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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA - UnB
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
CONTRIBUIÇÃO GENÉTICA DE DUAS POPULAÇÕES URBANAS DA
REGIÃO CENTRO
-OESTE BRASILEIRA ESTIMADA
POR MARCADORES UNIPARENTAIS
Rejane da Silva Sena Barcelos
Brasília
2006
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA - UnB
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
CONTRIBUIÇÃO GENÉTICA DE DUAS POPULAÇÕES URBANAS DA
REGIÃO CENTRO
-OESTE BRASILEIRA ESTIMADA
POR MARCADORES UNIPARENTAIS
Tese apresentada ao Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade de Brasília como
requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Ciências, área de concentração:
Genética
Rejane da Silva Sena Barcelos (02/47316)
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Silviene Fabiana de Oliveira
Brasília
2006
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Trabalho desenvolvido no Laboratório de Genética
da Universidade de Brasília (UnB) e no Laboratório
de Clonagem do Hemocentro de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (USP), com suporte
financeiro da CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior),
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico), FINATEC (Fundação de
Empreendimentos Científicos e Tecnológicos),
FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa no
Estado de São Paulo) e FUNDHERP (Fundação
Hemocentro de Ribeirão Preto).
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Silviene Fabiana de
Oliveira
TESE DE DOUTORADO
Rejane da Silva Sena Barcelos
TÍTULO
CONTRIBUIÇÃO GENÉTICA DE DUAS POPULAÇÕES URBANAS DA
REGIÃO CENTRO
-OESTE BRASILEIRA ESTIMADA
POR MARCADORES UNIPARENTAIS
Comissão Examinadora
Profª. Dra. Silviene Fabiana de Oliveira
Universidade de Brasília
Presidente/Orientador(a)
Prof. Dr. João Farias Guerreiro Profª. Dra. Zulmira Guerrero Marques Lacava
Membro Titular Externo Membro Titular Interno
UFPA UnB
Profª. Drª. Maura Helena Manfrin Profª.Dra. Maria de Nazaré Klautau Guimarães Grisólia
Membro Titular Externo Membro Suplente em Substituição
USP UnB
Aos meus pais,
Raimundo Pena Sena
Pelo incentivo ao estudo, enfatizando sempre que o
conhecimento era a maior riqueza entre
os seres humanos;
pelo carinho, dedicação e amor que sempre
foi-lhe peculiar......
&
Maria Amélia da Silva Sena
Pelo exemplo de vida, dedicação, carinho, amor,
compreensão, confiança e sabedoria me orientando nas
horas boas e difíceis de minha vida....
Aos meus filhos
Augusto Henrique Silva Sena Barcelos
e
Tâmara Silva Sena Barcelos
Que com carinho, amor e compreensão tentaram e
talvez...entenderam os inúmeros momentos
de minha ausência....
DEDICO.
Agradecimentos
A Deus, por me oferecer mais esta oportunidade de ter outras perspectivas no campo
profissional e conhecer um novo mundo laborioso, cansativo, investigador, oneroso, competitivo, mas
extremamente contagiante e apaixonante que é o mundo da pesquisa e do conhecimento.
Aos órgãos de incentivo à pesquisa CAPES, CNPq, FAPESP, FUNDHERP e, em especial, à
FINATEC a qual proporcionou uma linda e inesquecível viagem ao exterior, ampliando meus
conhecimentos e o intercâmbio com pesquisadores de outros continentes.
Agradeço a todos que de alguma forma me auxiliaram galgar mais um grande degrau em
minha vida, especialmente,
À profª. e amiga Silviene Fabiana de Oliveira, pelos ensinamentos, apoio, orientação, carinho,
exemplo, amizade que sempre lhe foram peculiares ao longo destes anos de convívio, pela grande
experiência que adquiri sob sua orientação e à sua filha Gabriela por ceder, além de seu quarto, sua
mãe compreendendo a importância de sua presença no “computador” e no Campus nos momentos de
necessidade e dificuldade pelos quais passamos juntas.
A professora e também orientadora Dra. Zulmira Guerrero Marques Lacava que, no início de
meus trabalhos, me acolheu com muito carinho como orientadora me incentivando nos trabalhos.
Á famosa e boa Universidade de Brasília, por proporcionar condições satisfatórias para o
desenvolvimento de meu trabalho.
Ao corpo docente da Universidade de Brasília, em especial aos professores Dr. César Koppe
Grisólia, Dra. Maria de Nazaré Klatau Guimarães, que muito contribuíram para complementação
deste trabalho.
À equipe de funcionários do Laboratório de Genética (UnB) pelo grande apoio e amizade que
me ofereceram.
Aos funcionários do programa de Pós-Graduação em Biologia, em especial à querida Nara
Irléia, funcionária exemplar no atendimento. Agradeço por ser compreensiva, confiar em minha
pessoa e que, com muito carinho e paciência, me atendeu e orientou nesta temporada na UnB.
À amiga e colega de profissão Biomédica e Perita Neide Maria de Oliveira Godinho, pelo
carinho, respeito, paciência, atenção, presteza, boa vontade, companheirismo e pelo apoio, o meu
muito obrigado!
Aos meus amigos e amigas, companheiros do Laboratório da UnB:
- meu pupilo Guilherme, que sempre me auxiliou com grande carinho, dedicação,
cuidado, presteza, atenção e profissionalismo. Muito Obrigada!!!
- minha “orientanda”, amiga e pupila Mila, que brilhantemente terminou seu estágio
mesmo com pouca atenção de minha parte...
- minha companheira de moradia em Ribeirão Preto – Maria Angélica - Gegê, que me
proporcionou dias inesquecíveis em São Paulo, incentivando a ir em frente com muita
amizade e profissionalismo, pois não foi fácil ficar longe de meus filhos...
- Aos amigos Carol, Gabriel, Ana Paula, Neda e Lane - pelos momentos que passamos
juntos, pelas críticas, sugestões, ajuda, incentivo e colaboração.
Aos colegas da minha turma do curso de Doutorado em Biologia pelos momentos apertados e
bons que passamos juntos.
A professora e amiga Kiyoko Abé-Sandes que cedeu seu conhecimento e material ensinando
e orientando uma grande parcela das atividades práticas em Ribierão Preto. Agradeço também à sua
família por ter compreendido as horas a mais no laboratório.
Ao Hemocentro de Ribeirão Preto, na pessoa do professor Dr. Wilson Araújo da Silva Junior
que gentilmente cedeu o laboratório, material, oportunidade e a sua equipe do Laboratório de
Clonagem.
Ao profº. Aguinaldo Simões por ceder parte dos oligonucletídeos com presteza e rapidez.
Ao colega “indireto” do curso de Doutorado Luzitano pelos ensinamentos, atenção,
companheirismo e à sua família por me acolher com tanto carinho em minha estada em Ribeirão
Preto.
À amiga e companheira Vera Saddi pelo grande exemplo, dedicação, determinação, incentivo,
carinho e ensinamentos nos vinte e três anos... de convívio.
A toda a Administração da Universidade Católica de Goiás, pelo investimento em minha
pessoa, principalmente nas pessoas dos professores: Sérgio Machado - ex - diretor do CBB que muito
me apoiou e torceu pelo meu sucesso; professor Paulo Roberto de Melo Reis atual diretor que não
mediu esforços em me liberar, transmitindo incentivo e grande apoio nesta caminhada e ao professor
Paulo Luiz Carvalho Francescantônio, um grande amigo que sempre me incentivou e acreditou em
mim. Obrigada.
Ao coordenador do Mestrado em Ciências Ambientais e amigo profº Dr. Nelson Jorge da Silva
Júnior que com muito carinho me acolheu nas dependências da área 5 – UCG, e à profª Dr. Kátia
Pellegrino pela acolhida em seu laboratório deixando-me à vontade para efetuar as tarefas diárias.
Ao corpo docente da UCG, principalmente nas pessoas das professoras e amigas Ana Maria,
Carla, Cláudio, tia Ivanise, Lândia, Maria Paula e minha amiga Denise, pelo apoio, amizade e
carinho! Ao Cláudio agradeço também os socorros nos atendimentos estatísticos...
Aos funcionários da UCG da área V e do Mestrado em Ciências Ambientais – Natalina,
Rosilda, Claret, Eli, Roberto,Carlos e Camila pela acolhida e incentivo.
À Secretaria de Segurança Pública e Justiça do Estado de Goiás que investiu
profissionalmente nesta jornada e, em especial, ao sr. Secretário Profº Jônatas Silva, por acreditar em
mim e na classe dos Peritos Criminais. Profissão esta em que somente com estudo e pesquisa é que
poderemos prestar a população um serviço profissional de qualidade.
Ao meu Grande chefe, doctor Décio, pelo incentivo e força que foram vitais para o
desenvolvimento deste trabalho em outra unidade da Federação e, que indiferente de “comentários”
Sempre acreditou em mim.
Aos meus chefes “mais diretos” Antônio Carlos e Rhonan pelo incentivo e liberação durante
esse trabalho. E ao colega de Superintendência da Academia Sérgio por sua dedicação e carinho.
À Diretoria da Polícia Civil pelo investimento financeiro e por confiar em mim nesta jornada,
em especial ao grande delegado e Superintendente da Polícia Judiciária Dr. Alzemiro José dos Santos
e sua esposa Joana que sempre apostaram, investiram e acreditaram em mim. Obrigada!
À Ex-Superintendente de Criminalística, perita, madrinha e amiga Helena Fernandes
Martins, pelo incentivo, companheirismo, confiança, apoio moral, que por seu intermédio tornou
realidade um sonho da Polícia Técnica de Goiás.
Aos meus queridos amigos aos quais, em suas presenças, conheci todo o Estado de Goiás
durante a coleta das amostras, Atanagildo Ribeiro da Silva e Luis Carlos Augusto que com muita
garra me ajudaram a encontrar, sem medir esforços, os voluntários para essa pesquisa.
Ao meu colega Perito Roberto Pedrosa que nunca mediu esforços para defender a minha
profissionalização e a minha pessoa.
Ao meu querido “grande” chefe Geraldo Batista Ferreira, in memorian, que sempre com
muita alegria que lhe era peculiar, designava com presteza a viatura e o colega de trabalho para as
nossas viagens. Esteja onde estiver, meu muito obrigado!
Ao meu amigo e ex-Diretor do Instituto de Criminalística do Estado de Goiás, Dr. Júlio Tadeu
de Castro Barros, agradeço por sempre me apoiar, orientar e, principalmente, confiar em mim.
Aos chefes Nilce, Wagner e Jorge Carim por confiarem e compreenderem a importância do
meu estudo e profissionalização.
À amiga Gracyelena Maria Dorivê Silva por acreditar, incentivar e apoiar o estudo do DNA
Forense desde quando ele estava no papel com um carinho especial.
Aos colegas do Laboratório Químico do Instituto de Criminalística, que sempre me
incentivaram e por tentarem compreender os anos de ausência e trabalho incessante.
A toda a Divisão de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito Federal, nas pessoas dos
grandes profissionais e peritos Aluízio, Cláudia, Flávia, Gustavo, Karla Angélica e Yung e toda a
equipe técnica pelas horas de ensinamentos e empenho no repasse de experiências.
A toda equipe da Superintendência da Polícia Técnica: Andréia, Fernanda, Geraldo, Luis
Altino, Luis Augusto, Raquel, Régia e Ozana , que sempre empenharam em resolver os problemas
gerados com minha ausência.
Aos profº Alexandre Coelho da Universidade Federal de Goiás e profº Rinaldo da
Universidade Católica de Brasília pelo auxílio em parte das análises estatísticas sem medir esforços
para meu atendimento.
A todos os colegas Biomédicos e Peritos que em algum momento me apoiaram.
À Srª. Cinira, Maristene, Elder, Aurélio Antônio, Margarethe, Débora, Cínara e minha
afilhada Érica que muito me incentivaram a concluir com êxito mais esta fase de minha vida.
Ao meu irmão Renan, um batalhador “nato”, que a vida sempre coloca desafios e os quais
sempre consegue vencê-los, minha cunhada Jacqueline, minhas sobrinhas Renata, Rossana e Raíssa,
pelas horas de ausência, pelo apoio, por acreditarem muito em mim e pelo grande apoio emocional nas
horas mais difíceis que passei nesta jornada.
À minha irmã, amiga e companheira nas dificuldades da vida, Regina, pela paciência e
compreensão. Agradeço também ao seu esposo Marcelo e meu afilhado Brunno que juntos me
auxiliarem nas tarefas maternas.
Ao meu irmão Renato que Deus sabe o quanto é feliz em seu mundo, por me compreender e
entender, outra vez, a ausência da “Aninha”.
À minha querida amiga, admiradora e mãe Maria Amélia por sempre poder contar com seu
apoio nas horas boas e difíceis da vida por muitas vezes me substituiu no papel de mãe, pela confiança,
por acreditar e sempre investir em mim. Obrigada !!!
A meu saudoso e sábio pai Raimundo Pena Sena, in memorian, por sempre me ensinar que o
conhecimento é o bem mais valioso do ser humano e esteja onde estiver, sei que há de estar muito
orgulhoso pelo meu sucesso que também é seu.
Ao meu esposo Jovistênio pelas horas e horas de ausência, pelos momentos difíceis e pelos
bons que muitas vezes foram “encurtados” pelos afazeres do doutorado, por sempre me apoiar,
incentivar a galgar mais este degrau de minha vida e me substituir cuidando de nossos filhos com
muita eficiência.
Aos meus fihos Tâmara e Augusto Henrique que souberam, com seu jeitinho carinhoso, me
apoiar e ajudar a passar momentos difíceis com amor e muito companheirismo. Que Deus me permita
conceder a eles todas as oportunidades que tive.
A todos os voluntários que cederam a matéria prima deste estudo.
E a todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento e realização
destetrabalho, o meu MUITO OBRIGADO!!!
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi analisar e comparar a constituição genética
masculina e feminina da região Centro-Oeste brasileira utilizando 11 UEPs, um
elemento AluYAP e 4 STRs localizados na região não-recombinante do
cromossomo Y, além de 13 SNPs situados na região codificante do DNA
mitocondrial (DNAmt) e uma deleção de 9 pb localizados no DNAmt. Estes
marcadores foram analisados em 200 homens não aparentados do Estado de
Goiás e Distrito Federal. As análises dos marcadores situados no cromossomo
Y e no DNA mitocondrial demonstraram uma ampla diversidade genética entre
as populações. A análise estatística dos dados foi realizada pelos programas
ARLEQUIN 2000, PopGENE e pelo teste Z. Os marcadores binários do
cromossomo Y e do DNA mitocondrial não indicaram diferenças
estatisticamente significativas entre as populações. Entretanto, na análise dos
STRs Y específicos foram observadas diferenças genéticas (p<0.05). Os
resultados para contribuição paterna indicaram uma maior contribuição de
homens europeus que africanos e ameríndios. Já o DNA mitocondrial mostrou
uma predominância de linhagem materna ameríndia/asiática em ambas
populações, seguida pela africana e uma pequena contribuição européia.
Sendo assim, os resultados da contribuição paterna e materna são claramente
divergentes. Esses resultados corroboram dados históricos que indicam: o
cruzamento direcional entre homens europeus e mulheres dos três grupos
étnicos principais que colonizaram o Brasil; e um pequeno número de homens
descendentes de ameríndios na população brasileira atual, o qual é
conseqüência da colonização européia.
ABSTRACT
This research aimed to analyze and compare the male and female
genetic constitution of Middle-West Brazilian region by the investigation of 11
UEPs, an AluYAP element and 4 STRs located in the nonrecombinant region
of the Y-chromosome, and, also, 13 SNPs placed in coded regions of
mitochondrial DNA (mtDNA) and a 9 bp deletion of mtDNA. These markers
were analyzed in 200 unrelated men from Goiás state and Federal District. The
analysis of the Y-chromosome and mtDNA markers demonstrated a great
genetic diversity between populations. The statistical analysis of the data
obtained was done using the ARLEQUIN 2000 software, PopGENE and Z test.
The binary markers of Y-chromosome and mtDNA did not indicate statistic
supported differences between the populations. However, genetic differences
were observed in Y-chromosome STRs analysis (p<0.05). The paternal
contribution results indicated a greater European men contribution than African
or Amerindian ones. Besides, mtDNA showed a predominance of
Amerindian/Asiatic maternal lineage in both populations constitution, followed
by African and then a small European contribution. Therefore, the results
showed a clear divergence from paternal to maternal lineages. These results
corroborated historical data that points to: directional mating between European
males and females from any of the main three ethnic groups that colonized
Brazil; and to a small number of Amerindians males’ descendants in nowadays
Brazilian populations, which is a consequence of the European colonization.
Sumário
I. INTRODUÇÃO 1
I.1. A população brasileira – um relato histórico 1
I.2. Marcadores genéticos e reconstrução histórica 4
I.2.1. Marcadores genéticos uniparentais 8
I.2.1.1. Cromossomo Y 8
I.2.2.2. DNA mitocondrial 11
I.3. A população brasileira: um relato genético 13
II. OBJETIVOS 17
III. MATERIAL E MÉTODOS 19
III.1. Populações 19
III.2. Coleta de material biológico e dados demográficos 21
III.3. Processamento e conservação da amostra e extração de DNA 24
III.4. Marcadores genéticos 24
III.4.1. Cromossomo Y 25
III.4.1.1.Elemento Alu 25
III.4.1.2. Marcadores binários 26
III.4.1.3. Marcadores do tipo STR 28
III.4.2. DNA mitocondrial 30
III.4.2.1. Marcadores situados no DNA mitocondrial 30
III.5. Análise estatística 34
IV. RESULTADOS 39
IV.1. Contribuição uniparental masculina 39
IV.1.1. Inserção AluYAP 39
IV.1.2. Marcadores binários do tipo SNPs situados no cromossomo Y 40
IV.1.2.1. Caracterização genética populacional por locus 40
IV.1.2.2. Caracterização genética populacional por haplótipos e
haplogrupos 43
IV.1.2.3. Análise de mistura: marcadores binários Y-específicos 45
IV.1.2.4. Análise filogeográfica 46
IV.1.3. Microssatélites situados no cromossomo Y 48
IV.1.3.1. Caracterização genética populacional por locus 48
IV.1.3.2. Caracterização genética populacional por haplótipos e
haplogrupos 58
IV.1.3.3. Diferenciação genética analisada por marcadores do tipo STR
63
IV.1.4. Associação SNPs/STRs/AluYAP 65
IV.2. Contribuição uniparental feminina 65
IV.2.1.Mistura genética: marcadores do DNA mitocondrial 71
IV.3. Comparação: Y versus DNA mitocondrial 75
IV.3.1.Análise indivíduo a indivíduo 75
V. DISCUSSÃO 80
V.1. Contribuição uniparental masculina 81
V.1. Inserção AluYAP 82
V.2. Marcadores binários do tipo SNPs situados no cromossomo Y 82
V.3. STR (Short tandem repeats) 90
V.4. Marcadores genéticos Y-específicos: uma comparação 96
V.2. Contribuição uniparental feminina 98
V.2.1. Mistura genética utilizando marcadores do DNA mitocondrial 101
V.3. Comparação entre a contribuição parental masculina e feminina
103
V.4. Comparação individual: Y versus DNA mitocondrial 103
V.5. Comparação populacional: Y versus DNA mitocondrial 105
VI. CONCLUSÕES 108
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 110
VIII. ANEXOS 130
SUMÁRIO DE FIGURAS
Figura III.1
Mesorregiões e microrregiões que compõem o Estado de
Goiás (Mapa: Albani Borges dos Reis).
20
Figura III.2
Regiões Administrativas que compunham o Distrito Federal à
época da coleta de material biológico (Fonte: Codeplan,
1997). Quatro outras regiões administrativas foram criadas
desde então: Park Way (2003), Setor Complementar de
Indústria e Abastecimento (2004), Sobradinho II (2004) e
Itapoã (2005) (sítio oficial do Governo do Distrito Federal –
www.distritofederal.df.gov.br acessado em 31/01/2006), as
quais não estão representadas no presente mapa.
20
Figura III.3
Estrutura do cromossomo Y humano e a localização dos
quatro STRs analisados.
29
Figura IV.1
Distribuição das freqüências dos alelos ancestrais dos
marcadores genéticos do tipo SNP situados no cromossomo
Y nas populações do Estado de Goiás e Distrito Federal.
42
Figura IV.2
Distribuição dos haplogrupos do cromossomo Y nas
populações de Goiás e Distrito Federal.
45
Figura IV.3
Relacionamento dos haplogrupos do cromossomo Y
observados nas populações do Distrito Federal (A) e Goiás
(B). Os haplogrupos são representados pelos círculos (o
diâmetro do círculo é proporcional à freqüência dos
haplogrupos) e estão indicados ao lado dos mesmos; as
mutações estão indicadas ao lado dos ramos.
47
Figura IV.4
Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS19
nas populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e
Centro-Oeste.
51
Figura IV.5
Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS390
nas populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e
Centro-Oeste.
51
Figura IV.6
Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS391
nas populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e
Centro-Oeste.
52
Figura IV.7
Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS393
nas populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e
Centro-Oeste.
52
Figura IV.8
Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões
brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS19. A
população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal
enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de
paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia
et al., 2005), Abaixo valores de F
st
e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
54
Figura IV.9
Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões
brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS390. A
população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal
enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de
paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia
et al., 2005), Abaixo valores de F
st
e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
55
Figura IV.10
Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões
brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS391. A
população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal
enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de
paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia
et al., 2005), Abaixo valores de F
st
e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
56
Figura IV.11
Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões
brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS393. A
população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal
enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de
paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia
et al., 2005), Abaixo valores de F
st
e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
57
Figura IV.12
Haplótipos de microssatélites do cromossomo Y e suas
freqüências nas populações de Goiás e Distrito Federal.Os
haplótipos foram agrupados em YAP+ e YAP-. Haplótipos
compartilhados entre as populações: 1 a 21 e 57 a 59;
Haplótipos YAP- específicos da população do Distrito Federal
(22 a 37) e do Estado de Goiás (38 a 56). Haplótipos YAP+
específicos da população do Distrito Federal (60 a 62) e do
Estado de Goiás (63 a 72).
62
Figura IV.13
Distribuição das freqüências dos haplogrupos de DNA
mitocondrial observados no Estado de Goiás e no Distrito
Federal classificados de acordo com suas linhagens.
***Não Ameríndios/Asiáticos.
69
Figura IV.14
Matriz de comparação par a par dos resultados obtidos pelos
marcadores de DNA mitocondrial entre as cinco regiões
brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
. A
população do Centro-Oeste é o conjunto formado pelas
populações de Goiás e Distrito Federal enquanto que as das
demais regiões são compostas por indivíduos auto-
declarados como “brancos” e a população denominada
“Brasil” é o conjunto amostral das regiões brasileiras
excetuando o Centro-Oeste (dados de Alves-Silva et al.,
2000). Abaixo valores de F
st
e acima valores de P. Número
de permutações: 10100.
70
Figura IV.15
Distribuição dos haplogrupos de DNA mitocondrial
observados em Goiás e no Distrito Federal distribuídos pelas
origens geográficas. ***Não ameríndios/Asiáticos.
72
Figura IV.16
Contribuição uniparental na constituição de cada indivíduo
amostrado na população do Estado de Goiás. Na parte
inferior da figura estão representadas as linhagens referentes
ao cromossomo Y e, na superior, as do DNA mitocondrial. As
amostras caracterizadas como linhagens européias estão
representadas na cor azul, as africanas na cor vermelha, as
ameríndias na cor verde.
77
Figura IV.17
Contribuição uniparental na constituição de cada indivíduo
amostrado na população do Distrito Federal. Na parte inferior
da figura estão representadas as linhagens referentes ao
cromossomo Y e, na superior, as do DNA mitocondrial. As
amostras caracterizadas como linhagens européias estão
representadas na cor azul, as africanas na cor vermelha, as
ameríndias na cor verde e a asiática na cor laranja.
78
SUMÁRIO DE TABELAS
Tabela III.1
Distribuição dos habitantes do Estado de Goiás e do
Distrito Federal por gênero (masculino e feminino), região
(urbana ou rural), contingente total em cada população e
na região Centro-Oeste como um todo (Dados IBGE –
censo 2000 – www.ibge.gov.br).
21
Tabela III.2
Proporção da população residente, por faixas etárias, no
Estado de Goiás e no Distrito Federal, conforme dados
do IBGE (2000).
21
Tabela III.3
Distribuição dos indivíduos do Estado de Goiás de acordo
com as mesorregiões, microrregiões, municípios
coletados e sua densidade populacional.
23
Tabela III.4
Distribuição dos doadores do Distrito Federal de acordo
com a região administrativa de moradia dos pais à época
do nascimento do sujeito da pesquisa.
24
Tabela III.5
Relação dos marcadores binários analisados, mutação
característica do locus, seqüência dos iniciadores
utilizados, temperatura de pareamento, tamanho do
fragmento amplificado e enzima de restrição utilizada
27
Tabela III.6
Relação dos loci gênicos do tipo STRs do cromossomo Y
analisados, seqüência dos iniciadores, temperatura de
pareamento, segmento amplificado, repetição e
localização cromossômica.
29
Tabela III.7
Relação dos haplogrupos analisados, iniciadores,
temperatura de pareamento, segmento amplificado,
polimorfismos analisados por digestão enzimática para
caracterização dos haplogrupos de DNA mitocondrial e
sua distribuição geográfica. As amplificações foram feitas
utilizando-se iniciadores específicos e as condições
descritas por Torroni et al. (1992, 1993a e 1996).
32
Tabela III.8:
Freqüências alélicas parentais utilizadas nos cálculos das
estimativas de contribuições étnicas para a constituição
da população da região Centro-Oeste brasileira.
38
Tabela IV.1
Freqüência dos alelos ancestrais dos marcadores
genéticos do tipo SNP situados no cromossomo Y
analisados nas populações do Estado de Goiás e Distrito
Federal, parâmetros de variabilidade genética (índice de
diversidade gênica (Nei, 1973) e % loci polimórfico) e
teste de heterogeneidade intra locus.
41
Tabela IV.2
Haplogrupos do cromossomo Y observados e respectivas
freqüências nas populações de Goiás, Distrito Federal e
Centro-Oeste e populações parentais.
44
Tabela IV.3
Estimativas de composição quanto à origem geográfica
das populações de Goiás e Distrito Federal e do conjunto
amostral (Centro-Oeste brasileiro) baseada nos
haplogrupos do cromossomo Y e comparação das
estimativas obtidas para as duas populações (teste z).
46
Tabela IV.4
Distribuição das freqüências alélicas de quatro
microssatélites do cromossomo Y nas populações de
Goiás e Distrito Federal (DF) e em cinco regiões
geopolíticas brasileiras (Grattapaglia et al., 2005) (N =
Norte; NE = Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul; CO =
Centro-Oeste)
49
Tabela IV.5
Haplótipos observados em quatro microssatélites
situados no cromossomo Y, suas freqüências em cada
população e a diversidade haplotípica. Os haplótipos
foram divididos em dois grupos YAP e YAP
+
59
Tabela IV.6
Estimativas de mistura genética (erro padrão em
parênteses) das populações de Goiás e Distrito Federal e
para o conjunto amostral (Centro-Oeste brasileiro)
considerando um conjunto de cinco marcadores
genéticos uniparentais (STRs e AluYAP) e comparação
das estimativas obtidas para as duas populações (teste
z).
64
Tabela IV.7
Comparação entre as estimativas de mistura genética
geradas a partir dos dados dos marcadores bialélicos e
microssatélites para o conjunto amostral do Centro-Oeste
brasileiro.
64
Tabela IV.8
Distribuição geográfica e freqüências dos haplogrupos de
DNA mitocondrial observados no Centro-Oeste brasileiro
e em dados da literatura (indivíduos autodeclarados
brancos de quatro regiões geopolíticas brasileiras - N =
Norte; NE = Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul - e do Brasil
sem a região Centro-Oeste (Alves-Silva et al., 2000)). A
nomenclatura de haplogrupos no presente trabalho foi
baseada em Chen et al. (2000).
67
Tabela IV.9
Composição quanto a origem geográfica das populações
de Goiás e Distrito Federal e do conjunto amostral
(Centro-Oeste brasileiro) baseada nos haplogrupos do
DNA mitocondrial e comparação das estimativas obtidas
para as duas populações (teste z).
71
Tabela IV.10
Distribuição das freqüências dos haplogrupos do DNA
mitocondrial agrupados por origem geográfica
(ancestralidade) da região Centro-Oeste (CO) e dados de
brasileiros autodefinidos como brancos da literatura (N =
Norte; NE = Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul) (Alves-
Silva et al., 2000). Destaca-se que a região Centro-Oeste
não foi contemplada na literatura citada.
73
Tabela IV.11
Teste z (valores de p entre parênteses) para a
comparação das proporções de contribuição das três
origens geográficas principais (Europa, África e
América/Ásia) na região Centro-Oeste e no Brasil com
relação às demais regiões geográficas brasileiras (N =
Norte; NE = Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul). Valores
de z estatisticamente significativos estão em negrito.
74
Tabela IV.12
Constituição genética individual definida pela associação
das linhagens de DNA mitocondrial e cromossomo Y nas
populações de Goiás, Distrito Federal e Centro-Oeste
brasileiro
79
Tabela IV.13
Comparação das estimativas de mistura genética
geradas a partir das linhagens do cromossomo Y e do
DNA mitocondrial para o conjunto amostral da região
Centro-Oeste brasileiro e comparação das estimativas
obtidas para as duas categorias de marcadores (teste z).
79
Introdução
1
I. INTRODUÇÃO
I.1. A população brasileira – um relato histórico
O Brasil é um país dividido geopoliticamente em cinco regiões: Sul,
Sudeste, Norte, Nordeste e Centro-Oeste. Apesar da história oficial do Brasil
ter iniciado a partir do ano de 1500 com a colonização portuguesa, os
ameríndios já habitavam o território brasileiro há pelo menos 12 mil anos. É
estimado que os ameríndios somavam dois milhões de indivíduos no início da
colonização (Cunha, 1998), sendo que esse número foi reduzido ao longo da
história do país, tendo sido estimada em 734.127 indivíduos (IBGE-Censo
2000).
A colonização do Brasil iniciou pela costa brasileira e, gradualmente, os
europeus e africanos que aqui chegaram juntamente com seus descendentes
interétnicos seguiram para o interior. Isto proporcionou um processo de
colonização diferenciada entre as regiões socioeconômicas brasileiras.
Até 1808, ano da abertura dos portos para migrações de outros países,
a migração para o país foi composta basicamente por homens portugueses,
sendo que a de mulheres européias durante os primeiros séculos de
povoamento foi insignificante (Ribeiro, 1995). O fluxo migratório para o Brasil
teve altos e baixos até a virada do século XX, quando viveu seu ápice. No
exterior, desdobrava-se a Revolução Industrial, dispensando a mão-de-obra
com os avanços técnicos na produção, bem como os transportes e as
comunicações eram facilitados sendo que movimentos sociais conturbavam o
cenário político. No Brasil, a expansão da lavoura cafeeira no Sudeste e a
chamada “questão da mão-de-obra” foram fundamentais para o maior
movimento imigratório já vivido pelo país até hoje (IBGE, 2000).
