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FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE PORTO ALEGRE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA GERAL E EXPERIMENTAL
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE
AMOSTRAS DE ENTEROCOCOS RESISTENTES À
VANCOMICINA (ERV) EM PORTO ALEGRE, R.S. (2002-2005).
Silvana Vargas Superti
Orientador: Prof. Dr.Pedro Alves d’Azevedo
Dissertação de Mestrado
Porto Alegre, 2006.
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Dedico este trabalho à pequena Clara,
com o amor maior do mundo, para que
desde já compreenda que o conhecimento
é o bem maior que se pode ter.
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AGRADECIMENTOS
À Coordenação e Professores do Programa de Pós Graduação em Patologia
Clínica da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre.
À Secretaria de Pós-Graduação.
Ao Professor Dr. Pedro Alves d’Azevedo, agradeço pela orientação e revisão
cuidadosa.
Aos colegas do Laboratório Weimann, Hospital Nossa Senhora da Conceição e
Complexo Irmandade Santa Casa de Misericórdia, pelo fornecimento das amostras.
Aos colegas do Laboratório de Cocos Gram positivos, Departamento de
Microbiologia desta Instituição.
Ao Professor Cícero Dias, pelo estímulo e pelo exemplo.
À colega Juliana Caierão, pela companhia e apoio nas quase intermináveis
tardes de Biologia Molecular.
Às técnicas de laboratório Maria Beatriz e Rosângela.
À professora Ana Paula Frazon, pelo estímulo e pela disponibilidade.
4
SUMÁRIO
Abstract................................................................................................................5
Resumo................................................................................................................6
Introdução.............................................................................................................7
Taxonomia............................................................................................................9
Descrição do Gênero Enterococcus..................................................................11
Infecções causadas por enterococos.................................................................13
Resistência aos antimicrobianos........................................................................15
Epidemiologia do ERV.......................................................................................31
Importância da identificação bioquímica ao nível de espécie ......................... 34
Detecção fenotípica de resistência em enterococos..........................................37
Genótipos de resistência aos Glicopeptídeos....................................................38
Objetivos Gerais e Específicos..........................................................................40
Referências Bibliográficas .................................................................................41
1º Artigo em Português.......................................................................................52
1º Artigo em Inglês..............................................................................................62
2º Artigo em Português.......................................................................................71
2º Artigo em Inglês..............................................................................................93
Anexos..............................................................................................................116
5
ABSTRACT
Enterococci are currently ascendant nosocomial pathogens. One of the major
reasons why these organisms have survived in the hospital environment is their
intrinsic resistance to several commonly used antimicrobials and their ability to
acquire resistance. First described in Europe, vancomycin-resistant Enterococci
(VRE) are nowadays disseminated worldwide, most of them presenting a
multiresistant profile. This study was conducted to characterise 240 isolates
vancomycin-resistant Enterococcus spp, recovered from three different hospitals in
Porto Alegre city, southern Brazil, between 2002 and 2005. The presence of
vancomycin resistance genes was determined by a polymerase chain reaction using
eigth oligonucleotide specific primers to amplify the vanA, vanB, vanC-1, vanC-2,
vanC-3, vanD, vanE and vanG genes. The isolates were identified at species level
by conventional biochemical tests and were evaluated for their in vitro susceptibility
to ampicillin, teicoplanin, gentamicin, streptomycin, chloramphenicol, rifampin,
erythromycin, ciprofloxacin, nitrofurantoin, fosfomycin and linezolid, by disk diffusion
method. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to vancomycin was determined
by E-test. All isolates were identified as Enterococcus faecalis and proved to harbour
the vanA gene in the PCR multiplex. All isolates showed MIC to vancomycin >256
g/ml and were resistant to gentamicin (high level). The most in vitro active
compound was linezolid, followed by fosfomycin and ampicillin resistance was
detected in a few isolates. The results of our study indicate high rates of resistance
between the isolates evaluated, what emphasize the need for infection control
measures.
Key words: vancomycin resistance, enterococi, PCR.
6
RESUMO
Enterococos estão cada vez mais entre os principais patógenos nosocomiais.
Fatores responsáveis pela sobrevivência deste microrganismo no ambiente
hospitalar são a resistência intrínseca a diferentes antimicrobianos utilizados na
prática clínica e sua capacidade de adquirir resistência. Enterococos resistentes à
vancomicina foram primeiramente descritos na Europa e encontram-se atualmente
disseminados em todo o mundo, a maioria apresentando fenótipos de multi-
resistência. Este estudo foi realizado com o objetivo de caracterizar 240 isolados de
Enterococcus sp, resistentes à vancomicina, isolados de três diferentes hospitais na
cidade de Porto Alegre, entre os anos de 2002 e 2005. A presença de genes
determinantes de resistência à vancomicina foi pesquisada pela técnica de reação
em cadeia de polimerase (PCR), utilizando oito diferentes primers específicos
( vanA, van B, vanC-1, vanC-2, vanC-3, vanD, vanE e vanG ) . A susceptibilidade in
vitro a ampicilina, teicoplanina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol,
rifampicina, eritromicina, ciprofloxacina, nitrofurantoina, fosfomicina e linezolida foi
determinada pelo método de difusão em ágar e a Concentração Inibitória Mínima
(CIM) à vancomicina pelo método de Etest. Todos os isolados foram identificados
como Enterococcus faecalis. Todos os isolados apresentaram CIM para a
vancomicina >256 g/ml e tiveram o gene vanA detectado na reação de PCR
multiplex. O agente mais ativo in vitro foi a linezolida, seguido da fosfomicina.
Resistência à ampicilina foi detectada em alguns poucos isolados. Os resultados
deste estudo demonstram altas taxas de resistência entre os isolados avaliados,
enfatizando a necessidade de medidas para o controle de sua disseminação.
Palavras chaves: resistência à vancomicina, enterococos, PCR.
7
INTRODUÇÃO
Os enterococos fazem parte da flora normal do trato gastrointestinal e do
trato genitourinário. São cocos Gram positivos, que crescem em forma de cadeias
curtas, aos pares ou em células isoladas. Podem estar envolvidos em uma grande
variedade de infecções em humanos, incluindo infecções do trato urinário,
infecções de feridas, bacteremias e endocardites.
São conhecidos por sua relativa baixa virulência, quando comparados com
outros cocos Gram positivos. No entanto, multiplicam-se em elevadas
temperaturas, em meio contendo alta concentração de sal e em ambientes com
ampla faixa de pH, o que lhes confere uma grande capacidade de sobrevivência
fazendo com que, uma vez estabelecidos em determinada área, sua erradicação
seja extremamente difícil, apresentando um desafio no controle da disseminação
de cepas patogênicas.
Na década de 80, na Europa, foi descrito o primeiro caso de
Enterococcus spp resistente à vancomicina (ERV). Foi prevista na época a
dificuldade no tratamento de possíveis infecções causadas por estes
microrganismos multi-resistentes. Diversos surtos causados por uma cepa
epidêmica do ERV foram descritos nos Estados Unidos e na Europa. No Brasil, o
primeiro caso de ERV foi descrito no ano de 1996 na cidade de Curitiba, no
Paraná. Rapidamente, este microrganismo foi descrito em outras regiões do país,
sendo isolado o primeiro ERV em Porto Alegre no ano de 2000.
Fatores de risco para aquisição do ERV são maiores em pacientes
transplantados e neutropênicos, pacientes em uso de terapia antimicrobiana, bem
8
como hospitalização prolongada. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que
as infecções pelo ERV podem ser causadas por microrganismo da flora
endógena, havendo, portanto, a possibilidade do paciente permanecer colonizado
por períodos muito longos, provavelmente disseminando este microrganismo.
Motivo de grande preocupação é também o risco de transmissão de material
genético do enterococo para microrganismos ainda mais virulentos.
Recentemente, nos Estados Unidos, isolados de Staphylococcus aureus
apresentando resistência plena à vancomicina (VRSA) foram relatados em dois
centros. Ambas as cepas continham o transposon Tn1546 carreando o gene
vanA. A habilidade deste gene para ser mobilizado entre cepas de S. aureus por
via plasmideal e a possibilidade de disseminação dessas cepas resistentes
representa uma séria ameaça à saúde pública, tanto a nível hospitalar como
comunitário.
Devido às limitações na terapia antimicrobiana das infecções causadas
por enterococos apresentando este perfil de multi-resistência, torna-se de grande
importância um melhor entendimento desse problema, através do conhecimento
dos mecanismos envolvidos na resistência aos glicopeptídeos e da obtenção de
dados de resistência a outras classes de antimicrobianos que poderiam
representar opções terapêuticas para o ERV em nosso meio.
Este é um estudo de prevalência, transversal, descritivo, realizado com
amostras provenientes de três diferentes hospitais de Porto Alegre, coletadas
entre o ano de 2002 e 2005. A inexistência de um estudo caracterizando as
amostras de enterococos resistentes à vancomicina em nosso meio, justifica a
realização deste trabalho.
9
TAXONOMIA
A palavra enterococo originou-se do termo francês entérocoque,
utilizado pela primeira vez no ano de 1899 por Thiercelin, descrevendo
bactérias vistas em pares e cadeias curtas, e enfatizando a origem intestinal
deste microrganismo. Em 1906, a denominação de Streptococcus faecalis foi
proposta por Andrews e Horder para identificar um organismo de origem fecal
capaz de fermentar manitol e lactose. Em 1919, foi descrito por Orla-Jensen
um segundo isolado de Streptococcus faecalis que diferia em padrões
bioquímicos do anterior, e foi então denominado Streptococcus faecium. Esta
nova denominação foi, no entanto, ignorada e este microrganismo considerado
como sendo também um Streptococcus faecalis (apud Facklam, Carvalho e
Teixeira, 2002). Sherman em 1937 propôs uma classificação onde os
estreptococos eram divididos em quatro grupos: piogênicos, viridans, lactico e
enterococo. Microrganismos que cresciam em temperaturas entre 10ºC e
45ºC, em pH elevado, eram tolerantes a substâncias inibitórias como cloreto de
sódio e sobreviviam a altas temperaturas, além de possuírem a capacidade de
hidrolizar a esculina foram então incluídos no grupo enterococos (apud
Facklam, Carvalho e Teixeira, 2002).
No início da década de 30, Lancefield criou uma classificação
sorológica, correlacionada com a classificação de Sherman, onde avaliava a
reação dos enterococos com anti-soros, sendo que os enterococos reagiam
com anti-soros do grupo D, os estreptococos piogênicos com anti-soros do
grupo A, B, C, D, E ou G, os estreptococos viridescentes eram não agrupáveis
e o S.bovis, classificado por Sherman como viridans mais tarde foi visto que
10
reagia com anti-soro do grupo D. Com o passar do tempo, as diferenças
bioquímicas entre o Streptococcus faecium e o Streptococcus faecalis
tornaram-se mais evidentes. Em 1960, a espécie Streptococcus faecium foi
incorporada à nomenclatura oficial (apud Murray, 1990). Em 1967, Nowlan e
Deibel acrescentaram ao grupo um microrganismo denominado Streptococcus
avium.
Em 1970, Kalina propôs a criação de um gênero para os estreptococos
do tipo enterococos, e propôs que, baseado em seu arranjo celular e
características fenotípicas, o Streptococcus faecalis e Streptococcus faecium
fossem denominados Enterococcus. Somente na década de 80, quando
Schleifer e Kilpper-Baltz, com base em experimentos de hibridização DNA-DNA
e DNA-RNA, demonstraram que as espécies S. faecalis e S. faecium
apresentavam graus de homologia muito baixos com as espécies integrantes
do gênero Streptococcus, fornecendo então evidências genéticas de que estes
microrganismos eram suficientemente diferentes para compor um gênero
próprio é que foi criado o gênero Enterococcus, havendo então a transferência
das espécies S. faecalis e S. faecium para o mesmo, que passaram a serem
reconhecidas como Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium,
respectivamente (Schleifer et al., 1984; Ludwig at al. 1985).
Mais tarde, novas espécies foram transferidas para o gênero, como
também outras foram descritas, e adicionadas a uma longa lista de espécies
que atualmente compõem o gênero Enterococcus (Svec et al., 2001; Teixeira et
al., 2001; Tyrrel et al., 2002; Carvalho et al., 2004).
11
DESCRIÇÃO DO GÊNERO ENTEROCOCCUS
São cocos Gram positivos, catalase negativos, que crescem em forma de
cadeias curtas, aos pares ou em células isoladas. Podem ser cocobacilares em
colorações preparadas a partir de cultura em ágar, porém tendem a serem
ovóides e em cadeias quando preparados a partir de culturas em caldo, algumas
espécies são móveis, são anaeróbios facultativos, crescem bem em temperaturas
que vão de 10ºC a 45ºC, em presença de NaCl a 6,5% , hidrolisam a esculina em
presença de sais biliares e não contém a enzima citocromo-oxidase (Teixeira e
Facklam, 2003). Os testes laboratoriais utilizados para a identificação presuntiva
do gênero Enterococcus incluem a hidrólise da bile-esculina e do L-leucina-β-
naftilamida (LAP), a reação de PYR (pyrrolidonyl-ß-naphthylamide) e o
crescimento em meios contendo NaCl a 6,5% (Teixeira e Facklam, 2003).
Entre as numerosas espécies de enterococos descritas,
aproximadamente 80 a 90% das infecções em humanos são causadas por E.
faecalis, 5 a 10% por E. faecium e, ocasionalmente, são isolados E. durans, E.
casseliflavus, E. gallinarum e E. hirae (Kak e Chow, 2002; Teixeira e Facklam,
2003). Em 1989, foi proposta por Facklam e Collins uma metodologia
simplificada para a identificação de espécies de enterococos, utilizando provas
bioquímicas que permitiam a divisão em grupos. Estas provas incluíam a
hidrólise da arginina e a fermentação de alguns carboidratos como manitol,
sorbitol e sorbose (Facklam e Collins, 1989). Mais tarde, foi proposta a inclusão
de testes complementares, para auxiliar na diferenciação entre as espécies de
enterococos e de microrganismos relacionados, sendo então distribuídos em
12
cinco grupos, de acordo com suas características bioquímicas (Facklam, Sahm
e Teixeira, 1999).
O grupo I é formado por sete espécies, capazes de formar ácido a partir do
manitol e sorbose, porém não hidrolizam a arginina. São identificadas pelas
reações com arabinose e rafinose, pela capacidade de utilizar o piruvato e
eventual pigmentação. Fazem parte deste grupo: E. avium, E. maldoratus, E.
raffinosus, E. pseudoavium, E. saccharolyticus, E. pallens e E. gilvus.
O grupo II é formado por cinco espécies, capazes de formar ácido a partir
do manitol e hidrolizar a arginina. Fazem parte deste grupo os Lactococcus
spp, devido às semelhanças apresentadas entre algumas espécies isoladas em
humanos, especialmente L.gergoviae e L.lacti. Fazem parte deste grupo: E.
faecalis, L. spp, E. faecium, E. casseliflavus, E. mundtii e E. gallinarum.
