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CLAUDETE APARECIDA ALVES
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES NO
ADENOCARCINOMA E NO ENDOMÉTRIO NORMAL DE
MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Doutor em Ciências
SÃO PAULO
2007
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Milhares de livros grátis para download.
II
CLAUDETE APARECIDA ALVES
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES NO
ADENOCARCINOMA E NO ENDOMÉTRIO NORMAL DE
MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Wagner José Gonçalves
Co-orientadores: Prof. Dr. Ismael D. C. G. Silva
Profª. Dra. Claudia C. R. Bortoletto
SÃO PAULO
2007
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III
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
CHEFE DO DEPARTAMENTO: Prof.Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO: Prof. Dr. Vilmon de Freitas
IV
DEDICATÓRIA
V
Aos meus queridos pais Maurílio e Conceição,
responsáveis pela minha formação acadêmica e
cúmplices na minha formação pessoal,
dedicação e amor incondicional, em todos os
momentos da minha vida.
Aos meus amados irmãos Carlos, Roberto e
Altair, pela felicidade desses anos de
convivência, e pelas alegrias que ainda
viveremos juntos.
VI
AGRADECIMENTOS
VII
A DEUS
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, professor do Departamento de
Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, coordenador do Laboratório de
Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo, pelo importante estímulo e
preciosas sugestões na execução deste trabalho e pelos conhecimentos em biologia
molecular compartilhados, disponibilidade e otimismo.
Prof. Dr. Wagner José Gonçalves, professor livre-docente Chefe da Disciplina de
Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de
São Paulo, pelo estímulo, atenção e ensinamentos em nossa vida acadêmica e na
realização deste trabalho.
Aos professores Dra. Cláudia de Carvalho Ramos Bortoletto e Dr. Sérgio Mancini
Nicolau, da Disciplina de Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da
Universidade Federal de São Paulo, por compartilharem conosco o atendimento das
pacientes deste estudo.
Prof. Dr. João Norberto Stávale, professor livre-docente do Departamento de Patologia
da Universidade Federal de São Paulo, pela colaboração na leitura de lâminas deste
trabalho.
Sr. Márcio Alexandre Custódio, Biólogo do Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Federal de São Paulo, pela colaboração na utilização dos equipamentos
necessários à realização deste trabalho.
A todos os pós-graduandos e médicos da Disciplina de Oncologia Ginecológica do
Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, Dr. Robério de
Souza Damião, Dr. Marco Antônio Pereira, Dra. Maria Paula Ribas Caramuru, Dr.
Renato Moretti, Dr. Ademir Narciso de O Menezes, Dr. Roney Signorini Filho, Dra
Vivian Beatriz Natale, Dr. Milton Sakano, Dr. Levon Badiglian Filho pelo auxílio no
atendimento das enfermas.
Dra. Elizabeth Rautmann Cesarino Linhares, pós-graduanda do Departamento de
Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pela amizade, ensinamentos e
apoio sempre recebidos.
Às secretárias do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São
Paulo, Valéria Miranda dos Santos Medina, Zélia Maria Gomes Macedo, Maria Cecília
da Rocha Santos e Karim Martim dos Santos pela dedicação e auxílio em nosso
trabalho.
A todos os demais professores, pós-graduandos, residentes e funcionários do
Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pela
solidariedade e cooperação durante o nosso estudo.
Às pacientes, minha eterna gratidão.
VIII
RESUMO
IX
A tecnologia microarray revelou ser metodologia eficiente na avaliação da expressão
diferencial de genes e, portanto, tornou-se ferramenta usual em investigação molecular
do câncer.
Neste estudo, utilizou-se microarrays de cDNA contendo 2000 genes diferentes para
analisar a expressão gênica em 10 casos de carcinomas endometrióides humanos pós-
menopausa pareados contra seus tecidos normais correspondentes adjacentes para
identificar genes diferencialmente expressos.
Vários genes foram encontrados diferencialmente expressos neste estudo. Destacou-
se o MAP3K8, gene que nunca havia sido descrito superexpresso neste tipo de
neoplasia maligna.
Para validar a expressão diferencial deste gene, assim como a membrana array,
executou-se análise RT-PCR semiquantitativa. O MAP3K8 mostrou-se superexpresso
em 30% das amostras de carcinoma de endométrio.
Este é o primeiro relato mostrando o oncogene MAP3K8 relacionado ao carcinoma de
endométrio humano, sugerindo ser outra molécula envolvida no câncer endometrial
humano.
X
LISTAS
XI
Lista de abreviaturas e símbolos
cDNA – DNA complementar
RT-PCR – transcrição reversa – reação em cadeia de polimerase
MAP3K8 – mitogen – activated protein kinase kinase kinase 8
COT – Cancer Osaka Thyroid Oncogene
TPL2 – Tumor progression locus 2
ORESTES – Open reading frames; EST´S – Expression sequence tags
XII
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Diagnóstico Anátomo-patológico, estadiamento clínico-cirúrgico,
superexpressão do MAP3K8 e seguimento das pacientes.
XIII
Lista de figuras
FIGURA 1 – Identificação de genes diferencialmente expressos em tumores
endometriais.
FIGURA 2 – Genes com expressão diferencial em tumores endometrióides.
FIGURA 3 – Seqüenciamento automático de DNA.
XIV
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA.............................................................................................................. IV
AGRADECIMENTOS.................................................................................................... VI
RESUMO..................................................................................................................... VIII
LISTAS........................................................................................................................... X
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................1
2. PROPOSIÇÃO............................................................................................................7
3. PACIENTES E MÉTODOS..........................................................................................9
3.1. Pacientes...........................................................................................................10
3.1.1. Critérios de inclusão para o estudo..........................................................10
3.1.2. Critérios de exclusão para o estudo.........................................................10
3.2. Métodos.............................................................................................................12
3.2.1. Método Anátomo-patológico.....................................................................12
3.2.2. Método Biomolecular.................................................................................12
3.3. Análise dos dados ............................................................................................14
3.4. RT-PCR ..............................................................................................................15
3.5. Sequenciamento automático de DNA .............................................................15
4. RESULTADOS..........................................................................................................16
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................22
6. CONCLUSÕES .........................................................................................................29
7. ANEXOS ...................................................................................................................31
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................46
SUMMARY
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
INTRODUÇÃO
2
O câncer de endométrio representa uma das mais comuns
neoplasias malignas em ginecologia.
Desde 1972 o carcinoma de endométrio é a neoplasia maligna mais
freqüente da pelve nos países desenvolvidos, mormente nos Estados Unidos da
América (Barakat et al., 1997; Bristol R. E., 1999).
