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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
HUMBERTO BUSKÜHL
AVALIAÇÃO IN VITRO DO MECANISMO DE AÇÃO CITOTÓXICA DE
LACTONAS SESQUITERPÊNICAS E OUTRAS SUBSTÂNCIAS
ISOLADAS DE Vernonia scorpioides (LAM) PERS.
Itajaí, 2007
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1
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
HUMBERTO BUSKÜHL
AVALIAÇÃO IN VITRO DO MECANISMO DE AÇÃO CITOTÓXICA DE
LACTONAS SESQUITERPÊNICAS E OUTRAS SUBSTÂNCIAS
ISOLADAS DE Vernonia scorpioides (LAM) PERS.
Dissertação submetida à
Universidade do Vale do Itajaí
como partes dos requisitos para
a obtenção do grau de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Profa. Dra. Maique
Weber Biavatti.
Co-orientador: Prof. Dr. Rilton A.
de Freitas.
Itajaí, agosto de 2007.
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2
Avaliação in vitro do mecanismo de ação citotóxica de lactonas
sesquiterpênicas e outras sustâncias isoladas de Vernonia
scorpioides (Lam) Pers.
Humberto Buskühl
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Maique Weber Biavatti, Dr
a
__________________________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Dr
a
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Dr
a
Maique Weber Biavatti UNIVALI
Presidente
______________________________________
Dr Rilton Alves de Freitas UNIVALI
Co-orientador
______________________________________
Dr
a
Ednéia Casagrande Bueno UNIVALI
Membro
______________________________________
Dr Angela Malheiros UNIVALI
Membro
____________________________________
Dr Andersson Barison UFPR
Membro
Itajaí (SC), 16 de agosto de 2007.
3
Dedico esta dissertação a todos que me apoiaram, familiares e amigos,
principalmente aos meus pais e minha namorada
Rafaela, que com paciência e companheirismo
ajudaram a conquistar mais uma vitória em
nossas vidas.
A Deus que me guiou até alcançar os objetivos finais
.
Dedicatória
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha orientadora, Dr
a
Maique Weber Biavatti, que com sua
enorme capacidade científica e capacidade de compreensão, ajudou-me a superar
equívocos e visar objetivos.
Agradeço ao professor Co-Orientador Dr. Rilton Alves de Freitas, que sempre
esteve presente, com sua capacidade intelectual, desvendando qualquer dúvida.
Sou enormemente grato aos meus orientadores e "pais científicos", seus
ensinamento serão úteis tanto para vida profissional como pessoal.
Agradeço as alunas de PIPG Patrícia Moretti e Laryssa Menegueli por sua
dedicação e comprometimento com o trabalho.
Agradeço aos meus colegas de laboratório Silvana Felício, Marina Kaiser e
Felipe Zótico que disponibilizaram seu tempo para ajudar-me em momentos difíceis.
Agradeço a Professora Darlene pela ajuda em experimentos.
Agradeço ao Laboratório Thomson - UINICAMP - por realizar as
espectroscopias de massas.
Agradeço ao Laboratório RMN DQ-UFSCar e DQ-UFPR pela análise das
amostras.
Aos professores Franco Delle Monache e Paulo C. Vieira pelas valiosos
discussões espectroscópicas.
Agradeço a Juliano e Daniel da UFSCar pelo espectro de massas do
poliacetileno.
5
"Non deterret sapientem mors"
Marcus Tullius Cícero (106 a.C. - 46 a.C.)
EPÍGRAFE
6
Avaliação in vitro do mecanismo de ação citotóxica de lactonas
sesquiterpênicas e outras substâncias isoladas de Vernonia
scorpioides (Lam) Pers.
Humberto Buskühl
Agosto/2007
Orientador: Maique Weber Biavatti, Drª.
Co-orientador: Rilton A. de Freitas, Dr.
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.
Número de Páginas: 118.
O desenvolvimento de novos fármacos é de suma importância para o tratamento
quimioterápico, uma vez que tais tratamentos são agressivos ao paciente e alguns
tipos de neoplasias ainda não possuem tratamento. A Vernonia scorpioides
apresenta potencial antitumoral in vivo, mas seu mecanismo de ação e substâncias
efetoras ainda não estão elucidados. Sabe-se que a morte celular tanto de células
tumorais quanto em células não tumorais pode ocorrer por apoptose ou por necrose,
sendo que a apoptose consiste em um processo programado e controlado, trazendo
benefícios no combate a proliferação maligna. O presente trabalho realizou o
isolamento e caracterização de lactonas sesquiterpênicas, um poliacetileno e um
éster do ácido cafeico extraídos de Vernonia scorpioides, sendo o poliacetileno
inédito. Foram determinados, em células tumorais (Hela e B16F10) e células não
tumorais (L929), a citotoxicidade destas substâncias, assim como, o processo de
apoptose por, marcação com Brometo de etídeo e Anexina V-FITC, fragmentação do
DNA e quantificação de caspase 3. O potencial genotóxico também foi verificado
através do ensaio do cometa. Tanto as lactonas sesquiterpênicas quanto o
poliacetileno apresentaram maior citotoxicidade para células tumorais Hela, o
poliacetileno apresentou maiores níveis de indução a apoptose com indução de
caspase 3 com 1 M. Todas as substâncias testadas apresentaram níveis elevados
de genotoxicidade.
Palavras-chave: Vernonia scorpioides. Lactona Sesquiterpênica. Poliacetileno.
Hirsutinolídeo. Glaucolídeo. Hela. B16F10. L929. Atividade citotóxica. Apoptose.
Necrose. Caspase-3.
7
ABSTRACT
IN VITRO EVALUATION OF THE CYTOTOXICITY MECHANISM OF
SESQUITERPENE LACTONES AND OTHER SUBSTANCES ISOLATED FROM
Vernonia scorpioides (Lam) PERS.
Humberto Buskühl
August/2007
Supervisor: Maique Weber Biavatti, Dr.
Co-supervisor: Rilton A. de Freitas, Dr.
Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances.
Number of Pages: 118.
The development of new drugs is of utmost importance for the treatment of cancer.
Vernonia scorpioides presents antiinflammatory and antitumoral effects. In this study,
the investigation of Vernonia scorpioides afforded the hirsutinolide isolate, a mixture
of sesquiterpene lactones and an unpublished polyacetylene. We report on the
cytotoxic activity and the mechanism of cell death exhibited by the substances of
Vernonia scorpioides against adenocarcinoma cell line (Hela), melanoma cells
(B16F10), in comparison with fibroblast (L929). The induction of apoptosis was
determined by DNA fragmentation, Anexin V-FITC and Caspase-3. This study also
evaluated its potential genotoxicity, using the Commet assay. The results suggest
that polyacetylene exhibits antiproliferative effects on Hela cells via apoptosis. All
substances showed high levels of DNA damage
Key words: Vernonia scorpioides. Sesquiterpene lactone. Polyacetylene.
Hirsutinolide. Glaucolide, Hela. B16F10. L929. Cytotoxic activity. Apoptosis.
Necrosis. Caspase 3
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Vernonia scorpioides (LAM) PERS..................................................
27
Figura 2 Processos de morte celular: necrose e apoptose ...........................
30
Figura 3 Vias extrínseca e intrínseca da apoptose........................................
34
Figura 4 Fluxograma do processo de isolamento de substâncias e mistura
de lactonas sesquiterpênicas de V. Scorpioides..............................
37
Figura 5
Poliacetileno (Fração 6) isolada de V. scorpioides..........................
45
Figura 6 Espectro de RMN de
1
H do Poliacetileno.........................................
46
Figura 7 Expansão do espectro de RMN de
1
H do Poliacetileno,
evidenciando a presença de triterpeno............................................
46
Figura 8 Mapa de correlação HSQC do Poliacetileno....................................
48
Figura 9 Mapa de correlação HMBC do Poliacetileno....................................
49
Figura 10 Ampliação do mapa de correlação HMBC do poliacetileno (Fração
6)......................................................................................................
50
Figura 11 Espectro de massas do poliacetileno (Fração 6) obtido por
eletrnspray, modo negativo..............................................................
50
Figura 12
Poliacetileno (Fração 6) isolado da V. scorpioides e as principais
correlações
1
H -
13
C a longa distância.............................................
51
Figura 13
Hirsutinolídeo (Fração 15) isolado da V. scorpioides.......................
52
Figura 14 Espectro de RMN de
1
H do hirsutinolídeo (Fração
15).................................................................................................
53
Figura 15 a. Hirsutinolídeo 19 major (Fração 19-21) b. Glaucolideo 19 minor
em mistura da V. scorpioides...........................................................
54
Figura 16 Espectro de RMN de
1
H da Mistura de lactonas sesquiterpênicas
(Fração 19-21)..................................................................................
55
Figura 17 Ampliação do espectro de RMN de
1
H da Mistura de lactonas
sesquiterpênicas (Fração 19-21)......................................................
55
Figura 18 Espectro de massas da Mistura de lactonas sesquiterpênicas
(Fração 19-21) a. Eletronspray negativo b. Eletronspray positivo...
58
9
Figura 19
Cafeato de etila (Fração 17) isolado da V. scorpioides ...................
59
Figura 20 Espectro de RMN de
1
H do Cafeato de etila (Fração 17)................
60
Figura 21 a. Hirsutinolídeo (S1) b. Glaucolideo (S2) c. Hirsutinolideo (S3)
isolados da V. scorpioides................................................................
61
Figura 22 Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) ao poliacetileno (Fração 6) isolado de V.
scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e
controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado
por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY...........................................................................
63
Figura 23 a. Células L929 após 24 h de contato com poliacetileno. b.
Células B16F10 após 24 h de contato com poliacetileno. c.
Células Hela após 24 h de contato com poliacetileno......................
64
Figura 24 Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) ao hirsutinolídeo (Fração 15) isolado de
V. scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e
controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado
por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY...........................................................................
65
Figura 25 Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) a mistura de lactonas sesquiterpênicas
(Fração 19-21) isolado de V. scorpioides utilizando como controle
negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO).
Gráfico representado por média ± desvio padrão. *p<0,05
**p<0,01 ***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY............................
67
Figura 26 Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) ao cafeato de etila (Fração 17) isolado
de V. scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e
controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado
por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY...........................................................................
68
Figura 27 Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) ao hirsutinolídeo (S1) isolado de V.
scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e
controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado
por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY...........................................................................
69
Figura 28 Viabilidade das células L929
(a)
B16F10
(b)
e Hela
(c)
expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) ao glaucolídeo (S2) isolado de V.
scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e
10
controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado
por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY...........................................................................
71
Figura 29 Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a
1 hora (1) e 24 horas (2) ao hirsutinolídeo (S3) isolado de V.
scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e
controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado
por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY...........................................................................
72
Figura 30 Quantificação da lactato desidrogenase formada na presença de
substâncias isoladas e mistura de lactona sesquiterpênica de V.
scorpioides com exposição de 1 hora em células L929. Utilizando
meio MEM como controle negativo e DMSO (dimetilsulfóxido)
como controle positivo. ***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.....
78
Figura 31 Fragmentação do DNA de células Hela induzidas pela substância
poliacetileno (b) na concentração de 1 M, utilizando
dimetilsulfóxido (DMSO) como controle negativo (a) e paclitaxel
como controle positivo (c) na concentração de 1 M......................
83
Figura 32 Níveis de danos ao DNA ocasionadas pelo Hirsutinolídeo (S1),
Hirsutinolídeo (Fração 15), Hirsutinolídeo (S3) e Glaucolídeo (S2)
(gráfico superior); mistura de lactonas, cafeato de etila e
poliacetileno (gráfico inferior) utilizando como controle negativo
dimetilsulfóxido (DMSO) e metilmetanosulfonato (MMS) como
controle positivo. As células da medula óssea de camundongos
Swiss foram expostas às substâncias testes e controles por 1
hora..................................................................................................
85
Figura 33 Índice de dano ao DNA ocasionadas pelo Hirsutinolídeo (S1),
Hirsutinolídeo (Fração 15), Hirsutinolídeo (S3), Glaucolídeo (S2),
mistura de lactonas, cafeato de etila e poliacetileno. Utilizando
como controle negativo dimetilsulfóxido (DMSO) e
metilmetanosulfonato (MMS) como controle positivo. As células
de medula de camundongos Swiss foram expostas às
substâncias testes e controles por 1 hora. **p<0,01 ***p<0,001
ANOVA seguido de TUKEY.............................................................
86
Figura 34 Cometas (Níveis 2 e 3) em células de medula de camundongo
Swiss com exposição de 1 hora ao Hirsutinolídeo (S3)...................
87
Figura 35 Cometas (Níveis 0 e 1) em células de medula de camundongo
Swiss com exposição de 1 hora ao dimetil sufóxido (DMSO)
utilizado como controle negativo......................................................
87
Figura 36
Cometa (Nível 4) em células de medula de camundongo Swiss
com exposição de 1 hora ao metilmetanosulfanato (MMS)
utilizado como controle positivo.......................................................
87
11
Figura 37
Quantificação da p-nitro anilina (pNa) formada nas células
tumorais B16F10 em presença do Poliacetileno (Fração 6) isolado
de V. scorpioides, utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) para
controle negativo e Paclitaxel como controle positivo com tempo
de exposição de 24 horas. As barras são expressas pela média ±
desvio padrão. *p<0,05 ***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.....
88
Figura 38 Quantificação da p-nitro anilina (pNa) formada nas células
tumorais Hela em presença do Poliacetileno (Fração 6) isolado de
V. scorpioides, utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) para controle
negativo e Paclitaxel como controle positivo com tempo de
exposição de 24 horas. As barras são expressas pela média ±
desvio padrão. **p<0,01 ANOVA seguido de TUKEY......................
89
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C do Poliacetileno (Fração 6)..
51
Tabela 2 Dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C do Hirsutinolídeo (Fração
15)......................................................................................................
53
Tabela 3 Dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C da Mistura de lactonas
sesquiterpênicas 19 major (Fração 19-21)........................................
56
Tabela 4 Dados espectrais de
1
H e
13
CRMN da Mistura de lactonas
sesquiterpênicas 19 minor (Fração 19-21)........................................
56
Tabela 5 Porcentagem de morte celular da mistura de lactonas
sesquiterpênicas e substâncias isoladas de V. scorpioides em
células não tumorais L929 com tempo de exposição de 24 horas, e
células tumorais B16F10 e Hela com tempo de exposição de 24
horas..................................................................................................
74
Tabela 6 Tabela demonstrativa do índice de necrose apresentado pelas
substâncias isoladas e mistura de V. scorpioides no processo de
morte celular através da marcação de morte celular com Anexina
V-FITC e Brometo de Etídeo nas células L929, B16F10 e Hela........
79
13
LISTA DE ABREVIATURAS
L929: fibroblastos de adipócotos de camundongo.
B16F10: melanócitos de melanoma de camundongo.
Hela: adenocarcinoma de cérvix humano.
TNFR1: receptor do fator de necrose tumoral do tipo 1
MMP: potencial de membrana mitocondrial
NF-KB: fator de necrose tumoral KB
AIF: fator de indução de apoptose
BCRJ: banco de células do Rio de Janeiro
MTT: sal de tetrazólio
SFB: soro fetal bovino
LDH: lactato desidrogenase
DTT: ditiotreitol
pNa: p-nitroanilina
EDTA: ácido etilenodiamino tetraacético
SDS: dodecilo sulfato de sódio
MMS: metilmetanosulfonato
DMSO: dimetilsulfonato
CCD: cromatografia em camada delgada
HEX: hexano
DCM: diclorometano
AE: acetato de etila
AC: acetona
EM: espectrometria de massas
RMN de
13
C: ressonância magnética nuclear de carbono
RMN de
1
H: ressonância magnética nuclear de hidrogênio
HMBC: hetero nuclear multiple bond correlation
HSQC: hetero nuclear single quantum coherance
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
................................................................................…...............
16
2 OBJETIVOS
.......................................................................................................
18
2.1Objetivo Geral
..................................................................................................
18
2.2 Objetivos Específicos
....................................................................................
18
3 REVISÃO DA LITERATURA
.........................................................................
19
3.1 Produtos naturais com atividade antitumoral
…………………................
19
3.2 Gênero Vernonia: Ocorrência e aspectos biológicos
………………….
21
3.3 Gênero Vernonia: Atividade antitumoral
..................................................
22
3.4 Gênero Vernonia: Aspecto fitoquímico
.....................................................
24
3.5 Gênero Vernonia: Lactonas sesquiterpênicas e aspectos biológicos
25
3.6 Vernonia scorpioides: Ocorrência e aspectos biológicos..................
26
3.7 Processo de morte celular
...........................................................................
28
3.7.1 Lesão celular irreversível..............................................................................
30
4 MATERIAIS E MÉTODOS
...................…………………………..........
...........
35
4.1 Material Vegetal
……………………………………………………...…..
............
35
4.1.1 Coleta………………………………………………………………………
...........
35
4.1.2 Obtenção de substâncias e mistura de Vernonia scorpioides..................
35
4.1.3 Identificação das substâncias puras e misturas de lactonas….
.............
38
4.2 Cultura de células
…..................………………………………………..
...........
38
4.2.1 Ensaio de Citotoxicidade (MTT)........................................................
..........
39
4.2.2 Formação de Lactato desidrogenase...........................................................
39
4.2.3 Análise da morte celular por microscopia de fluorescência......................
40
4.2.4 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico...............................
41
4.2.5 Análise da fragmentação do DNA.................................................................
41
4.2.6 Ensaio do cometa...........................................................................................
42
4.3 Análise estatística......................................................................
..............
43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
....................................................................
44
5.1 Isolamento de substâncias....................................................................
44
15
5.2 Identificação das substâncias isoladas e mistura de lactonas..........
44
5.2.1 Poliacetileno (Fração 6).................................................................................
45
5.2.2 Hirsutinolídeo (Fração 15).............................................................................
51
5.2.3 Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)................................
54
5.2.4 Cafeato de etila (Fração 17)...........................................................................
59
5.3 Cultivo Celular.........................................................................................
61
5.3.1 Avaliação da viabilidade celular...................................................................
61
5.3.1.1 Poliacetileno (Fração 6)..............................................................................
62
5.3.1.2 Hirsutinolídeo (Fração 15)..........................................................................
64
5.3.1.3 Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21).............................
66
5.3.1.4 Cafeato de etila (Fração 17)........................................................................
67
5.3.1.5 Hirsutinolídeo (S1).......................................................................................
68
5.3.1.6 Glaucolideo (S2)..........................................................................................
70
5.3.1.7 Hirsutinolídeo (S3).......................................................................................
71
5.3.2 Avaliação da morte celular: Necrose X Apoptose.......................................
76
5.3.2.1 Quantificação de lactato desidrogenase...................................................
76
5.3.2.2 Marcadores de morte celular Anexina V-FITC e Brometo de etídeo.....
78
5.3.2.3 Fragmentação do DNA................................................................................
82
5.3.3 Genotoxicidade...............................................................................................
83
5.3.4 Quantificação da caspase 3..........................................................................
88
6 CONCLUSÕES
.................................................................................................
