( PDF ) Avaliação genotóxica e antigenotóxica de extratos obtidos a partir das esponjas marinhas Aplysina fulva e Arenosclera brasiliensis

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Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Ciências Médicas

Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental

Avaliação genotóxica e antigenotóxica de extratos

obtidos a partir das esponjas marinhas Aplysina fulva e

Arenosclera brasiliensis.

Luiza da Cunha Stankevicins

Rio de Janeiro

2008

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Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Ciências Médicas

Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental

Avaliação genotóxica e antigenotóxica de extratos

obtidos a partir das esponjas marinhas Aplysina fulva e

Arenosclera brasiliensis

Luiza da Cunha Stankevicins

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Fisiopatologia Clínica e

Experimental da Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro para

obtenção do grau de Mestre em Fisiopatologia

Clínica e Experimental.

Rio de Janeiro

2008

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iii

Ficha Catalográfica

Stankevicins, Luiza

Avaliação genotóxica e antigenotóxica de extratos obtidos a partir das esponjas

marinhas Aplysina fulva e Arenosclera brasiliensis./ Luiza da Cunha Stankevicins - Rio

de Janeiro, 2008.

xii, 104p.: il

Dissertação (Mestrado)- Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade

de Ciências Médicas, Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e

Experimental

Orientador: Prof. Dr. Israel Felzenszwalb

Co- Orientadora: Profa. Dr. Claudia Alessandra Fortes Aiub

1. Arenosclera brasiliensis 2. Aplysina fulva 3.Teste de mutação reversa 4.

Produtos naturais marinhos 5. Genotoxicidade 6. Antigenotoxicidade.

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Ciências Médicas

Programa de Pós Graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental

Avaliação genotóxica e antigenotóxica de extratos

obtidos a partir das esponjas marinhas Aplysina fulva e

Arenosclera brasiliensis

Luiza da Cunha Stankevicins

Orientador: Israel Felzenszwalb

Co- Orientação: Claudia Alessandra Fortes Aiub

Banca Examinadora:

Efetivos:

Prof

. Dr

. Helena Pereira da Silva Zamith

Prof. Dr. Nasser Assad

Prof

. Dr

. Kátia Costa de Carvalho Sabino

Suplentes:

Prof. Dr. José Luiz Mazzei

Prof

. Dr

. Marsen Garcia Pinto Coelho

Prof

. Dr

. Manuela da Silva

Rio de Janeiro

2008

Aos meus pais.

Agradecimentos:

• À minha família pelo total apoio e confiança.

• À Braulio Medina, meu namorado, pelo carinho, paciência e incentivo.

• À Claudia Aiub por seu apoio e orientação durante os anos que

trabalhamos juntas.

• Ao prof. Israel Felzenszwalb pela orientação.

• Ao prof. Luiz Claudio Santa-Maria, Departamento de Química

Orgânica- Uerj, pela ajuda na análise dos extratos.

• Ao pessoal do Labmut pela colaboração e pelas horas agradáveis de

trabalho .

• E a todos os demais que contribuíram de forma indireta para a realização

deste trabalho.

vii

Lista de Siglas e Abreviaturas

a.C- Antes de Cristo

ONU- Organização das Nações Unidas

UV- Radiações ultravioleta

AZT-

Zidovudina, 3’ azido-3’-deoxitimidina

ICH- International Conference on Harmonization

OECD- Organization for Economic Co-Operation and Development

FDA- Food and Drug Administration

SMART- Somatic Mutation and Recombination Test

ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária

viii

Lista de figuras

Figura 1: Foto Aplysina fulva na Pedra Vermelha, Arraial do Cabo por Eduardo

Hajdu; página 15.

Figura 2: Foto Arenosclera brasiliensis Amostra coletada na praia de João

Fernandinho, Búzios por Gisele Lobo- Hajdu; página 16.

Lista de quadros

Quadro 1: Exemplos de compostos obtidos a partir de esponjas e sua respectiva

ação biológica; página 6.

Quadro 2: Exemplos de produtos naturais, largamente utilizados, derivados de

plantas e de microorganismos; página 12.

Resumo:

O ambiente marinho vem se destacando como uma fonte promissora para

produção de novos fármacos. A grande diversidade de organismos encontrada nos

oceanos dá origem a compostos com padrões estruturais únicos não encontrados em

produtos naturais de outra natureza. A maioria dos metabólitos secundários

provenientes de organismos marinhos é produzida pelo filo Porifera, popularmente

conhecido como esponjas marinhas. Devido à sua natureza séssil, as esponjas possuem

um mecanismo de defesa baseado na produção de substâncias químicas e a maioria dos

compostos já estudados possui atividades antiinflamatória, antibiótica, antiviral e

antitumoral. Embora sejam poucos os trabalhos que discutem o mecanismo de

interação destes compostos com o DNA, é sabido que as esponjas marinhas Aplysina

fulva e Arenosclera brasiliensis possuem substâncias com atividades citotóxica e

antitumoral. No presente estudo realizamos uma análise sobre a potencialidade

genotóxica de extratos aquoso, alcoólico e acetônico obtidos dessas esponjas. A análise

consistiu na realização de testes toxicológicos variados, como o de mutação reversa,

utilizando Salmonella typhimurium (TA97, TA98, TA100 e TA102), do SOS

cromoteste com Escherichia coli (PQ35, PQ37, PQ65, OG40 e OG100), do teste

cometa (cultura de células de mamíferos) e a avaliação da indução de quebra em DNA

plasmidial. O efeito antigenotóxico de extratos de A. brasiliensis foi avaliado através de

duas variações do teste de mutação reversa e de um tratamento plasmidial. Os extratos

de A. fulva apresentaram atividade genotoxica no teste de mutação reversa para as cepas

TA97 e TA100, validado pelo SOS cromoteste para as cepas PQ35, PQ37 e PQ65 e

pelo ensaio cometa com detecção de aumento na ocorrência de lesões no DNA. Os

extratos de A. brasiliensis não apresentaram efeito genotóxico; ao contrário, para

algumas das condições testadas, A. brasiliensis levou a uma diminuição no número de

colônias revertentes induzidas por 4 nitroquinolina 1- óxido, 2-aminofluoreno, azida

sódica e mitomicina C. Extratos de A. brasiliensis reduziram o número de quebras no

DNA induzidas pelo agente oxidante SnCl

, no tratamento plasmidial. Os resultados

sugerem que extratos aquoso e alcoólico de A. fulva possuem atividade genotóxica.

Extratos de A. brasiliensis, por sua vez, apresentaram atividade protetora contra

diferentes agentes genotóxicos.

Abstract:

Nature has provided a great diversity of compounds with biological activities

and has an important role on the development of new drugs. Nowadays marine

environment is being considered a promissing source of new bioactive compounds due

to their unique chemical patterns not found in non- marine organisms. Because of their

sessile nature sponges is the marine phylum (Porifera) with more compounds described.

Most secondary metabolites from sponges can be classified as antiinflamatory,

antibiotic, antitumor and antiviral. There are few works that investigated an interaction

between marine compounds and DNA. In the present work we performed a genotoxic

evaluation with aqueous, alcoholic and acetone extracts obtained from the sponges

Aplysina fulva and Arenosclera brasiliensis. Compounds with cytotoxic and antitumor

activities have already been isolated from these species. We performed different

toxicological in vitro assays: bacterial reverse mutation assay with Salmonella

typhimurium strains (TA97, TA98, TA100 and TA102), SOS cromotest with

Escherichia coli strains (PQ35, PQ37, PQ65, OG40 and OG100), comet assay and

DNA strand breaks induction analysis with plasmidial treatment. A possible

antigenotoxic effect from A. brasiliensis was also evaluated with two variations of

bacterial reverse assay. A. fulva extracts presented mutagenic activity verified by a

bacterial reverse mutation test with TA97 and TA100 strains, confirmed by SOS

cromotest with PQ35, PQ37 and PQ65 strains and by comet assay. A. brasiliensis

extracts have not shown any genotoxic effect. In antimutagenesis assays a decrease on

induced revertants number by 4-nitroquinolina 1-oxide, 2-aminofluorene, sodium azide

and mitomycin C could be observed under some tested conditions. A. brasiliensis

extracts and in plasmidial treatment, a reduction on DNA strand breaks induced by

SnCl

an oxidative agent was observed. These results suggest A. fulva crude extracts

have a genotoxic activity in and A. brasiliensis crude extracts have a protective action

against different kinds of genotoxic agents.

xii

Sumário

Lista de abreviaturas.................................................................................................... vii

Lista de Figuras ...........................................................................................................viii

Lista de Quadros............................................................................................................ ix

Resumo .............................................................................................................................x

Abstract.......................................................................................................................... xi

1. Introdução....................................................................................................................1

1.1. Uso de produtos naturais- Histórico .......................................................................2

1.2. Produtos naturais marinhos.....................................................................................6

1.2.1. Filo Porifera .....................................................................................................9

1.2.2. Fármacos provenientes de Poriferos ..............................................................12

1.2.3. Aplysina fulva................................................................................................14

1.2.4. Arenosclera brasiliensis................................................................................15

1.3. Importância da avaliação toxicológica de produtos naturais................................16

1.4. Estratégias nacionais e internacionais para normatização de avaliações

genotóxicas. .................................................................................................................17

1.4.1. Avaliação antigenotóxica...............................................................................20

2. Objetivos.....................................................................................................................22

2.1. Objetivos gerais ....................................................................................................23

2.2. Objetivos específicos ............................................................................................23

3. Genotoxic evaluation of extracts from Aplysina fulva, a Brazilian marine sponge

.........................................................................................................................................24

4. Genotoxic and antigenotoxic evaluation of extracts from Arenosclera brasiliensis,

a Brazilian marine sponge. ...........................................................................................33

5. Cytotoxic, mutagenic and antimutagenic screening of Arenosclera brasiliensis

acetone and ethanol extracts.........................................................................................70

6. Discussão ....................................................................................................................82

7. Conclusão ...................................................................................................................88

8. Referências bibliográficas ........................................................................................90

Anexo1: Guide for Authors- Toxicology in Vitro

Anexo2: Guide for Authors- Genetics and Molecular Research

1. Introdução

1.1. Uso de produtos naturais – Histórico

Os primeiros registros do uso de produtos naturais como medicamento datam de

2600 a.C, originários da Mesopotâmia. Esses registros descrevem a utilização de óleos

de cedro (Cedrus sp.) e pinheiro (Cupressus sp.), que ainda têm sua importância, na

medicina popular, para o tratamento de algumas doenças e infecções (The Global

Biodiversity Institute/International Institute of Tropical Agriculture, 2005).

Compostos presentes na natureza foram a base para a formação de sistemas

tradicionais de medicina, como a chinesa. Guias de 2000 a.C. encontrados na China já

documentavam o uso de plantas herbáceas. O livro “Chinese Materia Medica” foi

repetidamente documentado ao longo dos séculos tendo seu primeiro registro em 1100

a.C. Antigos relatos indianos, egípcios e gregos contribuíram substancialmente para a

classificação e desenvolvimento dos fármacos derivados de produtos naturais por

descreverem o uso destes como método preventivo e de tratamento de doenças

(Spainhour, 2006).

Os egípcios, em 1500 a.C., já tinham documentado o uso de diversas ervas, no

entanto, o mais conhecido dos documentos egípcios é o Eber Papyrus (1552 a.C.) que

descreve cerca de 1000 substâncias e formulações, a maioria através do uso de plantas

(Spainhour, 2006).

Em 1500 a.C., Asclepius, médico na antiga Grécia, alcançou fama em parte

devido ao uso de plantas medicinais na prática médica. Uma coleção de hinos

Ayuvédicos na Índia, datada de 1000 a.C. descreve o uso de cerca de mil diferentes

ervas servindo de base para o trabalho “Medicina Tibetana”, traduzido do sânscrito no

século 8 d.C (Spainhour, 2006). Em aproximadamente 300 a.C., o filósofo e cientista

Theophasus, escreveu “A história das plantas”, descrevendo os atributos medicinais de

algumas ervas e a maneira de cultivá-las, baseado no provérbio latino similia similibus

curantur, “semelhante cura semelhante”. Com essa teoria acreditava-se que a forma, a

cor, o sabor e o odor das plantas estavam relacionados com as suas propriedades

terapêuticas, podendo dar indícios de seu uso clínico. Algumas dessas plantas passaram

a fazer parte das farmacopéias alopáticas e homeopáticas a partir do século XIX, quando

se começou a investigar suas bases terapêuticas (Heinrich, 2003). O botânico grego

Pedanious Dioscorides, em 100 d.C. produziu “De Materia Medica” que ainda hoje é

um reconhecido documento sobre o uso de produtos naturais. Galen (130- 200 d.C.),

farmacêutico, dava aulas em Roma e era conhecido pelo preparo de formulações

complexas, contendo múltiplos ingredientes naturais, tendo publicado mais de 20 livros.

Monges, nos monastérios da Idade Média (séculos V-XII), copiaram diversos

manuscritos sobre ervas e seus usos (Spainhour, 2006).

Foram os árabes os principais responsáveis pela conservação dos documentos

gregos e romanos e pela expansão deste conhecimento, agregando a estas informações

conhecimentos sobre a medicina chinesa e indiana. O trabalho “Canon Medicinae”,

escrito pelo médico e filósofo persa Avicena, é considerado uma referência por

compilar e resumir os conhecimentos da medicina grega e romana (Spainhour, 2006).

Em 1506, durante a dinastia Ming, Li-Shih-Chen produziu uma enciclopédia de

fármacos intitulada “Pen-ts`ao kang mu”, registrando 1898 produtos naturais e 8160

prescrições (Spainhour, 2006).

O continente americano também teve uma importante contribuição na expansão

do conhecimento acerca do uso de produtos naturais, especialmente após a chegada dos

colonos quando houve uma escassez de médicos e a necessidade de se recorrer ao

conhecimento dos nativos. Este fato resultou na publicação de diversos almanaques e

outras publicações contendo diversas formulações com produtos naturais e variadas

informações médicas interessantes (Turola e Nascimento, 2006).

