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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
Avaliação da Transferência Gênica pela Via Nasal para o Sistema
Nervoso Central Utilizando um Vetor Não Viral
Tiago Pires Dalberto
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular
da UFRGS como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Prof. Dra. Nance Beyer Nardi
Porto Alegre
Abril de 2007
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2
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Imunogenética
do Departamento de Genética do Instituto de Biociências da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Financiamento: CNPq e FAPERGS.
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3
Esta dissertação é dedicada à aqueles que nunca me
faltaram e são os responsáveis pela sua
concretização, meus avós, Olavo e Zola
4
Agradecimentos
Inicialmente gostaria de agradecer a minha orientadora, Dra Nance Nardi, que
em todos os momentos esteve perto (mesmo quando estava em outro continente), me
dando todo apoio possível.
Aos meus avós, por todo o suporte, exemplos, e concessões que fizeram por
mim desde o meu nascimento até agora, sendo sempre o meu porto seguro. Vô, a única
coisa que eu realmente lamento é que tu não podes presenciar o final desta jornada, que
também foi tua e da vó. Não te preocupa, estou seguindo a risca a última frase que
dissestes a mim e a Marina, na nossa última despedida – “tchau e sejam felizes”. Um
caráter não pode ser só formado por bons exemplos, por isso agradeço aos meus pais
por me ensinarem como não ser.
Obrigado a toda a família imunogenética – Andrés, Luiza, Isabel, Pricila, Lari,
Bruno, Daniel G, Daniel O, Andréia W., Paula, Alessandra B., Flávia, Gustavo, Tiago,
Tati, Lindolfo, Renata, Anne, Andréia V, Dona Dilma, Zeca, Kátia, Marion - pela ajuda
na bancada (e fora dela) e momentos de descontração. Gostaria de agradecer em
especial à Mel e ao Pedro, pelo auxílio dos últimos meses!
Às professoras Marilda Fernandes e Elisa Winkelmann e ao bolsista Ricardo
Santin, do laboratório de pesquisa em patologia por disponibilizar o seu escasso tempo e
vasto conhecimento.
Aos colegas de mestrado e de departamento que estiveram próximos de mim
nestes turbulentos 24 meses. É impossível não citar alguns nomes em especial: Jéferson
Fregonesi, Vandervei, Nice, Tábita, Carol, Pricila Prestes, Fernanda Spies, Deise,
Matias, Francine, Claiton.
5
Aos grandes amigos do RPG de toda (na verdade nem toda) terça: Rodrigo,
Rogério, Fernando, Carlos, Luciano e André. Ou deveria dizer: Mestre, Talgor, Aegon,
Andrews, Shion e David?
Aos grandes amigos (humanos e caninos) que fiz no “cachorródromo da
redenção”, pelos chimarrões e conversas enquanto os cuscos brincavam. E também
pelos poucos churrascos e festinhas fora do parque. Entre todos gostaria de citar aqueles
que se tornaram muito próximos: Simone, Carol, Oscar, Cuca, Miguel, Gustavo, Rita.
À família Muschner que esteve sempre por perto na primeira metade desta
jornada. À família Macagnan por terem me acolhido tão carinhosamente neste último
ano. Em especial a minha “cunhada” Vica que me deu uma baita força cuidando da
minha cusca no último mês.
À Panda, a cusca mais sem vergonha que existe, que sempre me recebe com uma
imensa festa independente de qualquer coisa, e a Pepa, a mais nova comparsa.
Por último e, sem qualquer sombra de dúvidas, nem um pouco menos
importante, agradeço à responsável por eu não ter enlouquecido nestes últimos meses.
Obrigado Marina, por toda a compreensão, carinho e apoio nesta reta final, não poderia
estar em mais perfeitas mãos!!! EU TE AMO!!!
6
Lista de Abreviaturas
β-Gal – beta-galactosidase
BBB - blood-brain barrier (barreira hematoencefálica)
EGFP – enhanced green fluorescent protein (proteína verde fluorescente otimizada)
GAGs – glicosaminoglicanos
gapdh – glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gliceraldeido-3-fosfato
desidrogenase)
GFP - green fluorescent protein (proteína verde fluorescente)
hGH – human growth hormone (hormônio de crescimento humano)
HIV – human immunodeficiency virus (vírus da imunodeficiência humana)
HRP - horseradish peroxidase (peroxidase de raiz forte)
IDUA - α-L-iduronidase
LSD – lysossomal storage disease (doença de armazenamento lisossomal)
MPS I - mucopolissacaridose tipo I
NGS - normal goat serum (soro de cabra normal)
PBS – phosphate buffered saline
RSV - Rous sarcoma virus (virus do Sarcoma de Rous)
RT – Room temperature (temperatura ambiente)
SNC – sistema nervoso central
TG – terapia gênica
7
Sumário
Resumo
8
Abstract
9
Introdução
10
Terapia gênica
10
Vias de administração do vetor
14
A via nasal
16
Objetivos
21
Targeting the central nervous system by intranasal administration
of plasmid DNA
22
Informações complementares
43
Produção do vetor
44
Teste funcional do vetor
45
Experimento piloto 1: biodistribuição do vetor
45
Experimento piloto 2: expressão de EGFP no cérebro
47
Experimento piloto 3: redução da autofluorescência basal
48
Experimento piloto 4: transcrição do EGFP
50
Discussão
51
Referências bibliográficas
54
8
Resumo
O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas
ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é
extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso
central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas.
Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de
fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via
para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um
vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced
green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em
camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o
vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8
semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi
analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos
resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em
ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas
varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco
não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas
encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento.
Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene
administrados pela via nasal no cérebro.
9
Abstract
The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to
the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the
treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly
on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that
pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also
appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal
administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in
water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were
examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment.
RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two
types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even
8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were
analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain
samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of
EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from
the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with
zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency
of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the
hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the
long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous
system.
10
Introdução
Terapia gênica
O desenvolvimento massivo das técnicas de biologia molecular vem
possibilitando a identificação cada vez mais detalhada das bases genéticas da
patogênese de muitas doenças. Estes conhecimentos vêm propiciando a criação de
estratégias clínicas baseadas na inserção e expressão de genes com finalidade
terapêutica, conhecidas como terapia gênica (TG) (Parker et al., 2003).
De maneira geral, esta abordagem se resume à adição de genes exógenos com o
intuito de suprir ou bloquear a função de genes defeituosos. A transferência gênica pode
ser realizada em células coletadas do paciente e posteriormente reintroduzidas no
mesmo (ex vivo), pode ser realizada diretamente no paciente (in vivo) (Nardi et al.,
2002) ou o vetor pode ser administrado ao líquido amniótico (in utero) (Garrett et al.,
2003).
Uma questão de extrema importância para a TG é a seleção de um vetor que vai
transportar o gene de interesse (neste caso chamado de transgene) até o tipo celular,
tecido ou órgão alvo. O vetor deve apresentar uma série de características que tornam
seu uso viável e seguro, entre elas: permitir a acomodação de um grande transgene e de
todos os elementos fundamentais para a expressão deste, permitir a regulação da
quantidade e do tempo de expressão do transgene, fácil manipulação possibilitando a
produção em grande escala viável, ausência de efeito colateral como resposta
imunológica ou toxicidade, e não indução de mutagênese por inserção em sítio
indesejado (Nardi et al., 2002). O vetor que possui todas estas características não existe.