91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
...............................................................
92
ANEXO A...............................................................................................
102
ANEXO B...............................................................................................
115
16
1 INTRODUÇÃO
A procura de novos fármacos com ação antitumoral e propriedades menos
agressivas ao paciente comparada à quimioterapia e radioterapia tem sido de suma
importância. Além da diversidade de tumores que ainda não possuem um tratamento
satisfatório, os quimioterápicos provocam diminuição de leucócitos, deixando o
paciente susceptível a infecções. O possível tratamento que condiciona ao estímulo
do sistema imunológico auxilia na recuperação do paciente (GALLIN; SNYDERMEN,
1999; HENTY et al., 2001; NEVIN; VIJAYAMMAL, 2003; PAGNO, 2004).
A morte celular, tanto de células malignas como de células normais, pode
acontecer por necrose que consiste em uma forma descontrolada e sem
especificidade para as células malignas ocasionando assim, a morte de células em
estado normal. Outra desvantagem da necrose é a indução de um processo
inflamatório em tecidos adjacentes. Entretanto, a morte celular pode acontecer por
apoptose, caracterizado por um processo regulado e mais específico às células
malignas. Neste caso, as células são degeneradas sem destruir a membrana celular,
assim não são liberadas enzimas que agridem os tecidos adjacentes e o processo
inflamatório não é induzido (ROBBINS; COTRAN, 2005).
A indução de apoptose pela lactona sesquiterpênica partenolídeo nas
células de carcinoma do ducto biliar foi verificada por Kim et al. (2005), onde a
diminuição da expressão de Bcl-2 e a produção de radicais de oxigênio são os
possíveis mecanismos que proporcionam a apoptose por estresse oxidativo.
A Vernonia scorpioides é utilizada popularmente como anti-inflamatório e
cicatrizante, sendo o efeito cicatrizante comprovado por Almeida e Palhano (2001) e
a ação anti-inflamatória confirmada por Dalazen et al. (2005).
A ação antitumoral do extrato diclorometano de Vernonia scorpioides em
camundongos foi observada em estudos realizados por Pagno (2004) e Blind e
Moya (2005) frente ao tumor de Ehrlich quando tratados por via intraperitoneal.
Outra vantagem observada com o tratamento da fração diclorometano de Vernonia
scorpioides foi uma indução do sistema imune verificado pelo aumento de neutrófilos
na área tumoral, possibilitando, assim, melhor prognóstico quando comparado ao
tratamento com o quimioterápico 5-fluoro-uracil (PAGNO, 2004).
17
No gênero Vernonia são encontradas diversas substâncias de classes
diferenciadas como flavonóides, esteróides, polissacarídeos e lactonas
sesquiterpênicas, sendo esta última, possivelmente responsável pela ação citotóxica
(HUANG; DING; LIU, 2003; KRISHNA-KUMARI et al., 2003; KOUL et al., 2003; KUO
et al., 2003; NERGARD et al., 2004).
As lactonas sesquiterpênicas apresentam ação antitumoral comprovada
para células de câncer ovariano humano (A2780), extraídas de uma planta do
mesmo gênero, com CI
50
de 3,3 M (WILLIAMS et al., 2005). Além disso, a
citotoxicidade de lactonas sesquiterpênicas foi observada a linhagem de células
tumorais P-388 e A-549 (CHEN et al., 2005).
Em decorrência da agressividade dos agentes quimioterápicos, a dificuldade
de recuperação dos pacientes, a procura de novos fármacos que aumentem o
prognóstico à cura de neoplasias, assim como a escassez de estudos sobre o
mecanismo antitumoral de substâncias isoladas de Vernonia scorpioides, o objetivo
deste estudo foi avaliar o mecanismo de ação das substâncias em melanócitos
(B16F10), adenocarcinoma de cervix uterino (Hela), assim como verificar a ação
citotóxica em células não tumorais de fibroblastos (L929).
18
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Isolar e identificar substâncias das partes aéreas de Vernonia scorpioides,
assim como avaliar o mecanismo apoptótico das mesmas, em duas linhagens de
células tumorais (B16F10 e Hela) e uma não tumoral (L929).
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Realizar o fracionamento fitoquímico da V. scorpioides para a
obtenção e identificação de substâncias isoladas ou identificando os componentes
em mistura.
2.2.2 Verificar a citotoxicidade (CI
50
) para determinar concentração ideal na
relação toxicidade/atividade em 24h, por intermédio de testes in vitro em fibroblastos
(L929) e células tumorais (B16F10 e Hela).
2.2.3 Verificar o potencial genotóxico em células de medula de camundongo
Swiss.
2.2.4 Identificar a indução do processo apoptótico por quantificação de
lactato desidrogenase em células L929, marcação com Anexina V e Brometo de
Etídeo e nas células L929, B16F10 e Hela, assim como, quantificação da atividade
da Caspase 3, nas células tumorais B16F10 e Hela e fragmentação do DNA nas
células Hela.
19
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Produtos naturais com ênfase na atividade antitumoral
A utilização de plantas para o fim medicinal ocorre desde os primórdios da
civilização, sendo suas ações terapêuticas sustentadas por gerações. No longínquo
primeiro século da era cristã já eram estudadas cerca de 600 plantas medicinais,
pelo botânico grego Pedânios Dioscórides, em cinco livros (De matéria medica libri
cinque). Este tratado foi seguido durante cerca de quinze séculos (ROBBERS;
SPEEDIE; WARRS, 1997; ELDIN; DUNFORD, 2001).
Ao passar dos anos, a indústria farmacêutica vem se interessando cada vez
mais pela produção de medicamentos obtidos de plantas medicinais. Somente no
Oeste da Europa e nos Estados Unidos da América o faturamento da indústria
farmacêutica com o consumo de fitoterápicos gira em torno de 4 bilhões de dólares
(2,56 bilhões de libras) por ano. No Reino Unido o comércio de fitoterápicos em 2001
rendeu cerca de 65 milhões de libras, com previsão de crescimento de 50% nos
próximos 5 anos (HEINRICH et al., 2004).
No Brasil, estima-se um crescimento no mercado de fitoterápicos de 5% ao
ano, enquanto o crescimento para os produtos sintéticos gera em torno de 3 a 4%
(REIS; MARIOT; STEENBOCK, 2004).
Contudo, a grande diversidade da flora, principalmente no Brasil, pode ser
mais bem estudada e explorada, tanto no descobrimento de novas substâncias com
potencial terapêutico quanto na elucidação de inúmeras substâncias que são
utilizadas pela população sem o conhecimento de suas propriedades, efeitos
farmacológicos e efeitos tóxicos (TAVARES, 1996).
Estima-se que o planeta possui aproximadamente 500.000 espécies de
plantas superiores. Dentre estas, poucas têm sua completa composição fitoquímica
conhecida, e o percentual é ainda menor quando se trata de potencial terapêutico.
Presume-se que, no mundo, somente 5 a 15% das plantas superiores tenham sido
estudadas na busca de substâncias biologicamente ativas, sendo que no Brasil este
índice é ainda menor (OLIVEIRA; BRAGA, 2003).
20
A medicina moderna interage positivamente com os produtos de origem
natural. Segundo os autores Robbers; Speedie e Warrs (1997) a busca de novas
substâncias em produtos naturais é vantajosa porque, em primeiro plano, os
produtos naturais fornecem fármacos que, por via sintética, a sua obtenção seria
muito difícil e de alto custo; eles também podem ser utilizados como estrutura básica
na obtenção de novos medicamentos, e com pequenas modificações estruturais
tornarem-se mais ativos ou menos tóxicos; ainda podem servir de modelo para a
obtenção de medicamentos sintéticos com atividade biológica semelhante.
Por outro lado, a obtenção de fármacos de produtos naturais tem suas
desvantagens, a falta de reprodutibilidade dos experimentos pode ser considerada o
grande problema enfrentado pelos pesquisadores. O perfil fitoquímico da planta
pode ser alterada por fatores como local e época de coleta, polinizadores diferentes,
sendo necessário realizar screenings em diferentes coletas de diferentes épocas do
ano para minimizar este efeito (RASKIN et al., 2002).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera 252 fármacos como
essenciais para a manutenção da saúde da população de um país, 11% destes
medicamentos são obtidos exclusivamente a partir de plantas superiores
(Angiospermas), número representativo da importância da pesquisa em produtos
naturais (RASKIN et al., 2002).
Os produtos naturais apresentam uma grande diversidade de atividades
biológicas, dentre elas encontra-se a atividade cardiovascular, antibacteriana,
antifúngica, anti-reumática, atividade no sistema nervoso central, anti-tumoral etc.
(NIERO et al., 2003). Dentre estas, destaca-se a ação antitumoral pelo impacto dos
produtos naturais no desenvolvimento de novos fármacos na destruição de células
cancerígenas, sendo que 60% de todos medicamentos utilizados clinicamente para
este fim de origem natural (HEINRICH et al., 2004).
O diterpeno taxol foi a primeira substância isolada com atividade
anticancerígena, e representou um grande salto na obtenção de fármacos
antitumorais. Anos após sua descoberta, com algumas modificações estruturais, foi
gerado um análogo mais ativo que é amplamente utilizado no tratamento de câncer
ovariano, mamário e pulmonar. Existem outras substâncias importantes na ação
antitumoral que provêm de produtos naturais, como a camptotecina, ácido betulínico,
podofilotoxina que gera o etoposídeo e o teniposídeo, vincristina e vinblastina
(MANTLE; LENNARD; PICKERING, 2000; HEINRICH et al., 2004).
21
O câncer é a segunda causa de morte por doença no Brasil, segundo
Instituto Nacional de Câncer (INCA), em 2000 as neoplasias foram responsáveis por
12,73% dos 946.392 óbitos registrados, sendo que 53,97% dos óbitos por neoplasia
ocorreram entre os homens e 46,01%, entre as mulheres (BRASIL, 2000).
De 1940 a 2006 foram descritas 175 novas substâncias com ação
antitumoral, sendo 72,9% provenientes de produtos naturais, e 22,8 % dos mesmos
mencionados a partir do ano 2000 (NEWMAN; CRAGG, 2007).
A procura de novos fármacos com ação antitumoral tem sido muito
importante, visto que ainda existem muitos tipos de tumores que não possuem
tratamento ou são resistentes aos fármacos existentes no mercado atual. Ainda,
tumores que possuem tratamento, possibilita-se a obtenção de um produto menos
agressivo para o organismo comparado com a quimioterapia e radioterapia que, por
sua vez, são tratamentos que afetam principalmente o sistema imunológico do
paciente (NEVIN; VIJAYAMMAL, 2003).
3.2 Gênero Vernonia: Ocorrência e aspectos biológicos
O gênero Vernonia é pertencente à família Asteraceae (Compositae) e está
representada por, aproximadamente, 920 gêneros e 19000 espécies,
compreendendo a maior família das angiospermas. Podem ser ervas, subarbustos,
trepadeiras e árvores, tendo em sua grande maioria pequeno porte (JOLY, 1998). No
Brasil, são estimadas mais de 200 espécies de Vernonia (MONTEIRO et al., 2001).
As espécies de Vernonia apresentam atividade biológica variada. A espécie
V. condensata é utilizada para distúrbios gastrointestinais (MONTEIRO et al., 2001);
a V. colorata e a V. kotschyana são utilizadas para erupções cutâneas (CIOFFI et al.,
2004a; NERGARD et al., 2004), a V. guianensis apresenta atividade antihelmíntica,
afrodisíaca, antídoto para envenenamento, malária e icterícia (TCHINDA et al.,
2002), a V. canescens é ativa contra hemorragias e inflamação, a V. deppeana
auxilia na dor estomacal, a V. leiocarpa é utilizada para tratamento da asma, a V.
patens é um vermífugo, enquanto a V. cinerea é antibacteriana (GUPTA et al.,
2003a). A V. amygdalina apresentou inibição total no crescimento do Sclerotium
22
rolfsii e infecções pós-emergentes (ENIKUOMEHIN; IKOTUN; EKPO, 1998).
Também é relatada atividade antitumoral nas espécies V. pachyclada, V. amygdalina
e V. scorpioides (HOWARD et al., 2003; PAGNO, 2004; WILLIAMS et al., 2005).
Gupta et al. (2003b) verificaram, em ratos, o potencial antipirético do extrato
metanol da V. cinerea nas doses de 250 e 500 mg/kg, indicando uma diminuição da
temperatura corporal nas duas doses, assim como, a diminuição da mesma em caso
de pirexia induzida, obedecendo a uma linearidade dose-dependente. O efeito
antipirético do extrato administrado na dose de 500 mg/kg foi idêntico ao fármaco
padrão paracetamol.
Sy et al. (2005) analisaram a atividade hipoglicemiante e antidiabética da
fração acetona e da fração hexano da V. colorata em ratos normoglicêmicos e
diabéticos induzido por aloxano. A fração acetona induziu um decréscimo
significativo na glicemia dos ratos normoglicêmicos, enquanto que a fração hexano
provocou aumento significativo na glicemia dos normoglicêmicos. Quanto ao
potencial antidiabético a fração acetona apresentou efeito anti-hiperglicemiante no
teste de tolerância oral da glicose em ratos diabéticos.
3.3 Gênero Vernonia: Atividade antitumoral
Em decorrência da procura de novas substâncias antitumorais, ou novas
fontes de obtenção das mesmas Pagno (2004) verificou que a fração diclorometano
(DCM) de V. scorpioides apresentou atividade antitumoral em camundongos com
tumor de Ehrlich quando tratados por via intraperitoneal. Similarmente, Blind e Moya
(2005) demonstraram ação contra o tumor de Ehrlich, em camundongos, com as
frações diclorometano e acetato de etila de V. scorpioides na concentração de 5
mg/kg.
Além da ação antineoplásica, outra vantagem que Pagno (2004) observou,
no tratamento com o extrato diclorometano em relação ao tratamento convencional
com quimioterápico, foi elevação da quantidade de neutrófilos na área tumoral
quando comparados com a região tumoral dos camundongos tratados com o
quimioterápico 5-fluoro-uracil, evidênciado esta determinada por microscopia.
23
Os quimioterápicos provocam, em geral, diminuição do número de
leucócitos, deixando o paciente susceptível a infecções. Então, um tratamento que
possibilita o aumento de neutrófilos e leucócitos em geral, auxilia na recuperação do
paciente, proporcionando um prognóstico favorável para a cura (GALLIN;
SNYDERMEN, 1999; HENTY et al., 2001; PAGNO, 2004).
O efeito citotóxico é comumente verificado em experimentos utilizando
plantas do gênero Vernonia. Dalazen e Molon (2003) demonstraram um efeito
citotóxico da fração diclorometano de V. scorpioides quando em contato com lesões
cutâneas de camundongos sugerindo, assim, que estudos com atividade antitumoral
poderiam ser realizados.
Outras espécies de Vernonia também apresentam propriedadas citotóxicas.
Estudos realizados por Izevbigie; Bryant e Walker (2004) demonstraram um
potencial de inibição da síntese do DNA ocasionado pelo extrato aquoso das folhas
de V. amydalina, sugerindo ser importante na prevenção do câncer de mama.
Vários agentes antitumorais aumentam a expressão de enzimas catalíticas
da fase 2 sem afetar enzimas da fase 1, representadas, principalmente, pelo
citocromo P450 (CYP). Estas enzimas estão envolvidas nos processos oxidativos,
biotransformação e detoxificação, sendo que estes eventos são favoráveis ao
tratamento da neoplasia. Em vista disso, Howard et al. (2003) testaram o potencial
antitumoral da V. amygdalina na expressão do citocromo P450 (fase 1) e do epóxido
hidrolase microssomal (fase 2) como resposta à célula de câncer de mama (MCF-7),
utilizando doses de 3 – 100 g/mL. A expressão do citocromo P450 não foi afetada,
mas ocorreu indução na expressão de enzimas de fase 2, sugerindo um potencial
quimioterápico ao extrato.
Esta mesma espécie exibiu moderada atividade antioxidante frente ao
ensaio de radical livre (1–1 difenil 2–picrilhidrazil), demonstrando também baixo
efeito citoprotetor no ensaio de hemaglutinação de eritrócitos bovinos (IWALEWA et
al., 2005).
Nergard et al. (2005a) extraíram polissacarídeos pectina e arabinogalactona
da V.kotshyana. A pectina apresentou baixa atividade na fixação do complemento e
influencia na proliferação de células B e T, enquanto a arabinogalactona mostrou ser
um potente ativante do complementos, indutor de células T e B. Além disso, esses
polissacarídeos induzem a quimiotaxia de macrófagos, células T e NK. Nergard et al.
24
(2005b) também demonstraram que a arabinogalactona, é um potente ativante da
fixação do complemento e indutor da atividade mitótica das células B.
3.4 Gênero Vernonia: Aspecto fitoquímico
O gênero Vernonia produz substâncias como flavonóides, esteróides,
polissacarídeos e principalmente lactonas sesquiterpênicas, sendo estas últimas,
possivelmente responsáveis pela ação citotóxica (HUANG; DING; LIU, 2003;
KRISHNA-KUMARI et al., 2003; KOUL et al., 2003; KUO et al., 2003; NERGARD et
al., 2004).
A presença de lactonas sesquiterpênicas em V. scorpioides pode ser
observada pelo espectro de infravermelho com absorções entre 1750 cm
-1
e 1770
cm
-1
(FREIRE et al., 1996). Estruturalmente, as lactonas sesquiterpênicas consistem
em seis unidades isoprênicas ligadas a um anel lactônico, recebendo o sufixo
“olideo” (PENGELLY, 2004).
As lactonas sesquiterpênicas apresentam carbonilas , – insaturadas,
epóxidos além de um sistema – metileno – lactona. Estes grupos funcionais são
responsáveis pela ligação aos receptores biológicos proporcionando, assim,
atividade antimicrobiana, antitumoral, antiinflamatória, entre outras (ROBBERS;
SPEEDIE; WARRS, 1997).
As lactonas sesquiterpênicas são divididas basicamente quatro sub-grupos:
Eudesmanolideos com dois anéis de seis membros fundidos; Germacranolideos com
um anel com dez membros; Guaianolideos formado por um anel de cinco membros
fundido com outro anel de sete membros, o C4 é substituído por uma metila; e o
Pseudoguaianolideos igual ao anterior, mas a metila é no C5. (RODRIGUEZ;
TOWERS; MITCHELL, 1976; HARBORME; BAXTER, 1993)
Os Hirsutinolideos e glaucolideos são germacranolides altamente
oxigenados, e foram isolados de várias espécies de Vernonia (HARBORNE;
BAXTER, 1993).