A medicina popular africana é a mais antiga e talvez a mais diversificada entre

os sistemas tradicionais. Isto se deve à riqueza biológica somada às diferenças culturais

regionais. A região de Madagascar se destaca ainda por um alto endemismo, chegando à

taxa de 82% das espécies presentes. Porém, infelizmente, os registros sobre estas

práticas são escassos e mal conservados. Algumas das espécies africanas conhecidas e

utilizadas na formulação de diversos produtos são: Acacia senegal (goma arábica), Aloe

vera, Artemisia afra e Commiphora myrrha (mirra) (Gurib-Fakim, 2006).

Assim como o continente africano, a América do Sul e Central também contam

com uma abundante diversidade de recursos naturais e de conhecimentos populares,

embora fracamente registrados. Algumas espécies originárias destes locais são:

Erythroxylum coca (coca), Ilex paraguariensis (mate), Peumus boldus (boldo), assim

como os legumes: batata, milho, tomate, amendoim, abóbora e batata doce que têm

enorme importância na agricultura (Gurib-Fakim, 2006).

De maneira isolada, em alguns desses documentos, existem citações sobre

efeitos biológicos de substâncias isoladas de organismos marinhos. Não há, entretanto,

um histórico de uso tão vasto e difundido como o das plantas medicinais (Sipkema et

al., 2005). Os relatos existentes apontam principalmente para seus efeitos tóxicos, como

os dos naturalistas Plinius (23-79 d.C.) e Darwin (1809-1882) que descreveram a

toxicidade do molusco do gênero Aplysia sp. (Kelecom, 1998). Esta escassez de dados

se deve principalmente à dificuldade de exploração dos mares historicamente relatada

através de lendas sobre seres fantásticos que habitariam os oceanos.

Embora o uso de produtos naturais seja milenar, sua aplicação na forma de

compostos isolados e caracterizados no desenvolvimento de novos fármacos, tem sua

origem somente no século XIX a partir da Revolução Industrial e do desenvolvimento

da química orgânica. A morfina, narcótico introduzido para uso terapêutico pela Merck

em 1826, foi o primeiro composto isolado de produtos naturais a ser comercializado. A

primeira droga semi-sintética baseada em um produto natural, introduzida no mercado

pela Bayer em 1899, foi a aspirina (ácido acetilsalicílico) a partir do isolamento do

ácido salicílico presente em cascas de salgueiro (Salix alba) e sua posterior

derivatização à acetato, o qual se mostrou menos tóxico (Spainhour, 2006; Turola e

Nascimento, 2006).

Tratamentos com produtos naturais têm uma grande aceitação por parte da

população. De acordo com a Organização das Nações Unidas (ONU), 80% da

população mundial confia neste tipo de terapia como primeira opção de tratamento (The

Global Biodiversity Institute/International Institute of Tropical Agriculture, 2005). Esta

ampla aceitação é em grande parte devido à falsa premissa de que produtos de origem

natural são livres de efeitos colaterais. Ignora-se o fato de que possam apresentar efeitos

tóxicos, como é o caso de alguns fármacos e de diversos venenos de origem natural

como a estricnina, originária de sementes do vegetal Nux vomica (Arnold e Harry,

1968).

Atualmente, cerca de 25% das drogas prescritas nos Estados Unidos da América,

contém extratos naturais ou compostos ativos extraídos deles. Das 520 novas drogas

aprovadas para o uso comercial entre 1983 e 1994, 30 eram produtos naturais e 127

eram compostos naturais modificados. O quadro 1 apresenta alguns importantes

fármacos em uso, derivados de plantas ou animais (Rates, 2001

Quadro 1: Exemplos de produtos naturais, largamente utilizados, derivados de

plantas e de microorganismos (Adaptado de Rates, 2001).

Nomedo composto Espécie Origem Ação

Digoxina Digitalius purpúrea Vegetal Tratamento cardíaco

Reserpina Raulwolfia serpentina Vegetal Anti-hipertensivo

Efedrina Ephedra sínica Vegetal Anti-asmático

Quinina Cinchona sp. Vegetal Anti-malárico

Morfina Papoula opiácea Vegetal Analgésico

Tubocurarina Curarea sp. Vegetal Relaxante muscular

Penicilina Penicillium sp. Animal Antibiótico

Ciclosporina Streptomyces sp. Animal Imunosupressor

Mevastatina e lovastatina Penicillium sp. Animal Redutor de colesterol

Ivermectina Streptomyces sp. Animal Anti-helmíntico

1.2. Produtos naturais de origem marinha

Devido à grande diversidade de compostos com atividade biológica presentes em

produtos naturais, a farmacologia busca aproveitar aqueles que possuem estruturas

químicas capazes de permitir o desenvolvimento de novos fármacos com princípios

ativos e modos de ação distintos dos já conhecidos (Harvey, 1999; Kijjoa e

Sawangwong, 2004).

O ambiente marinho vem se destacando como uma fonte promissora de novos

compostos para a indústria farmacêutica, com um destaque para o filo Porifera, devido à

vasta descrição de novas substâncias, possuindo principalmente, atividades

antibacteriana e antitumoral (Geldof et al.,1999; Schwartsmann et al., 2001; Rifai et al.,

2005; Mayer e Gustafson, 2006; Mayer et al., 2007).

Os mares e oceanos ocupam mais de 70% de toda superfície terrestre e durante

muitos séculos sua exploração foi inacessível à espécie humana. Muitos compostos

foram identificados durante os anos 80, seguindo grandes avanços na coleta de amostras

em mar profundo e de tecnologias que permitem a produção de drogas em larga escala

através da aquacultura e síntese química (Rocha et al., 2001).

Estima-se haver de 1,5 a 4,5 milhões de diferentes espécies marinhas, a maioria

ainda não descrita. Acredita-se ainda que a biodiversidade presente em águas profundas

e em recifes de corais supere a encontrada nas florestas tropicais (Guyot, 2000).

Esta grande diversidade dá origem à compostos com padrões estruturais únicos

não encontrados em produtos naturais de outra natureza com um grande potencial para

uso farmacológico, cosmético, nutricional, entre outros (Kijjoa e Sawangwong, 2004).

À medida que as descobertas de compostos biologicamente ativos presentes em

organismos marinhos avançam (Mayer, 1999; Torres, 2002; Sipkema et al., 2005),

percebe-se que os mais produtivos tendem a ser os de corpo mole e modo de vida

sedentário, que aparentemente não possuem defesas físicas. Isto se deve ao fato de que o

mecanismo de defesa destes animais é baseado na produção de compostos químicos que

geralmente são lançados na água e logo diluídos. Por isso, estas substâncias são

freqüentemente potentes, mesmo em pequenas quantidades (Van Soerst e Braekman,

1999; Faulkner, 2000).

Grande parte destes organismos habita áreas densamente povoadas como recifes

de corais e costões rochosos. A produção de compostos secundários remete à sua função

ecológica, tendo como importante papel evitar a predação. Um bom exemplo são as

esponjas, organismos predados por poucos animais, como tartarugas, alguns peixes

tropicais e gastrópodes (Van Soerst, 1999).

Apesar de a principal função ser a de evitar a predação, outras são atribuídas aos

compostos produzidos pelos organismos marinhos, como: agir na competição por

espaço e nas interações entre espécies, reduzir o impacto da exposição a fatores

ambientais estressantes como a altos níveis de radiação ultravioleta (UV) e evitar o

ataque de microorganismos. Sendo este último, um papel bastante específico contra

organismos patogênicos, uma vez que elas possuem relações simbióticas com outras

bactérias (Barnes, 1984; Faulkner, 1994).

A primeira descoberta de um composto proveniente de um organismo marinho

ocorreu somente na década de 50 do século XX. Isolou-se de uma esponja marinha

caribenha, a Cryptotheca crypta, os nucleosídeos espongotimina e espongouridina que

mostraram ter atividades antiviral e antitumoral (Bergmann e Feeney, 1951). Servindo

de base para a síntese dos compostos Ara-C (Pharmacia), o primeiro medicamento

anticâncer derivado de organismos marinhos e do Ara-A (Glaxo SmithKline), uma

droga antiviral. Ara-C é usado no tratamento de linfomas e de leucemia. O composto 3’

azido-3’-deoxythymidine (conhecido como AZT), também é um análogo destes

nucleosídeos e é usado como antiviral (Schwartsmann et al., 2001

;

Sipkema et al., 2005;

Mayer, 1999; Kijoa, 2004).

Quatro novos alcalóides, kottamides A-D, foram descobertos em um ascídio da

Nova Zelândia, o Pycnoclavella kottae com atividade anti-leucêmica moderada. Além

desta, a kottamide D, exibiu uma potentes atividades anti-proliferativa e antiinflamatória

(Baker e Alvi, 2004).

Proteínas marinhas biologicamente ativas, obtidas a partir do veneno de

serpentes do gênero Conus têm sido estudadas. Conhecidas como conotoxinas, são

peptídeos que interagem de forma única com canais de íons voltagem dependentes,

produzindo um amplo espectro de efeitos farmacológicos, incluindo anestesia, analgesia

e atividade anticonvulsiva. A regulamentação do uso da conotoxina ziconotida está

atualmente sob avaliação nos Estados Unidos da América para tratamento de dores

crônicas resistentes a ação de opiáceos. Existem cerca de mil espécies de serpentes do

gênero Conus e de acordo com algumas estimativas, cada serpente produz

aproximadamente 200 tipos diferentes de compostos ativos (Spainhour, 2006).

Compostos de origem marinha podem ter outros usos como, por exemplo, a

cartilagem de tubarão, rica em minerais é utilizada como suplemento alimentar e possui

atividade antioxidante (Felzenszwalb et al., 1998) ou a quitosana uma fibra extraída da

carapaça de caranguejos utilizada como auxiliar na perda de peso (Beppu et al., 1999).

Outros exemplos de produtos de origem marinha, já em fase de testes são: o

GTS21(Taiho), originário de um nematoda (Amphiporus lactifloreus

)

que age em canais

iônicos, sendo indicado no tratamento do Mal de Alzheimer e da esquizofrenia; o

aminoácido LAF389 (Novartis), presente em esponjas do gênero Jaspidae sp., inibidor

da metionina aminopeptidase, com indicação para o tratamento do câncer; o

semisintético OAS1000 (OsteoArthritis science) um glicosídeo diterpenóide, produzido

a partir de um coral mole, inibidor de enzimas fosfolipases A2, atua contra inflamações

e no processo de cicatrização. O ILX651 (Ilex Oncology) e o crematodin (Knoll),

peptídeos que interferem na organização dos microtúbulos, produzido por pepinos do

mar e indicados para o tratamento do câncer e o IPL512602 (Iflazime/ Aventis) um

esteróide extraído de uma esponja que age na inflamação de modo ainda desconhecido

(Spainhour, 2006).

1.2.1.

Filo Porifera

O filo Porifera, reino Metazoa, compreende os animais popularmente conhecidos

como esponjas. Comparadas a outros metazoários, as células das esponjas apresentam

um alto grau de independência, com grande capacidade de regeneração, de forma que o

corpo da esponja lembra uma colônia (Barnes,1984).

As esponjas não apresentam órgãos, nem tecidos verdadeiros, embora possuam

uma estrutura corporal contendo células especializadas em desempenhar várias funções.

Os pinacócitos, que compõem o revestimento externo; os coanócitos, células flageladas

responsáveis pela formação de uma corrente de água da qual retiram oxigênio e

alimento e, as células amebóides que são totipotentes e podem atuar na digestão,

excreção de colágeno, espongina e formação do esqueleto (Barnes,1984).

São organismos sésseis na fase adulta e têm plano corporal incomum, construído

ao redor de um sistema de canais de água. Possuem três camadas celulares: a

pinacoderme, que é a camada mais externa, a coanoderme, camada interna e o mesohilo

que é uma matriz gelatinosa localizada entre as outras duas camadas onde estão

presentes células amebóides e, as espículas que formam o endoesqueleto (Barnes,1984).

As esponjas podem possuir a estrutura corporal em formato de vaso, denominada

asconóide e considerada uma forma primitiva ou, a forma leuconóide, presente na

grande maioria das espécies na qual há a formação de diversas câmaras, permitindo a

obtenção de um tamanho maior e de uma grande diversidade de formas, uma vez que a

alimentação e a troca de gases nestes seres dependem do fluxo de água através do corpo

(Barnes, 1984).

As esponjas bombeiam através do seu corpo quantidades de água que estão em

torno 170-72.000 vezes seu volume corporal, por dia. A alimentação é realizada através

da captura por filtração de partículas como bactéria, microalgas, outros organismos

unicelulares e matéria orgânica morta particulada (Barnes,1984).

O formato corporal poroso com canais e a natureza séssil favorecem a presença

de outros organismos, presentes em quantidades abundantes, associados às esponjas

podendo em alguns casos ocupar mais de 40% do seu tecido. Os tipos de organismos e

as relações ecológicas estabelecidas entre eles e as esponjas são variadas. É comum

encontrar pequenos artrópodes comensais no interior dos canais e algas que usam a

superfície como ponto de fixação. Outros organismos podem estabelecer uma relação

simbiótica, como cianobactérias, algas, fungos e bactérias. O papel destes simbiontes

consiste na reciclagem de nutrientes ou no caso das cianobactérias e de bactérias

quimiotróficas, suplementar a dieta das esponjas fixando carbono e nitrogênio. Estes

simbiontes também podem ser responsáveis pela produção de compostos bioativos,

protegendo a esponja de hospedeiros indesejáveis, microorganismos patogênicos e

evitando a predação (Sipkema, et al., 2005).

A especificidade na interação entre as esponjas e seus hospedeiros é atribuída a

lectinas, identificadas em algumas espécies de esponjas. Esta interação pode ser

verificada pela incapacidade do crescimento da bactéria Pseudomonas insoluta na

ausência da lectina produzida pela esponja Halichondria panicea, sua hospedeira. Da

mesma forma, esta lecitina não foi capaz de promover o crescimento de outras seis

bactérias isoladas de diferentes esponjas marinhas. Além disso, diferentes espécies,

coletadas na mesma área, apresentaram populações bacterianas distintas (Schmidt,

2005).

