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MARINEIDE PRUDENCIO DE CARVALHO
EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE
MARCADORES MOLECULARES NO LINFOMA
DIFUSO DE GRANDES CÉLULAS B
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo para obtenção do Título de Doutor em
Medicina
SÃO PAULO
2007
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MARINEIDE PRUDENCIO DE CARVALHO
EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE
MARCADORES MOLECULARES NO LINFOMA
DIFUSO DE GRANDES CÉLULAS B
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo para obtenção do Título de Doutor em
Medicina
Área de Concentração: Clínica Médica
Orientador: Prof Dr. Carlos Sérgio Chiattone
Co-orientador: Prof. Dr. Roberto Antonio Pinto Paes
SÃO PAULO
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Carvalho, Marineide Prudêncio de
Expressão imunoistoquímica de marcadores moleculares no
linfoma difuso de grandes células B./ Marineide Prudêncio de
Carvalho. São Paulo, 2007.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo – Curso de pós-graduação em Medicina.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Carlos Sérgio Chiattone
Co-Orientador: Roberto Antonio Pinto Paes
1. Marcadores biológicos 2. Imunoistoquímica 3. Linfoma difuso
de grandes células
BC-FCMSCSP/64-07
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus filhos
Ceci, Francisco e Ivo
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Carlos Sérgio Chiattone, meu orientador, pelo apoio e pelos ensinamentos ao
longo destes anos.
Ao Prof. Dr. Roberto Antonio Pinto Paes, meu co-orientador, pelo apoio e pelo entusiasmo
com que realizamos este trabalho.
Ao Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, pela confiança que depositou em nossas idéias,
transformando-as em realidade, em trabalho científico.
À Dra. Teresa Cristina Bortolheiro, pelo coleguismo e pelo auxílio durante a revisão do
texto.
À Dra. Maria Fernanda Carriel Amary, pelo coleguismo e pelo auxílio na versão
internacional deste trabalho.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à Irmandade da Santa Casa
de Misericórdia de São Paulo. O exercício da medicina nestas Instituições é motivo de
orgulho para mim. Aqui, convivo com pessoas pelas quais tenho profundo respeito e
admiração.
Aos nossos pacientes, mestres de humildade e afeto.
AGRADECIMENTOS
Às pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho:
- aos colegas Chang Ho Lee, Cíntia Mendonça de Abreu e Vanessa de Carvalho
Fabrício, pelo coleguismo e pela compreensão durante minhas ausências nas
atividades cotidianas;
- aos funcionários do Arquivo Médico da Santa Casa, pelo empenho em localizar
os prontuários e pelo carinho com que me recebem;
- aos funcionários da Central de Quimioterapia da Santa Casa, pelo apoio e pela
compreensão durante a elaboração deste trabalho;
- à amiga Suely Francisco, bibliotecária do Hospital A.C. Camargo, que sempre
me acolhe, apesar dos meus atropelos;
- aos funcionários do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital A. C.
Camargo, Fundação Antonio Prudente, pela execução do TMA;
- aos amigos da Clínica São Germano, pelo apoio em todas as horas desta longa
jornada.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas iniciais do desenvolvimento da célula B.................................................. 03
Figura 2. Fotografia de um corte microscópico de um linfonodo humano......................... 04
Figura 3. O receptor da célula B e a sinalização intracelular.............................................. 05
Figura 4. Diferenciação do linfócito B no centro germinativo. .......................................... 06
Figura 5. Rearranjo na cadeia pesada da imunoglobulina (Ig
H
).......................................... 07
Figura 6. Representação esquemática dos elementos de regulação do gene da cadeia
pesada da imunoglobulina do camundongo.........................................................08
Figura 7. Proposta de regulação gênica do centro germinativo e a transição para
plasmócito............................................................................................................ 10
Figura 8. Representação esquemática da interação do fator de transcrição Blimp-1 com os
genes envolvidos na diferenciação da célula B para plasmócito......................... 11
Figura 9. Expressão gênica do plasmócito na medula óssea. Blimp1 reprime a expressão
de CXCR5 e induz a expressão de CXCR4 e da α
4
-integrina............................. 13
Figura 10. Modelo de regulação gênica do fenótipo do centro germinativo. ....................... 14
Figura 11. Representação esquemática da regulação gênica do fenótipo do centro
germinativo.......................................................................................................... 15
Figura 12. Representação esquemática da proteína BCL-6. ................................................. 16
Figura 13. Assinatura gênica em matriz de cDNA dos distintos tipos de LDGCB..............21
Figura 14. Representação esquemática do gene bcl-6 humano. ........................................... 26
Figura 15. Modelo de controle transcricional da transição da célula pré-B para B.............. 29
Figura 16. Vias da apoptose..................................................................................................32
Figura 17. Ativação da via intrínseca independente do p53. ................................................ 33
Figura 18. Modelo para a função da survivina na formação do fuso mitótico. .................... 38
Figura 19. Diagrama representando a proteínas STATs....................................................... 40
Figura 20. Mecanismo de ação do interferon γ (IFN-γ)........................................................ 41
Figura 21. Proteínas reguladas por STAT-1. ........................................................................ 42
Figura 22. Fluxograma dos casos envolvidos no estudo....................................................... 51
Figura 23. Fotomicrografia de linfoma difuso de grandes células B mostrando células
volumosas, com núcleos polimorfos e nucléolos evidentes. ............................... 58
Figura 24. Planilha original de posicionamento dos cortes histológicos de todos os blocos
dos pacientes envolvidos no estudo..................................................................... 59
Figura 25. Visão frontal do aparelho de precisão da Becker Instruments utilizado para. a
construção do arranjo tecidual em matriz............................................................60
Figura 26. Confecção do bloco receptor............................................................................... 61
Figura 27. Lâmina corada com hematoxilina-eosina............................................................62
Figura 28. Avaliação da qualidade das amostras do TMA. ................................................. 63
Figura 29. Avaliação da qualidade da amostra do TMA em maior aumento. ......................63
Figura 30. Avaliação dos critérios de intensidade da coloração à imunoistoquímica no
TMA. ................................................................................................................... 70
Figura 31. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão membranoso na
reação imunoistoquímica para CD 10. ............................................................... 71
Figura 32. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na reação
imunoistoquímica para BCL-6 ............................................................................71
Figura 33. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão membranoso na
reação imunoistoquímica para BCL-2. ............................................................... 72
Figura 34. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na reação
imunoistoquímica para MUM1 ........................................................................... 72
Figura 35. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na reação
imunoistoquímica para p53. ................................................................................ 73
Figura 36. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na reação
imunoistoquímica para OCT-2............................................................................ 73
Figura 37. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear e
citoplasmático na reação imunoistoquímica para survivina. .............................. 74
Figura 38. Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear e
citoplasmático na reação imunoistoquímica para STAT-1.................................. 74
Figura 39. Algorítmo de decisão para a classificação imunoistoquímica da casuística
baseado na expressão de CD10, BCL-6 e MUM1 ..............................................78
Figura 40. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável sexo................. 82
Figura 41. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável idade ...............82
Figura 42. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável estádio
clínico .................................................................................................................. 83
Figura 43. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável sintomas
constitucionais. .................................................................................................... 83
Figura 44. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável sítio
extranodal ............................................................................................................ 84
Figura 45. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável IPI................... 84
Figura 46. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável
perfil CG e NCG.................................................................................................. 85
Figura 47. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão do CD 10..... 87
Figura 48. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão do BCL-6.... 87
Figura 49. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão do MUM1. .. 88
Figura 50. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do p53. .................................................................................88
Figura 51. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do BCL-2 ............................................................................... 89
Figura 52. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica da survivina............................................................................ 89
Figura 53. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do OCT2 ................................................................................90
Figura 54. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do STAT-1............................................................................ 90
Figura 55. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do
CD10.................................................................................................................... 93
Figura 56. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do
BCL-6.................................................................................................................. 93
Figura 57. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do
MUM1 ................................................................................................................. 94
Figura 58. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do
p53. ...................................................................................................................... 94
Figura 59. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica
da survivina. ........................................................................................................95
Figura 60. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica
do OCT2. ............................................................................................................. 95
Figura 61. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do
STAT-1................................................................................................................ 96
Figura 62. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica
do BCL-2............................................................................................................. 96
Figura 63. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão do BCL-2
no NCG................................................................................................................ 97
Figura 64. Análise da sobrevida global de acordo com a expressão do BCL-2 no CG........ 97
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica ................................................................................................18
Tabela 2. Taxas médias anuais de incidência de linfoma no Brasil, ajustadas por idade por
100.000 homens...................................................................................................19
Tabela 3. Taxas médias anuais de incidência de linfoma no Brasil, ajustadas por idade e
por 100.000 mulheres .......................................................................................... 19
Tabela 4. Distribuição dos grupos de risco do IPI e as taxas de probabilidade de sobrevida
global .................................................................................................................. 20
Tabela 5. Dados referentes ao impacto da expressão do CD10 na sobrevida global .......... 25
Tabela 6. Dados referentes ao impacto da expressão do BCL-6 sobre a sobrevida
global ................................................................................................................... 28
Tabela 7. Dados referentes ao impacto da expressão do MUM1 sobre a sobrevida
global ................................................................................................................... 30
Tabela 8. Dados referentes ao impacto da expressão do p53 sobre a sobrevida global...... 36
Tabela 9. Dados referentes ao impacto da expressão do BCL-2 sobre a sobrevida
global .................................................................................................................. 44
Tabela 10. Distribuição da casuística de acordo com variáveis demográficas, clínicas, tempo
de seguimento e evolução clínica........................................................................ 55
Tabela 11. Critérios de resposta ao tratamento nos linfomas não-Hodgkin segundo o
International Working Group.............................................................................. 56
Tabela 12. Distribuição da casuística de acordo com o tratamento ...................................... 56
Tabela 13. Leitura da expressão protéica no TMA baseada na coloração característica da
reação imunoistoquímica dos marcadores moleculares.......................................67
Tabela 14. Distribuição da casuística de acordo com a expressão dos marcadores
moleculares..........................................................................................................75
Tabela 15. Resultados da análise da associação entre os grupos de risco do IPI e a expressão
do CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, STAT-1, p53, OCT-2 e da survivina .......... 76
Tabela 16. Resultados da análise da associação entre a expressão do CD10, BCL-6, BCL-2,
MUM1, STAT-1, p53, OCT-2 e da survivina e a resposta à quimioterapia ....... 77
Tabela 17. Resultados da análise da associação entre a expressão do BCL-2, p53, survivina,
OCT-2 e STAT-1 e os subgrupos centro germinativo e não centro
germinativo.......................................................................................................... 79
Tabela 18. Resultados da análise da associação entre os estádios agrupados, o IPI e a
resposta à quimioterapia nos subgrupos centro germinativo e não centro
germinativo.......................................................................................................... 80
Tabela 19. Taxas de sobrevida livre de eventos em 24 meses segundo as variáveis sexo,
idade, estádio, sintomas constitucionais, sítio extranodal. IPI e classificação
imunoistoquímica ................................................................................................81
Tabela 20. Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses de acordo com a expressão
do CD10, BCL-6, MUM1, BCL-2, OCT-2, p53, STAT-1 e da survivina .......... 86
Tabela 21. Taxas de sobrevida global em 24 meses segundo as variáveis sexo, idade,
estádio, sintomas constitucionais, sítio extranodal. IPI e classificação
imunoistoquímica ................................................................................................91
Tabela 22. Análise da sobrevida global em 24 meses de acordo com a expressão do CD10,
BCL-6, MUM1, BCL-2, OCT-2, p53, survivina e STAT-1................................ 92
Tabela 23. Análise multivariada. Modelo de regressão COX com as variáveis IPI,
classificação imunoistoquímica e o marcador BCL-2, sem incluir a variável
resposta à quimioterapia...................................................................................... 98
Tabela 24. Análise multivariada. Modelo de regressão COX com as variáveis resposta à
quimioterapia, classificação imunoistoquímica e o marcador BCL-2................. 98
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................................1
1.1 Diferenciação dos linfócitos........................................................................................2
1.2 Linfoma não-Hodgkin ...............................................................................................17
1.2.1 Dados epidemiológicos .............................................................................................18
1.2.2 Linfoma difuso de grandes células B ........................................................................20
1.2.2.1 CD10..........................................................................................................................22
1.2.2.2 BCL-6........................................................................................................................25
1.2.2.3 IRF4/MUM1..............................................................................................................28
1.2.2.4 OCT-2........................................................................................................................30
1.2.3 Apoptose....................................................................................................................31
1.2.3.1 Proteína p53...............................................................................................................33
1.2.3.2 Survivina....................................................................................................................37
1.2.3.3 STAT-1......................................................................................................................39
1.2.3.4 BCL-2........................................................................................................................43
1.3 Arranjo tecidual em matriz (TMA) ...........................................................................45
1.4 Justificativa................................................................................................................46
2. OBJETIVOS ............................................................................................................47
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS .................................................................................49
3.1 Casuística...................................................................................................................50
3.1.1 Estratégia de busca de pacientes................................................................................50
3.1.2 Critérios de exclusão .................................................................................................51
3.1.3 Levantamento das características clínicas no momento do diagnóstico....................52
3.1.4 Distribuição da casuística de acordo com as variáveis demográficas, clínicas, tempo
de seguimento, evolução e resposta à quimioterapia.................................................53
3.2 Métodos .....................................................................................................................57
3.2.1 Revisão histopatológica.............................................................................................57
3.2.2 Procedimentos para a construção do arranjo tecidual em matriz ..............................58
3.2.3 Procedimentos para a realização da técnica de imunoistoquímica............................64
3.2.4 Estudo estatístico.......................................................................................................68
4. RESULTADOS........................................................................................................69
4.1 Estudo imunoistoquímico por meio do arranjo tecidual em matriz...........................70
4.1.1 Avaliação da qualidade do arranjo tecidual em matriz..............................................70
4.1.2 Expressão imunoistoquímica do CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, p53, OCT-2,
STAT-1 e da survivina ..............................................................................................70
4.2 Distribuição da casuística de acordo com a expressão imunoistoquímica do CD10,
BCL-6, BCL-2, MUM1, STAT-1, p53, OCT-2 e da survivina.................................75
4.3 Distribuição da casuística, segundo o algorítimo baseado na expressão do CD10,
BCL-6 e MUM1 ........................................................................................................78
4.4 Análise univariada .....................................................................................................80
4.4.1 Análise da sobrevida livre de eventos .......................................................................80
4.4.2 Análise da sobrevida global.......................................................................................91
4.5 Análise multivariada..................................................................................................98
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................99
6. CONCLUSÕES......................................................................................................110
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................112
RESUMO ................................................................................................................127
ABSTRACT ............................................................................................................128
APÊNDICE .............................................................................................................129
1. INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
2
Com a finalidade de se defender da ação dos agentes infecciosos, entre os quais vírus,
bactérias e fungos, os organismos desenvolveram estratégias que vão desde barreiras de
proteção, moléculas tóxicas e células fagocíticas como primeira linha de defesa, até respostas
adaptativas altamente específicas, inclusive com a capacidade de gerar proteção por longos
períodos. As primeiras estratégias de defesa ou resposta imune inata são ativadas diretamente
pelos patógenos e estimulam o desenvolvimento de respostas imunes adaptativas. Há duas
classes de respostas adaptativas: respostas mediadas por anticorpos e respostas mediadas por
células, realizadas pelos linfócitos B e T, respectivamente (Alberts et al. 2002).
1.1 Diferenciação dos linfócitos
Qualquer substância capaz de estimular a resposta imune adaptativa é denominada
antígeno e a interação do antígeno com a célula B é feita através de um complexo protéico de
superfície citoplasmático denominado receptor da célula B (RCB). A formação deste receptor
remonta à fase precoce de diferenciação do linfócito, a célula pré-B, quando ainda não
ocorreu o contato com o antígeno. Inicialmente, o RCB é formado por uma unidade de
imunoglobulina ligada de forma não covalente a duas proteínas, CD79a (Igα) e CD79b (Igβ);
nesta fase, a imunoglobulina é constituída por dois polipeptídeos longos, do tipo µ, e duas
cadeias leves provisórias (Alberts et al. 2002).
Estas cadeias leves provisórias são substituídas por cadeias definitivas, que combinam
com as cadeias µ, para formar a imunoglobulina M (IgM). Além de produzir IgM, a célula B
virgem imatura também produz moléculas de superfície celular do tipo imunoglobulina D
(IgD), com o mesmo sítio de ligação para o antígeno contido nas moléculas de IgM. Estas
imunoglobulinas se inserem na membrana citoplasmática e atuam como receptores de
antígenos (Fig. 1).
INTRODUÇÃO
3
Figura 1 - Etapas iniciais do desenvolvimento da célula B. A IgM possui uma cadeia pesada
do tipo µ, sendo sempre a primeira classe de anticorpos produzida pelas células B
em diferenciação. Após a substituição das cadeias leves (L) precursoras pelas
cadeias leves definitivas, a IgM se insere na membrana citoplasmática, tendo ao
lado quatro cadeias não variantes associadas. O conjunto forma o receptor da
célula B (RCB) e atua como receptor de antígeno. A IgD é produzida após a saída
da célula da medula óssea, e também funciona como receptor de antígeno
(Modificado de Alberts et al. 2002).
Além das imunoglobulinas, as células B expressam outras proteínas de superfície,
denominadas proteínas de d
iferenciação clonal (CD). Estas proteínas possibilitam a
identificação da linhagem e da fase de maturação em que a célula se encontra.
São exemplos destes marcadores CD10; CD19, CD20 e CD45, que além de identificar
a origem B do linfócito, atuam no processo de transdução de sinal de ativação celular; o
CD22, que está envolvido na sinalização e adesão aos monócitos e às células T, e o CD40,
que participa da interação com o linfócito-T auxiliar (Hennessy et al. 2004; Küppers, 2005).
As células B virgens maduras são identificadas na medula óssea como grandes células
que proliferam rapidamente. Estas células podem evoluir para pequenos linfócitos quiescentes
ou migrar da medula óssea e circular constantemente através da linfa e do sangue até
encontrar um antígeno.
cadeia δ
cadeia L
IgD
célula
pluripotente
hematopoiética
célula pré-B célula B virgem imatura célula B virgem madura
cadeia L precursora
cadeia
µ
cadeia L
IgM
cadeia δ
cadeia
µ
BB
Desenvolvimento na medula óssea Circula nos órgãos linfóides secundários
β
α
α
β
RBC
INTRODUÇÃO
4
A migração de linfócitos para os linfonodos e sua recirculação depende da interação
entre a selectina-L e os oligossacarídeos. A selectina-L é uma molécula de adesão célula-
célula dependente de Ca
2+
, que está presente na membrana citoplasmática do linfócito. Os
oligossacarídeos estão presentes na superfície de células endoteliais especializadas, das
vênulas pós-capilares dos órgãos linfóides periféricos.
Nos órgãos linfóides, a interação entre os oligossacarídeos e a selectina-L estabelece
uma ligação fraca, que permite o rolamento contínuo e reversível dos leucócitos pelo
endotélio, até que os leucócitos ativem integrinas, deixem o vaso sangüíneo e migrem para o
interior do linfonodo (Fig. 2). (Alberts et al. 2002; Küppers, 2005).
Figura 2 - Fotografia de um corte microscópico de um linfonodo humano. As células B
inicialmente ficam agrupadas em estruturas denominadas folículos, enquanto que
as células T ficam concentradas principalmente no paracórtex. Estas células
migram para os linfonodos atraídas por quimiocinas. Se não encontram seus
antígenos específicos, tanto a célula B quanto a célula T entram no sinusóide
medular e deixam o linfonodo pelo vaso linfóide eferente. (Modificado de
Alberts et al, 2002 & www.pleiad.umdnj.edu).
Trabécula
Cápsula
Folículo primário (células B)
Cordões medulares
Folículo secundário
Paracórtex (principalmente células T)
Ce
n
t
r
o
ge
rmin
at
i
vo
INTRODUÇÃO
5
As células T e B inicialmente entram na mesma área do linfonodo, em seguida são
atraídas por quimiocinas para diferentes regiões. As células T se dirigem para a região para
cortical, e as células B, para os folículos linfóides. Se não encontrarem seus antígenos, irão
deixar o linfonodo através dos vasos linfáticos eferentes.
Porém, se as células encontrarem seus antígenos irão permanecer no linfonodo,
proliferar e diferenciar-se em células efetoras. Os antígenos reconhecidos pela célula B
formam um agregado com os RCBs na zona escura do centro germinativo (CG), em seguida,
a porção caudal da Igα e da Igβ, do RCB, se ativa e serve de ancoragem para a proteína
sinalizadora intermediária citoplasmática SyK, que também se ativa e dispara o sinal para
outras tirosino-quinases intracelulares. O sinal iniciado causa proliferação da célula B, agora
denominada imunoblasto ou centroblasto, gerando assim, clones de células efetoras que
secretarão imunoglobulinas antígeno-específico (Fig. 3) (Pao, 1998; Tan, 2001).
Figura 3 - O receptor da célula B e a sinalização intracelular. A fosforilação das cadeias
invariáveis Igα e Igβ atuam como sítios de ancoragem para as tirosino-quinases
Shc e SyK, assim a cascata de fosforilação ativa as proteínas sinalizadoras
intermediárias citoplasmáticas que sinalizam para o núcleo. O sinal iniciado
causa crescimento, proliferação e a criação de um clone amplificado de células
efetoras (Modificado de www.sigmaaldrich.com).