O Brasil classifica-se entre os países com alta incidência de câncer.
A estimativa do INCA (Instituto Nacional do Câncer) para o ano de 1998 foi de 5.685
casos novos de câncer do corpo uterino, correspondendo à sexta mais freqüente
neoplasia maligna da mulher, sendo superada apenas pelo colo uterino, pele, mama,
intestino grosso e estômago (Brasil, 1998).
O câncer de endométrio, em especial, apresenta incidência variável
dentre as diversas regiões do nosso país. A taxa específica para a região sudeste é de
9,9/100.000 mulheres (Brasil, 1998).
Assim, o estudo desta neoplasia se reveste de importância, pois,
registra-se, de forma progressiva, o aumento de sua incidência, ao lado de
considerável mortalidade (Rakar e Kovacic, 1990). A maior freqüência pode ser
explicada pelo aumento da longevidade, das melhores condições nutritivas, da
obesidade, da baixa paridade, do abuso da estrogenioterapia no climatério e a outros
fatores ainda desconhecidos (Rodrigues de Lima et al., 1999).
Assinalaram Homesley e Zaino (1994) e Evans e Podratz (1996) que
o número de óbitos em decorrência desta neoplasia praticamente dobrou desde 1987.
Ressalta-se, ainda, que a sobrevida de cinco anos, quando se englobam todos os
estádios clínicos, é da ordem de 72,7%, mesmo se considerando os progressos
alcançados pelas diversas modalidades terapêuticas (International Federation of
Gynecology and Obstetrics - 1995).
O prognóstico da maior parte das pacientes com câncer de
endométrio no estádio I é bom, com índices de sobrevida em cinco anos de 80% a 98%
(Gal et al., 1992; Evans e Podratz, 1996). Entretanto, esta sobrevida deve-se em
grande parte, ao sangramento genital, que constitui sintoma relativamente precoce.
Em cerca de 75% a 80% de todos os casos, a neoplasia encontra-se
confinada ao corpo uterino no momento do diagnóstico (Tornos et al., 1992; Barakat et
al., 1997). Todavia, cerca de 20% a 50% do número de óbitos ocorrerão em mulheres
inicialmente atendidas no estádio clínico I (Evans e Podratz, 1996).
3
Para Tornos et al. (1992), embora a sobrevida das pacientes no
estádio IG1, seja superior a 90%, não é desprezível a mortalidade inclusive neste
subgrupo, face do grande número de pacientes acometidas.
A maior parte dos fatores prognósticos utilizados para prever a
evolução das enfermas embasam-se no estudo de peças operatórias, obtidos por
ocasião da cirurgia. Assim, quando a FIGO (1988) modificou e preconizou o
estadiamento clínico-cirúrgico atual, vários fatores prognósticos passaram a ser
avaliados com maior exatidão, identificando-se subgrupos com maior risco para
apresentar recidivas e metástases. Estes dados, obtidos pelo estadiamento, são de
suma importância para o adequado tratamento e prognóstico (Gal et al., 1992).
Indubitavelmente, os critérios adotados pela FIGO (1988) ao estadiar
o câncer de endométrio, associando os informes da propedêutica clínica aos dados
histopatológicos obtidos das peças operatórias na laparotomia, incluíram os principais
fatores prognósticos, destacando-se o grau de invasão miometrial, a presença e o grau
do comprometimento do colo, dos anexos, da vagina e dos paramétrios, o
acometimento linfonodal, a presença de citologia peritoneal positiva, a invasão tumoral
da mucosa da bexiga ou do reto e a ocorrência de metástases.
Gebrim et al. (1999) assinalaram a importância de vários elementos
ao aquilatar o risco de recidivas. Consideraram, além do estadiamento, a idade da
enferma, o volume do útero, a diferenciação histológica, o grau de invasão miometrial,
o tipo histopatológico, o comprometimento linfonodal, a citologia peritoneal, a invasão
linfática tumoral, os receptores hormonais e a obesidade. Na dependência destas
variáveis, classificaram as pacientes em sem risco, com pequeno e com grande risco
para recidivas da neoplasia.
Assim, as pacientes identificadas no subgrupo de grande risco
deveriam receber terapia adjuvante, enquanto as de baixo risco seriam dispensadas da
rádio, hormônio e/ou da quimioterapia.
Por outro lado, na literatura assinalam-se outras variáveis
relacionadas ao maior risco de recidivas e metástases e que não estão incluídas no
estadiamento vigente da FIGO. Assinalam-se o tipo histopatológico, a invasão
linfovascular, o número de mitoses por campo de grande aumento e a presença de
infiltrado linfocítico perivascular. Estes parâmetros podem ser obtidos dentro da
metodologia rotineira no estudo anátomo-patológico das peças operatórias (Góis et al.,
1993; Esteller et al., 1999; Stávale, 1999).
4
Quanto aos subtipos histopatológicos sabe-se que os carcinomas de
endométrio nas variedades adenoescamosa, serosa-papilífera, de células claras e
indiferenciada são mais agressivos e associam-se a menores taxas de sobrevida
(Wilson et al., 1990; Esteller et al., 1999; Stávale, 1999).
Se a histopatologia dos tumores proporciona dados relevantes para
o prognóstico, a biologia molecular promoveu nova frente de pesquisas para a melhor
compreensão das neoplasias e, eventualmente, novas oportunidades na seleção dos
grupos de maior risco de recidivas e metástases.
Para Evans e Podrats (1996), as alterações verificadas na ploidia do
DNA e na atividade proliferativa das células traduziriam as mudanças no conteúdo do
material genético e na regulação do crescimento. Mais especificamente, estas
características semiquantitativas decorreriam de alterações em vários proto-oncogenes
ou de genes supressores de tumores, ou ainda de ambos, que codificam proteínas
reguladoras (Friend et al., 1988).
Os genes de uma célula normal que podem ser ativados e originar o
câncer são denominados de proto-oncogenes, enquanto executam normalmente sua
função, obedecendo aos mecanismos de controle. Quando estes proto-oncogenes
deixam de obedecer aos controles da célula e originam a neoplasia passam a constituir
oncogenes (Weinberg, 1985). Ou seja, os oncogenes, responsáveis pela
carcinogênese, são versões alteradas de genes normais do genoma humano (Friend et
al.,1988).