O grupo III é formado por três espécies, todos capazes de hidrolizar a
arginina e incapazes de formar ácido a partir do manitol, da sorbose e do
sorbitol. Fazem parte deste grupo: E. durans, E. hirae e E.dispar.
O grupo IV é também formado por três espécies, incapazes de hidrolizar a
arginina e de formar ácido a partir do manitol e da sorbose. Fazem parte deste
grupo: E. asini, E. sulfurens e E. cecorum.
O grupo V é formado por cinco espécies diferentes, sendo três delas
variantes de E. casseliflavus, E. gallinarum e E. faecalis que não são capazes
de hidrolizar a arginina.
13
INFECÇÕES CAUSADAS PELOS ENTEROCOCOS
Os enterococos são considerados patógenos importantes, tanto
em infecções comunitárias, como em infecções nosocomiais
(Malani et al.,
2002). A importância dos enterococos como patógenos nosocomiais foi
reconhecida na década de 70, paralelamente ao aumento considerável da
resistência adquirida aos antimicrobianos comumente utilizados. Este
grupo de microrganismos atua, na maioria das vezes, como patógeno
oportunista, especialmente em pacientes idosos, com doença de base
grave, imunocomprometidos, hospitalizados por longos períodos ou que
fazem uso de terapia antimicrobiana de amplo espectro (Murray, 1990;
Hancock e Gilmore, 2000; Malani et al., 2002).
A maioria das infecções nosocomiais é causada por Enterococcus
faecalis e Enterococcus faecium sendo as mais comuns as infecções do
trato urinário, freqüentemente associadas à instrumentação ou a
anormalidades estruturais, devido à alta capacidade de translocação deste
microrganismo. São seguidas pelas infecções de feridas que normalmente
envolvem sítios abdominais ou pélvicos e também podem estar envolvidos
em endocardites, como complicação de bacteremias em pacientes críticos
com infecções associadas a cateteres intravenosos (Rouff et al., 1990;
Bonten et al., 2001; Malani et al. 2002).
Estudos de prevalência têm mostrado que os enterococos estão
freqüentemente envolvidos em infecções de sítio cirúrgico (17,1%), sendo a
segunda causa de infecções de feridas e de bacteremias nos Estados
Unidos (Gilmore et al., 2002).
São considerados também, o segundo
14
agente mais prevalente em infecções do trato urinário (ITU), sendo
responsáveis por cerca 10% de todas as ITU (Schaberg et al., 1991) e 15%
das ITU nosocomiais (Richards et al., 2000). Enterococcus são
freqüentemente os agentes etiológicos de endocardites (Hancock e
Gilmore, 2000).
Outras infecções, menos comuns, atribuídas aos enterococos
são: meningites, osteomielites, artrite séptica e pneumonia, sendo esta
última extremamente rara e na maioria das vezes, atribuída ao uso de
cursos longos de antibióticos, em pacientes imunocomprometidos (Malani
et al., 2002).
Enterococos apresentando resistência à vancomicina em nada
diferem dos enterococos susceptíveis à vancomicina, quanto ao espectro
de infecções por eles causadas e também não existem evidências que
indiquem que causem mais infecção que os enterococos apresentando
maior susceptibilidade aos antimicrobianos (Malani et al., 2002), embora
representem um maior desafio no tratamento de infecções graves, como
também na sua erradicação do trato gastro-intestinal de pacientes
colonizados devido à escassez de antimicrobianos com efeito bactericida
sobre os mesmos (Linden, 2002; Kauffmann, 2003).
15
RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS E OPÇÕES
TERAPÊUTICAS
Os enterococos são intrinsecamente resistentes a uma grande
variedade de antimicrobianos, como as cefalosporinas, penicilinas
resistentes a penicilinases, co-trimoxasol, clindamicina e aminoglicosídeos
(com exceção de níveis elevados). Quando comparados a outros
estreptococos, os enterococos são também relativamente resistentes às
penicilinas (Murray, 1990; Cetinkaya et al., 2000; Kauffmann, 2003).
Tem sido ainda demonstrado um aumento crescente na
resistência, seja por aquisição de genes de resistência através de
plasmídeos ou transposons de outras bactérias ou por mutações
espontâneas (Murray, 1990; Cetinkaya et al., 2000). A aquisição de genes
de resistência tem sido facilitada por uma série complexa de plasmídeos,
transposons e elementos cromossômicos que apresentam uma faixa ampla
de hospedeiros, fazendo com que o acesso a esses elementos seja
relativamente fácil, em um ambiente contendo uma flora bacteriana mista e
em constante mudança, como é o trato gastrintestinal (habitat natural dos
enterococos), permitindo com isto que os enterococos adquiram, com
relativa facilidade, determinantes de resistência a diversas classes de
antimicrobianos (Kak e Chow, 2002).
Apesar da publicação de diversos trabalhos estudando os
enterococos multirresistentes (Cetinkaya et al., 2000; Bonten, 2001; Linden,
16
2002; Kauffmann, 2003; Bethea, 2004), ainda não se conhece a melhor
abordagem terapêutica diante de infecções graves causadas por
enterococos resistentes aos glicopeptídeos, os quais, muitas vezes,
também se mostram resistentes aos demais antimicrobianos comumente
utilizados no tratamento de infecções por bactérias gram-positivas (Linden,
2002; Kaufmann, 2003).
O fenótipo de multiresistência adquirido pelo enterococo além de
tornar extremamente limitadas, muitas vezes, as opções de tratamento das
infecções, ainda lhes proporciona uma capacidade muito grande de
sobrevivência no ambiente hospitalar repleto de antimicrobianos (Kak and
Chow, 2002; Harbarth et al. 2002; Kauffman, 2003).
São bastante escassos os dados de resistência de amostras
brasileiras de Enterococcus, sendo que os dados disponíveis são, em sua
maioria, restritos à região sudeste e centro-oeste (Stern, Carvalho e
Teixeira, 1994; Cereda et al., 1997; Mondino et al., 2003 Titze-de-Almeida
et al., 2004) e na região sul, até o momento, apenas os trabalhos de
d’Azevedo e colaboradores (2004; 2006).
Aminoglicosídeos
Este grupo de antimicrobianos atua sobre os cocos Gram
positivos por interferência na síntese protéica, ligando-se
irreversivelmente a uma ou mais proteínas receptoras específicas da
subunidade 30S ribossomal e interferindo com o complexo de iniciação,
17
entre ARNm e a subunidade 30S, resultando na formação de proteínas
não funcionais. A resistência dos enterococos a este grupo pode ser
dividida em intrínseca e adquirida (Kak e Chow, 2002). A maioria dos
enterococos apresenta Concentração Inibitória Mínima (CIM) para os
aminoglicosídeos entre 14 a 64 µg/ml, ou seja, concentrações muito
maiores que os níveis séricos alcançados com doses usuais. Esta
resistência deve-se provavelmente ao fato da absorção dos
aminoglicosídeos através da parede celular bacteriana ser um processo
dependente de oxigênio e o metabolismo dos enterococos ser
essencialmete anaeróbio, fazendo com isto que o antimicrobiano não
penetre no interior da célula bacteriana em concentração suficiente para
atingir o seu alvo que é o ribossomo. Este é considerado um “baixo nível”
de resistência, fazendo com que os aminoglicosídeos não sejam efetivos
em monoterapia contra os enterococos. No entanto, quando um agente
contra a síntese da parede celular como os beta-lactâmicos ou
glicopeptídeos é combinado com um aminoglicosídeo, a entrada deste na
célula bacteriana é aumentada muitas vezes, resultando em um efeito
sinérgico bactericida (Chow, 2000; Kak e Chow, 2002).
Os enterococos possuem a capacidade de desenvolver
resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos por três diferentes
mecanismos: alteração na molécula alvo, interferência com o transporte
do antibiótico e degradação enzimática do antibiótico. Os primeiros dois
tipos de resistência são devidos à mutação cromossômica, enquanto o
terceiro geralmente é mediado por plasmídios. As enzimas podem ser:
fosfo-transferases (APHs), acetiltransferases (AACs) ou
18
nucleotidiltransferases (ANTs). Quando presentes nos enterococos, a
CIM aos aminoglicosídeos pode muitas vezes aumentar para 2000
µg/ml.
Na década de 90, Saraiva e colaboradores (1997), avaliando a
atividade in vitro de diferentes agentes antimicrobianos frente a 87
amostras clínicas de ERV isoladas em 97 diferentes hospitais norte-
americanos ainda no ano de 1992, observaram taxas bastante elevadas
de resistência aos aminoglicosídeos gentamicina e estreptomicina (82% e
85%, respectivamente). Yazgi et al (2002) realizaram um estudo que
objetivava comparar as taxas de resistência em alto nível aos
aminoglicosídeos entre enterococos susceptíveis e resistentes a
vancomicina. Foram considerados resistentes os isolados que
apresentavam resistência a gentamicina e/ou estreptomicina. Foi
observada uma taxa duas vezes maior de resistência entre os
enterococos resistentes a vancomicina, quando comparados aos
susceptíveis.
No Brasil, em estudo realizado por Cereda e colaboradores
(2002), avaliando 23 isolados de E. faecium resistentes à vancomicina,
todos os isolados (100%) apresentaram resistência in vitro a níveis
elevados de gentamicina. Em outro estudo, realizado por Cordeiro e
colaboradores (2004), avaliando a atividade de diferentes antimicrobianos
contra 73 E. faecalis também resistentes à vancomicina, isolados de nove
diferentes hospitais brasileiros, foi também observada 100% de
resistência in vitro a níveis elevados de gentamicina.
19
Um estudo realizado por d’Azevedo e colaboradores (2006),
avaliando a diversidade genética de um grande número de isolados
provenientes de três diferentes hospitais na cidade de Porto Alegre,
isolados entre 1996 e 1997, todos susceptíveis à vancomicina, sugere a
disseminação intra e inter-hospitalar de um grupo clonal predominante de
Enterococcus faecalis, apresentando resistência aos aminoglicosídeos,
sendo observada neste estudo uma alta taxa de resistência (24,8% ) à
níveis elevados de gentamicina. Outros estudos brasileiros relatam
também altas taxas de resistência à níveis elevados de aminoglicosídeos,
variando de 39% (Stern et al.,1994) até aproximadamente 55%
(d’Azevedo et al., 2001) entre isolados susceptíveis à vancomicina.
Beta lactâmicos
Os enterococos possuem uma resistência natural a esta classe de
antimicrobianos devido à baixa afinidade de suas proteínas ligadoras das
penicilinas (PBPs) a estes agentes. Esta resistência é variável entre os
diferentes agentes desta classe, sendo que de um modo geral, as
penicilinas têm a melhor atividade, os carbapenêmicos têm alguma
atividade e as cefalosporinas praticamente não têm atividade contra os
enterococos, a ponto de não poderem ser usadas no tratamento de
infecções e inclusive, podendo levar a superinfecções (Cetinkaya et al.,
2000; Teixeira e Facklam, 2003). A ampicilina é o beta-lactâmico que
demonstra a melhor atividade in vitro. Ainda assim, a CIM geralmente
fica na faixa de 1,0 a 16 g/ml, muitas vezes mais alta que as CIMs dos
estreptococos, que geralmente se situam entre 0,006 e 0,25 g/ml. As
20
CIMs para a ampicilina geralmente são maiores entre E.faecium, quando
comparados com E.faecalis. Isolados clínicos de E. faecium e, mais
raramente E. faecalis, podem desenvolver alto nível de resistência à
ampicilina, podendo apresentar CIMs de 256 g/ml ou ainda maiores
(Fontana et al., 1996; Kak e Chow, 2002).
Nos últimos anos, níveis muito altos de resistência aos beta-
lactâmicos têm sido descritos em E. faecium, com CIMs para a penicilina
muitas vezes superiores a 128 g/ml (Murrray, 2000; Teixeira, e Facklam,
2003) . Em alguns hospitais, estima-se que mais de 90% dos E.faecium
sejam resistentes à ampicilina. O mecanismo de resistência envolvido é,
na maioria das vezes, uma super produção de um PBP com baixa
afinidade natural aos antibióticos beta lactâmicos ou ainda, a mutação
para um tipo de PBP com afinidade ainda menor (Murray, 2000). Nove
diferentes PBPs foram descritas até o momento (Murray, 2000; Kak e
Chow, 2002). Embora raro, outro mecanismo de resistência possível é a
produção de lactamases (Murray, 2000). Para sua detecção, o CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute) recomenda o teste da
cefalosporina cromogênica ou Nitrocefin
®
. Dentro da espécie faecalis, a
resistência à esta classe de antimicrobianos, embora menos freqüente,
tem sido descrita por alguns autores. Em estudo conduzido por Titze-de-
Almeida e colaboradores (2004), onde foi avaliada a atividade in vitro de
99 isolados de enterococos isolados em unidades de terapia intensiva em
dois hospitais brasileiros, resistência à ampicilina foi observada em 12%
dos isolados de E.faecalis. Em outro estudo, realizado por Maschieto e
colaboradores (2004), avaliando a resistência aos antimicrobianos em
21
enterococos isolados do trato gastro-intestinal de pacientes internados em
um hospital universitário brasileiro, foi descrita uma resistência à penicilina
entre isolados de Enterococcus faecalis, igual a 9,8%. Em estudo
realizado por d’Azevedo e colaboradores (2004), avaliando a atividade de
diferentes antimicrobianos frente a 455 isolados de Enterococcus spp,
provenientes de cinco diferentes instituições localizadas na cidade de
Porto Alegre, resistência à ampicilina foi observada em 8 isolados de
Enterococcus faecalis.
Cloranfenicol
A resistência a este grupo de antimicrobianos é devida, na
maioria das vezes, a presença da enzima acetil-transferase (CAT), a qual
confere resistência por acetilar o grupo hidroxil da molécula do
cloranfenicol, resultando em um produto incapaz de ligar-se ao ribossoma
bacteriano. Outro mecanismo de resistência ao cloranfenicol já
demonstrado é a presença de uma bomba de efluxo capaz de jogar o
antimicrobiano para fora da célula bacteriana (Kak e Chow, 2002).
Apesar do uso pouco freqüente deste antimicrobiano na
maioria dos hospitais, estima-se que grande parte dos enterococos
apresente resistência. No entanto, as taxas atuais de resistência dos
enterococos ao cloranfenicol não são conhecidas, uma vez que não são
publicados com freqüência estudos em grande escala avaliando a
atividade deste antimicrobiano frente a este microrganismo.