INTRODUÇÃO
6
Na resposta imune dependente da célula T, o linfócito B antígeno ativado sofre
expansão clonal na zona escura do centro germinativo, onde ocorrem mutações pontuais
específicas nas seqüências que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas das
imunoglobulinas. Estas mutações ocorrem, em média, em torno de uma por seqüência
codificante de região V em cada célula gerada na expansão clonal. Este fenômeno é
conhecido como maturação da afinidade com o antígeno, num processo denominado de
hipermutação somática cujo efeito é de aumento da afinidade entre a imunoglobulina e o
anticorpo (Fig. 4) (Pasqualucci et al. 1998; Küppers, 2005).
Na zona clara do CG, as células B2 que apresentam receptores de alta afinidade com o
antígeno, em contato com os linfócitos T CD4+ e com as células dendríticas foliculares, são
preferentemente estimulados a sobreviver e a proliferar, num processo conhecido por
RCB (-)
Apoptose
Zona Escura
Mutação que reduz a afinidade com o antígeno
Expansão clonal
Hipermutação somática
Diferenciação
Mutação que aumenta a afinidade com o antígeno
célula dendrítica folicular
Zona clara
Zona do Manto
Célula B memória
Plasmócito
Célula B
apoptose
Troca de classe de Ig
B
B
T CD4+
Precursor da célula B
Recombinação região-V gene da imunoglobulina
Diferenciação do linfócito B no centro germinativo. Na resposta imune
dependente da célula T, o linfócito B antígeno ativado sofre expansão clonal na
zona escura do centro germinativo, onde o processo de hipermutação é ativado.
As células que sofrem mutações que favorecem a afinidade com o antígeno são
selecionadas para entrar em contato com as células T CD4
+
e as células
dendríticas na zona clara do centro germinativo (Modificado de Küppers,
2005).
Figura 4-
INTRODUÇÃO
7
expansão clonal. Uma fração destas células B centro foliculares sofre o processo denominado
de troca de classe de imunoglobulinas e passa a produzir moléculas do tipo IgG, IgE ou IgA,
denominados anticorpos secundários. No processo de troca de classe de imunoglobulina
ocorre a deleção do DNA, entre a seqüência VDJ e a seqüência codificante da imunoglobulina
que será produzida (Fig. 5) (Alberts et al. 2002; Chaudhuri, Alt, 2004). Neste processo, é
essencial o fator de transcrição AID (activation-induced deaminase) codificado pelo gene
aicda. In vivo, a expressão de AID geralmente é restrita às células B ativadas no CG, sendo
regulado positivamente pelos fatores de transcrição E2A e Pax5 (Gonda et al. 2003,
Chaudhuri, Alt, 2004; McBride, 2006).
Rearranjo na cadeia pesada da imunoglobulina (Ig
H
). A região variável da Ig
H
é composta pela recombinação dos componentes: variável(V
H
), diversidade
(D
H
) e juncional (J
H
). Nos processos de recombinação e troca de classe de
imunoglobulina ocorre clivagem do DNA entre a seqüência DVJ e a seqüência
codificante da imunoglobulina. (Referência: Chaudhuri, Alt, 2004)
Figura 5-
INTRODUÇÃO
8
A seqüência octamérica ATGCAAAT está presente no promotor e no ativador dos
genes da Ig e desempenha importante papel na expressão tecido específica destes genes
(Hermanson et al. 1989; Kemler, Schaffner, 1990; Schubart et al. 2001), além de estar
presente em outros genes importantes da diferenciação e proliferação das células B, incluindo
Pax-5, IL-2, IL-4, CD20 e CD21 (Thevenin et al. 1993), CD36 (Corcoran et al. 2002), Btk
(Bruton’s tyrosine Kinase) (Brunner, Wirth, 2006) e BLR1/CXCR5 (Legler et al. 1998; Wolf
et al. 1998),
A seqüência ATGCAAAT é a região de ligação para fatores de transcrição da família
POU, cujos membros mais relevantes envolvidos no controle da expressão dos genes da IgH
são o Oct1 e o Oct2 (octámero) (Fig. 6) (Singh et al. 1986; Scheidereit et al. 1987; Kemler,
Schaffner,1990; Feldhaus et al. 1993).
Para a atividade específica da célula B, estes fatores de transcrição necessitam
interagir com o coativador denominado OCA-B (octamer coactivator from B cells) (Luo et al.
1992) cuja sinonímia é OBF.1 (Oct binding factor 1) (Strubin et al. 1995) e BOB.1 (B cell
Oct-binding protein 1) (Gstaiger et al. 1995). Todos estes fatores são largamente expressos na
Representação esquemática dos elementos de regulação do gene da cadeia
pesada da imunoglobulina do camundongo. As seqüências TATA (local de
fixação da RNA polimerase II; CTCATGA (heptámero) e ATGCAAAT
(octámero) sítio de ligação das proteínas Oct-1 e Oct-2, são importantes para a
função do promotor do gene. Há outra seqüência octamérica no ativador que se
encontra entre as regiões VDJ e a região constante (Cµ). Abreviaturas: V-
região variável; D-; J- segmento de junção. (Modificado de Kemler,
Schaffner,1990)
V D J Ativador Cµ
TATA
CTCATGA ATGCAAAT ATGCAAAT
Figura 6 -
Promotor
Oct-2 Oct-2
INTRODUÇÃO
9
linhagem B, enquanto que PU-1 também é expresso nas células mielóides (Fisher, Scott,
1998).
Quando foram exploradas as diferenças funcionais entre Oct-1 e Oct-2, usando
experimento com proteínas quiméricas em células híbridas, ficou evidente que Oct-2 é
essencial para as células que secretam Ig, tendo sido identificado o domínio C como a região
responsável pela função da proteína Oct-2 (Sharif et al. 2001, Salas, Eckhardt, 2003;
Concoran et al. 2004).
O mecanismo pelo qual IRF4 regula a troca de imunoglobulinas e a diferenciação para
plasmócito ainda não foi completamente elucidado, apesar das experiências com
linfócitos B Irf4
-/-
demonstrarem importante comprometimento no processo de troca de
imunoglobulinas e da diferenciação para plasmócito, como conseqüência da falha na indução
da transcrição dos genes aicda e prdm1(positive-regulatory-domain-containing 1),
respectivamente (Sciammas et al. 2006).
Foi proposto que IRF4 em baixas concentrações, como ocorre no início da
diferenciação para plasmócito, ativaria indiretamente o gene aicda em colaboração com o
fator de transcrição Pax5. À medida que a diferenciação vai ocorrendo, a expressão de IRF4
vai aumentando. Nesta fase, IRF4 induz o gene prdm1 que, por sua vez, aumenta a expressão
de Ifr4. A auto-regulação positiva entre IRF4 e Blimp1(B
lymphocyte-induced maturation
protein-1) gera o estado de diferenciação estável, necessária para a diferenciação do
plasmócito, onde Blimp1 reprime bcl-6 e Pax5 (Fig. 7) (Sciammas et al. 2006).
INTRODUÇÃO
10
Esta hipótese se baseia nos resultados de pesquisas que relataram que a deleção do
gene prdm1 em células B, quando estimulada pelo mitógeno LPS, levou à falha de resposta da
expressão do IRF4 (Kallies et al. 2004); e que a expressão ectópica de Blimp-1, na linhagem
M12 (linfoma B), elevou a expressão do gene Ifr4 e a secreção de imunoglobulinas e permitiu
a expressão do programa da diferenciação dos plasmócitos (Sciammas, Davis, 2004). Células
B deficientes de IRF4 apresentaram comprometimento da expressão da ativação induzida pela
deaminase e a perda da recombinação da troca de classe (Klein et al. 2006).
O papel da proteína Blimp-1, codificada pelo gene prdm1, foi estabelecido a partir de
estudos com camundongos manipulados geneticamente para não expressarem o gene prdm1.
Células B prdm1-/- são incapazes de desenvolver plasmócitos e de secretar imunoglobulinas
circulantes (Shapiro et al. 2003).
Blimp-1 exerce sua função inibindo genes que se expressam estritamente nas células
B, como o ativador do gene do complexo principal de histocompatibilidade classe II (CIITA),
Maturação de afinidade
e Troca de Ig
Diferenciação para plasmócito
Alto
Baixo
Proposta de regulação gênica do centro germinativo e a transição para
plasmócito. Concentrações baixas de IRF4 ativam indiretamente o gene aicda
que também é ativado pelo fator de transcrição PAX5. Concentrações altas
de IRF4 ativam diretamente o gene prdm1 que codifica o fator de transcrição
Blimp1. (Modificado de Sciammas et al, 2006).
Figura 7 -
INTRODUÇÃO
11
o gene pax5, o gene SpiB e o id3. A proteína SpiB é um fator transcricional importante na via
de sinalização e sobrevida da célula B madura. O gene id3 é o repressor do fator de
transcrição E2A, cuja função está relacionada com o desenvolvimento, sobrevida e
diversificação das imunoglobulinas. No processo de diferenciação terminal, também é
necessária a saída da célula B do ciclo celular, e Blimp-1 exerce esta função bloqueando o
gene c-myc e (Fig. 8) (Shaffer et al. 2002).
Outro fator de transcrição, que atua na diferenciação terminal da célula B para
plasmócito é a proteína XBP1(X-box binding protein-1), responsável pelo fenótipo secretor
do plasmócito. Camundongos que não expressam Blimp-1 também não expressam XBP1,
mostrando que funcionalmente XBP1 é transcrito na presença de Blimp-1 ou diretamente por
meio da repressão do gene pax5 (Shaffer et al. 2004).
Blimp1 também é importante para migração das células B que se diferenciam em
plasmócitos. Blimp1 reprime a expressão de CXC-quimioreceptor 5 (CXCR5) e induz a
expressão de CXCR4 e da α
4
-integrina. Estas mudanças podem causar a saída dos
Representação esquemática da interação do fator de transcrição Blimp-1 com
os genes envolvidos na diferenciação da célula B para plasmócito. A proteína
Blimp-1 atua bloqueando os genes de expressão restrita à célula B e à divisão
celular, e ativa o gene XBP1, responsável pelo fenótipo secretor do plasmócito
(Modificado de Shaffer et al. 2002).
Blimp-1
c-myc
CIITA
Spi-B
Id3
PAX5
Figura 8-
Plasmócito
B
XBP1
INTRODUÇÃO
12
plasmócitos dos folículos e migração para a medula óssea ou para as mucosas. Estas células
aumentam a expressão de CXCR4, que auxilia no direcionamento para a medula óssea, onde
as células do estroma produzem altas quantidades do ligante CXC-quimiocina 12 (CXCL 12).
São importantes, para a retenção dos plasmócitos na medula óssea, a E-selectina e a
molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM 1), expressas na superfície das células
estromais da medula óssea, além de polissacarídeos e integrinas expressos na superfície dos
plasmócitos. Os plasmócitos induzem as células estromais a produzirem interleucina-6 (IL-6).
O fator ativador da célula B (BAFF), provavelmente produzido por macrófagos ou células
dendríticas, ativa o receptor de maturação antígeno da célula B (BCMA) e junto com a IL-6
promovem sinais cruciais de sobrevida para os plasmócitos (Fig. 9) (Shapiro-Shelef, Calame,
2005).
INTRODUÇÃO
13
A regulação gênica do fenótipo do centro germinativo está sob forte regulação da
proteína BCL-6. Independentes linhas de pesquisas sugerem que a função de BCL-6, dentro
do CG, é reprimir genes envolvidos no processo da resposta imune, do controle do ciclo
celular através do p21 e do p27, da diferenciação da célula B à plasmócito e da apoptose (Fig.
10) (Shaffer et al. 2004).
Figura 9-
Medula óssea
Plasmócito
Centro germinativo
Gradiente de
citoquinas
núcleo
Célula estromal
Expressão gênica do plasmócito na medula óssea. Blimp1 reprime a expressão
de CXCR5 e induz a expressão de CXCR4 e da α
4
-integrina. Estas mudanças
permitem que o plasmócito deixe os folículos e migre para a medula óssea ou
p
ara as mucosas
(
Modificado de Sha
p
iro-Shelef, Calame, 2005
)
.
Migração para a medula óssea
INTRODUÇÃO
14
Uma das funções de BCL-6 é exercida a partir de sua ligação com o promotor do gene
PT53. Em material de experimentação, esta ligação preveniu a resposta apoptótica induzida
por baixos níveis de quebra de DNA, associada à hipermutação somática e à recombinação da
troca de imunoglobulinas. No entanto, quando o nível de lesão do DNA era alto, a expressão
de BCL-6 diminuía e as células migravam do centro germinativo ou entravam em apoptose
(Phan, Dalla-Favera, 2004).
Bcl-6 também atua sobre o gene prdm1 que codifica a proteína Blimp1. Esta função
ocorre simultaneamente com a ação de dois fatores de repressão transcricional: MITF
(microphthalmia-associated transcriptional factor) que inibe MUM1 e Pax5 que inibe XBP1
(Fig. 11) (Shapiro-Shelef, Calame, 2005).
Figura 10 -
Modelo de regulação gênica do fenótipo do centro germinativo. A proteína
BCL-6 é expressa nas células B do centro germinativo e exerce ação
supressora sobre genes que regulam a resposta imune, o controle do ciclo
celular e a diferenciação da célula B para plasmócito. Esta ação permite que
as células B escapem da resposta apoptótica durante a troca das
imunoglobulinas e da hipermutação somática, impedindo que as células se
dividam e se diferenciem rapidamente. No modelo também estão
representadas as alças regulatórias entre BCL-6 e p53 e BCL-6 e Blimp-1
(Modificado de Shaffer et al, 2004).
Cito/quimiocinas→ Resposta imune
Controle do ciclo celular
BCL-6
p53 (via p53RE)
p21 (via MIZ-1)
p27
B
Plasmócito
CENTRO GERMINATIVO
Diferenciação
Blimp-1
INTRODUÇÃO
15
A proteína BCL-6 é fosforilada em múltiplos sítios pelas quinases ERK-1 e ERK-2,
que pertencem à família das MAPKs (mitogen-activated protein kinases). Os sítios de
fosforilação estão localizados na região N-terminal da proteína, especificamente na região
denominada PEST, nas serinas 333 e 343 (Fig. 12). A fosforilação induzida por MAPK deixa
a proteína menos estável, permitindo sua degradação via ubiquina/proteosoma (Niu et al.
1998).
PAX5 BCL-6 MITF
Blimp1 IRF4
IgH
IgL
Cadeia J
XBP1
Igα
CD19
BLNK
AID
Centro Germinativo
Representação esquemática da regulação gênica do fenótipo do centro
germinativo. A ação dos fatores de transcrição assinalados permite que a célula
B responda à sinalização do BCR, à citoquinas, à estimulação TLR, à
proliferação, à troca de Ig e à afinidade de maturação com o antígeno
(Modificado de Shapiro-Shelef, Calame, 2005).
Fatores de transcrição
Proteínas
Figura 11 -
INTRODUÇÃO
16
A ativação do BCR pela MAPK e a inativação de BCL-6 devem ser vistas no contexto
da rede de sinalização deste receptor no CG. Células B pré-CG na zona do manto, local onde
as células B encontram o antígeno, expressam bcl-6-RNA, mas não expressam a proteína
BCL-6 (Cattoretti et al. 1995; Allman et al. 1996). Dentro do CG, a coexistência do antígeno
e a expressão de bcl-6 implicam na sinalização do antígeno-receptor, modulada por
mecanismos que permitem a estabilidade do BCL-6 (Cattoretti et al. 1997). Portanto, durante
a diferenciação pós-CG, a degradação induzida pelo antígeno pode servir como um
mecanismo rápido de regulação e redução da expressão de BCL-6, em sinergismo com a sub-
regulação transcricional da sinalização pelo CD40 (Cattoretti et al. 1997, Niu et al. 1998).
Também foi sugerido que esta redução de BCL-6 implica na expressão de Blimp1, e
que uma vez iniciada esta alça de retroalimentação, Blimp-1 atenuará a expressão de BCL-6,
mesmo após as células terem deixado o CG, encerrando a estimulação antigênica via BCR
(Shaffer et al. 2002).
A acetilação do bcl-6 ocorre na região PEST, requer o co-ativador p300 e rompe a
habilidade de recrutar desacetilases histônicas. A acetilação do bcl-6 ocorre fisiologicamente
nas células do CG e leva a inativação de sua função transcricional (Fig. 12) (Bereshchenko et
al. 2002).
POZ PEST Dedos de zinco
Terminal-N Terminal-C
Ser 333
Ser 343
Lis 379
Representação esquemática da proteína BCL-6. No terminal-N, encontra-se o
motivo POZ responsável pela atividade transcricional da proteína; no
terminal-C, estão os seis dedos de zinco que reconhecem seqüências
específicas de DNA. O motivo PEST encontra-se no terminal N, sendo a
região onde a proteína sofre fosforilação (ser 333 e 343) e acetilação (lis 379)
(Modificado de Bereshchenko et al, 2002).
Figura 12 -
INTRODUÇÃO
17
1.2 Linfoma não-Hodgkin
Linfomas não-Hodgkin são tumores sólidos das células linfóides, cuja caracterização
da célula que deu origem a cada um dos linfomas e é alvo constante de estudos.
Nos anos 70, conceitos importantes foram agregados aos estudos dos linfomas, como o
emprego de marcadores da superfície celular para distinguir as neoplasias linfóides de
linhagem B e T (Aisenberg, Bloch, 1972); a descrição do linfoma linfoblástico (Barcos,
Lukes,1973); o conceito de células do centro folicular, que resultou na Classificação de Kiel
(Lennert et al. 1973); a classificação baseada nas linhagens de células B e T (Lukes, Collins,
1974); a descrição da leucemia/linfoma de células T do adulto (Uchiyama et al. 1977) e a
caracterização do linfoma MALT (Isaacson, Wright, 1978).
No início da década de 1990, um grupo de 19 patologistas da Europa, EUA e Ásia,
após discutir aspectos morfológicos, imunológicos, genéticos e clínicos decidiram por
apresentar uma nova classificação para as neoplasias linfóides. Este trabalho culminou com a
publicação em 1994 da Classificação REAL (Revised European-American Classification of
Lymphoid Neoplasms) (Harris et al. 1994). Nesta classificação, foi proposto o termo linfoma
difuso de grandes B (LDGCB) para substituir e agregar as categorias centroblástico e
imunoblástico da Working Formulation (Rosemberg et al. 1982)
A Classificação REAL foi submetida à revisão e à atualização por um grupo de
clínicos e patologistas, patrocinados pela Organização Mundial da Saúde (OMS), que utilizou
elementos morfológicos e moleculares, resultando no reconhecimento de 36 subtipos de LNH:
15 de células T e 21 de células B. Na Tabela 1, estão representados os linfomas de células B
maduras, segundo a Classificação da OMS (Jaffe et al. 2001).
INTRODUÇÃO
18
Tabela 1 - Classificação da Organização Mundial de Saúde. Neoplasias de células B maduras
___________________________________________________________________________
• Leucemia linfóide crônica de células B/ linfoma de pequenos linfócitos
• Leucemia pró-linfocítica de célula B
• Linfoma linfoplasmocítico
• Linfoma da zona marginal esplênico
• Tricoleucemia
• Mieloma múltiplo
• Plasmocitoma solitário ósseo
• Plasmocitoma extra-ósseo
• Linfoma da zona marginal extranodal do tecido linfóide associado à mucosa (MALT)
• Linfoma da zona marginal nodal
• Linfoma folicular
• Linfoma de células do manto
• Linfoma difuso de grandes células B
• Linfoma de grandes células B intravascular
• Linfoma de grandes células B primário de efusões
• Linfoma /leucemia de Burkitt
___________________________________________________________________________
Fonte: Jaffe et al., 2001
1.2.1 Dados epidemiológicos
A incidência dos linfomas aumentou nas últimas décadas e as maiores taxas de
incidência foram registradas nas regiões desenvolvidas (América do Norte, Europa, Austrália
e Nova Zelândia), enquanto que as menores taxas estão no centro sul e na parte oriental da
Ásia (http://www.inca.gov.br).
No Canadá, a incidência de linfoma é de 14 casos por 100.000 habitantes por ano; na
Dinamarca e na Suécia, é de 10 casos por 100.000 por ano e, na Ásia, é de 03 por 100.000
habitantes por ano (Devesa, Fears, 1992).
Na América do Norte, houve acentuada elevação da incidência de linfoma no período
entre 1970 e 1989, 3% a 4%, fazendo com que esta neoplasia passasse a ser o 5
o
câncer mais
freqüente.
Naquele país, nos anos 90, a taxa de crescimento dos linfomas foi inferior a 1% ao
ano, com estabilização da taxa de incidência a partir deste período em 19,1 casos por 100.000
INTRODUÇÃO
19
habitantes. A American Cancer Society estimou, para o ano de 2006, 58.870 casos novos de
linfoma, sendo 30.680 homens e 28.190 mulheres e, para o ano de 2007, 63.190 casos novos,
sendo 34.200 homens e 28.990 mulheres. A mortalidade estimada é de 18.660 casos para
ambos os sexos, com 9.600 casos no sexo masculino e 9.060 no sexo feminino (Howe et al.
2001; Ries et al. 2001; Clarke et al. 2002; http://www.seer.gov).