O filo possui aproximadamente 9000 espécies, organizadas em três classes:

Calcarea, Hexactinellida e Demospongiae, que têm sua classificação baseada na

natureza do seu esqueleto. A maioria das espécies pode ser encontrada em águas rasas e

áreas densamente povoadas como costões rochosos, recifes de corais, madeiras

submersas, conchas, ou qualquer substrato, que permita sua fixação. Nestes

ecossistemas, a predação e a competição entre organismos vizinhos, pela aquisição e

manutenção do espaço podem ser bastante intensas influenciando a estrutura das

comunidades marinhas bênticas (Barnes, 1984; Brusca e Brusca, 2003).

O mecanismo de defesa destes organismos é baseado na produção de

metabólitos secundários. São capazes de produzir um surpreendente espectro de

compostos tóxicos que têm como objetivo evitar a predação, impedir que outros

organismos se fixem em sua superfície, auxiliar na competição por espaço de fundo e

evitar infecções, visto que a ocorrência de agentes antimicrobianos é bem difundida

entre as espécies (Barnes, 1984; Rangel et al., 2001). O filo Porifera demonstra ainda

ser bastante resistente à ação de compostos tóxicos devido a um eficiente sistema de

biotransformação e detoxificação (De Flora et al., 1995).

1.2.2. Fármacos provenientes de Poríferos

As esponjas foram incluídas ainda no primeiro tratado sobre classificação de

organismos (350 a.C.) na Grécia clássica por Aristóteles. Registros de 700 a.C. relatam

o uso de esponjas naturais para a higiene corporal. Em 200 a.C. tem-se registro do relato

do poeta grego Oppian sobre o trabalho de mergulhadores que coletavam esponjas para

sua utilização medicinal e cosmética (Almeida e Berlinck, 1997).

Nos séculos XIX e XX as esponjas naturais de banho (algumas espécies dos

gêneros Spongia sp. e Hippospongia sp.) tiveram grande importância comercial com seu

apogeu na década de 1930. Eram utilizadas de diversas maneiras: como material de

limpeza, para pintura, em máscaras de gás e como absorventes. Atualmente, apesar da

difusão das esponjas sintéticas, significativamente mais baratas, as naturais ainda são

comercializadas (http://acd.ufrj.br/labpor/1-Esponjas/Esponjas.htm).

O interesse no potencial farmacêutico das esponjas foi intensificado em 1951,

após a descoberta por Bergman e Feeney dos nucleosídeos espongotimina e

espongouridina da esponja marinha Cryptotethia crypta (Schwartsmann et al., 2001

;

Sipkema et al., 2005).

Porifera é o filo marinho com mais compostos identificados (nucleosídeos,

terpenos, esteróis, alcalóides, derivados de aminoácidos e ácidos graxos) sendo portanto

o mais promissor na geração de novos fármacos.

Na busca de novos medicamentos, mais de 15000 compostos provenientes de

organismos marinhos já foram descritos sendo 5300 derivados de esponjas. Nestes,

verifica-se a maior incidência de atividades antiinflamatórias, antitumorais,

imunossupressoras, antivirais, antibióticas e antiincrustantes (quadro 2). Como

exemplo, em fase de teste clínico têm-se a Manoalida, um terpenóide extraído da

esponja Luffariella variabilis com atividade antiinflamatória, inibidora da fosfolipase

A2, e Halichondrina B da esponja Halichondria okadai com atividade anticâncer agindo

na despolimerização da tubulina (Sipkema et al., 2005).

Uma proteína isolada da espécie Tethya ingalli é capaz de lisar seletivamente

células de câncer de ovário. Lectinas isoladas de Chondrilla nucula se mostraram úteis

para marcação histoquímica de amostras de melanomas de tumores de tireóide e mama.

A substância manadomanzamine do gênero Acanthostrongylophora sp. possui atividade

antituberculose e antiviral (de Oliveira et al., 2004).

Quadro 2: Exemplos de substâncias químicas obtidas a partir de esponjas e suas

respectivas ações biológicas (Retirado de Sipkema et al., 2005).

Nome do composto Classe do

composto

Espécie/ Ordem Modo de ação

Acido subérsico Diterpenóide Suberea sp./ Verongida Antiinflamatório

inibidor da

lipooxigenase

EspongidinasA-D Alcalóide

piridínico

Spongia sp./ Dictyoceratida Antiinflamatório

inibidor da fosfolipase

Adociasulfatos Triterpenóides

hidroquinonas

Sarcotragus sp./

Dictyoceratida

Haliclona sp./

Haplosclerida

Antitumoral inibidor

3-fucosiltransferase, e

proteína motora

cinesina

Neoamphimedine Alcalóide Xetospongia carbonaria/

Haplosclerida

Inibidor topoisomerase

Salicislamida A Salicilato Haliclona sp./

Haplosclerida

Inibidor v-ATPase

Crambecidina 1-4 Derivado

guanidina

Crambe crambe/

Poecilosclerida

Bloqueador canal de

Naamina D Alcalóide Leucetta chagosensis/

Calcinea

Inibidor da oxido

nítrico sintetase

ArenastatinaA Lactona Dysidea arenaria/

Dendroceratida

Inibidor polimerização

da tubulina

LatrunculinaA Thiazol Latrunculia magnified/

Poecilosclerida

Despolimerização

actina

1.2.3. Aplysina fulva

Aplysina fulva (Figura 1) é uma espécie pertencente à classe Demospongiae,

ordem Verongida. Já foram isolados cerca de 240 compostos de pelo menos 22 espécies

desta ordem que tem como principal característica a produção de bromometabólitos.

São também caracterizadas presença de carotenóides derivados de 2-oxazolina e por não

serem detectados terpenos na composição. (Gopichand e Schmitz, 1979; Van Soerst e

Braekman, 1999).

Aplysina fulva foi inicialmente classificada como Aplysina fistularis forma fulva,

sendo considerada a mesma espécie da Aplysina fistularis forma insularis. Um dos

parâmetros utilizados para separá-las em duas espécies foi quanto às classes de

compostos secundários produzidos por elas. Ambas produzem como metabólitos

específicos os compostos brominados, característicos da ordem e a fistularina 3, porém

a composição dos outros metabólitos parece ser completamente distinta, por exemplo,

A. fulva produz aerotionina a qual na é encontrada em A. insularis (Ciminiello et al.,

1996). Além da aerotionina que possui atividade antimicrobiana já foram isolados da

espécie A. fulva os compostos aplysilina A e fistularinas 1, 2 e 3 que apresentaram forte

atividade antibacteriana e toxicidade in vitro contra células tumorais humanas

(Gopichand e Schmitz, 1979).

Figura 1: Foto Aplysina fulva na Pedra Vermelha, Arraial do Cabo por Eduardo Hajdu.

Fonte: http://www.iqsc.usp.br/iqsc/grupos_pesquisa/dfq/qopn/pesquisa1.htm

1.2.4. Arenosclera brasiliensis

Arenosclera brasiliensis (Figura 2), pertence à classe Demospongiae, ordem

Haplosclerida e é endêmica do litoral sudeste do Rio de Janeiro. A ordem haplosclerida

demonstra ser uma rica fonte de alcalóides derivados de 3-alquilpiperidina. Estes

compostos estão presentes em todas as famílias pertencentes a esta ordem, com mais de

cem compostos identificados (Van Soerst e Braekman, 1999; Torres et al., 2000).

Já foram isolados quatro alcalóides presentes em A. brasiliensis: Arenosclerina

A, B e C e Haliclonaciclamina E. Estes compostos mostraram forte atividade

antibacteriana, inclusive contra 11 cepas resistentes a antibióticos, atividade citotóxica

para as linhagens de células tumorais HL-60 (leucemia), L929 (fibrosarcoma), B16

(melanoma) e U138 (cólon) (Torres et al., 2000; Torres et al., 2002) e os compostos

arenosclerina A e haliclonaciclamina E induziram forte alteração na morfologia celular

e nos microtúbulos para a linhagem T47D de câncer de mama humano (Prado et al.,

2004).

Figura 2: Foto Arenosclera brasiliensis. Amostra coletada na praia de João

Fernandinho, Búzios por Gisele Lobo- Hajdu.

1.3. Importância da avaliação toxicológica de produtos

naturais.

Para que um medicamento possa estar disponível no mercado, é preciso que se

obtenha seu registro junto à Vigilância Sanitária, o que só é possível após a realização

de pesquisas que comprovem que o medicamento em questão é eficaz e seguro, ou seja,

é capaz de tratar a doença e não tem alta incidência de efeitos colaterais graves na

população, apresentando baixa toxicidade em doses definidas. Na fase de estudos pré-

clínicos, é avaliada a possível toxicidade aguda e a longo prazo, as propriedades

farmacológicas, a farmacocinética, dose e estabilidade. São realizados ensaios

farmacológicos definindo o modo de ação da droga e a avaliação farmacocinética, ou

seja, como o medicamento será metabolizado e absorvido pelo organismo e a pesquisa

toxicológica. Os estudos toxicológicos fornecem informação sobre uma série de

aspectos relacionados à segurança dos medicamentos: toxicidade aguda, sub-crônica e

crônica, mutagenicidade, genotoxicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade e

toxicidade sobre a função reprodutora. Um composto só entrará em estudos da fase

clínica se ele tiver apresentado resultados satisfatórios na fase pré-clínica

(www.anvisa.gov.br).

O desenvolvimento de tumores pode envolver três etapas a iniciação, a

promoção e a progressão (Gesher et al., 2001). A iniciação geralmente é induzida por

um agente mutagênico e ,uma vez presente, é irreversível, sendo considerada uma fase

crítica no desenvolvimento de tumores. Alterações no processo de regulação do ciclo

celular, recombinação genética, quebra na fita de DNA ou interações epigenéticas

também são considerados agentes iniciadores que podem culminar no processo de

carcinogênese (Vargas, 1992). A fase seguinte é a promoção. Tem duração variável e é

representada por uma série de eventos reversíveis que envolvem principalmente uma

indução na proliferação celular (Suhr, 1999). A progressão ocorre quando células

fenotipicamente e genotipicamente alteradas desenvolvem mudanças microscópicas,

macroscópicas e funcionais e é considerada irreversível (Gescher et al., 2001). A grande

maioria dos tumores humanos é causada por agentes químicos ligados ao hábito de

fumar, ao estilo de vida e à dieta (Ribeiro et al., 2003). Daí a importância de

consistentes estudos toxicológicos em novos compostos, antes da aprovação para o uso.

1.4. Estratégias nacionais e internacionais para normatização de

avaliações genotóxicas.

Testes de genotoxicidade podem ser classificados como in vitro ou in vivo e são

desenvolvidos para detectar agentes químicos ou físicos capazes de induzir danos

genéticos direta ou indiretamente identificando os mecanismos de ação. Estes testes

permitem uma caracterização do risco de uma substância em relação à ocorrência de

danos no DNA e a sua fixação. A positividade nestes testes pode indicar que os agentes

testados sejam potenciais mutágenos e carcinógenos para a espécie humana. Os

protocolos de alguns ensaios de genotoxicidade são normatizados por agências

nacionais e multinacionais, sendo as mais relevantes a ICH (International Conference on

Harmonization) e a OECD (Organization for Economic Co-Operation and

Development) (Cimino, 2006).

A ICH produziu dois guias para avaliação de genotoxicidade para novos

fármacos: “S2A Guidance on specific aspects of regulatory genotoxicity tests” (ICH,

1996) e “S2B Genotoxicity: a standart battery for genotoxicity testing of

pharmaceuticals” (ICH, 1997), ambos com atualizações disponibilizadas em seus

respectivos sites, periodicamente. Estes documentos servem de base para a avaliação de

fármacos nos Estados Unidos da América pelo FDA (Food and Drug Administration,

orgão governamental responsável pelos testes e liberação de novos fármacos e aditivos

alimentares), em países membros da União Européia e em outros como o Japão

(Cimino, 2006). Os guias da ICH consideram o teste de mutação reversa em bactérias

como critério fundamental na avaliação in vitro uma vez que ele é capaz de detectar

uma quantidade relevante de danos genéticos, a maioria dos compostos que

apresentaram positividade neste ensaio também demonstram atividade carcinogênica em

roedores. É recomendada a realização de testes de mutação gênica em células de

mamíferos, podendo incluir em células de linfoma de camundongos (ICH, 1997). A

realização de testes in vivo é complementar e necessária devido à incapacidade de

detecção de problemas relacionados à absorção, metabolização, distribuição e excreção

de substâncias químicas nos testes in vitro (Cimino, 2006).

A OECD é uma organização internacional que desenvolve e coordena atividades

visando a saúde e segurança ambientais em nível internacional. Estas atividades

incluem: harmonização de procedimentos de testagem e de avaliação de risco de

substâncias químicas, harmonização da classificação e rotulagem, desenvolvimento de

boas práticas laboratoriais, cooperação na investigação de químicos e realização de

atividades colaborativas na administração de risco. A OECD é um fórum de discussão

onde membros de 30 países expressam seus pontos de vista, dividem suas experiências

e buscam um comum acordo (Cimino, 2006).

Como parte do programa de avaliação da segurança de substâncias químicas, foi

elaborado o “Guidelines for the testing chemicals” (OECD, 2005). Esta coleção de

testes e procedimentos tem como objetivo regular a avaliação de risco de substâncias

químicas novas e já existentes usados em pesticidas, fármacos e aditivos alimentares,

feita por orgãos governamentais, indústrias e laboratórios independentes (Cimino,

2006). Algumas das recomendações incluem a avaliação da genotoxicidade através do

teste de mutação reversa em bactérias, usando cepas de Salmonella typhimurium ou

Escherichia coli, teste de mutação em células de mamíferos, teste SMART (Somatic

mutation and recombination test) em drosófilas e avaliação de danos cromossomais

através do teste de micronúcleo e teste de aberração cromossômica em mamíferos.

Ressalta ainda que em alguns casos seja necessária a realização de testes

complementares para uma melhor interpretação dos resultados que podem consistir na

repetição dos mesmos testes em diferentes condições experimentais ou de outros

ensaios que podem ser o cometa, estudo do potencial genotóxico in vivo em roedores

trangênicos e testes para detecção de mutagenicidade fotoquímica.

