( PDF ) Filogeografia e variabilidade genética de Calibrachoa heterophylla (Sendtn.) Wijsman (Solanaceae)

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Biociências

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular

Filogeografia e Variabilidade Genética de Calibrachoa

heterophylla (Sendtn.) Wijsman (Solanaceae)

Geraldo Mäder

Orientadora: Dra. Loreta Brandão de Freitas

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação

em Genética e Biologia Molecular da UFRGS como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em

Genética e Biologia Molecular.

Porto Alegre

Fevereiro de 2008

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INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS

- Laboratório de Evolução Molecular, Departamento de Genética, Instituto de Biociências,

UFRGS

- Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, PUCRS

- Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX)

- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

- Programa Especial em Taxonomia – PROTAX (MCT/CNPq/CAPES)

- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS)

- Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PROPESQ-

UFRGS)

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AGRADECIMENTOS

Esse trabalho marca mais uma etapa na minha vida profissional, nem sempre é

possível lembrar o nome de todas as pessoas que me ajudaram nesse período, entretanto

não posso deixar de agradecer a algumas delas:

À minha orientadora Dra. Loreta Brandão de Freitas, pela amizade, disponibilidade

e atenção me auxiliando sempre que tive dúvidas, além de acreditar no meu potencial. Por

buscar soluções e transmitir tranqüilidade sempre que surgiu um novo obstáculo durante

esses dois anos.

Ao colaborador Dr. João R. Stehmann pelo auxílio na averiguação das exsicatas.

À Dra. Aline P. Lorenz Lemke, pela amizade e dedicação nos ensinamentos desde

utilização dos programas para a análise dos resultados até dicas fundamentais para a

conclusão deste trabalho.

Aos demais colegas do Laboratório de Evolução Molecular pela amizade no dia-a-

dia, auxílio nas coletas e atividades de laboratório, além de idéias para o desenvolvimento

dessa dissertação: Aline R., Carol, Clênio, Jéferson, Pakisa, Priscilla, Raquel e Tielli.

Aos professores e demais colegas do Departamento de Genética que muito me

ensinaram nesses anos, não esquecendo também dos colegas do Departamento de Botânica

com os quais aprendi a interpretar as questões com outros olhos.

Ao Elmo e à Ellen pela presteza em resolver tantas questões burocráticas.

À minha família que sempre me apoiou e incentivou a chegar até aqui.

Aos amigos, colegas de graduação e do futebol pelos momentos de descontração

durante a composição deste trabalho.

À Universidade Federal do Rio Grande do Sul e Instituições e Fontes

Financiadoras.

SUMÁRIO

RESUMO..................................................................................................................... 06

ABSTRACT................................................................................................................. 09

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 12

1.1. Sinopse histórica do gênero Calibrachoa Cerv. ex La Llave & Lex.........

1.2. Caracterização do grupo de estudo............................................................ 14

1.3. Utilização e potencial ornamental............................................................. 16

1.4. Calibrachoa heterophylla (Sendtn.) Wijsman...........................................

1.5. A Planície Costeira do Rio Grande do Sul................................................ 19

1.6. Especiação e fluxo gênico......................................................................... 26

1.7. Filogeografia e conservação...................................................................... 29

1.8. Marcadores moleculares............................................................................ 32

2. OBJETIVOS............................................................................................................. 36

2.1. Objetivo geral............................................................................................ 36

2.2. Objetivos específicos................................................................................. 36

3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 37

3.1. Coletas....................................................................................................... 37

3.2. Extração do DNA...................................................................................... 39

3.3. Amplificação e seqüenciamento................................................................ 40

3.4. Análise das seqüências.............................................................................. 44

4. RESULTADOS........................................................................................................ 46

4.1. Caracterização das seqüências obtidas...................................................... 46

4.2. Estrutura populacional............................................................................... 49

4.3. Detecção de barreiras biogeográficas........................................................ 57

4.4. Dinâmica populacional.............................................................................. 62

5. DISCUSSÃO............................................................................................................ 66

5.1. A diversidade dos marcadores utilizados.................................................. 66

5.2. Geologia da Planície Costeira vs filogeografia de C. heterophylla........... 66

5.3. Expansão ou estabilidade populacional.................................................... 71

5.4. Conservação do ambiente.......................................................................... 72

5.5. Distribuição da espécie.............................................................................. 74

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 76

RESUMO

O gênero Calibrachoa (Solanaceae) é tipicamente Sul-americano, atingiu o sudeste

brasileiro através de uma provável rota migratória andino-pampeana. As espécies de

Calibrachoa não possuem mecanismos de dispersão de sementes a longas distâncias nem

qualquer estratégia de multiplicação vegetativa. Calibrachoa heterophylla é uma espécie

que habita dunas e campos arenosos, preferencialmente ao longo da Planície Costeira do

Rio Grande do Sul (RS). Essa região pode ser considerada como uma área altamente

dinâmica do ponto de vista da geografia histórica. Oscilações periódicas no clima e na

disponibilidade de habitats, especialmente durante o Pleistoceno, tiveram grande efeito na

distribuição e história evolutiva de muitos grupos biológicos. Na Planície Costeira do RS,

áreas que conservam a fisionomia natural são cada vez mais raras e fragmentadas, devido à

urbanização e atividades agronômicas, fazendo com que muitas espécies vegetais e animais

estejam cada vez mais ameaçadas de extinção. A disponibilidade e o avanço das técnicas

moleculares, além do enriquecimento das análises filogenéticas intra-específicas, têm

possibilitado de maneira eficaz a interpretação de possíveis cenários evolutivos. Dados

filogeográficos permitem estabelecer uma estratégia que prioriza a conservação de grupos

que incluam representantes da maior parte da história evolutiva das espécies.

Este trabalho teve como objetivo principal caracterizar, através de marcadores

moleculares plastidiais, a variabilidade genética da espécie C. heterophylla ao longo de

toda sua distribuição geográfica conhecida, fornecendo dados sobre sua evolução,

taxonomia e filogeografia, associando-os à geologia da Planície Costeira.

Foram amostrados 220 indivíduos pertencentes a 13 populações ao longo da

distribuição da espécie no RS. O material coletado teve o DNA extraído a partir de folhas

jovens usando CTAB. Foram analisadas as seqüências dos espaçadores intergênicos

plastidiais trnH-psbA, e trnS-trnG. Análises filogeográficas e populacionais foram

realizadas com a finalidade de avaliar a diversidade e padrões evolutivos de C.

heterophylla.

O alinhamento das seqüências de trnH-psbA e trnS-trnG apresentou 1280 pb com

26 sítios polimórficos, variabilidade relativamente alta se considerarmos a recente história

evolutiva do grupo. Na network gerada foi observada uma estruturação geográfica

consistente onde 65,24% da variação detectada corresponderam à variação entre

populações (Φ

=0,65238). Esta característica foi reforçada pela significante correlação,

entre as distâncias genética e geográfica, observada através dos testes de Mantel e

Autocorrelação Espacial. A análise de possíveis barreiras ao fluxo gênico na área de

estudo, realizada através do programa SAMOVA, indicou a existência de até duas barreiras

formando três grupos de populações. Não foram encontradas evidências de expansão

demográfica recente para o conjunto completo de dados: a análise da distribuição mismatch

apresentou uma curva bimodal e os índices D de Tajima e Fs de Fu não apresentaram

valores estatisticamente significativos. Entretanto, quando os mesmos parâmetros foram

calculados para os agrupamentos formados pelo programa SAMOVA isoladamente, dois

deles (1 e 2) parecem ter passado por um período de expansão demográfica recente.

A restrita capacidade de dispersão de sementes nesta espécie e, a herança materna

dos cloroplastos neste gênero, podem ser as prováveis razões para a baixa variabilidade

genética intrapopulacional encontrada, visto que os marcadores utilizados são seqüências

plastidiais. A alta diversidade observada entre alguns dos grupos dificilmente poderia ter

surgido, em sua totalidade, já na Planície Costeira, pois essa é uma região geologicamente

muito recente (~ 400.000 A.P.). Então, distintas linhagens devem ter colonizado essa

região através de diferentes rotas ou em momentos diversos e não se uniram devido às

barreiras biogeográficas que encontraram no ambiente. Quando se compara a localização

das barreiras biogeográficas sugeridas pelo programa SAMOVA com a geologia da

Planície Costeira, percebe-se que essas barreiras coincidem com paleocanais mapeados

através de dados sísmicos por diversos autores.

Durante as coletas, muitas vezes não foi possível encontrar C. heterophylla em

regiões onde sua ocorrência era esperada. Pelo fato da Planície Costeira do RS ser cada vez

mais alvo da ação humana e de C. heterophylla demonstrar ser muito exigente quanto a

mudanças ambientais, essa espécie pode ser indicada como altamente ameaçada.

Um resultado inesperado foi a descoberta da existência de populações de C.

heterophylla fora da Planície Costeira em coleta realizada por nosso grupo na região da

Campanha Sul-rio-grandense, em um ambiente muito semelhante àquele normalmente

encontrado na Planície Costeira. Este fato conduz à necessidade de averiguarmos a

existência de outras populações no interior do continente no RS. Fica como perspectiva

para o pleno conhecimento da evolução, origem e real distribuição de C. heterophylla,

investigar as redes hidrográficas localizadas no interior do Estado.

ABSTRACT

The South American genus Calibrachoa (Solanaceae) likely arrived at the Brazilian

southeast region through an andean-pampean migratory route. Calibrachoa species do not

have a long distance seed dispersal system or any strategy for vegetative propagation.

Calibrachoa heterophylla dwell in dunes and sandy fields, mainly at the Coastal Plain of

Rio Grande do Sul Brazilian state. Cyclic climatic and habitat occurrence oscillations in

the Pleistocene had high influence in the distribution and evolutionary history of many

biological groups. Areas that still maintain the original habitats in the Coastal Plain are rare

and mostly fragmented due to anthropic actions, leading many plant and animal species to

near extinction. The use of new molecular techniques and analytical methods bring

important insights into likely evolutionary scenarios. Besides, findings of phylogeographic

studies also brought new light into biological conservation strategies, focusing in

intraspecific history and patterns of diversity.

The main objective of this work is to use plastidial molecular markers to

characterize the genetic diversity of C. heterophylla through its distributional range, to

better understand its evolution, phylogeographic patterns and taxonomy, associated with

the geological history of the Coastal Plain.

We sampled 220 individuals from 13 populations through Rio Grande do Sul, from

which we obtained sequences from the plastidial intergenic spacers trnH-psbA and trnS-

trnG. The sequences were aligned and analyzed with several populational and

phylogeographic methods.

The alignment of trnH-psbA plus trnS-trnG spacers is 1280 bp with 26 variable

sites, a high value considering the likely recent evolutionary history of the specie.

The

haplotype network shows a clear geographical structure, with 65.2% of the variation being

among populations in the AMOVA as well as having a significantly high Φ

(=0,65238).

We also found a significant correlation between the genetic and geographical distances and

significant patterns in the Spatial Autocorrelation analysis. The SAMOVA analysis found

two likely barriers to gene flow separating three groups of populations. No evidence for

population expansion for the species was found using a mismatch distribution analysis

(that was bimodal) or by neutrality tests (all non-significant). However, when these

statistics where estimated for each population-group found in SAMOVA, two of them (1

and 2) presented evidences for a relatively recent demographic expansion.

The limited seed dispersal ability of this species coupled with the maternal

inheritance of the plastidial markers used may be a likely explanation for the low

intrapopulational diversity found. The high divergence found between some groups could

not likely be explained has having originated in the Coastal Plain, as this region of

geologically very recent (~400.000 years ago). Consequently, already differentiated

lineages should have colonized the region perhaps by different routes and stayed isolated

due the barriers found in the area. When the location of the barriers suggested by

SAMOVA is compared with the geology of the region, there are coincidence between

those and the reconstructed path of ancient river channels.

