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Márcio Oliveira Penna de Carvalho
Estudo da recuperação da função locomotora e
histomorfométrico da lesão medular em ratos:
efeitos da metilprednisolona e do gangliosídeo G(M1)
Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Área de concentração: Ortopedia e Traumatologia
Orientador: Prof. Dr. Tarcísio Eloy Pessoa de Barros Filho
São Paulo
2007
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Márcio Oliveira Penna de Carvalho
Estudo da recuperação da função locomotora e
histomorfométrico da lesão medular em ratos:
efeitos da metilprednisolona e do gangliosídeo G(M1)
Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Área de concentração: Ortopedia e Traumatologia
Orientador: Prof. Dr. Tarcísio Eloy Pessoa de Barros Filho
São Paulo
2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Carvalho, Márcio Oliveira Penna de
Estudo da recuperação da função locomotora e histomorfométrico da lesão
medular em ratos : efeitos da metilprednisolona e do gangliosídeo G(M1) / Márcio
Oliveira Penna de Carvalho. -- São Paulo, 2007.
Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Ortopedia e Traumatologia.
Área de concentração: Ortopedia e Traumatologia.
Orientador: Tarcisio Eloy Pessoa de Barros Filho.
Descritores: 1.Ratos Wistar 2.Traumatismos da medula espinal 3.Medula
espinal/anatomia & histologia 4.Atividade motora 5.Metilprednisolona
6.Gangliosídeo G(M1)
USP/FM/SBD-447/07
Dedicatória
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
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Aos meus pais, Carlos e Márcia Penna de Carvalho, pelo amor, apoio e
estrutura que me deram para realizar tudo em minha vida, a eles devo tudo o que sou
e conquistei até hoje.
À Carla Penna de Carvalho, irmã querida, que mesmo distante me apoiou e
incentivou em todos os momentos de minha vida.
À minha filha, Maria Eduarda Penna de Carvalho, que mesmo com a
distância me dá forças para continuar sempre..., e pelas tantas vezes que deixei de
brincar e de compartilhar momentos de alegria.
Ao meu avô, Agenor Porto Penna de Carvalho, que ensinou seus filhos e
netos a viverem com dignidade, respeito e honestidade, e por toda a influência direta
ou indireta em minha formação como pessoa e como profissional.
À Carolina Fonseca Marques, companheira de sempre e de todas as horas,
dedicação, amor e carinho.
Ao amigo eterno em meu coração, Vinícius Estrela Leão, que juntos
galgamos e trilhamos os primeiros passos no mundo da Ortopedia... para sempre em
minhas lembranças...
Agradecimentos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
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Ao Professor Doutor Tarcísio Eloy Pessoa de Barros Filho, Professor Titular
do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo, pela confiança e pelo incentivo no desenvolvimento do
conhecimento científico.
Ao amigo, Professor e sócio Doutor Marcos Antônio Tebet, maior
incentivador na realização deste trabalho, pela paciência e sapiência com que me
trilhou em todos os caminhos profissionais, desde a formação ortopédica, à cirurgia
da coluna e à esse momento.
Ao amigo, Professor e sócio Doutor Wagner Pasqualini, pelo apoio e estímulo
no aprimoramento contínuo na cirurgia da coluna vertebral.
Ao Doutor Itibagi Rocha Machado, chefe da Residência Médica do Instituto
Jundiaiense de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina de Jundiaí,
competência na formação profissional, agradeço pelos ensinamentos e minha
formação Ortopédica.
Aos doutores Marcelo de Azevedo e Souza Munhoz, Sidnei Satoshi
Murayama, Renato de Moraes, Cleber Ferreira Moreira, Eduardo Gomes Machado,
Helton Hiroshi Hirata, Ricardo Ezidio de Andrade Bandeira, Lincoln Hiroiti
Kamimura, Luciana de Fatima Miquelin e Carlos Alberto Moreira Kopke,
preceptores da Residência Médica do Instituto Jundiaiense de Ortopedia e
Traumatologia da Faculdade de Medicina de Jundiaí.
Agradecimentos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Aos residentes do Instituto Jundiaiense de Ortopedia e Traumatologia da
Faculdade de Medicina de Jundiaí, Rubens Massaru Kanno, Luiz Henrique Silveira
Rodrigues, Maria Fernanda Reis Ribeiro, Juliano Paulo Fratezi, Paulo Pereira Fontes
Martins Filho, tânia mara da silva Gomes, Raul Hernandez Juliato, Luis Henrique
Penteado Gullo, Leandro Nani Pires, Gustavo Martins Fontes, Vinicius Pontes do
Nascimento, Adriano Cachulo Neto, Luis Eduardo Pedigoni Bulisani, Daniel Giner
Roselis, Eder Ferreira Moreira, Ivan Henrique Wahlbrink, Bruno Barbosa Oliveira e
Silva e Daniel Machado, maior incentivo acadêmico.
Ao Professor Doutor Idércio Luiz Sinhorini, professor da pós-graduação do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, pela imensa ajuda e pelo carinho com que me recebeu
em seu Departamento.
Ao Aluno Heidge Fukumasu, pós-graduando do Departamento de Patologia
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo e
ao técnico Cláudio Arroyo do mesmo Departamento, pelo apoio na realização e
avaliação das lâminas histológicas.
À Rosana Moreno Costa e Maria Helena Nunes, secretárias da pós-graduação
do Instituto de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da USP, pela
paciência nestes anos e pela dedicação que realizam seus trabalhos.
Ao amigo e Professor Edson Berbary, que com carinho e satisfação
contribuiu com seus conhecimentos na língua portuguesa.
À secretária doméstica Maria Cacilda Esteves (Brisa do mar), que suportou
minha bagunça nestes anos, sem poder arrumá-la.
Normalização
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Esta dissertação está de acordo com as normas em vigor no momento desta
publicação:
Terminologia Anatômica em Português conforme a terminologia anatômica
internacional da FEDERATIVE COMMITTEE ON ANATOMICAL TERMINOLOGY
- FCAT (COMISSÃO FEDERATIVA DE TERMINOLOGIA ANATÔMICA -
CFTA) aprovada em 1998 e traduzida pela Comissão de Terminologia Anatômica da
Sociedade Brasileira de Anatomia – CTA-SBA. 1. Ed. (Brasileira) São Paulo,
Editora Manole Ltda 2001. 248p.
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. GUIA DE APRESENTAÇÃO DE DISSERTAÇÕES, TESES E
MONOGRAFIAS. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L.
Freddi, Maria Fazanelli Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos
Cardoso, Valéria Vilhena, 2ª Ed. - São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação
– SBD/FMUSP, 2005.
Normalização
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Utilizaram-se a terminologia e as definições estatísticas conforme o GUIA
PARA EXPRESSÃO DA INCERTEZA DE MEDIÇÃO, Segunda Edição Brasileira
do Guide to the Expression of Uncertainty in Measurements (BIPM, IEC, IFCC,
ISSO, IUPAC, IUPAP, OIML, 1983). Edição revisada (Agosto de 1998) – Rio de
Janeiro: ABNT, INMETRO, SBM, 1998.
As abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com LIST OF JOURNALS
INDEXED IN INDEX MEDICUS (1992) e na LILACS – LITERATURA LATINO-
AMERICANA E DO CARIBE EM CIÊNCIAS DA SAÚDE (1995).
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver).
Sumário
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
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Lista de abreviaturas
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 1
2. OBJETIVO ..................................................................................................
9
3. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................... 11
4. MÉTODOS ..................................................................................................
39
4.1 Modelo de lesão medular ..................................................................... 40
4.1.1 Animais de experimentação ......................................................... 41
4.1.2 Procedimento anestésico e cirúrgico ........................................... 42
4.1.3 Contusão medular ........................................................................
43
4.2 Formação dos grupos e tratamento medicamentoso ............................. 45
4.3 Avaliação da função locomotora ......................................................... 46
4.4 Eutanásia e amostras de tecido ............................................................ 46
4.5 Análise histológica e morfométrica ..................................................... 47
4.6 Análise estatística ................................................................................ 50
5. RESULTADOS
............................................................................................. 52
5.1 Função locomotora ................................................................................
53
5.2 Histológicos e morfométricos ............................................................... 57
5.3 Correlação função locomotora e histomorfometria ............................. 80
6. DISCUSSÃO ............................................................................................... 81
7. CONCLUSÕES .......................................................................................... 94
8. ANEXOS ...................................................................................................... 96
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................... 107
Lista de abreviaturas
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ANOVA análise de variância
AMP adenosinamonofosfato
ATP adenosinatrifosfato
ATPase adenosinatrifosfatase
BBB Basso, Beattie e Bresnahan
C celsius
Ca
+2
cálcio
cm centímetro
ECC escore combinado comportamental
Ed. edição
EPO eritropoetina humana recombinante
et al. e outros
EUA Estados Unidos da América do Norte
g gramas
g/cm gramas por centímetro
GM-1 monosialotetraeosilgangliosídeo
GM1 grupo que recebeu GM-1
h hora (s)
HE hematoxilina-eosina
IL-10 interleucina 10
K
+
potássio
Lista de abreviaturas
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
kg quilograma
L vértebra lombar
MASCIS Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study
mg miligramas
mg/kg miligramas por quilogramas
min. minutos
mm milímetros
mm
2
milímetros quadrados
MP metilprednisolona ou grupo que recebeu metilprednisolona
MP+GM1 grupo que recebeu metilprednisolona associado ao GM-1
NASCIS National Acute Spinal Cord Injury Study
NYU New York University
p. página
Prof. Professor
® marca registrada
rev. revista
RNA ácido ribonucléico
SNC sistema nervoso central
T vértebra torácica
x vezes
Resumo
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
RESUMO
Penna de Carvalho MO. Estudo da recuperação da função locomotora e
histomorfométrico da lesão medular em ratos: efeitos da metilprednisolona e do
gangliosídeo G(M1) [dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade
de São Paulo; 2007. 123p.
A metilprednisolona (MP) e o gangliosídeo GM-1 são drogas de uso clínico
estabelecido para o tratamento da lesão medular em humanos, embora sua eficácia e
seus mecanismos de ação ainda não sejam totalmente entendidos. O objetivo do
presente trabalho foi avaliar os resultados da recuperação da função locomotora e
comparar com as alterações histomorfométricas da medula de ratos com lesão
medular medicados com MP; GM-1 e sua associação. A lesão medular foi produzida
pelo sistema New York University
®
em 24 ratos Wistar, divididos em quatro grupos:
controle (n=6), MP (n=6), GM1 (n=6) e MP+GM1 (n=6). A avaliação da
recuperação da função locomotora dos ratos foi realizada utilizando-se a escala de
BBB no 2º, 7º e 14º dias após lesão medular e sacrificados no 14º dia para análise
histológica e morfométrica de área total, área preservada e percentual de área
preservada. Concluímos que a MP e sua associação com o GM-1 mostraram-se
eficazes na recuperação da função locomotora e que todos os ratos medicados
demonstraram melhora no percentual de área preservada superior ao grupo controle.
Os Grupos MP e GM1 foram superiores na preservação de substância branca e o
GM-1 demonstrou efeitos benéficos na preservação de substância cinzenta no centro
da lesão. A substância cinzenta demonstrou ser mais suscetível à lesão que a
substância branca e não houve correlação entre os achados histológicos e a
recuperação da função locomotora.
DESCRITORES: 1.Ratos Wistar 2.Traumatismos da medula espinal 3.Medula
espinal/anatomia & histologia 4.Atividade motora 5.Metilprednisolona
6.Gangliosídeo G(M1)
Summary
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
SUMMARY
Penna de Carvalho MO. Locomotor function recovering and histomorphometric
study of spinal cord injury in the rat: effects of methylprednisolone and ganglioside
G(M1) [dissertation]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo; 2007. 123p.
The methylprednisolone and the GM-1 ganglioside are drugs with established
clinical usage for the treatment of spinal cord injury in human; however its efficiency
and its active mechanisms are not completely understood yet. The objective of the
present paper has been to evaluate the results from the neurological function
recovering and to compare these with the histomorphometric alterations in rats with
spinal cord injury, prescribed with methylprednisolone; GM-1 and its association.
The spinal cord injury has been done by the New York University system
®
in 24
Wistar rats which were assigned to one of four groups: control (n=6), MP (n=6),
GM1 (n=6) and MP+GM1 (n=6). The evaluation of the neurological function
outcome has been carried out using BBB locomotor rating scale on the second,
seventh and fourteenth days after the injury and sacrificed on the fourteenth day for
histological and morphometric analyses of total cross-sectional area, spared area and
percentage of spared area. We concluded that the methylprednisolone and its
association with the GM-1 revealed themselves effective concerning to the
locomotor function recover and that every medicated rat demonstrated an
improvement in the preserved area percentage superior to the control group. The MP
and GM1 Groups were superior in the white matter preservation and the GM-1
demonstrated beneficial effects regarding the gray matter preservation at the injury
epicenter. The gray matter has been more sensitive for damaged than the white
matter and there has not been correlation between the histological findings and the
locomotor function recovering.
DESCRIPTORS: 1.Rats Wistar 2.Spinal cord injuries 3.Spinal
cord/anatomy & histology 4.Motor activity 5.Methylprednisolone
6.Ganglioside G(M1)
1. INTRODUÇÃO
2
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
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A lesão medular é um problema devastador que acomete principalmente
jovens do sexo masculino em idade produtiva. Atinge entre 15 e 40 pessoas por
milhão de habitantes a cada ano e acarreta impacto econômico anual de mais de
quatro bilhões de dólares nos Estados Unidos da América (Burney et al. 1993;
Ducker e Zeidman 1994). No Brasil, a incidência de trauma raquimedular (TRM)
estimada é de 40 novos casos ano/milhão de habitantes, aproximadamente 6 a 8 mil
casos novos por ano e a causa mais freqüente são os ferimentos por arma de fogo
(Barros Filho et al., 1990; Greve, 1997). Causa limitações funcionais físicas e
psicológicas tanto para o paciente e abala a estrutura de toda a família (Young,
1993).
A lesão ao tecido medular ocorre em dois eventos distintos: primário ou
mecânico, decorrente da lesão traumática mecânica aguda que lesa e comprime os
elementos neurais e independe de mecanismos celulares, e secundário ou isquêmico
em função de lesões adicionais, devido a uma cascata de eventos que envolvem
edema, alteração da perfusão e do fluxo sanguíneo, fatores de crescimento, influxo
celular de cálcio, peroxidação lipídica e, por fim, necrose tecidual, que são eventos
biológicos desencadeados em decorrência ao trauma inicial (Ducker et al., 1971;
3
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Sandler e Tator, 1976; Anderson et al., 1982; Hall et al., 1984; Faden et al.,
1987; Noble e Wrathall, 1985, 1989; Tator e Fehlings, 1991; Young, 1993).
O primeiro a estudar e assim postular o conceito de lesão medular secundária
foi Allen, em 1911, que desenvolveu a teoria de que agentes nocivos encontrados na
necrose hemorrágica são os agentes bioquímicos responsáveis pelos danos
posteriores. Entretanto esses estudos só foram retomados após cinco décadas para
melhor avaliar os mecanismos fisiopatológicos e biológicos que são atribuídos à
destruição pós–traumática do tecido medular (Balentine, 1978, Tator e Rowed,
1979; Lohse et al., 1980; Young e Flamm, 1982; Blight, 1983; Tator e Fehlings,
1991; Braughler e Hall, 1992; Young, 1993).
O tratamento dos pacientes com lesão da medula espinhal aguda iniciou-se no
período da Segunda Guerra Mundial, na Inglaterra, onde seu sucesso incentivou a
criação de centros de emergência e protocolos para promover prevenção e tratamento
das seqüelas. Com o intuito de melhorar a assistência a esses pacientes, estudos têm
sido realizados (Geisler et al., 1991).
Do ponto de vista médico, existem diferentes tipos de abordagens para o
tratamento desses pacientes: a abordagem cirúrgica, que consiste na descompressão e
estabilização das fraturas associadas (Tator et al. 1999; Legos et al., 2002; La Rosa
et al., 2004); por métodos físicos, como a hipotermia e a terapia com oxigênio
4
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
hiperbárico (Albin e White, 1987; Galvão, 2003); abordagem por terapia biológica,
que consiste na utilização de células embrionárias progenitoras (células-tronco),
fatores genéticos e estimuladores de proliferação celular, como a eritropoetina
recombinante humana e o fator de crescimento insulina-like (Akesson et al., 2001;
McDonald e Howard, 2002; Kaptanoglu et al., 2004; Kimura et al., 2005; Lee et
al., 2005b; Urdzíková et al, 2006; Cízková et al., 2006; Cristante, 2007;
Vitellaro-Zuccarello et al., 2007); e com o uso de agentes farmacológicos, como o
monosialotetraesosilgangliosídeo g(m1) (GM-1), a metilprednisolona (MP), a
naloxona, o tilirazade e a nimodipina (Hall e Braugler, 1982; Cuello et al., 1989;
Geisler et al., 1991; 1993, 2001; Geisler, 1993; Walker e Harris, 1993;
Constantini e Young, 1994; Nash et al., 2002; Lee at al., 2005a; Hung et al.,
2007; Tarasenko et al., 2007).
A metilprednisolona, em altas doses, tem sido utilizada nos estudos
experimentais realizados em ratos e gatos, com melhora na perfusão microvascular,
no metabolismo medular e em medidas histomorfométricas (Anderson et al., 1982;
Constantini e Young, 1994). Postula-se que seus mecanismos de ação sejam a
inibição da peroxidação lipídica, a diminuição da degeneração do axônio, a
prevenção de isquemia e a reversão do acúmulo de cálcio intracelular (Young e
Flamm, 1982; Hall et al., 1984, 2001; Anderson et al., 1982; Constantini e
Young, 1994; Bracken e Holford, 1993). Apesar da maioria dos estudos
experimentais demonstrarem efeito benéfico com a utilização de esteróides, os
mecanismos de ação da MP na medula lesionada ainda não são totalmente
compreendidos (Ducker e Zeidman, 1994).
5
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Ensaios clínicos multicêntricos e controlados, como o National Acute Spinal
Cord Injury Study (NASCIS) I, II e III, realizados a partir de 1979, defendem o uso
da MP dentro das primeiras oito horas após lesão medular traumática na prática
clínica, sendo o primeiro agente farmacológico a demonstrar melhora na recuperação
funcional do trauma medular em humanos (Bracken et al., 1990; Ducker e
Zeidman, 1994; Bracken et al., 1997; Gebrin, 1997b; Gerndt et al., 1997;
Vaccaro e Singh, 1999; Bracken, 2002; Bracken e Holford, 2002; Tsutsumi et
al., 2006). Entretanto, mesmo o uso da MP sendo adotado clinicamente em diversos
centros de tratamento, ainda não é um consenso usado por todos (Lammertse 2004).
Os gangliosídeos são glicolipídeos endógenos derivados do ácido siálico,
presentes na camada externa das membranas do sistema nervoso central (SNC).