No Brasil, para os Registros de Câncer de Base Populacional analisados, os maiores
valores da taxas médias anuais de incidência de linfoma não-Hodgkin (número de
casos/100.000 habitantes), ajustadas por idade no sexo masculino, foram constatadas no
Distrito Federal (Tab. 2), e as menores taxas foram registradas na cidade de Belém, Pará (Tab.
3) (Câncer no Brasil, Registros de Câncer de Base Populacional. 2003).
Tabela 2 - Taxas médias anuais de incidência de linfoma no Brasil, ajustadas por idade por
100.000 homens
Cidade Período Homens
Distrito Federal 1996-1998 14,1
São Paulo 1997-1998 13,0
Porto Alegre 1993-1997 11,0
Belém 1996-1998 2,0
Fonte: Câncer no Brasil, Registros de Câncer de Base Populacional. 2003.
Tabela 3 - Taxas médias anuais de incidência de linfoma no Brasil, ajustadas por idade e por
100.000 mulheres.
Cidade Período Mulheres
Distrito Federal 1996-1998 8,6
São Paulo 1997-1998 8,6
Recife 1995-1998 7,6
Belém 1996-1998 1,6
Fonte: Câncer no Brasil, Registros de Câncer de Base Populacional. 2003.
INTRODUÇÃO
20
1.2.2 Linfoma difuso de grandes células B
O linfoma difuso de grandes células B, o mais comum dos subtipos dos linfomas,
representa 30% a 40% dos casos em adultos, apresenta-se em sítios nodais mais
freqüentemente que em sítios extranodais e evolui com taxa de resposta completa à
quimioterapia de 40%, sendo esta a condição que prolonga a sobrevida.
Em 1993, o grupo de pesquisa, Projeto Internacional de Fatores Prognósticos em
Linfoma não-Hodgkin, propôs um modelo associando características clínicas (idade e
desempenho clínico), o valor sérico da dehidrogenase láctica e o estadiamento clínico
(classificação de Ann Arbor), a fim de estratificar os pacientes para a escolha do tratamento e
conseqüentemente prognosticar a evolução clínica. Este modelo, denominado Índice
Prognóstico Internacional (IPI), classifica quatro grupos de risco para o óbito, onde o grupo
de baixo risco tem probabilidade de sobrevida global (SG), em cinco anos, de 73% em que o
grupo de alto risco tem probabilidade de 26% (Tab. 4) (Shipp et al. 1993)
Tabela 4 - Distribuição dos grupos de risco do IPI e as taxas de probabilidade de sobrevida
global
Categorias Taxa de Sobrevida Global 5 anos (%)
Baixo risco 73
Baixo risco intermediário 51
Alto risco intermediário 43
Alto risco 26
Fonte: Shipp et al. 1993.
No entanto, uma proporção de pacientes classificados pelo IPI como tendo baixo risco,
evoluem desfavoravelmente; enquanto que outros, com alto risco, evoluem bem. A falha deste
modelo de risco em parte reflete a heterogeneidade biológica própria do LDGCB e aponta
para a necessidade de identificar fatores de risco paciente-específico.
INTRODUÇÃO
21
Em 2000, Alizadeh et al. usando a técnica de assinatura gênica a partir de arranjo de
DNA em matriz (DNA microarray), foram capazes de identificar duas formas distintas de
LDGCB com expressão de genes envolvidos em diferentes estágios de diferenciação,
proliferação e resposta do hospedeiro (Fig. 13). Um tipo, expressando genes característicos
das células do CG como, por exemplo, bcl-6, CD10 e CD38, que são genes associados à
diferenciação e genes menos conhecidos como o BCL-7A e o LMO2. Um segundo tipo,
expressando genes que normalmente são induzidos durante a ativação in vitro e in vivo das
células B como, por exemplo, o MUM1/IRF4 e dois genes cujos produtos inibem a apoptose,
FLIP e o bcl-2. Os pacientes com LDGCB-CG tem SG melhor do que aqueles com LDGCB-
semelhante a células ativadas, 76% vs 16%, respectivamente, p = 0,01.
FIGURA 1
3
–
Assinatura gênica em matriz de cDNA dos distintos tipos de LDGCB. No
painel da direita, estão representadas as expressões gênicas de amostras de
células B normais. À esquerda, estão representadas as expressões gênicas
de amostras de tecido tumoral de LDGCB. As imagens vermelhas
representam a expressão gênica; os espaços verdes representam a ausência
de expressão gênica. Fonte: Alizadeh et al. 2000.
INTRODUÇÃO
22
Rosenwald et al. em 2002, aplicando tecnologia utilizada por Alizadeh, além de
identificar os mesmos subgrupos de LDGCB, identificaram um terceiro grupo que foi
denominado tipo 3. Este grupo não expressa características gênicas de CG nem de células B
ativadas, mas apresenta taxa de SG similar ao subgrupo células B ativadas, 39% e 35%,
respectivamente. Além do relato deste subgrupo, os autores observaram que a translocação
t(14;18) (q32:q21) e a amplificação do gene c-rel só foram detectadas no CG e confirmaram
que a taxa de SG é maior neste subgrupo, 60%. Os autores foram mais além nas pesquisas e
investigaram se havia diferença entre estes subgrupos e as variantes morfológicas
reconhecidas na Classificação da OMS; no entanto, nenhuma diferença na incidência foi
encontrada.
Shipp et al. em 2002, analisando a expressão de 6.817 genes, estabeleceram um
algorítimo classificando duas categorias diferentes de pacientes: os que curam e os que
apresentam doença refratária, com diferentes taxas de sobrevida global em cinco anos (70%
vs 12%). Os genes implicados nestes resultados incluem alguns que regulam a resposta à
sinalização do RCB, a via de fosforilação serina/treonina e a apoptose.
1.2.2.1 CD10
CD10 é uma enzima proteolítica expressada em uma variedade de células, incluindo
células B precursoras e células epiteliais.
Na linhagem de células B, o CD10 é expresso nas células pró-B e pré-B, desaparece
durante as outras fases de diferenciação, reaparece no centro germinativo, durante a fase de
maturação antígeno-dependente e, assim, serve como marcador do CG.
O gene que codifica o CD10 está localizado no cromossomo 3 na região 3q21-q27.
Sua expressão corresponde à glicoproteína de cadeia simples de 100 kd, pertencente à classe
das exoenzimas, enzimas cuja atividade é exercida no lado externo da membrana
INTRODUÇÃO
23
citoplasmática, no ambiente extracelular. O CD10 hidrolisa pequenos polipeptídeos como as
encefalinas, a substância P, a endotelina, a bradicinina, a angiotensina e a bombesina. O CD10
tem vários sinônimos: common acute lymphocytic leukemia antigen (CALLA), encefalinase,
membrana metaloendopeptidase (MME), endopeptidase neutra associada à membrana (NEP)
e neprilisina (Shipp et al 1993; Salmi, Jalkanen, 2005).
A expressão do CD10 pode ser detectada por citometria de fluxo (Fang at al. 1999) ou
por reação imunoistoquímica (Dogan et al. 2000). Os anticorpos anti-CD10, usados
inicialmente em estudos de imunoistoquímica, funcionavam somente em tecidos a fresco ou
congelados. O anticorpo monoclonal anti-CD10 (clone 56C6) utilizável em material
parafinado, foi disponibilizado comercialmente em 1999, permitindo estudos clínicos
retrospectivos (McIntosh et al. 1999). Em 2000, Chu et al publicaram os resultados
concordantes do estudo comparativo entre a expressão de CD10, obtida por citometria de
fluxo em doenças hematológicas, e a expressão de CD10 obtida por imunoistoquímica (Chu et
al. 2000).
Nas neoplasias hematológicas, o CD10 é expresso no linfoma de Burkitt, nos linfomas
foliculares e no LDGCB, enquanto que os linfomas MALT e linfomas das células do manto
não expressam CD10.
Na literatura, a análise da expressão do CD10 como fator prognóstico no LDGCB é
controversa (Tab. 5). Oshima et al. em 2001, analisando uma série de 138 pacientes com o
objetivo de avaliar o significado clínico da expressão do CD10 no LDGCB, encontrou
positividade de 28% e probabilidade de SG de 68%, em cinco anos, enquanto que os pacientes
sem expressão imunoistoquímica do CD10 apresentaram 48% de probabilidade de SG, com
diferença estatística significante (p = 0,031). A expressão de CD10 no grupo de baixo risco do
IPI representou um prognóstico melhor quanto à SG (93% vs. 71%), o que não foi observado
INTRODUÇÃO
24
no grupo de alto risco (25% vs 20%). Os autores concluíram que a expressão de DC10 pode
ser útil como fator prognóstico, se combinada com os parâmetros clínicos.
Colomo et al. em 2003, estudando uma série de 127 pacientes, encontrou positividade
imunoistoquímica para CD10 em 72% dos casos, no entanto, não foi observada diferença
estatística quanto a SG e a SLD. Resultados semelhantes foram observados por Fabiani, em
2004, que observou que a expressão do CD10 não se correlacionou com os parâmetros
clínicos, com os grupos de risco do IPI e ou as taxas de SG e de SLE. Hans et al., em 2004,
estudando uma série de 152 pacientes, encontrou positividade para CD10 em 28% e impacto
sobre a SG (p = 0,019).
Andrade, em 2006, analisando uma série de 104 casos, encontrou positividade para
CD10 em 21% dos casos e sobrevida câncer específica, maior, embora sem diferença
estatística (p = 0,155). Mais recentemente, em 2006, Muris et al. relatam que a análise
multivariada, incluindo vários marcadores (CD10, BCL-6, MUM1, BCL-2, XIAP e cFLIP),
revelou o BCL-2 como o fator prognóstico mais forte, seguido de CD10 e MUM1 (Muris et
al. 2006).
INTRODUÇÃO
25
Tabela 5 – Dados referentes ao impacto da expressão do CD10 na sobrevida global
Autor
(ano)
Critério de
Positividadde
Expressão
%
Número
de
Pacientes
Sobrevida Global
Expressão
Período positiva negativa p
% %
Ohshima
(2001)
20 28 138 5 anos 68 48 . <0,031
Hans
(2004
30 28 152 5 anos 74 44 0,019
Colomo
(2003)
25 21 128 NS
Fabiani
(2004)
10 34 98 NS
Biasoli
(2005)
5 21 86 NS
Berglund
(2005)
30 35 161 5anos 57 40 0,04
De Paepe
(2005)
30 40 153 NS
Muris
(2006)
10 23 71 5 anos 63 36 0,03
1.2.2.2 BCL-6
O gene bcl-6 (B-cell lymphoma 6), clonado no cromossomo 3, banda q27 (Baron et al.
1993; Ye et al. 1993), expressa uma proteína nuclear de 95-Kd, membro da família dos
fatores de transcrição POZ/BTB (Pox-virus zinc finger/bric-a-brac, tramtrack, broad complex)
(Chang et al. 1996) que funciona como um repressor transcricional, sendo importante para a
formação do CG, exercendo sua função mediante ligação a diversas proteínas (Miles et al.
2005).
A análise, realizada pela técnica de DNA microarray, identificou no bcl-6, um sítio
com 110 pb, localizado na região 5' do íntron 1 onde freqüentemente são encontradas
INTRODUÇÃO
26
alterações como translocação, mutação e deleção nos linfomas e, por este motivo, esta região
foi denominada TMDR (translocação, mutação, deleção). Na TMDR, também foi detectado
um sítio de ligação específica para gene p53, composto por uma seqüência de consenso 5'-
RRCWWGYYY-3', separada por 0-13 pb, em que R corresponde a A ou G; W corresponde a
A ou T e Y a C ou T. Este sítio foi denominado p53RE (response element) (Fig. 14) (Margalit
et al., 2006).
Estudos moleculares e citogenéticos, realizados em LDGCB de novo, têm
demonstrado a presença de translocações no gene bcl-6 o que sugere que estas lesões podem
derivar de recombinações ilegítimas após quebras de DNA de dupla-hélice, geradas durante o
processo de rearranjo da diversidade variável (VDJ), da recombinação da troca de classes e/ou
hipermutação somática dos genes da Ig. As translocações do locus do gene bcl-6 t(3q27)
ocorrem em 40% dos casos de LDGCB, sendo as mais características e freqüentes
anormalidades genéticas nestes linfomas. Como resultado das translocações, há substituição
do promotor do bcl-6 e envolvimento com os genes da Ig nas bandas 14q32, 2p12 e 22q11.
Outras combinações em outros loci de outros cromossomos têm sido observadas, fenômeno
denominado translocação promíscua.
2
345678910
1
5' 3'
TMDR
1Kb
Figura 14 -
Representação esquemática do gene bcl-6 humano. A região TMDR
contém110 pb e está localizada na região 5
'
do íntron 1. Nesta região, encontra-
se um sítio de ligação específico (response element) para o gene p53 (p53RE).
A ligação do p53 ao sítio BCL-6p53RE leva à ativação transcricional do gene
bcl-6 com indução de RNAm e expressão protéica de BCL-6. (Modificado de
Mar
g
alit et al., 2006
)
.
INTRODUÇÃO
27
Os promotores heterólogos de bcl-6 exibem atividade oncogênica e previnem a
subregulação de bcl-6. Em adição às translocações, pequenas deleções e pontos de mutação
somática ocorrem na região regulatória 5' não transcrita de bcl-6 (Lossos, Levy, 2000). Estas
alterações permitem que o bcl-6 escape do controle regulatório ao qual está submetido
regularmente e favoreça a parada da diferenciação, proliferação contínua, sobrevida e
instabilidade genética, condições que favorecem a transformação neoplásica (Lossos, 2005).
Os estudos iniciais, que investigaram o significado prognóstico destas alterações,
falharam em encontrar aumento de sobrevida nos casos que exibiam rearranjo ou mutação de
bcl-6 (Bastard et al. 1994; Pescarmona et al. 1997; Kramer et al. 1998; Capello et al. 2000;
Jerkeman et al. 2002).
No entanto, estudo mais recente, usando a detecção de RNAm e a expressão protéica
de BCL-6, encontrou correlação positiva entre a expressão de BCL-6 e a probabilidade de
sobrevida, além de ser observado valor preditivo independente quando comparado ao IPI
(Tab. 6) (Lossos et al. 2001).
Hans et al. em 2004, numa série de 152 pacientes, encontraram positividade para
BCL-6 em 56% dos casos e probabilidade de SG de 69% em cinco anos enquanto que os
casos BCL-6 negativo apresentaram 30% de probabilidade de SG para o mesmo período de
tempo (p = <0,001).
Winter et al. em 2006, encontraram positividade para BCL-6 de 77% e taxa de SG de
61%, enquanto que os pacientes com expressão negativa de BCL-6 evoluíram com taxa de
probabilidade de sobrevida em dois anos de 17% (p = 0,001).
INTRODUÇÃO
28
Tabela 6 – Dados referentes ao impacto da expressão do BCL-6 sobre a sobrevida global
Autor
(ano)
Positividade
Imunoistoquímica
%
Número
de
Pacientes
Expressão
na
Amostra
%
Taxa de Sobrevida Global
Período Expressão p
positiva negativa
% %
Lossos
(2001)
10 61 10 71 24 0,007
Colomo
(2003)
25 72 25 NS
Hans
(2004)
30 56 30 5 anos 69 30 <0,001
Berglund
(2005)
30 48 30 5 anos 64 28 0,00003
De Paepe
(2005)
30 70 30 NS
Muris
(2006)
10 58 10 NS
Winter
(2006)
50 77 50 2 anos 77 17 < 0,001
1.2.2.3 IRF4/MUM1
O IRF4 é um membro da família dos fatores de regulação do interferon (IRF),
caracterizado por um domínio específico de ligação com os elementos regulatórios dos
promotores dos genes induzidos pelos interferons. Diferentemente dos outros IRFs, sua
expressão não é regulada pelos Interferons tipo I e II (Billiau, 2006).
O IRF4 tem a seguinte sinonímia: Pip – PU.1 interaction partner (Eisenbeis et al.
1995), LSIRF -lymphoid-specific interferon regulatory factor (Matsuyama 1995), ICSAT-
interferon consensus sequence activated T cells (Yamagata et al. 1996) e MUM1/IRF4 -
multiple myeloma oncogene 1/interferon regulatory factor 4 (Iida et al. 1997).
INTRODUÇÃO
29
A expressão do MUM1 é restrita às células do sistema imune, incluindo linfócitos,
células dendríticas e macrófagos. MUM1 exerce várias funções, incluindo proliferação,
apoptose e diferenciação celular. Esta gama de ações pode ser explicada pela interação com
fatores de transcrição como PU.1, E2A e SpiB (Eisenbeis et al. 1995), E47 (van der Stoep,
2004) STAT-6 (Gupta et al 1999) e IRF8 (Lu, 2003), que influenciam sua atividade
transcriciona (Figura l5).
Na linhagem B, MUM1 tem expressão bifásica sendo expresso nas células imaturas da
medula óssea (Lu, 2003. Lazorchak et al. 2006) e numa subpopulação de centrocitos no CG e
nos plasmócitos (Falini et al. 2000).
A expressão de MUM1, em tecidos linfóides normais e reativos, é limitada ao núcleo.
Algumas vezes, a expressão é detectada no citoplasma de plasmócitos e em uma pequena
porcentagem (5%) de células da zona clara do CG. Estas células, na zona clara, apresentam
um fenótipo peculiar (MUM1 + /BCL-6 - /Ki-67 -), sendo considerado que a expressão de
MUM1 pelas células do CG corresponde à fase final da diferenciação da célula-B. Estas
células mantêm a expressão de MUM1 e passam a expressar CD138, necessária para
µ
µ, κ/λ
µ, Vpré-B,λ5
IRF4,8
PU. 1/Spi.B
BCR
Vpré-B,
λ
5 Ig
κ
/
λ
pré-BCR
Célula pré-B proliferativa Célula pré-B quiescentes Célula B imatura
Modelo de controle transcricional da transição da célula pré-B para B. Os
fatores de transcrição IRF4 e IRF8 promovem a diferenciação, induzindo a
transcrição e o rearranjo do gene da cadeia leve da imunoglobulina. Neste
processo, IRF4e IFR8 se ligam aos ativadores de κ e λ com a colaboração de
PU.1 (Modificado de Lu, 2003)
Figura 15 -
INTRODUÇÃO
30
progredir no processo de diferenciação para a fase de plasmócito ou de célula memória
(Gaidano, Carbone, 2000; Falini et al. 2000; Ponzoni et al. 2007).
Diferentemente das células normais, em que a expressão de MUM1 e de BCL-6 são
excludentes, no LDGCB ambas podem ser expressas simultaneamente, sugerindo distúrbio de
regulação (Falini et al. 2000).
A expressão de MUM1 no LDGCB é relatada entre 21% e 73% e seu impacto na
evolução dos casos tem diferentes relatos na literatura. Há autores que observaram que a
expressão de MUM1 foi associada com sobrevida global menor (Hans et al. 20004; Muris et
al. 2006) enquanto que outros não observaram impacto sobre a evolução (Tab. 7) (Colomo,
2003; De Paepe et al. 2005).
Tabela 7 – Dados referentes ao impacto da expressão do MUM1 sobre a sobrevida global
Autor
(ano)
Positividade
Imunoistoquímica
%
Número de
Pacientes
Expressão
na Amostra
%
Taxa de Sobrevida Global
Período Expressão p
positiva negativa
% %
Colomo
(2003)
25 21 25 NS
Hans
(2004)
30 47 30 5 anos 36 66 009
De Paepe
(2005)
30 58 30 NS
Muris
(2006)
10 65 10 5 anos 31 59 0,01
1.2.2.4 OCT-2
O OCT-2 é um fator transcricional requerido na formação do CG e na resposta imune,
sendo considerado um fator de sobrevida celular. Na linhagem BL64 (linfoma de Burkitt), foi
observado que o OCT-2 atua sinergicamente com o NFκB na ativação do receptor
INTRODUÇÃO
31
BLR1/CXCR5 (receptor de quimiocinas envolvidas com a migração dos linfócitos) (Wolf et
al. 1998). Em células B normais e linhagem de células de LDGCB, o OCT-2 atua como fator
de transcrição do gene da cadeia pesada da Ig (Sepúlveda et al. 2004). Recentes investigações
têm mostrado que o OCT-2 atua como fator de sobrevida nas células de linfomas com a
translocação t(14;18), agindo diretamente sobre a região promotora do gene bcl-2 (Heckman
et al. 2006).
As células do CG mostram forte expressão destes fatores de transcrição e estudos
realizados com imunoistoquímica têm demonstrado seletiva expressão de OCT-2 em linfomas
derivados do CG; sendo assim, a identificação da expressão deste fator de transcrição pode
auxiliar na definição da fase de desenvolvimento da célula B e, conseqüentemente, do linfoma
(Greiner et al. 2000; Sáez et al. 2002; McCune et al. 2006, Ponzoni et al. 2007).
Nos pacientes portadores de LDGCB, a expressão de OCT-2 está associada à evolução
desfavorável como a recidiva pós-quimioterapia e imunoterapia (Chu et al. 2006).
1.2.3 Apoptose
A apoptose é um processo ATP-dependente, caracterizado por uma série de mudanças
específicas na célula. Para a execução deste processo, é necessário que proteases (caspases),
regularmente expressadas pelas células na forma de pró-enzimas, sejam ativadas. Estas
proteases são divididas em ativadoras (caspase 8, 9, 10 e 12) e efetoras (caspases 3, 6 e 7).