O tráfico de escravos iniciou-se no ano de 1538 e oficialmente terminado
em 1850. Estima-se que aproximadamente três milhões e seiscentos mil
escravos foram trazidos para o Brasil durante este período, o que representa
em torno de 40% do total de escravos vindos para a América, sendo que a
proporção sexual foi de 2/3 de homens para 1/3 mulheres (Curtin, 1969; Reis e
Gomes, 1996).
Introdução
2
Do total de imigrantes que chegaram ao Brasil entre 1500 e 1978,
estima-se que 58% foram europeus, 40% africanos e 2% asiáticos (Callegari-
Jacques e Salzano, 1999) e as contribuições de outras regiões da Europa,
como Itália, Espanha, Alemanha, Sírios e Líbano foi intensificado e continuado
até o início do século XX (Carvalho-Silva et al., 2001). Contribuições de outras
regiões do mundo também aconteceram, mas foi numericamente insignificante.
Portanto, o povoamento brasileiro foi conduzido a partir da fusão da
diversidade genética de, principalmente, três grupos étnicos - ameríndios,
europeus e africanos - em um processo de miscigenação que já se estende por
meio milênio. Devido a sua grande extensão territorial, a distribuição destes
grupos no território brasileiro não foi homogênea, a qual é refletida na
composição da população atual (IBGE, 2000). Porém, houve também um
processo de incorporação de várias outras culturas à brasileira e,
conseqüentemente, suas características genotípicas e fenotípicas também
foram adicionadas à nossa população (Salzano, 1986). Dessa forma, o povo
brasileiro forma uma das mais heterogêneas populações do mundo (Carvalho-
Silva et al., 2001).
Uma das regiões menos conhecidas com relação à caracterização
genética é a região Centro-Oeste. Essa região é composta por três estados –
Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul – e o Distrito Federal, onde se
localiza Brasília, a Capital Federal. Devido a sua localização central, longe da
costa brasileira, esta região foi uma das últimas a ser povoada. Mais da metade
da população habita Goiás e Distrito Federal (60,6%) (Censo IBGE – 2000).
A colonização do Estado de Goiás foi conduzida pela descoberta do
ouro, a qual atraiu rapidamente pessoas especialmente dos estados vizinhos
(Palacín, 1994). Esta migração foi principalmente composta de pessoas
miscigenadas, oriundas principalmente da reprodução entre representantes dos
três grupos parentais principais da população brasileira – europeus
(principalmente portugueses), africanos e ameríndios da região Norte. Outros
grupos, como os japoneses, também contribuíram para a constituição desta
população, embora essa participação tenha realmente sido muito pequena
(Palacín e Moraes, 1994).
Introdução
3
Dentro da região Centro-Oeste encontra-se o Distrito Federal. O
povoamento desse Distrito apresenta a peculiaridade de ter ocorrido
artificialmente, incentivado por benefícios governamentais para a construção da
cidade de Brasília (1956 até 1960). A construção da Capital foi o principal
atrativo para o processo migracional, originando-se principalmente das regiões
Norte, Sul e Sudeste. Desde o início dessa construção, pessoas de todos os
lugares do Brasil, e mesmo de outros países, vieram se fixar aqui (Arantes,
1999). E foi com essa contribuição que se formou a população nativa
brasiliense, o que deve contemplar um amplo conjunto dos genótipos
existentes em nosso país.
A contribuição de cada região brasileira para a formação da população
do Distrito Federal é bastante diferenciada. Foi estimado que 1,47% dos
migrantes são oriundos da região Sul, 1,94% do Norte, 16,84 % da Sudeste,
27,87% da Nordeste e 52,08% da própria região Centro Oeste. De acordo com
o último censo (IBGE, 2000), 95,0% da população do Distrito Federal que
abrange, Brasília e cidades satélites, vive em área urbana sendo que 43,9% da
população total nasceram no próprio Distrito Federal refletindo uma diminuição
no fluxo migratório e assim o reconhecimento de uma população local
(Codeplan, 1997).
Na composição étnica do Centro-Oeste brasileiro, de acordo com o
último censo do IBGE (2000), os indivíduos se autodeclararam ao entrevistador
como pertencendo a uma dada cor da pele, sendo que 49,72% dos indivíduos
brasileiros são brancos, 43,68% pardos, 4,62% pretos, 0,90% indígena, 0,40%
amarelo e, 0,68% sem declaração.
Uma característica importante do povoamento do Brasil foi o forte
cruzamento direcional entre homens europeus e mulheres ameríndias e
africanas (Carvalho-Silva, 2001; Abé-Sandes, 2002; Grattapaglia et al., 2005).
A conseqüência desse cruzamento diferencial, relatado na história do país,
como, por exemplo, na reprodução entre portugueses e ameríndias no início do
povoamento e entre Senhores de Engenho e escravas em fazendas do Brasil
colonial, pode ser avaliado utilizando marcadores genéticos.
Introdução
4
I.2. Marcadores genéticos e reconstrução histórica
A análise de marcadores genéticos iniciou com os estudos de genética
mendeliana e a observação de genes associados a caracteres morfológicos.
Esses primeiros trabalhos contribuíram significativamente para o
desenvolvimento teórico da análise de ligação gênica e na construção das
primeiras versões dos mapas genéticos (Ferreira e Grattapaglia, 1995).
Porém, o número desses marcadores morfológicos era restrito e com a
ampliação de pesquisas em genética e bioquímica, foram descritos novos
marcadores. Além disso, com o advento das técnicas modernas de biologia
molecular, passou-se a utilizar os polimorfismos de DNA, úteis para análise de
populações. Os primeiros marcadores genéticos moleculares que foram
utilizados visando o diagnóstico de patologias humanas (Meyer et al., 1995;
Bydlowski et al., 1996), identificação humana (Jeffreys et al., 1985a; Silva e
Moura-Neto, 1998) e mapeamento genético (Donis-Keller et al., 1987; Telenius
et al., 1990) foram as variações no comprimento de fragmentos de restrição de
DNA - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
O estudo de marcadores genéticos auxilia no entendimento das relações
evolutivas, assim como na reconstrução das rotas e origens dos povoamentos
(Salzano e Callegari-Jacques, 1988; Saitou, 1995). Uma das questões que tem
sido enfocada é a mistura genética de populações. Dentro dessa abordagem,
pode-se estimar a contribuição de cada um dos grupos étnicos com base nas
freqüências gênicas desses marcadores.
A variabilidade genética encontrada em populações humanas não é
aleatória e depende do nível da análise realizada, se intra ou inter populacional
e dos marcadores genéticos utilizados. Esta variabilidade não é
necessariamente paralela quando diferentes níveis de hierarquia biológica são
analisados, como DNA nuclear e proteínas (Salzano, 1998). Dessa forma,
torna-se interessante estudar diferentes tipos de marcadores para que se tenha
uma visão mais ampla dos processos de mistura étnica e subestruturação
ocorridos na formação da população de interesse.
Os marcadores genéticos, polimórficos e facilmente detectáveis na
população, podem se referir a um gene, um sítio de restrição ou qualquer outra
seqüência do DNA que apresente diferentes versões alélicas para aquele locus
Introdução
5
(Edwards et al., 1991). Os mecanismos que explicam o polimorfismo podem
ser mudanças únicas de nucleotídeos (por exemplo, substituições) como os
SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), variações no comprimento de
repetições in tandem (VNTRs - Número variável de repetições in tandem e
STRs - Repetições curtas in tandem) e a inserção ou deleção de seqüências de
DNA, os Indels, como as inserções Alu (Edwards et al., 1991). É importante
ressaltar ainda que determinados marcadores, em decorrência da diferença de
freqüência entre dois grandes grupos populacionais (como europeus e
africanos) ser superior a 50%, são considerados específicos de populações,
denominados PSAs, ou mais recentemente indicadores de ancestralidade, os
AIMs (Shriver et al., 1997; Shriver et al., 2005).
Os elementos Alu, restritos a primatas, são compostos por uma
seqüência de aproximadamente 300 pares de base que são encontradas
inseridas em uma série de regiões do genoma, sendo que parte deles são
polimórficos, isto é, nem todos os indivíduos de uma dada população possuem
a inserção. São ferramentas altamente úteis para a análise da reconstrução
histórica de populações humanas e dos eventos demográficos pertinentes a
estas. Isto porque a inserção de elementos Alu é um tipo de evento mutacional
estável, único e unidirecional. Essas particularidades fazem que este marcador
genético seja um dos marcadores em que há segurança quanto ao
conhecimento do estado ancestral, isto é, a ausência do elemento Alu na
região de interesse (Tishkoff et al., 2000). O elemento YAP (Y chromosome Alu
Polymorphism), localiza-se na região Yq11 do cromossomo e apresenta
polimorfismo (Hammer, 1994).
Os marcadores do tipo SNPs são posições ao longo dos cromossomos
onde a seqüência apresente variação em uma única base. Estima-se que
ocorra, aproximadamente, um SNP a cada mil bases ao longo do genoma
humano (Nielsen, 2000). São também referidos como marcadores binários ou
bialélicos por apresentarem apenas dois alelos segregando em populações
humanas, a seqüência ancestral ou a derivada (Hammer e Zegura, 2002).
Considera-se que são oriundos de eventos que ocorreram apenas uma vez na
história evolutiva de uma determinada espécie (Underhill et al., 2001).
Introdução
6
Estudos de relações mais ancestrais entre populações e a tentativa para
reconstruí-las a partir de linhagens do cromossomo Y, requerem polimorfismos
com baixa probabilidade de mutações paralelas na porção não-recombinante
do cromossomo Y nos quais o estado ancestral possa ser determinado. Os
marcadores do tipo SNPs, com baixas taxas de mutação, na ordem de 2-4 x
10
-8
/sítios/geração, são os escolhidos para esse propósito. Esses
polimorfismos auxiliam na determinação da origem filogeográfica de linhagens
do cromossomo Y, permitindo a reconstrução do estado ancestral e
preservando a informação haplotípica população-específica (Underhill et al.,
1997). O relacionamento ancestral entre os marcadores pode ser inferido pela
análise filogenética. Entende-se por alelo ancestral aquele que está presente
na base da árvore e o derivado o que apresenta uma mutação no mesmo local.
Os dados gerados pela análise dos SNPs são considerados como uma
importante ferramenta para pesquisas genéticas e biológicas, sendo, portanto,
aplicados em vários campos, como em áreas médica e genética de
populações, com o objetivo de traçar migração e mistura de grupos ancestrais.
Um outro campo de aplicação é a ciência forense para a identificação humana,
tanto de indivíduos como de restos humanos (Krawczak, 1999; Petkovski et al.,
2005).
Os marcadores do tipo STR (Short tandem repeats), também chamados
microssatélites ou repetições consecutivas curtas são abundantes no genoma.
Possuem sua seqüência núcleo variando no número de repetições (Drobnic e
Budowle, 2000), e/ou na seqüência de unidades repetidas, como seqüências
mono, di, tri ou tetranucleotídios. Além disso, podem ser repetidos de poucas a
inúmeras vezes no genoma e são muito polimórficos (Edwards et al., 1992,
Pena e Jeffreys, 1993; Ferreira e Grattapaglia, 1995; Hancock, 1996; Lins et
al., 1996). O número de alelos em um típico locus STR do tipo tetranucleotídeo
pode variar de 5 a 20, dependendo do locus (Inman e Rudin, 1997), além de
possuírem de 100 a 300 pares de bases.
Uma provável causa destas variações nos loci STRs são mutações
envolvendo a inserção ou deleção de unidades que alteram o tamanho do alelo
(Hancock, 1996; Kruglyak et al., 1998; Drobnic e Budowle, 2000). Erros do tipo
deslizamento (slippage) favorecem a mutação nos STRs proporcionando
pequenas mudanças na ordem das unidades de repetição. São marcadores
Introdução
7
com alta taxa de mutação (Kayser et al., 2000), proporcionando situações em
que dois alelos possuem mesmo número de repetições, mas não são idênticos
por descendência.
A instabilidade desses marcadores gera uma grande quantidade de
alelos enquanto os outros marcadores genéticos flanqueadores destes STRs,
que são mais estáveis, permitem um rastreamento mais preciso das linhagens,
assim como uma determinação da identidade das mesmas por descendência
(Tishkoff et al., 2000). O conjunto de alelos, transmitidos em blocos de alelos
de diferentes STR no mesmo cromossomo, chama-se haplótipo e, a herança,
haplotípica. Dessa maneira, é possível a identificação de diversos loci STR em
um único cromossomo, sendo os mesmos alelos encontrados no pai, irmãos,
tios, primos, avô e demais antepassados masculinos (Budowle e Brown, 2001).
São caracterizados como loci hipervariáveis, codominantes, multialélicos
(Ferreira e Grattapaglia, 1995) e com uma alta heterozigosidade (Hammer e
Zegura, 2002) sendo extremamente úteis no mapeamento genético de
espécies, na identificação de pessoas ou de linhagens/ clones e predisposições
de doenças (Armour et al., 1996), em estudos de identificação humana
(Hammond et al., 1992, 1994; Hammer e Zegura, 2002), análise de paternidade
(Alford et al., 1994; Bever e Creacy, 1994; Schumm et al., 1997), mapeamento
genético (Schumm et al., 1995; Edwards et al., 1991, 1992) e análise de
populações (Deka et al., 1995; Gill e Evett, 1995; Martinez-Jarreta et al., 1999,
Yamamoto et al., 1999; Drobnic e Budowle, 2000; Hashiyada, 2000; Tahir et al.,
2000; Aler et al., 2001; Bosch et al., 2001; Chantratita et al., 2001; Goodwin et
al., 2001; Gusmão et al., 2001; Han et al., 2001).
As mutações pontuais, deleções ou inserções de nucleotídeos, que
levam à perda ou ganho de sítios de restrição, também revelam alterações na
molécula do DNA mitocondrial, proporcionando polimorfismo. Esses sítios de
restrições são específicos para endonucleases, enzimas de restrição capazes
de reconhecer uma seqüência específica de DNA e a cortá-la, gerando
fragmentos de tamanhos definidos (High e Benz, 1985) diferentes daqueles
segmentos de DNA que não possuem este sítio, o que faz com que estes
polimorfismos possam ser diferenciados.
Introdução
8
Esses marcadores polimórficos podem auxiliar na diferenciação de
populações humanas e podem ser denominados específicos de populações ou
indicadores de ancestralidade. Apresenta maior sensibilidade, especificidade e
são mais informativos que outros marcadores genéticos (Budowle e Brown,
2001). A análise de populações humanas utilizando a RFLP e/ ou
seqüenciamento da região controle (Ballinger et al., 1992; Torroni et al., 1994a,
1994b, 1996) revela clusters, que definem a origem dos polimorfismos em
africanos, europeus, asiáticos/ameríndios, muitas vezes continente-específicos
(Torroni et al., 1996, Alves-Silva et al., 1999). Dessa forma, a análise de
polimorfismo do DNA mitocondrial permite, por exemplo, estabelecer
associações ou exclusões entre espécimes forenses e suspeitos de crimes e
determinar relações de parentesco, tornando-se uma metodologia muito
utilizada no meio forense.
Portanto, os loci haplóides, não-recombinantes, de herança uniparental,
como os situados no cromossomo Y e no DNA mitocondrial são
particularmente sensíveis para fazer inferências sobre eventos que ocorreram
no passado. Em especial, eventos como efeito do fundador, migrações e
expansões demográficas podem ser revelados com a análise dessas
categorias de marcadores genéticos (Malaspina et al., 1998; Cavalli-Sforza et
al., 1994; Underhill et al., 2001).
I.2.1.Marcadores genéticos uniparentais
Os marcadores genéticos de herança uniparental são aqueles herdados
de apenas um dos pais pelos filhos e estão situados em duas regiões distintas:
no genoma nuclear (especificamente no cromossomo Y) e no mitocondrial. O
conjunto de dados de loci analisados em conjunto (haplótipo) pode caracterizar
o indivíduo e, o conjunto desses haplótipos, também caracterizar populações
através de seus haplogrupos.
I.2.1.1.Cromossomo Y
Os cromossomos sexuais humanos são morfologicamente distintos.
Enquanto o cromossomo X tem um tamanho médio de 150 Mb, o cromossomo
Introdução
9
Y é pequeno (60 Mb) e apresenta poucos genes (Affara et al., 1994). De
acordo com análises citogenéticas, o cromossomo Y é altamente
heteromórfico, ou seja, estudos em homens normais demonstram grandes
variações no tamanho desse cromossomo dentro da espécie humana (Bobrow
et al., 1971).
O cromossomo Y apresenta poucos genes funcionais e um excesso de
seqüências repetitivas (Smith et al., 1987). Nas extremidades dos dois braços
existem duas pequenas regiões, denominadas pseudoautossômicas (PARs -
pseudo-autossomal regions), as quais apresentam homologia com o
cromossomo X (Bradman e Thomas, 1998) e perfazem cerca de 5% do total do
cromossomo Y (Hammer e Zegura, 2002). A homologia existente entre o
cromossomo Y e o X permite que ocorra pareamento e recombinação entre
esses na região pseudoautossômica (Bradman e Thomas, 1998). Excetuando
essas duas regiões, os 50 milhões de pares de bases restantes compõem o
restante desse cromossomo, é específico do Y (Hammer e Zegura, 2002).
Em decorrência da ausência de recombinação na região Y-específica, a
cópia genética deste cromossomo encontrada em um pai e seu filho é idêntica,
na ausência de mutação. As mutações, única forma de mudança na região Y-
específica e fonte de toda variabilidade genética encontrada no mesmo são
transmitidas de geração a geração (Jobling e Tyler-Smith, 1995). Elas podem
aumentar de freqüência na população e, com isso, a região passa a apresentar
polimorfismo principalmente devido aos efeitos da deriva genética (Futuyma,
1998). O cromossomo Y possui diferentes tipos de polimorfismos que
apresentam taxas de mutação diferentes, permitindo assim selecionar o
intervalo de tempo da história das populações que desejamos estudar e
escolher o tipo de marcador mais adequado (Jobling e Tyler-Smith, 1995). A
maioria das mudanças ocorre nas regiões de introns e nas regiões
extragênicas, conhecidas como regiões neutras, ou seja, que não representam
nenhuma característica e nem conferem caráter adaptativo aos indivíduos.
Logo, a análise das mudanças dentro destas regiões Y-específicas pode nos
revelar a genealogia paterna e as relações evolutivas entre diferentes grupos
de indivíduos (Bradman e Thomas, 1998; Hammer, 1995).
Introdução
10
Indivíduos que compartilham a mesma seqüência cromossomal ou
haplótipo o fazem por ancestralidade comum o que possibilita quantificar, em
termos de gerações, a distância entre o cromossomo ancestral e os derivados.
Desta forma, a porção não-recombinante do cromossomo Y de um homem
representa a história única de sua linhagem patrilinear e contém um registro de
eventos mutacionais que ocorreram ao longo da evolução em toda a linhagem
(Mitchell e Hammer, 1996).
Esses fatores fazem com que o estudo de loci polimórficos situados no
cromossomo Y seja muito útil em diferentes abordagens. Os haplótipos podem
ser utilizados para traçar a evolução do cromossomo Y e detectar padrões
geográficos em sua distribuição, permitindo a detecção de conjuntos
característicos de haplótipos específicos de determinadas populações (Mitchell
e Hammer, 1996). São particularmente úteis em estudos populacionais, pois
refletem os efeitos de deriva e migração e auxiliam no entendimento da história
evolutiva e na identificação humana (Seielstad et al., 1994; Jobling e Tyler-
Smith, 1995; Hammer e Zegura, 1996; Underhill et al., 1997; Jobling et al.,
1997; Underhill et al., 2000, 2001; Hammer et al., 2001; Jobling, 2001; Brion et
al., 2004).
Como já explicado, a análise de marcadores binários do cromossomo Y
possibilita a determinação da origem filogeográfica de cada cromossomo
analisado, utilizando o conjunto haplotípico formado pelos alelos de cada locus
estudado (haplogrupo). Quanto maior o poder discriminatório do conjunto de
marcadores, ou seja, quanto mais recentes forem as mutações analisadas,
maior será a capacidade de determinar geograficamente a origem étnica do
cromossomo Y analisado. Os haplogrupos são população-específicos, como
por exemplos, o haplogrupo Q3* que é característico de populações ameríndias
sendo encontrado de acordo com Y - The Y-Chromosome Consortium (YCC,
2002), na América do Norte, Central e do Sul e o haplogrupo R1b8 que possui
origem ancestral Ibérica (Hurles et al., 1999).
Introdução
11
I.2.1.2. DNA mitocondrial
Mitocôndrias são organelas encontradas no citoplasma celular. Seu
número varia conforme a função da célula (Salzano, 2002), possuindo em sua
estrutura uma matriz, uma membrana interna e uma externa (Alvarez et al.,
2001). A quantidade de mitocôndrias varia em função de suas necessidades
energéticas, sendo que uma única célula pode chegar a possuir mais de 5.000
cópias dessa organela (Jobim et al., 1999).
O DNA mitocondrial (DNAmt), um genoma extranuclear, é uma molécula
circular pequena de 16.569 pares de nucleotídeos. Sua seqüência é totalmente
conhecida, sendo que a região codificante contém 37 seqüências
codificadoras, sendo 22 genes para RNA de transferência, 2 para RNA
ribossômico e 13 para proteínas envolvidas na fosforilação oxidativa e na
produção de ATP (Anderson et al., 1981).
Uma das características de interesse em seu estudo é que, semelhante
ao padrão de herança do cromossomo Y, a transmissão é em haplótipos. O
DNA mitocondrial é de herança uniparental materna (Budowle e Brown, 2001;
Alvarez et al., 2001), ocorrendo a transmissão do genoma da mãe para os
filhos sem modificação (Alvarez et al., 2001).
O genoma mitocondrial é idêntico, entre diferentes indivíduos, na maior
parte de sua seqüência. Diferenças de seqüências são encontradas na região
D-loop - uma região de aproximadamente 1100 pares de bases com alta taxa
de mutação, de 5 a 10 vezes maior que no DNA nuclear (Alvarez et al., 2001).
Dentro da região D-loop foram definidas duas regiões denominadas regiões
hipervariáveis I e II. Estas têm sido amplamente utilizadas para investigar a
diversidade dentro e entre as populações.
Os primeiros trabalhos a usar esta abordagem demonstraram uma
grande variabilidade das linhagens mitocondriais humanas entre as populações
e diferenças entre as linhagens de populações de regiões geográficas
diferentes (Vigilant et al., 1989, 1991; Stoneking et al. 1991). Analisando as
mutações pontuais é possível verificar diferenças entre populações de
diferentes regiões geográficas em função das mutações acumuladas e de suas
freqüências (Cavalli-Sforza, 1994).
Introdução
12
As diferenças observadas entre as seqüências de DNA mitocondrial são
devido à presença de mutações. O acúmulo seqüencial de mutações ao longo
do tempo levou à constituição de linhagens independentes, os haplótipos, que
ao serem agrupados definem haplogrupos (Maca-Meyer et al., 2001). Como
exemplo: uma mutação na posição 663 do genoma mitocondrial criou um sítio
para a enzima HaeIII, o qual é utilizado para a definição do haplogrupo A,
independente do restante do genoma.
O DNA mitocondrial de ameríndios modernos é definido primariamente
por quatro conjuntos de mutações específicas que se agrupam em quatro
haplogrupos, denominados A, B, C e D. Um quinto haplogrupo de nativos
americanos, o X, é encontrado no Norte da América do Norte e não está
relacionado ao haplogrupo X europeu (Mishmar et al., 2003). Esse haplogrupo
ocorre em baixas freqüências entre os ancestrais colonizadores das Américas
(Salzano, 2002). Esses cinco haplogrupos (A, B, C, D e X) são responsáveis
por 100% da variação do DNA mitocondrial dos amerínidios nas Américas
(Mishmar et al., 2003).
Grupos humanos principais de DNA mitocondrial são continentais ou
etnicamente específicos. O DNA mitocondrial africano pode ser definido pela
presença do sítio de restrição na posição 3592 definido pela enzima HpaI,
caracterizando o haplogrupo L. Este haplogrupo é o mais divergente de todos
aqueles identificados nas populações humanas. Três haplogrupos maiores (L1,
L2 e L3) são característicos desta origem, sendo que os haplogrupos menores
de L1 (L1a e L1b), de L2 (L2a e L2b) e L3 (L3a, L3b, L3c e L3D) também são
componentes do macrohaplogrupo L*. Destes, o haplogrupo L1 é considerado
o mais ancestral dos haplogrupos africanos, e o L2, o mais recente (Chen et
al., 2000).
A variabilidade genética observada nos haplogrupos europeus de DNA
mitocondrial se encontra categorizada dentro de dez linhagens maiores - H, I,
J, K, M, T, U, V, W e X. Cada um desses haplogrupos foi definido por sítios
polimórficos situados na região codificante do DNA mitocondrial. Estas
linhagens foram derivadas primariamente do macrohaplogrupo N (Torroni et al.,
1996; Mishmar et al., 2002). Ao menos seis destes haplogrupos europeus (H, I,
J, K, T, W) são essencialmente restritos a populações européias. O haplogrupo
Introdução
13
H representa aproximadamente 40,0% do DNA mitocondrial europeu. Estes
provavelmente se originaram depois que os ancestrais europeus tornaram-se
geneticamente separados dos demais (Torroni et al., 1996).
A análise desse tipo de genoma é uma importante ferramenta em
estudos antropológicos, evolutivos e forenses (incluindo tecidos antigos e
arqueológicos), pois uma única célula possui, em média, mais de 5.000 cópias
de DNA mitocondrial e a estrutura circular é resistente à digestão enzimática
(Vigilant et al., 1989; Álvarez et al., 2001). Como existem milhares de cópias de
DNAmt, é mais fácil recuperar a seqüência do que a cópia única do DNA
nuclear por célula. Além disso, a natureza haplóide do DNA mitocondrial o
torna mais fácil para analisar do que o genoma diplóide (Butler e Levin, 1998).
Em decorrência dessas características, em especial herança e distribuição
celular, associado à alta variabilidade genética, o DNA mitocondrial tornou-se
importante em várias áreas além da evolução humana. Tem sido útil em
estudos sobre a origem humana (Cann et al., 1987; Vigilant et al., 1991; Krings
et al., 1997; Gutierres et al., 2002), de evolução humana (Torroni et al., 1996;
Cann et al., 1987; Mateu et al., 1997), estudos da dispersão de populações
pelos continentes (Wallace e Torroni, 1992; Bonato e Salzano, 1997; Mesa et
al., 2000; Pereira et al., 2001), diferenciação de grupos humanos (Chen et al.,
1995; Torroni et al., 1996; Richards et al., 2002; Salas et al., 2002), formação
de populações específicas (Batista-dos-Santos et al., 1999), mistura étnica
(Alves-Silva et al., 2000), identificação humana (Wallace, 1997; Álvarez et al.,
2001; Budowle et al., 2003) e de outras espécies (Wallace, 1997; Höss, 2000),
estudos de evolução dos organismos (Strauss, 1999), antropológicos (Lleonart
et al., 1999) e elucidação de passos envolvidos na biossíntese mitocondrial
(Luft, 1994; Wallace, 1997).
I.3. A população brasileira: um relato genético
A população brasileira, como já relatado anteriormente, teve uma
formação histórica peculiar, o que refletiu em uma estrutura genética
populacional complexa. O país apresenta ainda nos dias de hoje populações
isoladas e semi-isoladas, como populações indígenas, em especial na
Introdução
14
Amazônia (Zago et al., 1996), e remanescentes de quilombos dispersos pelo
país (Cayres-Vallinoto et al., 2003; Oliveira et al., 2003; Cotrim et al., 2004). No
início dos estudos de genética de população no país, um grande enfoque foi
dado ao estudo das populações ameríndias. Porém, a análise de populações
urbanas brasileiras remonta também ao início com o trabalho pioneiro de
Krieger et al. (1965) sobre mistura gênica em migrantes do nordeste brasileiro.
A análise de populações urbanas dispersas pelo país tem referenciado a
grande heterogeneidade da população brasileira. A mistura gênica tem sido
estudada com base nas diferenças e similaridades das freqüências gênicas de
marcadores genéticos entre as populações de interesse e suas populações
parentais (grupos étnicos parentais). Existe uma série de trabalhos na literatura
relacionados à contribuição genética estimada para as várias regiões
brasileiras, com a utilização de marcadores genéticos clássicos, em especial
proteínas. Os dados genéticos, em geral, corroboram os dados históricos. Por
exemplo, de acordo com análises de mistura, utilizando marcadores
polimórficos clássicos (grupos sangüíneos, proteínas séricas e eritrocitárias), a
contribuição ameríndia estimada em populações miscigenadas varia de 55,0%
na população de Alenquer (Santos e Guerreiro, 1995) no Norte do país a 5,0%
em Santa Catarina (Dornelles et al., 1999) no Sul.
Estimativas baseadas em microssatélites mostram uma maior
similaridade na comparação das contribuições das diferentes regiões do país,
porém ainda mantém o quadro global. Apesar da contribuição ameríndia ainda
ser maior no Norte do país (18%) e menor no Sul (7%), a contribuição européia
varia pouco e a africana é similar. Com relação a região Centro-Oeste
brasileira, o único trabalho até o momento tratando do assunto, utilizando
microssatélites autossômicos, relata situação similar à encontrada no resto do
país: maior presença européia, seguida de africana e finalmente ameríndia
(Callegari-Jacques et al., 2003). Essa maior similaridade observada pode ser
decorrente do tipo de amostragem realizada no trabalho de Callegari-Jacques
et al. (2003), que utilizaram amostras de investigação de paternidade de uma
firma particular, associado ao fato dos marcadores microssatélites
apresentarem um diferencial de freqüência entre as populações parentais muito
baixo.
Introdução
15
A filogeografia de linhagens do cromossomo Y brasileiro foi analisada
em 247 indivíduos de quatro das cinco regiões brasileiras, isso é, sem
contemplar a região Centro-Oeste e utilizando uma amostra de indivíduos
autodefinidos como “brancos” (Carvalho-Silva et al., 2001). Em uma outra
análise, a heterogeneidade do cromossomo Y em populações afro-brasileiras
foi investigada utilizando 209 indivíduos dos estados da Bahia e São Paulo
(Abe-Sandes et al., 2004).
No Brasil, algumas populações foram estudadas para se conhecer a
distribuição dos haplogrupos de DNA mitocondrial com o objetivo de
caracterizá-las (Bortolini et al., 1997; Alves-Silva et al., 2000; Bandelt et al.,
2001). Quatro regiões geográficas brasileiras foram também investigadas
acerca da ancestralidade de linhagens do DNA mitocondrial, para um total de
247 amostras de indivíduos autodeclarados como “brancos” novamente sem
contemplar a região Centro-Oeste (Alves-Silva et al., 2000).
A grande contribuição desses artigos foi relatar que o processo de
miscigenação no Brasil foi peculiar, pois o padrão de reprodução foi
preferencial. Os resultados mostram que as patrilinhagens foram
essencialmente européias, enquanto que as matrilinhagens foram
principalmente ameríndias e africanas (Alves-Silva et al., 2001; Carvalho-Silva
et al., 2001; Abé-Sandes et al., 2004). Dessa forma, a análise de marcadores
de herança uniparental tem corroborado com dados históricos que relatam o
cruzamento preferencial entre homens de origem européia e mulheres de todas
as origens, com baixa participação dos homens das demais origens na
constituição da população atual (Bortolini et al., 1999; Alves-Silva, 2000;
Carvalho-Silva et al., 2001; Abé-Sandes et al., 2004; Grattapaglia et al., 2005).