A preservação de material genético capaz de induzir o
desenvolvimento de câncer seria desvantagem para o organismo que contenha tais
genes. Entretanto, os proto-oncogenes estão preservados amplamente ao longo da
evolução biológica tanto de invertebrados quanto de vertebrados. Este fato traduz o
papel essencial dos proto-oncogenes nos processos celulares normais (Slamon, 1987;
Friend et al., 1988).
Está bem estabelecido que os proto-oncogenes codificam proteínas
que normalmente participam e controlam, em todos os níveis, a proliferação e/ou a
diferenciação celular. Estas proteínas podem ser divididas em quatro categorias: 1)
fatores de crescimento que atuariam na superfície das células; 2) receptores de
membrana para estes fatores; 3) proteínas intracelulares que influenciam os processos
celulares quando os receptores para os fatores de crescimento são ativados e 4)
5
fatores que gerenciam a transcrição do DNA para o RNA mensageiro (Bishop, 1991;
Junqueira e Carneiro, 1997).
Apesar do grande número e da diversidade de ações, os proto-
oncogenes são classificados de acordo com os mecanismos ou função na regulação do
crescimento e, ainda, pelos caminhos de ativação. Aparentemente, haveria três
mecanismos bioquímicos para sua ação: 1) pela fosforilação de proteínas, sendo a
serina, treonina e a tirosina, como substratos. O papel do proto-oncogene seria a
indução da fosforilação ou agir como seu catalizador. Estas proteínas tirosina-quinases
são conhecidas há décadas, mas a sua importância tornou-se evidente com o estudo
dos proto-oncogenes; 2) transmissão de sinais por GTPases e 3) controle da
transcrição a partir do DNA (Bishop, 1991).
De forma geral, quando o fator de crescimento liga-se ao seu
receptor (específico), este torna-se transitoriamente ativado. Esta ativação causa, por
sua vez, a ativação de outras proteínas de forma seqüencial “em cascata” e a produção
de pequenas moléculas regulatórias, designadas mensageiros secundários. Estes
últimos, constituem sinais transmitidos para o núcleo da célula, onde a expressão de
genes específicos seria induzida, resultando na divisão celular (Druker et al., 1989).
Portanto, os oncogenes codificam proteínas denominadas
oncoproteínas, as quais são muito similares ao produto normal dos proto-oncogenes.
Entretanto, como estas proteínas perderam os mecanismos de regulação que
refreavam a sua atividade, estariam continuamente ativadas; eventualmente, estas
proteínas não mais necessitam de sinais ou estímulos externos para sua ativação
(Druker et al., 1989).
Por outro lado, sendo a transformação neoplásica um processo de
múltiplas etapas, as aberrações que ocorrem em vários proto-oncogenes e/ou genes
supressores de tumores, presumivelmente realizam-se antes ou no início do franco
desenvolvimento da neoplasia (Evans e Podratz, 1996).
Assinalam-se, dentre os vários fatores que podem alterar os proto-
oncogenes, a radiação ionizante e os carcinógenos químicos. Entre os mecanismos
envolvidos destacam-se a amplificação, a translocação e as mutações destes genes
para facilitar ou promover a transformação maligna (Slamon, 1987; Berchuck e Boyd,
1995).
Do ponto de vista das alterações genéticas descritas no surgimento
do câncer de endométrio, vários autores têm demonstrado que alterações nos genes
6
p53, PTEN, c-myc além de vários outros, podem ser encontradas com freqüências
variáveis neste tipo de tumor.
O microarray de cDNA é técnica relativamente recente e vem sendo
cada vez mais utilizada. Basea-se na utilização de uma matriz composta por pequenos
sítios de sondas (cDNA) conhecidas e específicas localizadas em posições
padronizadas em membranas de nylon ou lâminas de vidro. Para a identificação dos
genes envolvidos nas atividades celulares que se quer estudar, utiliza-se o DNA
complementar (cDNA) produzido pelo RNA mensageiro, extraído do tecido através da
transcrição reversa. Para Kurian et al. (1999), o cDNA, recém sintetizado, pode ser
identificado através da sua ligação com as sondas da membrana (“array”).
Com a tecnologia do cDNA microarray, é possível analisar qualitativa
e quantitativamente centenas a milhares de genes simultaneamente (Afshari et al.,
1999; Heller et al., 1997; Schene et al., 1996). As aplicações dessa nova tecnologia
variam desde estudos sobre etiopatogenia, diagnóstico, prognóstico a efeito de drogas
(Afshari et al., 1999).
Estudos recentes têm avaliado a expressão diferencial de genes no
endométrio normal e no neoplásico, assim como, nos tipos histopatológicos de
carcinoma endometrial. (Risinger et al., 2003; Kao et al., 2002).
Assim, o nosso maior interesse foi encontrar genes diferencialmente
expressos no adenocarcinoma endometrial e na mucosa uterina normal adjacente ao
câncer em mulheres após a menopausa, pela técnica do microarray de cDNA.
PROPOSIÇÃO
8
Propõe-se, no presente estudo,a:
1- Identificar genes diferencialmente expressos no adenocarcinoma de
endométrio quando comparado com o tecido endometrial normal da mesma
paciente através da técnica de cDNA array.
2- Confirmar os resultados pela transcrição reversa – reação em cadeia de
polimerase ( RT-PCR).
3- Verificar, nas enfermas com adenocarcinoma de endométrio, a relação entre
a expressão do(s) eventual(is) gene(s) diferencialmente expresso(s) com o
estadiamento clínico-cirúrgico e a sobrevida.
PACIENTES E MÉTODOS
10
3.1. Pacientes
Neste estudo, analisaram-se dez pacientes com sangramento genital
da pós-menopausa, atendidas no Ambulatório de Oncologia Cirúrgica do Departamento
de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina,
no período de 2002 a 2004.
3.1.1. Critérios de inclusão para o estudo
− Mulheres com idade acima de 40 anos, apresentando sangramento genital da
pós-menopausa, com diagnóstico histopatológico de adenocarcinoma de
endométrio da variedade endometrióide.
− Apenas amostras contendo, pelo menos, 70% de tecido tumoral.
3.1.2. Critérios de exclusão para o estudo
- Enfermas com sangramento genital cuja etiologia não estivesse localizada na
cavidade uterina.
- As que fizeram uso de reposição hormonal mesmo que por pequeno período de
tempo.
- Mulheres que receberam radioterapia.
- Pacientes com neoplasia maligna da mucosa uterina com quaisquer variedades
histopatológicas distintas do adenocarcinoma endometrióide.
- Todas as afecções benignas do útero e da mucosa uterina responsáveis pelo
sangramento.