22
Em estudo brasileiro, realizado por Titze-de-Almeida e
colaboradores (2004), onde foi avaliada a atividade de diferentes classes
de antimicrobanos frente a enterococos isolados em Unidades de Terapia
Intensiva, sendo 75 E. faecalis e 9 E. faecium, foi observado um nível
significativo de resistência (36,8%) ao cloranfenicol entre isolados de E.
faecalis. Todos estes isolados, no entanto, mostravam-se susceptíveis
aos glicopeptídeos. Níveis semelhantes de resistência são descritos em
estudo realizado por d’Azevedo e colaboradores (2004) onde 24,8% de
um total de 455 enterococos avaliados apresentaram resistência a este
antimicrobiano.
Os dados brasileiros publicados avaliando a atividade deste
antimicrobiano frente ao ERV são ainda mais escassos. Reis e
colaboradores (2001) avaliaram a atividade do cloranfenicol frente a 33
isolados de enterococos resistentes à vancomicina. Foi observada uma
melhor atividade contra Enterococcus faecium com uma CIM
50
igual a 8
µg/ml e 64,7% de susceptibilidade, enquanto contra Enterococcus faecalis
resistentes à vancomicina a CIM
50
foi igual a 16 µg/ml e apenas 18,8%
dos isolados demonstraram susceptibilidade in vitro.
Em estudo onde Cereda e colaboradores (2002) avaliaram a
atividade in vitro pela determinação da CIM de 22 isolados de E. faecium
isolados de 6 diferentes hospitais brasileiros, foram observadas CIMs
baixas para o cloranfenicol, sendo a grande maioria dos isolados
categorizados como susceptíveis.
23
Fluorquinolonas
Embora a atividade desta classe de antimicrobianos frente aos
enterococos não tenha sido largamente avaliada, é esperado que este
grupo não apresente uma boa atividade contra os enterococos, sendo o
seu uso geralmente indicado apenas para o tratamento de infecções do
trato urinário (Cetinkaya et al., 2000; Kaufmann, 2003).
A ciprofloxacina apresenta uma atividade moderada contra os
enterococos, sendo que as novas fluorquinolonas como a levofloxacina e
a gatifloxacina apresentam atividade muito pouco superior, uma vez que
desenvolvida a resistência à ciprofloxacina, é esperada rapidamente a
resistência a outras drogas da mesma classe (Kak e Chow, 2002).
Em estudo realizado ainda em 1995, comparando atividade da
levofloxacina contra enterococos resistentes e susceptíveis a
vancomicina, foi observado apenas 11% de susceptibilidade em 100 VRE
testados, contra 39% de susceptibilidade entre os enterococos
susceptíveis à vancomicina (Hayden, 1995).
Entre os enterococos multiresistentes, a resistência em alto
nível às fluorquinolonas tem sido descrita e atribuída à mutações do gene
girA da DNA girase (Kak e Chow, 2002). De nosso conhecimento, não
existem dados brasileiros sobre a atividade deste grupo de
antimicrobinaos contra os enterococos resistentes à vancomicina.
24
Mondino e colaboradores (2003) avaliando a atividade da
ciprofloxacina frente a enterococos isolados de dois hospitais brasileiros
localizados no estado do Rio de Janeiro, todos susceptíveis à
vancomicina, relatam níveis de resistência de 36,4% entre estes isolados.
Em estudo realizado por d’Azevedo e colaboradores (2004) onde foram
avaliados enterococos também susceptíveis à vancomicina, isolados de
três diferentes hospitais na cidade de Porto Alegre, os percentuais de
resistência à ciprofloxacina e à norfloxacina observados foram de 22,6%
e 22%, respectivamente.
Glicopeptídeos
Os glicopeptídeos são moléculas grandes, compostas de uma
estrutura peptídica básica que é substituída por 5 a 7anéis aromáticos e
diferentes açúcares. Atuam sobre os cocos Gram positivos inibindo a
síntese da parede celular, e, ao contrário dos antimicrobianos beta-
lactâmicos que atuam sobre as enzimas envolvidas na síntese da parede
celular bacteriana, agem sobre os substratos destas enzimas, os
precursores dos peptideoglicanos (Bonten et al., 2001).
Formam complexos com D-alanina-D-alanina (D-Ala-D-Ala) na
superfície externa dos peptideoglicanos e esta ligação impede o passo
seguinte na síntese da parede celular, que seria a transpeptidação e
transglicolização, levando então à perda da integridade da parede celular
e conseqüente morte da célula bacteriana (Bonten et al., 2001).
25
O mecanismo de resistência dos enterococos aos glicopeptídeos
envolve uma alteração na composição destes precursores da parede
celular, através da substituição de aminoácidos. Esta substituição pode
ser de D-Ala-D-Ala por D-Ala-D-lactato (D-Lac) ou D-Ala-D-Serina (D-
Ser). Esta troca de aminoácidos provoca uma diminuição na afinidade de
ligação droga-receptor de até 1000 vezes, o que acaba por impedir esta
ligação e tornar a bactéria resistente. Esta capacidade de produzir e
utilizar estes precursores da parede celular alterados pode estar presente
constitutivamente, ou ser induzida pelos glicopeptídeos, sendo que seis
diferentes mecanismos genéticos podem determinar a expresssão do
fenótipo de resistência à vancomicina nos enterococos: vanA, vanB,
vanC, vanD, vanE ou vanG . O gene vanA media alto nível de
resistência induzível à vancomicina (CIM ≥ 64 ug/ml )e resistência
moderada à teicoplanina (CIM ≥ 16 ug/ml). É normalmente adquirido
através de um transposon, o Tn 1546. A exposição a concentrações sub
inibitórias de glicopeptídeos pode induzir a síntese de inúmeras proteínas
codificadas por este determinante genético, conferindo resistência pelo
impedimento da ligação da vancomicina ao seu substrato. O gene vanB
media resistência induzível de baixo a alto nível à vancomicina (CIM de 4
a >1000 ug/ml) e não é capaz de mediar resistência à teicoplanina. Esta
resistência parece ser cromossomal, porém pode ser transferida por
conjugação em algumas cepas. O gene vanC, localizado em um operon, é
uma propriedade intrínseca de certos enterococos móveis e é responsável
por baixos níveis de resistência à vancomicina (CIM de 2 a 32 ug/ml).
São genes constitutivos de espécies como E. gallinarum (vanC-1) e E.
26
casseliflavus (vanC-2 e vanC-2 e vanC-3). O gene vanD , também
encontrado em um operon, é capaz de mediar níveis moderados de
resistência tanto à vancomicina (CIM de 64 a 128 ug/ml) quanto à
teicoplanina (CIM de 4 a 64 ug/ml ) tem localização cromossômica e não
parece ser transferível. O gene vanE foi descrito em um isolado de
E.faecalis apresentando CIM para a vancomicina de 16 ug/ml (baixo nível
de resistência) e CIM de 0,5µg/ml para a teicoplanina (susceptível); é
induzível e , provavelmente, não transferível .O gene vanG também
descrito em E. faecalis, mediando baixos níveis de resistência à
vancomicina (MIC<16 ug/ml) e apresentando susceptibilidade à
teicoplanina com CIMs geralmente menores que 0,5 µg/ml. (Arthur et al.
1993; Dutka-Malen et al. 1994; Lai et al. 1996; Clark et al, 1998;
Casadewal e Courvalin, 1999; Fines et al., 1999; Cetinkaya et al., 2000;
McKessar et al., 2000; Murray, 2000; Bonten et al., 2001).
Quinopristina/dalfopristina
Uma combinação de duas estreptograminas (A e B), que tem se
mostrado efetiva no tratamento de infecções causadas por Enterococcus
faecium. Em estudo avaliando a atividade deste antimicrobiano contra
isolados de Enterococcus faecium realizado por Eliopolus e colaboradores
(1998), 94,3% destes isolados mostraram-se susceptíveis in vitro. No
entanto, genes mediando a inativação deste antimicrobiano têm sido
27
encontrados em amostras resistentes de E. faecium em humanos e
animais (Werner et al., 1998).
Este antimicrobiano está disponível somente em formulação
intravenosa e tem como principal efeito colateral a capacidade de
provocar mialgias e artralgias. Outro fator importante a ser considerado é
o fato de apresentar apenas atividade bacteriostática e não bactericida,
fazendo com que na maioria das vezes esta droga necessite associação a
outros antimicrobianos para tornar-se efetiva.
Sucesso no tratamento de endocardites com quinopristina-
dalfopristina em combinação ou não com outros agentes como, por
exemplo, a rifampicina foi relatado em alguns poucos casos (Matsumura e
Simor, 1998). Winston e colaboradores (2000) avaliaram a eficácia desta
droga em 24 pacientes (19 bacteremias e 5 infecções localizadas)
causadas por Enterococcus faecium, apresentando susceptibilidade in
vitro a este microrganismo. Foi observada uma resposta clínica favorável
(cura ou melhora) em 83% dos pacientes avaliados, sugerindo que esta
droga é efetiva no tratamento de infecções por Enterococcus faecium em
pacientes severamente doentes.
Há um relato recente de sucesso no tratamento de uma
bacteremia pelo ERV com a associação de quinopritina-dalfopristina mais
altas doses de ampicilina em paciente com leucemia mielóide aguda e
neutropenia febril (Bethea et al., 2004).
Estudos in vitro, avaliando a atividade da associação de
quinopritina-dalfopristina com ampicilina e também com doxiciclina, têm
28
mostrado resultados positivos, indicando ser esta uma opção válida
(Linden, 2002).
Enterococcus faecalis, no entanto, são quase sempre resistentes a
este antimicrobiano, devido a uma provável bomba de efluxo presente
nesta espécie (Eliopolus, 2003; Kauffman, 2003).
Fosfomicina
A fosfomicina é um antimicrobiano natural, de baixo peso
molecular, que penetra na célula bacteriana através de dois sistemas de
permeases, um que transporta o L--glicerol-fosfato e outro, induzível,
que leva a D-glicose-6-fosfato ao interior da célula bacteriana
(Gobernado, 2003). Uma vez no interior da célula, age impedindo a
síntese da parede celular, inibindo por competição a enzima UDP-N-
acetilglucosamina-3-0-enolpiruvato transferase. Este mecanismo de ação
faz com que tenha efeito bactericida, com amplo espectro de ação, tanto
sobre bactérias Gram positivas como Gram negativas (Gobernado, 2003).
Em um estudo realizado por Allerberger e colaboradores (1999)
onde foi testada a atividade da fosfomicina contra 118 amostras de
enterococos de diferentes espécies, sendo 100 deles resistentes à
vancomicina, a MIC
50
para a fosfomicina foi igual a 32 ug/ml e a CIM
90
igual a 64 ug/ml, tendo a fosfomicina inibido mais de 90% dos isolados.
Em outro estudo, realizado por Perri e colaboradores (2002) avaliando a
atividade da fosfomicina contra 75 isolados clínicos de ERV, foi observado
100% de susceptibilidade in vitro à fosfomicina entre os isolados de E.
29
faecalis e 67% de susceptibilidade entre isolados de E. faecium. Shresta
e colaboradores (2000) relatam sucesso no tratamento de infecção
urinária complicada, causada por este microrganismo, com o uso de
fosfomicina.
Linezolida
A Linezolida é uma oxazolidinona que apresenta efeito
bacteriostático e não bactericida contra E.faecium e E. faecalis. Este
antimicrobiano apresenta uma grande vantagem que é o fato de estar
disponível também em formulação para administração oral (Kaufman,
2003).
Existem alguns relatos na literatura de sucesso no tratamento de
infecções graves causadas pelo ERV, como endocardites e infecções
intravasculares, com o uso deste antimicrobiano (McNeil et al., 2000;
Babcock et al., 2001).
Em um estudo realizado por Reis e colaboradores no ano de 2001,
avaliando a atividade in vitro deste antimicrobiano contra isolados de
enterococos resistentes à vancomicina isolados de diferentes hospitais
brasileiros, sendo 17 E. faecium e 16 E. faecalis, a MIC
90
para a linezolida
foi igual a 2 µg/ml para as duas espécies avaliadas, sendo 100% dos
isolados categorizados como susceptíveis, de acordo com critérios do
NCCLS. Em outro estudo, realizado por Cordeiro e colaboradores no ano
de 2004, 73 isolados de E. faecalis resistentes à vancomicina, isolados de
nove diferentes hospitais mostraram-se susceptíveis in vitro à linezolida.
30
Existem já alguns relatos de resistência a esta droga, porém ainda de
modo esporádico (Gonzáles, 2001; Jones, 2002; Herrero, 2002; Halle,
2004).
Rifampicina
A rifampicina é um derivado semi-sintético da rifamicina B.
O principal mecanismo de ação é a inibição da atividade RNA-polimerase
DNA-dependente. Embora se acredite que a grande maioria dos
enterococos resistentes à vancomicina sejam resistentes a este
antimicrobiano, tentativas têm sido feitas de utilização em combinação
com outros agentes (Murray, 2000). Um estudo publicado recentemente
descreve o efeito sinérgico in vitro de rifampicina com daptomycin e
ampicilina (Rand e Houck, 2004).
Tigeciclina
Primeiro representante da classe das glicilciclinas,
aprovado para uso em humanos pelo FDA (Food and Drug Administration)
em junho de 2005. Boa atividade in vitro tem sido descrita , indicando que
esta poderá vir a ser um a opção válida no tratamento de infecções
causadas por enterococos multi-resistentes (Cercenado, 2003; Bouchillon,
2005). Discos para uma avaliação sistemática da sensibilidade in vitro
desta droga frente aos enterococos resistentes à vancomicina até o
momento não estão disponíveis comercialmente no Brasil.
31
EPIDEMIOLOGIA DO ERV
Entre as espécies mais comumente isoladas de amostras clínicas
(E. faecalis e E. faecium) os fenótipos Van A e Van B são os mais
observados, significando um desafio para o controle da disseminação
destes microrganismos uma vez que estes são determinados por
elementos transferíveis, o que fez com que os enterococos resistentes à
vancomicina tenham se tornado cada vez mais prevalentes como
patógenos de infecções nosocomiais, no mundo todo, estando as infecções
causadas por estes agentes entre as mais importantes do ambiente
hospitalar (Murray, 2000; Hayden, 2000; Malani et al., 2002). Entre as
principais razões de estes microrganismos terem sobrevivido no ambiente
hospitalar são apontados o fato de apresentarem-se intrinsecamente
resistentes a diferentes antimicrobianos comumente utilizados e, talvez
ainda mais importante, a sua relativa facilidade em adquirir resistência
(Cetinkaya et al, 2000). O ERV pode ser transmitido de um paciente a outro
pelas mãos dos profissionais de saúde, sendo este provavelmente o modo
de transmissão nosocomial mais comum. A transmissão também pode
ocorrer por via de equipamentos médicos contaminados (Cetinkaya, 2000;
Baden et al, 2001; Kauffman, 2003; Patel, 2003). Em 1995, foi publicado
pelo Hospital Infection Control Practises Advisory Committee nos Estados
Unidos, recomendações para o controle da disseminação do ERV,
incluindo o uso controlado de glicopeptídeos e a realização de culturas de
swab retal para a identificação de portadores, sendo recomendado para
estes pacientes o isolamento de contato
(CDC, 1995).