Na prática podemos contar com diferentes sistemas de vetores que vêm sendo avaliados
por muitos grupos com o intuito de aprimorar a eficiência, a estabilidade e a segurança
11
da transferência gênica. (revisado por Jakobsson e Lundberg, 2006).
De uma maneira geral os vetores são divididos entre aqueles originados de vírus,
chamados de vetores virais, e aqueles onde o transgene está inserido em um plasmídeo,
chamados de vetores não virais ou plasmidiais.
Os vetores virais representam um grande grupo de sistemas de transferência
gênica bastante heterogêneo, mas todos apresentam maior eficiência que os sistemas de
vetores não virais. Estes vetores são classificados e nomeados de acordo com os vírus
nos quais foram baseados. A transferência gênica mediada por estes vetores é chamada
de transdução. O ponto mais importante para a classificação destes vetores diz respeito à
capacidade de integração do transgene à célula transduzida. Aqueles que possuem esta
capacidade são chamados de vetores virais integrativos, os demais se mantêm na célula
sem promover a integração do transgene ao genoma da célula hospedeira e são
chamados de epissomais. Os sistemas de vetores integrativos mais conhecidos são
aqueles baseados em retrovírus e nos vírus adeno-associados. Os sistemas baseados em
adenovírus se mantêm de forma epissomal.
Os vetores baseados em retrovírus são subdivididos entre aqueles produzidos a
partir de representantes da subfamília oncovirinae, chamados de vetores onco-retrovirais
ou retrovirais, e aqueles produzidos a partir de representantes da subfamília lentivirinae,
chamados de vetores lentivirais. Todos estes vetores possuem como vantagens: fácil
manipulação e produção, grande eficiência na transdução e expressão do transgene por
um longo período. A maquinaria enzimática dos lentivírus lhes permite a transdução de
células quiescentes, fazendo com que estes vetores não dependam do rompimento da
carioteca, ocasionado pela divisão celular, como os retrovírus. As principais
desvantagens deste conjunto de vetores consistem na possibilidade de mutagênese
insercional, pequena capacidade de acomodação do transgene (cerca de 8 kb) e nas
12
considerações éticas, especialmente no uso de vetores baseados no lentivírus HIV
(revisado por Pagès e Bru, 2004).
Os vetores baseados em vírus adeno-associados pertencem aos parvovírus não
patogênicos que naturalmente requerem um vírus auxiliar, geralmente um adenovírus,
para poderem transduzir. Estes vetores são considerados muito seguros, já que não são
patogênicos. Mas apresentam a menor capacidade de acomodação de transgene entre os
sistemas virais, 5 kb e difícil manipulação e, conseqüentemente, produção (Smith,
2003).
Os adenovírus possuem a capacidade de transduzir um grande número de tipos
celulares, tornando muito atrativo o uso sistêmico destes vetores. Possuem capacidade
de carregar um transgene maior que 8 kb e são produzidos em grande quantidade com
facilidade (Gardlík et al., 2005). Estudos mostram que, apesar de não serem vírus
integrativos, a expressão do transgene transportado pode permanecer por até um ano
(Smith, 2003). A grande desvantagem destes vetores diz respeito à segurança, pois são
capazes de induzir forte resposta imunológica (Connelly et al., 1999).
Os vetores não virais possuem menor eficiência que os vetores virais, falta de
direcionamento ao tecido alvo, e não se integram ao genoma da célula hospedeira,
mantendo-se de forma epissomal. Esta última característica traz como conseqüência
uma transferência gênica ou, neste caso, transfecção, transiente do transgene. Os
métodos de transferência destes sistemas podem ser divididos em duas categorias:
físicos e químicos.
Os métodos físicos baseiam-se na entrada do vetor na célula alvo a partir de
processos mecânicos ou elétricos (Herweijer e Wolff, 2003). As metodologias variam
bastante (revisado por Parker et al., 2003), mas se baseiam geralmente nas seguintes
abordagens: injeção direta do DNA na célula alvo (microinjeção); abertura de poros
13
causada pela pressão criada pela injeção do vetor diluído em grande quantidade de
solução salina na corrente sanguínea (injeção hidrodinâmica), bombardeamento do vetor
complexado com microesferas de ouro ou tungstênio, aceleradas por um gás carreador
nas células alvo (biobalística), ou pela criação de poros na célula alvo após a aplicação
de pulsos elétricos alternados, de alta voltagem (eletroporação).
Os métodos químicos empregam materiais sintéticos de carga positiva
(catiônicos) que se complexam espontaneamente com o DNA, que possui carga
negativa. O objetivo desta abordagem é diminuir a força de repulsão entre o DNA e o
domínio extracelular das proteínas de membrana, que também possui carga total
negativa. Estes métodos apresentam baixo custo e fácil manipulação e produção. Os
materiais sintéticos são divididos em lipídeos catiônicos e polímeros catiônicos e
compostos químicos.
Os lipídeos catiônicos formam uma estrutura de dupla membrana chamada de
lipossomo ou micela. A entrada do lipossomo na célula se dá por meio de endocitose.
Os polímeros catiônicos se ligam ao DNA através de interações iônicas. Devido à
grande quantidade de polímeros catiônicos comercializados atualmente, o pesquisador
pode selecionar aquele que apresenta a melhor estrutura para transfectar a célula alvo
específica, já que diferentes tipos celulares do mesmo tecido não apresentam
homogeneidade na eficiência de transferência gênica com o mesmo polímero (Wong et
al., 2004). Estes polímeros também protegem o DNA do ataque de nucleases e da
degradação pelo lisossomo.
Os compostos químicos têm como base a liberação de cátions, em solução
aquosa, que se ligam ao DNA. O fosfato de cálcio é o composto mais utilizado para a
produção de vetores virais, e mesmo com uma eficiência relativamente alta, não é
indicado para o uso in vivo. Um outro composto pouco utilizado é o cloreto de zinco
14
que, em solução, libera íons Zn
2+
e contribui significativamente para o aumento da
expressão do transgene (Tucker et al., 2004).
Vias de administração do vetor
Juntamente com a seleção do vetor é importante a escolha da via pela qual este
será administrado. Para selecionar a via mais adequada devem-se considerar alguns
fatores, entre os quais podem ser incluídos o tecido alvo e as barreiras fisiológicas e
celulares a serem transpostas.
O alvo da TG pode ser um tecido específico, ou pode-se desejar a administração
sistêmica do vetor. No primeiro caso o tratamento de câncer, diabetes mellitus tipo I e
da fibrose cística podem ser usados como exemplo; já no segundo caso as doenças de
acúmulo lisossomal se mostram um exemplo bem representativo.
Na administração sistêmica, a via intravenosa é uma excelente opção. No estudo
realizado por McCormack et al. (2001) foi aplicada injeção intravenosa de um vetor
retroviral com o gene do hormônio do crescimento humano (hGH). Foi detectada
expressão de hGH no fígado e pulmão. No estudo desenvolvido por Camassola et al.