During field work, at several sites where the presence of C. heterophylla was

expected, it actually could not be found. This is likely caused by the increasing human

interference in the habitat and the small tolerance of the species to habitat degradation, and

suggests that this species may be in danger of extinction.

An unexpected result was the discovery of one population of C. heterophylla

outside the Coastal Plain, in a region adjacent to it, in a place such as sandy river beach,

habitat that is very similar to its usual habitat in the Coastal Plain. Therefore, it is important

to better understand the evolutionary history of this species to continue investigating these

other populations outside its main area of occurrence.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Sinopse histórica do gênero Calibrachoa Cerv. ex La Llave & Lex.

A família Solanaceae, pertencente à ordem Solanales, Euasterídeas I (APG II,

2003), é composta por aproximadamente 3000 espécies, distribuídas em 150 gêneros

(Souza & Lorenzi, 2005), sendo a América do Sul seu maior centro de diversidade

(Hunziker, 2001). No Brasil ocorrem 32 gêneros e 350 espécies (Souza & Lorenzi, 2005).

Essa família possui grande importância econômica para a sociedade, com diversas espécies

comestíveis, ornamentais e medicinais. D’Arcy (1991) dividiu Solanaceae em três

subfamílias: Solanoideae, Nolanoideae e Cestroideae. Estudos filogenéticos baseados em

informações do DNA plastidial (cpDNA) mudaram significativamente a compreensão dos

relacionamentos entre as subfamílias de Solanaceae e uma nova classificação foi proposta

(Olmstead & Palmer, 1992; Olmstead et al., 1999). A tradicional subfamília Cestroideae

foi dividida em cinco subfamílias menores: Cestroideae, Petunioideae, Schizanthoideae,

Nicotianoideae e Schwenckioideae. Petunioideae inclui os gêneros Petunia Juss. e

Calibrachoa Cerv. ex La Llave e Lexarza, além de outros gêneros da antiga tribo

Nicotianeae.

O gênero Petunia foi descrito por Antoine L. Jussieu em 1803 a partir de duas

espécies, P. parviflora Juss. e P. nyctaginiflora Juss., hoje conhecidas como Calibrachoa

parviflora (Juss.) D’Arcy e P. axillaris (Lam.) Britton, Sterns & Poggenb.,

respectivamente (Stehmann, 1999). Outros autores, como Miers (1846) e Sendtner (1846),

publicaram importantes obras que contribuíram para o conhecimento do gênero e

acrescentaram diversas espécies. Em 1911, Fries publicou um trabalho reconhecendo 27

espécies para Petunia, sendo que nove destas nunca haviam sido descritas. Wijsman (1983)

e Wijsman & Jong (1985) perceberam que as espécies de Petunia podiam ser divididas em

dois grupos de acordo com o número cromossômico e algumas características

morfológicas como pré-floração, hábito, forma da folha e coloração da corola. A partir

dessas informações, Wijnands et al. (1986) separaram esses grupos em dois gêneros:

Petunia, com 2n=14, e Calibrachoa, com 2n=18. O epíteto genérico Calibrachoa é uma

homenagem de Cervantes ao professor de botânica mexicano Antonii de la Cal et Bracho

(Stehmann, 1999). A recombinação de diversas espécies de Petunia sensu para

Calibrachoa foi realizada a seguir por Wijsman (1990), que transferiu 15 espécies e

Stehmann & Semir (1997) que acrescentaram mais dez (sendo uma espécie nova), ambos

os trabalhos baseados nas mesmas características diferenciais utilizadas por Wijsman &

Jong (1985). Atualmente, são reconhecidas 25 espécies para o gênero Calibrachoa,

entretanto algumas espécies descritas como pertencentes ao gênero Petunia, apesar de

possuírem características cromossômicas de Calibrachoa, ainda não foram recombinadas

por não terem sido analisadas após a separação dos dois gêneros (Stehmann & Semir,

2005).

Estudos mais recentes indicam que Calibrachoa pode ser divido em dois subgrupos

baseados na autocompatibilidade reprodutiva (Watanabe et al., 1997; Tsukamoto et al.,

1998; Ando et al., 2001; Tsukamoto et al., 2002), morfologia da superfície das sementes

(Watanabe et al., 1999), conteúdo de DNA nuclear (Mishiba et al., 2000) e análises

filogenéticas (Ando et al., 2005). Em todas essas análises, C. parviflora (Juss.) Wijsman e

C. pygmaea (R.E.Fr.) Wijsman ficam agrupadas, enquanto as outras espécies do gênero

formam um grupo à parte.

1.2. Caracterização do grupo de estudo

O gênero Calibrachoa, com a exceção de C. parviflora, ocorre exclusivamente no

sudeste da América do Sul, de Minas Gerais até o Uruguai, com abundância máxima nos

estados brasileiros do Rio Grande do Sul (RS) e Santa Catarina (SC) (Tsukamoto et al.,

2002). Gêneros irmãos de Calibrachoa e Petunia, como por exemplo, Fabiana Ruiz &

Pav., habitam regiões andinas e patagônicas. Sugere-se que os gêneros Calibrachoa e

Petunia teriam surgido através de uma radiação adaptativa a partir dos Andes, tendo sido

conduzidos a uma evolução divergente, colonizando áreas de clima subtropical como a

região pampeana e chegando posteriormente ao planalto catarinense (Stehmann, 1999).

A grande maioria das espécies possui distribuição contínua, associada a uma

determinada região fisionômica e restrita a uma condição edáfica característica (Stehmann,

1999). Segundo Stehmann & Semir (2005), no Brasil ocorrem 19 espécies, divididas em

dois grandes centros de diversidade: um nos Planaltos de Curitiba e Ponta Grossa (Paraná);

outro nos campos de altitude da borda oriental do planalto sul-brasileiro (Santa Catarina).

Segundo os mesmos autores existe ainda um terceiro, porém menor, centro de diversidade

na província Pampeana, fronteira entre Brasil e Uruguai. Calibrachoa, assim como a

maioria de seus gêneros irmãos, possui origem andina e é aceitável crer que tenha existido

no passado uma rota migratória andino-pampeana que permitiu que as espécies atingissem

o sudeste brasileiro (Stehmann, 1999). Esta hipótese biogeográfica é sugerida para vários

outros grupos de plantas, devido à presença de espécies de gêneros típicos dos Andes na

região subtropical do Brasil, especialmente em áreas mais altas e frias (Rambo, 1951;

Safford, 1999).

As espécies do gênero têm hábito arbustivo, subarbustivo ou herbáceo e, em geral,

possuem menos de 70 cm de altura. Três padrões de hábito já foram observados em

Calibrachoa: ereto, decumbente e repente. A maioria das espécies possui caule lenhoso,

característica que sugere que essas sejam perenes. C. parviflora e C. elegans (Miers)

Stehmann & Semir são as únicas espécies comprovadamente anuais (Stehmann, 1999). O

indumento das plantas representantes do gênero pode ser pubérulo, tomentoso, piloso ou

subviloso, e constituído de tricomas simples e unisseriados. Braquiblastos, pequenos ramos

axilares, são encontrados principalmente no grupo de espécies com folhas lineares, como

C. ericaefolia (R.E.Fr.) Wijsman, C. heterophylla (Sendtn.) Wijsman, C. micrantha

(R.E.Fr.) Stehmann & Semir e C. paranensis (Dusén) Wijsman. A corola é zigomorfa

infundibuliforme, com a base tubulosa amarela ou esbranquiçada, possui pré-floração

conduplicada, onde as duas maiores pétalas que formarão os lobos inferiores se dobram

sobre as três restantes. Os cinco estames estão arranjados em três alturas diferentes e o

pólen é amarelo, diferindo da maior parte das espécies de Petunia. A maioria das espécies

de Calibrachoa possui características morfológicas associadas à melitofilia, as exceções

são C. serrulata (L.B. Sm. & Downs) Stehmann & Semir e C. sendtneriana (R.E.Fr.)

Stehmann & Semir que são ornitófilas e C. parviflora que é autógama e não necessita de

dispersores de pólen (Stehmann, 1999).

As espécies do gênero são preferencialmente encontradas em afloramentos

rochosos, bordas de floresta, campos arenosos ou pedregosos. Nenhuma estratégia de

multiplicação vegetativa foi observada e as espécies de Calibrachoa não possuem

mecanismos de dispersão de sementes a longas distâncias, seus frutos são deiscentes e as

sementes (Figura 1) liberadas diretamente no solo, próximas à planta-mãe (Stehmann,

1999).

1.3. Utilização e potencial ornamental

O cultivo de Petunia para utilização como planta ornamental foi registrado pela

primeira vez por volta de 1830, através de sucessivos cruzamentos interespecíficos. Hoje já

existem cultivares de petúnia com praticamente todas as colorações de flor comumente

encontradas na horticultura (Murakami et al., 2004). Cultivares comerciais de Calibrachoa

foram inicialmente desenvolvidas no Japão, em 1994, e posteriormente na Europa, em

1996 (Rice, 1997). Desde então, diversos cruzamentos têm sido feitos e uma grande escala

de cores de corola já foi gerada. A hibridação entre espécies do gênero não é difícil e,

aparentemente, não existem mecanismos de isolamento reprodutivo pós-polinização ou

pós-zigóticos entre a maioria das espécies dentro de cada um destes gêneros (Watanabe et

al., 1997; Stehmann, 1999). Possíveis híbridos interespecíficos já foram identificados em

seu ambiente natural: C. linoides (Sendtn.) Wijsman x C. sellowiana (Sendtn.) Wijsman

(Stehmann et al., 1996); C. linoides x C. excellens (R.E.Fr.) Wijsman (Fregonezi et al.,

2007) e C. sellowiana x C. serrulata (J.N. Fregonezi, comunicação pessoal). Mais

recentemente, foi desenvolvido a primeiro híbrido entre os dois gêneros (Calibrachoa x

Petunia), denominado Petchoa Boker & Shaw que é estéril

(Shaw, 2007).

Figura 1

–

Foto ilustrando

o fruto e sementes de

Calibrachoa heterophylla.

G. Mäder

1.4. Calibrachoa heterophylla (Sendtn.) Wijsman

A espécie alvo deste trabalho foi descrita por Sendtner (1846) como Petunia

heterophylla que, posteriormente, foi recombinada para o gênero Calibrachoa por

Wijsman (1990). Sua distribuição tem sido descrita para toda a Planície Costeira do RS,

em áreas de Formações Pioneiras com influência marinha, lacunar ou lacustre. Seu registro

mais setentrional foi feito em Imbituba (SC), enquanto o limite meridional é o norte do

litoral uruguaio, embora não tenham sido observadas, recentemente, plantas desta espécie

nos extremos de sua distribuição (P. Speranza, comunicação pessoal para ocorrência no

litoral uruguaio). Esta espécie habita dunas e campos arenosos, além de ambientes

alterados, como beiras de estradas e lavouras abandonadas. As plantas se caracterizam

como subarbustos, com base lenhosa, e muitos ramos inicialmente eretos, logo

decumbentes; suas folhas são pequenas e há presença de braquiblastos axilares (Figura 2).