Estudos clínicos mostram ação terapêutica significante do gangliosídeo GM-1 na
recuperação neurológica de pacientes vítimas de trauma raquimedular, tanto na fase
aguda como na fase crônica (Gorio, 1988; Geisler at al., 1991, 2001; Walker e
Harris, 1993; Gebrin et al., 1997a).
O GM-1 tem como propriedades farmacológicas a redução do edema
neuronal através do aumento da atividade das bombas Na
+
-K
+
e Mg
++
ATPases;
homeostase das células nervosas pelo restabelecimento do equilíbrio de membrana
(Mahadik et al., 1989; Karpiak et al., 1991) e, principalmente, o aumento de
fatores neurotróficos endógenos (Cuello et al., 1989), que diminuem a perda de
6
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
neurônios após o trauma, aumentando os mecanismos de plasticidade dos circuitos
medulares lesados, potencializando a recuperação de conexões funcionais (Young,
1995).
Os gangliosídeos foram inicialmente utilizados no tratamento de pacientes
com trauma crânio-encefálico e lesões diversas do sistema nervoso central. Nos
últimos anos, têm sido utilizados no tratamento do trauma medular agudo, sendo
estudado por diversos autores, porém sua eficácia na recuperação de função
neurológica ainda é controversa (Gebrin et al., 1997a, 1997b; Geisler et al. 1991,
1993a, 1993b, 2001)
Modelos experimentais de lesão medular aguda são fundamentais para o
estudo de drogas utilizadas na prática clínica (Means et al., 1981; Constantini e
Young, 1994; Basso et al., 1996). Um modelo experimental deve produzir uma
lesão no sistema nervoso central consistente e com pouca variabilidade (Bresnahan
et al., 1987; Gruner, 1992). No entanto esta lesão deve apresentar resultados
anatômicos e de recuperação motora e funcional reprodutível (Basso et al., 1996).
Rodrigues (1999) reproduz e padroniza a lesão medular utilizando o New
York University (NYU) Spinal Cord Contusion System
®
, que reproduz lesão
medular por compressão em animais de pequeno porte no Instituto de Ortopedia e
Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
7
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
de São Paulo. Isto nos possibilita estudar em laboratório, de maneira padronizada, a
lesão medular sempre com resultados idênticos, o que permite a análise controlada
do uso de fármacos neuroprotetores.
O conhecimento das alterações histológicas e fisiopatológicas da lesão
medular secundária através de estudos experimentais permite o desenvolvimento e o
estudo de drogas que atuem diretamente impedindo a cascata bioquímica, que
culmina com o aumento da lesão inicial. Várias drogas são estudadas no âmbito
experimental e na prática clínica, em que as duas drogas de uso estabelecido e
reconhecido em humanos são a MP e o GM-1. Entretanto o mecanismo de ação e a
eficácia dessas drogas ainda não são totalmente entendidos e ainda não formam
consenso na prática clínica (Taoka e Okajima, 1998, 2000).
Na última década, estudos de análise morfométrica da lesão medular com
coloração específica para tecido nervoso têm sido realizados com o objetivo de
avaliar o efeito de drogas sobre a medula e sobre a função neurológica, entretanto
com resultados divergentes, deixando dúvidas, tanto do efeito das drogas, quanto da
correlação das alterações histomorfométrica com a função neurológica (Blight,
1983; Behrmann et al., 1992; Delamarter et al., 1995; Basso et al., 1996;
Rabchevsky et al., 2002; Takami et al., 2002).
8
Introdução
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Tebet e colaboradores têm estudado em nosso meio os efeitos da MP, do
GM-1 e sua associação na recuperação da função locomotora e nas alterações
histológicas da lesão medular em ratos, utilizando-se da coloração com hematoxilina-
eosina (HE) (Tebet, 2002; Tebet et al., 2003). Obtêm resultados, do ponto de vista
histológico, divergentes ao encontrado na literatura (Constantini e Young, 1994) e
constatam que a metodologia de seu estudo histológico foi insuficiente, sugerindo a
realização de outros estudos com metodologia histológica mais adequada.
Esses estudos têm observado também que os resultados histológicos não são
comparáveis aos da recuperação funcional, suscitando a questão se, com o estudo
histológico adequado, essa comparação não seria positiva. Dessa forma, faz-se
necessário dar continuidade aos estudos de Tebet e seus colaboradores e de realizar
estudo histológico com coloração específica para tecido nervoso, onde os métodos de
coloração de azul rápido de luxol e violeta de cresyl têm sido utilizados com êxito na
literatura (Noble e Wrathall, 1985; Bresnahan et al., 1987; Behrmann et al.,
1992; Basso et al., 1995; Delamarter et al., 1995)
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
2. OBJETIVO
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Objetivo
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O objetivo deste estudo foi avaliar os resultados da recuperação da função
locomotora e comparar com as alterações histomorfométricas da medula de ratos
com lesão medular medicados com metilprednisolona, GM-1 e sua associação.
3. REVISÃO DA LITERATURA
12
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
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3
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Allen (1911) desenvolve um modelo experimental para produzir lesão
medular. Utiliza cães com lesão medular causada por queda de peso sobre a medula,
mantendo a dura-máter íntegra. Qualifica a gravidade da lesão como o produto em
gramas pela altura em centímetros, sendo o resultado expresso em g/cm.
Ducker et al. (1971) realizam estudo experimental em 32 macacos Rhesius.
Fazem laminectomia da transição torácica e lombar (T12 - L1) e produzem lesão
medular por queda livre de um êmbolo colocado a 20 cm de altura. Os grupos são
divididos de acordo com a massa do êmbolo: 10, 15, 20 e 25 g.
Analisam os achados histopatológicos e observam que quanto maior a carga
aplicada, maior a gravidade da lesão medular, sendo a área de necrose também
proporcionalmente maior. Observam haver melhora da função neurológica apesar de
alterações histológicas significativas.
Sandler e Tator (1976) avaliam o fluxo sanguíneo da medula de macacos
com lesão medular provocada pela técnica experimental de compressão com balão
inflável na região extradural, 24 horas após o trauma inicial. Demonstram que ocorre
intensa diminuição do fluxo localizada tanto na substância branca, quanto na
substância cinzenta, e que é observado tanto em posição proximal quanto em posição
13
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
distal em relação ao centro da lesão. Concluem que uma compressão aguda da
medula está associada a longos períodos de isquemia, mesmo após a retirada do fator
compressivo.
Balentine (1978) estuda lesão necrótica da medula de ratos com lesão
medular provocada por queda de peso. Avalia as alterações histológicas, pela
coloração com hematoxilina-eosina, dos vasos sanguíneos e da necrose tecidual da
medula em períodos de tempo de 30 minutos a 1 semana após a lesão. Confirma a
evolução temporal de que a necrose ocorre primeiro na substância cinzenta
principalmente nas primeiras quatro horas e posteriormente na substância branca.
Observa que a necrose isquêmica é resultante da ruptura dos grandes vasos
sanguíneos que ocorrem no momento do impacto.
Tator e Rowed (1979) salientam a importância da lesão medular secundária
após o trauma inicial. Afirmam que raramente uma lesão medular causa transecção
anatômica na medula, embora freqüentemente cause paralisia completa ou
incompleta da função medular.
Descrevem que, inicialmente, pelo exame histológico da medula, são
observados pontos hemorrágicos na substância cinzenta e edema na substância
branca. Semanas após a lesão inicial, é observada a substituição do tecido medular
necrótico por cavidades. Acreditam na hipótese de que o tratamento deve ser
direcionado a fim de impedir o infarto secundário, melhorar a recuperação e citam os
corticosteróides como drogas a serem utilizadas para impedir essa cascata secundária
de lesões após o trauma inicial.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Lohse et al. (1980) realizam estudo experimental em gatos submetidos à
lesão medular aplicando-se forças de 100 g/cm ou 260 g/cm para avaliar o fluxo
sangüíneo na medula medido pelo método de clearance de hidrogênio antes e após a
lesão.
Observam, após o trauma, aumento da pressão sangüínea (137%) e arritmia
cardíaca em todos os grupos. Demonstram que, no grupo com trauma de 100 g/cm,
não foi observada diferença significante quanto ao fluxo sangüíneo, enquanto, no
grupo com trauma de 260 g/cm, houve aumento do fluxo sangüíneo nas seis horas
posteriores ao trauma.
Anderson et al. (1982) utilizam 76 gatos submetidos à lesão medular
produzida por compressão contínua com peso de 170 g durante 5 minutos com o
objetivo de avaliar o efeito do uso da MP na perfusão microvascular e no
metabolismo da medula lesionada através do uso de carbono coloidal. Observam que
o grupo tratado com dose 15 mg/kg/24h de MP apresenta preservação da
microcirculação e afirmam também que essa dosagem propicia ao tecido o substrato
e o oxigênio necessários para manter um estado energético suficiente.
Hall e Braughler (1982) examinam a habilidade de altas doses de MP,
administradas em dose única intravascular, em diminuir a peroxidação lipídica e
aumentar a atividade da bomba sódio, potássio e ATPase. Realizam estudo
experimental em ratos e avaliam os efeitos dessa droga em diversas doses. Concluem
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
que, em doses únicas de 15 a 30 mg/kg, a MP é eficaz na prevenção destes efeitos e
que doses suplementares apresentam efeito contrário.
Young e Flamm (1982) realizam estudo experimental em gatos com lesão
medular contusa. Avaliam o efeito da metilprednisolona em altas doses quanto à
melhora do fluxo sanguíneo, da concentração de cálcio extracelular e do potencial
evocado somato-sensitivo. Concluem que altas doses de MP promove dilatação dos
vasos e melhora do fluxo sanguíneo, explicando seus efeitos benéficos na
recuperação funcional.
Blight (1983) descreve método sistemático para mapeamento e contagem de
axônios mielinizados em estudo neuropatológico. Documenta as alterações
morfológicas crônicas da medula de gatos lesionada por método de queda de peso.
Observa, nestas lesões, a redução intensa do número de axônios, eliminação seletiva
de fibras nervosas e a desmielinização. Salienta que um desses achados ou a sua
combinação pode ser responsável pela paralisia crônica nos animais e demonstra
correlação entre os achados morfológicos e a função neurológica.
Hall et al. (1984) estudam o fluxo sangüíneo medular em 25 gatos adultos
submetidos à contusão medular, padronizada ao nível de L3. Após a lesão, realizam
estudo do fluxo sangüíneo em todos os gatos com o tempo de10 minutos, 30
minutos, uma, duas, três e quatro horas após a lesão. Dividem os animais em quatro
grupos: o grupo controle e os que receberam metilprednisolona em doses diferentes
15, 30 e 60 mg/kg. Concluem que o corticóide diminui a isquemia medular pós-
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
traumática, quando administrado na dose de 30 mg/kg, dentro das primeiras horas
após do trauma, mas não reverte a isquemia, quando esta já ocorreu.
Noble e Wrathall (1985) avaliam as alterações histopatológicas e funcionais
de lesão medular em ratos provocada pela queda livre de peso de 10g sobre a medula
da altura de 2,5 cm, 5,0 cm, 7,5 cm, 10,0 cm e 17,5 cm ao nível do oitavo segmento
medular torácico. Sugerem, baseados na análise dos resultados, existir uma
correlação significante dos parâmetros morfométricos no centro da lesão (volume da
lesão, extensão da lesão e a área de substância branca e cinzenta lesionada) com a
altura de queda do peso e déficit funcional após 4 semanas de lesão.
Albin e White (1987) analisam os fatores epidemiológicos e as alterações
biológicas do fluxo sanguíneo medular e ressaltam modalidades terapêuticas clínicas
e experimentais desde hipotermia, antagonistas opióides e bloqueadores
adrenérgicos.
Bresnahan et al. (1987) desenvolvem um dispositivo de lesão medular
experimental através de impacto controlado e direcionado eletromecanicamente, que
provoca graus variados de lesão tecidual, para avaliar as alterações anatômicas,
comportamentais e determinar a capacidade do dispositivo de produzir graus de
intensidade de lesão medular consistentes.
A análise dos resultados demonstra correlação significativa das alterações
comportamentais com a intensidade da lesão e com as alterações teciduais.
17
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Concluem que é possível produzir lesão medular intermediária em ratos de forma
consistente e reprodutível.
Faden et al. (1987) demonstram, em estudo experimental de lesão medular
em ratos, que o trauma leva a hidrólise da membrana de fosfolipídeos precocemente,
o que resulta na liberação de ácidos graxos livres. Salientam que essas alterações
contribuem para a lesão medular secundária aoreduzir o fluxo sanguíneo medular
através de resposta inflamatória ao trauma.
Cuello et al. (1989) avaliam os efeitos do fator beta de crescimento neural e
gangliosídeo GM-1 sobre o SNC de ratos submetidos à lesão no córtex cerebral.
Sugerem que o gangliosídeo exógeno pode desencadear respostas tróficas em
neurônios colinérgicos do SNC.
Noble e Wrathall (1989) promovem lesão medular contusa e graduada em
ratos e examinam a relação entre a substância branca residual e o déficit funcional
através do Escore Motor, que é uma modificação do teste de Tarlov e do Escore
Combinado Comportamental (ECC), que varia de zero por cento para o rato normal
até 100% para o rato com paralisia total das patas traseiras, aplicado após cada sessão
de teste.
Observam interrupção na substância cinzenta com o aspecto de cavidades
uma semana após a lesão inicial. A hemorragia é mais evidente entre 15 minutos e 24
horas após a lesão. A presença de áreas contendo cavidades ocorre em todos os
grupos que sofreram lesão após 24 horas.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Demonstram que há substancial correlação entre a substância branca residual
e o déficit funcional medido pelo ECC e que isto é observado após quatro semanas,
quando a lesão está totalmente desenvolvida.
Barros Filho et al. (1990) analisam, em estudo epidemiológico retrospectivo,
428 pacientes com traumatismo da coluna vertebral atendidos no período de 1982 a
1987. Atestam que a região cervical é a mais freqüentemente acometida. Citam,
como fatores causais mais comuns, os ferimentos por projéteis de armas de fogo
(36,7%), seguidos dos acidentes de trânsito e mergulho em água rasa. Chamam a
atenção para o dado que mais de 50% dos pacientes foram atendidos em até 24 horas
após o trauma.
Bracken et al. (1990) realizam ensaio clínico duplo-cego, placebo-
controlado, randomizado com o objetivo de avaliar a eficácia e a segurança do uso da
MP e da naloxone em pacientes com trauma medular agudo. Concluem que o uso da
MP em altas doses promove recuperação neurológica quando administrada dentro
das oito primeiras horas do trauma, não sendo observado o mesmo com o uso da
naloxone.
Geisler et al. (1991) apresentam estudo prospectivo, randomizado, duplo–
cego, placebo controlado do gangliosídeo GM-1 em 37 pacientes com trauma
medular agudo comparados com grupo controle. Evidenciam a existência da melhora
da recuperação da função motora após um ano nos pacientes que receberam GM-1.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Tator e Fehlings (1991) revisam os conceitos das principais causas de lesão
medular secundária com ênfase especial no mecanismo vascular.
Apresentam evidências da teoria de que a lesão secundária é causada pelo
mecanismo-chave de isquemia pós-traumática e infarto, através de diferentes
métodos angiográficos para avaliar a microcirculação e para medir o fluxo sanguíneo
medular.
Descrevem as alterações histológicas na medula lesionada incluindo
hemorragia, edema, necrose axonal e neuronal, desmielinização, formação cística e o
infarto. Documentam que a hemorragia observada imediatamente após o trauma
agudo está associada a zonas isquêmicas na substância branca. Discutem os vários
métodos de tratamento sobre os efeitos vasculares da lesão medular aguda como os
bloqueadores dos canais de cálcio, antagonistas opióides e os esteróides. Apresentam
evidências de que a isquemia pós-traumática é um mecanismo secundário importante
da lesão medular e que pode ser contido com o uso de corticóides.
Behrmann et al. (1992) apresentam um novo método para produzir lesão
medular em ratos através de deslocamento breve da superfície dural com vários graus
de deslocamento até a secção completa. Realizam análise histomorfométrica e da
função locomotora pela modificação da escala de Tarlov, observando a marcha dos
animais em campo aberto, em plano inclinado e em grade.
Demonstram haver recuperação funcional nos animais que sofreram contusão
medular com lesão parcial quando comparados com os do grupo que foi submetido à
secção. Concluem que a área de lesão e a área de substância branca residual íntegra
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
são os melhores indicadores morfológicos da recuperação funcional, tendo relação
direta com a intensidade do trauma.
Gruner (1992) apresenta um novo modelo de aparelho monitorado para
realizar lesão contusa na medula de ratos em estudo experimental, o sistema New
York University
®
(NYU). Salienta que esse aparelho é uma alternativa melhor aos
modelos anteriormente descritos na literatura, pois permite obter medidas da
velocidade de impacto e da quantidade de contusão medular, produzindo lesão
controlada e reprodutível.
Hall (1992) revisa o conhecimento a respeito da ação neuroprotetora da MP
na lesão medular, incluindo o mecanismo de ação, dose requerida e tempo de ação.
Relata que um regime intensivo de MP em altas doses tem melhorado a recuperação
funcional de pacientes e de animais de laboratório. Ressalta que a ação
neuroprotetora da MP envolve a capacidade de inibir os radicais livres de oxigênio
induzidos pela peroxidação lipídica e aponta questões não resolvidas incluindo a
janela terapêutica, a duração do tratamento e a combinação racional com novos
agentes neuroprotetores a fim de diminuir os efeitos colaterais do seu uso em altas
doses.
Bracken e Holford (1993) publicam artigo com os resultados observados no
National Acute Spinal Cord Injury Study (NASCIS). Relatam que o NASCIS 1
(1977) conduziu estudo randomizado e controlado das terapias que podem melhorar
a lesão medular e o NASCIS 2 comparou o uso de altas doses de MP ou nalaxone ao
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
placebo e reportou que pacientes que iniciaram tratamento dentro das primeiras oito
horas tiveram melhora significante da função motora com seis semanas, seis meses e
um ano após a lesão.
Afirmam que a MP, aplicada precocemente após lesão medular, melhora a
função motora de pacientes diagnosticados inicialmente com lesão completa e
incompleta, e. que o tratamento tardio com a MP está associado à diminuição da
recuperação neurológica e que essa análise suporta seu uso em altas doses para o
tratamento das lesões medulares no trauma raquimedular agudo.
Burney et al. (1993) salientam a importância de programas de prevenção dos
acidentes e de atendimento local primário às vítimas com lesão medular aguda ao
apresentarem os resultados de estudo epidemiológico de pacientes que deram entrada
nos maiores centros de trauma dos EUA. Reportam que as causas mais comuns de
lesão medular são acidentes com veículos motorizados, quedas de altura e ferimentos
por projéteis de arma de fogo. Constatam que 80% dos pacientes são
politraumatizados, sendo o local anatômico mais freqüente de lesão a coluna cervical
(65% dos casos).