25
3.5 Gênero Vernonia: Lactonas sesquiterpênicas e aspectos biológicos
As plantas medicinais que possuem lactonas sesquiterpênicas são
utilizadas, popularmente, no tratamento de doenças inflamatórias. Ainda, a atividade
antitumoral destas substâncias vem sendo estudada para a elucidação do
mecanismo de ação tanto antitumoral como anti-inflamatório (ZHANG et al., 2005).
Cioffi et al. (2004b) isolaram lactonas sesquiterpênicas, glicosídeos e
esteróides da V.colorata, demonstrando atividade antiinflamatóra somente com a
fração que continha as substâncias isoladas, evidenciando que as lactonas
sesquiterpênicas são as responsáveis pela ação antiinflamatória.
A atividade anti-hepatotóxica de lactonas sesquiterpênicas extraídas das
folhas de V. amydalina foi demonstrada em ratos machos adultos pela diminuição
das enzimas hepáticas ALT e AST nos animais tratados previamente com Vernonia
amygdalina, indicando o efeito hepatoprotetor (BABALOLA; ANETOR; ADENIYI,
2001).
Lactonas sesquiterpênicas foram empregadas como potencializadores do
interferon- no tratamento da hepatite-C (HCV), com amplificação desta atividade
quando realizada modificações estruturais no esqueleto terpenóide (HWANG et al.,
2006).
A citotoxicidade de lactonas sesquiterpênicas contidas no extrato da V.
pachyclada foi testada em linhagens de células de câncer ovariano humano (A2780),
ocorrendo uma atividade moderada com CI
50
de 3,3 M (WILLIAMS et al., 2005).
O estudo da citotoxicidade de cinco lactonas sesquiterpênicas isoladas e
identificadas da V. chinensis em linhagens de células tumorais P-388 e A-549
demonstrou potencial citotóxico para três destas lactonas sesquiterpênicas (CHEN et
al., 2005).
A lactona sesquiterpênica partenolideo foi utilizada no tratamento de
carcinoma do ducto biliar, ocorrendo indução de apoptose nas quatro linhagens de
células utilizadas. Foram investigadas as proteínas p53, Fas/FasL e Bcl-2, sendo
que o partenolideo diminuiu a expressão de Bcl-2 indicando a ocorrência de
apoptose. Ainda o partenolídeo está envolvido na produção de radicais de oxigênio
que ocasionam apoptose por estresse oxidativo (KIM et al., 2005).
26
Estudos com o partenolideo demonstram suas propriedades
quimiopreventivas através de experimentos in vivo e in vitro. Para os testes in vivo
foi induzido câncer por radiação ultravioleta B (UVB), sendo que camundongos pré-
tratados com partenolideo mostraram uma redução na incidência do papiloma
comparado com camundongos não tratados. No experimento in vitro foram utilizadas
células epidermais (JB6), o tumor também foi induzido por UVB. O pré-tratamento
com o partenolideo provocou ativação da proteína – 1 na transcrição do DNA,
ativação da p38 e inibição da JNK. Estas proteínas sensibilizaram as células JB6
impedindo a apoptose pela radiação UVB (WON et al., 2004).
Segundo Bocca et al. (2004) a lactona sesquiterpênica costunolideo
apresentou atividade anti-proliferativa nas células de câncer de mama (MCF-7).
Ainda, demonstrou uma habilidade polimerizante por induzir a formação organizada
de microtúbulo com, conseqüente, redução da divisão celular.
3.6 Vernonia scorpioides: Ocorrência e aspectos biológicos
A espécie V. scorpioides (Figura 1) é encontrada na região da mata pluvial
da encosta atlântica do estado de Santa Catarina – Brasil, conhecida popularmente
como Enxuga, Erva de São Simão e Piracá. Sobre suas características físicas pode-
se relatar que é um arbusto, com ramos numerosos, lanuginosos; folhas curto-
pecioladas, ovaladas, agudas no ápice e atenuadas na base, inteiras ou crenada-
dentada nas margens, verdes e glabas na página superior e pardacento-hirsuto-
pubescente na página inferior, membranosas; flores de corola purpúrea, reunidas em
capítulos numerosos, séssiles, unilaterais, dispostas em panículos alongados
escorpióides (origem do nome científico); fruto aquênio piloso turbinado com papo
brancacento (CORREA, 1978; REITZ, 1980).
27
Figura 1: Vernonia scorpioides (LAM) PERS.
Embora existam poucos estudos com relação à atividade biológica da
espécie V. scorpioides, encontram-se estudos sobre citotoxicidade, ação
antiinflamatória e antimicrobiana.
Freire et al. (1996) observaram a atividade fungicida da V. scorpioides nas
doses de 1, 3 e 5 mg/100 L para Aspergillus alutaceus e Penicillum citrunum. A
fração acetato de etila foi ativa contra o Trypanossoma cruzi (ALBERTON, 2002).
A fração etanol de V. scorpioides apresentou atividade antimicrobiana para
Staphylococcus aureus e Escherichia coli na concentração de 1000 g/mL
(CAMPOS, 2001).
Almeida e Palhano (2001) demonstraram o efeito cicatrizante da V.
scorpioides devido à formação mais organizada do tecido conjuntivo.
Pagno (2004) demonstrou em camundongos que a fração diclorometano de
V.scorpioides nas doses de 5 mg/kg apresenta atividade antitumoral frente ao tumor
de Ehrlich, resultado confirmado posteriormente por Blind e Moya (2005).
28
Dalazen et al. (2005) verificaram a ocorrência de citotoxicidade do extrato
de V. scorpioides após o tratamento em camundongos, com recrutamento e
estimulação de células inflamatórias e processos de reparos celulares.
3.7 Processo de morte celular
A lesão celular pode ocorrer por diferentes tipos de estímulos, seja causa
externa ou interna, conforme descritos abaixo: 1. A ausência de oxigênio causa
lesão celular pela redução da respiração aeróbica oxidativa, dependendo da
intensidade da hipoxemia a célula pode sofrer lesões ou até morrer. 2. Agentes
Químicos e Drogas provocam lesões que podem ser diretamente ou pela alteração
da homeostasia eletrolítica. Neste grupo encontram-se as substâncias citotóxicas,
como exemplos as antitumorais. 3. Agentes Infecciosos podem ocasionar lesões
celulares variadas. 4. Reações Imunológicas podem ocasionar lesões celulares,
como por exemplo à reação anafilática e as reações auto-imunes. 5. Distúrbios
genéticos podem desencadear diversas anormalidades, como erros inatos do
metabolismo decorrentes da falta de uma enzima, ocasionadas por alteração sutil do
DNA. 6. Desequilíbrios nutricionais como a deficiência protéico-calórica, assim como
os excessos nutricionais são casos importantes na lesão celular. Por exemplo, o
excesso de lipídeos predispõe a aterosclerose (ROBBINS; COTRAN, 2005).
O estímulo nocivo proporcionado desencadeia os seguintes mecanismos
bioquímicos que são responsáveis pela lesão celular (ROBBINS; COTRAN, 2005).
1) Diminuição do ATP: Lesões hipóxicas e químicas estão freqüentemente
associadas à diminuição de ATP por diminuição da fosforilação oxidativa, que por
sua vez, é a principal fonte de ATP (ANKARCRONA et al., 1995). A diminuição da
fosforilação oxidativa ocasiona no aumento da glicólise anaeróbica para compensar
a deficiência de ATP, sendo assim os depósitos de glicogênio são rapidamente
reduzidos, com acúmulo de ácido lático e fosfatos inorgânicos reduzindo o pH
intracelular, resultando na diminuição da atividade de muitas enzimas celulares
(LEIST et al., 1997). A diminuição prolongada de ATP ocasiona o deslocamento dos
ribossomos do retículo endoplasmático granular com diminuição na síntese de
proteína, ocasionando dano irreversível às membranas citoplasmáticas e
29
lisossomais, levando à necrose (ANKARCRONA et al., 1995). A bomba de sódio da
membrana plasmática das células é dependente de ATP, um defeito ocasiona
acúmulo de sódio intracelular e perda de potássio, acarretando em ganho de água e
edema celular (ZHANG; HUANG, 2006).
2) Fluxo intracelular de Cálcio: Alguns efeitos nocivos causam aumento do
cálcio intracelular por influxo do cálcio através da membrana e desprendimento do
cálcio da mitocôndria e retículo endoplasmático. Este evento ativa diversas enzimas
(ATPases, fosfolipases, proteases e endonucleases) que causam lesões celulares.
O aumento de cálcio intracelular ocasiona permeabilidade da membrana
mitocondrial e induz a apoptose (WATERS et al., 1997).
3) Dano mitocondrial: As mitocôndrias são alvos de quase todos estímulos
nocivos. Elas podem ser danificadas por aumento de cálcio intracelular, estresse
oxidativo ou peroxidação lipídica, formando um canal chamado de poro de transição
de permeabilidade mitocondrial. Pelo poro pode ser liberado o citocromo c e iniciar a
morte por apoptose (ZHANG; HUANG, 2006).
4) Estresse oxidativo: Os radicais livres podem ser formados por absorção
de energia radiante, metabolismo enzimático de substâncias químicas, reações de
redução-oxidação em processos metabólicos normais como a inflamação, metais de
transição e óxido nítrico. A lesão celular é ocasionada por peroxidação lipídica das
membranas e organelas quando os radicais livres atacam as ligações duplas dos
ácidos graxos insaturados dos lipídeos das membranas; também pode ocorrer a
modificação oxidativa das proteínas por oxidação da cadeia lateral dos aminoácidos,
formação de ligação cruzada entre proteínas e oxidação da proteína; lesões no DNA
ocorrem por reações com a timina e posterior ruptura em um dos filamentos do DNA
(WEN et al., 2002).
5) Defeitos na permeabilidade da membrana: A perda da permeabilidade
seletiva da membrana leva a um dano à mesma, podendo afetar a mitocôndria, a
membrana plasmática e outras membranas celulares. A disfunção mitocondrial, a
degradação de fosfolipídeos e dano ao citoesqueleto por aumento de cálcio
intracelular, estresse oxidativo e produtos de degradação de lipídeos que atuam
como detergentes podem desencadear os defeitos relacionados à permeabilidade
da membrana (VERMES; HAANEN; REUTELINGSPERGER, 2000).
30
3.7.1 Lesão celular irreversível
A célula, dentro de certos limites pode compensar alterações e retornar ao
seu estado normal, mas quando o estímulo nocivo ultrapassa o limiar da lesão
irreversível ocorre a morte celular que, por sua vez, pode acontecer por necrose ou
apoptose (ROBBINS; COTRAN, 2005).
Figura 2: Processos de morte celular: necrose e apoptose
Fonte: Bioagency (2006).
A necrose (Figura 2) é um processo de morte celular descontrolado. Após o
efeito deletério ocorre edema celular (não é detectado um aumento de cálcio
intracelular) e destruição de membranas. Com a membrana dos lisossomos lesada
ocorre extravasamento das enzimas para o citoplasma, que degradam os
componentes celulares e nucleares. A fragmentação do DNA ocorre de forma
desigual formando um padrão “manchado” em eletroforese em agarose.
Concomitantemente, existe um extravasamento extracelular de enzimas celulares
31
que danificam os tecidos adjacentes causando inflamação nos mesmos. A morte
celular por necrose não é a via desejada pelos medicamentos antitumorais, por não
ser um processo específico para as células cancerígenas assim como, pela
promoção de processo inflamatório intenso (BURLACU et al., 2001).
A apoptose (Figura 2) é uma via de morte celular altamente regulada, sendo
que as membranas celulares permanecem intactas enquanto seu conteúdo
citoplasmático e nuclear é degrado por enzimas, e sem o desencadeiamento da
reação inflamatória (McCONKEY, 1998).
O mecanismo apoptótico pode ser iniciado por duas principais vias distintas,
mas convergentes, a via extrínsica e a intrínsica (Figura 3).
a) Via Extrínsica: Essa via é iniciada pela ativação de receptores da morte
que, por sua vez, são da família de receptores de necrose tumoral. Os mais
conhecidos são os receptores da família de receptores do fator de necrose tumoral
do tipo 1 (TNFR1) e o receptor Fas (CD95). Tanto o receptor Fas quanto o TNFR1
promovem o mesmo caminho apoptótico (COHEN, 1997).
O Fas é uma proteína transmembrana ativada pelo ligante de Fas (FasL),
que é produzido pelas células do sistema imunológico. Algumas proteínas Fas
unem-se após serem ativadas formando local de ligação para a proteína FADD (Fas
associada ao domínio da morte) que, por sua vez, possuem um domínio da morte
ativador das caspases 8 e 10 (caspases iniciadoras). As caspases iniciadoras ativam
as caspases 3 e 7 (caspases efetoras da apoptose) promovendo a apoptose
(ROBBINS; COTRAN, 2005).
Essa via de apoptose pode ser inibida pela proteína FLIP que se liga a pré-
caspase-8 e não a deixa ser ativada (THOME; TSCHOPP, 2001). Outra enzima anti-
apoptótica normalmente solúvel no citoplasma são as IAPs, elas ligam-se a pré-
caspase-3 (ROBBINS; COTRAN, 2005).
A indução por receptor da morte também pode induzir a permeabilidade da
mitocôndria (outra via apoptótica), por exemplo à sinalização com Fas ativa uma
proteína chamada Bid (família da Bcl-2) que ativa a via mitocôndrial (ROBBINS;
COTRAN, 2005).
b) Via Intrínsica: Esta via resulta em aumento do potencial de membrana
mitocondrial (MMP) resultando na permeabilidade da mesma. Proteínas da
mitocôndria da família Bcl-2 (Bcl-2 e Bcl-X) são responsáveis por não deixar
acontecer a apoptose, elas são estimuladas por fatores de crescimento e outros
32
sinais de sobrevivência. Por exemplo, o NF-KB expressa estes fatores
(RAVAGNAM; ROUMIER; KROEMER, 2002; SCORRANO; KORSMEYER, 2003;
ZHANG; HUANG, 2006).
Com a diminuição destes fatores de crescimento, hormônios e sinais de
sobrevivência, assim como danos ao DNA, as células perdem as proteínas anti-
apoptóticas Bcl-2 e são substituídas por proteínas pró-apoptóticas da mesma família,
como a Bak, a Bax e a Bim (STENNICKE; SALVESEN, 1998).
Proteínas como a Bax aumentam o potencial de membrana mitocôndrial
(MMP) formando poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT), íons
infundem no citoplasma mitocondrial e várias proteínas com capacidade de ativar a
cadeia de caspase são liberadas da mitocôndria, como o citocromo c, que se liga à
proteína APAF-1 e a caspase 9 formando o apoptossoma que efetiva a formação da
caspase 3, promovendo a apoptose (ADRAIN; MARTIN, 2001; LI; LUO; WANG,
2001). Também são liberadas proteínas mitocôndrias tais como o fator de indução
de apoptose (AIF) e a SMAC/Diablo que neutralizam vários inibidores de caspase,
como as proteínas anto-apoptóticas AIPs (SALVESEN; DUCKETT, 2002).
A apoptose via mitocondrial também pode ser ativada pelo dano no DNA
gerado por radiação ionizante, ação viral ou toxinas, onde aumenta a expressão de
p53 que estimula a produção de Bax, estimulando a apoptose. O estresse
mitocôndrial causado por radicais livres, cálcio, entre outros geram processo
apoptótico (ZHANG; HUANG, 2006).
Após a indução da cascata de caspase por qualquer via inicia-se a fase
efetora. Em células normais as caspases são pré-enzimas, sendo ativadas para
produzir apoptose, dependendo da caspase ativada pode ser identificada à via
apoptótica, por exemplo, a caspase 8 e 10 são normalmente ativadas pelo receptor
da morte enquanto a caspase-9 pela via mitocôndrial. As caspases efetoras como a
caspase-3 podem ser ativadas pelas duas vias (SAUNDERS et al., 2000).
Com a ativação da cascata de caspases inicia-se o processo de
desnaturação de proteínas do citoesqueleto e da matriz nuclear. A cromatina
encontra-se condensada, o DNA é fragmentado de modo uniforme por
endonucleases, sendo visualizado em eletroforese de agarose com formação de
bandas características de DNA (McARTHY; EVAN, 1998).
Há uma redução do tamanho das células e são formados corpos
apoptóticos compostos de citoplasma e organelas compactadas. As membranas
33
encontram-se intactas e os corpos apoptóticos são rapidamente degradados nos
lisossomos. As células saudáveis migram para o local ocupado pela célula
apoptótica sem haver processo inflamatório no local (ROBBINS; COTRAN, 2005)
Os fosfolipídios da camada interna da membrana são exteriorizados para
camadas mais externas deixando a fosfatidilserina exposta. Outras proteínas
também podem ser encontradas na camada externa dos corpos apoptóticos como a
trombospondina. Essas modificações permitem o reconhecimento por macrófagos e
facilitam a fagocitoses dos corpos apoptóticos (SAVILL; FADOK, 2000).
As células apoptóticas secretam fatores que recrutam macrófagos
facilitando a retirada imediata das mesmas antes que sofram necrose secundária e
causem inflamação. Os macrófagos também podem liberar substâncias para marcar
as células apoptóticas, assim como, as células normais expressam moléculas de
superfície (CD31) que as protegem da captura pelos macrófagos (RAVICHANDRAN,
2003).
34
Figura 3: Via extrínseca e intrínseca da apoptose.
Fonte: Bioagency (2006).
35
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material Vegetal
4.1.1 Coleta
As folhas e inflorescências de Vernonia scorpioides foram coletadas na
cidade de Navegantes/SC, identificada pela Botânica Ana Claudia Araújo. A exsicata
encontra-se no herbário Barbosa Rodrigues sob especificação, Maique Weber
Biavatti 11 (15/03/2001).
4.1.2 Obtenção de substâncias e mistura de Vernonia scorpioides
O processo extrativo foi realizado com monitoramento químico por
cromatografia em camada delgada (CCD), com padrão de lactona sesquiterpênica
obtida por estudos anteriores, de todas as frações obtidas para direcionamento a
separação por cromatografia subseqüente (Figura 4).
O extrato bruto de V. scorpioides foi obtido por maceração de folhas e
inflorescências verdes, em etanol, bidestilado, por sete dias. Após, o extrato foi
concentrado em rota vapor reduzindo em 85% o volume alcoólico. Foram utilizados
18 litros de etanol para 5 kg da planta.
A partir do extrato bruto foi realizada partição líquido–líquido com solventes
de polaridade crescente: hexano, diclorometano e acetato de etila. As frações
secaram com auxílio de secador de cabelo obtendo as frações HEX I, DCM I e AE I.