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Federal
de São Paulo UNIFESP-EPM (Anexo 1) e o consentimento livre e esclarecido foi obtido
de todas as pacientes (Anexo 2).
Definiu-se como pós-menopausa, a mulher com mais de 40 anos,
com tempo de amenorréia superior a um ano e níveis séricos elevados de
gonadotrofinas hipofisárias (Baracat,1991).
11
Realizaram-se em todas, anamnese, exames físico geral e
ginecológico, coleta de citologia oncológica cérvico-vaginal e estudo histopatológico da
mucosa uterina. Entre os exames subsidiários dosou-se a glicemia de jejum.
Anotaram-se entre os dados da anamnese, a idade, a raça, a época
de incidência da menarca e da menopausa, o tempo de pós-menopausa e o número de
gestações, de partos e de abortamentos. Alinham-se, no Anexo 3, os dados de
identificação e registro das pacientes e, no Anexo 4, os respectivos antecedentes
ginecológicos e obstétricos.
A idade variou de 55 a 70 anos, com média de 60. Observou-se
predomínio da raça branca. A idade de incidência da menopausa situou-se entre 44 e
55 anos, com média de 50. O tempo de pós-menopausa oscilou de 6 a 22 anos, com
média de 13,5.
O número de gestações oscilou de 0 a 7, com média de 3; o de
partos foi de 0 a 7 e, de abortamentos, de 0 a 1.
Dentre os dados de exame físico geral, apreciaram-se o peso, a
altura e o índice de massa corpórea. O índice de massa corpórea foi calculado pela
relação entre o peso (em quilogramas) dividido pela altura (em metros) ao quadrado
(Keys et al, 1972). No Anexo 5 registram-se as informações relativas ao valor deste
índice.
Caracterizou-se, eventualmente, a hipertensão arterial sistêmica
quando, em dois atendimentos consecutivos, os níveis registrados nos membros
superiores ultrapassaram 140 mmHg para a sistólica ou de 90 mmHg para a diastólica
(Anexo 5).
A propedêutica subsidiária solicitada, incluiu as dosagens séricas de
FSH (hormônio folículo-estimulante) e de LH (hormônio luteinizante), apenas para se
confirmar o estado de pós-menopausa. Os valores plasmáticos da glicemia de jejum de
todas as pacientes encontram-se, também, no Anexo 5.
Após avaliação clínica inicial, todas as pacientes submeteram-se à
investigação da cavidade uterina. Realizou-se o diagnóstico de adenocarcinoma no
estudo do endométrio obtido por biópsia, com cureta de Novak modificada, orientada
pela histeroscopia ambulatorial (Anexo 6).
Estas enfermas foram encaminhadas à cirurgia para estadiamento
de acordo com os critérios atuais adotados pela FIGO - International Federation of
Gynecology and Obstetrics. Pequeno fragmento de adenocarcinoma foi retirado a
12
fresco (imediatamente após retirada da peça operatória – útero) e armazenado em gelo
seco para análise biomolecular.
Os fragmentos de mucosa uterina, na sala cirúrgica, foram
rapidamente conservados em gelo seco e, no mesmo período do dia, congelados em
nitrogênio líquido para extração de RNA.
A extração de RNA foi realizada no Laboratório de Biologia
Molecular e Ginecologia Experimental do Departamento de Ginecologia da
Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina.
3.2. Métodos
3.2.1. Método Anátomo-patológico
Processou-se o material obtido por biópsia ambulatorial e da peça
operatória no Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP-EPM).
O material obtido foi colocado em frasco contendo formol tamponado
a 10%. Posteriormente, as peças foram desidratadas em concentrações crescentes de
etanol, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina.
Os blocos parafinados foram cortados com espessura aproximada
de três micrômetros e, as lâminas, coradas pela técnica de hematoxilina-eosina. Desta
forma, determinou-se o tipo histopatológico da neoplasia de endométrio e graduou-se a
diferenciação.
3.2.2. Método Biomolecular
Extração de RNA, síntese das sondas e hibridização em membranas de cDNA
O RNA total foi isolado usando o reagente TRIZOL (Invitrogen) como
indicado pelo fabricante.
13
Para extração de RNA total utilizou-se fragmento de 200 mg de
tecido, o qual foi pulverizado em nitrogênio líquido, sendo o macerado resultante
imediatamente imerso em tubo de 2,0 ml contendo 1,0 ml de Trizol, seguindo-se
agitação vigorosa do tubo em vortex. Logo após, acrescentou-se 200 microlitros de
clorofórmio ao referido tubo, com nova agitação em vortex.
Os tubos foram centrifugados em equipamento refrigerado da marca
Eppendorf por 15 minutos a 14000 rpm a uma temperatura de 4°C. A solução, assim
tratada, apresentou-se em três fases. A fase superior, contendo o RNA, foi então
removida e colocada em outro tubo de 2,0 ml contendo 500 microlitros de isopropanol.
Após homogenização por inversão, a referida solução foi colocada para precipitação
em freezer –20°C por um período de 12 horas. Transcorrido esse período, o tubo foi
removido do freezer e submetido a nova centrifugação por 20 minutos a 14000 rpm em
temperatura de 4°C. Observou-se, neste momento, a presença de um precipitado
(pellet) de RNA no fundo do tubo. O RNA foi lavado em solução de etanol a 75% por 3
vezes e seco à temperatura ambiente por 20 minutos. Adicionou-se 50 microlitros de
água milliQ autoclavada e tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). O RNA, em solução,
foi imediatamente armazenado em freezer a –80°C.
A pureza do RNA isolado foi avaliada espectrofotometricamente pela
razão de absorbância A260/A280. A qualidade do RNA total foi avaliada pela
eletroforese em gel de agarose/formaldeído. Previamente à transcrição reversa, dois
pools de RNA foram obtidos misturando-se 2 µg do RNA total de cada amostra
individual em dois tubos representando os grupos I (tecido normal) e II (tecido tumoral).
Para se obter sondas de cDNA radiomarcadas, os dois pools de
RNA contendo 5,0 µg de RNA cada, foram submetidos a transcrição reversa na
presença de primers oligodT e α- [33 P] dATP (2000 Ci/mmol), usando o kit Superscript
II (Invitrogen), seguindo instruções do fabricante. As sondas foram purificadas
utilizando-se as microcolunas Probe Quant G 50 (Amersham Pharmacia Biotech).
Para analisar a expressão diferencial de genes entre os grupos I e II,
quatro membranas de microarray de cDNA humano contendo 2000 genes foram
usadas (duas vezes).