Portanto, é possível observar que pode haver diferença em respostas à mesma
questão quando marcadores de diferentes níveis hierárquicos são empregados.
Dentre as regiões do país, considerando marcadores uniparentais, a
menos extensamente estudada é a região Centro-Oeste. A diversidade
haplotípica do cromossomo Y foi avaliada nas cinco regiões brasileiras,
contemplando a região Centro-Oeste com 48 indivíduos investigados, porém
sem enfocar a questão de mistura genética (Grattapaglia et al., 2005). A
caracterização uni e bi-parental, baseada respectivamente, em haplótipos de
Introdução
16
cromossomo Y e marcadores nucleares autossômicos, para populações do
Centro-Oeste permitirá obter informações sobre a proporção da incorporação
de alelos ameríndios, europeus e africanos na formação da população dessa
região, complementando pesquisas históricas e etnográficas.
Objetivos
17
II. OBJETIVOS
O estudo de marcadores uniparentais em populações urbanas pode
contribuir para um melhor entendimento do processo de formação histórica de
uma dada região. O presente trabalho visa avaliar a constituição genética
amostral de duas populações urbanas, Estado de Goiás e Distrito Federal
pertencentes à região Centro-Oeste brasileira e estimar a contribuição parental
na constituição das mesmas, utilizando marcadores uniparentais paternos e
maternos: Cromossomo Y e DNA mitocondrial. Considerando-se as
características peculiares a esses marcadores moleculares, estabelecemos
como objetivos:
01. Analisar a variabilidade genética e a diferenciação populacional amostral
das populações de Goiás e Distrito Federal quanto a:
a. Doze marcadores genéticos bialélicos situados na região
específica do cromossomo Y;
b. Haplogrupos obtidos da análise de marcadores bialélicos
(cromossomo Y);
c. Quatro microssatélites Y-específicos;
d. Haplótipos obtidos da análise de marcadores microssatélites
acrescidos da inserção AluYAP;
e. Associação dos dados referentes ao cromossomo Y
(SNPs/STRs/AluYAP);
f. Quatorze marcadores genéticos bialélicos situados no DNA
mitocondrial;
g. Haplogrupos obtidos da análise de marcadores situados no DNA
mitocondrial;
02. Análise filogeográfica do cromossomo Y;
03. Comparar os dados uniparentais gerados;
Objetivos
18
04. Estimar a contribuição dos três grupos parentais principais na formação
das duas populações utilizando:
a. Haplótipos de STR/AluYAP;
b. Haplogrupos de cromossomo Y;
c. Haplogrupos de DNA mitocondrial;
05. Estimar a constituição genética individual quanto às linhagens maternas
e paternas;
06. Comparar as estimativas geradas de mistura genética entre elas e com
os dados de outras regiões brasileiras.
Material e Métodos
19
III. MATERIAL E MÉTODOS
III.1. Populações
A região Centro-Oeste brasileira é composta por três estados – Goiás,
Mato Grosso e Mato Grosso do Sul – e pelo Distrito Federal. Esse trabalho
enfocou a análise de amostras de duas populações dessa região: Estado de
Goiás e Distrito Federal.
O Estado de Goiás possui uma área territorial oficial de 340.086.698
Km
2
, dividida em 5 mesorregiões e 18 microrregiões administrativas (Figura
III.1). Já o Distrito Federal, composto por 23 regiões administrativas
(considerando Lago Norte e Lago Sul como duas regiões distintas), localiza-se
geograficamente dentro da região Centro-Oeste com uma área territorial oficial
de 5.801.937 Km
2
, de acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE). Na época da coleta, o Distrito Federal era composto por 20
regiões administrativas (Figura III.2).
A população urbana é bem maior (~88% em Goiás e 96% no Distrito
Federal) que a população rural. O número de habitantes do sexo masculino é
levemente inferior em relação aos do feminino no meio urbano, ocorrendo em
forma inversa no meio rural. O Estado de Goiás possui mais do que o dobro do
número de habitantes do Distrito Federal. A soma das duas populações
compõe 60,6% do total de habitantes da região Centro-Oeste (Tabela III.1).
Com relação à distribuição por faixas etárias, os indivíduos com idade de
15 a 64 anos constituem o maior percentual da população residente nas duas
populações analisadas. As demais faixas etárias mostram-se em percentuais
bem menores e semelhantes para as duas populações (Tabela III.2).
Importante salientar que o Distrito Federal foi fundado oficialmente em 1960,
portanto indivíduos nascidos anteriormente a essa data são considerados
migrantes.
Material e Métodos
20
3
4
10
12
I - Mesorregião do Noroeste Goiano
1 - Microrregião do São Miguel do Araguaia
2 - Microrregião do Rio Vermelho
3 - Microrregião do Aragarças
II - Mesorregião do Norte Goiano
4 - Microrregião do Porangatu
5 - Microrregião da Chapada dos Veadeiros
III - Mesorregião do Centro Goiano
6 - Microrregião de Céres
7 - Microrregião de Anápolis
8 - Microrregião de Iporá
9 - Microrregião de Anicuns
10 - Microrregião de Goiânia
IV - Mesorregião do Leste Goiano
11 - Microrregião do Vale do Paranã
12 - Microrregião do Entorno de Brasília
V - Mesorregião do Sul Goiano
13 - Microrregião do Sudeste de Goiás
14 - Microrregião do Vale do Rio dos Bois
15 - Microrregião do Meia Ponte
16 - Microrregião do Pires do Rio
17 - Microrregião de Catalão
18 - Microrregião de Quirinópolis
13
14
15
16
17
18
11
9
7
6
5
2
1
DF
GO
Figura III.1 - Mesorregiões e microrregiões que compõem o Estado de Goiás
(Mapa: Albani Borges dos Reis).
Figura III.2 - Regiões Administrativas que compunham o Distrito Federal à
época da coleta de material biológico (Fonte: Codeplan, 1997).
Quatro outras regiões administrativas foram criadas desde então:
Park Way (2003), Setor Complementar de Indústria e
Abastecimento (2004), Sobradinho II (2004) e Itapoã (2005) (sítio
oficial do Governo do Distrito Federal –
www.distritofederal.df.gov.br acessado em 31/01/2006), as quais
não estão representadas no presente mapa.
Material e Métodos
21
Tabela III.1 – Distribuição dos habitantes do Estado de Goiás e do Distrito
Federal por gênero (masculino e feminino), região (urbana ou
rural), contingente total em cada população e na região Centro-
Oeste como um todo (Dados IBGE – censo 2000 –
www.ibge.gov.br).
Goiás Distrito Federal Centro-Oeste
População
Urbano Rural Total Urbano Rural Total Total
Masculino 2.160.766 331.672 2.492.438 933.839 47.517 981.356 5.801.005
Feminino 2.235.879 274.911 2.510.790 1.027.660 42.130 1.069.790 5.835.723
Total 4.396.645 606.583 5.003.228 1.961.499 89.647 2.051.146 11.636.728
Tabela III.2 - Proporção da população residente, por faixas etárias, no Estado
de Goiás e no Distrito Federal, conforme dados do IBGE (2000).
Faixa etária Goiás (%) Distrito Federal (%)
0 – 14 anos 29,32 28,43
15 – 64 anos 66,00 68,28
> 65 anos 4,68 3,29
III.2. Coleta de material biológico e dados demográficos
A coleta de material biológico foi aprovada pela Comissão Nacional de
Ética em Pesquisa (CONEP). O protocolo específico desse trabalho foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Saúde da
Universidade de Brasília sob o número de registro CEP-FM 024/2005.
Estado de Goiás
Para a realização das coletas das amostras do Estado de Goiás, foram
selecionados 43 municípios (Tabela III.3) com base na densidade populacional
dos mesmos (dados do IBGE – 1996). Os municípios selecionados foram
visitados no período de 07/02/2000 a 09/06/2000.
Material e Métodos
22
Os critérios básicos para a escolha dos voluntários em cada município
foram: idade acima de 18 (dezoito) anos ou com autorização paterna/materna e
ter nascido no local onde a coleta estava sendo processada. Com a finalidade
de descartar consangüinidade entre os voluntários, foram realizadas
entrevistas com os participantes da pesquisa antes da coleta das amostras.
Cada indivíduo assinou um “Termo de Consentimento de Investigação” (Anexo
1) de acordo com as normas da CONEP. Do total de duzentos doadores foram
selecionadas 129 de indivíduos do sexo masculino. A faixa etária média dos
indivíduos que compuseram a amostra foi de 32,6 anos (D.P. ± 10,5) à época
da coleta.
Distrito Federal
Como a fundação do Distrito Federal ocorreu em 1960,
conseqüentemente o povoamento humano efetivo deu-se após essa data. Por
esse motivo, foi estabelecido como critério básico de seleção que o local de
residência dos pais fosse no Distrito Federal na data de nascimento do
indivíduo. O critério de idade superior aos 18 anos ou com autorização dos pais
foi também seguido.
Similarmente à coleta do Estado de Goiás, os voluntários também foram
esclarecidos sobre o projeto e solicitados a assinarem um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2). Paralelamente a isso, foi
aplicado um questionário demográfico visando à obtenção de dados referentes
à taxa de migração e grau de miscigenação étnica. As informações coletadas
referiram-se também, no mínimo, a uma geração ascendente (Anexo 3).
A coleta de dados e de sangue venoso dos voluntários ocorreu durante o
ano de 2002. Foi coletado um total de 71 indivíduos do sexo masculino com
faixa etária média de 21,6 anos (D.P. ± 3,8) à época da coleta, sendo que
53,5% dos indivíduos se autodeclararam brancos, 39,3% pardos, 3,6% negros
e 3,6 % amarelos perfazendo uma amostragem de 13 regiões administrativas
do Distrito Federal (Tabela III.4).
Material e Métodos
23
Tabela III.3 – Distribuição dos indivíduos do Estado de Goiás de acordo com as
mesorregiões, microrregiões, municípios coletados e sua
densidade populacional.
Mesorregião Microrregião Municípios coletados População Nº amostras
Crixás 14.801 1
São Miguel do Araguaia
São M. Araguaia 21.980 1
GOIÁS
28.170 2
Itapirapuã 9.264 1
Rio Vermelho
Jussara 18.713 1
Noroeste
Goiano
Aragarças Aragarças 18.205 1
Minaçú 37.044 2
Porangatu 39.011 3
Porangatu
Uruaçu 33.514 2
Campos Belos 16.009 1
Norte Goiano
Chapada Veadeiros
São João da Aliança 15.986 1
Ceres 20.292 2
Goianésia 48.165 4
Ceres
Itapuranga 27.677 3
Anápolis 282.197 7
Inhumas 41.726 2
Anápolis
Jaraguá 30.651 2
Fazenda Nova 7.832 1
Iporá
Iporá 32.537 2
Firminópolis 9.605 1
Anicuns
São L.M. Belos 25.684 2
Aparecida de Goiânia 324.662 10
Goiânia 1.056.330 23
Centro
Goiano
GOIÂNIA
Trindade 78.222 1
Iaciara 10.163 1
Vão do Paranã
Posse 25.764 2
Águas L. de Goiás 89.200 6
Luziânia 125.597 6
Leste Goiano
Entorno de Brasília
Valparaízo de Goiás 88.734 5
Jataí 78.945 3
Mineiros 35.096 2
Sudoeste de Goiás
Rio Verde 107.755 7
Acreúna 15.945 1
Indiara 12.718 1
Vale do Rio dos Bois
Palmeiras de Goiás 18.377 2
Caldas Novas 45.222 3
Itumbiara 81.823 6
Meia-Ponte
Morrinhos 33.922 3
Silvânia 19.513 1
Pires do Rio
Vianópolis 9.911 1
Corumbaíba 6.216 1
Catalão
Ipameri 22.856 1
Sul Goiano
Quirinópolis Quirinópolis 35.857 1
Fonte: Censo Demográfico do Brasil publicado no diário oficial da União em 30/08/1999 –
Trabalho realizado através da Gerência de Serviços Técnicos e Urbanísticos. Setor de Serviços
Cartográficos e Geográficos – 1996 – EMCIDEC.
Material e Métodos
24
Tabela III.4 – Distribuição dos doadores do Distrito Federal de acordo com a
região administrativa de moradia dos pais à época do
nascimento do sujeito da pesquisa.
Regiões administrativas Número de amostras
Asa Norte 09
Asa Sul 10
Ceilândia 03
Cruzeiro 05
Brazlândia 03
Gama 05
Guará 06
Planaltina 07
Sobradinho 06
Taguatinga 06
Núcleo Bandeirante 03
Lago Sul 03
Lago Norte 05
III.3. Processamento e conservação da amostra e extração de DNA
As amostras biológicas foram obtidas com sistema de coleta a vácuo,
utilizando EDTA como anticoagulante. Estas foram processadas para
estocagem após a coleta (Anexo 4) e encontram-se armazenadas em freezer à
temperatura de 20
0
C negativos na Universidade de Brasília, no Laboratório de
Genética. Para extração do DNA foram utilizados três protocolos alternativos:
(i) Higuchi (1989), (ii) GFX
TM
Genomic Blood DNA purification kit (Pharmacia) e
(iii) Puregene kit – Gentra systems (Biosystems) (Anexo 5).
Após a extração, as amostras de DNA foram analisadas quanto ao seu
estado de integridade e quanto à concentração, utilizando-se gel de agarose a
0,8% e coloração com Brometo de Etídeo - EtBr (Anexo 6).
III.4. Marcadores genéticos
Para a análise das amostras coletadas foram utilizados marcadores
uniparentais situados no cromossomo Y e no DNA mitocondrial. Os resultados
das análises de marcadores genéticos uniparentais permitem a construção de
haplótipos e, por conseguinte, a reconstrução da genealogia dos loci. Estes loci
são freqüentemente utilizados na análise de genética de populações para
Material e Métodos
25
esclarecer questões evolutivas e da estrutura populacional (Roewer et al.,
1992).
Para a análise laboratorial de todos os marcadores do cromossomo
Y e do DNA mitocondrial, os segmentos de interesse foram inicialmente
amplificados através da técnica da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
(Saiki et al., 1986; Mullis, 1990), a qual encontra-se descrito no Anexo 7. Uma
das grandes vantagens dessa técnica é o potencial de utilização de DNA
degradado, quantidades mínimas de DNA e independência da manipulação de
materiais marcados radioativamente (Budowle e Monson, 1993).
As amplificações foram realizadas com um volume total de 25,0 μl. A
quantidade de cada um dos reagentes variou para alguns sistemas. Para cada
marcador genético há uma seqüência de iniciadores (primers) que são de suma
importância para o processo de amplificação, pois estes iniciadores anelam-se
às seqüências flanqueadoras do locus a ser analisado e fornecem a base para
o início da ação da polimerase. Os produtos das amplificações foram
visualizados em gel de agarose em uma concentração de 1%, corados com
brometo de etídeo.
III.4.1. Cromossomo Y
Foram analisadas três categorias de marcadores genéticos –
inserção Alu, SNP e STR - localizadas na região não-recombinante do
cromossomo Y, totalizando dezesseis loci uniparentais masculinos.
III.4.1.1. Elemento Alu
Dentre as inserções Alu encontradas no cromossomo Y humano
está o polimorfismo no locus DYS287–AluYAP (Y Chromosome Alu
Polymorphism) situado na região Yq11 do cromossomo Y. A região genômica
de interesse foi amplificada, via PCR, utilizando os iniciadores (Tabela III.5). A
presença ou ausência dessa inserção foi avaliada após eletroforese vertical em
gel de poliacrilamida 6% e coloração por nitrato de prata dos produtos de
amplificação (Anexo 10).
Material e Métodos
26
III.4.1.2. Marcadores binários
Foram analisados onze SNPs Y-específicos: 92R7, M89, M213, P2,
SRY2627, SRY4064, M2, M3, M60, M34 e P3, que permitem a construção de
haplogrupos e a definição da origem geográfica dos indivíduos amostrados, de
acordo com o descrito na literatura. A Tabela III.5 mostra os marcadores
binários analisados e a mutação que caracteriza o locus, a seqüência dos
iniciadores utilizados, a temperatura de pareamento, o tamanho do fragmento
amplificado e a enzima de restrição utilizada para genotipagem. A metodologia
utilizada para análise de grande parte desses SNPs foi amplificação de regiões
genômicas específicas por PCR seguida de digestão enzimática (Anexo 7). Os
marcadores M89, M213, P2, M60, M34 e P3 foram analisados por
seqüenciamento direto utilizando o Kit Big Dye Terminator, específico para o
equipamento da Perkin-Elmer ABI 377.
A maioria dos marcadores bialélicos foi identificada genotipicamente
de acordo com a hierarquia, baseada na filogenia relatada no Y - The Y-
Chromosome Consortium (YCC, 2002) para haplogrupos binários do
cromossomo Y.
Os marcadores moleculares 92R7, M89, M213, P2, SRY2627,
SRY4064, M2, M3, M60, M34 e P3 (Tabela III.5) foram analisados no
Laboratório de Clonagem da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto
(Universidade de São Paulo), no ano de 2004. Os segmentos de interesse
foram amplificados por PCR utilizando um termociclador “Perkin Elmer-Cetus
9600”. As condições da reação de PCR para todos os SNPs encontram-se
descrito no Anexo 7.
Os resultados das amplificações dos SNPs 92R7, SRY2627, SRY4064,
M2 e M3 foram analisados através da técnica de RFLP. Esta técnica consiste
em amplificar as regiões de interesse do DNA e submeter à digestão
enzimática, utilizando-se enzimas específicas para cada marcador. Os
produtos da digestão foram identificados utilizando-se géis de poliacrilamida a
6%, corados com nitrato de prata, ou géis de agarose, com concentrações que
variaram de 2 a 3%, conforme o tamanho e o número dos fragmentos, corados
com Brometo de etídeo (Anexo 8). Após, eram analisados o fenótipo de cada
amostra.
Material e Métodos
27
Tabela III.5 - Relação dos marcadores binários analisados, mutação característica do locus, seqüência dos iniciadores utilizados,
temperatura de pareamento, tamanho do fragmento amplificado e enzima de restrição utilizada.
Marcador Mutação característica Iniciadores TA SA (pb) Enzima Referência
92R7
C⇒T
5’- GAC CCG CTG TAG ACC TGA CT -3’
5’- GCC TAT CTA CTT CAG TGA TTT CT -3’
62°C 709 HindIII Hurles et al. (1999)
M89
C⇒T
5’ – AGA AGC AGA TTG ATG TCC CAC T – 3’
5’ – TCC AGT TAG GAG ATC CCC TCA – 3’
59°C 527 * Underhill et al., (2000)
M213
T⇒C
5’ – TAT AAT CAA GTT ACC AAT TAC TGG – 3’
5’ – TTT TGT AAC ATT GAA TGG CAA A – 3’
56°C 409 * Underhill et al., (2000)
P2
C⇒T
5’- GAT GCA AAT GAG AAA GAA CT -3’
5’- CTA AAA ACT GGA GGG AGA AA -3’
51°C 536 * Hammer et al.(1997 e 1998)
SRY2627
C⇒T
5’- CGC GGC TTT GAA TTT CAA GCT CTG -3’
5’- CCA GGG CCC CGA GGG ACT CTT –3’
54°C 391 BanI Underhill et al. (2000)
SRY4064
G⇒A
5’- ACA GCA CAT TAG CTG GTA TGA C -3’
5’- TCT CTT TAT GGC AAG ACT TAC G -3’
60°C 509 BsrBI Santos et al. (1999)
M2
A⇒G
5' - AGG CAC TGG TCA GAA TGA AG -3'
5' - AAT GGA AAA TAC AGC TCC CC -3'
57°C 209 NlaIII Seielstad et al. (1994)
M3
C⇒T
5' - TAA TCA GTC TCC TCC CAG CA -3'
5' - AGG TAC CAG CTC TTC CCA AAT -3'
61°C 202 MfeI Santos et al., (1999)
M60 insT
‘5’ – GCA CTG GCG TTC ATC ATC T – 3’
5’ – ATG TTC ATT ATG GTT CAG GAG G – 3’
55°C 388 * Underhill et al., (2000)
M34
C⇒T
5’- CAC TTC ACA TTT GTT TTT AGG -3’
5’- AGT CAT TAT TTA GTC ATT CCA G -3’
49°C 372 * Underhill et al. (2000)
P3
G⇒A
5’- GAT GCA AAT GAG AAA GAA CT -3’
5’- CTA AAA ACT GGA GGG AGA AA -3’
51°C 536 * Hammer et al.(1997 e 1998)
YAP
(DYS287)
-⇒+
5'- CAG GGA AGA TAA AGA AAT A -3'
5'- CTG CTA AAA GGG GAT GGA T -3'
51°C 450 **
Hammer (1994)
*seqüenciamento; **visualização direta do produto amplificado; TA – temperatura de pareamento; SA – Tamanho do segmento
amplificado
Material e Métodos
28
III.4.1.3 Marcadores do tipo STR
Os loci STR selecionados foram do tipo tetranucleotídeos: loci DYS19
(também conhecido como DYS394), DYS390, DYS391 e DYS393. As principais
características destes marcadores, como constituição da seqüência cerne repetida,
número de alelos descritos na literatura e localização cromossômica, dentre outros,
estão mostrados na Tabela III.6. A figura III.3 ilustra as localizações dos quatro STRs
analisados no cromossomo Y humano.
Após a realização da técnica de PCR, os produtos da amplificação dos
sistemas de microssatélites e do elemento Alu foram analisados em gel vertical de
poliacrilamida 10%, sendo utilizado o gel desnaturante para os microsatélites e não-
desnaturante, com glicerol, para o marcador AluYAP. No anexo 10 estão os
protocolos de preparo dos géis utilizados.
A análise desses loci foi realizada no Laboratório de Genética da
Universidade de Brasília (UnB), utilizando um aparelho termociclador PT-100 MJ
(Research, Inc). As condições da reação de PCR para estes marcadores estão
descritas no Anexo 7.
Construção dos haplótipos de STRs e haplogrupos de SNPs
Os alelos de STRs foram nomeados de acordo com o número de repetições
da seqüência cerne, conforme sugerido por Roewer et al. (1992) e Kayser et al.
(1997a). Para a construção dos haplótipos de STRs, utilizamos a seqüência sugerida
por Kayser et al. (1997a). O marcador YAP foi utilizado no intuito de se distinguir
dois grupos de haplótipos: YAP+ (presença de inserção) e YAP- (ausência de
inserção).
Para a construção dos haplogrupos utilizamos marcadores moleculares que
conseguissem distinguir os três grupos parentais que colonizaram a região (europeu,
africano e ameríndio). As seqüências desses marcadores são as descritas de acordo
com Hurles et al. (1999), Underhill et al., (2000), Hammer et al.(1997 e 1998), Santos
et al. (1999), Seielstad et al. (1994), Hammer (1994), conforme a Tabela III.5.
Material e Métodos
29
Tabela III.6 - Relação dos loci gênicos do tipo STRs do cromossomo Y analisados,
seqüência dos iniciadores, temperatura de pareamento, segmento
amplificado, repetição e localização cromossômica.
Locus
Iniciadores*
TA
(ºC)
SA
(pb)
Repetição
N
0
alelos
Localização
DYS19
5’ – CTA CTG AGT TTC TGT TAT AGT - 3’
5’ – ATG GCA GTA GTG AGG ACA – 3’
58 e 54 186-202 CTAT 5 Yp11,2
DYS390
5' - TAT ATT TTA CAC ATT TTT GGG CC - 3'
5' - TGA CAG TAA AAT GAA CAC ATT GC - 3'
63 e 58 199-227 CTAT 8 Yq11,23
DYS391
5' - CTA TTC ATT CAA TCA TAC ACC CA - 3'
5' - GAT TCT TTG TGG TGG GTC TG - 3'
63 e 58 275-291 CTAT 5 Yq11,21
DYS393
5' - GTG GTC TTC TAC TTG TGT CAA TAC - 3'
5' - AAC TCA AGT CCA AAA AAT GAG G –3’
63 e 58 120-132 GATA 4 Yp11,3
TA – temperatura de pareamento; SA – Segmento amplificado.
* O iniciador DYS19 foi desenhado por Roewer et al.(1992) e, os demais por Kayser et al.
(1997a).
17
24
23
22
21
20
19
18
PAR2
12
DYS390
DYS391
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
PAR1
centrômero
DYS19
Yq
Yp
DYS393
11.3
11.2
11.21
11.23
Figura III.3 - Estrutura do cromossomo Y humano e a localização dos quatro STRs
analisados
Material e Métodos
30
III.4.2. DNA mitocondrial
Os marcadores genéticos localizados no DNA mitocondrial pertencem
basicamente a duas categorias: SNPs e Inserções/Deleções (Indels). Os SNPs
podem ser identificados por seqüenciamento ou, alternativamente, pela análise dos
produtos amplificados via PCR seguido de digestão enzimática, os denominados
RFPL (Restriction Fragment Length Polymorphisms) (Torroni et al., 1994; Chen et
al., 1995). Nesse caso, os SNPs são identificados através da presença ou ausência
de sítios de reconhecimento das enzimas de restrição as quais podem “cortar” o
DNA (dependendo da presença ou ausência do nucleotídeo em uma dada região)
(Salzano, 2002). O conjunto de resultados para o genoma de um dado indivíduo
permite a construção de haplogrupo de DNA mitocondrial (Chen et al., 1995).
Para a definição dos haplogrupos do DNA mitocondrial dos indivíduos
foram analisados 13 SNPs localizados na região codificadora do DNA mitocondrial e
uma deleção de 9pb em um pequeno segmento não codificante, entre os genes
COII/tRNALys. Para ambas categorias de marcadores foi empregada a técnica de
PCR para amplificação de fragmentos específicos. Para análise dos SNPs, os
fragmentos foram digeridos por endonucleases específicas e características para a
definição dos haplogrupos (HaeIII, HincII, AluI, HinfI, MboI, TaqI, DdeI, BstNI, HaeII e
BamHI). Os fragmentos, tanto os da amplificação direta como da digestão
enzimática, foram separados em eletroforese para genotipagem.
III.4.2.1 Marcadores situados no DNA mitocondrial
O protocolo da PCR e a quantidade dos reagentes utilizados para
amplificação em todos os marcadores situados no DNA mitocondrial estão descritos
no Anexo 7.
Os produtos de PCR foram visualizados em gel de poliacrilamida a 6%
corados, com nitrato de prata ou em gel de agarose com concentração de 2% ou
3%, corado com brometo de etídeo (Anexo 10).
A relação dos haplogrupos, iniciadores utilizados para amplificação dos
segmentos e das enzimas utilizadas na digestão, estão listados na Tabela III.7. Os
Material e Métodos
31
SNPs foram analisados por PCR-RFLP de acordo com Chen et al. (1995) e Torroni
et al. (1996).
As digestões foram feitas com endonucleases apropriadas seguindo as
especificações dos fabricantes (Gibco BRL ou Biolabs) e obedeceram a uma
hierarquia:
1. As amostras das populações de Goiás e Distrito Federal foram
testadas, de conformidade com os dados de seu povoamento, para a
mutação HpaI 3.592; quando positivas, foram testadas para os
subhaplogrupos L: L1 e L2;
2. Quando os resultados foram negativos para HpaI na posição 3.592,
foram testadas para os haplogrupos L3a, L3b, L3c e L3d.
3. As amostras negativas para esses haplogrupos foram então testadas
para os demais haplogrupos;
4. As amostras positivas para + 663 HaeIII foram definidas como
pertencentes ao haplogrupo A;
5. As amostras positivas para deleção de 9pb foram testadas para os
subhaplogrupos L3.
6. As amostras que foram negativas para os haplogrupos descritos
acima foram testadas para outros haplogrupos que também
caracterizavam ameríndios e europeus.
Material e Métodos
32
Tabela III.7 - Relação dos haplogrupos analisados, iniciadores, temperatura de pareamento, segmento amplificado, polimorfismos
analisados por digestão enzimática para caracterização dos haplogrupos de DNA mitocondrial e sua distribuição
geográfica. As amplificações foram feitas utilizando-se iniciadores específicos e as condições descritas por Torroni et al.
(1992, 1993 e 1996).
Haplogrupo
Mutação
característica
Iniciadores
TA
(ºC)
SA
(pb)
Enzima
Distribuição geográfica do
haplogrupo
A +663
5’-ACC TCC TCA AAG CAA TAC ACT G-3’
5’-GTG CTT GAT GCT TGT TCC TTT TG-3’
52 176 HaeIII América/Ásia
B Deleção 9pb
5’-ATG CTA AGT TAG CTT TAC AG-3’
5’-ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC-3’
49 178 -- América/Ásia
C -13259
5’-CGC CCT TAC ACA AAA TGA CAT CAA-3’
5’-TCC TAT TTT TCG AAT ATC TTG TTC-3’
50 208 HincII América/Ásia
D -5176
5’-TAA CTA CTA CCG CAT TCC TA-3’
5’-AAA GCC GGT TAG CGG GGG A-3’
51 146 AluI América/Ásia
L +3592
5’-CGC TGA CGC CAT AAA ACT CT-3’
5’-GAG ATT GTT TGG GCT ACT GCT-3’
56 255 Hpal África Subsaariana
L1 +10.806
5’-CCA ACA CAT ATG GCC TAG ACT-3’
5’-GGT TGG GGA ACA GCT AAA TA-3’
50 210 HinfI África Subsaariana
L2 -10.806
5’-GGA ACG TGT GGG CTA TTT AGG-3’
5’-GCC CGA ATG ATA TTT CC-3’
54 994 HinfI África Subsaariana
L3a +2349
5’-AAC ACA AAG CAC CCA ACT TAC ACT TAG
GA-3’
52 278 MboI África Subsaariana
Material e Métodos
33
Haplogrupo
Mutação
característica
Iniciadores
TA
(ºC)
SA
(pb)
Enzima
Distribuição geográfica do
haplogrupo
5’-CTT TGG CTC TCC TTG CAA AGT-3’
L3b* -8616
5’-AAC CCT GAG AAC CAA AAT GAA CGA-3’
5’-ATG GGG ATA AGG GGT GTA GGT-3’
54 434 MboI África Subsaariana
L3c +10084
5’-CGA AGC CGC CGC CTG ATA CTG G-3’
5’-GTA GTA AGG CTA GGA GGG TG-3’
50 818 TaqI África Subsaariana
L3d -10394
5’-TCC TTT TAC CCC TAC CAT GAG-3’
5’-ATT ATT CCT TCT AGG CAT AGT AG-3’
49 309 DdeI África Subsaariana
H -7025
5’-AAG CAA TAT GAA ATG ATC TGC-3’
5’-CGT AGG TTT GGT CTA GG-3’
53 241 AluI Europa
K -9052
5’-CCT AGC CAT GGC CAT CC-3’
5’-GGC TTA CTA GAA GTG TGA AAA C-3’
52 355 HaeII Europa
J -13704
5’-CCT CCC TGA CAA GCG CCT ATA GC-3’
5’-CTA GGG CTG TTA GAA GTC CT-3’
52 260 BstNI Europa
T +13366
5’-GCT TAG GCG CTA TCA CCA C-3’
5’-ATA TCT TGT TCA TTG TTA AG-3’
48 231 BamHI Europa
* Iniciador desenhado no Laboratório de Clonagem do Hemocentro – RP – SP
Material e Métodos
34
III.5. Análise estatística
Para a análise dos dados obtidos no presente estudo, considerando
tanto os marcadores Y-específicos, quanto os situados no DNA mitocondrial,
realizamos algumas análises em comum, a saber:
1. A análise da estimativa da freqüência de cada marcador e do
haplogrupo para os marcadores analisados no presente estudo, foi realizada
pelo método de contagem direta, de acordo com a equação:
pi= ni/n , onde ni é o número de ocorrências (freqüência absoluta do
haplogrupo i na amostra) e n é o número total de indivíduos amostrados.
