1021, YG1024, YG1041 e TA98DNP-6 foram pré-
incubadas com IIp a 10% (p/v) na presença e na ausência de S9 mix (4%).
É importante ressaltar que a IIp, após o preparo anteriormente descrito, foi filtrada
em filtro millex 0.22 m para a realização dos testes bacterianos. O controle negativo
utilizado para todos os experimentos foi NaCl 0.9%. Os controles positivos utilizados
para cada linhagem estão relacionados no quadro 4.
Os experimentos foram realizados em tubos de ensaio contendo 100 μL de IIp, 500
μL de S9 mix (para ensaios na presença de metabolização) ou 500 μL de tampão
sódio-fosfato 0.2 M pH 7.4 (para ensaios na ausência de metabolização), e 100 μL de
suspensão bacteriana (2 x 10
9
células / mL). As suspensões foram pré-incubadas por
40 minutos sob agitação constante (131 OPM - Orbitações por minuto) a 37ºC. Em
seguida foram adicionados 2 mL de top ágar (0.6% ágar, 0.5% NaCl, 50 μM L-
histidina, 50 μM de biotina, pH 7.4, 45ºC). Esta solução foi vertida em placa de petri
contendo meio mínimo (1.5% ágar, meio Vogel-Bonner 10X contendo 2% de glicose).
As placas foram incubadas a 37ºC por 72 horas e as colônias revertentes His+ foram
contadas. Os resultados foram expressos através do índice de mutagenicidade (I.M. =
número de revertentes His+ / número de revertentes espontâneos His+ do controle
negativo). A mutagenicidade da IIp foi considerada positiva quando o I.M. apresentou
valor superior a 2 e/ou p < 0.05 na análise de variância (ANOVA). Esta avaliação
seguiu o critério estabelecido por Vargas et al. (1993, 1995).
Quadro 5 : Relação das drogas usadas como controle positvo
nos ensaios.
a
Sem S9 mix;
b
Com S9 mix
Drogas / Concentração Linhagens bacterianas
utilizada Sensíveis
2-Aminofluoreno
2 mg /mL
TA98
Azida sódica
0.1 mg / mL
TA1535, TA100, PQ35
a
,
PQ37
4-Nitroquinolina N-óxido
1 mg / mL
TA97, PQ35
b
Mitomicina C
50 μg / mL
TA102
1-metil 3-nitroso-1-
nitrosoguanidina
0.2 mM
YG7104, YG7108,
YG1021, YG1024
Teste quantitativo de Antimutagenicidade
A antimutagenicidade foi determinada utilizando-se o método descrito acima para
mutagenicidade (Maron & Ames, 1983), com algumas modificações. As cepas
utilizadas para os ensaios foram: TA97, TA98, TA100 e TA102 de Salmonella
typhimurium
As linhagens foram testadas em três grupos experimentais: (CH+) as suspensões
foram pré-incubadas por 40 minutos com uma solução contendo o controle positivo e a
IIp, ao mesmo tempo; (CH,+) as suspensões foram pré-incubadas por 20 minutos
somente com a IIp e posteriormente por 20 minutos com o controle positivo e (+,CH)
as suspensões foram pré-incubadas por 20 minutos somente com o controle positivo e
posteriormente por 20 minutos com a IIp.
Foi utilizado 100 μL de IIp em três diferentes concentrações (0.1% p/v, 1% p/v e
10% p/v), 500 μL de S9 mix ou 500 μL de tampão sódio-fosfato 0.2 M pH 7.4, 100 μL
de suspensão bacteriana (2 x 10
9
células / mL) e 100 μL de droga sabidamente
mutagênica específica para cada linhagem. Todos os controle tiveram seus volumes
finais ajustados em 800 L. A atividade antimutagência foi medida pelo número de
revertantes comparado com a reversão das linhagens quando tratadas com o controle
positivo.
Teste de sobrevivência celular
A citotoxicidade foi determinada nos ensaios de mutagenicidade e
antimutagenicidade segundo Maron & Ames (1983). Após a pré-incubação de 40
minutos com ou sem S9 mix, como descrito anteriormente,10 μL da suspensão foi
diluída duas vezes em NaCl 0.9% para obtenção de uma suspensão contendo 2 x 10
3
células / mL. Uma alíquota de 100 μL desta suspensão foi plaqueada em meio meio
Louria Bertani sólido (10 g/L bacto triptona, 5 g/L bacto yeast extract, 10 g/L NaCl, 15
g/L top ágar). As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e as colônias foram
contadas.Todos os experimentos foram realizados em triplicata. A citotoxicidade foi
considerada positiva quando p < 0.05 na análise de variância (ANOVA) e quando a
sobrevivência celular foi menor que 70% em relação ao controle negativo (Aiub et al.,
2006).
17- SOS CROMOTESTE
A genotoxicidade foi determinada segundo Quillardet et al. (1985) utilizando-se as
linhagens PQ35 e PQ37 de E. coli. Sob certas concentrações da substância teste,
pode haver inibição de síntese protéica levando a uma subestimação de indução de β-
galactosidase, resultando num falso positivo. Para isto ser evitado, a atividade de
fosfatase alcalina também foi avaliada (Quillardet et al.,1985). Todos os experimentos
foram realizados em triplicata.
Em tubos de ensaio colocou-se 500 μL de tampão sódio-fosfato 0.2 M ou 500 μL
de S9 mix, 100 μL de cepa (10
8
células / mL), 100 μL de IIp, ou controle positivo. As
suspensões foram pré-incubadas por 40 minutos sob agitação constante a 37ºC. Em
seguida foi centrifugado a 3000 x g e as células foram ressuspendidas em NaCl 0.9%
no mesmo volume (700 μL). Desta suspensão retirou-se 200 μL para uma bateria de
tubos (destinados a verificação de atividade de β-galactosidase) e 200 μL para outra
bateria de tubos (destinados a verificação da atividade de fosfatase alcalina).
Determinação da atividade de β galactosidase
Foi acrescentado 1.6 mL de tampão B (3% Na
2HPO4 .7H2O; 0.55% NaH2PO4. H2O;
0.075% KCl; 0.1% SDS; 0.025% MgSO
4 .7H2O; 0.27% de β-mercaptoetanol) e
incubou-se a 37ºC por 10 minutos. Em seguida foi adicionado 0.35 mL da solução de
ONPG (4 mg/mL de β-D-galactopiranosídeo em tampão sódio-fosfato 0.2 M, pH 7.4) e
incubou-se a suspensão por 90 minutos a 37ºC. A reação foi parada com a adição de
1.2 mL de Na
2CO3 1 M. A leitura foi realizada no espectrofotômetro a 420 nm .
Determinação da atividade de fosfatase alcalina
Foi acrescentado 1.6 mL de tampão P (12.1% Tris, 0.1% SDS; pH 8.8) e incubou-
se a 37ºC por 10 minutos. Em seguida foi adicionado 0.35 mL da solução de PNPP (4
mg / mL de p-nitrofenil fosfato dissódico em tampão P) e incubou-se a suspensão por
90 minutos a 37ºC. A reação foi parada com a adição de 0.6 mL de Tris 2 M e, após 5
minutos, foi adiciondo 0.6 mL de HCl 2.5 M . A leitura foi realizada no
espectrofotômetro a 420 nm.
A indução de LacZ é calculada com base na divisão do valor de -
galactosidase (-gal) pelo valor de fosfatase alcalina (F.A.). Ambos os valores sendo
dados em unidades Miller (Abs% x 1000/ tempo de incubação com o substrato, em
minutos). O fator de indução (F.I.) superior a 1.5 é considerado uma resposta positiva
no SOS cromoteste, enquanto que o decréscimo nos valores de fosfatase alcalina de
70% em relação ao controle negativo está relacionado a uma resposta citotóxica do
composto estudado (Quillardet et al., 1985).
IV- Resultados
1- MODULAÇÃO DO CYP2A3 EM ESÔFAGO DE RATOS TRATADOS
COM INFUSÃO DE Ilex paraguariensis
1.1- Análise do efeito da infusão de Ilex paraguariensis (IIp) na
expressão do RNAm da enzima CYP2A3 em esôfago de ratos.