A fração DCM I foi submetida a fracionamento por cromatografia em coluna
com silicagel 60 e fase móvel hexano (300 mL), diclorometano (300 mL), acetato de
etila (300 mL) e metanol (300 mL). Obteve-se as respectivas frações HEX II, DCM II,
AE II e MET II.
A partir da fração DCM II foi realizada, novamente, cromatografia em coluna
com silicagel e os solventes hexano (200 mL), diclorometano (500 mL), gradiente
36
HEX:AE de etila (1:1) (500 mL) e gradiente HEX:AE (7:3) (500 mL). Através do
gradiente (1:1) foram recolhidas 42 frações, destas a fração 6 (2,77 mg) apresentou
cristais sendo posteriormente identificado por RMN e EM. As frações 17-24 foram
reunidas por possuírem aspecto químico semelhante e submetidas à cromatografia
em coluna com sílica gel 60.
Na cromatografia das frações 17-24 foi utilizado, como fase móvel,
gradientes de concentrações HEX:AE (7:3) (600 mL) sendo recolhidas 47 frações,
HEX:AE (1:1) (100 mL) e acetona (100 mL). Através do processo de eluição
utilizando HEX:AE (7:3), as frações 15 (4,5 mg) e 17 (11,86 mg), obtiveram
substâncias isoladas, evidenciadas pela formação de cristais e CCD analítica, sendo
identificadas por RMN e EM. As frações 20-26 foram reunidas, e realizada
cromatografia em coluna flash Lobar.
Na cromatografia flash Lobar B MERK 310-25 (sílica gel 0,040 mm - 0,063
mm) utilizou-se gradiente de concentração HEX:AE (8:2) (200 mL) e (7:3) (600 mL)
sendo coletadas 38 frações. As frações 19-21 (155 mg) foram juntadas por
apresentarem mesmo aspecto químico em CCD analítica e caráter cristalino,
posteriormente identificado por RMN e EM.
Todos solventes utilizados possuem grau de pureza para HPLC (VETEC
®
).
A substâncias Hirsutinolídeo (S1), Glaucolídeo (S2) e Hirsutinolídeo (S3)
foram obtidas anteriormente (BLIND; MOYA, 2005; LAZZAROTO, 2006), e cedidas
para análise de atividade biológica no presente estudo.
37
Figura 4: Fluxograma do processo de isolamento de substâncias e mistura de lactonas sesquiterpênicas de V.
Scorpioides.
Partição líquido-líquido
HEX I
Cromatografia em coluna
HEX II
Cromatografia em coluna
HEX III
DCM III
H:AE (7:3)
12 frações
Fração 6
Substância pura
Cromatografia em coluna
Fração 15
Substância pura
Fração 17
Substância pura
Cromatografia
flash
em coluna Lobar
Fração 19-21
Mistura de lactonas sesquiterpênicas
H:AE (8:2 - 7:3)
38 frações
Fração 20-26
H:AE (7:3)
47 frações
H:AE (1:1)
AC
Fração 17-24
H:AE (1:1)
42 frações
DCM II
AE II
DCM I
AE I
Extrato bruto: Folhas e inflorescências de
Vernonia scorpioides
Extração em etanol bidestilado
38
4.1.3 Identificação das substâncias
Os compostos isolados, e a mistura utilizada em testes biológicos foram
submetidos a análises espectrométricas de massas (EM) em equipamento
Micromass Q-Tof (Laboratório Thomson de espectrometria de massas, Unicamp) e
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1D e 2D nos equipamentos Bruker
AVANCE 400 e AVANCE DRX 400 (Laboratórios de RMN da UFPR e UFSCar,
respectivamente).
4.2 Cultura de células
Todas células utilizadas foram adquiridas do banco de células da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (BCRJ). A células de fibroblasto (L929) são
culturas secundárias extraídas do tecido conectivo de adipócitos de camundongos
(Mus musculus C3H/NA) machos com 100 dias de vida (BCRJ CR020/ATCC CCL1).
As células B16F10 são melanócitos extraídos a partir de melanoma de pele de
camundongos (Mus musculus C57BL/6J) (BCRJ CR010). As células Hela são de
adenocarcinoma de cérvix humano (Homo sapiens) (BCRJ CR050).
As células foram mantidas em meio MEM - (Gibco-BRL) suplementado com
10% soro fetal bovino (Sigma), 100 IU/mL de penicilina, 100 µg/mL de
estreptomicina (Roche) e 10 mM de L-glutamina (Ajinomotto) e 1% de aminoácidos
não-essenciais. As culturas foram mantidas em estufa a 37ºC com 5% de CO
2
. Para
as células B16F10 o pH do meio foi de 7,1 e para as células L929 e Hela o pH foi de
7,4.
As amostras foram solubilizadas em meio de cultura MEM suplementado
com L-glutamina e esterilizadas por filtração (0,22 µm).
39
4.2.1 Ensaio de Citotoxicidade (MTT)
A citotoxicidade nas células foi determinada pelo teste MTT (3-[4,5-
dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo) (Sigma). O MTT (sal de tetrazólio) é
convertido em sal de formazan pelas células vivas, formando uma coloração azulada
(MOSMANN, 1983).
As células L929, B16F10 e Hela foram plaqueadas, em placas de 96 poços,
a 2.10
4
células/poço e incubadas com 300 µL de meio MEM suplementado com soro
fetal bovino a 10% (SFB) por 24h a 37ºC em 5% CO
2
. A fim de manter todas as
células em um mesmo estágio da divisão celular (Go), o meio MEM com SFB foi
substituído por 180 L de meio MEM sem SFB e incubado por 1h a 37ºC em 5%
CO
2
. Posteriormente foram adicionadas 20 L das substâncias testes em diferentes
concentrações (0,01; 0,1; 1,00; 10; 100 e 1000 g/mL), do controle positivo
dimetilsulfóxido (DMSO) e do controle negativo (meio MEM sem SFB contendo 1%
de acetona) e incubadas por 1 e 24h a 37ºC em 5% CO
2
. Após este tempo foi
retirado o meio e adicionado 270 µL de MEM sem SFB e 30 µl de MTT (5 mg/mL) e
incubadas por 4h a 37ºC em 5% CO
2
. O meio juntamente com o MTT foi retirado e
os cristais de formazan insolúveis foram dissolvidos em 100 µL de DMSO. A
determinação da absorbância foi realizada em leitor de microplaca a 570 nm. Os
testes foram realizados em quadruplicata. A viabilidade relativa das células
relacionadas ao controle sem as substâncias testes foi calculada como absorbância
da amostra teste/absorbância do controle negativo x 100. Através dos gráficos pode
ser calculada a CI
50
das substâncias testes.
4.2.2 Formação de Lactato desidrogenase (LDH)
As células L929 foram plaqueadas a 5.10
5
células/poço em placas de 6
poços e mantidas por 1 hora a 37ºC em 5% CO
2.
Foram adicionados 10 L das
substâncias teste, do controle positivo (Triton X-100 0,8%) e do controle negativo
(meio MEM sem SFB a 1% de acetona) e incubadas por 24h 37ºC em 5% CO
2
nas
concentrações pré-determinadas pelo teste de citotoxicidade (MTT). A determinação
40
da LDH é proporcional ao número de células lisadas por processo necrótico sendo
mensurada pelo Kit LDH (DiaSys). Valores de absorbância foram medidos a 37
o
C,
em leitor de microplaca. Os resultados foram realizados em triplicata e os resultados
expressos pela A/min x 2000 (UI) conforme descrito pelo Kit (CRUZ-CHAMORRO
et al., 2006; DIASYS, 2006).
4.2.3 Análise da morte celular por microscopia de fluorescência
Para este teste as células L929, B16F10 e Hela (2.10
4
células por poço em
placas de 96 poços) foram incubadas em presença das substâncias teste, do
controle positivo (DMSO) e do controle negativo (meio MEM sem SFB a 1% de
acetona) por 24 h a 37ºC a 5% de CO
2
em placas de 96 poços.
O corante Brometo
de etídeo (50 L de solução a 20 L/mL) e Anexina V-FITC (1L de solução a 12
mg/mL) foram utilizados para verificar o mecanismo de morte celular. O Brometo de
etídeo emite fluorescência vermelha por associação ao DNA das células com
membrana celular alterada, este corante não marca célula saudável, ou seja, sugere
a morte celular por necrose. Em caso de apoptose a fosfatidilserina desloca-se para
membrana externa e, por sua vez, a anexina marcada com fluorocromo (FITC), liga-
se a fosfatidilserina emitindo sinal de fluorescência.
Usando a combinação destes dois corantes, dois processos de morte
celular podem ser identificados: a) células em necrose o núcleo fica marcado em
vermelho por causa da desnaturação das membranas plasmáticas que permite a
internalização do brometo de etídeo, assim como ocorre emissão de fluorescência
verde, pois com as membranas desnaturadas a Anexina também internaliza e liga-se
a fosfatidilserina; b) nas células em apoptose a membrana celular ainda está íntegra,
mas a fosfatidilserina transloca-se para a parte externa da membrana plasmática. A
Anexina V liga-se as mesmas emitindo fluorescência de coloração verde. Como o
brometo de etídeo não internaliza, visualiza-se somente a fluorescência verde.
Foram avaliados dez campos microscópicos diferentes, classificados por presença
de necrose superior a 75% das células do campo (+++), necrose entre 75% e 25%
das células (++) e necrose inferior a 25% das células (+).
As células foram analisadas usando microscópio de fluorescência (Olympus
CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de
41
aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm)
(NOBRE JUNIOR, 2006).
4.2.4 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico
As células tumorais B16F10 e Hela foram plaqueadas, em placas de 6
poços, a 5.10
5
células/poço. Foram mantidas por 24 horas na presença das
substâncias testes. Para o controle negativo foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) e
para o controle positivo Paclitaxel na concentração de 1 M (KHALILZADEH et al,
2007). As células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000xg a 4
o
C, seguido de
duas etapas de lavagem. O centrifugado formado foi ressuspendido em 100L de
tampão de lise (5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM DTT e 1% Triton X-
100) e incubado em banho de gelo por 20 minutos. Após centrifugação a 5000xg por
30 minutos a 4
o
C, o sobrenadante corresponde ao lisado. A presença de caspase 3
no lisado produz a p-nitroanilina (pNa) que gera coloração, quantificado em 405 nm.
Em placa de 96 poços foram colocados em cada poço 84 L de tampão de
ensaio (100 mM Hepes, 1 mM EDTA, 10 mM DTT e 10% Glicerol), 10 L do
reagente de uso (substrato de caspase 3 a 2 mM) e 5 L do lisado.
Os testes foram realizados em octaplicata e os resultados expressos em M
pNa/min/mL (POSMANTUR; WANG; GILBERTSEN, 1998).
4.2.5 Análise da fragmentação do DNA
As células tumorais Hela foram plaqueadas, em placas de 6 poços, a 5.10
5
células/poço. Foram mantidas por 24 horas na presença das substâncias testes.
Para o controle negativo foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) e para o controle
positivo Paclitaxel na concentração de 1 M (KHALILZADEH et al., 2007). As células
foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000xg a 4
o
C, as células foram lavadas duas
vezes e centrifugadas novamente. O centrifugado formado foi ressuspendido com
250
L de tampão de lise (0,5% SDS, 10 mM Tris, 1 mM EDTA e 100 g/mL de
42
proteinase K, pH 8.0) e incubado por uma noite a 4
o
C. Posteriormente foi
centrifugado a 5000xg por 20 minutos. O sobrenadante foi removido para frascos
novos, adicionado isopropanol (1:1) e ajustado para 0,5 M NaCl, deixado precipitar
durante uma noite a 4
o
C. O precipitado formado foi removido e lavado duas vezes
com etanol 70%. O etanol 70% foi deixado evaporar e o precipitado foi
ressuspendido em 40 L de tampão TE (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA e 20 g/mL
RNAse, pH 8.8). A eletroforese realizada com aplicação de 15 L deste produto em
agarose gel 1,5% por 60 minutos (25 V e 300 mA), seguido de revelação com
brometo de etídeo e lâmpada de UV, com imagem fotografada para documentação
(CHOI et al., 2006).
4.2.6 Ensaio do Cometa
No ensaio de genotoxicidade foram utilizadas células de medula de
camundongos Swiss, projeto aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da
UNIVALI sob protocolo número 236/07.
As células foram retiradas e contadas em câmara de Neubauer com azul de
tripan, com concentração da suspensão celular ajustada em 2,5.10
6
cél/mL. Lâminas
foscas de microscópio receberam 100 L de agarose gel 0,6% distribuídos por
esfregaço e armazenadas a 4
o
C por 15 minutos. Foi adicionado 20 L da
suspensão celular em 90 L de agarose gel com baixo ponto de fusão (0,6%) a
37
o
C. Após a mistura, os 110 L foram gotejados nas lâminas com agarose gel 0,6%
e cobertos com uma lamínula. As lâminas foram mantidas a 4
o
C durante 15 minutos.
Após esta incubação as lamínulas foram retiradas e as lâminas foram tratadas com
100 L de substâncias testes, com dimetilsulfóxido (DMSO) para controle negativo e
metilmetanosulfonato (MMS) a 40 mM como controle positivo. As lâminas foram
incubadas por 24 horas a 37
o
C, seguido de resfriamento a 4
o
C e duas etapas de
lavagem. As lâminas foram mergulhadas em tampão de lise (2,5 mM NaCl, 100 mM
Tris, 100 mM EDTA, 1% N-lauril sarcosinato, 1% Triton X-100 e 10% DMSO, pH
10.0) a 4
o
C por 1 hora. Após a lise as lâminas foram acomodadas em tampão de
corrida (1 mM EDTA e 300 mM NaOH) por 30 minutos e submetidas a eletroforese a
300mA, 25 V por 30 minutos. Após a eletroforese as lâminas foram neutralizadas
através de lavagem com tampão de neutralização (0,4 M Tris). As lâminas foram
43
coradas com 50 L de brometo de etídeo (20 g/mL) e foi realizada visualização em
microscópio de fluorescência em comprimento de onda 510-569 nm de excitação e
filtro de barreira de 590 nm (CAVALCANTI et al., 2006) (Olympus CKX41SF2,
sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de aquisição de
imagens, da Olympus Optical Co. Ltd). Foram observados 20 cometas e calculado
pelo índice de dano (ID) pela somatória dói níveis de dano: (Nível 0 x 0) + (Nível 1
x 1) + (Nível 2 x 2) + (Nível 3 x 3) + (Nível 4 x 4)
4.3 Análise estatística
Os resultados foram expressos por média ± desvio padrão, analisados de
forma independentes. Os ensaios foram analisados por ANOVA seguido de Tukey
utilizando o software GraphPad InStat. O nível de significância utilizado foi de p<0,05
(VIEIRA, 1991).
44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Isolamento de substâncias
Em virtude dos resultados antitumorais obtidos por Pagno (2004) e Blind e
Moya (2005), assim como o efeito antiinflamatório verificado por Dalazen et al.
(2005) utilizando frações de V. scorpioides, foi realizado o processo de isolamento e
caracterização de substâncias da mesma.
O processo descrito no item 4.1.2 possibilitou o isolamento de 3
substâncias puras, além de uma mistura de lactonas sesquiterpênicas: 1.
Poliacetileno (Fração 6); 2. Lactona sesquiterpênica do tipo hirsutinolídeo (Fração
15); 3. Cafeato de etila (Fração 17); e Mistura de lactonas sesquiterpênicas do tipo
hirsutinolídeo e glaucolídeo (Fração 19-21).
A presença de lactonas sesquiterpênicas está de acordo com o encontrado
na literatura para o gênero Vernonia. Existem relatos da presença das mesmas nas
folhas e flores da V. scorpioides (FREIRE et al., 1996). Assim como, a presença de
hirsutinolídeo no gênero Vernonia, como exemplo na V. staehelinoides (PILLAY et
al., 2007) e na V. triflosculosa (KOS et al., 2006); e de glaucolídeos encontrados na
V. pachyclada (WILLIAMS et al., 2005) e na Vernonanthura discolor (BAZON et al.,
1997).
A literatura não apresenta relatos da presença do cafeato de etila no gênero
Vernonia, mas este composto já foi isolado em plantas como a Camchaya calcarea
que também pertence à família Asteraceae, a mesma da V. scorpioides
(VONGVANISK et al., 2006). Da mesma forma, a presença de poliacetilenos não é
relatada no gênero Vernonia, mas sim na família Asteraceae como na Bidens pilosa
(GRAMBONE-GUARATINI et al., 2005), Artemísia monosperma (STAVRI et al.,
2005) e Rudbeckia hirta (GUILLET et al., 1997).
5.2 Identificação das substâncias isoladas e mistura de lactonas
As amostras isoladas por cromatografias foram identificadas através de
cromatografia de camada delgada (CCD) com padrões de lactonas sesquiterpênicas.
45
As mesmas foram submetidas à análise de ressonância magnética nuclear (RMN)
de 1D e 2D.
5.2.1 Poliacetileno (Fração 6)
Conforme descrito na Figura 4, o poliacetileno (Figura 5) foi obtido após
sucessivas cromatografias em coluna como um sólido cristalino (2,77 mg). Seu
espectro de RMN de
1
H apresentou sinais de uma substância majoritária contendo
sinais de contaminação com algum triterpeno não identificado na proporção de 5:1,
segundo integração (Figuras 6 e 7). Essa substância é inédita na literatura.
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C
12
H
8
O
2
PM: 184 g/mol
Figura 5: Poliacetileno (Fração 6) isolada de V. scorpioides.
46
ppm (t1)
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0
50
100
150
200
7.573
7.569
7.559
7.555
7.264
6.244
6.239
6.229
6.224
5.154
5.141
5.139
5.137
5.135
5.122
2.979
2.966
2.935
2.922
2.699
2.679
2.655
2.636
1.969
1.640
1.639
1.269
1.252
1.169
1.004
0.995
0.988
0.963
0.945
0.9280.857
Figura 6: Espectro de RMN de
1
H do Poliacetileno (CDCl
3
, 400 MHz).
ppm
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
2.
97
9
2.
96
6
2.
93
5
2.
92
2
2.
69
9
2.
67
9
2.
65
5
2.
63
6
1.
96
9
1.
64
0
1.
63
9
1.
26
9
1.
25
2
1.
16
9
1.
00
4
0.
99
5
0.
98
8
0.
96
3
0.
94
5
0.
92
8
0.
85
7
1.
00
5.
09
5.
20
Figura 7: Expansão do espectro de RMN de
1
H do Poliacetileno,
evidenciando a presença de triterpeno (CDCl
3
, 400 MHz).