2. As freqüências alélicas e haplotípicas e seus desvios padrão foram
calculados utilizando o programa Arlequin 2000 (Schneider et al., 2000). Este
cálculo foi baseado em tabelas de contingências geradas para cada locus,
onde se analisam o número de populações estudadas e o número de alelos
para o locus.
3. Para análise da variância molecular foi também utilizado o programa
Arlequin 2000 (Schneider et al., 2000). A análise de variância molecular
(AMOVA) (Excoffier et al., 1992) foi aplicada para analisar a distribuição da
diversidade intra e interpopulacional.
A entrada dos dados no programa ARLEQUIN pode ser realizada pelos
tipos de dados: DNA, RFLP, MICROSAT, STANDART ou FREQÜÊNCIA. Em
nosso conjunto de marcadores utilizamos três alternativas: RFLP, Microsat e
freqüência.
Quando da análise de haplótipos conjugados STRs/SNPs foi escolhido a
opção MICROSAT no programa ARLEQUIN v.2000, pois esta permite
enquadrar alelos múltiplos. No entanto, os loci de marcadores binários, que
deveriam ser analisados como RFLPs, foram adaptados para representarem
microssatélites. Ou seja, o Estado ancestral e o derivado foram identificados
como números, 10 e 11, que representavam os dois alelos.
4. Para o cálculo da diversidade gênica por locus foi utilizado o programa
PopGENE (versão 1.32, 1997) disponível gratuitamente no sítio
http://www.ualberta.ca/~fyeh/ . A diversidade gênica é uma medida de variação
Material e Métodos
35
gênica, similar a heterozigose para locus do genoma de uma população (Nei,
1973).
5. Para avaliar se há ou não diferença entre as proporções obtidas
quanto às contribuições parentais na constituição das populações do Distrito
Federal e Goiás, foi utilizado o teste z. O teste foi realizado utilizando uma
planilha em Excel, correlacionando as proporções par a par entre cada origem
geográfica. Para todos os casos foi considerado como hipótese nula a
igualdade entre as proporções e um nível de significância de 5%.
Cromossomo Y
Como já explicitado, no presente trabalho foram investigadas duas
categorias de marcadores genéticos - binários (a inserção AluYAP e do tipo
SNPs) e microssatélites, todos situados na região não recombinante do
cromossomo Y. Por possuírem histórias evolutivas distintas, em decorrência
das diferenças nas taxas de mutação (Jobling e Tyler-Smith, 1995), esses
marcadores foram analisados separadamente e posteriormente em conjunto. A
inserção AluYAP foi analisada tanto dentro do banco de dados dos SNPs
quanto dos microssatélites, para compor os haplótipos desses marcadores.
Neste estudo buscou-se averiguar o grau de diferenciação entre e
dentro das populações estudadas em relação à linhagem patrilinear. Ou seja,
buscou-se investigar a ocorrência de efeito do fundador masculino e de fluxo
gênico para estas populações.
Dois tipos de dados foram utilizados para testar a hipótese de existência
de diferenciação genética entre as populações do Estado de Goiás e do Distrito
Federal: freqüência de alelos e de haplótipos, estes últimos definidos com base
na consolidação dos alelos determinados para cada locus. O valor crítico de p
considerado no teste foi de 0,05.
a) Marcadores binários:
Com relação aos marcadores de eventos únicos do cromossomo Y, os
resultados estatísticos consideram o Estado ancestral e o derivado para
determinar os haplótipos e, conseqüentemente, formar os haplogrupos,
Material e Métodos
36
específicos de cada região no Mundo. A nomenclatura dos haplogrupos do
cromossomo Y seguiu a classificação adotada pelo Consórcio do Cromossomo
Y - The Y-Chromosome Consortium (YCC, 2002).
Baseando-se nos estados alélicos ancestral e derivado para todos os
marcadores do tipo SNPs, construímos manualmente uma árvore (network)
(Figura IV.3) que reflete a relação entre os diferentes haplogrupos observados
nas populações do Estado de Goiás e Distrito Federal. Para essa classificação
foi denominado como zero (0) o Estado alélico ancestral e como um (1) o alelo
derivado.
Para avaliar a composição das populações quanto à origem geográfica
baseada nos haplogrupos do cromossomo Y, foi realizado o teste z. Para efeito
de comparação, agrupou-se os dados no conjunto amostral Centro-Oeste
brasileiro em função de não existir diferenças entre elas.
Para a análise de mistura dos marcadores binários, a distribuição
geográfica dos haplogrupos foi considerada da seguinte forma: o haplogrupo
F*, de distribuição ampla mundial (YCC, 2002) caracterizou-se europeu porque
em nosso país não houve migração significativa do Oriente Médio e Índia; o
haplogrupo P* também foi considerado europeu porque em nossa colonização
não tivemos migração importante de países como Norte da África e Ásia.
Na análise utilizando o teste z, a correlação das proporções par a par foi
realizada entre cada origem geográfica. Por exemplo, foi comparada a
proporção de europeus em Goiás com a do Distrito Federal e, da mesma forma
entre as proporções de africanos e ameríndios.
b) Marcadores do tipo STRs:
Além das análises em comum para todos os marcadores analisados
nesse estudo, realizamos uma análise de variância molecular (AMOVA). Com o
resultado obtido, foi construída uma matriz de comparação par a par para cada
marcador STR Y-específico. Essa comparação foi realizada utilizando os dados
da literatura (Grattapaglia et al., 2005), correlacionando as cinco regiões
brasileiras.
Material e Métodos
37
As freqüências alélicas parentais utilizadas no cálculo da estimativa de
mistura genética para o conjunto de cinco marcadores genéticos uniparentais
(STRs e AluYAP) estão ilustradas na Tabela III.8.
5.2 DNA mitocondrial
Conforme relatada anteriormente, a análise estatística dos resultados
dos marcadores do DNA mitocondrial foi realizada de forma semelhante aos
marcadores do cromossomo Y. Para a análise de mistura foi realizado o
agrupamento de acordo com a origem geográfica. Todos os haplogrupos
característicos de linhagem africana foram agrupados como africanos; os
característicos de linhagens européias, como europeus. Somente os
haplogrupos de linhagem ameríndia não foram agrupados visto que, tanto em
nossa análise, quanto na de Alves-Silva et al. (2000), todos os haplogrupos
foram observados.
Os dados das populações aqui analisadas foram também agrupados em
dados da região Centro-Oeste em decorrência da não diferença entre as
populações do Distrito Federal e Goiás. Após o agrupamento, foi realizada uma
comparação par a par dos dados de DNA mitocondrial gerados no presente
estudo com dados da literatura (Alves-Silva et al., 2000) das quatro regiões
brasileiras e o Brasil como um todo.
Material e Métodos
38
Tabela III.8: Freqüências alélicas parentais utilizadas nos cálculos das
estimativas de contribuições étnicas para a constituição da
população da região Centro-Oeste brasileira.
População Parental
Marcador Alelos
Europeu
1
Africano
2
Ameríndio
3
DYS19 12 0,000 0,010 0,000
13 0,121 0,078 0,980
14 0,585 0,165 0,013
15 0,227 0,494 0,007
16 0,053 0,126 0,000
17 0,014 0,117 0,000
18 0,000 0,010 0,000
N 207 103 150
DYS390 20 0,000 0,010 0,000
21 0,029 0,639 0,014
22 0,130 0,078 0,000
23 0,184 0,078 0,212
24 0,531 0,146 0,514
25 0,121 0,039 0,253
26 0,000 0,010 0,007
27 0,005 0,000 0,000
N 207 103 150
DYS391 09 0,087 0,010 0,007
10 0,493 0,602 0,941
11 0,406 0,359 0,052
12 0,014 0,029 0,000
N 207 103 150
DYS393 12 0,178 0,058 0,033
13 0,682 0,573 0,735
14 0,135 0,252 0,113
15 0,005 0,107 0,119
16 0,000 0,000 0,000
17 0,000 0,010 0,000
N 207 103 150
YAP
4
Presença 0,070 0,740 0,007
Ausência 0,930 0,260 0,993
N 192 611 150
1
Carvalho et al.,2003.
2
Trovoada et al.,2003.
3
Wanderley-Santos, 2001.
4
Hammer,1994.
Resultados
39
IV. RESULTADOS
Amostras de duas populações – Goiás (GO) e Distrito Federal (DF) -
pertencentes a região Centro-Oeste brasileira foram investigadas quanto a
marcadores uniparentais situados no cromossomo Y e no DNA mitocondrial.
Os resultados foram divididos para apresentação em: contribuição uniparental
masculina, contribuição uniparental feminina e comparação dos dados gerados
por esses marcadores uniparentais.
IV.1. Contribuição uniparental masculina
A contribuição uniparental masculina foi analisada para as populações
do Estado de Goiás e do Distrito Federal utilizando 16 marcadores genéticos
situados na região não-recombinante do cromossomo Y, sendo que 12 eram
marcadores binários (uma inserção Alu e 11 SNPs) e 4 do tipo microssatélites.
IV.1.1. Inserção AluYAP
A freqüência da inserção AluYAP nas duas populações está
apresentada na Tabela IV.1. O alelo YAP
-
(ausência de inserção) foi observado
em 72,9% da população de Goiás e em 84,5% do Distrito Federal. De acordo
com a AMOVA, não há diferença estatisticamente significativa entre as duas
populações (F
st
=0,029; p=0,076±0,003) com relação a esse marcador. A maior
parte da variação foi encontrada dentro das populações (97,31%).
Resultados
40
IV.1.2. Marcadores binários do tipo SNPs situados no cromossomo
Y
IV.1.2.1.Caracterização genética populacional por locus
Na Tabela IV.1 e na Figura IV.1 estão apresentadas as distribuições das
freqüências alélicas dos 11 marcadores binários do tipo SNPs - 92R7, M89,
M213, P2, SRY2627, SRY4064, M2, M3, M60, M34, P3 – nas populações de
Goiás e do Distrito Federal. Foram encontradas similaridades entre as
freqüências alélicas observadas nas duas populações para a maioria dos loci
analisados.
Considerando como locus polimórfico aquele em que o alelo mais
comum tenha uma freqüência máxima de 99%, a população de Goiás
apresentou uma menor porcentagem de loci polimórficos (58,3%) do que o
Distrito Federal (75,0%), conforme pode ser verificado na Tabela IV.1. Ambas
as populações apresentaram monomorfismo para os loci M60, M34 e P3
enquanto que o locus SRY2627 apresentou-se monomórfico quanto ao alelo
ancestral no Estado de Goiás.
A diversidade gênica (Nei, 1973) observada considerando os doze loci
bialélicos analisados (incluindo a inserção AluYAP) foi similar nas duas
populações (Distrito Federal - h* = 0,164±0,153; Goiás- h* = 0,216±0,206.
Dentre os marcadores que apresentaram polimorfismo, a maior diversidade
gênica foi observada para o locus 92R7 em ambas as populações e a menor
para o M3 no Estado de Goiás e M2 no Distrito Federal (Tabela IV.1).
O teste de heterogeneidade mostrou que as populações não
apresentaram diferenças estatisticamente significativas nas freqüências
alélicas para a maioria dos loci. Exceções foram observadas quanto aos loci
P2, SRY 2627 e SRY4064 que apresentaram valores de χ
2
maior que 3,84
(p<0,05).
Resultados
41
Tabela IV.1: Freqüência dos alelos ancestrais dos marcadores genéticos do tipo SNP situados no cromossomo Y analisados nas
populações do Estado de Goiás e Distrito Federal, parâmetros de variabilidade genética (índice de diversidade
gênica (Nei, 1973) e % loci polimórfico ) e teste de heterogeneidade intra locus.
Locus Goiás Distrito Federal Teste de heterogeneidade
N=129
h*
N=71
h*
χ
2
1
p
92R7 0,496 0,500 0,535 0,498 0,280 0,597
M89 0,271
0,395
0,155
0,261 3,502 0,061
M213 0,271
0,395
0,155
0,261 3,502 0,061
P2 0,760 0,365 0,887 0,200 4,752 0,029***
SRY2627 -- -- 0,916 0,155 11,239 0,0008***
SRY4064 0,729 0,395 0,859 0,242 4,470 0,034***
M2 0,930 0,129 0,972 0,055 1,525 0,217
M3 0,992 0,015 0,986 0,278 0,186 0,667
YAP 0,729 0,395 0,845 0,262 3,503 0,061
M60 - - - - 0,000 1,000
M34 - - - - 0,000 1,000
P3 - - - - 0,000 1,000
% loci polimórfico 58,33 - 75,00 -
h** (DP) - 0,216 (0,206) - 0,164 (0,153)
*h = diversidade gênica (Nei 1973);** diversidade gênica média e, entre parênteses, Desvio Padrão (DP) ;*** valores significativos ao nível de 5%
Resultados
42
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
92R7 M89 M213 P2 SRY2627 SRY4064 M2 M3 YAP M60 M34 P3
Locus
Freqüências (%)
GO
DF
Figura IV.1: Distribuição das freqüências dos alelos ancestrais dos marcadores
genéticos do tipo SNP situados no cromossomo Y nas populações
do Estado de Goiás e Distrito Federal
Resultados
43
IV.1.2.2. Caracterização genética populacional por haplótipos e
haplogrupos
Os marcadores bialélicos analisados localizam-se na região não
recombinante do cromossomo Y. De acordo com a literatura (YCC, 2002), os
marcadores bialélicos permitem a identificação dos haplogrupos do
cromossomo Y, o que possibilita a identificação da origem geográfica do
indivíduo. A Tabela IV.2 e a Figura IV.2 apresentam a distribuição dos
haplogrupos observados, gerados a partir da combinação dos dados dos doze
marcadores binários Y-específicos, nas populações de Goiás e Distrito Federal
e no Centro-Oeste (conjunto amostral total). A distribuição mundial dos
haplogrupos Y-específicos observados no presente trabalho estão também
apresentadas nessa Tabela com o objetivo de identificar a origem geográfica
dos mesmos nas populações amostradas.
Foram identificados seis haplogrupos em Goiás, todos compartilhados
com o Distrito Federal. Adicionalmente, foram observados dois outros
haplogrupos - R1b8 e D1 – no Distrito Federal, totalizando oito. Em Goiás o
mais freqüente foi o P* (49,6%), seguido pelo F* (38,0%), somando 87,6% dos
indivíduos analisados. No Distrito Federal 74,6% dos indivíduos pertencem a
um desses haplogrupos. Porém, diferentemente de Goiás, a distribuição destes
dois haplogrupos foi quase eqüitativa (Tabela IV.2). A diversidade haplotípica
(diversidade gênica de Nei, 1973) foi similar nas duas populações (h
DF
=
0,697±0,034; h
GO
= 0,670±0,029).
Com relação à divergência populacional, analisada por AMOVA, a maior
fonte de variação foi encontrada dentro das populações (98,03%). Como
evidenciado pela análise de F
st
, não há diferença entre as populações de Goiás
e Distrito Federal (F
st
= 0,020; p=0,068±0,002).
Resultados
44
Tabela IV.2: Haplogrupos do cromossomo Y observados e respectivas freqüências nas populações de Goiás, Distrito Federal e
Centro-Oeste e populações parentais.
Haplogrupo
#
Goiás Distrito Federal Centro-Oeste População parental
##
P*
###
0,496 0,366 0,450 Europa (excluindo Q* e R1b8)
F* 0,225 0,380 0,280 Europa
E3* 0,170 0,084 0,140 Mediterrâneo
R1b8 - 0,084 0,030 Europa (em especial Bascos e Catalães)
E* 0,031 0,029 0,030 África Subsaariana
E3a* 0,070 0,029 0,055 África Subsaariana
Q3* 0,008 0,014 0,010 América
D1 - 0,014 0,005 Japão
#
Classificação dos haplogrupos de acordo com o Consórcio do Cromossomo Y (2002).
##
População parental: população em que o haplogrupo considerado é encontrado e que participou da constituição da população
brasileira de forma significativa.
###
Os haplogrupos Q3* e R1b8 pertencem ao haplogrupos P*. No presente trabalho os indivíduos portando essas mutações foram
discriminados e, portanto, excluídos da soma dos haplogrupos mais amplos.
Resultados
45
0
10
20
30
40
50
P* F* E3* R1b8 E* E3a* Q* D1
Haplogrupos
Freqüências (%)
GO
DF
Figura IV.2: Distribuição dos haplogrupos do cromossomo Y nas populações de
Goiás e Distrito Federal.
IV.1.2.3. Análise de mistura: marcadores binários Y-específicos
A Tabela IV.3 apresenta a estimativa de composição quanto a origem
geográfica das populações de Goiás e Distrito Federal e comparação das
mesmas utilizando o teste z. A contribuição parental principal foi a européia para
ambas as populações, seguidas da africana e uma pequena contribuição
ameríndia. A composição das populações é similar em relação à origem européia
(p=0,295) e à africana (p=0,142), mas uma diferença estatisticamente significante
foi observada com relação à contribuição ameríndia/asiática (p<0,05).
Considerando o conjunto amostral, visto que não há diferença entre as
estimativas nas duas populações analisadas, foi observado que a maioria, 90%
dos homens da amostra da região Centro-Oeste, apresentam linhagens
européias. As linhagens africanas perfizeram 8,5% do total, sendo que 1,5% foi
contribuição ameríndia e asiática.
Resultados
46
Tabela IV.3: Estimativas de composição quanto à origem geográfica das
populações de Goiás e Distrito Federal e do conjunto amostral
(Centro-Oeste brasileiro) baseada nos haplogrupos do cromossomo
Y e comparação das estimativas obtidas para as duas populações
(teste z).
Origem Geográfica Goiás Distrito Federal z (p) Centro-Oeste
Europa 0,892 0,916 0,54 (0,295) 0,900
África 0,100 0,056 1,07 (0,142) 0,085
Ásia e América
0,008 0,028 2,67 (0,004) 0,015
IV.1.2.4. Análise Filogeográfica
Combinando a distribuição dos alelos dos 11 marcadores binários e uma
inserção AluYAP, foi possível classificar os haplótipos encontrados em oito
haplogrupos diferentes. A Figura IV.3 mostra a relação entre os haplogrupos
observados nas duas populações analisadas. Cada círculo representa um
haplogrupo e tem uma área proporcional à sua freqüência. Os nomes dos
haplogrupos estão representados nos braços. As diferenças observadas entre as
duas árvores (network) são decorrentes da presença de haplogrupos exclusivos
na população do Distrito Federal e da diferença na freqüência de observação dos
haplogrupos.
Resultados
47
A –
M2
E3a*
Q3
*
P*
F*
E*
E3*
M3
P92R7
M89/ M213
SRY406
4
P2
Q3*
P
*
F*
R1b8
E
*
E3*
D1
M2
P92R7
P2
DYS28
7
SRY4064
M89/M213
SRY2627
M3
E3a
*
B-
Figura IV.3: Relacionamento dos haplogrupos do cromossomo Y observados nas
populações do Distrito Federal (A) e Goiás (B). Os haplogrupos são
representados pelos círculos (o diâmetro do círculo é proporcional à
freqüência dos haplogrupos) e estão indicados ao lado dos mesmos;
as mutações estão indicadas ao lado dos ramos.
Resultados
48
IV.1.3. Microssatélites situados no cromossomo Y
IV.1.3.1. Caracterização genética populacional por locus
A Tabela IV.4 apresenta a distribuição das freqüências alélicas dos quatro
microssatélites do cromossomo Y nas populações de Goiás e Distrito Federal aqui
analisadas. Dados da literatura (Grattapaglia et al., 2005) referentes à análise dos
mesmos marcadores em populações urbanas das cinco regiões geopolíticas
brasileiras também estão apresentados na Tabela. As figuras IV.4 a IV.7
apresentam a distribuição dos alelos dos marcadores do tipo microssatélites nas
populações em estudo e nas principais populações parentais brasileiras.
Foram encontrados 4,25 e 3,50 alelos em média nas amostras do Estado
de Goiás e Distrito Federal, respectivamente, sendo que foi observado de 3
(DYS19 e DYS391 no Distrito Federal) a 5 (DYS19 em Goiás) alelos em cada
população para cada marcador (Tabela IV.4).
Para o marcador DYS19, foram encontrados cinco alelos na população de
Goiás e três no Distrito Federal. O alelo modal para ambas as populações foi o
DYS19*14. A Figura IV.4 mostra que esse alelo modal é o mesmo encontrado na
população parental européia. Os alelos DYS19*16 e DYS19*17 foram
identificados apenas na população do Estado de Goiás e mostraram baixa
freqüência.
Em relação ao marcador DYS390 (Figura IV.5), as duas populações
apresentaram quatro alelos. Ambas as populações da região Centro-Oeste
apresentaram o alelo DYS390*24 como modal, semelhante a duas das
populações parentais - européia e ameríndia.
Já o marcador DYS391 apresentou quatro alternativas alélicas para a
população do Estado de Goiás e três para o Distrito Federal. Ambas as
populações apresentaram o alelo DYS391*10, o mesmo descrito para as três
populações parentais principais (Figura IV.6).
Quanto ao loci DYS393 (Figura IV.7), foram identificados quatro diferentes
alelos nas duas populações. O alelo modal, o DYS393*13, é o mesmo tanto para
as populações analisadas no presente trabalho quanto para as populações
parentais. O alelo DYS393*15 foi o menos freqüente.
Resultados
49
Tabela IV.4 - Distribuição das freqüências alélicas de quatro microssatélites do cromossomo Y nas populações de Goiás e Distrito
Federal (DF) e em cinco regiões geop olíticas brasileiras (Grattapaglia et al., 2005) (N = Norte; NE = Nordeste; SE =
Sudeste; S = Sul; CO = Centro-Oeste)
Presente estudo Grattapaglia et al. (2005)*
GO DF CO N NE CO SE S Brasil
Locus
Alelos
N % N % N % N % N % N % N % N % N %
DYS19
12 - - - - - - - - 01 0,024 - - - - - - 01 0,005
13 29 0,224 16 0,225 45 0,225 01 0,040 10 0,238 10 0,208 06 0,167 05 0,106 32 0,162
14 70 0,543 34 0,479 104 0,520 17 0,680 18 0,429 25 0,521 20 0,556 32 0,681 112 0,566
15 27 0,209 21 0,296 48 0,240 03 0,120 12 0,286 07 0,146 10 0,278 07 0,149 39 0,197
16 01 0,008 - - 01 0,005 04 0,160 01 0,024 04 0,083 - - 02 0,043 11 0,056
17 02 0,016 - - 02 0,010 - - - - 02 0,042 - - 01 0,021 03 0,015
Total 129 71 200 25 42 48 36 47 198
DYS390
21 - - - - - - 02 0,080 01 0,024 03 0,063 01 0,028 - - 07 0,035
22 12 0,093 06 0,085 18 0,090 04 0,160 03 0,071 03 0,063 10 0,278 02 0,043 22 0,111
23 24 0,186 23 0,324 47 0,235 03 0,120 08 0,190 12 0,250 06 0,167 09 0,191 38 0,192
24 86 0,667 37 0,521 123 0,615 15 0,600 23 0,548 23 0,479 16 0,444 30 0,638 107 0,540
25 07 0,054 05 0,070 12 0,060 01 0,040 06 0,143 07 0,146 02 0,056 01 0,021 17 0,086
26 - - - - - - - - 01 0,024 - - 01 0,028 05 0,106 07 0,035
Resultados
50
Presente estudo Grattapaglia et al. (2005)*
GO DF CO N NE CO SE S Brasil
Locus
Alelos
N % N % N % N % N % N % N % N % N %
Total 129 71 200 25 42 48 36 47 198
DYS391
8 02 0,016 - - 02 0,010 - - - - - - - - - - - -
9 36 0,278 07 0,099 43 0,215 - - 01 0,024 02 0,042 01 0,028 - - 04 0,020
10 49 0,380 35 0,493 84 0,420 15 0,600 18 0,429 28 0,583 21 0,583 23 0,489 105 0,530
11 42 0,326 29 0,408 71 0,355 10 0,400 23 0,548 17 0,354 13 0,361 23 0,489 86 0,434
12 - - - - - - - - - - 01 0,021 01 0,028 01 0,021 03 0,015
Total 129 71 200 25 42 48 36 47 198
DYS393
11 - - - - - - 01 0,040 - - - - 01 0,028 02 0,043 04 0,020
12 11 0,085 11 0,155 22 0,110 03 0,120 08 0,190 14 0,292 08 0,222 09 0,191 42 0,212
13 89 0,690 43 0,606 132 0,660 15 0,600 30 0,714 29 0,604 23 0,639 27 0,574 124 0,626
14 26 0,202 11 0,155 37 0,185 05 0,200 04 0,095 04 0,083 04 0,111 07 0,149 24 0,121
15 03 0,023 06 0,084 09 0,045 01 0,040 - - 01 0,021 - - 02 0,043 04 0,02
Total 129 71 200 25 42 48 36 47 198
* N de cada alelo foi estimado a partir da freqüência alélica e N total.
Resultados
51
12
13
14
15
16
17
18
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Frequencia
Alelos
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
Figura IV.4: Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS19 nas
populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e Centro-Oeste.
20
21
22
23
24
25
26
27
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Alelos
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
Freqüência
Figura IV.5: Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS390 nas
populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e Centro-Oeste.
Resultados
52
8
9
10
11
12
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Alelos
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
Freqüência
Figura IV.6: Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS391 nas
populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e Centro-Oeste
11
12
13
14
15
16
17
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Alelos
Europeu
Africano
Ameríndio
Goiás
Distrito Federal
Centro-Oeste
Freqüência
Figura IV.7: Distribuição de freqüências alélicas para o marcador DYS393 nas
populações parentais e em Goiás, Distrito Federal e Centro-Oeste
Resultados
53
De acordo com a análise de variância molecular – AMOVA, utilizando os
loci do tipo marcadores STR, foi observado que há uma diferença
estatisticamente significativa (Fst=0,143; p=0,016±0,001) entre as populações de
Goiás e Distrito Federal, indicando subestruturação populacional. Essa diferença
observada entre as populações é reflexo da diferença estatisticamente
significativa quanto às freqüências alélicas observadas para os loci DYS390
(Fst=0,025, p=0,033) e DYS391 (Fst=0,029, p=0,027). Os resultados mostraram
uma alta variabilidade dentro das populações (98,56%).
As Figuras IV.8 a IV.11 mostram a análise de variância molecular (AMOVA)
entre o conjunto amostral do Centro-Oeste aqui apresentado e os dados
publicados por Grattapaglia et al. (2005) utilizando os loci STRs - DYS19,
DYS390, DYS391 e DYS393.
O marcador DYS19 foi o que apresentou o maior número de diferenças
entre as populações dentre os marcadores aqui analisados. A amostra do Centro-
Oeste aqui analisada mostrou diferença estatisticamente significativa com a
população do Norte e Sul. A região Sudeste e o conjunto amostral “Brasil” não
apresentaram diferenças com nenhuma outra região brasileira. A região Sul foi a
que apresentou o maior número de diferenças significativas com as outras regiões
(Norte, Centro-Oeste do presente estudo e Nordeste).
Com relação ao marcador DYS390, a amostra analisada no presente
estudo não apresentou diferença estatisticamente significativa com a maioria das
outras regiões, com exceção da região Sudeste. A comparação das demais
regiões apresentou diferença estatisticamente significante entre a região Sul e a
Sudeste.
Já o marcador DYS391 apresentou o maior número de diferenças
estatisticamente significativas na comparação entre a amostra do Centro-Oeste e
o publicado por Grattaglia et al. (2005), sendo que não foi observada diferença
apenas com as regiões Sudeste e Norte.
O marcador DYS393 apresentou-se semelhante aos outros marcadores, ou
seja, sem diferenças estatisticamente significativas com a maioria das regiões
(Norte, Nordeste, Sul e Sudeste).
Resultados
54
Presente estudo Norte Nordeste Centro-Oeste Sudeste Sul Brasil
Presente estudo ***********
0,028±0,002 0,534±0,005 0,362±0,005 0,750±0,005 0,041±0,001 0,168±0,004
Norte 0,055 ***********
0,019±0,001 0,177±0,003 0,106±0,003 0,607±0,005 0,053±0,022
Nordeste -0,006 0,080 ***********
0,003±0,000 0,512±0,005 0,000±0,000 0,126±0,004
Centro-Oeste -0,000 0,020 0,003 ***********
0,395±0,004 0,197±0,003 0,235±0,004
Sudeste -0,012 0,037 -0,087 -0,002 ***********
0,235±0,004 0,652±0,005
Sul 0,028 -0,012 0,058 0,011 0,010 ***********
0,291±0,004
Brasil 0,004 0,015 0,012 -0,006 -0,008 0,003 ***********
Figura IV.8: Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método Fst,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS19. A população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia et al., 2005). Abaixo valores de Fst e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
Resultados
55
Presente estudo Norte Nordeste Centro-Oeste Sudeste Sul Brasil
Presente estudo *********** 0,348±0,004 0,413±0,005 0,110±0,003
0,022±0,001
0,278±0,004 0,143±0,004
Norte -0,000 *********** 0,528±0,004 0,265±0,005 0,401±0,005 0,332±0,004 0,650±0,005
Nordeste -0,001 -0,009 *********** 0,814±0,004 0,146±0,003 0,297±0,004 0,883±0,003
Centro-Oeste 0,013 0,009 -0,015 *********** 0,118±0,003 0,079±0,002 0,443±0,005
Sudeste 0,042 -0,001 0,019 0,021 ***********
0,024±0,001
0,144±0,003
Sul 0,003 0,003 0,003 0,026 0,054 *********** 0,200±0,004
Brasil 0,004 -0,010 -0,010 -0,002 0,013 0,006 ***********
Figura IV.9: Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método Fst,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS390. A população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia et al., 2005). Abaixo valores de F
st
e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
Resultados
56
Presente estudo Norte Nordeste Centro-Oeste Sudeste Sul Brasil
Presente estudo *********** 0,063±0,002
0,020±0,001 0,030±0,001
0,050±0,002
0,017±0,001 0,000±0,000
Norte 0,039 *********** 0,152±0,003 0,816±0,004 0,100±0,000 0,463±0,005 0,702±0,005
Nordeste 0,042 0,018 *********** 0,107±0,003 0,136±0,003 0,600±0,005 0,226±0,004
Centro-Oeste 0,031 -0,027 0,034 *********** 0,100±0,000 0,271±0,005 0,400±0,004
Sudeste 0,032 -0,032 0,029 -0,025 *********** 0,318±0,005 0,551±0,005
Sul 0,040 -0,011 -0,015 0,006 -0,000 *********** 0,615±0,004
Brasil 0,041 -0,016 0,008 -0,004 -0,009 -0,008 ***********
Figura IV.10: Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método Fst,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS391. A população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia et al., 2005). Abaixo valores de Fst e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
Resultados
57
Presente estudo Norte Nordeste Centro-Oeste Sudeste Sul Brasil
Presente estudo *********** 0,850±0,004 0,255±0,004
0,033±0,002
0,270±0,004 0,283±0,005
0,041±0,002
Norte -0,018 *********** 0,346±0,005 0,274±0,004 0,592±0,005 0,917±0,003 0,538±0,005
Nordeste 0,005 -0,000 *********** 0,337±0,005 0,784±0,004 0,350±0,005 0,552±0,005
Centro-Oeste 0,031 0,009 0,000 *********** 0,745±0,004 0,502±0,005 0,550±0,005
Sudeste 0,004 -0,015 -0,018 -0,017 *********** 0,831±0,004 0,100±0,000
Sul 0,003 -0,024 0,001 -0,006 -0,018 *********** 0,769±0,004
Brasil 0,010 -0,008 -0,005 -0,005 0,016 -0,009 ***********
Figura IV.11: Matriz de comparação par a par entre as cinco regiões brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
,
para o marcador do tipo STR Y-específico DYS393. A população do Centro-Oeste (Presente estudo) é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos que utilizaram um serviço de investigação de paternidade e a população denominada “Brasil” é o conjunto
de todas as amostras de paternidade (dados de Grattapaglia et al., 2005). Abaixo valores de F
st
e acima valores de p;
Número de permutações: 10100.