Para investigar a influência da IIp 10% sobre a expressão do RNAm da enzima
CYP2A3 no esôfago de ratos tratados por 2, 4, 7, 14 e 21 dias, foi utilizada a técnica
de RT-PCR. O desenvolvimento dessa técnica possibilitou a análise da expressão de
genes, permitindo amplificar regiões específicas do RNAm com pequenas quantidades
de tecido. Foi realizado, também, uma análise semi-quantitativa para compararmos as
diferenças na expressão do RNAm entre os animais tratados e os animais controle.
A figura 8 apresenta a padronização para detecção do produto amplificado de
220 pb correspondente à amplificação do GAPDH, o “housekeeping gene”, nas
amostras dos grupos controle e 2, 4, 7, 14, e 21 dias. A análise densitométrica
referente aos produtos gênicos encontra-se na tabela 2. A quantidade cDNA utilizada
para cada amostra permite a amplificação do RNAm do GAPDH em quantidades
semelhantes entre as amostras. Os valores obtidos através da análise densitométrica
deste gene foram utilizados para normalizar os valores observados na expressão da
enzima CYP2A3, com o objetivo de eliminar possíveis falhas referentes à quantidade
de cDNA utilizada.
1 2 3 4 5 6 7
220 pb
250 pb
300 pb
Figura 8: Figura representativa da análise por RT-PCR da expressão do RNAm do GAPDH
(produto de amplificação com 220 pb) no tecido esofágico de ratos controle (raia 2) e tratados
com IIp 10%, por diferentes períodos de tratamento: 2 dias (raia 3), 4 dias (raia 4), 7 dias (raia
5), 14 dias (raia 6) e 21 dias (raia 7), em gel de poliacrilamida 6%. Raia 1: marcador de peso
molecular de 50 pb (DNA de plasmídeo pEJ3 digerido com Eco1471I e PvuI).
Raia 2:
1 L de cDNA utilizado
Raia 5:
1 L de cDNA utilizado
Raia 3:
2 L de cDNA utilizado
Raia 6:
2 L de cDNA utilizado
Raia 4:
1 L de cDNA utilizado
Raia 7:
1 L de cDNA utilizado
Tabela 2: Valores referentes à análise densitométrica dos produtos de amplificação do GAPDH
no esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10%, por diferentes períodos de tratamento.
Animais Unidades de densitometria
Controle 1.00
Tratados 2 dias 0.98
Tratados 4 dias 1.02
Tratados 7 dias 0.99
Tratados 14 dias 1.02
Tratados 21 dias 1.01
A figura 9 apresenta a expressão do RNAm do CYP2A3 (produto com 398 pb)
no esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10%, onde podemos observar que não
houve alteração significativa da expressão gênica nos ratos tratados em relação ao
grupo controle. Através da análise densitométrica (figura10 e tabela 3), podemos
200 pb
observar que a IIp 10% não interferiu na expressão do CYP2A3 nos animais tratados
em relação aos animais controle.
1 2 3 4 5 6 7
Figura 9: Figura representativa da análise por RT-PCR da expressão do RNAm do CYP2A3
(produto de amplificação com 398 pb) no esôfago de ratos controle (raia 2) e tratados com
IIp10%, por diferentes períodos de tratamento: 2 dias (raia 3), 4 dias (raia 4), 7 dias (raia 5), 14
dias (raia 6) e 21 dias (raia 7), em gel de poliacrilamida 6%. Raia 1: marcador de peso
molecular de 50 pb (DNA de plasmídeo pEJ3 digerido com Eco1471I e PvuI).
Controle 2 dias 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Período de Tratamento com IIp
Unidades de GAPDH
500 pb
400 pb
300 pb
398 pb
Animais Unidades de GAPDH
Controle 1.00
Tratados 2 dias 0.94 ± 0.04
Tratados 4 dias 0.97 ± 0.03
Tratados 7 dias 1.01 ± 0.06
Tratados 14 dias 1.00 ± 0.06
Tratados 21 dias 1.02 ± 0.02
Figura 10 e Tabela 3: Valores de média e desvio padrão da expressão do RNAm do CYP2A3
em ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias. Valores são expressos em
unidades de densitometria de GAPDH, como média e desvio padrão de triplicatas, relativos aos
valores obtidos na amostra controle (1.00).
1.2 - Análise do efeito da infusão de Ilex paraguariensis (IIp) na
expressão da apoproteina CYP2A3 em esôfago de ratos.
A expressão da apoproteína CYP2A3 foi analisada através da técnica de
Western blotting utilizando o anticorpo anti-CYP2A5. A figura 11 mostra a análise da
apoproteína CYP2A3 (49.5 kDa) em microssomos de esôfago de ratos controle e
tratados com IIp 1
4 3 2 1
49.5 kDa
66 kDa
45 kDa
8 7 6 5
49.5 kDa
66 kDa
45 kDa
Figura 11: Análise por Western blotting da expressão da apoproteína CYP2A3 no esôfago de
ratos controle (raia 2) e tratados com IIp 10% por diferentes períodos de tratamento: 2 dias
(raia 3), 4 dias (raia 4), 7 dias (raia 6), 14 dias (raia 7) e 21 dias (raia 8). Raias 1 e 5: Marcador
de peso molecular, albumina sérica bovina (66 kDa) e ovoalbumina (45 kDa).
Não foi detectada diferença na expressão desta proteína entre os animais
controle e tratados, ou seja, a IIp 10% não interferiu na tradução do CYP2A3 quando
utilizamos a análise semi-quantitativa (figura12 e tabela 4).
Controle 2 dias 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias
0.0
0.5
1.0
Período de Tratamento com IIp
Unidades de densitometria
Animais Unidades de densitometria
Controle 1.00
Tratados 2 dias 0.92 ± 0.07
Tratados 4 dias 0.89 ± 0.12
Tratados 7 dias 0.80 ± 0.26
Tratados 14 dias 0.85 ± 0.15
Tratados 21 dias 0.85 ± 0.20
Figura 12 e Tabela 4: Valores de média e desvio padrão da expressão da apoproteína
CYP2A3 em ratos controle e tratados com IIp 10% por 2, 4, 7, 14 e 21 dias. Valores são
expressos em unidades de densitometria, como média e desvio padrão de triplicatas, relativos
aos valores obtidos na amostra controle (1.00).
1.3 - Caracterização do efeito da infusão de Ilex paraguariensis (IIp)
na atividade associada à proteína CYP2A3.
1.3.1 – Atividade de Hidroxilação da Cumarina (CHO)
A atividade de hidroxilação da cumarina (COH) é realizada unicamente por
membros da subfamília CYP2A, sendo catalisada pelo CYP2A3 em esôfago de ratos.
Por este motivo, verificamos esta atividade em ratos tratados com a IIp 10% em
relação aos animais controle. A umbeliferona produzida é um composto fluorescente
possibilitando sua dosagem através de análise espectrofluorimétrica por método
descrito por Burke et al. (1985).
O efeito da IIp sobre a atividade COH em microssomos esofágicos de ratos
controle e tratados por diferentes dias estão apresentados na figura 13 e tabela 5. As
atividades nos ratos tratados e controle não apresentaram diferenças significativas
entre si (p > 0.05).
0
1
2
3
Controle 2 dias 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias
Período de tratamento com IIp
pmol umb/min/mg ptn
Tabela 5: Atividade de Hidroxilação da cumarina (COH) em microssomos de esôfago de ratos
controle (C) e tratados com IIp 10% por diferentes períodos de tratamento (2, 4, 7, 14 e 21
dias). Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas, em pmol de
umbeliferona / min / mg proteína.
Animais Atividade
(pmol de umbeliferona / min / mg de proteína)
Controle 2.22 ± 0.03
Tratados 2 dias 2.10 ± 0.10
Tratados 4 dias 2.10 ± 0.10
Tratados 7 dias 2.25 ± 0.35
Tratados 14 dias 2.00 ± 0.14
Tratados 21 dias 2.03 ± 0.15
1.3.2 – Atividade de Desetilação da N-Nitrosodietilamina (NDEAd)
Após dosarmos a atividade específica para a subfamília CYP2A decidimos
verificar a atividade de desetilação da NDEA em microssomos de epitélio esofágico de
ratos controles e tratados com IIp 10%. A NDEA é um pré-cancerígeno que requer
ativação metabólica catalisada por CYPs (inclusive da subfamília 2A) para exercer
seus efeitos tóxicos.
