( PDF ) Avaliação da atividade antinociceptiva, antiinflamatória e protetora gástrica do extrato hidroalcoólico bruto da Polygala paniculata L.

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Fernanda da Rocha Lapa

Avaliação da Atividade Antinociceptiva, Antiinflamatória

e Protetora Gástrica do Extrato Hidroalcoólico Bruto da

Polygala paniculata L.

CURITIBA

2006

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Fernanda da Rocha Lapa

Avaliação da Atividade Antinociceptiva, Antiinflamatória

e Protetora Gástrica do Extrato Hidroalcoólico Bruto da

Polygala paniculata L.

Dissertação desenvolvida no Departamento

de Farmacologia do Setor de Ciências

Biológicas da Universidade Federal do

Paraná e no Departamento de Ciências

Fisiológicas da Universidade Federal de

Santa Catarina durante o curso de Pós-

Graduação em Farmacologia e apresentada

como requisito parcial para a obtenção do

título de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Profº Drº Adair Roberto Soares

dos Santos

Co-orientadora: Profª Dr

Maria Consuelo

Andrade Marques

CURITIBA

2006

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AGRADECIMENTOS

À DEUS, pela proteção e saúde, por iluminar meus caminhos em busca do

conhecimento e realização pessoal.

Á minha família, pelo amor e incentivo e por estar presente no decorrer de todo este

trabalho.

Ao amigo e professor orientador Adair Roberto Soares dos Santos e à professora

co-orientadora Maria Consuelo Andrade Marques, pelos ensinamentos transmitidos,

paciência, confiança em mim depositada e pelo exemplo de dedicação à ciência.

Ao professor Moacir G. Pizzolatti e seus alunos, pela preparação do extrato e

isolamento dos compostos.

Ao meu namorado, Vinícius Scalco Costa, pelo seu grande companheirismo,

incentivo e compreensão demonstrados em todos os momentos desta jornada.

À Cristina Setim Freitas e à Critiane Hatsuko Baggio, pela parceria e amizade no

decorrer deste estudo.

À CAPES pelo apoio financeiro.

Aos amigos da Pós-graduação em Neurosciências de Florianópolis, pelo imenso

apoio e ensinamentos que contribuíram decisivamente para o desenvolvimento deste

trabalho.

À todos colegas e docentes do curso de Pós-graduação em Farmacologia da UFPR,

pelo respeito, amizade e conhecimento transmitidos.

iii

O valor das coisas não está no tempo que

elas duram, mas na intensidade com que

acontecem. Por isso existem momentos

inesquecíveis, coisas inexplicáveis e

pessoas incomparáveis.

Fernando Pessoa

RESUMO

A Polygala paniculata L. é conhecida por vários nomes populares, dentre eles,

“barba-de-são-joão, bromil, vassourinha branca e mimosa”. Esta planta é utilizada na

medicina popular para o tratamento da asma, bronquite, artrite, dor de estômago e

diarréia. O presente estudo investiga as possíveis atividades antinociceptiva,

antiinflamatória e protetora gástrica do extrato hidroalcoólico da P. paniculata

(EHPP), e os efeitos antinociceptivos de mais três compostos isolados a partir desta

planta: a febalosina, aurapten e rutina, em vários modelos experimentais in vivo, em

ratos e camundongos. Quando administrado por via oral (v.o.), o EHPP reduziu a

nocicepção induzida pelo ácido acético, formalina, capsaicina e glutamato, sem

influenciar no período de latência no modelo de nocicepção térmica (tail-flick). O

efeito antinociceptivo do EHPP não foi influenciado pelo pré-tratamento com L-

arginina (precursor do óxido nítrico) ou com naloxona (antagonista de receptores

opióides), quando verificado no modelo do glutamato e não está relacionado com

efeitos inespecíficos como relaxamento muscular ou sedação, como o observado na

caixa de movimentação espontânea. Os compostos isolados, administrados por via

intraperitoneal (i.p.), apresentaram efeito antinociceptivo no modelo do glutamato,

sendo que a rutina foi mais potente e eficaz neste modelo de nocicepção. Além

disso, o EHPP e a rutina, reduziram a nocicepção induzida pela administração

intratecal de glutamato e NMDA, bem como de IL-1β e TNF-α. O EHPP reduziu de

forma parcial a inflamação induzida pela carragenina no modelo do edema de pata e

pleurisia. No teste de lesões gástricas agudas, induzidas pelo etanol 70%, o EHPP,

administrado pela v.o. e i.p., apresentou importante atividade protetora gástrica,

reduzindo o índice de úlceras e aumentando a produção de muco gástrico, em ratos.

Contudo, o EHPP não protegeu a mucosa gástrica contra lesões induzidas pela

indometacina, nem alterou o volume e pH da secreção gástrica, quando avaliados no

modelo da ligadura pilórica em ratos e, tão pouco, alterou a motilidade

gastrointestinal e o esvaziamento gástrico, quando avaliado no modelo do vermelho

de fenol, em camundongos. Em síntese, os dados analisados em conjunto, permitem

sugerir que o EHPP e o compostos isolados, principalmente a rutina, apresentam

importante efeito antinociceptivo, e esta ação está envolvida a participação direta ou

indireta dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos tipo NMDA e de citocinas pró-

inflamatórias. O EHPP reduziu, de maneira parcial, o edema de pata e a migração

celular induzidos pela carragenina nos modelos de edema de pata e pleurisia. Em

adição, foi possível demonstrar que o EHPP protegeu a mucosa gástrica de ratos

contra lesões induzidas pelo etanol, esta ação citoprotetora envolve o aumento da

secreção de muco gástrico. Finalmente, os resultados mostram que o EHPP

apresenta importante atividade antinociceptiva, antiinflamatória e protetora gástrica,

confirmando a utilização popular da P. paniculata.

Palavras-chave: Polygala paniculata L., nocicepção, glutamato, inflamação,

gastroproteção, muco, plantas medicinais.

ABSTRACT

vii

The Polygala paniculata L., is known by a popular name of “barba-de-são-joão,

bromil, vassourinha branca and mimosa”. It is used in the folk medicine for the

treatment of asthma, bronchitis, arthritis, stomach pain and diarrhea. The present

study examined the gastroprotective, antiinflammatory and antinociceptive effects of

the hydroalcoholic extract of P. paniculata (HEPP), in several experimental models in

vivo, in rats and mice. The antinociceptive effect of compounds isolated from this

plant: phebalosin, auraptene and rutin, was also evaluated. The HEPP, given orally

(p.o.), reduced the nociception induced by acetic acid, formalin, capsaicin and

glutamate, without influence the latency to noxious stimulus in the tail-flick model in

mice. The HEPP antinociception was neither affected by the pre-treatement with L-

arginine or by the antagonist of opioid receptors, naloxone, nor associated with

nonspecific effects such as muscle relaxation or sedation, as observed in the

spontaneous locomotor activity test. The isolated compounds given by intraperitoneal

route (i.p.) also presented antinociceptive activity in the glutamate model of pain. The

rutin was the compound with the greatest potency and efficacy in the glutamate test.

Both, HEPP and rutin reduced the nociceptive response induced by intrathecal

injection of glutamate and NMDA, as well IL-1β and TNF-α. The extract reduced

partially the oedema induced by carrageenan when accessed in the paw oedema in

rats, but it was more efficacious in inhibit leukocyte migration in the pleurisy induced

by same phlogistic agent in mice. The treatment of rats with HEPP by p.o. or i.p.

route, decreased the index of lesions and increased the gastric mucus production, in

the acute gastric lesions caused by ethanol 70%. On the other hand, the extract

neither protected the mucosa against indomethacin induced lesions, nor changed the

volume and pH of gastric secretion, when accessed in the model of pylorus ligature.

The HEPP did not alter the gastrointestinal motility or gastric emptyness as

determined by the phenol red model in mice. The data from the current study show

that the HEPP and isolated compounds, mainly the rutin, produce an important

antinociceptive effect, which could be related with a direct or indirect interaction with

the NMDA type glutamatergic ionotropic receptors and pro-inflammatory cytokines

(IL-1β and TNF-α). The extract reduced partially, the oedema and the cell migration,

induced by carrageenan, when accessed in the paw oedema and pleurisy acute

models of inflammation. Moreover, was possible to show, that the HEPP presented

gastroprotective action against ethanol induced lesions. These effects were probably

related with increased mucus production, and maybe, this could be responsible for its

citoprotective effects. Finally our results show that EHPP presented important

antinociceptive, antiinflammatory and gastroprotective effects, confirming the popular

use of P. paniculata.

Key-words: Polygala paniculata, nociception, glutamate, inflammation,

gastroprotection, mucus, medicinal plants.

viii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS xii

LISTA DE ABREVIATURAS xiv

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 16

1.1 Família Polygalaceae e plantas do gênero Polygala................................................

1.2 Polygala paniculata L................................................................................................

1.3 Mecanismos envolvidos na nocicepção....................................................................

1.4 Mecanismos evolvidos na etiologia da úlcera péptica e citoproteção gástrica.........

2.0 JUSTIFICATIVA........................................................................................................ 35

3.0 OBJETIVOS.............................................................................................................. 36

3.1 Objetivos gerais.........................................................................................................

3.2 Objetivos específicos................................................................................................

4.0 MATERIAL e MÉTODOS.......................................................................................... 37

4.1 Animais......................................................................................................................

4.2 Classificação botânica...............................................................................................

4.3 Preparação do extrato, identificação, isolamento e purificação dos compostos.......

4.3.1 Preparação do extrato e purificação dos compostos................................................

4.3.2 Isolamento e purificação dos compostos..................................................................

4.4 Drogas e soluções usadas........................................................................................

4.5 Análise farmacológica in vivo....................................................................................

4.5.1 Vias de administração...............................................................................................

4.6 Métodos.....................................................................................................................

4.6.1 Teste das contorções abdominais induzidas pela injeção intraperitoneal de ácido

acético (0,6%), em camundongos.............................................................................

4.6.2 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina (2,5%), em

camundongos............................................................................................................

4.6.3 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina, em

camundongos............................................................................................................

4.6.4 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato....................................

4.6.5 Teste da retirada da cauda (tail-flick)........................................................................

4.6.6 Efeito sobre o desempenho motor no teste de atividade locomotora

espontânea................................................................................................................

4.6.7 Estudo do possível mecanismo de ação antinociceptivo do EHPP, em

camundongos............................................................................................................

4.6.7.1 Participação do sistema opióide................................................................................

4.6.7.2 Participação da via L-arginina-óxido nítrico..............................................................

4.6.7.3 Participação do sistema glutamatérgico....................................................................

4.6.7.4

Participação de citocinas como a IL-1β e TNF-α............................................................

4.7 Estudo da atividade antiinflamatória do EHPP..........................................................

4.7.1 Avaliação da atividade antiinflamatória do EHPP no modelo do edema de pata

induzido pela administração intraplantar de carragenina, em ratos..........................

4.7.2 Avaliação da atividade antiinflamatória do EHPP no modelo de pleurisia induzido

pela carragenina, em camundongos.........................................................................

4.8 Estudo da atividade antiúlcera e anti-secretora ácida do EHPP, em ratas...............

4.8.1 Lesões gástricas induzidas por etanol......................................................................

4.8.2 Lesões gástricas induzidas por indometacina...........................................................

4.8.3 Avaliação das lesões gástricas nos modelos de indução aguda..............................

4.8.3.1 Determinação do índice de úlceras...........................................................................

4.8.3.2 Quantificação do muco gástrico................................................................................

4.8.4 Método de estudo in vivo: Método da ligadura pilórica.............................................

4.8.5 Estudo dos mecanismos de ação envolvidos no possível efeito protetor gástrico

do EHPP, em ratas....................................................................................................

4.8.6 Avaliação do EHPP sobre a motilidade gastrointestinal...........................................

4.8.6.1 Trânsito intestinal, em camundongos........................................................................

4.8.6.2 Esvaziamento gástrico de semi-sólidos....................................................................

4.9 Análise Estatística.....................................................................................................

5 RESULTADOS.......................................................................................................... 56

5.1 Nocicepção induzida pela injeção intraperitoneal de ácido acético (0,6%), em

camundongos............................................................................................................

5.2 Nocicepção induzida pela administração intraplantar de formalina (2,5%) em

camundongos............................................................................................................

5.3

Nocicepção induzida pela administração intraplantar de capsaicina (1,6µg/pata)

em camundongos......................................................................................................

5.4 Efeito do EHPP no modelo do tail – flick em camundongos.....................................

5.5 Efeito do EHPP sobre o desempenho motor no teste de atividade locomotora

espontânea................................................................................................................

5.6 Efeito do EHPP e dos compostos isolados, febalosina, aurapten e rutina sobre a

nocicepção induzida pela administração intraplantar de glutamato, em

camundongos............................................................................................................

5.7 Curva tempo-resposta do EHPP no modelo de nocicepção induzida pela

administração intraplantar de glutamato em camundongos......................................

5.8 Análise do mecanismo de ação do EHPP.................................................................

5.8.1 Efeito do pré-tratamento com L-arginina...................................................................

5.8.2 Participação do sistema opióide................................................................................

5.8.3 Efeito do EHPP e da rutina sobre a nocicepção causada pela injeção intratecal de

aminoácidos excitatórios (AAE)................................................................................

5.8.4 Efeito do EHPP e da rutina sobre a nocicepção causada pela injeção intratecal de

IL-1β (1 pg) e TNF-α (0,1 pg)....................................................................................

5.9 Atividade antiinflamatória do EHPP..........................................................................

5.9.1 Efeito do EHPP no edema de pata induzido pela injeção intraplantar de

carragenina, em ratos...............................................................................................

5.9.2 Efeito do EHPP na pleurisia induzida pela injeção intrapleural de carragenina, em

camundongos............................................................................................................

5.10 Atividade protetora gástrica do EHPP.......................................................................

5.10.1 Efeito do EHPP sobre as lesões gástricas agudas induzidas por etanol 70%, em

ratas..........................................................................................................................

5.10.2 Efeito do EHPP sobre a quantidade de muco da mucosa gástrica após a indução

de lesões com etanol 70%, em ratas........................................................................

5.10.3 Influência da inibição da óxido nítrico sintase sobre a atividade protetora gástrica

do EHPP, após a indução de lesões com etanol 70%, em ratas..............................

5.10.4 Efeito do EHPP sobre as lesões gástricas agudas induzidas por indometacina,

em ratas....................................................................................................................

5.10.5 Avaliação da atividade anti-secretora gástrica o EHPP............................................

5.10.5.1 Efeito do EHPP sobre a secreção ácida gástrica basal (não estimulada), quando

avaliado no modelo da ligadura pilórica, em ratas....................................................

5.11 Avaliação da atividade do EHPP sobre as atividades gerais do trato

gastrointestinal..........................................................................................................

5.11.1 Atividade do EHPP sobre o trânsito intestinal e esvaziamento gástrico...................

6 DISCUSSÃO............................................................................................................. 78

7 CONCLUSÕES......................................................................................................... 97

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 98

LISTA DE FIGURAS

Figura 1:

Partes aéreas da Polygala paniculata L................................................................

Figura 2:

Partes aéreas da Polygala paniculata L...............................................................

Figura 3:

Foco das flores ....................................................................................................

Figura 4:

Flavonóide e cumarinas isoladas da Polygala paniculata L..................................

Figura 5:

Efeito do EHPP sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético,

em camundongos.................................................................................................

Figura 6:

Efeito do EHPP sobre a nocicepção induzida pela formalina, em

camundongos........................................................................................................

Figura 7:

Efeito do EHPP sobre a nocicepção induzida pela capsaicina, em

camundongos........................................................................................................

Figura 8:

Efeito do EHPP e da morfina sobre latência ao estímulo térmico nocivo

aplicado no método da teste da retirada da cauda tail-flick, em camundongos....

Figura 9:

Efeito do tratamento dos animais com EHPP sobre o desempenho motor, em

camundongos........................................................................................................

Figura 10:

Efeito do EHPP na nocicepção induzida pela administração intraplantar de

glutamato, em camundongos................................................................................

Figura 11:

Efeito da febalosina, aurapten e rutina em relação a nocicepção induzida pela

injeção intraplantar de glutamato, em camundongos...........................................

Figura 12:

Curva tempo-resposta do EHPP no modelo de nocicepção induzida pela

administração intraplantar de glutamato em camundongos..................................

Figura 13:

Efeito do pré-tratamento com L-arginina sobre a antinocicepção causada pelo

EHPP.....................................................................................................................

Figura 14:

Efeito do pré-tratamento com naloxona sobre a antinocicepção causada pelo

EHPP.....................................................................................................................

Figura 15:

Efeito antinociceptivo do EHPP e da rutina sobre a nocicepção causada pela

injeção intratecal de glutamato, NMDA e trans-ACPD, em camundongos...........

Figura 16:

Efeito antinociceptivo do EHPP e da rutina em relação a nocicepção causada

pela injeção intratecal de IL-1β (1 pg) e TNF-α (0,1 pg).......................................

Figura 17:

Efeito do EHPP sobre o edema de pata causado pela administração

intraplantar de carragenina, em ratos....................................................................

Figura 18:

Efeito do pré-tratamento com EHPP na pleurisia induzida pela carragenina, em

camundongos........................................................................................................

Figura 19:

Efeito do EHPP, sobre as lesões gástricas agudas induzidas por etanol 70%,

em ratas................................................................................................................

xii

Figura 20;

Efeito do tratamento dos animais com EHPP sobre as concentrações de muco

da mucosa glandular gástrica de ratas..................................................................

Figura 21:

Efeito do pré-tratamento com L-NAME e do etanol 70% sobre a atividade

protetora gástrica do EHPP, em ratas...................................................................

Figura 22:

Efeito do EHPP sobre as lesões gástricas agudas induzidas por indometacina,

em ratas.................................................................................................................

Figura 23:

Efeito do EHPP sobre a secreção ácida gástrica basal, em

ratas.......................................................................................................................

Figura 24:

Atividade do EHPP sobre o trânsito intestinal e esvaziamento gástrico, em

camundongos........................................................................................................

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

AAE Amino ácido excitatório

AMPA

α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxalopropionato

ATP Adenosina trifosfato

Cálcio

CCD Cromatografia de camada delgada

CCK

Receptor da colecistocinina tipo 2

COX Cicloxigenase

COX-2 Cicloxigenase-2

CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

a Componente C

a do sistema complemento

a Componente C

a do sistema complemento

ECL Célula enterocromoafim

EHPP Extrato hidroalcoólico da Polygala paniculata

E.P.M. Erro padrão da média

EXINS Interneurônios exitatórios

GLU Glutamato

H Hora

IASP Associação internacional para estudo da dor

Dose que reduziu a resposta em 50% quando comparado ao grupo controle

ININS Interneurônios inibitórios

IL-1β

Interleucina-1 beta

IL-1α

Interleucina-1 alfa

IL- 8 Interleucina- 8

IM Inibição máxima

i.d. Intraduodenal

i.p. Intraperitoneal

i.pl. Intrapleural

i.pt. Intraplantar

i.t. Intratecal

Potássio

KA Cainato

KCl Cloreto de potássio

L- NAME L-arginina metil éster

L- NOARG

-nitro-arginina

LTP Potencial de longa duração

xiv

min. Minutos

MeHg Metil mercúrio

Sódio

NaOH Hidróxido de sódio

NMDA N-metil-D-aspartato

NO Óxido nítrico

NOS Sintase do óxido nítrico

NRM Núcleo magno da rafe

PAG Substância cinzenta periaquedutal

PGE

Prostaglandina E

PGI

Prostaglandina I

PME Porcentagem de efeito máximo

PN Neurônios de projeção

RVM Medula rostroventomedial

s.c. Subcutânea

SNC Sistema nervoso central

SNE Sistema nervoso entérico

SP Substância P

TNF-α

Fator de necrose tumoral – alfa

1 INTRODUÇÃO

A utilização das plantas, como medicamento para o tratamento das

enfermidades que acometem a espécie humana, remonta à idade antiga (CALIXTO,

2001).

As primeiras drogas foram as de origem natural, extraídas principalmente de

plantas superiores e destinavam-se à terapia de doenças infecciosas. De fato, povos

antigos, como os do mediterrâneo, chineses, hindus e maias (séculos antes da era

atual), já conheciam o emprego terapêutico de certas plantas e de alguns minerais

(KOROLKOVAS e BURCKHALTER, 1988).

Nesse sentido, a terapêutica moderna, composta por um grande número de

medicamentos com ações específicas sobre receptores, enzimas e canais iônicos,

não teria atingindo o grau de desenvolvimento atual se não fosse o auxílio dos

produtos naturais, notadamente aqueles derivados das plantas superiores

(CALIXTO, 2001).