(2005) em nosso laboratório, foi administrado um vetor não viral contendo o cDNA do
gene da α-L-iduronidase no modelo murino para mucopolissacaridose tipo I (MPS I),
doença causada pela deficiência desta enzima, através de injeção hidrodinâmica do
plasmídeo na veia caudal em solução salina ou com injeção intraperitonial do vetor
complexado com o polímero catiônico Superfect. Na análise realizada por RT-PCR em
tempo real foi detectada a expressão do transgene em todos os orgãos analisados dos
animais tratados tanto pela via intravenosa como pela via intraperitonial.
Um bom exemplo de administração a um tecido específico é o trabalho de
Woodley et al. (2004), que reverteram os sinais clínicos da distrofia epidermolítica
15
bulosa em células de pacientes enxertadas em camundongos atímicos. Foi utilizado um
vetor lentiviral que codificava o gene do colágeno tipo VII, através de injeção
intradérmica.
O sistema nervoso central (SNC), especialmente o encéfalo, é o alvo que
apresenta maior dificuldade de ser atingido, devido à barreira hematoencefálica (blood-
brain barrier, BBB) (Loftus et al., 2006). A BBB é formada pela grande coesão das
células endoteliais dos capilares cerebrais limitando a passagem de substâncias do
sangue para o cérebro. Este controle rigoroso faz com que apenas substâncias de massa
inferior a 600 Da, hidrofóbicas, ou dependentes de transporte ativo possam chegar
facilmente até o encéfalo (Graff e Pollack, 2003). A BBB apresenta ainda um aspecto
enzimático. Solutos que passam pela membrana celular são imediatamente expostos a
enzimas degradativas, já que as células endoteliais possuem grande densidade de
lisossomos. Outra característica que torna a BBB tão eficiente é a grande concentração
de glicoproteína P, encarregada do transporte de drogas do citoplasma para a membrana
do lúmen do capilar do endotélio cerebral (Graff e Pollack, 2003). Devido a este
contexto, uma série de estratégias para burlar ou desorganizar temporariamente a BBB
foram desenvolvidas para que moléculas terapêuticas, em geral, possam chegar até o
encéfalo.
A estratégia mais agressiva utilizada baseia-se no uso da via trans-cranial através
de intervenção cirúrgica, que possibilita a entrada da molécula de interesse no encéfalo
sem que esta seja exposta a BBB. As abordagens mais utilizadas são injeção
intracerebral e infusão intraventricular ou intratecal, onde o fármaco é aplicado
diretamente no líquido cerebroespinhal (CSF). Ambas abordagens, entretanto, além de
serem muito invasivas são limitadas pela lenta difusão do fármaco no encéfalo, fazendo
com que este fique restrito ao sítio de aplicação (revisado por Pardridge, 2005).
16
Uma estratégia amplamente testada em nível pré-clínico é a modificação dos
fármacos com o intuito de aumentar a hidrofobicidade facilitando sua passagem pela
BBB. Uma maneira utilizada é a administração de formas inativas (pré-drogas) mais
lipofílicas que a droga, e que se tornam ativas após modificação in vivo (revisado por
Misra et al., 2003). Outro método é tornar o fármaco complexado a substâncias que
possuem estas características, aumentando assim sua penetração no encéfalo (Xie et al.,
2005).
A disrupção temporária da BBB causada por agentes hipotônicos é outra
maneira de se introduzir uma molécula terapêutica no encéfalo (Xie et al., 2005). Mas
esta é outra estratégia agressiva, pois esta disrupção também possibilita a entrada de
moléculas que podem exercer um efeito deletério para o SNC.
Outra estratégia é a exploração de vias menos invasivas para administração do
fármaco, que facilitem a entrega de moléculas terapêuticas ao encéfalo e ao mesmo
tempo não sejam tão invasivas.
A via nasal
A via nasal é comumente usada para o tratamento de males locais como
congestão, irritação ou inflamação nasal, mas ultimamente tem chamado a atenção de
diversos grupos de pesquisa como alternativa para a administração sistêmica de drogas.
A literatura é rica em exemplos da utilização desta via na administração sistêmica de
diversos fármacos como fatores de crescimento, morfina e citocinas (revisado por Illum,
2003).
As principais vantagens desta via perante outras vias sistêmicas incluem a rápida
absorção do fármaco pela mucosa nasal; fácil administração, dispensando a esterilidade
do material e o treinamento de pessoas para aplicação; pouco ou nenhum efeito
17
colateral; e relativa eficiência, já que evita contato hepático e gastrointestinal como na
via oral. Entre as desvantagens pode ser citada a rápida remoção da droga pelos cílios da
mucosa nasal (revisado por Davis e Illum, 2003).
Mas não é só na administração sistêmica que a via nasal tem se mostrado eficaz.
Outro fato importante é a que a anatomia da cavidade nasal oferece entrada para o SNC
sem a BBB. Isto se deve aos dendritos das células do nervo olfatório, localizados na
parte superior da cavidade nasal, fazendo a interface entre meio externo e o SNC
(Thorne et al., 2004). Em geral existem três rotas que a droga pode seguir após a
administração nasal: passagem direta da mucosa nasal para a circulação sanguínea,
entrada no bulbo olfatório via transporte neuronal ou entrada direta no encéfalo (Graff e
Pollack, 2003). Embora não encontre a BBB nestes casos, o fármaco precisa passar pela
membrana aracnóide que separa o líquido cerebroespinal olfatório do espaço sob o
muco do nariz, que também apresenta junções muito coesas (revisado por Davis e Illum,
2003).
Na literatura já se podem encontrar exemplos com diversos tipo de vetores
usados via nasal para a transferência gênica. É ainda uma via pouco explorada, e a
maioria dos trabalhos estão voltados para a investigação de seu potencial na
transferência gênica. A forma mais comum de se realizar este tipo de trabalho é o
emprego de genes que codifiquem peptídeos ou enzimas de fácil detecção e que fazem
parte de uma estratégia corriqueira quando se deseja estudar transferência gênica
(Teixeira et al., 2002). Estes genes são chamados de genes repórteres. Entre os mais
utilizados se encontram o gene da proteína verde fluorescente (green fluorescent
protein, GFP) e suas variantes (Jerusalmi et al., 2003), o gene da enzima β-
galactosidade (Oh te al., 2001) e o gene da enzima luciferase (Li et al., 2004).
18
Um dos primeiros trabalhos a explorar o potencial desta via foi publicado por Oh
et al. (2001), e teve como objetivo analisar a absorção e biodistribuição de um vetor não
viral utilizando como gene repórter o gene da Beta-galactosidase (β-gal) em
camundongos. Os pesquisadores verificaram a expressão deste gene 15 minutos e 24 h
após a aplicação, em diversos tecidos e órgãos como músculo, linfonodos, fígado,
pulmão, baço, coração, rim e cérebro.
A maior parte dos trabalhos publicados usando esta via se concentram no estudo
de possíveis tratamento de males que afetam o pulmão, como se pode verificar no artigo
publicado por Pringle et al. (2005). Neste trabalho os autores investigaram a
transferência de um gene repórter nas vias aéreas de camundongos, usando o lipossomo
GL67. Os resultados indicaram que o gene usado, no caso o gene da luciferase, foi
expresso no pulmão, sendo constatada a presença do plasmídeo intacto por até uma
semana, mas sem detecção da atividade de luciferase.