As membranas foram preparadas na Universidade Estadual Paulista,
usando os clones ORESTES obtidos da “Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo”/ Ludwig Institute for Cancer Research – Human Cancer Genome Project
14
(Brentani et al.,2003). Sempre que possível, cada gene foi representado por duas
cópias correspondendo a regiões diferentes do cDNA completo e cada cópia do cDNA
foi marcada em duplicata sobre as membranas de nylon.
A hibridização ocorreu em 42°C em reação por 12 horas, contendo
citrato salino (SSC) 20x, solução de Denhardt 50x, formamida 50%, sulfato dodecil
sódico (SDS) 10x e 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão.
Os filtros foram lavados a 50°C em 1x SSC/0,1% SDS por 15
minutos.
As imagens foram obtidas utilizando-se o scanner da marca
Cyclone TM – Packard BioScience Company (Meriden, CT, USA).
As imagens assim obtidas foram, então, analisadas em software
Array Vision.
3.3. Análise dos dados
Por análise estatística, foram selecionados genes com expressões
que diferiam por pelo menos três vezes com relação ao pool de referência em 30% das
pacientes.
Esta abordagem nos assegura a identificação apropriada de genes
com alta possibilidade de se encontrarem diferencialmente expressos.
Para encontrar um grupo de genes que sejam diferencialmente
expressos nos dois grupos, foi usado o teste de Welch, que não requer divergências
iguais entre os grupos (Miller,1977). Entretanto, porque foram testados muitos genes
para expressão diferencial, necessitou-se levar em conta múltiplos testes para evitar
um número excessivo de resultados falso-positivos. Assim, utilizou-se o método step-
down maxT (Westfall et al.,1993; Dudoit et al., 2002).
Devido ao tamanho da amostra ser pequeno, os valores ajustados
foram obtidos pela permutação randômica, usando 50.000 permutações ao acaso.
Considerou-se os genes diferencialmente expressos nos dois grupos quando seu valor
ajustado foi 0,05. A comparação estatística foi realizada com o programa POMELO
(http://www.genoma.wi.mit.edu/MPR/software).
15
3.4. RT-PCR (Transcrição Reversa – Reação em Cadeia de Polimerase)
A validação dos dados da membrana, pela RT-PCR
semiquantitativa, foi realizada usando quantidades iguais do RNA total de cada
paciente individualmente (tecido normal e tumoral). As amostras foram então
submetidas a transcrição reversa, usando-se a transcriptase reversa RNAse H do
Superscript II (Invitrogen) em um volume final de 20 µl de acordo com as instruções do
fabricante.
Os primers foram desenhados pelo programa Prime 3 (http://www-
genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi/primer3_www.cgi).
O gene beta actina citoplasmático (ACTB) foi usado para normalizar
as reações. Dois microlitros do cDNA transcrito reversamente foi amplificado em um
volume final de 100 µl pela PCR sob condições padrão: 1,5 mM MgCl2, 125 µM dNTP
e 2,5 U taq polimerase usando primers específicos em concentração de 10 µM. Os
primers e parâmetros de ciclagem foram: beta actina citoplasmática (375bp); 32 ciclos
(94°C, 1 min/ 55°C, 30 seg/ 72°C, 30 seg). Senso: 5’- CGTGACATTAAGGAGAAGCTG
-3’; Antisenso: 3’ CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA -5’. MAP3K8/Cot: 225 bp; 25
ciclos(94
o
C,1 min / 55
o
C,30 seg / 72
o
C,30 seg) S: 5’- GTC CAT TTT GGG GAG TGA
TG -3’; AS: 3’- GAG GAT TTG CTT GCT TTT GC -5’.
Os produtos da amplificação por PCR foram separados em gel de
agarose a 2% contendo 0,1 µg/ml de brometo de etídio. As bandas visualizadas foram
analisadas semiquantitativamente, usando o software para análise densitométrica
(Kodak EDAS 120) (Figura 1).
3.5. Sequenciamento automático de DNA
Esta etapa da pesquisa foi realizada no Centro de Pesquisas do
Genoma “José Fernando Perez” da UNIFESP-EPM. Utilizou-se o kit BigDye (Applied
Biosystems) conforme preconizado pelo fabricante em seqüenciador de DNA ABI
(Applied Biosystems). Esta etapa teve como objetivo a confirmação de que a banda
amplificada tratava-se realmente de um fragmento do RNA mensageiro do gene
MAP3K8.
RESULTADOS
17
Os achados clínicos e histopatológicos das pacientes estão
dispostos na tabela 1.
A partir das amostras pareadas identificadas como fragmentos do
tumor e os respectivos endométrios atróficos de cada caso, efetuou-se após a extração
do RNA, os estudos microarray e RT-PCR como, esquematicamente, mostra a figura 1.
Neste estudo, foram encontrados cinqüenta genes diferencialmente
expressos (figura 2) quando comparou-se endométrio atrófico com seu correspondente
tumoral.
A figura 3 mostra o seqüenciamento automático de DNA com o
objetivo de confirmar que a banda amplificada tratava-se realmente de fragmento do
RNA mensageiro do gene MAP3K8.
O gene MAP3K8 encontrou-se superexpresso em 3 das 10 amostras
tumorais.
Duas pacientes entre as três que mostraram superexpressão deste
gene morreram durante dois anos de seguimento e duas delas apresentavam mais que
50% de invasão miometrial.
Quanto ao estadiamento clínico-cirúrgico, as três pacientes tinham
estádios IIB, IC e IC; o grau de diferenciação foi respectivamente G2, G1 e G1. Em
nenhuma delas houve invasão linfovascular ou comprometimento linfonodal.
18
TABELA 1 - DIAGNÓSTICO ANÁTOMO-PATOLÓGICO, ESTADIAMENTO
CLÍNICO-CIRÚRGICO, SUPEREXPRESSÃO DO MAP3K8 E SEGUIMENTO DAS
PACIENTES.