São inúmeros os exemplos de medicamentos que foram desenvolvidos, direta

ou indiretamente, de fontes naturais, especialmente de plantas, incluindo dentre

outros a morfina, a pilocarpina, os digitálicos, os curares, a quinina, a artemisina, a

atropina, escopolamina e o cromolin. Além disso, cerca de 60% a 75% dos

medicamentos para tratamento do câncer e de doenças infecciosas que estão

disponíveis no mercado ou em fase clínica de desenvolvimento, são derivados de

produtos naturais (FARNSWORTH e BINGEL, 1997; CALIXTO, 2001; NEWMAN et

al., 2003; BOLDI, 2004).

Estes dados justificam o crescente interesse da indústria farmacêutica na

produção de agentes terapêuticos de origem natural, inclusive em países de clima

tropical, como o Brasil, que apresentam grande biodiversidade. Entre os países da

América Latina, somente o Brasil detêm cerca de 20-22% das plantas e micro-

organismos do planeta (CALIXTO, 2005). Porém, apesar de toda diversidade natural,

até por volta do ano 1996, cerca de 84% das drogas presentes no mercado brasileiro

eram importadas e 60% de todas as drogas processadas eram consumidas por

somente 23% da população, fazendo com que os remédios caseiros a base de

plantas medicinais se mantivesse como a principal fonte de medicamentos para a

maioria da população (ELIZABETSKY e COSTA-CAMPOS, 1996; ELISABETSKY,

1999).

Apesar do Brasil não ter uma indústria farmacêutica forte, o comércio interno

de medicamentos registrado no país atinge hoje a casa dos 10 bilhões de dólares,

sendo o sétimo mercado mundial em termos de vendas. Dentro desse contexto, as

plantas medicinais e em especial o uso dos medicamentos fitoterápicos adquirem

importância como agentes terapêuticos e, por isso, devem ser prioritariamente

analisados segundo os métodos modernos disponíveis (LAPA et al., 1999; CALIXTO,

2001).

Para a sociedade dos países em desenvolvimento, a produção e utilização de

fitoterápicos padronizados com seus benefícios comprovados e de alta qualidade,

podem facilitar o acesso da população a medicamentos seguros e de baixo custo,

facilitando ainda o crescimento da fitomedicina nacional e desta forma, apresentando

impacto na economia local (ELIZABETSKY e COSTA-CAMPOS, 1996).

1.1 Família Polygalaceae e plantas do gênero Polygala

As plantas da família Polygalaceae são predominantemente encontradas em

regiões tropicais. Entre as plantas desta família, incluem-se as do gênero Polygala,

que compreende cerca de 500 espécies, apresentando-se a maior parte das vezes

na forma de arbustos ou de pequenas trepadeiras que cobrem galhos de árvores.

Suas flores apresentam cor rosa ou branca e variam entre as espécies (GENTRY,

1996).

Os membros da família Polygalaceae são conhecidos por conter uma grande

diversidade de compostos químicos, muitos dos quais exibem significante atividade

biológica. Investigações fitoquimicas em diferentes espécies de Polygala revelaram

vários compostos incluindo lignanas citotóxicas (DALL´ACQUA et al., 2002),

saponinas (DESBENE et al., 1999; ESTRADA et al., 2000; CHUNG et al., 2002),

xantonas (EL SAYAH, et al., 1999; MAK et al., 2001; DALL´ACQUA et al., 2002;

CRISTIANO et al., 2003), cumarinas e flavonóides (CRISTIANO et al., 2003).

Investigações sobre as ações de compostos como lignanas e xantonas,

isoladas da Polygala vulgaris L., em relação à proliferação celular de tumores

sólidos, demonstraram que principalmente as xantonas apresentaram atividade

antiproliferativa em tumores sensíveis e não sensíveis ao tratamento com

doxorubicina, um importante quimioterápico (DALL´ACQUA et al., 2002).

A Polygala tenuifolia W., rica em saponinas, é utilizada a centenas de anos, na

medicina coreana e chinesa, no tratamento de doenças psicóticas. Estudos de

binding mostraram sua afinidade por receptores dopaminérgicos e serotoninérgicos.

Estudos adicionais in vivo demonstraram que estas saponinas são capazes de

reduzir a psicose promovida pela síndrome serotoninérgica, induzida

experimentalmente pela 5-hidroxitriptamina e o comportamento de hiperatividade

induzido pela cocaína em ratos (CHUNG et al., 2002).

Recentemente, foi demonstrado que o extrato aquoso das raízes de Polygala

tenuifolia W. inibiu a liberação de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina

1 beta (IL-1β) em cultura de astrócitos de camundongos, sugerindo que esta planta

pode apresentar uma importante atividade antiinflamatória central (KIM et al., 1998).

Além disso, foi demonstrado que o extrato das raízes desta planta também

apresentou ação neuroprotetora contra a morte celular induzida pelo N-metil-D-

aspatato (NMDA) em cultura de células cerebelares de ratos (LEE et al., 2004).

O extrato hidroalcoólico da Polygala fallax H., quando analisado in vivo,

apresentou um importante efeito antiinflamatório, promovendo uma diminuição do

edema de orelha provocado pela administração tópica de xilol (KOU et al., 2003).

Em um estudo com outra planta da família Polygalaceae, a Polygala cyparissias St.

Hillaire & Moquin, foi demonstrado que tanto o seu extrato hidroalcoólico quanto a

1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxi xantona, isolada a partir deste extrato, apresentaram

notável atividade antinociceptiva quando analisados nos modelos de nocicepção

induzida pelo ácido acético, formalina, capsaicina e no modelo de hiperalgesia

induzida pela bradicinina e substância P (CAMPOS et al., 1997).

Posteriormente, um estudo complementar, realizado pelo mesmo grupo,

demonstrou através de experimentos in vitro, utilizando traquéia isolada de cobaia

não sensibilizada e sensibilizada por ovalbumina, que tanto o extrato hidroalcoólico

quanto a 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxi xantona, isolada da Polygala cyparissias St.

Hillaire & Moquin., apresentaram importante efeito antiespasmódico, contra

contrações induzidas pela acetilcolina, KCl, bradicinina, prostaglandina E

, histamina,

substância P, composto 48/80 (composto liberador de histamina) e U46619 (um

análogo estável do tromboxano A

) (EL SAYAH et al., 1999).

Recentemente, o nosso grupo de pesquisa demonstrou que as frações

clorofórmica, etanólica e butanólica obtidas a partir do extrato bruto da Polygala

sabulosa A. W. Bennett, bem como vários compostos isolados a partir destas

frações, como dihidroestiril-2-pirona e estiril-2-pirona, α-espinasterol, escopoletina,

além dos compostos modificados a partir da escopoletina, a acetilescopoletina e

bezoilescopoletina apresentaram importante atividade antinociceptiva, no modelo das

contorções abdominais, induzidas pelo ácido acético 0,6% (MEOTTI et al., 2006).

Em adição, o α-espinasterol e a escopoletina foram cerca de 55 a 91 vezes mais

potentes que todos outros os compostos isolados testados neste estudo. O α-

espinasterol e a escopoletina também foram de 313 a 400 vezes mais potentes que o

acetaminofeno e a aspirina, quando analisados no modelo do ácido acético (MEOTTI

et al., 2006).

1.2 Polygala paniculata L.

A Polygala paniculata L. (Fig. 1, 2 e 3) é uma planta que cresce na costa

Atlântica brasileira, sendo encontrada também no litoral de Santa Catarina. É

conhecida popularmente como barba-de-são-joão, barba-de-bode, bromil,

vassourinha branca e mimosa, sendo seu chá utilizado na medicina popular para o

tratamento da asma, bronquite crônica, demais afecções do aparelho respiratório,

atrite, artrose, água no joelho, problemas renais, dor de estômago, diarréia, bem

como tonificante (NEWALL et al., 1996; LORENZI e MATOS, 2002).

Figura 1, 2 e 3: Partes aéreas da Polygala paniculata L. (Fig.1 e 2); foco das flores (Fig. 3).

Fonte:(Fig. 1) Warren L. Wagner (2005); (Fig. 2): Forest & Kim Starr (2005); (Fig. 3): G.D.

Carr (2005).

Alguns compostos da P. paniculata já foram identificados e isolados.

CRISTIANO et al. (2003) isolaram em suas análises três xantonas (denominadas 1-

hidroxi-5-metoxi-2,3-metilenodioxixantona, 1,5-dihidroxi-3,2-dimetoxixantona e 1-

hidroxi-2,3,5-trimetoxixantona). A presença de outros compostos como cumarinas e

um flavonóide rutina foi observada. Dois esteróis também foram caracterizados como

o espinasterol e delta 25-espinasterol.

Estudos recentes mostraram que o extrato bruto hidroalcoólico da P.

paniculata (EHPP) possui importante atividade antioxidante. Esta atividade foi

relacionada ao seu efeito protetor contra a neurotoxicidade induzida pelo tratamento

crônico de camundongos com metilmercúrio (MeHg) (FARINA et al., 2005). Existem

evidências indicando que as células cerebelares são as células mais atingidas após

a intoxicação por MeHg. Dessa forma, a intoxicação por este agente afeta

principalmente o sistema motor (GRANDJEAN et al., 1997; SANFELIU et al., 2003).

O tratamento com o EHPP foi capaz de reverter completamente o prejuízo

motor provocado pelo MeHg e restabeleceu a atividade da glutationa peroxidase e da

glutationa redutase, no córtex cerebral e cerebelo, que estava diminuída e

aumentada pelo tratamento com MeHg, respectivamente (FARINA et al., 2005). Os

autores sugeriram que o efeito apresentado pelo extrato, está relacionado a

presença de xantonas e flavonóides, que são compostos que apresentam importante

efeito antioxidante.

7- genariloxi cumarina

Aurapten

Quercetina-3-rutinosídeo

(Rutina)

OCH

OH O

Febalosina

Figura 4: Flavonóide e cumarinas isoladas da Polygala paniculata L.

Fonte: Cortesia Profº Moacir Pizzolatti

1.3 Mecanismos envolvidos na nocicepção

A dor é um sintoma de muitas desordens clínicas e afeta grande parte da

população (BESSON e DICKENSON, 1997). Ela é uma característica cardinal dos

mecanismos protetores fisiológicos normais e uma das suas funções é preservar o

organismo, evitando o dano tecidual (DRAY, 1997).

Segundo a IASP - Associação Internacional para Estudo da Dor, a dor pode

ser definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável, associada a

dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termo de tal lesão (MELZAC e

LOESER, 1999; RAINVILLE, 2002; ALMEIDA et al., 2004).

Além envolver um estímulo potencialmente nocivo, a dor tem uma conotação

individual e é representada por uma experiência subjetiva, incluindo componentes

afetivos e emocionais, que amplificam ou diminuem a sensação dolorosa (MELZACK

e LOESER, 1999; RAINVILLE, 2002; ALMEIDA et al., 2004).

O fenômeno doloroso pode ocorrer espontaneamente, em decorrência da

redução do limiar de sensibilidade para dor, devido a danos no SNC ou ainda lesão

nas fibras sensoriais. A este tipo de dor é atribuído o termo de dor neuropática

(MILLAN, 1999; ALMEIDA et al., 2004).

Existe uma diferença entre os termos nocicepção e dor. O termo nocicepção

refere-se a manifestações neurofisiológicas, geradas por estímulos nocivos. A dor

envolve a percepção de um estímulo aversivo e requer a capacidade de abstração e

elaboração do impulso sensorial (MELZACK e LOESER, 1999; ALMEIDA et al.,

2004).

Em termos de duração, a dor pode ser classificada como aguda ou crônica. A

dor aguda é caracterizada por ser pontual delimitada e desaparecer com a resolução

do processo patológico. A dor crônica persiste por um longo período de tempo,

sendo associada à processos patológicos crônicos e mudanças no padrão de

transmissão neuronal (ALMEIDA et al., 2004).

Na maioria das situações, o processo inflamatório pode estar relacionado aos

mecanismos que envolvem a nocicepção (LEVINE e REICHLING, 1999).

A inflamação caracteriza-se por um fenômeno complexo multimediado. Ela é

uma resposta desencadeada por traumas, lesões teciduais e invasão por agentes

infecciosos, com a finalidade de eliminar microorganismos ou outros agentes

irritantes e potenciar o reparo tecidual (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004).

Os sinais clínicos da inflamação, eritema, calor, inchaço e dor, foram descritos

no início da era clássica pelos gregos e romanos (FANTONE e WARD, 1990). O

quinto sinal da inflamação, lesão aguda dos tecidos, com perda da função dos

órgãos foi mencionado mais tarde por Virchow, no século XIX (ROCHA e SILVA,

1978).

Neste contexto, a inflamação pode ser classificada como aguda e crônica, de

acordo com o tempo de duração e características patológicas (SHERWOOD e

TOLIVER-KINSKY, 2004).

A inflamação aguda apresenta curta duração (horas a meses). Durante o

processo inflamatório agudo, muitos mediadores como o NO e prostaglandinas como

prostaglandina I

(PGI

), prostaglandina D

(PGD

), prostaglandina E

(PGE

) e

prostaglandina F

2α

.(PGF

2α

) promovem principalmente vasodilatação, um dos sinais

clássicos do processo inflamatório agudo, representado pelo calor e rubor

característicos da reação inflamatória (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004).

Outro sinal precoce da inflamação aguda é a formação do edema, que ocorre

devido ao fluxo transvascular de fluido rico em proteínas (plasma) dos

compartimentos intravasculares para o interstício devido ao aumento de

permeabilidade vascular de capilares e vênulas, como resultado da liberação de

histamina, bradicinina, leucotrienos, fatores do complemento, substância P e fator de

agregação plaquetária (PAF) no sítio inflamatório (SHERWOOD e TOLIVER-

KINSKY, 2004).

A vasodilatação e formação de exsudato são geralmente acompanhadas da

marginação, adesão e migração de leucócitos, principalmente neutrófilos. Na fase

aguda da resposta inflamatória, ocorre a liberação de vários mediadores em especial

componentes do complemento como os fragmentos C3a e C5a, leucotrienos,

quimiocinas como a IL-8 e ainda bioprodutos bacterianos como peptídeos N-

formilados, que promovem a quimiotaxia de leucócitos e outras células fagocíticas

para o sítio da reação inflamatória (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004;

ADEREM e SMITH, 2004).

A inflamação aguda pode finalizar-se com a resolução de todos eventos

característicos da reação inflamatória e retorno do tecido lesionado à normalidade ou

sua substituição por tecido conjuntivo (GILROY et al., 2004; ADEREM e SMITH,

2004).

A progressão da resposta tecidual para inflamação crônica caracteriza-se por

infiltração de células mononucleares, que incluem macrófagos, linfócitos e

plasmócitos. Os processos inflamatórios crônicos são de duração prolongada

estendendo-se de semanas a meses. Durante a inflamação crônica ocorrem

simultaneamente: a presença de processo inflamatório ativo, tentativas de reparo

tecidual com conseqüente destruição do tecido e formação de fibrose. Entre as

doenças crônicas inflamatórias incluem-se desordens como artrite reumatóide,

aterosclerose e lupus eritematoso sistêmico (GILROY et al., 2004; SHERWOOD e

TOLIVER-KINSKY, 2004).

A liberação de mediadores, em tecidos inflamados pode sensibilizar fibras

nociceptivas periféricas, promovendo a facilitação central da transmissão nociceptiva

(SYRIÁTOWICZ et al., 1999; VANEGAS, 2004), levando a uma resposta dolorosa

aumentada a um estímulo nocivo, chamado de hiperalgesia (TJ

ØLSEN e HOLE

1997; VANEGAS, 2004; SOMMER e KRESS, 2004; COUTAUX et al., 2005).

Alterações na percepção sensorial, envolvendo sensibilização central, pode levar a

alodínia, que está relacionada a dor evocada por um estímulo normalmente não

nocivo (MILLAN, 1999).

O processo inflamatório resulta da liberação de vários mediadores, alguns

deles podendo ativar ou sensibilizar os nociceptores locais das fibras aferentes

periféricas (C e Aδ). Contribuindo em maior parte para o desenvolvimento da dor de

origem inflamatória, bem como aumento e/ou expressão de moléculas como

neurotransmissores, enzimas, canais iônicos e receptores (LEVINE et al., 1993;

DRAY, 1994; BESSON e DICKENSON, 1997; COUTAUX et al., 2005).

A propagação da dor é iniciada com a ativação de receptores sensíveis aos

estímulos nocivos, amplamente encontrados na pele, membranas, tecidos conectivos

de órgãos vicerais, ligamentos, cápsulas articulares, periósteo, músculos, tendões e

vasos sangüíneos. Os nociceptores correspondem às terminações nervosas livres e

representam a parte mais distal dos neurônios aferentes de primeira ordem, que

consistem nas fibras de pequeno diâmetro, dos tipos Aδ e do tipo C,

respectivamente (JULIUS e BASBAUM, 2001; ALMEIDA et al., 2004).

As fibras Aδ, são fibras pouco mielinizadas, de médio diâmetro que medeiam a

“primeira” dor, representada pela dor pungente, aguda e passageira, que aparece

logo após a lesão tecidual. As fibras C, não mielinizadas de pequeno diâmetro,

medeiam a “segunda” dor, uma dor mais latente e difusa, que se perpetua por mais

tempo (JULIUS e BASBAUM, 2001; CRAIG, 2003).

Estas fibras podem ser chamadas de polimodais, pois respondem a estímulos

nocivos térmicos, mecânicos e químicos. Dessa forma, apresentam receptores

termosensíveis ao calor e ao frio, bem como receptores específicos para substâncias

algogênicas (HUNT e MANTYH, 2001; IKEDA et al., 2001; ALMEIDA et al., 2004;

COUTAUX et al., 2005).

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais, de grande diâmetro, localizados

na raiz do gânglio dorsal, dão origem as fibras mielinizadas, de rápida condução,

chamadas de fibras primárias aferentes Aβ. Estas fibras detectam estímulos inócuos

aplicados sobre a pele, músculos e juntas, não contribuindo para condução da dor,

em situações normais (MILLAN, 1999).

Dentro deste contexto, basicamente, os neurônios aferentes primários podem

ser ativados por uma gama de mediadores, liberados no tecido lesado. A lesão

tecidual pode ser desencadeada por estímulos térmicos, traumas mecânicos,

invasão com agentes infecciosos e reações antígeno-anticorpo (SAWYNOK, 2003).

Estes mediadores promovem a despolarização das fibras aferentes primárias Aδ e C

que irão conduzir o impulso doloroso, iniciado em diferentes tecidos, para o corno

dorsal da medula espinhal, principalmente até suas lâminas mais superficiais,

lâminas I/II e profundas V/VI e X (HUNT e MANTYH, 2001; MILLAN, 2002; CRAIG,

2003).

A partir da integração dos impulsos no corno dorsal, as vias nociceptivas

aferentes dão origem a diferentes modelos de projeção à estruturas corticais e

supracorticais. Neste estágio, os componentes sensoriais; discriminativos e afetivos,

bem como os componentes cognitivos, são atribuídos ao impulso nociceptivo

(WILLIS et al., 1997; MORROW et al., 2000; ALMEIDA et al., 2004).

Os diferentes feixes ascendentes que se formam devido à interação de

neurônios de primeira ordem com neurônios de segunda ordem no corno dorsal da

medula espinhal darão origem a diversas vias ascendentes que podem ser

classificadas em dois grupos: monossinápticas e polissinápticas (MILLAN, 1999;

ALMEIDA et al., 2004).

As vias de projeção monossinápticas projetam-se diretamente a estruturas

cerebrais superiores e incluem os feixes: espinotalâmico, espinoreticular,

espinomencefálico, espinoparabraquio-amigdalóide, espinoparabraquio-hipotalâmico,

espinohipotalâmico e neoespinotalâmico. O outro sistema, polissináptico, apresenta

uma estação de retransmissão a neurônios de segunda ordem que conduzem a

informação nociceptiva aos centros superiores cerebrais e consistem nos feixes

paleoespinotalâmico, espinocervical e coluna dorsal polissináptica (MILLAN, 1999;

MILLAN, 2002; ALMEIDA et al., 2004).

Muitas destas vias ascendentes fazem conexões com neurônios de terceira

ordem no tálamo, que projetam seus axônios pela cápsula interna do córtex

somatosensorial até o giro pós-central, onde a localização do estímulo nociceptivo é

realizada; e giro anterior do cingulado, relacionado a interpretação emocional da dor

(RUSSO e BRODE, 1998).

Dentro deste contexto, há uma complexa e integrativa rede neuronal até

estruturas supraespinhais, que constituem as vias ascendentes. Estas regiões

supraespinhais são extensivamente interligadas e também interagem com

mecanismos da modulação descendente, permitindo a ativação rápida de circuitos

envolvidos no controle da dor (MILLAN, 1999).

As vias descendentes originam-se no tronco cerebral e outras estruturas como

hipotálamo, córtex e tálamo, bem como o núcleo magno da rafe (NRM), substância

cinzenta periaquedutal (PAG) e estruturas adjacentes da medula rostroventromedial

(RVM), que exercem um importante papel na modulação e integração das

mensagens nociceptivas no corno dorsal (MILLAN, 1999; MILLAN, 2002; VANEGAS

e SCHAIBLE, 2004).