47
O sinal em 7,56 ppm (Figura 6) apresentou-se como um duplo-dubleto (J=
5.7, 1.5) o qual correlaciona-se no experimento de HSQC (Figura 8) com carbono
em 154,5 ppm, e o duplo-dubleto em 6,23 ppm (J= 5,7; 1,9) com carbono em 122,9
ppm, indicando presença de insaturação. O sinal em 5,14 ppm, equivalente a um
dddd (J= 7,9; 5,2; 1,9; 1,5), correlaciona-se com o carbono em 79,6 ppm no HSQC.
Os duplo-dubletos em 2.95 dd (J= 17.4, 5.2) e 2.67 dd (J= 17.4, 7.9) correlacionam-
se com um único carbono em 24,5 ppm no HSQC. O ultimo sinal relevante no
espectro é de uma metila singleto em 1,97 ppm, com carbono correspondente em
4,5 ppm, evidenciado no experimento de HSQC.
48
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
150
200
ppm (t1)
ppm (t2)
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
50
100
150
ppm (t1)
Figura 8: Mapas de correlação HSQC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do Poliacetileno.
49
O espectro de RMN de
13
C do Poliacetileno apresentou mais 7 carbonos
quaternários, sendo um em 171,9 ppm e seis entre 76,2 e 58,7 ppm. O sinal em
171,9 ppm, referente a carbonila, apresentou correlações de longa distância no
experimento de HMBC com os duplo-dubletos em 6,23 e 7,56 ppm, indicando uma
provável lactona α-β-insaturada, já que estes hidrogênios também se correlacionam
com o carbono em 79,6 ppm, que também se correlaciona com hidrogênios dd em
2,95 e 2,67 ppm (Figura 9).
ppm (f2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
150
200
ppm (f1)
Figura 9: Mapa de correlação HMBC (400 MHz para
1
HRMN, CDCl
3
) do
Poliacetileno.
A partir deste ponto, analisou-se a correlação HMBC observada entre os
carbonos quaternários, entre 80 e 50 ppm (Figura 10), em conjunto com o espectro
de massas (Figura 11) obtido por impacto eletrônico no modo negativo. O íon [M -
H]
+
formado em 183 Da, e a perda de apenas um fragmento neutro de 44 (CO
2
)
gerou íon com m/z 140, denotando ausência de oxigênios para a série de carbonos
quaternários, conduzindo a proposta de um poliacetileno, conforme Tabela 1 e
Figura 12.
50
ppm (f2)
2.00
2.50
3.00
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
ppm (f1)
Figura 10: Ampliação do mapa de correlação HMBC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Poliacetileno (Fração 6).
Figura 11: Espectro de massas do Poliacetileno (Fração 6) obtido por eletronspray,
modo negativo.
51
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C
12
H
8
O
2
PM: 184 g/mol
Figura 12: Poliacetileno (Fração 6) isolado da V. scorpioides e as principais
correlações
1
H -
13
C a longa distância
Tabela 1: Dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C do Poliacetileno (Fração 6)
Posição
1
H δ
δδ
δ
13
C δ
δδ
δ
HMBC
1
H -
13
C
1
- 171.9
2 6,23 dd (5,7:1,9)
122,9 C4 - C3 e C1
3 7,56 dd (5.7, 1.5)
154,5 C4 - C2 e C1
4 5.14 dddd (7,9:5, 2:1,9;
1,5)
79.6 C5 - C6 - C3 e C2
5 2.95 dd (17.4, 5.2)
2.67 dd (17.4, 7.9)
24.5 C8 - C7 - C6 e C4
6
- 70,5
7
- 69,3
8
- 58,7
9
- 62,3
10
- 64,6
11
- 76,2
12 1.97 s
4.5 C11 - C10 e C9
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
A fração 6, trata-se de um poliacetileno inédito, chamado provisoriamente
de: 5-octa-2,4,6-triinil-5H-furan-2-ona. Foram encontradas as seguintes
publicações para comparação dos dados espectrais obtidos: Muller e Pritchard
(1959a); Muller e Pritchard (1959b) e Höbold; Radegli e Klose (1976).
5.2.2 Hirsutinolídeo (Fração 15)
Conforme descrito na Figura 4, o Hirsutinolídeo (Fração 15) foi obtido após
sucessivas cromatografias em coluna como um sólido cristalino (4,5 mg) (Figura 13).
Seu espectro de RMN de
1
H (Figura 14) apresentou sinais de um hirsutinolideo
característico de Vernonia, sendo comparados os sinais publicados anteriormente
(Tabela 2).
52
A substância (lS*,4R*,8S*,10R*)-1,4-epoxi-l3-etoxi-1,10-diidroxi-8-acetoxi-
germacra-5E,7(11)-dien-6, 12-olideo, ou 8-Acetil-13-etoxipiptocarfol, foi isolado pela
primeira vez em Vernonia molissima (CATALAN; IGLESIAS, 1986). Depois em
Eirmocephala megaphylla (Hieron.) H. Robinson (antes Vernonia megaphylla)
(BORKOSKY et al., 1996), e em Lepidaploa remotiflora (L.C. Rich) H. Robinson
(VALDÉS et al., 1998), gênero anteriormente classificado como Vernonia, com a
função acetato em C-8 α-orientada nestes últimos.
O
O
OCOCH
3
OH
OH
O
O
1
4
8
13
10
14
15
11
12
C
19
H
26
O
8
PM: 382 g/mol
Figura 13: Hirsutinolídeo (Fração 15) isolado da V. scorpioides
Como outras lactonas deste tipo, a fração 15 apresentou apenas sinais largos
de RMN de
1
H à temperatura ambiente, os sinais e suas multiplicidades somente
foram definidas a 0
o
C (Figura 14).
Através de técnicas espectrocópicas bidimensionais (HSQC e HMBC) foi
possível atribuir o esqueleto as lactonas demonstradas acima (Anexo A, Figuras 1, 2
e 3).
53
ppm (f1)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
6.482
6.455
5.863
4.576
4.546
4.374
4.344
4.103
3.988
3.973
3.596
3.578
3.561
2.598
2.570
2.557
2.530
2.434
2.417
2.402
2.385
2.149
2.112
2.104
2.063
1.802
1.586
1.483
1.288
1.254
1.236
1.219
Figura 14: Espectro de RMN de
1
H do Hirsutinolídeo (Fração 15) (CDCl
3
, 400
MHz).
Tabela 2: Dados espectrais de RMN de
1
H e
13
C do Hirsutinolídeo (Fração 15) em
comparação com dados de literatura (CATALAN; IGLESIAS, 1986).
Posição
1
H δ
δδ
δ
13
C δ
δδ
δ
8-Acetil-13-
etoxipiptocarfol
1
H (60 MHz, CDCI
3
)
1
- 108,6 -
2 2,13 m
2,42 m
38,4 -
3
-
4
- 81,8 -
5 5,85 sl
125,1 5,84
6
- 144,1 -
7
- -
8 6,47 d J= 10 Hz
67,4
6,32 dbr, J =9 Hz
9 2,55 dd J= 15,8 e 10 Hz
-
2.50 dd, J= 15,5 e 9 Hz,
colapsa em d pela irradiação
em H-8, H-9β
10
- 77,8 -
11
12
13 4,53 e 4,32 d A e B, J=12
Hz
61,7 4.46 e 4.30
AB quarteto, J=12 Hz
C13-
O-CH
2
-CH
3
3,56 q J= 7,1 Hz
66,7
3,55 q J= 6,5 Hz
C13-
O-CH
2
-CH
3
1,22 t J= 7,1 Hz
15,2
1,20 t J= 6,5 Hz
C8-
O-CO-CH
3
2,10 21,1 2.10 (Ac)
14 1,23 s
15 1,58 s
29,1
1,57 e 1,23 (2 Me)
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
54
5.2.3 Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)
Conforme descrito na Figura 4, a mistura de lactonas sesquiterpênicas
(Figura 15) foi obtida após sucessivas cromatografias em coluna como um sólido
cristalino (155 mg). Seu espectro de RMN de
1
H (Figuras 16 e 17) apresentou sinais
característicos das lactonas de Vernonia, exibindo sinais para 4 acetatos, e sinais
duplicados na região dos hidrogênios característicos ligados a C-13, e para as
metilas 14 e 15, levando a suspeita da presença de 2 lactonas em proporções
praticamente iguais após integração das áreas, sendo uma levemente majoritária,
denominada 19 major e a outra 19 minor (Figura 15). Uma breve inspeção do
espectro de RMN de
13
C apontou a presença de cerca de 30 carbonos, confirmando
a suspeita de uma mistura de duas lactonas semelhantes. Através de técnicas
espectroscopicas bidimensionais (Anexo A, Figuras 4, 5 e 6) foi possível atribuir os
esqueletos as lactonas, resumidos na Tabela 3 e 4.
a
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
O
OH
OH
1
4
8
13
10
14
15
11
12
b
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
O
H
OH
O
O
1
4
8
13
10
15
11
12
14
C
19
H
24
O
10
PM: 412 g/mol C
19
H
24
O
10
PM: 412 g/mol
Figura 15: a. Hirsutinolídeo 19 major (Fração 19-21) b. Glaucolideo 19 minor em
mistura da V. scorpioides
55
ppm (t1)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
100
200
300
400
6.752
6.733
6.731
6.727
5.471
5.460
5.453
5.104
5.071
5.005
5.002
4.974
4.971
4.915
4.892
4.882
4.862
3.793
3.541
3.538
2.936
2.917
2.903
2.884
2.638
2.631
2.613
2.595
2.577
2.569
2.526
2.502
2.497
2.488
2.484
2.343
2.333
2.329
2.310
2.298
2.293
2.213
2.206
2.203
2.192
2.182
2.179
2.173
2.148
2.131
2.116
2.108
2.085
2.079
2.073
2.065
2.057
1.804
1.770
1.608
1.585
1.561
1.554
1.527
1.474
1.325
1.257
1.245
1.00
0.94
4.52
3.16
3.62
3.27
3.02
3.02
2.97
2.81
3.24
Figura 16: Espectro de RMN de
1
H da Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração
19-21) (CDCl
3
, 400 MHz).
ppm (t1)
1.50
2.00
2.50
3.00
0
100
200
300
400
500
600
2.936
2.917
2.903
2.884
2.638
2.631
2.613
2.595
2.577
2.569
2.526
2.502
2.497
2.488
2.484
2.343
2.333
2.329
2.310
2.298
2.293
2.213
2.206
2.203
2.192
2.182
2.179
2.173
2.148
2.131
2.116
2.108
2.085
2.079
2.073
2.065
2.057
1.804
1.770
1.608
1.585
1.561
1.554
1.527
1.474
1.357
1.325
1.257
1.245
3.16
3.62
3.27
3.02
3.02
2.97
2.81
3.24
Figura 17: Ampliação do espectro de RMN de
1
H da Mistura de lactonas
sesquiterpênicas (Fração 19-21) (CDCl
3
, 400 MHz).
56
Tabela 3: Dados espectrais de
1
H e
13
C RMN da Mistura de lactonas
sesquiterpênicas 19 major (Fração 19-21).
Posição
1
H δ
δδ
δ
19 major
13
C δ
δδ
δ
19 major
Correlações HMBC
1
107,9
2 2,18/2,50 m
33,6 C-5
3 2,20 m
36,7
4
- 80,5
5 3.78 s
71,4 C6-C15
6
- 91,2
7
- 160.8
8 5.47 dd (7,3; 2,6)
63.9 C7-C11
9 2.62 dd (14,4; 7,0)
2,23 m
47,2 C7-C8-C11
10
- 75,8
11
- 130,1
12
- 160,8
13 5.08 d (13)
4.90 d (13)
55,5 C7-C11
14 1.32 s
24,8 C9-C10
15 1.61 s
29,6 C3-C4-C5
Acetato
(COCH
3
)
2.15
2.13
Acetato
(COCH
3
)
20,9/20.6
169,5/169.3
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
Tabela 4: Dados espectrais de
1
H e
13
C RMN da Mistura de lactonas
sesquiterpênicas 19 minor (Fração 19-21).
Posição
1
H δ
δδ
δ
19 minor
13
C δ
δδ
δ
19 minor
Correlações HMBC
1
95.0
2 1,75 m
2,31 m
33,1 C-3- C-10
3 1,82 m
2,65 m
34,7
4
- 70,5
5 3.56 s
78,8 C3 –C4-C15
6
87,9
7
162.0
8 6.73 dd (10,5; 8,0)
67.9
9 2.91 dd (13,0; 7,0)
1.54 m
39,9 C7-C8
10
82,5
11
120,7
12
167.6
13 4.98 d (12,3)
4.88 dd (12,2; 1,4)
54,9 C7-C11-C12
14 1.36 s
22,9 C9
15 1.47 s
27,0 C3
Acetato
(COCH
3
)
2,14/2,15 s
20,6
Acetato
(COCH
3
)
- 169,6/170,6
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
57
O espectro de massas obtido via Eletronspray, modo positivo, revelou que a
mistura possuía pico do íon molecular em 413 Da, e dois fragmentos principais de
m/z 351 e m/z 309 (Figura 18). Íons filhos observados para [M+H]
+
: m/z 351
(formado pela perda de acido acético a partir de m/z 411, – 60 Da), m/z 309
(formado pela perda de ceteno a partir de m/z 351, - 42 Da), m/z 291 (formado pela
perda de água a partir de m/z 309, - 18 Da) (Figura 18). O fragmento principal m/z
351 parece comprovar a presença de OH em C6, apenas com a presença de OH em
C6 é possível haver a perda mecanistica do acido acético.
Apenas a estereoquimica das lactonas 19 major e 19 minor precisam ainda
ser confirmadas, apesar da estereoquimica relativa dos hirsutinolideos ser quase
sempre idêntica (JAKUPOVIC et al., 1985),
principalmente para C-1 e C-10; C-5 e C-
6.
58
a
b
Figura 18: Espectro de massas da Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-
21) a. Eletronspray negativo. b. Eletronspray positivo.
59
5.2.4 Cafeato de etila (Fração 17)
O cafeato de etila (Figura 19) foi caracterizado conforme o espectro de
1
H
RMN (Figura 20).
Analisado o espectro percebe-se sinais referentes à dupla ligação trans em
7,55 e 6,25 ppm, com J=16 Hz. Pode-se observar a substituição do anel aromático
com os sinais em 6,87 (d, J=8,2 Hz), 6,98 (dd, J=8,2 e 1,9 Hz) e 7,08 (d, J=1,9 Hz)
ppm. O éster etílico pode ser definido pelo quarteto em 4,2 ppm (J=7,1 Hz) e tripleto
em 1,3 ppm (J=7,1 Hz) definido como a metila terminal (Figura 20).
O
O
OH
OH
CH
3
C
11
H
12
O
4
PM: 208 g/mol
Figura 19: Cafeato de etila (Fração 17) isolado da V. scorpioides
60
Figura 20: Espectro de RMN de
1
H do Cafeato de etila (Fração 17) (CDCl
3
, 400
MHz).
A série de substâncias acima foi isolada neste trabalho de mestrado, alem
destas, também foram testadas nos modelos de atividade citotóxica in vitro outras 3
lactonas (Figura 21) isoladas previamente por outros estudantes. 1. Hirsutinolídeo
(S1), inédito, descrito por Lazzarotto (2006); 2. Glaucolideo (S2) e; 3. Hirsutinolídeo
(S3). Os dados espectrais destas substâncias estão sendo descritos pela primeira
vez neste trabalho Os sinais de RMN de
1
H e
13
C, assim como correlações HSQC e
HMBC das 3 substâncias encontram-se no Anexo A (Figuras 7 - 15 e Tabela 1 - 3).
100
7 .58 8
7.5 48
7 .2 6 6
7 .07 9
7 .07 5
6 .9 7 0
6.9 65
6.8 74
6.8 54
6.2 65
6 .2 2 5
4 .2 8 7
4.2 69
4 .25 1
4.2 33
2 .11 3
1.5 76
1.3 54
1 .3 3 6
1.3 18
1.2 90
1 .27 2
61
a
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
OH
OH
O
1
4
8
13
10
14
15
11
12
b
O
OCOCH
3
OCOCH
3
OH
O
O
O
OH
1
4
8
13
10
15
11
12
14
C
19
H
24
O
10
PM: 412 g/mol C
19
H
24
O
10
PM: 412 g/mol
c
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
OH
OH
1
4
8
13
10
14
15
11
12
C
19
H
24
O
9
PM: 396 g/mol
Figura 21: a. Hirsutinolídeo (S1) b. Glaucolideo (S2) c. Hirsutinolideo (S3) isolados
da V. scorpioides.
5.3 Cultivo Celular
5.3.1 Avaliação da viabilidade celular
A avaliação da citotoxicidade foi realizada, em princípio para relacionar as
atividades citotóxicas em linhagens células tumorais e não tumoral. Em testes onde
foi observada uma relação dose-resposta da citotoxicidade, foi determinada a
concentração letal ou inibitória em cinqüenta porcento das células (CI
50
)
Foram utilizadas concentrações variadas em três linhagens celulares
diferentes: uma de fibroblasto de tecido conjuntivo de adipócitos de origem não
tumoral (L929) em experimentos com 1 e 24 horas de avaliação e duas linhagens
celulares tumorais, a saber um adenocarcinoma de cervix uterino humano (Hela) e
62
melanócitos obtidos de malanoma de camundongos (B16F10), com exposição de
citotoxicidade de 24 horas.
5.3.1.1 Poliacetileno (Fração 6)
A Figura 22 mostra a citotoxicidade do poliacetileno frente às células L929,
B16F10 e Hela. Os resultados em 1 hora indicam alto índice de citotoxicidade, na
concentração de 543 M houve morte de aproximadamente 65% das células. A CI
50
determinada foi de 55,27 M. No entanto, com o aumento da exposição para 24
horas ocorreu um decréscimo na citoxicidade de aproximadamente 20%, com CI
50
de 1330 M. O poliacetileno não apresentou diferença significativa ao grupo controle
negativo na citotoxicidade em células B16F10, este resultado seguiu o apresentado
em L929 com exposição de 24 horas, ou seja, baixo efeito citotóxico não
ultrapassando 20% de morte celular. Com relação a citotoxicidade nas células Hela,
todas as concentrações apresentaram níveis de significância comparados ao
controle negativo. Como nas células anteriores a maior concentração foi a mais
tóxica, apresentando uma diminuição de 41 % na viabilidade celular. A CI
50
determinada foi de 158,1 M (Figura 22)
63
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 22: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) ao poliacetileno (Fração 6) isolado de V. scorpioides utilizando
como controle negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO).
Gráfico representado por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001
ANOVA seguido de TUKEY.
Os resultados estão de acordo com os encontrados na literatura. Segundo
Lee; Hwang e Lim (2004) em experimentos de citotoxicidade com poliacetilenos, em
células tumorais HT-29, houve uma porcentagem de morte celular de 30% com 24
horas de exposição.