As folhas são sésseis, com lâmina geralmente linear, densamente pubérulo-glandulosas em

ambas as faces. Nos ramos mais velhos, as folhas caem e apenas o conjunto de pequenas

folhas dos braquiblastos persiste (Figura 3A). A presença destes dois tipos de folhas deu

origem ao epíteto específico. A perda das folhas maiores e a persistência nos braquiblastos

podem ser interpretadas como uma estratégia da planta para a economia de água, já que

essa espécie sofre grande estresse hídrico por habitar solos arenosos (Stehmann, 1999). As

flores são de cor magenta ou purpúrea, com fauce amarelada, circundada por um anel

purpúreo-escuro (Figura 3B). A morfologia floral está associada à melitofilia e os

polinizadores mais freqüentes são abelhas solitárias. É uma espécie caracteristicamente

psamófila, facilmente reconhecida pela coloração esbranquiçada ou acinzentada, conferida

pelos grãos de areia aderidos ao seu indumento, nos seus ramos jovens, folhas e cálice

(Stehmann, 1999) (Figura 3B). De acordo com observações em campo, essa espécie possui

uma considerável plasticidade fenotípica representada por diferentes padrões quanto ao

hábito, forma e tamanho das folhas ao longo da sua distribuição geográfica.

Figura 2 – Indivíduo de Calibrachoa heterophylla fotografado no Horto Florestal da Aracruz, Barra

do Ribeiro/RS: hábito subarbustivo.

J.N. Fregonezi

1.5. A Planície Costeira do Rio Grande do Sul

O termo Província Costeira é amplamente utilizado para designar um grupo de

elementos geológicos característico da margem continental brasileira na atualidade.

Durante o Cenozóico, a erosão dos terrenos elevados situados a oeste gerou fácies

sedimentares que se acumularam ao longo da Província Costeira do RS. Em conseqüência

desse processo, a Província Costeira do RS pode ser dividida em dois compartimentos

geomorfológicos: o das “terras altas” e o das “terras baixas” (Villwock & Tomazelli,

1995). O Compartimento das “terras altas” agrupa o Planalto Sul-rio-grandense, a

Depressão Central e o Planalto das Araucárias; enquanto que o das “terras baixas” é

formado pela Planície Costeira e pela plataforma continental adjacente (Weschenfelder,

2005).

A Planície Costeira do Rio Grande do Sul constitui a mais ampla planície litorânea

do Brasil, cobrindo cerca de 33.000 km² (Tomazelli & Villwock, 2000). A atual praia

oceânica da Planície Costeira é extensa e contínua lateralmente, localizada em uma região

costeira aberta, dominada pela ação das ondas. As feições morfológicas da praia se

Figura 3 –

Calibrachoa

heterophylla.

A) Ramos com

predominância

de folhas dos

braquiblastos.

B) Flor em

detalhe e areia

aderida ao

indumento.

G. Mäder

J.R. Stehmann

caracterizam pela relativa homogeneidade e continuidade lateral, em contraste com a

marcante modificação antrópica, causada ao campo de dunas frontais, e à planície arenosa

adjacente (Weschenfelder, 2005).

A Laguna dos Patos é um dos componentes mais marcantes na fisiografia do

Estado. A Laguna é a bacia de captação da rede de drenagem da Bacia Fluvial do Sudeste

do RS e do Nordeste da República do Uruguai. A extensão total de sua superfície de

captação alcança 180.000 km² e as águas captadas desembocam diretamente no Oceano

Atlântico, através do Canal de Rio Grande, localizado no extremo sul da laguna

(Weschenfelder et al., 2005). Toda essa região pode ser vista como uma área altamente

dinâmica do ponto de vista geográfico.

Os eventos de transgressão-regressão do nível do mar que originaram a Planície

Costeira do Rio Grande do Sul, entre o Pleistoceno e o Holoceno, geraram quatro extensos

sistemas deposicionais do tipo laguna-barreira, paralelos à linha de costa (três

pleistocênicos e um holocênico). Cada um desses sistemas é caracterizado por uma barreira

arenosa e, atrás destes em direção ao continente, existem extensos depósitos lagunares

costeiros (Lima & Buchmann, 2005; Tomazelli & Villwock, 2005). A formação destes

sistemas foi relacionada com a alternância cíclica de períodos frios e quentes ocorridos

durante o Pleistoceno e Holoceno, os estágios glaciais e interglaciais. Durante estes

períodos havia a fusão (estágios interglaciais) ou crescimento (estágios glaciais) das

regiões polares e, conseqüentemente, subida (transgressão) ou descida (regressão) do nível

do mar (Villwock & Tomazelli 1995). Há cerca de 500 mil anos Antes do Presente (ka

A.P.), o nível do mar na região do RS estava 70 m abaixo do nível atual e a linha da costa

recuada mais de 100 km. Há 400 ka A.P. ocorreu uma grande transgressão marinha e, no

RS, o mar invadiu toda região de Porto Alegre, ficando somente os morros emersos.

Assim, formou-se a primeira barreira da Planície Costeira. O mar regrediu e, cerca de 75

ka depois, houve outra transgressão, dessa vez a área ocupada pelo mar foi

consideravelmente menor que a anterior, formando a segunda barreira da Planície Costeira.

Novamente o mar recuou e, há 120 ka A.P., ocorreu uma nova transgressão que resultou na

formação da terceira barreira da Planície Costeira e das restingas que delimitaram a

Laguna dos Patos.

A formação de uma barreira arenosa holocênica (quarta barreira),

surgida há aproximadamente 5 ka A.P. e integrante de um sistema complexo de múltiplas

barreiras que reúne ainda a Laguna dos Patos e a Lagoa Mirim, foi o episódio final

conseqüente das variações do nível do mar que afetaram este setor costeiro (Figura 4).

Após esse último evento, formou-se uma restinga arenosa entre o planalto e o mar que

promoveu a ligação da Planície Costeira do RS com litoral do norte do País, permitindo a

migração da flora e fauna atuais e interrompeu o curso dos rios. A partir de então, toda a

drenagem continental que anteriormente atingia a quebra da plataforma continental ficou

retida no interior deste sistema lagunar (Weschenfelder et al., 2005). As desembocaduras

dos estuários e os canais fluviais foram soterrados pelas areias transgressivas. Desta forma,

o registro dos canais soterrados representa evidências da drenagem pleistocênica sobre a

antiga PC na atual plataforma continental (Abreu & Calliari, 2005). Paleocanais detectados

na linha de costa atual podem representar o antigo curso de alguns dos principais rios do

Estado como o Jacuí, o Camaquã e o Jaguarão, que fragmentavam a costa, desaguando

diretamente no Oceano Atlântico, como sugerem Corrêa (1996) e Weschenfelder (2005)

(Figura 5).

Na Tabela 1 são apresentados, resumidamente, acontecimentos da Era Cenozóica,

relevantes para o entendimento deste trabalho.

Figura 4 - Cenário paleogeográfico da Planície Costeira do RS (modificado de Tomazelli et al., 2000).

Figura 5 - Rede de paleocanais mapeados através de dados sísmicos segundo Weschenfelder (2005).

Tabela 1 - Escala geológica da Era Cenozóica e resumo dos acontecimentos recentes na Planície Costeira.

Era Período Época ka A.P Acontecimentos

Holoceno Atual a 11,5 Formação 4ª barreira da PC -5 ka

Superior 11,5 a 126 Formação 3ª barreira da PC -120 ka

Médio 126 a 781

Formação 2ª barreira da PC -325 ka

Formação 1ª barreira da PC - 400 ka

Ultima glaciação- 500 ka

Pleistoceno

Inferior 781 a 1806

Plioceno 1806 a 5332

Neogeno

Mioceno 5332 a 23300

Oligoceno 23300 a 33900

Eoceno 33900 a 55800

Surgimento de grande parte das

angiospermas atuais (Romero, 1993).

Cenozóico

Paleogeno

Paleoceno 55800 a 65500

ka= Mil anos A.P.: Antes do Presente PC: Planície Costeira

Essas oscilações paleoclimáticas periódicas alteraram fortemente a disponibilidade

de habitats e produziram grande impacto na distribuição e história evolutiva de muitos

grupos biológicos (Knowles, 2001). A Planície Costeira do RS possui exuberante

vegetação hidrófila e halófita em ambientes de muita instabilidade, que tornam as

comunidades vegetais altamente mutáveis (Werneck & Lorsheister, 2001). O revestimento

vegetacional dessa região, muitas vezes referido como vegetação pioneira, é composto, na

realidade, de um imenso mosaico de comunidades florísticas e estruturalmente distintas,

que depende mais do solo que do clima (Dorneles & Waechter, 2004). Cordazzo &

Seeliger (1988) consideram que o extremo sul do Brasil e o Uruguai representam o centro

de uma zona biogeográfica subtropical, transição entre as regiões temperada e tropical. As

espécies vegetais formadoras destas comunidades apresentam características que as

habilitam a colonizar solos pobres, arenosos, encharcados ou com certa salinidade, em

ambientes com ventos constantes (Porto & Dillenburg, 1986). O solo contém quantidades

de sal prejudicial à maior parte dos vegetais, portanto desenvolvem-se nele somente

espécies capazes de suportar essa adversidade (Rambo, 1954). Na zona das dunas móveis

prevalecem as gramíneas, nos intervalos mais calmos e úmidos surgem espécies rasteiras

de verbenáceas, leguminosas e compostas. Os arbustos por sua vez, só aparecem na zona

das dunas fixas (Rambo, 1954).

Hasenack & Ferraro (1989) definiram o clima da região como sendo do tipo

subtropical úmido, sem estação seca e com verão quente. Segundo os mesmos autores, a

temperatura média anual é em torno de 20º C, com amplitude térmica anual de ± 9,4° C; a

umidade relativa do ar varia de 80 a 86%, sendo mais elevada no inverno; a taxa de

precipitação pluviométrica é elevada e com grande regularidade ao longo do ano,

excedendo a taxa anual de evaporação, não caracterizando período de seca.

A paisagem da Planície Costeira tem sofrido modificações constantes devido à

urbanização, criação de gado, plantio e procedimentos da drenagem associados ao cultivo

de arroz (Freitas, 1995). O aumento progressivo da utilização da terra para atividades

agrárias afeta drasticamente o ambiente e coloca em risco diversas espécies animais e

vegetais como é o caso do roedor Ctenomys minutus, cuja distribuição está sendo

fragmentada e restringida a áreas cada vez menores (Marinho & Freitas, 2006). A maior

parte da urbanização nas praias do RS está localizada no Litoral Norte. Como existe uma

tendência de que essa urbanização aumente ainda mais, migrando no futuro próximo para

áreas pouco desenvolvidas, é importante caracterizar zonas prioritárias para preservação

nessa região.

Dentre as áreas de preservação criadas ou já implantadas sobre a Planície

Costeira destacam-se: o Parque Nacional da Lagoa do Peixe, que possui uma área de 344

, abrangendo porções litorâneas dos municípios de Mostardas e Tavares (RS)

(Dorneles & Waechter, 2004); a Estação Ecológica do Taim, administrada pelo IBAMA,

possui uma área de 1.113,17 km

, situa-se na estreita faixa de terra entre o oceano

Atlântico e a Lagoa Mirim (IBAMA, 2004); o Parque Estadual de Itapeva, localizado em

Torres (RS), possui 10 km

; e o Parque Estadual de Itapuã com área de 55,66 km

localizado em Viamão (RS) (SEMA, 2002).

1.6. Especiação e fluxo gênico

A definição de um conceito de espécie para plantas tem sido um grande desafio

para os botânicos. Essa dificuldade se deve a características como a hibridação

interespecífica e o fato da variação fenotípica que, em alguns grupos, não varia

prontamente em categorias discretas (Rieseberg & Willis, 2007).