Quando ativadas, as caspases destroem a célula por meio da degradação de proteínas
vitais, como as que constituem a estrutura celular, as proteínas que controlam o ciclo celular e
as proteínas de reparo do DNA (Wilson, 2006; Muris et al; 2006). A ativação deste processo
tem sido alvo de constantes pesquisas e três vias de ativação já foram descritas: a via
extrínseca, a via intrínseca e a via induzida pela granzima (Fig. 16).
INTRODUÇÃO
32
A via de ativação da granzima, relacionada com a ação dos linfócitos T CD8+,
desencadeia a clivagem da pró-caspase 9, da pró-caspase 8 e da pró-caspase 3.
A via extrínseca é induzida a partir da ativação dos receptores TNFR1, Fas; DR3;
TRAIL-R1 e R2 e desencadeia a ativação da pró-caspase 8 e da pró-caspase-3.
Lesões do DNA, induzidas por radiação ionizante e drogas citotóxicas, sinalizam a
transcrição de genes envolvidos com a execução da apoptose pela via intrínseca, estresse-
induzido, p53 dependente.
Lesões sofridas pelo retículo endoplasmático também ativam a via intrínseca-p53
independente pela ativação da pró-caspase 12, seguida pela caspase 9 e finalizando na caspase
3 (Fig. 17). As alterações na expressão e inter-relação das proteínas envolvidas na apoptose
têm sido associadas à resistência à quimioterapia e ao impacto na evolução do LDGCB
(Alenzi et al. 2004).
Vias da apoptose. A via extrínseca é induzida a partir da ativação dos
receptores TNFR1, Fas; DR3; TRAIL-R1 e R2. A via intrínseca, estresse-
induzida é ativada por lesão do DNA. A granzima liberada pelos linfócitos T
CD8+ tem a capacidade de ativar tanto a pró-caspase 9 quanto a pró-caspase
8. Modificado de Wilson, 2006.
Figura 16 -
Via extrínseca
Via intrínseca
Apoptose
STAT-1
Survivina
INTRODUÇÃO
33
1.2.3.1 Proteína p53
O gene TP53 é um gene supressor de tumor, que atua como um fator de transcrição
multifuncional e está envolvido no controle do ciclo celular, na diferenciação e na replicação
celular, no reparo do DNA e na manutenção da estabilidade do genoma.
O seqüenciamento do promotor do gene TP53 revelou duas seqüências homólogas
àquelas de ligação de BCL-6 e experimentos com vetores foram capazes de bloquear a
expressão de p53 na presença de BCL-6. Em contrapartida, experimentos realizados com
células que apresentam mutação nos sítios de ligação do BCL-6 foram capaz de expressar
níveis normais de TP53.
Ativação da via intrínseca independente do p53. A via intrínseca pode ser
induzida por lesões sofridas pelo retículo endoplasmático que ativa a pró-caspase
12, que por sua vez ativa a pró-caspase 9. Fonte: Muris et al, 2006.
Figura 17 -
INTRODUÇÃO
34
Estas observações permitiram formular a hipótese de que, nos centros germinativos,
em que a expressão de BCL-6 é alta e de p53 é nula, a função do BCL-6 seria permitir que as
células B tolerassem as quebras fisiológicas de DNA que acontecem durante o processo de
recombinação gênica, na troca de classes da imunoglobulina e na hipermutação somática.
Assim, a supressão de p53 preveniria a parada do ciclo celular e a apoptose, facilitando a
rápida expansão do centro germinativo (Phan, Dalla-Favera, 2004).
A atividade transcricional do p53 sobre o gene bcl-6 foi testada in vitro, em
experimento utilizando células linfoblastóides humanas e células da linhagem U2OS (sarcoma
osteogênico humano) submetidas à quimioterapia com doxorubicina. Inicialmente, foi
detectada a elevação do nível de p53, em seguida foi observada a ligação do p53 ao BCL-
6p53RE e, finalmente, a ativação transcricional do gene bcl-6 com indução de RNAm e
expressão da proteína BCL-6 (Margalit et al., 2006).
A mesma atividade transcricional ocorre in vivo. Pacientes submetidos à quimioterapia
e radioterapia com radiação γ apresentam níveis séricos elevados de BCL-6RNAm, de
p21RNAm e de suas proteínas. O aumento do RNAm de BCL-6, in vitro, foi atenuado quando
foi utilizado o inibidor do p53 PFTα (Pifithrin-α) (Margalit et al., 2006).
Estes resultados levaram os autores a sugerir que a expressão de p53 está sob ativa
repressão pelo BCL-6, em condições normais no centro germinativo e que esta condição é
possível por meio de uma alça regulatória na qual o p53 aumenta a expressão do BCL-6, que
em contrapartida suprime a expressão do p53 (Lossos, 2006).
Mutação do gene TP53, inativação causada por oncoproteínas virais, modulação
realizada pela proteína MDM2 e pelo fator de transcrição BCL-6 são causas de inativação da
proteína p53 (Soussi, 2000; Sánches-Beato, 2003; Margalit et al. 2006; Lossos, Morgensztern,
2006; Lossos, 2006).
INTRODUÇÃO
35
Enquanto a proteína normal tem meia vida de aproximadamente 20 minutos, a
proteína resultante do gene com mutação tem sua meia-vida aumentada em horas, além do
aumento da estabilidade molecular. Mesmo que a correlação entre as mutações do TP53 e a
expressão protéica detectada pelo método imunoistoquímico não seja perfeita, este método
tem sido usado largamente na prática diária (Lossos, Morgensztern, 2006).
No LDGCB, o impacto do p53 como fator prognóstico é controverso. Kramer et al. em
1996, relataram que a expressão de p53 esteve relacionada aos casos que apresentavam
doença mais extensa, sem, no entanto, influenciar a evolução dos casos (Tab. 8).
Ichikawa et al. em 1997, observaram que os pacientes portadores de LDGCB que
expressaram p53 evoluíram com probabilidade de SG, em cinco anos, menor, 16% vs 64%
(p<0,001). Zhang et al. em 1999, relataram que nos casos p53 positivo, a probabilidade de
SLD foi de 37% em cinco anos e que, nos casos p53 negativo, a probabilidade de SLD
encontrada foi 60% (p=0,01).
Leroy et al. em 2002, detectaram mutação no gene TP53, nos exons 5-8, em 16 casos
de 69 pacientes portadores de LDGCB de baixo risco e baixo risco intermediário do IPI e
menor probabilidade de sobrevida. Também foi observada a associação entre a mutação do
gene e a expressão imunoistoquímica da proteína e, na análise multivariada, a mutação
constituiu o único parâmetro que mostrou impacto sobre a evolução dos casos.
Na casuística analisada por Sohn et al. em 2003, a expressão de p53 não apresentou
impacto na evolução e, na análise multivariada, apenas o IPI e tumores de grandes dimensões
apresentaram-se como fatores prognósticos independentes.
Maartense et al. em 2004, analisando o impacto da expressão de p53 em diferentes
faixas etárias (<65 anos de idade e >65 anos), observaram impacto negativo da expressão do
p53 no grupo de pacientes mais jovens, tanto na taxa de RC e na SLD. Nenhum impacto foi
INTRODUÇÃO
36
observado na evolução dos pacientes com idade superior a 65 anos. Neste grupo, somente o
IPI foi capaz de identificar os pacientes de pior prognóstico.
Andrade, em 2006, também observou impacto sobre a evolução analisando uma série
de 104 casos, constatando que os pacientes que expressaram p53 evoluíam com probabilidade
de sobrevida câncer-específica 32% versus 63%, (p = 0,024). Enquanto que, Domingues, em
2006, não observou impacto na evolução de sua casuística.
Tabela 8 – Dados referentes ao impacto da expressão do p53 sobre a sobrevida global
Autor
(ano)
Positividade
Imunoistoquímica
%
Número
de
Pacientes
Expressão
na
Amostra
%
Taxa de Sobrevida Global
Período Expressão p
positiva negativa
% %
Kramer
(1996)
50 13 13 NS
Ichikawa
(1997)
PCR 22 22 5 anos 16 64 <0,001
Zhang
(1999)
1 58 58 NS
Leroy
(2002)
10 23 23 6 anos 44 79 0,01
Colomo
(2003)
25 28 28 NS
Sohn
(2003)
30 23 23 NS
Maartense
(2004)
50 18 18 5 anos
<65 anos 44 57 0,04
>65 anos 33 23 0,47
Domingues
(2006)
Intensidade/
coloração
41 41 NS
Andrade
(2006)
Intensidade/
coloração
47 47 5 anos 32 77 0,024
INTRODUÇÃO
37
1.2.3.2 Survivina
O gene que codifica a survivina encontra-se no cromossomo 17 e transcreve diferentes
isoformas da proteína, incluindo: survivina regular, survivina-2B, survivina-∆Ex-3, (Mahotka
et al 1999; Conway et al. 2000), survivina-3B (Badran et al. 2004) e survivina 2α (Caldas et
al. 2005). A interação e o mecanismo de ação entre as isoformas da survivina ainda é
controverso. Há autores que sugerem que as diversas funções da survivina podem ser
explicadas, em parte, por sua capacidade de formar heterodímeros com suas variantes (Caldas
et al. 2005), enquanto que outros argumentam que as isoformas survivina-2B e survivina-
∆Ex-3, apesar de apresentarem alta afinidade com a survivina regular in vitro, têm baixa
afinidade com a survivina in vivo. Também foi demonstrado que a superexpressão das
isoformas 2B e -∆Ex-3 não foi capaz de impedir a progressão do ciclo celular, sugerindo que
estas isoformas não atuam como competidores da survivina (Noton et al. 2006).
A survivina é uma proteína bifuncional, que atua como supressora da apoptose
(Ambrosini et al. 1997; Li et al. 1999) e como promotora da proliferação celular (Fig. 18)
(Carvalho et al. 2003, Rosa et al. 2006; Colnaghi et al. 2006). A survivina é detectada no
citoplasma e no núcleo, na proporção de 6:1, respectivamente (Kornacker et al. 2001;
Johnson, Howerth, 2004). A survivina regular e a survivina-2B são predominantemente
citoplasmáticas, enquanto que a survivina-∆Ex-3 é primariamente nuclear (Mahotka et al.
2002). Os dados da literatura sugerem que a survivina nuclear desempenha a função de
promoção da proliferação celular, enquanto que a survivina citoplasmática atua no controle da
sobrevida (Li et al. 2005; Altieri, 2006).
INTRODUÇÃO
38
Em tecidos normais a survivina é abundantemente expressa nos tecidos fetais e
indetectada nos tecidos diferenciados adultos (Kornacker et al; 2001). Sua superexpressão
ocorre em uma variedade de tecidos tumorais, correlacionando-se com comportamento
agressivo, com diminuição de resposta à quimioterapia e com menor sobrevida. Por esses
motivos, a survivina é considerada fator de mau prognóstico (Schmidt et al. 2003; Johnson,
Howerth, 2004; Caldas et al. 2006).
Kuttler et al. em 2002, analisando a relação entre a expressão de 34 genes envolvidos
no controle do ciclo celular e da apoptose, em uma série de 27 casos de LDGCB, encontraram
positividade para o RNA mensageiro da survivina em 80% dos casos, sem observar diferença
estatisticamente significante na SG. No entanto, os autores identificaram uma relação
preferencial entre a superexpressão da ciclina B e da survivina, o que sugere haver promoção
específica no nível da transição G2/M. Este fenótipo caracteriza a célula ativada e enfatiza um
Cromátides
Microtúbulos
despolimerizados
Tubulina
Complexo cromossomal
Microtúbulos
polimerizados
Modelo para a função da survivina na formação do fuso mitótico. A survivina
regula a dinâmica dos microtúbulos nos cinetócoros por mecanismo dependente
do complexo cromossomal e, por um segundo mecanismo, independente desta
via. Modificado de Altieri, 2006.
Figura 18 -
INTRODUÇÃO
39
dos mecanismos de ação da survivina no ciclo celular, que é a promoção da proliferação
celular via mitose.
Adida et al. em 2000, na série de 222 casos, além de observar diferença estatística
significante na SG, entre os casos com expressão da survivina, também identificaram, na
análise multivariada, que a expressão da survivina e o IPI são fatores prognóstico
desfavoráveis no LDGCB.
Watanuki-Miyauchi et al. em 2005, em um trabalho prospectivo com 60 casos de
LDGCB, detectaram 60% de positividade para a expressão da survivina. Os casos que
expressaram survivina evoluíram com pior prognóstico (p=0,01). Por este motivo, os autores
sugerem que a survivina deva ser considerada fator preditivo de evolução.
Domingues, em 2006, em uma série de 75 casos, observou probabilidade de sobrevida
menor nos casos que expressaram survivina citoplasmática, quando comparados com aqueles
cuja expressão fora nuclear ou nuclear/citoplasmática (p<0,0001).
1.2.3.3 STAT-1
As proteínas STATs (signal transducers and activators of transcription) participam da
vias de sinalização do EGFR, PDGFR (receptores ligados à membrana citoplasmática com
atividade de tirosina quinase), do protooncogene Src, das proteínas Bcr-Abl e Janus tirosinas
quinases (JAKs), que são associadas aos receptores de citoquinas, como interleucinas e
interferons (Haura, 2005). Todas as STATs apresentam topografia comum e são organizadas
em três domínios funcionais distintos, que incluem: o domínio de ligação ao DNA, o domínio
de dimerização e o domínio de ativação transcricional (TAD) (Fig. 19).
INTRODUÇÃO
40
No terminal NH2, ocorre a interação entre os dímeros de STAT-1 fosforilados (ligados
ao DNA) e a interação entre monômeros citoplasmáticos não fosforilados (importante na
ativação do receptor e na translocação para o núcleo). No domínio SH2, está a tirosina 701,
que é fosforilada a partir do estímulo de ligantes com o IFNγ. O domínio TAD e o resíduo de
serina (importante na otimização do processo de transcrição) estão no terminal COOH. O
domínio de ligação ao DNA está localizado no centro da proteína.
A ligação do IFNγ a seu receptor de membrana desencadeia uma cascata de
fosforilação que se inicia pela fosforilação do próprio receptor, que recruta e ativa as proteínas
quinases JAK1 e JAK2 e, em seguida, STAT-1, que é fosforilada na tirosina 701. Uma vez
ativada, STAT-1 é liberada do complexo receptor-JAKs e homodimerizada pela interação
recíproca entre a tirosina 701 e o domínio Src-homólogo 2 (SH2). Esta mudança estrutural
permite alta afinidade com o sítio de ligação do DNA. Os homodímeros são translocados até o
núcleo (Fig. 19) (Schindler, 1998).
Fosforilação da tirosina 701
Domínio de
li
g
a
ç
ão ao DNA
TAD
Tetramerização
Domínio-N
100 400
200
300
500 600
COOH
700
Domínio-SH2
p-S
p-Y
NH2
Dimerização Ativação transcricional
Diagrama representando a proteínas STATs. No terminal NH2, interação entre
dímeros de STATs. No domínio SH2, tirosina 701, fosforilada a partir do
estímulo do IFNγ. Domínio de ligação ao DNA, centro da proteína. Domínio de
ativação transcricional (TAD) e o resíduo de serina no terminal COOH.
(Modificado de Mitchell, John 2005).
Figura 19 -
INTRODUÇÃO
41
A habilidade do interferon em inibir o crescimento de certos tipos celulares é
dependente de membros da família de fatores de transcrição STAT. Esta ação se faz mediante
da regulação da expressão de inibidores do ciclo celular (Mui, 1999).
Estudos recentes revelaram que STAT-1, 3 e 5 movimentam-se entre o citoplasma e o
núcleo, em forma de dímeros não fosforilados, sem o estímulo de citoquinas. Enquanto estas
formas não fosforiladas movimentam-se livremente, a forma fosforilada é retida no núcleo, só
sendo liberada após a desfosforilação realizada por fosfatases nucleares. Estas observações
sugerem que a retenção da STAT-1 fosforilada é um importante aspecto no processo de
ativação das citoquínas. Uma vez no núcleo, os dímeros de STAT-1 ligam-se às áreas de
reconhecimento do DNA, denominadas seqüência de ativação gama (GAS), que regulam os
genes estimulados pelo interferon (ISG) (Figura 20) (Schindler, 1998, Mui 1999; Mitchell,
John, 2005).
2.
IFN-
γ
Membrana cito
p
lasmática
α
Jak1
Ja
k
2
GAS
Gene
Núcleo
Stat1
Stat
P
Stat1
Stat1
P
β
1.
3.
ISG
Mecanismo de ação do interferon
γ
(IFN-
γ
). Pela ação do IFN
γ
, os
receptores com atividade de tirosina quinase tornam-se ativados, pois este
complexo recruta e fosforila STAT-1 na tirosina 701 (1.). Uma vez ativado,
STAT-1 é liberado do receptor, forma homodímeros e migra para o núcleo
(2.), onde se liga às áreas de reconhecimento do DNA, denominadas sítios
ativados-gama (GAS), nos promotores dos genes (3.). (Modificado de
Schindler 1998).
Figura 20 -
INTRODUÇÃO
42
A proteína STAT-1 participa de vários processos celulares: inibe a ação do
gene c-myc e aumenta a expressão de p-21, funcionando como supressora do ciclo celular
(Fig. 21). Camundongos deficientes em STAT-1 desenvolvem mais rapidamente e mais
freqüentemente tumores induzidos por carcinógenos químicos. O aumento da incidência de
tumores nestes animais pode ser atribuída à perda da resposta da vigilância imunológica
induzida pela via de sinalização IFNγ-JAK .
A proteína STAT-1 também participa do processo de angiogênese tumoral. inibindo a
expressão de moléculas como o fator de crescimento do fibroblasto básico, o MMP-2 e o
MMP9, o que lhe confere propriedade antiangiogênica (Haura, 2005).
Ao inibir a expressão dos genes bcl-2 e bcl-
Xl
e promover a expressão das caspases1,
2, 3 e 7, STAT-1 torna-se proteína próapoptótica (Micheau et al. 1999). Trabalhos
RESPOSTA IMUNE
STAT-1
IFNγ
EGF
ANGIOGÊNESE
- ↓ b FGF, MMP2, MMP9
PARADA DO CICLO CELULAR
- ↑ p 21
PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR
- ↓ c-Myc
EFEITO PRÓ APOPTÓTICO
- ↑ CASPASE 1
- ↑ CASPASES 2, 3, 7
EFEITO ANTI APOPTÓTICO
- ↓ Bcl-xl, Bc l-2
Figura 21 -
Proteínas reguladas por STAT-1. A proteína STAT-1 pode regular a
expressão de genes e seus produtos, envolvendo-se em diferentes processos
celulares. Estes efeitos são mediados pelo fator de crescimento epitelial e
pelo IFNγ (Modificado de Haura 2005).
INTRODUÇÃO
43
experimentais têm demonstrado a participação de STAT-1 na apoptose induzida pela lesão do
DNA, em linfócitos B submetidos ao quimioterápico fludarabina (Baran-Marszak et al. 2004).
1.2.3.4 BCL-2
O gene bcl-2, proto-oncogene localizado no loci 18q21, codifica uma proteína
antiapoptótica localizada na membrana interna da mitocôndria. Esta proteína foi
originalmente identificada devido ao seu envolvimento na translocação t(14;18)(q32;q21),
que coloca o gene bcl-2 (18q21) sob o domínio do gene que codifica a cadeia pesada da
imunoglobulina (14q32), resultando em superexpressão de BCL-2 (Bakhshi et al 1985;
Bakhshi et al 1987).
O exato mecanismo de ação de BCL-2 permanece desconhecido. Tem sido proposto
que BCL-2 pode bloquear a morte modulando a cascata de sinalização da apoptose, como por
exemplo, inativando proteínas próapoptóticas.
A superexpressão de BCL-2 no LDGCB é detectada entre 24% e 77% dos tumores,
enquanto que a translocação t(14;18)(q32;q21), é o evento mais constante no linfoma
folicular, 85% dos tumores, no LDGCB é detectada em 20% dos casos (Lossos,
Morgensztern, 2006).
A amplificação 18q21, que é detectada em 31% dos casos, pode explicar a
superexpressão de BCL-2 no LDGCB sem a presença da translocação (Monni et al. 1997).
A superexpressão de BCL-2 confere às células tumorais resistência ao tratamento e
vantagem na sobrevida, Tabela 9 (Muris et al. 2006).
INTRODUÇÃO
44
Tabela 9 – Dados referentes ao impacto da expressão do BCL-2 sobre a sobrevida global
Autor
(ano)
Critérios
de
Positividadde
Expressão
%
Número
de
Pacientes
Sobrevida Global
Expressão
Período positiva negativa p
% %
Hermine
(1996)
60 45 151 3 anos 61 81 0,05
Kramer
(1996)
50 45 165 NR
Gascoyne
(1997)
10 24 116 8 anos 34 60 <0,01
Barrans
(2002)
50 52 169 2 anos 24 65 0,006
Colomo
(2003)
25 59 126 5 anos 34 57 0,03
Sohn
(2003)
50 26 94 3 anos 36 69 0,06
Mounier
(2003)
50 66 292 2 anos 48 67 0,05
Hans
(2004)
30 50 152 NS
Biasoli
(2005)
50 42 86 6 anos 36 52 0,05
Berglund
(2005)
50 55 161 5 anos 39 54 0,03
Muris
(2006)
50 73 71 5 anos 30 71 0,0007
Arenillas
(2006)
25 NR 60 3 anos 28 67 0,02
Iqbal
(2006)
30 NR 138 NS
INTRODUÇÃO
45
1.3 Arranjo tecidual em matriz (TMA)
O cDNA-microarrays não pode ser amplamente usado para o estudo genômico de
neoplasias em laboratórios de rotina, não fosse apenas pelo alto custo econômico, também o
seria pela complexidade extraordinária do laboratório adequado. Por estas razões, o método
imunoistoquímico, na identificação indireta dos subtipos CG e NCG, tem sido investigado.