32
Em estudo realizado para tentar estabelecer os prováveis fatores
de risco para a aquisição do ERV (Tornieporth et al, 1996) as variáveis que
mais contribuíram com a aquisição deste microorganismo foram,
independentes entre si, o uso de cefalosporinas de 3ª geração e
vancomicina, a duração do período de hospitalização por mais de sete dias e
as transferências pelo hospital. As chances de adquirir o ERV são
aumentadas por hospitalização prolongada, proximidade de indivíduos
colonizados pelo ERV, e a proporção de pacientes colonizados no hospital
(Murray, et al. 2000).
O primeiro enterococo resistente à vancomicina (ERV) foi
reportado na Europa no final da década de 80 (Leclerq et al.,1988). Pouco
tempo depois, foram detectadas amostras resistentes nos Estados Unidos,
sendo que em menos de 10 anos, este microrganismo estava entre os
patógenos nosocomiais mais importantes e em 1995 já chegava a 25% dos
enterococos isolados em unidades de terapia intensiva (NNIS, 1999). A
partir de então, cepas apresentando este fenótipo têm sido descritas em
diferentes partes do mundo (Clark et al. 1993; Jones et al., 1995; Lai et al.
1998; Murray, 2000).
Em 1996 foi reportado o primeiro ERV no Brasil, na cidade de
Curitiba, isolado de amostra de sangue em paciente com anemia aplásica,
sendo este um E. faecium carreando o gene vanD (Dalla Costa et al.,
2000). Logo após, isolados de E.faecium carreando o gene vanA foram
descritos na cidade de São Paulo (Zanella et al., 1999; Cereda et al., 2001)
onde rapidamente foi observado o primeiro surto, sendo este causado pela
disseminação clonal de E. faecium, apresentando fenótipo VanA (Zanella et
33
al., 2003). O primeiro enterococo resistente à vancomicina isolado na
cidade de Porto Alegre foi identificado como E. faecalis portador do gene
vanA (d’Azevedo et al., 2000), pertencente ao clone dominante no país
(Albuquerque et al.,2000; Teixeira et al., 2001). Diversas políticas de
vigilância e controle foram estabelecidas pelos Comitês de Controle de
Infecção na tentativa de prevenir a disseminação deste microrganismo. No
entanto, o isolamento sucessivo de enterococos apresentando resistência à
vancomicina tem sido observado em várias unidades hospitalares na
cidade de Porto Alegre. Até a finalização deste estudo, não é de nosso
conhecimento o isolamento em hospitais de nossa cidade, de Enterococus
faecium apresentando resistência à vancomicina, diferentemente de outras
regiões do país, onde diversos surtos causados por esta espécie têm sido
observados. A disseminação inter hospitalar de E. faecalis, também
apresentando fenótipo VanA foi descrita em 2004 por Moretti e
colaboradores, demonstrando a presença de isolados pertencentes ao
mesmo clone presentes em hospitais de cidades diferentes no estado de
São Paulo. Furtado e colaboradores (2005), avaliando a epidemiologia do
ERV em um hospital brasileiro de ensino, demonstraram um aumento
significativo na incidência deste microrganismo entre os períodos de 2000 a
2002. Neste estudo, foi encontrada significância estatística para o aumento
no isolamento do ERV de amostras de urina e também foi observado o
aumento do isolamento em hemoculturas. No ano de 2000, naquele
hospital, o ERV havia sido isolado em 17 unidades, passando para 25
unidades no ano de 2002. O número de ERV por paciente-dia foi de 0,21
34
em 2000 para 0,6 em 2000, demonstrando claramente a disseminação
deste microorganismo pelo hospital.
Nos Estados Unidos, o ERV é considerado endêmico em um
número muito grande de hospitais, embora não seja evidenciada a
colonização de indivíduos sadios na comunidade. Na Europa, ao contrário,
surtos hospitalares são considerados esporádicos, mas a colonização de
indivíduos saudáveis e de animais parece ser endêmica (Goossens, 1998;
CDC, 1999; Bonten et al, 2001).
Nos últimos anos, aumentou a preocupação com o fato de que o
ERV poderia transferir determinantes de resistência a organismos ainda
mais patogênicos, como Staphylococcus aureus. Esta transmissão foi
sugerida quando foram isolados S.aureus resistentes à vancomicina nos
Estados Unidos (CDC,2002; CDC, 2004; Tenover et al.,2004).
IMPORTÂNCIA DA IDENTIFICAÇÃO AO NÍVEL DE ESPÉCIE
Depois do surgimento da resistência adquirida aos
glicopeptídeos entre os enterococos, a identificação ao nível de espécie
tornou-se de fundamental importância, uma vez que amostras contendo
resistência intrínseca a vancomicina como E. gallinarum e E. casseliflavus
precisam, para fins de controle de infecção hospitalar, ser diferenciadas
das espécies mais comumente isoladas de amostras clínicas como E.
faecalis e E.faecium, os quais possuem resistência adquirida (CDC,
35
1995). Os genes responsáveis pela resistência adquirida, o gene vanA e
provavelmente o gene vanB localizam-se no transposon Tn 1546, o qual
freqüentemente reside em plasmídeos, fazendo com que sejam facilmente
transferíveis, enquanto
o operon vanC é uma propriedade intrínseca de
alguns Enterococcus móveis (E. gallinarum,vanC1; E. casseliflavus,
vanC2; Enterococcus flavescens, vanC3) (Clark et al, 1998; Rice,1998;
Willems et al.,1999 ; Bonten ,2001; Guardarbassi e Dalsgaard, 2004).
Poucos laboratórios clínicos estão aptos a realizar a
identificação dos enterococos ao nível de espécie. O método proposto por
Facklam e colaboradores 1989 e considerado o gold standard apresenta
uma complexidade, um custo e um tempo de execução inviáveis para a
rotina destes serviços. Pelo sistema proposto, para a identificação da
maioria das espécies presentes em amostras clínicas, é necessária a
realização das seguintes provas: manitol, sorbose, arginina, arabinose,
sorbitol, rafinose, telurito, motilidade, produção de pigmento, sacarose,
piruvato, MGP (methyl--D-glucopyranoside), além de bile-esculina, NaCl
a 6,5% e PYR (hidrólise da L-pirrolidonil-β-naftilamida), com tempo de
incubação para algumas provas de, no mínimo, sete dias.
Os sistemas comerciais disponíveis no Brasil para a
identificação de enterococos, embora rápidos e com um número
significativo de provas bioquímicas, apresentam uma série de deficiências
quanto a acurácia e reprodutibilidade (d’Azevedo et al, 2001).
Alguns estudos têm demonstrado alta acurácia do sistema
Vitek2
®
na identificação de enterococos e na capacidade de detectar
corretamente fenótipos de resistência aos glicopeptídeos. Em estudo
36
realizado por Garcia e colaboradores (2000) foi considerado satisfatório o
desempenho do sistema Vitek 2 frente a um total de 150 isolados de
Enterococcus spp. Já em outro estudo, conduzido por Rantakoko e
colaboradores (2006), foram identificados corretamente apenas 17(81%)
do total de isolados e, então, apontadas necessidades de melhorias deste
sistema.
Em avaliação de 80 amostras de enterococos, foram
comparados os resultados obtidos no sistema automatizado Vitek aos
obtidos com os testes fisiológicos convencionais. A concordância entre os
dois sistemas foi de 83,7% (67/80). Entre as amostras de E. faecalis, o
sistema Vitek identificou corretamente 35/40 (87,5%) e entre as amostras
de E. faecium, a concordância verificada em 12/14 (85,7%), porém
somente em 20/26 (76,9%) amostras pertencentes às espécies não-E.
faecalis e não-E. faecium o sistema chegou à identificação correta. As
demais espécies apresentaram problemas de identificação em cerca de
23% das cepas testadas. Outros sistemas comerciais disponíveis em
nosso meio apresentam limitações semelhantes (d’Azevedo et al, 2004).
37
DETECÇÃO FENOTÍPICA DE RESISTÊNCIA
O Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) sugere os
seguintes antimicrobianos para o teste em isolados de enterococos de
amostras clínicas: a ampicilina ou penicilina deve ser testada em qualquer
isolado; a vancomicina deve ser sempre testada, porém reportada
seletivamente; a ciprofloxacina deve ser testada em isolados urinários.
Em isolados com resistência à vancomicina, devem ser adicionados ao
teste: cloranfenicol, tetraciclina , rifampicina e eritromicina.
Falhas dos métodos automatizados e do de difusão em ágar na
detecção de enterococos com baixos níveis de resistência à vancomicina
têm sido apontadas (Tenover,1995; Dodgson, 2004). Este problema foi
parcialmente contornado pela determinação do uso de um meio de
triagem para a resistência à vancomicina (ágar Brain Heart Infusion com 6
µg de vancomicina) na rotina dos laboratórios clínicos (Facklam, Carvalho
e Teixeira 2002).
Detecção de β-lactamase
O CLSI recomenda que todos os enterococos isolados do
sangue e do líquor sejam testados para a produção de beta-lactamase
usando o teste da cefalosporina cromogênica ou Nitrocefin
®
. A β-
lactamase hidroliza o anel β-lactâmico, produzindo uma alteração na
coloração do disco.
38
GENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA AOS GLICOPEPTÍDEOS-
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)
A principal característica da reação em cadeia de polimerase
(PCR) é a capacidade de amplificar rapidamente e exponencialmente uma
seqüência particular de DNA. Esta técnica utiliza um segmento de DNA
molde e oligonucleotídeos que funcionam como iniciadores sendo
estendidos por uma enzima DNA polimerase na presença de nucleotídeos
e um tampão. Os iniciadores são desenhados de forma a parear com fitas
do DNA opostas do molde, em sítios que ladeiam a região a ser
amplificada. Com a técnica de PCR, altamente sensível e específica, um
gene de resistência ou virulência bacteriano a ser pesquisado, pode ser
rapidamente detectado, o que pode ser extremamente útil em
determinadas circunstâncias, como por exemplo, na ocorrência de um
surto (Swenson et al. 1995).
Dutka-Malen, Evers e Courvallin (1995) desenvolveram um teste de
PCR que permitia detectar simultaneamente genes de resistência aos
glicopeptídeos (vanA, vanB, vanC1 e vanC2) e identificar os enterococos
ao nível de espécie. Esta técnica mostrou-se uma alternativa rápida e
específica na detecção de resistência em enterococos. Patel e
colaboradores (1997) utilizando a técnica de PCR-multiplex, também para
a detecção de genes vanA, vanB, vanC1 e vanC2/3 em enterococos,
demonstraram que esta metodologia poderia ser útil na detecção rápida
de genótipos de resistência em laboratórios clínicos.
39
Mais recentemente, Depardieu e colaboradores (2004),
desenvolveram uma técnica de PCR multiplex, onde é possível pesquisar
simultaneamente a presença dos genes vanA, vanB, vanC, vanD, vanE,
vanG, e ainda de porções específicas (ddl) de E. faecium e E. faecalis,
uma porção nuc de S. aureus e ainda uma porção cromossomal
específica de S. epidermidis, permitindo a identificação destes
microrganismos a nível de espécie.
Métodos moleculares, por serem altamente específicos, não são
capazes de detectar resistência relacionada a mecanismos que não estão
incluídos em um determinado teste, assim como mecanismos emergentes
de resistência, para os quais não são conhecidos os determinantes
genéticos (Teixeira e Facklam, 2003).
A melhor caracterização de uma determinada população deverá
incluir, portanto, uma combinação de métodos fenotípicos e genotípicos.
40
OBJETIVOS
Objetivo Geral:
Caracterizar fenotipica e genotipicamente amostras de
enterococos resistentes à vancomicina (ERV) isoladas de três diferentes
hospitais da cidade de Porto Alegre, entre agosto de 2002 e julho de
2005, através da pesquisa de genes de resistência aos glicopeptídeos e
determinação do perfil de susceptibilidade in vitro frente a possíveis
agentes antimicrobianos.
Objetivos Específicos:
♦Identificar ao nível de espécie, por meio de métodos
convencionais amostras de enterococos resistentes à vancomicina.
♦Determinar os mecanismos moleculares da resistência aos
glicopeptídeos em amostras de enterococos por técnica de PCR.
♦Caracterizar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos por
métodos fenotípicos.
♦Avaliar a utilidade potencial de antimicrobianos como a
fosfomicina e a linezolida frente a estes microorganismos.
41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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vancomycin-resistant enterococci. J. of Antim. Chemotherapy. 43:211-217.
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V.L. C. 2000. Occurrence of vancomycin-resistant Enterococcus faecalis in
Rio de Janeiro, Brazil: strains showed genetic relationship with a high-level
gentamicin resistant (HLGR) endemic clone. p. 107. Abstract of 40th
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62.
52
Atividade in vitro da fosfomicina em Enterococcus faecalis resistentes à
vancomicina
Superti, S.V
1
;
Dias, C. G. A
2
;
d’Azevedo, P. A
2
1
Programa de Pós-Graduação em Patologia da Fundação Faculdade Federal
de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
2
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Fundação Faculdade
Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
* Corresponding author:
Professor Pedro A. d’Azevedo, Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre, Rua Sarmento Leite 245/211, Porto Alegre, RS 90050-170,
Brazil.
Fone: 55 51 32248822
Fax: 55 51 32269756
E-mail: [email protected]
53
Resumo
Enterococos fazem parte da flora endógena dos seres humanos,
são intrinsecamente resistentes a diversas classes de antimicrobianos, e
adquirem resistência com relativa facilidade. Atualmente o ERV
(enterococo resistente à vancomicina) encontra-se disseminado pelo
mundo todo sendo as opções para o tratamento das infecções por ele
causadas , muitas vezes, extremamente limitadas. Neste estudo, foram
avaliados 193 isolados de Enterococcus faecalis resistentes à
vancomicina, provenientes de quatro diferentes hospitais de Porto Alegre,
quanto à susceptibilidade à fosfomicina, pelos métodos de Etest e difusão
em ágar. A fosfomicina mostrou-se ativa in vitro contra a grande maioria
dos isolados, indicando uma opção válida no tratamento destas infecções.
Palavras chaves: Enterococcus faecalis, multiresistência,
fosfomicina, vancomicina.
54
Introdução
Enterococos são constituintes da flora normal intestinal, e podem
estar envolvidos em uma grande variedade de infecções, sendo as
infecções do trato urinário as mais comuns (1). São intrinsecamente
resistentes a uma ampla faixa de antimicrobianos o que muitas vezes
limita a escolha de agentes para o tratamento das infecções, e ainda, tem
sido observado um aumento significativo na resistência, como o que vem
acontecendo com os glicopeptídeos (2,10,11). No ano de 2000 foi
detectado o primeiro ERV (enterococo resistente à vancomicina) em Porto
Alegre, sendo este um E. faecalis, contendo o gene vanA (3). Atualmente,
este microrganismo vem sendo isolado em diversos hospitais da cidade,
tanto em culturas de swab retal para pesquisas de portadores, como em
materiais clínicos diversos, associados a processos infecciosos. O perfil
de multiresistencia apresentado por estes microrganismos torna
necessária a busca de alternativas para o tratamento destas infecções.