As barreiras reprodutivas que isolam as espécies de plantas podem ser: (1) pré-

polinização, que limita a transferência de pólen de uma espécie para estigmas de outras

espécies através de isolamento ecogeográfico, mecânico ou temporal; (2) pós-polinização e

pré-zigóticas, onde ocorre a vantagem no desenvolvimento do pólen específico ou falha na

germinação do pólen não específico; (3) pós-zigóticas, através da inviabilidade,

esterilidade ou redução do sucesso reprodutivo do híbrido nas gerações subseqüentes

(Rieseberg & Willis, 2007). Na maioria dos casos, essas barreiras atuam juntas gerando

efeito acumulativo que aumenta o isolamento das espécies. O isolamento ecogeográfico é

tido como a mais importante barreira reprodutiva entre espécies vegetais. Esta hipótese tem

sido confirmada por estudos que mostram que espécies próximas ou subespécies possuem

diferentes preferências de habitat (Rieseberg & Willis, 2007). Quando há contato

secundário entre espécies isoladas somente por barreiras ecogeográficas, a formação do

híbrido é provável e, como conseqüência disso, a utilização do conceito biológico de

espécie torna-se inadequada. No conceito filogenético, quando comparados com outros

grupos, os indivíduos de uma mesma espécie são mais relacionados entre si e suas

moléculas de DNA mostram um ancestral comum mais recente (Avise, 2000). Filogenias

construídas com a utilização de seqüências de DNA podem melhor esclarecer os processos

envolvidos na evolução e a utilização de várias seqüências do genoma descreve de forma

mais adequada estes processos (Templeton et al., 2000).

A especiação pode acontecer por alopatria, quando uma barreira física ou a própria

distância reduzem o fluxo gênico entre as populações. Esta barreira pode aparecer por

mudanças geológicas e geomorfológicas (rios, cadeias de montanhas, deriva continental,

formação de desertos, etc.) ou por eventos de dispersão (deslocamento de populações para

locais distantes, dispersão provocada pelo vento, correntes marinhas, etc.) As populações

isoladas se diferenciam através de mutações e alteram suas freqüências alélicas por deriva

ou seleção natural, até que ocorra isolamento reprodutivo. Se os alelos favorecidos pela

seleção são diferentes em duas populações adjacentes, estabelece-se uma clina de

freqüências alélicas. Se existe uma seleção suficientemente forte sobre loci relacionados ao

isolamento reprodutivo, as populações podem se diferenciar em espécies isoladas

reprodutivamente.

Especiação por vicariância ocorre quando duas populações são separadas pelo

surgimento de uma barreira extrínseca, enquanto a especiação peripátrica ocorre quando há

formação de uma subpopulação periférica por dispersão a partir da população original e,

após várias gerações, ocorre o isolamento reprodutivo. Essa segunda possibilidade é

comum em eventos de colonização de ilhas a partir do continente. Em locais onde

populações distintas geneticamente se intercruzam são formadas zonas híbridas. Estudos

com marcadores genéticos podem esclarecer estes processos: (1) zonas híbridas compostas

por indivíduos geneticamente divergentes (similares aos parentais) são interpretadas como

locais de contato secundário entre as populações que se diferenciaram em alopatria; (2)

zonas híbridas formadas por indivíduos geneticamente intermediários entre os parentais

(variação clinal) são consideradas áreas de diferenciação in situ, ou seja, originadas pela

divergência primária de populações parapátricas (Avise, 2000).

Na especiação simpátrica, uma barreira biológica que impede o cruzamento se

origina dentro dos limites de uma população, sem o isolamento espacial das espécies

incipientes (Futuyma, 2002). Para isso, são propostos os modelos graduais e instantâneos,

sendo os modelos instantâneos mais aceitos: hibridação seguida de poliploidia

(alopoliploidia); modificação do sistema reprodutivo de auto-incompatível para

autocompatível; modificações cromossômicas estruturais, que levam à interesterilidade; e

mutações em genes de grande efeito nas estruturas reprodutivas (Judd et al., 1999).

Eventos de especiação simpátrica são comumente vistos em plantas, especialmente devido

a eventos de poliploidização, amplamente tolerados neste grupo.

O padrão da variação genética pode refletir o modo de especiação e o tempo de

divergência de prováveis espécies irmãs. Estes dados devem ser correlacionados com

fatores históricos e contemporâneos, como a distribuição geográfica, ecologia reprodutiva

e o modo de dispersão. O modo de dispersão tem influência direta na diversificação de

uma espécie, pois é o principal mecanismo responsável pelo fluxo gênico dentro e entre as

populações, além de determinar a sua distribuição. Quanto maior a área de distribuição de

uma espécie, mais elevada tende a ser a heterogeneidade genética entre suas populações,

isso por causa das diferentes pressões seletivas que essas populações sofrem ou por causa

dos níveis limitados de fluxo gênico entre elas (Takayama et al., 2006). Se a

heterogeneidade genética entre populações se torna grande o bastante, estas populações

podem eventualmente especiar. Por outro lado, o fluxo gênico é um dos processos mais

importantes na manutenção da unidade de uma espécie (Barton & Hewitt, 1989).

Geralmente, os efeitos do fluxo gênico são tão grandes que um imigrante por geração é

suficiente para impedir uma forte diferenciação entre populações (Ellstrand & Elam 1993).

1.7. Filogeografia e conservação

A filogeografia é o campo de estudo relativo aos princípios e processos que

governam a distribuição geográfica das linhagens genealógicas, especialmente aquelas

dentro e entre espécies fortemente relacionadas. O tempo e o espaço estão ligados e são

considerados os eixos da filogeografia (Avise, 2000).

A disponibilidade de utilização e

avanço das técnicas moleculares, além do enriquecimento das análises filogenéticas intra-

específicas, tem possibilitado de maneira eficaz a interpretação de possíveis cenários

evolutivos, como o tempo e o padrão de divergência entre as populações de uma mesma

espécie ou de espécies relacionadas. Espécies de origem muito recente ou que apresentam

dispersão e fluxo gênico a longas distâncias podem não apresentar diferenciação

geográfica, não havendo coerência entre o relacionamento genético e a distribuição das

populações analisadas. Já espécies que apresentam linhagens genéticas distintas e formam

grupos monofiléticos, na maioria das vezes, estiveram isoladas geograficamente e

consequentemente tiveram seu fluxo gênico interrompido por certo período (Avise, 2000).

Dependendo da capacidade de dispersão do grupo que está sendo estudado, essas barreiras

podem ser rios, desertos, montanhas, entre outras.

A perda e a fragmentação do habitat favorecem o isolamento e a redução das

populações a níveis que favorecem o endocruzamento, à perda de variabilidade genética e

do potencial evolutivo (Frankham et al. 1999). Em casos extremos, o aumento de

homozigotos na população pode levar à expressão de alelos deletérios e, o efeito dessas

mudanças, pode resultar na extinção local da espécie (Leijs et al. 1999).

Diversos métodos de estimativa da biodiversidade têm sido propostos para a

identificação de áreas prioritárias para a conservação. Recentemente, o conhecimento da

biologia evolutiva dos organismos passou a ser valorizado neste contexto. Dessa forma,

muitos planos de conservação têm como objetivo a manutenção da variabilidade genética,

tendo em vista os processos evolutivos (Mace & Purvis, 2008). A filogeografia é uma das

ferramentas que pode ser utilizada com muito sucesso neste tipo de avaliação. Os dados

filogeográficos permitem estabelecer uma estratégia que prioriza a conservação de grupos,

que incluam representantes da maior parte da história evolutiva das espécies, identificando

populações com maior variabilidade genética (Vázquez & Gittleman, 1998). Regiões ricas

em endemismos devem ser bastante valorizadas devido à grande vulnerabilidade destas

espécies que, além de apresentarem uma distribuição geográfica restrita, muitas vezes

necessitam nichos ecológicos específicos (Primack & Rodrigues, 2001).

A maioria dos organismos possui uma distribuição disjunta, característica da

espécie ou determinada pela descontinuidade do habitat. A freqüência de alelos pode

apresentar uma estrutura espacial diferente, em função dos efeitos do fluxo gênico, das

diferentes pressões seletivas entre populações isoladas, da deriva genética e do sistema de

cruzamento (Wright, 1943). Em espécies com distribuição espacial contínua, o

endocruzamento é restrito a pequenas distâncias, limitado pelo alcance da dispersão. Isto é

especialmente relevante em plantas, onde as sementes representam a principal forma de

dispersão, a qual, na maioria dos casos, é limitada a distâncias curtas (Cain et al., 2000). A

ausência de fluxo gênico permite que essas populações possam se diferenciar com o passar

do tempo (Wright, 1943).

Hoje em dia, grande parte das paisagens originais foi reduzida a fragmentos de

habitats remanescentes, cercados por áreas desfavoráveis. Neste processo, grandes

populações foram reduzidas ou subdivididas, possivelmente levando ao isolamento. A

fragmentação do habitat pode levar à redução da variabilidade genética. Na Planície

Costeira do RS, áreas que conservam a fisionomia natural estão cada vez mais raras e

fragmentadas, devido à urbanização e atividades agronômicas, fazendo com que muitas

espécies vegetais e animais estejam cada vez mais ameaçadas.

Cientistas reconhecem que estudos evolutivos são componentes chave para o

manejo e conservação ambiental, entretanto, esse pensamento raramente tem sido colocado

em prática. Muitos planos de manejo e conservação do meio ambiente têm sido feitos sem

informações imprescindíveis devido à falta de comunicação entre evolucionistas e os

responsáveis pela determinação das áreas que serão preservadas, ou ainda pela urgência

com que essas decisões têm que ser tomadas. Para reduzir os obstáculos e integrar os

conhecimentos dos processos evolutivos nos planos de conservação e manejo, é preciso

estabelecer um vínculo direto entre cientistas e formadores de opinião, além disso, os

responsáveis pelas decisões devem atuar junto com esses cientistas do início ao fim do

trabalho (Mace & Purvis, 2008).

1.8. Marcadores moleculares

A utilização de marcadores moleculares tem demonstrado ser grande aliada nos

estudos que envolvem questões taxonômicas e evolutivas. Os métodos de análise

taxonômica mais utilizados atualmente são os morfológicos e moleculares, ambos

apresentando vantagens e desvantagens próprias. Os dados moleculares são criticados,

porque é possível que representem somente a evolução do marcador e, não

necessariamente, das espécies (Pedersen & Seberg, 1998). Entretanto uma grande

vantagem dos marcadores moleculares é que a análise do DNA pode acessar indiretamente

informações sobre a morfologia, além de que, em alguns casos, pode apresentar muito mais

caracteres informativos que a análise da morfologia. Abordagens genéticas e morfológicas

se complementam e reforçam a avaliação taxonômica, pois, dessa forma, geram-se mais

caracteres para a análise, além destes não estarem diretamente relacionados.

O seqüenciamento de DNA tem sido uma das técnicas mais utilizadas em estudos

filogeográficos, pois permite a avaliação de diversos níveis taxonômicos em muitas escalas

geográficas (Avise, 2000).

A amplificação de seqüências do DNA mitocondrial (mtDNA) pode ser muito útil

para elucidar questões filogeográficas entre espécies animais (Zink et al., 2006), entretanto

essas seqüências são muito pouco informativas quando o grupo de estudo em questão é

uma espécie vegetal (Duminil & Petit, 2002; Dombrovska & Qiu, 2004). Outro marcador

molecular bastante utilizado em estudos populacionais, inclusive de plantas, são os

espaçadores internos transcritos (ITS1 e ITS2) do DNA ribossomal nuclear (nrDNA), mas

que no gênero Calibrachoa não possui variabilidade intra-específica suficientemente

informativa (J.N. Fregonezi, comunicação pessoal).