Geisler (1993) acredita que o tratamento com drogas melhore a restauração
da função motora em pacientes que sofrem lesão medular. Relata que estudos
recentes com o uso do GM-1 demonstram melhora da recuperação da função
neurológica um ano após o início do tratamento. Salienta que os pacientes que
receberam dose em bolo do GM-1 e de MP apresentaram melhora funcional, quando
avaliados pela escala de FRANKEL, e que a recuperação da função do membro
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
inferior é melhor do que com o uso de placebo, o que não ocorre nos membros
superiores. Sugere que esse estudo estimule a realização de trabalhos mais amplos
com GM-1 em lesados medulares.
Geisler et al. (1993) resumem os estudos prospectivos, randomizados, duplo-
cego e placebo controlado da associação de MP e do GM-1 no tratamento da lesão
medular aguda e evidenciam os benefícios de seu uso em pacientes com essa lesão.
Walker e Harris (1993) publicam estudo transversal, randomizado duplo
cego em humanos com lesão medular crônica que receberam GM-1 ou placebo.
Observam que aqueles tratados com o gangliosídeo mostraram melhor resultado
funcional em relação àqueles que receberam placebo. Afirmam que o GM-1 é uma
opção terapêutica no tratamento desses pacientes
Young (1993) revisa a literatura sobre a lesão medular secundária, citando
tanto estudos experimentais, quanto estudos clínicos como o NASCIS 2. Critica e
discute também a utilização de novas drogas, além da MP, assim como dosagem,
janela terapêutica e duração do tratamento. Conclui que são necessários mais estudos
com modelos animais reprodutíveis e ressalta que, em modelos animais, a
preservação de números relativamente pequenos de axônios pode suportar
recuperação funcional.
Constantini e Young (1994) comparam os efeitos da MP, do GM-1 e da
associação dessas drogas em lesão medular aguda produzida em ratos. Realizam
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
análise iônica tecidual para estimar o volume da lesão e avaliação histológica com
hematoxilina-eosina. Administram a MP e o GM-1 em várias dosagens 5 minutos e 3
horas após o trauma medular por meio intravenoso.
Estudos clínicos mostram que a MP melhora a recuperação da função
neurológica, quando aplicada em altas doses nas primeiras oito horas após a lesão
inicial, e que o gangliosídeo GM-1 melhora a recuperação da função motora, quando
iniciado 48 a 72 horas após a lesão medular e após o tratamento com baixas doses de
MP. No entanto os efeitos da combinação de MP e GM-1 não têm sido estudados em
modelos animais.
Concluem que o GM-1 antagoniza os efeitos benéficos da MP em ratos com
lesão medular e recomendam que essa associação não deve ser usada para tratar lesão
medular aguda em humanos até que sejam mais estudados.
Ducker e Zeidman (1994) revisam baseados em evidência o papel do uso de
corticosteróide na lesão medular. Criticam os estudos publicados, fornecem
recomendação ao seu uso e suas complicações e avaliam objetivamente os resultados
do NASCIS 1 e 2. Apesar das controvérsias, defendem o uso do corticóide o mais
cedo possível após trauma raquimedular agudo e determinam não haver benefícios
após oito horas do trauma.
Basso et al. (1995) afirmam que a avaliação da função locomotora após lesão
medular experimental é importante para avaliar a eficácia terapêutica de drogas.
Apresentam escala de índice de recuperação locomotora em ratos que sofreram lesão
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
medular produzida em laboratório e a denominam escala de BBB (Basso, Beattie e
Bresnahan). Demonstram que essa escala é eficiente, ampla e não ambígua.
Concluem que é uma medida válida e previsível da recuperação funcional,
sendo capaz de distinguir resultados comportamentais em diferentes tipos de lesões e
predizer alterações anatômicas, como a preservação de substância branca no centro
da lesão.
Delamarter et al. (1995) realizam estudo em modelo animal com a utilização
de lesão medular com compressão de 50% do diâmetro da medula. Avaliam a
duração da compressão e o tempo de descompressão e a relação com a recuperação
funcional.
Utilizam, para avaliação dos resultados, potencial evocado somato-sensitivo,
exame neurológico e estudo histopatológico. Observam relação direta do tempo de
compressão com os achados histológicos, neurofisiológicos e com a recuperação da
função locomotora.
Basso et al. (1996) avaliam as alterações anatômicas e funcionais de ratos
submetidos à lesão medular contusa produzida pelos dispositivo NYU. Realizam
avaliação da função locomotora pela escala de BBB e estudo histológico do centro da
lesão, avaliando o percentual de área de tecido preservado.
Afirmam que a escala de BBB é suficiente para discriminar diferenças
locomotoras significativas entre os vários graus de lesão e confirmam que a maior
quantidade de tecido poupado está diretamente relacionada com a melhora da função
locomotora.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gebrin et al. (1997a) revisam os avanços clínicos e científicos existentes
sobre a manipulação farmacológica no tratamento em pacientes com déficit
neurológico causado por lesão medular. Descrevem as principais substâncias
endógenas que participam do dano medular secundário e as drogas em estudo para
combater esse efeito. Indicam a MP como a primeira droga a demonstrar melhora
funcional comprovada e citam as pesquisas promissoras com aminoesteróidese e
outras drogas como o tilirazade e o GM-1. Por fim, ressaltam a grande importância e
contribuição dos estudos multicêntricos NASCIS 1, 2 e 3, desenvolvidos na América
do Norte.
Gebrin et al. (1997b) publicam artigo de revisão da literatura discutindo as
perspectivas de recuperação do paciente com lesão medular. Relatam os resultados
do NASCIS, que apontam a MP como droga que melhora a função neurológica e
citam o GM-1 como sendo uma substância eficiente na recuperação de pacientes com
lesões crônicas do SNC.
Afirmam que trabalhos experimentais demonstram que axônios íntegros,
mesmo que poucos, podem propiciar integridade de arco reflexos viscerais, como
vesical, sexual e intestinal; e que 10% de axônios remanescentes podem oferecer
condições de marcha para o paciente.
Gerndt et al. (1997) revisam retrospectivamente, com controle histórico,
todos os pacientes com lesão medular aguda atendidos dentro de 8 horas do trauma e
que receberam altas doses de corticosteróide segundo o protocolo NASCIS 2 de
maio de 1990 a abril de 1994.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Comparam os resultados e os parâmetros demográficos com o grupo de
pacientes admitidos de março de 1986 a dezembro de 1993, também com lesão
medular aguda e que não receberam terapia com corticóide.
Afirmam que o uso do corticóide associa-se com o aumento de 2,6 vezes a
incidência de pneumonia e o aumento dos dias de cuidados intensivos. Entretanto seu
uso está associado com a diminuição do tempo de reabilitação e não tem nenhum
impacto significante em outros parâmetros, inclusive na mortalidade.
Kuhn e Wrathall (1998) afirmam que, em experimentos de lesão medular,
modelos de ratos desenvolvidos em laboratórios por mutações de engenharia
genética podem aumentar o conhecimento básico dos mecanismos envolvidos na
lesão e na sua recuperação funcional. Investigam se os métodos utilizados para
realizar lesão medular e para avaliar a recuperação funcional locomotora podem ser
modificados pela utilização de ratos produzidos geneticamente em laboratório.
Concluem que esse novo modelo de rato e de contusão do SNC pode ser um caminho
para estudos in vivo.
Rodrigues (1999) padroniza modelo de lesão de medula espinhal em ratos
Wistar e utiliza equipamento computadorizado para impacto por queda de peso, o
sistema NYU, de acordo com parâmetros determinados pelo Multicenter Animal
Spinal Cord Injury Study – MASCIS. Verifica a existência de correlação
estatisticamente significante entre o volume de lesão e os parâmetros mecânicos.
Conclui que o modelo é capaz de gerar lesões medulares padronizadas e
reprodutíveis.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Tator et al. (1999) realizam estudo retrospectivo e multicêntrico em 36
centros de atendimento nos EUA para avaliar o uso do tratamento cirúrgico e o
tempo em que a intervenção deve ser realizada em pacientes com lesão medular
aguda. Os dados indicam que, apesar da cirurgia ser realizada comumente, um terço
dos casos é conduzido de forma conservadora e que o momento adequado de sua
utilização ainda não foi totalmente estabelecido.
Vaccaro e Singh (1999) realizam revisão da literatura com o objetivo de
avaliar a eficácia do tratamento farmacológico e o momento ideal para a intervenção
cirúrgica.
Ressaltam que o tratamento farmacológico visa diminuir os efeitos dos
mediadores inflamatórios produzidos na lesão medular. Comprovam que há
benefícios com o uso de MP nas primeiras oito horas após a lesão medular e que o
corticóide aumenta a recuperação neurológica entre seis semanas e seis meses após o
trauma. Documentam que sua administração após oito horas do trauma provoca piora
neurológica, porque atrapalha as reações inflamatórias que são vitais para a
regeneração da célula nervosa.
Yoon et al. (1999) determinam a janela terapêutica do tratamento com MP
em ratos com lesão medular. Estudam a administração de dose predeterminada de 30
mg/kg em diferentes tempos após lesão provocada pelo sistema NYU (10, 30, 120,
150 e 240 min.) e comparam com medidas estimadas do volume da lesão através da
bomba de Na
+
e K
+
24 horas após.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
A dose única de MP após 10 minutos reduz significativamente o volume da
lesão e qualquer outro tratamento iniciado após 30 minutos não tem efeito no volume
da lesão ao comparar com o grupo controle e até podem, em alguns casos, aumentar
o volume da lesão. Sugerem que o sistema de lesão medular com o NYU tem janela
terapêutica curta.
Metz et al. (2000) preocupam-se em verificar se os resultados de estudos de
modelos em ratos com lesão medular são aplicáveis em humanos. Para isso,
comparam parâmetros funcionais, eletrofisiológicos e morfológicos seguidos de
lesão medular em ratos e em humanos e sugerem haver uma relação análoga entre
eles. Concluem que as técnicas para avaliação da extensão e gravidade da lesão do
SNC em ratos e humanos são de valores comparáveis e indicam que o rato pode
servir como um animal adequado para pesquisa de alterações morfológicas e
funcionais e para avaliação dos efeitos de novas estratégias terapêuticas.
Short et al. (2000) realizam revisão sistemática da literatura com o fim de
avaliar o efeito do uso de altas doses de MP na melhora da função neurológica após
lesão medular aguda. Evidenciam, nesta revisão, que não há suporte para seu uso
com o intuito de recuperação neurológica e que seu efeito deletério, tanto na
morbidade quanto na mortalidade precoce, não pode ser excluído.
Akesson et al. (2001) concluem que o transplante de células embrionárias de
tecido medular humano para cavitação de medulas lesionadas de ratos resulta em
efeitos morfológicos benéficos tanto em lesões crônicas como em agudas.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Geisler et al. (2001) publicam estudo clínico multicêntrico randomizado,
duplo-cego e seqüencial para determinar a eficácia e a segurança do uso de duas
doses de GM-1 em pacientes com lesão medular aguda e comparam com o grupo
placebo. Ressaltam que, embora não ocorra eficácia primária do GM-1 nessa análise,
parece haver benefícios em seu uso em pacientes com lesão medular grave.
Hall (2001) demonstra que a maioria das lesões medulares não são lesões
completas e que parte da substância branca permanece íntegra. Salienta que a
recuperação neurológica depende da preservação das estruturas que permaneceram
íntegras após o trauma, principalmente axônios descendentes e ascendentes da
substância branca e de sua mielinização normal.
Discute que as estratégias farmacológicas enfocam o controle do processo de
lesão secundária, primariamente a peroxidação lipídica e a manutenção do máximo
de substância branca remanescente possível e afirma que a MP é a única droga que
em altas doses melhora a função neurológica em animais e que essas estratégias de
neuroproteção vão ser eventualmente seguidas por agentes restauradores que
estimulam a plasticidade dos tratos sobreviventes como transplantes celulares e
técnicas de terapia genética.
Bracken (2002) revisa artigos randomizados sobre o uso de esteróides no
trauma raquimedular agudo. Utiliza como critérios de seleção todos os estudos
controlados randomizados publicados e não publicados sobre o tema em todas as
línguas. Conclui que a terapia com MP em altas doses é o único tratamento
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
farmacológico que demonstra eficácia em estudos randomizados fase três, quando
administrado dentro das oito primeiras horas do trauma. Um estudo indica benefício
adicional por estender o tratamento por 24 a 48 horas, se o tratamento se inicia entre
três e oito horas do trauma. Ressalta também a necessidade de novos estudos
randomizados para avaliar outros protocolos diferentes do uso da MP.
Legos et al. (2002) realizam revisão da literatura sobre o tratamento não
cirúrgico de pacientes com trauma medular. Enfatizam a importância do tratamento
da lesão celular secundária e que o tratamento farmacológico sozinho é capaz de
promover recuperação neurológica e facilitar regeneração futura.
Nash et al. (2002) avaliam a eficácia do uso de células embrionárias e da MP
em promover recuperação neurológica e regeneração axonal em medulas lesionadas.
Realizam estudo experimental em ratos com lesão medular após 6 semanas de
trauma. Concluem que células embrionárias são capazes de promover regeneração
axonal e que o uso da MP em conjunto potencializa seu efeito.
McDonald e Howard (2002) revisam os estudos de seu grupo sobre a
capacidade de células-tronco embrionárias de promover a remielinização e restaurar
as funções neurológicas primária em roedores. Afirmam que essas células são
capazes de se diferenciar em oligodendrócitos e mielinizar os axônios do
hospedeiro tanto in vivo quanto in vitro, assim como de melhorar a função neuronal
de ratos.
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Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Rabchevsky et al. (2002) realizam estudo experimental de lesão medular em
ratos com o objetivo de avaliar a preservação de tecido, o volume da lesão, assim
como a recuperação funcional a longo prazo.
Avaliam a função locomotora pelo teste de BBB e produzem lesão medular
utilizando-se do sistema NYU. Utilizam 80 ratos divididos em dois grandes grupos,
um administrado MP e outro apenas soro fisiológico por 24 horas, iniciando-se 5
minutos após a lesão.
Observaram que o volume da lesão é extremamente dinâmico, o qual após 6
semanas reduz a um terço do aferido na primeira semana. Afirmam que não há
diferença entre os grupos ao se avaliar a área de preservação e percentual de
preservação da substância branca e cinzenta e que a MP falhou em mostrar melhora
na avaliação da recuperação funcional.
Takami et al. (2002) avaliam o efeito da MP e da interleucina-10 (IL-10)
isoladamente e combinada na recuperação funcional, preservação axonal e lesão
tecidual da medula de ratos com trauma medular. Demonstram preservação tecidual
e diminuição do volume de lesão, principalmente na substância cinzenta, como uso
da MP isolada e da sua combinação com IL-10, o que não ocorre com o uso isolado
da IL-10. Concluem que nenhum dos tratamentos melhorou a preservação axonal ou
a recuperação funcional.
Tebet (2002) realiza estudo experimental de lesão medular em ratos e avalia
os efeitos farmacológicos da MP e do GM-1 e sua associação através de testes
funcionais e análise histológica.
32
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Produz lesão medular pelo sistema NYU, avalia a recuperação da função
neurológica pelo teste de BBB e analisa os achados histológicos utilizando-se do
método de coloração hematoxilina-eosina.
Conclui que não há correlação entre os achados histológicos e o resultado da
recuperação locomotora. Os ratos que receberam MP isolada obtiveram os melhores
resultados funcionais e o grupo que recebeu a associação das drogas teve o melhor
resultado histológico.
Vialle et al. (2002) testam um modelo de escala de avaliação locomotora para
a lesão medular experimental e propõem um protocolo. Utilizam dois grupos de 10
ratos. O primeiro é submetido à lesão medular após laminectomia ao nível de T9 a
T10 pelo sistema NYU, estabelecendo peso de 10 g e altura de 25 mm. O segundo
grupo, destinado a controle, sofreu apenas laminectomia preservando o saco dural.
Realizam avaliação motora dos animais no sétimo, 14
º
e 21
º
dia após a lesão medular,
realizando-se seis testes. Afirmam que o modelo de avaliação testado é eficaz e
quantifica de maneira satisfatória a recuperação das funções motoras em três dos seis
testes.
Tebet et al. (2003) realizam estudo experimental em ratos com lesão medular
para avaliar os efeitos da metilprednisolona na recuperação da função locomotora e
nas alterações histológicas.
Utilizam o método de coloração de HE para o estudo histológico e utilizam o
teste de BBB para a avaliação da função locomotora. Observam que a
33
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
metilprednisolona apresentou-se eficaz na recuperação da função, não sendo possível
compará-la aos achados histológicos.
Kaptanoglu et al. (2004) investigam a eficácia da eritropoetina humana
recombinante (EPO) em atenuar a severidade do trauma medular experimental.
Comparam o uso de diversas doses de EPO com 30 mg/kg de MP em dose única
intraperitoneal. Demonstram que a EPO apresenta efeitos benéficos na avaliação
bioquímica e ultra-estrutural da medula lesionada de ratos.
La Rosa et al. (2004) realizam revisão da literatura clínica em lesão medular
com ênfase no papel da cirurgia de descompressão precoce e executam meta-análise
dos resultados. Seus resultados demonstram que 89,7% dos pacientes com déficit
neurológico incompleto obtiveram melhora funcional após descompressão medular
precoce e que estatisticamente a descompressão precoce demonstrou melhores
resultados comparando tanto com o tratamento conservador, como a intervenção
cirúrgica tardia.
Lammertse (2004) revisa os maiores ensaios clínicos sobre o tratamento
farmacológico no trauma medular agudo. Afirma que, apesar de os resultados
continuarem controversos, a terapia com MP continua sendo adotada por muitos
clínicos no mundo, e que, se não é um consenso, talvez seja o tratamento padrão.
McCutcheon et al. (2004) comparam o custo hospitalar e o tempo de
hospitalização em pacientes que receberam MP para o tratamento de lesão medular
34
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
aguda e os que não receberam. Documentam que 48% dos 1.227 pacientes
selecionados receberam MP e que o tempo de internação e o custo hospitalar desses
pacientes são significativamente maiores.
Chinnock e Roberts (2005) revisam sistematicamente a literatura com
ensaios clínicos randomizados controlados de pacientes com lesão medular aguda
com grupo de pacientes que receberam gangliosídeo e com grupo controle. Avaliam
a mortalidade, a recuperação da função motora, a melhora da função sensitiva, a
atividade funcional geral, a infecção e outros eventos adversos. Concluem que a
evidência existente não suporta o uso do gangliosídeo com o objetivo de reduzir a
taxa de mortalidade, assim como o de melhora funcional e de qualidade de vida
desses pacientes.
Kimura et al. (2005) realizam estudo experimental em ratos para avaliar a
eficácia do uso de células-tronco embrionárias de tecido neuronal. Afirmam ocorrer a
recuperação funcional com eficácia favorável a sua utilização no trauma medular em
animais
Lee et al. (2005a) avaliam a eficácia da MP na recuperação funcional em
ratos com lesão medular e comparam com os resultados de potencial evocado motor.
Utilizam o teste de BBB para avaliação da função locomotora e afirmam resultados
positivos na melhora funcional dos ratos tratados com a MP.