A fosfomicina é um antimicrobiano natural, de baixo peso
molecular, que penetra na célula bacteriana através de dois sistemas de
permeases, um que transporta o L--glicerol-fosfato e outro, induzível,
que leva a D-glicose-6-fosfato ao interior da célula bacteriana. Uma vez
no interior da célula, age impedindo a síntese da parede celular, inibindo
por competição a enzima UDP-N-acetilglucosamina-3-0-enolpiruvato
transferase (4). Este mecanismo de ação faz com que tenha efeito
bactericida, com amplo espectro de ação, tanto sobre bactérias Gram
positivas como Gram negativas.
55
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade in vitro da
fosfomicina em 193 isolados de Enterococcus faecalis resistentes à
vancomicina, isolados na cidade de Porto Alegre entre os anos de 2002 -
2004.
Materiais e Métodos
1. Amostras Bacterianas:
Foram testados 193 isolados de Enterococcus faecalis, resistentes
à vancomicina, coletados de pacientes hospitalizados em quatro
diferentes serviços de saúde: a Irmandade Santa Casa de Misericórdia
de Porto Alegre, o Complexo Nossa Senhora da Conceição , o Hospital
Ernesto Dornelles e o Hospital São Lucas da PUC, todos localizados na
cidade de Porto Alegre, no sul do Brasil. Os isolados foram identificados
ao nível de espécie através de testes bioquímicos convencionais
propostos por Facklam et al (1998), com modificações, usando os
seguintes testes: manitol, sorbose, arginina, arabinose, sorbitol, rafinose,
motilidade, pigmento, sacarose, piruvato, methyl--D-glucopiranoside.
Todos os isolados foram também avaliados quanto a sua capacidade de
crescer em meio contendo 6,5% de NaCl, de hidrolizar a esculina em
presença de sais biliares ,a L-pirrolidonil-β-naftilamida (PYR) e hidrólise
da L-leucina-β-naftilamida (LAP). A resistência à vancomicina foi
confirmada por determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima)
pelo método de Etest e diluição em agar em todos os isolados.
56
2. Testes de Susceptibilidade:
2.a.Teste de difusão em ágar:
Realizado de acordo com CLSI (2005) , com o uso de discos
contendo 200 g/ml de fosfomicina acrescidos de 50 g/ml de D-glicose
6-fosfato (Cecon, São Paulo, Brazil)
2.b.Teste em Gradiente de Concentração:
Foram utilizadas tiras de Etest (AB Biodisk, Sweden) com
gradiente de concentração de fosfomicina variando de 0,04 g/ml a 1024
g/ml , acrescidas de 50 g/ml de glicose -6-fosfato e o teste realizado de
acordo com as orientações do fabricante.
3. Controle de Qualidade: Foi utilizada cepa ATCC Enterococcus
faecalis-29212.
57
Resultados e Discussão:
Pelos dois métodos, apenas 3 isolados apresentaram resistência ,
sendo 2 com resistência intermediária com CIM igual a 128 g/ml e 1
apresentando resistência total com CIM maior que 256 g/ml (tabelas 1 e
2). Os isolados apresentando resistência intermediária eram provenientes
de culturas de vigilância para portadores e o isolado apresentando
resistência era proveniente de secreção de ferida operatória. As CIMs
obtidas, variaram de 2 g/ml a maior que 256 g/ml , porém foram, em
sua maioria, bem abaixo do breakpoint para a resistência , sendo que a
CIM50 foi igual a 8 g/ml e a CIM90 foi igual a 16 g/ml. De acordo com o
CLSI (2005), são considerados susceptíveis isolados apresentando CIMs
menores ou iguais a 64 g/ml . Diversos esquemas foram propostos
para o tratamento das infecções pelo ERV, porém são raros os estudos
avaliando a atividade destes em humanos. Novas drogas vêm sendo
desenvolvidas, como foi o caso da linezolida, uma oxazolidinona, e da
quinopristina-dalfopristina, uma estreptogramina, aumentando as opções
para o tratamento de infecções causadas por este microrganismo (5). O
Enterococcus faecalis, no entanto, apresenta-se intrinsecamente
resistente à quinopristina-dalfopristina e já existem relatos de resistência
desenvolvida à linezolida (6). A fosfomicina, devido ao seu espectro de
ação, farmacocinética e possibilidade de vias de administração, pode ser
utilizada no tratamento de diferentes infecções como as infecções
urinárias, respiratórias, osteoarticulares, bacteremias, infecções
ginecológicas e outras (4). A resistência bacteriana à fosfomicina pode
58
ocorrer por alterações no sistema de transporte através da parede celular,
por alteração na membrana, ou raramente por ruptura enzimática da
droga (4). Pouco se conhece sobre a atividade deste antimicrobiano
contra os enterococos resistentes à vancomicina e estudos avaliando sua
atividade sobre o E.faecalis resistente à vancomicina são escassos.
Em um estudo realizado por Allerberger et al (1999), onde foi
testada a atividade da fosfomicina contra 118 amostras de enterococos de
diferentes espécies, sendo 100 deles resistentes à vancomicina, a CIM50
para a fosfomicina foi igual a 32ug/ml e a CIM90 igual a 64ug/ml, tendo a
fosfomicina inibido mais de 90% dos isolados (7). Em outro estudo,
realizado por Perri et al (2002), avaliando a atividade da fosfomicina
contra 75 isolados clínicos de ERV, foram relatadas 100% de
susceptibilidade in vitro à fosfomicina entre os isolados de E.faecalis e
67% de susceptibilidade entre isolados de E.faecium (8).Estes dados
coincidem com os resultados obtidos em nosso estudo, onde mais de
98% das amostras avaliadas mostraram-se susceptíveis in vitro à
fosfomicina.
Shresta et al (2000) relatou sucesso no tratamento de infecção
urinária complicada, causada por este microrganismo, com o uso de
fosfomicina (9). Entre os 193 E.faecalis avaliados em nosso estudo, um
total de 39 isolados (20,2 %) eram provenientes de urina, de pacientes
hospitalizados.
Os resultados obtidos nos dois métodos realizados foram
totalmente concordantes, sendo que de acordo com critérios
interpretativos do CLSI (2005), pelo teste de difusão em agar, como pelo
59
método de Etest, um total de 190 isolados foi categorizado como
susceptível à fosfomicina, apenas 2 isolados com resistência
intermediária e somente 1 isolado foi categorizado como resistente, com
CIM >256 g/ml .
Avaliando-se os resultados encontrados, observa-se que a
fosfomicina apresentou excelente atividade in vitro contra os isolados
testados de E.faecalis resistentes à vancomicina isolados em hospitais de
Porto Alegre entre os anos de 2002 e 2004, e podería ser uma opção
válida no tratamento das infecções causadas por estes microrganismos
multiresistentes.
60
Tabela 1.
Susceptibilidade de E. faecalis à fosfomicina pelo
método de Etest
___________________________________________________________
CIMa 2 4 8 16 32 64 128 256 >256
____________________________________________
Nº isolad 3 6 121 41 19 0 2 0 1
___________________________________________________________
a Concentração Inibitória Mínima
Tabela 2.
Susceptibilidade de E.faecalis à fosfomicina pelo método de
disco-difusão
_______________________________________________________
S I R
Nº isolados: 190 2 1
______________________________________________________
S:Susceptível I:Intermediário R:Resistente
61
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63
In vitro fosfomycin activity in vancomycin-resistant Enterococcus
faecalis
Silvana Superti
1
Cícero A. G. Dias
2
Pedro Alves d’Azevedo
1,2
1
Programa de Pós-Graduação em Patologia da Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
2
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
* Corresponding author:
Professor Pedro A. d’Azevedo, Fundação Faculdade Federal de
Ciências Médicas de Porto Alegre, Rua Sarmento Leite 245/211, Porto
Alegre, RS 90050-170, Brazil.
Fone: 55 51 32248822
Fax: 55 51 32269756
E-mail: [email protected]
64
Abstract
Enterococci are part of the endogenous flora of human beings, are
naturally resistant to several classes of antimicrobials, and are able to
acquire resistance with relative ease. Currently the vancomycin-resistant
enterococcus (VRE) is spread all over the world and treatment options for
infections caused by it are often extremely limited. In this study 193
vancomycin-resistant Enterococcus faecalis isolates collected at four
different hospitals in Porto Alegre were assessed as to their susceptibility
to fosfomycin using the E test and the agar diffusion test. Fosfomycin
proved to be active against the great majority of isolates in vitro, indicating
a valid option in the treatment of these infections.
Key-words: Enterococcus faecalis, resistance, fosfomycin,
vancomycin.
65
Introduction
Enterococci are part of the normal intestinal human flora and can be
involved in a great variety of infections, urinary tract infections being the
most common ones (1). Because they are intrinsically resistant to a large
range of antimicrobials, the choice of agents for treatment of infections is
often very limited, and a significant increase in resistance has been
observed, such as what is happening with the glycopeptides (2,10,11).
The first case of vancomycin-resistant enterococcus (VRE) in Porto Alegre
was reported in 2000, an E. faecalis containing the vanA gene (3).
Currently this microorganism has been repeatedly isolated in several
hospitals of the city, both in culture of rectal swabs for investigation of
carriers and in various clinical materials associated with infectious
processes. The multiresistance profile presented by these microorganisms
makes it necessary to seek for alternate treatments for these infections.
Fosfomycin is a natural antimicrobial of low molecular weight which
penetrates the bacterial cell through two systems of permeases: one which
transports L--glycerol-phosphate, and another one, which is inducible
and takes D-glucose-6-phosphate into the interior of the bacterial cell.
Once inside the cell, it acts by preventing cell wall synthesis, inhibiting by
competition enzyme UDP-N-acetylglucosamine-3-0-enolpyruvate
transferase (4). This action mechanism grants it a bactericidal effect, with
broad antimicrobial spectrum on both Gram-positive and Gram-negative
bacteria. The aim of this work was to assess in vitro activity of
fosfomycin in 193 vancomycin-resistant Enterococcus faecalis samples
isolated in the city of Porto Alegre in the 2002-2004 period.
66
Materials and Methods:
1. Bacterial isolates:
A total of 193 vancomycin-resistant Enterococcus faecalis isolates
were tested. They were collected from patients hospitalized in 4 different
health services: Irmandade Santa Casa de Misericórdia of Porto Alegre,
Complexo Nossa Senhora da Conceição, Hospital Ernesto Dornelles, and
Hospital São Lucas (PUC), all of them located in the city of Porto Alegre,
South Brazil. Vancomycin resistance was verified by MIC determination
(Minimum Inhibitory Concentration) by the E test and agar diffusion test in
all isolates.
2. Susceptibility Tests:
2. a. Agar diffusion test:
Performed according to the CLSI (2005), using disks containing 200
g/ml of fosfomycin added to 50 g/ml of D-glucose 6-phosphate (Cecon,
São Paulo, Brazil).
2. b. Gradient Diffusion Test (E test):
E test strips (AB Biodisk, Sweden) were used with fosfomycin
gradient concentrations ranging from 0.04 g/ml to 1024 g/ml, added with
50 g/ml of glucose -6-phosphate. The tests were carried out as indicated
by the manufacturer.
3. Quality Control: Strain ATCC Enterococcus faecalis-29212 was
used.
67
Results and Discussion
Only 3 isolates presented resistance by both methods, 2 with
intermediate resistance (MIC of 128 g/ml) and 1 with full resistance (MIC
above 256 g/ml) (Tables 1 and 2). The isolates presenting intermediate
resistance came from surveillance cultures for carriers, and the isolate with
full resistance was from secretion of a surgical wound. The MICs obtained
ranged from 2 g/ml to > 256 g/ml, but they were mostly well below the
breakpoint for resistance, with MIC 50 equal to 8 g/ml and MIC 90 equal
to 16 g/ml. According to the CLSI (2005), isolates presenting MICs ≤ 64
g/ml are considered susceptible.
A number of schemes have been proposed for treatment of
VRE infections, but there are no studies evaluating the activity of these
microorganisms in humans. New drugs have been developed, such as
linezolid, an oxazolidinone, and quinupristine-dalfopristine, a
streptogramin, increasing the options for treatment of infections caused by
this microorganism (5). However, Enterococcus faecalis is intrinsically
resistant to quinupristine-dalfopristine, and resistance against linezolid has
already been reported (6). Fosfomycin, owing to its broad antimicrobial
spectrum, pharmacokinetics and administration routes, can be used in
treating a diversity of infections such as bacteremias and urinary,
respiratory, osteoarticular, and gynecological infections, among others (4).
Bacterial resistance to fosfomycin can occur by alterations in the transport
system through the cell wall, by changes in the membrane, or seldom by
enzymatic disruption of the drug (4). Little is known about the activity of
68
this antimicrobial against vancomycin-resistant enterococci, and studies
investigating its activity on vancomycin-resistant E. faecalis are scarce.
In a study by Allerberger et al (1999), where fosfomycin activity
was tested against 118 samples of enterococci of different species, 100 of
which resistant to vancomycin, MIC 50 to fosfomycin was 32ug/ml and
MIC 90 was 64ug/ml, with fosfomycin having inhibited more than 90% of
the isolates (7). In another study by Perri et al (2002) evaluating
fosfomycin against 75 VRE clinical isolates, the reported in vitro
susceptibility to fosfomycin was 100% among E. faecalis isolates and 67%
among E. faecium isolates (8). These data are in agreement with the
results obtained in our study, where more than 98% of the samples
evaluated showed in vitro susceptibility to fosfomycin.
Shresta et al (2000) reported success in the treatment of
complicated urinary infection, caused by this microorganism, with the use
of fosfomycin (9). Among the 193 E. faecalis evaluated in our study, 39
isolates (20.2 %) were from the urine of hospitalized patients.
The results obtained in the two methods used were totally
concordant, and according to the CLSI interpretive criteria (2005), both by
the agar diffusion test and the E test, a total of 190 isolates was
categorized as susceptible to fosfomycin, only 2 isolates with intermediate
resistance, and only 1 was characterized as resistant, with MIC >256
g/ml .
An analysis of the results obtained in this study shows that
fosfomycin presented excellent in vitro activity against the vancomycin-
resistant E. faecalis samples isolated in hospitals of Porto Alegre in the
69
2002-2004 period, and could be a valid option in the treatment of
infections caused by these multiresistant microorganisms in our city.