No Brasil, a agência governamental que regula a segurança de compostos

químicos para uso humano é a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). É

o órgão responsável por estabelecer, coordenar e monitorar os sistemas de vigilância

toxicológica e farmacológica, coordenar as ações de vigilância sanitária realizadas por

todos os laboratórios que compõem a rede oficial de laboratórios de controle de

qualidade em saúde e promover a revisão e atualização periódica da farmacopéia

(www.anvisa.gov.br).

O teste de mutagenicidade com S. typhimurium (ensaio Salmonella/microssoma

ou ensaio de mutação reversa) é a metodologia de triagem mais utilizada atualmente

para detectar substâncias mutagênicas sendo validado por diversos laboratórios

(Ribeiro, et al., 2003). Os testes com organismos procariotos permitem uma avaliação

genotóxica rápida, de baixo custo e segura no diagnóstico, apresentando uma boa

correlação com o efeito em mamíferos. A utilização de um sistema de ativação

metabólica ( à exemplo do S9 mix) permite simular o efeito do sistema enzimático

P450, um dos principais complexos metabólicos da célula eucariótica em relação à

xenobióticos (Vargas, 1992).

1.4.1. Avaliação antigenotóxica.

A identificação de compostos com atividade antigenotóxica e, por inferência,

provável anticarcinogênica traz uma possibilidade de prevenção contra os efeitos

causados pela inevitável exposição à mutágenos ambientais de ocorrência natural,

gerados pela poluição ou através de produtos comercializados (Zeiger, 2007).

A busca por compostos com atividade antigenotóxica tem se concentrado em

produtos naturais devido à variedade de compostos e da ampla ocorrência de

substâncias com atividades protetoras, como a antioxidante. O uso dessas substâncias

pode reduzir os efeitos da exposição diária a mutágenos ambientais e também a

fármacos que possuem atividade mutagênica (Zeiger, 2007).

O evento mutagênico, responsável pela iniciação tumoral, pode sofrer uma série de

interações ou modificações induzidas por agentes químicos (Gescher et al., 2001).

Alguns trabalhos na área de quimioprevenção têm identificado agentes que parecem

modular o processo de carcinogênese em qualquer de suas etapas (iniciação, promoção

e progressão) (Wattenberg, 1985; Stoner et al., 1997). O possível evento

quimiopreventivo relaciona-se com essas etapas e com o tipo de carcinógeno ao qual o

indivíduo é exposto (Craddock, 1993).

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

• Avaliação genotóxica e antigenotóxica de extratos brutos das esponjas A.

fulva e A. brasiliensis.

2.2.

Objetivos específicos

• Distinguir grupos químicos presentes nos extratos obtidos das esponjas A.

fulva e A. brasiliensis através de espectros infravermelho e ultravioleta.

• Realizar ensaio quantitativo de mutagenicidade (ensaio de mutação

reversa com S. typhimurium) e SOS cromoteste com extratos de A. fulva e

A.brasiliensis.

• Avaliar a indução de quebras no DNA através dos ensaios cometa e de

uma manipulação plasmidial.

• Investigar um possível efeito antimutagênico dos extratos através de duas

variações no ensaio Salmonella/microssoma.

• Avaliar uma possível ação antigenotóxica dos extratos contra quebras no

DNA plasmidial.

• Realizar ensaios qualitativos de mutagenicidade e antimutagenicidade

com os extratos cetônico e etanólico de A. brasiliensis.

3. Genotoxic evaluation of extracts from Aplysina fulva, a

Brazilian marine sponge.

4. Genotoxic and antigenotoxic evaluation of extracts from

Arenosclera brasiliensis, a Brazilian marine sponge.

Submitted to Toxicology in vitro in 03/18/2008.

Submetido à revista Toxicology in vitro em 18/03/2008.

Genotoxic and antigenotoxic evaluation of extracts from Arenosclera brasiliensis, a

Brazilian marine sponge

Stankevicins L.

, Aiub C.

1, 4

, de Santa Maria L.C.

, Lobo-Hajdu G.

, Felzenszwalb I.

1,*

Departamento de Biofísica e Biometria,

Departamento de Biologia Celular e Genética,

Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes,

Departamento de Química Orgânica,

Instituto de Química,

Universidade do Estado do Rio de Janeiro, 20551-030 and

Departamento de Farmacologia e Toxicologia, Instituto Nacional de Controle de

Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 21040-900, Brazil

Abbreviations:

Arecr- A. brasiliensis crude extract

Arefil- A. brasiliensis filtrated extract

CoT(1)- Co- treatment (1)

CoT(A)- Co- treatment (A)

CoT(B)- Co- treatment (B)

FTIR- Fourier transform infrared

I.F.- Induction factor

M.I.- Mutagenic index

ONPG- O-nitrophenyl β-D-galactopyranosidae

PA- Alkaline phosphatase

pBsk- pBlueScript SK

PNPP- p-nitrophenyl disodic phosphate

PostT(1)- Post- treatment (1)

PostT(A)- Post- treatment (A)

PostT(B)- Post- treatment (B)

PreT(1)- Pre- treatment (1)

PreT(A)- Pre- treatment (A)

S9 mix- S9 metabolic activation mixture

SD- Standard deviation

β-Gal- β- Galactosidase

4NQO- 4-nitroquinoline 1-oxide

S.A- sodium azide

MMS- methyl methano sulphate

2-AF- 2-aminofluorene

Abstract:

The marine environment is a rich source of biological active compounds and the

sponges can be considered the most productive one. This diversity gives rise to unique

chemical compounds with potential pharmacological properties. Our study is focused on

the genotoxic and antigenotoxic evaluation of two crude extracts obtained from the

Brazilian endemic marine sponge Arenosclera brasiliensis. Salmonella typhimurium

reverse mutation test with TA97, TA98, TA100 and TA102 strains were done. For

antimutagenic analysis, a pre-, co-, and post-treatment to evaluate, respectively,

intracellular and extracellular reactions and possible modulation on DNA repair.

Additionally, in order to verify the influence of the crude extracts on DNA damage

induction, a plasmid-DNA treatment was assayed. No mutagenicity was observed in

Salmonella reverse mutation test, neither DNA strand induced damage. Antimutagenic

activity was observed in pre-, co-, and post-treatment. A significant antigenotoxic effect

was observed in the crude extract, wich suggests that A. brasiliensis extract has the

potential to protect DNA from the action of 4NQO, 2-aminofluorene, sodium azide and

mitomycin C.

Key words: Arenosclera brasiliensis; antimutagenicity; marine sponge; marine extracts.

Corresponding author: Israel Felzenszwalb, Ph.D - Departamento de Biofísica e

Biometria, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, 20551-030, Brazil. Tel: +55 21

25876132.

E-mail address: [email protected]

1. Introduction

Nowadays, there is a growing interest in marine compounds, especially due to its great

diversity of unique secondary metabolites with potent pharmacological properties

(Sipkema et al., 2005; Aiub et al., 2006). Within marine animals, sponges are the most

productive sources of bioactive compounds and also have the highest rates of cytotoxic

metabolites, comprising 10% of the investigated species (Prado et al., 2004). It has

already been demonstrated ictiotoxic, antifungic and neurotoxic activities from sponge

metabolites (Almeida et al., 1997).

Our source of study was an endemic marine sponge from southwest coast of Brazil,

Arenosclera brasiliensis (Demospongiae, Haplosclerida). Haplosclerida is an

exceptional source of alkylpiperidine alkaloids and one of the orders with more

diversity of compounds presenting potent biological activities (Van Soerst and

Braekman, 1999; de Oliveira et al., 2004). Manadomanzamine from

Acanthostrongylophora sp. presents antiviral and antituberculosis activities;

xetospongins A, C and D, arguspongine B and demethylxestospongin B are potent

blockers of IP

mediated Ca

release from endoplasmatic reticulum vesicles of rabbit

cerebellum. From A. brasiliensis, Arenosclerins A, B and C (C

O) and

Halioclonacyclamine E (C

) are tetracyclic alkylpiperidine alkaloids that present

a strong antibiotic activity against eleven resistant bacteria strains, cytotoxicity against

the human tumor cell lines HL-60 (leukemia), L929 (fibrosarcoma), B16 (melanoma)

and U138 (colon); hemolytic and neurotoxic activities (Muricy et al. , 1993; Rangel et

al., 2001; Torres et al., 2000; Torres et al., 2002; de Oliveira et al., 2004; Prado et al.,

2004).

The present study provides data on the mutagenic and antimutagenic activity of

different preparations of a crude extract from Arenosclera brasiliensis.

2. Material and Methods

2.1 Preparation, characterization and standardization of Arenosclera brasiliensis

extracts.

Five samples of Arenosclera brasiliensis were collected in april 2006 at João

Fernandinho beach, Búzios, Rio de Janeiro, Brazil (22

44´49´´S /41

52´54´´W).

The specimens were collected on a rocky shore, at depths of 2-7 meters, cleaned of all

visible surface debris, washed rapidly with freshwater and stored at 4

C in ethanol 92%

(two-fold of its mass) for 1 month (stock solution). A voucher sample was deposited in

Museu Nacional do Rio de Janeiro (MNRJ 1704).

A sample containing 53.6g (wet) stocked in 120mL ethanol (92%) was used to prepare

A. brasiliensis crude extract (Arecr). The stock solution was evaporated under vacuum

at 55ºC, lyophilized and frozen at – 20ºC until use. The final residue (1.11g) was diluted

in distilled water at 3.5, 35, 350, 1000 µg/mL concentrations.

Another A. brasiliensis extract (Arefil) was prepared from four samples (200g wet)

stocked in 500 mL of ethanol (92%). Arefil was obtained by filtration using filter paper,

from the insoluble fraction formed when the stock solution was stored under 4

C. The

filtered solution was evaporated under vacuum at 55ºC, lyophilized and frozen at – 20ºC

until use. The final residue (4.2g) was diluted in distilled water at 0.035, 0.35, 3.5 and

35 µg/mL concentrations.

The Arecr and Arefil ultraviolet and infrared spectra were recorded. The ultraviolet

spectra of the lyophilized extracts were assayed by diluting in distilled water and

ethanol 98% (proportion of 1:100) on a Shimadzu UV-160A spectrophotometer. For

infrared spectra (FTIR), the dried extracts were dissolved in chloroform and deposited

in a liquid cell with KBr window and analyzed on a Perkin-Elmer spectrum one

(resolution of 4 cm

-1

2.2. Bacterial Strains

The Salmonella typhimurium strains TA97, TA98, TA100 and TA102 were provided by

Dr. B. N. Ames, University of California, Berkeley, CA, USA. Escherichia coli

AB1157 was obtained from Dr. N. Asad, Universidade do Estado do Rio de Janeiro,

Instituto Roberto Alcantara Gomes, Rio de Janeiro, Brazil and E. coli SOS chromotest

strains PQ35 and PQ37, derived from E. coli GC4436 (Huisman and D´Ari, 1981) were

obtained from Dr. M. Hofnung, Institute Pasteur, Paris (France).

2.3. S9 fraction

S9 fraction 4% (~19.1 mg total protein) was purchased from Molecular Toxicology Inc.

(Moltox

, USA), prepared from livers of Sprague-Dawley rats pre-treated with a

polychlorinated biphenyl mixture (Aroclor 1254). The S9 metabolic activation mixture

(S9 mix) was prepared according to Maron and Ames (1983) for the

Salmonella/microsome assay and used as previously described (Aiub et al., 2003; Aiub

et al., 2006).

2.4. Salmonella typhimurium reverse mutation test

Arecr and Arefil induced mutagenicity were tested following the protocol proposed by

Maron and Ames (1983) with some adaptations (Aiub et al., 2003; Aiub et al., 2004).

Aliquots of 100 µL of S. typhimurium strains TA97, TA98, TA100 and TA102 (2 x 10

cells/mL) were pre-incubated (60 minutes, at 37

C, 150 rpm) with 100 µL of Arecr or

Arefil concentrations and 500 µL of S9 mix or the same volume of 0.2M sodium

phosphate buffer (pH 7.4). After 60 min, 2 mL top-agar (0.7% agar, 0.6% NaCl, 50 µM

L-histidine, 50 µM biotin, pH 7.4, 45

C) was added to the test tubes and the final

mixtures were poured into Petri dishes with minimal agar (1.5% agar, Vogel- Bonner E

medium, containing 2% glucose). These final mixtures were incubated at 37

C for 72h,

and the His

revertant colonies were counted. The mutagenic index (M.I.) was

calculated by the mean value obtained for each concentration divided by the mean value

of the negative control (distilled water). All experiments were performed in triplicate

and repeated twice (Aiub, 2004).

2.5. Survival experiments

For determination of the cytotoxic effects of Arecr and Arefil, the pre-incubation assay

mixture in the bacterial (reverse) mutation test was diluted in 0.9% NaCl (w/v) in order

to obtain a suspension containing 2 x 10

cells/mL. A suitable aliquot (100 µL) of this

suspension was plated on nutrient agar (0.8% bacto nutrient broth (Difco), 0.5% NaCl

and 1.5% agar). The plates were then incubated at 37

for 24h and survival fractions

were calculated as described before (Caldeira de Araujo, et al., 1996). All experiments

were performed in triplicate and repeated twice.

2.6. Antimutagenicity analysis

Two different assays were performed to evaluate antimutagenic activity of Arefil,

consisting in variations of S. typhimurium reverse mutation test, described elsewhere.

In both, a pre-, co- and post-treatment were done. The pre-treatment evaluates the

extract penetration capacity into bacterial cells prior to contact with the mutagen. The

co-treatment investigates possible extracellular reactions between the extract and the

mutagen. The post-treatment, can evaluate the effects of the extract on DNA repair

modulation.