Resultados
58
IV.1.3.2. Caracterização genética populacional por haplótipos e
haplogrupos
Os resultados dos haplótipos observados foram categorizados em dois grupos
de acordo com o genótipo observado para o locus AluYAP: YAP
+
(presença de
inserção) e YAP
-
(ausência de inserção). A ocorrência destes em cada população
(compartilhados e não compartilhados) está apresentada na Figura IV.12 e na Tabela
IV.5. Os haplótipos, definidos usando os genótipos dos quatro loci microssatélites,
apresentam a seguinte ordem de registro dos alelos: DYS19, DYS390, DYS391 e
DYS393.
Foram identificados 72 haplótipos (YAP/STRs) diferentes para os 200
cromossomos Y analisados, sendo que a maioria é YAP- (77,8%). A população do
Estado de Goiás apresentou 53 haplótipos e a do Distrito Federal, 43. Os valores
encontrados de diversidade gênica (haplotípica), segundo Nei (1973), foram elevados:
h = 0,964±0,007 para Goiás e h=0,976±0,008 para o Distrito Federal. Dos haplótipos
identificados, 24 foram compartilhados entre as duas populações. Destes, o conjunto
gênico mais freqüente em Goiás foi o haplótipo h11 (-/14/24/10/13) e no Distrito
Federal, o h13 (-/14/24/11/13).
Na população do Estado de Goiás, 40,3% dos haplótipos do cromossomo Y
observados foram exclusivos para esta população, dentre os quais o haplótipo h68
(+/15/24/09/13) foi o mais freqüente (5,4%). Já na população do Distrito Federal, foi
observado percentual bem menor de haplótipos exclusivos (26,4%), sendo que os
haplótipos h36 (-/15/23/11/13) e h58 (+/13/24/09/13) apresentaram as maiores
incidências (4,2%) dentre esses.
Resultados
59
Tabela IV.5 – Haplótipos observados em quatro microssatélites situados no
cromossomo Y, suas freqüências em cada população e a diversidade
haplotípica. Os haplótipos foram divididos em dois grupos YAP e YAP
+
Número de repetições STR Populações
Goiás
(N=129)
Distrito Federal
(N=71)
Haplótipo
DYS19
DYS390
DYS391
DYS393
N % N %
Grupo YAP -
01 13 24 10 13 06 0,046 02 0,028
02 13 24 11 13 04 0,031 01 0,014
03 13 24 11 14 03 0,023 02 0,028
04 14 22 11 13 01 0,008 01 0,014
05 14 23 09 13 01 0,008 01 0,014
06 14 23 10 12 03 0,023 01 0,014
07 14 23 10 13 02 0,015 03 0,042
08 14 23 11 13 03 0,023 02 0,028
09 14 24 09 13 10 0,077 01 0,014
10 14 24 10 12 02 0,015 02 0,028
11 14 24 10 13 15 0,116 05 0,070
12 14 24 10 14 02 0,015 02 0,028
13 14 24 11 13 11 0,085 08 0,113
14 14 24 11 14 04 0,031 01 0,014
15 14 25 09 13 01 0,008 01 0,014
16 14 25 10 13 02 0,015 01 0,014
17 15 23 10 13 03 0,023 03 0,042
18 15 24 10 13 02 0,015 02 0,028
19 15 24 11 13 02 0,015 02 0,028
20 15 24 11 14 03 0,023 01 0,014
21 15 24 11 15 01 0,008 01 0,014
22 13 22 11 13 - - 01 0,014
23 13 23 10 12 - - 01 0,014
24 13 24 10 12 - - 01 0,014
Resultados
60
Número de repetições STR Populações
Goiás
(N=129)
Distrito Federal
(N=71)
Haplótipo
DYS19
DYS390
DYS391
DYS393
N % N %
25 13 25 10 14 - - 01 0,014
26 14 22 10 12 - - 01 0,014
27 14 23 11 12 - - 01 0,014
28 14 25 10 12 - - 01 0,014
29 14 25 11 13 - - 01 0,014
30 15 23 10 14 - - 02 0,028
31 15 24 10 12 - - 01 0,014
32 15 23 11 15 - - 01 0,014
33 15 22 10 15 - - 01 0,014
34 15 23 10 15 - - 01 0,014
35 15 23 11 12 - - 01 0,014
36 15 23 11 13 - - 03 0,042
37 15 24 11 12 - - 01 0,014
38 13 23 11 13 01 0,008 - -
39 13 23 11 14 01 0,008 - -
40 13 24 08 13 01 0,008 - -
41 14 22 09 13 01 0,008 - -
42 14 22 10 13 01 0,008 - -
43 14 22 11 14 01 0,008 - -
44 14 23 09 12 01 0,008 - -
45 14 23 10 14 02 0,015 - -
46 14 23 11 14 01 0,008 - -
47 14 24 09 14 02 0,015 - -
48 14 24 11 12 02 0,015 - -
49 14 25 09 14 01 0,008 - -
50 14 25 10 14 01 0,008 - -
51 15 22 09 13 01 0,008 - -
52 15 22 10 13 01 0,008 - -
53 15 23 09 13 01 0,008 - -
54 15 24 08 12 01 0,008 - -
Resultados
61
Número de repetições STR Populações
Goiás
(N=129)
Distrito Federal
(N=71)
Haplótipo
DYS19
DYS390
DYS391
DYS393
N % N %
55 15 25 11 14 01 0,008 - -
56 16 22 10 13 01 0,008 - -
Grupo YAP+
57 13 23 10 13 04 0,031 02 0,028
58 13 24 09 13 05 0,040 03 0,042
59 15 22 11 15 01 0,008 01 0,014
60 13 23 09 15 - - 01 0,014
61 13 24 10 14 - - 01 0,014
62 14 22 10 14 - - 01 0,014
63 13 22 10 13 01 0,008 - -
64 13 23 09 13 01 0,008 - -
65 13 24 09 14 01 0,008 - -
66 13 24 11 12 01 0,008 - -
67 15 22 11 12 01 0,008 - -
68 15 24 09 13 07 0,054 - -
69 15 24 09 14 01 0,008 - -
70 15 25 09 14 01 0,008 - -
71 17 22 09 14 01 0,008 - -
72 17 22 10 15 01 0,008 - -
F
st
-0,001 0,025 0,029 0,006
p
0,440
0,033 0,027
0,195
Figura IV.12: Haplótipos de microssatélites do cromossomo Y e suas freqüências nas populações de Goiás e Distrito Federal.Os
haplótipos foram agrupados em YAP+ e YAP-. Haplótipos compartilhados entre as populações: 1 a 21 e 57 a 59;
Haplótipos YAP- específicos da população do Distrito Federal (22 a 37) e do Estado de Goiás (38 a 56). Haplótipos
YAP+ específicos da população do Distrito Federal (60 a 62) e do Estado de Goiás (63 a 72).
62
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
Grupo YAP - Grupo YAP +
Haplótipos
Freqüências (%)
GO
DF
Resultados
Resultados
63
IV.1.3.3. Diferenciação genética analisada por marcadores do tipo STR
De acordo com a análise de variância molecular – AMOVA, utilizando os loci
do tipo STR, foi observado que há diferença estatisticamente significativa
(Fst=0,143; p=0,016±0,001) entre as populações de Goiás e Distrito Federal,
indicando subestruturação populacional. Essa diferença observada entre as
populações é reflexo da diferença estatisticamente significativa quanto as
freqüências alélicas observadas para os loci DYS390 (Fst=0,025; p=0,033) e
DYS391 (Fst=0,029; p=0,027). Os resultados obtidos através da presente análise
mostraram uma alta variabilidade dentro das populações (98,56%) e baixa entre as
populações (1,44%).
IV.1.3.4. Mistura genética utilizando marcadores STR Y-específicos
As estimativas de contribuições dos principais grupos parentais brasileiros
(europeu, africano e ameríndio) na constituição das populações do Centro-Oeste,
com base nos marcadores uniparentais do tipo STR e na inserção AluYAP estão
apresentadas na Tabela IV.6. As análises mostram uma predominância da parental
européia na constituição dessa população. Os valores observados para os outros
dois grupos parentais apresentaram-se baixos, sendo que a contribuição parental
africana foi mais expressiva que a ameríndia.
A comparação de mistura genética gerada a partir dos dados dos marcadores
bialélicos e microssatélites (Tabela IV.7) mostra que não há diferença
estatisticamente significativa entre a estimativa obtida utilizando ambas as
categorias de marcadores Y-específicos uniparentais (p>0,05).
Resultados
64
Tabela IV.6 – Estimativas de mistura genética (erro padrão em parênteses) das
populações de Goiás e Distrito Federal e para o conjunto amostral
(Centro-Oeste brasileiro) considerando um conjunto de cinco
marcadores genéticos uniparentais (STRs e AluYAP) e comparação
das estimativas obtidas para as duas populações (teste z).
População Parental Goiás Distrito Federal z (p) Centro-Oeste
Europeu
0,797 (0,036) 0,841 (0,060) 0,763 (0,224) 0,858 (0,082)
Africano
0,119 (0,016) 0,101 (0,032) 0,395 (0,348) 0,125 (0,044)
Ameríndio 0,083 (0,025) 0,058 (0,036) 0,656 (0,258) 0,017 (0,050)
Tabela IV.7. Comparação entre as estimativas de mistura genética geradas a partir
dos dados dos marcadores bialélicos e microssatélites para o conjunto
amostral do Centro-Oeste brasileiro.
População Parental
Centro-Oeste
(SNPs)
Centro-Oeste
(STRs)
z (p)
Europeu
0,900 0,858 1,288 (0,099)
Africano 0,085 0,125 1,305 (0,095)
Ameríndio 0,015 0,017 0,159 (0,436)
Resultados
65
IV.1.4 Associação SNPs/STRs/AluYAP
Considerando o conjunto haplotípico formado pela união dos dados dos
marcadores do tipo STRs e SNPs, foram observados 118 haplótipos em 200
cromossomos analisados. Ambas as populações compartilharam 10% dos
haplótipos, sendo que a população do Distrito Federal apresentou 39 haplótipos
específicos e o Estado de Goiás apresentou um maior polimorfismo haplotípico
específico (59 haplótipos). A diversidade gênica, segundo Nei (1973), da população
do Distrito Federal foi similar (0,990±0,0002) à do Estado de Goiás (0,993±0,0001).
A análise de AMOVA realizada para esse conjunto de dados mostrou
resultados semelhantes aos já descritos para os marcadores STR analisados
separadamente. As populações apresentam diferenças estatisticamente
significativas (F
st
=0,016, p=0,029±0,002). A maior porcentagem de variação
encontra-se dentro das populações (98,35%). A variação interpopulacional foi
responsável por uma pequena parcela da variação (1,65%).
IV.2. Contribuição uniparental feminina
Com o intuito de avaliar a contribuição uniparental feminina nas duas
populações do Centro-Oeste brasileiro estudadas, foram analisados treze
marcadores do tipo SNPs e a presença da deleção de 9 pb situada na região COII-
tRNALys do genoma mitocondrial.
A Tabela IV.8 e a Figura IV.13 apresentam as freqüências dos haplogrupos
de DNA mitocondrial observados nas amostras do Estado de Goiás e do Distrito
Federal e a distribuição geográfica (origem das linhagens) das mesmas. Os dados
obtidos por Alves-Silva et al. (2000), para amostras de indivíduos autodeclarados
“brancos” originários de quatro regiões geopolíticas brasileiras (Norte, Nordeste,
Sudeste e Sul), constam também da Tabela para efeito de comparação. Esses
autores não contemplaram a região Centro-Oeste. Os haplogrupos foram definidos
como descrito em Material e Métodos e a nomenclatura seguiu a proposta por Chen
et al. (2000).
Os haplogrupos A, B, C e D, característicos de linhagens ameríndias, foram
observados em maior freqüência em ambas às populações analisadas. Destes, o
Resultados
66
haplogrupo A foi o mais freqüente e o haplogrupo D o menos. Dentre os haplogrupos
analisados que caracterizam a linhagem africana, foram observados seis
haplogrupos no Estado de Goiás e cinco no Distrito Federal. As freqüências desses
haplogrupos variaram de 0,016 a 0,101 em Goiás e de 0,028 a 0,085 no Distrito
Federal. Com relação aos haplogrupos característicos de linhagem européia (H, J, K
e T), apenas o haplogrupo H foi observado na presente amostra tendo uma
freqüência de 10,8% em Goiás e 18,3% no Distrito Federal. Das amostras
analisadas, 5,4% do Estado de Goiás e 11,3% do Distrito Federal não pertencem a
nenhum dos haplogrupos analisados. Essas amostras não categorizadas foram
identificadas como “não-ameríndias/não-africanas” e, possivelmente, devem
pertencer a outras linhagens européias que não H, J, K e T.
Avaliando a diferenciação genética das populações do Estado de Goiás e do
Distrito Federal, utilizando a análise de AMOVA locus a locus, não observamos
diferença estatisticamente significativa entre as populações (0,193<p<1,000),
indicando uma homogeneidade entre elas. Com relação ao índice de diversidade
gênica (no caso haplotípica) de Nei (1973), ambas as populações apresentaram a
mesma estimativa: Goiás=0,894±0,009 e Distrito Federal= 0,894±0,013. Na AMOVA
utilizando o conjunto dos haplótipos, observa-se também que não há diferença
significativa estatisticamente entre as populações (F
st
=-0,003; p=0,680±0,004),
sendo que toda a variância se encontra dentro das populações.
Resultados
67
Tabela IV.8 – Distribuição geográfica e freqüências dos haplogrupos de DNA mitocondrial observados no Centro-Oeste brasileiro e
em dados da literatura (indivíduos autodeclarados brancos de quatro regiões geopolíticas brasileiras - N = Norte; NE
= Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul - e do Brasil sem a região Centro-Oeste (Alves-Silva et al., 2000)). A
nomenclatura de haplogrupos no presente trabalho foi baseada em Chen et al. (2000).
Presente estudo Alves-Silva et al. (2000) Distribuição
geográfica/
Haplogrupo
Goiás
Distrito
Federal
Centro-
Oeste
N NE SE S Brasil
Mutação N % N % N % N % N % N % N % N %
Ásia/Améric a
A +663 HaeIII
23 0,178 11 0,155 34 0,170
04 0,081 04 0,080 13 0,134 03 0,059 24 0,098
B Deleção 9pb
21 0,163 08 0,113 29 0,145
08 0,167 03 0,060 10 0,103 03 0,059 24 0,098
C -13259 HincII
13 0,101 09 0,127 22 0,110
10 0,205 01 0,020 06 0,062 03 0,059 20 0,081
D -5176 AluI
06 0,047 03 0,042 9 0,045
04 0,081 03 0,060 04 0,041 02 0,040 13 0,053
Total
0,489 0,437 0,470
0,534 0,220 0,339 0,217 0,330
África
L1 +10.806 HinfI
13 0,101 05 0,070 18 0,090
02 0,042 07 0,140 11 0,112 03 0,061 23 0,093
L2 -10.806 HinfI
12 0,093 04 0,056 16 0,080
01 0,021 05 0,100 08 0,082 - - 14 0,058
L3a +2349 MboI
04 0,031 02 0,028 6 0,030
03 0,062 07 0,140 11 0,112 - - 21 0,086
L3b -8616 MboI
02 0,016 02 0,028 4 0,020
- - 02 0,040 - - 02 0,040 04 0,016
L3c +10084 TaqI
03 0,023 - - 3 0,015
- - - - - - - - - -
L3d -10394 DdeI
11 0,085 06 0,085 17 0,085
- - - - - - - - - -
L3* *
- - - - - -
- - 01 0,022 02 0,020 - - 03 0,012
U6 +12308 HinfI
- - - - - -
02 0,042 - - 02 0,020 01 0,020 05 0,020
Total
0,349 0,267 0,320
0,167 0,440 0,347 0,121 0,285
Resultados
68
Presente estudo Alves-Silva et al. (2000) Distribuição
geográfica/
Haplogrupo
Goiás
Distrito
Federal
Centro-
Oeste
N NE SE S Brasil
Mutação N % N % N % N % N % N % N % N %
Europa
H -7025 AluI
14 0,108 13 0,183 27 0,135
04 0,084 11 0,220 14 0,142 13 0,257 42 0,171
pré*V *
- - - - - -
01 0,022 - - 01 0,010 01 0,020 03 0,012
V -4577NlaIII
- - - - - -
- - 01 0,020 04 0,041 01 0,020 06 0,024
HV* *
- - - - - -
- - - - - - 01 0,020 01 0,004
U +12308 HinfI
- - - - - -
02 0,040 03 0,060 05 0,051 05 0,099 15 0,061
Pré*HV *
- - - - - -
- - - - - - 01 0,020 01 0,004
J -13704 BstNI
- - - - - -
- - - - - - 06 0,119 06 0,024
K -9052 HaeII
- - - - - -
02 0,047 01 0,020 01 0,009 - - 04 0,016
T +13366 BamHI
- - - - - -
04 0,084 01 0,020 04 0,041 04 0,079 13 0,053
I
-4529 HaeII,
+8249 AvaI,
+16389 BamHI,
+10032 AluI
- - - - - -
01 0,022 - - - - - - 01 0,004
X -1715 DdeI
- - - - - -
- - - - 02 0,019 01 0,020 03 0,012
Total
0,108 0,183 0,135
0,299 0,340 0,314 0,654 0,385
Não-ameríndios
e Não-africanos
07 0,054 08 0,113 15 0,075
- - - - - - - - - -
N Total
129 71 200
48 50 98 50 246
* Seqüenciamento
Resultados
Como não há diferenças entre as duas populações analisadas, o
conjunto amostral aqui utilizado foi agrupado e denominado “Centro-Oeste”. A
comparação entre a população do Centro-Oeste e as outras regiões brasileiras
mostraram discrepância (Figura IV.14). Foram observados valores de F
st
estatisticamente significativos (p<0,05) entre o Centro-Oeste e todas as outras
regiões. Com relação à amostra de Alves-Silva et al. (2000), foi observada
diferença estatisticamente significativa entre as regiões Sudeste e Nordeste e
entre a região Sul e todas as regiões do país.
Figura IV.13: Distribuição das freqüências dos haplogrupos de DNA
mitocondrial observados no Estado de Goiás e no Distrito Federal
classificados de acordo com suas linhagens.
***Não Ameríndios/Asiáticos
0
5
10
15
20
L3c L3d H ***
Freqüências (%)
A B C D L1 L2 L3a L3b
Haplogrupos
69
GO
DF
Resultados
70
Centro Oeste Norte Nordeste Sudeste Sul Brasil
Centro Oeste ***********
0,043±0,001 0,022±0,001 0,000±0,000 0,000±0,000 0,000±0,000
Norte 0,018 ***********
0,006±0,000 0,111±0,003 0,000±0,000 0,053±0,022
Nordeste 0,022 0,058 ***********
0,003±0,000 0,000±0,000 0,126±0,004
Sudeste 0,043 0,014 0,059 ***********
0,023±0,001 0,068±0,003
Sul 0,142 0,097 0,128 0,033 ***********
0,001±0,000
Brasil 0,021 0,017 0,010 0,011 0,058 ***********
Figura IV.14: Matriz de comparação par a par dos resultados obtidos pelos marcadores de DNA mitocondrial entre as cinco
regiões brasileiras e o Brasil como um todo utilizando o método F
st
. A população do Centro-Oeste é o conjunto
formado pelas populações de Goiás e Distrito Federal enquanto que as das demais regiões são compostas por
indivíduos auto-declarados como “brancos” e a população denominada “Brasil” é o conjunto amostral das regiões
brasileiras excetuando o Centro-Oeste (dados de Alves-Silva et al., 2000). Abaixo valores de F
st
e acima valores de P.
Número de permutações: 10100.
Resultados
71
IV.2.1. Mistura genética: marcadores do DNA mitocondrial
A Tabela IV.9 mostra a distribuição da freqüência de cada haplogrupo de
DNA mitocondrial com suas respectivas origens geográficas para o Estado de
Goiás, Distrito Federal e para o conjunto amostral do Centro-Oeste. Os dados
compilados na Tabela IV.9 foram obtidos a partir dos dados apresentados na
Tabela IV.8. Os dados foram agrupados de acordo com a origem geográfica de
cada haplogrupo (Figura IV.15). Por exemplo, os indivíduos pertencentes aos
haplogrupos A, B, C e D observados foram agrupados na categoria
Ameríndios. Não há diferença estatisticamente significativa quando se compara
as estimativas obtidas para as duas populações (p>0,05).
Tabela IV.9 – Composição quanto a origem geográfica das populações de
Goiás e Distrito Federal e do conjunto amostral (Centro-Oeste
brasileiro) baseada nos haplogrupos do DNA mitocondrial e
comparação das estimativas obtidas para as duas populações
(teste z).
População Parental Goiás Distrito Federal z (p) Centro-Oeste
Europeu
0,108 0,183 1,487 (0,068) 0,135
Africano
0,349 0,267 1,190 (0,117) 0,320
Ameríndio/asiático 0,489 0,437 0,705 (0,239) 0,470
Não-ameríndio 0,054 0,113 1,516 (0,064) 0,075
A Tabela IV.10 apresenta a distribuição das freqüências dos
haplogrupos do DNA mitocondrial agrupados por origem geográfica
(ancestralidade) no conjunto amostral da região Centro-Oeste e dados da
literatura para as demais regiões brasileiras (Norte, Nordeste, Sudeste e Sul)
de indivíduos autodefinidos como “brancos” (Alves-Silva et al., 2000). Destaca-
se que a região Centro-Oeste não foi contemplada na literatura citada. A
população denominada Brasil é um agrupamento dos dados da literatura (soma
dos haplogrupos das quatro regiões descritas na literatura)
Resultados
A Tabela IV.11 apresenta a comparação das proporções de contribuição
das três origens geográfica principais na região Centro-Oeste e no Brasil com
relação as demais regiões geográficas brasileiras. O teste z mostra diferença
estatisticamente significativa em relação a região Sul para as três origens
geográficas da região Centro-Oeste (p<0,05). Já no agrupamento do conjunto
Brasil dos dados da literatura, a região Sul mostra diferença estatiscamente
significativa com as origens européia e africana (p<0,05). Dentre as regiões
brasileiras comparadas, apenas a região Sul não apresentou diferença
estatisticamente significante com o Brasil.
Os dados da Tabela IV.10 foram utilizados para comparação das
proporções das estimativas de mistura genética entre a região Centro-Oeste e
as demais regiões brasileiras e destas com o Brasil. Por não haver diferenças
estatiscamente significativas entre as populações aqui analisadas com esse
conjunto de marcadores, os dados gerados foram agrupados em Centro-Oeste.
Para efeito de cálculo, as amostras da região Centro-Oeste pertencentes aos
haplogrupos não-ameríndios foram somados ao haplogrupo europeu.
Figura IV.15: Distribuição dos haplogrupos de DNA mitocondrial observados
em Goiás e no Distrito Federal distribuídos pelas origens
geográficas. ***Não ameríndios/Asiáticos
0
10
20
30
40
50
Ameríndios Africanos Europeu ***
Haplogrupos
Freqüências (%)
DF
GO
72
Resultados
73
Tabela IV.10 – Distribuição das freqüências dos haplogrupos do DNA mitocondrial agrupados por origem geográfica
(ancestralidade) da região Centro-Oeste (CO) e dados de brasileiros autodefinidos como brancos da literatura
(N = Norte; NE = Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul) (Alves-Silva et al., 2000). Destaca-se que a região Centro-
Oeste não foi contemplada na literatura citada.
Presente estudo Brasileiros autodefinidos como brancos
Origem do
haplogrupo
CO N NE SE S
Brasil
(sem CO)
Europeu 0,135 0,299 0,340 0,314 0,654 0,385
Africano 0,320 0,167 0,440 0,347 0,121 0,285
Ameríndio/asiático 0,470 0,534 0,220 0,339 0,217 0,330
Não-ameríndio 0,075 - - - - -
Resultados
74
Tabela IV.11 – Teste z (valores de p entre parênteses) para a comparação das proporções de contribuição das três origens
geográficas principais (Europa, África e América/Ásia) na região Centro-Oeste e no Brasil com relação às
demais regiões geográficas brasileiras (N = Norte; NE = Nordeste; SE = Sudeste; S = Sul). Valores de z
estatisticamente significativos estão em negrito.
Regiões brasileiras
N NE SE S
Brasil
(sem Centro-Oeste)
Europa 1,320 (0,093)
1,940 (0,026) 1,960 (0,025) 6,130 (p<<0,050) 3,990 (p<<0,050)
África
2,100 (0,018)
1,600 (0,055) 0,470 (0,319)
2,800 (0,003)
0,800 (0,212)
Centro-Oeste
América/Ásia 0,800 (0,212)
3,200 (0,001) 2,150 (0,016) 3,240 (0,001) 3,010 (0,001)
Europa 1,130 (0,129) 0,600 (0,274) 1,230 (0,109)
3,500 (p<<0,050)
-
África
1,690 (0,046) 2,160 (0,015)
1,130 (0,129)
2,420 (0,008)
-
Brasil (sem
Centro-Oeste
América/Ásia
2,690 (0,004)
1,530 (0,063) 0,160 (0,436) 1,570 (0,058) -
Resultados
75
IV.3 Comparação: Y versus DNA mitocondrial
IV.3.1.Análise indivíduo a indivíduo
As Figuras IV.16 e IV.17 apresentam a contribuição uniparental na
constituição de cada indivíduo amostrado das populações do Distrito Federal e
Goiás, respectivamente. As linhagens de DNA mitocondrial não categorizadas
foram excluídas dessa análise. A Tabela IV.12 apresenta um sumário da
constituição genética individual obtida dessa maneira.
Na amostra do Distrito Federal quatorze indivíduos (19,7%)
apresentaram tanto o cromossomo Y quanto o mitocondrial de mesma origem,
sendo treze de linhagens européias e um de africana. Já no Estado de Goiás,
foram observados 19 indivíduos (14,7%) com as linhagens uniparentais de
mesma origem: seis africanos, um ameríndio e doze europeus. Os demais
indivíduos apresentaram a linhagem materna de origem geográfica distinta da
paterna, sendo que o predomínio foi de linhagens do cromossomo Y de origem
européia e a do DNA mitocondrial, ameríndia (45,0% em Goiás; 39,4% no
Distrito Federal; 43% da amostra total). No Distrito Federal não foi identificado
caso de Y africano e ameríndio associado a DNA mitocondrial europeu.
IV.3.2.Análise populacional
A Tabela IV.13 apresenta o contraste da contribuição uniparental
baseado nas duas categorias de marcadores analisados no presente trabalho
(cromossomo Y e DNA mitocondrial). A mistura genética estimada com base na
origem geográfica dos haplogrupos dos marcadores uniparentais situados no
cromossomo Y e no DNA mitocondrial, revelou um predomínio das linhagens
de cromossomo Y européias enquanto que as linhagens ameríndias de DNA
mitocondrial foram as mais numerosas. Linhagens de cromossomo Y
ameríndias foram observadas em freqüências extremamente baixas. Com
relação à contribuição africana, esta foi muito inferior à européia com relação
ao Y enquanto que o quadro se inverte quando se considera o DNA
mitocondrial. Os valores das estimativas baseadas nas duas categorias de
linhagens são estatisticamente distintos, de acordo com teste z cujos valores
Resultados
76
obtidos apresentaram uma probabilidade de desvio do valor esperado ao acaso
muito menor que o nível de significância de 5% (p<<0,05).
Resultados
77
1 5 9 13172125293337414549535761656973778185899397101105109113117121125129
Figura IV.16: Contribuição uniparental na constituição de cada indivíduo amostrado na população do Estado de Goiás. Na parte
inferior da figura estão representadas as linhagens referentes ao cromossomo Y e, na superior, as do DNA
mitocondrial. As amostras caracterizadas como linhagens européias estão representadas na cor azul, as africanas na
cor vermelha, as ameríndias na cor verde.
Figura IV.17: Contribuição uniparental na constituição de cada indivíduo amostrado na população do Distrito Federal. Na parte
inferior da figura estão representadas as linhagens referentes ao cromossomo Y e, na superior, as do DNA
mitocondrial. As amostras caracterizadas como linhagens européias estão representadas na cor azul, as africanas na
cor vermelha, as ameríndias na cor verde e a asiática na cor laranja.
78
Resultados
1 3 5 7 9 11131517192123252729313335373941434547495153555759616365676971
Resultados
79
Tabela IV.12 – Constituição genética individual definida pela associação das
linhagens de DNA mitocondrial e cromossomo Y nas populações
de Goiás, Distrito Federal e Centro-Oeste brasileiro
Linhagem do Cromossomo Y
Freqüência
Linhagem do DNA mitocondrial
Freqüência
Européia Africana Ameríndia/asiática
Européia 0,093 0,016 -
Africana 0,302 0,047 -
Ameríndia/ Asiática 0,450 0,031 0,007
Goiás
Não-ameríndia* 0,047 0,007 -
Européia 0,183 - -
Africana 0,254 0,014 -
Ameríndia/ Asiática 0,394 0,042 -
Distrito Federal
Não-ameríndia* 0,085 - 0,028
Européia 0,125 0,010 -
Africana 0,285 0,035 -
Ameríndia/ Asiática 0,430 0,035 0,005
Centro-Oeste
Não-ameríndia* 0,060 0,005 0,010
* Considera-se não-ameríndia as amostras em que não foi possível a
categorização da linhagem do DNA mitocondrial.
Tabela IV.13 – Comparação das estimativas de mistura genética geradas a
partir das linhagens do cromossomo Y e do DNA mitocondrial
para o conjunto amostral da região Centro-Oeste brasileiro e
comparação das estimativas obtidas para as duas categorias de
marcadores (teste z).