A técnica do tissue microarrays (TMA), que consiste em um arranjo de amostras para
estudo morfológico e imunoistoquímico, foi introduzida por Kononen et al. em 1998, sendo, a
seguir, aprimorada e difundida por Bubendorf em 2001.
Estes autores detalharam a preparação de blocos de parafina contendo 1.000 cilindros,
de 2 mm de diâmetro, com tecido de biópsia obtidos de arquivos de vários tumores e de
tecidos normais.
Este arquivo miniaturizado de patologia permite analisar simultaneamente, em uma
mesma lâmina, a morfologia e a expressão imunoistoquímica de numerosas proteínas em até
centenas de amostras de diferentes casos, com considerável economia de tempo e de dinheiro.
Possibilita também a repetição dos experimentos com homogeneidade nos protocolos
laboratoriais pela realização de todas as reações simultaneamente.
O bloco, contendo todos os cilindros de tecido, permite aproximadamente 200 cortes,
podendo ser seccionado e utilizado para revisão de morfologia, imunoistoquímica e técnicas
de hibridização in situ com leitura por imunofluorescência.
Esta técnica apresenta acuidade comprovada e justifica seu emprego em estudos
retrospectivos de grandes centros ou estudos cooperativos com grandes bancos de dados.
INTRODUÇÃO
46
1.4 Justificativa
O linfoma difuso de grandes células B, o mais comum dos linfomas dos adultos, é
considerado uma entidade particular pela Organização Mundial de Saúde. Entretanto, não se
trata de doença homogênea sob os pontos de vista clínico, terapêutico, histológico ou mesmo
molecular. O conhecimento de fatores que determinam esta heterogeneidade possibilita
otimizar o tratamento e conseqüentemente a evolução do caso.
Fatores relacionados à heterogeneidade e a diversidade biológica do LDGCB têm sido
estudados por técnicas sofisticadas como o cDNA-microarray. Esta técnica não pode ser
amplamente usada para o estudo em laboratórios de rotina, em virtude do alto custo e da
complexidade do método. Uma alternativa é estudar estes fatores indiretamente, pelo método
imunoistoquímico.
Pelo exposto, consideramos oportuno o estudo do LDGBC, para a identificação de
marcadores moleculares pelo método imunoistoquímico, visando individualizar o tratamento
e influenciar na evolução dos casos.
2. OBJETIVOS
OBJETIVOS
48
1 – Avaliar a associação entre as expressões imunoistoquímicas de CD10, BCL-2, BCL-6,
MUM1, p53, OCT-2, STAT-1 e survivina com o IPI.
2 – Avaliar o impacto das expressões imunoistoquímicas de CD10, BCL-2, BCL-6, MUM1,
p53, OCT-2, STAT-1 e survivina na resposta à quimioterapia antineoplásica.
3 – Avaliar a importância das expressões imunoistoquímicas de CD10, BCL-2, BCL-6,
MUM1, p53, OCT-2, STAT-1 e survivina na sobrevida livre de eventos e na sobrevida
global.
4 – Avaliar a sobrevida livre de eventos e a sobrevida global nos subgrupos centro
germinativo e não centro germinativo.
5 – Avaliar a associação entre as expressões imunoistoquímicas de BCL-2, p53, OCT-2,
STAT-1 e survivina e os subgrupos centro germinativo e não centro germinativo.
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
CASUÍSTICA E MÉTODOS
50
3.1 Casuística
3.1.1 Estratégia de busca de pacientes
Os casos de LDGCB foram selecionados a partir de um banco de dados pré-existente
no Departamento de Patologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
(FCMSCSP), utilizando 117 blocos de parafina na montagem do arranjo tecidual em matriz.
Após nova revisão dos prontuários, foram excluídos 31 casos assim distribuídos:
pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (quatro casos), LDGCB
transformado de linfoma folicular (quatro casos), linfoma linfoblástico (um caso), duplicidade
de identificação de bloco (quatro casos), abandono de tratamento (três casos), prontuários não
localizados pelo arquivo médico hospitalar (14 casos) e prontuário incompleto (um caso) (Fig.
22).
Desta maneira, foram estudados retrospectivamente 86 casos de linfoma não-Hodgkin
difuso de grandes células B de novo, diagnosticados no Serviço de Hematologia e
Hemoterapia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, de fevereiro de
1996 até 30 de setembro de 2005, tratados com quimioterapia contendo ciclofosfamida,
vincristina, doxorubicina/epirubicina e prednisona (CHOP) e/ou radioterapia de consolidação.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
51
3.1.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos os casos de LDGCB evoluídos de linfoma folicular; casos de
pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, e casos de LDGCB que
não foram tratados ou acompanhados no Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Santa
Casa de Misericórdia de São Paulo.
N=117
blocos de parafina
N=86
casos estudados
N=44
análise de sobrevida
livre de eventos
(p
acientes admitidos até 2004
)
N=74
análise de sobrevida global
(pacientes admitidos até 2004)
Figura 22 – Fluxograma dos casos envolvidos no estudo. Os casos de LDGCB foram
selecionados a partir de um banco de dados e de um arquivo de blocos de
parafina existentes no Departamento de Patologia da FCMSCSP.
N= 31
casos excluídos
CASUÍSTICA E MÉTODOS
52
3.1.3 Levantamento das características clínicas no momento do diagnóstico
Foram registrados a idade (em anos), o sexo, o estádio segundo a classificação de Ann
Arbor (estádios I, II, III ou IV), a presença ou ausência de sintomas B (sudorese profusa,
perda de peso superior a 10% do peso corporal e febre, que foi definida como temperatura
axilar igual ou maior que 38
0
C), a dosagem de dehidrogenase lática sérica (normal ou
elevada, de acordo com a referência do laboratório de patologia clínica) e a presença de
acometimento extranodal.
O desempenho do pacientes foi classificado, restrospectivamente, de acordo com a
escala proposta pelo ECOG (Eastern Cooperative Onalogy Group) (Oken et al., 1982).
Também foram registradas as cinco características pré-tratamento utilizadas para a
aplicação do IPI e suas respectivas dicotomizações para a análise dos dados (Quadro 1)
(Shipp et al 1993).
Quadro 1 – Características clínicas que definem o Índice Prognóstico Internacional
Características pré-tratamento
Fatores de bom
prognóstico
Fatores de mau
prognóstico
Idade < 60 anos > 60 anos
Estádio de Ann Arbor Doença localizada
(Estádio I ou II)
Doença avançada
(Estádio III ou IV)
Número de áreas extranodais <1 >1
Desempenho- ECOG <1 >1
DHL sérica Normal Elevada
Fonte: Shipp et al 1993.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
53
De acordo com o número de fatores de mau prognóstico, os pacientes foram
classificados em quatro grupos de risco e, em seguida, em grupos de baixo risco e alto risco
(Wilder et al. 2002; Biasoli et al. 2001), assim discriminados:
I. grupo de baixo risco: presença de até dois fatores de mau prognóstico. Esta
categoria engloba os subgrupos de baixo risco e risco baixo-intermediário do IPI;
II. grupo de alto risco: presença de pelo menos três fatores de mau prognóstico. Esta
categoria engloba os subgrupos de risco intermediário alto e alto risco do IPI.
Todos os casos foram classificados sempre que não houvesse prejuízo para a aplicação do IPI.
3.1.4 Distribuição da casuística de acordo com as variáveis demográficas,
clínicas, tempo de seguimento, evolução e resposta à quimioterapia.
Nesta série de 86 pacientes, 44 eram do sexo masculino (51,2%), 81 pacientes
pertenciam à raça branca; as idades mínima e máxima registradas foram 16 anos e 89 anos, e
as idades média e mediana foram 55,9 anos e 59 anos, respectivamente (Tab. 10).
Os dados referentes ao estadiamento clínico (EC), mostraram EC- I representado por
15,1% de casos, EC- II 29,1%, EC- III 24,4% e o EC- IV por 31,4 % de casos; enquanto os
sintomas A e B estavam presentes em 31,4 e 68,6%, respectivamente.
Trinta e dois pacientes apresentavam comprometimento em sítio extranodal, entre eles,
23 eram extranodal primário, sendo 10 casos no EC- I e 13 casos no EC-II. A amígdala
palatina foi o órgão extranodal mais freqüentemente envolvido (sete casos); a tireóide e o
ovário (dois casos cada), mama, testículo, íleo, cólon, reto, faringe, palato, rinofaringe,
parótida, órbita, ilíaco e tecido muscular esquelético da coxa e do membro superior (um caso),
respectivamente.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
54
O IPI estratificado em baixo risco (englobando baixo risco e baixo risco intermediário)
ou alto risco (alto risco intermediário e alto risco) apresentou as seguintes porcentagens:
54,6% no grupo de baixo risco, e 45,4% no grupo de alto risco.
O tempo de seguimento foi calculado entre a data do diagnóstico anátomo-patológico
e a data do óbito, da última informação ou consulta médica. O tempo de seguimento
apresentou mediana de 16,6 meses e média de 27,5 meses (0,1 a 121,8 meses). Trinta e seis
pacientes (41,9%) evoluíram para óbito.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
55
Tabela 10 – Distribuição da casuística de acordo com variáveis demográficas, clínicas,
tempo de seguimento e evolução clínica
Variável
Categoria
Número de casos (%)
Sexo Masculino
Feminino
44 (51,2)
42(48,8)
Raça Branco
Não branco
81 (94,2)
5 (5,8)
Idade
Média
d.p
Mínimo.
Mediana
Máximo
55,9
19,0
16
59
89
Estadiamento
I
II
III
IV
13 (15,1)
25 (29,1)
21 (24,4)
27 (31,4)
Sintomas
A
B
27 (31,4)
59 (68,6)
Sítio extranodal
Não
Sim
54 (62,7)
32 (37,3)
Sítio extranodal
primário
IE
IIE
10 (43,4)
13 (56,6)
Índice Prognóstico
Internacional (IPI)
Baixo risco
Alto risco
47 (54,6)
39 (45,4)
Tempo de seguimento
(meses)
Média
d.p
Mínimo.
Mediana
Máximo
27,5
30,9
0,1
16,6
121,8
Evolução Óbito
Vivo
36 (41,9)
50 (58,1)
CASUÍSTICA E MÉTODOS
56
Dos 86 casos, 15 casos não foram submetidos à quimioterapia; 14 destes por terem
evoluído para óbito antes do início do tratamento. Destes, sete pacientes apresentavam estádio
IV, três pacientes apresentavam estádio III, três pacientes foram estádio II, e um caso era
estádio I. O 15º caso não foi submetido à quimioterapia em virtude de ser estádio I e IPI de
baixo risco. Setenta e um pacientes (82,6%) foram submetidos à quimioterapia.
Destes, 67 (94,0%) foram tratados com esquema de drogas contendo antraciclina. O
número de ciclos de quimioterapia apresentou mediana de sete, média de 6,4 e desvio padrão
de 2,1. Os critérios de resposta ao tratamento adotado foram aqueles recomendados pelo
International Working Group (IWG) (Tab. 11) (Cheson et al. 1999). Assim, 37 pacientes
(52,1%) apresentaram resposta completa à quimioterapia, 17 pacientes (23,9%) apresentaram
resposta parcial, e 17 pacientes evoluíram com progressão da doença (Tab. 12).
Tabela 11 – Critérios de resposta ao tratamento nos linfomas não-Hodgkin segundo o
International Working Group.
Tipo de Resposta
Exame Físico
Linfonodos
Medula Óssea
Completa
Normal
Normal
Normal
Parcial
Normal
Normal
Infiltrada
Progressão Hepatomegalia/
Esplenomegalia
Novos sítios
Novos ou
aumentados
Reaparecimento
da infiltração
Fonte: Cheson et al. 1999.
Tabela 12 – Distribuição da casuística de acordo com o tratamento
Variável
Categoria
Número de Casos (%)
Tipo de Quimioterapia
Sem antraciclina
Com antraciclina
4 (5,6)
67 (94,4)
Número de Ciclos N
Variação
Mediana
Média
Desvio-padrão
72
0 – 8
7
6,4
2,1
Resposta à Quimioterapia Resposta completa
Resposta parcial+ progressão
37 (52,1)
34 (47,8)
CASUÍSTICA E MÉTODOS
57
3.2 Métodos
3.2.1 Revisão histopatológica
Na primeira fase do estudo, o método consistiu em separar 117 blocos em parafina e as
respectivas lâminas histológicas coradas em hematoxilina-eosina. Para a revisão
histopatológica, foi utilizado microscópio NIKON ECLIPSE E 400. Todos os casos foram
revisados por dois patologistas, Dr. Roberto Antônio Pinto Paes e o Dr. Fernando Augusto
Soares.
Todos os casos foram revisados conforme os critérios histopatológicos estabelecidos
pela Classificação da OMS de 2001 (Jaffe et al. 2001), o que permitiu fundamentar o
diagnóstico de linfoma difuso de grandes células B: neoplasia de natureza linfóide,
caracterizada por proliferação de células volumosas, com núcleos polimorfos e nucléolos
evidentes, CD20 positivo (Fig. 23). A leitura dos cortes corados com HE foi iniciada com
aumento de 100X para a avaliação da qualidade das amostras de tumor obtidas para o TMA.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
58
3.2.2 Procedimentos para a construção do arranjo tecidual em matriz
As áreas de interesse para o estudo foram selecionadas nas lâminas que serviram para
o diagnóstico do linfoma e circundadas com caneta de retroprojetor. Como imagem em
espelho, as lâminas foram alocadas sobre os blocos correspondentes, e a mesma área,
previamente marcada em cada uma das lâminas histológicas, foi transferida para o bloco de
parafina, agora denominado bloco doador. Escolhidas as duas áreas em cada um dos blocos,
os números deles foram ordenados em uma planilha, confeccionada no programa de
computador Excell (Windows xp – Microsoft) com eixo XY que se refere à coluna e linha
respectivamente, a qual serviu para a ordenação do arranjo tecidual em matriz (Fig. 24).
Fotomicrografia de linfoma difuso de grandes células B mostrando células
volumosas, com núcleos polimorfos e nucléolos evidentes. Coloração:H&E.
(Departamento de Patologia –Santa Casa de São Paulo).
Figura 23 –
CASUÍSTICA E MÉTODOS
59
A partir daí, o material estava pronto para iniciar a confecção do bloco de TMA.
Todos os blocos doadores de tumores dos 86 pacientes em estudo e dois blocos de biópsia de
fígado normal foram levados ao aparelho de precisão da Becker Instruments Microarray
Tecnology (Fig. 25)
Planilha original de posicionamento dos cortes histológicos de todos os blocos dos
pacientes envolvidos no estudo. Casos ordenados horizontalmente pelo número de
bloco em parafina das amostras dos tumores; a posição 00, superior e inferior,
representam cortes de fígado. A planilha foi executada no programa de computador
Excell, Windows xp-Microsoft.
Figura 24 -
CASUÍSTICA E MÉTODOS
60
De acordo com a ordem estabelecida na planilha original fez-se o primeiro furo em um
bloco novo de parafina (em branco), denominado bloco receptor, através de um sistema de
agulhas, no nosso caso com 1,0 mm de diâmetro interno acopladas a eixo milimetrado (Fig.
26).
A seguir, retirou-se do interior da agulha o cilindro de parafina obtido do bloco
receptor, deixando-a limpa. Perfurou-se, então, com a agulha, o primeiro bloco doador, tecido
hepático, e implantou-se este tecido na respectiva cavidade previamente aberta no bloco
receptor.
Visão frontal do aparelho de precisão da Becker Instruments utilizado para a
construção do arranjo tecidual em matriz (Departamento de Patologia –
Hospital A. C. Camargo/SP).
Figura 25-
CASUÍSTICA E MÉTODOS
61
E assim procedeu-se sucessivamente e ordenadamente à retirada de duas amostras (A e
B) de cada um dos blocos doadores com tecido tumoral e seu implante no bloco receptor, de
acordo com a planilha original. No final, obteve-se um único bloco receptor, contendo duas
seqüências diferentes, dos blocos em estudo.
O bloco receptor foi então cortado em micrótomo de parafina Leika. Os cortes obtidos
no micrótomo são colados em fita adesiva especial para a técnica de arranjo tecidual em
matriz (Adesive Tape for tissue microarray). Os cortes histológicos em cinco micrômetros
aderidos à fita adesiva, obtidos em 100 níveis diferentes com distância de 10 micrômetros
entre si, foram numerados e alados sobre lâminas especiais, marca Star Frost Slide. Os cortes
foram tratados com luz ultravioleta e solvente químico (TPC Solvent) para soltar a fita adesiva
e apenas os cortes histológicos permanecerem nas lâminas. Os cortes foram recobertos com
parafina e armazenados em freezer para conservação.
Cortes em dois níveis do bloco receptor foram corados com hematoxilina-eosina (HE)
para demonstração da qualidade das amostras de tumor obtidas para o TMA (Fig. 27-29). As
lâminas com o número mais baixo de cada marcador representavam os cortes mais
Figura 26 -
Número
de
amostras
Diâmetro Interno
da
a
g
ulha
0,6mm: 500/600 amostras
1,0mm: 270/300 amostras
1,5mm: 120 amostras
2,0mm: 80 amostras
Confecção do bloco receptor. Através da agulha acoplada a um eixo
milimetrado, são feitos os furos no bloco receptor de acordo com a ordem
estabelecida na planilha original. O número de amostras orienta a escolha do
diâmetro interno das agulhas (Departamento de Patologia – Hospital A. C.
Camargo/SP).
CASUÍSTICA E MÉTODOS
62
superficiais (Nível 1) e as lâminas com o número mais alto de marcador representavam os
cortes do nível mais profundo (Nível 2). Controles positivos, externo e interno, atestaram a
qualidade das reações.
Figura 27 –
Lâmina corada com hematoxilina-eosina. Cortes em dois níveis do bloco
receptor foram corados com hematoxilina-eosina (HE) para demonstração da
qualidade das amostras de tumor obtidas para o arranjo tecidual em matriz.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
63
Figura 29 -
Figura 28 –
Avaliação da qualidade da amostra do TMA em maior aumento.
Avaliação da qualidade das amostras do TMA.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
64
3.2.3 Procedimentos para a realização da técnica de imunoistoquímica
As lâminas preparadas segundo a técnica do TMA foram desparafinizadas e
preparadas por passagens sucessivas no xilol e etanol e submetidas à recuperação antigênica,
conforme está demonstrado no Quadro 2.
A seguir, foi feito o bloqueio da peroxidase endógena com solução de peróxido de
hidrogênio a 3% (água oxigenada 10 volumes) com três trocas de 5 minutos cada. As lâminas
foram incubadas com os anticorpos primários pesquisados, nas diluições pré-estabelecidas em
tampão PBS, contendo albumina bovina (BSA) 1% (SIGMA, A9647, USA) e azida sódica
(NaN3), 0,1% por 2 horas, em câmara úmida, à temperatura ambiente. Após a incubação, as
lâminas foram lavadas em tampão PBS com três trocas de 5 minutos cada. A seguir, as
lâminas contendo os cortes histológicos, foram incubadas com o Link (DAKO A/S, K0690,
Denmark) por 30 minutos em temperatura ambiente, seguidas por três lavagens de 5 minutos
em PBS, e incubação com streptavidina (HRP 9DAKO A/S, K0690, Denmark) por 30
minutos à temperatura ambiente. Após a incubação as lâminas, foram lavadas em tampão PBS
(3 e 5 minutos), reveladas com solução de diaminobenzidina (DAB, Sigma) por 5 minutos e
contra coradas com hematoxilina de Harris (Merck).
O estudo imunoistoquímico foi realizado com os oito marcadores em dois níveis de
corte do bloco da técnica do TMA para cada marcador. A distância entre os cortes do nível
superficial (Nível 1) e do nível profundo (Nível 2) foi de 360 a 400 micrômetros.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
65
Anticorpo
Clone
Fabricante
Código
Título
Recuperação
Solução
pH
Tempo
CD20 L26 DakoCytomation M0755 1:200 p. pressão Citrato 6.0 15 min
CD10 56C6 Novocastra NCL-CD10-270 1:100 p. pressão Citrato 6.0 15 min.
BCL-6 GI 191E/A8 Cell MarK CMC 798 1:50 banho maria EDTA 8.0 40 min.
MUM1 MUM1p DakoCytomation M7259 1:100 p. pressão EDTA 9.0 15 min.
BCL-2 124 DakoCytomation M0887 1:50 p. pressão Citrato 6.0 15 min
p53 DO-7 DakoCytomation M7001 1:100 p. pressão Citrato 6.0 15 min
Survivina policlonal Neomarkers RB-9245P 1:100 microondas Citrato 6.0 24 min.
OCT-2 policlonal Santa.Cruz
Biotechonology Sc233 1:3000 p. pressão Citrato 6.0 15 min.
STAT-1 policlonal Santa.Cruz
Biotechonology Sc346 1:3000 p. pressão Citrato 6.0 15 min.