One of the used protocols was described by De Flora et al. (1992) and performed using

S. typhimurium TA102 strain, Arefil extract at 0.05 - 5 µg/mL (final concentrations) for

pre-treatment and 0.04 - 4 µg/mL, (final concentrations) for the co- and post-

treatments. The pre-treatment (PreT(A)) consists of incubating 100 µL cells at log

phase with 100 µL Arefil and 500 µL nutrient medium (0.45% yeast extract, 0.9%

bacto triptone, 0.9% NaCl) for 4 hours. The mixture was centrifuged (3000 rpm, rotor

54. 15C Eppendorf for 20 minutes), the medium removed and cells ressuspended with

the same volume with 0.2 M phosphate buffer pH 7.4. Then, after 20 minutes of

incubation in the presence of S9 mix or 0.2M phosphate buffer pH 7.4 at 37

C under

shaking (150 rpm), 100 µL of mitomycin was added and incubated in the presence of S9

mix or 0.2M phosphate buffer pH 7.4 for 20 minutes at 37

C under shaking (150 rpm).

The cells were washed and plated on minimal agar plates with top agar. The plates were

incubated at 37

C for 72h, and the His

revertants colonies were counted. The M.I. was

calculated as previously described.

The Co-treatment consisted of two different incubations procedures, identified as

CoT(A) and CoT(B). CoT(A) consisted of 100 µL of an overnight grown culture of

TA102, 100 µL of mitomycin C, in the presence or absence of S9 mix and 100 µL of

Arefil concentrations at 37

C for 20 minutes, 150 rpm Cells were washed and plated as

described.

CoT(B) consisted of incubating 100 µL of Arefil and 100 µl mitomycin C in the

presence or absence of S9 mix for 20 min at 37

C, 150 rpm. Then, 100 µL of cell

culture (2 x 10

cells/mL) was added and the mixture plated.

The Post-treatment consisted also in two different incubations procedures, identified as

PostT(A) and PostT(B). PostT(A) consisted of incubating 100 µL of bacterial

suspension (2 x 10

cells/mL), 100 µL of mitomycin C (7.1 µg/mL) in the presence or

absence of S9 mix for 20 minutes at 37

C, 150 rpm. The cells were washed, 100 µL of

Arefil was added and the mixture was plated. In PostT(B), 100 µL of bacterial

suspension (2 x 10

cells/mL) and 100 µL of mitomycin C (7.1 µg/mL) were incubated

in the presence or absence of S9 mix for 20 minutes at 37

C, 150 rpm. Then, the cells

were incubated for 30 min in 700 µL fresh nutrient broth, re-washed, 100 µL of Arefil

was added and the mixture was plated.

The other protocol for antimutagenic analysis was performed with S. typhimurium

TA97, TA98, TA100 and TA102 strains. This assay also used a pre-, co- and post-

incubation denominated PreT(1), CoT(1) and PostT(1).

PreT(1) mixture consisted of incubation of 100 µL of Arefil and 100 µL of an

overnight grown bacterial suspension, in the presence or absence of S9 mix for 30

minutes at 37

C, 150 rpm. The mixture was incubated with 100 µL of the mutagen for

30 minutes and then plated on minimal agar plates.

CoT(1) was performed by incubating 100 µL of Arefil, 100 µL of the mutagen and 100

µL of an overnight grown bacterial suspension, in the presence or absence of S9 mix for

60 minutes at 37

C, 150 rpm. This mixture was then plated on minimal agar plates.

PostT(1) was performed by incubating 100 µL of the mutagen and 100 µL of an

overnight grown bacterial suspension in the presence or in the absence of S9 mix for 30

minutes at 37

C, 150 rpm.. Then, 100 µL of Arefil was added, the mixture was

incubated at 37

C 150 rpm for 30 minutes, and plated on minimal agar plates.

All experiments were done in triplicate and repeated twice.

2.7. Plasmidial treatment

The pBlueScript SK (pBsk), a 2958 bp gene-ampicillin resistant plasmid cloned in

Escherichia coli strain AB1157, was treated as described before (Dantas et al., 1999;

Kovary et al., 2001), with minor modifications. 5 µL aliquot samples of plasmidial

DNA (55 ng) were incubated with 5 µL Arecr at 1.75, 17, 170, 500 µg/mL

concentrations for 60 min at 37

C. DNA samples were immediately submitted to

electrophoresis in 0.8% agarose gel with 1X TAE buffer (40mM tris acetate, 1mM

EDTA), stained with ethidium bromide (0.5µg/mL) and visualized by ultraviolet

transilluminator.

The assay included a positive control using stannous chloride (SnCl

) (Sigma Chemical

Co. St Louis, USA) and α- Tocoferol (Vitamin E) (Sigma Chemical Co. St Louis, USA)

as a scavenger to evaluate possible protective action against oxidative damage on the

plasmidial DNA.

Gel images were capturated by Kodak digital science eletrophoresis documentation and

analysis system 120 and quantified by gel densitometry with the software ImageJ 1.3B

(Wayne Rasband, National Institutes of Health-USA). The treatments were repeated

three times.

2.8. SOS chromotest

The SOS chromotest was performed in Escherichia coli strains PQ35 and PQ37 with

Arefil at 0.05, 0.5 and 5 µg/mL, according to Quillardet and Hofnung (1985) with some

adaptations (Aiub, 2003). 100 µL of Arefil was incubated with 100 µL of bacterial

overnight grown culture, in the presence or absence of S9 mix at 37

C for 60 minutes

under shaking (150 rpm). The mixture was then centrifuged (5000 rpm for 10 minutes)

and ressuspended in 700 µL NaCl 0.9%. These cells were used to measure the

expression of β-galactosidase (β-Gal) and alkaline phosphatase (PA). ONPG (4 mg O-

nitrophenyl β-D-galactopyranosidae/mL) and PNPP (4 mg p-nitrophenyl disodic

phosfate/ mL) were used as substrate for β-galactosidase and alkaline phosphatase

respectively. The β-gal reaction was stopped by adding 1.6 mL of Na

1M; and the

PA by adding 800 µL HCl 2.5M and, after 10 minutes, 800 µL Tris 2M.

Enzymes activities were estimated in Miller units (Abs

420

x 1000/ incubation with the

substrate in minutes) (Miller, 1972). The induction factor corresponds to the ratio of the

activities of β-Gal/ PA divided by the negative control group value. The results were

considered positive when the increase of induction factor (I.F.) was higher than 1.5. A

reduction of alkaline phosphatase activity superior to 30%, when compared to the

negative control, indicates cytotoxicity. The experiment was performed in triplicate and

repeated twice.

2.9. Statistical analyses

Data are expressed as mean ± standard deviation (SD). Statistical analysis was

performed by ANOVA and Dunnett’s multiple comparison tests. Values significantly

different from control are indicated as * p</0.01.

3. Results

3.1. Chemical characterization of the extracts

The FTIR analysis for Arecr and Arefil were performed to search for characteristic

chemical groups. Both showed six absorption peaks as more representative: 3401, 2925,

1634, 1404, 1197 and 1045 cm

-1

(figures 1 and 2).

The ultraviolet spectrum was also performed to verify characteristic peaks between

Arecr and Arefil. The spectra obtained from both extracts were similar and presented an

absorption peak near 270 nm, a shoulder band around 210 - 230 nm and absorption

below 200 nm (figures 3a and 3b).

3.2. Salmonella typhimurium reverse mutation test

Tables 1 - 4 show the results of the S. typhimurium reverse mutation test and survival

experiments for Arecr and Arefil respectively.

No mutagenicity was detected for both Arecr and Arefil in all tested strains and

concentrations, neither in presence nor in absence of S9 mix. Cytoxicity was obtained

only for Arefil, in the absence of S9 mix, for TA98 strain treated with 5 µg/mL.

3.3. Antimutagenic assays

Tables 5 and 6 show the results for the antimutagenic assay (De Flora et al. 1992) with

the TA102 strain. Reductions in induced revertants numbers were obtained in PreT, for

all tested concentrations, ranging from 61 to 62%; in CoT(B) for 0.04 µg/mL of 37,5%

and in PostT(B) for 4 µg/mL of 41,7% in the presence of S9 mix, when compared to

mitomycin C (p≤ 0.01). In PreT, in the absence of S9 mix, a reduction of 15 and 25% in

induced revertants numbers was observed for 0.5 and 5 µg/mL and an increase of 40%

was observed for 0.05 µg/mL.

The other antimutagenic test was performed using TA97, TA98, TA100 and TA102

strains and the results are presented on tables 7-10. In PreT(1), Arefil exhibited a 44-

49% reduction in revertants numbers for TA97 strain in the absence of S9 mix, for all

tested concentrations.

In CoT(1) a significant reduction in revertants (35-54 %) was observed for strain TA98,

for all tested concentrations in the presence of S9 mix and a reduction for 0.04 and 0.4

µg/mL of 36% and 14% respectively in the absence of S9 mix. In CoT(1), TA100 strain

also showed a significant reduction in revertants (45-50%) for all tested concentrations.

In PreT(1), for 0,4 and 4 µg/mL, a 25% and 37% revertants reduction respectively, was

noted in the presence of S9 mix. For TA100 strain, for all tested concentrations, CoT(1)

showed an increase in revertants (24-75%) in the absence of S9 mix when compared to

sodium azide.

For TA102, in PreT(1), for 0.04 and 0.4 µg/mL, a 5 and 40% revertants number

increase was observed in the absence of S9 mix. Post-treatment in strain TA102 showed

a reduction of 42-75% in revertants numbers for Arefil for all concentrations in the

absence of S9 mix.

3.4. Plasmidial treatment

Figure 4 shows no modifications on pBsk gel electrophoresis profile after treatment

with Arecr.

Figure 5 shows a reduction on linear form (F2) for 11 and 110 µg/mL, demonstrated by

an increase in 20% on the supercoiled form (F1) obtained when pBsk was incubated

with Arecr and stannous chloride.

3.5. SOS chromotest

The SOS chromotest results showed a significant induction in SOS system (IF>1.5) for

PQ35 at 5 µg/mL concentrations and for PQ37 at 0.05 and 0.5 µg/mL concentrations, in

the absence of S9 mix. Alkaline phosphatase values for these concentrations showed a

decrease (66, 61.5 and 72% respectively), also observed for PQ37 at 5 µg/mL (92%)

(table 11).

4. Discussion

Marine sponges of the order Haplosclerida have proven to be a rich source of secondary

metabolites, especially alkylpyridine and alkylpiperidine alkaloids. FTIR analysis of

Arefil and Arecr detected the same absorption peaks observed in the previously isolated

compounds from A. brasiliensis (Torres, 2000).

The infrared peaks

3401, 2925, 1634, 1197 and 1045 cm

-1

are indicative of OH

stretching, CH

, C=C, C-N and C-O bonds respectively (Bellamy, 1980; Coates, 2000)

A previous screening (data not shown) on our study verified a strong cytotoxicity

against S. typhimurium strain TA102 for Arecr for concentrations above 143 µg/mL and

for Arefil for concentrations above 50 µg/mL. This toxicity led us into suspecting that

the alkaloids isolated from A. brasiliensis are not the only compounds responsible for

the biological activity observed in crude extracts. This assumption is supported

especially by the elevated concentration of the isolated alkaloids used in antimicrobial

experiments, which was 80 µg/mL (Torres, 2002).

Arecr and Arefil test concentrations were defined according to its cytotoxicity for

TA102 strain.

Another fact that corroborates the presence of other compounds with biological activity

in A. brasiliensis is the observed decrease (> 30%) on alkaline phosphatase values in

SOS chromotest with E.coli strains PQ35 and PQ37. This indicates an inhibition of

protein activity and consequently toxicity. Arenosclerins A-E and Haliclonaciclamine in

microbial test did not present any toxic response for E. coli ATCC 25922 strain (Torres

et al. 2002).

Although no mutagenicity was detected by the Salmonella microsome assay (tables 1-4)

in PQ35 for 5 µg/mL and in PQ37 strains for 0.5 and 5 µg/mL, induction factor values

above 1.5 were observed in SOS chromotest (table 11), indicating mutagenicity. The

values corresponding to alkaline phosphatase activity for the same concentrations had a

reduction > 30% that could be attributed to an Arefil cytotoxic effect inhibiting protein

activity. These mutagenic and cytotoxic effects could be observed only in the absence of

S9 mix, suggesting that active compounds present in Arefil can be detoxified by

cytochrome P450 enzimes.

It is well established that mutations in somatic cells play a key role in cancer initiation

and other stages of the carcinogenesis process. To avoid this, cancer chemopreventive

agents can act in a primary prevention inhibiting mutation and cancer initiation by

triggering protective mechanisms either in extracellular environment, or inside cells.

The mechanisms that could prevent cancer development usually have a relationship

with other diseases. Evidences are accumulating, showing that DNA alterations can also

contribute to the pathogenesis of other pathological conditions such as atherosclerosis,

obstructive pulmonary disease, degenerative heart disease and glaucoma. (De Flora and

Ferguson, 2005).

In line with the assumption that marine organisms do not suffer from neoplasic diseases,

it has been reported that they are able to inhibit the production of DNA lesions induced

by mutagens or carcinogens, because they have an efficient bio- transformation and

detoxification capacity (De Flora, et al., 1995; Aiub, et al., 2006).

A plasmidial treatment and two modifications of standard S. typhimurium reverse

mutation test were performed to verify the capacity of the extracts to protect DNA

against chemical induced lesions.

The plasmidial treatment performed with Arecr revealed a scavenger activity,

preventing DNA from oxidative lesions generated by SnCl

, a potentially genotoxic

agent that mediates single strand breaks in DNA through ROS formation (Dantas et al.,

1999). Arecr showed a protective action similar to the observed when the DNA was

treated with vitamin E (33.3 µg/mL) as demonstrated in figure 5.

Two antimutagenic assays were performed with S. typhimurium TA102, a strain capable

of detecting oxidative mutagens and base pair substitution (Levin et al., 1922).

The positive control used in the assays was mitomycin C, a drug that alkylates DNA in

several different ways acting for example through a bioreductive alkylation reaction as a

trifunctional or bifunctional alkylating agent (Sanderson et al., 1996; Takeiri et al.,

2003). Mitomycin C also requires redox reactions to form the reactive intermediates

involved in the ultimate toxic events (adduct formation). The same mechanisms lead to

the formation of reactive oxygen species (ROS), which can themselves exert direct

toxicity (Pagano, 2001).