Uma outra possibilidade de uso da via nasal é na produção de hormônios e
outros peptídeos para administração sistêmica. Tanaka et al. (2004) estudaram o efeito
da administração diária, por 12 dias, de um plasmídeo com o gene da insulina ou gene
repórter da luciferase complexado com lipossomo em camundongos que tiveram
diabetes induzida por estreptozocina. Os resultados foram bastante animadores,
mostrando que todos os animais tratados com o gene repórter morreram, enquanto
aqueles tratados com o gene da insulina sobreviveram. Nesta mesma publicação, os
autores investigaram a biodistribuição do vetor com insulina e constataram a transcrição
do vetor somente nos alvéolos pulmonares, indicando que o vetor não foi internalizado
por outros tecidos. No trabalho publicado por Griesenback et al. (2001), foi realizada a
comparação entre três vias diferentes para a produção sistêmica de peptídeos. Aqui os
autores optaram pela utilização de um vetor viral, o vírus Sendai recombinante
19
carregando o gene da interleucina-10. O vetor foi aplicado via intramuscular, via nasal e
via pulmonar. A via pulmonar foi a que apresentou maior eficiência, sendo a via nasal
com eficiência intermediária e a via intramuscular a com menor eficiência.
Han et al. (2007) compararam a eficiência da transferência gênica para o
encéfalo de camundongos utilizando dois vetores não virais com tamanhos diferentes,
pCMVΒ (7,2 kb) e pN2/CMVΒ (14,1 kb), codificando o gene da β-gal, administrados
pela via nasal e pela via intravenosa. O primeiro resultado deste estudo mostrou que
ambos os vetores atingiram o encéfalo pela via nasal, mas o pCMVΒ mostrou-se mais
eficaz, indicando que o tamanho do vetor infuencia na sua eficiência por esta via. No
mesmo estudo, foi avaliada a distribuição de pCMVΒ no encéfalo em três tempos
diferentes (5, 10 e 60 minutos) após administração intranasal e intravenosa. O vetor
atingiu diversas regiões do encéfalo nos dois tratamentos. A via intravenosa pareceu ser
a de maior eficiência a curto prazo, já que resultou em maior quantidade do vetor em 5
minutos em todas as regiões estudadas (bulbo olfatório, área do septo, estriado,
hipotálamo, tálamo, mesencéfalo, hipocampo, medula oblonga e cerebelo). Entretanto,
60 minutos após o tratamento foi observada maior quantidade do vetor nos
camundongos tratados pela via nasal.
Os resultados de Han et al. (2007) e Oh et al. (2001) mostram que a
administração de um plasmídeo pela via nasal pode ser importante na terapia de males
que afetem o SNC, onde o gene de interesse não requer a transferência gênica a um ou
mais tipos celulares específicos. As doenças de acúmulo lisossomal (lysossomal storage
disease, LSD), como a MPS I, se enquadram perfeitamente entre as candidatas a este
tipo de tratamento. A MPS I é causada pela deficiência ou ausência da enzima α-L-
iduronidase (IDUA), e caracteriza-se pelo acúmulo dos glicosaminoglicanos (GAGs)
dermatan sulfato e heparan sulfato. As características clínicas são bastante variadas,
20
sendo que na forma mais grave há comprometimento do sistema nervoso central,
gerando retardo mental. A terapia gênica se mostra uma alternativa promissora, já que
se trata de uma doença monogênica (Camassola et al., 2005).
O presente estudo mostra a administração de um vetor não viral pela via nasal,
diluído em água ou em uma solução de sulfato de zinco em camundongos da linhagem
BALB/c, e o acompanhamento da expressão do transgene por oito semanas.
21
Objetivos
Tendo em vista que um dos principais objetivos de nosso grupo de pesquisa é o
estabelecimento de protocolos de terapia gênica no modelo murino de MPS I, é de
grande interesse o estabelecimento de métodos de transferência gênica para o sistema
nervoso central. O presente projeto teve como objetivo geral o estudo da via nasal como
alternativa para a transferência gênica no sistema nervoso central, utilizando para isso
um plasmídeo contendo o gene repórter da proteína verde fluorescente otimizada
(enhanced green fluorescent protein, EGFP).
Os objetivos específicos deste trabalho podem ser assim definidos:
• Avaliar o potencial da via de administração intranasal na transferência do gene
repórter EGFP, em um vetor plasmidial, até diferentes regiões do cérebro de
camundongos BALB/c.
• Comparar a eficiência de preparados do vetor plasmidial diluído em água ou em uma
solução de sulfato de zinco em água.
• Avaliar a manutenção prolongada da expressão de EGFP nos camundongos BALB/c
transfectados.
22
Targeting the central nervous system by intranasal administration of
plasmid DNA
23
Manuscript to be submitted to Journal of Molecular Medicine
Targeting the central nervous system by intranasal administration of
plasmid DNA
Tiago Pires Dalberto
1
, Pedro Cesar Chagastelles
1
, Melissa Camassola
1
, Marilda da Cruz
Fernandes
2
, Elisa Cristiana Winkelmann
2
, Ricardo Santin
2
, Nance Beyer Nardi
1
*
1
Departament of Genetics, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av Bento
Goncalves 9500, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil
2
Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre, Rua Sarmento
Leite, 245, 90050-170, Porto Alegre, RS, Brazil
* Corresponding author.
Nance Beyer Nardi
Departament of Genetics, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Av Bento Goncalves 9500, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil
E-mail: [email protected]
Abbreviated title: Intranasal gene transfer to the brain.
24
Abstract
The blood-brain barrier (BBB) represents a major obstacle to effective therapy for
neurodegenerative disorders or any disease affecting the brain. Current methods to
overcome the problem are very aggressive, and recent studies have suggested that
pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route. Here, we investigated
brain targeting by intranasal administration of plasmid DNA diluted in water or in zinc
sulfate. A plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP was diluted in water
or in a zinc sulfate/water solution and nasally administered to adult mice. Brain regions
were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the
treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly
with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and
maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to
immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells,
that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration
of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great
variation even among mice from the same experimental group. A higher frequency of
these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the
hippocampus as compared to other brain regions. The supplementation of the
transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive
cells. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a
nonviral vector to the central nervous system.
Keywords: Plasmid DNA, EGFP, intranasal administration, central nervous system.
25
Introduction
There is a great need for the development of non-viral, non-invasive gene therapy of the
brain. The blood-brain barrier (BBB) represents a major obstacle to effective therapy for
neurodegenerative disorders, since it limits passage of therapeutics. The obstacle also
applies to the treatment of any disorder affecting the brain, as some metabolic diseases
such as the mucopolysaccharidoses (Matte et al., 2003). New strategies must be
investigated to target large or charged drug molecules, as well as therapeutic genes,
across the BBB. Currently, most methods involve the direct administration of the
therapeutic agent to the target site (Hereñú et al., 2007), or in the cerebrospinal fluid by
lumbar puncture (Shimamura et al., 2005). These methods, however, are very
aggressive, and other methodologies are under study. Noninvasive, nonviral gene
targeting to the brain has been shown with the encapsulation of the therapeutic gene in
pegylated immunoliposomes, tethering targeting monoclonal antibodies to the complex
and injection into the bloodstream (Shi and Pardridge, 2000).