Seqüências do DNA plastidial (cpDNA) são atualmente as mais utilizadas em

trabalhos que inferem padrões evolutivos de plantas, podendo ser comparadas apenas ao

seqüenciamento da região ITS (Shaw et al., 2005). Enquanto genes do cpDNA como rbcL,

ndhF, atpB e matK passaram a ser cada vez mais utilizados na filogenia de plantas,

paralelamente, regiões não-codificadoras começaram a ser muito utilizadas em estudos de

níveis taxonômicos mais baixos como infra-genéricos e intra-específicos (Hwang et al.,

2003; Shaw et al., 2005). O seqüenciamento de regiões do cpDNA

é muito eficiente para

interpretar a dinâmica espaço/tempo dos organismos estudados, devido à taxa de evolução

apropriada das seqüências (Palmer et al., 1988). Entre as regiões do cpDNA que estão

sendo utilizadas em estudos filogeográficos de plantas, podem-se destacar os espaçadores

intergênicos plastidiais psbB-psbH, trnH-psbA e trnS-trnG. Essas regiões apresentam um

grande potencial de variação para estudos populacionais e evolutivos (Okaura & Harada,

2002; Pelser et al., 2003; Dobes et al., 2004), para investigações sobre a origem de

espécies híbridas (Iwata et al., 2000) e para identificar eventos de hibridação recente

(Olsen, 2002; Olsen & Schaal, 1999; Bleeker, 2003).

Um dos primeiros estudos com o espaçador intergênico trnH-psbA foi realizado por

Aldrich et al. (1988) que mostrou que essa região é rica em eventos de inserção/deleção

(indels) e que sua variabilidade está intimamente relacionada com a classificação

taxonômica das espécies. Sang et al. (1997) mostraram que essa região é altamente

eficiente para inferir a taxonomia de espécies, possuindo maior variabilidade genética

quando comparada com o gene matK e o espaçador trnL-trnF, dois dos marcadores

plastidiais mais utilizados até então. A utilidade do trnH-psbA foi também demonstrada

por Hamilton (1999) que utilizou essas seqüências para um estudo intra-específico com

espécies do gênero Corythophora (Lecythidaceae). Mais recentemente, estudos têm

mostrado que apesar do espaçador trnH-psbA possuir um grande percentual de sítios

variáveis (Azuma et al., 2001; Hamilton et al., 2003), ele é usualmente analisado junto

com outras regiões por ser comparativamente mais curto, podendo não gerar caracteres

informativos em número suficiente para a construção de filogenias bem resolvidas.

Hamilton (1999) desenvolveu primers para a amplificação do espaçador entre os

genes trnS e trnG (trnS-trnG) com a finalidade de estudar a dinâmica populacional entre

três espécies tropicais do gênero Corythophora (Lecythidaceae). Estudos subseqüentes têm

demonstrado que essa região também é altamente variável em outras famílias. Olson

(2002) publicou que as seqüências do espaçador trnS-trnG são tão polimórficas que tornam

o alinhamento bastante difícil na comparação de gêneros das famílias Caricaceae e

Moringaceae. Xu et al. (2000) mostraram que esse espaçador é o mais informativo de nove

regiões não-codificadoras do cpDNA na análise de dois subgêneros de Glycine altamente

relacionados. Trabalhos realizados recentemente demonstraram que o espaçador trnS-trnG

possui mais sítios informativos que as seqüências dos marcadores rpL16, íntron do trnL,

trnL-trnF, trnT-trnL e atpB-rbcL na tribo Sinningieae (Gesneriaceae) (Perret et al., 2003);

psbB-psbH, atpB-rbcL, trnL-trnF, e rpS12-rpL20 em Corythophora (Lecythidaceae)

(Hamilton et al., 2003); trnH-psbA, atpB-rbcL e matK em famílias de Myrtales

(Schönenberger & Conti, 2003)

O espaçador intergênico psbB-psbH, cujos primers para amplificação e

seqüenciamento foram desenvolvidos por Hamilton (1999), possui em média 527 pares de

bases (pb), variando entre 250 e 604 pb, e contém aproximadamente 230 pb na porção

codificadora, região relativamente invariável entre diferentes linhagens. Xu et al. (2000)

afirmaram que esse marcador, quando comparado com os espaçadores trnH-psbA e trnS-

trnG, é menos informativo.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Caracterizar, através de marcadores moleculares, a variabilidade genética da

espécie Calibrachoa heterophylla ao longo de toda sua distribuição, fornecendo dados

sobre sua evolução, taxonomia e filogeografia.

2.2. Objetivos específicos:

a) Avaliar a variabilidade de seqüências espaçadoras plastidiais intergênicas trnH-

psbA, trnS-trnG e psbB-psbH de C. heterophylla.

b) Analisar a dinâmica populacional ao longo de toda a distribuição da espécie.

c) Correlacionar padrões de estruturação genética das espécies com a geografia da

área de estudo;

d) Demonstrar através de dados genéticos a importância da conservação de

ambientes naturais na Planície Costeira.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Coletas

O material analisado foi obtido através de coletas em campo. Foram analisados

indivíduos de C. heterophylla coletados em diferentes populações ao longo de toda a

Planície Costeira do RS (Tabela 2). Excetuando-se o litoral catarinense e uruguaio, toda a

distribuição conhecida de C. heterophylla foi percorrida. Nessa região, 12 populações

foram encontradas, sendo que três delas não possuíam nem ao menos cinco indivíduos.

Curiosamente, foi encontrada uma pequena população no município de São Francisco de

Assis, à margem de um arroio no interior do Estado (Pop3). Com isso, pela primeira vez,

C. heterophylla foi comprovadamente relatada fora da Planície Costeira. É importante

destacar que os rios dessa região possuem margens bastante arenosas, ambiente muito

semelhante aos terrenos arenosos da Planície Costeira.

As coordenadas geográficas dos locais de coleta foram obtidas através do sistema

de posicionamento global (GPS). Para as análises genéticas foram coletadas folhas jovens

de forma a não danificar os indivíduos amostrados. Estas folhas foram acondicionadas em

sílica gel para secagem e posterior extração de DNA. As exsicatas confeccionadas foram

depositadas no Herbário BHCB, do Departamento de Botânica, Instituto de Ciências

Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, e determinadas pelo taxonomista Dr.

João Renato Stehmann, especialista no grupo.

Tabela 2 - Informações de coleta.

População

Nº de

Indivíduos

Origem Latitude Longitude

Pop1 01 Arambaré/RS 30° 55' 09''S 51° 29' 46''W

Pop2 23 Estrada Interpraias,Torres/RS 29° 25' 56''S 49° 47' 53''W

Pop3 04 São Francisco de Assis/RS 29° 34' 59''S 55° 06' 03''W

Pop4 03

Entre Bacopari e Solidão,

Mostardas/RS

30° 56' 15''S 50° 44' 21''W

Pop5 13

Balneário Mostardense,

Mostardas/RS

31° 06' 33''S 50° 54' 04''W

Pop6 26

Proximidades da Lagoa das Flores,

Rio Grande/RS

32° 31' 26''S 52° 32' 48''W

Pop7 24

Margem da Lagoa dos Barros,

Santo Antônio da Patrulha/RS

29° 53' 34''S 50° 25' 46''W

Pop8 33

Próximo a Bojuru, São José do

Norte/RS

31° 40' 00''S 51° 25' 33''W

Pop9 16

Próximo a Bojuru, São José do

Norte/RS

31° 40' 04''S 51° 25' 27''W

Pop10 02

Entre Praia do Mar Grosso e a sede

de São José do Norte/RS

32° 02' 47''S 52° 00' 36''W

Pop11 19

Beira da Lagoa Mangueira,

próximo a Curral Alto, Santa

Vitória do Palmar/RS

32° 59' 15''S 52° 43' 56''W

Pop12 26

Ilha do Barba Negra, Barra do

Ribeiro/RS

30° 28' 31''S 51° 08' 46''W

Pop13 30

Horto Florestal da Aracruz, Barra

do Ribeiro/RS

30° 25' 13''S 51° 13' 30''W

Total: 13 Populações

220 Indivíduos analisados

3.2. Extração do DNA

As folhas do material coletado, após secas em sílica gel, foram pulverizadas com

nitrogênio líquido em gral e o DNA extraído pela técnica de Roy et al. (1992) modificada,

como será descrito a seguir:

→ 20 mg de material pulverizado;

→ Adição de 600 µl de tampão de extração (100 mM TRIS-HCl; 1,4 M NaCl; 20 mM

EDTA; 2% CTAB; 0,2% β-mercaptoetanol; 2% PVP 40), 60 µl de β-mercaptoetanol e 6 µl

de Proteinase K (10mg/ml);

→ Incubação a 65°C por 30 minutos;

→ Emulsão com 600 µl de fenol-clorofórmio (1:1);

→ Centrifugação por 15 minutos a 14000 rpm;

→ Recolhimento da fase aquosa e estimativa do seu volume;

→ Precipitação do DNA com um volume de isopropanol e 1/10 do volume de acetato de

sódio;

→ Armazenamento por 24 horas em freezer-18°C;

→ Centrifugação por 20 minutos e descarte do sobrenadante;

→ Lavagem do “pellet” com 200 µl de etanol 70% e secagem a temperatura ambiente por

20 minutos;

→ Eluição do “pellet” em 200 µl de água ultra-pura, estéril, e 2 µl de RNAse (10 mg/ml).

Os produtos de extração foram testados através de eletroforese horizontal em gel de

agarose 1%, corado GelRed

e visualizado em transiluminador de luz ultravioleta. Para a

quantificação, os produtos foram comparados com um DNA padrão (λ DNA, Invitrogen).

3.3. Amplificação e seqüenciamento

Os marcadores moleculares utilizados foram os espaçadores intergênicos trnH-psbA

e trnS-trnG. As condições de amplificação, bem como as seqüências dos primers e a

literatura consultada estão nas Tabelas 3 e 4. As seqüências do espaçador plastidial psbB-

psbH também foram obtidas, porém a análise desse marcador foi descontinuada logo após

os primeiros seqüenciamentos (representando 11 das 13 populações estudadas), quando foi

possível perceber que ele não apresenta nenhum sítio variável entre as amostras das

diferentes populações. Após a amplificação, os produtos de PCR foram purificados com

polietilenoglicol (PEG) segundo o protocolo de Dunn & Blattner (1986).

Tabela3 - Protocolo para amplificação e seqüências dos primers do espaçador trnH-psbA.

Reação

Tampão 1X

dNTP 0,2 mM

MgCl

2 mM

Primer psbA F 0,2 µM

Primer trnH R 0,2 µM

Taq polimerase 1 U

DNA 50 ng

Condições de amplificação

94°C por 5 min

94°C por 45 s

30 ciclos

58°C por 1 min

72°C por 45 s

72°C por 5 min

Seqüências dos primers (Sang et al. ,1997)

Primer psbA F

5’

GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C

3’

Primer trnH R

5’

CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAA TC

3’

Tabela 4 - Protocolo para amplificação e seqüências dos primers do espaçador trnS-trnG.

Reação

Tampão 1X

dNTP 0,2 mM

MgCl

2 mM

Primer trnS 0,2 µM

Primer trnG 0,2 µM

Taq polimerase 1 U

DNA 50 ng

Condições de amplificação

94°C por 5 min

94°C por 1 min

25 ciclos

54°C por 1 min

72°C por 45 seg

72°C por 5 min

Seqüências dos primers (Hamilton, 1999)

Primer trnS (GCU)

5’

GCC GCT TTA GTC CAC TCA GC

3’

Primer trnG (UCC)

5’

GAA CGA ATC ACA CTT TTA CCA C

3’

O seqüenciamento do DNA foi realizado em seqüenciador automático MegaBACE

1000 (Amersham Biosciences – GE Health Care), seguindo os protocolos que

acompanham o aparelho e o DYEnamic

ET terminator sequencing premix kit, com

marcação terminal fluorescente. As condições da reação de seqüenciamento estão descritas

na Tabela 5. Antes do seqüenciamento, cada amostra foi purificada diretamente nas placas

do seqüenciador, como segue:

 Adição de 1 µl de acetato de amônia 7,5 M pH e 30 µl de etanol absoluto (temperatura

ambiente);

 Mistura por 30 inversões;

 Centrifugação da placa por 45 min, a 1780 RCF a 20 °C;

 Descarte do sobrenadante por inversão;

 Spin a 500 RCF com a placa invertida e apoiada em papel toalha;

 Adição de 100 µl de etanol 70% (temperatura ambiente);

 Spin a 1780 RCF;

 Descarte do sobrenadante;

 Spin a 750 RCF com a placa invertida;

 Adição de 10 µl de Loading Solution e fechamento da placa com adesivo;

 Ressuspensão em vórtex por 5 min;

 Spin a 1780 RFC;

 Encaminhamento ao seqüenciador.