Na leitura das lâminas do TMA, foi utilizado um microscópio NIKON ECLIPSE E
400 de uma cabeça. As lâminas da técnica do TMA, contendo as duas seqüências de cortes,
foram posicionadas no microscópio com a etiqueta para a direita. Com a objetiva de 4X, foi
localizado o corte do fígado normal na posição 1.1 da planilha de leitura, esta posição serviu
como guia para o posicionamento do TMA.
A leitura sempre foi iniciada a partir da seqüência de amostras da parte superior da
lâmina (A), isto é, abaixo da etiqueta; a seguir, era avaliada a seqüência inferior na mesma
lâmina (B) (Fig. 27). Estas duas seqüências foram avaliadas complementarmente, uma vez
que foi observado não haver diferença entre elas, e anotada na planilha uma única leitura, a da
melhor amostra, que era a que continha a maior representatividade do tumor. A leitura dos
marcadores do TMA foi iniciada com aumento de 100X para a avaliação dos critérios de
intensidade da coloração à imunoistoquímica. Depois, para confirmação dos achados, foi
utilizado o aumento de 400X. Os elementos histopatológicos e imunohistoquímicos avaliados
na leitura das lâminas do arranjo tecidual em matriz foram:
Dados técnicos referentes aos anticorpos primários usados na reação
imunoistoquímica. Para a detecção da expressão das proteínas CD20, CD10, BCL-
6, MUM-1, BCL-2 e P53, foram usados anticorpos monoclonais. Para a detecção
das proteínas survivina, OCT-2 e STAT-1, foram usados anticorpos policlonais.
Para a execução do método, foi utilizada a técnica estabelecida pelo fabricante do
anticorpo.
Quadro 2 –
CASUÍSTICA E MÉTODOS
66
a) Reação para os marcadores CD20, CD10 e BCL-2
a.1) Positiva
Foram considerados positivos os casos com evidente coloração de membrana e/ou
citoplasma nas células neoplásicas em porcentagem superior a 10%
a.2) Negativa
Não havia nenhuma coloração característica da reação imunoistoquímica.
b) Reação para os marcadores MUM1, p53, BCL-6 e OCT-2.
b.1) Positiva
Foram considerados positivos os casos com evidente coloração nuclear das células
tumorais, em porcentagem superior a 20%
b.2) Negativa
Não havia nenhuma coloração característica da reação imunoistoquímica.
c) Reação para os marcadores survivina e STAT-1
c.1) Positiva
Foram considerados positivos os casos com evidente coloração nuclear ou
citoplasmática das células tumorais, em porcentagem superior a 20%
c.2) Negativa
Não havia nenhuma coloração característica da reação imunoistoquímica.
Os critérios de positividade para a reação imunoistoquímica estão descritos na Tabela 13.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
67
Tabela 13 – Leitura da expressão protéica no TMA baseada na coloração característica da
reação imunoistoquímica dos marcadores moleculares.
Proteína
Positividade (%)
Coloração
CD20 10 Membrana/citoplasma
CD10 10 Membrana/citoplasma
BCL-2 10 Membrana/citoplasma
MUM1 20 Nuclear
p53 20 Nuclear
BCL-6 20 Nuclear
OCT-2 20 Nuclear
STAT-1 20 Nuclear/citoplasmática
Survivina 20 Nuclear/citoplasmática
Para a avaliação dos critérios de intensidade da coloração à imunoistoquímica, foi
utilizado o aumento de 100X. Depois, para confirmação dos achados, foi utilizado o aumento
de 400X. Os resultados foram anotados em planilha, com modelo semelhante àquele
estabelecido para a anotação do registro dos blocos doadores (Fig. 24).
As anotações da planilha de leitura manuscrita foram posteriormente repassadas para
planilhas em programa de computador Excell, Windows xp – Microsoft para que todos os
dados pudessem ser cruzados e permitissem posterior avaliação estatística.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
68
3.2.4 Estudo estatístico
Na análise estatística, foi utilizado o Programa SPSS versão 11.0. As medidas de
tendência central e de dispersão foram usadas para caracterizar as variáveis quantitativas e a
distribuição de freqüências para representar as variáveis categóricas.
A associação entre as variáveis categóricas foi verificada por meio de teste de
associação do qui-quadrado.
As curvas de probabilidade de sobrevida foram construídas pelo método de Kaplan-
Meier e comparadas pelo teste de log-rank.
Para a análise dos fatores prognósticos independentes, foi utilizado o modelo dos
riscos proporcionais de Cox com o cálculo das “hazard ratios” (HR) brutas e ajustadas e
respectivos intervalos de confiança de 95%. Foram incluídas no modelo múltiplo todas as
variáveis que apresentaram na análise univariada p<0,25. Para todos os testes estatísticos,
estabeleceu-se um α=5%.
4. RESULTADOS
RESULTADOS
70
4.1 Estudo imunoistoquímico por meio do arranjo tecidual em matriz
4.1.1 Avaliação da qualidade do arranjo tecidual em matriz
A Fig. 30 ilustra o resultado de duas amostras em relação à intensidade da coloração
da reação imunoistoquímica. A amostra A apresenta reação negativa, e a amostra B, reação
positiva.
4.1.2 Expressão imunoistoquímica do CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, p53, OCT-
2, STAT-1 e da survivina
A reação imunoistoquímica positiva para o CD10 (Fig. 31) mostrou padrão
membranoso citoplasmático; a reação imunoistoquímica positiva para BCL-6 (Fig. 32), BCL-
2 (Fig. 33), MUM1 (Fig. 34), p-53 (Fig. 35) e OCT-2 (Fig. 36) mostrou padrão nuclear; a
reação para a survivina (Fig. 37) e para o STAT-1 (Fig. 38) mostrou padrão membranoso e
nuclear.
Figura 30 –
Avaliação dos critérios de intensidade da coloração à imunoistoquímica no TMA.
Amostra A, caso considerado negativo; amostra B, caso considerado positivo.
A B
RESULTADOS
71
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na
reação imunoistoquímica para BCL-6.
Figura 32 –
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão
membranoso na reação imunoistoquímica para CD10.
Figura 31 –
RESULTADOS
72
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na
reação imunoistoquímica para MUM1.
Figura 34 –
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão
membranoso na reação imunoistoquímica para BCL-2.
Figura 33 –
RESULTADOS
73
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na
reação imunoistoquímica para OCT-2.
Figura 36 –
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear na
reação imunoistoquímica para p53.
Figura 35 –
RESULTADOS
74
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear e
citoplasmático na reação imunoistoquímica para STAT-1.
Figura 38 –
Fotomicrografia de uma amostra do TMA, mostrando padrão nuclear e
citoplasmático na reação imunoistoquímica para survivina.
Figura 37 –
RESULTADOS
75
4.2 Distribuição da casuística de acordo com a expressão imunoistoquímica do
CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, STAT-1, p53, OCT-2 e da survivina
De acordo com o padrão da coloração imunoistoquímica, foram observados os
seguintes resultados: CD10= 26 casos (30,2%), BCL-6= 45 casos (56,3%), BCL-2= 39 casos
(45,4%), MUM1= 41 casos (52,3%), STAT-1= 56 casos (65,1%), p53= 58 casos (67,4%),
OCT-2 = 65 casos (75,6%) e survivina= 67 casos (77,9%) (Tab.14).
Tabela 14 - Distribuição da casuística de acordo com a expressão dos marcadores
moleculares
Variável
Categoria
Número de casos (%)
CD10:
positivo
negativo
26 (30,2)
60 (69,8)
BCL-6:
positivo
negativo
45 (56,3)
41 (47,7)
BCL-2:
positivo
negativo
39 (45,4)
47 (54,6)
MUM1:
positivo
negativo
41 (52,3)
45 (47,7)
STAT-1:
positivo
negativo
56 (65,1)
30 (34,9)
p53:
positivo
negativo
58 (67,4)
28 (32,6)
OCT-2:
positivo
negativo
65 (75,6)
21 (24,4)
Survivina:
positivo
negativo
67 (77,9)
19 (22,1)
RESULTADOS
76
Quando foi analisada a associação entre os grupos de risco do IPI, simplificados em
baixo risco e alto risco e a expressão do CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, STAT-1, p53, OCT-2
e da survivina, foi observada associação estatisticamente significante entre a expressão do
CD10 e o grupo de baixo risco do IPI (p = 0,024) (Tab. 15).
Tabela 15 – Resultados da análise da associação entre os grupos de risco do IPI e a
expressão do CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, STAT-1, p53, OCT-2 e da
survivina.
Variável
Expressão
imunoistoquímica
IPI
Baixo risco
Número de casos
(%)
IPI
Alto risco
Número de casos
(%)
p
CD10
positiva
negativo
19 (73,1)
28 (46,6)
7 (26,9)
32 (53,4)
0,024
BCL-6
positiva
negativo
28 (62,2)
19 (46,3)
17 (37,8)
22 (53,7)
0,139
MUM1
positiva
negativo
18 (43,9)
29 (64,4)
23 (56,1)
16 (35,6)
0,056
BCL-2
positiva
negativo
20 (51,3)
27 (57,4)
19 (48,7)
20 (42,6)
0,567
p53
positiva
negativo
32 (55,2)
15 (53,5)
26 (44,8)
13 (46,5)
0,889
Survivin
a
positiva
negativa
37 (55,2)
10 (52,6)
30 (44,8)
9 (47,4)
0,841
OCT-2
positiva
negativa
35 (53,8)
12 (57,2)
30 (46,2)
9 (42,8)
0,792
STAT-1
positiva
negativa
27 (48,2)
20 (66,6)
29 (51,8)
10 (33,4)
0,101
RESULTADOS
77
Quando foi analisada a distribuição da casuística em relação ao tipo de resposta à
quimioterapia, classificando os grupos em resposta completa (RC) e de resposta
parcial+progressão de doença (RP+PD), foi observado que a expressão imunoistoquímica do
CD10 e do BCL-6 foi acompanhada de significância estatística nos casos que evoluíram com
RC (p = 0,034). A expressão de survivina e do OCT-2 foi acompanhada de resistência ao
tratamento (p=0,032) e (p=0,041), respectivamente (Tab. 16).
Tabela 16 – Resultados da análise da associação entre a expressão do CD10, BCL-6, BCL-2,
MUM1, STAT-1, p53, OCT-2 e da survivina e a resposta à quimioterapia.
Variável
Expressão
imunoistoquímica
RC
Número de casos
(%)
RP+Progressão
Número de casos (%)
p
CD10
positiva
negativo
16 (44,4)
20 (55.6)
7 (20,6)
27 (79,4)
0,034
BCL-6
positiva
negativo
24 (66,7)
12 (33,3)
14 (41,2)
20 (58,8)
0,032
MUM1
positiva
negativo
13 (36,1)
23 (63,9)
19(55,9)
15 (44,1)
0,097
BCL-2
positiva
negativo
16 (44,4)
20 (55,6)
15 (44,1)
19 (55,9)
0,978
p53
positiva
negativo
22 (61,1)
14 (38,9)
27 (79,4)
7 (20,6)
0,095
Survivina
positiva
negativa
24 (66,7)
12 (33,3)
30 (88,2)
4 (11,8)
0,032
OCT-2
positiva
negativa
23 (63,9)
13 (36,1)
29 (85,3)
5 (14,7)
0,041
STAT-1
positiva
negativa
24 (66,7)
12 (33,3)
20 (58,8)
14 (41,2)
0,497
RESULTADOS
78
4.3 Distribuição da casuística, segundo o algorítimo baseado na expressão do
CD10, BCL-6 e MUM1
Baseado no algorítimo proposto por Hans et al. em 2004, foram identificados 31 casos
de CG (36%) e 55 casos de NCG (64%) (Fig. 39).
CD10
Bcl-6
CG
N=26
MUM1
+
-
-
+
-
+
CG
N=5
NCG
N=36
NCG
N=19
Figura 39-
Algorítmo de decisão para a classificação imunoistoquímica da casuística
baseado na expressão de CD10, BCL-6 e MUM1, (Modificado de Hans et
al., 2004).
RESULTADOS
79
A análise da associação entre a expressão do BCL-2, p53, survivina, OCT-2 e
STAT-1, e os grupos CG e NCG não mostrou significância estatística (Tab. 17).
Tabela 17 – Resultados da análise da associação entre a expressão do BCL-2, p53, survivina,
OCT-2 e STAT-1 e os subgrupos centro germinativo e não centro germinativo
Variável
Expressão
imunoistoquímica
CG
Número de casos
(%)
NCG
Número de casos (%)
p
BCL-2
positiva
negativo
18 (58,1)
13 (41,9)
29 (52,7)
26 (47,3)
0,633
p53
positiva
negativo
23 (74,2)
8 (25,8)
35 (63,6)
20 (36,4)
0,316
Survivina
positiva
negativa
23 (74,2)
8 (25,8)
44 (80,0)
11 (20,0)
0,533
OCT-2
positiva
negativa
21 (67,7)
10 (32,3)
44 (80,0)
11 (20,0)
0,204
STAT-1
positiva
negativa
19 (61,3)
12 (38,7)
37 (67,3)
18 (32,7)
0,576
p-valor obtido pelo teste de freqüências do qui-quadrado
A análise da associação entre a classificação imunoistoquímica e as variáveis estádios
agrupados, IPI e resposta à quimioterapia mostrou que os estádios I-II foram mais freqüentes
no CG e os estádios III-IV foram mais freqüentes no NCG (p= 0,001); também mostrou que
os casos com IPI de baixo risco foram mais freqüentes no CG (p= 0,033). Quando foi
analisada a associação entre a resposta à quimioterapia e os subgrupos CG e NCG, foi
observado que a categoria RC é mais frequüente no CG e as categorias RP e PD são mais
freqüentes no NCG (p=0,012) (Tab. 18).
RESULTADOS
80
Tabela 18 – Resultados da análise da associação entre os estádios agrupados, o IPI e a
resposta à quimioterapia nos subgrupos centro germinativo e não centro
germinativo
Variável
Categoria
CG
Número de casos (%)
Não CG
Número de casos
(%)
p
Estádio
I-II
III-IV
21 (67,7)
10 (32,3)
17 (30,9)
38 (69,1)
0,001
IPI
baixo risco
alto risco
23 (74,2)
8 (25,8)
24 (43,6)
31 (56,4)
0,006
Resposta a
quimioterapia
RC
RP
PD
19 (52,8)
5 (29,4)
3 (17,6)
17 (47,2)
12 (70,6)
14 (82,4)
0,033
RC
RP+Progressão
19 (52,8)
8(23,5)
17 (47,2)
26 (76,5)
0,012
p- valor obtido pelo teste de freqüência do qui-quadrado
4.4 Análise univariada
4.4.1 Análise da sobrevida livre de eventos
Para a seleção dos casos que foram submetidos à análise da associação entre a
sobrevida livre de eventos (SLE), foi adotada a definição proposta pelo International Working
Group ( intervalo de tempo entre a admissão do caso no estudo até a falha do tratamento ou o
óbito por qualquer causa, como, por exemplo: progressão da doença, toxicidade, preferência
do paciente, início de outro protocolo de tratamento) (Cheson et al. 2007). Sendo assim,
foram analisados 44 casos que apresentaram RC ou RP à quimioterapia, admitidos até
dezembro de 2004. A taxa da SLE, calculada para 24 meses, foi de 69,5%. Quando foi
analisado o impacto das variáveis sexo, idade, estádio, sintomas constitucionais, sítio primário
de acometimento do linfoma, IPI e a classificação imunoistoquímica do linfoma, foi
RESULTADOS
81
observado que apenas o subgrupo CG apresentou significância estatística (p<0,024), (Tab. 19)
e (Fig. 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46).
Tabela 19 – Taxas de sobrevida livre de eventos em 24 meses segundo as variáveis sexo,
idade, estádio, sintomas constitucionais, sítio extranodal, IPI e classificação
imunoistoquímica.
Variável
Categoria
Sobrevida Livre de Eventos
N=44
Número de casos analisados/
Número de casos vivos (%)
p
Sexo:
Masculino
Feminino
21/13 (61,9)
23/16 (69,6)
0,543
Idade
< 60 anos
> 60 anos
21/15 (71,4)
23/14 (60,9)
0,366
Estádio
I/II
III/IV
25/17 (68,0)
19/12 (63,2)
0,784
Sintomas
A
B
16/12 (75,0)
28/17 (67,7)
0,253
Sítio extranodal
Não
Sim
25/14 (56,0)
19/15 (78,9)
0,217
IPI
baixo risco
alto risco
34/23 (67,7)
10/6 (60,0)
0,576
Classificação
imunoistoquímica
CG
NCG
19/13 (84,2)
25/16 (52,0)
0,024
RESULTADOS
82
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabi lidade acumulada de sobrevi da global
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Sexo
Feminino
Mas c ulino
N= 23(16)
N= 21 (13)
p= 0,5
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável sexo
Figura 40 –
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Idade
>= 60 a
n
< 60 an
o
N= 23 (14)
N= 21 (15)
p= 0,3
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável idade
Fi
g
ura 41 –
RESULTADOS
83
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Sintomas AB
Sim
Não
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável sintomas
constitucionais.
Fi
g
ura 43 –
p = 0,2
N= 28(17)
N= 16(12)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Estádio clínico
III-IV
I-II
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável estádio clínico
Fi
g
ura 42 –
p = 0,7
N= 19(12)
N= 25
(
17
)
RESULTADOS
84
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
IPI
1
0
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável IPI
Figura 45 –
p = 0,5
N= 10(6)
N= 34(23)
Alto risco
Baixo risco
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Sítio extra-nodal
Sim
Não
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável sítio extranodal
Fi
g
ura 44 –
p = 0,2
N= 19(15)
N= 25(14)
Sítio extranodal
RESULTADOS
85
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Perfil genético
CG
Não-CG
Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses na variável
p
erfil CG e NCG.
Figura 46 –
p = 0,02
N= 19(13)
N= 25(16)
RESULTADOS
86
Quando foi realizada a análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a
expressão do CD10, BCL-6, MUM1, BCL-2, OCT-2, p53, STAT-1 e da survivina, foi
observado que apenas a expressão de BCL-2 apresentou significância estatística (p<0,006)
(Tab. 20) (Figura 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54).
Tabela 20 – Análise da sobrevida livre de eventos em 24 meses de acordo com a expressão
do CD10, BCL-6, MUM1, BCL-2, OCT-2, p53, STAT-1 e da survivina.
Variável
Categoria
Sobrevida Livre de Eventos
N=44
Número de casos analisados/
Número de casos vivos (%)
p
CD10
positivo
negativo
16/13 (81,2)
28/16 (57,1)
0,135
BCL-6
positivo
negativo
26/17 (65,6)
18/12 (66,6)
0,914
MUM1
positivo
negativo
18/10 (55,6)
26/19 (73,0)
0,139
p53
positivo
negativo
31/22 (71,0)
13/7 (53,9)
0,525
BCL-2
positivo
negativo
19/8 (42,0)
25/21 (84,0)
0,006
Survivina
positivo
negativo
33/22 (66,7)
11/7 (63,6)
0,863
OCT-2
positivo
negativo
32/21 (65,6)
12/8 (66,7)
0,727
STAT-1
positivo
negativo
30/20 (66,7)
14/9 (69,8)
0,981
RESULTADOS
87
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
BCL6
Positivo
Negativo
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão do BCL-6.
Fi
g
ura 48 –
p = 0,91
N= 26(17)
N= 18(12)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
CD10
Positivo
Negativo
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão do CD 10
Figura 47 –
p = 0,13
N= 16(13)
N= 28(16)
RESULTADOS
88
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
P53
Positivo
Negativo
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
MUM1
Pos it iv o
Negativo
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão do MUM1.
Figura 49 –
p = 0,13
N= 18(10)
N= 26(19)
N= 31(22)
N= 13(7)
Figura 50 –
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão imunoistoquímica
do p53.
p = 0,52
RESULTADOS
89
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Survivina
Pos it iv o
Negativo
Figura 52 –
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica da survivina.
p = 0,86
N= 33(22)
N= 11(7)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
BCL-2
Pos it iv o
Negativo
Figura 51 –
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do BCL-2
p = 0,006
N= 19(8)
N= 25(21)
RESULTADOS
90
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
STAT-1
Positivo
Negativo
Figura 54 –
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do STAT-1.
p = 0,98
N= 30(20)
N= 14(9)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida livre de eventos
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
OCT2
Positivo
Negativo
Figura 53 –
Análise da sobrevida livre de eventos de acordo com a expressão
imunoistoquímica do OCT2.
p = 0,72
N= 32(21)
N= 12(8)
RESULTADOS
91
4.4.2 Análise da sobrevida global
Para a análise da sobrevida global (SG), foram incluídos os 74 pacientes admitidos até
2004. A taxa da SG calculada para 24 meses foi de 54,1,%, com sobrevida mediana de 87,4
meses. Foram analisadas as variáveis sexo, idade, estádio, sintomas constitucionais, sítio
primário de acometimento do linfoma, IPI e a classificação imunoistoquímica do linfoma.
Mostraram significância estatística as seguintes categorias: estádios I/II (p=0,030), ausência
de sintomas constitucionais (p=0,025), CG ( p=0,003), IPI (p<0,001) e resposta completa à
quimioterapia (p<0,001). Foi adotada a definição proposta pelo IWG (intervalo de tempo
entre a admissão do caso no estudo e o óbito por qualquer causa) Tabela 21.