A figura 14 e tabela 6 apresentam o efeito da IIp 10% nos grupos avaliados.
Não houve diferença significativa (p > 0.05) entre a atividade verificada nos animais
controle e tratados, corroborando com o resultado encontrado na atividade de
hidroxilação da cumarina (COH).
Figura 13: Atividade de Hidroxilação da cumarina (COH) em microssomos de esôfago de ratos
controle e tratados com IIp 10% por diferentes períodos de tratamento (2, 4, 7, 14 e 21 dias), em
relação a atividade do grupo controle. Valores são expressos como média e desvio padrão de
triplicatas.
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Controle 2 dias 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias
Período de tratamento com IIp
nmol acetal./min/mg ptn micross.
Figura 14: Atividade de destilação da N-nitrosodietilamina (NDEAd) em microssomos
de esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10% por diferentes períodos de
tratamento (2, 4, 7, 14 e 21 dias), em relação a atividade do grupo controle. Valores são
expressos como média e desvio padrão de triplicatas.
Tabela 6: Atividade de destilação da N-nitrosodietilamina (NDEAd) em microssomos de
esôfago de ratos controle e tratados com IIp 10% por diferentes períodos de tratamento (2, 4,
7, 14 e 21 dias), em relação a atividade do grupo controle. Valores são expressos como média
e desvio padrão de triplicatas. , em nmol de acetaldeído / min / mg proteína.
Animais Atividade
(nmol de acetaldeído / min / mg de proteína)
Controle 0.97 ± 0.29
Tratados 2 dias 0.94 ± 0.15
Tratados 4 dias 0.95 ± 0.24
Tratados 7 dias 0.95 ± 0.27
Tratados 14 dias 1.03 ± 0.06
Tratados 21 dias 0.93 ± 0.31
1.3.3 – Atividade de Desetilação da Etoxicumarina (ECOD)
A atividade de desetilação da 7-etoxicumarina (ECOD) gera o produto
fluorescente 7-hidroxicumarina (ou umbeliferona) que é um indicador da atividade de
CYPs, apesar de não ser específica para CYP2A (Greenlee & Poland, 1978).
Decidimos dosar a atividade ECOD para nos certificarmos de que as proteínas
microssomais estavam íntegras e, portanto, validar os resultados obtidos nas
atividades mencionadas anteriormente.
A figura 15 e tabela 7 apresentam o resultado da atividade ECOD catalisada
pelos microssomos dos animais analisados. A atividade ECOD foi detectada em
microssomos de tecido esofágico de ratos e, através da análise estatística não
observamos diferença significativa entre os grupos controle e tratados (2, 4, 7, 14 e 21
dias).
0
5
10
15
Período de tratamento com IIp
Controle 2 dias 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias
pmol umb/min/mg ptn
Figura 15: Atividade de O-desetilação da etoxicumarina (ECOD) em microssomos de
esôfago de ratos controle e tratados com IIp por diferentes períodos de tratamento (2,
4, 7, 14 e 21 dias), em relação a atividade de ratos controle. Valores são expressos como
média e desvio padrão de triplicatas.
Tabela 7: Atividade de O-desetilação da etoxicumarina (ECOD) em microssomos de
esôfago de ratos controle (C) e tratados com IIp por diferentes períodos de tratamento (2, 4, 7,
14 e 21 dias). Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas, em pmol de
umbeliferona / min / mg proteína.
Animais Atividade
(pmol de umbeliferona / min / mg de proteína)
Controle 10.48 ± 4.13
Tratados 2 dias 13.45 ± 0.21
Tratados 4 dias 11.30 ± 2.14
Tratados 7 dias 12.43 ± 0.51
Tratados 14 dias 11.13 ± 0.81
Tratados 21 dias 8.43 ± 1.25
2- AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DA INFUSÃO DE Ilex
paraguariensis
2.1- Screening quantitativo da mutagenicidade com linhagens
standards através do Teste de Mutação Reversa com
Salmonella thyphimurium
Com o objetivo de verificar a mutagenicidade da IIp, foram realizados
experimentos quantitativos, utilizando diferentes cepas de Salmonella thyphimurium
auxotróficas para histidina. As cepas standards indicadas para o screening inicial em
um trabalho investigativo são denominadas TA97, que detecta mutação por adição ou
deleção no locus hisD6610 e hisO1242, TA98 que detecta mutação por adição no
locus hisD3052, TA100 que detecta mutação pontual de G-C para T-A no locus hisG46
e TA102 que detecta mutação pontual de T-A para G-C.
Para analisar o efeito da IIp foram utilizadas três concentrações: 0.1%, 1% e 10%.
O efeito da IIp nas diferentes concentrações sobre as linhagens TA97, TA98, TA100 e
TA102 está apresentado nas tabelas 8, 9, 10, 11, respectivamente. Através da análise
do índice de mutagenicidade (IM) nas quatro linhagens tratadas com a IIp, podemos
observar que não houve efeito mutagênico nas concentrações estudadas (0.1%, 1%,
10%), tanto na ausência quanto na presença de ativação enzimática (S9 mix), uma
vez que seu valores são menores que 2 (I.M. < 2). Em paralelo, no ensaio de
sobrevivência celular, também não observamos resposta citotóxica (sobrevivência ≥
70%) independentemente de ativação metabólica nas diferentes concentrações de IIp.
Tabela 8: Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1%, e 10%,
utilizando a linhagem TA97.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : 4-Nitroquinolina 1- Óxido – 4-NQO (1 mg/mL); CH 0.1%: IIp a
0.1%; CH 1%: IIp a 1%; CH 10%: IIp a 10%; IM:Índice de mutagenicidade em relação ao
controle negativo.
Tabela 9: Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1% e 10%,
utilizando a linhagem TA98.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : 2-Aminofluoreno (2 mg/mL); CH 0.1%: IIp a 0.1%; CH 1%: IIp a
1%; CH 10%: IIp a 10%; I.M.:Índice de mutagenicidade em relação ao controle negativo.
-S9 +S9
TA97
Média ± D.P. I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
223.6 ± 4 1.0 100 236.3 ± 6 1.0 100
+
558.3 ± 4 2.5 83.3 550.6 ± 40 2.3 87.7
CH 0.1%
152.0 ± 8
0.7
99.0 261.3 ± 10
1.1
100
CH 1%
157.3 ± 13
0.7
100 273.6 ± 28
1.1
100
CH 10%
155.3 ± 3
0.7
100 254.6 ± 44
1.1
100
-S9 +S9
TA98
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
50.3 ± 4 1.0 100 70.3 ± 5 1.0 100
+
430 ± 6 8.5 96
3645.3 ±
238
51.8 69
CH 0.1%
41 ± 7
0.8
94.7 57.6 ± 11
0.8
100
CH 1%
42 ± 3
0.8
95.3 49 ± 3
0.7
88.2
CH 10%
60 ± 15
1.2
75.5 62 ± 16
0.9
100
Tabela 10: Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1% e 10%,
utilizando a linhagem TA100.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : Azida Sódica (0.1mg/mL); CH 0.1%: IIp a 0.1%; CH 1%: IIp a 1%;
CH 10%: IIp a 10%; I.M.:Índice de mutagenicidade em relação ao controle negativo.
Tabela 11: Teste de mutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1% e 10%,
utilizando a linhagem TA102.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : Mitomicina C (50 µg/mL); CH 0.1%: IIp a 0.1%; CH 1%: IIp a 1%;
CH 10%: IIp a 10%; IM:Índice de mutagenicidade em relação ao controle negativo.
-S9 +S9
TA100
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
159.3 ± 18 1.0 100 205.3 ± 8 1.0 100
+
21666 ± 213 13.6 98.7 2896 ± 145 14.1 69
CH 0.1%
145 ± 24
0.9
90.3 196.6 ± 8
0.9
100
CH 1%
145 ± 6
0.9
100 219 ± 4
1.0
100
CH 10%
173.6 ± 6
1.1
96.7 224.6 ± 6
1.1
100
-S9 +S9
TA102
Média ± D.P. I..M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
442.6 ± 102 1.0 100 423 ± 100 1.0 100
+
2786.6 ± 375 6.3 76.8
2055.6 ±
140
4.8 90.1
CH 0.1%
339 ± 79
0.8
100 482 ± 50
1.1
75.1
CH 1%
298.3 ± 84
0.7
98.7 435.6 ± 115
1.0
100
CH 10%
296.3 ± 17
0.7
83.4 428.6 ± 3
1.0
92.7
2.2- Avaliação da mutagenicidade em outras linhagens de
Salmonella thyphimurium
Após o screening quantitativo inicial com as linhagens standards, foram utilizadas
cepas mais sensíveis e específicas, que facilitam a detecção de agentes mutagênicos,
como por exemplo, de lesões induzidas por nitrosaminas.