Estimativas de mistura genética
Origem
geográfica
Cromossomo Y DNA mitocondrial
z (p)
Europa
0,900
0,210 13,88 (p <<0,05)
África
0,085
0,320 5,85 (p <<0,05)
América/Ásia
0,015
0,470 10,62 (p <<0,05)
Discussão
80
V. DISCUSSÃO
A população brasileira atual foi constituída, nos últimos 500 anos, com
base em uma mistura populacional multiétnica, porém majoritariamente tri-
híbrida. No Brasil, os diferentes povos que aqui aportaram se mesclaram, se
reproduziram, diferentemente de alguns outros países onde os casamentos
inter-étnicos são exceções. Porém, o contingente de cada população na
composição das diferentes regiões brasileiras, não foi eqüitativo. Por exemplo,
ocorreu um maior fluxo de africanos para o Nordeste e Sudeste do Brasil,
enquanto que os extremos do país, Norte e Sul, tiveram menor participação
desses migrantes (IBGE, 2000). No Norte, a contribuição ameríndia foi
numericamente relevante para a composição populacional local, enquanto nas
outras regiões do país essa participação foi pequena ou até mesmo ausente.
A região Centro-Oeste brasileira foi colonizada por migrações internas
advindas de todas as partes do Brasil, principalmente dos estados vizinhos, e
foi uma das últimas regiões brasileiras a ser povoada (Palacín e Moraes, 1994).
O povoamento do Estado de Goiás foi iniciado em meados do século XIX,
enquanto que o Distrito Federal começou a ser ocupado a partir de 1960. O
povoamento do Distrito Federal ocorreu em decorrência da criação da nova
Capital Federal no Planalto Central e foi oriundo de populações pré-
estabelecidas das cinco regiões brasileiras, especialmente do Nordeste e
Sudeste, o que torna o brasiliense um caso ímpar do ponto de vista de
formação (dados da CODEPLAN, 1997). Essa é a região brasileira menos
conhecida quanto à caracterização genética, mas é possível que sua
constituição possa representar a constituição brasileira média em decorrência
da sua história de povoamento.
Os dados genéticos são utilizados na busca de melhor compreender os
fatos históricos, porém, podem mostrar diferenças quando se comparam
distintas categorias de marcadores genéticos. Marcadores uniparentais
(cromossomo Y e DNA mitocondrial) podem auxiliar a entender melhor o
processo de povoamento, pois permitem distinguir o quanto da mistura herdada
deriva da contribuição diferencial entre homens e mulheres. No Brasil, sabe-se
que o cruzamento inter-étnico foi assimétrico em relação ao sexo na época da
Discussão
81
colonização brasileira, onde homens europeus e mulheres africanas e
ameríndias contribuíram desproporcionalmente para esse processo (Callegari-
Jacques et al., 2003).
Nesse trabalho analisamos a constituição uniparental masculina e
feminina de duas populações do Centro-Oeste brasileiro - Estado de Goiás e
Distrito Federal - com vistas a contrastar os dados e colaborar para um melhor
conhecimento do povoamento dessa região em que a população residente
representa 60,6% da população do Centro-Oeste (dados do IBGE - 2000).
V.1 Contribuição uniparental masculina
A maior parte do cromossomo Y é não recombinante e, desse modo, as
mutações nesse cromossomo representam um registro de seu passado
evolutivo que pode ser usado na reconstrução da história de populações
(Jobling e Tyler-Smith, 2003). O cromossomo Y, a exemplo dos demais
cromossomos humanos, apresenta as diferentes categorias de marcadores
genéticos com diferentes taxas de mutação. Porém, a proporção de
marcadores nesse cromossomo é menor do que nos demais cromossomos
humanos.
Dentre os marcadores encontrados estão os bialélicos. Essa categoria
de marcador apresenta uma baixa taxa de mutação, pois são advindos de
eventos mutacionais lentos, tais como substituição de bases (SNPs) e
inserções/deleções (Indels), que podem ser registrados como eventos únicos
na evolução humana (Hurles et al., 1999). Em contraste, apresenta também
marcadores do tipo microssatélites que apresentam altas taxas de mutação e,
portanto, possibilidade de mutações recorrentes (Heyer, et al., 1997; Carvalho-
Silva, et al., 1999).
Os marcadores genéticos situados no cromossomo Y mais utilizados em
análises populacionais são os situados na região não recombinante desse
cromossomo (Underhill et al., 2000; Underhill et al., 2001; Martinez-Marignac et
al., 2004). O conjunto de informações gerado a partir da análise desses
marcadores possibilita a definição de haplótipos e haplogrupos, aumentando
assim o potencial discriminatório.
Discussão
82
V.1.1. Inserção AluYAP
As amostras das populações de Goiás e Distrito Federal apresentaram
valores altos e estatisticamente similares para o alelo YAP
¯
(ausência da
inserção) e, dessa forma, podemos dizer que a população do Centro-Oeste foi
fundada prioritariamente por indivíduos YAP
¯
.
A distribuição mundial dessa inserção apresenta diferenças marcantes
entre os vários continentes (Hammer et al., 1997). Populações portuguesas e
indígenas brasileiras são praticamente monomórficas para o YAP
¯
(Bianchi et
al., 1997; Oliveira, 1999; Rodriguez-Delfin, 1999) Na Itália, foi observada uma
freqüência variando de 7 a 17% (Hammer et al., 1997). Em contraste, esse
alelo é raro no continente africano. Nessa região do mundo, o alelo presença
de inserção é predominante, em especial na África Subsaariana (Hammer,
1994; Karafet et al., 1997), fonte de ondas migratórias (tráfico de escravos)
para o Brasil. Na África Ocidental, a freqüência foi estimada em 100% na
Nigéria, 95,0% na Costa do Marfim e 86,0% em Gâmbia (Hammer, 1994;
Hammer et al., 1997; Rodriguez-Delfin, 1999). Em bantos da África do Sul, a
freqüência varia de 65,0 a 83,0% (Hammer, 1994; Karafet et al., 1999).
Dessa forma, a alta freqüência do alelo YAP
¯
nas populações aqui
analisadas pode ser reflexo de uma alta contribuição de homens europeus e
eurodescendentes para o povoamento dessa região, assim como pode
evidenciar uma participação ameríndia. Por outro lado, sugere-se que a
contribuição parental africana no delineamento da freqüência alélica desse
marcador nas populações analisadas não deve ter tido um papel relevante.
V.1.2 Marcadores binários do tipo SNPs situados no cromossomo Y
Na região não recombinante do cromossomo Y foi descrita uma série de
polimorfismos que possibilitam a definição de haplogrupos que representam
linhagens associadas a origens geográficas (YCC, 2002; Underhill, 2003).
Dessa série de polimorfismos, foram selecionados para esse estudo 11
marcadores bialélicos (SNPs) que foram analisados juntamente com os dados
da inserção AluYAP.
Discussão
83
A análise desses polimorfismos permite a reconstrução “genealógica”,
determinando, assim, a origem filogeográfica de cada cromossomo analisado.
Cada haplogrupo representa uma única linhagem que foi originada de um único
homem no passado em algum lugar do mundo (Zerjal et al., 2001). Os
haplogrupos podem ser nomeados pelas mutações que definem as linhagens
(YCC, 2002; Hammer e Zegura, 2002).
V.1.2.1. Caracterização genética populacional por locus
A distribuição das freqüências alélicas desses doze marcadores binários
possibilitou a caracterização genética de ambas populações analisadas. No
Estado de Goiás foi observado que 58,3% desses loci eram polimórficos
enquanto que no Distrito Federal esse número foi maior, 75,0%. Apesar disso,
considerando esse conjunto de marcadores como loci independentes, não há
diferença estatisticamente significativa entre essas populações, evidenciando
uma similaridade entre elas.
A variação na freqüência gênica em uma população subestruturada
pode ser analisada diretamente em termos de diversidade gênica. Este método
pode ser aplicado para qualquer população independente das forças evolutivas
atuantes, tais como mutações, seleção e migração, e do sistema reprodutivo. A
diversidade gênica (h) é uma medida de variação genética em uma população
e pode ser analisada dentro e entre populações distintas (Nei, 1973). A média
da diversidade gênica no Estado de Goiás foi levemente maior que o Distrito
Federal, porém baixa nas duas populações, como era esperado em
decorrência de serem sistemas bialélicos e da ocorrência de monomorfismo
para uma porcentagem de loci.
V.1.2.2. Haplogrupos do cromossomo Y no Centro-Oeste
Como os marcadores analisados no presente trabalho estão situados na
região não recombinante do cromossomo Y e, portanto, ligados, a análise
considerando o conjunto de marcadores genéticos é mais adequada. O
conjunto específico de marcadores genéticos aqui investigados em homens do
Centro-Oeste permitiu a identificação de haplogrupos, o que possibilitou a
Discussão
84
definição da origem filogeográfica de cada cromossomo analisado. Com essa
análise, foram identificados oito haplogrupos distintos - P*, F*, E3*, R1b8, E*,
E3a*, Q3* e D1 - sendo que os haplogrupos R1b8 e D1 não foram encontrados
no Estado de Goiás. Importante frisar que os haplogrupos – F*, R1b8, Q3* e D1
- são sub-haplogrupos do P* e o E3* e o E3a* do E*. A análise filogeográfica
gerada para os haplogrupos observados (network) mostrou pequenas
diferenças decorrentes da ocorrência de haplogrupos exclusivos na população
do Distrito Federal e da diferença na freqüência de observação dos
haplogrupos.
O maior número de haplogrupos observados na população do Distrito
Federal é um provável reflexo do histórico de povoamento que relata a
migração interna para o Distrito Federal de um maior número de regiões
brasileiras do que para o Estado de Goiás. Enquanto Goiás foi formado
prioritariamente por indivíduos migrantes dos estados vizinhos (Palacín, 1994),
o Distrito Federal recebeu uma contribuição importante também de estados do
Nordeste e Sudeste (dados da CODEPLAN, 1997).
Apesar do maior número de haplogrupos no Distrito Federal, a
diversidade haplotípica estimada foi similar nas duas populações. Esse dado
deve ser decorrente das baixas freqüências dos haplogrupos adicionais (R1b8
e D1). As similaridades genéticas, decorrentes das similaridades das
freqüências haplotípicas, entre as duas populações foi confirmada pela análise
de AMOVA que mostrou que não há diferença estatisticamente significativa
entre as populações.
Distribuição dos haplogrupos de Y no Centro-Oeste e
contextualização
No Estado de Goiás o haplogrupo P* foi o mais freqüente (49,6%) e o
segundo do Distrito Federal (36,6%), o que o caracteriza como o mais
freqüente nessa amostra da região Centro-Oeste (45%). Esse haplogrupo,
caracterizado pela mutação 92R7, apresenta vários sub-haplogrupos, dentre os
quais o Q3* e R1b8, que serão discutidos posteriormente. Excluindo esses dois
sub-haplogrupos, o haplogrupo P* é encontrado em alta freqüência entre as
populações européias e está ausente na África (Flores et al., 2003) e no Japão
Discussão
85
(Pandya, 1998 in Carvalho-Silva et al., 2001). Também é observado nas
populações do Oriente Médio e Índia (Underhill et al., 2001; YCC, 2002). O
encontro desse haplogrupo nas populações do Centro-Oeste, assim como nas
demais populações brasileiras, deve refletir contribuição européia, visto que a
contribuição de povos do Oriente Médio e Índia na constituição genética do
povo brasileiro é negligenciável.
O haplogrupo P* é também o mais comum entre indivíduos autodefinidos
como “brancos” das outras quatro regiões do Brasil. Nesse caso é observada
uma discreta variação regional nas freqüências desse haplogrupo (Carvalho-
Silva et al., 2001). Freqüências similares foram observadas em euro-
descendentes brasileiros do Estado de São Paulo, situado na região Sudeste
(Abé-Sandes et al., 2004).
A observação do haplogrupo P* em remanescentes de quilombos é
considerada reflexo de mistura genética e auxilia na reconstrução histórica das
populações. Por exemplo, as observações de altas freqüências desse
haplogrupo devem ser reflexo de efeito do fundador, remetendo a uma
fundação dessas comunidades por indivíduos previamente miscigenados
(Ribeiro, 2005). A ocorrência do haplogrupo P*, em uma amostra de indivíduos
afro-derivados da população urbana de Ribeirão Preto (região Sudeste),
também reflexo de miscigenação (Abé-Sandes et al., 2004), contribui para a
discussão acerca da ausência de correlação entre cor da pele e ancestralidade
genética. Já entre brasileiros descendentes de asiáticos, esse haplogrupo não
foi observado (Abé-Sandes et al., 2004).
O haplogrupo F* foi o mais freqüente no Distrito Federal (38,0%) e o
segundo mais freqüente no Estado de Goiás (22,5%). Esse haplogrupo,
caracterizado pela presença das mutações M89/213, apresenta-se distribuído
na maioria dos continentes (Santos et al., 1999). Essa distribuição inclui a
Europa, América, Ásia e Leste da África e é decorrência de ser um haplogrupo
ancestral originado em um período anterior às grandes migrações. É sugerido
que essa linhagem tenha sido transportada via migração de um povo que se
dispersou da África para Europa e Ásia há 40 milhões de anos (Underhill et al.,
2001).
Discussão
86
Devido sua antiguidade, estima-se que no máximo 3,0% das mutações
do haplogrupo F* não estão associadas a outro evento mutacional. Por
exemplo, a mutação M3*T (haplogrupo Q3*), que caracteriza ancestralidade
ameríndia, é um sub-haplogrupo de F*. Essa mutação foi identificada em baixa
freqüência nas populações do Estado de Goiás e Distrito Federal (0,8 e 1,4%,
respectivamente). Outro exemplo é o haplogrupo R1b8, que foi observado em
8,4% das amostras do Distrito Federal e será discutido abaixo. Outros
haplogrupos derivados de F* são observados distribuídos em quase todo o
mundo, em especial na Europa, Ásia e Leste da África, e estão ausentes na
África Subsaariana (Underhill et al., 2001). Portanto, de acordo com a história
da colonização brasileira, de que não houve um fluxo gênico importante de
países asiáticos e do Leste da África, é possível concluir que a presença do
haplogrupo F* (excluindo o sub-haplogrupo Q3*) no Centro-Oeste brasileiro
deve ser conseqüência da migração européia, a exemplo do concluído para o
haplogrupo P*.
As freqüências observadas do haplogrupo F* nas populações aqui
averiguadas foram similares àquelas encontradas por Abé-Sandes et al. (2004)
em eurodescendentes do Sudeste brasileiro. A presença deste haplogrupo em
remanescentes de quilombos e entre afro-descendentes brasileiros é provável
conseqüência de mistura inter-étnica (Abé-Sandes et al., 2004; Ribeiro, 2005),
a exemplo do discutido para o haplogrupo P*. Esse haplogrupo não foi
analisado por Carvalho-Silva et al. (2001).
O haplogrupo R1b8, caracterizado pela mutação R1b8, foi observado no
Distrito Federal. Este haplogrupo é encontrado em alta freqüência entre as
populações Ibéricas, principalmente no País Basco e Catalunha, embora o
mesmo seja raro ou ausente na maioria das outras populações do mundo
(Hurles et al., 1999), incluindo o Nordeste da África (Flores et al., 2003). É
observado em populações com ancestralidade ibérica, como na Argentina
(Bianchi et al., 1997). As populações brasileiras comumente não apresentam
este haplogrupo, porém baixas freqüências (2,0 a 2,6%) foram observadas em
populações urbanas do Sudeste brasileiro (Abé-Sandes et al., 2004; Carvalho-
Silva et al., 2001). Este haplogrupo, indicador de ancestralidade européia,
Discussão
87
também foi observado em Mocambo e Kalunga, duas populações rurais
afrodescendentes brasileiras (Ribeiro, 2005).
A presença ameríndia nas populações do Centro-Oeste brasileiro
investigada neste trabalho foi indicada pela observação do haplogrupo Q3*,
definido pela presença do alelo T no locus M3 e restrito geograficamente às
populações ameríndias (Underhill et al., 1996). O alelo T está presente em
78,0% dos índios da região amazônica (Vallinoto et al., 1999) e ocorre em mais
de 90,0% dos nativos da América Central e do Sul (Underhill et al., 1996). Este
haplogrupo não foi encontrado em brasileiros que se autodefiniram como
“brancos” (Carvalho-Silva et al., 2001). Por outro lado, este alelo foi observado
em 4,0% de uma amostra de afro-brasileiros de Salvador e com valor superior
a 3,0% em duas populações remanescentes de quilombo, Rio das Rãs e
Kalunga (Abé-Sandes et al. 2004; Ribeiro, 2005). A presença deste alelo na
região Centro-Oeste brasileira, reflexo da contribuição indígena para o
desenvolvimento desta população, está em concordância com dados históricos
(Palacín e Moraes, 1994; Palacín et al., 1995).
O haplogrupo E3* também é um indicativo de contribuição européia
(Mediterrâneo) e/ou africana (Norte da África) na constituição das linhagens
patrilineares destas comunidades. Ele é observado em altas freqüências entre
populações, por exemplo, do Norte da África (50,0%) e italianos (29,0%)
(Hammer et al., 2000). Em Portugal, fonte primordial do fluxo migratório
europeu para o Brasil, foi observada uma freqüência de 9,7% (Carvalho-Silva
et al., 2001). Em populações brasileiras, o haplogrupo E3* é observado em
pessoas que se autodefiniram como “brancos” e em eurodescendentes
(Carvalho-Silva et al., 2001; Abé-Sandes et al., 2004). Foi também encontrado
em amostras de afrodescendentes residentes em populações urbanas, como
Ribeirão Preto e Salvador, e em comunidades rurais, tais como São Gonçalo,
Rio das Rãs e Kalunga (Abé-Sandes et al., 2004; Ribeiro, 2005).
O haplogrupo E3* é considerado como um marco da invasão africana na
Europa nos tempos em que os mouros conquistaram a Península Ibérica
(Carvalho-Silva et al., 2001). Entretanto, a observação desta mutação entre
brasileiros não pode ser considerada como um resultado de migrações
originadas de comunidades humanas do Norte da África. É mais plausível
Discussão
88
pensar que possa ser conseqüência de mistura prévia das populações
mediterrâneas fornecedoras de migrantes para o Brasil, especialmente
Portuguesas e Italianas, com populações do Norte africano.
Os haplogrupos E* e E3a* identificam ancestralidade da África
Subsaariana (Hammer et al., 1998; YCC, 2002). Assim, podemos deduzir que a
presença desse haplogrupo em nossa análise é uma conseqüência da
participação masculina afrodescendente na constituição das populações do
Centro-Oeste.
O haplogrupo E*, observado em 3,1% da amostra de Goiás e 2,9% do
Distrito Federal, foi também encontrado em diversas populações brasileiras,
como em eurodescendentes brasileiros, afrodescendentes urbanos e em
remanescentes de quilombos como São Gonçalo, Kalunga e Mocambo (Abé-
Sandes et al., 2004; Ribeiro, 2005). Entre indivíduos autodefinidos como
“brancos”, esse haplogrupo é encontrado em baixa freqüência (2%) na região
Norte (Carvalho-Silva et al., 2001).
O haplogrupo E3* foi observado em ambas populações do Centro-Oeste
analisadas: Goiás = 7,0%; Distrito Federal = 2,9%. Entre populações
brasileiras, foi observado no Sudeste (4,0%) e Nordeste (4,1%) em indivíduos
autodeclarados “brancos” (Carvalho-Silva et al., 2001). Em remanescentes de
quilombos do Nordeste brasileiro, a freqüência desse haplogrupo variou de
4,5% em Mocambo a 77,3% em Barra (Abé-Sandes et al., 2004; Ribeiro, 2005).
A ocorrência desses haplogrupos corrobora os dados históricos que
afirmam que o subsaara foi a região africana que mais contribuiu com escravos
para o Brasil colonial. Porém, a baixa freqüência observada no presente
trabalho pode ser um reflexo do cruzamento diferencial, onde os homens
europeus obtiveram um maior sucesso reprodutivo que os africanos, como
melhor discutido adiante.
O haplogrupo D1, definido pela presença do alelo YAP
+
associado à
ausência das mutações nos loci SRY4064, P2, M34 e M2, é observado no
Japão e Tibet (Karafet et al., 1999; YCC, 2002). Esse haplogrupo foi observado
em baixa freqüência na população do Distrito Federal (1,4%). No Brasil, esse
haplogrupo foi analisado em eurodescendentes, afrodescendentes e
Discussão
89
nipodescendentes, tendo sido encontrado em 25,0% dos nipodescendentes e
estando ausente nos demais grupos (Abé-Sandes et al., 2004). A ocorrência
deste haplogrupo no Centro-Oeste também corrobora dados históricos. O
Brasil recebeu uma grande migração japonesa no início do século XX no
Estado de São Paulo. Depois eles se moveram para outras regiões, incluindo a
centro-oeste onde existem comunidades fundadas por indivíduos advindos da
Ásia (Palacín e Moraes, 1994), assim como se encontram descendentes de
japoneses na área urbana.
Mistura Genética: Haplogrupos
Na análise da constituição dos homens de Goiás e Distrito Federal
avaliada pelos haplogrupos do cromossomo Y, foram encontrados haplogrupos
característicos dos três principais grupos étnicos fundadores da população
brasileira: europeus, africanos e ameríndios. Esse achado era esperado em
decorrência do relato histórico de povoamento da região. As estimativas de
freqüência de contribuição genética para as duas populações são similares em
relação à origem européia e africana e diferente estatisticamente com relação à
contribuição ameríndia/asiática (z=2,670; p=0,004).
A linhagem européia apresenta-se em grande maioria (90,0% do
conjunto amostral – Centro-Oeste). Esse dado é similar ao observado para
indivíduos autodeclarados como “brancos” do Brasil, onde 97,5% também são
de linhagem européia (Carvalho-Silva et al., 2001). Porém, com relação às
linhagens africanas e ameríndia foi observado uma maior discrepância na
comparação com os dados de Carvalho-Silva et al. (2001). Com relação às
africanas, foi observado um valor bem superior na amostra do Centro-Oeste
(8,5%) e no Brasil (2,5%). Referente à ameríndia, 1,5% da amostra total
apresentou a mesma, sendo que esta não foi observada entre os indivíduos
autodeclarados como “brancos”.
Foi observada uma discrepância entre as linhagens encontradas, as
quais refletem ancestralidade, e a autodeclaração dos indivíduos. No caso da
amostra do Distrito Federal, onde a porcentagem de linhagens européias foi de
91,6%, essa idéia é muito clara: essa estimativa é muito superior à proporção
Discussão
90
de indivíduos que se autodeclararam “brancos” (53,5%). Das linhagens
encontradas no Distrito Federal, 5,6% do total são africanas. Esse valor é baixo
quando comparado ao número de indivíduos que se autodeclararam como
tendo ancestrais africanos na amostra (pardos = 39,3%; negros = 3,6%).
Apesar do cromossomo Y carregar uma parcela ínfima do genoma individual,
este reflete diretamente a ancestralidade paterna. Esses dados corroboram a
idéia de que a forma que os brasileiros se autodenominam é um pobre
indicativo de ancestralidade (Parra et al., 2003) e também o maior sucesso
reprodutivo por parte dos homens europeus.
V.1.3. STRs (Short Tandem Repeats)
A utilização da análise dos polimorfismos dos microssatélites Y-
específicos no estudo da variação, identificação de linhagem paterna e
evolução humana e sido ilustrada por vários autores (González-Neira et al.,
2000; Goodwin et al., 2001; Wanderley-Santos, 2001; Bosch et al., 2001;
Gusmão et al., 2001; Han et al., 2001; Law et al 2001; Oliveira, 2001; Trovoada
et al, 2001; Carvalho et al., 2003; Grattapaglia et al., 2005; Palha et al., 2006,
dentre outros). Porém, apesar do uso dos microssatélites em comparações
populacionais, não é possível afirmar que distribuições similares de freqüências
alélicas seja um reflexo direto de ancestralidade comum. Esse fato é
decorrente da taxa de mutação, maior nessas regiões, que pode levar a
mutações recorrentes proporcionando a mesma distribuição dos alelos de
microssatélites (Santos e Tyler-Smith, 1996).
No presente trabalho analisamos quatro marcadores do tipo
microssatélites: DYS19, DYS390, DYS391 e DYS393. Estes estão dentre os
marcadores situados no cromossomo Y com maior volume de dados na
literatura e fazem parte integrante do haplótipo mínimo do cromossomo Y
(DYS19, DYS385-I, DYS385-II, DYS389-I, DYS389-II, DYS390, DYS391,
DYS392 e DYS393) que é recomendado para uso forense (Bar et al., 1997a;
Bar et al., 1997b). A escolha desses marcadores é justificada tanto com relação
à sua contribuição no entendimento das relações populacionais, foco desse
trabalho, como também pelo fato de poder compor um banco de dados com
finalidade forense para a região Centro-Oeste.
Discussão
91
V.1.3.1. Caracterização genética populacional por locus
As populações analisadas no presente trabalho apresentaram
polimorfismo para todos os marcadores analisados, sendo a maioria com
quatro alelos. A população de Goiás apresentou uma maior variabilidade em
relação à do Distrito Federal com relação a dois dos marcadores STRs -
DYS19 e DYS391 - e mesma variabilidade com relação aos demais, para os
quais foram observadas as mesmas alternativas alélicas.
O marcador DYS19 foi o primeiro microssatélite situado no cromossomo
Y a ser descrito na literatura (Roewer et al., 1992). Este marcador mostra uma
grande variabilidade em diferentes populações (Santos et al., 1995), sendo que
o número de alelos observados varia, assim como os alelos modais, quando se
consideram as três principais populações parentais brasileiras.
No Distrito Federal foram encontrados três alelos (DYS19*13, *14 e *15)
enquanto que em Goiás foram observados dois adicionais (DYS19*16 e *17),
sendo que o DYS19*14 foi o alelo modal para ambas. Na população parental
européia foram encontrados cinco alelos (DYS19*13 ao DYS19*17), sendo que
o modal é também o DYS19*14 (Gomolka et al., 1994; Muller et al., 1994;
Santos e Tyler-Smith, 1996; Pérez-Lezaun et al, 1997; Carvalho et al., 2003).
Em africanos subsaarianos foram encontrados os mesmos alelos observados
na Europa, porém o modal é o DYS19*15 (Santos e Tyler-Smith, 1996;
Trovoada et al.,2001; Alvaréz et al., 2001).
Entretanto, em ameríndios, o número de alelos varia de uma tribo para
outra, sendo, em média, de três. Apesar dessa variação quanto ao número de
alelos, na maioria das tribos o modal é o DYS19*13 (Zago et al., 1996; Santos
e Tyler-Smith, 1996; Vallinotto et al.,1999). Em algumas populações nativas
americanas, o alelo DYS19*15 foi encontrado com uma freqüência variando de
6,0%, como nos Ojibwa e ameríndios da Argentina, a 47,0%, como entre os
Navajos (Pena et al., 1995; Deka et al., 1996; Underhill et al., 1996; Scozzari et
al., 1997). Portanto, há variação quanto ao alelo modal nas populações
parentais: alelo DYS19*13 nas populações ameríndias, DYS19*15 nas
populações africanas e DYS19*14 nas populações européias.
Discussão
92
Em populações urbanas brasileiras foi observado o mesmo alelo modal,
DYS19*14 (Santos e Tyler-Smith, 1996; Costa et al., 2002; Grattapaglia et al.,
2005) encontrada na amostra aqui estudada, porém observa-se diferenças
quanto à presença/ausência dos alelos. O alelo DYS19*16, não encontrado no
Sudeste brasileiro, e o DYS19*17, relatado nas regiões Centro-Oeste e Sul
(Grattapaglia et al., 2005) foram encontrados em baixa freqüência no Estado de
Goiás. Já o alelo DYS19*12 observado no Nordeste brasileiro em baixa
freqüência, não foi encontrado no presente estudo (Grattapaglia et al., 2005).
Em afro-descendentes brasileiros, as mesmas alternativas alélicas foram
encontradas, sendo que o alelo mais freqüente foi o DYS19*15 (Rodriguez-
Delfin et al., 1997; Ribeiro, 2005), a exemplo das populações africanas
subsaarianas (Trovoada et al., 2001).
As duas populações aqui analisadas apresentaram quatro alelos para a
repetição tetranucleotídica DYS390 - DYS390*22, *23, *24 e *25 – sendo que o
alelo DYS390*24 foi o modal. Em populações européias e ameríndias verificou-
se o mesmo alelo modal e foi encontrado de quatro a seis alelos - DYS390*21
a DYS390*25 e o DYS390*27 - (Pérez-Lezaun et al., 1997; Wanderley-Santos,
2001; Carvalho et al., 2003). Em africanos, esse marcador é bimodal
apresentando sete alelos (DYS390*20 a *26), sendo que o mais freqüente é o
DYS390*21 (Trovoada et al., 2001).
Populações urbanas brasileiras apresentam um máximo de seis alelos
para esse marcador (DYS390*21 a DYS390*26) e também apresentam o alelo
DYS390*24 como modal (Oliveira et al., 2002; Grattapaglia et al., 2005). No
presente trabalho, os alelos DYS390*21 e DYS390*26 não foram observados.
Estes mesmos alelos foram encontrados com baixa freqüência, mas não em
todas as regiões brasileiras. O alelo DYS390*21 não foi encontrado na região
Sul, enquanto que o DYS390*26 não foi observado nas regiões Centro-Oeste e
Norte (Grattapaglia et al., 2005).
Com relação ao marcador DYS391, foram encontradas quatro
alternativas alélicas (DYS391*8 a *11) na população do Estado de Goiás e três
para o Distrito Federal (DYS391*9 a *11). O alelo DYS391*8 é raro, tendo sido
observado, sempre em baixas freqüências, no Norte da África, Hungria e
Taiwan (Bosch et al., 2001; Wu e Pu, 2001). O alelo DYS391*12, não
Discussão
93
observado no presente estudo, foi relatado nas regiões Centro-Oeste, Sudeste
e Sul, em baixas freqüências (Grattapaglia et al., 2005).
Em geral, o marcador DYS391 apresenta entre quatro e cinco alelos
(Ruiz-Linares et al., 1999; González-Neira et al., 2000; Grattapaglia et al.,
2005). Nas populações parentais da população brasileira o alelo modal é o
DYS391*10 (Trovoada et al., 2001; Wanderley-Santos, 2001; Carvalho et al.,
2003). Em europeus, o alelo DYS391*11 também apresenta altas freqüências,
sendo modal em algumas populações como, por exemplo, no País Basco e na
Catalunha (González-Neira et al., 2000).
No presente estudo o alelo *10 foi o modal em ambas as populações.
Em populações urbanas brasileiras tanto o alelo DYS391*10 como o *11
apresentam-se como modal, a depender da região e da amostra considerada.
No Nordeste, assim como em uma amostra de euro-descendentes, o alelo
DYS391*11 apresentou-se modal, enquanto que, nas demais regiões, o modal
é o DYS391*10 (Oliveira et al., 2002; Grattapaglia et al., 2005).
O último tetranucleotídeo aqui avaliado, o DYS393, apresentou quatro
alelos (DYS393*12, *13, *14 e *15) na amostra da região Centro-Oeste
brasileira, sendo o DYS393*13 o modal. Na população parental européia foram
encontrados de quatro a cinco alelos (Pérez-Lezaun et al., 1999; González-
Neira et al., 2000; Carvalho et al., 2003), enquanto que em africanos foi
verificado, além dos alelos observados na população do Centro-Oeste
brasileiro, o DYS393*17 em baixa freqüência (Trovoada et al., 2001). As
populações parentais apresentam como modal o mesmo alelo da região
Centro-Oeste brasileira.