Da mesma forma, Stavri et al. (2005) verificaram a citotoxicidade em 24
horas do poliacetileno isolado da Artemísia monosperma em linhagens de células de
tumor coloretal (LS174T, SKCO1, COLO320DM e WIDR) sendo apresentado, em
todas linhagem, citotoxicidade estatisticamente significativa.
Os resultados de citotoxicidade foram monitorados por microscopia. Os
testes com as substâncias foram realizados somente após a formação da
monocamada celular com imagem fotografada para documentação. A Figura 23
Mei
o
ME
M
0
,
05
43
0,543
5
,
43
5
4,
3
543
D
M
S
O
0
20
40
60
80
100
***
**
CI
50
= 55,27µ
µµ
µM
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio M
E
M
0,054
3
0,543
5,
43
54,3
5
43
DMSO
0
20
40
60
80
100
**
*
CI
50
= 1330 µ
µµ
µM
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio MEM
0,0543
0,543
5,43
54,3
543
D
MS
O
0
20
40
60
80
100
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio M
E
M
0,054
3
0,543
5,43
4
54,3
54
3
D
M
SO
0
20
40
60
80
100
***
***
***
***
***
CI
50
= 158,1 µ
µµ
µM
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
64
demonstra que nas células Hela o efeito citopático foi muito maior que nas células
L929 e B16F10 com 24 horas de exposição, confirmando os resultados.
a b
c
Figura 23: a. Células L929 após 24 h de contato com poliacetileno. b. Células
B16F10 após 24 h de contato com poliacetileno. c. Células Hela após 24 h de
contato com poliacetileno.
5.3.1.2 Hirsutinolídeo (Fração 15)
A Figura 24 demonstra que a fração 15, hirsutinolídeo, apresentou baixa
citotoxicidade para as células L929 durante exposição de 1 hora, não sendo
estatisticamente significativa quando comparada ao grupo controle negativo.
Quando a fração 15 foi deixada em contato com as células L929 por 24 horas a
resposta citotóxica foi semelhante, ou seja, proporcionou pouca morte celular
(~20%) apesar da concentração de 0,0262 e 262 M serem estatisticamente
diferente do grupo controle. A atividade citotóxica da fração 15 frente às células
tumorais B16F10 foi pouco significativa. A concentração que mais provocou morte
65
celular foi a de 0,262 M, diminuindo somente aproximadamente 20% a viabilidade
celular. Apesar da citotoxicidade do hirsutinolídeo em modelos L929 e B16F10 ter
sido considerada pouco significativa, a fração 15 apresentou atividade citotóxica
significativa para a linhagem tumoral Hela, pois as três maiores concentrações
utilizadas (2,62; 26,2 e 262 M), apresentaram resultados extremamente
significativos quando comparados ao controle negativo (p<0,001). A concentração
de 262 M possibilitou a morte celular de aproximadamente 50% das células. Este
resultado foi considerado satisfatório devido à baixa citotoxicidade em células L929,
sugerindo uma ação mais específica para esta linhagem tumoral Hela.
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 24: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) ao hirsutinolídeo (Fração 15) isolado de V. scorpioides utilizando
como controle negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO).
Gráfico representado por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001
ANOVA seguido de TUKEY.
Meio MEM
0,0262
0,262
2
,62
26,2
262
D
MS
O
0
20
40
60
80
100
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
M
e
io
M
EM
0
,
0262
0,
2
62
2,
6
2
2
6
,2
2
6
2
DM
SO
0
20
40
60
80
100
**
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio MEM
0,0262
0,262
2
,62
26,2
262
D
MS
O
0
20
40
60
80
100
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Me
i
o
M
EM
0,
0
262
0
,262
2,
62
26,2
262
DMSO
0
20
40
60
80
100
**
*
******
***
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
66
5.3.1.3 Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)
Conforme apresentado no item 5.2.5 sobre a caracterização das frações e
compostos isoladas, foi obtido uma mistura de lactonas também testada quanto à
atividade citotóxica. A mistura apresentou baixa citotoxicidade em células L929 com
exposição de 1 hora, com morte celular estatisticamente significativa (~20%)
somente para as concentrações de 10 e 100 g/mL (Figura 25).
Com o aumento do tempo de exposição para 24 horas, o perfil de
citotoxicidade manteve-se idêntico ao observado em 1 hora, com as concentrações
de 10 e 100 g/mL novamente sendo as mais citotóxicas, com aproximadamente
20% de morte celular. A mistura de lactonas foi mais ativa para as células tumorais
B16F10, quando comparada a modelo de células não tumorais (L929). Todas as
concentrações utilizadas apresentaram morte celular estatisticamente significativa
comparadas ao grupo controle negativo. Em concentração de 100 g/mL, assim
como observado em células L929, obteve os maiores índices de morte celular
(~40%). A mistura de lactonas apresentou uma porcentagem de 40% de morte
celular na concentração de 10 g/mL para as células Hela, ou seja, esta fração foi
mais citotóxica para células Hela quando comparadas a célula tumoral B16F10
(Figura 25).
67
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 25: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) a mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21) isolado de
V. scorpioides utilizando como controle negativo meio MEM e controle positivo
dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico representado por média ± desvio padrão. *p<0,05
**p<0,01 ***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.
5.3.1.4 Cafeato de etila (Fração 17)
O cafeato de etila não apresentou, em nenhuma concentração, efeito
citotóxico sobre as células L929 com 1 hora de exposição. Com 24 horas, passou a
ter citotoxicidade nas concentrações 0,048 e 4,80 M, sendo estatisticamente
diferentes do grupo controle, no entanto a morte celular foi menor que 20%. Em
células tumorais B16F10 a citotoxicidade do cafeato de etila aumenta, tornando-se
mais significativa em concentração de 48,0 M, apresentando aproximadamente
25% de morte celular. Taxas semelhantes de viabilidade celular também foram
observadas para a célula Hela (Figura 26).
Meio ME
M
0,01
0,1
1
10
100
DMSO
0
20
40
60
80
100
*
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio MEM
0,01
0,1
1
10
100
D
MS
O
0
20
40
60
80
100
**
*
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio
MEM
0
,
01
0,
1
1
10
100
D
MSO
0
20
40
60
80
100
***
*
*
**
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio MEM
0,01
0,1
1
10
D
MSO
0
20
40
60
80
100
***
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
68
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 26: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) ao cafeato de etila (Fração 17) isolado de V. scorpioides utilizando
como controle negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO).
Gráfico representado por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001
ANOVA seguido de TUKEY.
5.3.1.5 Hirsutinolídeo (S1)
O Hirsutinolideo (S1) apresentou citotoxicidade de 25% nas células L929
com exposição de 1 hora e estatisticamente significativa, na concentração de 2,43
M, quando comparado ao controle negativo. Após 24 horas de exposição a
porcentagem de morte celular, aumenta e todas as concentrações apresentam
mesmo nível de significância (<0,001) em relação ao controle negativo. A
concentração mais tóxica, 0,0243 M, apresenta porcentagem de morte celular de
31%. A S1 também apresentou citotoxicidade significativa nas células tumorais
B16F10, quando comparado ao controle negativo. Todas as concentrações testadas
obtiveram porcentagem de morte celular semelhante, sendo a concentração de
M
eio
M
EM
0
,0
4
8
0
,4
8
0
4
,8
0
4
8
,
0
480
DMSO
0
20
40
60
80
100
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio M
E
M
0,048
0,48
0
4,80
48,0
DMSO
0
20
40
60
80
100
**
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio ME
M
0,048
0,480
4,80
48,0
480
DMSO
0
20
40
60
80
100
**
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Mei
o
MEM
0,0480
0
,48
0
4,
80
48,
0
D
M
SO
0
20
40
60
80
100
*
* *
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
69
0,243 M a mais citotóxica, com ~30% de morte celular. Este resultado assemelha-
se ao obtido com as células L929. A atividade da S1 nas células tumorais Hela foi a
que apresentou os maiores níveis de morte celular, mas infelizmente não foi possível
realizar o teste com todas das concentrações do composto S1 devido à falta de
amostra para realização dos testes. Em uma exposição de 24 horas com a
concentração de 0,0243M ocorreu a morte celular de aproximadamente 40% das
células. Ressalta-se o fato de que neste experimento, utilizou-se uma concentração
10x inferior que as citadas para os experimentos com L292 e B16F10 (Figura 27).
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 27: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) ao hirsutinolídeo (S1) isolado de V. scorpioides utilizando como
controle negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico
representado por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY.
Mei
o
M
EM
0,0243
0,243
2,
43
2
4,
3
DMSO
0
20
40
60
80
100
**
*
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio M
E
M
0,0243
0,24
3
2,43
24,3
DMSO
0
20
40
60
80
100
***
***
***
***
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
M
ei
o
M
EM
0
,0
24
3
0
,243
2,
4
3
D
M
SO
0
20
40
60
80
100
*
*
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio MEM 0,0243 DMSO
0
20
40
60
80
100
***
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
70
5.3.1.6 Glaucolideo (S2)
O glaucolídeo (S2) apresentou citotoxicidade significante em células
L929 com exposição de 1 hora, quando comparado com o controle negativo, sendo
a concentração de 0,0243 M a mais citotóxica com morte celular de 27%. Com o
aumento no tempo de exposição para 24 horas a porcentagem de morte celular
diminuiu (~5%) em todas as concentrações testadas, permanecendo a concentração
de 0,0243 M como a mais tóxica. Esta mesma concentração foi a única a
apresentar citotoxicidade significativa em células tumorais B16F10 com morte celular
de aproximadamente 35%. A citotoxicidade do glaucolídeo S2 foi altamente
significativa, comparadas ao controle negativo, para as células Hela. Em todas as
concentrações testadas o efeito citotóxico foi observado, entretanto a concentração
mais citotóxica foi a de 2,43 M, com porcentagem de ~42% de morte celular.
Também pode-se observar uma resposta dose-dependente e a CI
50
foi determinada
como de 2,11 M (Figura 28).
71
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 28: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) ao glaucolídeo (S2) isolado de V. scorpioides utilizando como
controle negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico
representado por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY.
5.3.1.7 Hirsutinolídeo (S3)
A atividade citotóxica do hirsutinolídeo (S3) nas células L929 com 1 hora de
exposição diminuiu em ~40% a viabilidade celular com as duas menores
concentrações utilizadas (0,0252 e 0,252 M), sendo extremamente significativo
quando comparadas ao grupo controle negativo. Com uma exposição mais
prolongada (24h) a porcentagem de morte celular com as duas concentrações mais
baixas seguiram sendo as mais tóxicas, porém a morte celular decaiu em 15%
comparado a 1 hora. A atividade da S3 nas células tumorais B16F10 não foi
estatisticamente significativa. Ao contrário, a atividade citotóxica nas células
tumorais Hela foi significante na concentração de 25,2
M em relação ao grupo
M
e
i
o
ME
M
0
,
02
4
3
0,243
2,43
24
,
3
DMSO
0
20
40
60
80
100
**
*
**
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
M
e
i
o
ME
M
0
,
02
4
3
0,243
2,43
24
,
3
DMSO
0
20
40
60
80
100
*
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
Meio MEM
0
,0
2
43
0,243
2,43
D
MS
O
0
20
40
60
80
100
*
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
M
ei
o
M
EM
0,0243
0,2
4
3
2,4
3
DMSO
0
20
40
60
80
100
***
***
***
IC
50
= 2,11 µ
µµ
µM
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
72
controle negativo, embora a porcentagem de morte celular tenha sido somente de
~20% (Figura 29).
a-1 a-2
b-2 c-2
Figura 29: Viabilidade das células L929 (a) B16F10 (b) e Hela (c) expostas a 1 hora
(1) e 24 horas (2) ao hirsutinolídeo (S3) isolado de V. scorpioides utilizando como
controle negativo meio MEM e controle positivo dimetilsulfóxido (DMSO). Gráfico
representado por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA
seguido de TUKEY.
A fim de melhorar a identificação das relações entre a respostas citotóxicas
em modelos celulares não tumorais (L929) e tumorais (B16F10 e Hela), foi
construída uma tabela comparativa dos resultados com as concentrações mais
tóxicas das substâncias testadas para cada linhagem celular. Comparando a
atividade específica das substâncias testadas em cada tipo celular com 24 horas de
exposição, observa-se que todas, com exceção do cafeato de etila que foi mais ativo
para a célula B16F10 (28% de morte celular), foram mais potentes para as células
tumorais Hela. Dentre as lactonas sesquiterpênicas a fração 15 apresentou os
melhores resultados, com 46% de morte celular. Além disso, o mesmo mostrou a
M
eio
M
EM
0
,
02
5
2
0
,2
5
2
2
,5
2
2
5
,
2
252
DMSO
0
20
40
60
80
100
***
**
***
Concentrações (
µ
µµ
µ
M)
Viabilidade %
Meio MEM
0,0252
0
,2
5
2
2,
5
2
25,2
252
DM
S
O
0
20
40
60
80
100
**
**
Concentrações (µ
µµ
µM)
Viabilidade %
M
eio
M
EM
0
,
02
5
2
0
,2
5
2
2
,5
2
2
5
,
2
252
DMSO
0
20
40
60
80
100
Concentrações (
µ
µµ
µ
M)
Viabilidade %
Me
io
ME
M
0
,
02
5
2
0,2
5
2
2,52
2
5
,2
D
M
SO
0
20
40
60
80
100
*
Concentrações (
µ
µµ
µ
M)
Viabilidade %
73
maior diferença entre os dois tipos celulares, podendo ser considerada a substância
com maior especificidade para as células tumorais Hela. O poliacetileno também
apresentou citotoxicidade mais específica para as células Hela, com 41% de morte
celular, assemelhando-se aos resultados observados pela fração 15 (Tabela 5).
74
Tabela 5: Porcentagem de morte celular da mistura de lactonas sesquiterpênicas e
substâncias isoladas de V. scorpioides em células não tumorais L929 com tempo de
exposição de 24 horas, e células tumorais B16F10 e Hela com tempo de exposição
de 24 horas.
L929
B16F10
Hela
Substâncias
24h 24h 24h
Diferença entre L929
(24h) e Hela (24h)
Hirsutinolídeo (S1) 0,0243 M
O
O
O
O
CH
3
O
O
CH
3
O
OH
CH
3
OH
O
CH
3
31%
30%
35%
4%
Glaucolídeo (S2) 2,43 M
O
CH
3
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
O
O
O
OH
27%
30%
43%
16%
Mistura de lactonas
(Fração 19-21) 10 M
O
OH
O
O
CH
3
O
O
CH
3
O
CH
3
CH
3
OH
O
O
O
CH
3
O
O
CH
3
O
OH
CH
3
O
O
OH
O
O
CH
3
21%
38%
43%
22%
Hirsutinolídeo (Fração 15) 262 M
O
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
OH
CH
3
O
18%
23%
46%
28%
Hirsutinolídeo (S3) 25,2 M
O
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
OH
CH
3
O
O
25%
22%
25%
0%
Cafeato de etila (Fração 17)
48 M
O
O
OH
OH
CH
3
15%
28%
19%
13%*
Poliacetileno (Fração 6) 543 M
O
O
22%
25%
41%
19%
*Diferença da porcentagem de morte celular entre células L929 (24h) e células B16F10 (24h).
75
Existem muitos relatos na literatura que demonstram a citotoxicidade das
lactonas sesquiterpênicas como Chen et al. (2007) que observou a acão citotóxica
do costunolídeo e do isocostunolídeo em células tumorais HT-29, A2058 e HepG2
obteve-se como resultado a diminuição de 60% das células HT-29 e quase 100%
das demais células utilizadas. Estes resultados foram obtidos com concentrações de
7,5 g/mL e tempo de exposição de 72 horas.
Estudos realizados por Konishi et al. (2002) demonstram que lactonas
sesquiterpênicas isoladas de Inua helenium são as responsáveis pela ação
citotóxica do extrato metanol desta planta. As lactonas foram citotóxicas para as
células Hela, B16F10 e MK-1.
Hilmi et al. (2003) utilizaram diferentes tipos de lactonas sesquiterpênicas,
nas concentrações de 0,1 e 20 g/mL, que ficaram em contato por 72 horas com as
células Hela, Jukart T e PBMCs e apresentaram resultados extremamente
citotóxicos para todos os tipos celulares.
Blanco et al. (2001) observaram a citotoxicidade de lactona sesquiterpênica
na concentração de 100 M e 24 horas de exposição em células Hela, Jeg-3 e Cos-
7, sendo que em todas as linhagens celulares a morte celular foi estatisticamente
significante com inibição da viabilidade celular em até 80%.
Quintero et al. (1999) realizaram experimentos com sete tipos de lactonas
sesquiterpênicas em diferentes linhagens tumorais. Sendo que somente duas delas
apresentaram inibição do crescimento celular estatisticamente significativo. As
demais apresentaram níveis baixos de citotoxicidade.
Kuo et al. (2002) verificaram a atividade citotóxica, em células tumorais
Hela, de duas lactonas sesquiterpênicas, do tipo hirsutinolídeo, que diferem
estruturalmente somente no radical do C13. Comparando o hirsutinolídeo que
apresentava radical hidroxila (OH) com o hirsutinolídeo com radical acetato, foi
verificada diminuição estatisticamente significativa no potencial citotóxico do
hirsutinolídeo contendo o radical acetato, em todos os tipos celulares estudados.
Sugerindo que a presença deste radical possa interferir na capacidade citotóxica das
lactonas sesquiterpênicas.
Os resultados obtidos em nossos estudos estão de acordo com os
propostos por Kuo et al. (2002). Todas as lactonas sesquiterpênicas isoladas de V.
scorpioides, como exceção do Hirsutinolídeo (Fração 15), apresentam radical
acetato ligados a um oxigênio (OAc) no C13. Comparando a citotoxicidade das
76
lactonas isoladas de V. scorpioides, com as lactonas sem o radical acetato descrito
nos estudos acima, verifica-se uma diminuição na porcentagem de morte celular.
O Hirsutinolídeo (Fração 15), por sua vez, possui substituinte OCH
2
CH
3
no
C13, possivelmente responsável pelo aumento da citotoxicidade, mesmo não sendo
estatisticamente significativa.
Outro fator mencionado por Ohno et al. (2005) foi que o tipo de linhagem
celular utilizada pode alterar os resultados de citotoxicidade de lactonas, sugerindo
uma especificidade pelas linhagens tumorais. No estudo realizado pelo mesmo,
verificou-se citotoxicidade de lactonas sesquiterpênicas isoladas de Lindera
strychnifolia em células tumorais SBC-3, mas em fibroblastos isolados de ratos (3T3-
L1) a citotoxicidade foi de no máximo 20%. Foram utilizadas concentrações de 10
M com tempo de exposição as células de 24 horas.