35
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Lee et al. (2005b) realizam investigação do potencial terapêutico do
transplante de células astrócitos oligodendrócitos-tipo 2 em ratos com lesão medular
aguda. Os testes comportamentais, os estudos morfológicos e eletrofisiológicos
demonstram resultados satisfatórios e afirmam que seu uso pode ter papel importante
na recuperação funcional e na regeneração axonal.
Oliveira (2005) avalia os efeitos do tempo da descompressão medular em 50
ratos e cria modelo experimental de compressão medular com redução de 30% do
diâmetro do canal medular. Realiza descompressão aos 5 minutos, às 24 horas, às 72
horas e sem descompressão até o fim do experimento com quatro semanas. Utiliza o
potencial evocado motor, o teste de BBB e exame anatomopatológico para avaliar a
recuperação neurológica. Observa haver relação entre o potencial da recuperação
neurológica e o tempo de descompressão medular.
Cízková et al. (2006) investigam a capacidade de sobrevivência, migração e
diferenciação de células-tronco humanas mesenquimais transplantadas em ratos não-
imunosuprimidos com lesão medular e seu impacto na recuperação funcional após
injeção endovenosa dessas células. Usam a escala de BBB para avaliação funcional
locomotora semanalmente e análise imunocitoquímica. Confirmam a sobrevivência e
a migração das células no local lesado e indicam que elas podem facilitar a
recuperação funcional pela remielinização da substância branca preservada e/ou pelo
aumento do crescimento axonal.
36
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Marcon (2006) realiza estudo experimental com ratos com lesão medular
para avaliar os efeitos da MP quando administrada previamente à lesão. Utilizam o
teste de BBB para avaliação da função locomotora de 32 ratos por 28 dias divididos
em quatro grupos:.dois grupos receberam as drogas A (placebo) e B
(metilprednisolona) imediatamente após a lesão e dois grupos receberam as mesmas
drogas 4 horas antes da lesão. Conclui que não há diferença entre os grupos e que os
ratos tratados com MP antes da lesão apresentaram número de óbitos
significativamente maior quando comparados aos ratos tratados com a mesma droga
após o trauma.
Molina (2006) produz lesão medular em 30 ratos Wistiar por queda de peso
pelo NYU impactor
®
para avaliar a sensibilidade e a reprodutibilidade da escala
funcional de BBB. Conclui que a escala de BBB nas lesões medulares leves e
moderadas tem reprodutibilidade satisfatória, porém nas lesões moderadas
apresentam sensibilidade insatisfatória e nos traumas leves satisfatória. Nas lesões
graves, tanto a sensibilidade quanto a reprodutibilidade demonstram-se reduzidas.
Tsutsumi et al. (2006) avaliam, ao realizar estudo retrospectivo, a
recuperação da função motora e as complicações precoces em pacientes com lesão
medular cervical aguda após receber altas doses de MP e afirmam que ela deve ser
administrada em todos os pacientes com lesão medular cervical incompleta de acordo
com o protocolo do segundo NASCIS.
37
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Urdzíková et al. (2006) em estudo experimental de lesão medular avaliam o
uso de células-tronco mesenquimais de medula óssea. Avaliam a recuperação da
função locomotora pelo teste de BBB e os parâmetros morfométricos com o uso de
três diferentes populações de células de medula óssea. Demonstram efeito positivo
nos resultados comportamentais e nos achados histopatológicos com o aumento da
preservação de substância branca da medular.
Hung et al. (2007) investigam o papel da transferência do gene produtor de
fator de crescimento insulina-“like” I no trauma medular em quarenta ratos.
Demonstram que seu uso melhora significativamente as características bioquímicas e
a disfunção neurológica e inibe a apoptose.
Tarasenko et al. (2007) estudam a resposta funcional e histológica de ratos
com lesão medular tratados com células-tronco neurais humanas. Realizam o
transplante das células no dia do trauma, três e nove dias após. Observam que as
células sobreviveram três meses apenas nos ratos que receberam o enxerto nove dias
após o trauma. Concluem, pela análise histológica, que ocorre crescimento e
diferenciação de células neuronais e oligodendrócitos no sítio da lesão, além da
melhora da função locomotora.
Vitellaro-Zuccarello et al. (2007) investigam o efeito da administração única
de EPO na preservação de substância branca ventral em ratos com 4 semanas de
lesão medular. Concluem que essa investigação confirma estudos prévios que
demonstram o efeito neuroprotetor da eritropoetina na resposta degenerativa
38
Revisão da Literatura
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
secundária e seu potencial terapêutico para o tratamento de lesão medular aguda,
assim como a preservação de substância branca ventral, a qual contém tratos motores
descendentes, podendo ser crítico para a limitação do déficit funcional.
4. MÉTODOS
40
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
4 - MÉTODOS
O protocolo de pesquisa deste estudo foi avaliado e aprovado pela Comissão
Científica do Departamento de Ortopedia e Traumatologia e pela Comissão de
Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo.
A produção das lesões e a eutanásia foram realizadas no Laboratório de
Estudos do Traumatismo Raquimedular e Nervos Periféricos (LETRAN) do Instituto
de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (IOT-HC-FMUSP). O estudo histológico e a análise
morfométrica foram realizados no Departamento de Patologia (VPT) da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
4.1 – Modelo de lesão medular
Como modelo de lesão medular, continuaram-se os estudos de Tebet (2002) e
Tebet et al. (2003), estudando-se os mesmos 24 ratos submetidos à lesão medular
em 2002. Obtiveram-se os resultados funcionais da recuperação da função
41
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
locomotora e os comparou com novos estudos histomorfométricos realizados a partir
do material de tecido medular contidos em blocos de parafina, que foram mantidos e
armazenados no Departamento de Patologia do Instituto de Ortopedia e
Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo em condições adequadas com controle de temperatura e umidade.
4.1.1 – Animais de experimentação
Avaliaram-se 24 ratos machos e adultos jovens da raça Wistar, com peso
entre 300 a 350 g. Os animais foram fornecidos pelo Centro de Bioterismo da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Na admissão, todos os ratos
foram avaliados quanto às condições gerais de saúde e à motricidade conforme rotina
do LETRAN. Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais, em câmaras
climatizadas (temperatura ambiente de 25 ºC + ou – 1 ºC) com controle de luz (ciclo
claro-escuro de 12 horas), sob condições de alimentação ad libitum e higiene
adequadas, uma semana antes do experimento para se climatizarem e se tornarem
manuseáveis.
Foram adotados os seguintes critérios de inclusão e exclusão:
Critérios de inclusão:
• Ratos da raça Wistar;
• Peso entre 300 e 350 gramas, inclusive;
42
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
• Machos adultos jovens (entre 19 e 21 semanas de vida inclusive);
• Boa condição clínica (pelagem e estado clínico geral);
• Motricidade normal.
Critérios de exclusão:
• Óbito durante qualquer etapa do experimento (indução anestésica um
caso);
• Lesão da medula espinhal acidentalmente durante o procedimento
cirúrgico de laminectomia;
• Infecção da ferida operatória;
• Infecção urinária (piúria);
• Lesão medular fora dos padrões estabelecidos pelo sistema NYU
“impactor”
®
.
4.1.2 – Procedimento anestésico e cirúrgico
Utilizou-se pentobarbital intraperitoneal na dose de 55-75 mg/kg
(recomendam-se 65 mg/kg para machos) para o procedimento anestésico. O plano
anestésico profundo foi analisado através da ausência do reflexo corneano e ausência
de reação à compressão da cauda. Os ratos que se tornaram inaceitavelmente
despertos durante a cirurgia foram descartados do experimento e substituídos.
43
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
A fim de reduzir a taxa de infecção das vias urinárias e infecções de ferida
operatória, instituiu-se o regime de 25 mg/kg de cefalotina (Keflin Neutro )
subcutaneamente após a indução anestésica e repetida 6 a 8 horas após e duas vezes
ao dia, por 48 horas.
Cada rato foi preparado com tricotomia do dorso e uma abertura na pele da
linha média dorsal de aproximadamente 5 cm realizada para expor a coluna espinhal
de T8 a T12. Os músculos paravertebrais foram descolados dos processos espinhosos
e das lâminas, expondo-se as lâminas. Utilizou-se de cautério bipolar para
hemostasia quando necessário. Realizaram-se laminectomias de T10 e a metade
distal do processo espinhoso de T9 com micro sacabocados, sem provocar lesão do
saco dural e sem danificar o processo espinhoso de T8, expondo-se a medula o
suficiente para acomodar a cabeça do “impactor” com uma margem maior que 0,2
mm.
4.1.3 – Contusão medular
Adotou-se o modelo experimental de lesão medular do “Multicenter Animal
Spinal Cord Injury Study” (MASCIS) padronizado para ratos Wistar e implantado
no Instituto de Ortopedia do HC-FMUSP por Rodrigues em 1999.
Para realizar a contusão medular, utilizou-se o sistema NYU “impactor”
®
,
desenvolvido por Gruner em 1992, em que o rato é posicionado no sistema
acomodado sobre uma esponja, o segmento T8 e T11 então fixados com presilhas
44
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
nos processos espinhosos. Haste de 10 g a altura de 25 mm é solta sobre a medula em
queda livre. O sistema analisa e registra os dados referentes à velocidade da haste,
deformação relativa e absoluta da medula, carga e tempo de impacção, de forma a
produzir impacto direto, padronizado e reprodutível.
Seguiram-se os procedimentos, os cuidados, as regulagens, os controles, a
monitoração, a limpeza e a esterilização da haste de forma constante, conforme o
manual e as recomendações de Constantini e Young (1994) e Rodrigues (1999).
Uma vez contusa a medula, foi realizada a revisão da hemostasia e a lavagem
do sítio da contusão com soro fisiológico 0,9%. A ferida foi suturada por planos e a
pele fechada com pontos simples utilizando-se fio de náilon monofilamentar número
três zeros.
Após a lesão contusa da medula, procedimentos padrão de aferição de
temperatura e esvaziamento de bexiga foram realizados em intervalos de tempo pré-
estabelecidos (Rodrigues, 1999).
4.2 – Formação dos grupos e tratamento medicamentoso
Os ratos foram identificados um a um e divididos aleatoriamente em quatro
grupos: o grupo MP (n=6) que recebeu metilprednisolona; o grupo GM1 (n=6) que
recebeu o gangliosídeo GM-1, o grupo MP+GM1 (n=6) que recebeu
45
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
metilprednisolona associada ao GM-1, e o grupo controle (n=6) que recebeu placebo
com aplicação de soro fisiológico a 0,9%.
As medicações foram administradas por via intraperitoneal, sendo utilizada a
dosagem de 30 mg/kg de metilprednisolona nos grupos MP e MP+GM1 e 30 mg/kg
de gangliosídeo GM-1 nos grupos GM1 e MP+GM1. Essa dosagem foi administrada
5 minutos após a contusão medular e repetida 3 horas após, seguindo a metodologia
utilizada por Constantini e Young (1994), Tebet (2002) e Tebet et al. (2003)
(Tabela 1).
Tabela 1 - Protocolo das drogas e dosagens utilizadas em cada grupo
Grupos
Número de
ratos
Resumo do tratamento
Controle
06 LM; 1 ml de SF 0,9% com 5 minutos
Experimental
Grupo MP 06
LM; 30 mg/kg de MP com 5 minutos e
repetido com 3 horas
Grupo GM1 06
LM; 30 mg/kg de GM-1 com 5 minutos e
repetido com 3 horas
Grupo MP+GM1 06
LM; 30 mg/kg de MP + 30 mg/kg de GM-1
com 5 minutos e repetidos com 3 horas.
FONTE: Constantini e Young (1994)
LM = Lesão Medular; SF = Soro Fisiológico;
MP = Metilprednisolona; GM-1=Gangliosídeo g(m1).
4.3 – Avaliação da função locomotora
A avaliação locomotora foi realizada no segundo, sétimo e décimo quarto
dias após a lesão medular contusa por quatro examinadores, utilizando-se a escala de
Basso; Beattie; Bresnahan (BBB), publicada em 1995. Baseando-se nos itens dessa
46
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
escala, foram observados os movimentos da articulação do quadril, joelho e
tornozelo e a posição do tronco, rabo e patas traseiras de cada lado: direito e
esquerdo. A partir dessas observações, foram atribuídos pontos de zero a 21, sendo o
zero correspondente à ausência total de movimentos e o 21 à presença de
movimentos normais. Os dados foram coletados através de uma ficha própria para a
coleta de dados do teste de BBB e armazenados em banco de dados (Anexo A, B).
Utilizaram-se os resultados de Tebet (2002) e Tebet et al. (2003), cuja
avaliação do teste foi realizada por quatro observadores treinados. Foi realizada a
média dos valores atribuídos pelos quatro examinadores para cada rato e para cada
lado.
4.4 – Eutanásia e amostras de tecido
Os animais foram sacrificados no 14
º
dia após a lesão, aplicando-se 140
mg/kg de pentobarbital intraperitoneal, conforme as regras legislação em vigor,
seguindo-se a normatização do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal –
COBEA (1999).
O segmento de T1 a L5, contendo todo estojo ósseo e os músculos
paravertebrais foram removidos e realizadas laminectomias de T5 a L5 para remoção
da medula espinhal. A medula fixada numa superfície de papel cartão e identificada a
região onde se evidenciavam achados macroscópicos de contusão medular a qual foi
47
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
denominada “área da lesão” (zona B). A seguir, identificou-se a área cefálica (zona
A) e caudal à lesão (zona C), dentro de 1 cm a partir do epicentro da contusão, 5 mm
acima e 5 mm abaixo. Os conjuntos foram identificados e armazenados em frascos
contendo formol a 10%.
4.5 – Análise histológica e morfométrica
Ao se seguir a linha de pesquisa iniciada por Tebet (2002), os procedimentos
até o momento foram os mesmos, diferenciando-se apenas no tratamento e análise
histológica. Desta forma, os segmentos medulares foram submetidos a cortes
histológicos seriados em seu plano axial com intervalos de 2 mm e o material
processado e desidratado em bateria de alcoóis, depois submetida a processo de
diafanização em xilol e inclusão em blocos de parafina.
Uma vez contidos em blocos de parafina, foram realizados cortes histológicos
transversais ao plano axial da medula, seriados com espessura de cinco micrômetros.
Esses cortes foram realizados em 1 cm de medula lesionada, 5 mm acima e cinco
abaixo do centro da lesão. Cada quinto corte foi fixado e corado pelo método de
violeta de cresyl (cresyl) e cada sexto, fixado e corado pelo método de azul rápido
de luxol (luxol).
O procedimento de coloração com cresyl tem como objetivo demonstrar a
substância de Nissl, que é perdida após lesão celular, principalmente se ocorre
48
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
degeneração axonal. Os neurônios contêm substância de nissl em seu citoplasma, que
é primariamente composto pelo reticulo endoplasmático rugoso, que produz RNA, o
qual é basofílico e bem identificado por corantes de características alcalinas. Como
resultado, ocorre coloração que varia de azul-escuro a violeta.
As principais etapas da coloração de violeta de cresyl foram:
1. Desparafinização e hidratação com água destilada;
2. Solução de violeta de cresyl por dois minutos;
3. Enxágüe com água destilada;
4. Desidratação com álcool a 95%, limpeza com xilol, selagem e fixação em
lâmina de vidro.
O método de coloração de azul rápido de luxol tem como objetivo a coloração
de bainha de mielina que é uma capa de gordura protetora que envolve as fibras
nervosas. Tem como princípio a utilização de reagente composto de solução
equivalente de álcool e água solúvel em “alcian blue”. A coloração ocorre por reação
ácido-base e formação de sal com afinidade pelas lipoproteínas. O resultado é a
coloração das fibras mielínicas em azul-claro e células nervosas em azul-escuro.
O procedimento da coloração de luxol teve como principais etapas após os
cortes:
1. Desparafinização e hidratação em álcool a 95%;
2. Colocação em solução de azul rápido de luxol toda a noite a temperatura
de 60 ºC;
49
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
3. Enxágüe em álcool a 95% e após em água destilada;
4. Solução em carbonato de lítio por 5 segundos e novo enxágüe com água
destilada;
5. Eosina por 1 minuto, desidratação com álcool a 95 a 100%, seguida de
limpeza com xilol, selagem e fixação em lâmina de vidro.
Após o preparo das colorações, foi realizado estudo morfométrico com
obtenção de dados da área total (área seccional externa total da medula), área
preservada (área contida dentro da área total composta apenas de tecido íntegro) e
percentual de área preservada (relação da área preservada sobre a área total) em cada
lâmina de cada coloração em separado.
As imagens das lâminas foram capturadas através do microscópio Nikon
eclipse E800
®
acoplado a câmera Media Cybernetics
®
(fabricada por Roper
Scientific) e digitalizadas com auxílio do programa IMAGE-PRO PLUS
®
, onde os
dados morfométricos foram obtidos e calibrados em milímetros quadrados.
As lesões foram caracterizadas por áreas de formação cística e cavitação,
gliose e edema axonal. A substância branca foi julgada preservada se a coloração da
mielina (azul claro), sua densidade e organização tecidual apresentavam-se normais
ou próximas do normal, na ausência de gliose densa e edema axonal. A substância
cinzenta foi julgada preservada se a coloração se apresentasse próxima do violeta
com organização tecidual preservada e se os neurônios e a glia estivessem presentes
em densidade normal.
50
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
4.6 – Análise estatística
Para avaliar o efeito das colorações (cresyl e luxol), dos grupos (Controle,
MP, GM1 e MP+GM1) e das zonas da lesão (A, B e C) segundo as variáveis
morfométricas de área total, área preservada e percentual da área preservada, foi
realizada a análise de variância (ANOVA), onde foi medido o efeito de cada fator de
variação e suas respectivas interações: tipo e droga, tipo e região, droga e região.
Caso o efeito apresentasse significância estatística, foram testadas todas as
combinações dois a dois, de cada fonte de variação, bem como suas respectivas
interações, através do teste de Tukey.
Em relação às variáveis de área total e área preservada, foi realizada uma
transformação logarítmica para que os dados pudessem ser trabalhados com um teste
paramétrico, pois elas não apresentavam distribuição normal.
Para avaliar a recuperação da função locomotora através do teste de BBB nos
momentos 2º, 7º e 14º dias pós-lesão medular (DPLM), em cada um dos grupos
(Controle, MP, GM1 e MP+GM1), foi realizado o teste de Kruskal-Wallis seguido
do teste de Mann-Whitney, caso houvesse diferença significativa entre os grupos.
Para comparar, dentro de um mesmo grupo, a diferença entre os momentos foi
realizado o teste não paramétrico do sinal.
51
Métodos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
A correlação entre a área preservada, percentual da área preservada, área total
e o teste de BBB em cada momento foi avaliada através do índice de correlação de
Spearman.
Os testes de normalidade dos dados foram realizados através de “normal plot”
e teste de Shapiro-Wilk. Para os cálculos, foi adotado nível de significância de 5% e
utilizado o programa SAS versão 8.2
®
.
5. RESULTADOS
53
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
5
5
-
-
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
5.1 - Função locomotora
Os resultados da avaliação da função locomotora segundo a escala de BBB
dos ratos no segundo, sétimo e décimo quarto dia após lesão medular distribuídos em
cada grupo (Controle, GM1, MP e MP+GM1) estão apresentados com seus valores
absolutos na Tabela 2 e com seus dados de média e desvio padrão na Tabela 3.