The nasal airway has been attracting much attention for the local or systemic delivery of
drugs and genes. Gene therapy by intranasal delivery has been suggested for different
types of human diseases, such as cystic fibrosis (Noone et al., 2000), diabetes (Tanaka
et al., 2004) and intestinal allergic diarrhea (Hino et al., 2005), and the transfected nasal
epithelium has been proposed as a factory for systemic protein delivery (Griesenbach et
al., 2001). Intranasally administered drugs have also been shown to reach the blood, so
that systemic administration of drugs or genes by this route is also possible (reviewed
by Illum, 2003).
Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the
nasal route. This route is very attractive due to the absence of a blood–brain barrier at
26
the interface between the nasal epithelium and the brain, and although the mechanisms
are not fully understood it is possible that the agent reaches the brain via the
bloodstream (Oh et al., 2001) or the olfactory bulb (Thorne et al., 2004). Intranasal
delivery of different types of molecules to the brain have been reported, such as proteins
(Gao et al., 2006; Loftus et al., 2006), neuropeptides (Born et al., 2002), and insulin
(Mitra et al., 2000). Han et al. (2007) investigated the brain targeting efficiency and
transport pathways of intranasally administered plasmid DNA, showing that the reporter
gene was systemically absorbed and reached the brain, possibly via the olfactory bulb.
There is still a need for exploring more efficient methods of nonviral gene targeting to
the brain, particularly exploring the maintenance of the transgene expression. One of the
points to be explored involves the use of chemical compounds, such as zinc sulfate
(Tucker et al., 2004), to enhance the efficiency of gene transfer. Here, we investigated
brain targeting by intranasal administration of plasmid DNA diluted in water or in zinc
sulfate, showing that the transfected gene is expressed in the brain up to two month after
treatment.
27
Materials and methods
Animals
Adult (8-16 weeks old) BALB/c and EGFP mice (green mouse FM131, kindly provided
by M. Okabe, Osaka University, Japan) were used in this study. The animals were kept
under standard conditions (12 hours light/12 hours dark, water and food ad libitum) in
our animal house. All the experimental procedures were performed according to
institutional guidelines.
The EGFP mice were used for the preparation of EGFP-positive samples for control of
RT-PCR and immunohistochemistry reactions.
Preparation and intranasal administration of pREGFP
The EGFP reporter gene was subcloned in the mammalian expression vector pREP9
(Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA), downstream to the Rous sarcoma virus (RSV)
constitutive promoter, as previously described (Teixeira et al., 2001). The resulting
plasmid (pREGFP) has 11.2 kb. Escherichia coli DH5α-T1
R
(Invitrogen) was
transformed with pREGFP using standard procedures (Sambrook et al 1989) and the
plasmid was purified with PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen).
Electrophoresis in 1% agarose gel confirmed the purity of DNA preparations.
For administration of the plasmid DNA, the animals were anesthetized with a
combination of ketamine and xilazine (1.16 g and 2.3 g per kg body weight,
respectively) delivered intraperitoneally. pREGFP was diluted in water or in a solution
28
of 3.6 mM ZnSO
4
in water, at 1.25 µg/µl, and 20 µl of the solution was introduced into
the left nostril with a pipette tip.
Preparation of samples
Within 1, 2, 4 or 8 weeks after treatment, the animals were anesthetized as described
above. The abdominal cavity was opened, the diaphragm was ruptured, and 200 µl of a
0.8% sodium citrate solution were injected into the beating heart. The ascending aorta
was catheterized with a 27G intravenous catheter inserted through the left ventricle. The
right atrium was cut, and around 100 ml of saline solution 0.9 % were pumped in. After
the perfusion, the brain was extracted from the skull and the frontal lobe (except for the
olfactory bulb) was harvested for RNA extraction. The remaining of the brain was
collected, placed into 4% paraformaldehyde for 12 hours and, subsequently,
cryoprotected with 15% sucrose in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) until the
sample was saturated. The samples were then immersed in 30% sucrose/PBS, placed in
isopentano and frozen in liquid nitrogen. The brain samples were cut with a cryostat in 4
µm-thick coronal serial sections including the hypothalamus, thalamus, hippocampus
and olfactory bulb, using the Paxinos-Watson atlas for anatomical references. The
samples were collected on glued slides with an interval of 24 µm.
Immunohistochemistry
Sections were air dried, post fixed in methanol for 10 minutes at room temperature,
incubated with H
2
O
2
for 30 min and blocked in 1:6 diluted normal goat serum (NGS) for
20 minutes. The sections were then incubated with rabbit policlonal anti-gfp antibody
29
(Molecular Probes, Eugene, OR) in 1% NGS, for 16 h at 4 °C, followed by incubation
with goat anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody (Zymed, San Francisco, CA)
in 1% bovine serum albumin/PBS. The peroxidase activity was developed by adding
daminobenzidine (DAB, Sigma Chemical Co. St Louis, MO) for 10 min, and the
sections were counterstained with hematolixin. The slides were rinsed 3 times in PBS
between each incubation, except after blocking with NGS. Digital images were recorded
using a Zeiss Axiostar Plus microscope and Zeiss Axiovision Software (Zeiss Jena,
Germany).
RT-PCR assay of EGFP mRNA expression in the brain
Total RNA was harvested from the frontal lobe with Trizol reagent (Invitrogen, SP,
Brazil) according to the manufacturer’s instruction. The integrity of total RNA was
confirmed by denaturing gel electrophoresis, and the RNA was finally eluted in RNAse-
free water. Reverse transcription (RT) was performed using MMLV reverse
transcriptase (Invitrogen) in appropriate conditions. In all reactions, cDNA was
synthesized in 20 µl from 2 µg of total RNA. For each reaction, 1µl oligo(dT)
20
(500
mM), and 1 µl dNTP (10 mM) were used. Reactions were incubated at 70
o
C for 10 min,
then 4 µl RT buffer (10×), 2 µl DTT (0.1 mol/L) and 200U RT enzymes were added and
the reaction was incubated at 42
o
C for 90 min. The resulting cDNA was submitted to a
PCR reaction with the primers for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(gapdh) gene and the egfp gene, resulting in amplified fragments of 452 pb and 183 pb
in length, respectively. The antisense egfp primer was
5
’
CTTCAAGATCCGCCACAACAT3’ and the sense primer was
5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC3’ (Yao et al., 2004). The antisense gapdh
primer was 5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’ and the sense primer was
30
5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’ (Rubra et al., 2004). PCR was carried out in a 25
µl reaction mixture containing 1 µl of cDNA, 0.1 mM of each primer, 1 mM of each
dNTP, 1x Taq DNA polymerase buffer and 1 U Taq DNA polymerase (Invitrogen).
PCR
was performed under the following conditions: an initial denaturation
step at 94°C
for 5 min followed by cycles of denaturation
at 94°C for 35 sec, annealing at 58°C for
45 sec,
and extension at 72°C for 1 min; and a final extension step for 7 minutes. The
samples were subjected
to 40 cycles, and the PCR products were analyzed on 1.5 %
agarose gel stained with ethidium
bromide.
31
Results
Expression of intranasally administered pREGF in the brain was followed during a
period of two months. The experimental groups, composed by 5 BALB/c mice, were
analyzed in 1, 2, 4 or 8 weeks after treatment by RT-PCR and immunohistochemistry of
the brain.