Tabela 21 – Taxas de sobrevida global em 24 meses segundo as variáveis sexo, idade,
estádio, sintomas constitucionais, sítio extranodal. IPI e classificação imunoistoquímica.
Variável Categoria
Taxa da Sobrevida Global
N=74
Número de casos analisados/
Número de casos vivos (%)
p
Sexo:
Masculino
Feminino
38/21 (55,2)
36/20 (55,5)
0,909
Idade
< 60 anos
>
60 anos
40/21 (52,5)
34/20 (58,8)
0,529
Estádio
I/II
III/IV
34/23 (67,6)
40/18 (45,0)
0,030
Sintomas
A
B
23/17 (73,9)
51/24 (47,1)
0,025
Sítio extranodal
Não
Sim
46/21 (45,6)
28/20 (71,4)
0,052
IPI
baixo risco
alto risco
42/30 (71,4)
32/11 (34,4)
<0,001
Classificação
imunoistoquímica
CG
NCG
25/20 (80,0)
49/21 (38,9)
0,003
Resposta à
quimioterapia
RC
RP+PD
37/33 (81,8)
28/13 (46,4)
<0,001
RESULTADOS
92
Quando foi realizada a análise da sobrevida global de acordo com a expressão dos
marcadores moleculares CD10, BCL-6, MUM1, BCL-2, OCT-2, p53, STAT-1 e survivina,
foi observada significância estatística na expressão do CD10 (p<0,020) e do BCL-2 (p=0,38)
(Tab. 22) (Figura 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62).
Tabela 22 – Análise da sobrevida global em 24 meses de acordo com a expressão do CD10,
BCL-6, MUM1, BCL-2, OCT-2, p53, survivina e STAT-1.
Variável
Categoria
Taxa de Sobrevida Global
N=74
Número de casos analisados/
Número de casos vivos (%)
p
CD10
positivo
negativo
22/17 (77,3)
52/24 (46,1)
0,020
BCL-6
positivo
negativo
36/22 (61,0)
38/19 (50,0)
0,177
MUM1
positivo
negativo
36/17 (47,2)
38/24 (63,1)
0,083
p53
positivo
negativo
53/31 (58,4)
21/10 (47,6)
0,540
BCL-2
positivo
negativo
35/15 (42,9)
39/26 (66,7)
0,038
survivina
positivo
negativo
60/32 (53,3)
14/9 (64,3)
0,365
OCT-2
positivo
negativo
60/32 (64,3)
14/9 (53,3)
0,301
STAT-1
positivo
negativo
49/29 (59,1)
25/12 (48,0)
0,542
RESULTADOS
93
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevi da global
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
BCL6
Positivo
Negativo
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do BCL-6.
Fi
g
ura 56 –
p = 0,17
N= 36(22)
N= 38(19)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevi da global
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
CD10
Positivo
Negativo
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do CD10.
Figura 55 –
p = 0,02
N= 22(17)
N= 38(19)
RESULTADOS
94
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida global
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
P53
Positivo
Negativ o
Figura 58 –
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do p53.
p = 0,54
N= 53(31)
N= 21(10)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabi l idade acumul ada de sobrevi da gl obal
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
MUM1
Pos itiv o
Negativo
p = 0,08
N= 36(17)
N= 38(24)
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do MUM1
Figura 57 –
RESULTADOS
95
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Pr obabil idade acumulada de sobrevida gl obal
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
OCT2
Positivo
Negativ o
Figura 60 –
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica
do OCT2.
p = 0,30
N= 60(32)
N= 14(9)
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabilidade acumulada de sobrevida gl obal
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
Survivina
Positivo
Negativ o
Figura 59 –
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica
da survivina.
p = 0,36
N= 60(32)
N= 14(9)
RESULTADOS
96
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabi li dade acumul ada de sobrevi da global
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
BCL-2
Positivo
Negativo
Figura 62
- Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica do BCL-2.
p = 0,03
N= 35(15)
N= 39(26)
Análise da sobrevida global de acordo com a expressão imunoistoquímica
do STAT-1.
Figura 61 –
Tempo de seguimento (meses)
24181260
Probabi li dade acumulada de sobrevi da global
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
STAT-1
Positivo
Negativo
p = 0,54
N= 49(29)
N= 25(12)
RESULTADOS
97
Quando foi realizada a análise da sobrevida global de acordo com a expressão do BCL-2
nos subgrupos CG e NCG, foi observada a significância estatística no subgrupo NCG (p =
0,023) (Fig. 63), não sendo observado nenhum impacto no subgrupo CG (p = 0,58) (Fig. 64).
GCB DLBCL
24201612840
Cumul at ive Probabil it y of Overall Survival
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
BCL-2
Pos it iv
e
Negati
v
Figur 64 –
- Análise da sobrevida global de acordo com a expressão do BCL-2 no CG
Positivo
Negativo
Probabilidade acumulada de sobrevida global
p = 0,58
ABC DLBCL
Follow-up (months)
24201612840
Cumul ati ve Probabil i t y of Overall Survival
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
BCL-2
Pos it iv
e
Negati
v
Figura 63
-Análise da sobrevida global de acordo com a expressão do BCL-2 no NCG
Positivo
Negativo
p = 0,02
Probabilidade acumulada de sobrevida global
RESULTADOS
98
4.5 Análise multivariada
Os fatores de risco independentes para morte relacionada à doença, identificados pelo
modelo de regressão COX, sem incluir a variável resposta à quimioterapia, foram: IPI de alto
risco, subgrupo NCG e a expressão positiva de BCL-2, (Tab. 23).
Tabela 23 – Análise multivariada. Modelo de regressão COX com as variáveis IPI,
classificação imunoistoquímica e o marcador BCL-2, sem incluir a variável
resposta à quimioterapia
Variável
Categoria
HR"
HR*
HR*
IC 95%
p
IPI
baixo risco
alto risco
1,00
3,51
1,00
2,89
Ref.
1,38-6,10
0,005
Classificação
imunoistoquímica
CG
NCG
1,00
3,91
1,00
3,01
Ref.
1,10-8,19
0,031
Bcl-2
negativo
positivo
1,00
2,06
1,00
2,58
Ref.
1,26-5,28
0,009
-2 log-likelihood = 128,91, " hazard ratio bruta, * hazard ratio ajustada, IC – intervalo de
confiança
Quando a variável resposta à quimioterapia foi incluída, permaneceram, no modelo,
como fatores de risco independentes, as variáveis classificação imunoistoquímica, subgrupo
NCG, a expressão positiva de BCL-2, e doença residual após o regime quimioterápico (Tab.
24).
Tabela 24 – Análise multivariada. Modelo de regressão COX com as variáveis resposta
à quimioterapia, classificação imunoistoquímica e o marcador BCL-2.
Variável
Categoria
HR"
HR≠
HR*
IC 95%
p
Resposta à
quimioterapia
Completa
Parcial ou PD
1,00
6,95
1,00
6,19
Ref.
2,07-18,49
0,001
Classificação
imunoistoquímica
CG
Não CG
1,00
3,91
1,00
3,95
Ref.
1,01-15,43
0,048
Bcl-2
Negativo
Positivo
1,00
2,06
1,00
2,65
Ref.
1,08-6,52
0,033
≠ ajustados por Bcl-6; -2 log-likelihood = 128,91
5. DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
100
O LDGCB representa 33% dos casos de linfoma na classificação da OMS, sendo o
tipo mais comum dos linfomas e o mais comum em adultos. O LDGCB pode surgir de novo
ou a partir da transformação do linfoma folicular; seu comportamento clínico é heterogêneo,
assim como os aspectos morfológicos (grandes células pleomórficas com nucléolos
proeminentes e citoplasma basófilo), condições que dificultam a avaliação do prognóstico
(Jaffe et al 2001).
A subdivisão dos pacientes de acordo com fatores clínicos e laboratoriais (idade,
estádio, número de sítios extranodais, desempenho do paciente, grandes tumores, β2-
microglobulina e DHL entre outros) tem sido usada para avaliar o prognóstico do LDGCB e
orientar a escolha do tratamento. Em todos os modelos propostos, inclusive no IPI, houve
acentuada diferença nos resultados e na evolução dos pacientes pertencentes ao mesmo grupo
de risco (Lossos, Morgensztern, 2006).
Estes dados motivaram a realização de estudos tendo como objetivo a pesquisa do
local de origem da célula tumoral e a identificação de marcadores moleculares no LDGCB.
Assim, o conhecimento atual mostra que células emergentes do clone neoplásico acumulam
mudanças genéticas e/ou epigenéticas como a capacidade de manter o estado de proliferação,
evasão da apoptose, desrespeito aos sinais para a parada da proliferação e da diferenciação,
capacidade de invadir estruturas e órgãos e a capacidade de promover angiogênese, que
contribuem para o aparecimento de fenótipos aberrantes e comportamentos diversos (Lossos,
Morgensztern, 2006).
Geralmente o LDGCB requer tratamento agressivo e, em aproximadamente 40% dos
casos, pode ser curado com quimioterapia baseada em antraciclina. Este percentual se eleva
para 70%, quando o anticorpo monoclonal anti-CD20 é administrado com a quimioterapia
(Coiffier, 2007; Marcus, Hagenbeek, 2007).
DISCUSSÃO
101
A despeito dos avanços no tratamento do LDGCB, a resistência às drogas permanece a
maior causa de falha ao tratamento. Historicamente, o conceito de resistência às drogas é
baseado em mecanismos que envolvem a superexpressão de moléculas na membrana
citoplasmática como a P-glicoproteína, atividade aumentada das enzimas de reparação do
DNA ou aumentada atividade de radicais livres (Ohsawa et al 2005; Andreadis et al. 2007)
Atualmente os dados da literatura indicam que a resistência às drogas compreende um
complexo dinâmico relacionado ao controle do ciclo celular e ao processo apoptótico (Wilson,
2006, Muris et al. 2006).
A pesquisa dos marcadores moleculares tem dois objetivos primários: o primeiro é
estimar a sobrevida para guiar a escolha do tratamento inicial e permitir a estratificação
apropriada dos ensaios clínicos; o segundo objetivo é identificar subgrupos de pacientes que
permitam reconhecer alvos terapêuticos (Sehn, 2006).
O desequilíbrio entre a taxa de proliferação celular e a taxa de morte celular é o fato
universal de todas as células tumorais e as alterações em cada um destes processos têm sido
usadas como marcadores moleculares, por exemplo, moléculas reguladoras do ciclo celular
(p53, ciclina D, Ki-67), proteínas envolvidas com a apoptose (survivina, o BCL-2 e as
caspases) e proteínas envolvidas com a diferenciação da célula B (BCL-6, CD10, CD5,
FOXP1, PKC-β, CD21, ICAM-1, CD44, VEGF e as MMPs) (Lossos, Morgensztern, 2006).
Em nossa pesquisa selecionamos proteínas relacionadas ao desenvolvimento do
linfócito B e à apoptose e analisamos o impacto destas proteínas sobre a evolução dos
pacientes portadores de LDGCB. Por serem relacionadas com o desenvolvimento e a
maturação do linfócito B estudamos o CD10, o BCL-6, o MUM1 e o OCT-2. Também
estudamos a proteína STAT-1 que está envolvida com a resposta às citocinas. Relacionadas à
via intrínseca da apoptose estudamos as proteínas BCL-2, p53 e a survivina.
DISCUSSÃO
102
Para avaliar a expressão imunoistoquímica destas proteínas, utilizamos a técnica do
arranjo tecidual em matriz (TMA), descrita por Kononen et al., 1998, a qual permite que
grande número de amostras de tecidos seja rapidamente analisado em conjunto, com alto nível
de padronização para estudos imunoistoquímicos.
No TMA, o diâmetro dos fragmentos utilizados pode variar de 0,6 a 2,0 mm e, cada
fragmento de 1,5 mm, contem aproximadamente seis vezes mais tecido que um fragmento de
0,6 mm. O uso de três fragmentos cilíndricos de 0,6 mm de cada amostra, geralmente
assegura quantidade adequada de material para o estudo, em pelo menos 95% dos casos e,
quando o bloco receptor é confeccionado com cilindros de 1,5 mm, o uso de dois fragmentos
de cada espécime é suficiente para garantir a representatividade dos dados em praticamente
100% dos casos (Skacel et al. 2002).
Em séries com número menor de casos, o uso de fragmentos com diâmetros maiores
mostra-se superior em termos de representatividade e facilidade técnica, já que a confecção do
bloco é mais fácil e sua análise mais cômoda. O uso de fragmentos de diâmetros menores,
como foi utilizado em nosso estudo, tem a vantagem de permitir trabalhar grandes amostras.
Além da economia de material de consumo, como lâminas, corantes e anticorpos, o
TMA apresenta outras vantagens, como por exemplo: o grande número de cortes histológicos
de diferentes neoplasias em uma única lâmina aperfeiçoa a qualidade do método, já que as
diferentes amostras são preparadas e coradas em condições idênticas, inclusive as amostras
usadas como controle; a confiabilidade da interpretação é maior, uma vez que é possível a
comparação da intensidade da coloração em fragmentos colocados contiguamente; novas
secções histológicas podem ser feitas do mesmo bloco e a interpretação e a quantificação dos
resultados podem ser feitas em poucas horas com o uso de microscópio óptico (Kallioniemi et
al. 2001).
DISCUSSÃO
103
No presente estudo, o valor preditivo dos marcadores moleculares foi avaliado sob
diferentes contextos: inicialmente pesquisamos a associação destes marcadores com o IPI na
tentativa de identificar novos subgrupos.
Em seguida analisamos o impacto da expressão imunoistoquímica dos marcadores
sobre a resposta à quimioterapia e sobre a evolução dos casos e, finalmente, dirigimos nossa
observação para o impacto dos marcadores quando se expressam em células tumorais com
perfil de centro germinativo ou pós-centro germinativo.
Nossos resultados demonstram que a expressão imunoistoquímica dos marcadores
moleculares não apresenta associação com os grupos de risco do IPI, exceto o CD10. No
grupo de baixo risco o CD10 foi mais freqüente que no de alto risco.
Na casuística estudada por Ohshima et al. em 2001, a expressão do CD10 além de ser
mais freqüente nos pacientes de baixo risco do IPI também apresentou impacto sobre a
sobrevida deste grupo de pacientes. No grupo de alto risco, a expressão do CD10 não
apresentou impacto sobre a evolução dos casos.
Biasoli et al. em 2005, reportou que o DC10 não determinou impacto na SG, quando
considerado o total de pacientes independente do IPI, mas ao analisar os resultados no grupo
de baixo risco do IPI, a expressão do CD10 foi associada a melhor evolução. A identificação
destes dois grupos de pacientes, dentro do mesmo grupo de risco do IPI, reflete a
heterogeneidade biológica do LDGCB, explica a falha deste modelo prognóstico e as
diferentes evoluções observadas neste grupo.
Baseados nestes resultados podemos propor que a expressão do CD10, nos pacientes
classificados pelo IPI como tendo baixo risco, seja considerada fator de bom prognóstico,
diferentemente daqueles pacientes que não expressão CD10.
Nossos resultados também demonstram que a expressão do CD10 apresenta impacto
favorável sobre a resposta completa à quimioterapia e sobre a sobrevida global.
DISCUSSÃO
104
Provavelmente este fato seja o reflexo da atuação do DC10 como enzima pró-apoptótica, com
capacidade de proteger a célula da resistência primária à quimioterapia. Este argumento passa
a ter importância quando a análise multivariada demonstra que a resistência primária à
quimioterapia é a variável que apresenta maior risco de óbito.
Há várias hipóteses para explicar o papel do CD10 nas células selecionadas para
apoptose. Uma delas se baseia na capacidade das células linfóides de liberar citoquinas anti-
apoptóticas, mesmo depois do mecanismo de apoptose ter sido ativado. Neste caso, o papel do
CD10 seria o de degradar estes peptídeos, permitindo que o processo apoptótico seja
executado (Morabito et al. 2003).
Outra evidência da ação pró-apoptótica do CD10 é que esta proteína é detectada nas
células B do CG, células que são particularmente direcionadas à apoptose, enquanto que
células B ativadas que não sofrem apoptose espontaneamente não expressam CD10
(Martinez-Valdez et al. 1996).
Evidências da associação do CD10 com a apoptose também são encontradas em
tecidos tumorais: as células do linfoma de Burkitt, que conhecidamente apresentam apoptose
espontânea, tanto in vitro quanto in vivo, expressam abundante quantidade de CD10 (Rowe et
al. 1987); células do linfoma de Burkitt, quando transfectadas com c-myc, aumentam a taxa
de apoptose espontânea e a expressão de CD10 (Cutrona et al. 1995); células B induzidas à
apoptose pelo vírus da imunodeficiência humana têm expressão aumentada de CD10 (De-
Rossi et al. 1994).
Outro aspecto de relevância em nosso estudo é a expressão de BCL-6 que também
apresentou impacto favorável sobre a resposta à quimioterapia. A ação anti-apoptótica do
BCL-6 tem sido sugerida através de diferentes linhas de pesquisa.
Assim, foi demonstrado que o BCL-6 e o p53 exercem controle regulatório mútuo, in
vitro e in vivo (Phan, Dalla-Favera, 2004; Margalit et al. 2006); Yamochi et al., em 1999,
DISCUSSÃO
105
trabalhando com a linhagem celular CV-1, observaram associação entre a expressão de BCL-
6, o fenótipo apoptótico e a ausência de expressão de BCL-2 e de BCL-X
L.;
os resultados
relatados por Bai et al. em 2003, também apresentam correlação positiva entre a expressão de
BCL-6, alto índice de proliferação e alto índice de apoptose, além de identificaram correlação
negativa entre a expressão de BCL-6 e de BCL-2; resultados semelhantes foram relatados
por Larocca et al., em 1998.
Winter et al. em 2006, estudando o impacto da adição do anticorpo monoclonal anti-
CD20, rituximabe, ao esquema de quimioterapia CHOP, observaram que nos casos que não
expressavam BCL-6, a sobrevida livre de recidiva (SLR) e a sobrevida global foram
prolongadas naqueles pacientes tratados com R-CHOP (dois anos de SLR 76% versus 9%;
SG 78% versus 17%) quando comparados com aqueles tratados com CHOP. Enquanto que
nenhuma diferença foi observada na SLR e na SG dos casos que expressavam BCL-6. Estes
dados demonstram o impacto favorável do BCL-6 sobre a resposta à quimioterapia e revelam
BCL-6 como fator de bom prognóstico.
Ao contrário do CD10 e do BCL-6 que apresentaram características de bom
prognóstico, as expressões das proteínas OCT-2 e survivina apresentaram impacto
desfavorável sobre a resposta à quimioterapia.
Este resultado se explica em virtude do mecanismo de ação anti-apoptótico destas
proteínas ocorrer sobre a via intrínseca da apoptose, local de ação dos quimioterápicos
antitumorais. A survivina bloqueia a caspase 3 e, o OCT-2 atua diretamente na região
promotora do gene bcl-2. Como a resistência primária aos quimioterápicos permanece a maior
causa de falha do tratamento, conseqüentemente, a expressão da survivina e do OCT-2 deve
ser considerada um evento de mau prognóstico no LDGCB.
In vitro, as células com aumentada expressão de BCL-2 são resistentes à radiação e à
quimioterapia. Interessantemente a superexpressão, mas não a translocação se correlaciona
DISCUSSÃO
106
com resultados inferiores de sobrevida, sugerindo que BCL-2 isoladamente não é a causa da
resistência à droga, mas um biomarcador de outros mecanismos, como a ativação do NFκB
(Wilson; 2006).
Estes dados podem explicar, mesmo que parcialmente, nossos resultados referentes à
expressão de BCL-2. Não foi observada diferença estatística entre a expressão de BCL-2 e a
resposta completa à quimioterapia. No entanto houve impacto desfavorável na SLE e na SG.
Como desconhecemos o mecanismo de ativação do bcl-2 em nossa casuística, novos estudos
devem ser realizados para esclarecer esta diferença.
A proteína BCL-2 é freqüentemente superexpressa no LDGCB e seu impacto tem sido
objeto de estudo por diferentes grupos. Os resultados apresentados, por exemplo, pelo GELA
(Groupe d'Etude des Lymphomes de l'Adulte) sugerem que o efeito adverso da
superexpressão do BCL-2 pode ser anulado pela ação do anticorpo monoclonal anti-CD20,
rituximabe (Coiffier et al. 2002; Mounier et al. 2003). Os dados atualizados e com mediana de
seguimento de cinco anos mostram que o rituximabe continua tendo impacto favorável na
evolução dos pacientes com expressão positiva de BCL-2, sugerindo que o rituximabe é capaz
de reverter a resistência à quimioterapia em porcentagem significante de pacientes portadores
de LDGCB e mudar a evolução da neoplasia (Mounier et al. 2006).
Sumariamente, na nossa pesquisa a análise univariada identificou o CD10 e o BCL-6
como fatores de bom prognóstico e, a survivina, o OCT-2 e o BCL-2 como marcadores de
mau prognóstico.
A expressão imunoistoquímica destas proteínas tem sido objeto de pesquisa e,
diversos algoritmos têm sido sugeridos com a finalidade de reproduzir os resultados
apresentados pelo método de assinatura gênica.
Hans et al., em 2004, usando a mesma casuística utilizada por Rosenwald et al. em
2002, demonstraram que a expressão imunoistoquímica do CD10, do BCL-6 e do MUM1
DISCUSSÃO
107
poderia ser usada para sub classificar o LDGCB. O algoritmo proposto por estes autores
utiliza CD10 e BCL-6 como marcadores do subgrupo CG e MUM1 como marcador do
subgrupo NCG.