Arefil presented a protective effect against mitomycin C in PreT, CoT(B) and PostT(B),

when incubated in the presence of S9 mix (tables 5 and 6), indicating a reduction on

adducts formation and on oxidative stress. In PreT, this reduction indicates an

intracellular action of Arefil. The revertants numbers reduction in CoT(B), when

compared to CoT(A), can be attributed to the prolonged contact with Arefil, because in

CoT(A) the extract was removed after a 20 min incubation and in CoT(B) the extract

was plated with the cells. This could justify the protective effect of Arefil only in

CoT(B). The PostT(B) treatment shows an enhance on DNA repair. This led us to

suggest stimulation of the expression of repair enzymes, involved mainly in base

excision and nucleotide excision repair pathway (Aiub et al., 2004).

All treatments except PreT, in the presence of S9 mix, exhibited lower revertants

numbers than the non-metabolized ones (tables 5 and 6). This probably is due to Arefil

metabolic activation of P450 cytochrome oxidases, enhancing its antioxidant effect.

The other strains used in antimutagenic assays were TA97, TA98 and TA100, which are

designed to detect respectively: insert frameshift mutation of G:C base pairs, deletion

frameshift mutation of G:C base pairs and base pair substitution. The positive control

used for TA97 strain was 4-NQO. A reduction in the number of His

revertants for this

strain was verified for Pre(1) treatment, in the absence of S9 mix. This can suggest an

intracellular action of Arefil, as observed in TA102 strain for PreT.

TA98 strain was treated with 2- AF and a significant reduction in the number of His

revertants colonies was observed in CoT(1) with S9 mix for all concentrations, and for

0.04 µg/mL concentration without S9 mix. 2-AF is an aromatic amine that produces

bulky lesions as adducts, especially dGAF adduct (Dutta et al., 2004). In bacteria, there

is a preference for dG-AF adducts to cause base substitution mutations, mostly G3T

transversions. The 2-AF lesions can be removed by nucleotide excision repair (Dutta et

al., 2004). These results indicate an extracellular interaction between Arefil and 2-AF,

during CoT(1), protecting cells from these induced lesions.

TA100 strain, which detects base pair substitution (G:C/A:T), was treated with SA. In S.

typhimurium SA reverts only base substitution mutants (Olsen et al., 1993). For TA100

strain, Arefil showed a protective action in PreT(1) in the presence of S9 mix for 0.4

and 4 µg/mL concentrations, suggesting an intracellular action of Arefil, preventing cell

damage. In CoT(1) a synergism between Arefil and SA was observed, by the increase of

His

revertants rate, in the absence of S9 mix. In the presence of S9 mix a reduction of

induced revertants was verified. These data support the supposition that S9 mix

metabolization results in detoxification, as observed before, in tables 5 and 6.

The results obtained demonstrate that Arefil exhibited mutagenic activity in SOS

chromotest. No mutagenicity was observed in S. typhimurium reverse mutation test for

Arefil and Arecr. Meanwhile, Arefil presents antimutagenic activity, protecting cells

from different types of mutagens by acting intracellularly, extracellularly and on DNA

repair. On plasmidial treatment, Arecr protected DNA from oxidative lesions,

presenting an effect similar to that observed on vitamin E treatment.

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Figure legends:

Figure 1: Infrared analysis (FTIR) of Arecr dissolved in chloroform and deposited in a

liquid cell with KBr window, with resolution of 4 cm

-1

Figure 2: Infrared analysis (FTIR) of Arefil dissolved in chloroform and deposited in a

liquid cell with KBr window, with resolution of 4 cm

-1

Figure 3: Ultraviolet analysis of Arecr (a) and Arefil (b). Samples were diluted in a

distilled water and ethanol solution (1:100), at 1:10 concentration of Arecr and at 1:100

concentration of Arefil. A: Absorbance, λ: nanometer.

Figure 4: Aliquots of 5 µL of plasmidial DNA pBSK 55 ng treated with Arecr for 60

min at 37

C in 0.8% agarose gel. Lane 1: Negative control (distilled water), lane 2:

Arecr 1.75 µg/mL, lane 3: 17 µg/mL lane 4: 170 µg/mL, lane 5: 500 µg/mL, lane 6:

positive control, SnCl

25 µg/mL final concentrations. F1: supercoiled form; F2: relaxed

form.

Figure 5: Aliquots of 5 µL of plasmidial DNA pBSK (55ng)were incubated for 60 min

at 37

C with 5 µL Arecr concentrations. Lane 1: SnCl

(16.6 µg/mL), lane 2: SnCl

(16.6 µg/mL) + Vit E (16.6 µg/mL), lane 3: pBSK (55 ng), lane 4: Arecr 1.1 µg/mL +

SnCl

(16.6 µg/mL), lane 5: Arecr 11 µg/mL + SnCl

(16.6 µg/mL), lane 6: Arecr 110

µg/mL+ SnCl

(16.6 µg/mL), lane 7: SnCl

(16.6 µg/mL) + Vit E (33.3 µg/mL), lane 8:

Vit E (33.3 µg/mL).Gel quantification %F1: supercoiled form % F2: relaxed form.

Figure 1

Figure 2

0.2

0.4

0.6

0.8

200 230 260 290 320 350 380 410 440

λλ

(nm)

0.2

0.4

0.6

0.8

200 230 260 290 320 350 380 410 440

λλ

(nm)

Figure 3

Figure 4

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

%F2

%F1

Lane

Figure 5

Table 1: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strains by Arecr

(µg/mL) in reverse mutation test, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain -S9 +S9

Arecr M.I.

His

± SD

Survival

M.I.

His

± SD

Survival

TA97 0 0 161 ± 17 100 0 184 ± 15 100

0.5 1.0 155 ± 18 88 1.0 193 ± 12 100

5 1.1 183 ± 23 100 1.0 191 ± 13 100

50 1.1 175 ± 16 89 1.0 175 ± 13 100

143 1.2 201 ± 6 99 1.0 184 ± 2 100

4NQO

3.1

485 ± 15 2-AF

8.2

1582 ± 52

TA98 0 0 31 ± 8 100 0 32 ± 10 100

0.5 1.0 31 ± 2 100 0.8 25 ± 2 90

5 1.1 35 ± 8 87 1.1 35 ± 4 82

50 0.9 29 ± 8 91 0.8 24 ± 2 96

143 1.0 32 ± 3 100 0.8 26 ± 5 95

4NQO

7.7

239 ± 24 2-AF

1377 ± 49

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments.

Percent survival relative to the

negative control: Toxicity when percent survival < 70%.

Positive controls: 4NQO, 4-

nitroquinoline 1-oxide 70 µg/mL and 2-AF, 2-aminofluorene: 13 µg/mL, final

concentrations.

Significant statistical difference between negative control and tested

concentrations at same experimental conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 2: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strains by Arecr

(µg/mL) in reverse mutation test, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain -S9 +S9

Arecr M.I.

His+± SD

Survival

M.I.

His+ ± SD

Survival

TA100 0 0 255 ± 35 100 0 197 ± 5 100

0.5 1.1 272 ± 25 100 0.9 185 ± 10 100

5 0.9 242 ± 21 100 1.1 215 ± 21 100

50 1.0 255 ± 31 100 0.8 153 ± 28 100

143 1.1 270 ± 12 100 1.3 265 ± 22 88

S.A.

2.2

590 ± 6 2-AF

7.1

1308 ± 12

TA102 0 0 216 ± 14 100 0 212 ± 4 100

0.5 1.0 215 ± 20 85 1.0 218 ± 29 100

5 1.0 206 ± 27 93 0.8 172 ± 20 100

50 0.9 192 ± 31 87 0.9 188 ± 16 100

143 0.5

114 ± 13 99 0.9 194 ± 13 77

MMS

7.0

1500 ± 30 2-AF

5.7

1240 ± 42

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments.

Percent survival relative to the

negative control: Toxicity when percent survival < 70%.

Positive controls: S.A sodium

azide: 14 µg/mL and MMS methyl methano sulfate: 2.8%, final concentrations.

Significant statistical difference between negative control and tested concentrations at

same experimental conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 3: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strains by Arefil

(µg/mL) in reverse mutation test, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain -S9 +S9

Arefil M.I.

His

± SD

Survival

M.I.

His

± SD

Survival

TA97 0 0 150 ± 13 100 0 192 ± 19 100

0.005 1.0 153 ± 8 100 0.9 178 ± 7 96

0.05 1.0 147 ± 13 97 0.9 179 ± 6 100

0.5 0.7

112 ± 2 96 0.8

153 ± 5 100

5 0.9

130 ± 7 98 0.8

162 ± 8 100

4NQO

2.0

300 ± 15 2-AF

7.2

1280 ± 22

TA98 0 0 20 ± 5 100 0 35 ± 4 100

0.005 1.6 31 ± 4 71 0.9 31 ± 10 93

0.05 1.0 20 ± 5 97 1.0 34 ± 6 100

0.5 1.0 19 ± 6 91 1.0 36 ± 5 100

5 1.5 29 ± 8

0.8 28 ± 4 100

4NQO

7.7

239 ± 22 2-AF

1377 ± 32

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments.

Percent survival relative to the

negative control: Toxicity when percent survival < 70%.

Positive controls: 4NQO, 4-

nitroquinoline 1-oxide 70 µg/mL, final concentrations.

Significant statistical difference

between negative control and tested concentrations at same experimental conditions is

identified by

(p < 0.01).

Table 4: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strains by Arefil

(µg/mL) in reverse mutation test, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain -S9 +S9

Arefil M.I

His+± SD

Survival

M.I.

His+± SD

Survival

TA100 0 0 162 ± 25 100 0 216 ± 25 100

0.005 0.6 100 ± 36 97 1.1 234 ± 29 72

0.05 1.2 196 ± 46 95 1.2 254 ± 27 75

0.5 1.1 178 ± 23 86 1.1 239 ± 24 76

5 1.0 158 ± 22 86 1.1 243 ± 14 77

S.A.

5.9

590 ± 18 2-AF

5.6

1308 ± 3

TA102 0 0 165 ± 24 100 0 355 ± 18 100

0.005 1.0 160 ± 8 95 0.8 280 ± 17 87

0.05 1.0 157 ± 36 100 0.7 263 ± 8 83

0.5 1.2 200 ± 33 100 0.7 266 ± 4 89

5 1.3 216 ± 6 100 0.7 243 ± 18 79

MMS

6.6

1052 ± 9 2-AF

4.4

1240 ± 18

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments.

Percent survival relative to the

negative control: Toxicity when percent survival < 70%.

Positive controls: S.A, sodium

azide: 14 µg/mL and MMS methyl methano sulfate: 2.8%, final concentrations.

Significant statistical difference between negative control and tested concentrations at

same experimental conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 5: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strain TA102 by Arefil

(µg/mL)

in antimutagenic assay, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

- S9 + S9

Incubations

Arefil M.I.

His

± SD

M.I.

His

± SD

PreT 0 1.0 289 ± 14 1.0 170 ± 7

0.05

2.8

799 ± 30

3.4

583 ± 6

0.5 1.7

484 ± 40

3.2

546 ± 0

5 1.5* 443 ± 25

3.4

584 ± 5

Mit C

2.0

580 ± 9

8.2

1395 ± 12

CoT(A) 0 1.0 257 ± 36 1.0 278 ± 5

0.04

4.3

1106 ± 43 1.8 502 ± 2

0.4

4.0

1036 ± 16

2.1

590 ± 10

4.5

1160 ± 43

2.0

550 ± 10

Mit C

4.1

1052 ± 0

2.3

640 ± 6

CoT(B) 0 1.0 473 ± 14 1.0 265 ± 7

0.04

2.6

1249 ± 10 1.5

400 ± 27

0.4

3.4

1621 ± 6

2.3

599 ± 36

3.4

1616 ± 39

2.4

646 ± 25

Mit C

2.4

1152 ± 4

2.7

710 ± 24

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments. Positive control: Mitomycin C,

final concentrations are described in material and methods. Significant statistical

difference between positive control and tested concentrations at same experimental

conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 6: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strain TA102 by Arefil

(µg/mL)

in antimutagenic assay, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

- S9 + S9

Incubations

Arefil M.I.

His+ ± SD

M.I.

His+ ± SD

Post(A) 0 1.0 82 ± 21 1.0 208 ± 7

0.04

6.0

489 ± 14

2.1

431 ± 7

0.4

6.7

550 ± 12

2.2

459 ± 32

5.8

474 ± 31 1.7 348 ± 8

Mit C

6.5

535 ± 20

2.0

423 ± 18

Post(B) 0 1.0 121 ± 21 1.0 254 ± 21

0.04

3.4

409 ± 22

2.1

528 ± 25

0.4

4.1

500 ± 28

2.0

496 ± 32

4.0

487 ± 34 1.2

300 ± 14

Mit C

4.1

493 ± 38

2.4

608 ± 10

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments. Positive control: Mitomycin C,

final concentrations are described in material and methods. Significant statistical

difference between positive control and tested concentrations at same experimental

conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 7: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strain TA97 by Arefil

(µg/mL)

in antimutagenic assay, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain - S9 + S9

TA97

Arefil M.I.

His

± SD

M.I.

His

± SD

PreT(1) 0 1.0 98 ± 16 1.0 121 ± 13

0.04

2.1

201 ± 23

3.6

440 ± 8

0.4

2.3

224 ± 6

3.3

400 ± 30

2.2

213 ± 22

3.4

416 ± 4

4NQO

4.1

400 ± 28

3.6

433 ± 23

CoT(1) 0 1.0 103 ± 18 1.0 106 ± 6

0.04

2.9

303 ± 38

3.9

417 ± 9

0.4

3.4

350 ± 0

4.1

434 ± 9

2.4

243 ± 5

4.0

425 ± 35

4NQO

2.3

235 ± 17

4.3

454 ± 23

PostT(1) 0 1.0 105 ± 17 1.0 108 ± 17

0.04

3.3

350 ± 10

4.2

451 ± 7

0.4

3.4

357 ± 14

3.9

425 ± 6

3.5

368 ± 6

3.9

424 ± 37

4NQO

3.7

392 ± 9

3.9

417 ± 28

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments. Positive control: 4NQO, 60

µg/mL, final concentrations.