2.2.1 – Linhagens que expressam DNA metiltransferases
As cepas YG7104 (ogt
ST
-) e YG7108 (ogt
ST
e ada
ST
-) são derivadas da linhagem de
Salmonella thyphimurium TA1535, e possuem deleções nos genes ogt
ST
e ada
ST
. Os
genes ogt
ST
e ada
ST
codificam O-metilguanina DNA metiltransferases que estão
envolvidas no reparo de danos ao DNA causados por agentes alquilantes (Yamada et
al., 1997).
O efeito da IIp 10% sobre as linhagens TA1535, YG7104, YG7108 está
apresentado na tabela 12. O índice de mutagenicidade demonstra que, nas três
linhagens avaliadas, a IIp não apresentou efeito mutagênico na concentração
estudada (10%) tanto na ausência quanto na presença de ativação enzimática (S9
mix). Além disso, o percentual de sobrevivência que sinaliza a toxicidade da
substância teste, não demonstrou efeito citotóxico da IIp 10% na ausência e na
presença de S9 mix.
Tabela 12: Teste de mutagenicidade com IIp 10%, utilizando as linhagens TA1535, YG7104 e
YG7108.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : Azida Sódica (0.1mg/mL), + (Controle Positivo) YG7104 e YG7108
: 1-metil 3-nitroso-1-nitrosoguanidina (MNNG) (0,2 mM); CH 10%: IIp a 10%; IM:Índice de
mutagenicidade em relação ao controle negativo
-S9 +S9
TA1535
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
14.3 ± 2
1.0
100 29.6 ± 2
1.0
100
+
119.6 ± 4
8.4
68.9 220.6 ± 9
7.4
89.5
CH 10%
15.0 ± 3
1.04
98.6 28.3 ± 3
0.95
100
YG7104
0
7.3 ± 2
1.0
100 26 ± 4
1.0
100
+
97.7 ± 8
13.3
90.3 351 ± 27
13.5
73.4
CH 10%
9.0 ± 3
1.2
83,9 24.3 ± 5
0.9
92.8
YG7108
0
19 ± 3
1.0
100 55 ± 7
1.0
100
+
189.7 ± 12
10.0
68.7 509.7 ± 13
9.3
75.3
CH 10%
18.7 ± 1
1.0
100 46 ± 8
0.8
100
2.2.1 – Linhagens que expressam acetiltransferases e nitroredutases
Com a finalidade de verificar a presença de compostos carcinogênicos na erva-
mate em cepas sensíveis à presença de nitrosaminas, utilizamos também, as cepas
YG1021 (superexpressa nitroredutase), YG1024 (superexpressa acetiltransferase),
YG1041 (superexpressa nitroredutase e acetiltransferase), TA98DNP-6 (deficiente em
acetiltransferase) e TA98NR (deficiente em nitroredutase) que são derivadas da
linhagem de Salmonella thyphimurium TA98 (Aiub et al., 2006).
O efeito da IIp 10% sobre as linhagens YG1021, YG1024, YG1041, TA98NR e
TA98DNP6 na presença e na ausência de S9 mix está apresentado na tabela 13. O
índice de mutagenicidade demonstra que, nas três linhagens avaliadas, a IIp não
apresentou efeito mutagênico na concentração estudada (10%) tanto na ausência
quanto na presença de ativação enzimática (S9 mix). Além disso, o percentual de
sobrevivência que sinaliza a toxicidade da substância teste, não demonstrou efeito
citotóxico da IIp 10%na ausência e na presença de S9 mix.
Tabela 13: Teste de mutagenicidade com IIp 10% utilizando a linhagem YG1021, YG1024,
YG1041, TA98NR e TA98DNP-6.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) :
1-metil 3-nitroso-1-nitrosoguanidina (MNNG) (0.2 mM); CH 10%:
IIp a 10%; IM:Índice de mutagenicidade em relação ao controle negativo.
-S9 +S9
YG1021
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev. Média ± D.P. I.M. % Sobrev.
0
195.3 ± 8
1.0
100 262 ± 31
1.0
100
+
527 ± 38
2.7
92.8 605.3 ± 22
2.3
90.6
CH 10%
183.3 ± 20
0.9
88.9 234 ± 21
0.9
79.0
YG1024
0
65 ± 9
1.0
100 70.3 ± 17
1.0
100
+
455.3 ± 34
7.0
75.7 451.7 ± 25
6.4 67.8
CH 10%
67.3 ± 9
1.03
100 80.3 ± 13
1.1
79.4
YG1041
0
303.3 ± 8
1.0
100 364 ± 17
1.0
100
+
1092 ± 178
3.6
100 1231.7 ± 258
3.3
95.1
CH 10%
310 ± 11
1.0
98.6 372 ± 28
1.0
92.1
TA98NR
0
39.7 ± 5
1.0
100 46.3 ± 11
1.0
100
+
453 ± 35
11.4
100 457.7 ± 35
9.8
100
CH 10%
43.3 ± 9
1.1
100 43.0 ± 4
0.9
100
TA98DNP-
6
0
46.3 ± 5
1.0
100 45.3 ± 3
1.0
100
+
381.6 ± 19
8.2
100 366.3 ± 23
8.0
94.1
CH 10%
40.6 ± 4
0.9
81.5 43 ± 4
1.0
86.8
2.3- Avaliação da mutagenicidade através do SOS cromoteste
O sistema SOS controla a expressão de genes ligados com LacZ, um gene
estrutural para β-galactosidase. Muitos destes genes estão associados ao reparo por
excisão de nucleotídeos (REN) em Escherichia coli. Isto permite o monitoramento da
expressão constitutiva basal de um grande número de genes do sistema REN em
condições normais e uma forte indução quando a bactéria apresenta várias lesões no
seu DNA (Quillardet et al.,1985).
Sob certas concentrações da substância teste, pode haver inibição de síntese
protéica levando a uma subestimação de indução de β-galactosidase, resultando num
falso positivo. Para isto ser evitado, medimos também a atividade de fosfatase
alcalina. O SOS cromoteste é considerado positivo (presença de mutagenicidade na
substância teste) quando há um aumento de 1.5 ou mais no fator de indução (F.I.)
(Quillardet et al.,1985).
O efeito da IIp 10% sobre as linhagens PQ35 e PQ37 na presença e na ausência
de S9 mix está apresentado na tabela 14. O fator de indução demonstra que, nas duas
linhagens avaliadas, a IIp não apresentou efeito mutagênico na concentração
estudada (10%) tanto na ausência quanto na presença de ativação enzimática (S9
mix).
Tabela 14: Atividade de β-galactosidase e fosfatase alcalina mensuradas em unidades Miller.
O período de incubação com cada substrato foi de 90 minutos. O fator de indução (F.I.)
corresponde à taxa de atividade de β galactosidase (βGal) / fosfatase alcalina (F.A.) (B/F)
calculado em relação ao grupo controle. Valores são expressos como média e desvio padrão
de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl 0.9%; + (Controle Positivo para PQ35, sem S9 ) :
Azida sódica (0.1mg/mL); + (Controle Positivo para PQ35, com S9): 4- nitroquinolina 1-óxido
(1mg/mL); + (Controle Positivo para PQ37 com e sem S9; Azida sódica (0,1mg/mL); CH 10%:
IIp a 10%.
- S9 + S9
Cepa
βGal F.A. B/F F.I.
βGal F.A. B/F F.I.