Os mecanismos descendentes modulam a resposta nociceptiva por exercer

suas ações em nociceptores presentes nas fibras primárias aferentes, bem como em

neurônios intrínsecos do corno dorsal, como interneurônios excitatórios (EXINS),

interneurônios inibitórios (ININS) e neurônios de projeção (PN) (MILLAN, 1999;

MILLAN, 2002).

Acredita-se que um importante componente modulador da resposta

nociceptiva esteja presente no sistema de “analgesia” proveniente da RVM e pode

estar relacionado a dois tipos de neurônios, as chamadas células “liga” (on) e

“desliga” (off) (MILLAN, 1997; MASON, 1999; MILLAN, 2002; VANEGAS e

SCHAIBLE, 2004).

É proposto que as células “liga” (on) medeiem a facilitação da condução de

estímulos nociceptivos e as células “desliga” (off) medeiam a inibição da transmissão

da dor, provocada pela estimulação da PAG e liberação de opióides endógenos,

diminuindo a sensação dolorosa (MASON, 1999; VANEGAS e SCHAIBLE, 2004).

A importância de alguns mediadores na modulação das vias descendentes

ainda não está totalmente esclarecida, contudo acredita-se que as vias

serotoninérgica, noradrenérgica e em menor extensão a dopaminérgica contemplam

os maiores componentes dos mecanismos descendentes (MILLAN, 1999; MILLAN,

2002). Outros mediadores como a colecistocinina, encefalinas, glutamato e NO

também estão envolvidos neste mecanismo (MILLAN, 1999; VANEGAS, 2004;

VANEGAS e SCHAIBLE, 2004).

De uma maneira geral, os mediadores que participam da resposta nociceptiva

podem ser produzidos pelo sistema vascular, células imunes, tecido lesado, nervos

sensoriais. Dentre os principais mediadores incluem-se: cininas, histamina,

serotonina, adenosina trifosfato (ATP), prótons, peptídeos, prostaglandinas e

citocinas (DRAY, 1997; JULIUS e BASBAUM, 2001; SAWYNOK, 2003).

Grandes evidências indicam que os aminoácidos excitatórios, principalmente o

glutamato, que é encontrado primariamente em fibras sensoriais C, apresentam um

papel crítico na transmissão da informação nociceptiva da medula espinhal até

estruturas centrais (MILLAN, 1999; BEIRITH et al., 2002; BEIRITH et al., 2003).

No nível espinhal, o glutamato está presente nos terminais aferentes

primários, nas lâminas I, III e IV do corno dorsal. Nas fibras C o glutamato coexiste

com peptídeos como a substância P (SP), desta forma um estímulo nocivo liberaria

ambos, peptídeos e aminoácidos excitatórios das fibras nociceptivas aferentes e

estes agiriam de maneira sinérgica na transmissão da dor (DICKENSON, 1997;

BEIRITH et al., 2004).

Existem dois grupos distintos de receptores glutamatérgicos denominados

ionotrópicos e metabotrópicos. Os receptores N-metil-D-aspatato (NMDA), cainato

(KA) e α - amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionato (AMPA) são canais iônicos

permeáveis ao Ca

, Na

ou K

. (DICKENSON, 1997; BEIRITH et al., 2002).

Fortes evidências sugerem que os receptores glutamatérgicos ionotrópicos,

sensíveis ao NMDA (um análogo do glutamato), são receptores formados por várias

subunidades (NR1/NRA2, NR1/NRB2, NR1/NRC2, NR1/NRD2) e encontram-se

amplamente distribuídos no SNC (OZAWA et al., 1997; YAMAKURA e SHIMOJI,

1999).

Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (

GluR) dividem-se em oito

subtipos classificados em três subgrupos de acordo com a sua homologia. O grupo I

(

GluR 1 e 5) promove ativação da via da fosfolipase C; o grupo II (

GluR 2 e 3) e o

grupo III (

GluR 4, 6 e 7) estão acoplados negativamente a adenilato ciclase

(OZAWA et al., 1997).

Fortes indícios sugerem que os aminoácidos excitatórios e seus receptores,

além de contribuírem com a transmissão dolorosa, estão envolvidos na patogenia da

dor neuropática (hiperalgesia), assim como desordens neurológicas crônicas, além

de participarem de eventos como plasticidade neuronal e formação do potencial de

longa duração (LTP) (OZAWA et al., 1997; MILLAN, 1999; YAMAKURA e SHIMOJI,

1999).

É importante mencionar que tanto na dor clínica quanto na dor induzida em

modelos experimentais não há, a princípio, um mediador ou uma via (ascendente ou

descendente) dominante que contribua para a condução e perpetuação do estímulo

nociceptivo. Dependendo do local, tipo e duração do estímulo, levando-se em conta

componentes afetivos e emocionais, ocorrem a ativação de múltiplos canais

sensoriais, que irão convergir e interagir com estruturas supraespinhais, promovendo

a sensação global de dor (MILLAN, 1999).

1.4 Mecanismos envolvidos na etiologia da úlcera péptica e citoproteção

gástrica

O estômago apresenta muitas funções como motilidade, digestão, secreção

ácida e controle dos mecanismos de defesa da mucosa, além de manter o tônus do

esfíncter esofagiano e pilórico. Estas funções são fortemente influenciadas pela

liberação de hormônios gastrintestinais como a gastrina, colecistocinina e

somatostatina, bem como pelo sistema nervoso entérico (SNE), (EKBLAD et al.,

2000).

O sistema nervoso entérico é formado basicamente por dois plexos: o plexo

mioentérico e o plexo submucoso. Os neurônios que pertencem a estes plexos são

chamados de neurônios intrínsecos. O plexo mais externo denominado mioentérico

ou de Auerbach inerva as camadas musculares circular e longitudinal e regula a

função motora. O plexo submucoso, um plexo mais interno, inerva a mucosa e

controla a absorção, secreção gastrintestinal e o fluxo sangüíneo local (COSTA e

BROOKES, 1994; EKBLAD et al., 2000).

Os neurônios intrínsecos dos dois plexos do SNE realizam conexões com

neurônios do sistema nervoso simpático, parassimpático e neurônios sensoriais.

Estes neurônios são denominados neurônios extrínsecos (EKBLAD et al., 2000).

A maioria dos neurônios extrínsecos alcança o estômago através do nervo

vago. As fibras vagais são pré-ganglionares parassimpáticas e terminam nos

gânglios do plexo mioentérico. A estimulação das fibras parassimpáticas produz

aumento geral da motilidade e secreção gástrica (COSTA e BROOKES, 1994;

EKBLAD et al., 2000).

Os neurônios simpáticos são pós-ganglionares e inervam principalmente o

gânglio entérico e os vasos sangüíneos, inibindo a motilidade e a atividade secretora

do trato gastrintestinal e estimulam a contração da mucularis mucosae e de alguns

esfíncteres (LONGHUST et al., 1984 a-b).

A inervação da mucosa também apresenta importante papel na proteção

gástrica, em particular, as fibras aferentes sensíveis a capsaicina têm sido implicadas

diretamente na resposta aguda à agressão na mucosa, promovendo a dilatação das

arteríolas da submucosa e aumentando rapidamente a circulação sangüínea local.

Este mecanismo é mediado pela liberação de neuropeptídeos, fatores de

crescimento e liberação de óxido nítrico (MOZSIK, 1997; EKBLAD et al., 2000;

MATSUMOTO et al., 2001; VONGTHAVARAVAT et al., 2003).

De uma maneira geral, uma variedade de mensageiros neuronais (acetilcolina,

CGRP, NO), hormonais (gastrina), parácrinos (histamina e somatostatina), fatores de

crescimento (TGF-α), estão relacionados tanto com o processo de proteção, quanto

com a regulação de várias funções fisiológicas da mucosa, entre elas a secreção de

ácido (SCHUBERT, 2005).

A secreção de ácido clorídrico no estômago é mediada pelas células parietais,

presentes em maior quantidade nas glândulas oxínticas (ou gástricas), que estão

localizadas na mucosa oxíntica, que se estende pelo corpo e fundo gástrico. Na

glândula oxíntica também se encontram as células principais ou pépticas que

secretam pepsinogênio; as células secretoras de muco; as células D que liberam

somatostatina e células enterocromoafins envolvidas na síntese e secreção de

histamina (COSTA e BROOKES, 1994; YAO e FORTE, 2003).

Basicamente, a mucosa gástrica é revestida por uma série de glândulas com

células epiteliais superficiais e além da mucosa oxíntica, no antro gástrico,

encontramos a mucosa antral (HOGBEN et al., 1974).

Nesta mucosa, as glândulas apresentam os mesmos tipos de células que as

glândulas oxínticas com exceção das células parietais. Nas glândulas da mucosa

antral o tipo celular mais números são as células G, que secretam gastrina (LLOYD e

DEBAS, 1994; MÒZSIK et al., 1997).

A acetilcolina e a histamina, juntamente com a gastrina, constituem os

principais secretagogos envolvidos na secreção de ácido pela célula parietal

(SACHS, 1997; FUKUSHIMA et al., 2004). Via estimulação vagal, a acetilcolina é

liberada, ativando mecanismos intracelulares nas células parietais, através da

interação com receptores muscarínicos (M

), promovendo liberação de ácido. As

células G da mucosa antral secretam gastrina, que atua em receptores do tipo CCK

e que juntamente com a acetilcolina, promove a liberação de histamina pelas células

enterocromoafins (ECL). Além disso, a gastrina pode interagir com os receptores

CCK

na célula parietal e estimular diretamente a produção de ácido. A histamina

liberada contribui com a liberação de ácido pelas células parietais, através da sua

interação com os receptores H

(SACHS et al., 1997; SCHUBERT, 2005).

De acordo com Glavin e Szabo (1992), acreditava-se que a secreção de ácido

gástrico era o principal fator envolvido na ulceração da mucosa gástrica. Contudo,

em 1987, Isenberg e colaboradores demonstraram que pacientes com úlcera

duodenal apresentavam também diminuição da secreção de bicarbonato, dessa

forma percebeu-se que não só o excesso de um fator agressivo, mas também, a

deficiência de um mecanismo de defesa estava contribuindo com a ulceração da

mucosa.

Atualmente, está bem estabelecido que independentemente da etiologia da

úlcera, esta é formada quando ocorre um desequilíbrio entre os fatores agressivos

luminais (ácido clorídrico e pepsina) e fatores de defesa da mucosa (secreção de

muco e bicarbonato, prostaglandinas, fluxo sangüíneo e migração de granulócitos),

ocasionando irritação, ulceração da mucosa e sangramento (WALLACE, 2001;

WHITLLE, 2004; DEMBINSKI et al., 2005).

As úlceras gástricas são formadas no estômago e as formadas no duodeno

são chamadas de úlceras duodenais. De maneira geral podemos chamar tanto as

localizadas no estômago quanto no duodeno de úlceras pépticas que são lesões

crônicas, na maioria das vezes solitárias, que ocorrem em qualquer nível do trato

gastrointestinal exposto à ação agressiva dos sucos ácidos-pépticos (DAYAL e De

LELLIS, 1989).

Geralmente, os estímulos lesivos sobre a mucosa, responsáveis pela

formação de úlceras pépticas, são acompanhados por danos microvasculares locais,

com conseqüente isquemia, diminuição da distribuição de nutrientes, formação de

radicais livres e necrose tecidual (TARNAWSHI, 2005).

Um dos principais fatores de defesa da mucosa contra agentes agressivos

consiste em uma fina camada aderente de muco, que serve como uma barreira física

sobre a mucosa e é continuamente secretado por células epiteliais. O bicarbonato é

secretado juntamente pelas mesmas células, constituindo a chamada barreira muco-

bicarbonato. O muco e o bicarbonato formam uma camada gelatinosa que protege a

mucosa do suco gástrico. Acredita-se que esta barreira forma a primeira linha de

defesa da mucosa do estômago e duodeno contra agentes nocivos como o HCl, a

pepsina luminal e outros agentes lesivos (MÒZSIK et al., 1997; BI e KAUNITZ, 2003).

Contraditoriamente, o HCl pode ser considerado um fator de defesa de

mucosa, reduzindo a possibilidade de colonização por bactérias, fungos e parasitas

(WALLACE, 2001).

A barreira de proteção gástrica não depende somente da secreção de muco e

bicarbonato, mas também, depende essencialmente dos mecanismos fisiológicos,

como a secreção de prostaglandinas, para manter suas propriedades defensivas

(HOLZER, 2000). A síntese local de prostaglandinas, principalmente as

prostaglandinas da série E (E

, E

e 16,16diMePGE

) e a PGI

contribuem com a

manutenção dos mecanismos de defesa, estimulando produção de muco, secreção

alcalina no estômago e duodeno e aumento da microcirculação local (MÒZSIK et al.,

1997).

Atualmente, sabe-se que o uso crônico de medicamentos que inibem a

produção de prostaglandinas, como os antinflamatórios não esteroidais (AINES),

causa danos à mucosa gástrica, constituindo um fator de risco para eventos

adversos como ulceração, sangramento e perfuração gástrica (WHITTLE, 2004;

NEWTON, 2005). A utilização de medicamentos como anticoagulantes,

antiinflamatórios esteroidais, também contribuem com a formação de úlceras

(JONES e HAWKEY, 2001).

Não só o uso de medicamentos, mas também, a idade é um dos principais

fatores para o aumento da prevalência e patogênese da úlcera péptica,

principalmente no estômago, devido à perda gradual de mecanismos de proteção e

reparo da mucosa, envolvendo diminuição do conteúdo de prostaglandinas (JONES

e HAWKEY, 2001; NEWTON, 2005).

Vários outros fatores também favorecem o surgimento de ulceração na

mucosa. Entre eles estão: o aumento de secreção gástrica de ácido, aumento dos

níveis circulantes de catecolaminas, isquemia da mucosa gástrica, infecção por

Helicobacter pylori, fatores genéticos e o estilo de vida (que engloba o estresse, uso

abusivo de álcool, fumo e hábitos alimentares) (PAPPAS, 1999; WALLACE, 2001;

BAGGIO et al., 2003; ELLIOT e WHITTLE, 2004; DEMBINSKI et al., 2005).

Devido aos vários fatores predisponentes, pacientes portadores de úlcera

péptica tornaram-se comuns em países industrializados (DAYAL e De LELLIS, 1989).

Dessa forma, nos últimos anos, as lesões gastrointestinais vêm tornando-se

um dos principais focos de investigações experimentais e clínicas, adquirindo ênfase

comercial para desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (WHITTLE, 2004).

Segundo Wallace, 2001, a chave para o desenvolvimento de melhores

estratégias terapêuticas é a identificação e caracterização de fatores de crescimento

e outros mediadores, ainda não esclarecidos, que possam apresentar papel central

no processo de reparo da úlcera. Outro alvo importante para a pesquisa, no futuro,

seria o melhor entendimento de como podemos melhorar a qualidade da cicatrização

da úlcera e ainda evitar sua recorrência.

Dentro deste contexto, as plantas medicinais apresentam importância como

agentes terapêuticos, visto sua ampla utilização na medicina popular, no tratamento

relacionado à sintomatologia de desordens gástricas tais como úlceras gástricas e

gastrites (SCHMEDA-HIRSCHMANN e YESILADA, 2005).

2 JUSTIFICATIVA

Atualmente, o desenvolvimento de fitoterápicos tem recebido muita atenção

tanto por parte da comunidade científica, quanto pelas indústrias farmacêuticas.

Apesar da grande aceitação e seu extenso uso terapêutico pela população em geral,

principalmente a de baixa renda, as plantas medicinais têm sido relativamente pouco

avaliadas cientificamente, sendo, dessa forma, necessário estudos mais detalhados

no sentido de verificar e assegurar sua qualidade, segurança e eficácia.

Os produtos naturais apresentam-se como fonte de compostos com potencial

atividade biológica, assim, a descoberta de protótipos para o desenvolvimento de

novos fármacos ou de novos agentes terapêuticos, representa uma possibilidade

para o tratamento de patologias gástricas e processos inflamatórios associados à

dor, podendo determinar uma melhor qualidade de vida para os pacientes.

Dessa maneira, a importância deste estudo, se justifica na confirmação das

propriedades antinociceptivas, antiinflamatória e citoprotetora da Polygala paniculata

L., tendo como base o seu emprego na medicina tradicional. Estudos

complementares foram realizados com o objetivo de esclarecer os possíveis

mecanismos de ação envolvidos e validar seu uso popular.

3 OBJETIVOS

3.1 Geral:

Avaliar a possível atividade antinociceptiva, antiinflamatória e gastroprotetora do

extrato hidroalcoólico da P. paniculata (EHPP) e os mecanismos de ação envolvidos

nestes efeitos.

3.2 Específicos:

- Verificar os efeitos antinociceptivos do EHPP em modelos de nocicepção química

(testes do ácido acético, formalina, capsaicina, glutamato, NMDA, trans-ACPD, IL-

1β, TNF-α) e térmica ( modelo do tail-flick) em camundongos.

- Verificar a atividade antinociceptiva dos compostos isolados da P. paniculata

(febalosina, aurapten e rutina) no modelo de nocicepção química induzida pelo

glutamato e por citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α).

- Verificar, com o emprego de técnicas farmacológicas in vivo, o(s) possível(is)

mecanismo(s) envolvido(s) no efeito antinociceptivo da planta através da utilização

de agonistas e antagonistas seletivos de vários receptores que modulam a

nocicepção.

- Verificar a atividade protetora gástrica através dos modelos de lesões gástricas

agudas induzidas pelo etanol 70% e pela indometacina.

- Verificar a atividade anti-secretora ácida do EHPP através do método da ligadura

pilórica.

- Verificar os possíveis mecanismos de ação envolvidos na ação protetora gástrica

do EHPP através de técnicas farmacológicas in vivo, utilizando agonistas e

antagonistas seletivos.

MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar adultos (160 a 230 g) e camundongos Swiss

adultos (18 a 35 g) fêmeas, provenientes do biotério central do Setor de Ciências

Biológicas da Universidade Federal do Paraná e do biotério central do Centro de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.

Os animais foram mantidos em temperatura constante (23 ± 2

C), com

umidade relativa do ar entre 30% e 70%, ciclo claro-escuro de 12 horas e tratados

com água e ração ad libitum. Os animais permaneceram no laboratório para sua

adaptação por um período de pelo menos 1 h antes da realização dos experimentos,

os quais foram conduzidos entre 8 e 17 horas à temperatura de 22 ± 2 °C. Os

procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Uso de

Animais (CEUA) da UFPR sob protocolo nº 41685/04-46/2004 – 110. Os

experimentos foram conduzidos de acordo com as normas internacionais para o

estudo com os animais de laboratório (ZIMMERNANN, 1983).

4.2 Classificação botânica

A P. paniculata foi coletada no município de Florianópolis, na praia de Daniela

(Estado de Santa Catarina) e foi classificada pelo Dr. Olavo de Araújo Guimarães, do

Departamento de botânica da Universidade Federal do Paraná. Um exemplar está

catalogado no Herbário do Departamento de Botânica da UFPR sob o registro

UPCNB 26027.

4.3 Preparação do extrato, identificação, isolamento e purificação dos

compostos

4.3.1 Preparação do extrato e identificação dos compostos

A obtenção do extrato bruto hidroalcoólico da P. paniculata (EHPP) e a

identificação, isolamento e purificação dos compostos foi realizada pelo grupo de

pesquisa coordenado pelo Profº Moacir Pizzolatti do Departamento de Química da

Universidade Federal de Santa Catarina. Cerca de 1000g da planta inteira, seca e

triturada foram submetidos à extração, por maceração em 80% de etanol-água, à

temperatura ambiente (22 ± 3º C), por 14 dias. O etanol foi evaporado e o extrato

(rendimento 50g) foi concentrado ao nível desejado.

Os estudos fitoquímicos conduzidos com o extrato da P. paniculata

demonstraram a presença de muitos constituintes (CRISTIANO et al, 2003). Usando

métodos químicos e de espectroscopia (EIMS, IR,

H e

CNMR, NOE, DIF), foi

identificada a estrutura de duas xantonas (1-hidroxi-5-metoxi-2,3-

metilenodioxixantona e 1,5-dihidroxi-3,2-dimetoxixantona) e a presença de outros

compostos como cumarinas e o flavonóide rutina. Usando cromatografia de gás

acoplada à espectrometria de massa, dois esteróis foram caracterizados

(espinasterol e delta25-espinasterol) e uma xantona em menor quantidade (1-hidroxi-

2,3,5-trimetoxixantona).

4.3.2 Isolamento e purificação dos compostos

O composto isolado aurapten foi obtido a partir do extrato bruto diclorometano. A

febalosina foi isolada a partir da cera edicuticular da P. paniculata e a rutina foi obtida

a partir do extrato bruto hidroalcoólico da P. paniculata conforme descrito por Missau

e colaboradores (dados não publicados).