Expression of intranasally administered plasmid DNA in the brain
RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two
types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even
8 weeks after treatment, as presented in Fig. 1. The amplification pattern was confirmed
by analysis of brain samples from transgenic EGFP mice, and was absent in samples
from normal BALB/c animals. Amplification of the gapdh gene was observed in all
samples studied.
Immunohistochemical analysis of brain regions
Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the
detection of EGFP-positive cells. IHC of samples from EGFP-transgenic mice resulted
in a strong reaction of the whole section with anti-EGFP antibody, and showed that the
neuropil was also immunoreactive (Fig. 2a). Control reactions, which included IHC of
brain sections from non-treated BALB/c mice or normal C57Bl/6 animals submitted to
primary and secondary antibodies, as well as sections from EGFP mice or treated
animals without incubation with the primary antibody, showed consistently negative
32
results (Fig. 2b). EGFP-positive cells, on the other hand, could be observed in brain
samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. Cells considered
positive (a) presented the immunoperoxidase staining restricted to the cytoplasm, on the
same plane of the cell, (b) presented a clear relationship of the cytoplasm with the
nucleus, and (c) were located in regions of tissue integrity (Fig. 2c-2e). Olfactory bulb
sections were separately analyzed, and showed similar reaction patterns. Only sections
with uninjured tissue were analyzed, at least six sections from each animal.
The frequency of EGFP-positive cells was very low (Table 1), and presented great
variation even among mice from the same experimental group (Table 2). The results,
however, show clearly the presence of positive cells in treated animals even 8 weeks
after treatment, and no positive cells in the negative controls, and should therefore be
considered in the evaluation of the efficiency of the transfer protocol.
A clear difference is observed when the frequency of EGFP-positive cells in the
olfactory bulb is analyzed in animals treated 1, 2, 4 or 8 weeks earlier. Nasal
administration of the pREGFP plasmid diluted in water or in zinc sulfate showed clearly
higher frequency of positive cells one week after treatment, with a drop in these
frequencies on later analyses. Immunohistochemistry of the thalamus, hypothalamus
and cortex showed very low numbers of positive cells. The hippocampus, however,
showed higher frequency of EGFP-positive cells when analyzed one week (for plasmids
diluted in zinc sulfate only) and four weeks (for plasmids diluted in both water or zinc
sulfate).
Table 2 presents the individual analysis of these groups. It is interesting to notice that,
while the higher frequency of positive cells in the olfactory bulb is due to a more evenly
distributed number of positive cells in the five animals composing the groups, for the
hippocampus the intragroup variability is much larger.
33
Discussion
The central nervous system is one of the most difficult targets of gene therapy due to the
existence of the blood-brain barrier. In this study, we explored one of the new
alternatives currently investigated to overcome this obstacle, the nasal airway. Our
results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral
vector to the central nervous system. RT-PCR showed that the gene is expressed in the
brain up to eight weeks after nasal administration of pREGFP diluted in water or in a
zinc sulfate solution. Previous studies have also shown that intranasally administered
plasmid DNA presents enhanced brain targeting efficiency (Oh et al., 2001; Han et al.,
2007). Gene expression, however, was analyzed in very short periods of time after the
treatment (24 h and 14 h, respectively).
The frequency of EGFP-positive cells detected by immunohistochemistry is low, and a
great individual variability was observed, which could reflect the existence of
experimental parameters not well defined that interfere with the results. The very low
number of EGFP-positive cells is also probably responsible for this variability. In all
cases, however, EGFP expression was observed in two or more of the brain regions
analyzed.
The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher
numbers of EGFP-positive cells. Zinc has been shown to improve the efficiency of
nonviral transfection, but mostly in in vitro studies (Niedzinski et al., 2003; Elmadbouh
et al., 2004). Further studies are necessary to determine whether the enhancing activity
of zinc sulfate is expressed only in the in vitro situation, or if in our system this lack of
activity was due to the specific route used for plasmid administration.
34
Different mechanisms could be responsible for the delivery of DNA to the brain after
nasal administration. The present study did not allow the identification of the
mechanism involved, but the fact that a greater frequency of EGFP-positive cells was
observed in the olfactory bulb one week after treatment could suggest that this is the
route of delivery of the plasmid DNA to the brain. Other studies have suggested this
mechanism (Han et al., 2007), but it is difficult to determine if in that case the plasmid
is subject to retrograde axonal transport mechanisms (reviewed by Hanz and Fainzilber,
2004) or to paracellular routes. Since the nasal route may also result in the systemic
delivery of therapeutic drugs (reviewed by Davis and Illum, 2003), it is also possible,
although less probable, that pREGFP reached the brain after entering the bloodstream.
This study did not allow the identification of the type of cell transfected, so that its
potential for treating neurodegenerative diseases may not be appreciated. However, for
metabolic diseases affecting the central nervous system, such as mucopolysaccharidosis
type I, reposition of a small part of the normal enzymatic activity may result in
significant clinical improvement (Matte et al., 2003). Plasmid vectors, that are generally
less efficient but safer that viral vectors, are therefore more suitable for gene therapy of
this type of disease (Camassola et al., 2005).
Although our results show long-term expression of EGFP, more studies are necessary to
further determine the maintenance of this effect, and possibly optimize the use of the
nasal route for targeting the brain by adjusting technical variables of the method.
35
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Table 1 - Number of EGFP-positive cells / total sections examined, in separate brain
regions, 1, 2, 4 or 8 weeks after nasal administration of pREGFP dissolved in water
(H
2
O) or in a solution of zinc sulfate in water (ZnSO
4
).
Weeks Solution Brain region
Olfactory bulb Thalamus Hypothalamus Hippocampus Cortex
1H
2
0 13/67* 0/40 0/40 7/40 0/40
1 ZnSO
4
15/51* 1/39 0/39 32/39* 0/39
2H
2
0 3/34 5/43 1/43 5/43 0/43
2 ZnSO
4
4/42 7/42 2/42 4/42 1/42
4H
2
0 2/31 1/41 0/41 20/41* 1/41
4 ZnSO
4
1/32 4/35 4/35 35/35* 0/35
8H
2
0 3/41 4/48 0/48 4/48 4/48
8 ZnSO
4
0/30 0/38 3/38 2/38 6/38
* Groups shown in detail in Table 2.
39
Table 2 - Individual analysis of the number of EGFP-positive cells / total sections from
the olfactory bulb or hippocampus examined, 1 or 4 weeks after nasal administration of
pREGFP dissolved in water (H
2
O) or in a solution of zinc sulfate in water (ZnSO
4
).