Caso
nº
N° da
lâmina*
Diagnóstico
anátomo-
patológico
Estádio
clínico
Infiltração
Miometrial
Invasão
Linfovascular
Comprometimento
Linfonodal
Superexpressão
do MAP3K8
Seguimento
1 B01-
21662
Adenocarcinoma
endometrióide
IIB G2 <50% 0 0 SIM ÓBITO
2 B01-
14369
Adenocarcinoma
endometrióide
IC G1 >50% 0 0 SIM ÓBITO
3 B00-
13456
Adenocarcinoma
endometrióide
IC G1 >50% 0 0 SIM EM SEGUIMENTO
4 B00-
30897
Adenocarcinoma
endometrióide
IIB G3 <50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
5 B01-
16055
Adenocarcinoma
endometrióide
IB G1 <50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
6 B00-
25760
Adenocarcinoma
endometrióide
IIIA G3 <50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
7 B01-
23352
Adenocarcinoma
endometrióide
IIIB G3 >50% 1 0 NÃO EM SEGUIMENTO
8 B01-
20544
Adenocarcinoma
endometrióide
IC G2 >50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
9 B01-
12530
Adenocarcinoma
endometrióide
IC G2 >50% 1 0 NÃO EM SEGUIMENTO
10 B01-
23356
Adenocarcinoma
endometrióide
IIIA G3 >50% 1 0 NÃO ÓBITO
* Número de Registro do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina.
19
FIGURA 1 – Identificação de genes diferencialmente expressos em tumores
endometriais. Representação esquemática do nosso modelo experimental
(tumor/atrófico). Representação da amostra onde apenas a porção invasiva do
adenocarcinoma foi extraída e processada para extração de RNA. Cada amostra de
RNA foi hibridizada com duas membranas idênticas. Imagem representativa da
membrana de nylon após hibridização com o cDNA marcado com [α-33P]dCTP. Sinais
foram capturados em scanner específico e os dados foram adquiridos pelo software
Array Vision usando os arquivos gerados na etapa anterior. RT-PCR semi-quantitativa
foi usada para confirmar a expressão diferencial em cada amostra individual.
Endométrio Atrófico (N) Carcinoma de Endométrio (T)
20
FIGURA 2 – Genes com expressão diferencial em tumores endométrióides. Baseado
em dados apresentados os genes são listados (com respectivas diferenças indicadas
entre parênteses) com diferenças na expressão maiores que três vezes. Em verde,
genes com baixa expressão em tecido tumoral; em vermelho, genes com alta
expressão.
Genes de baixa expressão
Genes de alta expressão
21
FIGURA 3 – Seqüenciamento automático de DNA.
DISCUSSÃO
23
O câncer do corpo uterino é, como vimos, a neoplasia maligna mais
comum da pelve em vários países. Nos Estados Unidos da América constitui o quarto
mais comum câncer da mulher, das quais 75 a 80% encontram-se na pós-menopausa
(Disaia e Creasman, 1993). Assim, o seu estudo reveste-se de importância, pois, além
do aumento de sua incidência, é responsável por considerável taxa de morbidade e de
mortalidade (Rakar e Kovacic, 1990).
Por várias décadas, apenas os parâmetros clínicos foram
disponíveis para determinar o planejamento terapêutico no câncer de endométrio.
Entretanto, em 1988, a FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics),
introduziu o estadiamento cirúrgico, aprimorando os critérios já existentes na estimativa
do risco de recidivas e da sobrevida.
No tratamento do câncer de endométrio procura-se, rotineiramente,
identificar as doentes com alto risco para recidivas e metástases (Gebrim et al., 1999).
Igualmente importante é a identificação das pacientes com baixo risco, evitando-se os
custos e a morbidade decorrente de medidas terapêuticas excessivas e
desnecessárias (Evans e Podratz, 1996).
Constituem fatores de risco bem estabelecidos para o envolvimento
linfonodal, no adenocarcinoma endometrióide, estádio clínico I, o grau de diferenciação
histopatológico e a profundidade da invasão miometrial. Entretanto, há casos onde não
há invasão miometrial profunda ou mesmo de tumores bem diferenciados que
apresentam metástases linfonodais, e vice-versa. Por outro lado, há pacientes
rigorosamente estadiadas pela cirurgia, com amostragem linfonodal normal, que
desenvolvem recidivas, falecendo pelo câncer (Bell, 1997).
A explicação para o aparecimento de recidivas poderia advir de
algumas hipóteses; entre elas a de que o tumor era aparentemente limitado ao útero
mas, é provável, já haviam metástases ocultas. Entretanto, o desenvolvimento de
metástases ocultas requer, de início, a invasão do espaço linfovascular; eventualmente,
esta passa desapercebida na peça operatória (Nazeer et al., 1995).
Para Ambros e Kurman (1992) identificar o subgrupo de doentes
com alto risco, aparentemente incluídas no estádio clínico I de adenocarcinoma
endometrióide, representaria relevante redução no percentual de óbitos pela neoplasia,
pois, justamente nestas enfermas é que haveria grande benefício a terapêutica
adjuvante.
24
Outrossim, a identificação de fatores prognósticos em pacientes nos
estádios iniciais é de suma importância, pois a maioria destas é atendida nesta fase
(Nazeer et al., 1995).
A propósito, no Setor de Oncocirurgia do Departamento de
Ginecologia da UNIFESP-EPM, 70,7% das pacientes com câncer de endométrio
encontravam-se no estádio I por ocasião do atendimento inicial (Rodrigues de Lima et
al., 1999).
Por outro lado, detectar o maior potencial de agressividade de
neoplasias de endométrio em estádios precoces, selecionando o subgrupo de
pacientes de maior risco, que receberiam a terapia adjuvante é um dos objetivos
príncipes da oncologia ginecológica na atualidade (Gebrim et al., 1999).
Assim, nestes últimos lustros, procurou-se investigar o real valor
prognóstico dos parâmetros obtidos pela histopatologia da peça operatória. Todavia, há
limitações e também ocorre subjetividade na interpretação destes parâmetros (Evans e
Podratz, 1996).
Por outro lado, os estudos de biologia molecular demonstraram, na
última década, que a progressão desde a célula normal até o câncer requer a alteração
de vários oncogenes e genes supressores de tumor (Lukes et al., 1994). Muitos
oncogenes, ou seja, genes capazes de induzir ou manter a divisão celular são versões
alteradas de genes normais que controlam o crescimento celular (Weinberg, 1985).
Há várias provas de que a maior parte das neoplasias malignas tem
origem em alterações ou desordens genéticas que codificam proteínas envolvidas na
regulação da proliferação celular (Bishop,1991). Por isso, a identificação de uma ou
mais variáveis moleculares, que direta ou indiretamente estão envolvidas com a
biologia do tumor, auxiliar-nos-ia caracterizar as pacientes com elevado risco e a
selecionar, de forma mais adequada, as opções terapêuticas (Evans e Podratz, 1996).
Na seleção de pacientes para este estudo não incluímos pacientes
no menacme, pois o estrogênio e a progesterona poderiam interferir na expressão
deste oncogene e sucitar inúmeras dúvidas quando da análise dos resultados.