4.4 Drogas e soluções usadas

Foram utilizadas as seguintes drogas e soluções: ácido acético, formalina,

hidrocloreto ou hidrobrometo de morfina (Merck AG, Darmstadt, Alemanha), N

-nitro-

L-arginina (L-NOARG), L-arginina-metil-éster (L-NAME), L-arginina, glutamato,

carragenina lambda, capsaicina, IL-1β, TNF-α, cimetidina (Sigma Chemical CO., St

Luis, MO, EUA), hidrocloreto de naloxona (Research Biochemicals International,

Natick, MA, EUA), éter etílico, álcool etílico, sacarose, alciam blue e cloreto de

magnésio (Biotec). Os demais reagentes e sais utilizados foram de alto grau de

pureza analítica e procedência Merck.

A capsaicina foi dissolvida em etanol absoluto e carbonato de sódio (0,5%).

Os compostos isolados, febalosina e aurapten foram diluídos em uma mistura

de tween 80 e salina (NaCl 0,9%), sendo que a concentração final de tween não

excedeu a 10%, de modo a não influenciar na atividade exercida pelos compostos.

As demais drogas e o extrato hidroalcoólico e a rutina foram diluídos em

salina.

4.5 Análise Farmacológica in vivo

4.5.1 Vias de administração

Para avaliar a atividade antinociceptiva do EHPP, de modo sistêmico, o

mesmo foi administrado por via oral (v.o.) e os compostos isolados (febalosina,

aurapten e rutina) foram administrados por via intraperitoneal (i.p.). Os animais foram

tratados por v.o. e i.p., com diferentes doses do extrato ou compostos,

respectivamente 60 e 30 minutos antes da administração dos agentes indutores da

nocicepção, que foram administrados por via i.p., intraplantar (i.pt.) e via intratecal

(i.t.).

A atividade antiinflamatória do EHPP foi avaliada através da administração de

diferentes doses do extrato por v.o., respectivamente 60 minutos antes da

administração dos agentes flogísticos, que foram administrados por via i.pt. e

intrapleural (i.pl.).

A atividade protetora gástrica foi verificada através da administração do EHPP

por v.o., 1 h antes e por via i.p., 30 min. antes da administração dos agentes

indutores da lesão gástrica. Para indução das lesões gástricas, o etanol foi

administrado por v.o. e a indometacina por via subcutânea (s.c.). O extrato também

foi administrado por via intraduodenal (i.d.), durante a cirurgia da ligadura do piloro.

4.6 Métodos

A metodologia utilizada para verificar a atividade antinociceptiva EHPP

consistiu inicialmente na utilização de modelos de nocicepção química, induzida pelo

ácido acético (0,6%, 450µl/ animal, i.p.), formalina (2,5%, 20 µl/pata), capsaicina (1,6

µg/pata), glutamato (10 µmol/pata; 175 nmol/ sítio, i.t.), NMDA (450 pmol/sítio, i.t.),

Trans-ACPD (50 nmol/sítio, i.t.), IL-1β (1 pmol/sítio, i.t.) e TNF-α (0,1pmol/sítio, i.t.).

Também foi utilizado o modelo de nocicepção térmica, o tail-flick (potência 90W).

(SCHEIDT et al., 2002; SANTOS et al., 1999; BEIRITH et al., 2002).

Com a finalidade de verificar a ação antiinflamatória do EHPP, foi utilizado

como agente flogístico, a carragenina tanto nos modelos de edema de pata

(300 µg/pata) como no modelo de pleurisia (1%, 0,1ml/sítio).

A atividade protetora gástrica do EHPP foi verificada através de modelos de

indução aguda de lesões gástricas induzidas por etanol 70% (0,5 ml/animal, v.o.) e

por indometacina (20 mg/kg, s.c.). A secreção ácida gástrica foi avaliada através do

modelo da ligadura pilórica. O trânsito intestinal e o esvaziamento gástrico foram

verificados através do método do vermelho de fenol.

4.6.1 Teste das contorções abdominais induzidas pela injeção intraperitoneal

de ácido acético (0,6%), em camundongos

Este modelo consiste na indução da resposta nociceptiva através da

administração intraperitoneal de ácido acético (0,6%) diluído em solução salina. A

administração de ácido acético por via intraperitoneal provoca irritação da membrana

serosa, o que ocasiona movimentos estereotipados, os quais são caracterizados por

contração da musculatura abdominal (contorções abdominais), juntamente com a

extensão de uma das patas posteriores (COLLIER et al., 1968; SANTOS et al., 1999;

LE BARS et al., 2001).

Grupos de animais foram pré-tratados por via oral com o EHPP, nas doses de

5, 10, 50, 100 e 200 mg/kg, 1 h antes da injeção do ácido acético. Os grupos

controles receberam o mesmo volume do veículo (salina, 10 ml/kg, v.o.) utilizado

para diluir o extrato. Após a administração do ácido acético, os animais foram

colocados sob funis de vidro individuais transparentes e durante 20 minutos, o

número de contorções abdominais foi quantificado cumulativamente. A atividade

antinociceptiva do extrato pôde ser obtida através da comparação do número de

contorções abdominais quantificadas entre os grupos controle (tratado com o

veículo) e tratado com o EHPP.

4.6.2 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina (2,5%), em

camundongos

Para confirmação do efeito antinociceptivo do EHPP, foi utilizado o teste de

nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina, na pata traseira direita,

(HUNSKAAR e HOLE, 1987 e SANTOS et al., 1999). Este modelo é mais específico

que o teste de contorções abdominais, permitindo avaliar dois tipos de dor: a dor de

origem neurogênica (estimulação direta dos neurônios nociceptivos) e a dor

inflamatória (caracterizada pela liberação de mediadores pró-inflamatórios). Os

animais pré - tratados com o EHPP, receberam 20 µl de formalina a 2,5% (0,92% de

formaldeído) por via intraplantar, na superfície ventral da pata posterior traseira. Logo

após a injeção da formalina os animais foram colocados individualmente dentro de

um funil de vidro, ao lado de um espelho para facilitar a observação. Em seguida o

tempo foi cronometrado durante 30 minutos.

O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada

com formalina foi quantificado cumulativamente em segundos como índice de

nocicepção. Os 5 min iniciais, após a administração intraplantar de formalina,

correspondem à primeira fase (dor de origem neurogênica) da nocicepção

desencadeada por este agente nociceptivo. A segunda fase, que ocorre entre 15 a

30 min após a administração de formalina, representam a resposta tônica à

nocicepção, acompanhada de uma resposta inflamatória relacionada à liberação de

mediadores inflamatórios. Ao fim do experimento os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical e para verificar a ação antiedematogênica do EHPP, a pata

que recebeu o agente nociceptivo foi cortada na altura da articulação e pesada em

balança analítica. A diferença entre a pata que recebeu o agente algogênico e a pata

que não o recebeu, corresponde ao edema, em mg, como descrito por Ferreira et al.,

1999 e Beirith et al., 2002.

Grupos de animais foram previamente tratados com o EHPP por via oral, nas

doses de 0,0001, 0,001, 0,01 e 0,1 mg/kg, 1 h antes da injeção da formalina. Os

animais controle receberam igual volume do veículo (salina, 10 ml/kg, v.o.) utilizado

para diluir o extrato.

4.6.3 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina, em

camundongos

Esse modelo foi proposto para o estudo de compostos que atuam sobre a dor

de origem neurogênica. A injeção de capsaicina induz estimulação direta dos

neurônios nociceptivos e causa a liberação de vários neuropeptídeos e aminoácidos

excitatórios, envolvidos na transmissão dolorosa, incluindo principalmente as

taquicininas (substância P, neurocinina A e neurocinina B) e o glutamato,

respectivamente (SAKURADA et al, 1992, SAKURADA et al, 1996).

Os animais foram colocados sob funis de vidro transparentes individuais, para

um período de adaptação de 20 minutos. Após, esse período, cada animal recebeu

por via intraplantar 20 µl de solução de capsaicina (1,6 µg/pata) na pata posterior

direita, sendo que o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata

injetada com capsaicina foi cronometrado por um período de 5 min e considerado

como índice de nocicepção. Grupos de animais foram tratados com o EHPP, nas

doses de 0,01, 0,1 0,5, 1,0 e 10 mg/kg por via oral 1 h antes da injeção da

capsaicina. Os animais controles receberam igual volume dos veículos utilizados

(salina, 10 ml/kg, v.o.) para diluir o extrato.

4.6.4 Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato, em

camundongos

Para testar a hipótese do envolvimento dos aminoácidos excitatórios (AAE) no

efeito antinociceptivo do EHPP, este foi administrado por via oral e uma hora após,

sua atividade foi analisada no modelo de nocicepção induzida pelo glutamato

(SANTOS e CALIXTO, 1997; BEIRITH et al., 2002). Também neste modelo, foi

avaliada a atividade antinociceptiva dos três compostos isolados da P paniculata,

sendo que todos foram administrados por via intraperitoneal, devido a pouca

quantidade. A febalosina foi administrada nas doses de 1, 3, 10 e 30 mg/kg; o

aurapten, administrado nas doses de 3, 10, 30 e 100 mg/kg e a rutina, nas doses de

1, 3, 10, 30 e 100 mg/kg, 30 minutos antes da injeção de glutamato.

Após os tratamentos com o extrato e/ou compostos isolados, os animais receberam

20 µl de solução de glutamato (10 µmol/pata) dissolvido em salina por via intraplantar

na pata traseira direita. Após, os animais foram colocados individualmente sob funis

de vidro transparentes, e o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo

a pata injetada foi cronometrado durante 15 minutos e considerado como um índice

de nocicepção. Ao fim do experimento, os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical e a pata foi cortada na altura da articulação e pesada em

balança analítica. A diferença entre a pata que recebeu o agente nociceptivo e a pata

que não o recebeu, corresponde ao edema, em mg (FERREIRA et al., 1999;

BEIRITH et al., 2002).

Os animais controle receberam igual volume de veículos utilizados para diluir

o extrato e compostos.

4.6.5 Teste da retirada da cauda (tail-flick)

A atividade antinociceptiva do EHPP foi analisada no teste da retirada da

cauda, também chamado tail-flick, descrito previamente por D`Amour e Smith, 1941.

O teste do tail-flick é um teste simples e de fácil visualização que consiste na

utilização de uma fonte de calor como estímulo nociceptivo. Para a realização deste

foi utilizado o aparelho tail-flick analgesia meter, San Diego instruments. Este

aparelho possui um aparato que contém uma fonte térmica luminosa e um suporte

para encaixe da cauda do camundongo. No mesmo momento em que a cauda é

colocada no aparato, a fonte térmica nociva é acionada e um cronômetro é

disparado, sendo que o tempo até a retirada da cauda (período de latência) é

utilizado como determinação do índice de nocicepção (Le BARS et al., 2001). Todos

animais foram pré-selecionados. Nesta pré-seleção, os animais que permaneceram

no aparato, por mais de 8 segundos, foram eliminados do teste. Durante a avaliação

da atividade antinociceptiva do extrato, o tempo máximo de permanência permitido

aos animais, no aparato, foi de 30 s para evitar danos teciduais.

Os animais foram pré-tratados, por via oral, com o EHPP, na dose de 100

mg/kg, 1 h antes do experimento ou, 30 min antes com morfina (5 mg/kg, s.c.),

utilizada como controle positivo. O tempo de permanência dos animais no aparelho

de tail-flick foi convertido em percentuais, sendo utilizada a seguinte fórmula:

percentagem de efeito máximo (PME)= TF (tempo final) – TI (tempo basal)/30 – TI

(tempo basal).

4.6.6 Efeito sobre desempenho motor no teste de atividade locomotora

espontânea

Com o objetivo de esclarecer a presença de efeito depressor sobre o sistema

nervoso central ou periférico dos compostos em estudo, foi empregado o teste de

atividade locomotora espontânea, que analisa o desempenho motor do animal. Este

teste é realizado em caixas fechadas de 40 x 25 x 20 (Plexiglas cages) equipada

com três fotocélulas que são sensíveis à passagem do animal. O número total de

vezes que o animal passou em frente à fotocélula, em um tempo de 5 minutos, foi

cumulativamente registrado e foi utilizado como indicativo de atividade motora

(SKALISZ et al., 2004).

Os animais foram tratados por via oral com o EHPP nas doses de 5, 10, 50 e

100 mg/kg, 1 h antes do teste ou somente com o veículo (salina,10 ml/kg) utilizados

para diluir o extrato, sendo o grupo tratado com o veículo, foi identificado como grupo

controle.

4.6.7 Estudo do possível mecanismo de ação antinociceptivo do EHPP, em

camundongos.

4.6.7.1 Participação do sistema opióide

Com o objetivo de avaliar a influência do sistema opióide sobre o efeito

antinociceptivo do EHPP, grupos distintos de animais foram pré-tratados com o

antagonista opióide não seletivo, naloxona (1 mg/kg, i.p.) 20 min antes da

administração do EHPP (0,1 mg/kg, v.o.) ou da morfina (5 mg/kg, s.c.), que foi

utilizada como controle positivo. Decorridos 1h após a administração por via oral do

extrato ou 30 minutos após a administração subcutânea de morfina, foi avaliado o

efeito desse tratamento em relação a nocicepção induzida pela injeção intraplantar

de glutamato. Os grupos utilizados como controle foram tratados 1h antes com o

EHPP (0,1 mg/kg, v.o.) ou veículo utilizado para diluir o extrato, agonistas e

antagonista (salina, 10 ml/kg, v.o.), ou 30 minutos antes da injeção de glutamato,

com a morfina (5 mg/kg, s.c.) ou naloxona (1 mg/kg, i.p.).

4.6.7.2 Participação da via L-arginina-óxido nítrico

Para avaliamos também a participação da via da L - arginina - óxido nítrico no

efeito antinociceptivo causado pelo EHPP, os animais foram previamente tratados

com o precursor do óxido nítrico, a L-arginina (600 mg/kg, i.p.) e após 15 min

receberam o EHPP (0,1 mg/kg, v.o.) ou Nω

– nitro – L - arginina (L-NOARG, 100

mg/kg, i.p.) um inibidor da enzima óxido nítrico sintase (BEIRITH et al., 1998).

Decorridos 1h após a administração do EHPP e 30 min após o tratamento com L-

NOARG, os animais foram avaliados quanto a nocicepção induzida pela injeção

intraplantar de glutamato. Os animais controles foram tratados 1h antes da injeção

intraplantar de glutamato, com o EHPP (0,1 mg/kg, v.o.) ou com veículo utilizado

para diluir o extrato, agonistas e antagonista (salina, 10 ml/kg, v.o.); ou 30 minutos

antes da administração, com L-arginina (600 mg/kg, i.p.) ou L-NOARG (100 mg/kg,

i.p).

4.6.7.3 Participação do sistema glutamatérgico

Para verificar se a atividade antinociceptiva da P. paniculata está relacionada

a uma possível interação com receptores glutamatérgicos, o efeito antinociceptivo do

EHPP (1,0 mg/kg, v.o.) e também da rutina (30 mg/kg, i.p.) foi analisado sobre a

resposta induzida pela administração intratecal de glutamato (GLU, 175nm/sítio, i.t.),

NMDA (450pm/sítio, i.t.) e trans-ACPD (50nm/sítio, i.t.).

As injeções foram administradas nos animais acordados conforme o método

descrito por Hylden e Wilcox, 1980. Os animais foram imobilizados manualmente e

uma agulha conectada a uma microseringa de 50 µl, foi inserida através da pele

entre as vértebras L

e L

, no espaço subdural. A nocicepção foi induzida pela

administração intratecal (no volume de 5 µl) dos aminoácidos excitatórios diluídos em

solução salina. Como controle também foi administrado somente o veículo (salina).

O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo os membros

inferiores (patas posteriores, cauda e abdômen) foi cronometrado durante o período

de tempo padronizado para cada AAE, após sua administração, (glutamato: 3 min;

NMDA: 5 min e trans-ACPD: 15 min). Este tempo foi considerado como índice de

nocicepção, conforme descrito previamente (FERREIRA et al., 1999; SCHEIDT et al.,

2002).

4.6.7.4 Participação de citocinas como a IL-1β e TNF-α

Tanto a IL-1β quanto o TNF-α contribuem diretamente na perpetuação da dor

associada a processos inflamatórios como a hiperalgesia e alodínia (FERREIRA et

al., 1988; DAVIS e PERKINS, 1994, CUNHA e FERREIRA, 2003, COUTAUX et al.,

2005). Com base nestas informações, decidiu-se avaliar o efeito antinociceptivo do

EHPP (0,1 mg/kg, v.o.) e de seu composto isolado rutina (30mg/kg, i.p.) na

nocicepção induzida pela administração intratecal destas citocinas. Os animais

receberam uma injeção intratecal de 5 µl de IL-1β (1pg/sítio, i.t.), TNF-α (0,1pg/sítio,

i.t.) ou das soluções veículo usadas para diluir extrato (salina) e compostos (salina e

tween). As injeções foram administradas nos animais acordados conforme o método

descrito por Wilcox em 1980. Os animais foram imobilizados manualmente e com

uma agulha conectada a uma microseringa de 50 µl, que foi inserida através da pele

entre as vértebras L

e L

dentro do espaço subdural, foram administradas as

soluções.

O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo os membros

inferiores, após a injeção de IL-1β e TNF-α foi cronometrado por um período de 15

min, sendo utilizado para determinar o índice de nocicepção, conforme descrito

previamente (FERREIRA et al., 1999; SCHEIDT et al., 2002).

4.7 Estudo da atividade antiinflamatória do EHPP

4.7.1 Avaliação da atividade antiinflamatória do EHPP no modelo do edema de

pata induzido injeção intraplantar de carragenina, em ratos

O modelo de edema em pata de rato foi realizado de acordo com Winter,

1962. O volume da pata direita e esquerda dos animais foi avaliado por

pletismometria. Em seguida, os animais receberam o tratamento com EHPP, nas

doses de 30, 100 e 300 mg/kg (v.o.), indometacina (4 mg/kg, i.p.) ou veículo (salina,

10 ml/Kg, v.o) e após 60 e 30 min.respectivamente, receberam uma injeção

intraplantar de carragenina (300 µg/pata) na pata posterior direita e salina na pata

posterior esquerda no volume de 50 µl. Os volumes das patas traseiras direita e

esquerda foram avaliados novamente por pletismometria após 1, 2, 3 e 4 h. Os

resultados foram expressos como a diferença entre o volume final da pata a cada

tempo (Vf) e o volume inicial (Vi), representados pela fórmula Vf-Vi.

4.7.2 Avaliação da atividade antiinflamatória do EHPP no modelo de pleurisia,

induzido pela injeção intrapleural de carragenina, em camundongos

Para indução experimental da pleurisia, primeiramente foi administrado por via

endovenosa a solução de Azul de Evans (25 mg/kg, 0,2 ml i.v.), para posterior

determinação indireta do grau de exsudação na cavidade pleural (SALEH, 1997;

VIANNA e CALIXTO, 1998). Decorridos 30 min da injeção de Azul de Evans, grupos

de animais foram tratados com EHPP (3, 10, 30 mg/kg, v.o.). Após 1 hora do

tratamento, os mesmos foram levemente anestesiados com éter etílico e em seguida

foi administrado na cavidade pleural direita, através do espaço intercostal, 0,1 ml de

solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) contendo, carragenina (1%), ou somente

salina (grupo controle). Quatro horas após a administração do agente flogístico, os

animais foram mortos com uma overdose de éter etílico. A seguir os animais foram

fixados em mesa cirúrgica, em declive de 30 a 45º, sendo feita uma incisão

transversal na pele e nos músculos abdominais. Em seguida o apêndice xifóide foi

pinçado e através de uma incisão abaixo do esterno, os pulmões e a cavidade

pleural foram expostos. Logo após esta operação, a cavidade pleural foi lavada com

1,0 mL de solução salina heparinizada (20 UI/ ml). A seguir, o volume líquido da

cavidade pleural foi coletado com auxílio de pipetas automáticas e processado para

posterior determinação do número total e diferencial de células e da exsudação.

A contagem total foi realizada utilizando-se a câmara de Neubauer espelhada

e microscópio óptico (aumento de 400 vezes), com uma prévia diluição de 10 µl do

exsudato em 200 µl do líquido de Türk (2% de ácido acético).

A contagem diferencial foi efetuada, realizando-se a leitura das amostras de

exsudato fixadas em 3% de albumina bovina, sendo secados à temperatura

ambiente e corados pelo método de May-Grunwald-Giensa. A contagem diferencial

foi feita em microscópio óptico comum com auxílio de objetiva de imersão, contando-

se aproximadamente 100 células por lâmina.

Após a lavagem das cavidades pleurais com solução salina heparinizada, uma

alíquota de 1 ml foi separada e congelada em freezer (-20ºC) para posterior

determinação dos níveis de Azul de Evans em espectrofotômetro (Pharmacia Biotech

– Ultrospec 2000) por leitura de densidade óptica, em comprimento de onda de 600

nm. Para tal, curvas-padrão com concentrações previamente conhecidas do corante

também tiveram suas densidades óticas determinadas, permitindo a quantificação

dos valores experimentais em µg/ml com auxílio de equação da reta.