Confirmando os resultados de Ohno (2005), o presente experimento verifica
uma maior afinidade para a ação citotóxica, das lactonas sesquiterpênicas, pelas
células de linhagem tumoral (B16F10 e Hela) do que as células não tumorais (L929).
5.3.2 Avaliação da morte celular: Necrose X Apoptose
Células apoptóticas podem ser identificadas pelas seguintes mudanças
morfológicas: condensação e marginalização da cromatina nuclear, fragmentação do
DNA, vacuolisação citoplasmática e lise celular. Subseqüentemente, a célula é
fragmentada em compactas estruturas membranosas e posteriormente fagocitadas
por macrófagos e então removidas do tecido sem gerar uma resposta inflamatória
(BORTNER; CIDLOWSKI, 2002). Ao contrário, na necrose ocorre o desenvolvimento
de resposta inflamatória devido a liberação de enzimas que iniciam o processo
inflamatório dos tecidos adjacentes (BURLACU et al., 2001).
5.3.2.1 Quantificação de lactato desidrogenase
A quantificação de LDH é uma técnica que possibilita a diferenciação entre
apoptose e necrose. Esta enzima cataliza a interconversão de L-lactato e piruvato,
estando presente no citoplasma de todos tecidos humanos (DIASYS, 2006).
77
Como descrito anteriormente, a ocorrência de necrose desencadeia a
desintegração celular, ou seja, o conteúdo citoplasmático das células fica exposto.
No entanto, na apoptose são formados os corpos apoptóticos sem desintegração
das membranas celulares (CLARKE, 1990). Assim, a detecção da LDH pode ser um
indicativo de que o processo de morte celular seja por necrose devido a liberação
deste para o meio extracelular.
Este experimento foi realizado com as células L929, sendo utilizado um
tempo de exposição de 1 hora. As substâncias e concentrações testadas foram
escolhidas com base nos testes de citotoxicidade nas células L929 com 1 hora de
exposição, ou seja, foi selecionada somente a concentração mais citotóxica de cada
substância que apresentou algum nível de significância de morte celular. Os
controles negativo e positivo foram os mesmos utilizados nos experimento de
citotoxicidade. Os resultados demonstrados pela Figura 30 sugerem morte celular
via necrose principalmente pelo hirsutinolídeo (S1), glaucolídeo (S2) e mistura de
lactonas. Ambas apresentaram níveis altos de LDH sendo extremamente significante
(p<0,001) comparado ao controle negativo. Entretanto, o Poliacetileno quanto o
hirsutinolídeo (S3), apesar de apresentarem níveis de LDH estatísticamente
significativos, podem ter conduzido a morte celular por necrose e também por
apoptose, pois, mostraram os maiores níveis de citotoxicidade nas células L929 em
1 hora (55% e 39% respectivamente) e os menores valores na quantificação da
LDH.
78
Figura 30: Quantificação da lactato desidrogenase formada na presença de
substâncias isoladas e mistura de lactona sesquiterpênica de V. scorpioides com
exposição de 1 hora em células L929. Utilizando meio MEM como controle negativo
e DMSO (dimetilsulfóxido) como controle positivo. ***p<0,001 ANOVA seguido de
TUKEY.
5.3.2.2 Marcadores de morte celular Anexina V-FITC e Brometo de etídeo
O anticoagulante anexina V é uma proteína com propriedades de ligação
aos fosfolipídios, como a fosfatidilserina. Em células normais a fosfatidilserina está
localizada na região interna da membrana plasmática. Com a morte celular, mesmo
nos estágios iniciais da apoptose, a fosfatidilserina é translocada para a região
externa da membrana, ficando exposta e passível de interação com marcadores
celulares como a Anexina-V (CHEN, 2007).
Considerando que a translocação da fosfatidilserina apresenta-se também
em processos de necrose, pois com a desnaturação da membrana plasmática a
anexina penetra no citoplasma e liga-se a fosfatidilserina, utilizou-se o brometo de
etídeo, que marca apenas as células necrosadas e permite a diferenciação dos dois
processos.
Este experimento foi realizado com todas as substâncias, com tempo de
exposição de 24 horas, nas células tumorais B16F10 e Hela e células não tumorais
M
e
io MEM
Po
liacetilen
o
H
ir
s
u
t
in
olíd
e
o (S3
)
M
is
t
u
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c
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o
n
a
s
G
la
ucolídeo (S2
)
H
ir
s
u
t
in
olíd
e
o (S1
)
D
M
S
O
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
543 µM
2,43 µM
100 µg/mL
0,0243 µM
2,43 µM
***
***
***
***
***
Lactato desidrogenase
(U/I)
79
L929. Embora tenham sido utilizadas diferentes concentrações das substâncias
testes, os resultados obtidos não diferiram.
Tabela 6: Tabela demonstrativa do índice de necrose apresentado pelas
substâncias isoladas e mistura de V. scorpioides no processo de morte celular
através da marcação de morte celular com Anexina V-FITC e Brometo de Etídeo nas
células L929, B16F10 e Hela.
L929
B16F10
Hela
Substâncias
24h 24h 24h
Hirsutinolídeo (S1)
O
O
O
O
CH
3
O
O
CH
3
O
OH
CH
3
OH
O
CH
3
+++
+++
++
Glaucolídeo (S2)
O
CH
3
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
O
O
O
OH
+++
+++
++
Mistura de lactonas
(Fração 19-21)
O
OH
O
O
CH
3
O
O
CH
3
O
CH
3
CH
3
OH
O
O
O
CH
3
O
O
CH
3
O
OH
CH
3
O
O
OH
O
O
CH
3
+
++
++
Hirsutinolídeo (Fração 15)
O
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
OH
CH
3
O
++
+++
++
Hirsutinolídeo (S3)
O
O
O
CH
3
O
CH
3
O
OH
CH
3
OH
CH
3
O
O
+
+
++
Cafeato de etila (Fração 17)
O
O
O
H
OH
CH
3
++
++
+++
Poliacetileno (Fração 6)
O
O
+
+
+
+++ Elevados Índices de Necrose (>75%)
++ Moderados índices de Necrose (25-75%)
+ Baixos índices de Necrose (<25%)
80
As fotos para visualização das células marcadas com Anexina V-FITC e
Brometo de etídeo encontram-se no Anexo B (Figuras 1 - 7).
O Hirsutinolideo (S1) apresentou níveis altos de necrose evidenciados pela
emissão de fluorescência alaranjada, caracterizada pela internalização do brometo
de etídeo nas células. Os três tipos celulares apresentaram resposta semelhante, ou
seja, predominância de processo necrótico. Este resultado esta de acordo com os
obtidos na quantificação da LDH (Figura 30 e Tabela 6).
O processo necrótico, produzido pelo Glaucolídeo, mistura de lactonas e
cafeato de etila, é predominante nas três linhagens de células utilizadas em nossos
experimentos, apresentando em sua grande maioria, intensa fluorescência
alaranjada (Tabela 6).
O hirsutinolídeo (Fração 15) tem a necrose como principal mecanismo de
morte celular, para as células B16F10, L929, assim como para as Hela apesar de
ser observado apoptose em pequeno número de células (Tabela 6).
O hirsutinolídeo (S3) apresentou, dentre as lactonas sesquiterpênicas, os
maiores índices de apoptose (Tabela 6). Mesmo assim, nas células L929 e B16F10,
observa-se tanto em necrose como apoptose. Verifica-se, em algumas células,
somente fluorescência verde, emitida pela ligação da Anexina V a fosfatidilserina.
Mas também se nota células que apresentam internalização de brometo de etídeo,
demonstrando que ocorre necrose, mas, em pequena intensidade. Resultado em
concordância aos obtidos na quantificação de LDH (Figura 30). Entretanto, nas
células tumorais Hela o hirsutinolídeo provoca um processo, predominantemente,
necrótico.
O poliacetileno, confirmando os resultados da LDH, apresentou índices de
apoptose mais intensos que as substâncias anteriores (Tabela 6). Através da
microscopia verificou-se que a apoptose está ligeiramente superior a necrose. Nos
três tipos celulares, a morte celular acontece por apoptose e, em quase igual
equivalência, por necrose.
A capacidade de invibializar as células tumorais, com o mínimo de danos
possíveis as células não tumorais é o motivo pelo qual procura-se novas substâncias
com propriedade antitumorais. Portanto, o mecanismo com o qual ocorre a morte
81
celular é de extrema importância. A apoptose, por ser um processo organizado, com
vantagens mencionadas anteriormente, é o mecanismo de morte celular preferível.
Em virtude dos resultados observados nos experimento de quantificação de
LDH e marcadores de morte celular, onde podem ser diferenciados os dois
processos de morte celular, necrose e apoptose, pode-se salientar que o
poliacetileno e o hirsutinolídeo (S3) são as substâncias que apresentam os maiores
índices de apoptose, apesar de também apresentarem necrose, nos dois tipos de
células tumorais utilizadas.
Entretanto, o hirsutinolídeo (S3) apresentou baixa porcentagem de morte
celular nas células tumorais testadas (B16F10 e Hela) e semelhante às células não
tumorais (L929). Por outro lado, o poliacetileno apresentou uma boa porcentagem de
citotoxicidade para as células tumorais Hela com exposição de 24 horas, assim
como, para as células L929, neste mesmo tempo de exposição, o percentual caiu
em 19%. Estes resultados, somados aqueles observados na determinação da
presença de apoptose no processo de morte celular, sugere-se o poliacetileno como
a substância isolada de V. scorpioides como a mais indicada a estudos mais
aprofundados de mecanismo de ação antitumoral nas células Hela.
Estes resultados confirmam os obtidos por Choi et al. (2006), que utilizando
poliacetileno de Petrosla sp em células de melanoma humano (SK-MEL-2)
verificaram processo apoptótico relacionando aumento da proteína Bax, do
citocromo C, assim como, ativação das caspases 3 e 9 e fragmentação do DNA.
A necrose produzida pelo poliacetileno pode ser responsável por um
pequeno processo inflamatório, o que não seria ruim, pois seriam recrutadas células
de reparo como descrito por Dalazen et al. (2005).
Em relação as lactonas sesquiterpênicas, os resultados não confirmam os
encontrados na literatura, contudo a grande diversidade estrutural das mesmas pode
justificar os resultados ambíguos encontrados. Estudos realizados com a lactona
sesquiterpênica Partenolídeo (25M) demonstrou indução de apoptose em células
tumorais (COLO 205) com o envolvimentos de membros da familia BCL-2 (ZHANG;
ONG; SHEN, 2004).
Rivero et al. (2003) observaram a indução de apotose de lactonas
sesquiterpênicas isoladas da Tanacetum ptarmicaeflorum em células de leucemia
mielóide HL-60 e U937. As lactonas apresentaram apoptose verificada pela ativação
da caspase 3, fragmentação específica do DNA e aumento do citocromo C. Chen et
82
al. (2007) utilizando o Isoustonolídeo, lactona sesquiterpênica isolada de Inula
Helenium, verificaram que a apoptose gerada em três linhagens de células tumorais
(A2058, HT-29 e HepG2) ocorre com ativação da cascata de caspases e proteínas
da família Bcl-2.
5.3.2.3 Fragmentação do DNA
A fragmentação do DNA é outra possibilidade metodológica de
diferenciação entre apoptose e necrose. As células apoptóticas exibem
decomposição característica do DNA em pedaços de 50 a 300 quilobases. A seguir
ocorre clivagem do DNA em múltiplos de 180 a 200 pares de bases. Esta clivagem é
realizada por endonucleases que, por sua vez, são dependentes de Ca
2+
e Mg
2+
.
Estes fragmentos de DNA formados podem ser visualizados por eletroforese com a
formação bandas de DNA caracterizando sua fragmentação específica (VAUX;
SILKE, 2003). Na necrose o DNA não fragmenta em bandas específicas, em
eletroforese nota-se a formação de uma mancha de DNA. (McCARTHY; EVAN,
1998).
Este experimento foi realizado somente com a Poliacetileno, por ser entre
todas substâncias testadas neste experimento, a que apresentou, maiores
indicativos de processo apoptótico. Foram utilizadas as células Hela por sua maior
afinidade, verificada pelos testes de citotoxicidade.
Na Figura 31 está representada a fragmentação do DNA das células
expostas ao Poliacetileno, DMSO como controle negativo e Paclitaxel como controle
positivo. Nota-se, no controle negativo a fragmentação inespecífica do DNA pela
formação de uma "mancha" de DNA, sem banda específica.
Para o controle positivo percebe-se a formação de banda específica entre
100 e 200 pb, esta banda caracteriza a morte celular por apoptose. O DNA das
células tratadas com o Poliacetileno formou uma mancha de DNA, mas de menor
intensidade quando comparada ao grupo controle. Visualiza-se fluorescência mais
concentrada entre 100 e 200 pb, mas sem a formação de banda de fragmentação
específica de DNA.
Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Choi et al. (2006), a
fragmentação do DNA em agarose gel, utilizando um poliacetileno nas
83
concentrações de 5 e 10 M, não possibilitou a visualização de bandas bem
definidas, apesar de tenderem a concentrarem em bandas específicas de marcação
de apoptose.
Em função dos resultados obtidos anteriormente que demonstraram a
presença tanto de necrose como de apoptose, o resultado da ausência de bandas
específicas na fragmentação do DNA pode ter ocorrido por uma possível ação
genotóxica que o Poliacetileno possa exercer sobre o DNA das células, não
deixando visível a banda de DNA. Entretanto, a execução de testes de
genotoxicidade pode auxiliar na elucidação do dano ao DNA promovido pelo
poliacetileno.
a b c
1000 pb
400 pb
200 pb
100 pb
Figura 31: Fragmentação do DNA de células Hela induzidas pela substância
poliacetileno (b) na concentração de 1 M, utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) como
controle negativo (a) e paclitaxel como controle positivo (c) na concentração de 1
M. Seta: Banda específica correspondendo a apoptose.
5.3.3 Genotoxicidade
O teste do cometa é um dos modelos mais utilizados na avaliação do
potencial genotóxico de substâncias. Modelos de genotoxicidade das classes
químicas de substâncias em estudo apresentam escassos dados na literatura.
O ensaio cometa é uma ferramenta sensível para quantificar danos no DNA,
bem como o processo de reparação dos mesmos, sendo amplamente empregado
84
em estudos de genética toxicológica e monitoramento ambiental (TICE et al., 2000;
COLLINS et al., 1997). A versão alcalina do teste, descrita por Singh et al. (1988),
permite medir a ocorrência de quebras simples e dupla, sítios alcali-lábeis e cross-
links no DNA.
Os resultados da Figura 32 demonstram a tendência das substâncias
testadas de danificar o DNA. Percebe-se que o Hirsutinolídeo (S1) e a Mistura de
lactonas apresentam, 90% e 80% respectivamente, dos cometas formados nos
níveis 3 e 4 (nível máximo de genotoxicidade), ou seja, níveis altos de
genotoxicidade. O Hirsutinolídeo obteve a maioria dos cometas (60%) em nível 3 de
genotoxicidade, enquanto a mistura de lactonas ficaram 40% para o nível 3 e 40%
para o nível 4.
O Glaucolídeo (S2) e o Hirsutinolídeo (S3) (Figura 34) demonstraram, nos
níveis 2 e 3, 90% e 95% dos cometas formados, sendo atribuídos ao nível 4 apenas
10% e 5%, respectivamente. O Glaucolídeo apresentou 45% dos cometas de níveis
2 (nível de agressão ao DNA de média intensidade) e 40% no nível 3. Assim como, o
Hirsutinolídeo apresentou 50% dos cometas no nível 2 e 45% de nível 3 (Figura 32).
As substâncias Hirsutinolídeo (Fração 15) e Poliacetileno (Figura 32) foram
as que obtiveram a maior variedade de cometas formados, ou seja, os mesmos
ficaram dispersos do nível 1 (baixa intensidade de genotoxicidade) ao nível 4. A
maioria dos cometas (45%) formados pelo Hirsutinolídeo foi de nível 2, mas 30%
foram de nível 4. Para o poliacetileno 40% dos cometas foram de nível 3, 25% de
nível 2 e 4, e 10% de nível 1.
O Cafeato de etila (Figura 32), foi a substância testada a apresentar
cometas em níveis mais baixos de genotoxicidade (1 e 2), 50% em cada um desses
níveis.
Comparando os resultados com os controles verifica-se aparente
genotoxicidade, em diferentes níveis, para todas substâncias testadas. Lembrando
que o controle negativo obteve 65% dos cometas formados de nível 0 (nível mais
baixo de genotoxicidade) (Figura 35) e o controle positivo (Figura 36) apresentou
70% dos cometas de nível 4 (Figura 32).
85
Figura 32: Níveis de danos ao DNA ocasionadas pelo Hirsutinolídeo (S1),
Hirsutinolídeo (Fração 15), Hirsutinolídeo (S3) e Glaucolídeo (S2) (gráfico superior);
mistura de lactonas, cafeato de etila e poliacetileno (gráfico inferior) utilizando como
controle negativo dimetilsulfóxido (DMSO) e metilmetanosulfonato (MMS) como
controle positivo. As células da medula óssea de camundongos Swiss foram
expostas às substâncias testes e controles por 1 hora.
O Índice de dano (ID) representado na Figura 33 relaciona,
matematicamente, os cometas formados por cada substância.
Através da Figura 33 pode-se observar que todas as substâncias
apresentam ID estatisticamente significativo (p<0,001) comparado ao grupo controle
negativo. Apenas o cafeato de etila apresentar ID mais baixo que as demais
substâncias, com diferença significativa (p<0,01) comparado ao controle negativo.
Nível 0 Nível 1 Nível 2 Nível 3 Nível 4
0
20
40
60
80
100
DMSO
Mistura de lactonas 100 µg/mL
Cafeato de etila 48,0 µM
Poliacetileno 54,3 µM
MMS 40 µM
Níveis de danos ao DNA
Porcentagem %
Nível 0 Nível 1 Nível 2 Nível 3 Nível 4
0
20
40
60
80
100
DMSO
Hirsutinolídeo (S1) 24,3 µM
Hirsutinolídeo (15) 26,2 µM
Hirsutinolídeo (S3) 25,2 µM
Glaucolídeo (S2) 24,3 µM
MMS 40 µM
Níveis de danos ao DNA
Porcentagem %
86
Figura 33: Índice de dano ao DNA ocasionadas pelo Hirsutinolídeo (S1),
Hirsutinolídeo (Fração 15), Hirsutinolídeo (S3), Glaucolídeo (S2), mistura de
lactonas, cafeato de etila e poliacetileno. Utilizando como controle negativo
dimetilsulfóxido (DMSO) e metilmetanosulfonato (MMS) como controle positivo. As
células de medula de camundongos Swiss foram expostas às substâncias testes e
controles por 1 hora. **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.