0
2.55 1.95 1.31
1.0
2.21 1.91 1.16
1.0
+
4.67 1.57 2.97
2.7
3.60 1.34 2.69
2.3
PQ35
CH 10%
1.3 1.54 0.84
0.6
2.23 1.7 1.31
1.1
0
2.17
0.97
2.24
1.0
2.38
1.04
2.29
1.0
+
3.3 0.46 7.3
3.3
3.23 0. 62 5.21
2.3
CH 10%
2.3 1.1 2.1
0.9
2.0 0.97 2.06
0.9
PQ37
3- AVALIAÇÃO DA ANTIMUTAGÊNICIDADE DA INFUSÃO DE Ilex
paraguariensis ATRAVÉS DO TESTE DE MUTAÇÃO REVERSA COM
Salmonella thyphimurium
Como não foi encontrado mutagenicidade causada pela erva-mate nas cepas
estudadas, decidimos verificar a capacidade antimutagênica da IIp. Para isto, foram
realizados experimentos, utilizando diferentes concentrações de IIp (0.1%; 1% e 10%)
em cepas de Salmonella thyphimurium para uma avaliação inicial. As linhagens
utilizadas para analisarmos este possível efeito protetor da erva-mate foram: TA97,
TA98, TA100 e TA102. Para verificarmos este perfil as cepas foram incubadas com
seus respectivos controles negativos e a IIp.
As linhagens foram testadas em três grupos experimentais: (CH+) as suspensões
foram pré-incubadas por 40 minutos com uma solução contendo a droga que funciona
como controle positivo e a IIp, ao mesmo tempo; (CH, +) as suspensões foram pré-
incubadas por 20 minutos somente com a IIp e posteriormente por 20 minutos com o
controle positivo e (+,CH) as suspensões foram pré-incubadas por 20 minutos
somente com o controle positivo e posteriormente por 20 minutos com a IIp.
O efeito da IIp nas diferentes concentrações (0.1%; 1% e 10%) sobre as linhagens
TA97, TA98, TA100 e TA102 está apresentado nas tabelas 15, 16, 17, 18,
respectivamente. Podemos observar através do índice de mutagenicidade (calculado
neste ensaio, em relação ao controle positivo) que, na TA97, a IIp 10% foi capaz de
reduzir a mutagenicidade causada pelo controle positivo de forma significativa (p <
0,05) nos grupos (CH10%+) com diminuição da mutagenicidade na ausência de S9 de
24% e de 31% na presença de S9; e (+,CH10%) com diminuição de 25% de
mutagenicidade na ausência de S9 e 27% na presença de S9.
Na TA98, a IIp 10% também foi capaz de reduzir significativamente a
mutagenicidade no grupo (CH10%+) sem S9 em 25% e em 42% na presença de
metabolização. No grupo (CH10%,+) a diminuição foi de 21% na ausência de S9 mix e
de 38% na presença de metabolização. Nas TA100 e TA102 não foi observado efeito
antimutagênico.
Além disso, observamos também que o percentual de sobrevivência não
demonstrou efeito citotóxico da IIp em nenhuma das linhagens avaliadas na ausência
e na presença de S9 nas diferentes concentrações.
Tabela 15: Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1%, e
10% utilizando a linhagem TA97.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. Diferença significativa (p <
0,05) entre os grupos experimentais e o controle positivo. (ANOVA - Análise de variância fator
único). 0 (controle negativo): NaCl 0.9%; + (Controle Positivo) : 4-Nitroquinolina 1- Óxido – 4-
NQO (1 mg/mL); CH+: 40 minutos de pré-incubação com chimarrão e controle positivo,
-S9 +S9
TA97
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
223.6 ± 4 - - 236.3 ± 6 - -
+
558.3 ± 4 1.00 100 550.6 ± 40 1.00 100
CH 0.1%
+
541.6 ± 57 0.97 89.2 556.3 ± 24 1.01 100
CH 0.1%,
+
539.0 ± 17 0.96 85.4 565.0 ± 21 1.02 100
+, CH
0.1%
541.0 ± 37 0.96 71.4 583.6 ± 5 1.06 100
CH 1% +
654.3 ± 120 1.16 90.5 564.6 ± 48 1.02 100
CH 1%, +
563.6 ± 83 1.01 77.4 571.6 ± 21 1.04 100
+, CH 1%
564.3 ± 32 1.01 74.4 570.3 ± 21 1.03 100
CH 10%
+
422.6 ± 60 0.76* 75.0 379.9 ± 18 0.69* 100
CH 10%,
+
582.3 ± 7 1.04 94.9 589.0 ± 16 1.07 97.1
+, CH
10%
419.3 ± 21 0.75* 76.2 401.3 ± 33 0.73* 84.6
concomitantemente. CH; +: 20 minutos de pré-incubação com chimarrão e 20 minutos com
controle positivo. +; CH: 20 minutos de pré-incubação com controle positivo e 20 minutos com
chimarrão; IM:Índice de mutagenicidade em relação ao controle positivo.
Tabela 16: Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1%, e
10% utilizando a linhagem TA98.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. Diferença significativa (p <
0,05) entre os grupos experimentais e o controle positivo. (ANOVA - Anáilise de variância fator
-S9 +S9
TA98
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
50.3 ± 4 - - 70.3 ± 5 - -
+
430 ± 46 1.00 100
3645.3 ±
238
1.00 100
CH 0.1%
+
431.3 ± 17 1.00 93.7
3399.3 ±
501
0.93 97.6
CH 0.1%,
+
450.3 ± 85 1.05 94.7
3413.3 ±
512
0.94 98.7
+, CH
0.1%
458.3 ± 77 1.06 81.7
3622.6 ±
293
0.99 85.2
CH 1% +
421.3 ± 27 0.98 93.7 3546 ± 278 0.97 100
CH 1%, +
450.6 ± 99 1.05 98.4 3480 ± 181 0.95 100
+, CH 1%
445.6 ± 23 1.04 100
3398.6 ±
937
0.93 100
CH 10%
+
322 ± 11 0.75* 75.6 2114.3 ±
352
0.58* 100
CH 10%,
+
339.6 ± 23 0.79* 88.3 2260 ± 221 0.62* 92.0
+, CH
10%
429.3 ± 14 1.00 100 3369.3 ±
135
0.92 78.6
único)0 (controle negativo): NaCl 0.9%; + (Controle Positivo) : 2-Aminofluoreno (2mg/mL);
CH+: 40 minutos de pré-incubação com chimarrão e controle positivo, concomitantemente. CH;
+: 20 minutos de pré-incubação com chimarrão e 20 minutos com controle positivo. +; CH: 20
minutos de pré-incubação com controle positivo e 20 minutos com chimarrão; IM:Índice de
mutagenicidade em relação ao controle positivo.
Tabela 17: Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1%, e
10% utilizando a linhagem TA100.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : Azida Sódica (0.1 mg/mL); CH+: 40 minutos de pré-incubação com
-S9 +S9
TA100
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
0
159.3 ± 18 - - 205.3 ± 8 - -
+
2166.6 ±
214
1.00 100 2896 ±145 100 100
CH 0.1%
+
2128.6 ±
218
0.98 89.5 2970.6 ± 95 1.02 98.7
CH 0.1%,
+
2189.3 ±
184
1.01 73.2 2894 ±130 0.99 100
+, CH
0.1%
2079.3 ± 95 0.96 74.3
3074.6 ±
624
1.06 100
CH 1% +
2073.3 ±
180
0.96 100 2880 ± 251 0.99 100
CH 1%, +
2137 ± 91 0.99 82.0 2914.7 ± 85 1.01 100
+, CH 1%
2011.3 ±
154
0.93 75.7
2786.6 ±
127
0.96 100
CH 10%
+
2107.3 ±
136
0.97 86.5 299.6 ± 121 1.03 100
CH 10%,
+
2179.7 ±
173
1.01 97.8
2867.3 ±
179
0.99 100
+, CH
10%
2131 ± 138 0.98 82.0 2780 ± 210 0.96 100
chimarrão e controle positivo, concomitantemente. CH; +: 20 minutos de pré-incubação com
chimarrão e 20 minutos com controle positivo. +; CH: 20 minutos de pré-incubação com
controle positivo e 20 minutos com chimarrão; IM: Índice de mutagenicidade em relação ao
controle positivo.
Tabela 18: Teste de antimutagenicidade com IIp em diferentes concentrações 0.1%, 1%, e
10% utilizando a linhagem TA102.
Valores são expressos como média e desvio padrão de triplicatas. 0 (controle negativo): NaCl
0.9%; + (Controle Positivo) : Mitomicina C (50 µg/mL; CH+: 40 minutos de pré-incubação com
chimarrão e controle positivo, concomitantemente. CH; +: 20 minutos de pré-incubação com
chimarrão e 20 minutos com controle positivo. +; CH: 20 minutos de pré-incubação com
-S9 +S9
TA102
Média ±
D.P.