4.8 Estudo da atividade antiúlcerogênica e anti-secretora ácida do EHPP, em

ratas

4.8.1 Lesões gástricas induzidas por etanol

Este modelo foi descrito por Robert e colaboradores (1979) e nele, as lesões

da mucosa gástrica ocorrem independente de qualquer efeito sobre a secreção

gástrica, sendo que a lesão se caracteriza pela presença de focos hiperêmicos e

hemorrágicos indicando o comprometimento do fluxo sangüíneo pelo agente lesivo.

Para testar a hipótese de uma possível atividade protetora gástrica do EHPP,

o mesmo foi administrado em ratas Wistar adultas, em jejum de 15-18 horas, por via

oral, nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg, e por via intraperitoneal, nas doses de 3, 10

e 30 mg/kg. Uma hora depois da administração do etanol 70% (0,5 ml/ animal, v.o.),

os animais foram mortos e a parede abdominal foi exposta e o estômago foi

localizado e removido.

Após a remoção do estômago, o mesmo foi mantido em placa de Petri, lavado

e aberto ao longo da curvatura menor. O conteúdo gástrico foi desprezado, a mucosa

foi lavada delicadamente com água destilada e esticada em placa de isopor. Depois

deste procedimento, o índice de úlceras foi determinado através de “leitura cega” de

acordo com a tabela de pontuação para lesões gástricas agudas como descrito no

item 4.8.3.1.

4.8.2 Lesões gástricas induzidas por indometacina

O modelo de lesões gástricas induzidas por indometacina foi conduzido de

acordo com Djahanguiri, 1969. Nele, as úlceras são induzidas através da inibição da

síntese de prostaglandinas, cuja função fisiológica é estimular a secreção de muco e

bicarbonato e inibir a secreção gástrica.

Para testar a atividade protetora gástrica do EHPP, o extrato foi administrado

por via oral nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg, em ratas Wistar adultas, 1 hora antes

de iniciar os outros tratamentos.

Os animais, em jejum de 15-18 horas, foram tratados com água e extrato, por

gavagem (via oral). Após uma hora do pré-tratamento, foi administrado indometacina

20 mg/Kg, por via subcutânea. Seis horas após a administração do antiinflamatório,

os animais foram sacrificados e a parede abdominal foi exposta e o estômago foi

localizado e removido.

Após a remoção do estômago, o mesmo foi mantido em placa de Petri, lavado

e aberto ao longo da curvatura menor. O conteúdo gástrico foi desprezado, a mucosa

foi lavada delicadamente com água destilada e esticada em placa de isopor. Depois

deste procedimento, o índice de úlceras foi determinado em ‘’leitura cega’’, de acordo

com a tabela de pontuação para lesões gástricas agudas, como descrito no item

4.8.3.1..

4.8.3 Avaliação das lesões gástricas nos modelos de indução aguda

4.8.3.1 Determinação do índice de úlceras: O índice de úlceras foi determinado de

acordo com Mesia, 1998, por contagem direta das lesões menores ou iguais a 1 mm

(1 ponto). Quando maiores, o comprimento de cada lesão na mucosa glandular foi

medido e quantificado, considerando 1,5 pontos x mm. No caso de úlceras

perfuradas, estas também foram medidas e cada mm de lesão e multiplicado por 5

pontos (5 pontos x mm)

4.8.3.2 Quantificação do muco gástrico

Após a realização do modelo de lesão gástrica por etanol, foi realizada a

quantificação do muco gástrico. Neste modelo, segmentos úmidos da mucosa

gástrica (exatamente pesados), foram incubados em 10 ml de solução da Alcian Blue

0,1%, onde permaneceram corando por duas horas. O excesso de Alcian Blue foi

removido com sacarose 0,25 mol/L (duas lavadas sucessivas, a primeira por 15

minutos e a segunda durante 45 minutos). O corante complexado com o muco da

parede glandular foi extraído com 5 ml de cloreto de magnésio (0,5 mol/L), agitando-

se intermitentemente, cada segmento, por 1 minuto, a cada 30 minutos durante duas

horas. Foi misturada 3 ml da solução sobrenadante azul, obtida com 3 ml de éter

dietílico e agitado vigorosamente até a formação de uma emulsão. Centrifugou-se a

3600 rpm x 10 min., para separar a fase aquosa, descartando o resíduo. A

concentração de Alcian Blue, nas amostras, foi determinada por leitura

espectrométrica a 598 nm (CORNE et al, 1974). Para tal, curvas-padrão com

concentrações previamente conhecidas do corante também tiveram suas densidades

óticas determinadas, permitindo a quantificação dos valores experimentais em µg de

Alcian Blue/ml/g de tecido úmido, através da interpolação na curva padrão do corante

4.8.4 Método de estudo in vivo: Método da ligadura pilórica

Este modelo foi conduzido de acordo com o descrito por Shay et al, 1945. O

modelo da ligadura pilórica nos permite estudar o efeito da drogas sobre a secreção

gástrica, bem como sobre eventos envolvidos na gastroproteção. Neste método, o

conteúdo gástrico, acumulado durante 4 horas, foi avaliado em termos de volume

secretado, pH, acidez total e atividade péptica. Com o objetivo de descartar efeitos

inespecíficos que interferem com a secreção, como o estímulo reflexo de secreção

gástrica pelo contato direto de um extrato vegetal com terminações nervosas

sensitivas peritoneais, deu-se preferência à via de administração intraduodenal

porque, além de ser protegida pela mucosa, é a que mais se aproxima da via oral.

Para fazer a ligadura no piloro, os ratos em jejum (15-18 horas) foram

anestesiados com éter e fixados em decúbito dorsal em uma placa de isopor. Através

de uma incisão de cerca de 2 cm no abdômen, o estômago foi localizado e o piloro

foi amarrado com linha cordonê. Após este procedimento, foi administrado o veículo:

água (10 ml/Kg) pela via intraduodenal nos animais controle. A cimetidina 60 mg/kg e

o EHPP nas concentrações de 30, 100 e 300 mg/kg foram administrados por via

intraduodenal.

Depois deste procedimento a parede abdominal e a pele foram suturadas e foi

aguardada a recuperação da anestesia. Quatro horas após a cirurgia, os animais

foram mortos e seus estômagos foram removidos após pinçamento do esôfago para

evitar perda do material secretado.

Depois da retirada do estômago, o órgão foi lavado com água destilada,

secado com gaze e mantido em placa de Petri. O estômago foi aberto ao longo da

curvatura menor e a mucosa foi lavada com 3 ml de água destilada, recolhendo, a

seguir, o suco gástrico em tubos de ensaios. Os tubos foram centrifugados (1500

rpm x 30 min. em centrífuga refrigerada), sendo o volume determinado por medida

direta em provetas e a acidez total (mEq [H

]/ml/4h) foi determinada por titulação

com NaOH 0,1N utilizando solução de fenoftaleína 2% como indicador da

neutralização.

4.8.5 Estudo dos mecanismos de ação envolvidos no possível efeito protetor

gástrico do EHPP, em ratas

Com o objetivo de avaliar a participação do óxido nítrico no mecanismo de

ação envolvido na atividade protetora gástrica do EHPP, observada no modelo de

úlceras agudas induzidas por etanol, os animais foram previamente tratados com o

inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e após 30 minutos

receberam o EHPP (100 mg/kg, v.o.). Após 1h, foi administrado por gavagem 0,5 ml

de etanol 70% para cada animal; 1h depois da administração do etanol, os animais

foram sacrificados e a parede abdominal foi exposta e o estômago foi localizado e

removido (ARRIETA et al, 2003).

O pré-tratamento com L-NAME modifica as características da úlcera induzida

pelo etanol, aumentando o tamanho da lesão e tornando-a mais larga. Dessa forma,

para aumentar a reprodutibilidade da leitura do índice de úlceras, o mesmo foi

determinado de forma diferente do descrito no item 4.8.3.1., através da leitura da

área lesada, onde a largura da lesão foi medida e multiplicada pelo seu comprimento.

A concentração de muco, secretado pela mucosa gástrica, foi quantificada como

descrito no item 4.8.3.2..

4.8.6 Avaliação do EHPP sobre a motilidade gastrintestinal

4.8.6.1 Trânsito intestinal, em camundongos

Esse método consiste na administração de um marcador colorido (vermelho

de fenol 0,05% em carboximetilcelulose 1,5%) e na avaliação do trajeto do mesmo

no intestino delgado durante um período de tempo. Camundongos, em jejum de 6

horas, foram tratados com o veículo (grupo C: controle, água, via oral), ou com

metoclopramida 30 mg/kg v.o., ou com atropina 3,0 mg/kg, s.c. ou com EHPP (10, 30

e 100 mg/kg, v.o.). Decorrido 1 h dos tratamentos, foi administrado o marcador

colorido, por via oral a todos os animais. O grupo controle tempo zero foi morto, por

deslocamento cervical, logo após a administração do marcador colorido e os outros

grupos, após 20 min. da administração. A cavidade abdominal foi aberta e o intestino

delgado foi removido. Com auxílio de uma régua, foi medido o comprimento total do

intestino delgado de cada animal desde o piloro até a válvula ileocecal, bem como a

distância percorrida pelo marcador. Os resultados destas medidas foram expressos

em porcentagem de distância percorrida pelo marcador em relação ao comprimento

total do intestino delgado (SCARPIGNATO et al, 1980).

4.8.6.2 Esvaziamento gástrico de semi-sólidos

Esse método consiste na administração de um marcador colorido semi-sólido

(vermelho de fenol 0,05% em carboximetilcelulose 1,5%) e na avaliação da

quantidade do marcador que permanece no estômago durante um período de tempo.

Camundongos, em jejum de 6 horas, foram tratados com o veículo (grupo C:

controle, água, via oral), ou com metoclopramida 30 mg/kg v.o., ou com atropina 3,0

mg/kg, s.c. ou com EHPP (10, 30 e 100 mg/kg, v.o.). O grupo controle tempo zero foi

sacrificado, por deslocamento cervical, logo após a administração do marcador

colorido, e os outros grupos, após 20 min. da administração. A cavidade abdominal

foi aberta, o piloro e a parte distal do esôfago foram pinçados, o estômago retirado

com seu conteúdo e então aberto e lavado com 7ml de água destilada. O conteúdo

gástrico coletado foi centrifugado a 1.500 (r.p.m.), por 15 min. Foi coletado 1 ml do

sobrenadante, no qual foi adicionado 1 ml de NaOH 1N (pH 12). Os resultados

foram obtidos por leitura espectrofotométrica a 560nm, e expressos em porcentagem

de esvaziamento gástrico em relação ao grupo controle tempo zero (SCARPIGNATO

et al , 1980).

4.9 Análise Estatística

Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média, exceto as

s (dose ou concentração das drogas ou compostos que reduziram a resposta em

50% em relação ao grupo controle), que são apresentadas como médias

geométricas, acompanhadas de seus respectivos limites de confiança, em nível de

95%. As análises estatísticas dos resultados foram realizadas por meio de análise de

variância (ANOVA), seguidas pelo teste de múltipla comparação, utilizando-se o

método de Newman Keuls, quando apropriado. Valores de P<0,05 foram

considerados como indicativos de significância. As DI

s foram estimadas a partir de

experimentos individuais, utilizando o método de regressão linear através do

programa “Graph Pad” ou “Instat”.

5 RESULTADOS

5.1 Nocicepção induzida pela injeção intraperitoneal de ácido acético (0,6%) em

camundongos

A Figura 5 mostra que o EHPP (5, 10, 50, 100 e 200 mg/kg), administrado por

via oral, foi capaz de reduzir, de forma dependente da dose, as contorções

abdominais induzidas pela injeção intraperitoneal de ácido acético em camundongos.

O valor médio da DI

(juntamente com seus limites de confiança de 95%) foi de 24,8

(18,3 - 33,5) mg/kg, apresentando inibição de 90 ± 4% na dose de 200 mg/kg.

C 5 10 50 100 200

EHPP (mg/kg, v.o.)

***

Número de contorções

Figura 5: Efeito do EHPP sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético, em

camundongos. Os animais foram tratados com o extrato (barras abertas) ou veículo (C, barra

fechada), 1h antes por via oral, nas doses indicadas e após este período, receberam uma

injeção intraperitoneal de ácido acético 0,6% e o número de contorções abdominais foi

avaliado durante 20 min. Cada grupo representa a média de 6 -12 animais e as barras

verticais o E.P.M. Na análise estatística, foi considerado significante **P < 0,01 e ***P <

0,001 quando comparado ao grupo controle (C).

5.2 Nocicepção induzida pela administração intraplantar de formalina (2,5%) em

camundongos

A Figura 6 mostra que o EHPP (0,0001-0,1 mg/kg), administrado por v.o., foi

capaz de inibir de forma parcial a nocicepção de origem neurogênica (1ª fase –

Figura 6A) com inibição de 24 ± 6%, na dose de 0,01 mg/kg, sendo mais eficaz em

reduzir a nocicepção inflamatória (2ª fase – Figura 6B) com valor médio de DI

4,2 (3,5-4,9) µg/kg e inibição de 69 ± 4%, na dose de 0,01 mg/kg. No entanto, o

tratamento com o extrato não apresentou efeito sobre o edema de pata causado pela

injeção intraplantar de formalina (dado não apresentado).

C 0,0001 0,001 0,01 0,1

100

EHPP (mg/kg, v.o.)

Tempo de reação (s)

C 0,0001 0,001 0,01 0,1

100

200

300

EHPP (mg/kg, v.o.)

***

Tempo de reação (s)

Figura 6: Efeito do EHPP sobre a nocicepção, induzida pela formalina, em camundongos.

Os animais foram tratados com o extrato (barras abertas) ou veículo (controle: C, barra

fechada), 1h antes por via oral, nas doses indicadas e após este período receberam uma

injeção intraplantar de formalina 2,5% e a nocicepção foi avaliada na primeira (A) e segunda

fase (B). Cada grupo representa a média de 6 - 12 animais e as barras verticais o E.P.M. Na

análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e significante *P < 0,05 **P<

0,01 e ***P < 0,001 quando comparado ao grupo controle (C).

5.3 Nocicepção induzida pela administração intraplantar de capsaicina

(1,6µg/pata) em camundongos

O resultado apresentado na Figura 7 mostra que o EHPP (0,01-10 mg/kg),

administrado por v.o., foi capaz de inibir de maneira significativa a nocicepção de

origem neurogênica causada pela capsaicina, somente na dose de 1,0 mg/kg com

inibição de 50 ± 3%.

C 0,01 0,1 0,5 1,0 10

EHPP (mg/kg, v.o.)

Tempo de reação (s)

Figura 7: Efeito do EHPP sobre a nocicepção induzida pela capsaicina, em camundongos.

Os animais foram tratados com o extrato (barras abertas) ou veículo (C, barra fechada), 1h

antes por via oral, nas doses indicadas e após este período receberam a injeção intraplantar

de capsaicina e a nocicepção foi avaliada. Cada grupo representa a média de 6 - 12 animais

e as barras verticais o E.P.M. Na análise estatística foi considerado não significante P > 0,05

e significante **P < 0,01 quando comparado ao grupo controle (C).

5.4 Efeito do EHPP no teste da retirada da cauda (tail-flick), em camundongos

O resultado na Figura 8 mostra que o EHPP (100 mg/kg, 1h antes),

administrado por via oral, não foi capaz de alterar o período de latência ao estímulo

térmico luminoso, quando analisado no teste do tail-flick, após 1 e 2 hs da sua

administração por via oral. Porém, o tratamento com morfina (agonista opióide, 5

mg/kg, s.c.) aumentou o período de latência de resposta dos animais ao estímulo

térmico quando avaliada por este modelo.

C 1h 2h morfina

EHPP (100mg/kg, v.o.)

PME%

Figura 8: Efeito do EHPP e da morfina sobre latência ao estímulo térmico nocivo aplicado no

teste da retirada da cauda (tail-flick), em camundongos. Os animais foram tratados com o

extrato (barra aberta) ou veículo (C, barra fechada), 1h antes por via oral ou morfina (barra

hachurada, 5mg/kg, s.c.) 30 min. antes, nas doses indicadas e após, a latência ao estímulo

térmico foi avaliada. Cada grupo representa a média de 6 - 12 animais e as barras verticais

o E.P.M. Na análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e significante **P <

0,01, quando comparado ao grupo controle (C).

5.5 Efeito do EHPP sobre a performance motora no teste de atividade

PP (5-100 mg/kg, v.o.), 1

hora a

igura 9:

Efeito do tratamento dos animais com EHPP sobre o desempenho motor, em

amundongos. Os animais foram tratados com o extrato (barras abertas) ou veículo (C, barra

locomotora espontânea, em camundongos

A Figura 9 demonstra que o tratamento com o EH

ntes, não alterou de maneira significante a atividade locomotora dos animais

quando avaliados no modelo da caixa de atividade locomotora, quando comparado

ao grupo controle, que corresponde aos animais tratados somente com o veículo

(salina).

C 5 10 50 100

100

150

EHPP (mg/kg, v.o.)

Número de interrupções

200

fechada), 1h antes por via oral, nas doses indicadas e após, a atividade locomotora foi

avaliada. Cada grupo representa a média de reação de 6 - 12 animais e as barras verticais o

E.P.M. Na análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 quando comparado

ao grupo controle (C).

5.6 Efeito do EHPP e dos compostos isolados, febalosina, aurapten e rutina

Os resultados apresentados na Figura 10 mostram que o EHPP (0,001 – 1,0

igura 10:

Efeito do EHPP na nocicepção induzida pela administração intraplantar de

glutamato, em camundongos. Os animais foram tratados com o extrato (barras abertas) ou

os com o EHPP, a atividade

sobre a nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato, em

camundongos

mg/kg), administrado por via oral, causou uma inibição de forma dose dependente,

da nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato (10µmol/pata) em

camundongos, porém sem interferir com o edema produzido pela mesma (dado não

apresentado). O valor médio da DI

(juntamente com seus limites de confiança de

95%) foi de 8,4 (7,7 – 9,2) µg/kg, apresentando inibição de 72 ± 3% para a dose de

1,0 mg/kg.

C 0,001 0,005 0,01 0,1 1

100

150

***

EHPP (mg/kg, v.o.)

Tempo de reação (s)

200

veículo (C, barra fechada), 1h antes por via oral nas doses indicadas e após a nocicepção

foi avaliada. Cada grupo representa a média de 6 - 12 animais e as barras verticais o E.P.M..

Na análise estatística foi considerado não significante P > 0,05 e *P < 0,05; ***P < 0,001,

significante quando comparado ao grupo controle (C).

e forma a complementar, aos dados obtidD

antinociceptiva dos compostos isolados febalosina (1-30 mg/kg, i.p.), aurapten (3-100

mg/kg, i.p.) e rutina (1-100 mg/kg, i.p.), foram testados no modelo de nocicepção

induzida pelo glutamato. A Figura 11 C, mostra que o rutina apresentou, de forma

dependente da dose, uma importante atividade antinociceptiva, com inibição de 82

7%, para a dose de 100 mg/kg e valor médio da DI

(juntamente com seus limites de

confiança de 95%) de 10,98 (7,80-15,45) mg/kg.

No entanto, a febalosina (Fig. 11 A) apresentou atividade antinociceptiva

igu

duzida pela administração intraplantar de glutamato, em camundongos. Os animais foram

somente na dose de 10 mg/kg, i.p., com inibição de 64

± 12%. O mesmo ocorreu com

o aurapten (Fig. 11 B), que apresentou efeito inibitório somente na dose de 100

mg/kg, com inibição de 71

± 7%.

ra 11:

Efeito da febalosina (A), aurapten (B) e rutina (C) em relação a nocicepção

C131030

100

200

Febalosina (mg/kg, i.p.)

Tempo de reação (s)

C 3 10 30 100

100

200

Aurapten (mg/kg, i.p.)

Tempo de reação (s)

C 1 3 10 30 100

100

200

***

Rutina (mg/kg, i.p.)

Tempo de reação (s)

tratados com os compostos (barras abertas) ou veículo (C, barra fechada), 30 minutos antes

por via intraperitoneal nas doses indicadas e após a nocicepção foi avaliada. Cada grupo

representa a média de 6 - 12 animais e as barras verticais o E.P.M.. Na análise estatística foi

considerado não significante P > 0,05 e *P < 0,05; **P < 0,01, ***P < 0,001, significante

quando comparado ao grupo controle (C).

5.7 Curva tempo-resposta do EHPP no modelo de nocicepção induzida pela

administração intraplantar de glutamato (10 µmol/ pata), em camundongos

A Figura 12 mostra que o EHPP, quando administrado na dose de 0,1 mg/kg,

igura 12:

Curva tempo-resposta do EHPP no modelo de nocicepção induzido pela

dministração intraplantar de glutamato, em camundongos. Os animais foram tratados com o

por via oral, 1 hora antes, foi capaz de inibir significativamente a nocicepção causada

pela injeção intraplantar de glutamato. Os resultados demonstram que a atividade

antinociceptiva do extrato foi mantida até a oitava hora, sendo mais pronunciada da

primeira a quarta hora.