Ao avaliarmos os resultados funcionais comparativos totais em cada
momento, constatamos ter havido diferença estatística entre os momentos, pelo teste
do Sinal de Mann-Whitney (p<0,01).
Através do teste de Kruskall-Wallis, observamos que não houve diferença
entre os grupos (Controle, GM1, MP e MP+GM1) no segundo dia de lesão (p>0,05).
Entretanto, no sétimo (p<0,05) e décimo quarto dias (p<0,01), os valores
apresentaram diferença entre os grupos em cada momento avaliado (Anexo C).
54
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
No sétimo dia de avaliação após a lesão medular, o grupo MP+GM1
demonstrou melhora da função locomotora superior ao grupo controle (p<0,05), o
que não foi observado nos demais grupos. Os grupos MP e MP+GM1, no décimo
quarto dia de avaliação, apresentaram média de recuperação funcional acima
(p<0,05) da apresentada pelo grupo controle (Tabela 3, Gráfico 1, Anexo C).
Tabela 2 - Distribuição dos valores do teste de BBB dos 24 ratos divididos em cada
grupo, controle, GM1, MP e MP+GM1 no 2º, 7º e 14º dias pós-lesão
medular
Grupos Rato 2º DPLM 7º DPLM 14º DPLM
1
1 2 2
2
0 1 4
Controle
3
0 3 3
4
1 1 3
5
0 4 4
6
0 2 2
7
1 1 8
8
0 1 1
GM1
9
0 1 8
10
2 7 12
11
0 8 7
12
0 1 8
13
0 7 10
14
3 7 12
MP
15
6 8 13
16
3 1 5
17
0 7 12
18
0 6 13
19
0 8 12
20
1 7 13
MP+GM1
21
0 4 8
22
0 6 10
23
0 7 8
24
0 8 10
DPLM: dia de pós-lesão medular
55
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Tabela 3 - Distribuição da média e desvio padrão da avaliação funcional de BBB no
2º, 7º e 14º dias de pós-lesão medular em cada grupo: controle, GM1, MP
e MP+GM1
Grupos
2º DPLM 7º DPLM 14º DPLM
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
Total (n = 24) 0,75 1,45 4,50 2,89 7,83 3,97
Controle (n =6)
0,33 0,52 2,17 1,17 3,00 0,89
GM1 (n=6)
0,50 0,84 3,17 3,37 7,33 3,56
MP (n = 6)
2,00 2,45 6,00 2,53 10,83 3,06
MP + GM1 (n = 6)
0,17 0,41 6,67 1,51 10,17 2,04
Anova
p<0,01 para 2º DPLM < 7º DPLM < 14º DPLM
p>0,05 para 2º DPLM: Controle, MP+GM1, GM1e MP
p<0,05 para7º DPLM: MP+GM1 > Controle
p<0,05 para14º DPLM: MP+GM1 e MP > Controle
DPLM: dia de pós-lesão medular
56
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 1 - Evolução dos valores médios da avaliação funcional de BBB no 2º, 7º e
14º dias pós-lesão medular (DPLM)
* p>0,05 para 2º DPLM: controle, MP+GM1, GM1e MP
** p<0,05 para7º DPLM: MP+GM1 > controle
*** p<0,05 para14º DPLM: MP+GM1 e MP > controle
DPLM: dia de pós-lesão medular
*
**
*
**
*
*
*
2.
4.
6.
8.
10.
12.
2º DPM
7º DPM
14º DPM
BBB
Total
Controle
GM1
MP
MP + GM1
57
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
5.2 - Histológicos e Morfométricos
Os achados histológicos na zona B demonstram que a lesão ocupou mais
freqüentemente a porção dorsal tanto do corno posterior como da coluna e funículos
laterais (Figura 1). A demonstração das lâminas com suas características de
coloração, área total e área preservada, distinguindo-a da área lesionada, está
representada nas Figuras 2, 3, 4 e 5.
Os valores absolutos dos dados morfométricos de área total, área preservada e
percentual de área preservada de cada rato, distribuídos em cada grupo (Controle,
GM1, MP e MP+GM1) e em cada zona A, B e C, segundo a coloração de Luxol,
estão demonstrados no Anexo D e segundo a coloração de Cresyl no Anexo E.
58
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Figura 1 - Fotomicrografia com objetiva de 4x demonstrando corte histológico de
medula de rato na zona B corado pelo método de azul rápido de luxol.
Notar área de destruição na porção dorsal: corno posterior e funículos
laterais.
Dorsal
Ventral
59
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Figura 2 - Fotomicrografia com objetiva de 10x demonstrando corte histológico de
medula de rato da zona B corado pelo método de azul rápido de luxol.
Notar áreas de cavitação e necrose.
60
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Figura 3 - Fotomicrografia com objetiva de 10x demonstrando corte histológico de
medula de rato da zona B corado pelo método de violeta de cresyl. Notar
áreas de cavitação e necrose tecidual.
61
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Figura 3 - Fotomicrografia com objetiva de 4x demonstrando corte histológico de
medula de rato da zona C corado pelo método de violeta de cresyl. Notar
marcação histomorfométrica de área de secção total.
62
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Figura 4 - Fotomicrografia com objetiva de 10x demonstrando corte histológico de
medula de rato da zona C corado pelo método de azul rápido de luxol.
Notar marcação histomorfométrica diferenciando-se área preservada da
área lesionada.
Área preservada
Área lesionada
63
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Figura 5 - Fotomicrografia com objetiva de 10x demonstrando corte histológico de
medula de rato da zona B corado pelo método de violeta de cresyl. Notar
marcação histomorfométrica diferenciando-se área preservada da área
lesionada.
Área preservada
Área lesionada
64
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Ao se avaliar os dados morfométricos em cada zona, independente do grupo e
da coloração, observou-se que a zona C teve a maior média de área total com
diferença significante em relação às outras zonas (p<0,001). Em relação à área
preservada, a zona C obteve a maior média que as outras zonas (p<0,01).
Comparando-se a zona B com as demais, esta foi a que menos (p<0,01) preservou
área (Tabela 4; Gráfico 2; Anexo F).
Comparando-se a média dos valores dos dados de percentual de área
preservada da zona B com as demais, observamos que ela obteve as menores médias
(p<0,05) e a zona A foi a que mais preservou percentualmente (p<0,05), Tabela 4,
Gráfico 3 e Anexo F.
Tabela 4 - Distribuição da média e desvio padrão dos dados morfomértricos (área
total, área preservada e percentual de área preservada) em cada zona: A,
B e C. Efeito isolado da zona, independente do grupo e da coloração
Zona A Zona B Zona C
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
Valor-p
Área total (mm
2
)
3,38 0,38 3,29 0,52 4,39 0,84 < 0,0001
Área Preservada (mm
2
)
1,50 0,82 0,88 0,46 1,78 0,69 < 0,0001
Percentual de área preservada
44,23 23,38 27,30 14,41 40,55 14,02 < 0,0001
Anova
p<0,05 para área total: C > A e C
p<0,05 para área preservada: C > A e B; A e C > B
p<0,05 para percentual de área preservada: A > B e C
65
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 2 - Média e desvio padrão dos valores morfométricos da área total e área
preservada em mm
2
, em cada zona: A, B e C
* p<0,05 para área total: C > A e C
** p<0,05 para área preservada: C > A e B; A e C > B
3,38
4,39
1,50
0,88
1,
78
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
A B C
mm
2
2
Área Total
Área Preservada
*
*
*
*
*
66
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 3 - Média e desvio padrão dos valores do
percentual
de área preservada, em
cada zona: A, B e C
* p<0,05 para percentual de área preservada: A > B e C
44,23
27,30
40,55
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
A B
C
Percentual de área preservada
*
*
67
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Avaliando-se os dados morfométricos de toda a amostra de acordo com os
grupos controle, GM1, MP e MP+GM1, independente da zona e da coloração,
observamos que não houve diferença estatística (p>0,05) na área total entre os grupos
(Tabela 5; Gráfico 4; Anexo G).
Todos os grupos que receberam medicação (GM1, MP e MP+GM1) foram
superiores ao grupo controle (p<0,05) na avaliação da área preservada e do
percentual de área preservada, sendo que o grupo GM1 obteve média superior quanto
ao percentual de preservação (p<0,05) ao grupo MP+GM1 (Tabela 5; Gráficos 4 e 5;
Anexo G).
Tabela 5 - Distribuição da média e desvio padrão dos dados morfométricos (área
total, área preservada e percentual de área preservada) em cada grupo:
controle, GM1, MP e MP+GM1. Efeito isolado dos grupos, independente
da coloração e da zona
CONTROLE GM1 MP MP+GM1
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
Valor-p
Área total (mm
2
) 3,77 0,76 3,55 0,75 3,55 0,60 3,88 0,97 0,0515
Área Preservada
(mm
2
)
1,17 0,70 1,53 0,68 1,42 0,76 1,43 0,90 0,0003
Percentual de
área preservada
30,66 18,29 43,25 17,21 39,36 19,36 36,17 20,04 < 0,001
Anova
p<0,05 para área preservada: controle < GM1, MP e MP+GM1
p<0,05 para percentual de área preservada: controle < GM1, MP e MP+GM1; GM1> MP+GM1
68
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
*
3,88
3,77
3,55
3,55
1,43
1,17
1,53
1,42
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
CONTROLE GM1
MP
MP + GM1
mm
2
Área Total Área Preservada
Gráfico 4 - Média e desvio padrão dos valores da área total e área preservada em
mm
2
em cada grupo: controle, GM1, MP e MP+GM1
* p<0,05 para área preservada: controle < GM1, MP e MP+GM1
Gráfico 5 - Média e desvio padrão dos valores do percentual de área preservada, em
cada grupo: controle, GM1, MP e MP+GM1
* p<0,05 para percentual de área preservada: controle < GM1, MP e MP+GM1; GM1> MP+GM1
36,17
30,66
43,25
39,36
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
CONTROLE
GM1
MP MP + GM1
Percentual de área preservada
*
*
69
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Ao analisarmos a média dos valores morfométricos segundo o tipo de
coloração utilizada, independentes dos grupos e das zonas, observou-se que não
houve diferença estatística em relação à área total (p>0,05) nas duas colorações. Em
relação aos dados de área preservada e percentual de área preservada, os cortes com
coloração de luxol apresentaram números superiores (p<0,01) em comparação aoss
cortes com a coloração de cresyl (Tabela 6, Gráficos 6 e 7).
Tabela 6 - Distribuição da média e desvio padrão dos dados morfométricos (área
total, área preservada e percentual de área preservada) segundo a
coloração cresyl e luxol
Anova
CRESYL LUXOL
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
Valor-p
Área total (mm
2
) 3,69 0,72 3,68 0,85 0,9308
Área Preservada (mm
2
) 0,92 0,43 1,86 0,74 < 0,0001
Percentual de área preservada 24,2 7,06 50,52 18,32 < 0,0001
70
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 6 - Média e desvio-padrão dos valores da área total e área preservada em
mm
2
segundo a coloração cresyl e luxol.
* p<0,01 para área preservada: luxol > cresyl
3,69 3,68
0,92
1,86
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
CRESYL
LUXOL
Área Total Área Preservada
*
mm
2
71
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 7 - Média e desvio-padrão do valor percentual de área preservada segundo a
coloração cresyl e luxol
* p<0,01 para percentual de área preservada: luxol > cresyl
24,2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CRESYL
LUXOL
Percentual de área preservada
*
50,5
72
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Comparando-se os dados morfométricos com os grupos e com o tipo de
coloração, independente da zona (Tabela 7), observa-se que, para a coloração de
cresyl, o grupo GM1 foi o único que teve o percentual de área preservada superior
(p<0,05) ao grupo controle (Gráfico 8; Anexo H).
Em contrapartida, com a coloração de luxol, os grupos em que o percentual
de área preservada foi superior ao grupo controle foram os grupos MP e o GM1
(p<0,01). O grupo MP+GM1 foi superior ao grupo controle, porém sem significância
(p>0,05) e foi inferior ao grupo que recebeu o GM-1 isolado (p<0,05) (Tabela 7;
Gráfico 9; Anexo H)
Tabela 7 - Distribuição da média e desvio padrão dos dados morfométricos (área
total, área preservada e percentual de área preservada) distribuídos
quanto ao tipo de coloração em cada grupo. Efeito do tipo de coloração e
dos grupos, independente da zona.
Área total
(mm
2
)
Àrea Preservada
(mm
2
)
Percentual de Área
preservada
Coloração Droga média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
Cresyl
Controle
3,77 0,75 0,79 0,32 20,27 5,52
GM1
3,61 0,70 1,06 0,47 28,24 6,37
MP
3,53 0,66 0,84 0,33 23,24 5,49
MP + GM1
3,86 0,80 1,00 0,52 25,03 8,47
Luxol
Controle
3,77 0,80 1,56 0,77 41,06 20,73
GM1
3,48 0,82 2,01 0,49 58,25 9,62
MP
3,58 0,56 2,00 0,59 55,48 13,85
MP + GM1
3,91 1,13 1,87 0,99 47,30 22,18
VALOR-P 0,9058 0,1315
0,0004
Anova
p<0,05 para cresyl x percentual de área preservada: GM1> controle
p<0,05 para luxol x percentual de área preservada: GM1e MP > controle ; GM1> MP+GM1
73
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 8 - Média e desvio padrão dos valores do percentual de área preservada, em
cada grupo (Controle, GM1, MP e MP+GM1) distribuídos segundo a
coloração de cresyl
* p<0,05 para cresy: GM1> controle
Cresyl
25,03
23,24
28,24
20,27
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
CONTROLE GM1 MP
MP + GM1
Percentual de área preservada
*
74
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 9 - Média e desvio padrão dos valores do percentual de área preservada, em
cada grupo (Controle, GM1, MP e MP+GM1) distribuídos segundo a
coloração de luxol
* p<0,05 para luxol: GM1e MP > controle; GM1> MP+GM1
Luxol
41,06
58,25
55,48
47,30
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
CONTROLE GM1 MP MP + GM1
Percentual de área preservada
*
*
75
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Analisando-se os dados morfométricos de percentual de área preservada em
cada grupo na zona B, independente da coloração utilizada, os grupos MP e GM1
preservaram mais área que o grupo controle (p<0,01) (Tabela 8; Gráfico 10; Anexo
I).
Na zona A não houve diferença estatística no percentual de área preservada
entre os grupos (p>0,05), e na zona C, os grupos GM1, MP e MP+GM1
apresentaram médias superiores (p<0,01) às do grupo controle (Tabela 8; Gráfico 10;
Anexo I).
76
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Tabela 8 - Distribuição da média e desvio padrão dos dados morfomértricos (área
total, área preservada e percentual de área preservada) em relação aos
grupos (Controle, GM1, MP e MP+GM1) e às zonas A, B e C. Efeito do
grupo e da zona, independente da coloração
Área total
(mm
2
)
Área preservada
(mm
2
)
Percentual de Área
preservada
Droga Zona média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
média
desvio-
padrão
Controle
A 3,43 0,39 1,48 0,89 42,94 25,21
B 3,24 0,30 0,61 0,24 18,49 6,62
C 4,64 0,60 1,43 0,43 30,56 7,70
GM1
A 3,26 0,33 1,45 0,73 44,47 21,37
B 3,06 0,30 1,20 0,38 40,18 15,57
C 4,33 0,77 1,95 0,68 45,09 15,09
MP
A 3,42 0,51 1,51 0,90 44,06 25,54
B 3,25 0,36 1,04 0,53 31,38 12,80
C 3,98 0,67 1,70 0,69 42,64 16,49
MP + GM1
A 3,42 0,27 1,56 0,85 45,46 24,24
B 3,42 0,27 1,56 0,85 19,13 9,00
C 4,62 1,14 2,06 0,81 43,91 11,51
VALOR-P 0,3626
0,0007 < 0,0001
Anova
p>0,05 para zona A: comparando-se todos os grupos
p<0,05 para zona B x percentual de área preservada: controle < GM1 e MP
p<0,05 para zona C x percentual de área preservada: controle < GM1, MP e MP+GM1
77
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Gráfico 10 - Média e desvio padrão dos valores do percentual de área preservada
em relação aos grupos (Controle, GM1, MP e MP+GM1) e às
zonas A, B e C
* p>0,05 para zona A: comparando-se todos os grupos
** p<0,05 para zona B: GM1 e MP > controle
*** p<0,05 para zona C: controle < GM1, MP e MP+GM1
30,56
18,49
42,94
45,09
40,18
44,47
42,64
31,38
44,06
43,91
19,13
45,46
0
10
20
30
40
50
60
Zona B Zona C
Percentual de área preservada
Controle
GM1
MP MP + GM1
*
*
*
*
*
**
*
Zona A
78
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Avaliando os dados morfométricos segundo a coloração e os grupos na zona
B, o percentual de área preservada segundo o tipo da coloração, houve maior
preservação de tecido nos grupos GM1 e MP em comparação com o grupo controle
na coloração de luxol (p<0,05). Na coloração de cresyl, somente o grupo que recebeu
gangliosídeo isolado (grupo GM1) preservou mais substância cinzenta que o controle
(p<0,05), não sendo observado o mesmo em relação ao grupo MP+GM1 em
nenhuma coloração (p>0,05) (Tabela 9; Gráfico 11, Anexo J).
Tabela 9 - Distribuição da média do dado morfomértrico de percentual de área
preservada dos grupos em ralação a zona B em cada coloração: cresyl e
luxol
Percentual de área preservada na zona B
Grupo média desvio-padrão
Cresyl
Controle
17,58 8,32
GM1
26,67 1,59
MP
21,49 4,54
MP + GM1
18,41 7,99
Luxol
Controle
19,4 5,03
GM1
53,69 9,64
MP
41,28 10,24
MP + GM1
19,85 10,64
Anova
p<0,05 para luxol: controle e MP+GM1 < GM1 e MP
p<0,05 para cresyl: controle e MP+GM1 < GM1 e MP
79
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
19,85
41,28
53,69
19,4
18,41
21,49
26,67
17,58
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle GM1
MP
MP+GM1
Percentual de área preservada na zona B
Luxol
Cresyl
*
*
*
*
Gráfico 11 - Média e desvio padrão dos valores do percentual de área preservada dos
grupos (Controle, GM1, MP e MP+GM1) na zona B
* p<0,05 para luxol: controle e MP+GM1 < GM1 e MP
** p<0,05 para cresyl: GM1> MP, MP+GM1 e controle
80
Resultados
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
5.3 – Correlação função locomotora e histomorfometria
Avaliamos os resultados dos achados histológicos e os dos achados da
avaliação da função locomotora de BBB utilizando o índice de correlação (r) de
Spearman. Observamos não haver correlação direta ao compararmos tanto os dados
morfométricos, independente da zona, como os dados de percentual de área
preservada na zona B, isoladamente na coloração de luxol ou na coloração de cresyl
com a avaliação da recuperação da função locomotora no décimo quarto dia.