Os autores justificam esta opção em virtude do CD10 ser expresso na superfície das
células B do centro folicular; o BCL-6 exercer papel central na formação do centro
germinativo, no início da formação do centro germinativo reacional e, desaparece quando as
células são selecionadas para a apoptose ou para a diferenciação em plasmócito ou célula
memória e, MUM1 ser expresso apenas nos linfócitos com algum grau de diferenciação
plasmocitóide e nos plasmócitos.
Este algoritmo reproduziu os resultados da técnica de arranjo de cDNA em 71% no
CG e em 88% no NCG, além de predizer de maneira semelhante a sobrevida em ambos os
grupos.
O uso de três marcadores com o poder de discriminar o prognóstico dos pacientes
portadores de LDGCB nos parece bastante razoável do ponto de vista de metodologia, custo e
benefício. A expressão de CD10 como sendo o marcador que define 80% dos casos
pertencentes ao subgrupo CG é bastante interessante quando estamos tentando minimizar os
custos e o tempo dispensado na etapa do diagnóstico.
A expressão de MUM1 no LDGCB e os resultados desfavoráveis no subgrupo NCG,
foi sugerida a partir dos dados que revelaram que MUM1 é um gene alvo de NF-κB e, que
MUM1 reflete a ativação desta via, resultando na expressão de outros genes alvos de NF-κB;
como por exemplo: bcl-2 e XIAP (Wang et al. 1998; Chen et al. 2000). A inibição da via NF-
κB em linhagem celular resultou em aumento da sensibilidade à quimioterapia no subgrupo
com fenótipo NCG, mas não foi observado nenhum efeito no fenótipo CG (Davis et al. 2001;
Piva et al. 2005).
DISCUSSÃO
108
Do ponto de vista de decisão terapêutica, o algoritmo composto por CD10, BCL-6 e
MUM1, também nos parece interessante por permitir identificar aqueles pacientes com muito
bom prognóstico (CD10 positivo) que se beneficiarão com o esquema de tratamento
convencional; enquanto que os casos MUM1 positivos são candidatos a esquemas de
tratamento mais intensivos.
No algoritmo, BCL-6 também tem poder de orientação terapêutica e valor prognóstico
ao discriminar, como pertencente ao subgrupo CG, o caso CD10 negativo e MUM1 negativo.
Na realidade estes casos podem ser incluídos no grupo de bom prognóstico em virtude do
BCL-6 conferir à célula sensibilidade à quimioterapia, como ficou demonstrado nos nossos
resultados.
O impacto da expressão de BCL-2 na evolução do LDGCB tem sido alvo de atenção,
em virtude de seu comportamento ser diferente nos subgrupos CG e NCG. Em nossa
casuística a expressão do BCL-2 reproduziu estes dados, pois não observamos impacto sobre
a evolução dos casos classificados como CG e, em contrapartida, nos casos classificados
como NCG a expressão do BCL-2 mostrou-se de mau prognóstico.
Esta diferença é atribuída ao fato das células tumorais apresentarem diferentes
genótipos, provavelmente como resultado de diferentes mecanismos de transformação
tumoral. Por exemplo, nas células do CG a translocação t(14;18)(q32;q21) está presente em
45% dos casos, não tendo sido observado impacto sobre a evolução dos casos (Bea et al.
2005; De Paepe, Wolf-Peeters, 2007). Enquanto que, nas células do NCG a expressão do
BCL-2 está relacionada à ativação da via NF-κB e/ou a amplificação gênica (Iqbal et al. 2004;
Rosenwald et al. 2006).
O tratamento dos linfomas, baseado em alvos moleculares, representa uma nova era de
possibilidades terapêuticas e mostra como é importante a identificação do perfil genético da
neoplasia na escolha do tratamento. Embora alguns marcadores percam seu impacto durante a
DISCUSSÃO
109
evolução da terapêutica, a análise destes marcadores biológicos continua a ter importância
para o entendimento biológico da neoplasia.
6. CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
111
1 – A expressão de CD10 é mais freqüente no grupo de baixo risco do IPI.
2 – Nos casos que apresentam resposta completa à quimioterapia, as expressões de CD10 e de
BCL-6 são mais freqüentes, portanto as expressões destas proteínas podem ser
consideradas fatores de bom prognóstico.
3 – Nos casos que apresentam resistência primária à quimioterapia, as expressões de OCT-2 e
de survivina são mais freqüentes, portanto as expressões destas proteínas podem ser
consideradas fatores de mau prognóstico.
4 – O algorítimo baseado nas expressões imunoistoquímicas de CD10, BCL-6 e MUM1
identificou dois subgrupos com diferentes prognósticos, sendo que a expressão do CD10
define 80% dos casos pertencentes ao CG e a expressão de MUM1 define os casos
pertencentes ao NCG.
5 – A expressão do BCL-2 no subgrupo NCG apresenta impacto desfavorável na evolução
dos casos, contudo isto não foi observado no subgrupo CG. Estes resultados sugerem
diferentes mecanismos de transformação tumoral
6 – IPI de alto risco, ausência de resposta completa à quimioterapia, expressão
imunoistoquímica da proteína BCL-2 e fenótipo NCG são fatores independentes de mau
prognóstico, portanto devem ser avalizados nas decisões terapêuticas e na definição do
prognóstico.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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RESUMO
127
RESUMO
EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE MARCADORES MOLECULARES NO
LINFOMA DIFUSO DE GRANDES CÉLULAS B. Carvalho, Marineide Prudencio. Tese.
2007.
INTRODUÇÃO – A técnica de assinatura gênica, a partir de arranjo de DNA em matriz,
identifica duas formas distintas de LDGCB com diferentes prognósticos. No entanto, esta
técnica é constituída por metodologia complexa e alto custo. Uma alternativa é o arranjo
tecidual em matriz que é um arquivo miniaturizado de amostras, apresenta menor custo e
utiliza o método imunoistoquímico. OBJETIVOS – A identificação de marcadores
moleculares prognósticos no linfoma difuso de grandes células B através do método
imunoistoquímico. CASUÍSTICA E MÉTODOS - Foram estudados retrospectivamente 86
casos de linfoma não-Hodgkin difuso de grandes células B de novo (51,2% sexo masculino /
48,8% sexo feminino; idade mediana 59 anos; mediana para o tempo de seguimento 16 meses
e média 27 meses; doença nodal 63% dos casos). Material de biópsia conservado em parafina
foi corado com anticorpos anti-CD10, BCL-6, BCL-2, MUM1, p53, OCT-2, STAT-1 e
survivina, utilizando a técnica do arranjo tecidual em matriz. RESULTADOS – A expressão
de CD10 foi mais freqüente no grupo de baixo risco do IPI (p= 0,024). As expressões de
OCT-2 e de survivina foram mais freqüentes nos casos com resposta parcial à quimioterapia
(p= 0,04) ou progressão da doença (p= 0,03). As expressões de CD10 e de BCL-6 foram
associadas à resposta completa à quimioterapia (p= 0,03) e (p= 0,03), respectivamente. A
expressão de BCL-2 foi associada à menor probabilidade de sobrevida livre de eventos (p=
0,006) e de sobrevida global (p= 0,03). O algorítimo baseado nas expressões de CD10, BCL-6
e MUM1 identificou dois subgrupos de LDGCB, sendo 31 casos pertencentes ao centro
germinativo (CG) e 53 casos de não-centro germinativo (NCG). A expressão do BCL-2 no
NCG apresenta impacto na evolução, o mesmo não ocorre no CG. Na análise multivariada, os
fatores de risco independentes para a morte relacionada à doença são: IPI de baixo risco,
resposta parcial ou progressão de doença, expressão de BCL-2 e imunofenótipo NCG.
CONCLUSÕES – As expressões das proteínas antiapoptóticas OCT-2 e survivina e BCL-2
foram associadas com a resistência à quimioterapia e, podem ser consideradas fatores de mau
prognóstico. A imunofenotipagem do LDGCB baseada nas expressões das proteínas CD10,
BCL-6 e MUM1 identifica dois subgrupos de LDGCB com distintas evoluções. A expressão
de BCL-2 no subgrupo NCG apresentou impacto desfavorável, fato não observado no
subgrupo CG. Este resultado pode refletir a ativação de diferentes vias genéticas nos
subgrupos do LDGCB e consequentemente distintas evoluções clínicas. Portanto, a
identificação de marcadores moleculares mostra-se importante para as decisões terapêuticas,
além de auxiliar no entendimento do processo de transformação neoplásica.
ABSTRACT
128
ABSTRACT
MOLECULAR MARKERS' IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION IN
DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA. Carvalho, Marineide Prudencio. Thesis. 2007.
INTRODUCTION- The technique of gene signature from the DNA arrangement in the
matrix identifies two distinct forms of DLBCL associated with differences in the clinical
outcome. However this technique is complex and expensive. One option is the novel
technology of tissue microarray (TMA) which allows rapid and cost-effective analysis of
hundreds of markers on the same set of specimens. OBJECTIVE – Identification of
molecular markers in DLBCL by immunohistochemical method. CASES AND METHODS–
Eighty-six cases of DLBCL de novo lymphoma were studied retrospectively (51.2% male/
48.8% female, median age of 59 years, median follow-up time of 16 months and average of
27.5 months, 63% nodal disease). Paraffin sections from each sample were immunostained
with antibodies against CD10, BCL-6, MUM1, BCL-2, p53, OCT-2, STAT-1 and survivin.
RESULTS- Expression of CD10 was the most frequent in the low-risk for the IPI group (p=
0.024). Expressions of OCT-2 and survivin were the most frequent in the cases with partial
response to chemotherapy (p= 0.04) or progressive disease (p= 0.03). Expressions of CD10
and BCL-6 were associated with complete response (p= 0.03) and (p= 0.03), respectively.
Expression of BCL-2 was associated with the least probability of event-free survival (p=
0.006) and overall survival (p= 0.03). CD10 was associated with the greatest probability of
OS (p= 0.02). Cases were subclassified using CD10, BCL-6 and MUM1 expression, and 31
cases (36%) were considered germinal center B-cell-like (GCB), and 55 cases (64%) non-
germinal center B-cell-like (non-GCB). While the expression of BCL-2 in the non-GCB
presents impact on the outcome, the same does not occur in the GCB. In the multivariate
analysis, the high-risk IPI, the PR/PD, BCL-2 expression and the immunophenotype NGC are
associated with a higher risk of death. CONCLUSIONS -Expressions of antiapoptótico
proteins OCT-2, survivin and BCL-2 were associated with a drug resistance to chemotherapy
and may be considered a bad prognosis factor in DLBCL. Immunostains using CD10, BCL-2
and MUM1 were able to identify two groups of DLBCL with different outcomes. BCL-2
protein expression presented unfavorable impact on the outcome in non-GCB, which was not
observed in the GC. Therefore, BCL-2 protein expression may reflect activation of different
genetic pathways in the two subgroups of DLBCL and distinct clinical implications.
APÊNDICE
129
APÊNDICE
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130
APÊNDICE
131
Tissue microarrays method is useful for immunophenotyping and analyses of molecular
markes with outcome predictive value in patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma
Authors- Carvalho, Marineide Prudencio; Chiattone, Carlos; Ribeiro, Karina Barbosa; Soares,
Fernando Augusto; Paes, Roberto Antonio Pinto.
Institution-
Hematology and Oncology Department of Santa Casa Medical School of Sao
Paulo, Brazil; Pathology Department Antonio Prudente Foundation, Sao Paulo, Brazil;
Pathology Department of Santa Casa Medical School of Sao Paulo, Brazil.
Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is heterogeneous both clinically and
morphologically reflecting a mixture of underlying biologic or genetic differences. Therefore,
it is important to identify at diagnosis biological markers which permit determination of
subgroups with favourable or unfavourable evolution. Tissue microarray technology
(TMA) is useful for immunophenotyping and clinic pathological analyses and it makes
diagnosis less labor-intensive at lower cost. The aim of this study was to identify at diagnosis
biological markers through TMA. As in other studies, CD10 expression predicted a
favourable outcome (p= 0.02), whereas BCL-2 expression was associated with decreased
survival (p= 0.03) , OCT-2 and survivin expressions were the most frequent in the cases with
partial remission or progressive disease profiling subtypes of DLBCL, (p= 0.04) and (p=
0.03), respectively. Based on CD10, BCL-6, and MUM1 expression, germinal center B-cell-
like subgroup (GCB) is characterized by a better prognosis than activated B-cell (ABC)
subgroup (p=0.02). BCL-2 expression had an unfavorable impact on overall survival within
the ABC subgroup, whereas within GCB subgroup had no impact on survival. Therefore,
TMA method is a valuable method to identify molecular markers in DLBCL.
Keywords: Prognostic molecular markers; tissue microarrays; diffuse large B-cell lymphoma
Correspondence- Dr Carlos Chiattone- Rua Marquês de Itú 579, 3
o
andar, CEP 01223-001,
Vila Buarque, São Paulo, SP, Brasil. E-mail- [email protected]
Diffuse Large B-Cell Lymphoma is the most common of the non-Hodgkin lymphomas. This
lymphoma may be de novo or from the transformation of indolent lymphomas. The technique
of gene signature from the DNA arrangement in the matrix identifies two distinct forms of
DLBCL—one that express genes characteristic of the GCB cells and another, which express
genes which are normally induced during in vitro and in vivo ABC. Many of these genes
codify proteins which play a role in the transcription factors and thus control the tumor
transformation and response to the chemotherapy program.
1
Immunohistochemical expression
of these proteins is variable within the subgroups identified by the gene signature.
2-5
Tissue
microarrays (TMA) appear to be particularly useful for immunohistochemical characterization
of lymphomas and facilitate comprehensive molecular characterization of a large number of
tumors at a time.
6-8
The biologic insights provide by molecular studies should allow for more
targeted therapies to be developed, which will increase treatment choice and the possibility of
tailored therapy. Reliable prognostic markes could allow the identification of patient subsets
that may benefit from alternate approaches.
3
The aim of this study was to evaluate the
association between the immunohistochemical expression of CD10, BCL-2, BCL-6, MUM1,
p53, OCT-2, STAT-1 and survivin and its association with the International Prognostic Index
(IPI) and to evaluate the association between the immunohistochemical expression of BCL-2,
p53, OCT-2, STAT-1 and survivin and the GC and NGC subgroups.
APÊNDICE
132
Pathological Specimens
From the files of the Department of Pathology at Santa Casa Medical School of Sao Paulo,
74 cases de novo DLBCL were selected and representative paraffin embedded tissue blocks
were retrieved for construction of tissue microarrays.
Immunohistochemical Study
A tissue microarray block was prepared from 74 cases of de novo DLBCL (Figure 1). The
tissue microarray block consisted of two 1-mm tissue cores for each case. Sections were
stained with hematoxylin-eosin, CD20 (Clone L26; dilution 1:200, from DakoCytomation,
Carpinteria, CA, USA), CD10 (Clone 56C6, dilution 1:100, Novocastra, UK), BCL-6 (Clone
GI 191E/A8, dilution 1:50, Cell Mark, UK), MUM1 (Clone MUM1p, dilution 1:100, from
Dako), BCL-2 (Clone 124, dilution 1:50, from Dako), p53 (Clone DO-7, dilution 1:100, from
Dako), survivin (Polyclonal antibody, dilution 1:100, from Neomarkers, USA), OCT-2
(Polyclonal antibody, 1:3000, from Santa Cruz Biotechonology, Santa Cruz, CA, USA),
STAT-1 (polyclonal antibody, dilution 1:3000, from Santa Cruz). Staining of more than 10%
of tumor cells was considered positive for CD10 and BCL-2; staining of more than 20% of
tumor cells was considered positive for MUM1, p53, BCL-6, OCT-2, STAT-1 and survivin.
Statistical Analysis
Categorical data were analyzed using χ2 test, whereas non-parametric tests were used for
ordinal data. Survival curves were estimated by using Kaplan-Meier method. The log-rank
test was used to compare Kaplan-Meier survival curves. Survival time was measured from the
time of the initial diagnosis. Multivariate survival analysis was performed with Cox's stepwise
proportional hazards model.
Results
Immunohistochemical Findings
As shown in Figure 2, positive immunohistochemistry staining results for CD10 was observed
in 22 of 74 cases (30%). Thirty-six cases (49%) gave positive reactions with antibody to
BCL-6. Thirty-five cases (47%) showed plasmatic membrane expression to BCL-2. Nuclear
immunohistochemical expression was show in 36 cases (49%) to MUM1, in 53 cases (71%)
to p53 and 60 cases (81%) to OCT-2. Cytoplasmic and nuclear immunohistochemical
expressions were shown in 49 cases (66%) to STAT-1 and in 60 cases (81%) to survivin.
Liver biopsy was used as external control.
Prognostic Parameters
The cases were distributed as follows: 51.2% male/ 48.8% female, median age of 59 years,
median follow-up time of 16 months and average of 27.5 months, with 63% presenting nodal
disease. The CD10 expression was the most frequent in the low-risk for the International
Prognostic Index group (p= 0.024). The OCT-2 and survivin expressions were the most
frequent in the cases with partial remission (p= 0.04) or progressive disease (p= 0.03). The
CD10 and BCL-6 expressions were associated with the complete remission (p= 0.03) and (p=
0.03), respectively. The BCL-2 expression was associated with the least probability of event-
APÊNDICE
133
free survival (p= 0.006) and overall survival (p= 0.03). The CD10 expression was associatd
with the greatest probability of overall survival (p= 0.02). No association was found between
the expression of p53, OCT-2, STAT-1 and survivin with overall survival. We used the same
decision algorithm as Hans et al
2
and each case was then assigned to GCB or ABC categories
on the basis of its immunohistochemistry profile. A case was assigned to the GCB category if
it was positive for CD10 or it was BCL-6 positive and MUM1 negative. Otherwise, it was
assignments ABC category. Twenty-five cases (34%) were comprised of GCB DLBCL and
49 cases (66%) were comprised ABC DLBCL . Overall survive was shorter in ABC DLBCL
(p=0.02) (Figure 3). While the expression of BCL-2 in the ABC DLBCL presents impact on
the outcome, the same does not occur in the GCB DLBCL (Figure 4). In the multivariate
analysis, the high-risk IPI, the PR/PD, the positive expression of the BCL-2 protein and the
immunophenotype ABC DLBCL are associated with a higher risk of death.
Discussion
The use of immunohistochemical methods has become part of the routine diagnostic
procedure in several malignancies, and is essential in lymphoma. Moreover,
immunohistochemistry using a limited number of markers is an attractive alternative
technique that enables exploration in larger retrospective and prospective studies, in
uniformly treated series from clinical trials. Furthermore, integration of many other markers
that have been identified over the years as single prognostic markers is feasible. Tissue
microarrays appear to be particularly useful for immunohistochemical characterization of
lymphomas. Combining TMA and immunohistochemistry will enable a rapid and cost-
effective screening of marker expression.
The staining of a single TMA slide provides a much great degree of consistency and
standardization than the immunostaining of hundreds of individual slides and reduces the
amount of antibodies. Quantitation of immunostaining is markedly easier on arrayed samples
than on large sections. Also, this facilitates a reproducible application of the selected scoring
criteria because the entire tissue is always used for interpretation and the subjective selection
of one tumor area for decision making is avoided.
9
A potential caveat of TMA technology is the limited amount of tissue analyzed. The TMA
approach has been criticized for its use of small punches of usually only 0.6 mm (0.27 mm
2
)
diameter from tumor with an original size of up several centimeters in diameter, comprising
areas of increased proliferation, apoptosis, matrix remodeling and necrosis. Care in the
composition of an array and a certain degree of redundancy is essential to minimize sampling
drawbacks, because the selection of different tumor areas should be oriented towards the
requirements of the investigated tumor entity.
7
Among alternatives to circumvent those problem is the use of larger punch needles of up to 2
mm diameter (3 mm
2
). The obvious disadvantage, for the use of TMA in cancer research, is
that instead of several hundreds of tumors on a single slide/section, far fewer than 100
samples can be investigated at the same time. Despite the fact that these arrays might be
suboptimal for cancer research, large punch arrays may be preferable for distinct areas of
research and perhaps routine practice. The disadvantage is that these large punches cause
considerable damage to the donor and acceptor blocks, when conventional paraffin wax
blocks are used .
10
Our study clearly showed the ability of TMA to identify the expression of prognostics
markers and subgroups of DLBCL proved to be highly compatible with cDNA. As in other
studies, CD10 expression predicted a favorable outcome, whereas BCL-2 expression was
associated with decreased survival
11-12
, OCT-2 and survivin expressions were the most
APÊNDICE
134
frequent in the cases with partial remission or progressive disease.
13
Three antigens (CD10,
BCL-6, and MUM1) have shown promise in their ability to predict gene expression profiling
subtypes of DLBCL. Based on these markers we showed similar results. Germinal center B-
cell-like subgroup is characterized by a better prognosis than ABC.
2,14-15
When DLBCL was analyzed as a single entity, patients with BCL-2 expression had a
significantly worse overall survival. Analyzing BCL-2 expression in the context of DLBCL
subgroups, we observed that BCL-2 expression had an unfavorable impact on overall survival
within the ABC subgroup, whereas within GCB subgroup had no impact on survival.
Therefore, the significance of biomarkers should be assessed in the context of DLBCL
subgroups, which will increase treatment choice and the possibility of tailored therapy.
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