Da mesma forma, todas as pacientes que referiram o uso de
reposição hormonal no climatério também não foram por nós incluídas, pois na
investigação do sangramento genital possivelmente encontrar-se-iam resultados
histopatológicos alterados, comprometendo a elaboração dos grupos-controle e,
eventualmente, na expressão do oncogene.
25
Para Baker (1996), os hormônios esteróides poderiam atuar de
diferentes formas na carcinogênese do endométrio. Sabe-se que a estimulação
prolongada aumenta o risco de neoplasia como conseqüência de maior atividade
proliferativa. O número de células em mitose é mais alto e, assim como a possibilidade
de mutação em um ou mais genes durante a replicação do DNA. Quando um número
crítico de genes sofreram mutação, as transformações celulares podem culminar com o
desenvolvimento de neoplasia.
Assinala-se, ainda, que os hormônios esteróides poderiam modular
a expressão do gene pelo direto envolvimento no sítio do DNA, realçando ou ativando a
transcrição. Sabe-se que os esteróides podem, também, exercer seu efeito por
mecanismos pós-transcricionais pela estabilização do RNAm transcrito, prevenindo a
sua degradação citoplasmática (Brock e Shapiro, 1983).
Quanto à idade acrescenta-se, ainda, que o câncer de endométrio,
assim como outras neoplasias epiteliais malignas, geralmente ocorre em mulheres
mais idosas. Justifica-se este fato, pois as mutações em vários destes genes
reguladores e em oncogenes podem acumular-se, sucessivamente, até que uma
simples célula inicia a transformação (Berchuck e Boyd, 1995). A idade média de 60
anos de nossa amostra endossou esta assertiva.
No presente estudo, com intuito de identificar-se novos genes
envolvidos no surgimento e/ou manutenção do processo carcinogênico endometrial,
decidimos estudar a expressão diferencial de genes envolvidos no processo de
carcinogênese humana.
A técnica selecionada para este estudo foi o “cDNA array” pelo fato
de fornecer um amplo painel simultâneo e quantitativo da expressão genética naqueles
tecidos.
Foram estudados dez pares de carcinoma endometrial e seus
respectivos tecidos normais adjacentes.
O principal objetivo deste estudo foi identificar diferenças na
expressão de genes em tecidos tumorais usando seus correspondentes adjacentes
normais.
Todas as pacientes encontravam-se no período pós- menopausa e,
portanto, os resultados representam diferenças na expressão de genes entre
endométrio atrófico e seu correspondente tumoral.
26
As amostras tumorais foram previamente analisadas a fim de se
incluir apenas aquelas com pelo menos 70% de células tumorais.
Para validar a expressão diferencial de genes foi escolhido o
MAP3K8 (COT ou Tpl-2), pois, na investigação de genes superexpressos, não
encontramos relatos do mesmo no câncer endometrial.
A validação foi executada individualmente em todas as amostras
(figura 1), tornando possível a identificação da superexpressão deste gene em 30% das
amostras tumorais.
Pela análise de células somáticas híbridas e pela fluorescência em
hibridização in situ, o gene MAP3K8 foi mapeado no cromossoma 10p11.2 (Chan et al.,
1993) e foi inicialmente descrito como uma proteína truncada em sua região
carboxiterminal, recebendo o nome de COT (Câncer Osaka Tireóide). O referido gene
foi originalmente identificado no DNA de tumor de tireóide humano como um gene
capaz de transformar células SHOK (Syrian Hamster Osaka Kanazawa) (Miyoshi et al.,
1991).
Após seqüenciamento do referido gene, observaram que tratava-se
de gene responsável pela codificação de uma proteína de 415 aminoácidos com
características de serina treonina quinase.
Outros pesquisadores em datas muito próximas isolaram o mesmo
gene MAP3K8 e o designaram, desta vez, como est (Ewing Sarcoma Transforming) ao
estudarem o potencial oncogênico do MAP3K8 em células NIH 3T3 (Chan et al., 1993).
De modo geral, o MAP3K8 é um gene que se encontra expresso em grande número de
tecidos como baço, timo, fígado, pulmão e mama (Patriotis et al., 1993; Sourvinos et
al., 1999).
Entretanto, as funções fisiológicas desse gene bem como aquelas
responsáveis pela transformação neoplásica ainda não se encontram esclarecidas. O
gene MAP3K8 tem sido encontrado como elemento que participa da regulação de uma
série de genes como fator de necrose tumoral alfa e IL-2 (Ballester et al., 1997, 1998).
Evidências atuais têm demonstrado que MAP3K8/COT faz parte das
vias que estimulam, de maneira significativa, as vias das proteíno-quinases ativadas
por mitógenos (MAPK). A atividade das MAPK quinases, por sua vez, é necessária
para a estimulação da região promotora do proto-oncogene c-jun, durante a
transformação neoplásica induzida por COT (Chiariello et al., 2000).
27
O MAP3K8 foi identificado como um gene transformador do
adenocarcinoma de pulmão humano e tem uma mutação na região 3’ caracterizada em
seu cDNA. A mutação foi localizada no exon 8 do MAP3K8 e confirmada no DNA do
tumor primário.
Ambos os tipos selvagem e mutante de cDNAs de MAP3K8
transformaram células NIH3T3, mas a atividade transformadora do mutante foi muito
maior que a da forma selvagem. Este foi o primeiro relato da mutação deste gene
ocorrendo em um tumor primário, mas os autores concluíram que a ativação
mutacional do gene é um evento muito raro (Clark et al., 2004).
Esta é a primeira vez que este oncogene foi encontrado
superexpresso em carcinoma de endométrio, ainda que em apenas 30% dos casos.
Deve ser enfatizado que a maioria dos oncogenes, como, por exemplo, os conhecidos
oncogenes c-myc e o c-erbB2, foram encontrados superexpressos em porcentagens
muito similares às observadas neste estudo.
Ao analisar-se a expressão do referido gene através de Northern
Blot virtual no site SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/index.cgi?cmd=tagsearch&org=Hs&tag=AATCTTT
CAT&anchor=NLAII do NCBI, encontrou-se a expressão do MAP3K8 presente em
número grande de tecidos, inclusive em carcinoma mamário, sugerindo um eventual
papel deste gene neste tipo de tumor. Entretanto, a referida análise virtual, não mostrou
expressão do MAP3K8 em endométrio, reforçando a originalidade dos nossos
resultados.