6. DISCUSSÃO
82
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
6
6
-
-
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
O conhecimento das alterações fisiopatológicas da lesão medular secundária,
por meio de estudos experimentais, permitiu o desenvolvimento e o estudo de drogas
que agem diretamente impedindo a cascata bioquímica que ocorre após a lesão
primária intensificando o dano tecidual, com o objetivo de diminuir a progressão e
até promover a recuperação da função neurológica (Hall et al., 1984; Faden et al.,
1987; Noble e Wrathall, 1985, 1989; Tator e Fehlings, 1991).
Com este intuito, várias drogas foram estudadas experimentalmente nas
últimas três décadas como a naloxona, tilirazade, nimodipina, GM-1, MP, entre
outras (Hall et al., 1984; Cuello et al., 1989; Hall, 1992; Ducker e Zeidman, 1994;
Constantini e Young, 1994; Geisler et al., 1991, 1993a, 2001; Geisler, 1993a;
Walker e Harris, 1993; Lee at al., 2005a), e mais recentemente células-tronco,
fatores genéticos de proliferação celular (GAP-43, Bcl-2, c-Jun), eritropoetina
recombinante humana e fator de crescimento insulina-like (Bregman e Bagden,
1994; Kaptanoglu et al., 2004; Bartholdi e Schwab, 1997; Hung et al., 2007;
Vitellaro-Zuccarello et al., 2007). As duas drogas de uso clínico estabelecido e
reconhecido para o tratamento da lesão medular aguda em humanos são a MP e o
83
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
GM-1, e, segundo alguns autores, o uso em conjunto dessas drogas pode promover
ação sinérgica no tratamento desses pacientes (Taoka e Okajima, 1998, 2000).
O uso da metilprednisolona em estudos experimentais em ratos é bastante
presente na literatura e sua dosagem já foi bem estudada e estabelecida (30 mg/kg),
variando apenas no tempo em que é utilizada após o trauma (Constantini e Young,
1994; Yoon et al., 1999; Rabchevsky et al., 2002; Takami et al., 2002; Tebet,
2002; Lee et al., 2005a). Estudos têm demonstrado existir janela terapêutica para o
uso da MP em ratos com lesão medular, onde 30 minutos após o trauma parece ser o
tempo limite para se iniciar o tratamento (Yoon et al., 1999).
A dose ideal do GM-1 em ratos não está bem estabelecida (Fusco et al.,
1986). Os pesquisadores Constantini e Young (1994) realizaram estudo com várias
dosagens de GM-1 e concluíram que a dose ideal é a de 30 mg/kg. Dessa forma,
resolvemos seguir o protocolo instituído por esses autores como referência, da
mesma forma que Tebet em 2002 e Tebet et al. em 2003, utilizando-se essa
dosagem tanto para o GM-1, quanto para a MP, iniciada cinco minutos e repetida
após três horas do trauma.
O mecanismo de ação, a eficácia e as relações entre os achados histológicos e
funcionais do tratamento, tanto com o GM1, quanto com a MP, ainda não são
totalmente entendidos e seu uso ainda não é um consenso na prática clínica. Dessa
forma, decidimos melhor avaliar seus efeitos experimentais em ratos.
84
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
A necessidade incessante de conhecimento sobre as alterações biológicas do
trauma medular agudo e de avaliar o potencial terapêutico de novas drogas levou
alguns autores a revisar a evolução do desenvolvimento e aprimoramento dos
modelos experimentais de lesão medular em animais como transecção parcial e
completa, contusão, compressão por clipe ou por fita, balão e impacto por queda de
peso (Kuhn e Wrathall, 1998; Kwon et al. 2002; Oliveira, 2005).
O modelo de impacção por queda de peso oferece a vantagem de ser
clinicamente relevante, uma vez que mimetiza a lesão em humanos, nos quais a
maioria das lesões teciduais é provocada pelo movimento rápido da coluna posterior
da vértebra com impacto do osso sobre a medula (Kuhn e Wrathall, 1998; Metz et
al., 2000).
O sistema NYU, inicialmente descrito por Gruner em 1992, é o modelo de
queda de haste de 10g de diferentes alturas sobre a medula exposta: 6,25 mm, 12,5
mm, 25 mm e 50 mm. Permite a avaliação e o controle de alguns parâmetros
biomecânicos como a velocidade de impacto, taxa de compressão medular e a força
dinâmica aplicada à medula, promovendo lesão com poucas variáveis.
Rodrigues, em 1999, padronizou o uso do sistema NYU no Laboratório de
Estudos do Traumatismo Raquimedular e Nervos Periféricos (LETRAN) do Instituto
de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São
85
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Paulo (IOT-FMUSP) segundo os parâmetros determinados pelo Multicenter Animal
Spinal Cord Injury Study – MASCIS.
Esse modelo é capaz de gerar lesões medulares controladas e padronizadas
em ratos, sendo o escolhido para realização desse experimento. Optamos pela
utilização de queda de peso da altura de 25 mm, pois estudos anteriores demonstram
que a altura de 50 mm está associada a uma alta taxa de mortalidade e provoca lesão
completa impossibilitando estudos de recuperação, e na lesão provocada por 12,5
mm ocorre a recuperação funcional completa, mesmo nos ratos sem tratamento nos
primeiros dez dias (Basso at al. 1996; Constantini e Young, 1994; Rodrigues,
1999). Pudemos confirmar a ocorrência de lesão medular parcial e incompleta uma
vez que observamos melhora progressiva na avaliação da função locomotora,
concordando com o encontrado em outras publicações (Basso at al. 1995, 1996;
Constantini e Young, 1994; Tebet, 2002; Tebet et al., 2003)
O estudo comportamental para avaliação da função neurológica é importante
para determinar a eficácia terapêutica de drogas experimentais. Os primeiros a
desenvolver uma escala de avaliação da função locomotora foram Tarlov e Klinger
em 1954. Depois deles, diversos investigadores desenvolveram testes para avaliação
locomotora, sensitiva e a função reflexa de animais com medula lesionada (Lhose et
al., 1980; Gale et al., 1985; Noble e Wrathall, 1989; Basso et al., 1994; Vielle et
al., 2002)
86
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
A maioria dessas escalas é uma descrição qualitativa simples do
comportamento de marcha, tendo uma limitação na avaliação da sensibilidade do
teste, o que não permite uma avaliação precisa, consistente e reprodutível da
evolução da recuperação funcional (Basso et al., 1995).
O método de avaliação da recuperação neurológica deve idealmente ser de
fácil uso, alta sensibilidade, detectar mudanças comportamentais e ser capaz de
acessar rapidamente a função locomotora de um grande número de animais. Esses
métodos, porém, são geralmente de difícil aplicação e interpretação, não havendo um
consenso sobre qual método de avaliação é o mais adequado e preciso (Gale at al.,
1985; Basso at al., 1995; Vialle at al., 2002)
Basso at al., em 1995, desenvolveram uma escala de avaliação locomotora
com 21 pontos, desenvolvida para avaliar os ratos submetidos à lesão medular pelo
sistema NYU. Esse modelo de avaliação locomotora foi utilizado em nosso meio por
Tebet (2002); Tebet et al., (2003); Marcon (2006) e Molina (2006) que, assim
como Basso et al., concluíram ser um método válido, aplicável, preditivo e capaz de
avaliar as medidas de recuperação locomotora, distinguindo os resultados
comportamentais em vários momentos.
Assim como Tebet (2002) e Tebet et al. (2003), optamos por avaliar a
função locomotora no segundo, sétimo e décimo quarto dia após lesão medular, uma
vez que a recuperação da função locomotora em ratos com lesão medular tem
algumas características peculiares, nos quais, nas primeiras 24 horas, praticamente
87
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
não ocorre melhora funcional (Gale at al., 1985), após 14 dias da lesão a melhora é
pequena (Behrmann et al., 1992) e após 4 semanas todos os ratos apresentam
recuperação próximo ao normal, independente do tratamento, dificultando a
avaliação do efeito de drogas (Basso et al., 1996).
Os resultados funcionais do segundo dia após lesão foram muito baixos, não
ultrapassando o valor de seis, não havendo diferença entre os grupos, o que sugere
ocorrer uma paralisia funcional transitória, similar ao choque medular no homem, o
que não permite a avaliação da ação das drogas administradas neste momento como
demonstrado por Gale et al. (1985) e Basso et al (1995, 1996).
Analisando os resultados finais da recuperação funcional, verificamos que os
ratos tratados com MP e sua associação com GM-1 (grupos MP e MP+GM1)
obtiveram médias superiores ao grupo controle com diferença estatística significante,
sugerindo que as drogas administradas dessa forma podem atenuar as alterações
biológicas da lesão medular secundária às custas de seus efeitos antiinflamatórios e
neuroprotetores tanto da MP (Oudega et al., 1999; Blight e Zimber, 2001; Taoka
et al., 2001; Merola et al., 2002; Lee at al., 2005a) quanto do gangliosídeo (Sabel
et al., 1988; Geisler et al., 1991, 1993; Geisler, 1993; Walker e Harris, 1993). No
entanto, contrariando aos achados de Constanini e Young (1994), que concluíram
que o GM-1, quando usado em associação com a MP, suprimem-se os efeitos
benéficos da MP.
88
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Mesmo os efeitos da metilprednisolona na recuperação da função locomotora
ainda permanecem controversos, uma vez que Marcon (2006) demonstrou não haver
diferença estatística entre ratos com lesão medular que receberam a MP e os que
receberam placebo.
Na comparação do grupo que recebeu GM-1 isoladamente com o grupo
controle, apesar de apresentar resultado funcional superior, não foi evidenciada
diferença significativa. Estudos têm demonstrado que os efeitos dos gangliosídeos
são encontrados mais na fase crônica (Sabel et al., 1988; Borzeix et al., 1989;
Geisler et al., 1991; Walker e Harris, 1993; Constantini e Young, 1994), em
longo prazo, não podendo ser excluídos seus efeitos benéficos porque o estudo
terminou com quatorze dias.
Resolvemos dividir a medula contusa em zonas, A proximal, B no centro da
lesão e C distal, para avaliarmos as alterações secundárias que ocorrem
perifericamente ao epicentro da contusão, pois acreditávamos que drogas com a
finalidade de diminuir as alterações biológicas e se poupar níveis neurológicos
agiriam nessas zonas, principalmente na proximal, o que não observamos.
Quanto aos achados histológicos, observamos que no epicentro da lesão (zona
B) os achados de tecido lesionado foram mais freqüentemente encontrados na porção
dorsal, principalmente no corno posterior e nos tratos dorsais estendendo-se
lateralmente aos funículos, concordando com os resultados encontrados por Kuhn e
Wrathall (1998).
89
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Com relação à área de secção total, a zona C apresentou a maior média em
comparação com as outras zonas. Delamarter et al., em 1995, também observaram
essas alterações distal ao centro da lesão. Acreditamos que a região caudal à lesão
seja mais suscetível aos efeitos do edema axonal que se inicia no centro e depois se
expande para a periferia, como observado por Rabchevsky et al. em 2002.
Acreditamos que, se o experimento tivesse durado mais tempo, os achados
histológicos da zona C seriam mais similares aos das zonas A e B, uma vez que
alguns autores têm demonstrado que o edema se inicia e atinge seu auge nas
primeiras 48 horas e depois vai sendo reabsorvido lentamente. O volume do edema
retorna aos padrões iniciais e as outras lesões teciduais se desenvolvem e são
observadas após quatro semanas na periferia (Noble e Wrathall, 1989; Kuhn e
Wrathal, 1998; Rabchevsky et al., 2002).
Observamos que a zona A apresentou maior preservação de área (maiores
valores de percentual de área preservada) do que a zona B e C, sem correlação
estatística com a droga administrada ou mesmo o grupo controle, tendo seus valores
semelhantes em todos os grupos, demonstrando que a zona A pouco sofreu com as
alterações vasculares secundárias após quatorze dias de trauma.
90
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
A zona C apresentou-se mais suscetível à lesão secundária e à ação das
medicações usadas, uma vez que o percentual de área preservada foi menor que na
zona A e os animais medicados (grupos MP, GM1 e MP+GM1) apresentaram média
de preservação superior em comparação ao grupo controle.
Os valores médios de área preservada e percentual de área preservada na
coloração de luxol foram maiores que o encontrado na coloração por cresyl com
diferença estatisticamente significante. Esse achado se deve provavelmente ao fato
de que a coloração de cresyl é mais específica para observação de substância
cinzenta, local onde ocorre a maior parte da destruição tecidual como demonstrado
em outros estudos (Duker et al., 1971; Noble e Wrathaal, 1989; Behrmann et al.,
1992; Kuhn e Wrathall, 1998; Rabchevsky et al., 2002; Takami et al., 2002).
Dessa forma, ao realizarmos o estudo morfométrico com a coloração de luxol, não se
pôde avaliar ao certo a área de substância cinzenta lesionada, aumentando a área
preservada encontrada.
A alteração histológica que mais se correlaciona com o estado da função
neurológica é o percentual de substância branca remanescente no epicentro da lesão
(Gale at al., 1985; Noble e Wrathall, 1985; Bresnahan et al., 1987; Basso et al.,
1996; Kuhn e Wrathall, 1998). Observamos que todos os ratos que receberam
medicação (Grupos MP, GM1 e MP+GM1) apresentaram um maior percentual de
área preservada em ralação ao grupo controle, independente do tipo de coloração.
Não se concorda com os achados histológicos encontrados por Constantini e Young
91
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
(1994), em que a associação do GM-1 a MP inibiu a ação neuroprotetora apresentada
pelos ratos que receberam a segunda droga isoladamente.
Entretanto, quando analisamos os dados de percentual de área preservada
apenas nos cortes com coloração de luxol, específico para substância branca,
observamos que os grupos MP e GM1 apresentaram efeitos histológicos benéficos ao
compararmos com o grupo controle, o que não foi observado com a associação das
duas drogas.
A ação da metilprednisolona na preservação de substância branca é
controversa, pois da mesma forma que alguns experimentos de lesão medular em
ratos com análise de campimetria têm demonstrado que a utilização da MP aumenta
o volume de substância branca preservada (Merola et al., 2002; Takami et al.,
2002), outros autores concluem que ocorre diminuição do volume de tecido residual
(Rabchevsky et al., 2002).
O uso da metilprednisolona em ratos com lesão contusa da medula não tem
demonstrado ser capaz de preservar substância cinzenta (Merola et al., 2002;
Takami et al., 2002), concordando com nossos resultados histológicos. Ao
utilizarmos a coloração de cresyl para substância cinzenta, observamos que o grupo
que recebeu GM1 isoladamente obteve o maior percentual de área preservada,
evidenciando sua ação neuroprotetora promovendo fatores neurotróficos endógenos e
92
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
diminuindo a perda de neurônios após o trauma e agindo principalmente na
preservação de neurônios.
Esses achados sugerem que o gangliosídeo GM-1 tem ação na preservação,
tanto de substância branca quanto de substância cinzenta, e que a MP age somente na
preservação dos tratos e tecido axonal da substância branca.
Tebet (2002) observou não haver correlação entre os resultados da
recuperação da função locomotora e os da avaliação histológica, visto que o grupo
com o melhor resultado da função locomotora foi o grupo que recebeu MP
isoladamente e o grupo que recebeu MP associado ao GM-1. O grupo com menor
pontuação de alterações histológicas foi o que recebeu GM-1 isoladamente,
ressaltando os efeitos histológicos favoráveis encontrados como uso do gangliosídeo.
Divergindo dos resultados de Tebet, os resultados histomorfométricos mais
favoráveis foram encontrados nos ratos que receberam medicação (Grupos GM1, MP
e MP+GM1) e, especificamente na preservação de substância branca no centro da
lesão, os ratos que receberam a MP e o GM-1 isoladamente foram mais beneficiados.
Não observamos correlação entre os achados histomorfométricos e a
recuperação da função locomotora, concordando com o encontrado por Means et al.
93
Discussão
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
(1981) e Tebet ( 2002) e contrariando os resultados encontrados por outros estudos
(Gale at al., 1985; Noble e Wrathall, 1985; Bresnahan et al., 1987; Basso et al.,
1995, 1996; Kuhn e Wrathall, 1998), que demonstraram correlação direta,
principalmente do tecido de substância branca residual e a função neurológica
remanescente, o que nos faz concluir que essa relação ainda é uma dúvida e não
podemos correlacionar os efeitos clínicos de uma droga aos seus efeitos biológicos e
histológicos.
Na literatura, persistem controvérsias quanto à melhora do resultado da
função locomotora e da preservação de tecido nervoso com a utilização da MP na
lesão medular experimental em ratos, tampouco se pode relacionar a diminuição de
tecido lesionado em estudos histológicos com a melhora funcional (Tebet, 2002;
Rabchevsky et al., 2002). Dessa forma, os princípios em que ocorre a recuperação
da função neurológica permanecem desconhecidos, podendo envolver diferentes
mecanismos ainda não entendidos.
O homem tem procurado estudar incessantemente os mecanismos e alterações
biológicas que ocorrem no paciente com trauma medular agudo. Este presente estudo
abre portas e incentiva novos estudos para o melhor entendimento dessas alterações e
para novas pesquisas com essas e outras novas drogas. Talvez um dia a ciência
médica consiga encontrar um tratamento que nos possibilite curar ou, ao menos,
melhorar a qualidade de vida desses pacientes.
7. CONCLUSÕES
95
Conclusões
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
7
7
-
-
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
Õ
Õ
E
E
S
S
1 - A metilprednisolona isolada e sua associação com o gangliosídeo GM-1
mostraram-se eficazes na recuperação da função locomotora;
2 - A metilprednisolona, o GM-1 e sua associação demonstraram, independente do
tipo de coloração e da zona, eficácia na preservação de tecido medular;
3 - No centro da lesão, o gangliosídeo GM-1 teve ação na preservação, tanto de
substância branca como de substância cinzenta, e a MP agiu somente na
preservação da substância branca;
4 - A substância cinzenta apresentou-se mais suscetível à lesão que a substância
branca;
5 - Não houve correlação entre os achados histomorfométricos e a recuperação da
função locomotora.
8. ANEXOS
97
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
8
8
-
-
A
A
N
N
E
E
X
X
O
O
S
S
Anexo A - Ficha de pontuação com os atributos que acompanham a escala de
avaliação locomotora de BBB
Rat#:___________ Data:________________ DPO:___________ Escore: E_____D_____
Movimento do membro Posição
do Tronco
Abdomen
Posição
da Pata Passo
Coordination
Limpar
Patas
Posição
Predominante
da pata
Instabilidade do Tronco
Rabo
Plantar PL.
contato
Inicial
Elevar
Quadril Joelho Tornoz.
Varrer w/o
Sup.
w.
Sup.