Populações urbanas e ameríndias do Sul do país apresentaram o
mesmo alelo como modal (Rodriguez-Delfin et al., 1997; Oliveira et al., 2002).
O alelo DYS393*15, evidenciado em baixas freqüências no presente estudo,
não foi observado em duas (NE e SE) das cinco regiões brasileiras. O alelo
DYS393*11, não observado aqui, foi encontrado, com freqüências inferiores a
1%, nas regiões Norte, Sudeste e Sul do Brasil (Grattapaglia et al., 2005).
Portanto, dos quatro marcadores STR analisados, o único que apresenta
alelos modais distintos para cada uma das três populações parentais é o
Discussão
94
DYS19, sendo que as populações aqui analisadas apresentaram como alelo
modal o mesmo observado na população parental européia. Para o marcador
DYS390, o alelo modal observado aqui é o mesmo que o descrito para
europeus e ameríndios e distinto do africano. Os alelos modais para os demais
marcadores são os mesmos para as populações parentais e as aqui
analisadas.
V.1.3.2. Diferenciação populacional
A estrutura genética das populações quanto aos dados dos STRs do
cromossomo Y foi avaliada pela análise de variância molecular (AMOVA), a
qual analisa o percentual de variação genética a ser calculada em dois níveis:
dentro e entre as populações (Excoffier et al., 1992). As populações do Estado
de Goiás e do Distrito Federal apresentaram diferença estatisticamente
significativa considerando essa categoria de marcadores genéticos, em
decorrência das diferenças de freqüências para dois dos quatro loci analisados:
DYS390 e DYS391.
Na comparação entre o banco de dados dos marcadores STRs Y-
específicos gerado nesse trabalho e o publicado para o Brasil (Grattapaglia et
al., 2005) foi observada que a maior parte das diferenças populacionais
encontra-se com relação a amostra do Centro-Oeste aqui apresentada. Essas
diferenças podem ser reflexo da amostragem. Enquanto no presente trabalho a
estratégia de amostragem visou a coleta de material de indivíduos nascidos no
Estado de Goiás e no Distrito Federal, independente do nível socioeconômico e
de autodeclaração racial, a amostra de Grattapaglia et al. (2005) foi obtida de
indivíduos que buscaram um serviço de investigação de paternidade particular.
De acordo com Callegari-Jacques et al. (2003) que trabalhou com uma
amostra de origem similar à de Grattapaglia et al. (2005), essa composição
amostral pode causar desvios visto ques de acordo com o IBGE, há diferenças
na composição de ancestralidade entre as classes socioeconômicas
brasileiras. As estimativas de mistura genética obtida para as cinco regiões
geográficas brasileiras utilizando essas amostras mostraram uma contribuição
européia alta e similar entre as regiões (Callegari-Jacques et al., 2003). Os
Discussão
95
valores obtidos são intermediários aos estimados para marcadores do
cromossomo Y e do DNA mitocondrial de indivíduos autodeclarados “brancos”
(Alves-Silva et al., 2000; Carvalho-Silva et al., 2001).
Esses dados podem estar refletindo que a amostra de investigação de
paternidade é composta majoritariamente por indivíduos euro-descendentes
que possivelmente se autodeclarariam “brancos”. No caso da presente
amostra, há uma similaridade entre a distribuição por cor da pele obtida pelo
IBGE (2000) e a autodeclaração dos sujeitos de pesquisa do Distrito Federal
(53,5% Brancos, 39,3 % Pardos, 3,6% Negros e 3,6 % Amarelos).
V.1.3.3. Haplótipos do cromossomo Y
Pelo fato dos microssatélites situados na região não recombinante do
cromossomo Y serem completamente ligados, as informações dos vários loci
são combinadas para construir haplótipos de microssatélites (Roewer et al.,
1996; Kayser et al., 1997b). Atualmente, é considerado o sistema haplotípico
mais informativo (Underhill, 2003), sendo que uma comparação mais robusta
pode ser realizada utilizando os haplótipos ao invés das freqüências de um
dado locus (González-Neira et al., 2000). Estes apresentam particular
aplicabilidade na genética de população e na identificação humana do sexo
masculino devido à sua alta capacidade discriminatória.
Uma análise utilizando haplótipos de microssatélites do cromossomo Y
gerados a partir de um conjunto de nove loci STRs em uma população alemã,
revelou completa individualização de todos os 70 indivíduos do sexo masculino
analisados (Kayser et al., 1997a). Estes dados revelam a alta capacidade
discriminatória deste marcador e seu enorme potencial para propósitos
forenses e em genética de população (Kayser et al., 1997b).
A análise haplotípica de microssatélites na região Centro-Oeste
brasileira mostrou uma grande variabilidade de haplótipos. Dos duzentos
cromossomos Y analisados, setenta e dois diferentes haplótipos foram
identificados, sendo que a maior freqüência de haplótipos distintos foi
observada na população do Estado de Goiás.
Discussão
96
V.1.3.4. Diversidade genética
A alta diversidade haplotípica em todas as populações analisadas reflete
a alta variabilidade intrapopulacional dos haplótipos STR do cromossomo Y. A
diversidade haplotípica, estimada segundo a metodologia de Nei (1973), foi
elevada em ambas as populações (0,964±0,007 para Goiás e 0,976±0,008
para o Distrito Federal), justificando, assim, que a análise em conjunto
(haplótipos) favorece uma melhor diferenciação das populações.
V.1.3.5. Mistura genética
A proporção de mistura genética das duas populações localizadas na
região Centro-Oeste brasileira – Estado de Goiás e Distrito Federal – foi
estimada utilizando os quatro marcadores uniparentais do tipo STR situados no
cromossomo Y e a inserção AluYAP. Esses marcadores são informativos para
análise de mistura, pois mostram diferenças de freqüências entre as
populações parentais.
Os resultados da análise de mistura gênica indicam a participação das
três principais populações que povoaram o país, o que corrobora os dados
históricos de que a população do Centro-Oeste é trihíbrida, a exemplo do
restante do Brasil. A contribuição de linhagem européia na região Centro-Oeste
brasileira foi substancialmente maior - cerca de 80,0% - em ambas as
populações em comparação com as outras parentais. A contribuição da
linhagem africana foi em torno de 10% e da ameríndia menos de 10,0%. Esses
dados, similares aos obtidos para os haplogrupos de cromossomo Y, também
evidenciam o sucesso reprodutivo dos homens europeus e euroderivados,
também caracterizado por possuírem condições sócio-econômicas melhores
que os demais.
V.1.4. Marcadores genéticos Y-específicos: uma comparação
De acordo com os dados gerados a partir de AMOVA utilizando os loci
STRs observamos uma diferença estatisticamente significante entre as
populações de Goiás e Distrito Federal. Porém, essa diferença não foi
observada para os marcadores do tipo SNPs. Para os dois casos, a exemplo
Discussão
97
do que sempre ocorre com análises de populações humanas, a maior parte da
diferenciação genética foi verificada dentro das comunidades e a menor entre
elas. Como há uma diferença entre as populações na análise dos STRs, o
percentual da variação observada cuja fonte é definida a partir das diferenças
interpopulacionais é maior na análise por STRs. Esse dado é interessante, uma
vez que o poder informativo dos STRs suplantou a distinção haplotípica
observada na análise de 11 SNPs associado à inserção AluYAP.
V.1.4.1. Associação SNPs/STRs/AluYAP
A taxa relativamente alta de mutação dos microssatélites do
cromossomo Y o faz útil para o propósito de se comparar grupos populacionais
relativamente próximos em comparação com populações que divergiram há
muito tempo atrás. Estes marcadores sozinhos oferecem pouco auxílio para
traçar eventos ancestrais na evolução humana. Mas, combinados com
marcadores de mutações pontuais do cromossomo Y podem revelar
eficientemente a origem de populações humanas e a história de sua migração.
Associados, os marcadores do tipo STRs e SNPs, podem ser, provavelmente,
o melhor método de escolha para investigar a evolução humana quanto a
contribuição masculina (Kayser et al., 1997a).
Apesar do poder de discriminação já conseguido pela quantidade de
alternativas alélicas e, conseqüentemente, haplotípicas obtidas para os
marcadores de microssatélites, os dados dos marcadores de evento único
(SNPs) foram adicionados visando aumentar ainda mais esse poder. A
construção dos haplótipos associados SNPs/STRs/AluYAP revelou 118
haplótipos para 200 cromossomos analisados, isto é, aproximadamente 61,0%
mais haplótipos do que quando considerou-se os STRs exclusivamente. Com
isso, o poder de discriminação aumentou substancialmente.
A diversidade gênica (Nei 1973) da população do Distrito Federal foi
similar (0,990±0,0002) à do Estado de Goiás (0,993±0,0001). Já a análise de
AMOVA realizada para esse conjunto de dados mostrou resultados
semelhantes aos já descritos para os marcadores STR analisados
separadamente, isto é, as populações apresentam diferenças estatisticamente
Discussão
98
significativas (p= 0,029±0,002), sendo que novamente a maior porcentagem de
variação encontrou-se dentro das populações.
V.2. Contribuição uniparental feminina
A análise da variabilidade do DNA mitocondrial tem sido uma ferramenta
potente no entendimento da evolução humana (Ingman e Gyllensten, 2001).
Uma das abordagens que tem levado ao estabelecimento das relações
filogeográficas entre grupamentos humanos é a análise da variabilidade desse
genoma (Alvaréz et al., 2001). No presente trabalho analisamos treze SNPs
localizados na região codificadora do DNA mitocondrial e uma deleção de 9pb
na região COII/tRNALys, em amostras de indivíduos não relacionados
maternalmente das populações do Distrito Federal e Goiás. Esses marcadores
foram selecionados visando à avaliação da presença/ausência de haplogrupos
característicos de linhagens ameríndias, africanas e européias, ou seja, das
principais populações parentais brasileiras. Essas análises permitiram a
definição dos haplogrupos da maioria dos indivíduos amostrados, assim como
a determinação da origem filogeográfica dos mesmos.
O haplogrupo mitocondrial mais freqüente em ambas as populações foi
o A (Goiás – 17,8% e Distrito Federal – 15,5%), seguido, no Estado de Goiás
pelo haplogrupo B e C e no Distrito Federal, pelo C e B. O haplogrupo D
apresentou freqüência mais baixa e similar em ambas as populações. Os
subhaplogrupos do haplogrupo L foram, em conjunto, também bastante
comuns, sendo que os mesmos apresentaram uma freqüência maior no Estado
de Goiás do que no Distrito Federal. Porém, em ambos os casos, essa
proporção foi menor do que as dos haplogrupos A a D. Já o haplogrupo H foi o
menos freqüente nas duas populações.
Análises filogenéticas do genoma mitocondrial de ameríndios revelou
que a maioria é classificada dentro de quatro grupos distintos de linhagens,
pertencentes aos haplogrupos A, B, C e D (Horai et al., 1993; Salzano, 2002;
Starikovskaya et al., 2005). É postulado que os haplogrupos A, C e D, que
representam 58,0% do DNA mitocondrial encontrado no Sul da Sibéria, vieram
para a América a partir do Norte da Sibéria cruzando o estreito de Bering. A
Discussão
99
presença da deleção de 9-pb, característica do haplogrupo B, pode ter chegado
mais tarde ou, alternativamente, vindo de outra região, pois está virtualmente
ausente na Sibéria e é encontrado em baixa freqüência no Norte da América do
Norte. Ainda, a diversidade na seqüência dos haplótipos pertencentes ao
haplogrupo B em nativos americanos é menor do que a observada quanto aos
haplótipos pertencentes aos haplogrupos A, C ou D. Na Ásia, o haplogrupo B é
encontrado principalmente na costa, na Mongólia, Tibet e em Taiwan (Torroni
et al., 1993a; Merriwether e Ferrell, 1996). Em amostras de ameríndios da
Amazônia, os haplogrupos A e C foram os mais freqüentes e o haplogrupo B, o
menos freqüente (Mendes-Júnior, 2005). Em outro estudo foram observadas as
quatro linhagens, sendo que a freqüência dos haplogrupos A, B e C foram
similares e o D foi o menos freqüente (Santos et al., 1996).
No estudo aqui apresentado, verificamos a presença de todos os
haplogrupos característicos de ameríndios, que somados representaram 48,9 e
43,7% das amostras do Estado de Goiás e Distrito Federal, respectivamente.
Esses dados evidenciam a alta contribuição desse grupo parental na
constituição da população do Centro-Oeste.
Diversos estudos já foram realizados na América com populações
miscigenadas utilizando o genoma mitocondrial na estimativa de contribuição
dos grupos parentais. Por exemplo, em populações afro-colombianas nenhum
dos haplogrupos característico de ameríndios foi identificado (Rodas et al.,
2003). No Uruguai, país em que se assumiu por muito tempo que a população
era euroderivada e que a contribuição biológica da população ameríndia e de
afrodescendentes era ínfima, foram encontrados, na cidade de Tacuarembo,
62% de haplogrupos ameríndios (Bonilla et al., 2004). Em outra cidade do
Uruguai, Melo, o genoma mitocondrial mostrou que 29% das linhagens eram
ameríndias (Sans et al., 2002). Em um trabalho com brasileiros autodefinidos
como “brancos” foi observado que 33% das linhagens pertencentes a quatro
das cinco regiões do país (exceto Centro-Oeste) são ameríndias (Alves-Silva et
al., 2000), sendo que a maior freqüência foi observada no Norte e a menor no
Sul do país. Em populações afrodescendentes urbanas e semi-isoladas
brasileiras foram encontradas, em baixa freqüência, haplogrupos ameríndios
com pequenas variações entre essas comunidades (Abe-Sandes et al., 2002).
Discussão
100
No presente trabalho observou-se um predomínio de linhagens ameríndias nas
amostras do Centro-Oeste, como já comentado.
Entre europeus, mais de 98,0% da variação dos haplogrupos de DNA
mitocondrial são categorizados nos haplogrupos H, I, J, K, M, T, U, V, W e X.
Dentre os haplogrupos característicos de origem européia, o H apresenta a
mais alta freqüência (Torroni et al., 1996), tendo sido observado em 45,7% dos
dados SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods)
(Budowle et al., 2003). Além do H, os haplogrupos europeus mais comuns no
conjunto de dados do SWGDAM são U (15,6%), T (10,5%), J (10,0%) e K
(8,9%), sendo que estes valores observados são similares a outras análises
publicadas (Budowle et al., 2003). O haplogrupo U é encontrado também em
populações africanas, porém em baixas freqüências (Torroni et al., 1996).
Foram investigados os haplogrupos H, J, K e T na população do Centro-
Oeste, porém apenas o H foi observado, sendo que 10,85% da população do
Estado de Goiás e 11,30% no Distrito Federal pertencem a esse haplogrupo. O
haplogrupo H é o mais freqüente (27 a 65%) na maioria dos indivíduos
autodeclarados “brancos” brasileiros analisados por Alves-Silva et al. (2000) e
em brancos do sudeste brasileiro (Abé-Sandes, 2002). Somente a região Norte
apresentou dois haplogrupos (H e T) como os mais freqüentes (Alves-Silva et
al., 2000).
Os haplogrupos T e J foram encontrados em amostras de brasileiros das
quatro regiões analisadas com freqüências se estendendo de 3 a 27% (Alves-
Silva. et al., 2000). Já em amostras de descendentes de asiáticos e afro-
brasileiros urbanos e semi-isolados, esses mesmos haplogrupos não foram
observados (Abé-Sandes, 2002). O haplogrupo K foi encontrado em baixa
freqüência em amostras de asiáticos e de “brancos” (Abé-Sandes, 2002).
O macrohaplogrupo L* é africano sendo que a maior parte dos mesmos
(68,0% a 100,0%) pertence ao haplogrupo L (Chen et al., 2000). Destes, o
haplogrupo L1 é considerado o mais ancestral dos haplogrupos africanos, e o
L2, o mais recente (Chen et al., 2000). Os haplogrupos maiores (L1 e L2) são
freqüentes em Moçambique e em brasileiros com ancestralidade africana
(Brehm et al., 2002). Dentre os haplogrupos analisados que caracterizam as
Discussão
101
linhagens africanas, o haplogrupo menor L1 foi o mais freqüente nas
populações do Estado de Goiás e do Distrito Federal.
O haplogrupo mais freqüente em três das quatro regiões brasileiras foi o
L3e, mas na região Sul o haplogrupo L3d apresentou freqüência preponderante
(Alves-Silva et al., 2000). Já em populações afro-descendentes semi-isoladas e
urbanas de Salvador, o haplogrupo L3a é o mais freqüente (Abé-Sandes,
2002). Os haplogrupos L3d e L1b, específicos do Oeste da África, ocorrem em
uma freqüência de 10% de indivíduos brasileiros autodeclarados “brancos”
(Alves-Silva et al. 2000). Para este par de haplogrupos, freqüências maiores
são encontradas no Oeste da África: 25,0% no Senegal e 17,0% entre os
indivíduos de Songhai, Yoruba, Hausa, e Kanuri. Isto sugere que a maioria das
linhagens de DNA mitocondrial ancestral africano nas amostras brasileiras teve
sua origem na África Central (a qual inclui Camarões e Angola), embora um
número substancial deve ter vindo do Oeste da África (Bortolini et al., 1997;
Alves-Silva et al., 2000).
Nem todas as amostras analisadas neste trabalho foram classificadas
dentro das linhagens de DNA mitocondrial, totalizando 6,2% das amostras
estudadas na população de Goiás e 11,3% no Distrito Federal. Consideramos
essas como amostras “não-ameríndias/ não-africanas” pois não exibiam
nenhum dos sítios de restrição analisados. Possivelmente esses indivíduos
pertencem a linhagens européias não analisadas.
Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre as
populações (p>0,05) para todos os loci de DNA mitocondrial analisados.
Valores F
st
locus a locus demonstram a alta homogeneidade da amostra em
relação a esse conjunto de marcadores.
V.2.1. Mistura genética utilizando marcadores do DNA mitocondrial
Foram realizadas comparações entre os dados obtidos no presente
estudo e dados da literatura referentes a uma amostra de indivíduos
autodeclarados como “brancos” de quatro das cinco regiões brasileiras e do
Brasil como um todo (Alves-Silva et al., 2000). Como não há diferenças quanto
aos haplogrupos de DNA mitocondrial entre as populações de Goiás e do
Discussão
102
Distrito Federal, o conjunto amostral foi agrupado e denominado “Centro-
Oeste”.
A distribuição das freqüências dos haplogrupos do DNA mitocondrial
agrupados por origem geográfica (ancestralidade) dos dados da literatura
mostra que a proporção das linhagens européias, africanas e ameríndias são
muito similares, quando se considera o país como um todo (Alves-Silva et al.,
2000). Já nas amostras do Centro-Oeste houve um predomínio de linhagens
ameríndias. Porém, as regiões Norte e Sudeste, apresentaram os haplogrupos
característicos de linhagens ameríndias/asiáticas com maior freqüência, similar
ao aqui observado.
A comparação par a par dos resultados obtidos pelos marcadores de
DNA mitocondrial entre as cinco regiões brasileiras e o Brasil, utilizando o
método F
st
mostrou valores discrepantes, estatisticamente significativos
(p<0,05), entre a população do Centro-Oeste e as regiões Sudeste, Sul e o
conjunto amostral denominado Brasil. Apesar da amostra de Alves-Silva et al.
(2000) ser composta por indivíduos autodeclarados como “brancos”, foi
observada diferença estatisticamente significativa nos haplogrupos observados
entre as regiões Sudeste e Nordeste e entre a região Sul e todas as regiões do
país. Essas diferenças encontradas entre a região Sul e as demais regiões
brasileiras devem refletir o processo de povoamento do país e a subseqüente
miscigenação. A região Sul ainda hoje é a região brasileira com maior
contingente de eurodescendentes não miscigenados, sendo encontradas, por
exemplo, cidades que são redutos de países europeus, sendo que seus
habitantes mantêm laços culturais fortes com os países de origem.
Com relação às estimativas de mistura genética baseada nos
haplogrupos do DNA mitocondrial, não foram observadas diferenças na
composição das populações de Goiás e Distrito Federal e do conjunto amostral
(Centro-Oeste brasileiro). Porém, a comparação dos dados aqui gerados com
dados da literatura mostrou diferenças estatisticamente significantes entre o
Centro-Oeste e todas as regiões brasileiras para pelo menos um dos grupos
parentais. A região Sul do país foi a que mostrou o maior volume de
discrepâncias.
Discussão
103
Essas diferenças devem ser decorrentes das amostras utilizadas por
Alves-Silva et al. (2000) serem de indivíduos autodefinidos como “brancos”. Por
outro lado, as diferenças entre o Brasil como um todo e as várias regiões
devem refletir as diferenças regionais na composição do povo brasileiro e que
indivíduos que se autodeclaram brancos em uma dada região não apresentam
o mesmo perfil genético que em outra.
V.3. Comparação entre a contribuição parental masculina e feminina
O objetivo deste trabalho foi a caracterização da contribuição genética
parental em duas amostras urbanas da região Centro-Oeste brasileira
utilizando marcadores genéticos de herança uniparental. Esses marcadores (Y-
específicos e situados no DNA mitocondrial) podem fornecer informações sobre
os padrões de fluxo gênico entre homens e mulheres e serem úteis para
detectar cruzamento direcional. Esses marcadores, associados aos
autossômicos, descrevem a história global de mistura (Martinez-Marignac et al.,
2004).
Em populações miscigenadas, a contribuição genética parental
específica através da análise de marcadores uniparentais pode ser de
diferentes proporções devido ao cruzamento direcional durante o processo de
mistura genética. A análise de mistura baseada em DNA, especialmente
aquelas que utilizam marcadores situados no cromossomo Y e DNA
mitocondrial, são especialmente interessantes porque se pode determinar a
contribuição materna e paterna, inclusive ao nível individual (Sans, 2000).
V.4. Comparação individual: Y versus DNA mitocondrial
A avaliação do compartilhamento de origem geográfica entre as
linhagens materna e paterna em um mesmo indivíduo revelou que em Goiás
menos de 15,0% apresentaram tanto o cromossomo Y e o DNA mitocondrial de
mesma origem (doze de linhagem européia, seis de linhagem africana e um de
linhagem ameríndia). A grande maioria dos indivíduos apresentou a linhagem
paterna distinta da materna. Quando o cromossomo Y foi identificado ser de
linhagem européia, a contribuição uniparental feminina mostrou-se pertencer as
Discussão
104
três linhagens: ameríndia, africana e européia. A proporção dessa contribuição
é diferenciada nessa observação, sendo a contribuição ameríndia com quase
50%, seguida pela africana e menor proporção, a européia. Analisando o
Distrito Federal verificamos que a maioria dos indivíduos é oriunda de
miscigenação, pois menos de 20% apresentaram tanto o cromossomo Y
quanto o mitocondrial de mesma origem (treze de linhagem européia e um de
linhagem africana). Os demais indivíduos apresentaram a linhagem materna de
origem geográfica distinta da paterna.
Considerando a contribuição uniparental masculina africana no Estado
de Goiás, observa-se a contribuição materna das três linhagens sendo, uma
maior freqüência da africana, seguida da ameríndia e uma pequena parcela da
européia. Já na população do Distrito Federal a contribuição materna é
predominante de ameríndios seguidos de uma pequena porcentagem de
africanos. Não foi encontrado indivíduo portando simultaneamente linhagem
paterna africana com linhagem materna européia nessa última população. Para
os indivíduos que apresentam Y advindos da Europa (linhagem européia),
observamos que a contribuição materna novamente aparece com as três
linhagens (ameríndia, africana e européia), caracterizando o cruzamento
preferencial de homens europeus com mulheres ameríndias, seguidos em
menor proporção, de mulheres africanas seguido de européias.
Analisando a contribuição uniparental paterna como sendo de linhagem
ameríndia foi observado apenas um indivíduo em cada população, sendo que a
contribuição materna do indivíduo do Estado de Goiás foi ameríndia e o do
Distrito Federal não foi possível ser identificada com a utilização dos sítios de
restrição analisados. Semelhante a essa contribuição observou-se que a
asiática não foi observada na população do Estado de Goiás e foi revelada em
apenas um indivíduo na população do Distrito Federal, sendo que a
contribuição materna desse indivíduo também não foi identificada.
Em resumo observa-se, claramente, através da análise da contribuição
genética individual, que houve um cruzamento preferencial entre homens
europeus e mulheres, seqüencialmente, ameríndias, africanas e européias. Os
dados do cromossomo Y e do DNA mitocondrial mostram evidências de
Discussão
105
contribuição genética advindas das três populações parentais que colonizaram
o país.
V.5. Comparação populacional: Y versus DNA mitocondrial
A análise de mistura genética baseada na origem geográfica dos
haplogrupos mostrou que a contribuição paterna européia foi semelhante nas
populações de Goiás e no Distrito Federal (~ 90,0%), porém a contribuição
materna européia observada para as mesmas populações foi bem inferior.
Goiás apresentou uma contribuição africana paterna (10,0%) e materna
(34,9%) maior do que o Distrito Federal (5,6% e 26,7%, respectivamente). A
contribuição ameríndia mostrou uma enorme discrepância entre a contribuição
materna e paterna: 48,9% e 0,8% em Goiás e 43,7% e 2,8% no Distrito
Federal.
As análises mostram uma predominância da parental européia na
constituição da população da região Centro-Oeste brasileira, quando se refere
ao cromossomo Y. Os outros dois grupos parentais, africanos e ameríndios,
mostraram-se em um pequeno percentual sendo que a contribuição parental
africana é mais expressiva que a ameríndia. Já nas análises do DNA
mitocondrial observa-se o inverso, sendo a maior contribuição para a região de
linhagens ameríndias, seguidas de africanas e européias.
Como relatado acima, a análise de nossos dados mostra que a maioria
dos haplogrupos do cromossomo Y originou da Europa, seguidos pelos
haplogrupos africanos e uma limitada participação de haplogrupos ameríndios.
Quando a contribuição ameríndia é analisada, todos os resultados são
coerentes em sugerir que a contribuição feminina é muito maior do que a
contribuição masculina. (Bortolini et al., 1999; Sans, 2000;). Tal afirmativa é
confirmada com a análise do DNA mitocondrial que revela resultados diferentes
dos obtidos com marcadores situados no cromossomo Y. Observa-se a maioria
dos haplogrupos sendo de linhagem ameríndia em ambas as populações,
seguidas de linhagens africanas e uma pequena fração de linhagens
européias. Nossos dados demonstram uma diferença entre a contribuição
Discussão
106
masculina e feminina para a constituição genética da população da região
Centro-Oeste brasileira.
Várias análises têm sido realizadas com o intuito de verificar a proporção
de mistura genética em populações. A introdução de genes europeus através
dos homens em indivíduos afroderivados habitantes da área urbana do
Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil foi confirmada utilizando marcadores
autossômicos e um uniparental (Bortolini et al., 1999). Em análises de
marcadores STRs autossômicos, em cinco regiões brasileiras, a contribuição
européia mostra-se substancialmente superior às demais populações parentais
(Callegari-Jacques et al., 2003). Dados semelhantes foram observados em
populações da América Latina onde se observou o fluxo gênico entre homens
europeus e mulheres nativas americanas (Bonilla et al., 2004). O mesmo foi
observado em indivíduos afrodescendentes dos Estados Unidos, estimada com
alelos específicos de populações, DNA mitocondrial e com o marcador AluYAP
onde os resultados indicam que a contribuição masculina européia foi maior
que a contribuição feminina (Parra et al., 1998).
A comparação de dados de marcadores STRs autossômicos com dados
de DNA mitocondrial (de Alves-Silva et al., 2000) de populações de quatro das
cinco regiões do Brasil, revelou contribuições distintas, sendo que as
estimativas obtidas com STRs mostrou uma maior contribuição européia
enquanto que o DNA mitocondrial mostrou uma presença eqüitativa entre as
três parentais (Callegari-Jacques et al., 2003). Outro trabalho com indivíduos
afroderivados do Sul do país utilizando dados de marcadores biparentais,
revela a presença de genes europeus e africanos na mesma proporção no pool
de genes nucleares desta população. Entretanto, sugere uma assimetria, com
mulheres africanas e homens europeus contribuindo em proporções maiores
para a formação daquela população (Bortolini et al., 1999).
Análises utilizando marcadores situados no DNA mitocondrial em
indivíduos brasileiros urbanos autodeclarados como “brancos”, das diferentes
regiões geográficas, demonstram que há diferença na contribuição parental
feminina. A maior parcela de contribuição de linhagens ameríndias foi nas
regiões Norte e Sudeste, enquanto que no Nordeste foi africana e na região
Sul, a européia (Alves-Silva et al., 2000). Ressalte-se que esse resultado da
Discussão
107
região Sul, com um percentual superior a 60,0% pode ser reflexo da amostra
analisada (indivíduos autodeclarados “brancos”), e ainda por essa região ser
fundamentalmente formada por comunidades de descendentes de europeus.
Já nas análises de marcadores situados no cromossomo Y em indivíduos que
se autodeclararam como “brancos” (Carvalho-Silva et al., 2001) de regiões
geográficas brasileiras distintas, houve um predomínio de ancestrais europeus
(68,0 a 81,0%), com uma ínfima contribuição de linhagens africanas (0,11% a
0,18%) seguidas de ameríndias (0,07 a 0,18%). Esse resultado, reprodução
preferencial do homem europeu, é similar ao observado por outros autores,
tanto para populações urbanas como a aqui descrita, como para populações
semi-isoladas como remanescentes de quilombos (Bortolini et al., 1999;
Carvalho-Silva et al., 2001; Alves-Silva et al., 2000)
Estes dados confirmam os relatos históricos e sociológicos do
povoamento brasileiro. Houve um cruzamento interétnico assimétrico em
relação ao sexo no Brasil colonial, entre homens europeus e mulheres
africanas e ameríndias, os quais contribuíram desproporcionalmente para o
povoamento do país (Salzano e Freire-Maia, 1970; Callegari-Jacques et al.,
2003). Esse cruzamento proporcionou uma mistura genética entre homens
derivados de europeus com mulheres derivadas de africanos e/ou ameríndios,
com uma ínfima proporção em relação a descendentes de seu próprio
continente.
No presente trabalho, uma alta contribuição de homens europeus em
relação a homens africanos e ameríndios e uma maior contribuição de
mulheres ameríndias do que de outros grupos étnicos. Assim, analisar mistura
com o objetivo de entender melhor nosso passado, enriquecido pelo uso de
marcadores moleculares uniparentais, mostra a possibilidade de escrever mais
claramente a história, considerando a contribuição masculina e feminina.