I.M. % Sobrev.
Média ±
D.P.
IM % Sobrev.
0
442.6 ± 102 - - 423 ± 100 - -
+
2786.6 ±
375
1.00 100
2055.6 ±
140
1.00 100
CH 0.1%
+
2837.7 ±
337
1.01 100
2198.7 ±
750
1.07 100
CH 0.1%,
+
2708.7 ±
396
0.97 98.3 2011 ± 36 0.98 98.3
+, CH
0.1%
2701 ± 352 0.97 100
2074.3 ±
200
1.01 100
CH 1% +
2691.3 ±
700
0.96 98.7
2140.6 ±
170
1.04 100
CH 1%, +
2748.7 ±
155
0.99 100 2003 ± 101 0.97 100
+, CH 1%
2801.6 ±
389
1.00 100
2038.3 ±
120
0.99 100
CH 10%
+
2900.6 ±
428
1.04 83.5 2006.7 ± 93 0.98 96.3
CH 10%,
+
2831.3 ±
398
1.02 96.3
2034.6 ±
219
0.99 100
+, CH
10%
2811 ± 600 1.01 100
2040.7 ±
109
0.99 100
controle positivo e 20 minutos com chimarrão; IM:Índice de mutagenicidade em relação ao
controle positivo.
V- Discussão
1- EXPRESSÃO E ATIVIDADE DO CYP2A3 EM ESÔFAGO DE RATOS
TRATADOS COM INFUSÃO DE Ilex paraguariensis
A infusão de erva-mate é amplamente consumida na região sul da América do
Sul sendo, no Brasil, ingerida como chá gelado nos estados do centro-oeste e
sudeste, e no sul do país é consumido preferencialmente sob a forma de chimarrão.
Diversas propriedades terapêuticas são atribuídas à erva-mate (Filip et al., 2001,
2000), contudo, o consumo de chimarrão tem sido associado ao risco de
desenvolvimento de câncer de esôfago (De Stefani et al., 1990; Craddock, 1993;
Castellsagué et al., 2000).
Paralelo a isto, estudos têm demonstrado que compostos presentes em chás
podem estar associados à prevenção de doenças cardiovasculares e ao câncer (Wang
et al., 2000; Katiyar e Mukhtar, 1996; Yang et al., 2002). Estes estudos especulam
que os mecanismos associados ao efeito protetor parecem estar relacionados à
repressão de fatores de transcrição e proteínas transdutoras de sinais, assim como a
modulação da atividade de enzimas que atuam no metabolismo de pré-carcinógenos
(Yang et al., 2002; Moon et al., 2006).
Não existem trabalhos associando o efeito da erva-mate sobre as enzimas
CYP no esôfago. Uma vez que o CYP2A3 presente no tecido esofágico do rato
participa do metabolismo de nitrosaminas, e este CYP apresenta homologia (~ 86%)
com o CYP2A6 presente no mesmo tecido em humanos, decidimos avaliar o efeito da
infusão de Ilex paraguariensis (IIp) sobre a expressão e atividade desta enzima.
A análise da influência da IIp a 10% (p/v) sobre a expressão do RNAm da
enzima CYP2A3 demonstrou que esta infusão não foi capaz de induzir ou reprimir a
expressão do RNAm do CYP analisado nos animais tratados. Observamos também
que não houve modulação da apoproteína CYP2A3 nos animais tratados nos
diferentes intervalos de tempo (2, 4, 7, 14, 21 dias) quando comparados ao grupo
controle. As atividades associadas à subfamília CYP2A (NDEAd e COH) não foram
induzidas ou reprimidas nos animais tratados, corroborando com os resultados da
análise da expressão do RNAm e da apoproteína CYP2A3 .
Alguns trabalhos foram realizados com o objetivo de verificar o efeito de alguns
chás comumente consumidos sobre a expressão de enzimas CYP presentes no fígado
de animais experimentais, contudo, nenhum destes avaliaram o efeito sobre a
expressão de enzimas no tecido esofágico (Maliakal et al., 2000; Breinholt et al., 2000;
Breinholt et al., 2002; Yang et al., 2005). Maliakal e colaboradores (2000) avaliaram o
efeito do extrato aquoso de Camellia sinensis (erva a partir da qual é preparado o chá
verde) a 0.5% e 0.1% (p/v), no fígado de ratos Wistar, tratados por 4 semanas. Os
animais tratados com 0.5% (p/v), mas não a 0.1% (p/v), apresentaram um aumento de
aproximadamente 80% na atividade do CYP1A1 e 170% na atividade do CYP1A2
(Maliakal et al., 2000; Maliakal e Wanwimolruk, 2001). Os CYP1A1 e CYP1A2 estão
presentes no fígado de ratos e apresentam 80% e 70% de similaridade,
respectivamente, com a isoforma presente no tecido hepático de humanos. O CYP1A1
metaboliza preferencialmente hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)
enquanto que o CYP1A2 metaboliza preferencialmente aminas e amidas
heterocíclicas e poliaromáticas, como a cafeína (Nedelcheva & Gut, 1994). Um estudo
inédito realizado em nosso laboratório, teve a finalidade de avaliar o efeito do extrato
aquoso de Ilex paraguariensis sobre a expressão e atividade de CYPs, presentes no
fígado de ratos Wistar, tratados por diferentes períodos de tratamento (2, 4,7,14, 21
dias). Foi observada uma indução significativa da expressão gênica, protéica e
atividades associadas aos CYP1A2, CYP2B1, CYP2B2 e CYP2E1 (Lubanco, 2006).
Esta indução parece estar relacionada a compostos presentes na erva-mate como, por
exemplo, a cafeína (substrato do CYP1A2) e a quercetina, um dos flavonóides mais
abundantes nos vegetais (Ciolino et al., 1999; Maliakal e Wanwimolruk, 2001). O efeito
da quercetina foi avaliado em cultura de células mamárias humanas e foi observado
um aumento nos níveis de RNAm do CYP1A1, dependente da concentração de
quercetina (Ciolino et al., 1999). Neste estudo, a quercetina causou um rápido
aumento na transcrição deste CYP, chegando ao ponto máximo de indução após 12
horas de tratamento. Estes trabalhos demonstram que indução verificada nos CYPs
hepáticos, parece estar associada à existência de diversos compostos presentes nos
chás.
Por outro lado, Muto et al. (2001) demonstraram que as frações polifenólicas
presentes no chá verde, foram capazes de inibir a metabolização de carcinógenos
como o benzopireno e a aflatoxina B1, através da inibição dos CYP1A1 e CYP1A2
expressos na membrana da linhagem de Salmonella typhimurium TA1538. Chaudhary
e colaboradores (2006) demonstraram também que a quercetina (4 µM) e o
caempferol (3.7 µM) foram capazes de inibir a atividade de desetilação da
etoxiresorufina (específica para CYP1A1) induzida por 2, 3, 7, 8-Tetrachlorodibenzo-p-
dioxin (TCDD) em células de câncer de próstata.
Uma vez que não verificamos alterações na expressão e atividade do CY2A3
no esôfago de ratos tratados com infusão de Ilex paraguariensis a 10% (p/v),
sugerimos que os compostos bioativos extraídos pelo processo de infusão de erva-
mate não estão diretamente relacionados com a bioativação de pré-carcinógenos
envolvidos no desenvolvimento de tumores esofágicos. Ou seja, embora nosso grupo
tenha mostrado que a IIp altera os níveis de CYP hepáticos (Lubanco, 2006), isto não
ocorre com o CYP2A3 ou com a ativação da NDEA no esôfago de ratos tratados com
IIp a 10% (p/v).
2- AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DA INFUSÃO DE Ilex
paraguariensis
O aparecimento de mutações ocorre em todos os seres vivos, sendo um
processo fundamental para a evolução e diversidade das espécies. Muitas das
mutações não implicam em mudanças detectáveis na atividade metabólica da célula,
portanto, passam despercebidas. Outras mutações podem determinar a morte celular
e, por conseqüência, não são, também, detectáveis. Assim, apenas um pequeno
número de mutações que ocorrem em genes específicos pode determinar vantagens
ou um crescimento desordenado de células (Marx, 1993).