70
Table 1 Susceptibility of E. faecalis to fosfomycin by the E test
___________________________________________________________
MICs
a
(g/ml) 2 4 8 16 32 64 128 256 >256
No. isolates: 3 6 121 41 19 0 2 0 1
a
Minimum inhibitory concentrations
Table 2 - Susceptibility of E. faecalis to fosfomycin by the disk diffusion test
___________________________________________________________
S I R
No. isolates: 190 2 1
___________________________________________________________
S: Susceptible I: Intermediate R: Resistant
71
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73
Resistência aos antimicrobianos em Enterococcus faecalis
resistentes à vancomicina, isolados de três diferentes hospitais na cidade
de Porto Alegre, (2002-2005).
Silvana Vargas Superti
1
Pedro Alves d’Azevedo
1,2
1
Programa de Pós-Graduação em Patologia da Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
2
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
* Corresponding author:
Professor Pedro A. d’Azevedo, Fundação Faculdade Federal de
Ciências Médicas de Porto Alegre, Rua Sarmento Leite 245/211, Porto
Alegre, RS 90050-170, Brazil.
Fone: 55 51 32248822
Fax: 55 51 32269756
E-mail: [email protected]
74
Resumo:
Enterococos resistentes à vancomicina estão, atualmente,
presentes em diversos hospitais em nossa cidade. Estes microrganismos
costumam exibir um perfil de multi-resistência, tornando muitas vezes
extremamente difícil a escolha de um antimicrobiano para tratar as
infecções por eles causadas. Neste estudo, um total de 240 isolados
clínicos de enterococos resistentes à vancomicina , isolados em três
diferentes hospitais , entre abril de 2002 e novembro de 2005 foram
identificados ao nível de espécie por testes bioquímicos convencionais e
avaliados quanto à susceptibilidade in vitro à ampicilina, teicoplanina,
gentamicina e estreptomicina (níveis elevados), cloranfenicol, eritromicina,
ciprofloxacina, fosfomicina e linezolida. A Concentração Inibitória Mínima
(CIM) à vancomicina foi determinada em todos os isolados pelo método
de Etest. Genótipos de resistência à vancomicina foram determinados por
técnica de PCR, utilizando primers específicos para vanA, vanB, vanC,
vanD e vanG. Todos os isolados foram identificados como Enterococcus
faecalis. Todos os isolados demonstraram a presença do gene vanA e
tiveram MIC para a vancomicina >256 g/ml. O antimicrobiano mais ativo
in vitro foi a linezolida, seguido da fosfomicina. Resistência à ampicilina foi
detectada em alguns poucos isolados.
Palavras-chaves: Enterococcus faecalis, resistência aos
glicopeptídeos, PCR, multiresistência.
75
Introdução:
Enterococos resistentes à vancomicina (ERV) constituem uma das
principais causas de infecções adquiridas no hospital e estão, atualmente,
disseminados em diversos países (4,13). O aumento na resistência aos
antimicrobianos observado nas infecções nosocomiais transformou-se em
um grave problema de saúde pública (1,13).
O primeiro enterococo resistente aos glicopeptídeos isolado no Brasil
foi um Enterococcus faecium, carreando um elemento genético incomum,
mais tarde caracterizado como vanD, em Curitiba, Paraná no ano de 1996
(8). Mais tarde, isolados de ERV foram reportados no estado de São Paulo
(31,32). Depois disso, numerosos isolados de ERV têm sido reportados em
diferentes regiões do Brasil. O primeiro caso de ERV em Porto Alegre
aconteceu em 2000, em um hospital terciário, sendo este isolado um
Enterococcus faecalis carreando o gene vanA (6).
Devido à resistência cumulativa deste microrganismo a
diferentes classes de antimicrobianos usados na prática clínica,
Enterococcus spp tem se tornado um importante patógeno nosocomial,
especialmente em alguns grupos de pacientes considerados mais
susceptíveis, criando sérias limitações nas opções de tratamento (15,20).
Até o momento, sete diferentes genótipos de resistência aos glicopeptídeos
foram descritos em enterococos (1,4,17). Alguns destes (vanA, vanB, vanD,
vanE e vanG) são mecanismos adquiridos enquanto outros (vanC1 e
vanC2/C3) são propriedades intrínsecas dos enterococos. Os fenótipos
VanA e VanB podem estar associados à transferência de resistência a
76
outros microrganismos, incluindo Staphylococcus aureus. A transmissão in
vivo desta resistência foi sugerida em maio de 2002, quando o primeiro
caso de infecção causada por S. aureus totalmente resistente à
vancomycin, VRSA (MIC> 128 g/ml) foi descrito (2).
Poucos são os dados de susceptibilidade entre isolados de ERV
disponíveis na literatura, o que poderia representar uma ferramenta útil na
escolha da terapia empírica de infecções graves onde este é o agente
etiológico.
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade in vitro de
diferentes agentes antimicrobianos frente a isolados de Enterococcus
faecalis resistentes à vancomicina isolados em três diferentes hospitais de
Porto Alegre, e caracterizar a resistência aos glicopeptídeos nestes
isolados, determinando o genótipo de resistência por meio da técnica de
reação em cadeia de polimerase (PCR) com primers específicos para genes
vanA, vanB, vanC, vanD e vanG.
77
Materiais e métodos
1. Amostras bacterianas
Os isolados de ERV (n=240) avaliados foram provenientes de
amostras clínicas de pacientes de três diferentes hospitais de Porto Alegre,
sul do Brasil: Hospital Nossa Senhora da Conceição (n= 86); Complexo
Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre (n=118) e Hospital
Ernesto Dornelles (n=36), coletados entre abril de 2002 e novembro de
2005. Somente um isolado por paciente foi incluído no estudo. Os isolados
de ERV foram provenientes de diferentes materiais clínicos, conforme
mostrado na tabela 1.
2. Identificação:
Os isolados foram identificados ao nível de espécie através de testes
bioquímicos convencionais propostos por Facklam et al (1998), com
modificações. Os seguintes testes foram realizados: manitol, sorbose,
arginina, arabinose, sorbitol, rafinose, motilidade, pigmento, sacarose,
piruvato e methyl--D-glucopiranoside. Todos os isolados foram também
avaliados quanto a sua capacidade de crescer em meio contendo 6,5% de
NaCl; de hidrolizar a esculina em presença de sais biliares , a L-pirrolidonil-
β
-naftilamida (PYR) e hidrólise da L-leucina-
β
-naftilamida (LAP).
3. Susceptibilidade aos Antimicrobianos:
3.1.Teste de difusão em ágar:
78
Os isolados foram testados por meio de difusão em ágar para os
seguintes antimicrobianos: ampicilina, teicoplanina, vancomicina,
gentamicina, estreptomicina, rifampicina, cloranfenicol, linezolida,
ciprofloxacina e eritromicina. Os testes foram realizados seguindo
orientações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2005.
3.2. Etest:
As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) para a vancomicina e a
fosfomicina foram determinadas por meio de Etest (AB BIODISK, Solna,
Sweden). Os resultados foram interpretados conforme o CLSI-2005.
3.3. Diluição em ágar:
Triagem para a resistência à vancomicina (6 µg/ml) foi realizada
conforme recomendações do NCCLS , e triagem para resistência à
ampicilina (8 e 16 µg/ml) de acordo com Stern e colaboradores (1994)
empregando placas de diluição preparadas com meio brain heart infusion
(Oxoid, Basingstoke, England). As amostras foram inoculadas na superfície
do agar , em inóculo igual a 10
8
UFC/ spot. As placas foram incubadas a
35º C por 24/48 horas.
3.4. Detecção de resistência aos aminoglicosídeos:
Testes de triagem para a resistência a níveis elevados de
aminoglicosídeos foram realizados em ágar brain heart infusuin (Oxoid,
Basingstoke, England) suplementado com 500 mg de gentamicina por ml e
2000 µg de estreptomicina por ml, de acordo com NCCLS. As amostras
79
foram inoculadas na superfície do ágar, em inóculo igual a 10
8
UFC/ spot.
As placas foram incubadas a 35º C por 24/48 horas.
3.5. Produção de lactamase:
Todos os isolados foram testados para a produção de lactamase
através do teste Nitrocephin (Becton Dickinson,Sparks,MD,USA), seguindo
instruções do fabricante.
4. Detecção dos genes van por PCR:
4.1 Extração do DNA:
Para cada reação, duas a três colônias desenvolvidas após
incubação overnight em placa de ágar sangue de carneiro foram
suspendidas em 100 l de tampão TE. Esta suspensão foi aquecida por 10
min a 100ºC e depois centrifugada a 15,000 g por 10 min. A reação de PCR
foi realizada utilizando o sobrenadante.
4.2.Primers:
Oito primers foram utilizados para amplificar: vanA, vanB, vanC-1,
vanC-2, vanC-3, vanD, vanE e vanG. As seqüências de cada primer foram
as seguintes: (5’3’): vanA: CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA e
CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA (732 bp); vanB:
GTGACAAACCGGAGGCGAGGA e CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA (635
bp); vanC-1: ATGGATTGGTACTGGTAT e TAGCGGGACTGACCAGTAA
(815 bp); vanC-2: ATGGATTGGTATTTGTAT e
80
TAGCGGGACTGCCTCGTAA (827 bp); van C-3:
GCCTTTACTTATTGTTCC e GCTTGTTCTTTGACCTTA (224 bp); vanD:
TGTGGGATGCGATATTCAA e TGCAGCCAAGTATCCGGTAA (500bp);
vanE: TGTGGTATCGGAGCTGCAG e ATAGTTTAGCTGGTAAC (430bp) e
vanG: CGGCATCCGTGTTTTTGA e GAACGATAGACCAATGCCTT
(941bp), de acordo com protocolo sugerido por Depardieu e colaboradores
(2004).
4.3. Amplificação PCR Multiplex
Dois micro litros de DNA foram levados a amplificação, de acordo
com Depardieu et al protocol, utilizando um total de 25 µl de uma mistura
de reação contendo 1X PCR tampão (10 mM Tris-HCl [pH 9.0], 50 mM
KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, ,50 M de cada dinucleotídeo , 40
pmol de cada par de primer ( tabela 1) , e 2 U de Taq polymerase
(Invitrogen). Essa mistura foi então submetida a um ciclo de desnaturação
inicial a 94ºC por 3 min e 30 ciclos de 94°C por 1 min, 54°C por 1 min e
72°C por 1 min, 1 ciclo de 72°C por 7 min e posteriormente mantida a 4°C
em termociclador (PT 100 Programable Thermal Controler, MJ Research
Inc., Cambridge, Reino Unido). Os fragmentos amplificados de DNA
fragments foram então anallisados por electroforese em 0.5 X Tris-borate-
EDTA em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio.
5. Controle de Qualidade
Realizado com E. faecalis cepa ATCC 29212, cepa referência E.
faecalis A256 (genótipo vanA), E. faecalis V583 (genótipo vanB), E.
81
gallinarum SS 1228 (genótipo vanC-1), E. casseliflavus SS 1229 (genótipo
vanC-2) e E. “flavescens” SS 1317 (genótipo vanC-2/3). Cada cepa foi
testada diversas vezes durante o estudo, por todos os métodos realizados.
82
Resultados e Discussão
Todos os 240 isolados foram identificados como Enterococcus
faecalis pelos testes convencionais. Todos os isolados demonstraram a
presença do gene vanA pela reação de PCR multiplex. Alguns estudos
têm demonstrado a alta prevalência do fenótipo Van A em isolados
brasileiros de ERV. Cereda et al (2002) demonstraram o gene vanA em 21
de 22 isolados brasileiros de E. faecium e Cordeiro et al (2004) em um
estudo realizado para caracterizar 73 E. faecalis resistentes aos
glicopeptídeos , isolados de diferentes hospitais brasileiros, demonstraram
a presença do gene vanA em todos os isolados.
De acordo com os resultados obtidos no teste de difusão em ágar
(tabela 2) 92,9% dos isolados mostraram-se resistentes a eritromicina; 80%
ao cloranfenicol; 2,6% a ampicilina; 73,3% a ciprofloxacina; 90,1 % a
rifampicina e 88,3 % a tetraciclina.
Os estudos disponíveis avaliando a atividade de drogas
alternativas contra Enterococcus faecalis resistentes à vancomicina são
extremamente escassos, embora exista a recomendação para que os
laboratórios clínicos testem as tetraciclinas, eritromicina, cloranfenicol e
rifampicina , especialmente quando o ERV apresenta-se resistente (com
CIM elevada) à ampicilina (1,15,23 ).
Um estudo onde isolados clínicos de ERV coletados em 97
diferentes centros médicos americanos no ano de 1992 foram analisados,
mostrou altas taxas de resistência à eritromicina e ciprofloxacina (98% e
69%, respectivamente), sendo porém somente de 18% a taxa de
83
resistência ao cloranfenicol. Outro estudo, mais recente, realizado com o
objetivo de investigar tendências na resistência ao cloranfenicol em
amostras de ERV isoladas da corrente sanguínea, no entanto, descreve um
aumento crescente da resistência a este antimicrobiano entre estes
patógenos (16). Em outro estudo multicêntrico, realizado pelo grupo
NAVRESS, entre as opções consideradas ainda disponíveis para o manejo
das infecções pelo ERV estavam o cloranfenicol e a linezolida considerando
que somente 0,3% de todos os Enterococcus faecium avaliados mostraram-
se resistentes a estes dois antimicrobianos (25). É importante salientar,
entretanto, que os isolados avaliados em nosso estudo apresentaram alta
taxa de resistência ao cloranfenicol, enquanto foram todos susceptíveis à
linezolida.
A ciprofloxacina é sugerida pelo CLSI para teste em isolados
urinários de enterococos. Entre os isolados urinários testados em nosso
estudo, foi observada uma taxa extremamente alta de resistência a este
antimicrobiano 42/52 (80,1%), do total de isolados urinários avaliados.
Resistência a este agente foi também extremamente alta em isolados de
ERV de outros sítios, representando 86% do total avaliado. Em um estudo
realizado por Mondino e colaboradores (2003) onde um grande número de
isolados de enterococos provenientes de dois hospitais brasileiros,
localizados no estado do Rio de Janeiro, foram avaliados quanto a sua
sensibilidade in vitro a diferentes agentes antimicrobianos, a percentagem
de resistência à ciprofloxacina observada foi de 36,4%. Ainda, nossa
porcentagem de resistência é extremamente alta quando comparada aos
resultados obtidos em estudo realizado por d’Azevedo et al (2004) onde o
84
percentual de resistência à esta droga observado foi de aproximadamente
22%. No entanto, a imensa maioria dos isolados avaliados nestes estudos
era composta por enterococos susceptíveis à vancomicina. Nossos achados
estão em concordância com resultados obtidos em estudo envolvendo
amostras de vigilância provenientes de diferentes hospitais de Brasilia, onde
79% dos isolados de Enterococcus faecalis mostravam-se resistentes à
ciprofloxacina (30), como também em estudo multicêntrico onde isolados
urinários de ERV foram avaliados (34).