Em virtude dos resultados de genotoxicidade, nota-se que todas as
substâncias apresentam níveis estatisticamente significativos de genotoxicidade.
Este resultado pode ser um indicativo de mutagenicidade. Contudo, outros estudo
devem ser realizados a fim de elucidar esta suposição, como o teste de
micronúcleos.
Relacionando o teste de genotoxicidade e o experimento de fragmentação
de DNA realizados com o Poliacetileno, verifica-se que o processo de lesão ao DNA,
verificado pelo teste de cometa, pode ter mascarado a visualização de banda
específica da fragmentação do DNA entre 100 e 200 pb.
D
M
S
O
C
a
f
e
a
t
o
d
e
e
ti
la
H
ir
s
u
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o (S3
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o
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(15
)
H
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s
u
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olíd
e
o (S2
)
Po
liacetilen
o
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olíd
e
o (S1
)
M
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t
u
r
a d
e
la
c
t
o
n
a
s
MMS
0
20
40
60
80
24,3 µM
24,3 µM
100 µg/mL
26,2 µM
25,2 µM
48,0 µM
54,3 µM
**
***
***
***
******
***
40 µM
Índice de Dano
87
Figura 34: Cometas (Níveis 2 e 3) em células de medula de camundongo Swiss com
exposição de 1 hora ao Hirsutinolídeo (S3).
Figura 35: Cometas (Níveis 0 e 1) em células de medula de camundongo Swiss com
exposição de 1 hora ao dimetil sufóxido (DMSO) utilizado como controle negativo.
Figura 36: Cometa (Nível 4) em células de medula de camundongo Swiss com
exposição de 1 hora ao metilmetanosulfanato (MMS) utilizado como controle
positivo.
88
5.3.4 Quantificação da caspase 3
Neste experimento foi quantificada a caspase 3, uma caspase efetora
pertencente as duas vias de ativação apoptótica.
Foi realizada a quantificação da caspase 3 nas células tumorais B16F10 e
Hela utilizando a substância Poliacetileno que, devido aos resultados anteriores,
demonstrou ser a substância de maior indução de apoptose. Foi utilizado somente a
concentração de 1 M pelo término das concentrações superiores. Segundo Zhang;
Ong e Shen (2004) o partenolídeo, em células COLO205, verificaram a presença de
caspase 3 somente a partir da concentração de 25 M.
Na Figura 37 observa-se pequeno aumento, estatisticamente significativo
(p<0,05), na formação da caspase 3 nas células tumorais B16F10 em presença ao
Poliacetileno quando comparado ao controle negativo.
DMSO
Poliacetileno
Paclitaxel
0
10
20
30
40
50
1 µM
100 µM
*
***
µ
µ
µ
µ
mol pNa/min/mL
Figura 37: Quantificação da p-nitro anilina (pNa) formada nas células tumorais
B16F10 em presença do Poliacetileno (Fração 6) isolado de V. scorpioides,
utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) para controle negativo e Paclitaxel como controle
positivo com tempo de exposição de 24 horas. As barras são expressas pela média
± desvio padrão. *p<0,05 ***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.
Na Figura 38 verifica-se aumento da caspase 3 nas células Hela que
estiveram em contato com o Poliacetileno quando comparado ao controle negativo,
mas este aumento não foi estatisticamente significativo (p>0,05).
89
Figura 38: Quantificação da p-nitro anilina (pNa) formada nas células tumorais Hela
em presença do Poliacetileno (Fração 6) isolado de V. scorpioides, utilizando
dimetilsulfóxido (DMSO) para controle negativo e Paclitaxel como controle positivo
com tempo de exposição de 24 horas. As barras são expressas pela média ± desvio
padrão. **p<0,01 ANOVA seguido de TUKEY.
O aumento de caspase 3 nas células tumorais Hela e B16F10, sugerem que
o Poliacetileno promove morte celular por apoptose. No entanto, esta via de morte
celular não é exclusivamente apoptótica, pode ser observado nos experimentos
realizados anteriormente a presença do processo necrótico.
Os resultados de quantificação estão de acordo com os obtidos por Choi et
al. (2006), onde foram quantificadas as caspases 3 e 9 na presença de um
poliacetileno nas concentrações de 5 e 10 M por 24 horas. O método de
quantificação das caspases foi semelhante ao aqui utilizado, ou seja, quantificação
da p-nitroanilina (p-Na). O poliacetileno na concentração de 5 M obteve pequeno
aumento na caspase 3, sendo semelhante aos aqui obtidos com 1 M, mas na
concentração de 10 M a atividade de caspase 3 se torna duas vezes mais potente
comparada a concentração inferior, sugerindo resposta dose dependente.
As caspases pertencem à família de proteases cisteínas, podendo ser
divididas em caspases inflamatórias e caspases apoptóticas, as quais podem ser
incluídas nos grupos de caspases iniciadoras e efetoras. Caspases são os sensores
centrais e executores da apoptose celular (THOME; TSCHOPP, 2001).
DMSO
Poliacetileno
Paclitaxel
0
10
20
30
40
1 µM
1 µM
**
µ
µ
µ
µ
mol pNa/min/mL
90
A apoptose pode ser iniciada por dois caminhos: O primeiro, também
chamado de caminho extrínseco, é mediado pelos receptores de morte, como Fas
(TNF). Adaptadores específicos de proteínas como FADD/MORT1; TRADD ou
CRADD/RAIDD ligam-se aos receptores específicos formando um complexo que por
sua vez ativa os iniciadores de apoptose como as caspases iniciadoras 2, 8 ou 10 as
quais ativam as caspases efetoras (3, 6 e 7) induzindo a ativação cascata apoptótica
(ROBBINS; COTRAN, 2005).
No segundo caminho, intrínseco, citocromos “c” são liberados pelas
mitocôndrias para o citoplasma em células expostas a drogas quimioterapêuticas, a
irradiações UV, fatores de crescimento ou ativação dos receptores Fas ou TNF. O
citocromo “c” liberado liga-se ao Apaf-1, promovendo a oligomerização do complexo
citocromo/APAF formando o apoptossomo. O recrutamento de procaspase-9 pelos
apoptossomos ativos resultam na autoativação e subseqüentemente na ativação das
caspases-3 efetora (ZHANG; HUANG, 2006).
A ativação das mitocôndrias para a liberação dos citocromos “c” pode ser
feita também via receptores de morte que induzem a ativação de caspases
iniciadoras (pro-caspase-8) levando a clivagem da proteína Bid. Os fragmentos
resultantes da clivagem de Bid são translocados do citosol até as mitocôndrias,
resultando na ruptura destas e liberação dos citocromos “c”. Além do citocromo “c”
outros fatores proapoptóticos como o AIF e Smac (DIABLO) estão envolvidos na
ativação do sinal apoptótico. Outra proteína chamada HtrA2/Omi é liberada pela
mitocôndria durante a apoptose. No citosol a proteína bloqueia a ação do inibidor de
apoptose IAPs, levando o aumento da ativação das caspases (SALVESEN;
DUCKETT, 2002).
91
6 CONCLUSÕES
Através do processo extrativo foi isolado e caracterizados uma lactona
sesquiterpênica do tipo hirsutinolídeo (Fração 15), um éster do ácido cafeico (cafeato
de etila (Fração 17), um poliacetileno (Fração 6) além de uma mistura de lactonas
sesquiterpênicas contendo um hirsutinolídeo e um glaucolídeo. Dentre as
substâncias isoladas, o poliacetileno é inédito na literatura.
As lactonas sesquiterpênicas isoladas e em mistura, apresentaram níveis
significativos de citotoxicidade para todos as linhagens celulares, tendo de modo
geral maior afinidade para as células de adenocarcinoma de cérvix (Hela). O Cafeato
de etila foi a substância isolada que apresentou índices baixos de citotoxicidade
tanto para as células L929 quanto para as células tumorais B16F10 e Hela. O
poliacetileno também demonstrou maior especificidade pelas células tumorais Hela
com uma inibição de ~40% da viabilidade celular, sendo que nas células tumorais
B16F10 e não tumorais L929 em 24 horas a diminuição da viabilidade celular foi de
~20%.
O processo necrótico, juntamente com a apoptose, foi evidenciado em todas
as substâncias testadas. Entretanto ficou evidenciado que o poliacetileno apresentou
maiores indícios de apoptose, apesar de não ser exclusivo. Em experimento com
marcadores de morte celular, essa substância obteve índices de necrose menores
que 25% nas três linhagens celulares utilizadas. Ainda foi confirmada a ocorrência
de processo apoptótico pela baixa liberação de LDH (~600 UI). A indução da
caspases 3 pelo poliacetileno foi observada nas células tumorais B16F10 e Hela,
mesmo quando utilizada em baixa concentração (1 M). A fragmentação do DNA de
células Hela em contato com o poliacetileno não formou banda específica de
apoptose, o que pode ser devido ao potencial genotóxico demonstrado no ensaio do
cometa. Todas as substâncias isoladas, assim como a mistura de lactonas
sesquiterpênicas, apresentaram níveis estatisticamente significativos de
genotoxicidade.
Considerando os promissores resultados obtidos com o poliacetileno, a
continuidade dos estudos com a pesquisa de citocromo "c", proteínas como a Bcl-2,
Bax, assim como caspases iniciais (8 e 9), possibilitarão o desvendamento da via
apoptótica, intrínseca ou extrínseca, envolvidas no processo de morte celular.
92
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102
ANEXO A
Espectros de RMN das substancias estudadas
103
Hirsutinolídeo (Fração 15): (lS*,4R*,8S*,10R*)-1,4-epoxi-l3-etoxi-1,10-diidroxi-8-
acetoxi-germacra-5E,7(11)-dien-6, 12-olideo, ou 8-Acetil-13-etoxipiptocarfol
O
O
OCOCH
3
OH
OH
O
O
1
4
8
13
10
14
15
11
12
ppm (t2)
0.0
5.0
10.0
5.0
10.0
ppm (t1)
Figura 1: Mapa de correlação Homonuclear COSY (400 MHz, CDCl
3
) do
Hirsutinolídeo (Fração 15).
104
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0
50
100
ppm (t1)
Figura 2: Mapa de correlação heteronuclear HSQC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Hirsutinolídeo (Fração 15).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
150
ppm (t1)
105
Figura 3: Mapa de correlação heteronuclear HMBC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Hirsutinolídeo (Fração 15).
Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21):
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
O
OH
OH
1
4
8
13
10
14
15
11
12
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
O
H
OH
O
O
1
4
8
13
10
15
11
12
14
ppm (f2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
ppm (f1)
Figura 4: Mapa de correlação Homonuclear COSY (400 MHz, CDCl
3
) da Mistura de
lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21).
106
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
ppm (t1)
Figura 5: Mapa de correlação Heteronuclear HSQC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) da
Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
150
200
ppm (t1)
Figura 6: Mapa de correlação Heteronuclear HMBC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) da
Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)
107
Hirsutinolídeo (S1)
O Hirsutinolideo (S1) apresentou-se como uma goma incolor, denominado:
1,4-5,6-diepoxi-1,10-diidroxi-8,13-diacetoxi-7(11)-germacradien-12,6-olideo, cujos
dados espectrais encontram-se na tabela abaixo (LAZZAROTTO, 2006).
Tabela 1: Sinais de RMN de
1
H e
13
C atribuídos para o Hirsutinolídeo (S1).
Posição
1
H
13
C
1
108,5
2
1,44 (ddd 12,5; 12,8; 8,6)
1,91 (ddd 12,5; 7,6; 0,5)
32,2
3
2,31 (ddd 12,8; 12,8; 7,6)
2,11 (ddd 12,8; 8,6; 0,5)
34,6
4
- 78,1
5
3,48 s 69,9
6
- 90,2
7
- 158,3
8
5,99 dd (10,2; 0,7) 68,6
9
2,56 dd (16,2; 10,2)
2,07 dd (16,2; 0,7)
2,12 m
40,5
10
- 77,1
11
- 132,1
12
166,0
13
5,95 d (13,5)
4,78 d (13,5)
55,1
14
1,14 s 25,6
15
1,52 s 26,7
Acetato
(COCH
3
)
2,04/2,05 s
Acetato
(COCH
3
)
20,6
170,0/169,6
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
108
Glaucolídeo (S2)
O
OCOCH
3
OCOCH
3
OH
O
O
O
OH
1
4
8
13
10
15
11
12
14
Tabela 2: Sinais de RMN de
1
H e
13
C atribuídos para o Glaucolídeo (S2).
Posição
1
H
13
C
1
- 215,2
2
2,14 m
1.80 m
31,0
3
2.21 m
1.89 m
37,5
4
- 71,0
5
4.21 s 66,8
6
87,6
7
155,1
8
6,11 dd (5.5/2.5) 67,8
9
2,80 dd (15.5/2.5)
2,23 dd (15.5/5.5)
41,9
10
80,3
11
128,2
12
166,7
13
4.97 s 55,1
14
1.23 s 30.2
15
1.28 s 23.9
Acetato
(COCH
3
)
2,07/1,99 s
Acetato
(COCH
3
)
20,4/20.6
169,1/170.2
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
109
ppm (t1)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
150
Figura 7: Espectro de RMN de
1
H (400 MHz, CDCl
3
) do Glaucolideo (S2).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
ppm (t1)
Figura 8: Mapa de correlação Homonuclear COSY (400 MHz, CDCl
3
) do
Glaucolideo (S2).
110
ppm (f2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0
50
100
ppm (f1)
Figura 9: Mapa de correlação Heteronuclear HSQC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Glaucolideo (S2).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0
50
100
150
200
ppm (t1)
Figura 10: Mapa de correlação Heteronuclear HSQC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Glaucolideo (S2).
111
Hirsutinolideo (S3) - Diacetilpiptocarfol
Esta lactona foi originalmente encontrada em Vernonia scorpioides e
Vernonia saltensis, sendo bem característica para o gênero Vernonia. Seu espectro
de RMN de
1
H apresentou o sinal do H-8 como um dubleto largo em 6,51 ppm,
característico da β-orientação da função éster, como na maioria das lactonas
descritas anteriormente.
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
OH
OH
1
4
8
13
10
14
15
11
12
Tabela 3:
Sinais de RMN de
1
H e
13
C do Hirsutinolideo (S3) em comparação com
dados de literatura (CATALAN; IGLESIAS, 1986).
Posição
1
H
13
C Diacetilpiptocarfol
1
H (60 MHz, CDCI
3
)
1
- 108,6 -
2 1,96 dd (12,4; 6,4)
1,79 ddd (12,9; 12,9; 7,2)
31,0
3 2,43 ddd (12,8; 12,8; 6,6)
2,13 m
37,9 -
4
- 81,8 -
5 5,95 s
126,6 5,93
6
- 144,1 -
7
- -
8 6,51 d J= 10,9 Hz
66,7
6,28 dl, J =8 Hz
9 2,02 d J= 16
2,16 dd (16 e 10,9) Hz
37,2
2.56 dd, J= 15,5 e 9 Hz
10
- 78,1 -
11
130,9
12
167,1
13
5,31 e 4,86
AB quarteto, J=12,8 Hz
56,0 5,10 e 4,95
AB quarteto, J=13 Hz
O-CO-CH
3
2,11/2,15 s
21,1/21,5 2,09 e 2,07 (Ac)
O-CO-CH
3
- 170,8/ 169,4
14 1,25 s
25,5
15 1,56 s
29,1
1,57 e 1,53 (2 Me)
112
Obtidos a 253K em CDCl
3
observado
1
H a 400,13 e
13
C a 100,61 MHz, respectivamente.
Assim como o Hirsutinolideo (Fração 15) e outras lactonas deste tipo, a S3
apresentou apenas sinais largos de RMN de
1
H à temperatura ambiente, os sinais e
suas multiplicidades só foram definidas a 0
o
C (Figura 10).
ppm (t1)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
6.469
6.415
6.025
5.939
5.885
5.227
5.061
4.975
4.926
4.913
4.113
3.858
3.845
3.832
2.491
2.482
2.460
2.434
2.430
2.413
2.407
2.383
2.178
2.112
2.087
1.587
Figura 11: Espectro de RMN de
1
H do Hirsutinolideo (S3), obtido a temperatura
ambiente (CDCl
3
, 400 MHz).
ppm (t1)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0
50
100
150
200
250
300
113
Figura 12: Espectro de RMN de
1
H do Hirsutinolideo (S3), obtido a 0
o
C (CDCl
3
, 400
MHz).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
ppm (t1)
Figura 13: Mapa de correlação Homonuclear COSY (400 MHz, CDCl
3
) do
Hirsutinolideo (S3).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0
50
100
150
200
ppm (t1)
114
Figura 14: Mapa de correlação heteronuclear HSQC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Hirsutinolideo (S3).
ppm (t2)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0
50
100
150
200
ppm (t1)
Figura 15: Mapa de correlação heteronuclear HMBC (400 MHz para
1
H, CDCl
3
) do
Hirsutinolideo (S3).
115
ANEXO B
Fotos dos marcadores de morte celular estudados
116
Hirsutinolídeo (S1):
a b c
Figura 1: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com hirsutinolídeo (S1). b. Células B16F10 após 24 h de
contato com hirsutinolídeo (S1). c. Células Hela após 24 h de contato com
hirsutinolídeo (S1).
Glaucolídeo (S2):
a b c
Figura 2: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com glaucolídeo (S2). b. Células B16F10 após 24 h de
contato com glaucolídeo (S2). c. Células Hela após 24 h de contato com glaucolídeo
(S2).
Mistura de lactonas sesquiterpênicas (Fração 19-21)
a b c
Figura 3: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com mistura de lactonas (Fração 19-21). b. Células
117
B16F10 após 24 h de contato com mistura de lactonas (Fração 19-21). c. Células
Hela após 24 h de contato com mistura de lactonas (Fração 19-21).
Hirsutinolídeo (Fração 15)
a b c
Figura 4: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com hirsutinolídeo (Fração 15). b. Células B16F10 após
24 h de contato com hirsutinolídeo (Fração 15). c. Células Hela após 24 h de contato
com hirsutinolídeo (Fração 15).
Hirsutinolídeo (S3)
b c
Figura 5: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com hirsutinolídeo (S3). b. Células B16F10 após 24 h de
contato com hirsutinolídeo (S3). c. Células Hela após 24 h de contato com
hirsutinolídeo (S3).
Cafeato de etila (Fração 17)
a b c
Figura 6: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com cafeato de etila. b. Células B16F10 após 24 h de
118
contato com cafeato de etila. c. Células Hela após 24 h de contato com cafeato de
etila.
Poliacetileno (Fração 6)
a b c
Figura 7: Células marcadas com Anexina V-FITC e Brometo de etídeo. a. Células
L929 após 24 h de contato com poliacetileno. b. Células B16F10 após 24 h de
contato com poliestireno. c. Células Hela após 24 h de contato com poliacetileno.
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