1 2 4 6 8 12

100

150

***

Tempo (h)

Tempo de Resposta

***

200

(h)

extrato (círculos abertos) ou veículo (C, círculos fechados), 1h antes por via oral, na dose de

0,1mg/kg e após o efeito antinociceptivo tempo-resposta foi avaliado. Cada grupo representa

a média ± erro padrão da média de 6 -12 animais e as barras verticais o E.P.M. Na análise

estatística foi considerado não significante P > 0,05 e *P < 0,05; ***P < 0,001, significante

quando comparado ao grupo controle (C).

5.8 Análise do mecanismo de ação do EHPP

5.8.1 Efeito do pré-tratamento com L-arginina

ento dos animais com L-arginina, A Figura 13 demonstra que o pré-tratam

(substrato da óxido nítrico sintase, 600mg/kg, i.p.), reverteu a ação antinociceptiva

causada pela administração da L-NOARG (inibidor da óxido nítrico sintase, 75 mg/kg,

i.p.). Porém, o tratamento com a L-arginina não interferiu de forma significativa com a

atividade antinociceptiva causada pelo EHPP (0,1 mg/kg, v.o.), quando analisada em

relação a nocicepção induzida pelo glutamato.

igura 13:

ausada pelo EHPP (0,1 mg/kg; 1h antes) por via oral ou pela L-NOARG (100mg/kg, i.p.) em

Efeito do pré-tratamento com L-arginina (600mg/kg, i.p.) sobre a antinocicepção

120

160

Veículo

L-arginina (600mg/kg)

L-NOARG (100mg/kg)

EHPP(0,1mg/kg)

Glutamato

***

Tempo de reação (s

200

)

relação à nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato em camundongos.

Cada grupo representa a média de 6 - 12 animais e as barras verticais o E.P.M. Na análise

estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e ***P < 0,001, significante quando

comparado aos grupos pré-tratados com controle e antagonista (veículo + glutamato e L-

arginina + glutamato) e # P < 0,001 difere significativamente do grupo tratado com L-NOARG

e glutamato.

5.8.2 Participação do sistema opióide

14 mostra que pré-tratamento dos animais

igura 14:

ausada

O resultado apresentado na Figura

c naloxona (1 mg/kg, i.p.) reverteu a ação antinociceptiva causada pela

administração da morfina (5 mg/kg, s.c.). No entanto, o tratamento com a naloxona

não interferiu com a antinocicepção causada pelo EHPP (0,1 mg/kg, v.o.), quando

analisada em relação a nocicepção induzida pela administração intraplantar de

glutamato.

Efeito do pré-tratamento com naloxona (1 mg/kg, i.p.) sobre a antinocicepção

pelo EHPP (0,1 mg/kg; 1h antes) por via oral ou pela morfina (5 mg/kg, s.c.) em

120

160

Veículo

Naloxona(1mg/kg)

Morfina (5mg/kg)

EHPP(0,1 mg/kg)

Glutamato

***

Tempo de reação (s)

200

relação à nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato em camundongos.

Cada grupo representa a média de 6 – 12 animais e as barras verticais o E.P.M. Na análise

estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e ***P < 0,001 significante quando

comparado ao grupo pré-tratado com controle e antagonistas (veículo + glutamato e

naloxona + glutamato) e #P < 0,001 difere significativamente do grupo tratado com morfina +

glutamato.

5.8.3 Efeito do EHPP e da rutina sobre a nocicepção causada pela injeção

tratecal de aminoácidos excitatórios (AAE), em camundongos

e tanto o EHPP

,0 mg/kg, v.o., 1 hora antes), quanto a rutina (30 mg/kg, i.p., 30 min. antes) foram

Os dados apresentados na Figura 15 (A e B) demonstram qu

capazes de reverter de forma significativa a nocicepção causada pela administração

intratecal de glutamato (175 nmol/sítio) e NMDA (450 pmol/sítio) com inibições de 48

± 9% e de 81 ± 5%, respectivamente para o EHPP e 45 ± 13% e de 39 ± 15%,

respectivamente para a rutina. No entanto, o EHPP e a rutina não interferiram na

nocicepção induzida pelo trans-ACPD (50nmol/sítio).

Figura

nocicepção

duzida

CPD ( ou rutina

15:

Efeito antinociceptivo do EHPP (A) e da rutina (B), em relação a

pela administração intratecal de glutamato (175 nmol), NMDA (450 pmol) e trans-

50 nmol), em camundongos. Os animais foram tratados com o EHPP

100

200

Glutamato

(175nmol)

Controle

EHPP

(1,0 mg/kg, v.o.)

NMDA

(450pmol)

Veículo

(5µg/i.t)

Trans-ACPD

(50nmol)

***

Tempo de reação (

100

200

300

Controle

Rutina

(30 mg/kg, i.p.)

Veículo

(5µg/i.t)

Glutamato

(175nmol)

NMDA

(450pmol)

Trans-ACPD

(50nmol)

Tempo de reação (s)

300

(barras abertas) ou veículo (C, barras fechadas), 1h antes, v.o. ou 30 min. antes, i.p. nas

doses indicadas, respectivamente e após a nocicepção foi avaliada. Cada grupo representa

a média de 6 - 12 animais e as barras verticais o E.P.M.. Na análise estatística, foi

considerado não significante P > 0,05 e *P < 0,05, ***P < 0,001, significante quando

comparado com o grupo controle.

5.8.4 Efeito do EHPP e da rutina sobre a nocicepção causada pela injeção

tratecal de IL-1

β (1 pg) e TNF-α (0,1 pg), em camundongos

pela administração

tratecal de IL-1

β (1pg) e TNF-α (0,1pg). Tanto o EHPP (0,1 mg/kg, v.o., 1 hora

atados com o EHPP ou rutina (barras abertas) ou veículo (C, barras fechadas), 1h antes,

A Figura 16 (A e B) mostra o efeito nociceptivo induzido

antes), quanto a rutina (30 mg/kg, i.p., 30 min. antes) foram capazes de reduzir de

maneira significativa a nocicepção causada pela IL-1

β e pelo TNF-α, com inibição de

59 ± 14% e 46 ± 12%, respectivamente para o EHPP e de 87 ± 3% e de 73 ± 5%,

respectivamente para a rutina.

300

)

Cont

igura 16

: Efeito antinociceptivo do EHPP (A) e da rutina (B), em relação a nocicepção

duzida pela injeção intratecal de IL-1β e TNF-α, em camundongos. Os animais foram

100

200

role

0,1mg/kg, v.o.)

Veículo

(5µg/i.t)

IL -1β

(1pg/i.t.)

TNF-α

(0,1pg/i.t.)

Tempo de reação (s

100

200

Controle

Rutina

(30mg/kg, i.p.)

(0,1pg/i.t.)

***

(1pg/i.t.)

IL-1β

TNF- α

Veículo

(5µg/i.t)

Tempo de reação (

300

(

v.o. ou 30 min. antes, i.p. nas doses indicadas, respectivamente e após a nocicepção foi

avaliada. Cada grupo representa a média de 6 - 12 animais e as barras verticais o E.P.M..

Na análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e *P < 0,05; significante

quando comparado ao grupo controle.

5.9 Atividade antiinflamatória do EHPP

a induzido pela injeção intraplantar de

A Figura 17 demonstra que o EHPP (30 e 300 mg/kg, v.o., 1 hora antes) foi

5.9.1 Efeito do EHPP no edema de pat

carragenina, em ratos

capaz de reduzir o edema de pata causado pela administração intraplantar de

carragenina (300

µg/sítio), na segunda hora após a injeção do agente flogístico,

somente nas doses de 30 e 300 mg/kg com inibição de 43 ± 2 % e 58 ± 13 %,

respectivamente. Além disso, foi possível confirmar que a indometacina, um

antiinflamatório não esteroidal, inibidor inespecífico da cicloxigenase, reduziu quase

que totalmente o edema induzido pela carragenina.

igura 17:

Efeito do EHPP sobre o edema de pata causado pela administração intraplantar

e carragenina, em ratos. Os animais foram tratados, com indometacina ou EHPP nas doses

0 1 2 3 4

0.00

0.25

0.50

Controle

Indometacina

EHPP 30mg/kg,v.o.

EHPP 100mg/kg, v.o.

EHPP 300mg/kg, v.o.

Tempo (h)

Volume da pata (ml)

0.75

indicadas ou veículo e após 30 min e 1h respectivamente, receberam a administração

intraplantar de carragenina. O efeito antiedematogênico destas drogas, foi analisado através

da variação do volume da pata medido no pletismômetro, 1, 2, 3 e 4 hs após a administração

da carragenina. Os pontos representam a média de 8 animais e as barras verticais o E.P.M..

Na análise estatística P > 0,05, foi considerado não significante e *P < 0,05 significante,

quando comparado ao grupo controle carragenina.

5.9.2 Efeito do EHPP na pleurisia induzida pela carragenina, em camundongos

Os resultados apresentados na Figura 18 (A - D) demonstram que o

atamento dos animais com EHPP (3, 10, 30 mg/kg, v.o.) foi capaz de inibir a tr

primeira fase do processo inflamatório (4 h) da cavidade pleural induzido pela injeção

de carragenina (1%). Podemos observar que o EHPP causou uma redução da

migração celular (número de leucócitos totais) para a cavidade pleural (Figura 18 A)

com inibição de 34 ± 5% para dose de 30 mg/kg, v.o.. Esta redução foi representada

principalmente por uma diminuição na migração de neutrófilos (Figura 18 C) com

inibição de 53 ± 5% para dose de 30 mg/kg, v.o. e DI

de 13,04 (9,28-18-32) mg/kg.

Contudo, o EHPP não foi capaz de reduzir a exsudação induzida pela carragenina

(Figura 18 B) e a migração de mononucleares (Figura 18 D) para o sítio inflamatório.

x10

)

g/ml)

S CAR 3 10 30

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

EHPP (mg/kg, v.o.)

Leucócitos totais (

S CAR 3 10 30

0.0

2.5

5.0

7.5

EHPP (mg/kg, v.o.)

Azul de Evans (

S CAR 3 10 30

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

EHPP (mg/kg, v.o.)

Neutrófilos (x10

)

S CAR 3 10 30

EHPP (mg/kg, v.o.)

Mononucleares (x10

)

Figura 18: Efeito do pré-tratamento com EHPP na pleurisia induzida pela carragenina, em

camundongos. Os leucócitos totais (A); extravasamento de azul de evans (B); neutrófilos (C)

mononucleares (D) foram medidos 4 h após a administração intrapleural de carragenina na

resença e na ausência das drogas. Cada coluna representa a média de 6 - 12 animais e as

barras verticais o E.P.M.. Na análise estatística P > 0,05, foi considerado não significante, *P

< 0,05 significante quando comparado ao grupo controle tratado com carragenina (CAR) e

#P < 0,001 significante quando comparado ao grupo controle tratado com salina (S).

5.10 Atividade protetora gástrica do EHPP

5.10.1 Efeito do EHPP sobre as lesões gástricas agudas induzidas por etanol

70% em ratas

A Figura 19 (A e B) mostra a atividade protetora gástrica do EHPP,

administrado por via oral, nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg, e nas doses de 3, 10 e

30 mg/kg, por via intraperitoneal. Quando administrado por via oral, o EHPP, foi

capaz de reduzir o índice de úlceras apresentando DI

de 101,6 (78,8-130,8) mg/kg

e inibição de 97±1% na dose de 300 mg/kg. Quando administrado por via

intraperitoneal, o EHPP reduziu o índice de úlceras induzidas pelo etanol

O extrato administrado na dose de 30 mg/kg, v.o. e de 3 mg/kg, i.p. não protegeu a

mucosa.

mini ação do etanol 70%. Cada grupo representa a média de 6 animais e as barras

apresentando DI

de 13,03 (7,8 - 21,81) mg/kg e inibição de 74 ± 3%, na dose de 10

mg/kg.

Figura 19: Efeito do EHPP, sobre as lesões gástricas induzidas por etanol 70% (A e B), em

ratas. Os animais foram tratados com o extrato ou veículo, 1h antes por via oral (A) ou 30

minutos antes pela via intraperitoneal (B), nas doses indicadas e após ocorreu a

CNL CL 30 100 300

100

EHPP (mg/kg, v.o.)

Etanol 70%(0.5 mL/animal)

***

Índice de úlceras

CNL CL 3 10 30

100

***

Etanol 70%(0.5 mL/animal)

EHPP (mg/kg, i.p.)

Índice de úlceras

150

ad str

verticais o E.P.M. A barra hachurada corresponde ao grupo controle não lesado (CNL)

tratado somente com água, a barra fechada, ao grupo controle lesado (CL) tratado com o

etanol (0,5 mL/animal, v.o.) e as barras abertas correspondem aos grupos tratados com

etanol e extrato. Na análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e ***P <

0,001, significante quando comparado ao grupo controle (C).

5.10.2 Efeito de EHPP sobre a quantidade de muco da mucosa gástrica após a

indução de lesões com etanol 70%, em ratas

A Figura 20 (A e B) mostra o efeito do EHPP, administrado pela via oral ou por

via intraperitoneal, na proteção da mucosa gástrica contra o estímulo lesivo do

etanol. O EHPP, administrado por via oral, foi capaz de promover um aumento da

secreção de muco gástrico (doses de 100 e 300 mg/kg, v.o. e 10 e 30 mg/kg, i.p.),

quando comparado ao grupo controle lesado (CL), que foi somente tratado com

etanol. Nestas mesmas doses, a quantidade de muco gástrico foi restabelecida ao

nível da mucosa não lesada (CNL).

CNL CL 30 100 300

100

Etanol 70%(0.5 mL/animal)

EHPP (mg/kg, v.o.)

g de Alcian Blue/ mL/ te

CNL CL 3 10 30

100

EHPP (mg/kg, i.p.)

Etanol 70%(0.5 mL/animal)

g de Alcian Blue/ mL/ tecido

abertas) ou ve

intraperitoneal

cido

Figura 20: Efeito do tratamento dos animais com EHPP sobre as concentrações de muco da

mucosa glandular gástrica de ratas (A e B). Os animais foram tratados com o extrato (barras

ículo (CNL, barra hachurada), 1h e 30 min. antes por via oral (A) ou via

(B), nas doses indicadas e após este período estes animais e o grupo controle

lesado (CL, barra fechada) receberam por via oral etanol 70%. Cada grupo representa a

média da concentração da Alcian Blue e as barras verticais o E.P.M.. Na análise estatística,

P > 0,05 foi considerado não significante, *P < 0,05, **P < 0,01 significante quando

comparado ao grupo controle lesado (CL) e #P <0,01 significante quando comparado ao

grupo controle não lesado (CNL).

5.10.3 Influência da inibição do óxido nítrico sintase sobre a atividade protetora

ástrica do EHPP, após a indução de lesões com etanol 70%, em ratas

que o

atamento dos animais com um inibidor da óxido nítrico sintase, L-NAME (70mg/kg,

Os resultados apresentados na Figura 21 (A e B) demonstram

i.p.), foi capaz de aumentar o índice de úlceras induzidas pelo etanol 70%. No

entanto, não foi capaz de reverter a proteção gástrica (Inibição de 65 ± 7%) e a

produção de muco, induzida pelo EHPP (100 mg/kg, v.o.).

100

150

Salina

L-NAME

EHPP

Etanol

***

Índice de úlceras

100

150

200

Salina

L-NAME

EHPP

Etanol

***

g de Alcian Blue/ mL/ tecido

igura 21:

Efeito do pré-tratamento com L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e do etanol 70% sobre a

tividade protetora gástrica do EHPP (100 mg/kg, v.o.), em ratas. Os animais foram pré-

atados com L-NAME e/ou etanol, sendo após 1 h, avaliado o índice de úlceras (A) e a tr

secreção de muco gástrico (B). Cada grupo representa a média de 6 – 12 animais e as

barras verticais o E.P.M.. Na análise estatística foi considerado não significante P > 0,05;

significante **P < 0,01, ***P < 0,001, quando comparado ao grupo tratado com etanol e

#P<0,001, significante quando comparado ao grupo controle salina.

5.10.4 Efeito do EHPP sobre as lesões gástricas agudas induzidas por

dometacina, em ratas

que o tratamento com o EHPP pela via oral, nas doses de

0, 100 e 300 mg/kg, não foi capaz de reduzir significativamente o índice de úlceras

igura 22:

em ratas.

s animais foram tratados com o extrato ou veículo, 1h antes por via oral, nas doses

dicadas e após ocorreu a administração da indometacina. A barra fechada corresponde ao

A Figura 22 mostra

da mucosa gástrica, provocado pela administração subcutânea de indometacina (20

mg/kg), quando comparado ao grupo controle lesado.

Efeito do EHPP, sobre as lesões gástricas induzidas por indometacina,

CNL CL 30 100 300

***

EHPP (mg/kg, v.o.)

Indometacina, 20 mg/kg, s.c.

Índice de úlcera

grupo tratado com indometacina (CL) e as barras abertas correspondem aos grupos tratados

com indometacina e extrato. Cada grupo representa a média de 6 animais e as barras

verticais os E.P.M.. Na análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e ***P <

0,01 significante quando comparado ao grupo controle lesado (CL).

5.10.5 Avaliação da atividade anti-secretora gástrica o EHPP

l (não estimulada),

uando avaliado no modelo da ligadura pilórica, em ratas

.d.), nas doses de 30,

00 e 300 mg/kg, no momento da cirurgia da ligadura pilórica, não foi capaz de

5.10.5.1 Efeito do EHPP sobre a secreção ácida gástrica basa

O EHPP, quando administrado por via intraduodenal (i

alterar o volume, o pH e a acidez total do conteúdo gástrico secretado após 4 horas

da cirurgia, quando comparados ao controle veículo (água 0,1 mL/100g, v.o), como

apresentado na Figura 23 (A-C). Contudo a cimetidina, um antagonista de receptores

, foi capaz de aumentar o pH e reduzir a acidez e o volume da secreção ácida

gástrica.

ram tratados com o extrato no momento da cirurgia por via intraduodenal, nas doses

dicadas. A barra fechada corresponde ao grupo tratado com cimetidina, a barra hachurada,

o grupo controle (C) tratado com água e as barras abertas correspondem aos grupos

Figura 23:

Efeito do EHPP sobre a secreção ácida gástrica basal, em ratas. Os animais

C 30 100 300

0.0

2.5

5.0

Cimetidina

EHPP (mg/kg, i.d.)

Volume (mL)

C 30 100 300

Cimetidina

EHPP (mg/kg, i.d.)

C 30 100 300

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Cimetidina

EHPP (mg/kg, i.d.)

Acidez total (mEq[H

]/ml)

***

7.5

operados e tratados com o extrato. Cada grupo representa a média de 6 animais e as barras

verticais os E.P.M.. Na análise estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e ***P <

0,001, **P < 0,01, *P < 0,05 significante quando comparado ao grupo controle (C).

5.11 Avaliação da atividade do EHPP sobre as atividades gerais do trato

astrintestinal

5.11.1 Atividade do EHPP sobre o trânsito intestinal e esvaziamento gástrico

Figura 24 mostra que o tratamento com o EHPP, pela via oral, nas doses de

uando comparado aos grupos controle (C: água 0,1 mL/100g, v.o.), bem como,

ntes, nas doses indicadas. A barra fechada corresponde ao grupo controle (C) tratado com

eículo e as barras hachuradas, aos grupos controle tratados com A (atropina) e M

etoclopramida); as barras abertas correspondem aos grupos tratados com o extrato. Cada

10, 30 e 100 mg/kg, não modificou o trânsito intestinal e o esvaziamento gástric

quando comparado à atropina (A: 3 mg/kg, v.o., um antagonista muscarínico),

redutor da motilidade intestinal, ou metoclopramida (M: 30 mg/kg, v.o., agente pró-

cinético), estimulador da motilidade intestinal.

Figura 24:

Efeito do EHPP, sobre o trânsito intestinal (A) e esvaziamento gástrico (B), em

camundongos. Os animais foram tratados com o extrato, atropina e metoclopramida 1h

EHPP (mg/kg, v.o.)

(3 mg/kg, v.o.) (30 mg/kg, v.o.)

10030

Distância de verm

fenol (%)

EHPP (mg/kg, v.o.)

10030

(3 mg/kg, v.o.) (30 mg/kg, v.o.)

Esvasiamento gástr

elho de

100

ico (

grupo representa a média de 8 animais e as barras verticais os E.P.M.. Na análise

estatística, foi considerado não significante P > 0,05 e *P < 0,05, **P < 0,01 significante

quando comparado ao grupo controle (C).

6 DISCUSSÃO

Embora a fitoterapia já agregue um contingente apreciável de trabalhos

realizados e publicados, constitui, ainda, um vasto campo para pesquisa.