Tabela 5 - Condições das reações de PCR para seqüenciamento.

Componentes da reação Volume Condições de amplificação

DYEnamic

ET terminator sequencing premix 4 µl

Produto de PCR purificado 40 ng

Primer

5 µM

Água estéril Completar 10 µl

35 ciclos:

C por 20 s

C por 15 s

C por 1 min

3.4. Análise das seqüências

As seqüências obtidas foram alinhadas no programa GeneDoc (Nicholas &

Nicholas, 1997) e, quando necessário, corrigidas manualmente após verificação dos

cromatogramas, como o auxílio do programa Chromas 2.33 (www.technelysium.com.au).

Estatísticas básicas como diversidade nucleotídica (π) e haplotípica (Hd) foram

calculadas no programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005).

Os índices de neutralidade D de Tajima (Tajima, 1989) e Fs de Fu (Fu, 1996),

foram calculados pelo programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005) com a finalidade de

avaliar a dinâmica das populações. Para verificar a existência de uma possível expansão

populacional recente, foi realizada a análise da pairwise mismatch distribution (Rogers &

Harpending, 1992) com intervalo de confiança de 95% e 1000 replicações de bootstrap

(programa Arlequin 3.11).

Os haplótipos foram gerados através do programa DnaSP 4.10.9 (Rozas et al.,

2003). As relações evolutivas entre as seqüências foram inferidas pelo método de median-

joining network (ε=0; Bandelt et al., 1999) realizadas pelo programa Network 4.5

(www.fluxus-engineering.com). Ainda no programa Arlequin 3.11, foi estimada a

diferenciação genética entre as populações através da análise de variância molecular

(AMOVA; Excoffier et al., 1992) no intervalo de confiança de 95 % após 1000

permutações, onde foi calculado o índice Φ

Para identificar a ocorrência de possíveis barreiras ao fluxo gênico entre as

populações estudadas foi utilizado o programa SAMOVA 1.0 (Dupanloup et al., 2002)

onde também foram calculados os índices de fixação correspondentes.

A correlação entre as distâncias genéticas e geográficas, para testar a hipótese de

isolamento por distância, foi realizada no programa Alleles In Space (AIS) 1.0 (Miller,

2005) através da realização do Teste de Mantel (Mantel, 1967) e do teste de

Autocorrelação Espacial.

4. RESULTADOS

4.1. Caracterização das seqüências obtidas

O seqüenciamento dos marcadores plastidiais gerou um alinhamento com 1280

pares de bases (pb) para os 220 indivíduos analisados. Destes, 487 pb corresponderam à

amplificação do espaçador intergênico trnH-psbA (de 1 a 487) e 793 pb (de 488 a 1280) do

espaçador trnS-trnG.

As análises foram conduzidas com as seqüências dos dois espaçadores combinadas

e o conteúdo de GC (guaninas e citosinas) apresentado foi de 30,7 %. Foram identificados

26 polimorfismos no alinhamento concatenado (12 na porção correspondente ao trnH-psbA

e 14 no trnS-trnG), sendo uma duplicação e 25 substituições, das quais oito foram

transições e 17 transversões. A diversidade nucleotídica (π) verificada foi de 0,003724 ±

0,002022, enquanto a diversidade haplotípica (Hd) de 0,822 ± 0,00024 entre os 22

haplótipos identificados pelo programa DnaSP. Quando os marcadores foram analisados

separadamente, os valores de π e Hd foram, respectivamente, 0,00376 ± 0,00413 e 0,770 ±

0,017 para trnH-psbA e 0,00334 ± 0,00275 e 0,718 ± 0,019 para trnS-trnG.

As principais características das seqüências analisadas, incluindo os valores

calculados para cada população, estão expostas na Tabela 6. Os haplótipos, suas

respectivas freqüências e as populações nas quais foram encontrados são apresentados na

Tabela 7.

Tabela 6 - Principais características das seqüências analisadas.

População

Nº de

indivíduos

Nº de sítios

polimórficos

Nº de

haplótipos

Diversidade

nucleotídica

Diversidade

haplotípica

Pop1

- 1 - -

Pop2

1 2

0,00007

(± 0,00007)

0,08696

(± 0,00606)

Pop3

0 1 0 0

Pop4

0 1 0 0

Pop5

1 2

0,00012

(± 0,00011)

0,15385

(± 0,01590)

Pop6

2 3

0,00050

(± 0,00040)

0,57846

(± 0,00320)

Pop7

2 3

0,00029

(± 0,00023)

0,30072

(± 0,01255)

Pop8

4 4

0,00031

(± 0,00019)

0,32386

(± 0,00969)

Pop9

0 1 0 0

Pop10

0 1 0 0

Pop11

7 4

0,00071

(± 0,00030)

0,45029

(± 0,01644)

Pop12

7 2

0,00239

(± 0,00099)

0,50769

(± 0,00162)

Pop13

7 3

0,00078

(± 0,00031)

0,24598

(± 0,00956)

Total

220

26 22

0,00372

(± 0,00202)

0,82200

(± 0,01600)

Valores entre parênteses: desvio padrão

Tabela 7 - Haplótipos amostrados nas populações analisadas.

Posição Nucleotídica

trnH-psbA trnS-trnG

Haplótipos

N° observado

Populações

amostradas

H1 T

01 Pop1

H2 . . . C

. . . . . . . . .

. . . . . . . T

. . 42 Pop2; 7

H3 . . . C

. . . . . . . . .

. . G

. . . . T

. . 01 Pop2

H4 . . . . G

. . . . . . . .

. . . . . . . . . T

. . 04 Pop3

H5 . . . . . . T

. . . . . .

. . . . . . . . . T

. . 03 Pop4

H6 . . . . . . T

. . . . . C

. . . T

. . . . - T

. . 71 Pop5; 6; 8; 9; 10

H7 . . . . . . T

. . . . . C

. . . T

. . . . - T

. . 01 Pop5

H8 . . . . . . C

. . . . . C

. . . T

. . . . - T

. G

02 Pop6

H9 . . T

. . . C

. . . . . C

. . . T

. . . . - T

. . 10 Pop6

H10 . . . C

. . . . . . . . .

. . . . . T

. T

. . 03 Pop7

H11 . . . C

. . . . . . A

. .

. . . . . T

. T

. . 01 Pop7

H12 . . . . . . T

. . . A

. C

. . . T

. . . . - T

. . 01 Pop8

H13 . . . . . . T

. . . . . C

. . A

. . . . - T

. . 04 Pop8

H14 . . . . . . T

. . . . . .

. . . . . . . . - T

. . 01 Pop8

H15 . A

. . . . . G

. . G

. . . . . . T

. . T

. . 14 Pop11

H16 A

. . . . . G

. . G

. . . . . . T

. . T

. . 03 Pop11

H17 . A

. . . . . G

. . G

. . . . . . T

. . T

. . 01 Pop11

H18 . . . . . . . . . . A

. .

. . . . . . T

. . T

. . 01 Pop11

H19 . . . . . . T

. . A

. . .

. . . . . T

. . - T

. 15 Pop12

H20 . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . T

. . 37 Pop12; 13

H21 . . . . . C

. . . . . . .

. . . . . . . T

. . 01 Pop13

H22 . . . . . . T

. . A

. . .

. . . . . . . . - T

. 03 Pop13

4.2. Estrutura populacional

O relacionamento entre as seqüências foi inferido pelo método de median-joining

(ε=0, Bandelt et al., 1999) no programa Network 4.5. Para facilitar a compreensão, os

códigos H1, H2,... Hn, representados na network (rede de haplótipos) (Figura 6), são

correspondentes aos códigos da Tabela 6.

Através da confecção da network foi possível verificar uma tendência de

estruturação geográfica, separando geneticamente os indivíduos das diferentes populações.

Dentre as características da rede de haplótipos que mais chamaram a atenção, pode-se

destacar o relacionamento entre as populações localizadas entre Mostardas e São José do

Norte (Pop5; 6; 8; 9 e 10). Nessas populações foi encontrado um haplótipo central bastante

freqüente fortemente relacionado a outros menos freqüentes encontrados em algumas das

mesmas populações (H6, n=71, presente em 78,89% das amostras destas populações e, em

32,27% da amostragem total).

A população localizada no extremo sul da amostragem (Santa Vitória do Palmar,

Pop11), foi a que se mostrou mais distante geneticamente das demais. Seus quatro

haplótipos ficaram agrupados e a menor distância evolutiva entre eles e um haplótipo de

outra população é de três sítios polimórficos. Além disso, a Pop11 está separada por no

mínimo seis sítios polimórficos da população mais próxima geograficamente (Pop6,

aproximadamente 54 km) indicando uma possível barreira ao fluxo gênico entre elas.

As populações Pop12 e Pop13, de Barra do Ribeiro (Ilha do Barba Negra e Horto

Florestal da Aracruz, respectivamente) foram as únicas que apresentaram haplótipos não

relacionados diretamente no mesmo ramo da network, ou seja, ocorrência de haplótipos

intermediários amostrados em outras populações. Essa característica influenciou

diretamente a elevação dos índices de diversidade nucleotídica e haplotípica nessas

populações (Tabela 5). Um dos haplótipos da Pop12 (Ilha do Barba Negra) é exclusivo

dessa população.

A população Pop3, de São Francisco de Assis, coletada em uma região nunca antes

citada como de ocorrência para a espécie, onde apenas quatro indivíduos foram

encontrados, apresentou um único e exclusivo haplótipo (H4).

Foram também verificados na rede de haplótipos dois vetores médios, indicando a

existência de haplótipos extintos ou não amostrados.

O grau de estruturação genética das populações pôde ser verificado através da

Análise da Variância Molecular (AMOVA) e do cálculo do índice de fixação Φ

. Para

estes testes a população Pop1, por possuir apenas um indivíduo amostrado, não foi incluída

na análise. Observou-se que 65,24 % da variação encontrada entre as seqüências

correspondem à variação entre as populações, enquanto 34,76% da variação é relativa à

variação intrapopulacional. O valor de Φ

foi de 0,65238 em um intervalo de confiança de

95 % após 1000 permutações (Tabela 8).

Quando a AMOVA é calculada sem a presença das populações Pop12 e Pop13

(únicas que apresentaram haplótipos não relacionados diretamente no mesmo ramo da

network) o percentual de variação entre as populações se eleva para 88,42 % com Φ

0,88415.

Na Tabela 9 pode-se observar que entre boa parte das populações os índices de

fixação alélica das populações comparados par a par são significativamente diferentes.

O teste de Mantel teve como resultado a correlação moderada e significativa entre

as distâncias genéticas e geográficas para as populações de C. heterophylla [Coeficiente de

Correlação (r) = 0,4463; P<0,001] (Figura 7). Esse resultado também foi verificado através

do teste de Autocorrelação Espacial, onde é possível perceber um aumento contínuo da

distância genética conforme aumenta o distanciamento geográfico entre as populações.

Este padrão indica a existência de isolamento por distância (Figura 8). A distância genética

média estimada foi de 0,8289; observando-se um aumento significativo desta (P<0,05) a

partir da distância de 150 quilômetros entre as populações.