Significant statistical difference between positive control

and tested concentrations at same experimental conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 8: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strain TA98 by Arefil

(µg/mL)

in antimutagenic assay, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain - S9 + S9

TA98

Arefil M.I.

His

± SD

M.I.

His

± SD

0.04

2.1

56 ± 6

5.1

238 ± 20

0.4

2.1

57 ± 12

5.3

249 ± 2

4 1.8 49 ± 4

5.2

245 ± 7

2-AF

2.2

60 ± 7

5.7

266 ± 23

CoT(1) 0 1.0 28 ± 5 1.0 47 ± 1

0.04 1.4

39 ± 3

2.4

112 ± 16

0.4 1.9

53 ± 7

3.4

161 ± 22

2.2

61 ± 6

3.4

161 ± 16

2-AF

2.4

68 ± 5

5.2

244 ± 22

PostT(1) 0 1.0 23 ± 0 1.0 46 ± 16

0.04

2.4

56 ± 10

2.5

113 ± 22

0.4

2.4

55 ± 11

4.1

188 ± 32

2.7

61 ± 6

3.3

153 ± 35

2-AF

2.9

66 ± 6

4.1

190 ± 23

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments. Positive control: 2-AF, 13

µg/mL, final concentration.

Significant statistical difference between positive control

and tested concentrations at same experimental conditions is identified by

(p < 0.01).

Table 9: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strain TA100 by Arefil

(µg/mL) in antimutagenic assay, without (-S9) and with (+S9) metabolic activation.

Strain -S9 +S9

TA100

Arefil M.I.

His

±SD

M.I.

His

±SD

PreT(1) 0 1.0 184 ± 2 1.0 224 ± 8

0.04

4.9

896 ± 31

4.8

1085 ± 30

0.4

4.4

816 ± 24

3.8

848 ± 13

4.2

772 ± 4

3.2

718 ± 30

S.A.

3.9

720 ± 13

5.1

1144 ± 38

CoT(1) 0 1.0 282 ± 14 1.0 199 ± 31

0.04

3.8

1084 ± 11 1.2

244 ± 39

0.4

5.1

1428 ± 17 1.1

225 ± 7

3.6

1012 ± 23

2.0

389 ± 35

S.A.

2.9

808 ± 23

4.8

960 ± 34

PostT(1) 0 1.0 144 ± 22 1.0 176 ± 28

0.04

2.8

405 ± 12

7.0

1236 ± 34

0.4

2.6

379 ± 33

9.2

1624 ± 15

2.7

382 ± 6

7.3

1285 ± 21

S.A.

2.8

400 ± 14

9.2

1626 ± 17

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments. Positive control was Sodium

azide, 13 µg/mL, final concentration. Significant statistical difference between positive

control and tested concentrations at same experimental conditions is identified by

(p <

0.01).

Table 10: Induction of His

revertants in Salmonella typhimurium strain TA102 by

Arefil (µg/mL) in antimutagenic assay, without (-S9) and with (+S9) metabolic

activation.

Strain -S9 +S9

TA102

Arefil M.I.

His

±SD

M.I.

His

±SD

PreT(1) 0 1.0 303 ± 6 1.0 255 ± 7

0.04

5.4

1640 ± 9

3.5

886 ± 14

0.4

4.0

1200 ± 10

3.3

829 ± 28

3.9

1172 ± 18

3.5

897 ± 32

Mit C

3.8

1149 ± 16

3.2

821 ± 35

CoT(1) 0 1.0 280 ± 13 1.0 231 ± 15

0.04

3.0

840 ± 17

3.3

760 ± 27

0.4

2.9

825 ± 17

3.5

805 ± 7

3.0

850 ± 22

3.4

785 ± 7

S.A.

3.0

849 ± 12

3.4

795 ± 34

PostT(1) 0 1.0 195± 6 1.0 233 ± 18

0.04 0.9

183 ± 12

3.8

889 ± 15

0.4 1.4

276 ± 8

3.7

857 ± 10

2.1

413 ± 17

3.7

869 ± 3

S.A.

3.6

700 ± 14

3.8

875 ± 35

Mutagenic index: n

. of His

induced in the sample/n

. of spontaneous His

in the

negative control (H

O). Bold numbers mean positivity for mutagenicity: MI ≥ 2.0.

His

/plate: mean values of at least three experiments. Positive control was mitomycin

C, 6.3 µg/mL, final concentration. Significant statistical difference between positive

control and tested concentrations at same experimental conditions is identified by

(p <

0.01).

Table 11: SOS induction by Arefil extract in E. coli strains PQ35 and PQ37 without (-

S9) or with (+S9) metabolic activation.

-S9 +S9

Strain

Arefil

(µg/mL)

β-Gal

B/P

β-Gal

B/P

PQ35

0 5,3 25 0,2 1,0 1,8 4,3 0,4 1,0

0.05 6,9 24 0,3 1,4 1,3 4,7 0,3 0,7

0.5 5,5 19 0,3 1,3 1,5 4,7 0,3 0,8

5 6,8

0,6

2,8

1,6 4,6 0,4 0,9

SA 7,0 22 0,3

1,5

2-AF 6,8 6,4 1,1

3,8

PQ37

0 1,0 1,3 0,7 1,0 1,6 0,1 18,6 1,0

0.05 1,5

0,5

3,2

4,1

2,0 0,4 5,1 1,3

0.5 2,2

0,3

8,7

1,7 0,2 7,4 1,1

5 0,1

0,1

0,5 0,7 1,6 0,9 1,7 1,0

SA 1,7

0,4

4,2

5,3

2-AF 2,4 0,1 41,7

1,6

β-galactosidase (β-Gal) and

alkaline phosphatase (PA) activities are expressed in

Miller units.

β-Gal/ PA

Induction factor. The period of incubation with each substract

was 60 minutes. Bold numbers indicate a positive toxicity and/ or mutagenicity

response. Positive controls for the assay without S9 mix was Sodium azide (13 µg/mL)

and with S9 mix was 2- aminofluorene (13 µg/mL). Significant statistical difference

between negative control and tested concentrations at same experimental conditions is

identified by

(p < 0.01).

5. Cytotoxic, mutagenic and antimutagenic screening of

Arenosclera brasiliensis acetonic and ethanolic extracts.

Accepted by Genetics and Molecular Research in 03/24/2008.

Artigo aceito pela revista Genetics and Molecular Research em 24/03/2008.

Cytotoxic, mutagenic and antimutagenic screening of Arenosclera brasiliensis

acetone and ethanol extracts.

Luiza Stankevicins

, Claudia Alessandra Fortes Aiub

, José Luiz Mazzei

, Gisele Lobo-

Hajdu

, Israel Felzenszwalb

1,*

Departamento de Biofísica e Biometria,

Departamento de Biologia Celular e

Genética, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do

Rio de Janeiro. Avenida 28 de setembro, 87 fds, 20551-030, Rio de Janeiro, Brasil.

Departamento de Farmacologia e Toxicologia, Instituto Nacional de Controle de

Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, 21040-900, Rio de Janeiro, Brasil.

Corresponding author: Israel Felzenszwalb

E-mail: [email protected]

Abstract:

The marine environment is a rich source of biologically active compounds with

pharmacological properties. Marine organisms often produce secondary metabolites

with structural features different from those produced by terrestrial ones, and the

phylum Porifera seems to be one of the most productive in this sense. This study was

undertaken to provide data on mutagenic and antimutagenic activities from an acetone

(Areac) and an ethanol (Areet) extract obtained from Arenosclera brasiliensis, an

endemic Brazilian sponge. A qualitative Salmonella reverse mutation test was

performed with the TA97, TA98, TA100 and TA102 strains by incubating cells with

Areac and Areet in the presence and absence of a known mutagen. A cytotoxic

evaluation of the extracts was also performed. A.brasiliensis did not display any

mutagenic activity, but Areac showed significant toxicity against test strains. In the

antimutagenic assay, a reduction in the number of his

revertants was observed for the

TA97, TA100 and TA102 strains treated with Areac when compared to the positive

controls. Areet treatment showed protective activity against DNA lesions only for the

TA100. These results are in agreement with those obtained previously with other A.

brasiliensis extracts, suggesting an antimutagenic activity.

Key words: Arenosclera brasiliensis, antimutagenicity, Salmonella reverse mutation

test, marine natural products.

1. Introduction

Nature is an attractive source of new therapeutic compounds with a tremendous

diversity found among millions of species of plants, animals, marine organisms and

microorganisms (Rocha et al., 2001). The marine environment is a promising source of

biologically active compounds, especially in Brazil where the coastline extends about

8000 km and comprises over 800,000 km

of continental shelf still poorly explored.

The marine fauna and flora usually produce secondary metabolites with structural

features distinct from other natural sources which are of interest for potential industrial

and medical applications (Berlinck et al., 2004; Hausman et al., 2006; Aiub et al., 2006)

The marine sponges (Phylum Porifera) have the greatest diversity of active secondary

metabolites (Van Soerst and Braekman, 1999). Most of them have unique chemical

patterns and generally have anti-inflammatory, antitumor, antibiotic, antiviral or

antifouling activities (Sipkema et al. 2005).

Our source of study was the marine sponge Arenosclera brasiliensis (Demospongiae,

Haplosclerida) which is endemic to the southwest coast of Brazil (Torres et al., 2000).

The order Haplosclerida is an important source of alkylpiperidine alkaloids, with a great

diversity of compounds reported (Almeida and Berlinck, 1997).

The present study was undertaken to screen for chemical groups of active components

in acetone and ethanol extracts of Arenosclera brasiliensis and to provide data on the

genotoxic and anti-genotoxic activity present.

2. Material and Methods

2.1 Preparation and infrared and ultraviolet analysis of A. brasiliensis extracts.

Samples of A. brasiliensis were collected at João Fernandinho Beach, Búzios (Rio de

Janeiro, Brazil), in April, 2006 at a depth of 2 -7 meters. Samples were washed with sea

water, cleaned of all visible surface debris, and stored at 4

C for 6 months, in 92%

ethanol in a volume corresponding to twofold its weight. A voucher sample was

deposited in the Porifera collection of Museu Nacional do Rio de Janeiro (MNRJ 1704).

To prepare the acetone (Areac) and ethanol (Areet) extracts of A. brasiliensis, 106 g

tissue sample were submitted to an extraction using a Soxhlet extractor with 300 mL of

acetone (99.5%) and ethanol (96%) as solvents. After the first cycle, samples were

submitted to extraction for two more hours. Acetone and ethanol were evaporated under

vacuum at 45ºC and 55ºC and the extracts were lyophilized, yielding 143.7 mg and 61.9

mg dry weight, respectively. Both extracts were frozen at – 20ºC and diluted in distilled

water before use.

The chemical analysis of the extracts consisted of measuring the ultraviolet spectra of

the final fractions (diluted in distilled water and ethanol 1:100), recorded with a

Shimadzu UV-160A spectrophotometer, and the infrared spectra (FTIR), recorded with

a Perkin-Elmer Spectrum One instrument with a resolution of 4 cm

-1

with the dried

extracts dissolved in chloroform and deposited in a liquid cell with a KBr window.

2.2 Bacterial strains

The Salmonella typhimurium strains TA97, TA98, TA100 and TA102, were provided

by Dr. B. N. Ames, University of California, Berkeley, CA, USA.

2.3 Qualitative Salmonella reverse mutation assay

Mutagenicity and antimutagenicity were evaluated in both Areac and Areet, following

the protocol proposed by Maron and Ames (1983), with some adaptations. A 100-µL

aliquot of an overnight cell culture (2 x 10

cells/mL)

of S. typhimurium strains TA97,

TA98, TA100 and TA102 were plated with 2 mL of top agar (0.7% agar, 0.6% NaCl, 50

µM L-histidine, 50 µM biotin, pH 7.4, 40

C) in Petri dishes containing 1.5% agar in

Vogel Bonner E medium with 2% glucose (minimal agar medium). After solidification

of the top agar, filter disks of approximately 5 mm were placed in the middle of all Petri

dishes.

For the mutagenic test, 10 µL of Areac (1.2 µg/plate) and 10 µL Areet (2.3 µg/plate)

were poured on the filter disks, and for the antimutagenic test, 10 µL of Areac and

Areet (1.2 and 2.3 µg/plate, respectively) together with 10 µL of the respective positive

control were poured on the filter disks. Afterward, the strains were incubated at 37

for

72 h, his

revertants were counted, and if an inhibition halo formed, it was measured.

Positive controls used in the assay were 4-nitroquinoline 1- oxide (0.5 ng/plate) for the

TA97 strain, 2-aminofluorene (0.015 ng/plate) for the TA98 strain, sodium azide (50

ng/plate) for the TA100 strain and mitomycin C (2.5 ng/plate) for the TA102 strain. The

tests were performed in triplicate and repeated twice.

2.4 Cytotoxicity

For Areac and Areet cytotoxic determination, 10 µL of each (1.2 and 2.3 µg/plate,

respectively) were poured on the filter disks placed in the middle of Petri dishes,

containing nutrient agar medium (0.8% Bacto nutrient broth (Difco), 0.5% NaCl and

1.5% agar). The plates were incubated at 37

C for 24 h and the inhibition halo, when

present, was measured. Experiments were performed in triplicate and repeated twice.

3. Results and Discussion

The infrared analysis (FTIR) of the extracts showed the following absorption peaks:

3411, 2924, 2853, 1634, 1405, 1195, 1044 and 742 cm

-1

for Areac

and 3412, 1634,

1404, 1199, 1044 cm

-1

for Areet. The spectra obtained by ultraviolet (UV) analysis

corroborate the functional groups detected in Areet and Areac extracts by FTIR.

The chemical groups detected are also the same described for arenosclerins A-C and

haliclonacyclamine E, previously isolated compounds from A. brasiliensis (Torres et

al., 2000), and for Arecr and Arefil, A. brasiliensis extracts that have shown

antimutagenic activity (Stankevicins L, Aiub C, de Santa Maria LC, Lobo-Hajdu G,

Felzenszwalb I, unpublished data).

No mutagenicity was observed in the S. typhimurium qualitative reverse mutation assay

for Areac. The TA97, TA100 and TA102 strains showed a reduction in the number of

revertants in the antimutagenic assay performed with Areac, when compared to the

positive controls (Figures 1-4). No mutagenic activity was detected in strains treated

with Areet. Antimutagenicity was detected only for the TA100 strain.