Dorsal Plantar
E D E D E D Lado Prop E D E D E D E D E D
Ø Ø Ø Ø Ø Ø E D E D Arrasto E D E D E D Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø I I I I
Acima
S S S S S S Paralelo 0 0 0 0 0 0 0 E E E E
E E E E E E Alto F F F F F F F P P P P
Baixo
C C C C C C C
E= esquedo D=direito Tornoz=tornozelo
Comment: ________________________________________________________________________
Ø – Sem movimento Ø – Nada 0% I – Rotação interna
S – Movimento leve 0 – Ocasional <50% E – Rotação Externa
E – Movimento extenso F – Freqüente 51 - 94% P - Paralela
C – Consistente95-100%
FONTE: BASSO et al. (1995)
98
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Anexo B - Escala de avaliação locomotora de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)
0 Sem movimentos observáveis na pata traseira (PT)
1 Leve movimento de uma das duas articulações, usualmente o quadril e/ou o joelho
2 Extenso movimento de uma articulação ou extenso movimento de uma articulação e um leve movimento de
outra
3 Extenso movimento de duas articulações
4 Leve movimento de todas as três articulações da PT
5 Leve movimento de duas articulações e extenso movimento da terceira
6 Extenso movimento de duas articulações e leve da terceira
7 Extenso movimento de todas as três articulações da PT
8 Arrastar ou acomodação plantar da PT sem suporte de peso
9 Acomodação plantar da PT com suporte de peso somente quando imóvel ou ocasional. Freqüente ou
consistente apoio dorsal e sem apoio plantar da pata
10 Ocasional suporte de peso plantar, sem coordenação PT-PD
11 Freqüente a consistente suporte de peso plantar e sem coordenação PT-PD
12 Freqüente a consistente suporte de peso plantar e ocasional coordenação PT-PD
13 Freqüente a consistente suporte de peso plantar e freqüente coordenação PT-PD
14 Suporte de peso plantar consistente, consistente coordenação PT-PD, posição predominante da pata durante
a locomoção em rotação (interna ou externa), quando realizado contato inicial no solo quando solto, ou
freqüente suporte plantar, consistente coordenação PT-PD e ocasionais passadas dorsais
15 Consistentes passadas plantares e consistente coordenação PT-PD e sem limpeza dos pés ou ocasional
limpeza dos pés durante a ascensão adiante do membro, posição predominante da pata ao contato inicial é
paralela ao corpo
16 Consistentes passadas plantares e consistente coordenação PT-PD durante a marcha e freqüente limpeza dos
pés durante a ascensão adiante do membro, posição predominante da pata ao contato inicial é paralela ao
corpo e rodada ao se levantar
17 Consistentes passadas plantares e consistente coordenação PT-PD durante a marcha e freqüente limpeza dos
pés durante a ascensão adiante do membro, posição predominante da pata é paralela ao corpo ao contato
inicial e ao se levantar
18 Consistentes passadas plantares e consistente coordenação PT-PD durante a marcha e consistente limpeza
dos pés durante a ascensão adiante do membro, posição predominante da pata ao contato inicial é paralela
ao corpo e rodada ao se levantar
19 Consistentes passadas plantares e consistente coordenação PT-PD durante a marcha e consistente limpeza
dos pés durante a ascensão adiante do membro, posição predominante da pata é paralela ao corpo ao
contato inicial e ao se levantar e o rabo está para baixo parte ou todo o tempo
20 Consistentes passadas plantares e consistente coordenação PT-PD durante a marcha e consistente limpeza
dos pés, posição predominante da pata é paralela ao corpo ao contato inicial e ao se levantar, e instabilidade
dom tronco; o rabo está para cima consistentemente
21 Consistentes passadas plantares e coordenação de marcha, consistente limpeza dos pés. Posição
predominante da pata é paralela por todo o instante, e consistente estabilidade do tronco; rabo
consistentemente elevado
Nota. Leve: movimento parcial menor que a metade da amplitude normal. Extensivo: movimento maior que a
metade da amplitude. Varrer: movimentos rítmicos de extensão para flexão completa e novamente extensão da
PT. Sem suporte de peso: sem contração dos músculos extensores da PT durante a acomodação plantar da pata
ou sem elevação do quarto traseiro. Suporte de peso: presença de contração dos músculos extensores da PT
durante a acomodação plantar da pata ou elevação do quarto traseiro. Apoio plantar: pata em contato plantar
com suporte de peso. Apoio dorsal: peso suportado pela superfície dorsal em alguns pontos do ciclo da marcha.
Coordenação PT-PD: para cada passo da pata dianteira um passo da pata traseira é dado. Ocasional: menor ou
igual a 50%. Freqüente: maior que a metade , mas não sempre (51-94%). Consistente: quase sempre ou sempre
(95-100%). Instabilidade de tronco: deslocamento lateral do peso que cause balançar de latero-lateral ou
colapso parcial do tronco.
FONTE: BASSO et al. (1995)
99
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Anexo C - Distribuição do valor-P da comparação entre os dados da avaliação
funcional de BBB no 2º, 7º e 14º dias de pós-lesão medular em cada
grupo. Comparação entre os dias de avaliação e entre os grupos. Teste de
Mann-Whitney
Comparações Total* 2º DPLM 7º DPLM 14º DPLM
7º X 2º
< 0,0001
14º X 2º
< 0,0001
14º X 7º
< 0,0001
Entre os Grupos **
0,4181
0,0401 0,0030
Controle X MP
- 0,0668
0,0165
Controle X GM1
- 0,8020 0,0891
Controle X MP+GM1
-
0,0190 0,0165
MP X GM1
- 0,2939 0,1156
MP X MP+GM1
- 0,1444 0,1238
GM1 X MP+GM1
-
Teste de Mann-Whitney
* teste do Sinal (pareado - antes e depois)
** teste de Kruskall-Wallis
DPLM: dia de pós-lesão medular
FONTE: LETRAN-IOT-HC-FMUSP
100
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
54,903,085,6110,222,462,7468,71
2,353,42
24
53,942,604,8224,92
2,44
3,25
73,562,423,2923
41,552,415,808,75
3,65
4,0064,401,99
3,0922
50,17
1,44
2,8733,881,622,4571,092,413,3921
58,88
3,58
6,0828,603,875,4270,712,803,9620
62,102,313,7212,74
2,74
3,1462,352,07
3,3219
MP+GM1
59,542,313,8844,11
1,85
3,3167,522,37
3,5118
56,27
1,84
3,2742,201.893,2769,742,423,4717
55,49
2,83
5,1032,67
2,04
3,0370,682,70
3,8216
61,872,453,9628,67
1,992,79
59,642,29
3,8415
67,132,393,5658,06
1,694,03
64,022,42
3,7814
41,791,63
3,90
41,95
1,913,2977,25
1,97
2,5513
MP
52,94
2,34
4,4246,85
1,35
2,5460,782,03
3,3412
43,54
1,824,1854,52
1,36
2,9970,062,27
3,2411
56,80
2,344,1270,40
0,82
2,7765,262,16
3,3110
55,23
2,434,4042,00
1,74
3,0059,77
1,592,669
52,19
2,985,7153,68
1,32
2,8567,37
2,56
3,808
77,37
2,53
3,2754,711,252,7665,11
2,09
3,21
7
GM1
41,10
1,87
4,5518,51
2,513,0870,40
2,45
3,486
37,00
2,125,7314,08
2,382,7763,78
1,993,125
35,55
1,714,8119,88
2,743,42
76,42
2,823,694
39,73
1,764,4314,152,673,1170,20
2,45
3,493
38,87
1,85
4,7622,71
2,453,1766,33
1,99
3,002
31,84
1,213,8027,06
2,483,4051,46
2,124,121
Controle
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Á
rea total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Colora
ç
ão de Luxol
Anexo D -
Distribui
ç
ão dos dados morfom
é
rtricos
(á
rea total,
á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ç
ão de
luxol agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Controle, GM1, MP e MP+GM1
54,903,085,6110,222,462,7468,71
2,353,42
24
53,942,604,8224,92
2,44
3,25
73,562,423,2923
41,552,415,808,75
3,65
4,0064,401,99
3,0922
50,17
1,44
2,8733,881,622,4571,092,413,3921
58,88
3,58
6,0828,603,875,4270,712,803,9620
62,102,313,7212,74
2,74
3,1462,352,07
3,3219
MP+GM1
59,542,313,8844,11
1,85
3,3167,522,37
3,5118
56,27
1,84
3,2742,201.893,2769,742,423,4717
55,49
2,83
5,1032,67
2,04
3,0370,682,70
3,8216
61,872,453,9628,67
1,992,79
59,642,29
3,8415
67,132,393,5658,06
1,694,03
64,022,42
3,7814
41,791,63
3,90
41,95
1,913,2977,25
1,97
2,5513
MP
52,94
2,34
4,4246,85
1,35
2,5460,782,03
3,3412
43,54
1,824,1854,52
1,36
2,9970,062,27
3,2411
56,80
2,344,1270,40
0,82
2,7765,262,16
3,3110
55,23
2,434,4042,00
1,74
3,0059,77
1,592,669
52,19
2,985,7153,68
1,32
2,8567,37
2,56
3,808
77,37
2,53
3,2754,711,252,7665,11
2,09
3,21
7
GM1
41,10
1,87
4,5518,51
2,513,0870,40
2,45
3,486
37,00
2,125,7314,08
2,382,7763,78
1,993,125
35,55
1,714,8119,88
2,743,42
76,42
2,823,694
39,73
1,764,4314,152,673,1170,20
2,45
3,493
38,87
1,85
4,7622,71
2,453,1766,33
1,99
3,002
31,84
1,213,8027,06
2,483,4051,46
2,124,121
Controle
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Á
rea total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Colora
ç
ão de Luxol
-
Distribui
ç
ão dos dados morfom
é
rtricos
(á
rea total,
á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ç
ão de
luxol agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Controle, GM1, MP e MP+GM1
54,903,085,6110,222,462,7468,71
2,353,42
24
53,942,604,8224,92
2,44
3,25
73,562,423,2923
41,552,415,808,75
3,65
4,0064,401,99
3,0922
50,17
1,44
2,8733,881,622,4571,092,413,3921
58,88
3,58
6,0828,603,875,4270,712,803,9620
62,102,313,7212,74
2,74
3,1462,352,07
3,3219
MP+GM1
59,542,313,8844,11
1,85
3,3167,522,37
3,5118
56,27
1,84
3,2742,201.893,2769,742,423,4717
55,49
2,83
5,1032,67
2,04
3,0370,682,70
3,8216
61,872,453,9628,67
1,992,79
59,642,29
3,8415
67,132,393,5658,06
1,694,03
64,022,42
3,7814
41,791,63
3,90
41,95
1,913,2977,25
1,97
2,5513
MP
52,94
2,34
4,4246,85
1,35
2,5460,782,03
3,3412
43,54
1,824,1854,52
1,36
2,9970,062,27
3,2411
56,80
2,344,1270,40
0,82
2,7765,262,16
3,3110
55,23
2,434,4042,00
1,74
3,0059,77
1,592,669
52,19
2,985,7153,68
1,32
2,8567,37
2,56
3,808
77,37
2,53
3,2754,711,252,7665,11
2,09
3,21
7
GM1
41,10
1,87
4,5518,51
2,513,0870,40
2,45
3,486
37,00
2,125,7314,08
2,382,7763,78
1,993,125
35,55
1,714,8119,88
2,743,42
76,42
2,823,694
39,73
1,764,4314,152,673,1170,20
2,45
3,493
38,87
1,85
4,7622,71
2,453,1766,33
1,99
3,002
31,84
1,213,8027,06
2,483,4051,46
2,124,121
Controle
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Á
rea total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Colora
ç
ão de Luxol
Anexo D -
Distribui
ç
ão dos dados morfom
é
rtricos
(á
rea total,
á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ç
ão de
luxol agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Controle, GM1, MP e MP+GM1
54,903,085,6110,222,462,7468,71
2,353,42
24
53,942,604,8224,92
2,44
3,25
73,562,423,2923
41,552,415,808,75
3,65
4,0064,401,99
3,0922
50,17
1,44
2,8733,881,622,4571,092,413,3921
58,88
3,58
6,0828,603,875,4270,712,803,9620
62,102,313,7212,74
2,74
3,1462,352,07
3,3219
MP+GM1
59,542,313,8844,11
1,85
3,3167,522,37
3,5118
56,27
1,84
3,2742,201.893,2769,742,423,4717
55,49
2,83
5,1032,67
2,04
3,0370,682,70
3,8216
61,872,453,9628,67
1,992,79
59,642,29
3,8415
67,132,393,5658,06
1,694,03
64,022,42
3,7814
41,791,63
3,90
41,95
1,913,2977,25
1,97
2,5513
MP
52,94
2,34
4,4246,85
1,35
2,5460,782,03
3,3412
43,54
1,824,1854,52
1,36
2,9970,062,27
3,2411
56,80
2,344,1270,40
0,82
2,7765,262,16
3,3110
55,23
2,434,4042,00
1,74
3,0059,77
1,592,669
52,19
2,985,7153,68
1,32
2,8567,37
2,56
3,808
77,37
2,53
3,2754,711,252,7665,11
2,09
3,21
7
GM1
41,10
1,87
4,5518,51
2,513,0870,40
2,45
3,486
37,00
2,125,7314,08
2,382,7763,78
1,993,125
35,55
1,714,8119,88
2,743,42
76,42
2,823,694
39,73
1,764,4314,152,673,1170,20
2,45
3,493
38,87
1,85
4,7622,71
2,453,1766,33
1,99
3,002
31,84
1,213,8027,06
2,483,4051,46
2,124,121
Controle
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Á
rea total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Colora
ç
ão de Luxol
-
Distribui
ç
ão dos dados morfom
é
rtricos
(á
rea total,
á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ç
ão de
luxol agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Controle, GM1, MP e MP+GM1
101
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
39,35
2,055,2122,77
0,743,2522,51
0,773,42
24
32,57
1,43
4,3923,92
0,943,93
21,710,71
3,27
23
35,36
1,57
4,4425,080,823,2723,05
0,713,08
22
29,55
0,86
2,917,980,263,2621,080,74
3,51
21
37,44
2,22
5,938,370,384,5425,831,01
3,91
20
31,08
1,15
3,722,360,914,0720,470,69
3,37
19
MP+GM1
29,44
1,214,1118,32
0,593,2219,45
0,643,29
18
20,60
0,623,0122,49
0,652,8918,39
0,643,48
17
32,22
1,735,3720,71
0,582,820,14
0,763,77
16
28,82
1,153,9917,51
0,593,3717,35
0,683,92
15
23,56
0,863,6519,88
0,683,4219,64
0,663,36
14
34,941,38
3,95
30,031,093,6324,890,57
2,29
13
MP
27,521,124,0725,500,773,0228,210,9
3,19
12
41,63
1,744,1828,86
0,993,4323,17
0,763,28
11
33,81
1,414,1727,25
0,913,3425,30
0,83
3,28
10
35,19
1,524,3226,520,873,2821,530,59
2,74
9
43,522,525,7927,53
0,983,5623,02
0,873,78
8
21,410,73,2724,36
0,763,1224,07
0,78
3,24
7
GM1
20,190,874,3117,770,593,3221,79
0,783,58
6
28,161,565,541,940,063,0918,84
0,55
2,92
5
21,77
0,96
4,4126,820,963,5819,46
0,72
3,7
4
22,49
1,12
4,9818,180,56
3,08
18,86
0,633,34
3
26,13
1,21
4,6320,470,612,9818,34
0,532,89
2
23,860,89
3,7320,310,793,8919,43
0,75
3,86
1
Controle
Percentual de
área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Coloração de
Cresyl
Anexo E
-
Distribui
ção dos dados morfomértricos (área total, á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ção de cresyl
agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Con
trole, GM1, MP e MP+GM1
39,35
2,055,2122,77
0,743,2522,51
0,773,42
24
32,57
1,43
4,3923,92
0,943,93
21,710,71
3,27
23
35,36
1,57
4,4425,080,823,2723,05
0,713,08
22
29,55
0,86
2,917,980,263,2621,080,74
3,51
21
37,44
2,22
5,938,370,384,5425,831,01
3,91
20
31,08
1,15
3,722,360,914,0720,470,69
3,37
19
MP+GM1
29,44
1,214,1118,32
0,593,2219,45
0,643,29
18
20,60
0,623,0122,49
0,652,8918,39
0,643,48
17
32,22
1,735,3720,71
0,582,820,14
0,763,77
16
28,82
1,153,9917,51
0,593,3717,35
0,683,92
15
23,56
0,863,6519,88
0,683,4219,64
0,663,36
14
34,941,38
3,95
30,031,093,6324,890,57
2,29
13
MP
27,521,124,0725,500,773,0228,210,9
3,19
12
41,63
1,744,1828,86
0,993,4323,17
0,763,28
11
33,81
1,414,1727,25
0,913,3425,30
0,83
3,28
10
35,19
1,524,3226,520,873,2821,530,59
2,74
9
43,522,525,7927,53
0,983,5623,02
0,873,78
8
21,410,73,2724,36
0,763,1224,07
0,78
3,24
7
GM1
20,190,874,3117,770,593,3221,79
0,783,58
6
28,161,565,541,940,063,0918,84
0,55
2,92
5
21,77
0,96
4,4126,820,963,5819,46
0,72
3,7
4
22,49
1,12
4,9818,180,56
3,08
18,86
0,633,34
3
26,13
1,21
4,6320,470,612,9818,34
0,532,89
2
23,860,89
3,7320,310,793,8919,43
0,75
3,86
1
Controle
Percentual de
área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Coloração de
Cresyl
-
Distribui
ção dos dados morfomértricos (área total, á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ção de cresyl
agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Con
trole, GM1, MP e MP+GM1
39,35
2,055,2122,77
0,743,2522,51
0,773,42
24
32,57
1,43
4,3923,92
0,943,93
21,710,71
3,27
23
35,36
1,57
4,4425,080,823,2723,05
0,713,08
22
29,55
0,86
2,917,980,263,2621,080,74
3,51
21
37,44
2,22
5,938,370,384,5425,831,01
3,91
20
31,08
1,15
3,722,360,914,0720,470,69
3,37
19
MP+GM1
29,44
1,214,1118,32
0,593,2219,45
0,643,29
18
20,60
0,623,0122,49
0,652,8918,39
0,643,48
17
32,22
1,735,3720,71
0,582,820,14
0,763,77
16
28,82
1,153,9917,51
0,593,3717,35
0,683,92
15
23,56
0,863,6519,88
0,683,4219,64
0,663,36
14
34,941,38
3,95
30,031,093,6324,890,57
2,29
13
MP
27,521,124,0725,500,773,0228,210,9
3,19
12
41,63
1,744,1828,86
0,993,4323,17
0,763,28
11
33,81
1,414,1727,25
0,913,3425,30
0,83
3,28
10
35,19
1,524,3226,520,873,2821,530,59
2,74
9
43,522,525,7927,53
0,983,5623,02
0,873,78
8
21,410,73,2724,36
0,763,1224,07
0,78