Figura 6 - Median-joining

network

(

=0)

construído a partir das seqüências dos

espaçadores plastidiais

trnH-psbA

trnS-trnG

C. heterophylla.

O tamanho dos círculos

corresponde à freqüência dos haplótipos. Os

sítios polimórficos que separam as seqüências

estão representados pelas linhas transversais. As

cores dos haplótipos na

network

correspondem à

cor da população onde foram amostrados no

mapa acima. Vm = Vetor Médio.

Tabela 8 - AMOVA entre as populações amostradas de C. heterophylla.

Fonte de

variação

Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Componentes

da variância

Percentual

de variação

Valor de P

Entre

populações

11 57,750 0,28754 65,24 <0,001

Dentro das

populações

207 31,716 0,15322 34,76 <0,001

Total

218 89,466 0,44076

: 0,65238

Tabela 9 - Resultado do teste de Φ

par a par das populações amostradas.

Pop2 Pop3 Pop4 Pop5 Pop6 Pop7 Pop8 Pop9 Pop10 Pop11 Pop12 Pop13

Pop2

Pop3

Pop4

Pop5

Pop6

Pop7

Pop8

Pop9

Pop10

Pop11

Pop12

Pop13

Sinal positivo = valor significante para P<0,05; Sinal negativo, valor não significante.

Figura 7 - Teste de Mantel. r = 0,4463 para P<0,001.

Figura 8 – Análise da Autocorrelação Espacial para C. heterophylla. Ay= média da distância

genética entre pares de indivíduos. A linha paralela ao eixo “x” (azul) indica o valor médio de Ay

para o conjunto de dados (= 0,8289). Asterisco (*) = estatisticamente significativo (P<0,05).

4.3. Detecção de barreiras biogeográficas

A fim de detectar possíveis barreiras biogeográficas que impeçam o fluxo gênico

entre as populações amostradas, foram feitas análises no programa SAMOVA 1.0. Esse

programa agrupa as populações de acordo com sua similaridade genética e localização

geográfica. As populações Pop1 e Pop3 não foram incluídas nas análises utilizando o

programa SAMOVA. A primeira por apresentar somente um indivíduo amostrado e a outra

por não estar no contexto biogeográfico da Planície Costeira e pela possível existência de

populações intermediárias, entre esta e as demais populações estudadas, que não foram

incluídas neste trabalho. Primeiramente, foi testada a hipótese da existência de uma

barreira biogeográfica, que separou a população Pop11 das demais, sugerindo uma barreira

(Barreira1) entre esses grupos (Figura 9). Como já havia sido visto anteriormente na

network, a população Pop11 está presente em um ramo separado dos demais e é

geneticamente bem distante da população mais próxima geograficamente (Pop6). A

AMOVA comparando esses dois agrupamentos resultou em F

de 0,47248. Dentre a

variação observada, 47,25% correspondem à variação entre os grupos (Pop11 e demais

populações); 42,40% entre as populações dentro dos grupos e 10,35% dentro das

populações (P<0,001; Tabela 10).

A seguir, foi testada a hipótese de duas barreiras biogeográficas. Como resultado,

se obteve a formação de três agrupamentos: a população Pop11, novamente isolada

(Barreira1, Grupo1); as populações Pop5, 6, 8, 9 e 10 formando outro grupo (Grupo2); e

um terceiro agrupamento, isolado do Grupo2 pela Barreira2 e, formado pelas populações

Pop2, 4, 7, 12 e 13 (Grupo3) (Figura 10). A variação entre os grupos foi de 73,16%; entre

as populações dentro dos grupos foi de 14,32% e dentro das populações foi de 12,52%.

Nesse caso, o índice F

calculado foi de 0,73158, para (P<0,001, Tabela 11). Análises que

consideravam a existência de três ou mais barreiras biogeográficas resultaram em valores

de F

semelhantes ao observado para duas barreiras. Esta tendência é esperada devido à

relação dependente dos valores dos índices de fixação: (1 - Φ

) = (1 - F

) (1 - F

). O

índice Φ

parece insensível ao aumento do número de barreiras, entretanto a variação

entre as populações dentro dos grupos (F

) diminui (já que o número de populações

presentes em cada grupo é reduzido) e conseqüentemente a diversidade entre os grupos

) aumenta (Dupanloup et al., 2002). Desta forma, além do alto valor de F

, a

existência de duas barreiras foi considerada a mais provável por apresentar uma maior

coerência com o contexto geológico da região e com o relacionamento entre os haplótipos

pertencentes aos diferentes grupos.

Tabela 10 - AMOVA para a hipótese de uma barreira biogeográfica.

Fonte de

variação

Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Componentes

da variância

Percentual de

variação

Valor de P

Entre grupos

2 105,930 2,02240 47,25% <0,001

Entre

populações

dentro dos

grupos

9 314,437 1,81463 42,40% <0,001

Dentro das

populações

207 90,396 0,44312 10,35% <0,001

Total

218 510,763 4,28014

: 0,47248

Figura 9 - Localização da barreira biogeográfica inferida pelo programa SAMOVA 1.0

para a hipótese de existência de apenas dois grupos.

Barreira1

Tabela 11 - AMOVA para a hipótese de duas barreiras biogeográficas.

Fonte de

variação

Graus de

liberdade

Soma dos

quadrados

Componentes

da variância

Percentual de

variação

Valor de P

Entre grupos

2 342,722

2.5883

73,16 <0,001

Entre

populações

dentro dos

grupos

8 77,645

0.50668

14,32 <0,001

Dentro das

populações

204 90,396

0.44312

12,52 <0,001

Total

214 510,763

3.53810

: 0,73158

Figura 10 - Localização das barreiras biogeográficas inferidas pelo programa SAMOVA

1.0 para a hipótese da existência de três grupos.

Barreira2

Barreira1

Grupo1

Grupo

Grup

4.4. Dinâmica populacional

Os testes de neutralidade utilizados para o conjunto completo de dados

apresentaram como resultados valores não significativos. Os valores obtidos para os

índices calculados são relacionados logo abaixo:

 D de Tajima: 0,04962; P > 0,10

 Fs de Fu: -1,450; P > 0,10

Os resultados destes testes estatísticos não apresentaram desvio significativo da

expectativa neutra das mutações indicando que essas populações se encontram em

equilíbrio quando consideradas haplótipos do cpDNA.

Esses índices de neutralidade também foram calculados para os três grupos de

populações gerados através da análise de barreiras biogeográficas inferidas pelo programa

SAMOVA, com o objetivo de verificar se o padrão observado na amostragem como um

todo se confirma nesses grupos (Tabela 11). Para o Grupo1, o teste estatístico D de Tajima

apresentou resultado negativo e significativo para P < 0,05, entretanto o índice Fs de Fu

não foi significativo. A análise do Grupo2 resultou em índices Fs de Fu e D de Tajima

negativos e significativos para P < 0,05. O Grupo3 não apresentou resultados significativos

para nenhum dos índices de neutralidade calculados (Tabela 12). A significância dos testes

de neutralidade para os grupos 1 e 2, sugere que, ao contrário do que é visto na análise

geral das populações, esses agrupamentos estão em expansão demográfica, sobretudo o

Grupo2, que além de apresentar resultados significantes para os dois testes, é composto por

cinco diferentes populações tornando o resultado mais confiável.

Tabela 12 - Índices de neutralidade calculados para os grupos de populações estudadas.

Grupos

Nº de

Indivíduos

D de Tajima Fs de Fu

Grupo1

(Pop11)

-1,81758* -0,274

Grupo2

(Pop5, 6, 8, 9 e 10)

-1,66095* -4,669*

Grupo3

(Pop2, 4, 7,12 e 13)

106

0,37464 0,676

Total

215

0,04962

-1,450

*P < 0,05

Corroborando os resultados não significativos dos testes de neutralidade para a

amostra como um todo, a análise da mismatch distribution não apresentou sinal de

expansão demográfica recente no intervalo de confiança de 95% com 1000 replicações de

bootstrap (P< 0,05) Observando o gráfico da mismatch distribution, verificamos a

presença de duas modas quanto ao número de diferenças entre os haplótipos, uma entre

zero e um e outra em sete sítios polimórficos, e não um padrão unimodal como é esperado

quando um evento de expansão ocorreu recentemente (Figura 11).

Quando a mismatch distribution é testada para os três grupos formados através do

programa SAMOVA, é possível detectar sinal de expansão demográfica para os grupos 1 e

2 (P> 0,05; ou seja, não difere dos valores simulados para a hipótese de expansão recente),

concordando com a significância evidenciada em alguns dos índices de neutralidade

(Figuras 12, 13, e 14).

1000

2000

3000

4000

5000

0 3 6 9 12

Número de diferenças

Freqüência

Observado

Esperado

Figura 11 - Mismatch distribution para o conjunto completo de dados.

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Número de diferenças

Freqüência

Observado

Esperado

Figura 12 - Mismatch distribution para as amostras do Grupo1.

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Número de diferenças

Freqüência

Observado

Esperado

Figura 13 - Mismatch distribution para as amostras do Grupo2.

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 3 6 9 12

Número de diferenças

Freqüência

Observado

Esperado

Figura 14 - Mismatch distribution para as amostras do Grupo3.

5. DISCUSSÃO

5.1. A diversidade dos marcadores utilizados

Levando-se em consideração a recente história evolutiva de toda a subfamília

Petunioideae, os índices π e Hd obtidos para C. heterophylla podem ser considerados de

médios até altos para os marcadores utilizados. Fregonezi et al. (2007) observaram valores

de π e Hd para C. excellens e C. linoides semelhantes aos verificados neste trabalho, porém

é importante ressaltar que essas espécies possuem distribuição muito mais ampla que C.

heterophylla. Ramos et al. (2007) também observaram valores de diversidade semelhantes

para P. integrifolia subsp. depauperata ( R.E.Fr. ) L.B.Sm. & Downs, espécie com

distribuição muito semelhante a C. heterophylla. P. exserta Stehmann (Lorenz-Lemke et

al., 2006) e C. elegans (Togni et al., 2007) apresentaram índices de diversidade mais

baixos em relação aos que observamos, resultado esperado pelo fato dessas espécies

possuírem caráter micro-endêmico.

Entretanto quando os valores de diversidade desses marcadores são verificados para

espécies de outras famílias como, por exemplo: Silene vulgaris (Caryophyllaceae)

(Štorchová & Olson, 2004); Eryngium alpinum (Apiaceae) (Naciri & Gaudeul, 2007) e

Asplenium hookerianum (Aspleniaceae) (Shepherd et al., 2007), valores consideravelmente

mais altos podem ser observados, característica explicada por se tratarem de grupos com

história evolutiva mais antiga que as Petunioideae.

5.2. Geologia da Planície Costeira vs filogeografia de C. heterophylla

Através dos testes que comparam o relacionamento entre os haplótipos e a

distribuição geográfica das amostras foi possível detectar que as populações de C.

heterophylla analisadas estão altamente estruturadas geneticamente. Baixos níveis de fluxo

gênico foram evidenciados pela AMOVA, ao demonstrar que a maior parte da diversidade

genética observada está presente entre as populações, resultado também observado por

Fregonezi et al. (2007) para C. excellens e C. linoides e por Ramos et al. (2007) para P.

integrifolia subsp. depauperata. O padrão de isolamento pela distância foi confirmado pelo

teste de Mantel que apresentou uma correlação significativa entre distância genética e a

distância geográfica e pelo teste de Autocorrelação Espacial o qual indicou que a partir de

150 km, a distância genética entre as populações é significativamente maior que a média

(P<0,05). Essa alta estruturação não é surpreendente quando pensamos na biologia da

espécie e no tipo de marcador molecular utilizado. Como os marcadores foram seqüências

espaçadoras de genes plastidiais e os cloroplastos são predominantemente ou

exclusivamente herdados de forma uniparental (no caso de espécies de Petunia, os

cloroplastos têm herança materna, Derepas & Dulieu, 1992), a ausência de mecanismos de

dispersão das sementes nas espécies de Calibrachoa inviabiliza o fluxo gênico plastidial

entre populações relativamente distantes.