Nos últimos dez anos, o número de publicações científicas, nos países latino-

americanos, aumentou muito (CALIXTO, 2005). O interesse pela fitomedicina

cresceu e está crescendo, devido à busca de novas alternativas terapêuticas para o

tratamento de diversas doenças cujos cuidados baseiam-se no uso de

medicamentos que apresentam uma série de efeitos colaterais e muitas vezes

aliviam parcialmente os sintomas sem tratar a doença (ALICE

et al., 1995).

Dessa forma, o potencial natural encontrado nos países latino-americanos,

principalmente no Brasil, aliado à diversidade de compostos bioativos encontrados,

especialmente nas plantas superiores, têm atraído a atenção da comunidade

científica e das indústrias farmacêuticas que apostam na produção de fitoterápicos

como um negócio lucrativo, uma vez que a utilização de plantas medicinais atinge

um público cada vez maior (CALIXTO, 2005).

O aumento do emprego dos produtos naturais traz consigo o uso

indiscriminado de plantas sem qualquer conhecimento fitoquímico, farmacológico e

toxicológico, o que é fato preocupante e também chama a atenção dos

pesquisadores, uma vez que isto está acontecendo com a maioria das espécies

vegetais consumidas pela população, em todo país (ALICE

et al, 1995).

Entre as várias espécies utilizadas pela população estão as plantas do gênero

Polygala que são amplamente distribuídas no litoral brasileiro, sendo encontradas

principalmente em zonas costeiras de solos arenosos, da Bahia ao Rio Grande do

Sul. Inúmeros representantes do gênero Polygala contêm altas concentrações de

salicilato de metila, que confere odor característico em suas raízes (WASICKY,

1945). Nos estados acima da Bahia, são conhecidas popularmente pelo nome de

erva-iodex e seu extrato alcoólico é usado, na forma de aplicações locais, em

entorces, machucados ou artropatias crônicas (LORENZI e MATOS, 2002).

Nas regiões costeiras do sul e sudeste, principalmente no estado de Santa

encontradas diversas espécies de plantas que pertencem ao gênero

Polyga

nnett e P.

l que é

003) demonstraram que as frações

quando

administrado pela via oral, reduziu de maneira dependente da dose o número de

Catarina, são

la, incluindo P. cyparissias St. Hillaire & Moquin, P. linoides var. ambiqua

Felipp & Beauverd,

P. campestris G., P. aspalata L., P. sabulosa A. W. Be

paniculata

L. (MEOTTI et al., 2006).

Entre estas espécies, a

P. paniculata, vem sendo utilizada por longa data pela

população e é conhecida popularmente como barba-de-são-joão, barba-de-são-

pedro, bromil, arrozinho, alecrim-de-santa-catarina, vassourinha branca. Análises

fitoquímicas têm revelado em sua composição a presença de várias cumarinas,

flavonóides e xantonas (CRISTIANO, 2003), além de um óleo essencia

utilizado para o tratamento da asma, bronquite crônica e doenças relacionadas. Esta

planta também é usada para dor de estômago, diarréia, nefropatias e em acidentes

ofídicos (LORENZI e MATOS, 2002). Apesar do seu grande uso, a eficácia e a

segurança de suas preparações não foram, comprovadas cientificamente.

P. paniculata vem sendo recentemente pesquisada. Estudos anteriores

realizados por Pizzolatti e colaboradores (2

diclorometano e hexanólica do extrato bruto da

P. paniculata apresentaram atividade

tripanossomicida contra a forma epimastigota do parasita

Trypanossoma cruzi. Outro

trabalho, conduzido por Farina e colaboradores (2005) constatou importante

atividade neuroprotetora e antioxidante do extrato bruto hidroalcoólico da

paniculata

, em relação a neurotoxicidade induzida pelo metilmercúrio.

Estes trabalhos mostram claramente o potencial farmacológico da

paniculata

. Adicionalmente, o presente estudo, baseando-se nas indicações

populares, mostrou pela primeira vez, quando administrado sistemicamente, que o

EHPP apresentou significativa atividade antinociceptiva em diferentes modelos de

nocicepção química, em camundongos. Além disso, foi demonstrado que o extrato

apresentou atividade antiinflamatória parcial e importante atividade protetora

gástrica, em modelos de indução aguda de lesões gástricas.

Os dados mais relevantes deste trabalho foram: (1) o EHPP,

contorções abdominais induzida pelo ácido acético e a nocicepção induzida pela

injeção intraplantar de formalina, capsaicina e glutamato, sendo que, nesse último

modelo, o efeito permaneceu significativo até a oitava hora; (2) a ação

antinociceptiva do EHPP, não foi revertida pelo pré-tratamento dos animais com L-

arginina e naloxona; (3) os compostos isolados, principalmente a rutina,

aprese

ção está

relacio

o teste das

contor

os em camundongos e

ratos,

ntaram atividade antinociceptiva no modelo de nocicepção química induzido

pela injeção intraplantar de glutamato; (4) quando administrados sistemicamente o

EHPP e a rutina (i.p.) reduziram de maneira significativa a nocicepção induzida pela

injeção intratecal de AAE (glutamato, NMDA) e de citocinas pró-inflamatórias (TNF-

α e IL-1β); (5) o EHPP apresentou efeito antiinflamatório parcial nos modelo do

edema de pata em ratos e de pleurisia em camundongos; (6) o EHPP também

apresentou atividade protetora gástrica, reduzindo o índice de úlceras na mucosa

causado pela administração oral de etanol 70%. Neste modelo, o EHPP foi

administrado pelas vias oral e intraperitoneal, sendo que esta prote

nada ao aumento da produção de muco gástrico.

Atualmente, o interesse para o uso clínico de novas substâncias com atividade

analgésicas, utilizadas principalmente para o tratamento de vários tipos de dor (tanto

de origem neurogência quanto inflamatória), vem aumentando significativamente.

Vários modelos de nocicepção em animais de laboratório foram desenvolvidos para

verificar a atividade analgésica de extratos e compostos.

Entre os modelos de nocicepção utilizados neste trabalho,

ções abdominais, induzidas pelo ácido acético, é descrito como um típico

modelo para avaliar a dor de origem inflamatória, pouco específico, mas com boa

sensibilidade, sendo uma ferramenta de triagem para avaliação da atividade

analgésica e antiinflamatória de novos agentes (IKEDA

et al., 2001; LE BARS et al.,

2001).

Neste modelo, a administração de um agente irritante para membrana serosa,

como o ácido acético, provoca comportamentos estereotipad

que são caracterizados por contorções abdominais, redução e incoordenação

da atividade motora. Estes comportamentos são considerados reflexos e evidenciam

a dor visceral (LE BARS

et al., 2001).

Através da realização deste teste, foi possível observar que a administração

sistêmica, v.o. do EHPP reverteu, de maneira dependente da dose, o número de

contorções abdominais produzidas pela injeção i.p. de ácido acético em

camundongos. A irritação local, provocada pela administração deste agente na

cavidade intraperitoneal desencadeia a liberação de vários mediadores como a

bradicinina, substância P e prostaglandinas, principalmente a PGI

, bem como

algumas citocinas como IL-1

β, TNFα e IL-8 (CORREA et al., 1996; RIBEIRO et al.,

2000; IKEDA

et al., 2001). Estes mediadores ativam nociceptores quimiosensíveis

que contribuem com o desenvolvimento da dor de origem inflamatória. Dessa forma,

o resultado obtido neste trabalho sugere que o efeito antinociceptivo do EHPP pode

estar relacionado à inibição da liberação de mediadores pró-inflamatórios, induzida

pelo ácido acético.

Os resultados obtidos no presente estudo também demonstraram que o EHPP

não a

nocicepção induzida pela

formal

fase inicial é caracterizada pela dor de origem neurogênica causada pela

inflamação nos tecidos periféricos e mecanismos de sensibilização espinhal e central

presentou qualquer interferência sobre a atividade locomotora, causando

incoodernação motora ou ainda efeitos relaxantes sobre a musculatura, assegurando

que o efeito antinociceptivo observado não está relacionado a um destes efeitos

inespecíficos.

Outro modelo empregado neste trabalho foi o de

ina. Este modelo consiste na injeção intraplantar ou subcutânea desta

substância. A resposta provocada pela formalina constitui-se duas fases de

nocicepção: uma fase inicial e uma tardia, que parecem envolver mediadores

químicos diferentes (TJOLSEN e HOLE, 1997; SANTOS

et al., 1999; VANEGAS e

SCHAIBLE, 2004).

estimulação química direta dos nociceptores das fibras sensoriais aferentes,

principalmente fibras do tipo C. A fase tardia é representada pela dor de origem

inflamatória que é desencadeada por uma combinação de estímulos que incluem

(TJØSEN et al., 1992; TJØLSEN e HOLE, 1997). Vários trabalhos têm

demonstrado que a administração intraplantar de formalina em roedores produz

TOS e CALIXTO, 1997; SANTOS

et al., 1999; VANEGAS e

formalina (dado não apresentado). Este resultado nos sugere que o

istração intraplantar de capsaicina em camundongos. Os dados

significativo aumento dos níveis espinhais de diferentes mediadores como

aminoácidos excitatórios, neuropeptídeos, PGE

, óxido nítrico e cininas (MALMBERG

e YARSH, 1995; SANTOS e CALIXTO, 1997; SANTOS

et al., 1998; OMOTE et al.,

1998).

Com os resultados obtidos neste trabalho foi possível mostrar que o EHPP foi

capaz de reduzir de forma significativa tanto a fase inicial, quanto a fase tardia da

resposta à formalina, onde o extrato apresentou seu efeito mais pronunciado. Estes

dados reforçam os indícios de que a planta em questão possui um importante efeito

antinociceptivo e antiinflamatório, pois é nesta fase que ocorre a liberação de

mediadores pró-inflamatórios, ocorrendo a ativação de neurônios aferentes

sensibilizados, devido à liberação anterior de mediadores neuroativos (TJOLSEN e

HOLE, 1997; SAN

SCHAIBLE, 2004).

Apesar de ser mais efetivo na fase tardia da nocicepção evocada pela injeção

de formalina, onde ocorre a inflamação dos tecido periféricos e sensibilização central,

o EHPP não foi capaz de reduzir, o edema de pata causado pela administração

intraplantar de

extrato não interfere na liberação periférica de mediadores pró-inflamatórios como a

histamina, bradicinina, leucotrienos, substância P e PAF, que contribuem com a

formação do edema, mas sim, seu efeito pode estar relacionado a uma ação

inibitória sobre a condução nociceptiva espinhal ou central.

O efeito EHPP também foi avaliado no modelo de nocicepção neurogênica,

induzida pela admin

apresentados neste trabalho indicam que o EHPP, administrado por v.o., foi capaz

de reduzir a nocicepção causada pela capsaicina de maneira significativa sendo, no

entanto menos efetivo, se comparado aos outros modelos de nocicepção, visto que o

extrato foi efetivo em reduzir a nocicepção somente na dose de 1,0 mg/kg.

A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) é o componente ativo

encontrado em pimentas vermelhas, sendo uma valiosa ferramenta farmacológica

para o estudo de drogas que atuam modulando a transmissão nociceptiva em

mamíferos através dos neurônios sensoriais primários do tipo C e A

δ (HOLZER,

1991; JANCSO, 1992).

Sua ação irritante e neurotóxica promove, quando administrada por via

992; SAKURADA et al., 1996).

1997; CARLTON, 2001;

em oito

subtipos, todos acoplados à proteína G (GAVIRAGHI, 2000). De maneira geral, a

intraplantar, reação dolorosa caracterizada por mordidas e lambidas na pata (JULIUS

e BASBAUM, 2001; LE BARS

et al., 2001). Estudos demonstraram que o estímulo

nociceptivo causado pela capsaicina é mediado pela ativação do receptor vaniloíde

(TRPV1), um canal iônico não seletivo encontrado nas fibras sensoriais de pequeno

diâmetro presentes nas raízes do corno dorsal e no gânglio trigêmeo (CATERINA

al.

, 1997). Estudos indicam que quando administrada, a capsaicina promove

liberação periférica de vários mediadores, aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e

taquicininas que contribuem com a transmissão da informação nociceptiva

(SAKURADA

et al., 1

Está bem estabelecido que os aminoácidos excitatórios, principalmente o

glutamato, é o neurotransmissor encontrado na maioria das sinapses excitatórias

rápidas no sistema nervoso de mamíferos e está envolvido em processos fisiológicos

(memória e aprendizado) e em algumas patologias (neurodegeneração crônica e

aguda) (GAVIRAGI, 2000). Além disso, está bem descrito na literatura que o

glutamato exerce um papel crítico no processo de transmissão da dor até estruturas

supraespinhais, sendo liberado na medula espinhal, após lesão tecidual ou em

processos inflamatórios (ZHOU

et al., 1996; DICKENSON,

BEIRITH

et al., 2003).

Os receptores glutamatérgicos são categorizados em dois grupos distintos: os

ionotrópicos e os metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos são classificados em

três subtipos de acordo com sua permeabilidade a íons e o tipo de ligante, sendo

denominados N-metil-D-aspartato (NMDA),

α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-

isoxazolepropionato (AMPA) e cainato. Os metabotrópicos são divididos

ativaçã

apresentam importante efeito antinociceptivo em diferentes

espéc

mbém demonstraram que o efeito antinociceptivo do extrato

pode

o de todos os tipos de receptores sensíveis ao glutamato participam na

indução, modulação ou manutenção da dor (BEIRITH

et al., 2003).

Em concordância com essas afirmações, dados da literatura demonstram que

substâncias capazes de bloquear os receptores glutamatérgicos tanto ionotrópicos

quanto metabotrópicos,

ies de mamíferos, inclusive em humanos (LUTFY

et al., 1997; NEUGEBAUER,

2002; WIECH

et al., 2004).

Em um estudo, Beirith e colaboradores, em 2002 e 2003, demonstraram que o

glutamato quando administrado por via intraplantar em roedores, desencadeia um

comportamento nociceptivo rápido e de curta duração, associado à formação de

edema de pata, que é desencadeado de maneira dependente da dose administrada

de glutamato. A resposta nociceptiva estava fortemente relacionada à ativação de

receptores NMDA e não-NMDA (AMPA, cainato e metabotrópico). O edema pareceu

ser mediado principalmente por receptores glutamatérgicos do tipo não–NMDA, pelo

NO e taquicininas.

Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que o EHPP,

administrado por v.o., apresentou importante atividade antinociceptiva no modelo do

glutamato, apesar disso, não foi capaz de reduzir o edema de pata provocado pela

administração deste agente (resultado não apresentado).

Foi observado ainda que o EHPP, administrado por v.o., quando avaliado no

teste do glutamato, produziu um significativo efeito antinociceptivo que se manteve

por 8 horas e foi mais pronunciado da primeira a quarta hora. Estes dados foram

utilizados como referencial para os demais tratamentos.

Nossos dados ta

ser explicado, em parte, por uma possível interação de um ou mais

componentes do extrato com receptores glutamatérgicos em nível periférico ou

central, porém esta interação não estaria interferindo com a liberação dos

mediadores envolvidos na formação do edema como as taquicininas e NO.

Com o objetivo de avaliar mais detalhadamente o efeito do EHPP, no modelo

do glutamato, alguns compostos isolados da

P. paniculata foram também avaliados,

neste

alizados com outras espécies do gênero, demonstraram

que a

s isolados, foram obtidos

import

ministrada i.p., foi capaz de

reverte

nto pela

administração i.t. de glutamato (agonista glutamatérgicos) quanto pela administração

mesmo modelo.

De acordo com análises fitoquímicas, vários compostos com atividade

biológica, como xantonas, cumarinas, flavonóides e esteróis estão presentes na

planta em estudo.

Estudos anteriores, re

cumarina isolada da

Polygala. sabulosa A. W. Bennett apresentou uma

importante atividade antinociceptiva no modelo de nocicepção química induzida pelo

ácido acético (MEOTTI

et al., 2006). Um outro trabalho indicou que as xantonas

isoladas da

Polygala. cyparissias St. Hillaire & Moquin além de demostrarem

importante atividade antinociceptiva em modelos de nocicepção química e mecânica,

apresentaram importante atividade antiespasmódica em um modelo

in vitro,

utilizando traquéia de cobaia sensibilizada por ovalbumina (CAMPOS

et al., 1997; El

SAYAH

et al., 1999)

Dos compostos já identificados e isolados apartir da

P. paniculata, duas

cumarinas; febalosina e o aurapten, bem como, um flavonóide; a rutina, são

encontrados em maior quantidade.

Avaliando a atividade antinociceptiva dos composto

antes resultados. Tanto a febalosina, como o aurapten foram administrados

sistemicamente por via i.p.e reduziram de forma significativa a nocicepção induzida

pela injeção intraplantar de glutamato, porém somente em uma dose (10 e 100

mg/kg, respectivamente). Em contrapartida, a rutina, ad

r a nocicepção induzida pelo glutamato significativamente e de forma dose-

dependente, caracterizando-se por ser o composto que apresentou a melhor

atividade.

Os resultados do presente trabalho demonstraram também que tanto o EHPP

como a rutina reduziram, de maneira significativa, a nocicepção causada ta

i.t. de

intratecal de AAE desencadeia comportamentos nociceptivos

espon

ERRE, 2003).

ta a injeção intraplantar de formalina, capsaicina ou substância

P, ou a

duziram a nocicepção causada pela injeção

associadas a neuropatias, crescimento tumoral e doenças inflamatórias

ponto final da cascata resulta na ativação da cicloxigenanse-2 (COX-2) (SOMMER e

NMDA (agonista dos receptores ionotrópicos tipo NMDA), sem interferir na

nocicepção promovida pelo trans-ACPD.

A administração

tâneos como elevação da cauda, mordidas, lambidas dos membros posteriores

(contato do focinho do animal com o membro) e elevação de uma das patas traseiras

(OSBORNE e COD

Os resultados obtidos neste teste sugerem que o efeito antinociceptivo obtido

no modelo da administração intraplantar e intratecal do glutamato seja em parte

devido à interação de um ou mais compostos, presentes no EHPP, além da rutina,

com receptores glutamatérgicos ionotrópicos sensíveis ao NMDA.

Estes dados também sugerem que este mecanismo pode ainda estar

envolvido indiretamente no efeito antinociceptivo do EHPP em outros modelos de

nocicepção realizados neste trabalho, como o da formalina e capsaicina, visto que

estudos evidenciam que aminoácidos excitatórios são liberados na medula espinhal

ou na pata em respos

inda em processos inflamatórios (BEIRITH

et al., 2002).

Este trabalho também demonstrou que o EHPP administrado por v.o. e a

rutina administrado por via i.p. re

intratecal das citocinas pró-inflamatórias IL-1

β e TNF-α. A administração intratecal

de IL-1

β e TNF-α desencadeia movimentos nociceptivos espontâneos como os

provocados pela administração intratecal de AAE.

Citocinas como IL-1

β e TNF-α participam ativamente de processos

inflamatórios e da transmissão nociceptiva (IKEDA

et al., 2001; ITO et al., 2001;

VANEGAS e SCHAIBLE, 2001).

A citocina inflamatória IL-1

β é produzida e secretada sobre condições

patológicas

crônicas como artrite reumatóide (SOMMER e KRESS, 2004).

O TNF-

α é considerado uma citocina inflamatória primária, devido seu papel

de iniciar a cascata de ativação de outras citocinas (IL-1

β, IL-6 e IL-8), sendo que o

KRESS, 2004). A IL-1β e o TNF-α são produzidas e liberadas durante a inflamação

periférica e também, nas mesmas condições, são liberados por células presentes no

balho, realizado por Kleinschnitz e colaboradores

ndire mente com

esar da rutina ser o composto em

. A atividade do extrato pode ainda ser atribuída a

s não publicados).

SNC, como células de Schwann, mononucleares (SOMMER e KRESS, 2004;

KLEINSCHNITZ

et al., 2004) e pela glia (VITKOVIC et al., 2000; WIESELER-FRANK

et al., 2004).

Além disso, um recente tra

(2004), demonstrou que os receptores glutamatérgicos NMDA modulam a expressão

de citocinas inflamatórias, como a IL-1

β e o TNF-α em modelos de lesão de nervo

periférico, em camundongos. Este resultado nos fornece subsídios, indicando que o

extrato e o composto isolado, possam estar interferindo direta ou i ta

a ação de citocinas, ou ainda estar inibindo a resposta nociceptiva desencadeada

pela IL-1

β e TNF-α, atuando em receptores glutamatérgicos ionotrópicos tipo NMDA.

Os dados apresentados neste trabalho ainda indicam grandes diferenças em

relação à atividade antinociceptiva apresentada pela rutina e pelo EHPP. O extrato

foi cerca de 300 vezes mais potente em inibir a nocicepção causada pela

administração intratecal de IL-1

β e TNF-α, respectivamente.

Outro dado de igual importância nos mostra que o EHPP ainda foi cerca de 30 vezes

mais potente e cerca 2,2 vezes mais eficaz (em termos de inibição máxima) em

reduzir a nocicepção causada pela administração intratecal de glutamato e NMDA,

em comparação à rutina.