Em estudo multicêntrico realizado na Europa, embora seja um
fato não completamente esclarecido, resistência às fluoroquinolonas foi
relacionada a altos níveis de resistência à gentamicina, sendo que 79% dos
isolados de E. faecalis com resistência a níveis elevados de gentamicina
eram resistentes a ciprofloxacina, em comparação com 6% dos isolados
susceptíveis à níveis elevados de gentamicina (27). Este achado podería
explicar, parcialmente, a alta prevalência de resistência à ciprofloxacina
entre nossos isolados.
Em contrapartida, quando os mesmos isolados urinários foram
testados para a susceptibilidade à nitrofurantoína, somente 3 (5,7%) em
um total de 52 isolados foram categorizados como resistentes. Este
resultado está em concordância com estudos prévios os quais têm
consistentemente reportado a baixa prevalência de resistência à
nitrofurantoína entre ERVs, indicando que esta poderia ser uma droga
efetiva no tratamento de infecções urinárias por eles causadas (33,34).
Alto nível de resistência à vancomicina foi observada em todos os
240 isolados, apresentando CIM>256µg/ml pelo método de Etest.
85
Todos os isolados tiveram teste de triagem positivo com 6 µg/ml de
vancomicina, em total concordância com os resultados obtidos na
determinação da concentração inibitória mínima. Estes resultados, conforme
descritos anteriormente (10), apontam o teste de triagem como um método
acurado e confiável, que poderia ser utilizado pelo laboratório clínico para a
deteção rápida de enterococos resistentes à vancomicina.
Todos os isolados mostraram-se resistentes a níveis elevados de
gentamicina e 16 (6,98%) destes também apresentaram resistência a níveis
elevados de estreptomicina. Existem diversas publicações onde têm sido
descritas altas taxas de resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos
em E.faecalis quando a gentamicina é avaliada (5,26,32). Um estudo
conduzido por d’Azevedo et al (2006), avaliando enterococos isolados em
três diferentes hospitais de nossa cidade, entre os anos de 1996 e 1997
demonstrou a disseminação intra e inter hospitalar de um clone
predominante de E. faecalis apresentando alto nível de resistência à
gentamicina.
Este grupo de microrganismos é intrinsecamente resistente a
diferentes classes de antimicrobianos, incluindo sulfa-trimetoprim,
clindamicina, cefalosporinas e penicilinas estáveis às penicilinases (4,15).
Cepas de ERV apresentando o fenótipo VanA são em sua maioria
altamente resistentes à vancomicina e moderadamente a altamente
resistentes à teicoplanina (1,4). Todos os isolados avaliados neste estudo
carreavam o gene vanA, conforme demonstrado pela técnica de PCR
multiplex. A grande maioria dos isolados, porém não todos, apresentaram
resistência à vancomicina e à teicoplanina, em concordância com o fenótipo
86
VanA. Quatro isolados, no entanto, apresentaram resistência somente à
vancomicina, permanecendo susceptíveis à teicoplanina pelo teste de
difusão em agar. Estes isolados deverão ser melhor investigados.
Embora todos os isolados tenham sido identificados com E. faecalis
e a resistência à ampicilina nesta espécie usualmente seja considerada um
fenômeno raro, uma não esperada redução da susceptibilidade foi
observada em alguns poucos isolados. Esta resistência foi detectada
inicialmente no teste de difusão em ágar e então confirmada pela
determinação da concentração inibitória mínima. Todos estes isolados
apresentaram CIMs para a ampicilina >64 µg/ml quando testados pelo
método de Etest e também tiveram resultado positivo no teste de triagem
para a resistência à ampicilina pelo método de diluição em agar. Taxas
semelhantes de resistência à ampicilina haviam sido descritas em amostras
de E. faecalis susceptíveis à vancomicina , em estudos realizados no Brasil
(7,18,30). A terapia de ERV resistente à ampicilina é particularmente difícil,
uma vez que estes isolados na maioria das vezes apresentam-se também
resistentes a múltiplos outros antimicrobianos (19,4). Os seis E. faecalis
apresentando resistência à ampicilina, eram também resistentes à
gentamicina (níveis elevados), teicoplanina, cloranfenicol, rifampicina e
tetraciclina. Dois deles eram também resistentes à níveis elevados de
estreptomicina. Estas amostras foram isoladas dos seguintes materiais
clínicos: trato urinário (1); sangue (2); cateter (1) e swab retal (2). Todos
foram recuperados no mesmo hospital, entre os anos de 2004 e 2005.
Um estudo conduzido por Rand e Houck (2004) descreve o
sinergismo obtido entre a rifampicina mais daptomicina e ampicilina, como
87
um esquema efetivo para tratar infecções causadas pelo ERV, no entanto,
altas taxas de resistência à rifampicina são esperadas neste microrganismo
multiresistente. Em estudo brasileiro, realizado por Reis e colaboradores
(2001), 16 isolados de E. faecalis resistentes à vancomicina foram testados
contra a rifampicina e todos eles demonstraram resistência in vitro, com
CIM
90
igual a 8 g/ml.
A produção de beta lactamase por enterococos tem sido
eventualmente descrita, embora permaneça incomum (20). Apesar disto, o
CLSI recomenda que o teste para a sua produção, através da técnica da
cefalosporina cromogênica seja realizado em isolados de sangue e líquor.
Nenhum dos isolados avaliados neste estudo teve um teste positivo para a
produção de lactamase pelo teste de Nitrocefin® , sugerindo não ser
este o mecanismo envolvido nos isolados resistentes à ampicilina.
A maioria dos enterococos são tolerantes à atividade bactericida dos
antibióticos -lactâmicos e glicopeptídeos, sendo necessário para o
tratamento de infecções como endocardites e meningites, a obtenção de
sinergismo entre um destes antimicrobianos mais um aminoglicosídeo
(4,14). A resistência à gentamicina apresentada por todos os isolados
avaliados neste estudo representa um motivo de preocupação, uma vez que
para a obtenção desinergismo sería necessário o uso de estreptomicina que
é considerada um aminoglicosídeo mais tóxico.
A identificação do ERV ao nível de espécie objetiva a diferenciação
entre resistência intrínseca e adquirida. O conhecimento do tipo de
resistência envolvido é considerado crítico para propostas de controle de
infecção hospitalar. Até o momento, de nosso conhecimento, nenhum
88
Enterococcus faecium apresentando resistência à vancomicina foi descrito
em nosso meio, embora a disseminação deste microorganismo tenha sido
descrita em diferentes cidades brasileiras.
Os resultados deste estudo, demonstram uma alta prevalência de
E.faecalis carreando o gene vanA em diferentes hospitais de nossa cidade,
a grande maioria exibindo um fenótipo de multiresistência. Dados de
susceptibilidade in vitro podem significar uma ferramenta útil na escolha da
terapia adequada das infecções sérias onde o ERV é o agente etiológico. O
agente mais ativo contra este grupo estudado foi a linezolida, considerando
que todos os isolados avaliados (100%) demonstraram susceptibilidade.
Nossos achados enfatizam a necessidade de medidas de controle da
disseminação deste microorganismo em nosso meio.
89
Tabela 1. Distribuição das amostras por material clínico
Instituição
Amostras ISCMPA
a
HNSC
b
HED
c
Total (%)
Urina 29 20 3 52 (21,7%)
Sangue 7 8 3 18 (7,5%)
Cateter 5 5 0 10 (4,2%)
Abscesso 5 2 1 8 (3,3%)
Swab retal 34 30 22 86 (35,8%)
Feridas 7 4 3 14 (5,8%)
Outros materiais 31 17 4 52 (21,7%)
Total 118 86 36 240 (100%)
a
Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre
b
Hospital Nossa Senhora da Conceição
c
Hospital Ernesto Dornelles
90
Table 2.
Antimicrobial susceptibility among Enterococcus faecalis vancomycin-resistant isolated in three different
hospitals in Porto Alegre-Results of disk diffusion
________________________________________________________________________
Number of isolates
_________________________________________________________
Institutions ISCMPA
a
(n= 118) HNSC
b
(n= 86) HED
c
(n=
36)
Antimicrobial agent S
d
I
d
R
d
S
d
I
d
R
d
S
d
I
d
R
d
______________________________________ __________________________________________________________________
Ampicillin 112(94.9%) 0 6 (5.1%) 86(100%) 0 0 36 (100%) 0
0
Ciprofloxacin 16(13.5%) 15 (12.7%) 87(73.8%) 9(10.5%) 12(13.9%) 65(75.6%) 7(19.4%) 5(13.8%)
24
Chloramphenicol 13(11.0%) 16 (13.5%) 89(75.5%) 7(8.1%) 5(5.8%) 74 (86.1%) 3 (8.3%)
3(8.3%) 29
Erythromycin 6 (5.1%) 1 (0.8%) 111 (94.1%) 5(5.8%) 1(1.2%) 80(93%) 2(5.5%)
1(2.8%) 33
Gentamicin 0 0 118(100%) 0 0 86(100%) 0 0
36
Linezolid 118(100%) 0 0 86(100%) 0 0 36(100%) 0
0
Streptomycin 92(77.9%) 0 10(22.1%) 80 (93%) 0 6 (7%) 36(100%) 0
0
Teicoplanin 0 0 118(100%) 4(4.7%) 0 82(95.3%) 0 0
36
Tetracyclin 12 (10.2%) 0 106 (89.8%) 14 (16.3%) 0 72 (83.7%) 2(5.5%) 0
34
____________________________________________________________________________________________________________
________
a
ISCMPA: Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre
b
HNSC: Hospital Nossa Senhora da Conceição
c
HED: Hospital Ernesto Dornelles
d
S:Susceptible I: Intermediate R: Resistant
91
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95
Antimicrobial resistance in vancomycin-resistant Enterococcus faecalis
isolated from three different hospitals in Porto Alegre, Southern of Brazil.
Silvana Vargas Superti
Pedro Alves d’Azevedo
1
Programa de Pós-Graduação em Patologia da Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
2
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).
* Corresponding author:
Professor Pedro A. d’Azevedo, Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre, Rua Sarmento Leite 245/211, Porto Alegre, RS 90050-170,
Brazil.
Fone: 55 51 32248822
Fax: 55 51 32269756
E-mail: [email protected]
96
Abstract
Vancomycin-resistant enterococci (VRE) are nowadays disseminated in
several hospitals in our city. These organisms used to show a multiresistant
profile, making some times the choice of an adequate antibiotic to treat the
infections where they are the etiologic agent extremely difficult. In this study,
a total of 240 isolates of enterococci presenting resistance to vancomycin,
recovered from three different hospitals between April 2002 and November
2005 were identified at species level by conventional biochemical tests and
were evaluated for their in vitro susceptibility to ampicillin, teicoplanin,
gentamicin and streptomycin, chloramphenicol, erythromycin, ciprofloxacin,
nitrofurantoin, fosfomycin and linezolid, by disk diffusion method. The
Minimal Inhibitory Concentration (MIC) to vancomycin was determined in all
isolates by E-test. Vancomycin-resistance genotypes were determined by
PCR with vanA, vanB, vanC, vanD and vanG specific primers. All the
isolates were identified as Enterococcus faecalis and showed the presence
of vanA gene by PCR analysis and MIC to vancomycin >256µg/ml. The most
in vitro active compound was linezolid, followed by fosfomycin. Ampicillin
resistance was detected in a few isolates.
Keywords: Enterococcus faecalis, glycopeptide resistance, PCR,
antimicrobial resistance.
97
Introduction
Vancomycin -resistant enterococci (VRE) are one of the most common
causes of hospital-acquired infections and presently VRE are disseminated
in many countries (4, 13). The increase in antimicrobial resistance observed
in nosocomial infections worldwide constitutes a major public health problem
(1, 13).
The first glycopeptide-resistant Enterococcus strain isolated in Brazil
was an isolate of Enterococcus faecium carrying a divergent vanD-type
resistant element, in Curitiba, Parana in 1996 (8). Further, VRE isolates were
reported in São Paulo State (31, 32). After that, numerous isolates of VRE
have been made throughout Brazil. Initially, most reports were of
Enterococcus faecium and later, the dissemination of Enterococcus faecalis
has occurred . The first report VRE in Porto Alegre was in 2000, in a tertiary
hospital, being an Enterococcus faecalis harboring the vanA gene (6).
Because of cumulative resistance to a variety of groups of antimicrobial
agents used in clinical practice, Enterococcus spp has become an important
nosocomial pathogen, especially in some groups of patients, creating
serious limitations in treatment options (15, 20). Till now, seven different
genotypes of VRE have been described in enterococci (1, 4, 17). Some of
these (vanA, vanB, vanD, vanE and vanG) are acquired mechanisms and
others (vanC1 and vanC2/C3) are intrinsic properties of enterococci. The
VanA and VanB types may be associated with the transfer of resistance to
other organisms, including Staphylococcus aureus. VanC type glycopeptide
resistance, on the other hand, is constitutive; therefore, transfer to other
98
organisms is not of such concern. The in vivo transmission of this resistance
had it first report suggested in May 2002 when the first case of infection
caused by S. aureus with complete resistance to vancomycin, VRSA
(MIC>128g/ml) was described (2).
The literature has little information about susceptibility profiles in VRE
isolates, particularly in Brazil and Latin America, what could represent a
helpful tool in empiric therapeutic of severe infections where it’s the etiologic
agent.
The aim of this study was to evaluate the in vitro activity of several
antimicrobial agents against vancomycin-resistant Enterococcus faecalis
isolated in three Hospitals in Porto Alegre city, southern Brazil and to
characterize these isolates, determining vancomycin-resistance genotypes
by PCR with vanA, vanB, vanC, vanD e vanG-specific primers.
99
Materials and methods
1. Bacterial strains:
The VRE strains (n=240) evaluated were isolated from patients of three
different hospitals in Porto Alegre, southern Brazil, being the following:
Hospital Nossa Senhora da Conceição (n=86); Complexo Irmandade Santa
Casa de Misericórdia de Porto Alegre (n=118) and Hospital Ernesto
Dornelles (n=36) between April 2002 and November 2005. Only one isolate
per patient was included in the study. The VRE strains were isolated from
different sites, according showed in table 1.
2. Identification:
The isolates were identified to the species level using the conventional
biochemical tests proposed by Facklam e Collins (1989) with modifications,
performing the following tests: mannitol; sorbose; arginine; arabinose;
sorbitol; raffinose; motility; pigment; sucrose; pyruvate; methyl--D-
glucopiranoside. All isolates were evaluated about your ability to grow in
broth containing 6.5% NaCl and to hydrolyze the esculin in presence of bile
salts, the pyrrolidonil--naphthylamide (PYR) and to hydrolyze the L-
leucina-β-naftilamida (LAP).
3. Antimicrobial Susceptibility
3.1. Disk Diffusion:
100
The isolates were tested by disk diffusion (Oxoid, Basingstoke, UK) for
resistance to ampicillin, teicoplanin, vancomycin, gentamicin (high level),
streptomycin (high level), rifampin, chloramfenicol, linezolid, ciprofloxacin,
erythromycin and fosfomycin. Susceptibility tests were performed following
the procedures and interpretive criteria provided by Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2005).