Os agentes mutagênicos podem alterar a seqüência das bases no DNA e
podem também acelerar ou aumentar o aparecimento de mutações que estão
associadas ao desenvolvimento da neoplasia. A mutação causada por compostos
ambientais é uma conseqüência de dano ao DNA não reparado, e este é o passo
inicial no processo pelo qual os carcinógenos químicos iniciam a formação de um
tumor (Marx, 1993).
Dados da literatura sugerem que existe participação da erva-mate na etiologia
do câncer de esôfago (Castellsagué et al., 2000). Por esta razão, investigamos a
mutagenicidade da infusão de Ilex paraguariensis (IIp) em linhagens bacterianas. Para
isto, utilizamos inicialmente o ensaio Salmonella/microssoma (Teste de Ames) que é
uma metodologia de triagem validada e mais utilizada atualmente para detectar
substâncias carcinogênicas genotóxicas (Maron & Ames, 1983).
Para a realização de uma análise inicial foram utilizadas as cepas TA97, TA98,
TA100 e TA102 que permitem avaliar a mutagênese por deslocamento do quadro de
leitura por adição de bases, deslocamento do quadro de leitura por adição ou deleção
de bases, substituição de pares de base e danos oxidativos, respectivamente. A
infusão de Ilex paraguariensis é consumida no sul do Brasil em uma concentração de,
aproximadamente, 10% (p/v). Em nossos ensaios com modelos bacterianos - um
sistema menos complexo quando comparado aos eucariotos - utilizamos a infusão de
Ilex paraguariensis a 0.1%, 1% e 10% (p/v) para realização do screening inicial do
possível efeito mutagênico e/ou genotóxico.
Nos experimentos sem ativação metabólica e com ativação metabólica não
foram observados efeito mutagênico nem citotóxico significativos causado pela IIp nas
concentrações de 0.1%, 1% e 10% (p/v), após 40 minutos de tratamento (Tabelas 9,
10, 11, 12) .
Fonseca et al. (2000) analisaram a presença de atividade mutagênica,
genotóxica e clastogênica na Ilex paraguariensis em linhagem bacteriana, linfócitos
humanos in vitro e células de ratos tratados com o extrato aquoso da Ilex
paraguariensis in vivo. Não foi detectada atividade clastogênica in vivo, porém
detectaram mutagenicidade para as TA100 sem S9 e TA102 com e sem S9 (10 mg de
extrato liofilizado / placa) e atividade clastogênica in vitro. A concentração de erva
utilizada no Teste de Ames foi duas vezes maior que a quantidade testada em nosso
estudo, assim como a concentração do extrato de erva-mate verde utilizada nos
experimentos in vivo. Os autores, inclusive, mencionam o fato de que a dose utilizada
nos ensaios foi consideravelmente alta, quando comparado à ingestão diária humana.
Além disso, as cepas TA97 e TA98 não apresentaram mutagenicidade nem
citotoxicidade na presença e na ausência de ativação metabólica (Fonseca et al.,
2000). É importante considerar na avaliação detalhada da mutagenicidade e toxicidade
de compostos naturais, a concentração da substância testada, a procedência da erva,
cosiderando também aspectos como solo, época de colheita e tipo de benificiamento
da erva utilizada. Essas características podem afetar consideravelmente os resultados
utilizando teste específicos e sensíveis para detecção de compostos carcinogênicos
(Maron & Ames, 1983).
Fomos também avaliar a mutagenicidade da IIp a 10% (p/v) em linhagens
bacterianas mais sensíveis a compostos N-nitrosos que estão relacionados ao
desenvolvimento do câncer de esôfago (Pajecki et al., 2003). As cepas YG7104 e
YG7108 são derivadas da linhagem de Salmonella typhimurium TA1535, e possuem
deleções nos genes ogt
ST
e ada
ST
(quadro 3).
As enzimas ogt
ST
e ada
ST
codificam as
principais proteínas de reparo de bases alquiladas que reconhecem os adutos O
6
-
alquilguanina e O
4
-alquiltimina (lesões pré-mutagênicas) na fita dupla de DNA e
remove o grupamento alquil, transferindo-o para uma cisteína da enzima em um
processo de auto-inativação (Yamada et al., 1997). A possível presença de agentes N-
nitrosos na erva-mate poderia causar mutações, aumentando assim o número de
revertentes na cepa com deleção para os dois genes que codificam a enzima de
reparo (YG7108). Sendo assim, utilizamos essas linhagens com a finalidade de
verificar o efeito da IIp a 10% (p/v) sobre as linhagens YG7104 e YG7108 utilizando a
TA1535 (selvagem) como controle do experimento. A ausência de I.M. acima de 2
nestas linhagens sugere que não existem compostos N-nitrosos presentes na erva-
mate (tabela 12).
Para complementar estes resultados foram utilizadas também, linhagens que
apresentam metabolismo diferenciado. As linhagens YG1021 (atividade aumentada de
nitroredutase), YG1024 (atividade aumentada de acetiltransferase), YG1041 (atividade
aumentada de nitroredutase e acetiltransferase), TA98NR (deficiente em
nitroredutase) e TA98DNP-6 (deficiente em acetiltransferase) são derivadas da
linhagem de Salmonella typhimurium TA98 e são utilizadas para detectar compostos
mutagênicos, inclusive compostos N-nitrosos (Aiub et al., 2006).
A possível presença de compostos N-nitrosos ou aminas aromáticas na erva-mate
poderia levar ao aparecimento de toxicidade e/ou mutagenicidade gerados pelos
metabólitos formados pela ação de NATs ou nitroredutases. Contudo, nossos
resultados demonstraram mais uma vez que não existem substâncias consideradas
carcinogências na IIp a 10% (p/v) quando estas linhagens foram utilizadas (tabela 13).
Entre os diversos testes bacterianos desenvolvidos para a identificação de
substâncias genotóxicas e carcinogênicas, encontra-se o SOS cromoteste que foi
utilizado por Oliver e Marzin (1987), na detecção de atividade genotóxica em diversos
compostos inorgânicos, supostamente carcinogênicos para os seres humanos. A
eficiência deste ensaio também foi verificada por Hude e colaboradores (1988) que
testaram uma grande variedade de substâncias químicas. Aproximadamente 80% das
substâncias que apresentaram resultados positivos no SOS cromoteste, confimaram
esses dados através da utilização do Teste de Ames.
Os resultados obtidos neste traballho através da utilização do SOS cromoteste
com as cepas de E. coli PQ35 e PQ37 sugerem que a IIp a 10% (p/v) nas condições
experimentais avaliadas não apresenta atividade genotóxica (tabela 15), corroborando
com os resultados obtidos no Teste de Ames.
3- AVALIAÇÃO DA ANTIMUTAGENICIDADE DA INFUSÃO DE Ilex
paraguariensis
Os resultados apresentados nesta dissertação indicam que o efeito
antimutagênico verificado nas cepas TA97 e TA98 é concentração dependente e que
existe diferença deste efeito entre os grupos experimentais propostos (CH 10%+; CH
10%, +; +, CH 10%). Na cepa TA97, que detecta danos que levam a adição de bases,
o grupo que recebeu o mutágeno (4-NQO, 1mg/mL) e a IIp a 10%
(concomitantemente) apresentou 24% e 31% de proteção (antimutagenicidade) com
ativação e sem ativação metabólica, respectivamente (Tabela 16). Ainda na linhagem
TA97, observamos também um efeito antimutagênico no grupo em que primeiramente
o controle positivo foi pré-incubado por vinte minutos e posteriormente a IIp a 10%
(p/v) foi adicionada por mais 20 minutos (25% de proteção na ausência de ativação
metabólica e 27% no grupo com ativação metabólica). O mutágeno utilizado como
controle positivo (4-NQO) não necessita de ativação metabólica para exercer seu
efeito mutagênico (Nunoshiba & Demple, 1993). Desta forma, podemos observar que
os percentuais de antimutagenicidade encontrados nos grupos foram bem
semelhantes (p > 0.05). O mecanismo de ação anticarcinogênica dos chás, inclusive
da erva-mate não é, ainda, completamente compreendido. Contudo, alguns autores
que estudaram o efeito de chás e seus componentes buscaram justificar esse possível
efeito protetor. Mamiko e colaboradores (1999) demonstraram que o tratamento de
células de hamster sírio com chá verde foi capaz de reduzir significativamente a
mutagenicidade induzida pelo 4-NQO. Os autores sugerem que esse efeito
antimutagênico está relacionado à presença de compostos antioxidantes presentes no
chá, mas não sugerem um mecanismo pelo qual estas substâncias atuariam.