Estes resultados, por tanto, indicam que ap

maior quantidade no EHPP, o efeito antinociceptivo, demonstrado pelo extrato, deva

estar relacionado à presença de outros compostos encontrados em menor

quantidade, porém mais potentes

ação sinérgica de vários compostos, estando entre eles a rutina, visto que estudos

fitoquímicos realizados com o EHPP apontam a presença de cinco compostos

desconhecidos, além daqueles já identificados e isolados (dado

Nossos dados também demonstram que a via da L-arginina-óxido nítrico não

está envolvida no efeito antinociceptivo do EHPP, uma vez que a L-arginina não foi

capaz de reverter o efeito antinociceptivo do extrato, quando administrado

sistemicamente.

Está bem descrito que a via da L-arginina – óxido nítrico, também exerce um

papel importante na modulação na nocicepção, uma vez que a ativação de

receptores glutamatérgicos, especialmente o NMDA, pode estimular a atividade de

ento do sistema opióide

reconhecidos por algum tempo. Em adição, os receptores

nocice

transmissão.

enzimas intracelulares como a óxido nítrico sintase (NOS) através do aumento de

cálcio intracelular e a produção de uma variedade de segundos mensageiros, como o

óxido nítrico (NO), relacionados com a transmissão e perpetuação da condução

dolorosa (BEIRITH

et al., 2002).

Em nossos experimentos ainda foi possível constatar como descrito na

literatura que a L-N

-nitro-arginina (L-NOARG - inibidor da óxido nítrico sintase),

quando administrado por via intraperitoneal, reduziu marcadamente a nocicepção

induzida pela administração intraplantar de glutamato. Este efeito da L-NOARG foi

totalmente revertido, com a injeção sistêmica por via i.p., da L-arginina, substrato da

NOS.

Outro mecanismo de ação investigado foi o envolvim

na atividade antinociceptiva do EHPP.

Os efeitos centrais dos opióides na transmissão da dor, por interação com

seus receptores (

µ, κ e δ), no corno dorsal da medula espinhal e regiões

supraespinhais, têm sido

opióides estão presentes também nos terminais periféricos das fibras aferentes

sensoriais (SAWYNOK, 2003).

Inúmeros estudos comportamentais têm sido utilizados para examinar os

efeitos antinociceptivos dos opióides exógenos, como a morfina e também de

extratos obtidos a partir de plantas medicinais.

Dentro deste contexto, este trabalho também demonstrou que quando

administrada por via subcutânea, a morfina foi capaz de reverter totalmente

pção causada pela administração intraplantar de glutamato. Este efeito se

deve a sua ligação a receptores opióides localizados em vários níveis de

Durante nossos experimentos, também foi observado que a naloxona, um

antagonista não específico de receptores opióides, reduziu significativamente a

flick.

lares que controlam os movimentos da cauda (DOUGLASS e CARSTENS,

1997).

motores (DOUGLASS e CARSTENS, 1997).

Do po

97).

emprego popular da

P. paniculata,

usada

crito que as cumarinas e flavóides como a rutina, encontradas em

nocicepção causada pela morfina, contudo, não reverteu a nocicepção promovida

pelo EHPP.

Estes resultados sugerem que a atividade antinociceptiva do EHPP parece

não estar envolvida com o sistema opióide. Esta hipótese pode ser reforçada pelo

fato do extrato apresentar pouca atividade, na primeira fase (dor neurogênica) da

nocicepção induzida pela formalina e por não interferir com a latência ao estímulo

térmico nocivo, no modelo do

tail

O modelo da elevação da cauda (

tail flick) consiste na aplicação térmica de

uma fonte radiante de calor, como estímulo nociceptivo na cauda do animal

provocando um rápido movimento de retirada da cauda (D`AMOUR e SMITH, 1941;

SMITH

et al., 1943). Este movimento pode ser caracterizado como um reflexo

organizado que usualmente envolve neurônios motores que inervam os três grupos

muscu

Este estímulo também desencadeia a ativação de interneurônios nociceptivos

que fazem conexões com os neurônios

nto de vista farmacológico, este método é eficiente para verificar a atividade

analgésica de substâncias com características semelhantes aos opióides (Le BARS

et al., 2001), uma vez que a morfina, administrada sistemicamente, foi capaz de

suprimir respostas de neurônios espinhais ao estímulo térmico nocivo da cauda

(DOUGLASS e CARSTENS, 19

Os resultados obtidos neste trabalho estendem os dados descritos na

literatura, mostrando claramente que o EHPP apresenta importante atividade

antinociceptiva. Além disso, tendo como base o

muitas vezes em lesões como entorces, machucados e processos

inflamatórios crônicos como artrite e artrose, a atividade antinflamatória do EHPP foi

verificada.

Em adição, vários dados encontrados na literatura reforçam esta hipótese.

Está bem des

muitas

sente trabalho podemos constatar que o EHPP apresentou importante

ativida

tes como os prostanóides, histamina e serotonina (DE BRITO, 1989),

plantas medicinais, apresentam grande atividade antioxidante e

antiinflamatória (SELLOUM

et al., 2003; De SOUZA e De GIOVANI, 2004; KIM et al.,

2005; BAJPAI et al., 2005; MICELI et al., 2005; ALIA et al., 2006).

No pre

de antiinflamatória quando analisada no modelo de pleurisia induzida pela

administração intrapleural de carragenina reduzindo, de forma dose dependente a

migração celular de neutrófilos para a cavidade pleural. O EHPP também foi capaz

de reduzir de maneira significativa o edema de pata causado pela administração

intraplantar de carragenina.

Trabalhos descritos anteriormente (HENRIQUES

et al., 1990; HENRIQUES,

1993), demonstraram que a administração de carragenina na cavidade pleural de

camundongos induz uma resposta inflamatória, bifásica, com aumento significativo

tanto do número total de células quanto da exsudação. Dessa forma, foi determinado

que este padrão de resposta é representado por duas fases, sendo uma precoce

(primeira fase) e a outra tardia (segunda fase) da resposta inflamatória induzida pela

carragenina em camundongos. Além disso, foi observado que a administração de

carragenina na cavidade pleural promoveu um aumento gradual do número total de

leucócitos, principalmente de neutrófilos, cujo pico foi em torno de 4 h seguido do

decréscimo por volta de 5 h, retornando aos valores basais dentro de 24 h.

Paralelamente, também foi observado um aumento da exsudação, avaliada

pelo extravasamento de azul de evans na cavidade pleural, com picos entre 4 e 5 h

da indução da pleurisia.

Deste modo, a carragenina tem sido o agente irritante mais utilizado para o

estudo do processo inflamatório na cavidade pleural, principalmente por induzir

intensa reação inflamatória (DE BRITO, 1989). Alguns estudos mostram que a

resposta inflamatória induzida pela carragenina é, em parte mediada pela bradicinina

(SALEH

et al., 1997), sendo que a carragenina também promove a liberação de

outros agen

observando-se que a liberação da bradicinina pode estar ligada com um processo

proteolítico produzido pela própria carragenina (DI ROSA e SORRENTINO, 1968).

Os nossos resultados mostram que o EHPP foi capaz de inibir de forma

significativa e dependente da dose, porém parcial, o influxo de leucócitos (migração),

principalmente de neutrófilos, para a cavidade pleural, sem interferir na exsudação.

e teste para pesquisa de drogas antiinflamatórias

(CRUN

mente o

edema

o não esteroidal aboliu quase totalmente o edema. Este

dado

Dessa forma, o dado do presente trabalho sugere que um ou mais

componentes do extrato estejam promovendo o efeito observado, principalmente por

interferir na atividade dos mediadores pró-inflamatórios principalmente ligados à

migração celular.

O modelo de inflamação, induzido pela injeção intraplantar de carragenina, é

considerado um important

KHORN e MEACOCK, 1971; HENRIQUES

et al., 1987). A administração de

carragenina na pata promove intensa vasodilação e extravasamento plasmático

mediados pela liberação de substâncias como cininas, taquicininas, óxido nítrico,

prostanóides, bem como a liberação de serotonina e histamina apartir de mastócitos

(CRUNKHORN e MEACOCK, 1971; ALVES

et al., 1999). Além de desencadearem a

formação do edema, estes mediadores contribuem fortemente com a migração

celular, principalmente de neutrófilos para o sítio inflamatório, como demonstrado por

Henriques e colaboradores (1987) através da análise histológica da região subplantar

da pata, realizado 4 horas após a administração de carragenina.

Nossos resultados demonstraram que o EHPP reduziu significativa

de pata induzido pela administração intraplantar de carragenina em ratos.

Além disso, foi possível demonstrar que o pré-tratamento com indometacina, um

conhecido antiinflamatóri

está de acordo com o descrito na literatura que descrevem tanto a

indometacina, quanto a dexametasona (um antiinflamatório esteroidal), como drogas

antiinflamatórias com importante efeito antiedematogênico no modelo do edema de

pata induzido pela carragenina (HENRIQUES

et al., 1987).

Em adição, o efeito antiinflamatório parcial do EHPP neste modelo, pode ser

atribuído à ação de um ou vários compostos presentes no extrato entre eles a rutina.

Um trabalho realizado por Selloum e colaboradores (2003), indicou que o rutina,

quando administrado por v.o., reduziu o edema de pata e a migração celular d

neutró

Dessa

r utilizada como antiinflamatória e analgésica, a

P. paniculata

dade intestinal, quando

filos, a partir da segunda hora, após a administração de carragenina. Também

foi demonstrado que a rutina apresenta um potente efeito inibitório sobre o burst

respiratório de neutrófilos estimulado pela f-Met-Leu-Phe (SELLOUM et al., 2003

forma, os resultados obtidos no presente estudo vão de encontro aos

descritos na literatura e indicam que a atividade antiinflamatória do EHPP, observada

no modelo do edema de pata e pleurisia, pode ser em parte atribuída à rutina.

Além de se

também apresenta indicação popular para “problemas gástricos”. Em adição, muitas

das etapas dos processos de gastrite e úlcera envolvem componentes relacionados

à dor e inflamação. Desta forma, a presença da ação protetora gástrica foi

investigada.

Os resultado obtidos neste estudo mostraram pela primeira vez que o EHPP

administrado sistemicamente por via oral foi capaz de proteger a mucosa gástrica

contra lesões induzidas pelo etanol 70%.

Está bem descrito que o etanol exerce sua ação lesiva através da agressão física da

mucosa, causada pelo seu efeito direto sobre a mesma, caracterizando-se por

esfoliação, erosão do epitélio, lesão vascular da mucosa e necrose celular (SZABO

et al., 1985).

Em adição, o EHPP quando administrado por via intraperitoneal, também

apresentou importante efeito citoprotetor. Este dado é de grande importância, pois

tendo ele como base, pode-se descartar a possibilidade do efeito observado quando

o EHPP foi administrado por via oral, ter ocorrido devido à aderência do extrato na

mucosa, formando uma barreira protetora à ação do etanol.

Uma das indicações populares da

P. paniculata é seu uso como anti-diarreico.

Esta indicação não foi confirmada, uma vez que os resultados do presente trabalho

mostraram que o EHPP não alterou o trânsito e motili

comparado aos controles atropina e metoclopramida. Está bem estabelecido que

tanto a metoclopramida (um importante antiemético e pró-cinético) como a atropina

(um antagonista muscarínico – redutor da motilidade intestinal) apresentam

importante aplicação na medicina clínica e em modelos experimentais

(SCARPIGNATO, 1990; VAN HOOGMOED, 2003; BURGER

et al., 2006).

Nossos resultados também demonstraram que o efeito protetor exercido pelo

EHPP, sobre as lesões agudas induzidas pelo etanol, está relacionado ao aumento

da produção de muco gástrico. Este efeito foi observado quando o extrato foi

administrado tanto por via oral como por via intraperitoneal, sendo que por esta via

de ser estimulada por muitos mediadores, entre eles fatores do

tiinflamatório não esteroidal indometacina,

io não esteroidal, foi capaz de lesionar a mucosa gástrica,

gástrica, por estarem

foi 10 vezes mais potente em relação ao aumento da produção de muco.

O muco é um dos principais fatores de defesa da mucosa contra agentes

agressivos. Serve como uma barreira física sobre a mucosa e é continuamente

secretado por células epiteliais (MÒZSIK

et al., 1997; BI e KAUNITZ, 2003). Sua

produção po

crescimento, acetilcolina, óxido nítrico e prostaglandinas (ICHIKAWA

et al., 2000).

O presente estudo também mostrou que o EHPP não foi capaz de proteger a

mucosa contra as lesões induzidas pelo an

sugerindo que neste extrato não estão presentes ou não estão em concentração

suficiente, compostos que exercem interação com a síntese de prostanóides.

Também foi possível observar em nosso estudo que a indometacina, um

antiinflamatór

caracterizando-se como uma importante ferramenta experimental. Esta atividade já

se encontra bem descrita na literatura, uma vez que a interferência com a atividade

da COX promove a inibição da produção de prostaglandinas. Além do seu papel

como importante mediador na dor e na inflamação, as prostaglandinas exercem um

papel fisiológico primordial na manutenção da integridade

envolvidas com a produção do muco protetor do epitélio gástrico e bicarbonato

(FIORUCCI

et al., 2003; SAWYNOK, 2003; WHITLLE, 2004).

Os principais fármacos capazes de proteger a mucosa gástrica,

comercializados atualmente (cimetidina, ranitidina e omeprazol) apesar de atuarem

por vias diferentes (receptores H

e H

-K

-ATPase), reduzem a secreção ácida

gástrica. Para verificar se o efeito citoprotetor do EHPP, observado no modelo do

etanol, estava relacionado, pelo menos em parte, a um mecanismo de redução da

secreção de ácido, realizou-se o modelo da cirurgia da ligadura do piloro.

contra

uda e

com a finalidade de

O extrato testado nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg não foi capaz de alterar

nem a quantidade nem a acidez da secreção ácida gástrica, durante as quatro horas

em que os animais estavam com o piloro ligado. Foi possível sugerir então que não é

através da diminuição da secreção gástrica que o EHPP exerce sua atividade

citoprotetora.

Os resultados obtidos até o momento sugerem que o EHPP pode estar

exercendo algum mecanismo de citoproteção, envolvido com a manutenção dos

níveis de muco, que talvez não esteja relacionado ação das prostaglandinas.

McNaughton e colaboradores (1989) mostraram que o óxido nítrico (NO), bem

como agentes liberadores de óxido nítrico, protegem significantemente a mucos

lesões induzidas pelo etanol, sendo que esta ação não foi alterada pelo pré-

tratamento com indometacina, sugerindo mecanismos diferentes daqueles que

envolvem prostaglandinas.

Atualmente, sabe-se, através de experimentos realizados por Mas

colaboradores (1995), que a supressão da síntese do óxido nítrico promove

diminuição do fluxo sangüíneo da mucosa, indicando que o NO diminui a lesão

causada pelo etanol através da regulação da microcirculação da mucosa. Em adição,

o efeito protetor do NO inclui aumento da secreção de muco, observando-se que a

óxido nítrico sintase (NOS) está presente em células epiteliais secretoras de muco.

Além disso, dados experimentais indicam também que doadores de NO e análogos

do GMPc estimulam a secreção de muco

in vivo e in vitro (BROWN et al., 1992;

BROWN et al., 1993)

Baseando-se nestes dados, experimentos adicionais

averiguar o envolvimento do óxido nítrico no mecanismo de proteção gástrica do

EHPP, foram realizados. Contudo, através dos resultados obtidos foi possível

observar que o pré-tratamento dos animais com L-NAME não foi capaz de reverter a

citoproteção e a produção de muco promovida pela administração oral do extrato,

sugerindo que provavelmente o NO, não esteja relacionado ao efeito protetor do

extrato.

De acordo com os resultados obtidos nesta série de experimentos realizados

para verificar a atividade protetora do EHPP, é possível somente afirmar que: (1) o

extrato apresenta efeito protetor da mucosa somente no modelo do etanol 70%; (2)

este efeito pode ser atribuído ao aumento da secreção de muco gástrico; (3) este

efeito protetor provavelmente não envolve interação de componentes do extrato com

ucosa.

se tecidual desencadeada pela isquemia da mucosa

verão ser realizados, porém envolverão a padronização de

febalosina, aurapten e rutina, também reduziram a nocicepção induzida pelo

a síntese ou atividade de prostaglandinas ou ainda a liberação do NO.

Não podemos descartar, no entanto, o possível efeito inibitório do extrato

sobre outros mediadores que estariam contribuindo com a ulceração da m

Acredita-se que muitos mediadores como leucotrienos (LT), tromboxano A

(TXA),

fator de ativação plaquetária e a endotelina – 1 estão implicados na formação da

úlcera induzida pelo etanol, principalmente por propiciarem potente vasoconstrição e

congestão da mucosa (IAQUINTO

et al, 2003).

Além disso, a necro

gástrica promove liberação de leucotrieno B, que atrai leucócitos e macrófagos, os

quais fagocitam o tecido necrosado e liberam citocinas pró-inflamatórias (como TNF-

α, IL-1α e IL-1β), ativando células epiteliais e endoteliais (TARNAWSKI, 2005). Uma

possível questão a ser analisada, seria do efeito citoprotetor do extrato estar ligado a

inibição da liberação de citocinas pró-inflamatórias, visto que tanto o EHPP, como

seu composto isolado, a rutina apresentaram atividade antinociceptiva, em modelos

de nocicepção induzidos pelas citocinas inflamatórias TNF-

α e IL-1β.

Novos experimentos para elucidar os mecanismos envolvidos com esta

atividade protetora de

novas metodologias e estudos

in vitro para confirmação dos resultados.

Em síntese, os resultados do presente trabalho, confirmam alguns de seus

usos populares e estendem os dados descritos na literatura, indicando que o EHPP

apresenta atividade antinociceptiva, em modelos de nocicepção química induzida

pelo ácido acético, formalina, capsaicina e glutamato. Os compostos isolados

glutamato. Os resultados apresentados são de grande importância, uma vez que a

antinocicepção induzida EHPP parece ser dependente de uma interação com

tora gástrica

dos adicionais dever ser realizados

fornece base

receptores ionotrópicos glutamatérgicos tipo NMDA e da inibição da atividade de

citocinas pró-inflamatórias (TNF-

α e IL-1β).

Além disso, com este trabalho foi possível confirmar, baseando-se no uso

popular da

P. paniculata, que o EHPP possui atividade antiinflamatória parcial em

modelos de inflamação, como o modelo do edema de pata e pleurisia.

Outro dado relevante aqui demonstrado foi a atividade prote

exercida pelo extrato. Este dado é particularmente interessante, uma vez que esta

atividade está ligada ao aumento da produção de muco gástrico, um fator de

proteção da mucosa gástrica e não da inibição de um fator agressor, como a

produção de ácido gástrico, sendo este o mecanismo comum a todos os

medicamentos mais empregados para o tratamento de úlceras gástricas atualmente.

Apesar deste importante resultado, estu

com a finalidade de caracterizar de forma mais detalhada os mecanismos envolvidos

neste efeito.

Estudos adicionais deverão também ser realizados para a confirmação do

preciso mecanismo de ação envolvido na atividade antinociceptiva do EHPP e da

rutina. Estudos químicos estão em progresso para caracterizar outros compostos,

que talvez contribuam com potencial antinociceptivo, antiinflamatório e protetor

gástrico do EHPP.

Neste contexto, o resultado obtido neste estudo nos

farmacológica para utilização da

P. paniculata, validando seu uso popular e

indicando seu potencial terapêutico para o desenvolvimento de novos fitofármacos

com propriedades analgésicas, antiinflamatórias e antiulcerosas.

7 CONCLUSÕES

Os resultados do presente trabalho permitem estender os dados descritos na

literatura, demonstrando que o EHPP e principalmente a rutina apresentam

s ionotrópicos

adicionais com o extrato hidroalcoólico e com compostos isolados

tencial atividade biológica que poderão dar origem ou servir de

importante ação antinociceptiva.

Analisando os resultados, observou-se que este efeito antinociceptivo pode envolver

uma possível ação do EHPP e da rutina em receptores glutamatérgico

tipo NMDA e inibição da atividade de citocinas pró-inflamatórias.

Além disso, foi demonstrado que o EHPP apresentou atividade antiinflamatória

parcial no modelo do edema de pata e pleurisia, porém os mecanismos envolvidos

neste efeito não foram esclarecidos.

Foi possível concluirmos também que o extrato bruto da

P. paniculata exerce

atividade citoprotetora gástrica local por um mecanismo que evolve uma elevação na

produção de muco e que esta atividade não está relacionada com a redução da

secreção ácida gástrica e produção de óxido nítrico.

Experimentos

devem ser realizados para esclarecer melhor o mecanismo de ação envolvido

principalmente na atividade citoprotetora quanto na ação antinociceptiva.

Os resultados deste trabalho em conjunto com os dados descritos na literatura,

mostram nitidamente que as plantas medicinais são fonte de uma variedade de

compostos com po

protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou fitofármacos.

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