Weeks Solution Brain region Mouse #
1 2345
1H
2
0 Olfactory bulb 0/6 5/17 0/6 2/13 6/21
1 ZnSO
4
Olfactory bulb 0/6 2/10 1/13 3/16 9/16
1 ZnSO
4
Hippocampus 0/8 2/9 23/8 9/7 0/7
4H
2
0 Hippocampus 11/10 3/8 2/7 2/8 2/8
4 ZnSO
4
Hippocampus 16/7 6/8 2/6 5/8 6/6
40
Figure legends
Fig. 1 – Electrophoresis pattens of the amplification products of brain RT-PCR. 1-4,
RT-PCR with EGFP-specific primers. 1, EGFP-transgenic mice; 2, BALB/c treated
with pREGFP in water, 8 weeks; 3, BALB/c treated with pREGFP in ZnSO
4
, 8 weeks;
4, non-treated BALB/c; 5-9, RT-PCR with gapdh-specific primers. 5, EGFP-transgenic
mice; 6, BALB/c treated with pREGFP in water, 8 weeks; 7, BALB/c treated with
pREGFP in ZnSO
4
, 8 weeks; 8, non-treated BALB/c; 9, PCR negative control.
Fig. 2 – (A) Brains section from EGFP-transgenic mouse, with anti-gfp antibody; (B)
brain section of EGFP-transgenic mouse, without anti-gfp antibody and with the
secondary antibody; (C,D) brain section of BALB/c mice, treated with pREGFP in
water (C) or zinc sulfate/water (D), with primary and secondary antibodies. Bar = 20
µm.
41
Fig. 1
452 pb
183 pb
1
2
3 456789
42
Fig. 2
AB
CD
43
INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES
44
Neste capítulo serão apresentados os resultados obtidos dos experimentos
realizados previamente que indicaram quais as regiões do encéfalo foram alcançadas
pelo vetor, teste de visualização direta da expressão da EGFP e teste de redução da
autofluorescência basal do encéfalo. Estas informações contribuem para o entendimento
dos métodos empregados no artigo científico assim como na discussão do trabalho
como um todo.
Produção do vetor
O primeiro resultado obtido neste trabalho foi a produção do vetor. Colônias de
bactérias Escherichia coli foram transformado com pREGFP (figura 1), como descrito
por Sambrook et al., 1989. Posteriormente, as colônias foram selecionadas em meio
contendo antibiótico e testadas através de reação de PCR quanto à presença de EGFP.
As colônias positivas foram crescidas em condições ideais e foram submetidas a
extração de DNA plasmidial. O DNA extraído foi clivado por enzimas para confirmar o
padrão de clivagem do pREGFP. Após a confirmação deste padrão o vetor foi
produzido em larga escala.
Figura 1 – Representação do vetor EGFP.
45
Teste funcional do vetor
Após a verificação do padrão de clivagem, o vetor foi submetido a um teste
funcional com o objetivo de averiguar a expressão de EGFP após os processos de
produção. Este ensaio se baseia na transfecção de células da linhagem Hek 293T pelo
vetor. De modo resumido, 10
5
células Hek 293T foram semeadas em cada poço de
placas de cultivo celular com 24 poços. Estas células foram cultivadas por 16 horas em
condições ideais e posteriormente foram transfectadas por 600 ng de pREGFP
complexado a 5 µL do polímero catiônico Superfect Reagent (Qiagen, Valencia, CA,
EUA). Após 48 horas a expressão do vetor pode ser visualizada por microscopia de
fluorescência (figura 2).
Experimento piloto 1: biodistribuição do vetor
No primeiro experimento realizado, 2 animais foram tratados, pela via nasal,
com 50 µg de pREGFP diluídos em 20 µl água estéril, 3 com 25 µg de pREGFP
diluídos em 20 µl água estéril e 2 com 20 µl de PBS; todas as soluções foram
administradas na narina esquerda. A diferença entre o número de animais tratados com
pREGFP foi ocasionada pela dificuldade de administrar a solução do vetor com
concentração de 2,5 µg/µl. Em princípio, conseguimos tratar os 3 primeiros animais
com 20 µl desta solução, mas como a solução entrava muito lentamente na narina do
animal e eventualmente era expelida, pensamos que a solução poderia estar muito
viscosa. Para testar esta hipótese, a solução foi diluída para 1,25 µg/µl. Nesta
concentração, 20 µl de solução foram administrados sem serem expelidos.
46
A B
Figura 2 - Resultado do teste funcional do pREGFP em células da linhagem HEK 293T.
Análise em microscopia de fluorescência, aumento de 100x . A) células transfectadas
com 600 µg de pREGFP complexadas com 5 µl de Superfect Reagent; B) controle
negativo da transfecção.
Uma semana após o tratamento, um animal de cada grupo foi sacrificado e
foram coletados o encéfalo, o rim, o fígado, o baço, o coração, o pulmão e a medula
espinhal. O encéfalo foi dividido nos dois hemisférios e foram separados de cada
hemisfério o córtex, o cerebelo, o hipotálamo, o estriado e o bulbo olfatório. Todas estas
amostras foram submetidas a extração de DNA, mas devida a problemas técnicos não
conseguimos obter DNA.
O mesmo procedimento foi repetido, com sucesso, quatro semanas após o
tratamento, com os animais restantes. Todas amostras foram submetidas a PCR com os
oligonucleotídeos específicos para gapdh e EGFP. Todas as amostras amplificaram
quando testadas com os oligonucleotídeos específicos para gapdh, enquanto nenhuma
das amostras dos animais tratados com salina ou com 50 µg de pREGFP diluídos em 20
µL água estéril amplificou quando testadas com os oligonucleotídeos específicos para
47
EGFP. Entretanto, ao menos uma das amostras de cada órgão ou região cerebral dos
animais que receberam 25 µg de pREGFP diluídos em 20 µL água estéril apresentou o
fragmento com tamanho esperado.
Os dados obtidos nos levam a especular que a solução com concentração de 2,5
µg/µL de pREGFP pode ter sida expelida da cavidade nasal pelo sua viscosidade. A
partir destes resultados em todos os experimentos posteriores os animais dos grupos
tratados receberam 25 µg de pREGF em um volume de 20 µL e os animais usados como
controle negativo receberam 20 µL de solução salina.
Experimento piloto 2: expressão de EGFP no cérebro
Neste experimento, 2 animais foram tratados com o vetor e um com salina.
Após 4 semanas os animais foram sacrificados e os cérebros foram coletados e
submersos em solução de paraformaldeído 4% por 12 horas a 4
o
C. Posteriormente
foram submetidos a um gradiente de sacarose, e foram preparadas secções de 4 µm de
espessura em criostato. Os cortes foram analisados em microscopia de fluorescência a
fim de visualizar a expressão de EGFP.
Os resultados obtidos não foram satisfatórios, pois não conseguimos encontrar
diferença na fluorescência dos cortes dos cérebros dos animais tratados e do controle, já
que o tecido apresentou muita autofluorescência basal. Este fato não nos surpreendeu
por completo já que a literatura mostra que o SNC possui grande acúmulo de
lipofuscina, substância responsável pela autofluorescência basal deste tecido.
Experimento piloto 3: redução da autofluorescência basal
Revisando a literatura, localizamos o trabalho de Stephen et al. (1999), que
descrevia dois protocolos para redução da autofluorescência basal. Por questões técnicas
48
optamos pelo protocolo com Sudan Black B 1% diluído em metanol. Neste experimento
foram usados 2 camundongos tratados com pREGFP, 2 tratados com pREGFP diluído
em solução 3,6 mM de sulfado de zinco, um com salina e, para podermos detectar
qualquer alteração da fluorescência do transgene devido ao tratamento foi usado um
camundongo transgênico para EGFP derivado da linhagem C57Bl/6.