3.2. Etest:
For all the isolates, the minimal inhibitory concentration to vancomycin was
determined using the Etest (AB BIODISK, Solna, Sweden). The results were
recorded as minimal inhibitory concentration (MIC) in µg/ml and interpreted
according to the CLSI-2005.
3.3. Screening to high level aminoglycoside, ampicillin and vancomycin
resistance:
The screening of resistance to vancomycin (6µg/ml) and to high level
aminoglycoside (500 µg gentamicin per ml and 2000 µg streptomycin per ml)
resistance were performed according to CLSI recommendations in agar
dilution plates prepared with Brain Heart Infusion (Oxoid, Basingstoke,
England) and the screening to ampicillin resistance (8 and 16 µg/ml)
according to Stern et al (1994). The isolates were inoculated on the surface
of the agar. The inoculum comprised 10
8
CFU/ spot. Plates were incubated
at 35ºC for 24 h/48 h.
3.5. lactamase production:
101
The lactamase production was tested by the Nitrocephin test (Becton
Dickinson, Sparks, MD, USA) according to the manufacturer’s instructions.
4. Detection of van genes by PCR:
4.1. DNA extraction:
For each reaction, two to three colonies taken from overnight growth on a
blood agar plate was scraped from the surface of the agar and resuspended
in 100 l of TE buffer. The cell suspension was heated for 10 min at 100ºC
and was then centrifuged at 15,000 g for 10 min. The supernatant containing
DNA was used as template for PCR reactions.
4.2. Oligonucleotide primers:
Eigth oligonucleotide primers were used to amplify the vanA, van B, vanC-
1, vanC-2, vanC-3, vanD, vanE and vanG , as showed at table 2, according
with Depardieu et al. (2004) protocol.
4.3. Multiplex PCR amplification:
Two micro liters of DNA was subjected to multiplex PCR amplification
according with Depardieu et al protocol, using a total 25 µl of a reaction
mixture containing 1X PCR buffer (10 mM Tris-HCl [pH 9.0], 50 mM KCl, 1.5
mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.2 mg of bovine serum albumin per ml), 50
M each deoxynucleoside triphosphate, 40 pmol of each of the 10 primer
pairs and 2 U of Taq polymerase (Invitrogen). Amplification was carried out
with the following thermal cycling profile: 3 min at 94°C and 30 cycles of
amplification consisting of 1 min at 94°C, 1 min at 54°C, and 1 min at 72°C,
102
with 7 min at 72°C for the final extension. The DNA fragments were analyzed
by electrophoresis in 0.5 X Tris-borate-EDTA on a 1% agarose gel stained
with ethidium bromide.
5. Quality assurance
Internal quality control was carried out with E. faecalis strain ATCC
29212. Each strain was tested many times during the study by the MIC and
disk-diffusion methods.
103
Results and Discussion:
All the 240 isolates were identified as Enterococcus faecalis by the
conventional biochemical tests. All the isolates showed the presence of the
vanA gene in the multiplex PCR. Some reports had been demonstrating the
high prevalence of Van A phenotype in Brazilian isolates of VRE. Cereda et
al (2002) found the vanA gene in 21 of 22 isolates of Brazilian isolates of
Enterococcus faecium and Cordeiro et al (2004) in a study made to
characterize 73 glycopeptide-resistant Enterococcus faecalis recovered from
different Brazilian Hospitals found the vanA gene in all the isolates.
According to the results of the disk diffusion (presented in table 3)
92.9% of isolates were resistant to erythromycin; 80% to chloramphenicol;
2.6 % to ampicillin; 73.3% to ciprofloxacin; 90.1 % to rifampin and 88.3 % to
tetracycline. The studies in the literature evaluating the activity of alternative
drugs against vancomycin-resistant Enterococcus faecalis are extremely
scarce, although the laboratory should test antimicrobials including
tetracyclines, erythromycin, chloramphenicol and rifampin, especially when
the infecting VRE is highly resistant to ampicillin (1, 15, 23). A study where
87 clinical VRE isolates collected and processed in 97 US medical centers in
1992 were analyzed, showed a high rate of resistance to erythromycin, and
ciprofloxacin (98% and 69%, respectively), but only 18% of isolates were
resistant to chloramphenicol. A more recent study, made to investigate
trends in chloramphenicol resistance in VRE bloodstream isolates, however,
described a significant emergence of chloramphenicol resistance in these
pathogens (16). In an another study performed by NAVRESS group,
104
between the options considered still avalilable to managment of VRE were
chloramphenicol and linezolid, considering that only 0.3% of the
Enterococcus faecium evaluated were resistant to these drugs (25). It should
be noted, however, that our isolates present high rate of resistance to
chloramphenicol but remain, all of them, susceptible to linezolid.
Ciprofloxacin is suggested by CLSI to test in isolates from urinary
tract. When an analysis of the 52 urinary isolates included in our study was
made, we observed that the resistance to this compound was found in 42
(80.1%) of the total. Resistance to this agent was also extremely high in VRE
isolates from others sites, representing 86% of the total of isolates. In a
study conduced by Mondino et al (2003) where a great number of isolates
recovered from two Brazilian hospitals, located in Niteroi city, Rio de Janeiro,
Brazil, were evaluated to their susceptibility to different antimicrobial agents,
the percentage of resistance to ciprofloxacin was 36.4%. Also, our
percentage of resistance is high when compared to results obtained in a
study performed by d’Azevedo et al (2004) in our city, where the percentage
of resistance to this fluorquinolone was about 22%. Almost all isolates
evaluated in both the studies, however, were vancomycin-susceptible
enterococci. Our finding supports data obtained in a prior study, involving
enterococcal surveilance isolates from hospitals of Brazilia, Brazil where
79% of Enterococcus faecalis isolates evaluated were resistant to
ciprofloxacin (30) and in a multicenter study where urinary isolates of VRE
strains were evaluated (34).
In a European multicenter study, although unexplained, fluoroquinolone
resistance was linked with high level of resistance (HLR) to gentamicin,
105
where 79% of E. faecalis isolates with HLR to gentamicin were resistant to
ciprofloxacin in comparison with 6% of strains with no HLR to gentamicin
(27). It could explain the high prevalence of fluorquinolone resistance
between our isolates.
On the other hand, when the same urinary isolates were tested for
susceptibility to nitrofurantoin, only 3(5.7%) in a total of 52 isolated were
resistant. Our data are in concordance with previous studies, which have
consistently reported a low prevalence of nitrofurantoin resistance in VRE
and indicate that this agent could be effective in the treatment of urinary
infections (33, 34).
High level of resistance to vancomycin was observed in all 240 isolates,
presenting MIC>256µg/ml by Etest method. All the isolates showed positive
results in the screening with 6 µg/ml of vancomycin, in complete agreement
with the results achieved with the MIC method. Considering these results, as
demonstrated earlier (10), the agar screen appeared to be a reliable and
easy method to laboratory to detect vancomycin resistance promptly.
All the isolates showed resistance to gentamicin (high level) and to our
concern, 16 (6.98%) of isolates showed high level resistance to streptomycin
either. Several publications have described resistance in all vancomycin-
resistant E. faecalis when gentamicin is evaluated (5, 26, 32). A study
conduced by d’Azevedo et al (2006), evaluating enterococci recovered from
three different hospitals in our city, between 1996 and 1997 had yet
demonstrated the intra and inter-hospital dissemination of a predominant
clone of E. faecalis presenting high level of resistance to gentamicin.
106
This group of microorganisms is intrinsically resistant to several groups
of antimicrobial agents, including co-trimoxazole, clindamycin,
cephalosporins, and penicillinase-resistant penicillins (15). Vancomycin-
resistant enterococci have acquired resistance to vancomycin and other
glycopeptides making the therapeutic options available to treat serious
infections caused by VRE extremely scarce (4, 15).
The VanA phenotype VRE strains are typically highly resistant to
vancomycin and moderately to highly resistant to teicoplanin (1,4). All
isolates evaluated in this study harboured the vanA gene as demonstrated
by PCR analysis. A great number of isolates, but not all, showed
vancomycin and teicoplanin resistance in congruence to the VanA
phenotype. Four isolates showed only resistance to vancomycin while
remained susceptible to teicoplanin by disk diffusion test. All of them had the
vanA gene. The teicoplanin susceptibility of these strains needs to be better
investigated.
Although all the isolates were identified as Enterococcus faecalis and
resistance to ampicillin in this group of microorganisms used to be extremely
rare, an unexpected reduced susceptibility was detected in a few isolates. It
was detected first in disk diffusion test and then confirmed by a MIC method.
All these isolates showed MIC>64 µg/ml when tested by Etest, and also had
the screening method by agar dilution positive to ampicilin. Similar
percentage of resistance to this agent was found in vancomycin-susceptible
Enterococcus faecalis in studies performed by others Brazilians authors (6,
18, 30).
107
Therapy of ampicillin-resistant VRE is particularly difficult
because such isolates often display resistance to multiple other antibiotics as
well (4, 19). The six Enterococcus faecalis presenting resistant to ampicillin
were also resistant to gentamicin (high level), teicoplanin, chloramphenicol,
rifampin and tetracycline. Two of them were also resistance to high level of
streptomycin. These strains were isolated from the following body sites:
urinary tract (1); blood (2); catheter (1) and retal swab (2). All isolates were
recovered from the same Hospital, between years 2004 and 2005.
A study conduced by Rand, K.H. e Houck H (2004) describe the
sinergism achieved between rifampin plus daptomycin and ampicillin as an
efetive scheme to treat VRE infectious, however , high rates of resistance
to this agent is expected in these multiresistant organisms (21). In a
Brazilian study performed by Reis et al (2001), 16 vancomycin-resistant
Enterococcus faecalis were tested against rifampin and all of them showed
in vitro resistance, with MIC
90
of 8 g/ml.
Penicillinase production has been reported in enterococci, but
remains uncommon (21). Despite this, the CLSI recommends that test for
lactamase production should be performed in all clinical isolates from blood
and liquor. None of the strains evaluated at this study had a positive test for
lactamase production by the Nitrocefin® test, suggesting that it’s not the
mechanism implicated here.
Most enterococci are tolerant to the bactericidal activity of -lactam
and glycopeptide antibiotics, is necessary to treat infections such as
endocarditis and meningitis achieving synergy between one of these
antibiotics and an aminoglycoside (4, 14). All isolates evaluated in this study
108
showed high-level resistance to gentamicin, what is a reason of worry,
because to obtain synergism would be necessary the use of streptomycin,
what is a more toxic aminoglycoside.
Identification of VRE to species level aids in confirming whether an
isolate has intrinsic or acquired resistance. Knowledge of the type of
resistance is critical for infections control purposes (CDC). Until now, by our
knowledge, no one Enterococcus faecium vancomycin-resistant was
described in our city, although the dissemination of this organism had been
described in different Brazilian cities.
Our results show the high prevalence of E.faecalis carrying the vanA
gene in different hospitals of our city, most of them exhibiting mutiresistance
phenotypes. Knowledge of the in vitro susceptibility data could means a little
help in the choice of antimicrobial drug to treat the infections where VRE is
the etiologic agent. The most active compound against this group of
microorganisms was linezolid considering that all isolates (100%) were
susceptible to this agent. Our finding emphasizes the need for infection
control measures to control the dissemination of this organism.
109
Table 1. Distribution of strains by culture source
Helthcare Institutions
Species ISCMPA
a
HNSC
b
HED
c
Total (%)
Urinary tract 29 20 3 52 (21.7%)
Blood 7 8 3 18 (7.5%)
Catheter 5 5 0 10 (4.2%)
Abscess 5 2 1 8 (3.3%)
Rectal swab 34 30 22 86 (35.8%)
Wounds 7 4 3 14 (5.8%)
Other 31 17 4 52 (21.7%)
Total 118 86 36 240 (100%)
a
Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre
b
Hospital Nossa Senhora da Conceição
c
Hospital Ernesto Dornelles
110
Table2. Deoxyoligonucleotide primers used in this study
Gene Sequence (5’-3’) Size of PCR product (pb)
vanA
CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA
CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA
732
vanB
GTGACAAACCGGAGGCGAGGA
CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA
635
vanC1
ATGGATTGGTACTGGTAT
TAGCGGGACTGACCAGTAA
815
vanC2
ATGGATTGGTATTTGTAT
TAGCGGGACTGCCTCGTAA
827
vanC3
GCCTTTACTTATTGTTCC
GCTTGTTCTTTGACCTTA
224
vanD
TGTGGGATGCGATATTCAA
TGCAGCCAAGTATCCGGTAA
500
vanE
TGTGGTATCGGAGCTGCAG
ATAGTTTAGCTGGTAAC
430
vanG
CGGCATCCGTGTTTTTGA
GAACGATAGACCAATGCCTT
941
111
Table 1.
Antimicrobial susceptibility among Enterococcus faecalis vancomycin-resistant isolated in three different
hospitals in Porto Alegre-Results of disk diffusion
________________________________________________________________________
Number of isolates
_________________________________________________________
Institutions ISCMPA
a
(n= 118) HNSC
b
(n= 86) HED
c
(n=
36)
Antimicrobial agent S
d
I
d
R
d
S
d
I
d
R
d
S
d
I
d
R
d
______________________________________ __________________________________________________________________
Ampicillin 112(94.9%) 0 6 (5.1%) 86(100%) 0 0 36 (100%) 0
0
Ciprofloxacin 16(13.5%) 15 (12.7%) 87(73.8%) 9(10.5%) 12(13.9%) 65(75.6%) 7(19.4%) 5(13.8%)
24
Chloramphenicol 13(11.0%) 16 (13.5%) 89(75.5%) 7(8.1%) 5(5.8%) 74 (86.1%) 3 (8.3%)
3(8.3%) 29
Erythromycin 6 (5.1%) 1 (0.8%) 111 (94.1%) 5(5.8%) 1(1.2%) 80(93%) 2(5.5%)
1(2.8%) 33
Gentamicin 0 0 118(100%) 0 0 86(100%) 0 0
36
Linezolid 118(100%) 0 0 86(100%) 0 0 36(100%) 0
0
Streptomycin 92(77.9%) 0 10(22.1%) 80 (93%) 0 6 (7%) 36(100%) 0
0
Teicoplanin 0 0 118(100%) 4(4.7%) 0 82(95.3%) 0 0
36
Tetracyclin 12 (10.2%) 0 106 (89.8%) 14 (16.3%) 0 72 (83.7%) 2(5.5%) 0
34
____________________________________________________________________________________________________________
________
a
ISCMPA: Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre
b
HNSC: Hospital Nossa Senhora da Conceição
c
HED: Hospital Ernesto Dornelles
d
S:Susceptible I: Intermediate R: Resistant
112
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