Através da análise dos resultados encontrados na TA97 no grupo (CH10%+)
podemos sugerir que os compostos presentes na erva-mate parecem dificultar a
ligação do mutágeno ao DNA, ou ainda, poderiam favorecer o reparo. A
antimutagenicidade observada no grupo (+, CH10%) também poderia ser explicada
pela hipótese de que substâncias bioativas presentes na erva-mate poderiam atuar
favorecendo o reparo de danos causados pelo agente mutagênico.
No grupo (CH10%,+) não observamos um efeito antimutagênico significativo.
Neste caso, podemos sugerir que os compostos que conferem este efeito protetor
podem ter sido consumidos durante os vinte minutos de incubação, não interferindo no
momento em que o controle positivo foi adicionado.
Na linhagem TA98, observamos 25% de proteção no grupo (CH10%+) e 21%
no grupo (CH10%,+), ambos sem ativação metabólica. Verificamos nestes mesmos
grupos, um percentual maior de proteção, na presença de ativação metabólica (grupo
CH10%+: 42% de proteção e grupo CH10%,+: 38% de proteção) utilizando como
controle positivo o 2-aminofluoreno (2 mg/mL). O 2-aminofluoreno é um agente
alquilante que causa mutações por adição de bases e precisa ser metabolizado para
exercer seus efeitos carcinogênicos (Ku et al., 2007). Neste caso, a IIp a 10% (p/v)
parece inibir enzimas que ativam e detoxificam metabolicamente o mutágeno,
impedindo que o carcinógeno exerça seus efeitos deletérios. Os CYP1A e CYP2B
estão induzidos na fração S9 mix (Ku et al., 2007), dessa forma a inibição destas
enzimas seria um possível mecanismo pelo qual a IIp a 10% (p/v) exerceria seu efeito
antimutagênico. Bacon e colaboradores (2003) demonstraram que a quercetina (5 – 20
µM) foi capaz de inibir a formação de adutos induzidos pelo 2-amino-1-metil-6-
fenilimidazo[4,5-b] piridina (PhIP) em hepatócitos humano de maneira dose-
dependente. A redução da formação de adutos se deu através da inibição do CYP1A2
(detectado por PCR em tempo real e ensaios enzimáticos), principal enzima de fase 1
responsável pela bioativação de PhIP. Yoshimoto e colaboradores (2002)
demonstraram que o ácido caféico, o ácido clorogênico e ácidos cafeoilquínicos (0.1 –
0.5 mM) foram capazes de inibir a mutação reversa causada pelo 1,3- amino 1,4-
dimetil 5-pirido 4,3-indol (0.075 µg/placa) na linhagem TA98 na presença de ativação
metabólica (S9 mix). O efeito antimutagênico variou numa faixa de 20 a 60% de
proteção. Considerando que a infusão de erva-mate apresenta em sua composição
estes compostos fenólicos (Bastos et al., 2006), podemos sugerir que estes estejam
envolvidos em seu mecanismo de antimutagenicidade. Paralelo a isto, um trabalho
realizado em Saccharomyces cerevisiae tratadas com peróxido de hidrogênio (10
mmol/L) demonstrou, também, um efeito antimutagênico da infusão de erva-mate
verde a 5% (Bracesco et al., 2003).
O grupo (+,CH10%) avaliado na linhagem TA98 não apresentou efeito
antimutagênico. É provável que os 20 minutos de tratamento tenham sido suficientes
para a metabolização do 2-aminofluoeno, desencadeando assim seus efeitos
mutagênicos.
Nas linhagens TA100 e TA102 tratadas com IIp em diferentes concentrações
(0.1%, 1% e 10%) não observamos efeito antimutagênico significativo. Considerando
que os mutágenos azida sódica (TA100) e mitomicina C (TA102) causam mutação
pontual de G-C para T-A e de T-A para G-C, respectivamente, sugerimos que a IIp não
exerce efeito protetor contra este tipo de dano ao DNA.
Nossos resultados indicam que a IIp a 10% (p/v) apresenta um efeito protetor,
sob certas condições experimentais. Contudo, considerando que não existem dados
consistentes e conclusivos na literatura a respeito dos mecanismos pelos quais os
chás atuam conferindo proteção contra alguns tipos de câncer, estudos posteriores
são necessários para melhor caracterização da atividade antimutagênica da IIp, bem
como de seus mecanismos de ação.
4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos nesta dissertação sugerem que a erva-mate, nas condições
avaliadas, não apresenta efeito mutagênico e citotóxico e também não foi capaz de
induzir a enzima CYP2A3, responsável pelo metabolismo de nitrosaminas no esôfago
de ratos. Dessa forma, as hipóteses de que a erva-mate apresentaria substâncias
potencialmente carcinogênicas ou que induziria enzimas CYP no esôfago, foram
descartadas. De maneira interessante, observamos um efeito antimutagênico, que
pode estar relacionado à sua composição química e seus efeitos antioxidantes ou a
mecanismos ainda desconhecidos.
Sendo assim, parece que a injúria térmica causada pelo consumo de chás a
temperaturas elevadas (~70ºC) pode estar associada ao desenvolvimento carcinoma
epidermóide de esôfago. Um estudo demonstrou que ratos submetidos à alimentação
oral crônica com água quente e N-metil-N’-nitrosoguanidina (MNNG), desenvolvem
mais neoplasias de esôfago do que o grupo controle de animais que receberam água
quente cronicamente, ou só MNNG (Kruel et al., 1995). Além disso, resultados
preliminares obtidos com um modelo experimental de carcinogênese esofágica
desenvolvido em nosso laboratório, corroboram com a hipótese de que a
administração de água quente (70ºC) associado a uma baixa dose de nitrosamina
(NDEA) pode causar a formação de tumores, ao contrário da administração isolada de
nitrosamina ou água quente (comunicação pessoal, Rapozo, et al., 2007).
Considerando que os indivíduos do sul do Brasil têm hábito não só de consumir
chimarrão, mas também de consumir álcool, tabaco e churrasco, podemos sugerir
que esses fatores possam contribuir ou potencializar a lesão causada pela
bebida ingerida quente. Dessa maneira, as evidências epidemiológicas e baseadas em
estudos experimentais indicam que o principal fator de risco para o carcinoma
epidermóide de esôfago na região sul do Brasil é a lesão crônica causada pela injúria
térmica e sua associação a hábitos culturais e estilo de vida adotado nesta região.
As evidências demonstradas neste presente trabalho podem trazer novas
hipóteses para futuras investigações. Os mecanismos de antimutagenicidade da erva-
mate devem ser estudados; considerando a hipótese de que a erva, mediante suas
propriedades antioxidantes, poderia minimizar a ação exercida pela injúria térmica
causada no epitélio esofágico. Estudos futuros serão realizados em nosso laboratório
com o objetivo de avaliar o efeito da infusão de erva-mate quente em animais
experimentais, buscando responder estas questões, assim como os possíveis
mecanismos relacionados à antimutagenicidade da erva-mate em outros modelos
experimentais.
VII- Conclusões
A infusão de Ilex paraguariensis não aumentou a ativação metabólica de
nitrosaminas no esôfago de ratos.
x A IIp a 10% (p/v) não alterou a expressão do RNAm do CYP2A3 em esôfago de
ratos tratados por diferentes intervalos de tempo.
x A IIp a 10% (p/v) não alterou a expressão da apoproteína CYP2A3 em esôfago
de ratos tratados por diferentes intervalos de tempo.
x A IIp a 10% (p/v) não alterou as atividades COH e NDEAd em esôfago de ratos
tratados por diferentes intervalos de tempo.
A infusão de Ilex paraguariensis não apresenta compostos mutagênicos.
x A infusão de Ilex paraguariensis não apresentou mutagenicidade nem toxicidade
nas linhagens bacterianas de S. typhimurium e E. coli na ausência e na presença
de ativação metabólica.
x A infusão de Ilex paraguariensis apresentou antimutagenicidade nas cepas de
S. typhimurium TA97 e TA98 na ausência e na presença de ativação metabólica.
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