Duas semanas após o tratamento os camundongos foram sacrificados e foram
realizados cortes com espessura de 4 µm, como descrito previamente. Após a análise foi
constatada a redução da autofluorescência basal nos cortes de cérebros dos animais
tratados com o vetor e com salina, sem qualquer alteração detectável na expressão de
EGFP nos cortes de cérebro do animal transgênico, como apresentado na figura 3.
Neste mesmo experimento não foi detectada qualquer expressão de EGFP nos
animais tratados.
Estes resultados nos propiciaram a formulação de duas hipóteses: 1) o transgene
não está se expressando ou, 2) a expressão do transgene ocorre em nível muito baixo,
impossibilitando a detecção direta.
Para testar estas hipóteses, realizamos um último experimento piloto, descrito a
seguir.
Experimento piloto 4 – transcrição do EGFP
No último experimento piloto que precedeu este estudo, foram formados 2
grupos de tratamento: no primeiro foi administrado pREGFP em água estéril em 4
49
Sem Sudan Black Com Sudan Black
Figura 3 – Microfotografias das amostras de cérebro antes e após o tratamento com
Sundan Black B 1% diluído em etanol, em microscopia de fluorescência (400 x). A e B)
animais transgênicos, C e D) animais tratados com solução salina, E e F) animais
tratados com 25 µl de pREGFP diluído em água destilada, G e H) animais tratados com
25 µl de pREGFP diluído em 3,6 mM de sulfato de zinco.
A
C
B
F
E
G
D
A
H
50
animais, no segundo, pREGFP em solução de zinco 3,6mM em 6 animais. Metade dos
animais foi sacrificada uma semana após o tratamento, enquanto que a outra metade foi
sacrificada 8 semanas após o tratamento. O cérebro dos animais foi coletado e
submetido à extração de RNA, síntese de cDNA e RT-PCR. Foi observada a transcrição
do gene repórter em todos as amostras testadas de animais tratados, corroborando a
hipótese de que a expressão de EGFP é tão sutil que não podemos detectar apenas com
o auxílio de microscópio ótico.
51
Discussão
O presente estudo mostrou o emprego do gene egfp (enhanced green fluorescent
protein) uma das variantes do GFP, para testar a transferência gênica tendo como alvo o
encéfalo, através da via nasal. Selecionamos esta via com base em um experimento
preliminar realizados em nosso laboratório por Silva et al. (1999) e pelo trabalho de Oh
et al. (2001). No primeiro caso, os autores constataram somente pela observação direta
em microscópio óptico a expressão de EGFP, 15 dias após a administração de 50 µg de
pREGFP a camundongos BALB/c. No segundo caso, os autores observaram a
biodistribuição do vetor em diversos tecidos, incluindo o cérebro, utilizando a mesma
quantidade do vetor. Na literatura pudemos encontrar inúmeros exemplos de peptídeos e
fármacos administrados por esta via com sucesso, muitos encontrados na revisão escrita
por Illum (2003).
Na série de experimentos piloto que realizamos, constatamos que o vetor havia
chegado até o encéfalo. Outra conclusão que estes experimentos puderam nos mostrar é
que uma quantidade inferior àquela usada por Silva et al. (1999) e Oh et al. (2001)
também é eficiente. Mas na tentativa de visualização direta da expressão do gene
repórter pudemos constatar que o EGFP deve ser usado, preferencialmente, em casos
onde o tecido ou órgão alvo possua pouca ou nenhum autofluorescência, para que esta
não prejudique a qualidade das análises. Nossa tentativa de eliminar este empecilho,
usando o protocolo descrito por Shnell et al. (1999), parece ter sido bem sucedida, já
que a fluorescência dos cortes de animais transgênicos para EGFP não parece ter sido
afetada. Mas como não tínhamos uma estimativa da eficiência do vetor, não pudemos
afirmar se o método é válido também quando a expressão de EGFP é baixa, ou se esta
baixa expressão pode ser afetada. Posteriormente, detectamos a transcrição de EGFP
52
por técnica de RT-PCR, mostrando que o vetor não só havia chegado até o encéfalo
como também estava funcional.
Nossos resultados mostraram, pela primeira vez na literatura disponível, a
expressão prolongada de um gene administrado pela via nasal em células do cérebro,
sendo levado por um vetor não viral. Estudos anteriores já haviam demonstrado que um
plasmídeo podia atingir o encéfalo por esta via, mas analisando um curto espaço de
tempo após a administração (Oh te al., 2001 e Han et al 2007). Neste trabalho também é
constatada uma grande variação da expressão do transgene em todos os tratamentos,
mas em todos os casos esta expressão é observada em duas ou mais regiões do cérebro.
A utilização do sulfato de zinco nas condições apresentadas não parece ter aumentado a
expressão de EGFP no cérebro como um todo.
A via nasal oferece uma série de mecanismos para a absorção e biodistribuição
de moléculas terapêuticas. Neste estudo não conseguidos identificar qual mecanismo
usado pelo pREGFP para atingir o cérebro. Outros estudos indicam fortemente que um
plasmídeo administrado na cavidade nasal possa chegar até o encéfalo pelo bulbo
olfatório (Han et al., 2007), mas não precisam se o vetor entrou pela via intracelular,
utilizando o transporte retrógrado (revisado por Hans et al., 2004), ou pela via
paracelular.
Uma série de trabalhos mostra que a via nasal também pode ser usada como via
sistêmica, já que moléculas terapêuticas administradas por ela podem alcançar
rapidamente a corrente sanguínea com grau muito pequeno de degradação (revisado por
Davis et al., 2003). Não descartamos a hipótese de que o pREGFP possa ter atingido o
cérebro após entrar na corrente sanguínea.
No presente estudo não foi possível detectar o tipo celular transfectado, por isso
não podemos afirmar, com base em nossos resultados, se o tratamento de doenças
53
neurodegenerativas podem ser realizado por esta via. Também não conseguimos fazer
uma avaliação precisa da eficiência dos tratamentos empregados, mas nossos resultados
apontam que doenças metabólicas que afetem o encéfalo podem ser tratadas, pois basta
que uma pequena parcela da atividade enzimática seja estabelecida para que os sintomas
sejam amenizados (Camassola et al., 2005).
Mais estudos com o objetivo de padronizar qual a melhor quantidade de vetor a
ser utilizada, o volume e concentração mais adequando da solução com o vetor para ser
administrada e comparar a eficiência de outros compostos que podem ser associados ao
vetor são de suma importância para a elaboração de um protocolo clínico.
Em conclusão, nossos dados parecem muito animadores, pois mostram
claramente que o gene repórter utilizado é capaz de atingir o encéfalo e gerar uma
proteína funcional, expressa por um período igual ou maior que 8 semanas. A nossa
maior dificuldade foi mensurar esta expressão de maneira mais precisa. A
imunohistoquímica fornece informações importantes, pois a presença de células EGFP-
positivas no cérebro confirma a expressão da proteína funcional. A quantificação da
transfecção e expressão gênica, por outro lado, pode ser mais adequadamente realizada
por RT-PCR em tempo real, que está sendo padronizado para complementar a análise.
Esta informação deverá confirmar e precisar o grau de transfecção e expressão gênica
obtida por administração intranasal do DNA plasmidial.
54
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