3,24
7
GM1
20,190,874,3117,770,593,3221,79
0,783,58
6
28,161,565,541,940,063,0918,84
0,55
2,92
5
21,77
0,96
4,4126,820,963,5819,46
0,72
3,7
4
22,49
1,12
4,9818,180,56
3,08
18,86
0,633,34
3
26,13
1,21
4,6320,470,612,9818,34
0,532,89
2
23,860,89
3,7320,310,793,8919,43
0,75
3,86
1
Controle
Percentual de
área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Coloração de
Cresyl
Anexo E
-
Distribui
ção dos dados morfomértricos (área total, á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ção de cresyl
agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Con
trole, GM1, MP e MP+GM1
39,35
2,055,2122,77
0,743,2522,51
0,773,42
24
32,57
1,43
4,3923,92
0,943,93
21,710,71
3,27
23
35,36
1,57
4,4425,080,823,2723,05
0,713,08
22
29,55
0,86
2,917,980,263,2621,080,74
3,51
21
37,44
2,22
5,938,370,384,5425,831,01
3,91
20
31,08
1,15
3,722,360,914,0720,470,69
3,37
19
MP+GM1
29,44
1,214,1118,32
0,593,2219,45
0,643,29
18
20,60
0,623,0122,49
0,652,8918,39
0,643,48
17
32,22
1,735,3720,71
0,582,820,14
0,763,77
16
28,82
1,153,9917,51
0,593,3717,35
0,683,92
15
23,56
0,863,6519,88
0,683,4219,64
0,663,36
14
34,941,38
3,95
30,031,093,6324,890,57
2,29
13
MP
27,521,124,0725,500,773,0228,210,9
3,19
12
41,63
1,744,1828,86
0,993,4323,17
0,763,28
11
33,81
1,414,1727,25
0,913,3425,30
0,83
3,28
10
35,19
1,524,3226,520,873,2821,530,59
2,74
9
43,522,525,7927,53
0,983,5623,02
0,873,78
8
21,410,73,2724,36
0,763,1224,07
0,78
3,24
7
GM1
20,190,874,3117,770,593,3221,79
0,783,58
6
28,161,565,541,940,063,0918,84
0,55
2,92
5
21,77
0,96
4,4126,820,963,5819,46
0,72
3,7
4
22,49
1,12
4,9818,180,56
3,08
18,86
0,633,34
3
26,13
1,21
4,6320,470,612,9818,34
0,532,89
2
23,860,89
3,7320,310,793,8919,43
0,75
3,86
1
Controle
Percentual de
área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de
área
preservada
Á
rea Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
Percentual de área
preservada
Área Preservada
(mm
2
)
Área total
(mm
2
)
RatoGrupo
Zona CZona B
Zona A
Coloração de
Cresyl
-
Distribui
ção dos dados morfomértricos (área total, á
rea preservada e percentual de
á
rea preservada) segundo a colora
ção de cresyl
agrupados de acordo com a zona de lesão A, B ou C e o grupo: Con
trole, GM1, MP e MP+GM1
102
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Anexo F - Distribuição do valor-P da comparação entre os dados morfomértricos
(área total, área preservada e percentual de área preservada) em cada
zona: A, B e C. Comparação entre as zonas 2 a 2 - teste de Tukey
ZONAS
A B
Área total (mm
2
)
A
- -
B
0,7418 -
C
< 0,0001 < 0,0001
Área Preservada (mm
2
)
A
- -
B
< 0,0001
C
0,0004 < 0,0001
Percentual de Área Preservada
A
- -
B
< 0,0001
-
C
0,0190 < 0,0001
- -
103
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Anexo G - Distribuição do valor-P da comparação entre os dados morfomértricos
(área total, área preservada e percentual de área preservada) e os grupos:
controle, GM1, MP e MP+GM1. Comparação entre os grupos 2 a 2 -
teste de Tukey
Controle GM1 MP
Área total (mm
2
)
Controle - - -
GM1 0,4088 - -
MP 0,4374 1,0000 -
MP + GM1 0,8643 0,0965 0,1076
Área preservada (mm
2
)
Controle - - -
GM1 0,0002 - -
MP 0,0213 0,5140 -
MP + GM1 0,0121 0,6371 0,9974
Percentual de Área preservada
Controle - - -
GM1
< 0,0001
- -
MP
< 0,0001
0,0635 -
MP + GM1
0,003 < 0,0001
0,1715
- - -
104
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
0,0069< 0,0001
0,0926
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ MP + GM1
-0,9093< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / MP
--< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ GM1
--
-
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / Controle
--
--0,99200,82250,3757Crezil / MP + GM1
-----0,31200,8739
Crezil
/ MP
-
-
----
0,0093
Crezil / GM1
-
------
Crezil
/ Controle
Percentual de área preservada
Luxol /
MP
Luxol /
GM1
Luxol /
Controle
Crezil
/
MP + GM1
Crezil /
MP
Crezil
/
GM1
Crezil
/
Controle
Anexo H
- Distribui
ç
ão do valor -p da compara ç
ão entre os dados
morfom
étricos de percentual de á
rea preservada em cada grupo
(Controle, GM1, MP e MP+GM1) e em cada tipo de colora
ção. Comparaç
ão entre as associa
ç
ões colora
ção e grupo 2 a 2
- teste de
Tukey
0,0069< 0,0001
0,0926
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ MP + GM1
-0,9093< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / MP
--< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ GM1
--
-
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / Controle
--
--0,99200,82250,3757Crezil / MP + GM1
-----0,31200,8739
Crezil
/ MP
-
-
----
0,0093
Crezil / GM1
-
------
Crezil
/ Controle
Percentual de área preservada
Luxol /
MP
Luxol /
GM1
Luxol /
Controle
Crezil
/
MP + GM1
Crezil /
MP
Crezil
/
GM1
Crezil
/
Controle
- Distribui
ç
ão do valor -p da compara ç
ão entre os dados
morfom
étricos de percentual de á
rea preservada em cada grupo
(Controle, GM1, MP e MP+GM1) e em cada tipo de colora
ção. Comparaç
ão entre as associa
ç
ões colora
ção e grupo 2 a 2
- teste de
Tukey
0,0069< 0,0001
0,0926
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ MP + GM1
-0,9093< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / MP
--< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ GM1
--
-
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / Controle
--
--0,99200,82250,3757Crezil / MP + GM1
-----0,31200,8739
Crezil
/ MP
-
-
----
0,0093
Crezil / GM1
-
------
Crezil
/ Controle
Percentual de área preservada
Luxol /
MP
Luxol /
GM1
Luxol /
Controle
Crezil
/
MP + GM1
Crezil /
MP
Crezil
/
GM1
Crezil
/
Controle
Anexo H
- Distribui
ç
ão do valor -p da compara ç
ão entre os dados
morfom
étricos de percentual de á
rea preservada em cada grupo
(Controle, GM1, MP e MP+GM1) e em cada tipo de colora
ção. Comparaç
ão entre as associa
ç
ões colora
ção e grupo 2 a 2
- teste de
Tukey
0,0069< 0,0001
0,0926
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ MP + GM1
-0,9093< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / MP
--< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol
/ GM1
--
-
< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
Luxol / Controle
--
--0,99200,82250,3757Crezil / MP + GM1
-----0,31200,8739
Crezil
/ MP
-
-
----
0,0093
Crezil / GM1
-
------
Crezil
/ Controle
Percentual de área preservada
Luxol /
MP
Luxol /
GM1
Luxol /
Controle
Crezil
/
MP + GM1
Crezil /
MP
Crezil
/
GM1
Crezil
/
Controle
- Distribui
ç
ão do valor -p da compara ç
ão entre os dados
morfom
étricos de percentual de á
rea preservada em cada grupo
(Controle, GM1, MP e MP+GM1) e em cada tipo de colora
ção. Comparaç
ão entre as associa
ç
ões colora
ção e grupo 2 a 2
- teste de
Tukey
105
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
< 0,00011,00001,00000,0005
1,00001,00000,96361,0000
0,0001< 0,0001
1,0000MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,00010,0007< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
0,00231,0000< 0,0001MP + GM1 / B
-
-0,9961< 0,00011,00001,00000,71491,0000< 0,0001< 0,00010,9986
MP + GM1 / A
-
--0,00301,00000,99890,99880,99990,0009< 0,00011,0000
MP / C
-
---0,0004< 0,00010,05850,00021,00000,00030,0019
MP / B
---
--1,00000,95171,0000
< 0,0001< 0,0001
1,0000MP / A
-
--
---0,79761,0000
< 0,0001< 0,0001
0,9997GM1 / C
-
------0,90630,0235< 0,00010,9967
GM1 / B
-
-------< 0,0001< 0,00011,0000
GM1 / A
-
--------0,00090,0006
Controle / C
---
-------
< 0,0001
Controle / B
---
--------
Controle / A
Percentual de área preservada
< 0,00010,03570,3755< 0,00010,0133
0,9999
< 0,00010,00340,0018< 0,00010,0069
MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,0001
0,3901
< 0,0001< 0,00010,0327< 0,0001< 0,0001
1,0000
< 0,0001
MP + GM1 / B
--0,99770,02951,00000,22280,36820,99990,9992< 0,00011,0000
MP + GM1 / A
-
--
0,00090,97710,84350,03450,86530,7747< 0,00010,9382
MP / C
-
--
-0,0730< 0,00010,99640,19230,27460,12230,1206
MP / B
-
--
--0,10760,58381,00001,0000
< 0,0001
1,0000
MP / A
-
--
---
< 0,0001
0,03630,0214
< 0,00010,0644
GM1 / C
---
----0,83490,9094
0,00520,7176
GM1 / B
-
-
------1,0000
< 0,00011,0000
GM1 / A
-
-
------
-
< 0,00011,0000
Controle / C
--
------
-
-
< 0,0001
Controle / B
--
----
--
---
Controle / A
Área preservada
MP+GM1 /
B
MP+GM1 /
A
MP
/ C
MP
/ B
MP
/ A
GM1
/ C
GM1
/ B
GM1
/ A
Controle
/ C
Controle
/ B
Controle
/A
Anexo I
-
Distribuiç
ão do valor
-p da comparaç
ão entre os dados
morfom
é
rtricos
(
á
rea preservada e percentual de á
rea preservada) e de cada
grupo em ralação as zonas A, B e C. Efeito do grupo e da zona, independente da coloração. Compara
ç
ão entre as associa
ç
ões dos
grupos e região
- 2 a 2
- teste de
Tukey
< 0,00011,00001,00000,0005
1,00001,00000,96361,0000
0,0001< 0,0001
1,0000MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,00010,0007< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
0,00231,0000< 0,0001MP + GM1 / B
-
-0,9961< 0,00011,00001,00000,71491,0000< 0,0001< 0,00010,9986
MP + GM1 / A
-
--0,00301,00000,99890,99880,99990,0009< 0,00011,0000
MP / C
-
---0,0004< 0,00010,05850,00021,00000,00030,0019
MP / B
---
--1,00000,95171,0000
< 0,0001< 0,0001
1,0000MP / A
-
--
---0,79761,0000
< 0,0001< 0,0001
0,9997GM1 / C
-
------0,90630,0235< 0,00010,9967
GM1 / B
-
-------< 0,0001< 0,00011,0000
GM1 / A
-
--------0,00090,0006
Controle / C
---
-------
< 0,0001
Controle / B
---
--------
Controle / A
Percentual de área preservada
< 0,00010,03570,3755< 0,00010,0133
0,9999
< 0,00010,00340,0018< 0,00010,0069
MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,0001
0,3901
< 0,0001< 0,00010,0327< 0,0001< 0,0001
1,0000
< 0,0001
MP + GM1 / B
--0,99770,02951,00000,22280,36820,99990,9992< 0,00011,0000
MP + GM1 / A
-
--
0,00090,97710,84350,03450,86530,7747< 0,00010,9382
MP / C
-
--
-0,0730< 0,00010,99640,19230,27460,12230,1206
MP / B
-
--
--0,10760,58381,00001,0000
< 0,0001
1,0000
MP / A
-
--
---
< 0,0001
0,03630,0214
< 0,00010,0644
GM1 / C
---
----0,83490,9094
0,00520,7176
GM1 / B
-
-
------1,0000
< 0,00011,0000
GM1 / A
-
-
------
-
< 0,00011,0000
Controle / C
--
------
-
-
< 0,0001
Controle / B
--
----
--
---
Controle / A
Área preservada
MP+GM1 /
B
MP+GM1 /
A
MP
/ C
MP
/ B
MP
/ A
GM1
/ C
GM1
/ B
GM1
/ A
Controle
/ C
Controle
/ B
Controle
/A
-
Distribuiç
ão do valor
-p da comparaç
ão entre os dados
morfom
é
rtricos
(
á
rea preservada e percentual de á
rea preservada) e de cada
grupo em ralação as zonas A, B e C. Efeito do grupo e da zona, independente da coloração. Compara
ç
ão entre as associa
ç
ões dos
grupos e região
- 2 a 2
- teste de
Tukey
< 0,00011,00001,00000,0005
1,00001,00000,96361,0000
0,0001< 0,0001
1,0000MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,00010,0007< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
0,00231,0000< 0,0001MP + GM1 / B
-
-0,9961< 0,00011,00001,00000,71491,0000< 0,0001< 0,00010,9986
MP + GM1 / A
-
--0,00301,00000,99890,99880,99990,0009< 0,00011,0000
MP / C
-
---0,0004< 0,00010,05850,00021,00000,00030,0019
MP / B
---
--1,00000,95171,0000
< 0,0001< 0,0001
1,0000MP / A
-
--
---0,79761,0000
< 0,0001< 0,0001
0,9997GM1 / C
-
------0,90630,0235< 0,00010,9967
GM1 / B
-
-------< 0,0001< 0,00011,0000
GM1 / A
-
--------0,00090,0006
Controle / C
---
-------
< 0,0001
Controle / B
---
--------
Controle / A
Percentual de área preservada
< 0,00010,03570,3755< 0,00010,0133
0,9999
< 0,00010,00340,0018< 0,00010,0069
MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,0001
0,3901
< 0,0001< 0,00010,0327< 0,0001< 0,0001
1,0000
< 0,0001
MP + GM1 / B
--0,99770,02951,00000,22280,36820,99990,9992< 0,00011,0000
MP + GM1 / A
-
--
0,00090,97710,84350,03450,86530,7747< 0,00010,9382
MP / C
-
--
-0,0730< 0,00010,99640,19230,27460,12230,1206
MP / B
-
--
--0,10760,58381,00001,0000
< 0,0001
1,0000
MP / A
-
--
---
< 0,0001
0,03630,0214
< 0,00010,0644
GM1 / C
---
----0,83490,9094
0,00520,7176
GM1 / B
-
-
------1,0000
< 0,00011,0000
GM1 / A
-
-
------
-
< 0,00011,0000
Controle / C
--
------
-
-
< 0,0001
Controle / B
--
----
--
---
Controle / A
Área preservada
MP+GM1 /
B
MP+GM1 /
A
MP
/ C
MP
/ B
MP
/ A
GM1
/ C
GM1
/ B
GM1
/ A
Controle
/ C
Controle
/ B
Controle
/A
Anexo I
-
Distribuiç
ão do valor
-p da comparaç
ão entre os dados
morfom
é
rtricos
(
á
rea preservada e percentual de á
rea preservada) e de cada
grupo em ralação as zonas A, B e C. Efeito do grupo e da zona, independente da coloração. Compara
ç
ão entre as associa
ç
ões dos
grupos e região
- 2 a 2
- teste de
Tukey
< 0,00011,00001,00000,0005
1,00001,00000,96361,0000
0,0001< 0,0001
1,0000MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,00010,0007< 0,0001< 0,0001< 0,0001< 0,0001
0,00231,0000< 0,0001MP + GM1 / B
-
-0,9961< 0,00011,00001,00000,71491,0000< 0,0001< 0,00010,9986
MP + GM1 / A
-
--0,00301,00000,99890,99880,99990,0009< 0,00011,0000
MP / C
-
---0,0004< 0,00010,05850,00021,00000,00030,0019
MP / B
---
--1,00000,95171,0000
< 0,0001< 0,0001
1,0000MP / A
-
--
---0,79761,0000
< 0,0001< 0,0001
0,9997GM1 / C
-
------0,90630,0235< 0,00010,9967
GM1 / B
-
-------< 0,0001< 0,00011,0000
GM1 / A
-
--------0,00090,0006
Controle / C
---
-------
< 0,0001
Controle / B
---
--------
Controle / A
Percentual de área preservada
< 0,00010,03570,3755< 0,00010,0133
0,9999
< 0,00010,00340,0018< 0,00010,0069
MP + GM1 / C
-
< 0,0001< 0,0001
0,3901
< 0,0001< 0,00010,0327< 0,0001< 0,0001
1,0000
< 0,0001
MP + GM1 / B
--0,99770,02951,00000,22280,36820,99990,9992< 0,00011,0000
MP + GM1 / A
-
--
0,00090,97710,84350,03450,86530,7747< 0,00010,9382
MP / C
-
--
-0,0730< 0,00010,99640,19230,27460,12230,1206
MP / B
-
--
--0,10760,58381,00001,0000
< 0,0001
1,0000
MP / A
-
--
---
< 0,0001
0,03630,0214
< 0,00010,0644
GM1 / C
---
----0,83490,9094
0,00520,7176
GM1 / B
-
-
------1,0000
< 0,00011,0000
GM1 / A
-
-
------
-
< 0,00011,0000
Controle / C
--
------
-
-
< 0,0001
Controle / B
--
----
--
---
Controle / A
Área preservada
MP+GM1 /
B
MP+GM1 /
A
MP
/ C
MP
/ B
MP
/ A
GM1
/ C
GM1
/ B
GM1
/ A
Controle
/ C
Controle
/ B
Controle
/A
-
Distribuiç
ão do valor
-p da comparaç
ão entre os dados
morfom
é
rtricos
(
á
rea preservada e percentual de á
rea preservada) e de cada
grupo em ralação as zonas A, B e C. Efeito do grupo e da zona, independente da coloração. Compara
ç
ão entre as associa
ç
ões dos
grupos e região
- 2 a 2
- teste de
Tukey
106
Anexos
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
Anexo J - Distribuição do valor-P da comparação entre os dados morfomértricos
de percentual de área preservada na zona B e os grupos: controle, GM1,
MP e MP+GM1. Comparação entre os grupos 2 a 2 - teste de Tukey
Comparações - somente zona B
Cresyl /
Controle
Cresyl /
GM1
Cresyl /
MP
Cresyl /
MP+GM1
Luxol /
Controle
Luxol /
GM1
luXol /
MP
Cresyl / Controle
Cresyl / GM1
0,0747
Cresyl / MP 1,0000 0,9995
Cresyl / MP+GM1
1,0000 0,8736 1,0000
Luxol / Controle 1,0000 0,9609 1,0000 1,0000
Luxol / GM1
< 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001
Luxol / MP
< 0,0001
0,0339 0,0002
< 0,0001 < 0,0001
0,1716
Luxol / MP+GM1 1,0000 0,9806 1,0000 1,0000 1,0000
< 0,0001 < 0,0001
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
108
Referências Bibliográficas
Marcio Oliveira Penna de Carvalho
9
9
–
–
R
R
E
E
F
F
E
E
R
R
Ê
Ê
N
N
C
C
I
I
A
A
S
S
B
B
I
I
B
B
L
L
I
I
O
O
G
G
R
R
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Á
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