A ocorrência de vetores médios na network indica a presença de haplótipos extintos

ou não amostrados. Caso não tenham sido amostrados, esses haplótipos provavelmente

encontram-se fora da Planície Costeira do RS, visto que essa região foi amplamente

investigada, tendo sido percorrida integralmente. Com a descoberta de que essa espécie

pode ocorrer no interior do continente é possível que os haplótipos não amostrados existam

nessa região ou, ainda, na costa catarinense e uruguaia.

Possivelmente a Planície Costeira do RS foi colonizada a partir de distintas ondas

migratórias em diferentes períodos da história, rotas e/ou, ainda, a partir de diferentes

refúgios. Essa hipótese pode muito bem explicar o padrão estruturado de pelo menos três

grupos de populações. A alta diversidade encontrada entre alguns grupos dificilmente teria

surgido, em sua totalidade, já na Planície Costeira, pois essa é uma região geologicamente

muito recente. Então, diferentes linhagens devem ter colonizado essa região através de

diferentes rotas ou em momentos diversos, e não se uniram devido às barreiras

biogeográficas que encontraram nesse ambiente.

A presença de haplótipos geneticamente distantes dentro das populações da Ilha do

Barba Negra e do Horto Florestal da Aracruz pode ser explicada por possível contato

secundário entre linhagens de diferentes origens. Um dos haplótipos encontrado Ilha do

Barba Negra apresenta polimorfismo em relação ao haplótipo mais próximo encontrado no

Horto da Aracruz. Outro haplótipo foi encontrado nessas duas populações. A partir desses

dados, é mais parcimonioso pensar que essas populações um dia estiveram em contato e

que o polimorfismo encontrado surgiu após o isolamento da ilha por deriva genética. De

acordo com a história geológica da Planície Costeira isso deve ter acontecido já no

Holoceno.

Quando se compara a localização das barreiras biogeográficas sugeridas pelo

programa SAMOVA com a geologia da Planície Costeira, percebe-se que essas barreiras

coincidem com paleocanais mapeados através de dados sísmicos por diversos autores

como Corrêa (1996) e Weschenfelder (2005) como pode ser visto na Figura 5.

A Barreira1 inferida no extremo sul do RS, entre as populações Pop6 e Pop11,

coincide com a localização sugerida para o antigo curso do Rio Jaguarão durante o

Pleistoceno (Figura 15). Após a última transgressão marinha, já no Holoceno, formou-se a

Lagoa Mirim e, a partir de então, o Rio Jaguarão passou a desaguar nesta lagoa. Entretanto

a Lagoa Mirim continuou diretamente ligada ao oceano até mais recentemente (Corrêa,

1996). Concordando com isso, Ayup-Zouain et al. (2003) observaram na região do

banhado do Taim, através de análise digital de imagens de satélite, uma feição morfológica

que seria a ligação entre a Lagoa e o mar. O banhado do Taim ainda hoje é influenciado

pela presença constante de água ao longo da história, apresentando solo alagadiço. Solos

alagados não são adequados para o desenvolvimento de C. heterophylla que,

preferencialmente, habita campos arenosos (Stehmann, 1999). Através dessas informações,

podemos supor que a barreira ao fluxo gênico entre as populações de C. heterophylla

persista desde o Pleistoceno Médio até os dias de hoje.

A localização da Barreira2 se sobrepõe à região onde foi detectada a presença de

paleocanais correspondentes, durante o Pleistoceno, ao curso do Rio Jacuí (Corrêa, 1996;

Weschenfelder, 2005) (Figura 15). Após a formação da restinga que delimitou a Laguna

dos Patos, o Rio Jacuí passou a desaguar na região hoje chamada de Delta do Jacuí

(Corrêa, 1996). Entretanto, através de análises de sedimentos e datação por radiocarbono,

ficou provado que esses paleocanais continuaram atuantes na drenagem da laguna até o

mar até o Holoceno e, portanto, isolando os locais onde atualmente foram coletadas as

populações Pop4 e Pop5 (Weschenfelder, 2005).

Siqueira et al. (2006) confirmaram a hipótese de rios como barreiras ao fluxo

gênico para os peixes Acanthurus bahianus e A. coerulus no Rio Amazonas. No Brasil,

trabalhos confirmando essa hipótese através de dados genéticos para espécies vegetais

ainda não foram publicados (Silva, 2008).

Figura 15 - Rede de paleocanais detectados na Planície Costeira e seu possível papel no fluxo gênico

entre as populações de C. heterophylla. Modificado de Weschenfelder (2005).

5.3. Expansão ou estabilidade populacional

Através do cálculo dos índices de neutralidade e da mismatch distribution não foi

possível detectar eventos recentes de expansão demográfica quando foi considerada a

distribuição total da espécie. Esse resultado pode ter sido influenciado pelo fato de que o

conjunto geral de dados possui amostras pertencentes a diferentes linhagens. A presença

dessas diferentes linhagens pode encobrir resultados significativos. A presença de duas

modas no gráfico da mismatch distribution pode indicar dois eventos de expansão: um

deles tendo dado origem às diferentes linhagens (moda em sete diferenças) e outro bem

mais recente (moda entre zero e uma diferenças).

A existência de uma expansão populacional recente pode ser evidenciada quando a

análise é feita separando as populações em grupos demográficos de acordo com as

barreiras detectadas na Planície Costeira. Um evento de expansão recente fica claro quando

verificamos os resultados dessas análises no Grupo2: índices de neutralidade negativos e

significativos (Fs de Fu e D de Tajima para P < 0, 05,), mismatch distribution com padrão

unimodal e o padrão de relacionamento “star-like” entre os haplótipos destas populações

(se considerarmos somente os haplótipos H6, H7, H8, H9, H12, H13 e H14 na network da

Figura 6). Através desses resultados, é possível sugerir que esse grupo sofreu expansão

recentemente, pois este padrão é freqüentemente observado em populações que passaram

por uma expansão demográfica recente (Hartl & Clark, 1997).

Para o Grupo1, embora tenha sido observada significância do índice de neutralidade

D de Tajima e padrão unimodal significante na mismatch distribution, não é seguro afirmar

que tenha se expandido recentemente, já que este grupo é representado por apenas uma

população com 19 indivíduos amostrados. Para o Grupo3, as análises referentes à dinâmica

populacional indicaram que ele está em equilibro, não tendo passado por eventos de

expansão recentemente.

Fregonezi et al. (2007) não identificaram eventos de expansão populacional recente

para C. excellens e C. linoides, assim como Togni et al. (2007) estudando populações de C.

elegans, espécie endêmica dos campos de altitude de Minas Gerais. Entretanto esse evento

foi identificado para P. integrifolia subsp. depauperata (Longo, 2005; Ramos et al., 2007),

espécie do gênero irmão que possui distribuição muito semelhante a C. heterophylla.

5.4. Conservação do ambiente

A Planície Costeira do RS é cada vez mais alvo da ação humana, seja pela

construção civil, atividades agrárias ou extrativismo. Essas ações tornam as espécies que

habitam a região altamente vulneráveis. Dentre eles, C. heterophylla pode ser indicada

como altamente ameaçada, pois sua distribuição é quase que exclusivamente nessa região,

além de ser muito exigente quanto a mudanças ambientais principalmente relacionadas ao

solo. Durante as coletas, muitas vezes não foi possível encontrar esta espécie em regiões

onde, por características ambientais gerais, sua ocorrência era esperada (boa parte do lado

oeste da Laguna dos Patos e a Praia de Fora no Parque Estadual de Itapuã, por exemplo).

Em outras regiões, foram encontradas apenas populações muito pequenas. O Litoral Norte

do RS é a região do Estado mais afetada pelas ações humanas, tendo sido encontrada nesse

local apenas uma população, justamente na área de proteção ambiental do Parque Estadual

de Itapeva.

Os dados filogeográficos semelhantes aos obtidos nesse trabalho permitem

estabelecer estratégias que priorizem a conservação de grupos com representantes da maior

parte da história evolutiva das espécies, levando em consideração populações com maior

variabilidade genética, que é a matéria-prima para a sobrevivência das espécies.

Os pontos de coleta onde foram identificadas as maiores e mais vigorosas

populações de C. heterophylla foram o Horto da Aracruz e a Ilha do Barba Negra. O

primeiro possui apenas resquícios da vegetação original, devido à monocultura de

eucaliptos ali existente. Já o segundo, apesar de não ser área protegida por nenhum parque,

é um local bem preservado por ser utilizado apenas como ponto de parada para alguns

pescadores da região. Como nossos dados indicaram, a ilha além de possuir uma numerosa

e vigorosa população, apresenta altos valores de diversidade nucleotídica e haplotípica,

provavelmente devidos à presença de diferentes linhagens. Por se tratar de uma ilha,

possivelmente vários outros organismos vegetais e animais podem apresentar padrão

bastante semelhante ao verificado neste trabalho quanto à diversidade genética. Pela

proximidade, uma possibilidade interessante para preservar essas espécies seria incorporar

essa ilha ao Parque Estadual de Itapuã.

Outra população que chamou bastante a atenção em relação à preservação foi a

população de Santa Vitória do Palmar (Pop11). Esta, além de apresentar níveis altos de

diversidade genética, apresentou haplótipos exclusivos que, provavelmente, tiveram

origem distinta dos demais encontrados em todas as outras populações estudadas. Esse

local, apesar de estar muito próximo à Estação Ecológica do Taim, não possui nenhum tipo

de proteção ambiental. Como a barreira que separou essa população das demais demonstra

bastante consistência, é provável que populações de outras espécies também possuam

características semelhantes nesse local.

5.5. Distribuição da espécie

A descoberta da existência de populações de C. heterophylla fora da Planície

Costeira chama a atenção à necessidade da investigação de novas populações no interior do

continente no RS. O local onde foi coletada a população Pop3, São Francisco de Assis, tem

sua classificação quanto à vegetação como “Área de Formação Pioneira” pelo IBGE. Não

por acaso, a mesma classificação dada à vegetação que cerca a Laguna dos Patos e a Lagoa

Mirim (Figura 16). De fato, a fisionomia da região onde essa população foi coletada é

muito semelhante à encontrada na Planície Costeira: terrenos bastante arenosos, com a

presença de espécies típicas de restinga litorânea. Segundo o IBGE (1992), as “Áreas de

Formações Pioneiras” são caracterizadas como a vegetação situada na Planície Costeira e

ao longo da rede hidrográfica da Depressão Central e da Campanha. Nestas áreas,

encontram-se espécies, de herbáceas a arbóreas, com ocorrência de variadas formas

biológicas, adaptadas às diferentes condições edáficas aí reinantes. As formações vegetais

encontradas são de influência marinha (restinga), fluvial (comunidades aluviais) e flúvio-

marinha (manguezal e campos salinos).

Como a origem de Calibrachoa é andina e esse gênero chegou ao RS migrando no

sentido oeste-leste, torna-se fundamental para o melhor entendimento dos processos

evolutivos que envolvem essa espécie, a obtenção de mais amostras coletadas no interior

do continente. Fica como perspectiva para o pleno conhecimento da evolução, origem e

real distribuição de C. heterophylla, investigar as redes hidrográficas localizadas na

Depressão Central e na Campanha Sul-rio-grandense a partir do mapeamento vegetacional

feito pelo IBGE (1992).

Figura 16 - Unidades de vegetação do RS segundo o IBGE (1992). Ponto vermelho:

indicação do local de coleta da população Pop3.

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