In survival assays, an inhibition halo of approximately 18 mm for TA97, 26 mm for

TA98, 14 mm for TA100 and 17 mm for TA102 could be observed when treated with

Areac. No cytotoxic effect was observed for Areet when compared to the negative

control, treated with 0.9% NaCl.

These results are in agreement with those obtained previously with Arefil extract

(Stankevicins L, Aiub C, de Santa Maria LC, Lobo-Hajdu G, Felzenszwalb I,

unpublished data), suggesting an important protective effect against lesions caused by

different classes of mutagens.

Acknowledgments

The authors are thankful to Rita Maria P. de Sá, Departamento de Química Orgânica,

UERJ, Brazil, for the spectrometric analysis. This work was supported by FAPERJ,

CNPq, SR-2-UERJ and CAPES.

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Figure legends:

Figure 1: Experiments performed with the TA97 strain. Survival experiment of

1. negative control (0.9% NaCl ), 2. Areac at 1.2 µg/plate and 3. Areet at 2.3

µg/plate, respectively. Salmonella reverse mutation assay of 4. negative control

(0.9% NaCl), 5. Areac at 1.2 µg/plate and 6. Areet at 2.3 µg/plate, respectively.

Antimutagenic analysis of 7. Areac at 1.2 µg/plate, 8. Areet at 2.3 µg/plate and

9. positive control described in Material and Methods.

Figure 2: Experiments performed with the TA98 strain. Survival experiment of

1. negative control (0.9% NaCl), 2. Areac at 1.2 µg/plate and 3. Areet at 2.3

µg/plate, respectively. Salmonella reverse mutation assay of 4. negative control

(0.9% NaCl ), 5. Areac at 1.2 µg/plate and 6. Areet at 2.3 µg/plate, respectively.

Antimutagenic analysis of 7. Areac at 1.2 µg/plate, 8. Areet at 2.3 µg/plate and

9. positive control described in Material and Methods.

Figure 3: Experiments performed with the TA100 strain. Survival experiment of

1. negative control (0.9% NaCl ), 2. Areac at 1.2 µg/plate and 3. Areet at 2.3

µg/plate, respectively. Salmonella reverse mutation assay of 4. negative control

(0.9% NaCl), 5. Areac at 1.2 µg/plate and 6. Areet at 2.3 µg/plate, respectively.

Antimutagenic analysis of 7. Areac at 1.2 µg/plate, 8. Areet at 2.3 µg/plate and

9. positive control described in Material and Methods.

Figure 4: Experiments performed with the TA102 strain. Survival experiment of

1. negative control (0.9% NaCl), 2. Areac at 1.2 µg/plate and 3. Areet at 2.3

µg/plate, respectively. Salmonella reverse mutation assay of 4. negative control

(0.9% NaCl), 5. Areac at 1.2 µg/plate and 6. Areet at 2.3 µg/plate, respectively.

Antimutagenic analysis of 7. Areac at 1.2 µg/plate, 8. Areet at 2.3 µg/plate and

9. positive control described in Material and Methods.

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

6. Discussão

Esponjas marinhas da ordem Verongida e Haplosclerida demonstram ser uma

rica fonte de compostos com atividades biológicas, já tendo sido descritas propriedades

antivirais, antibacterianas e antitumorais (Muricy et al.,1993; Ciminiello et al., 1996;

Rangel et al., 2001; Torres et al., 2002). Grande parte dos estudos toxicológicos

realizados com estes compostos inclusive os provenientes das esponjas A. fulva e A.

brasiliensis foram feitos com o intuito de verificar a citotoxicidade contra células

específicas de tumores ou contra microorganismos resistentes (Muricy et al.,1993;

Ciminiello et al., 1996; Torres et al., 2002).

Sabe-se que diversas substâncias utilizadas como quimioterápicos para o

tratamento do câncer são mutagênicas ou clastogênicas e seus efeitos antitumorais são

baseados na sua reatividade com o DNA, sendo um importante mecanismo de ação para

diversos agentes anticâncer (Zeiger, 2007).

Existem poucos trabalhos envolvendo avaliação genotóxica e antigenotóxica de

compostos marinhos. Não foi encontrado nenhum envolvendo extratos de A. fulva e A.

brasiliensis, apesar de já terem sido observados efeitos tóxicos específicos contra

linhagens tumorais (Torres, et al., 2002).

As esponjas da ordem Verongida se caracterizam pela presença de compostos

brominados. Em A. fulva já foi descrita a presença de compostos derivados de 2-

oxazolina, como as bromotirosinas fistularina 1 e 2 que possuem atividade citotóxica

(Gopichand e Schmitz, 1979). Frações dos extratos AQE e ALE de A. fulva, obtidas por

metodologia típica para separação de bromotirosinas e outros alcalóides apresentaram

espectros de UV e IV idênticos. A absorção entre 2950- 2854 cm

-1

, 1500 - 1200 cm

-1

próxima a 1740 cm

-1

é característica do espectro de 2-oxazolidona, um derivado mono-

oxidado da 2- oxazolina, sendo também considerado indícios da presença de compostos

com grupamento amida. A falta da absorção a 2265 cm

-1

e a comparação entre espectros

indicada a ausência das substâncias aeroplysina I e fistularina 3.

Já foram isolados de esponjas marinhas em torno de 30 a 50 compostos

derivados de 3- alquilpiperidina, sendo característicos da ordem Haplosclerida. A

potência destes compostos geralmente varia de acordo com o seu grau de polimerização.

Grande parte deles possui atividade citotóxica e/ou antibacteriana em baixas

concentrações, já tendo sido observadas atividades antimitóticas, inibidora de receptores

muscarínicos de acetilcolina e de algumas enzimas como as histonas desacetilases (Turk

et al., 2007). No presente trabalho, extratos obtidos a partir da esponja A. brasiliensis

não apresentaram diferenças entre si nos espectros UV e IV. Os espectros encontrados

revelaram a presença dos mesmos grupamentos químicos encontrados nos compostos

derivados de 3- alquilpiperidina.

Dentre os animais marinhos, as esponjas têm a mais alta taxa de compostos

citotóxicos já identificados, compreendendo 10% das espécies investigadas (Prado et

al., 2004). As frações AQE e ALE de A. fulva apresentaram efeito citotóxico em células

de mamíferos (fibroblastos de rato Balb/c 3T3) através do teste cometa, para as cepas de

S. typhimurium TA98, TA100 e TA102 através de curvas de sobrevivência e para as

cepas de E. coli PQ37 e PQ65 devido a uma redução na atividade de fosfatase alcalina

no SOS cromoteste. Os extratos de A. brasiliensis apresentaram atividade citotóxica nas

concentrações acima de 143 µg/mL para Arecr e 50 µg/mL para Arefil, durante uma

testagem prévia realizada com a cepa TA102 para determinação da concentração não

tóxica a ser utilizada nos ensaios de mutagenicidade e antimutagenicidade. O ensaio

qualitativo realizado com o extrato Areac (1,2 µg/placa) exibiu um efeito citotóxico,

verificada através da formação de um halo de inibição nas cepas de S. typhimurium

testadas. Foi verificada uma inibição da proteína fosfatase alcalina no SOS cromoteste

na concentração de 5 µg/mL de Arefil na cepa PQ35, e nas concentrações de 0,05, 0,5 e

5 µg/mL na cepa PQ37, mais um indício de toxicidade.

A avaliação mutagênica dos extratos de A. fulva e A. brasiliensis consistiu na

realização do teste de mutação reversa em células bacterianas e do SOS cromoteste.

Para verificar a ocorrência de quebras no DNA foram realizados o ensaio cometa ou

tratamento plasmidial. A fração AQE, de A. fulva, no SOS cromoteste, apresentou efeito

genotóxico quando incubada com a cepa PQ37 nas diluições de 1:20 e 1:40, na ausência

de S9 mix (metabolização), mostrando a ocorrência de uma lesão normalmente reparada

por excisão de nucleotídeos. A fração ALE, também de A. fulva, mostrou maior

atividade mutagênica quando comparada com a fração AQE, verificada pelo aumento

do fator de indução para as cepas PQ37 nas diluições 1:10, 1:5 e 1:2 na ausência de

metabolização promovida por S9mix e nas cepas PQ35 e PQ65 nas diluições 1:5 e 1:2

na presença de S9 mix e através do teste de mutação reversa na diluição 1:2, para a cepa

TA97, na ausência de S9.

A avaliação genotóxica realizada através do teste cometa demonstrou uma

indução significativa de lesões no DNA sugerindo a ocorrência de um processo

necrótico ou apoptótico nas células tratadas com os extratos, sendo verificada uma

maior ação induzida pela fração ALE.

Nenhum extrato de A. brasiliensis testado apresentou resposta mutagênica ou

induziu danos ao DNA nos ensaios realizados.

Nas esponjas marinhas, a maior expressão de enzimas metabolizadoras favorece

a detoxificação de xenobióticos sendo capaz de inibir a formação de lesões induzidas

por mutágenos ou carcinógenos (De Flora et al., 1995). Os níveis de glutationa

presentes nas células do mesohilo das esponjas são bastante elevados e algumas

espécies têm concentrações até duas vezes maiores que a de preparações de fígados de

ratos não tratados (De Flora et al., 1995). Além disso, como o mecanismo de defesa

destes animais é químico, é possível que haja a produção de compostos que protejam

suas células dos efeitos de compostos tóxicos e/ou mutagênicos por outros organismos

nos oceanos. Com a finalidade de testar um possível efeito protetor presente nos

extratos foram realizados ensaios de antigenotoxicidade com os extratos de A.

brasiliensis.

Os dados obtidos revelam uma atividade protetora contra danos no DNA

promovida por Arefil através da redução do número de revertentes induzidas no ensaio

de mutação reversa para algumas condições testadas, em todas as cepas, durante o pré-

tratamento, o co-tratamento e o pós-tratamento, evidenciando uma ação de Arefil

intracelular, extracelular e sobre o mecanismo de reparo de DNA.

Dois ensaios foram realizados com a cepa TA102 que é capaz de detectar

substituições de pares de base do tipo (A:T/G:C) sendo também a cepa de S.

typhimurium mais adequada para identificação de agentes que causam danos oxidativos

(Levin et al., 1982). O mutágeno utilizado foi a mitomicina C que requer reações redox

na formação de intermediários reativos, envolvidos na formação de adutos. Este mesmo

mecanismo leva a formação de espécies reativas de oxigênio, que terão propriedades

tóxicas e mutagênicas (Pagano, 2002). O extrato Arefil apresentou um efeito protetor

contra os danos gerados pela mitomicina C no pré- co- e pós- tratamento, indicando

uma redução na formação de adutos e do estresse oxidativo.

Todos, exceto o pré-tratamento, quando incubados com S9 mix exibiram menor

número de revertentes que os mesmos tratamentos na ausência de metabolização. Isto

pode ser atribuído a ativação metabólica de componentes do extrato, promovendo um

aumento no efeito antioxidante ou à interação do extrato com enzimas citocromo P450

oxidases.

Uma redução no número de revertentes His

foi verificada no pré-tratamento

realizado com a cepa TA97, apta a detectar mutações do tipo deslocamento do quadro

de leitura em pares de base G:C que foi tratada com o controle positivo 4-NQO. Isto

sugere que Arefil exerce um efeito protetor intracelular assim como foi verificado no

pré-tratamento realizado com a cepa TA102.

Os resultados obtidos para a cepa TA98 indicam uma possível interação

extracelular entre Arefil e 2-aminofluoreno durante o co-tratamento, protegendo as

células das lesões induzidas. A cepa TA98 detecta mutações do tipo deslocamento do

quadro de leitura em pares de bases G:C e foi tratada com 2- aminofluoreno, uma amina

aromática que promove a formação de adutos em especial os do tipo dGAF, removidos

pelo reparo por excisão de nucleotídeos (Dutta et al., 2004).

A cepa TA100 detecta substituições de pares de bases (G:C/A:T) e foi tratada

com azida sódica. Em S. typhimurium azida sódica reverte somente genótipos mutantes

com substituições de pares de base (Olsen et al., 1993). Para a cepa, TA100 Arefil

mostrou uma ação protetora no pré-tratamento na presença de S9 mix, sugerindo uma

ação intracelular de Arefil, prevenindo as células de danos. No co-tratamento um

sinergismo entre Arefil e a azida sódica pode ser observado pelo aumento da taxa de

revertentes His

, na ausência de S9 mix, pois na sua presença, ocorre o contrário, ou

seja houve uma redução no número de revertentes induzidas. Sugerimos que a

metabolização de Arefil resultou na detoxificação e redução da atividade mutagênica.

O tratamento plasmidial foi realizado a fim de se avaliar a proteção contra

quebras no DNA decorrentes de danos oxidativos. O controle positivo utilizado foi o

cloreto estanoso, um potente agente genotóxico causador de quebras simples e duplas

no DNA através da formação de espécies reativas de oxigênio (Dantas et al., 1999).

O extrato Arecr mostrou um efeito protetor semelhante ao observado quando o

DNA foi tratado com vitamina E (33.3 µg/mL) pela diminuição da forma relaxada F2

(quebras simples) e o aumento da forma superenovelada F1 (DNA intacto), sugerindo

um efeito antioxidante do extrato.

7. Conclusões

• Os extratos AQE e ALE de A. fulva apresentaram atividade

mutagênica.

• As frações AQE e ALE produziram quebras no DNA.

• Os extratos de A. brasiliensis não exibiram efeito genotóxico.

• O extrato Arefil da esponja A. brasiliensis mostrou um efeito

antimutagênico, protegendo a célula de lesões através de um efeito

intracelular, extracelular e modulando o sistema de reparo do DNA.

• Foi observada uma diminuição no número de quebras no DNA após

tratamento plasmidial com o extrato Arecr.

• Nos ensaios qualitativos realizados com Areac e Areet não foi

observado efeito mutagênico e foi verificado um efeito protetor,

antimutagênico do extrato Areac e Areet nas concentrações 1,2 e 2,3

µg/placa.

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