A confirmação dos resultados da expressão diferencial fornecidos
pela membrana através de RT-PCR, ou outro método confirmatório, deve ser sempre
realizada em estudos onde trabalhou-se com pools. Este refinamento, confirmando a
expressão diferencial, foi realizado individualmente em um total de 10 casos de
adenocarcinoma de endométrio.
A importância desta confirmação baseia-se em dois aspectos:
primeiro, o encontro, com precisão, do número de casos onde existe a expressão
diferencial; segundo, valida os demais resultados da membrana.
Finalmente, conclui-se que, neste estudo, foi-se capaz de identificar
o MAP3K8 como um novo gene superexpresso em 30% dos casos de carcinoma de
endométrio, fenômeno este possivelmente correlacionado a um pior prognóstico.
28
Entretanto, devido ao pequeno número de casos, os resultados necessitam ser
confirmados por estudos com maior casuística.
Neste momento, achamos de igual importância ressaltar também as
dificuldades técnicas em se trabalhar com as membranas de cDNA array, as quais em
nossas mãos e na experiência de outros autores ainda carecem de aperfeiçoamento.
De um modo geral, as referidas membranas oferecem um sinal
muito baixo de cada um dos genes, que, obrigatoriamente, nos leva ao estudo de
genes cuja expressão basal é alta. Assim, genes com taxas de expressão menores, e
nem por isso menos importantes, acabam por não serem estudados.
CONCLUSÕES
30
1- Encontramos em nossa amostra 50 genes diferencialmente expressos quando
comparado o tecido endometrial e o tecido neoplásico da mesma paciente.
2- Verificou-se a superexpressão do gene MAP3K8 em 30% dos casos de
adenocarcinoma de endométrio.
3- Entre os casos com superexpressão do gene MAP3K8, verificou-se em 2/3 o
óbito das pacientes no seguimento inicial de dois anos, sugerindo o pior
prognóstico nestas enfermas.
ANEXOS
32
33
34
35
ANEXO 3 – IDENTIFICAÇÃO DAS PACIENTES
Caso nº Nome
(iniciais)
Identificação
(RG – HSP)*
Número da
lâmina**
Idade
(anos)
Raça
1 CS 648.097 B01-21662 56 BRANCA
2 SSD 1.134.962 B01-14369 70 BRANCA
3 MFNSC 1.051.409 B00-13456 56 BRANCA
4 RFC 1.062.508 B00-30897 70 BRANCA
5 ATS 1.165.357 B01-16055 68 BRANCA
6 MFGG 808.626 B00-25760 55 BRANCA
7 EPO 1.201.218 B01-23352 65 NEGRA
8 RJR 772.992 B01-20544 69 BRANCA
9 GAG 893.799 B01-12530 70 BRANCA
10 GNS 818.247 B01-23356 59 BRANCA
*Número do Registro Geral do Prontuário de Pacientes do Hospital São Paulo.
**Número de Registro do Departamento de Patologia da Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina.
36
ANEXO 4 – ANTECEDENTES GINECOLÓGICOS E OBSTÉTRICOS: IDADE DA
MENARCA, MENOPAUSA E TEMPO DE MENOPAUSA (ANOS). NÚMERO DE
GESTAÇÕES (G), PARTOS (P) E ABORTAMENTOS (A).
Caso nº Menarca Menopausa Tempo de pós-
menopausa
G P A
1 11 48 8 3 3 0
2 13 55 15 3 3 0
3 13 47 9 0 0 0
4 14 53 17 7 7 0
5 12 50 18 3 2 1
6 13 44 11 1 1 0
7 16 55 10 2 2 0
8 11 50 19 6 6 0
9 13 48 22 2 2 0
10 14 53 6 2 2 0
37
ANEXO 5 – DADOS CLÍNICOS: HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA (HAS),
ÍNDICE DE MASSA CORPÓREA (IMC) E O VALOR DA GLICEMIA DE JEJUM (mg/dl)
Caso nº HAS IMC Glicemia
de jejum
1 ausente 22,27 140
2 presente 31,11 235
3 ausente 29,29 100
4 presente 27,55 202
5 ausente 25,39 88
6 presente 23,11 103
7 presente 24,44 111
8 presente 31,11 154
9 presente 29,68 157
10 ausente 26,95 87
38
ANEXO 6 – DIAGNÓSTICO ANÁTOMO-PATOLÓGICO E ESTADIAMENTO CLÍNICO-
CIRÚRGICO DAS PACIENTES COM ADENOCARCINOMA DE ENDOMÉTRIO.
Caso nº Número da
lâmina*
Diagnóstico anátomo-
patológico
Estádio
clínico
1 B01-21662 Adenocarcinoma
endometrióide
IIB G2
2 B01-14369 Adenocarcinoma
endometrióide
IC G1
3 B00-13456 Adenocarcinoma
endometrióide
IC G1
4 B00-30897 Adenocarcinoma
endometrióide
IIB G3
5 B01-16055 Adenocarcinoma
endometrióide
IB G1
6 B00-25760 Adenocarcinoma
endometrióide
IIIA G3
7 B01-23352 Adenocarcinoma
endometrióide
IIIB G3
8 B01-20544 Adenocarcinoma
endometrióide
IC G2
9 B01-12530 Adenocarcinoma
endometrióide
IC G2
10 B01-23356 Adenocarcinoma
endometrióide
IIIA G3
* Número de Registro do Departamento de Patologia da Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina.
39
40
41
42
43
44
45
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SUMMARY
52
Gene microarray technology is highly effective in screening for differential gene
expression and has hence become a popular tool in the molecular investigation of
cancer.
In the present study, cDNA microarrays containing 2000 different genes were used to
analyze gene expression profiles in 10 human postmenopausal endometrioid-paired
carcinomas specimens versus corresponding adjacent normal tissue to identify
differentially expressed genes.
In our study several genes were found differentially expressed. One of them was the
MAP3K8, a gene that was never described to be overexpressed in this kind of
malignancy.
To validate the differential expression of this gene as well as the membrane array, we
performed semiquantitative reverse transcription-PCR analysis. The MAP3K8 was
found overexpressed in 30% of endometrial carcinomas samples.
To the best of our knowledge this is the first report showing the MAP3K8 oncogene
linked to human endometrial carcinoma suggesting that it may be another molecule
involved in human endometrial cancer.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
54
Dicionário Aurélio Eletrônico 2000 [CD-ROM]. São Paulo: Nova Fronteira;
2000.Sumário.
Rother ET & Braga MER. Como elaborar sua tese: estrutura e referências. 2
a
ed. rev. e
ampl. São Paulo, BC gráfica e editora Ltda, 2005. 122p.
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