Conclusões
108
VI. CONCLUSÕES
1. A população do Centro-Oeste foi fundada predominante por homens
YAP - (ausência de inserção). A alta freqüência do alelo ausência de
inserção pode refletir contribuição européia e/ou ameríndia e uma baixa
contribuição africana;
2. Os marcadores bialélicos situados no cromossomo Y revelaram que a
maioria dos loci é polimórfico, a exceção dos loci M60, M34 e P3, os
quais apresentaram monomorfismo;
3. A diversidade gênica, considerando os doze loci bialélicos situados no
cromossomo Y, foi similar nas duas populações;
4. A população do Estado de Goiás apresentou seis haplogrupos todos
compartilhados com o Distrito Federal, sendo que este apresentou
outros dois haplogrupos – R1b8 e D1. Apesar do maior número de
haplogrupos, a diversidade gênica foi similar nas duas populações;
5. A análise de AMOVA dos dados dos marcadores binários do
cromossomo Y confirmou a similaridade genética entre as duas
populações;
6. Haplogrupos Y-específicos característicos dos três principais grupos
étnicos fundadores da população brasileira foram observados em ambas
as populações. Destes, a linhagem européia perfaz a grande maioria;
7. As estimativas de freqüência de contribuição genética para as duas
populações, baseados em haplogrupos Y-específicos, são similares em
relação à origem européia e africana e são estatisticamente diferente
com relação à contribuição ameríndia/asiática;
8. Ambas as populações apresentaram polimorfismo para todos os
marcadores do tipo STRs analisados;
9. A análise de AMOVA dos marcadores do tipo STRs mostrou alta
variabilidade dentro das populações e uma diferença estatisticamente
significativa entre elas;
10. Semelhante ao resultado obtido para os marcadores do tipo SNP, os
marcadores do tipo STRs apresentam alta diversidade gênica;
Conclusões
109
11. De acordo com a análise de mistura genética estimada com os dados
dos marcadores STRs, a maior parcela de contribuição para a formação
da região Centro-Oeste foi homens com origem européia;
12. A análise conjugada dos marcadores do tipo SNPs e STRs mostrou que
ambas as populações apresentam alta variabilidade e diferenças
estatisticamente significativas entre elas;
13. Foi observada a presença dos haplogrupos de DNA mitocondrial
característicos das três principais populações parentais. Dentre as três
origens, a maior contribuição foi da ameríndia, seguida da africana e, em
menor proporção da européia;
14. Semelhante aos marcadores do tipo SNPs, não foi observada diferença
estatisticamente significativa entre as populações para todos os loci de
DNA mitocondrial analisados;
15. Há diferença significativa quanto à contribuição dos três grupos
parentais, europeu, africano e ameríndio, para a população do Centro-
Oeste quando se comparam os valores obtidos com os dados dos
marcadores do cromossomo Y e com os dados do DNA mitocondrial;
16. Em ambas populações, quando o cromossomo Y identificado foi de
linhagem européia, a contribuição uniparental feminina pertencia a uma
das três linhagens parentais, sendo a maioria de origem ameríndia,
seguida pela africana, tendo, a européia sido minoria, o que caracteriza
o cruzamento direcional.
Referências Bibliográficas
110
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Referências Bibliográficas
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Anexos
130
VIII. ANEXOS
Anexo 1: Termo de consentimento utilizado na coleta do material biológico
dos indivíduos do Estado de Goiás.
TERMO DE CONSENTIMENTO
Eu, _____________________________________, natural de
________________,nascido em ___/__/____, portador do R.G.
nº.__________________SSP____, residente
em_______________________________filho
de__________________________________(natural de
__________________________) e
de_________________________________(natural
de__________________________) de
etnia:_________________________________________________________________
____
_____________________________________________________________________
_____
Telefone: ___________________
Declaro para os devidos fins:
I. que fui convidado (a) a participar de uma pesquisa científica que tem por objetivo
estabelecer um banco de dados de DNA da população do Estado de Goiás, onde serei
submetido a uma coleta sanguínea venosa com um volume de 5,0 ml (cinco mililitros);
II. que me foi explicado que o material coletado será utilizado exclusivamente para
análise de freqüência de marcadores genéticos da população;
III. que me foi explicado a finalidade do estudo e os benefícios que dele a ciência
possa vir a ter;
IV. que me foi explicado e garantido que posso recusar a participar do presente
estudo;
V. que me foi garantido sigilo dos dados pessoais acima discriminados;
VI. que os resultados obtidos nessa pesquisa poderão ser publicados em periódicos e
eventos científicos ou quaisquer outros veículos de comunicação;
VII. que não fui submetido à transfusão sanguínea e/ou transplante de medula óssea;
VIII. que, por livre e espontânea vontade, concordo em participar deste estudo e após
ler e sem ter quaisquer dúvidas, assino.
____________________________, ____/_____/20___
____________________________________________
Doador
____________________________________________
Testemunha com R.G.
____________________________________________
Pesquisador responsável
____________________________________________
Pesquisador responsável
Anexos
131
Anexo 2: Termo de consentimento livre e esclarecido utilizado na coleta do
material biológico dos indivíduos do Distrito Federal.
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E MORFOLOGIA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO, PÓS-
INFORMAÇÃO
O abaixo assinado,
________________________________________________ declara ter sido
plenamente esclarecido, lido e ouvido o presente termo de responsabilidade
que lhe informa estar ciente do seguinte:
a) Que pelo presente documento concorda em participar da pesquisa “Brasília:
reflexo da constituição genética brasileira?” visando a caracterização genética
da população brasiliense e a comparação desta com populações urbanas
brasileiras.
b) Que esta participação implicará na retirada de aproximadamente 5ml de
sangue de uma das veias do antebraço sendo que este material será utilizado
com finalidade de tipagem sangüínea, análise hemoglobina, extração de DNA,
análise de marcadores moleculares e marcadores protéicos e isoenzimáticos.
c) Que esse procedimento é método usual na pesquisa genética, não
implicando risco para a saúde, podendo, porém, provocar um pouco de dor.
d) Que a recusa em participar do projeto poderá ser feita a qualquer tempo
mesmo após a assinatura do presente termo de consentimento e ficará livre
para abandonar a pesquisa a qualquer momento bastando a comunicação aos
responsáveis do projeto.
Brasília, _____ de ______________de 2001
Assinatura : ________________________________________________
Documento de identidade: ____ ________________________________
Responsável pela pesquisa: ___________________________________
Anexos
132
Anexo 3: Questionário demográfico utilizado na coleta de dados relativo aos
indivíduos do Distrito Federal
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E MORFOLOGIA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA - PROJETO BRASÍLIA
Nome: No.
Endereço: Telefone:
E-mail: Estado civil:
Data de nascimento: Sexo: [ ] F [ ] M
Classificação fenotipica : ( ) Br ( ) Ng ( ) Am
(Ind)
Se misto
( ) Traços de Caucasóide
( ) Traços de Negróide
( ) Traços de Indígena
( ) Traços de Asiático
( ) Outros (especificar)
Ascendência materna:
Ascendência paterna:
( ) Am (Asia) ( ) Misto
|
|
| Foto 3 X 4
|
Peso :
Altura :
Pressão arterial 1 :
Pressão arterial 2:
Grau de Instrução: Profissão:
Local de residência dos pais na data do nascimento:
Filiação
Pai : Mãe :
Local de nascimento : LN :
Avó paterna : Avó materna :
LN : LN :
Avô paterno : Avô materno :
LN: LN:
Tempo em Brasília (dos pais) :
Motivo da mudança :
Irmãos ? ( ) Masc ( ) Fem.
Gêmeos ? ( ) Não
( ) Gêmeo Uni. ( ) Masc. ( ) Fem.
( ) Gêmeo Bi. ( ) Masc. ( ) Fem.
( ) Irmão Gêmeo Uni. ( ) Masc. ( ) Fem.
( ) Irmão Gêmeo Bi. ( ) Masc. ( ) Fem. Outro:
Alguma doença genética na família: Qual (is):
Afetados:
Nome do cônjuge: Data de nascimento:
Consangüinidade entre os cônjuges
LN: Obs : Se nascido em Brasília, fazer
ficha à parte
No. de filhos : Gêmeos? No. de abortos espontâneos:
No. de natimortos : Causa:
No. de filhos mortos: Causa:
Nome: Sexo: ( )masc. ( )fem.
LN: Idade:
Nome: Sexo: ( )masc. ( )fem.
LN: Idade:
Nome: Sexo: ( )masc. ( )fem.
LN: Idade:
OBS:
Anexos
133
Anexo 4: Processamento de amostras para estocagem
O intuito deste procedimento foi à separação do material biológico
em três frações sanguíneas, são elas: plasma, creme leucocitário e hemácias.
Esta etapa caracterizou-se por sucessivos processos de centrifugação e lavagem
do sangue total com salina.
4.1 Reagentes:
9 Salina 0,9%;
9 Glicerol a 40% em citrato tripotássio 0,1M, KH
2
PO
4
0,0345M, K
2
HPO
4
0,0344M
4.2 Procedimento:
a) Identificar três tubos de polipropileno de 1,5 ml com o número de
registro do protocolo;
b) Centrifugar a amostra (3000 rpm) por cinco minutos;
c) Retirar o plasma e estocar;
d) Retirar o creme leucocitário e estocar para posterior extração do DNA;
e) Acrescentar solução salina 0,9%, homogeneizar e centrifugar;
f) Repetir os procedimentos duas vezes mais;
g) Após a última centrifugação, retirar o sobrenadante e adicionar tampão
glicerol 40%;
h) Estocar para análise de proteínas eritrocitárias e como fonte de DNA;
i) Estocar em freezer a 20º C negativos.
Anexos
134
Anexo 5: Protocolos de extração de DNA
5.1Extração de DNA segundo método proposto por Higuchi (1989)
A técnica descrita por Higuchi (1989) foi utilizada para extração de
DNA a partir da fração de hemácias.
5.1.1 Reagentes e soluções:
9 Tampão para lise de eritrócitos: Tris/HCl 0,01M pH 7,6; sacarose 0,32
M; MgCl
2
5mM; Triton X-100 1%.
9 Tampão para lise de leucócitos: Tris/HCl 0,01M pH 8,5; KCl 50 mM;
MgCl
2
2,5 mM; NP-40 0,45%; Tween 20 (ou 80) 0,45%.
9 Proteinase K 10 mg/ml.
5.1.2 Procedimento:
a) Transferir 300 μl da fração de hemácias e leucócitos para um microtubo
de polipropileno de 1,5 ml estéril;
b) Adicionar 1,0 ml do tampão de lise de eritrócitos e homogeneizar;
c) Centrifugar a 12.000 rpm por 1 minuto e descartar o sobrenadante;
d) Repetir esse procedimento até que o precipitado fique claro, indicando
ausência de contaminação com hemoglobina. Normalmente três vezes
são suficientes;
e) Ressuspender o precipitado em 300 μl de tampão de lise de leucócito
acrescido de 5 μl de solução de proteinase K;
f) Manter em estufa regulada a 65°C por 1 hora;
g) Manter em estufa regulada a 37ºC durante uma noite;
h) Aquecer a solução a 94ºC por 10 minutos para inativar a proteinase K;
i) Estocar a 20ºC negativos.
5.2 Extração de DNA segundo o Kit “GFX
TM
Genomic Blood Purification Kit”
– adquirido da Amersham Pharmacia Biotech Inc.
Anexos
135
1ª etapa:
a) Adicionar, em um tubo de microcentrífuga, 300 μl da amostra de sangue
e três volumes da solução de lise pré-aquecida a 70ºC;
b) Homogeneizar o tubo por inversão;
c) Incubar a temperatura ambiente por cinco minutos;
d) Centrifugar em alta rotação (12000 rpm) por vinte segundos;
e) Remover o sobrenadante, por aspiração, tomando-se o cuidado para
não atingir o aglomerado de células brancas;
2ª etapa:
a) Ressuspender as células brancas;
b) Adicionar 500 μl da solução de extração;
c) Homogeneizar vigorosamente;
d) Incubar por 5 (cinco) minutos em temperatura ambiente.
3ª etapa:
a) Transferir para a coluna GFX;
b) Centrifugar (5000 rpm) por 1 minuto;
c) Descartar o volume do tubo coletor;
d) Aplicar à coluna GFX novo volume de 500 μl de tampão de extração;
e) Centrifugar (5000 rpm) por 5 minutos;
4ª etapa:
a) Adicionar 500 μl de solução de lavagem à coluna GFX;
b) Centrifugar em alta rotação (12000 rpm), durante 3 minutos;
c) Descartar e transferir a coluna para um novo tubo coletor;
5ª etapa:
a) Adicionar 100-200 μl de água mili-Q (pré-aquecida) à coluna GFX;
b) Incubar em temperatura ambiente por 1 minuto;
Anexos
136
c) Centrifugar (8000 rpm) por 1 minuto, para a recuperação do DNA
purificado.
5.3 Extração de DNA segundo o Kit “Puregene – Gentra-Systems” –
adquirido da Biosystems
1ª etapa:
a) Adicionar 300 μl da amostra de sangue e 900 μl de solução de lise RBC
a um tubo de centrífuga;
b) Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto;
c) Inverter gentilmente o tubo várias vezes durante a incubação. No caso
de sangue coletado dentro de uma hora, o tempo de incubação é
aumentado para 3 minutos para assegurar completa lise das células
vermelhas;
d) Centrifugar (13000 rpm) por 20 segundos;
e) Remover o sobrenadante, deixando-se cerca de 20 μl de líquido residual;
f) Submeter o tubo a uma vigorosa agitação, durante 10 segundos, visando
facilitar a ressuspensão das células;
g) Adicionar 300 μl de solução de lise celular;
2ª etapa:
a) Adicionar um volume de 100 μl de solução de precipitação de proteína
ao lisado celular;
b) Agitar vigorosamente por 20 segundos;
c) Centrifugar (13000 rpm) por 1 minuto;
3ª etapa:
a) Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um tubo “eppendorf” de
1,5 ml;
b) Adicionar 300 μl de isopropanol a 100%;
c) Homogeneizar o material;
Anexos
137
d) Centrifugar (13000 rpm) por 1 minuto;
e) Lavar várias vezes em 300 μl de etanol a 70%;
f) Descartar o sobrenadante;
g) Verter o tubo sobre papel absorvente para secar;
4ª etapa:
a) Adicionar 100 μl de solução de hidratação de DNA;
b) Homogeneizar;
c) Incubar a 65ºC por 5 minutos para acelerar a hidratação;
d) Agitar o tubo por inversão para adequada homogeneização da amostra;
e) Armazenar as amostras de DNA purificadas a 4ºC (estocagem rápida) e
a –20ºC (estocagem longa).
Anexos
138
Anexo 6: Quantificação de DNA em gel de agarose a 0,8% e em gel de
poliacrilamida a 6%.
Para estimar a concentração de DNA em cada amostra, assim como
para analisar as mesmas quanto ao seu estado de integridade antes da
diluição, foi utilizada a técnica de quantificação de DNA em gel de agarose a
0,8%.
O gel de agarose a 0,8% foi preparado em solução de TBE 1X, com
volume final de 100 ml em um molde de 150 x 100 mm e 3,0 μl de Brometo de
Etídeo (10 mg/ml da solução estoque). Após a polimerização por 30 minutos, o
gel foi retirado da placa e colocado em uma cuba de eletroforese horizontal
contendo TBE 1X, apresentando dimensões internas de 300 x 157 x 50 mm.
a) O sistema para quantificação foi preparado com um volume final de 15
μl, sendo 1,0 μl de DNA em solução estoque, 3,0 μl de tampão de
amostra 5x e 11,0 μl de água mili-Q;
b) As amostras foram aplicadas em sua totalidade e submetidas a uma
corrente de 1volt/cm por 30 minutos;
c) Após a corrida eletroforética, o gel era colocado em solução TBE 1x
contendo Brometo de Etídeo (EtBr) na proporção de 2,0 μl de EtBr para
100 ml de solução durante 15 minutos.
d) O DNA foi avaliado e quantificado visualmente, comparando com
padrões pré-estabelecidos no laboratório utilizando um transiluminador
de luz ultravioleta (Macro VUE, Hoefer, modelo UVIS-20);
e) Após a quantificação das amostras, foram preparadas alíquotas de
trabalho diluídas para uma concentração de 20 ng/μl.
Quantificação de DNA em gel de poliacrilamida a 6%
a) As alíquotas diluídas a 20 ng/μl foram novamente quantificadas em gel
de poliacrilamida a 6%, preparado com solução TBE 1X com volume
total de 35 ml para o molde de 160x160 mm, com espaçador de 1mm de
Anexos
139
espessura. Após a polimerização de 60 minutos, o gel era colocado em
uma cuba de eletroforese vertical com dimensões internas de 170 x 165
mm, sendo aplicada uma corrente de 1 Volt/cm por 30 minutos.
b) O sistema para quantificação era preparado colocando-se 6,0 μl de água
mili-Q, 2,0 μl de tampão de amostra 5x e 2,0 μl do DNA diluído a 20ng/
μl.
c) Após a corrida, o gel era corado com solução de nitrato de prata e a
leitura realizada visualmente conforme descrito anteriormente.
Anexos
140
Anexo 7: Reação em Cadeia da Polimerase
7.1 Reagentes e soluções:
9 Amostras de DNA genômico
9 Tampão de reação (Tris/HCl 0,2 M pH 8,5; KCl 0,5 M; MgCl
2
0,02 M)
9 Solução de dNTP 20 mM;
9 Taq DNA Polimerase;
9 Solução de trabalho dos iniciadores:
a) Diluir os iniciadores com água mili-Q esterilizada para uma
concentração de 50 μM utilizando-se para base de cálculo a
quantidade de nano moles obtidos na síntese dos mesmos (dados
fornecidos pelo fabricante);
b) Aliquotar os iniciadores diluídos (100 μl por frasco);
c) Estocar em freezer –20ºC até o momento do uso;
d) Para uso na PCR, preparar soluções de trabalho, com os dois
iniciadores necessários para a amplificação de cada região
genômica selecionada, na concentração de 10 μM de cada iniciador.
** Observação: Todas as reações foram realizadas tomando-se o
cuidado com o controle de qualidade interno, utilizando controles
positivo e negativo para cada sistema.
7.2 Procedimento:
a) Descongelar as amostras de DNA genômico a serem analisadas;
b) Numerar microtubos de polipropileno de 0,5 μl (número da PCR e
número de ordem);
c) Preparar uma mistura de reagentes da PCR suficientes para o número
de indivíduos em análise, conforme Tabela 1;
d) Acrescentar o DNA genômico de cada indivíduo na quantidade de cada
sistema a ser analisado no respectivo microtubo;
e) Iniciar o programa correspondente a região genômica a ser amplificada.
Anexos
141
Tabela 1: Reagentes (em µl) utilizados para amplificação de fragmentos específicos via PCR para os marcadores
genéticos analisados (SNPs, STRs, elemento Alu e DNA mitocondrial).
Reagentes (μl) SNPs DYS19 DYS390 DYS391 DYS393 YAP
DNA
mitocondrial
H
2
O 16,50 16,435 16,435 16,75 17,00 14,685 16,50
Tampão 10 X (Biotools) 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50
DNTP (25 mM) 2,00 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 2,00
Iniciadores (0,5 μM de cada iniciador)
2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 1,00
MgCl
2
* 1,00 1,00 1,00 0,75 0,75 *
Taq DNA polimerase (Biotools - 1U/μl)
1,00 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 1,00
DMSO - 0,315 0,315 - - 0,315
DNA (20 a 40 ng/μl)
1,00 2,00 2,00 2,00 2,00 4,00 1,00
Total 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00
* Nos marcadores do tipo SNPs e do DNA mitocondrial a enzima Taq polimerase utilizada apresentava MgCl2 em solução (2,0 mM), por isso, não se
adicionava tampão à reação de PCR.
Anexos
142
Tabela 2: Condições da PCR para os loci Y-específicos e do DNA
mitocondrial.
Condições de PCR
Passo Temperatura (ºC) Tempo
DYS19
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
94
94
58
72
4 vezes os passos 2, 3 e 4
94
54
72
29 vezes os passos 6, 7 e 8
72
04
3’
30”
1’
1’
30”
1’
1’
10’
Indefinido
DYS390
DYS391
DYS393
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
94
94
63
72
4 vezes os passos 2, 3 e 4
94
58
72
29 vezes os passos 6, 7 e 8
72
04
3’
30”
1’
1’
30”
1’
1’
10’
Indefinido
YAP 1
2
3
4
5
6
7
94
94
51
72
29 vezes os passos 2, 3 e 4
72
04
2’
1’
1’
1’
10’
Indefinido
SNPs 1
2
3
4
5
6
7
94
94
TA (Tabela III.5)
72
35 vezes os passos 2, 3 e 4
72
04
5’
1’
20”
1’
10’
Indefinido
Anexos
143
DNA mitocondrial 1
2
3
4
5
6
7
8
94
TA (Tabela III.7)
72
94
50
35 vezes os passos 3, 4 e 5
72
04
5’
1’
1’10’’
40’’
30”
10’
Indefinido
Anexos
144
Anexo 8: Digestão enzimática
A análise por RFLP (Restriction fragment length polymorphism) consiste em
amplificar as regiões de interesse e submeter à digestão enzimática, utilizando
enzimas específicas. O preparo do sistema, no geral, foi da seguinte forma:
a) Preparava-se um mix contendo tampão da enzima diluído a 1x e 5,0 U
da enzima;
b) Adicionava 5,0 μl do produto de PCR;
c) Após a vedação da placa, incubava-se em banho-maria (temperatura e
tempo específicos de cada enzima) ;
d) Após a incubação os produtos de digestão eram visualizados em gel de
agarose a 2,5% ou em gel de poliacrilamida a 10%.
Anexos
145
Anexo 9: Reação de seqüenciamento
A reação de seqüenciamento requer duas reações distintas. Uma PCR
inicial e, posteriormente, a submissão de seu produto ao seqüenciamento, sendo
que, em cada reação, utiliza-se iniciadores específicos, além de deoxinucleotídeos
especiais (Kit Big Dye Terminator), específicos para o seqüenciador automático da
Perkin-Elmer ABI 377.
a) Para a PCR inicial, foram utilizados de 1,0 μl a 2,0 μl do DNA extraído e
purificado. Foram seqüenciadas as amostras para marcadores binários -
M89, M213, P2, M60, M34 e P3 - situados no cromossomo Y.
b) A reação de seqüenciamento era composta por 2,0 μl de Big Dye, 1,3 μl
de iniciadores e 2,0 μl do produto de PCR.
c) Dessa maneira uma fita simples do DNA foi amplificada, em 25 ciclos nas
seguintes condições: 96ºC por 25’’; 50ºC por 20’’; 72ºC por 1’30’’.
d) Posteriormente, estas reações foram submetidas a um procedimento de
precipitação através da adição de etanol e acetato de potássio 3M.
e) Em seguida, as amostras foram aplicadas no gel de seqüenciamento,
nos fornecendo os resultados para cada uma das fitas de DNA, os quais
foram analisados visando a busca das regiões flanqueadoras ao sítio de
inserção ou deleção (Abé-Sandes, 2002).
Anexos
146
Anexo 10: Procedimento para eletroforese - Análise do produto de PCR
10.1 Gel de Poliacrilamida – Eletroforese vertical
10.1.1 Soluções
9 Tampão TBE 10X pH 8,0 (Tris/HCl 0,89 M, EDTA 0,08 M, Ácido Bórico
0,89 M);
9 Solução de acrilamida a 29% + bis-acrilamida a 1%;
9 Glicerol;
9 TEMED (N,N,N’,N’, tetrametiletilenodiamina);
9 Persulfato de potássio ou amônia a 0,1%.
10.1.2 Preparo das amostras para aplicação no sistema de eletroforese
As amostras foram preparadas para eletroforese adicionando-se tampão de
corrida, acrescido do corante bromofenol. A seguir será demonstrada a
especificidade do preparo para cada marcador analisado.
Para os marcadores microssatélites, adicionou-se formamida (900 µl de
formamida para 300 µl de corante) ao tampão de corrida. As amostras foram
submetidas a um aquecimento físico a 95ºC por 10 (dez) minutos antes da
aplicação no gel, favorecendo a desnaturação com o intuito de abrir a dupla
fita de DNA. Imediatamente após a desnaturação, as amostras foram
submetidas a um choque térmico (imersão em gelo) e posteriormente
aplicadas nos poços do gel de poliacrilamida desnaturante.
10.1.3 Procedimento
a) Após a assepsia das placas de vidro, montar as placas com espaçadores
prendendo com grampos de aço;
b) Preparar uma solução de poliacrilamida nas concentrações de 6% (gel
6%) ou 10% (gel 10%) na proporção conforme Tabela 3;
c) Adicionar a esta solução, se necessário, 35% de glicerol;
d) Adicionar os catalisadores TEMED e Persulfato de Amônia na proporção
conforme consta na Tabela 3;
e) Inserir rapidamente o gel não polimerizado pela borda superior e colocar o
pente;
Anexos
147
f) Tempo médio de polimerização: 30 minutos.
10.1.4 Condições de pré-corrida do gel de poliacrilamida
Nos sistemas em que a análise foi realizada em gel de poliacrilamida,
realizou-se uma pré-corrida, onde somente o gel era submetido em voltagem
fixa de duzentos Volts por um tempo de vinte minutos. Em todos os
procedimentos de eletroforese, iniciou-se a corrida com uma voltagem mais
baixa, em torno de 80 Volts, para que as amostras iniciassem a saída do poço
uniformemente. Após 20 minutos a voltagem ideal foi ajustada a cada
sistema.
Após a pré-corrida e verificação das condições ótimas de corrida, os poços
foram novamente limpos com tampão TBE 1X. Posteriormente foram
aplicadas todas as amostras no gel juntamente com os padrões dos alelos
dos respectivos marcadores intercalando a cada três ou quatro amostras.
Para os sistemas de STRs e o M3, os produtos de PCR foram submetidos a
eletroforese com voltagem constante de 200V e amperagem variável. O
tempo de corrida era específico para cada sistema variando de acordo com o
tamanho dos fragmentos amplificados: 3h50’ para o DYS19, DYS390 e
DYS391; 2h30’ para o DYS393, e para o M3 o tempo de corrida era em torno
de 1h30’. Em relação aos produtos do sistema AluYAP, estes foram
submetidos a uma voltagem de 150 Volts por um período 1h50’. Logo após a
eletroforese, os géis seguiam para o procedimento final de coloração,
utilizando nitrato de prata (Sanguinetti et al., 1994).
10.1.5 Leitura dos géis
As determinações dos perfis alélicos e genotípicos foram realizadas por
comparações visuais entre os alelos padrões e o alelo presente em cada
amostra. As leituras dos géis foram realizadas com auxílio de um
transiluminador – Macro VUE UVIS-20 - com luz branca (visível). Uma
segunda leitura dos resultados foi confirmada posteriormente utilizando-se a
escolha de amostras ao acaso.
Anexos
148
Tabela 3: Componentes e quantidades do preparo do gel de poliacrilamida
Gel não desnaturante Gel desnaturante
Componentes do gel
6% 10% 10%
H20 mili-Q (ml) 15,75 9,6 9,6
Uréia* (g) - - 9,6
Acrilamida + bisacrilamida (ml) 5,0 6,6 6,6
Glicerol (ml) 1,75 1,4 -
Tampão TBE 10X pH 8,0 (ml) 2,5 2,0 2,0
TEMED (μl)
18 15 15
Persulfato de Amônia 0,1% (μl)
350 300 300
* No preparo do gel desnaturante, primeiro adiciona-se uréia à água. Aquecer por 1 minuto no
forno de microondas para melhor dissolução do soluto. Após essa etapa inicial, o preparo
segue as mesmas etapas do gel não desnaturante.
10.1.6 Eletroforese: montagem e condições
a) Diluir o tampão TBE 10X na proporção 1:10;
b) Colocar o tampão diluído na parte inferior da cuba;
c) Retirar os grampos e os pentes da placa;
d) Lavar as bordas superiores e inferiores do gel com água deionizada;
e) Montar o gel na cuba de eletroforese;
f) Preencher a parte superior da cuba com tampão TBE diluído;
g) Lavar os poços dos géis com auxílio de pipetador ou seringa Hamilton;
h) Aplicar as amostras (7,0 μl de produto de PCR e 3,0 μl de tampão de
corrida);
i) Conectar a cuba com a fonte;
j) Estabelecer a voltagem máxima pretendida (de acordo com o sistema
analisado) e liberar a amperagem.
10.1.7 Coloração do gel de poliacrilamida com Nitrato de Prata
10.1.7.1 Soluções
9 Solução fixadora: Etanol (144,0 ml), Ácido acético (6,0 ml) e Água
deionizada (750,0 ml)
9 Solução de Prata: Nitrato de prata (0,2%g + 10,0 ml de água deionizada)
9 Solução Reveladora: Hidróxido de sódio (22,5g) e água deionizada (q.s.p.
1000 ml)
Anexos
149
10.1.7.2 Procedimento
a) Após desligar a fonte, desfazer a moldura do gel e transferi-lo para um
recipiente contendo 200 ml de solução fixadora (ácido acético a 10%);
b) Deixar permanecer nessa solução por aproximadamente 20 minutos;
c) Descartar a solução fixadora e lavar o gel em água deionizada três vezes
por aproximadamente 3 minutos cada;
d) Descartar a água e colocar a solução de nitrato de prata por 30 minutos;
e) Descartar a solução de nitrato de prata e lavar imediatamente o gel em
água deionizada por 20 segundos;
f) Adicionar a solução reveladora, agitar levemente até que a revelação
esteja completa;
g) Descartar o revelador e bloquear a reação com solução fixadora;
h) Proceder à leitura.
10.1.7.3 Secagem do gel
a) Solução
9 Solução de secagem: glicerol 40% em ácido acético 10%.
b) Procedimento
a) Hidratar duas folhas de papel celofane transparente;
b) Esticar uma das folhas em uma placa de vidro;
c) Colocar igual quantidade de solução de secagem suficiente para encobrir
a extensão do papel celofane a ser utilizado;
d) Colocar sobre o conjunto o gel a ser seco, devidamente etiquetado;
e) Colocar uma quantidade de solução de secagem suficiente para encobrir o
gel;
f) Estender a segunda folha de papel celofane hidratado sobre o gel;
g) Deixar secar a temperatura ambiente.
** Observação:
Metodologia de secagem alternativa do gel: colocar o gel por 2 horas
em água destilada e proceder à secagem sem o uso de solução de ácido
acético com glicerol.
Anexos
150
10.2 Gel de agarose – Eletroforese horizontal
10.2.1 Soluções
9 Agarose a 1% e 2,5%
9 TBE 1X
10.2.2 Procedimento
a) Após a assepsia da placa, montar o conjunto da mesma;
b) Preparar uma solução de agarose nas concentrações de 1% ou 2,5%.
Adicionar 2,0 μl do Brometo de Etídeo na solução de agarose. Usa-se o
gel a 1% para verificar os produtos de amplificação e o gel a 2,5% para
verificação dos produtos de digestão;
c) Inserir rapidamente o gel não polimerizado na placa e colocar o pente;
d) Tampar com papel alumínio e aguardar a polimerização;
e) Tempo médio de polimerização: 20 minutos.
10.2.3 Eletroforese: montagem e condições
a) Diluir o tampão TBE na proporção 1:10;
b) Colocar o tampão diluído na cuba;
c) Retirar o pente do gel;
d) Colocar o gel na cuba de eletroforese horizontal;
e) Aplicar as amostras (5,0 μl de produto de PCR e 5,0 μl de tampão de
corrida);
f) Conectar a cuba com a fonte;
g) Estabelecer a voltagem máxima pretendida (de acordo com o sistema
analisado) e liberar a amperagem.
h) Após o tempo de corrida, retirar o gel e analisar em luz ultravioleta.
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